融解曲線の自動解析システムおよび自動解析法
実験的な融解曲線を、真の融解曲線とバックグラウンド蛍光の和としてモデル化する。実験的な融解曲線データおよびバックグラウンド信号のモデルに基づいて偏差関数を生成することができる。この偏差関数は、その実験曲線のある範囲を複数の窓に分割することによって生成することができる。窓ごとに、バックグラウンド信号のモデルと実験的な融解曲線データの間のフィットを計算することができる。この偏差関数は、その結果得られるフィットパラメータから形成することができる。この偏差関数はバックグラウンド信号補償を含むことができ、そのため、データ視覚化、クラスタリング、ジェノタイピング、スキャニング、ネガティブ試料除去など、さまざまな融解曲線解析操作において、この偏差関数を使用することができる。この偏差関数を使用して、自動バックグラウンド補正プロセスを提供することができる。バックグラウンド補正された融解曲線をさらに処理して、凝集信号を除去することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、融解曲線の解析に関し、具体的には、核酸、タンパク質などの化合物の融解曲線の自動解析システムおよび自動解析法に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は、融解曲線の直線ベースライン解析を示すプロットである。
【図２】図２は、複数の遺伝子型および低温における指数バックグラウンド蛍光を示す、非標識プローブ融解実験の未変更の実験的な融解曲線のプロットである。
【図３】図３は、実験的な融解曲線の偏差関数を生成する方法の一実施形態の流れ図である。
【図４】図４は、ヘアピン構造の例示的な未変更の実験的な融解曲線のプロットを示す図である。
【図５】図５は、図４の融解曲線の導関数プロットを示す図である。
【図６】図６は、指数バックグラウンド差引き後の図４の融解曲線の導関数プロットを示す図である。
【図７】図７は、図４に示したデータの偏差関数のプロットを示す図である。
【図８】図８は、図４に示したデータの指数バックグラウンド差引き後の正規化された融解曲線のプロットを示す図である。
【図９】図９は、図４に示したデータの積分された偏差関数のプロットを示す図である。
【図１０】図１０は、多重ジェノタイピングのための指数バックグラウンド差引き後の融解曲線データの導関数プロットを示す図である。
【図１１】図１１は、図１０に示した融解曲線データの偏差プロットを示す図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、平滑化された例示的なタンパク質融解曲線を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、図１２Ａの平滑化されたタンパク質融解曲線の導関数プロットを示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、図１２Ａのタンパク質融解曲線データの偏差関数プロットを示す図である。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、バックグラウンド補正後の導関数融解曲線を示す図である。
【図１３】図１３は、図１２Ａのタンパク質融解曲線の正規化されたアンフォールディング曲線の導関数プロットを示す図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、平滑化された例示的なタンパク質融解曲線を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、図１４Ａの平滑化されたタンパク質融解曲線の導関数プロットを示す図である。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、図１４Ａのタンパク質融解曲線データの偏差関数プロットを示す図である。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、バックグラウンド補正後の導関数融解曲線を示す図である。
【図１５】図１５は、図１４Ａのタンパク質融解曲線の正規化されたアンフォールディング曲線の導関数プロットを示す図である。
【図１６】図１６は、偏差解析を使用してネガティブ試料を特定する方法の一実施形態の流れ図である。
【図１７】図１７は、偏差解析を使用してネガティブ試料を特定する方法の他の実施形態の流れ図である。
【図１８】図１８は、融解曲線のバックグラウンド領域および／または融解領域を自動的に特定する方法の一実施形態の流れ図である。
【図１９】図１９は、例示的な偏差関数のプロットを示す図である。
【図２０】図２０は、アンプリコンバックグラウンド領域および／またはアンプリコン融解領域ならびにプローブバックグラウンド領域および／またはプローブ融解領域を自動的に特定する方法の一実施形態の流れ図である。
【図２１Ａ】図２１Ａは、アンプリコン融解領域およびプローブ融解領域を含む融解曲線の偏差関数のプロットである。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、プローブ融解領域の偏差関数のプロットである。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、カーソルプローブ領域を特定するプロセスの他の例を示す図である。
【図２２】図２２は、自動バックグラウンド差引き法の一実施形態の流れ図である。
【図２３Ａ】図２３Ａは、例示的な理想曲線および融解曲線を示す図である。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、例示的な理想曲線および融解曲線を示す図である。
【図２４】図２４は、自動バックグラウンド差引き法の他の実施形態の流れ図である。
【図２５】図２５は、不偏階層法によって正確に自動クラスタリングされた偏差プロットを示す図である。
【図２６】図２６は、不偏階層法によって正確にクラスタリングされていない、指数バックグランド除去後の導関数プロットを示す図である。
【図２７】図２７は、ＰＣＲ融解解析後のネガティブ試料を含む一組の未変更の融解曲線を示す図である。
【図２８】図２８は、振幅カットオフ技法を使用したネガティブ試料排除後の一組のネガティブ試料インジケータを示す図である。
【図２９】図２９は、偏差解析を使用したネガティブ試料排除後の一組の融解曲線を示す図である。
【図３０】図３０は、偏差解析を使用したネガティブ試料排除後の一組のネガティブ試料インジケータを示す図である。
【図３１】図３１は、偏差解析によるプローブ融解領域およびアンプリコン融解領域の自動位置設定後の偏差プロットを示す図である。
【図３２】図３２は、一組のネガティブ試料／クラスタメンバシップインジケータを示す図である。
【図３３】図３３は、融解曲線データを解析するシステムのブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
追加の態様および利点は、添付図面を参照して展開される好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【０００６】
融解曲線の解析は、さまざまな物質の研究に役立つ。特に、核酸は、融解曲線によって広範囲に研究されており、融解曲線の差異によりさまざまな核酸配列を示すことができる。融解曲線は、タンパク質の結合の研究でも使用されており、特性融解曲線が、特定のリガンドに対するタンパク質の結合親和性を示す。本明細書では核酸およびタンパク質の融解を参照するが、他の化合物の融解曲線の解析も本開示の範囲に含まれることが理解される。
【０００７】
本明細書の一例では、融解曲線の解析が、核酸生成物の特定および／または構造に関する情報を提供する。核酸構造内の（例えば２本のＤＮＡ鎖間の）塩基−塩基水素結合を切るのに必要なエネルギー量は、その核酸生成物の構造に関連した因子に依存することがある。このような因子には、限定はされないが、長さ、相補性、グアニン−シトシン（ＧＣ）含量量、反復配列の有無などが含まれる。
【０００８】
融解曲線は、核酸生成物を含む溶液にエネルギー勾配を与える（例えば核酸生成物を含む溶液を加熱する）ことによって得ることができる。エネルギーが加えられ、溶液の温度が上昇すると、核酸生成物は変性する（例えば解離する）ことがある。この例は温度の上昇に関するが、当技術分野では、他の融解法、例えばイオン濃度を変化させる勾配も知られている。融解曲線は、この解離が起こる程度を、温度（または他の融解勾配）の関数として測定することによって生成することができる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，８７１，９０８号を参照されたい。したがって、本明細書で使用するとき、融解曲線は、温度、イオン濃度などの融解勾配に反応して化合物がその構造を変化させる程度（例えば、核酸生成物に加えられたエネルギー勾配に応じて核酸生成物中の鎖が解離する程度）を定量化する測定値を含む任意のデータセットを指すことがある。
【０００９】
ある実施形態では、この解離を電気光学的に測定する。結合染料を含む溶液に核酸生成物（または他の化合物）を入れる。この結合染料は、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に結合しているときに電気光学（ＥＯ）放射を放出するように適合されている。生成物が解離すると、結合染料はＥＯ放射の放出をやめる（または、後に論じるように、低レベルのＥＯ放射を放出する）。これに応じて、溶液にエネルギーを加えたときに（例えば溶液の温度を上昇させたときに）溶液から放出されるＥＯ放射（蛍光）の測定値を取得することにより、融解曲線を生成する。さらに、本開示は、融解時に蛍光が低減する実施形態だけに限定されないことが理解される。Ｇ−クエンチング単標識プローブ（Ｇ−クエンチング・シングルラベル・プローブ）を使用する実施形態など、いくつかの実施形態では、融解すると蛍光信号が増大する（例えば米国特許第６，６３５，４２７号参照）。
【００１０】
したがって、融解曲線は、一連のＥＯ放射測定値（例えば溶液から放出された蛍光の測定値）を温度の関数として含むことがある。しかしながら、他の方法で取得した解離測定値を含む他の融解曲線に、本開示の教示を適用することもできる。したがって、融解曲線データを取得する（例えば、核酸の解離を定量化する測定値を、溶液に加えたエネルギーの関数として取得する）特定の方法および／または技法に、本開示が限定されると解釈すべきではない。
【００１１】
上で論じたように、融解曲線から、核酸生成物の構造に関する情報を推測することができる。そのため、融解曲線データを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物を調べることができる。ＰＣＲ生成物の融解曲線は、結合染料の存在下でＰＣＲ反応の生成物を加熱することによって取得することができる。上で論じたように、この結合染料は、ｄｓＤＮＡに結合しているときの方が、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に結合しているときよりも強い蛍光を発するように適合されている。したがって、ＰＣＲ生成物が主にｄｓＤＮＡとして存在する比較的に低い温度において、この溶液は、比較的に高いレベルの蛍光を発する。溶液の温度を上昇させると、生成物は、２本のｓｓＤＮＡに解離（例えば変性）し、それによって、溶液は、より低レベルの蛍光を発する。ＰＣＲ生成物は、ｄｓＤＮＡ状態からｓｓＤＮＡ状態への相転移を、幅の狭い温度窓内で経験することがある。前述のとおり、この転移は、溶液が発する蛍光を低減させることがある。この転移が起こる温度窓を、融解領域、融解転移および／または融解窓と呼ぶことがある。
【００１２】
このような融解曲線実験で一般的に使用される結合染料には、温度に応じて、溶液中で自ら蛍光を発するものがある。例えば、ｄｓＤＮＡが存在しない場合、（アイダホ・テクノロジー社から販売されており、アイダホ・テクノロジー社の登録商標である）ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標） Ｐｌｕｓなどの結合染料の蛍光信号は、温度の関数として単調に低減する。したがって、前述の方法で（例えば核酸生成物と結合染料の溶液を加熱したときに放出されたＥＯ放射を測定することによって）取得した融解曲線は、ｄｓＤＮＡ生成物に結合した染料によって放出された蛍光と、溶液中の結合染料および／またはｓｓＤＮＡに結合した染料が自ら発したバックグラウンド蛍光との組合せを含むことがある。
【００１３】
したがって、結合染料の存在下で核酸生成物を融解させることによって取得した生の測定蛍光信号は、生成物の融解（溶液を加熱したときのｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡへの生成物の解離）に起因する蛍光とバックグラウンド蛍光の和としてモデル化することができる。式１は、「真の」融解曲線Ｍ（Ｔ）（例えば核酸生成物の融解によって生じた蛍光）とバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）の和を含む実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を示す。
【００１４】
【数１】
【００１５】
上で論じたように、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）から、核酸生成物に関する情報（例えば生成物の構造、組成など）を推測し、および／または求めることができる。しかしながら、実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）の解析は、そのバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）成分によって複雑になることがある。バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）信号をモデル化し、実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）からバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）信号を除去するさまざまなシステムおよび方法が開発されている。
【００１６】
一例では、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）が１次関数としてモデル化される。一般的な多くの染料の蛍光は、温度とともに直線的に低減する（ある温度範囲にわたって温度の上昇とともに低減する）。核酸融解曲線では、融解領域内で、生成物の蛍光が急激に低減する。しかしながら、融解領域の外側では、温度に伴う蛍光変化がほぼ直線的である。したがって、融解転移前の直線ベースラインおよび融解転移後の直線ベースラインを外挿することによって、実験的な融解曲線を正規化することができる。
【００１７】
図１は、直線ベースラインＬ１（Ｔ）およびＬ０（Ｔ）を有する実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を示す。正規化された融解曲線は、上ベースラインと下ベースラインの差に対する、下ベースライン（Ｌ０（Ｔ））よりも上の実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の高さの比として計算することができる。上ベースラインと下ベースラインの勾配は同じであることも、同じでないこともある。
【００１８】
図２は、非標識プローブの存在下で非対称ＰＣＲ反応の生成物を融解させることによって得た融解曲線のプロットを示す。この曲線は、非標識プローブの融解転移とＰＣＲ生成物の融解転移の両方を含む。図２に示すように、融解曲線の非直線性のため、上直線ベースラインと下直線ベースラインとが融解曲線よりも下で交差し、図１に示した１次補償方程式の分母がゼロになるため、前述の直線ベースライン法の使用には問題がある。
【００１９】
代替手法では、指数減衰関数を使用して、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）をモデル化する。指数バックグラウンドモデル化および指数バックグラウンド差引き（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）のためのシステムおよび方法は、参照によってその全体が参照によって組み込まれる２００６年９月２０日に出願された「ＭＥＬＴＩＮＧ ＣＵＲＶＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＷＩＴＨ ＥＸＰＯＮＥＮＴＩＡＬ ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ ＳＵＢＴＲＡＣＴＩＯＮ」という名称のＰＣＴ出願第ＷＯ２００７／０３５８０６号に記載されている。
【００２０】
経験的証拠は、ある温度（例えば８５℃よりも低い温度）では、結合染料からのバックグラウンド蛍光信号を、以下の形の減衰指数関数として正確にモデル化することができることを示している。
【００２１】
【数２】
【００２２】
式２で、Ｃおよびａは、融解曲線データＦ（Ｔ）からフィット（ｆｉｔ）させるための定数、ＴＬは、指数部の引数に対するシフティングパラメータ（カーソル位置（後述））であり、一般に、融解曲線Ｆ（Ｔ）内の融解転移よりも下に位置する。
【００２３】
とりわけ、融解領域の前後ではバックグラウンド蛍光のスケールが変化するため、式２のバックグラウンド蛍光モデルは、観察された蛍光のデータに直接にはフィットしない可能性がある。バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）をモデル化するのに使用する指数関数の特性（例えば指数関数の導関数が指数関数であること）に基づいて、式３を得ることができる。
【００２４】
【数３】
【００２５】
このバックグラウンド蛍光モデルによれば、融解転移領域の前後で、生成物融解関数が一定である。融解転移領域を間に挟むように２つの温度を選択することができる。融解転移領域の前に第１の温度ＴＬを選択し、融解転移領域の後に第２の温度ＴＲを選択することができる。本明細書ではこれらの温度を「正規化カーソル」と呼ぶことがある。式２と式３を結合することによって、正規化カーソルＴＬおよびＴＲを使用して、指数バックグラウンド信号Ｂ（Ｔ）のモデルを構築することができる。
【００２６】
【数４ａ】
【００２７】
【数４ｂ】
【００２８】
観察された蛍光データの導関数は、例えば中心差分法（セントラル・ディラレンシング法）を使用して近似することができる。式４ａおよび４ｂを、ａおよびＣについて解くと、式５ａおよび５ｂが得られる。
【００２９】
【数５ａ】
【００３０】
【数５ｂ】
【００３１】
式５ａおよび５ｂの結果を使用して、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）のモデルを構築することができる。実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）からこのモデルを差し引くと、「真の」融解曲線Ｍ（Ｔ）が得られる。
【００３２】
【数６】
【００３３】
一般に、操作者は、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）をモデル化するために（例えば式３〜６で）使用する正規化カーソル位置（ＴＬおよびＴＲ）を手動で選択する。この操作は、融解曲線データについて事前にある程度の知識を有し、および／または、生の実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）を適切に解釈する技能および経験を有する（例えば融解転移がどこで起こったのかなどが分かる）ことを操作者に要求することがある。本明細書に開示するシステムおよび方法は、融解曲線データＦ（Ｔ）内のバックグラウンド領域と融解領域とを、偏差解析（後述）を使用して特定することによって、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の自動解析を提供することができる。したがって、本明細書に開示する偏差解析システムおよび方法は、この手動操作の必要性を回避する（例えば、融解領域についての事前の知識および／または融解領域の手動推定の必要性を排除する）ことができる。
【００３４】
用途によっては、融解曲線データが、正規化された蛍光曲線として示され、この正規化された蛍光曲線では、融解曲線Ｍ（Ｔ）が、例えば１（完全にアニールしている）から０（完全に解離している）までに再スケーリングされる。ある実施形態では、以下の変換を使用して、融解曲線Ｍ（Ｔ）がＮ（Ｔ）に正規化される。
【００３５】
【数７】
【００３６】
１次バックグラウンドモデル化／バックグラウンド除去技法および指数バックグラウンドモデル化／バックグラウンド除去技法は、多くの用途で有用であることがある。例えば、１次モデルは、８０から９５℃までの間のＴｍを有するＰＣＲ生成物に対する良好なフィットであり、指数モデルは、解析する温度範囲が２０℃以下であるときに良好なフィットである。しかしながら、温度が８０℃未満であり、および／または解析する温度範囲が２０℃より高いとき、（緩衝液、ｄＮＴＰ、プライマなどによって生成された蛍光を含む）バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）信号は、１次モデルにも、指数モデルにも従わない可能性がある。具体的には、８０℃未満の温度は、予想されるバックグラウンドからの偏差を示し、７０℃未満の温度は、よりいっそう大きな偏差を示し、６０℃、５０℃および４０℃では偏差が次第に増大する。温度範囲に関して、２０℃より高い範囲でも、バックグラウンドは、単純な１次および指数モデルから外れることがある。解析範囲が、３０℃、４０℃、５０℃および６０℃と増大するにつれて、１次または指数モデルからのバックグラウンドの偏差は増大する。これらの低温解析条件および／または範囲の広い解析条件下においては、後述する偏差解析が、固定されたモデル化に対する良好な代替となる可能性がある。例えば、非標識プローブ、スナップバック・プライマおよびマルチプレックス・スモール・アンプリコンの融解は全て、しばしば２０℃より高い範囲で起こり、一部は８０℃未満の温度で起こる複数の融解転移に帰着しうる。非標識プローブ、スナップバックプライマおよびマルチプレックススモールアンプリコンの融解に関する追加の情報は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる「Ｌ．Ｚｈｏｕ他、Ｓｎａｐｂａｃｋ Ｐｒｉｍｅｒ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ＤＮＡ Ｄｙｅ ａｎｄ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ、５４（１０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１６４８〜５６（２００８年１０月）」、米国特許第７，３８７，８８７号、および２００８年３月７日に出願された「ＰＲＩＭＥＲＳ ＦＯＲ ＭＥＬＴＩＮＧ ＡＮＡＬＹＳＩＳ」という名称のＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１０９８２３号に出ている。
【００３７】
核酸融解曲線は、核酸の配列に関する情報を得るために使用されているが、タンパク質融解曲線はしばしば、タンパク質の熱力学的安定性を測定するために使用される。タンパク質の熱安定性を評価するためには、タンパク質のネイティブの構造が熱力学的に安定である温度よりも高い温度まで温度を上昇させる。タンパク質はアンフォールドし、以前はタンパク質構造中に隠れていた疎水性アミノ酸残基が露出する。タンパク質の融解では、熱傾斜の中点としてしばしばＴｍが定義され、Ｔｍは、ネイティブの形の自由エネルギーとネイティブでない形の自由エネルギーが等しい温度を表す。例えば、タンパク質を、単独で、およびリガンドの存在下で融解させ、安定性の摂動を使用して、ライブラリをスクリーニングすることができる。追加の情報は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる「Ｄ．Ｍａｔｕｌｉｓ他、Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎｉｃ Ａｎｈｙｄｒａｓｅ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ Ｕｓｉｎｇ ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５、４４、５２５８〜５２６６」に出ている。
【００３８】
上で論じた核酸融解曲線の解析と同様に、タンパク質融解曲線も、式１のＦ（Ｔ）＝Ｍ（Ｔ）＋Ｂ（Ｔ）の形で表すことができる。典型的なタンパク質融解と典型な核酸融解の主な違いＢ（Ｔ）は、タンパク質融解では、タンパク質が変性するにつれてＥＯ放射信号が増大することである。典型的なタンパク質融解曲線を図１２Ａおよび１４Ａに示す。図１２Ａの例では、温度が４０度に向かって上昇すると、熱消光（サーマル・クエンチング）によって蛍光が低減する。タンパク質に応じて、アンフォールディングは通常４０から６０℃までの間の温度で始まり、露出した疎水性残基により多くの染料が結合するため、このアンフォールディングは蛍光の増大として観察される。最終的には、タンパク質の凝集および沈殿が（通常は４５から７５℃までの間で）起こり、それに熱消光が加わるため、蛍光は再び低減する。図１２Ａには、一般的に観察される安定性および強度の範囲を示す、よく知られている６種類のタンパク質の融解が示されており、濃度は全て２．２５μＭである。
【００３９】
経験的証拠は、融解転移よりも高い高温（タンパク質によって例えば６０〜９０℃）では、結合染料からの残留蛍光を、下の形の２次多項式によってモデル化することができることを示している。
【００４０】
【数８】
【００４１】
式８で、ａｉ、ｂｉおよびｃｉは、実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）からフィットさせるための定数である。次いで、タンパク質融解曲線を、前述のＦ（Ｔ）＝Ｍ（Ｔ）＋Ｂ（Ｔ）の形で表すことができる。式１を参照されたい。式８の定数は一般に、バックグラウンド領域内の連続するある温度範囲にわたって集めた蛍光データに対する最小２乗フィットによって見つける。
【００４２】
本開示は、バックグラウンド蛍光信号の例示的な指数モデルおよび２次モデルの使用を教示するが、この点に関して本開示は限定されない。当業者には理解されるであろうが、当技術分野で知られている任意のモデル化技法および／またはモデル化形態とともに機能するように、本明細書に教示する偏差関数（および関連解析技法）を適合させることができる。
【００４３】
前述のとおり、操作者は一般に、融解曲線中のバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）を（例えば式８において）モデル化するために使用する温度領域を手動で選択する。この操作は、融解曲線データについて事前にある程度の知識を有し、および／または、生の実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）を適切に解釈する技能および経験を有する（例えば融解転移がどこで起こったのかなどが分かる）ことを操作者に要求することがある。本明細書に開示するシステムおよび方法は、融解曲線データＦ（Ｔ）内のバックグラウンド領域と融解領域とを、偏差解析（後述）を使用して特定することによって、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の自動解析を提供することができる。したがって、本明細書に開示する偏差解析システムおよび方法は、この手動操作の必要性を回避する（例えば、融解領域およびバックグラウンド領域についての事前の知識ならびに／または融解領域およびバックグラウンド領域の手動推定の必要性を排除する）ことができる。
【００４４】
融解曲線データは、導関数の形で（例えば正規化された融解曲線Ｎ（Ｔ）の導関数または負の導関数として）表すことができる。しかしながら、融解曲線Ｍ（Ｔ）は、常に等間隔であるとは限らない離散的な温度測定で集められ、少量の雑音を含むことがあるため、データを（例えば３次元平滑化スプライン（３次元スムージングスプライン）を使用して）平滑化することができ、および／または均一な温度測定値で再サンプリングすることができる。中心差分技法または他の技法を使用して、融解曲線の導関数を近似することができる。単一の融解転移を含む融解曲線については、導関数曲線のピークを「融解転移」ないしＴＭとして示すことができる。複数の融解転移を含む融解曲線については、融解転移ピークを特定し、および／またはそれに応じて番号（例えばＴＭ１、ＴＭ２、．．．、ＴＭｎ）をつけることができる。
【００４５】
融解曲線データを、偏差関数に換算して表示し、および／または解析することができる。この偏差関数は、実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）がバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）のモデルから外れる程度を定量化することができる。上で論じたとおり、ある実施形態では、とりわけ指数減衰関数を使用して、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）をモデル化する（例えば融解曲線の「理想」モデル化）。したがって、偏差関数は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の指数減衰率と（例えば上式２に基づく）バックグラウンド蛍光モデルの指数減衰率との間の偏差に基づくことがある。
【００４６】
偏差解析は、一連の温度窓内において実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を予め定義された関数にフィットさせることによって計算した複数のフィットパラメータを生成することを含むことができる。したがって、偏差関数（本明細書ではＥ（Ｔ）と称する）は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）が予め定義された関数から外れる程度を、温度の関数として定量化することができる。
【００４７】
後に論じるが、融解曲線の偏差関数Ｅ（Ｔ）は、融解曲線データを（例えば検査、視覚化、作図などによって）直接に解析するために使用することができ、および／または別の融解曲線解析プロセスもしくはシステムで使用することもできる。本明細書に開示した偏差関数Ｅ（Ｔ）の用途には、限定はされないが、（例えばジェノタイピング、スキャニングなどに使用する融解曲線間の差異を強調するために）融解曲線データを表示し、作図すること、ネガティブ試料（例えばネガティブコントロール試料、無効データなど）を自動的に特定すること、融解領域および／またはバックグラウンド領域の特定を自動化すること、融解曲線クラスタリングを自動化すること、ジェノタイピングおよび／またはスキャニング操作を自動化すること、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）の差引きを自動化することなどがある。しかしながら、本明細書に開示された偏差解析システムおよび偏差解析法を、別の融解曲線用途で使用することもできることを当業者なら理解するであろう。したがって、偏差解析を生成し、および／または本明細書に開示された融解曲線解析に偏差解析を適用するためのシステムおよび方法が、特定の一組の用途に限定されると解釈すべきではない。
【００４８】
偏差関数Ｅ（Ｔ）の生成は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）と所定の関数との間のランニングフィットを計算することを含むことができる。この所定の関数は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）内のバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）のモデル（本明細書では理想融解曲線と呼ぶ）を含むことができ、このモデルは、上で論じたように、指数減衰関数を使用して近似することができる。式２〜６を参照されたい。
【００４９】
実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）は、温度区間［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ］内で定義することができる。ランニングフィットは、実験的な融解曲線の温度区間（例えば［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ］または［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ−Ｗ］）内の幅がそれぞれＷの複数の温度窓（ＴＷ）内で実行することができる。
【００５０】
【数９】
【００５１】
式９で、ＴＷＬは、温度窓ＴＷの最低温度または「開始」温度を表す。温度窓ＴＷの幅Ｗは、融解曲線データの分解能（例えば実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）データの密度および／または精度）ならびに／または融解曲線データから抽出する特徴に応じて選択することができる。幅Ｗは、温度窓ＴＷ内の雑音のランダム変化を平滑化するために十分に大きく、同時に、関心の特徴を分解するために十分に小さくなるように選択することができる。
【００５２】
偏差関数Ｅ（Ｔ）は、区間［Ｔｍｉｎ＋Ｗ／２，Ｔｍａｘ−Ｗ／２］のＴｉによって表される均一な離散化に対して定義される。例えば、温度窓ＴＷ間の温度間隔ΔＴを下式として定義することができる。
【００５３】
【数１０】
【００５４】
ΔＴ（温度窓ＴＷ間の間隔）の選択は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の分解能、性能考慮事項、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）から抽出する特徴の性質などに基づくことができる。温度間隔ΔＴは、連続する任意の２つの融解曲線データ点間の最大差よりも大きく（例えば実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）内の最も粗い温度分解能よりも大きく）なるように選択することができる。
【００５５】
各温度窓ＴＷ内で、予め定義された関数と実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の間のフィットを計算することができる。フィットごとにフィットパラメータを得ることができ、そのフィットパラメータを、温度窓ＴＷに関連づけられたある点（温度値）に割り当てることができる。特定の温度窓ＴＷに関連づけられた温度点を、（範囲［Ｔｉ−Ｗ／２，Ｔｉ＋Ｗ／２］を含む温度窓に対する）Ｔｉと呼ぶことがある。
【００５６】
例えば、この形の偏差関数は、核酸融解曲線に対して適している。上で論じたように、偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成するために使用するこの予め定義された関数は、実験的な融解曲線内のバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）（例えば「理想」融解曲線）をモデル化するように構成された指数減衰関数とすることができる。この予め定義された関数が指数減衰関数を含む場合、前記フィットは、下式のようになるように、パラメータＣｉおよび／またはａｉを選択することを含むことができる。
【００５７】
【数１１】
【００５８】
式１１のフィットは、例えば最小２乗フィッティング技法など、当技術分野で知られている任意のフィッティング技法を使用して実施することができる。
【００５９】
ある実施形態では、数値的に安定させるために、指数関数形の式１１を、温度窓ＴＷ内の左端の温度値にシフトさせる（例えば左へシフトさせる）。
【００６０】
指数減衰因子ａｉを使用して、フィットパラメータＴｉごとに下式のようになるように、偏差関数Ｅ（Ｔ）を形成することができる。
【００６１】
【数１２】
【００６２】
上で示したとおり、式１２の偏差関数は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の指数減衰因子と「理想」融解曲線との間の偏差を温度の関数として定量化する。純粋な指数バックグラウンドについては、指数減衰因子が定数となることがある。したがって、その定数からの偏差を、２重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）融解（例えばバックグラウンド減衰と組み合わさった核酸生成物の融解）の結果とすることができる。ある実施形態では、この指数関数からの偏差を表すのに、偏差関数の最小値を偏差関数から差し引く。複数の曲線を、ピーク高さによって互いに正規化することができる（例えばＥ（Ｔ）−ｍｉｎ｛Ｅ（Ｔ）｝／ｍａｘ｛Ｅ（Ｔ）｝−ｍｉｎ｛Ｅ（Ｔ）｝）。あるいは、またはこれに加えて、それぞれの曲線を数値積分で除することによって、全ピーク面積による正規化を実行することもできる。（正規化された融解曲線に類似の）積分された偏差プロットＥ（Ｔ）は全てのプロットが同じ値から始まり、同じ値で終わるため、ピーク面積正規化の方が有利であることがある。
【００６３】
あるいは、またはこれに加えて、振幅定数Ｃｉ、ならびに／または振幅因子と減衰因子Ｃｉおよび／またはａｉの組合せを、偏差関数Ｅ（Ｔ）に組み込むこともできる。他の実施形態では、偏差関数が、融解曲線データとバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）の他のモデル（例えば２次モデル、離散モデルなど）との間の偏差を定量化する。したがって、本明細書に開示した偏差関数が特定の所定のフィット関数に限定されると解釈すべきではない。
【００６４】
タンパク質融解曲線に関しては、偏差関数Ｅ（Ｔ）の生成に使用する予め定義された関数を、例えば、実験的な融解曲線データ内のバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）をモデル化する２次多項式とすることができる。この予め定義された関数が２次多項式を含む場合、前記フィットは、下式のようになるように、パラメータａｉ、ｂｉおよび／またはｃｉを選択することを含むことができる。
【００６５】
【数１３】
【００６６】
式１３のフィットは、例えば最小２乗フィッティング技法など、当技術分野で知られている任意のフィッティング技法を使用して実施することができる。
【００６７】
２次項に乗じる定数ａｉを使用して、フィットパラメータＴｉごとに下式のようになるように、偏差関数Ｅ（Ｔ）を形成することができる。
【００６８】
【数１４】
【００６９】
上で示したとおり、式１４の偏差関数は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）と「理想」融解曲線との間の偏差を温度の関数として定量化する。純粋な２次バックグラウンドについては、この振幅因子が定数となることがある。したがって、その定数からの偏差を、タンパク質のアンフォールディングの結果とすることができる。
【００７０】
後に論じるように、（例えば融解領域／バックグラウンド領域の特定、バックグラウンド蛍光の除去、ネガティブ試料の特定、クラスタリングなどに使用する）実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）の解析において、この偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用することができる。偏差関数Ｅ（Ｔ）は、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）のモデルと実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の間の偏差を定量化することができるため、偏差関数Ｅ（Ｔ）は、本来的に、（場合によっては）（例えば１次バックグラウンド差引きおよび／または指数バックグラウンド差引きを使用する）専用バックグラウンド差引き処理に対する必要性を排除するバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）補償を含むことがある。
【００７１】
図３は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成する方法３００の一実施形態を示す。ステップ３１０で、方法３００を初期化する。この初期化は、方法３００が必要とする資源を割り当て、および／または方法３００が必要とする資源を初期化することを含むことができる。ある実施形態では、方法３００を、コンピュータ可読記憶媒体上に記憶された命令および／または別個のソフトウェアモジュールとして具体化する。したがって、ステップ３１０の初期化は、コンピューティングデバイスが、それらの命令を読み取り、および／またはそれらの命令をメモリもしくは他のデバイスへロードすることを含むことができる。あるいは、またはこれに加えて、方法３００は、１つまたは複数のプロセッサ、センサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ、特定用途向け集積回路、ディジタル論理などの１つまたは複数のハードウェアコンポーネントを含むことができる。
【００７２】
ステップ３２０で、方法３００は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を含む融解曲線データにアクセスする。
【００７３】
ステップ３３０で、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の温度範囲を複数の温度窓ＴＷに分割する。温度窓ＴＷはそれぞれ、幅Ｗを有するように定義することができる。幅Ｗは、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の分解能および／または融解曲線データから抽出する特徴の性質に応じて、方法３００（または方法３００のユーザ）が選択することができる。上で論じたとおり、温度窓ＴＷは、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の温度区間の均一な離散化を形成するように定義することができ、温度窓ＴＷ間の間隔を定義するΔＴメトリックによっては互いに重なり合うことがある。
【００７４】
ステップ３４０で、複数の温度窓ＴＷのそれぞれの温度窓ＴＷにわたって、方法３００は反復する。したがって、ステップ３４０で、方法３００は、処理すべき追加の温度窓ＴＷがあるかどうかを判定し、処理すべき追加の温度窓ＴＷがある場合には、フローはステップ３４２へ続き、ステップ３４２で、次の温度窓ＴＷに対する偏差パラメータを計算し、処理すべき追加の温度窓ＴＷがなければ、フローはステップ３５０へ続く。
【００７５】
ステップ３４２で、（現在の温度窓ＴＷ内において）実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）と理想バックグラウンド蛍光のモデルとの間のフィットを計算する。上で論じたように、ある実施形態では、バックグラウンド蛍光を指数減衰関数としてモデル化する。実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）（例えば核酸融解曲線）と指数減衰関数の間のフィットの一例は、式１１〜１２に関して上に示されている。他の実施形態では、２次関数（または他のモデル）を使用してバックグラウンド蛍光をモデル化する。実験的な融解曲線（例えばタンパク質融解曲線）と２次モデルとの間のフィットの一例は、式１３〜１４に関して上に示されている。ステップ３４２はさらに、温度窓ＴＷに対するフィットパラメータを求めることを含む。上で論じたように、数値的に安定させるために、フィッティングパラメータおよび／または窓を左へシフトさせることができる。
【００７６】
ステップ３５０で、それぞれの温度窓ＴＷのフィットパラメータを使用して偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成する。ある実施形態では、ステップ３５０がさらに、偏差関数Ｅ（Ｔ）を正規化することを含む。
【００７７】
ステップ３６０で、表示、追加の融解曲線解析などに対して、偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用可能にする。ステップ３６０は、偏差関数Ｅ（Ｔ）の表現をコンピュータ可読媒体に記憶すること、その表現を、１人または数人のユーザに対して使用可能にすること、人間機械インタフェース（ＨＭＩ）（例えばディスプレイ、プリンタなど）上にその表現を表示することなどを含むことができる。ステップ３６０はさらに、偏差関数Ｅ（Ｔ）を、別の１つもしくは複数のプロセスおよび／またはシステムに送信し、および／または、それらの別の１つもしくは複数のプロセスおよび／またはシステムに対して使用可能にすることを含むことができる。例えば、後に論じるように、自動ネガティブ試料特定プロセス、自動バックグラウンド差引きプロセスなどでこの偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用することができる。
【００７８】
前述の方法３００に従って生成した偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用して、実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）を表示し、および／または、解析することができる。一例として、以下のオリゴヌクレオチドを標準法を使用して合成した。
【００７９】
Ｓ５Ｄ：ｇｔｔａａｃｃＡＣＴＧＡｔａｇｃａｃｇａｃｇＴＣＡＧＴ （配列ＩＤ Ｎｏ．１）
【００８０】
Ｓ７Ｄ：ｇｔｔａａｃｃＡＣＴＧＡＣＡｔａｇｃａｃｇａｃｇＴＧＴＣＡＧＴ （配列ＩＤ Ｎｏ．２）
【００８１】
Ｓ９Ｄ：ｇｔｔａａｃｃＡＣＴＧＡＣＡＧＴｔａｇｃａｃｇａｃｇＡＣＴＧＴＣＡＧＴ （配列ＩＤ Ｎｏ．３）
【００８２】
上記のそれぞれのオリゴヌクレオチドの大文字の領域は相補型であり、そのため、これらのオリゴヌクレオチドは、低温において、５、７または９塩基対（ｂｐ）の幹領域を有する分子内ヘアピンを形成する。各ヘアピンには１０塩基のループが存在する。各ヘアピンの短端は、ポリメラーゼの存在下で７塩基分延長され、それぞれ１２、１４または１６塩基の幹領域を形成する。
【００８３】
上に開示したオリゴヌクレオチドを含む溶液を調製することによって融解曲線データを生成した。この溶液は、最終体積１０μｌ中に、ＰＣＲ緩衝液（例えば５０ｍＭのトリス、ｐＨ ８．３、３ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む）中の１μＭのそれぞれのオリゴヌクレオチド、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、および染料（例えば、アイダホ・テクノロジー社から市販されている１Ｘ ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標） Ｐｌｕｓ染料）を含む。一部の反応では、この溶液が、０．５ＵのＫｌｅｎＴａｑ １（ＡＢ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含み、その結果として、延長後に１２、１４および１６塩基対のヘアピンを得た。ＨＲ−１（商標）高分解能融解機器（アイダホ・テクノロジー社から市販されている）内において、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）毛細管（ロシュ・ダイアグノスティックス社から市販されており、ロシュ・ダイアグノスティックス社の登録商標である）を使用して、０．３℃／秒で、融解曲線データを得た。
【００８４】
図４は、ＨＲ−１（商標）機器（アイダホ・テクノロジー社から市販されている）を使用して得た未変更の融解曲線の例を示す。ＨＲ−１（商標）は、利得を自動的に調整するように構成することができ、そのため、各融解曲線は蛍光値９０から始まる。これらの曲線の指数関数的特徴は明白であり、７５℃付近には、より長いヘアピンの融解挙動が示唆される。しかしながら、図４に示した未変更の曲線を解釈することは容易ではなく、より短いヘアピンの観測可能な２重鎖融解が起こったかどうかははっきりしない。
【００８５】
図５は、図４に示したデータと同じデータの導関数プロットである。より高い温度における２重鎖転移がピークとしてはっきりと示されている。しかしながら、低温ではバックグラウンドが高いため、より低温での転移のＴｍを特定することは難しいことがある。したがって、追加の操作および／または処理（例えばバックグラウンド除去）なしでは、導関数プロットは、曲線中のバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）を適切に表現し、および／または調整することができないことがある。
【００８６】
（例えば式１〜６に関して）上で論じたように、実験的な融解曲線のバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）成分を融解曲線Ｆ（Ｔ）から差し引き、それにより「真の」融解曲線Ｍ（Ｔ）の近似を得ることができる。上式１〜６を参照されたい。図１８および２４（後に論じる）は、とりわけ偏差解析を使用する自動バックグラウンド除去プロセスの例を提供する。
【００８７】
図６は、指数バックグラウンド差引き後の図４および５のデータと同じデータの導関数プロットを示す。図６のプロットでは、全ての試料が融解転移を示しているが、バックグラウンド差引きの成果は理想的とは言えず、特に５ｂｐヘアピン２重鎖でそうである。
【００８８】
図３〜６のそれぞれの実験的な融解曲線の偏差関数Ｅ（Ｔ）を、（例えば式９〜１４および／または図３の方法３００を使用して）生成することができる。図７は、数値積分が１から０までの間で変化するように面積によって正規化した偏差関数Ｅ（Ｔ）のプロットである。図７に示すように、この偏差プロットはＥｍ（Ｔ）によって示されている。後に論じるように、Ｅｍ（Ｔ）は、各温度窓内で、偏差関数Ｅ（Ｔ）の最小値を偏差関数Ｅ（Ｔ）から差し引くようにして偏差関数Ｅ（Ｔ）から導き出される関数である。下式２０を参照されたい。図７に示すように、偏差関数Ｅ（Ｔ）（図７の例ではＥＭ（Ｔ））を使用すると、融解曲線データ内の関連する特徴がより際立ち、かつ容易に観測可能となる。例えば、図７は、４７〜７７℃の３０℃の範囲にわたってヘアピンＴｍが明らかに散らばっていることを示している。予想どおり、より短い幹は、より長い幹よりも広い範囲にわたって融解し、全ての転移が示されている。偏差関数Ｅ（Ｔ）（または図７に示したＥＭ（Ｔ））は本来的にバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）に対して適応するため、バックグラウンドは、全ての試料について適切に除去される。
【００８９】
導関数プロットの代わりに、指数バックグラウンド差引き後の正規化された融解曲線を示すこともできる。このようにして解析したヘアピンデータを図８に示す。より高い温度ではそれらの融解曲線は妥当であるように見えるが、より低い温度では、予想されるものからのより大きな偏差が観察され、５塩基対２重鎖は、いくつかの範囲の温度で「物理的に不可能な」蛍光の増大を示す。
【００９０】
図９は、図６〜８に示したデータと同じデータの（累積偏差の百分率として示された）積分された偏差プロットを示す。この場合には、予想どおり、長い２重鎖ほどより鮮明な転移を示しており、全ての曲線が理に適っているように見える。導関数／偏差プロットとして示されているのか、またはそれらの融解曲線／積分形として示されているかに関わらず、偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用して生成されたプロットはよりロバストであることができ、大きな温度範囲にまたがる複数の曲線の比較を可能にする。
【００９１】
別の例として、２つの温度コントロールキャリブレータを用いた少なくとも４つの単一塩基多様体の多重ジェノタイピングを、プローブなしで均一に実行する。多重プライマおよび内部コントロールに対するオリゴヌクレオチド配列は以前に、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる「Ｓｅｉｐｐ ＭＴ他、Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｆ５，Ｆ２，ａｎｄ ＭＴＨＦＲ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｌｏｓｅｄ Ｔｕｂｅ ｂｙ Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ、５４（ａ）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１０８〜１５（２００８年１月）」によって発表されている。
【００９２】
この例では、以下の５０ｂｐ低温コントロールを使用した。
【００９３】
ＡＴＣＧＴＧＡＴＴＴＣＴＡＴＡＧＴＴＡＴＣＴＡＡＧＴＡＧＴＴＧＧＣＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴ （配列ＩＤ Ｎｏ．４）
【００９４】
上記配列の相補配列を、２６０ｎｍにおける吸光度によって求めた等しいモル割合で上記配列と混合することができる。温度コントロールオリゴヌクレオチドは、３’−リン酸塩でブロックすることができる。以下の５０ｂｐ高温コントロールを使用した。
【００９５】
（Ｇ）ＣＧＧＴＣ（Ａ）ＧＴＣＧＧ（Ｃ）ＣＴＡＧＣＧＧＴ（Ａ）ＧＣＣＡＧ（Ｃ）ＴＧＣＧＧＣ（Ａ）ＣＴＧＣＧＴＧ（Ａ）ＣＧＣＴＣＡ（Ｇ） （配列ＩＤ Ｎｏ．５）
【００９６】
このコントロールはさらに相補配列を含むことができ、括弧内の太字の塩基は、記載した鎖上でのみロックト核酸（ＬＮＡ）である。
【００９７】
１Ｘ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＨｙｂＰｒｏｂｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス社から市販されている）、それぞれ０．５μＭのＦＶプライマ、それぞれ０．１５μＭのＭＴＨＦＲ１２９８および６７７プライマ、それぞれ０．１６μＭのＦ２プライマ、０．０６μＭの低温補正コントロールおよび０．０８μＭの高温補正コントロール、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） Ｍａｓｔｅｒ溶液によって与えられた１ｍＭのＭｇＣｌ２を含む）、０．０１Ｕ／μｌの非耐熱性ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス社から市販されている）、１Ｘ ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標） Ｐｌｕｓ（Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から市販されている）ならびにテンプレートＤＮＡ ２０ｎｇを含む１０μｌの体積中で、ＰＣＲ増幅を実行した。
【００９８】
この例において、ＰＣＲおよび高分解能融解実験は、ＬＳ３２（商標）デバイス（アイダホ・テクノロジー社から市販されている）を使用して実行した。ＰＣＲは、最初に９５℃を１０分間維持し、続いて９５℃、２秒、５６℃、１秒および７２℃、１秒のサイクルを１５回、９５℃、２秒、５８℃、１秒および７２℃、４秒のサイクルを２５回繰り返すことによって実行した。温度サイクルが長くなることを避けるために、増幅中は蛍光の取得は行わなかった。ＰＣＲ中の加熱および冷却ステップは全て、２０℃／秒にプログラムされた傾斜率で実行した。ＰＣＲ後、試料を（１０℃／秒で）９５℃から４０℃まで冷却し、その後、５５℃から９５℃まで０．３℃／秒で蛍光を連続取得して、融解曲線を生成した。
【００９９】
このようにして得た融解曲線データを、前述のとおりに処理して指数バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）を除去し、正規化した。図１０は、処理後の融解曲線の導関数のプロットを示す。図１０は、２５℃の範囲にまたがる融解温度を示しており、６８℃付近に低温コントロールピークを有する。しかしながら、高温コントロールの量を増大させた後でも、強度は低いことが明らかであり（９２〜９３℃における右側の小さなピーク）、このことは、高温コントロールピークを使用した温度調整を難しくする。
【０１００】
前述の偏差解析技法（例えば式９〜１４および／または図３の方法３００）を適用することによって、より高温のピークの見かけの相対強度を増大させることができる。この例では、この融解曲線データを使用して対応するそれぞれの偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成した。
【０１０１】
これらの偏差関数Ｅ（Ｔ）のプロットを（式２０に関して後に論じるＥｍ（Ｔ）の形で）図１１に示す。図１１に示すように、この偏差解析は、低温転移に対する高温転移の見かけの大きさを増大させる。これらの両方の解析法によって、中央の４つのピークの正確なジェノタイピングが達成された。
【０１０２】
図１２Ａは、６種類の異なるタンパク質、すなわち精製リゾチーム、Ｃ反応性タンパク質、ＩｇＧ、クエン酸シンターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびアルカリホスファターゼ（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））の実験的な融解曲線を示す。これらのタンパク質をそれぞれ別個に、等張リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ ７．４（ＰＢＳ）に対して透析し、ＰＢＳ中で、５Ｘ ＳＹＰＲＯ（登録商標） Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）から市販されている）の存在下で、タンパク質濃度２．２５μＭまで希釈した。ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ（登録商標）（アイダホ・テクノロジー社から市販されている）内で、反応物１０ｕｌを、１℃／分で、３５から９９℃まで融解させた。３次平滑化スプラインを使用して実験的な融解曲線データを平滑化し、均一な温度測定値で再サンプリングした。
【０１０３】
図１２Ｂは、図１２Ａの実験タンパク質融解曲線の導関数プロットを示す。これらの導関数は、中心差分技法を使用して近似することができる。
【０１０４】
図１２Ｃは、図１２Ａの実験タンパク質融解曲線データの偏差関数Ｅ（Ｔ）プロットを示す。図１２Ｃの偏差関数は、上で論じた式９〜１４および／または方法３００を使用して計算することができる。図１２Ｃの例では、式１３の２次多項式を使用してバックグラウンド蛍光信号をモデル化し、窓の幅は２０データ点とした。偏差関数は、それぞれのフィットの２次項に乗じる定数（式１３のａｉ）から形成した。
【０１０５】
図１２Ｄは、バックグラウンド補正後の導関数融解曲線を示す。バックグラウンド除去に関しては、カーソル位置を、８４．４度および９８．４度に手動でセットする（全試料について、これらのカーソル位置はともに、融解特徴よりも上のバックグラウンド領域内に位置する）。試料ごとに、前述のカーソル位置内で、（図１２Ａに示した）平滑な融解曲線データに２次多項式を、最小２乗フィッティングでフィットさせる。平滑化された実験的な融解曲線データからバックグラウンドモデルを差し引くことによって、バックグラウンドが補正された（以後、バックグラウンド補正された）融解曲線が形成される。次いで、バックグラウンド補正された融解曲線を正規化した。正規化後、融解曲線は一般にゼロ付近から始まり、融解転移の後、１付近で横ばいになる。図１２Ｄに示したバックグラウンド補正され、正規化された曲線の導関数は、中心差分技法を使用して計算した。全てのタンパク質（低強度のリゾチームは除く）が、よく知られた形式の予想された融解転移を示す。
【０１０６】
図１３は、指数関数的に減衰するバックグラウンドを除去し、さらに局所的に一定の凝集速度に起因する信号を除去した後の図１２Ａの融解曲線データのプロットを示す。タンパク質はしばしばより高い温度で凝集し、それにより、アンフォールディングによって以前に露出したさまざまな疎水性残基を覆い隠す。補正によって、その結果得られるデータが、バックグラウンドおよび凝集が補正されたアンフォールディング曲線を表すことがある。後に論じるように、図１３に示したアンフォールディング曲線は、導関数をとる前に、補正された融解曲線データを最大値によって再スケーリングすることによって、０〜１００の百分率範囲に正規化されている。
【０１０７】
図１３のアンフォールディング曲線データは、式１の実験曲線のモデルを、タンパク質アンフォールディング領域間の凝集を考慮するように修正することによって得ることができる。
【０１０８】
【数１５】
【０１０９】
式１５で、Ｕ（Ｔ）は、アンフォールディング曲線、Ａ（Ｔ）は凝集信号、Ｂ（Ｔ）はバックグラウンドＥＯ放射を表す。アンフォールディング曲線Ｕ（Ｔ）は、低温および高温では実質的に平らであり、Ａ（Ｔ）は、実質的に一定の負の勾配を有し、上で論じたように、Ｂ（Ｔ）は、指数減衰モデルに従うことが観察されている。これらの特性を使用して、バックグラウンド信号Ｂ（Ｔ）を特定し、除去することができる。後に、別のバックグラウンド除去プロセスが図２２に関して説明される。
【０１１０】
このバックグラウンド除去プロセスは、アンフォールディング転移の始点の直ぐ下側の第１の温度ＴＬを特定することを含み、この第１の温度ＴＬでは、凝集曲線がゼロであり、アンフォールディング曲線が平らである。曲線のこの点において、測定される（負の）勾配は全て、バックグラウンドＥＯ放射信号の勾配に帰すことができる（例えばＢ（Ｔ）：Ｆ’（ＴＬ）＝Ｂ’（ＴＬ））。ＴＬの位置は、生の蛍光がもはや一定の指数減衰率を示さない温度を特定するためにＤＮＡ融解に対して使用したのと同じ指数偏差解析を使用して、低温範囲において検出することができる。上で論じた式１１を参照されたい。
【０１１１】
アンフォールディング転移よりも上の温度領域で、第２の温度ＴＲを特定することができる。この領域では、Ａ’（Ｔ）がほぼ一定であり、Ｕ’（Ｔ）＝０であり、Ｂ’（Ｔ）が依然として指数関数である。これらの条件は、Ｕ’’（Ｔ）＝０、Ａ’’（Ｔ）＝０であり、したがってＦ’’（ＴＲ）＝Ｂ’’（ＴＲ）であることを含意する。バックグラウンドＥＯ放射信号の指数モデルの導関数は、下式のように表現することができる。
【０１１２】
【数１６ａ】
【０１１３】
これらの２つの温度値（ＴＲおよびＴＲ）から、式１６のＣおよびａの値を見つけることができる。式１６から、
【数１６ｂ】
であり、除算
【数１６ｃ】
は、例えばニュートンの方法を使用して解くことができる式であるため、Ｃ＝Ｂ’（ＴＬ）＝Ｆ’（ＴＬ）である。Ｃおよびａ、したがってＢ’（Ｔ）を求めた後、そのバックグラウンドモデルを実験的な融解曲線データから差し引いて（式１５参照。Ｕ’（Ｔ）＋Ａ’（Ｔ）＝Ｆ’（Ｔ）−Ｂ’（Ｔ））、バックグラウンド補正された融解曲線の導関数を得ることができる。
【０１１４】
次いで、凝集曲線Ａ（Ｔ）からアンフォールディング曲線Ｕ（Ｔ）を抽出する（例えば上で計算したバックグラウンド補正された融解曲線データから抽出する）ことができる。ある実施形態では、凝集の補正が、抽出されたアンフォールディングと凝集の重ね合わせの導関数を、その高温度範囲側の凝集成分Ａ’（Ｔ）のロジスティックモデルによってフィットさせることを含む。指数バックグラウンドは上で抽出されているため、局所的に一定の（負の）凝集率Ｍをこの範囲で、測定することが可能である。この凝集率Ｍを、ロジスティックモデルの「キャリイング・キャパシティ」として使用することができる。
【０１１５】
【数１７ａ】
【０１１６】
次に、量
【数１７ｂ】
に対して、（上で論じた）指数偏差解析を実行して、パラメータＤおよびｋが一定であるフィッティング範囲を特定することができる。この範囲のＤおよびｋの平均（アベレージ）値をこのフィットに対して使用することができる。その結果得られたモデル凝集曲線を、バックグラウンド補正された曲線から差し引くことができ、その結果、バックグラウンドおよび凝集が補正されたアンフォールディング曲線の導関数が得られる（式１参照。Ｕ’（Ｔ）＝Ｆ’（Ｔ）−Ｂ’（Ｔ）−Ａ’（Ｔ））。このバックグラウンドおよび凝集導関数曲線Ｕ’（Ｔ）を積分して、バックグラウンドおよび凝集が補正された融解曲線を得ることができる。
【０１１７】
代替手法では、抽出された曲線の上肩部まで、および／または上肩部を含む温度（ＴＳとして示される）では凝集の影響を無視することができる仮定の下で、低温度範囲側のロジスティックモデルによる、抽出されたアンフォールディングと凝集の重ね合わせが実現される。ＴＳ温度は、Ｕ（Ｔ）＋Ａ（Ｔ）の２次導関数が最もネガティブであり（例えばｍｉｎ｛Ｕ’’（Ｔ）＋Ａ’’（Ｔ）｝）、そのためＵ’’’（ＴＳ）＝０である点として特定することができる。導関数重ね合わせＵ（Ｔ）＋Ａ（Ｔ）は抽出されている（例えばバックグラウンドＥＯ放射信号Ｂ’（Ｔ）の導関数は除去されている）ため、その１次導関数が最もネガティブである温度ＴＳを見つける。
【０１１８】
このロジスティックモデルのパラメータは、以下のように表すことができる。
【０１１９】
【数１８】
【０１２０】
式１８のパラメータは、Ｕ’’’（ＴＳ）＝０であることによって求めることができ、Ｕ（ＴＳ）およびＵ’（ＴＳ）の値は以下のとおりである。
【０１２１】
【数１９】
【０１２２】
凝集信号Ａ（Ｔ）はＴＳよりも低い範囲では無視することができるため、（上で論じた）バックグラウンド除去の後に導関数曲線を評価して、Ｕ’（ＴＳ）＝Ｆ’（ＴＳ）―Ｂ’（ＴＳ）を見つける。前述のとおり、Ｕ’（Ｔ）を積分して、バックグラウンドおよび凝集が補正された融解曲線（アンフォールディング信号Ｕ（Ｔ）だけを含む融解曲線）を得ることができる。任意選択で、得られたアンフォールディング曲線Ｕ（Ｔ）およびその導関数Ｕ’（Ｔ）を、再スケーリングＵ（Ｔ）＝１００（Ｕ（Ｔ））／ｍａｘ｛Ｕ（Ｔ）｝によって百分率範囲０〜１００に正規化することができる。
【０１２３】
図１３は、前述の方法（例えば式１５〜１９）を使用して図１２Ａのタンパク質融解曲線から得た正規化された融解曲線データを示す。したがって、図１３のプロットは、図１２Ａの融解曲線データのアンフォールディング成分（Ｕ（Ｔ））を示す。
【０１２４】
図１４Ａは、別の一組の実験タンパク質融解曲線を示す。図１４Ａに示す融解曲線データは、精製ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から市販されている）の段階２倍希釈を示している。精製ＩｇＧは、最初にＰＢＳに対して透析し、次いで、１０μＭの１−アニリノ−８−ナフタリンスルホナート（シグマ・アルドリッチ（登録商標）から市販されている）の存在下で、１２ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌおよび０．３７ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで段階希釈した。４００ｎｍでのＵＶ励起用に変更したＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ（登録商標）（アイダホ・テクノロジー社から市販されている）上で、１０μｌの体積を解析し、融解曲線を１℃／分で集めた。次いで、融解曲線データを前述のとおりに平滑化した。
【０１２５】
図１４Ｂは、図１４Ａの実験的な融解曲線データのプロットを示す。導関数は中心差分技法を使用して近似した。
【０１２６】
図１４Ｃは、図１４Ａの融解曲線データの偏差関数Ｅ（Ｔ）のプロットを示す。図１４Ｃの例では、式１３の２次多項式を使用してバックグラウンド蛍光信号をモデル化し、窓の幅は３０データ点に設定した。偏差関数は、それぞれのフィットの２次項に乗じる定数（式１３のａｉ）から形成した。
【０１２７】
図１４Ｄは、図１４Ａ〜１４Ｃのバックグラウンド補正された融解曲線の導関数プロットを示す。このバックグラウンド補正された融解曲線データは、バックグラウンド除去カーソル位置を８０．０度および９８度に手動でセットすることによって得た（全試料について、これらのカーソル位置はともに、融解特徴よりも上のバックグラウンド領域内に位置する）。融解曲線ごとに、カーソル位置内で、平滑化された融解曲線データに２次多項式を（最小２乗技法を使用して）フィットさせた。平滑化された実験的な融解曲線データからバックグラウンド蛍光信号のモデルを差し引くことによって、バックグラウンド補正された融解曲線を形成した。次いで、バックグラウンド補正された融解曲線を正規化した。バックグラウンド補正され、正規化された曲線の導関数は、中心差分技法を使用して近似した。図１２Ｄおよび１４Ｄは、手動バックグラウンド補正技法を示しているが、図１８〜２１および式２０〜２７に関して後述するように、本開示の教示を使用して、バックグラウンド補正された融解曲線データを自動的に計算することもできる。
【０１２８】
図１５は、前述の方法（例えば式１５〜１９）を使用して得た、図１４Ａのタンパク質融解曲線の正規化された導関数アンフォールディング曲線データを示す。したがって、図１５のプロットは、図１４Ａの融解曲線データのアンフォールディング成分（Ｕ（Ｔ））を示す。
【０１２９】
図１６は、ネガティブ試料を特定する方法１６００の一実施形態を示す。本明細書で使用するとき、ネガティブ試料は、有効な融解転移領域を含まない実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を指すことがある。一組の融解曲線は、結果を検証する役目を果たす１つまたは複数のネガティブコントロール試料を含むことがある。あるいは、またはこれに加えて、ネガティブ試料は、融解曲線実験を実行する際のエラー、ＰＣＲ処理におけるエラー、融解曲線を構成する生の蛍光値を測定する際のエラー、特定の実験で使用した結合染料に関係したエラー、核酸生成物の不在、などによって生じる可能性がある。検証目的で、および／または処理時間を短縮するために、および／または無効データを処理することによって生じる他の問題を回避するために、ネガティブ試料を検出することが望ましいことがある。
【０１３０】
ステップ１６１０で、方法１６００を初期化する。この初期化は、上で論じたように、方法１６００を構成する１つまたは複数のコンピュータ可読命令をロードすること、１つまたは複数のハードウェアコンポーネントにアクセスすることなどを含むことができる。
【０１３１】
ステップ１６２０で、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）にアクセスする。
【０１３２】
ステップ１６３０で、その実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を使用して、偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成する。偏差関数Ｅ（Ｔ）は、前述の式９〜１４および／または図３の方法３００に従って生成することができる。したがって、方法３００を使用して生成された偏差関数Ｅ（Ｔ）にアクセスするように方法１６００を構成することができ、および／または、方法１６００は、方法３００の１つもしくは複数のステップを含むことができる。
【０１３３】
ステップ１６４０で、偏差関数Ｅ（Ｔ）を解析して、偏差関数Ｅ（Ｔ）が有効な融解転移領域を含むかどうかを判定する。上で論じたように、この偏差関数Ｅ（Ｔ）は、その実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）がバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）のモデルから外れる程度を（例えば対応するそれぞれの指数減衰因子間の偏差に換算して）定量化することができる。Ｆ（Ｔ）がバックグラウンドモデルに一致する（例えばバックグラウンド領域内の）温度領域では偏差関数Ｅ（Ｔ）が小さく、融解領域では偏差関数Ｅ（Ｔ）が増大する。したがって、偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用して、その実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）のどの部分が融解転移領域に対応し、どの部分がバックグラウンドであるのかを特定することができる。この判定は、偏差曲線Ｅ（Ｔ）をしきい値と比較することを含むことができる。このしきい値は、しきい値よりも小さな偏差値がバックグラウンド領域を示し、しきい値よりも大きな偏差値が融解領域を示すように設定することができる。偏差しきい値の一例を図１９に関して後に示す。ある実施形態では、このしきい値を、偏差関数Ｅ（Ｔ）のピークと偏差関数Ｅ（Ｔ）の平均（アベレージ）の比として計算する。あるいは、またはこれに加えて、このしきい値を、一組の融解曲線の解析（例えば偏差関数Ｅ（Ｔ）の平均（アベレージ）ピークの比）から導き出すこともできる。例えば、一組の融解曲線の偏差関数Ｅ（Ｔ）の平均（ミーン）μおよび標準偏差σを計算する。ある特定の量（例えば標準偏差σの２倍）を超えてそのグループとは異なる曲線をその解析から外す。残りの融解曲線Ｆ（Ｔ）を使用して、「平均（アベレージ）最大」を計算する。この平均最大が、（例えばこの最大値の１／ｅ、１／３または他の比率などとして）バックグラウンド領域／融解領域しきい値の基礎をなす。
【０１３４】
ステップ１６４０で、その実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）が有効な融解転移領域を含まない（例えば全てのＴの値について実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）がしきい値よりも小さい）ことを、偏差関数Ｅ（Ｔ）の解析が示している場合、フローはステップ１６５０へ続き、そうでなければ、ステップ１６６０へ続く。
【０１３５】
ステップ１６５０で、その実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）をネガティブ試料としてマークする。ステップ１６５０は、処理対象の一組の融解曲線からその融解曲線を除くこと、および／またはその実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）に「無効」試料ないし「ネガティブ」試料のフラグを立てることを含むことができる。ある実施形態では、その一組の実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）が、１つまたは複数の既知の「ネガティブコントロール」を含む。それらのネガティブコントロールは、ネガティブ試料であることを示す特性を示すように構成された実験的な融解曲線とすることができ、そのため、それらのネガティブコントロールを使用して結果を検証することができる。したがって、ステップ１６５０は、ネガティブ試料の識別子を既知の「ネガティブコントロール」のリストと比較して、そのネガティブ試料が「ネガティブコントロール」であるかどうかを判定することを含むことできる。
【０１３６】
ある実施形態では、ステップ１６６０で、その実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を「有効な」融解曲線としてマークする。別の実施形態では、ステップ１６６０のマーク付けを実行しない（例えば、その一組の融解曲線の中に残っており、および／または「無効」とマークされていない一切の実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を有効とみなす）。
【０１３７】
図１７は、ネガティブ試料を検出する方法１７００の代替実施形態を示す。ステップ１７１０、１７２０および１７３０で、ステップ１６１０〜１６３０に関して上で説明したとおりに、方法１７００を初期化し、融解曲線データにアクセスし、偏差関数を計算する。
【０１３８】
ステップ１７３２で、温度領域［ＴＭＩＮ，ＴＭＡＸ−Ｗ］内の偏差関数Ｅ（Ｔ）の絶対値の最小値（ｍｉｎＥ）を求める。範囲［ＴＭＩＮ，ＴＭＡＸ−Ｗ］内の全てのＴの値について、この最小値ｍｉｎＥをＥ（Ｔ）から差し引いて、Ｅｍ（Ｔ）を得ることができる。
【０１３９】
【数２０】
【０１４０】
ステップ１７３４で、この変更された偏差関数Ｅｍ（Ｔ）の最大値ｍａｘＥおよび平均（アベレージ）値または平均（ミーン）値μＥを計算する。
【０１４１】
ステップ１７３６で、変更された偏差関数Ｅｍ（Ｔ）の最大値ｍａｘＥと平均（アベレージ）値または平均（ミーン）値μＥの比ＲＥを計算する。
【０１４２】
【数２１ａ】
【０１４３】
ステップ１７４０で、方法１７００は、比ＲＥを使用して、その曲線がネガティブ試料であるかどうかを判定する。ある実施形態では、ステップ１７４０が、ステップ１７３６で計算した比ＲＥをしきい値と比較することを含む。このしきい値は、方法１７００のユーザが定義してもよく、および／または所定の値としてもよい。例えば、自動高分解能融解曲線解析では、このしきい値を５とすることができる。このしきい値よりも小さい比ＲＥは、融解領域が存在しないこと、そのためその融解曲線Ｆ（Ｔ）がネガティブ試料であることを示し、その場合、フローはステップ１７５０へ続き、そうでなければ、ステップ１７６０へ続く。ステップ１７５０では、ステップ１６５０に関して上で説明したとおりに、融解曲線Ｆ（Ｔ）を無効試料ないしネガティブ試料としてマークする。ステップ１７６０では、ステップ１６６０に関して上で説明したとおりに、融解曲線Ｆ（Ｔ）を有効な試料としてマークする。
【０１４４】
図１８は、偏差解析を使用して融解曲線のバックグラウンド領域および／または融解領域を自動的に特定する方法１８００の一実施形態を示す。後に論じるように、方法１８００を使用して特定した温度領域を使用して、自動バックグラウンド差引きプロセスを提供すること、および／または融解曲線データを表示し、もしくは融解曲線データの他の処理を実行することができる。
【０１４５】
ステップ１８１０で、方法１８００を初期化する。この初期化は、上で論じたように、方法１８００に必要な資源を割り当て、および／または方法１８００に必要な資源を初期化すること、コンピュータ可読記憶媒体から１つまたは複数の命令および／または別個のソフトウェアモジュールをロードすること、ハードウェアコンポーネントにアクセスすることなどを含むことができる。
【０１４６】
ステップ１８２０で、方法１８００は、一組の生の蛍光測定値を温度の関数として含む実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）にアクセスする。この実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）は、バックグラウンド蛍光成分Ｂ（Ｔ）を含むことがあり、そのため、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）と「真の」融解曲線蛍光Ｍ（Ｔ）の和としてモデル化することができる。上で論じた式１を参照されたい。ある実施形態では、ステップ１８２０のアクセスすることがさらに、正規化された実験的な融解曲線
【数２１ｂ】
にアクセスし、および／またはこの正規化された実験的な融解曲線を計算することを含む。
【０１４７】
ステップ１８３０で、偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成する。この偏差関数は、前述の方法３００を使用して生成することができる。したがって、ステップ１８３０は、外部プロセス（例えば方法３００）によって生成された偏差関数Ｅ（Ｔ）にアクセスすることを含むことができ、および／または方法３００において開示した１つもしくは複数のステップを含むことができる。
【０１４８】
ステップ１８４０で、この偏差関数を使用して、正規化カーソルの探索領域、および、拡張により、その融解曲線Ｆ（Ｔ）内の融解転移を特定する。上で論じたとおり、この探索領域は、融解転移領域を間に挟む融解曲線Ｆ（Ｔ）のバックグラウンド領域（例えば融解転移の前の低位バックグラウンド領域および融解転移の後の高位バックグラウンド領域）を含むことができる。したがって、ステップ１８４０の特定することは、低位探索領域Ｔｌｏｗおよび高位探索領域Ｔｈｉｇｈを特定することを含むことができる。低位探索領域Ｔｌｏｗおよび高位探索領域Ｔｈｉｇｈを特定することによって、拡張により、それらの探索領域間の融解転移領域（例えば低位領域Ｔｌｏｗと高位領域Ｔｈｉｇｈの間の温度領域）を特定することができる。
【０１４９】
ステップ１８３０で生成した偏差関数を使用して、関心の温度領域（例えば低位バックグラウンド領域、高位バックグラウンド領域、および／またはそれらのバックグラウンド領域間の融解領域）を特定することができる。これらの温度領域を特定することは、ステップ１８３０の偏差関数Ｅ（Ｔ）を１つまたは複数のしきい値と比較することを含むことができる。前述のとおり、偏差の大きい領域は融解領域を示すことがあり、偏差の小さい領域は、バックグラウンド領域を示すことがある。したがって、ステップ１８３０の特定することは、偏差関数Ｅ（Ｔ）を１つまたは複数のしきい値と比較すること、偏差関数Ｅ（Ｔ）の平均（アベレージ）、および／または偏差関数Ｅ（Ｔ）のピークと平均（ミーン）もしくは平均（アベレージ）の比を計算することなどを含むことができる。
【０１５０】
方法１８００は、単一の融解転移を間に挟む単一の温度領域対（Ｔｌｏｗ、Ｔｈｉｇｈ）の特定を論じているが、当業者は、融解曲線データ内の融解転移の数に応じた任意の数の温度領域（Ｔｌｏｗ、Ｔｈｉｇｈ）を特定するように、方法１８００を適合させることができることを理解するであろう。後に、複数の融解領域を特定する方法２０００の一例を、図２０に関して説明する。したがって、融解曲線内の特定の数の探索領域および／または融解転移を特定することに、本開示が限定されると解釈すべきではない。
【０１５１】
図１９は、例示的ないくつかの偏差関数の偏差プロットの一例を示す。図１９の例では、単一の融解転移１９２０が示されている。したがって、ステップ１８４０では、２つの温度領域（Ｔｌｏｗ１９３０およびＴｈｉｇｈ１９３２）を特定する。別の実験的な融解曲線は、追加の融解転移領域を含むことがある（例えばｎ個の融解転移領域を含むことがある）。したがって、ステップ１８４０の特定は、融解曲線内のｎ個のバックグラウンド温度領域（例えばＴｌｏｗ＿１およびＴｈｉｇｈ＿１、Ｔｌｏｗ＿２およびＴｈｉｇｈ＿２、．．．、Ｔｌｏｗ＿ｎおよびＴｈｉｇｈ＿ｎ）を特定することを含むことがある。各融解転移領域は、それぞれが異なる遺伝子型に対応する複数の融解パターン、例えば１９１２、１９１４および１９１６を含むことがある。しかしながら、それぞれの融解領域の外側において、それらの異なる遺伝子型の融解曲線は類似している。このことは、複数の曲線に対して、（両側にバックグラウンドを有する）１つの融解領域を定義することを可能にする。融解解析は複数の曲線を比較するため、曲線ごとに個別の領域を使用するよりも、これらの集合（アグリゲート）領域を使用した方がしばしば有利である。
【０１５２】
温度領域Ｔｌｏｗ１９３０およびＴｈｉｇｈ１９３２は、とりわけステップ１８３０の偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用して選択することができる。実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の温度範囲［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ］または［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ−Ｗ］内で、融解曲線の偏差関数Ｅ（Ｔ）を、１つまたは複数の偏差しきい値と比較することができる。図１９の例では、偏差関数Ｅ（Ｔ）がしきい値１９１０よりも小さい温度領域を、バックグラウンド領域１９３０および１９３２として特定し、偏差関数Ｅ（Ｔ）がしきい値１９１０よりも大きい領域を融解領域１９２０として特定する。
【０１５３】
しきい値１９１０は予め決めておくことができる。あるいは、またはこれに加えて、複数の実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の偏差関数Ｅ（Ｔ）を平均することによって、および／または偏差関数Ｅ（Ｔ）のピーク値を使用することによって、しきい値１９１０を計算することもできる。この平均算出および／または比の計算は、異常値の棄却および／または他の統計的技法（例えば上で論じたネガティブ試料の特定）を含むことができる。例えば、一組の融解曲線の偏差関数Ｅ（Ｔ）の平均（ミーン）μおよび標準偏差σを計算する。ある特定の量（例えば標準偏差σの２倍）を超えてそのグループとは異なる曲線をその解析から外す。残りの融解曲線Ｆ（Ｔ）を使用して、「平均（アベレージ）最大」を計算する。この平均最大が、（例えばこの最大値の１／ｅ、１／３または他の比率などとして）しきい値１９１０の基礎をなす。
【０１５４】
図１９は、例示的な３つの偏差関数Ｅ（Ｔ）１９１２、１９１４および１９１６を示している。融解領域１９２０は、偏差関数Ｅ（Ｔ）１９１２、１９１４および／または１９１６が偏差しきい値１９１０よりも大きい領域として示されている。下側バックグラウンド領域１９３０は、偏差関数Ｅ（Ｔ）１９１２、１９１４および／または１９１６が偏差しきい値１９１０よりも小さい温度領域を含む。
【０１５５】
図１８に戻ると、ステップ１８８０で、ステップ１８４０で特定した温度領域（１つまたは複数）を、表示および／または追加の処理に対して使用可能にする。前述のとおり、ステップ１８８０は、特定した温度領域（１つまたは複数）をコンピュータ可読記憶媒体上に記憶すること、それらの領域をＨＭＩ上に表示する（例えば融解曲線データの表示にそれらの領域を上重ねする）こと、それらの領域を使用して、融解曲線データの一部を表示する（例えば融解曲線データの融解領域だけを表示する）こと、外部システムおよび／または外部プロセス（例えば指数バックグラウンド除去プロセス）にデータを送信することなどを含むことができる。
【０１５６】
図２０は、融解曲線内のバックグラウンド領域および／または融解転移領域を自動的に特定する方法２０００の他の実施形態の流れ図である。複数の融解領域、すなわちアンプリコン融解領域およびプローブ融解領域を含む融解曲線内の融解領域を特定するように、図２０の方法２０００を適合させることができる。後に論じるように、この例示的な実施態様では、アンプリコン融解領域の方がプローブ融解領域よりも際立つことがある。（例えばアンプリコン融解領域およびプローブ融解領域を含む）このタイプの融解曲線の解析は、突然変異スキャニングとジェノタイピングの同時実施を可能にすることがある。しかしながら、方法２０００の教示を、異なる融解領域セットを含む別の融解曲線に適用することもできる。したがって、この点に関して方法２０００が限定されると解釈すべきではない。
【０１５７】
上で論じたように、方法２０００が処理する融解曲線は、２つの融解領域（例えばアンプリコン融解領域およびプローブ融解領域）を含むことができる。このような融解曲線の偏差関数プロットの一例を図２１Ａに示す。別個の４つの温度値、すなわちアンプリコン融解領域を間に挟む低位アンプリコン温度値ＴＡ，Ｌおよび高位アンプリコン温度値ＴＡ，Ｈ、ならびにプローブ融解領域を間に挟む低位プローブ温度値ＴＰ，Ｌおよび高位プローブ温度値ＴＰ，Ｈを自動的に特定するように、方法２０００を構成することができる。これらの温度値は、ＴＰ，Ｌ＜ＴＰ，Ｈ＜ＴＡ，Ｌ＜ＴＡ，Ｈとなるように特定される。
【０１５８】
ステップ２０１０および２０２０で、前述のとおりに、方法２０００を初期化し、融解曲線データにアクセスする。
【０１５９】
ステップ２０３０で、融解曲線データの偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成する。この偏差関数Ｅ（Ｔ）は、方法３００を使用することによって、および／または方法３００の１つまたは複数のステップを組み込むことによって生成することができる。
【０１６０】
ステップ２０３２および２０３４で、温度範囲［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ−Ｗ（温度窓の幅）］内の偏差関数Ｅ（Ｔ）の絶対値の最小値ｍｉｎＥを求める。［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ−Ｗ］内の全てのＴの値について、この最小値ｍｉｎＥをＥ（Ｔ）から差し引いて、Ｅｍ（Ｔ）を得ることができる（Ｅｍ（Ｔ）＝｜ＥＴ（Ｔ）｜−ｍｉｎＥ）。図１７のステップ１７３２〜１７３４に関して上で説明したように、Ｅｍ（Ｔ）の最大値ｍａｘＥを求めることができる。
【０１６１】
ステップ２０４０で、第１の温度セットを求める。この第１の温度カーソルセットは、アンプリコン融解領域を間に挟む低位アンプリコンカーソルＴＡ，Ｌおよび高位アンプリコンカーソルＴＡ，Ｈを含むことができる。低位アンプリコンカーソルＴＡ，Ｌは、偏差関数Ｅｍ（Ｔ）の絶対値がある特定の値以上である（Ｅｍ（Ｔ）の温度範囲内の）最も小さいＴの値とすることができる。ある実施形態では、この値が、スケーリングファクタ（例えば１／ｅ、１／３または他のスケーリングファクタ）によってスケーリングされたｍａｘＥである。したがって、温度ＴＡ，Ｌは、式２２を満たす最も低い温度Ｔとして特定することができる。
【０１６２】
【数２２】
【０１６３】
このようにしてＴＡ，Ｌを特定した一例が図２１Ａに示されており、図２１Ａには、ＴＡ，Ｌ２１２４が示されている。
【０１６４】
高位アンプリコン温度値ＴＡ，Ｈは、偏差関数Ｅｍ（Ｔ）の絶対値がある特定の値（例えば１／ｅなどの定数によってスケーリングされたｍａｘＥ）以上である（Ｅｍ（Ｔ）の温度範囲内の）最も大きなＴの値として特定することができる。
【０１６５】
【数２３】
【０１６６】
このようにしてＴＡ，Ｈを特定した一例が図２１Ａに示されており、図２１Ａには、ＴＡ，Ｈ２１２６が示されている。
【０１６７】
ある実施形態では、ステップ２０５０で、ステップ２０４０で特定した第１の温度セットＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈを変更する。値ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈの外側の温度値を使用することによって、この解析を改善することができる。したがって、緩衝定数ＢＡ，ＬおよびＢＡ，Ｈを使用して、温度ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈの両側に、対応するそれぞれのバッファ値ＢＡ，ＬおよびＢＡ，Ｈを含めることができる。緩衝定数ＢＡ，ＬおよびＢＡ，Ｈの値は経験的に求めることができる。これらの緩衝定数は、融解曲線データ内の関心の特徴サイズ（例えば１℃）に近くなるように選択することができる。したがって、これらの温度位置をそれぞれ、ＴＡ，Ｌ−ＢＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈ＋ＢＡ，Ｈになるように変更することができる。図２１Ａを参照されたい。さらに、図２１Ａおよび２１Ｂに示すように、値ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈの両側にＷパラメータを加えることによって、値ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈに基づくバックグラウンド温度領域を定義することができる。
【０１６８】
後に論じるように、温度値ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈ、ならびに／もしくはこれらの温度値によって定義された温度領域を使用して、バックグラウンド領域および／または融解領域を特定し、または指数バックグラウンド差引きプロセスを自動化することができ（例えば、これらの温度を使用して、バックグラウンド蛍光の指数モデルを式２〜６に従って構築することができ）、あるいは、これらの温度値ならびに／もしくは温度領域を、クラスタリング操作またはスキャニング操作で使用することなどができる。
【０１６９】
ステップ２０６０で、Ｅｍ（Ｔ）内のプローブ温度領域を特定する。この温度領域は、第１の温度セットの低位温度（ＴＡ，Ｌ）よりも低い温度範囲を含むことがある。ある実施形態では、この温度領域が、ＴＡ，Ｌ、バッファ値、および／または偏差関数Ｅ（Ｔ）の温度窓ＴＷの幅よりも低い（例えばＥｍ（Ｔ）の全てのＴについてＴＡ，Ｌ−ＢＡ，Ｌ−Ｗよりも低い）。この温度領域は、第２の融解領域（プローブ融解領域）を含み、アンプリコン融解領域を含まない。図２１Ｂを参照されたい。図２１Ａに示すように、プローブ融解領域は、（Ｅｍ（Ｔ）によって定量化される）アンプリコン融解領域ほど際立ってはいない。この理由から、第２の温度セット（例えばプローブ温度ＴＰ，ＬおよびＴＰ，Ｈ）は、第１の温度セット（ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈ）の後に、Ｅ（Ｔ）のサブセットを使用して特定することができる。しかしながら、他の実施形態および／または他のタイプの融解曲線では、これが当てはまらないこともある。したがって、本開示が、温度セットの特定の順序および／または数に限定されると解釈すべきではない。
【０１７０】
ステップ２０６２で、ステップ２０６０で特定した領域内におけるＥ（Ｔ）の最小値ｍｉｎＥを求める。上で論じたステップ２０３２を参照されたい。ｍｉｎＥを使用して、その温度領域内においてＥｍ２（Ｔ）を生成することができる（ステップ２０３２〜２０５０で論じたＥｍ（Ｔ）から区別するため、本明細書ではＥｍ２（Ｔ）と呼ぶ）。
【０１７１】
ステップ２０６４で、Ｅｍ２（Ｔ）の最大値ｍａｘＥ２を求める。上で論じたステップ２０３４を参照されたい。図２１Ａおよび２１Ｂの点２１４２も参照されたい。
【０１７２】
ステップ２０７０で、ステップ２０６４で求めた最大値ｍａｘＥ２を使用して、第２の温度セットを特定する。第２の温度セットの低位温度値ＴＰ，Ｌは、Ｅｍ２（Ｔ）の値が、定数（例えば１／ｅ）によってスケーリングされたｍａｘＥ２よりも大きい温度領域内の最も低い温度とすることができる。図２１ＢのＴＰ，Ｌ２１５４を参照されたい。第２の温度セットの高位温度値ＴＰ，Ｈは、Ｅｍ２（Ｔ）の値が、定数（例えば１／ｅ）によってスケーリングされたｍａｘＥ２以上である温度領域内の最も高い温度とすることができる。図２１ＢのＴＰ，Ｈ２１５６を参照されたい。
【０１７３】
ステップ２０８０で、対応するそれぞれの緩衝定数および／または偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成するために使用した温度窓の幅Ｗを使用して、第２の温度セットＴＰ，ＬおよびＴＰ，Ｈを変更する。上で論じたステップ２０５０を参照されたい。図２１Ｂの点２１６４および２１６６も参照されたい。
【０１７４】
ステップ２０９０で、第１および第２の温度セットを、表示、および／または１つもしくは複数の外部プロセスでの使用に対して使用可能にする。ある実施形態では、後に論じるように、これらの温度セットを使用して、指数バックグラウンド差引きプロセスを自動化する。例えば、第１の温度セット（ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈ）を使用して、アンプリコン融解領域のバックグラウンドを差し引くことができ、第２の温度セット（ＴＰ，ＬおよびＴＰ，Ｈ）を使用して、プローブ融解領域のバックグラウンド蛍光を差し引くことができる。上で論じた式１〜６を参照されたい。あるいは、またはこれに加えて、これらの温度値セットを使用して、アンプリコン融解領域および／またはプローブ融解領域の表示および／または処理（例えば、対応するそれぞれの融解領域（１つまたは複数）のスケーリングされ、および／またはズームされた図を自動的に表示すること、関連領域（１つまたは複数）内のクラスタリングを自動化することなど）を提供することができる。
【０１７５】
図２１Ａおよび２１Ｂは、アンプリコン融解領域およびプローブ融解領域を含む融解曲線を使用して生成した例示的な偏差関数Ｅｍ（Ｔ）２１１０のプロットである。
【０１７６】
図２１Ａは、前述の方法２０００のステップ２０３０〜２０５０の操作を示す。例えば、２１１２は、Ｅｍ（Ｔ）の最大値ｍａｘＥを示し、２１１４は、スケーリングファクタ（１／ｅ）によってスケーリングされた最大値ｍａｘＥ、２１２４は、Ｅｍ（Ｔ）がｍａｘＥ／ｅ以上である最も低い温度ＴＡ，Ｌ、２１２６は、Ｅｍ（Ｔ）がｍａｘＥ／ｅ以上である最も高い温度ＴＡ，Ｈである。図２１Ａに示すように、対応するそれぞれの緩衝定数２１３４および２１３６ならびに／または温度窓の幅Ｗによって、温度値ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈを変更することができる。
【０１７７】
図２１Ｂは、前述の方法２０００のステップ２０６０〜２０８０の操作を示す。プロット２１４０はプローブ融解領域を含み、このプローブ融解領域は、Ｅｍ（Ｔ）の温度範囲のサブセット（例えばＴＡ，Ｌ−ＢＡ，Ｌ−Ｗよりも低い温度範囲）を含むことができる。関数Ｅｍ２（Ｔ）は、プローブ融解領域（例えばステップ２０５０で特定した温度範囲）内の全てのＥ（Ｔ）値について、偏差関数の絶対値の最小値ｍｉｎＥを差し引くことによって生成する。Ｅｍ２（Ｔ）２１４２の最大値ｍａｘＥ２を使用して、温度値ＴＰ，Ｌ２１５４およびＴＰ，Ｈ２１５６を特定することができる。低位プローブ温度ＴＰ，Ｌ２１５４は、Ｅｍ２（Ｔ）が、スケーリングされた最大値ｍａｘＥ２（ｍａｘＥ２／ｅ）以上である最も低い温度として特定され、高位プローブ温度ＴＰ，Ｈ２１５６は、Ｅｍ２（Ｔ）が、スケーリングされた最大値ｍａｘＥ２（ｍａｘＥ２／ｅ）以上である最も高い温度として特定される。図２１Ｂに示すように、対応するそれぞれの緩衝定数２１６４および２１６６ならびに／または温度窓の幅Ｗを使用して、温度ＴＰ，ＬおよびＴＰ，Ｈを変更することができる。
【０１７８】
上で論じたように、方法２０００で特定した温度値を使用して、実験的な融解曲線からバックグラウンド蛍光信号Ｂ（Ｔ）を差し引くことができる。これは、方法２０００で特定したバックグラウンド温度値（例えばアンプリコン融解領域およびプローブ融解領域を間に挟む温度値）を使用して実行することができる。そのようにして特定した温度値を使用して、指数バックグラウンド信号を式２〜５に従ってモデル化することができる。式６に従って、その指数バックグラウンドのモデルを、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）から差し引くことができる。
【０１７９】
図２１Ｃは、カーソルプローブ領域を特定するプロセスの他の例を示す。偏差関数２１６０は例えばタンパク質融解曲線に対応する。この例示的な偏差関数２１６０は、ベースライン偏差２１６５、融解領域および（カーソルプローブ領域２１７５として示された）バックグラウンド領域を含む。偏差関数２１６０の融解領域は、それぞれが異なるタンパク質に対応する複数の融解パターンを含むことがある。しかしながら、（融解領域（１つまたは複数）の外側の）カーソルプローブ領域２１７５では、異なるタンパク質の融解曲線が類似している。このことは、複数の曲線に対して、１つのバックグラウンド領域（カーソルプローブ領域２１７５）を使用することを可能にする。融解解析は複数の曲線を比較するため、曲線ごとに個別の領域を使用するよりも、集合領域（例えば領域２１７５）を使用した方がしばしば有利である。
【０１８０】
カーソルプローブ領域２１７５は、（図２０のステップ２０４０のとおりに）バックグラウンドカーソル温度Ｔｃ２１７４を選択することによって特定することができる。バックグラウンドカーソル温度Ｔｃ２１７４は、偏差しきい値２１６４よりも大きく、および／または偏差しきい値２１６４に等しい偏差関数２１６０に沿った（温度範囲［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ］または［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ−Ｗ］内の）最も高い温度として特定することができる。この偏差しきい値は、最大値ｍａｘＥ２１６２（または最大値ｍａｘＥ２１６２とベースライン偏差２１６５の間の高さ）と定数（例えばｅ）の比として定義することができる。上式２２および２３を参照されたい。図２１Ｃに示すように、カーソルプローブ領域２１７５は、バックグラウンドカーソル温度Ｔｃ２１７４よりも高く、および／またはバックグラウンドカーソル温度Ｔｃ２１７４に等しい温度を含むと定義することができる。
【０１８１】
上で論じたように、偏差しきい値２１６４の値は、予め決めておくことができ（定数）、および／または偏差関数Ｅ（Ｔ）の最大値ｍａｘＥ２１６２を使用していることができる。あるいは、またはこれに加えて、複数の実験的な融解曲線の偏差関数Ｅ（Ｔ）を平均することによって、しきい値２１６４を計算することもできる。この平均算出および／または比の計算は、異常値の棄却および／または他の統計的技法（例えば上で論じたネガティブ試料の特定）を含むことができる。例えば、一組の融解曲線の偏差関数Ｅ（Ｔ）の平均（ミーン）μおよび標準偏差σを計算する。ある特定の量（例えば標準偏差σの２倍）を超えてそのグループとは異なる曲線をその解析から外す。残りの融解曲線Ｆ（Ｔ）を使用して、「平均（アベレージ）最大」を計算する。この平均最大が、（例えば１／ｅ、１／３または他の比として）しきい値２１６４の基礎をなす。
【０１８２】
方法１８００および／または２０００で特定し、ならびに／または図２１Ａ〜２１Ｃを使用して特定したバックグラウンド温度領域（カーソルプローブ領域）を使用して、バックグラウンド補正プロセスを自動化することができる。図２２は、偏差解析を使用して指数バックグラウンド差引きを自動化する方法２２００の流れ図である。
【０１８３】
ステップ２２１０〜２２３０で、前述のとおりに、方法２２００を初期化し、融解曲線データにアクセスし、この融解曲線データから偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成する。
【０１８４】
ステップ２２４０で、融解曲線データ内のバックグラウンド温度領域を特定する。バックグラウンド温度領域は、図１８の方法１８００を使用して（偏差関数Ｅ（Ｔ）を１つまたは複数のしきい値と比較することによって）特定することができる。あるいは、またはこれに加えて、方法２０００に従って（例えば偏差関数Ｅ（Ｔ）のスケーリングされた最大値を使用して）バックグラウンド領域を特定することもできる。
【０１８５】
ステップ２２５０で、目的関数（Φ）にアクセスする。目的関数Φは、最適化問題（方法２２００の場合には、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）内の指数バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）をモデル化するために使用するカーソル位置の位置設定など）に対する特定の解の望ましさ（デザイラビリティ）を定義することができる。ある実施形態では、ステップ２２５０でアクセスする目的関数Φが、以下の形の関数である。
【０１８６】
【数２４ａ】
【０１８７】
式２４で、ＴＬおよびＴＲは、温度軸に沿った正規化カーソル位置（その曲線の融解領域を間に挟む温度）を表す。式２４の目的関数は、ある種の条件に従うことがある。例えば、正規化カーソル位置ＴＬおよびＴＲの探索空間を、ステップ２２４０で特定した温度領域に限定することができる。
【０１８８】
実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）と理想融解曲線の間の誤差を最小化するように、目的関数Φを構成することができる。図２３Ａは、「理想」融解曲線の例および正規化された実験的な融解曲線
【数２４ｂ】
の一部を示す。図２３Ａに示すように、曲線２３１０および２３１２はともに、低位バックグラウンド領域２３２６、高位バックグラウンド領域２３２８および融解領域２３２５を含む。理想融解曲線２３１０では、融解領域２３２５が、滑らかな単調非増加関数としてモデル化されている。理想融解曲線２３１０と実験的な融解曲線
【数２４ｂ】
２３１２は、バックグラウンド領域２３２６および２３２８では類似しているが、融解領域２３２５では偏差を示す。したがって、理想曲線２３１０と実験曲線２３１２の間の偏差を使用して、（例えば理想曲線２３１０と実験曲線Ｆ（Ｔ）２３１２の指数減衰率を、例えば方法１８００および２０００に関して上で説明したとおりに比較することによって、）バックグラウンド領域２３２６および２３２８を融解領域２３２５から区別することができる。
【０１８９】
領域２３２０内において、曲線２３１０と２３１２は発散する。領域２３２０は、図２３Ｂに拡大図が示されている。面積２３２２は、理想融解曲線２３１０と正規化された融解曲線２３１２の（温度Ｔに沿って積分した）全体差を示す。正規化された融解曲線
【数２４ｂ】
２３１２が、蛍光中間点（正規化後の０．５蛍光）を通る温度をＴ１／２ ２３２４と定義することができる。
【０１９０】
図２３Ａおよび２３Ｂは、単一の融解領域２３２５を含む理想融解曲線および実験的な融解曲線２３１０および２３１２を示しているが、この点に関して本開示は限定されない。当業者には理解されることだが、本開示の教示を、任意の数の融解領域（および対応するバックグラウンド領域）を含むより複雑な融解曲線に適用することもできる。
【０１９１】
ある実施形態では、ステップ２２５０でアクセスする目的関数Φが、Ｔ１／２点２３２４の前に生じる１に対する誤差を最小化し、Ｔ１／２点２３２４の後に生じる０に対する誤差を０に最小化するように構成されている。さらに、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）が、融解転移領域（例えば図２３の領域２３２５）内において、単調に減少する指数関数に一致するように、目的関数Φを構成することができる。
【０１９２】
図２２を再び参照すると、「バックグラウンド」として特定された温度領域内に限って温度カーソル位置を探索するように、ステップ２２５０でアクセスする目的関数Φを構成することができる。低位バックグラウンド領域および高位バックグラウンド領域内への拘束を含むように、目的関数Φを書き直すことができる。
【０１９３】
【数２５】
【０１９４】
上で論じたように、融解転移の前（例えば図２３のＴ１／２点２３２４の前）に生じる１に対する誤差を最小化し、融解転移の後に生じる０に対する誤差を最小化するように、目的関数Φを構成することができる。下式２６の目的関数はそのように構成されている。
【０１９５】
【数２６ａ】
【０１９６】
式２６で使用されるとき、演算子
【数２６ｂ】
（例えば
【数２６ｃ】
に適用されている）は、以下の特性を有する。
【０１９７】
【数２７】
【０１９８】
ステップ２２６０で、方法２２００は、目的関数Φを使用して、最適な正規化カーソル値を特定する。ステップ２２６０の特定は、Ｔｌｏｗ温度領域およびＴｈｉｇｈ温度領域内のさまざまな温度値において、目的関数Φを評価することを含むことができる。ある実施形態では、これらの領域を、所定の数の値（例えばそれぞれの領域内の３０個の離散温度値）に量子化する。目的関数Φを最小化する温度ＴＬおよびＴＲを、最適なカーソル位置として特定することができる。ステップ２２６０の特定は、極小検出、最急降下、勾配降下などを含む当技術分野で知られている任意の最適化技法を含むことができる。
【０１９９】
ステップ２２７０で、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を処理して、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）のバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）成分を除去する。上で論じた式１〜６を参照されたい。ステップ２２７０の除去は、最適な温度値ＴＬおよびＴＲを使用してバックグラウンド蛍光をモデル化することを含むことができる。このモデルを、上で論じた式６に従って融解曲線データから差し引くことができる。
【０２００】
ステップ２２８０で、「真の」融解曲線データＭ（Ｔ）を使用可能にする。これは、上で論じたように、この補正されたデータを表示すること、補正されたデータをコンピュータ可読記憶媒体に記憶すること、補正されたデータを別のプロセッサおよび／またはシステムに送信することなどができるようにすることを含むことができる。
【０２０１】
図２４は、バックグラウンド蛍光補償を自動化する方法２４００の他の実施形態である。方法２４００は、バックグラウンド差引きの結果に対する改善を可能にするために、フィードバックステップおよび評価ステップを含む。
【０２０２】
ステップ２４１０〜２４７０は、方法２２００に関して上で説明したステップ２２１０〜２２７０と同じように実施することができる。
【０２０３】
テップ２４７２で、処理され、および／または正規化された融解曲線データＭ（Ｔ）を使用して、追加の解析を実行する。例えば、この融解曲線データＭ（Ｔ）をＨＭＩ内に表示し、またはジェノタイピング操作、スキャニング操作、クラスタリングプロセス、グルーピングプロセスなどで使用する。
【０２０４】
ステップ２４７２で実行した解析の結果の質（クオリティ）を定量化することができることがある。例えば、ステップ２４７２の解析が、クラスタリング操作またはグルーピング操作を含む場合、クラスタ／グループ間の分離性（セパレーション）を評価して、操作の「質」を決定することができる。したがって、ステップ２４８０で、質メトリックを計算する。この質メトリックを使用して、ステップ２４６０のバックグラウンド除去の質を定量化する（例えば「最適な」カーソルＴＬおよびＴＲの質を定量化する）ことができる。
【０２０５】
式２８は、クラスタリング操作および／またはグルーピング操作の質を定量化する１つの方式を示す。
【０２０６】
【数２８ａ】
【０２０７】
式２８に示すように、質メトリックγは温度の関数である。式２８は、２つのクラスタ／グループの質を、グループ間の分離性およびグループ内の凝集性（コヒージョン）の関数として定量化する（式２８ではこれらのグループがグループ１および２として特定される）。グループ／クラスタの質は、グループ平均（ミーン）値の分離および個々のグループ分散の和によって決定される。低い質メトリックγは、グループ１および２内の大きな偏差、および／またはグループ平均（ミーン）間の小さな分離に起因する。あるいは、グループがタイトにクラスタリングされており（
【数２８ｂ】
および
【数２８ｃ】
の値が小さい）、および／またはグループどうしが広く分離されている（差μ１（Ｔ）−μ２（Ｔ）が大きい）場合、質メトリックγは「良好」となる。
【０２０８】
本明細書では質メトリックの一例を論じるが、当業者は、（ステップ２４７２の解析に関係する任意の一組の因子に応じた）任意の質メトリックを本開示の教示の下で使用することができることを理解するであろう。
【０２０９】
ステップ２４８２で、ステップ２４８０で計算した質メトリックを評価する。この評価は、融解曲線データに対する改良をさらに実行する（例えばステップ２４８４でバックグラウンド除去カーソル位置を変更する）かどうかを判定することができる。したがって、ステップ２４８２は、質メトリックを１つまたは複数のしきい値と比較することを含むことができる。あるいは、またはこれに加えて、ステップ２４８２の判定は、現在の質メトリックを、ステップ２４６０〜２４８０の以前の１回または数回の繰返しで得た質メトリックと比較することを含むこともできる。このメトリックが一貫した改善を示している（例えば改善勾配をたどっている）場合には、改良を続けることが望ましいと判定することができ、（例えば所定の数の繰返しに比べて）質メトリックが低下している場合には、改良を続けても改善が見込めない可能性がある。さらに、この判定は、最大繰返しカウンタまたは他の処理限界を評価することを含むことができる。カーソル位置のさらなる改良を実行すべきと判定された場合、フローはステップ２４８４へ続き、そうでなければ、ステップ２４９０へ続く。
【０２１０】
ステップ２４８４で、正規化カーソル位置を改良する。ステップ２４８４で加える改良は、用途に特化した改良とすることができる（例えば、ステップ２４７２で実行した解析によって定義することができる）。あるいは、またはこれに加えて、この改良は、カーソル位置の１つもしくは複数の所定のシフト、および／またはユーザが選択可能なカーソル位置の１つもしくは複数のシフトを実行することを含むことができる。ある実施形態では、ステップ２４８０で計算した質メトリックがこの改良を決定する。あるいは、またはこれに加えて、カーソル位置ＴＬおよびＴＲに対する改良を、所定のパターンに従って実施することもでき、および／または、カーソル位置ＴＬおよびＴＲに対する改良がランダムな成分を含んでもよい。ステップ２４８４の改良はさらに、改良されたカーソル位置を使用して目的関数Φを評価することを含むことができる。ある変更によって目的関数Φの結果が不良になる場合には、より良好な結果を与える別の変更のために、その変更を破棄することができる。カーソル位置を改良した後、ステップ２４６０〜２４８２のバックグラウンド除去、解析、質メトリック計算および評価を実行することができる。
【０２１１】
ステップ２４９０で、解析結果および／または処理された融解曲線データを使用可能にする。上で論じたように、データを使用可能にすることは、そのデータをＨＭＩ上に表示すること、そのデータをコンピュータ可読記憶媒体に記憶すること、そのデータを他のプロセスおよび／またはシステムに送信することなどを含むことができる。
【０２１２】
低温融解転移または幅広い温度範囲にわたる転移の偏差プロットはしばしば、他の種類のプロットよりも、正確に自動クラスタリングすることが容易であることが分かっている。例えば、Ａ＞Ｃトランスバージョンであるヒト単一塩基多様体ｒｓ＃７２９１７２を、スナップバックプライマを使用して増幅し、その遺伝子型を判定した。スナップバックプライマは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１０９８２３号の主題である。スナップバックプライマに関する追加の情報は、「Ｚｈｏｕ Ｌ．他、Ｓｎａｐｂａｃｋ Ｐｒｉｍｅｒ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ＤＮＡ Ｄｙｅ ａｎｄ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ、５４（１０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１６４８〜５６（２００８年１０月）」に出ている。
【０２１３】
一例では、偏差解析後には異なる遺伝子型が正確にクラスタリングされたが、指数バックグラウンド差引き後には正確にクラスタリングされなかった。以下のプライマを使用して、ヒトゲノムＤＮＡからの１６２ｂｐ生成物を増幅した。
【０２１４】
ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＡＴＴＡＧＣ （配列ＩＤ Ｎｏ．６）、および
【０２１５】
ｇｇＴＣＴＧＣＡＧＡＣＣＧＡＡＴＧＴＡＴＧＣＣＴＡＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＡＧＡ （配列ＩＤ Ｎｏ．７）
【０２１６】
上記配列６および７の下線が引かれた塩基は、ヒトＤＮＡターゲットと相同であり、下線が引かれていない大文字の塩基は、スナップバックプライマのプローブ要素を構成し、太字の塩基は、単一塩基多様体の位置であり、小文字の塩基は、ターゲットにミスマッチされた２塩基オーバハングである。このＰＣＲは、ＬＣ４８０リアルタイム機器（ロシュ・アプライド・サイエンスから市販されている）内で、０．５μＭの制限プライマ、０．０５μＭのスナップバックプライマ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．３、５００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、１Ｘ ＬＣＧｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、および０．０４Ｕ／μｌのＫｌｅｎＴａｑ １ポリメラーゼ（ＡＢ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含む５ｎｇ／ｐｌのヒトゲノムＤＮＡが存在する条件下で、１０μｌの反応体積で実行した。この反応混合物を９５℃に加熱して、２分置き、次いで、９５℃、４．４℃／秒、１０秒保持、５８℃、２．２℃／秒、１０秒保持、７６℃、４．４℃／秒、１５秒保持のサイクルを５０回繰り返した。続いて、４．４℃／秒で９５℃に加熱し、１０秒保持、２．２℃／秒で４２℃に冷却し、１秒保持、０．１℃／秒で９８℃に加熱する融解プロトコルを実行し、１０回／℃の取得率で蛍光をモニタした。
【０２１７】
スナップバックプローブ融解転移の温度区間を、融解曲線の検査によって手動で特定し、２つの方法で処理した。図２５は、上で参照によって本明細書に組み込んだＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０３５８０６号に記載された不偏階層法によって、自動クラスタリングした偏差プロットを示す。
【０２１８】
この例では使用しないが、図２５に示したクラスタリング結果を使用し、質評価技法およびフィードバック技法を使用することによって、バックグラウンド差引きおよび／または温度領域の特定を改良することができる。このような技法を使用して融解曲線解析を改良する方法の一例を、図２４に関して説明した。図２９のステップ２４７０〜２４８２を参照されたい。式２０も参照されたい。例えば、図２５に示したグループ内の凝集性およびグループ間の分離性を定量化するように、式２８の質メトリックを適合させることができる。この質メトリックを評価して、（バックグラウンド差引きおよび／または温度領域の特定に対して使用する）温度領域を、より良好な結果（これは質メトリックによって定量化される）を与えるように改良すべきかどうかを判定することができる。
【０２１９】
このクラスタリングは、異なる遺伝子型を正確に分離し、約６６℃および７４℃にＴｍを有する予想されたホモ接合体およびヘテロ接合体を表示し、６８℃の異なるＴｍのところに予想外のヘテロ接合体を特定する。対照的に、指数バックグラウンド差引きだけによって同じデータを処理し、導関数プロットとして表示した場合には、全く同じ方法による自動クラスタリングでも、予想されたヘテロ接合体の区別に失敗する（図２６）。低温ホモ接合体とヘテロ接合体が一緒にクラスタリングされ、ジェノタイピングが不正確になる。これはおそらく、１つには、遺伝子型内の曲線の分散が大きいことが原因である。
【０２２０】
偏差解析を使用して、（方法１６００および１７００に関して上で説明したように）ネガティブ試料を特定することができる。さらに、偏差解析を使用して、クラスタリングおよびジェノタイピングのためのプローブ解析領域を自動的に求めることもできる。例えば、方法１８００および２０００は、融解曲線データ内の融解領域（１つまたは複数）を、偏差解析を使用して自動的に特定する。
【０２２１】
一例として、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる「Ｚｈｏｕ Ｌ．他、ＣＴ．Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｃａｎｎｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、５１（１０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１７７０〜７７（２００５年１０月）」に記載された方法の後に、非標識プローブを使用したＰＣＲおよび融解解析によって、Ｆ５ライデン単一塩基多様体の遺伝子型を判定した。
【０２２２】
（全体で３つの遺伝子型の）ポジティブ試料とネガティブ（テンプレート無しコントロール）試料とがチェッカー盤の形に散らばるように、９６穴プレート上に試料を置いた。ＰＣＲおよび融解解析の後、５０から９５℃までの未処理の融解曲線にアクセスした。図２７は、そのようにして得た未処理の融解曲線のプロットを示す。
【０２２３】
図２７に示すように、これらの曲線は２つのクラスタに分かれ、ポジティブ試料からなる上側のクラスタは、非標識プローブの融解転移とＰＣＲ生成物の融解転移の両方を含み、ネガティブ試料からなる下側のクラスタは予想された融解転移を示さず、その代わりに、代替生成物の意図しない増幅により、７５℃付近に予想外の転移が存在する。図２８は、（図２７では直線カットオフとして示されている）振幅カットオフ技法を使用して検出した一組の試料インジケータを示す。図２８に示すように、ネガティブ試料はいずれもこの技法を使用して正確に特定されなかった。
【０２２４】
それぞれの融解曲線に対して偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成し、それらの偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用して、ネガティブ試料（例えばテンプレート無しコントロール試料）を自動排除した。図１６および１７に関して上で説明したように、ネガティブ試料の特定を使用して、解析しうる信号を生成しない融解曲線を排除することができる。この例では、図１７の方法１７００に従ってネガティブ試料の特定を実行した。そのため、このネガティブ試料の特定は、区間［ＴＭＩＮ，ＴＭＡＸ−Ｗ］にわたって偏差関数Ｅ（Ｔ）の絶対値の最小ｍｉｎＥを求め、前述のとおりにＥＭ（Ｔ）を計算し（全てのＴ値についてｍｉｎＥを差し引き）、最大値ｍａｘＥおよびＥＭ（Ｔ）の平均（ミーン）または平均（アベレージ）を計算し、最大値ｍａｘＥと平均（ミーン）または平均（アベレージ）の比を計算し、その比をしきい値と比較することを含む。この例ではしきい値を５に設定した。
【０２２５】
図２９は、ネガティブ試料が除去された図２７の一組の融解曲線を示す。図２９に示すように、下側の一組の融解曲線（図２７の下部の部分に見られたネガティブ試料）はもはや、この一組の「有効」融解曲線には含まれていない。図３０は、前述の偏差解析技法を使用して検出したネガティブ試料を含む一組の試料インジケータを示す。図２８（振幅カットオフを使用したネガティブ試料の特定）と比較すると、図３０は、偏位分析の使用が、振幅カットオフ法が特定できなかったネガティブ試料の特定の成功を可能にしたことを示している。偏差解析とネガティブ試料の特定の振幅カットオフ法は、独立した解析であるため、並行して（例えば同時に）実施することができる。
【０２２６】
ネガティブデータの自動排除の後、偏差関数をさらに使用して、ＰＣＲ生成物（アンプリコン）融解領域と、プローブ融解領域と、全ての融解領域を含む全体領域とを特定した。この例では、図２０に関して上で説明したとおりに、４つの別個の温度を特定した：ＴＰ，Ｌ＜ＴＰ，Ｈ＜ＴＡ，Ｌ＜ＴＡ，Ｈ。低い方の温度対は、プローブ融解領域を間に挟みＴＰ，Ｌ＜Ｔ＜ＴＰ，Ｈ、高い方の温度対はアンプリコン融解領域を間に挟むＴＡ，Ｌ＜Ｔ＜ＴＡ，Ｈ。同時突然変異スキャニング／ジェノタイピングのための全体融解領域の自動解析の一例では、これらの４つの温度の中の極端対、すなわちＴＰ，Ｌ＜Ｔ＜ＴＡ，Ｈを使用することができ、そのため、追加の温度を計算する必要がない。
【０２２７】
アンプリコン領域は、ＴＡ，Ｌ＜Ｔ＜ＴＡ，Ｈによって特定されるが、ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈの両側のバッファ値Ｂを使用して、これらの境界の十分に外側で解析を開始した。したがって、解析領域は、ＴＡ，Ｌ−Ｂ＜Ｔ＜ＴＡ，Ｌ＋Ｂになる。図２０のステップ２０５０を参照されたい。
【０２２８】
適当なバッファ値Ｂは、機器特性（雑音、データ密度）および一般に約１℃であるデータから抽出する最小特徴サイズによって求めた。さらに、（指数バックグラウンド差引きなどの）いくつかの解析法は、計算のために両側に温度区間を必要とし、そのため、これらの区間を定義するために、それぞれの緩衝帯の外側に追加の幅（Ｗ）を含めることができる。図２０のステップ２０５０を参照されたい。
【０２２９】
これらの４つのそれぞれのＢおよびＷ値は、同じでもまたは異なっていてもよいことが理解される。複数の融解曲線を一度に解析するときには、平均（アベレージ）区間または最も外側の区間を使用することができる。
【０２３０】
アンプリコンバックグラウンド領域およびアンプリコン融解領域を特定した後、プローブ融解領域を含む温度範囲を求める。上で論じたように、この温度領域は、アンプリコン領域よりも低い［ＴＭＩＮ，ＴＡ，Ｌ−（Ｂ＋Ｗ）］を含む。図２０のステップ２０６０を参照されたい。この温度領域内で、区間［ＴＭＩＮ，ＴＡ，Ｌ−（Ｂ＋Ｗ）］内の｜Ｅ（Ｔ）｜の最小値ｍｉｎＥ２を特定し、区間［ＴＭＩＮ，ＴＡ，Ｌ−（Ｂ＋Ｗ）］にわたって関数ＥＭ２（Ｔ）を構築する（ＥＭ２（Ｔ）＝｜Ｅ（Ｔ）｜−ｍｉｎＰ）。図２０のステップ２０６２を参照されたい。ＥＭ２（Ｔ）の最大値ｍａｘＥ２を求める。図２０のステップ２０６４を参照されたい。
【０２３１】
上で特定したプローブ温度領域を評価して、プローブ融解領域が存在するかどうかを（例えば図１６および１７の方法１６００および１７００に開示したネガティブ試料の特定を使用して）判定した。この例では、対応するそれぞれの偏差プロット上のプローブピークとアンプリコンピークの比が約０．０２よりも小さい場合（ｍａｘＥ２＜ｍａｘＥ／ｅ４の場合）、そのデータ中に自動的に検出可能なプローブ融解はないと判定する。融解曲線データを取得するために使用する機器の分解能によっては、０．０２以外の値を選択することもできることが理解される。
【０２３２】
図１７の方法１７００に従って、プローブ温度値（ＴＰ，ＬおよびＴＰ，Ｈ）を特定した。したがって、温度（ＴＰ，ＬおよびＴＰ，Ｈ）を特定することは、ｍａｘＥ２が上記のしきい値（ｍａｘＥ／ｅ４）よりも大きい場合に、ＴＰ，Ｌを、［ＴＭＩＮ，ＴＡ，Ｌ−（Ｂ＋Ｗ）］内のＥＭ２（Ｔ）＞ｍａｘＥ２／ｅである最も小さなＴとすることを含む。ＴＰ，Ｈは、［ＴＭＩＮ，ＴＡ，Ｌ−（Ｂ＋Ｗ）］内のＥＭ２（Ｔ）＞ｍａｘＥ２／ｅである最も大きなＴである。図２０のステップ２０７０を参照されたい。したがって、ＴＰ，Ｌ＜Ｔ＜およびＴＰ，Ｈの外側では、ＥＭ２（Ｔ）値＞ｍａｘＥ２／ｅであり、これは、この記述が保持する［ＴＭＩＮ，ＴＡ，Ｌ−（Ｂ＋Ｗ）］の最も小さな部分区間である。
【０２３３】
プローブ解析についても、アンプリコン解析と同様に、バッファ値（Ｂ）および幅（Ｗ）区間を使用して、プローブ領域ＴＰ，Ｌ＜Ｔ＜ＴＰ，Ｈを、ＴＰ，Ｌ−Ｂ＜Ｔ＜ＴＰ，Ｈ＋ＢまたはＴＰ，Ｌ−（Ｂ＋Ｗ）＜Ｔ＜ＴＰ，Ｌ＋（Ｂ＋Ｗ）に拡張した。図２０のステップ２０８０を参照されたい。
【０２３４】
図３１は、テンプレート無しコントロールの自動排除、アンプリコン領域およびプローブ領域の自動特定、積分された偏差プロット上で試料が１から０へ変化するようにするプローブ領域偏差データの正規化、自動ジェノタイピングのための曲線のクラスタリング、および積分された偏差プロットとしての（累積偏差の百分率としての）プローブデータの作図の後の、Ｆ５プローブ解析の結果を示す。図３２のプレートマップは、遺伝子型およびネガティブコントロール試料（前述の偏差解析技法を使用して特定したネガティブ試料）の正しいパターンを示している。
【０２３５】
図３３は、融解曲線データを解析するシステム３３００のブロック図である。このシステムは、コンピューティングデバイス３３１０を含み、コンピューティングデバイス３３１０は、１つまたは複数のプロセッサ（図示せず）、メモリ（図示せず）、コンピュータ可読媒体３３１２、１つまたは複数のＨＭＩデバイス３３１４（例えば入出力デバイス、ディスプレイ、プリンタなど）、１つまたは複数の通信インタフェース３３１６（例えばネットワークインタフェース、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）インタフェースなど）などを備えることができる。あるいは、またはこれに加えて、システム３３００は、ローカルクラスタおよび／または分散クラスタ（図示せず）内に、複数のコンピューティングデバイス３３１０を備えることができる。
【０２３６】
コンピューティングデバイス３３１０を、融解曲線データ源３３２０に通信可能に結合することができ、融解曲線データ源３３２０は、融解曲線生成機器（例えばＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＧｍｂＨ．から市販されているＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）デバイス、ＨＲ−１（商標）高分解能融解機器など）を備えることができる。あるいは、またはこれに加えて、データ源３３２０は、融解曲線データを含むコンピュータ可読媒体を備えることができる。
【０２３７】
コンピュータ可読媒体３３１２からコンピュータ可読プログラムコードをロードするように、コンピューティングデバイス３３１０を構成することができる。このプログラムコードは、本明細書に開示したシステムおよび方法（例えば方法３００、１６００、１７００、２０００、２２００、２４００など）またはそれらの変型システムおよび方法のうちの１つまたは複数のシステムまたは方法を実現するプロセッサ実行可能命令またはプロセッサ解釈可能命令を含むことができる。これらの命令は、コンピュータ可読媒体３３１２上の１つまたは複数の別個のソフトウェアモジュールとして具体化することができる。これらのモジュールは、データ源３３２０の融解曲線データにアクセスするように構成されたデータ取得モジュール３３３２、バックグラウンド蛍光のモデルにアクセスするように構成されたモデル化モジュール３３３４、融解曲線データに対して偏差解析を実行する（例えば、とりわけ図３の方法３００に従って偏差関数を生成する）ように構成された解析モジュール３３３６、（ＨＭＩ３３１４を介した）融解曲線データの表示、および／または前述の偏差解析技法を使用した融解曲線データの追加の処理（例えば自動ネガティブ試料の特定、指数バックグラウンド差引き、融解領域の特定、クラスタリングなど）を提供するように構成された処理モジュール３３３８、ならびに人間ユーザ（図示せず）によるシステム３３００の制御、および／または他のコンピューティングデバイスもしくはエージェント（図示せず）などの１つもしくは複数の外部プロセス（図示せず）によるシステム３３００の制御を提供するように構成された制御モジュール３３３９を備えることができる。
【０２３８】
制御モジュール３３３９は、前述のとおりに、融解曲線データを取得し、かつ／もしくは融解曲線データにアクセスし、融解曲線データに対する偏差解析を実行し、および／または解析されたデータを表示するように、システム３３００を導くことを可能にすることができる。例えば、制御モジュール３３３９は、融解曲線データ、クラスタリングの結果、ジェノタイピングの結果、スキャニングの結果などのＨＭＩ３３１４上への表示を提供することができる。したがって、制御モジュール３３３９は、ユーザインタフェース制御をＨＭＩ３３１４上に表示し、および／またはＨＭＩ３３１４からユーザ入力を受け取るように構成されたユーザインタフェース（図示せず）を備えることができる。さらに、１つまたは複数の通信インタフェース３３１６を介してコマンドおよび／または命令を（例えばリモートコンピューティングデバイス、エージェントなどから）受け取るように、制御モジュール３３３９を構成することもできる。制御モジュール３３３９は、自動ネガティブ試料の特定、融解領域の特定、バックグラウンド差引き、表示、クラスタリングおよび他のプロセスを実行するため、ユーザおよび／または外部プロセスからプログラミングコマンドを受け取ることができる。さらに、偏差解析処理の結果をコンピュータ可読媒体３３１２に記憶し、および／または１つまたは複数の通信インタフェース３３１６上でそれらの結果を送信するように、制御モジュール３３３９を構成することもできる。
【０２３９】
ある実施形態では、本明細書に開示した偏差解析技法（例えば方法３００、１６００、１７００、２０００、２２００、２４００またはこれらの方法の変型法）を使用して、ジェノタイピングプロセスおよび／またはスキャニングプロセスを自発的に実行するように、システム３３００が構成される。上で論じたとおり、本明細書に開示した偏差解析技法は、特定の一組の融解曲線解析用途だけに限定されず、本明細書に開示した偏差解析技法を使用して多数の融解曲線解析用途を実現するように、システム３３００を構成することができる。したがって、本開示およびシステム３３００が、特定の一組の融解曲線偏差解析用途に限定されると解釈すべきではない。
【０２４０】
以上の説明では、本明細書に記載した実施形態を完全に理解できるように、多数の具体的な詳細を示した。しかしながら、それらの具体的な詳細のうちの１つもしくは複数の詳細を省くことができ、または、その他の方法、構成要素もしくは材料を使用することができることを、当業者なら理解するであろう。いくつかの場合には、操作を詳細には示さず、または説明しなかった。
【０２４１】
さらに、１つまたは複数の実施形態において、記載した特徴、操作または特性を適当な方法で組み合わせることができる。当業者には明らかなことだが、開示した実施形態に関して説明した方法のステップまたは実行の順序を変更することができることも容易に理解される。したがって、図面または詳細な説明内における順序は、例示だけが目的であり、その順序が必須であると明示されない限り、どの順序も、必須の順序であることを含意するものではない。
【０２４２】
実施形態は、さまざまなステップを含むことがあり、それらのさまざまなステップは、汎用または専用コンピュータ（または他の電子デバイス）によって実行される機械実行可能命令として具体化することができる。それらの機械実行可能命令は、コンピュータ可読記憶媒体上において具体化することができる。ある実施形態では、これらの命令が、１つまたは複数の別個のソフトウェアモジュールとして具体化される。あるいは、１つまたは複数のステップを、それらのステップを実行する特定の論理を含むハードウェアコンポーネントによって、または、ハードウェア、ソフトウェアおよび／またはファームウェアの組合せによって実行することができる。
【０２４３】
実施形態は、本明細書に記載したプロセスを実行するようにコンピュータ（または他の電子デバイス）をプログラムするのに使用することができる命令を記憶したコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品として提供することもできる。このコンピュータ可読媒体には、限定はされないが、ハードドライブ、フロッピーディスケット、光ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、磁気もしくは光学カード、固体メモリデバイス、または電子的な命令を記憶するのに適した他のタイプの媒体／機械可読媒体が含まれる。
【０２４４】
本明細書で使用するとき、ソフトウェアモジュールまたはコンポーネントは、メモリデバイスおよび／またはコンピュータ可読記憶媒体内に位置する任意のタイプのコンピュータ命令またはコンピュータ実行可能コードを含むことができる。ソフトウェアモジュールは例えば、１つまたは複数のタスクを実行し、または特定の抽象データ型を実現するルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などとして編成することができるコンピュータ命令の１つまたは複数の物理または論理ブロックを含むことができる。
【０２４５】
ある種の実施形態では、特定のソフトウェアモジュールが、メモリデバイスの異なる位置に記憶された異種の命令を含み、それらの命令は、協力して、そのモジュールの記載された機能を実現する。そのモジュールは、コンピュータ可読記憶媒体上において具体化し、および／または記憶媒体上の別個のモジュールとして具体化することができる。モジュールは、単一の命令または多くの命令を含むことができ、異なるいくつかのコードセグメントにわたって、異なるプログラムの中に、および／またはいくつかのメモリデバイスにわたって分散させることができる。ある実施形態は、通信ネットワークを介してリンクされたリモート処理デバイスによってタスクが実行される分散コンピューティング環境で実施することができる。分散コンピューティング環境では、ソフトウェアモジュールを、ローカルメモリ記憶デバイスおよび／またはリモートメモリ記憶デバイス内に配置することができる。さらに、データベースレコードとして連結されまたは一緒にされているデータは、同じメモリデバイス内に、またはいくつかのメモリデバイスにわたって常駐していることがあり、ネットワークにわたってデータベース内のあるレコードのフィールド内でリンクされていることがある。
【０２４６】
根底にある本発明の原理から逸脱することなく前述の実施形態の詳細に多くの変更を実施することができることを当業者なら理解するであろう。
【技術分野】
【０００１】
本開示は、融解曲線の解析に関し、具体的には、核酸、タンパク質などの化合物の融解曲線の自動解析システムおよび自動解析法に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は、融解曲線の直線ベースライン解析を示すプロットである。
【図２】図２は、複数の遺伝子型および低温における指数バックグラウンド蛍光を示す、非標識プローブ融解実験の未変更の実験的な融解曲線のプロットである。
【図３】図３は、実験的な融解曲線の偏差関数を生成する方法の一実施形態の流れ図である。
【図４】図４は、ヘアピン構造の例示的な未変更の実験的な融解曲線のプロットを示す図である。
【図５】図５は、図４の融解曲線の導関数プロットを示す図である。
【図６】図６は、指数バックグラウンド差引き後の図４の融解曲線の導関数プロットを示す図である。
【図７】図７は、図４に示したデータの偏差関数のプロットを示す図である。
【図８】図８は、図４に示したデータの指数バックグラウンド差引き後の正規化された融解曲線のプロットを示す図である。
【図９】図９は、図４に示したデータの積分された偏差関数のプロットを示す図である。
【図１０】図１０は、多重ジェノタイピングのための指数バックグラウンド差引き後の融解曲線データの導関数プロットを示す図である。
【図１１】図１１は、図１０に示した融解曲線データの偏差プロットを示す図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、平滑化された例示的なタンパク質融解曲線を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、図１２Ａの平滑化されたタンパク質融解曲線の導関数プロットを示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、図１２Ａのタンパク質融解曲線データの偏差関数プロットを示す図である。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、バックグラウンド補正後の導関数融解曲線を示す図である。
【図１３】図１３は、図１２Ａのタンパク質融解曲線の正規化されたアンフォールディング曲線の導関数プロットを示す図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、平滑化された例示的なタンパク質融解曲線を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、図１４Ａの平滑化されたタンパク質融解曲線の導関数プロットを示す図である。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、図１４Ａのタンパク質融解曲線データの偏差関数プロットを示す図である。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、バックグラウンド補正後の導関数融解曲線を示す図である。
【図１５】図１５は、図１４Ａのタンパク質融解曲線の正規化されたアンフォールディング曲線の導関数プロットを示す図である。
【図１６】図１６は、偏差解析を使用してネガティブ試料を特定する方法の一実施形態の流れ図である。
【図１７】図１７は、偏差解析を使用してネガティブ試料を特定する方法の他の実施形態の流れ図である。
【図１８】図１８は、融解曲線のバックグラウンド領域および／または融解領域を自動的に特定する方法の一実施形態の流れ図である。
【図１９】図１９は、例示的な偏差関数のプロットを示す図である。
【図２０】図２０は、アンプリコンバックグラウンド領域および／またはアンプリコン融解領域ならびにプローブバックグラウンド領域および／またはプローブ融解領域を自動的に特定する方法の一実施形態の流れ図である。
【図２１Ａ】図２１Ａは、アンプリコン融解領域およびプローブ融解領域を含む融解曲線の偏差関数のプロットである。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、プローブ融解領域の偏差関数のプロットである。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、カーソルプローブ領域を特定するプロセスの他の例を示す図である。
【図２２】図２２は、自動バックグラウンド差引き法の一実施形態の流れ図である。
【図２３Ａ】図２３Ａは、例示的な理想曲線および融解曲線を示す図である。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、例示的な理想曲線および融解曲線を示す図である。
【図２４】図２４は、自動バックグラウンド差引き法の他の実施形態の流れ図である。
【図２５】図２５は、不偏階層法によって正確に自動クラスタリングされた偏差プロットを示す図である。
【図２６】図２６は、不偏階層法によって正確にクラスタリングされていない、指数バックグランド除去後の導関数プロットを示す図である。
【図２７】図２７は、ＰＣＲ融解解析後のネガティブ試料を含む一組の未変更の融解曲線を示す図である。
【図２８】図２８は、振幅カットオフ技法を使用したネガティブ試料排除後の一組のネガティブ試料インジケータを示す図である。
【図２９】図２９は、偏差解析を使用したネガティブ試料排除後の一組の融解曲線を示す図である。
【図３０】図３０は、偏差解析を使用したネガティブ試料排除後の一組のネガティブ試料インジケータを示す図である。
【図３１】図３１は、偏差解析によるプローブ融解領域およびアンプリコン融解領域の自動位置設定後の偏差プロットを示す図である。
【図３２】図３２は、一組のネガティブ試料／クラスタメンバシップインジケータを示す図である。
【図３３】図３３は、融解曲線データを解析するシステムのブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
追加の態様および利点は、添付図面を参照して展開される好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【０００６】
融解曲線の解析は、さまざまな物質の研究に役立つ。特に、核酸は、融解曲線によって広範囲に研究されており、融解曲線の差異によりさまざまな核酸配列を示すことができる。融解曲線は、タンパク質の結合の研究でも使用されており、特性融解曲線が、特定のリガンドに対するタンパク質の結合親和性を示す。本明細書では核酸およびタンパク質の融解を参照するが、他の化合物の融解曲線の解析も本開示の範囲に含まれることが理解される。
【０００７】
本明細書の一例では、融解曲線の解析が、核酸生成物の特定および／または構造に関する情報を提供する。核酸構造内の（例えば２本のＤＮＡ鎖間の）塩基−塩基水素結合を切るのに必要なエネルギー量は、その核酸生成物の構造に関連した因子に依存することがある。このような因子には、限定はされないが、長さ、相補性、グアニン−シトシン（ＧＣ）含量量、反復配列の有無などが含まれる。
【０００８】
融解曲線は、核酸生成物を含む溶液にエネルギー勾配を与える（例えば核酸生成物を含む溶液を加熱する）ことによって得ることができる。エネルギーが加えられ、溶液の温度が上昇すると、核酸生成物は変性する（例えば解離する）ことがある。この例は温度の上昇に関するが、当技術分野では、他の融解法、例えばイオン濃度を変化させる勾配も知られている。融解曲線は、この解離が起こる程度を、温度（または他の融解勾配）の関数として測定することによって生成することができる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，８７１，９０８号を参照されたい。したがって、本明細書で使用するとき、融解曲線は、温度、イオン濃度などの融解勾配に反応して化合物がその構造を変化させる程度（例えば、核酸生成物に加えられたエネルギー勾配に応じて核酸生成物中の鎖が解離する程度）を定量化する測定値を含む任意のデータセットを指すことがある。
【０００９】
ある実施形態では、この解離を電気光学的に測定する。結合染料を含む溶液に核酸生成物（または他の化合物）を入れる。この結合染料は、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に結合しているときに電気光学（ＥＯ）放射を放出するように適合されている。生成物が解離すると、結合染料はＥＯ放射の放出をやめる（または、後に論じるように、低レベルのＥＯ放射を放出する）。これに応じて、溶液にエネルギーを加えたときに（例えば溶液の温度を上昇させたときに）溶液から放出されるＥＯ放射（蛍光）の測定値を取得することにより、融解曲線を生成する。さらに、本開示は、融解時に蛍光が低減する実施形態だけに限定されないことが理解される。Ｇ−クエンチング単標識プローブ（Ｇ−クエンチング・シングルラベル・プローブ）を使用する実施形態など、いくつかの実施形態では、融解すると蛍光信号が増大する（例えば米国特許第６，６３５，４２７号参照）。
【００１０】
したがって、融解曲線は、一連のＥＯ放射測定値（例えば溶液から放出された蛍光の測定値）を温度の関数として含むことがある。しかしながら、他の方法で取得した解離測定値を含む他の融解曲線に、本開示の教示を適用することもできる。したがって、融解曲線データを取得する（例えば、核酸の解離を定量化する測定値を、溶液に加えたエネルギーの関数として取得する）特定の方法および／または技法に、本開示が限定されると解釈すべきではない。
【００１１】
上で論じたように、融解曲線から、核酸生成物の構造に関する情報を推測することができる。そのため、融解曲線データを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物を調べることができる。ＰＣＲ生成物の融解曲線は、結合染料の存在下でＰＣＲ反応の生成物を加熱することによって取得することができる。上で論じたように、この結合染料は、ｄｓＤＮＡに結合しているときの方が、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に結合しているときよりも強い蛍光を発するように適合されている。したがって、ＰＣＲ生成物が主にｄｓＤＮＡとして存在する比較的に低い温度において、この溶液は、比較的に高いレベルの蛍光を発する。溶液の温度を上昇させると、生成物は、２本のｓｓＤＮＡに解離（例えば変性）し、それによって、溶液は、より低レベルの蛍光を発する。ＰＣＲ生成物は、ｄｓＤＮＡ状態からｓｓＤＮＡ状態への相転移を、幅の狭い温度窓内で経験することがある。前述のとおり、この転移は、溶液が発する蛍光を低減させることがある。この転移が起こる温度窓を、融解領域、融解転移および／または融解窓と呼ぶことがある。
【００１２】
このような融解曲線実験で一般的に使用される結合染料には、温度に応じて、溶液中で自ら蛍光を発するものがある。例えば、ｄｓＤＮＡが存在しない場合、（アイダホ・テクノロジー社から販売されており、アイダホ・テクノロジー社の登録商標である）ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標） Ｐｌｕｓなどの結合染料の蛍光信号は、温度の関数として単調に低減する。したがって、前述の方法で（例えば核酸生成物と結合染料の溶液を加熱したときに放出されたＥＯ放射を測定することによって）取得した融解曲線は、ｄｓＤＮＡ生成物に結合した染料によって放出された蛍光と、溶液中の結合染料および／またはｓｓＤＮＡに結合した染料が自ら発したバックグラウンド蛍光との組合せを含むことがある。
【００１３】
したがって、結合染料の存在下で核酸生成物を融解させることによって取得した生の測定蛍光信号は、生成物の融解（溶液を加熱したときのｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡへの生成物の解離）に起因する蛍光とバックグラウンド蛍光の和としてモデル化することができる。式１は、「真の」融解曲線Ｍ（Ｔ）（例えば核酸生成物の融解によって生じた蛍光）とバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）の和を含む実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を示す。
【００１４】
【数１】
【００１５】
上で論じたように、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）から、核酸生成物に関する情報（例えば生成物の構造、組成など）を推測し、および／または求めることができる。しかしながら、実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）の解析は、そのバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）成分によって複雑になることがある。バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）信号をモデル化し、実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）からバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）信号を除去するさまざまなシステムおよび方法が開発されている。
【００１６】
一例では、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）が１次関数としてモデル化される。一般的な多くの染料の蛍光は、温度とともに直線的に低減する（ある温度範囲にわたって温度の上昇とともに低減する）。核酸融解曲線では、融解領域内で、生成物の蛍光が急激に低減する。しかしながら、融解領域の外側では、温度に伴う蛍光変化がほぼ直線的である。したがって、融解転移前の直線ベースラインおよび融解転移後の直線ベースラインを外挿することによって、実験的な融解曲線を正規化することができる。
【００１７】
図１は、直線ベースラインＬ１（Ｔ）およびＬ０（Ｔ）を有する実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を示す。正規化された融解曲線は、上ベースラインと下ベースラインの差に対する、下ベースライン（Ｌ０（Ｔ））よりも上の実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の高さの比として計算することができる。上ベースラインと下ベースラインの勾配は同じであることも、同じでないこともある。
【００１８】
図２は、非標識プローブの存在下で非対称ＰＣＲ反応の生成物を融解させることによって得た融解曲線のプロットを示す。この曲線は、非標識プローブの融解転移とＰＣＲ生成物の融解転移の両方を含む。図２に示すように、融解曲線の非直線性のため、上直線ベースラインと下直線ベースラインとが融解曲線よりも下で交差し、図１に示した１次補償方程式の分母がゼロになるため、前述の直線ベースライン法の使用には問題がある。
【００１９】
代替手法では、指数減衰関数を使用して、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）をモデル化する。指数バックグラウンドモデル化および指数バックグラウンド差引き（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）のためのシステムおよび方法は、参照によってその全体が参照によって組み込まれる２００６年９月２０日に出願された「ＭＥＬＴＩＮＧ ＣＵＲＶＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＷＩＴＨ ＥＸＰＯＮＥＮＴＩＡＬ ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ ＳＵＢＴＲＡＣＴＩＯＮ」という名称のＰＣＴ出願第ＷＯ２００７／０３５８０６号に記載されている。
【００２０】
経験的証拠は、ある温度（例えば８５℃よりも低い温度）では、結合染料からのバックグラウンド蛍光信号を、以下の形の減衰指数関数として正確にモデル化することができることを示している。
【００２１】
【数２】
【００２２】
式２で、Ｃおよびａは、融解曲線データＦ（Ｔ）からフィット（ｆｉｔ）させるための定数、ＴＬは、指数部の引数に対するシフティングパラメータ（カーソル位置（後述））であり、一般に、融解曲線Ｆ（Ｔ）内の融解転移よりも下に位置する。
【００２３】
とりわけ、融解領域の前後ではバックグラウンド蛍光のスケールが変化するため、式２のバックグラウンド蛍光モデルは、観察された蛍光のデータに直接にはフィットしない可能性がある。バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）をモデル化するのに使用する指数関数の特性（例えば指数関数の導関数が指数関数であること）に基づいて、式３を得ることができる。
【００２４】
【数３】
【００２５】
このバックグラウンド蛍光モデルによれば、融解転移領域の前後で、生成物融解関数が一定である。融解転移領域を間に挟むように２つの温度を選択することができる。融解転移領域の前に第１の温度ＴＬを選択し、融解転移領域の後に第２の温度ＴＲを選択することができる。本明細書ではこれらの温度を「正規化カーソル」と呼ぶことがある。式２と式３を結合することによって、正規化カーソルＴＬおよびＴＲを使用して、指数バックグラウンド信号Ｂ（Ｔ）のモデルを構築することができる。
【００２６】
【数４ａ】
【００２７】
【数４ｂ】
【００２８】
観察された蛍光データの導関数は、例えば中心差分法（セントラル・ディラレンシング法）を使用して近似することができる。式４ａおよび４ｂを、ａおよびＣについて解くと、式５ａおよび５ｂが得られる。
【００２９】
【数５ａ】
【００３０】
【数５ｂ】
【００３１】
式５ａおよび５ｂの結果を使用して、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）のモデルを構築することができる。実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）からこのモデルを差し引くと、「真の」融解曲線Ｍ（Ｔ）が得られる。
【００３２】
【数６】
【００３３】
一般に、操作者は、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）をモデル化するために（例えば式３〜６で）使用する正規化カーソル位置（ＴＬおよびＴＲ）を手動で選択する。この操作は、融解曲線データについて事前にある程度の知識を有し、および／または、生の実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）を適切に解釈する技能および経験を有する（例えば融解転移がどこで起こったのかなどが分かる）ことを操作者に要求することがある。本明細書に開示するシステムおよび方法は、融解曲線データＦ（Ｔ）内のバックグラウンド領域と融解領域とを、偏差解析（後述）を使用して特定することによって、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の自動解析を提供することができる。したがって、本明細書に開示する偏差解析システムおよび方法は、この手動操作の必要性を回避する（例えば、融解領域についての事前の知識および／または融解領域の手動推定の必要性を排除する）ことができる。
【００３４】
用途によっては、融解曲線データが、正規化された蛍光曲線として示され、この正規化された蛍光曲線では、融解曲線Ｍ（Ｔ）が、例えば１（完全にアニールしている）から０（完全に解離している）までに再スケーリングされる。ある実施形態では、以下の変換を使用して、融解曲線Ｍ（Ｔ）がＮ（Ｔ）に正規化される。
【００３５】
【数７】
【００３６】
１次バックグラウンドモデル化／バックグラウンド除去技法および指数バックグラウンドモデル化／バックグラウンド除去技法は、多くの用途で有用であることがある。例えば、１次モデルは、８０から９５℃までの間のＴｍを有するＰＣＲ生成物に対する良好なフィットであり、指数モデルは、解析する温度範囲が２０℃以下であるときに良好なフィットである。しかしながら、温度が８０℃未満であり、および／または解析する温度範囲が２０℃より高いとき、（緩衝液、ｄＮＴＰ、プライマなどによって生成された蛍光を含む）バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）信号は、１次モデルにも、指数モデルにも従わない可能性がある。具体的には、８０℃未満の温度は、予想されるバックグラウンドからの偏差を示し、７０℃未満の温度は、よりいっそう大きな偏差を示し、６０℃、５０℃および４０℃では偏差が次第に増大する。温度範囲に関して、２０℃より高い範囲でも、バックグラウンドは、単純な１次および指数モデルから外れることがある。解析範囲が、３０℃、４０℃、５０℃および６０℃と増大するにつれて、１次または指数モデルからのバックグラウンドの偏差は増大する。これらの低温解析条件および／または範囲の広い解析条件下においては、後述する偏差解析が、固定されたモデル化に対する良好な代替となる可能性がある。例えば、非標識プローブ、スナップバック・プライマおよびマルチプレックス・スモール・アンプリコンの融解は全て、しばしば２０℃より高い範囲で起こり、一部は８０℃未満の温度で起こる複数の融解転移に帰着しうる。非標識プローブ、スナップバックプライマおよびマルチプレックススモールアンプリコンの融解に関する追加の情報は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる「Ｌ．Ｚｈｏｕ他、Ｓｎａｐｂａｃｋ Ｐｒｉｍｅｒ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ＤＮＡ Ｄｙｅ ａｎｄ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ、５４（１０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１６４８〜５６（２００８年１０月）」、米国特許第７，３８７，８８７号、および２００８年３月７日に出願された「ＰＲＩＭＥＲＳ ＦＯＲ ＭＥＬＴＩＮＧ ＡＮＡＬＹＳＩＳ」という名称のＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１０９８２３号に出ている。
【００３７】
核酸融解曲線は、核酸の配列に関する情報を得るために使用されているが、タンパク質融解曲線はしばしば、タンパク質の熱力学的安定性を測定するために使用される。タンパク質の熱安定性を評価するためには、タンパク質のネイティブの構造が熱力学的に安定である温度よりも高い温度まで温度を上昇させる。タンパク質はアンフォールドし、以前はタンパク質構造中に隠れていた疎水性アミノ酸残基が露出する。タンパク質の融解では、熱傾斜の中点としてしばしばＴｍが定義され、Ｔｍは、ネイティブの形の自由エネルギーとネイティブでない形の自由エネルギーが等しい温度を表す。例えば、タンパク質を、単独で、およびリガンドの存在下で融解させ、安定性の摂動を使用して、ライブラリをスクリーニングすることができる。追加の情報は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる「Ｄ．Ｍａｔｕｌｉｓ他、Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎｉｃ Ａｎｈｙｄｒａｓｅ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ Ｕｓｉｎｇ ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５、４４、５２５８〜５２６６」に出ている。
【００３８】
上で論じた核酸融解曲線の解析と同様に、タンパク質融解曲線も、式１のＦ（Ｔ）＝Ｍ（Ｔ）＋Ｂ（Ｔ）の形で表すことができる。典型的なタンパク質融解と典型な核酸融解の主な違いＢ（Ｔ）は、タンパク質融解では、タンパク質が変性するにつれてＥＯ放射信号が増大することである。典型的なタンパク質融解曲線を図１２Ａおよび１４Ａに示す。図１２Ａの例では、温度が４０度に向かって上昇すると、熱消光（サーマル・クエンチング）によって蛍光が低減する。タンパク質に応じて、アンフォールディングは通常４０から６０℃までの間の温度で始まり、露出した疎水性残基により多くの染料が結合するため、このアンフォールディングは蛍光の増大として観察される。最終的には、タンパク質の凝集および沈殿が（通常は４５から７５℃までの間で）起こり、それに熱消光が加わるため、蛍光は再び低減する。図１２Ａには、一般的に観察される安定性および強度の範囲を示す、よく知られている６種類のタンパク質の融解が示されており、濃度は全て２．２５μＭである。
【００３９】
経験的証拠は、融解転移よりも高い高温（タンパク質によって例えば６０〜９０℃）では、結合染料からの残留蛍光を、下の形の２次多項式によってモデル化することができることを示している。
【００４０】
【数８】
【００４１】
式８で、ａｉ、ｂｉおよびｃｉは、実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）からフィットさせるための定数である。次いで、タンパク質融解曲線を、前述のＦ（Ｔ）＝Ｍ（Ｔ）＋Ｂ（Ｔ）の形で表すことができる。式１を参照されたい。式８の定数は一般に、バックグラウンド領域内の連続するある温度範囲にわたって集めた蛍光データに対する最小２乗フィットによって見つける。
【００４２】
本開示は、バックグラウンド蛍光信号の例示的な指数モデルおよび２次モデルの使用を教示するが、この点に関して本開示は限定されない。当業者には理解されるであろうが、当技術分野で知られている任意のモデル化技法および／またはモデル化形態とともに機能するように、本明細書に教示する偏差関数（および関連解析技法）を適合させることができる。
【００４３】
前述のとおり、操作者は一般に、融解曲線中のバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）を（例えば式８において）モデル化するために使用する温度領域を手動で選択する。この操作は、融解曲線データについて事前にある程度の知識を有し、および／または、生の実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）を適切に解釈する技能および経験を有する（例えば融解転移がどこで起こったのかなどが分かる）ことを操作者に要求することがある。本明細書に開示するシステムおよび方法は、融解曲線データＦ（Ｔ）内のバックグラウンド領域と融解領域とを、偏差解析（後述）を使用して特定することによって、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の自動解析を提供することができる。したがって、本明細書に開示する偏差解析システムおよび方法は、この手動操作の必要性を回避する（例えば、融解領域およびバックグラウンド領域についての事前の知識ならびに／または融解領域およびバックグラウンド領域の手動推定の必要性を排除する）ことができる。
【００４４】
融解曲線データは、導関数の形で（例えば正規化された融解曲線Ｎ（Ｔ）の導関数または負の導関数として）表すことができる。しかしながら、融解曲線Ｍ（Ｔ）は、常に等間隔であるとは限らない離散的な温度測定で集められ、少量の雑音を含むことがあるため、データを（例えば３次元平滑化スプライン（３次元スムージングスプライン）を使用して）平滑化することができ、および／または均一な温度測定値で再サンプリングすることができる。中心差分技法または他の技法を使用して、融解曲線の導関数を近似することができる。単一の融解転移を含む融解曲線については、導関数曲線のピークを「融解転移」ないしＴＭとして示すことができる。複数の融解転移を含む融解曲線については、融解転移ピークを特定し、および／またはそれに応じて番号（例えばＴＭ１、ＴＭ２、．．．、ＴＭｎ）をつけることができる。
【００４５】
融解曲線データを、偏差関数に換算して表示し、および／または解析することができる。この偏差関数は、実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）がバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）のモデルから外れる程度を定量化することができる。上で論じたとおり、ある実施形態では、とりわけ指数減衰関数を使用して、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）をモデル化する（例えば融解曲線の「理想」モデル化）。したがって、偏差関数は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の指数減衰率と（例えば上式２に基づく）バックグラウンド蛍光モデルの指数減衰率との間の偏差に基づくことがある。
【００４６】
偏差解析は、一連の温度窓内において実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を予め定義された関数にフィットさせることによって計算した複数のフィットパラメータを生成することを含むことができる。したがって、偏差関数（本明細書ではＥ（Ｔ）と称する）は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）が予め定義された関数から外れる程度を、温度の関数として定量化することができる。
【００４７】
後に論じるが、融解曲線の偏差関数Ｅ（Ｔ）は、融解曲線データを（例えば検査、視覚化、作図などによって）直接に解析するために使用することができ、および／または別の融解曲線解析プロセスもしくはシステムで使用することもできる。本明細書に開示した偏差関数Ｅ（Ｔ）の用途には、限定はされないが、（例えばジェノタイピング、スキャニングなどに使用する融解曲線間の差異を強調するために）融解曲線データを表示し、作図すること、ネガティブ試料（例えばネガティブコントロール試料、無効データなど）を自動的に特定すること、融解領域および／またはバックグラウンド領域の特定を自動化すること、融解曲線クラスタリングを自動化すること、ジェノタイピングおよび／またはスキャニング操作を自動化すること、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）の差引きを自動化することなどがある。しかしながら、本明細書に開示された偏差解析システムおよび偏差解析法を、別の融解曲線用途で使用することもできることを当業者なら理解するであろう。したがって、偏差解析を生成し、および／または本明細書に開示された融解曲線解析に偏差解析を適用するためのシステムおよび方法が、特定の一組の用途に限定されると解釈すべきではない。
【００４８】
偏差関数Ｅ（Ｔ）の生成は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）と所定の関数との間のランニングフィットを計算することを含むことができる。この所定の関数は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）内のバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）のモデル（本明細書では理想融解曲線と呼ぶ）を含むことができ、このモデルは、上で論じたように、指数減衰関数を使用して近似することができる。式２〜６を参照されたい。
【００４９】
実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）は、温度区間［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ］内で定義することができる。ランニングフィットは、実験的な融解曲線の温度区間（例えば［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ］または［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ−Ｗ］）内の幅がそれぞれＷの複数の温度窓（ＴＷ）内で実行することができる。
【００５０】
【数９】
【００５１】
式９で、ＴＷＬは、温度窓ＴＷの最低温度または「開始」温度を表す。温度窓ＴＷの幅Ｗは、融解曲線データの分解能（例えば実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）データの密度および／または精度）ならびに／または融解曲線データから抽出する特徴に応じて選択することができる。幅Ｗは、温度窓ＴＷ内の雑音のランダム変化を平滑化するために十分に大きく、同時に、関心の特徴を分解するために十分に小さくなるように選択することができる。
【００５２】
偏差関数Ｅ（Ｔ）は、区間［Ｔｍｉｎ＋Ｗ／２，Ｔｍａｘ−Ｗ／２］のＴｉによって表される均一な離散化に対して定義される。例えば、温度窓ＴＷ間の温度間隔ΔＴを下式として定義することができる。
【００５３】
【数１０】
【００５４】
ΔＴ（温度窓ＴＷ間の間隔）の選択は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の分解能、性能考慮事項、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）から抽出する特徴の性質などに基づくことができる。温度間隔ΔＴは、連続する任意の２つの融解曲線データ点間の最大差よりも大きく（例えば実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）内の最も粗い温度分解能よりも大きく）なるように選択することができる。
【００５５】
各温度窓ＴＷ内で、予め定義された関数と実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の間のフィットを計算することができる。フィットごとにフィットパラメータを得ることができ、そのフィットパラメータを、温度窓ＴＷに関連づけられたある点（温度値）に割り当てることができる。特定の温度窓ＴＷに関連づけられた温度点を、（範囲［Ｔｉ−Ｗ／２，Ｔｉ＋Ｗ／２］を含む温度窓に対する）Ｔｉと呼ぶことがある。
【００５６】
例えば、この形の偏差関数は、核酸融解曲線に対して適している。上で論じたように、偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成するために使用するこの予め定義された関数は、実験的な融解曲線内のバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）（例えば「理想」融解曲線）をモデル化するように構成された指数減衰関数とすることができる。この予め定義された関数が指数減衰関数を含む場合、前記フィットは、下式のようになるように、パラメータＣｉおよび／またはａｉを選択することを含むことができる。
【００５７】
【数１１】
【００５８】
式１１のフィットは、例えば最小２乗フィッティング技法など、当技術分野で知られている任意のフィッティング技法を使用して実施することができる。
【００５９】
ある実施形態では、数値的に安定させるために、指数関数形の式１１を、温度窓ＴＷ内の左端の温度値にシフトさせる（例えば左へシフトさせる）。
【００６０】
指数減衰因子ａｉを使用して、フィットパラメータＴｉごとに下式のようになるように、偏差関数Ｅ（Ｔ）を形成することができる。
【００６１】
【数１２】
【００６２】
上で示したとおり、式１２の偏差関数は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の指数減衰因子と「理想」融解曲線との間の偏差を温度の関数として定量化する。純粋な指数バックグラウンドについては、指数減衰因子が定数となることがある。したがって、その定数からの偏差を、２重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）融解（例えばバックグラウンド減衰と組み合わさった核酸生成物の融解）の結果とすることができる。ある実施形態では、この指数関数からの偏差を表すのに、偏差関数の最小値を偏差関数から差し引く。複数の曲線を、ピーク高さによって互いに正規化することができる（例えばＥ（Ｔ）−ｍｉｎ｛Ｅ（Ｔ）｝／ｍａｘ｛Ｅ（Ｔ）｝−ｍｉｎ｛Ｅ（Ｔ）｝）。あるいは、またはこれに加えて、それぞれの曲線を数値積分で除することによって、全ピーク面積による正規化を実行することもできる。（正規化された融解曲線に類似の）積分された偏差プロットＥ（Ｔ）は全てのプロットが同じ値から始まり、同じ値で終わるため、ピーク面積正規化の方が有利であることがある。
【００６３】
あるいは、またはこれに加えて、振幅定数Ｃｉ、ならびに／または振幅因子と減衰因子Ｃｉおよび／またはａｉの組合せを、偏差関数Ｅ（Ｔ）に組み込むこともできる。他の実施形態では、偏差関数が、融解曲線データとバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）の他のモデル（例えば２次モデル、離散モデルなど）との間の偏差を定量化する。したがって、本明細書に開示した偏差関数が特定の所定のフィット関数に限定されると解釈すべきではない。
【００６４】
タンパク質融解曲線に関しては、偏差関数Ｅ（Ｔ）の生成に使用する予め定義された関数を、例えば、実験的な融解曲線データ内のバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）をモデル化する２次多項式とすることができる。この予め定義された関数が２次多項式を含む場合、前記フィットは、下式のようになるように、パラメータａｉ、ｂｉおよび／またはｃｉを選択することを含むことができる。
【００６５】
【数１３】
【００６６】
式１３のフィットは、例えば最小２乗フィッティング技法など、当技術分野で知られている任意のフィッティング技法を使用して実施することができる。
【００６７】
２次項に乗じる定数ａｉを使用して、フィットパラメータＴｉごとに下式のようになるように、偏差関数Ｅ（Ｔ）を形成することができる。
【００６８】
【数１４】
【００６９】
上で示したとおり、式１４の偏差関数は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）と「理想」融解曲線との間の偏差を温度の関数として定量化する。純粋な２次バックグラウンドについては、この振幅因子が定数となることがある。したがって、その定数からの偏差を、タンパク質のアンフォールディングの結果とすることができる。
【００７０】
後に論じるように、（例えば融解領域／バックグラウンド領域の特定、バックグラウンド蛍光の除去、ネガティブ試料の特定、クラスタリングなどに使用する）実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）の解析において、この偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用することができる。偏差関数Ｅ（Ｔ）は、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）のモデルと実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の間の偏差を定量化することができるため、偏差関数Ｅ（Ｔ）は、本来的に、（場合によっては）（例えば１次バックグラウンド差引きおよび／または指数バックグラウンド差引きを使用する）専用バックグラウンド差引き処理に対する必要性を排除するバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）補償を含むことがある。
【００７１】
図３は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成する方法３００の一実施形態を示す。ステップ３１０で、方法３００を初期化する。この初期化は、方法３００が必要とする資源を割り当て、および／または方法３００が必要とする資源を初期化することを含むことができる。ある実施形態では、方法３００を、コンピュータ可読記憶媒体上に記憶された命令および／または別個のソフトウェアモジュールとして具体化する。したがって、ステップ３１０の初期化は、コンピューティングデバイスが、それらの命令を読み取り、および／またはそれらの命令をメモリもしくは他のデバイスへロードすることを含むことができる。あるいは、またはこれに加えて、方法３００は、１つまたは複数のプロセッサ、センサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ、特定用途向け集積回路、ディジタル論理などの１つまたは複数のハードウェアコンポーネントを含むことができる。
【００７２】
ステップ３２０で、方法３００は、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を含む融解曲線データにアクセスする。
【００７３】
ステップ３３０で、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の温度範囲を複数の温度窓ＴＷに分割する。温度窓ＴＷはそれぞれ、幅Ｗを有するように定義することができる。幅Ｗは、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の分解能および／または融解曲線データから抽出する特徴の性質に応じて、方法３００（または方法３００のユーザ）が選択することができる。上で論じたとおり、温度窓ＴＷは、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の温度区間の均一な離散化を形成するように定義することができ、温度窓ＴＷ間の間隔を定義するΔＴメトリックによっては互いに重なり合うことがある。
【００７４】
ステップ３４０で、複数の温度窓ＴＷのそれぞれの温度窓ＴＷにわたって、方法３００は反復する。したがって、ステップ３４０で、方法３００は、処理すべき追加の温度窓ＴＷがあるかどうかを判定し、処理すべき追加の温度窓ＴＷがある場合には、フローはステップ３４２へ続き、ステップ３４２で、次の温度窓ＴＷに対する偏差パラメータを計算し、処理すべき追加の温度窓ＴＷがなければ、フローはステップ３５０へ続く。
【００７５】
ステップ３４２で、（現在の温度窓ＴＷ内において）実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）と理想バックグラウンド蛍光のモデルとの間のフィットを計算する。上で論じたように、ある実施形態では、バックグラウンド蛍光を指数減衰関数としてモデル化する。実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）（例えば核酸融解曲線）と指数減衰関数の間のフィットの一例は、式１１〜１２に関して上に示されている。他の実施形態では、２次関数（または他のモデル）を使用してバックグラウンド蛍光をモデル化する。実験的な融解曲線（例えばタンパク質融解曲線）と２次モデルとの間のフィットの一例は、式１３〜１４に関して上に示されている。ステップ３４２はさらに、温度窓ＴＷに対するフィットパラメータを求めることを含む。上で論じたように、数値的に安定させるために、フィッティングパラメータおよび／または窓を左へシフトさせることができる。
【００７６】
ステップ３５０で、それぞれの温度窓ＴＷのフィットパラメータを使用して偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成する。ある実施形態では、ステップ３５０がさらに、偏差関数Ｅ（Ｔ）を正規化することを含む。
【００７７】
ステップ３６０で、表示、追加の融解曲線解析などに対して、偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用可能にする。ステップ３６０は、偏差関数Ｅ（Ｔ）の表現をコンピュータ可読媒体に記憶すること、その表現を、１人または数人のユーザに対して使用可能にすること、人間機械インタフェース（ＨＭＩ）（例えばディスプレイ、プリンタなど）上にその表現を表示することなどを含むことができる。ステップ３６０はさらに、偏差関数Ｅ（Ｔ）を、別の１つもしくは複数のプロセスおよび／またはシステムに送信し、および／または、それらの別の１つもしくは複数のプロセスおよび／またはシステムに対して使用可能にすることを含むことができる。例えば、後に論じるように、自動ネガティブ試料特定プロセス、自動バックグラウンド差引きプロセスなどでこの偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用することができる。
【００７８】
前述の方法３００に従って生成した偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用して、実験的な融解曲線データＦ（Ｔ）を表示し、および／または、解析することができる。一例として、以下のオリゴヌクレオチドを標準法を使用して合成した。
【００７９】
Ｓ５Ｄ：ｇｔｔａａｃｃＡＣＴＧＡｔａｇｃａｃｇａｃｇＴＣＡＧＴ （配列ＩＤ Ｎｏ．１）
【００８０】
Ｓ７Ｄ：ｇｔｔａａｃｃＡＣＴＧＡＣＡｔａｇｃａｃｇａｃｇＴＧＴＣＡＧＴ （配列ＩＤ Ｎｏ．２）
【００８１】
Ｓ９Ｄ：ｇｔｔａａｃｃＡＣＴＧＡＣＡＧＴｔａｇｃａｃｇａｃｇＡＣＴＧＴＣＡＧＴ （配列ＩＤ Ｎｏ．３）
【００８２】
上記のそれぞれのオリゴヌクレオチドの大文字の領域は相補型であり、そのため、これらのオリゴヌクレオチドは、低温において、５、７または９塩基対（ｂｐ）の幹領域を有する分子内ヘアピンを形成する。各ヘアピンには１０塩基のループが存在する。各ヘアピンの短端は、ポリメラーゼの存在下で７塩基分延長され、それぞれ１２、１４または１６塩基の幹領域を形成する。
【００８３】
上に開示したオリゴヌクレオチドを含む溶液を調製することによって融解曲線データを生成した。この溶液は、最終体積１０μｌ中に、ＰＣＲ緩衝液（例えば５０ｍＭのトリス、ｐＨ ８．３、３ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む）中の１μＭのそれぞれのオリゴヌクレオチド、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、および染料（例えば、アイダホ・テクノロジー社から市販されている１Ｘ ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標） Ｐｌｕｓ染料）を含む。一部の反応では、この溶液が、０．５ＵのＫｌｅｎＴａｑ １（ＡＢ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含み、その結果として、延長後に１２、１４および１６塩基対のヘアピンを得た。ＨＲ−１（商標）高分解能融解機器（アイダホ・テクノロジー社から市販されている）内において、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）毛細管（ロシュ・ダイアグノスティックス社から市販されており、ロシュ・ダイアグノスティックス社の登録商標である）を使用して、０．３℃／秒で、融解曲線データを得た。
【００８４】
図４は、ＨＲ−１（商標）機器（アイダホ・テクノロジー社から市販されている）を使用して得た未変更の融解曲線の例を示す。ＨＲ−１（商標）は、利得を自動的に調整するように構成することができ、そのため、各融解曲線は蛍光値９０から始まる。これらの曲線の指数関数的特徴は明白であり、７５℃付近には、より長いヘアピンの融解挙動が示唆される。しかしながら、図４に示した未変更の曲線を解釈することは容易ではなく、より短いヘアピンの観測可能な２重鎖融解が起こったかどうかははっきりしない。
【００８５】
図５は、図４に示したデータと同じデータの導関数プロットである。より高い温度における２重鎖転移がピークとしてはっきりと示されている。しかしながら、低温ではバックグラウンドが高いため、より低温での転移のＴｍを特定することは難しいことがある。したがって、追加の操作および／または処理（例えばバックグラウンド除去）なしでは、導関数プロットは、曲線中のバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）を適切に表現し、および／または調整することができないことがある。
【００８６】
（例えば式１〜６に関して）上で論じたように、実験的な融解曲線のバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）成分を融解曲線Ｆ（Ｔ）から差し引き、それにより「真の」融解曲線Ｍ（Ｔ）の近似を得ることができる。上式１〜６を参照されたい。図１８および２４（後に論じる）は、とりわけ偏差解析を使用する自動バックグラウンド除去プロセスの例を提供する。
【００８７】
図６は、指数バックグラウンド差引き後の図４および５のデータと同じデータの導関数プロットを示す。図６のプロットでは、全ての試料が融解転移を示しているが、バックグラウンド差引きの成果は理想的とは言えず、特に５ｂｐヘアピン２重鎖でそうである。
【００８８】
図３〜６のそれぞれの実験的な融解曲線の偏差関数Ｅ（Ｔ）を、（例えば式９〜１４および／または図３の方法３００を使用して）生成することができる。図７は、数値積分が１から０までの間で変化するように面積によって正規化した偏差関数Ｅ（Ｔ）のプロットである。図７に示すように、この偏差プロットはＥｍ（Ｔ）によって示されている。後に論じるように、Ｅｍ（Ｔ）は、各温度窓内で、偏差関数Ｅ（Ｔ）の最小値を偏差関数Ｅ（Ｔ）から差し引くようにして偏差関数Ｅ（Ｔ）から導き出される関数である。下式２０を参照されたい。図７に示すように、偏差関数Ｅ（Ｔ）（図７の例ではＥＭ（Ｔ））を使用すると、融解曲線データ内の関連する特徴がより際立ち、かつ容易に観測可能となる。例えば、図７は、４７〜７７℃の３０℃の範囲にわたってヘアピンＴｍが明らかに散らばっていることを示している。予想どおり、より短い幹は、より長い幹よりも広い範囲にわたって融解し、全ての転移が示されている。偏差関数Ｅ（Ｔ）（または図７に示したＥＭ（Ｔ））は本来的にバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）に対して適応するため、バックグラウンドは、全ての試料について適切に除去される。
【００８９】
導関数プロットの代わりに、指数バックグラウンド差引き後の正規化された融解曲線を示すこともできる。このようにして解析したヘアピンデータを図８に示す。より高い温度ではそれらの融解曲線は妥当であるように見えるが、より低い温度では、予想されるものからのより大きな偏差が観察され、５塩基対２重鎖は、いくつかの範囲の温度で「物理的に不可能な」蛍光の増大を示す。
【００９０】
図９は、図６〜８に示したデータと同じデータの（累積偏差の百分率として示された）積分された偏差プロットを示す。この場合には、予想どおり、長い２重鎖ほどより鮮明な転移を示しており、全ての曲線が理に適っているように見える。導関数／偏差プロットとして示されているのか、またはそれらの融解曲線／積分形として示されているかに関わらず、偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用して生成されたプロットはよりロバストであることができ、大きな温度範囲にまたがる複数の曲線の比較を可能にする。
【００９１】
別の例として、２つの温度コントロールキャリブレータを用いた少なくとも４つの単一塩基多様体の多重ジェノタイピングを、プローブなしで均一に実行する。多重プライマおよび内部コントロールに対するオリゴヌクレオチド配列は以前に、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる「Ｓｅｉｐｐ ＭＴ他、Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｆ５，Ｆ２，ａｎｄ ＭＴＨＦＲ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｌｏｓｅｄ Ｔｕｂｅ ｂｙ Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ、５４（ａ）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１０８〜１５（２００８年１月）」によって発表されている。
【００９２】
この例では、以下の５０ｂｐ低温コントロールを使用した。
【００９３】
ＡＴＣＧＴＧＡＴＴＴＣＴＡＴＡＧＴＴＡＴＣＴＡＡＧＴＡＧＴＴＧＧＣＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴ （配列ＩＤ Ｎｏ．４）
【００９４】
上記配列の相補配列を、２６０ｎｍにおける吸光度によって求めた等しいモル割合で上記配列と混合することができる。温度コントロールオリゴヌクレオチドは、３’−リン酸塩でブロックすることができる。以下の５０ｂｐ高温コントロールを使用した。
【００９５】
（Ｇ）ＣＧＧＴＣ（Ａ）ＧＴＣＧＧ（Ｃ）ＣＴＡＧＣＧＧＴ（Ａ）ＧＣＣＡＧ（Ｃ）ＴＧＣＧＧＣ（Ａ）ＣＴＧＣＧＴＧ（Ａ）ＣＧＣＴＣＡ（Ｇ） （配列ＩＤ Ｎｏ．５）
【００９６】
このコントロールはさらに相補配列を含むことができ、括弧内の太字の塩基は、記載した鎖上でのみロックト核酸（ＬＮＡ）である。
【００９７】
１Ｘ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＨｙｂＰｒｏｂｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス社から市販されている）、それぞれ０．５μＭのＦＶプライマ、それぞれ０．１５μＭのＭＴＨＦＲ１２９８および６７７プライマ、それぞれ０．１６μＭのＦ２プライマ、０．０６μＭの低温補正コントロールおよび０．０８μＭの高温補正コントロール、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） Ｍａｓｔｅｒ溶液によって与えられた１ｍＭのＭｇＣｌ２を含む）、０．０１Ｕ／μｌの非耐熱性ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス社から市販されている）、１Ｘ ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標） Ｐｌｕｓ（Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から市販されている）ならびにテンプレートＤＮＡ ２０ｎｇを含む１０μｌの体積中で、ＰＣＲ増幅を実行した。
【００９８】
この例において、ＰＣＲおよび高分解能融解実験は、ＬＳ３２（商標）デバイス（アイダホ・テクノロジー社から市販されている）を使用して実行した。ＰＣＲは、最初に９５℃を１０分間維持し、続いて９５℃、２秒、５６℃、１秒および７２℃、１秒のサイクルを１５回、９５℃、２秒、５８℃、１秒および７２℃、４秒のサイクルを２５回繰り返すことによって実行した。温度サイクルが長くなることを避けるために、増幅中は蛍光の取得は行わなかった。ＰＣＲ中の加熱および冷却ステップは全て、２０℃／秒にプログラムされた傾斜率で実行した。ＰＣＲ後、試料を（１０℃／秒で）９５℃から４０℃まで冷却し、その後、５５℃から９５℃まで０．３℃／秒で蛍光を連続取得して、融解曲線を生成した。
【００９９】
このようにして得た融解曲線データを、前述のとおりに処理して指数バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）を除去し、正規化した。図１０は、処理後の融解曲線の導関数のプロットを示す。図１０は、２５℃の範囲にまたがる融解温度を示しており、６８℃付近に低温コントロールピークを有する。しかしながら、高温コントロールの量を増大させた後でも、強度は低いことが明らかであり（９２〜９３℃における右側の小さなピーク）、このことは、高温コントロールピークを使用した温度調整を難しくする。
【０１００】
前述の偏差解析技法（例えば式９〜１４および／または図３の方法３００）を適用することによって、より高温のピークの見かけの相対強度を増大させることができる。この例では、この融解曲線データを使用して対応するそれぞれの偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成した。
【０１０１】
これらの偏差関数Ｅ（Ｔ）のプロットを（式２０に関して後に論じるＥｍ（Ｔ）の形で）図１１に示す。図１１に示すように、この偏差解析は、低温転移に対する高温転移の見かけの大きさを増大させる。これらの両方の解析法によって、中央の４つのピークの正確なジェノタイピングが達成された。
【０１０２】
図１２Ａは、６種類の異なるタンパク質、すなわち精製リゾチーム、Ｃ反応性タンパク質、ＩｇＧ、クエン酸シンターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびアルカリホスファターゼ（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））の実験的な融解曲線を示す。これらのタンパク質をそれぞれ別個に、等張リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ ７．４（ＰＢＳ）に対して透析し、ＰＢＳ中で、５Ｘ ＳＹＰＲＯ（登録商標） Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）から市販されている）の存在下で、タンパク質濃度２．２５μＭまで希釈した。ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ（登録商標）（アイダホ・テクノロジー社から市販されている）内で、反応物１０ｕｌを、１℃／分で、３５から９９℃まで融解させた。３次平滑化スプラインを使用して実験的な融解曲線データを平滑化し、均一な温度測定値で再サンプリングした。
【０１０３】
図１２Ｂは、図１２Ａの実験タンパク質融解曲線の導関数プロットを示す。これらの導関数は、中心差分技法を使用して近似することができる。
【０１０４】
図１２Ｃは、図１２Ａの実験タンパク質融解曲線データの偏差関数Ｅ（Ｔ）プロットを示す。図１２Ｃの偏差関数は、上で論じた式９〜１４および／または方法３００を使用して計算することができる。図１２Ｃの例では、式１３の２次多項式を使用してバックグラウンド蛍光信号をモデル化し、窓の幅は２０データ点とした。偏差関数は、それぞれのフィットの２次項に乗じる定数（式１３のａｉ）から形成した。
【０１０５】
図１２Ｄは、バックグラウンド補正後の導関数融解曲線を示す。バックグラウンド除去に関しては、カーソル位置を、８４．４度および９８．４度に手動でセットする（全試料について、これらのカーソル位置はともに、融解特徴よりも上のバックグラウンド領域内に位置する）。試料ごとに、前述のカーソル位置内で、（図１２Ａに示した）平滑な融解曲線データに２次多項式を、最小２乗フィッティングでフィットさせる。平滑化された実験的な融解曲線データからバックグラウンドモデルを差し引くことによって、バックグラウンドが補正された（以後、バックグラウンド補正された）融解曲線が形成される。次いで、バックグラウンド補正された融解曲線を正規化した。正規化後、融解曲線は一般にゼロ付近から始まり、融解転移の後、１付近で横ばいになる。図１２Ｄに示したバックグラウンド補正され、正規化された曲線の導関数は、中心差分技法を使用して計算した。全てのタンパク質（低強度のリゾチームは除く）が、よく知られた形式の予想された融解転移を示す。
【０１０６】
図１３は、指数関数的に減衰するバックグラウンドを除去し、さらに局所的に一定の凝集速度に起因する信号を除去した後の図１２Ａの融解曲線データのプロットを示す。タンパク質はしばしばより高い温度で凝集し、それにより、アンフォールディングによって以前に露出したさまざまな疎水性残基を覆い隠す。補正によって、その結果得られるデータが、バックグラウンドおよび凝集が補正されたアンフォールディング曲線を表すことがある。後に論じるように、図１３に示したアンフォールディング曲線は、導関数をとる前に、補正された融解曲線データを最大値によって再スケーリングすることによって、０〜１００の百分率範囲に正規化されている。
【０１０７】
図１３のアンフォールディング曲線データは、式１の実験曲線のモデルを、タンパク質アンフォールディング領域間の凝集を考慮するように修正することによって得ることができる。
【０１０８】
【数１５】
【０１０９】
式１５で、Ｕ（Ｔ）は、アンフォールディング曲線、Ａ（Ｔ）は凝集信号、Ｂ（Ｔ）はバックグラウンドＥＯ放射を表す。アンフォールディング曲線Ｕ（Ｔ）は、低温および高温では実質的に平らであり、Ａ（Ｔ）は、実質的に一定の負の勾配を有し、上で論じたように、Ｂ（Ｔ）は、指数減衰モデルに従うことが観察されている。これらの特性を使用して、バックグラウンド信号Ｂ（Ｔ）を特定し、除去することができる。後に、別のバックグラウンド除去プロセスが図２２に関して説明される。
【０１１０】
このバックグラウンド除去プロセスは、アンフォールディング転移の始点の直ぐ下側の第１の温度ＴＬを特定することを含み、この第１の温度ＴＬでは、凝集曲線がゼロであり、アンフォールディング曲線が平らである。曲線のこの点において、測定される（負の）勾配は全て、バックグラウンドＥＯ放射信号の勾配に帰すことができる（例えばＢ（Ｔ）：Ｆ’（ＴＬ）＝Ｂ’（ＴＬ））。ＴＬの位置は、生の蛍光がもはや一定の指数減衰率を示さない温度を特定するためにＤＮＡ融解に対して使用したのと同じ指数偏差解析を使用して、低温範囲において検出することができる。上で論じた式１１を参照されたい。
【０１１１】
アンフォールディング転移よりも上の温度領域で、第２の温度ＴＲを特定することができる。この領域では、Ａ’（Ｔ）がほぼ一定であり、Ｕ’（Ｔ）＝０であり、Ｂ’（Ｔ）が依然として指数関数である。これらの条件は、Ｕ’’（Ｔ）＝０、Ａ’’（Ｔ）＝０であり、したがってＦ’’（ＴＲ）＝Ｂ’’（ＴＲ）であることを含意する。バックグラウンドＥＯ放射信号の指数モデルの導関数は、下式のように表現することができる。
【０１１２】
【数１６ａ】
【０１１３】
これらの２つの温度値（ＴＲおよびＴＲ）から、式１６のＣおよびａの値を見つけることができる。式１６から、
【数１６ｂ】
であり、除算
【数１６ｃ】
は、例えばニュートンの方法を使用して解くことができる式であるため、Ｃ＝Ｂ’（ＴＬ）＝Ｆ’（ＴＬ）である。Ｃおよびａ、したがってＢ’（Ｔ）を求めた後、そのバックグラウンドモデルを実験的な融解曲線データから差し引いて（式１５参照。Ｕ’（Ｔ）＋Ａ’（Ｔ）＝Ｆ’（Ｔ）−Ｂ’（Ｔ））、バックグラウンド補正された融解曲線の導関数を得ることができる。
【０１１４】
次いで、凝集曲線Ａ（Ｔ）からアンフォールディング曲線Ｕ（Ｔ）を抽出する（例えば上で計算したバックグラウンド補正された融解曲線データから抽出する）ことができる。ある実施形態では、凝集の補正が、抽出されたアンフォールディングと凝集の重ね合わせの導関数を、その高温度範囲側の凝集成分Ａ’（Ｔ）のロジスティックモデルによってフィットさせることを含む。指数バックグラウンドは上で抽出されているため、局所的に一定の（負の）凝集率Ｍをこの範囲で、測定することが可能である。この凝集率Ｍを、ロジスティックモデルの「キャリイング・キャパシティ」として使用することができる。
【０１１５】
【数１７ａ】
【０１１６】
次に、量
【数１７ｂ】
に対して、（上で論じた）指数偏差解析を実行して、パラメータＤおよびｋが一定であるフィッティング範囲を特定することができる。この範囲のＤおよびｋの平均（アベレージ）値をこのフィットに対して使用することができる。その結果得られたモデル凝集曲線を、バックグラウンド補正された曲線から差し引くことができ、その結果、バックグラウンドおよび凝集が補正されたアンフォールディング曲線の導関数が得られる（式１参照。Ｕ’（Ｔ）＝Ｆ’（Ｔ）−Ｂ’（Ｔ）−Ａ’（Ｔ））。このバックグラウンドおよび凝集導関数曲線Ｕ’（Ｔ）を積分して、バックグラウンドおよび凝集が補正された融解曲線を得ることができる。
【０１１７】
代替手法では、抽出された曲線の上肩部まで、および／または上肩部を含む温度（ＴＳとして示される）では凝集の影響を無視することができる仮定の下で、低温度範囲側のロジスティックモデルによる、抽出されたアンフォールディングと凝集の重ね合わせが実現される。ＴＳ温度は、Ｕ（Ｔ）＋Ａ（Ｔ）の２次導関数が最もネガティブであり（例えばｍｉｎ｛Ｕ’’（Ｔ）＋Ａ’’（Ｔ）｝）、そのためＵ’’’（ＴＳ）＝０である点として特定することができる。導関数重ね合わせＵ（Ｔ）＋Ａ（Ｔ）は抽出されている（例えばバックグラウンドＥＯ放射信号Ｂ’（Ｔ）の導関数は除去されている）ため、その１次導関数が最もネガティブである温度ＴＳを見つける。
【０１１８】
このロジスティックモデルのパラメータは、以下のように表すことができる。
【０１１９】
【数１８】
【０１２０】
式１８のパラメータは、Ｕ’’’（ＴＳ）＝０であることによって求めることができ、Ｕ（ＴＳ）およびＵ’（ＴＳ）の値は以下のとおりである。
【０１２１】
【数１９】
【０１２２】
凝集信号Ａ（Ｔ）はＴＳよりも低い範囲では無視することができるため、（上で論じた）バックグラウンド除去の後に導関数曲線を評価して、Ｕ’（ＴＳ）＝Ｆ’（ＴＳ）―Ｂ’（ＴＳ）を見つける。前述のとおり、Ｕ’（Ｔ）を積分して、バックグラウンドおよび凝集が補正された融解曲線（アンフォールディング信号Ｕ（Ｔ）だけを含む融解曲線）を得ることができる。任意選択で、得られたアンフォールディング曲線Ｕ（Ｔ）およびその導関数Ｕ’（Ｔ）を、再スケーリングＵ（Ｔ）＝１００（Ｕ（Ｔ））／ｍａｘ｛Ｕ（Ｔ）｝によって百分率範囲０〜１００に正規化することができる。
【０１２３】
図１３は、前述の方法（例えば式１５〜１９）を使用して図１２Ａのタンパク質融解曲線から得た正規化された融解曲線データを示す。したがって、図１３のプロットは、図１２Ａの融解曲線データのアンフォールディング成分（Ｕ（Ｔ））を示す。
【０１２４】
図１４Ａは、別の一組の実験タンパク質融解曲線を示す。図１４Ａに示す融解曲線データは、精製ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から市販されている）の段階２倍希釈を示している。精製ＩｇＧは、最初にＰＢＳに対して透析し、次いで、１０μＭの１−アニリノ−８−ナフタリンスルホナート（シグマ・アルドリッチ（登録商標）から市販されている）の存在下で、１２ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌおよび０．３７ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで段階希釈した。４００ｎｍでのＵＶ励起用に変更したＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ（登録商標）（アイダホ・テクノロジー社から市販されている）上で、１０μｌの体積を解析し、融解曲線を１℃／分で集めた。次いで、融解曲線データを前述のとおりに平滑化した。
【０１２５】
図１４Ｂは、図１４Ａの実験的な融解曲線データのプロットを示す。導関数は中心差分技法を使用して近似した。
【０１２６】
図１４Ｃは、図１４Ａの融解曲線データの偏差関数Ｅ（Ｔ）のプロットを示す。図１４Ｃの例では、式１３の２次多項式を使用してバックグラウンド蛍光信号をモデル化し、窓の幅は３０データ点に設定した。偏差関数は、それぞれのフィットの２次項に乗じる定数（式１３のａｉ）から形成した。
【０１２７】
図１４Ｄは、図１４Ａ〜１４Ｃのバックグラウンド補正された融解曲線の導関数プロットを示す。このバックグラウンド補正された融解曲線データは、バックグラウンド除去カーソル位置を８０．０度および９８度に手動でセットすることによって得た（全試料について、これらのカーソル位置はともに、融解特徴よりも上のバックグラウンド領域内に位置する）。融解曲線ごとに、カーソル位置内で、平滑化された融解曲線データに２次多項式を（最小２乗技法を使用して）フィットさせた。平滑化された実験的な融解曲線データからバックグラウンド蛍光信号のモデルを差し引くことによって、バックグラウンド補正された融解曲線を形成した。次いで、バックグラウンド補正された融解曲線を正規化した。バックグラウンド補正され、正規化された曲線の導関数は、中心差分技法を使用して近似した。図１２Ｄおよび１４Ｄは、手動バックグラウンド補正技法を示しているが、図１８〜２１および式２０〜２７に関して後述するように、本開示の教示を使用して、バックグラウンド補正された融解曲線データを自動的に計算することもできる。
【０１２８】
図１５は、前述の方法（例えば式１５〜１９）を使用して得た、図１４Ａのタンパク質融解曲線の正規化された導関数アンフォールディング曲線データを示す。したがって、図１５のプロットは、図１４Ａの融解曲線データのアンフォールディング成分（Ｕ（Ｔ））を示す。
【０１２９】
図１６は、ネガティブ試料を特定する方法１６００の一実施形態を示す。本明細書で使用するとき、ネガティブ試料は、有効な融解転移領域を含まない実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を指すことがある。一組の融解曲線は、結果を検証する役目を果たす１つまたは複数のネガティブコントロール試料を含むことがある。あるいは、またはこれに加えて、ネガティブ試料は、融解曲線実験を実行する際のエラー、ＰＣＲ処理におけるエラー、融解曲線を構成する生の蛍光値を測定する際のエラー、特定の実験で使用した結合染料に関係したエラー、核酸生成物の不在、などによって生じる可能性がある。検証目的で、および／または処理時間を短縮するために、および／または無効データを処理することによって生じる他の問題を回避するために、ネガティブ試料を検出することが望ましいことがある。
【０１３０】
ステップ１６１０で、方法１６００を初期化する。この初期化は、上で論じたように、方法１６００を構成する１つまたは複数のコンピュータ可読命令をロードすること、１つまたは複数のハードウェアコンポーネントにアクセスすることなどを含むことができる。
【０１３１】
ステップ１６２０で、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）にアクセスする。
【０１３２】
ステップ１６３０で、その実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を使用して、偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成する。偏差関数Ｅ（Ｔ）は、前述の式９〜１４および／または図３の方法３００に従って生成することができる。したがって、方法３００を使用して生成された偏差関数Ｅ（Ｔ）にアクセスするように方法１６００を構成することができ、および／または、方法１６００は、方法３００の１つもしくは複数のステップを含むことができる。
【０１３３】
ステップ１６４０で、偏差関数Ｅ（Ｔ）を解析して、偏差関数Ｅ（Ｔ）が有効な融解転移領域を含むかどうかを判定する。上で論じたように、この偏差関数Ｅ（Ｔ）は、その実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）がバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）のモデルから外れる程度を（例えば対応するそれぞれの指数減衰因子間の偏差に換算して）定量化することができる。Ｆ（Ｔ）がバックグラウンドモデルに一致する（例えばバックグラウンド領域内の）温度領域では偏差関数Ｅ（Ｔ）が小さく、融解領域では偏差関数Ｅ（Ｔ）が増大する。したがって、偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用して、その実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）のどの部分が融解転移領域に対応し、どの部分がバックグラウンドであるのかを特定することができる。この判定は、偏差曲線Ｅ（Ｔ）をしきい値と比較することを含むことができる。このしきい値は、しきい値よりも小さな偏差値がバックグラウンド領域を示し、しきい値よりも大きな偏差値が融解領域を示すように設定することができる。偏差しきい値の一例を図１９に関して後に示す。ある実施形態では、このしきい値を、偏差関数Ｅ（Ｔ）のピークと偏差関数Ｅ（Ｔ）の平均（アベレージ）の比として計算する。あるいは、またはこれに加えて、このしきい値を、一組の融解曲線の解析（例えば偏差関数Ｅ（Ｔ）の平均（アベレージ）ピークの比）から導き出すこともできる。例えば、一組の融解曲線の偏差関数Ｅ（Ｔ）の平均（ミーン）μおよび標準偏差σを計算する。ある特定の量（例えば標準偏差σの２倍）を超えてそのグループとは異なる曲線をその解析から外す。残りの融解曲線Ｆ（Ｔ）を使用して、「平均（アベレージ）最大」を計算する。この平均最大が、（例えばこの最大値の１／ｅ、１／３または他の比率などとして）バックグラウンド領域／融解領域しきい値の基礎をなす。
【０１３４】
ステップ１６４０で、その実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）が有効な融解転移領域を含まない（例えば全てのＴの値について実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）がしきい値よりも小さい）ことを、偏差関数Ｅ（Ｔ）の解析が示している場合、フローはステップ１６５０へ続き、そうでなければ、ステップ１６６０へ続く。
【０１３５】
ステップ１６５０で、その実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）をネガティブ試料としてマークする。ステップ１６５０は、処理対象の一組の融解曲線からその融解曲線を除くこと、および／またはその実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）に「無効」試料ないし「ネガティブ」試料のフラグを立てることを含むことができる。ある実施形態では、その一組の実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）が、１つまたは複数の既知の「ネガティブコントロール」を含む。それらのネガティブコントロールは、ネガティブ試料であることを示す特性を示すように構成された実験的な融解曲線とすることができ、そのため、それらのネガティブコントロールを使用して結果を検証することができる。したがって、ステップ１６５０は、ネガティブ試料の識別子を既知の「ネガティブコントロール」のリストと比較して、そのネガティブ試料が「ネガティブコントロール」であるかどうかを判定することを含むことできる。
【０１３６】
ある実施形態では、ステップ１６６０で、その実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を「有効な」融解曲線としてマークする。別の実施形態では、ステップ１６６０のマーク付けを実行しない（例えば、その一組の融解曲線の中に残っており、および／または「無効」とマークされていない一切の実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を有効とみなす）。
【０１３７】
図１７は、ネガティブ試料を検出する方法１７００の代替実施形態を示す。ステップ１７１０、１７２０および１７３０で、ステップ１６１０〜１６３０に関して上で説明したとおりに、方法１７００を初期化し、融解曲線データにアクセスし、偏差関数を計算する。
【０１３８】
ステップ１７３２で、温度領域［ＴＭＩＮ，ＴＭＡＸ−Ｗ］内の偏差関数Ｅ（Ｔ）の絶対値の最小値（ｍｉｎＥ）を求める。範囲［ＴＭＩＮ，ＴＭＡＸ−Ｗ］内の全てのＴの値について、この最小値ｍｉｎＥをＥ（Ｔ）から差し引いて、Ｅｍ（Ｔ）を得ることができる。
【０１３９】
【数２０】
【０１４０】
ステップ１７３４で、この変更された偏差関数Ｅｍ（Ｔ）の最大値ｍａｘＥおよび平均（アベレージ）値または平均（ミーン）値μＥを計算する。
【０１４１】
ステップ１７３６で、変更された偏差関数Ｅｍ（Ｔ）の最大値ｍａｘＥと平均（アベレージ）値または平均（ミーン）値μＥの比ＲＥを計算する。
【０１４２】
【数２１ａ】
【０１４３】
ステップ１７４０で、方法１７００は、比ＲＥを使用して、その曲線がネガティブ試料であるかどうかを判定する。ある実施形態では、ステップ１７４０が、ステップ１７３６で計算した比ＲＥをしきい値と比較することを含む。このしきい値は、方法１７００のユーザが定義してもよく、および／または所定の値としてもよい。例えば、自動高分解能融解曲線解析では、このしきい値を５とすることができる。このしきい値よりも小さい比ＲＥは、融解領域が存在しないこと、そのためその融解曲線Ｆ（Ｔ）がネガティブ試料であることを示し、その場合、フローはステップ１７５０へ続き、そうでなければ、ステップ１７６０へ続く。ステップ１７５０では、ステップ１６５０に関して上で説明したとおりに、融解曲線Ｆ（Ｔ）を無効試料ないしネガティブ試料としてマークする。ステップ１７６０では、ステップ１６６０に関して上で説明したとおりに、融解曲線Ｆ（Ｔ）を有効な試料としてマークする。
【０１４４】
図１８は、偏差解析を使用して融解曲線のバックグラウンド領域および／または融解領域を自動的に特定する方法１８００の一実施形態を示す。後に論じるように、方法１８００を使用して特定した温度領域を使用して、自動バックグラウンド差引きプロセスを提供すること、および／または融解曲線データを表示し、もしくは融解曲線データの他の処理を実行することができる。
【０１４５】
ステップ１８１０で、方法１８００を初期化する。この初期化は、上で論じたように、方法１８００に必要な資源を割り当て、および／または方法１８００に必要な資源を初期化すること、コンピュータ可読記憶媒体から１つまたは複数の命令および／または別個のソフトウェアモジュールをロードすること、ハードウェアコンポーネントにアクセスすることなどを含むことができる。
【０１４６】
ステップ１８２０で、方法１８００は、一組の生の蛍光測定値を温度の関数として含む実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）にアクセスする。この実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）は、バックグラウンド蛍光成分Ｂ（Ｔ）を含むことがあり、そのため、バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）と「真の」融解曲線蛍光Ｍ（Ｔ）の和としてモデル化することができる。上で論じた式１を参照されたい。ある実施形態では、ステップ１８２０のアクセスすることがさらに、正規化された実験的な融解曲線
【数２１ｂ】
にアクセスし、および／またはこの正規化された実験的な融解曲線を計算することを含む。
【０１４７】
ステップ１８３０で、偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成する。この偏差関数は、前述の方法３００を使用して生成することができる。したがって、ステップ１８３０は、外部プロセス（例えば方法３００）によって生成された偏差関数Ｅ（Ｔ）にアクセスすることを含むことができ、および／または方法３００において開示した１つもしくは複数のステップを含むことができる。
【０１４８】
ステップ１８４０で、この偏差関数を使用して、正規化カーソルの探索領域、および、拡張により、その融解曲線Ｆ（Ｔ）内の融解転移を特定する。上で論じたとおり、この探索領域は、融解転移領域を間に挟む融解曲線Ｆ（Ｔ）のバックグラウンド領域（例えば融解転移の前の低位バックグラウンド領域および融解転移の後の高位バックグラウンド領域）を含むことができる。したがって、ステップ１８４０の特定することは、低位探索領域Ｔｌｏｗおよび高位探索領域Ｔｈｉｇｈを特定することを含むことができる。低位探索領域Ｔｌｏｗおよび高位探索領域Ｔｈｉｇｈを特定することによって、拡張により、それらの探索領域間の融解転移領域（例えば低位領域Ｔｌｏｗと高位領域Ｔｈｉｇｈの間の温度領域）を特定することができる。
【０１４９】
ステップ１８３０で生成した偏差関数を使用して、関心の温度領域（例えば低位バックグラウンド領域、高位バックグラウンド領域、および／またはそれらのバックグラウンド領域間の融解領域）を特定することができる。これらの温度領域を特定することは、ステップ１８３０の偏差関数Ｅ（Ｔ）を１つまたは複数のしきい値と比較することを含むことができる。前述のとおり、偏差の大きい領域は融解領域を示すことがあり、偏差の小さい領域は、バックグラウンド領域を示すことがある。したがって、ステップ１８３０の特定することは、偏差関数Ｅ（Ｔ）を１つまたは複数のしきい値と比較すること、偏差関数Ｅ（Ｔ）の平均（アベレージ）、および／または偏差関数Ｅ（Ｔ）のピークと平均（ミーン）もしくは平均（アベレージ）の比を計算することなどを含むことができる。
【０１５０】
方法１８００は、単一の融解転移を間に挟む単一の温度領域対（Ｔｌｏｗ、Ｔｈｉｇｈ）の特定を論じているが、当業者は、融解曲線データ内の融解転移の数に応じた任意の数の温度領域（Ｔｌｏｗ、Ｔｈｉｇｈ）を特定するように、方法１８００を適合させることができることを理解するであろう。後に、複数の融解領域を特定する方法２０００の一例を、図２０に関して説明する。したがって、融解曲線内の特定の数の探索領域および／または融解転移を特定することに、本開示が限定されると解釈すべきではない。
【０１５１】
図１９は、例示的ないくつかの偏差関数の偏差プロットの一例を示す。図１９の例では、単一の融解転移１９２０が示されている。したがって、ステップ１８４０では、２つの温度領域（Ｔｌｏｗ１９３０およびＴｈｉｇｈ１９３２）を特定する。別の実験的な融解曲線は、追加の融解転移領域を含むことがある（例えばｎ個の融解転移領域を含むことがある）。したがって、ステップ１８４０の特定は、融解曲線内のｎ個のバックグラウンド温度領域（例えばＴｌｏｗ＿１およびＴｈｉｇｈ＿１、Ｔｌｏｗ＿２およびＴｈｉｇｈ＿２、．．．、Ｔｌｏｗ＿ｎおよびＴｈｉｇｈ＿ｎ）を特定することを含むことがある。各融解転移領域は、それぞれが異なる遺伝子型に対応する複数の融解パターン、例えば１９１２、１９１４および１９１６を含むことがある。しかしながら、それぞれの融解領域の外側において、それらの異なる遺伝子型の融解曲線は類似している。このことは、複数の曲線に対して、（両側にバックグラウンドを有する）１つの融解領域を定義することを可能にする。融解解析は複数の曲線を比較するため、曲線ごとに個別の領域を使用するよりも、これらの集合（アグリゲート）領域を使用した方がしばしば有利である。
【０１５２】
温度領域Ｔｌｏｗ１９３０およびＴｈｉｇｈ１９３２は、とりわけステップ１８３０の偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用して選択することができる。実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の温度範囲［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ］または［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ−Ｗ］内で、融解曲線の偏差関数Ｅ（Ｔ）を、１つまたは複数の偏差しきい値と比較することができる。図１９の例では、偏差関数Ｅ（Ｔ）がしきい値１９１０よりも小さい温度領域を、バックグラウンド領域１９３０および１９３２として特定し、偏差関数Ｅ（Ｔ）がしきい値１９１０よりも大きい領域を融解領域１９２０として特定する。
【０１５３】
しきい値１９１０は予め決めておくことができる。あるいは、またはこれに加えて、複数の実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）の偏差関数Ｅ（Ｔ）を平均することによって、および／または偏差関数Ｅ（Ｔ）のピーク値を使用することによって、しきい値１９１０を計算することもできる。この平均算出および／または比の計算は、異常値の棄却および／または他の統計的技法（例えば上で論じたネガティブ試料の特定）を含むことができる。例えば、一組の融解曲線の偏差関数Ｅ（Ｔ）の平均（ミーン）μおよび標準偏差σを計算する。ある特定の量（例えば標準偏差σの２倍）を超えてそのグループとは異なる曲線をその解析から外す。残りの融解曲線Ｆ（Ｔ）を使用して、「平均（アベレージ）最大」を計算する。この平均最大が、（例えばこの最大値の１／ｅ、１／３または他の比率などとして）しきい値１９１０の基礎をなす。
【０１５４】
図１９は、例示的な３つの偏差関数Ｅ（Ｔ）１９１２、１９１４および１９１６を示している。融解領域１９２０は、偏差関数Ｅ（Ｔ）１９１２、１９１４および／または１９１６が偏差しきい値１９１０よりも大きい領域として示されている。下側バックグラウンド領域１９３０は、偏差関数Ｅ（Ｔ）１９１２、１９１４および／または１９１６が偏差しきい値１９１０よりも小さい温度領域を含む。
【０１５５】
図１８に戻ると、ステップ１８８０で、ステップ１８４０で特定した温度領域（１つまたは複数）を、表示および／または追加の処理に対して使用可能にする。前述のとおり、ステップ１８８０は、特定した温度領域（１つまたは複数）をコンピュータ可読記憶媒体上に記憶すること、それらの領域をＨＭＩ上に表示する（例えば融解曲線データの表示にそれらの領域を上重ねする）こと、それらの領域を使用して、融解曲線データの一部を表示する（例えば融解曲線データの融解領域だけを表示する）こと、外部システムおよび／または外部プロセス（例えば指数バックグラウンド除去プロセス）にデータを送信することなどを含むことができる。
【０１５６】
図２０は、融解曲線内のバックグラウンド領域および／または融解転移領域を自動的に特定する方法２０００の他の実施形態の流れ図である。複数の融解領域、すなわちアンプリコン融解領域およびプローブ融解領域を含む融解曲線内の融解領域を特定するように、図２０の方法２０００を適合させることができる。後に論じるように、この例示的な実施態様では、アンプリコン融解領域の方がプローブ融解領域よりも際立つことがある。（例えばアンプリコン融解領域およびプローブ融解領域を含む）このタイプの融解曲線の解析は、突然変異スキャニングとジェノタイピングの同時実施を可能にすることがある。しかしながら、方法２０００の教示を、異なる融解領域セットを含む別の融解曲線に適用することもできる。したがって、この点に関して方法２０００が限定されると解釈すべきではない。
【０１５７】
上で論じたように、方法２０００が処理する融解曲線は、２つの融解領域（例えばアンプリコン融解領域およびプローブ融解領域）を含むことができる。このような融解曲線の偏差関数プロットの一例を図２１Ａに示す。別個の４つの温度値、すなわちアンプリコン融解領域を間に挟む低位アンプリコン温度値ＴＡ，Ｌおよび高位アンプリコン温度値ＴＡ，Ｈ、ならびにプローブ融解領域を間に挟む低位プローブ温度値ＴＰ，Ｌおよび高位プローブ温度値ＴＰ，Ｈを自動的に特定するように、方法２０００を構成することができる。これらの温度値は、ＴＰ，Ｌ＜ＴＰ，Ｈ＜ＴＡ，Ｌ＜ＴＡ，Ｈとなるように特定される。
【０１５８】
ステップ２０１０および２０２０で、前述のとおりに、方法２０００を初期化し、融解曲線データにアクセスする。
【０１５９】
ステップ２０３０で、融解曲線データの偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成する。この偏差関数Ｅ（Ｔ）は、方法３００を使用することによって、および／または方法３００の１つまたは複数のステップを組み込むことによって生成することができる。
【０１６０】
ステップ２０３２および２０３４で、温度範囲［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ−Ｗ（温度窓の幅）］内の偏差関数Ｅ（Ｔ）の絶対値の最小値ｍｉｎＥを求める。［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ−Ｗ］内の全てのＴの値について、この最小値ｍｉｎＥをＥ（Ｔ）から差し引いて、Ｅｍ（Ｔ）を得ることができる（Ｅｍ（Ｔ）＝｜ＥＴ（Ｔ）｜−ｍｉｎＥ）。図１７のステップ１７３２〜１７３４に関して上で説明したように、Ｅｍ（Ｔ）の最大値ｍａｘＥを求めることができる。
【０１６１】
ステップ２０４０で、第１の温度セットを求める。この第１の温度カーソルセットは、アンプリコン融解領域を間に挟む低位アンプリコンカーソルＴＡ，Ｌおよび高位アンプリコンカーソルＴＡ，Ｈを含むことができる。低位アンプリコンカーソルＴＡ，Ｌは、偏差関数Ｅｍ（Ｔ）の絶対値がある特定の値以上である（Ｅｍ（Ｔ）の温度範囲内の）最も小さいＴの値とすることができる。ある実施形態では、この値が、スケーリングファクタ（例えば１／ｅ、１／３または他のスケーリングファクタ）によってスケーリングされたｍａｘＥである。したがって、温度ＴＡ，Ｌは、式２２を満たす最も低い温度Ｔとして特定することができる。
【０１６２】
【数２２】
【０１６３】
このようにしてＴＡ，Ｌを特定した一例が図２１Ａに示されており、図２１Ａには、ＴＡ，Ｌ２１２４が示されている。
【０１６４】
高位アンプリコン温度値ＴＡ，Ｈは、偏差関数Ｅｍ（Ｔ）の絶対値がある特定の値（例えば１／ｅなどの定数によってスケーリングされたｍａｘＥ）以上である（Ｅｍ（Ｔ）の温度範囲内の）最も大きなＴの値として特定することができる。
【０１６５】
【数２３】
【０１６６】
このようにしてＴＡ，Ｈを特定した一例が図２１Ａに示されており、図２１Ａには、ＴＡ，Ｈ２１２６が示されている。
【０１６７】
ある実施形態では、ステップ２０５０で、ステップ２０４０で特定した第１の温度セットＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈを変更する。値ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈの外側の温度値を使用することによって、この解析を改善することができる。したがって、緩衝定数ＢＡ，ＬおよびＢＡ，Ｈを使用して、温度ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈの両側に、対応するそれぞれのバッファ値ＢＡ，ＬおよびＢＡ，Ｈを含めることができる。緩衝定数ＢＡ，ＬおよびＢＡ，Ｈの値は経験的に求めることができる。これらの緩衝定数は、融解曲線データ内の関心の特徴サイズ（例えば１℃）に近くなるように選択することができる。したがって、これらの温度位置をそれぞれ、ＴＡ，Ｌ−ＢＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈ＋ＢＡ，Ｈになるように変更することができる。図２１Ａを参照されたい。さらに、図２１Ａおよび２１Ｂに示すように、値ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈの両側にＷパラメータを加えることによって、値ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈに基づくバックグラウンド温度領域を定義することができる。
【０１６８】
後に論じるように、温度値ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈ、ならびに／もしくはこれらの温度値によって定義された温度領域を使用して、バックグラウンド領域および／または融解領域を特定し、または指数バックグラウンド差引きプロセスを自動化することができ（例えば、これらの温度を使用して、バックグラウンド蛍光の指数モデルを式２〜６に従って構築することができ）、あるいは、これらの温度値ならびに／もしくは温度領域を、クラスタリング操作またはスキャニング操作で使用することなどができる。
【０１６９】
ステップ２０６０で、Ｅｍ（Ｔ）内のプローブ温度領域を特定する。この温度領域は、第１の温度セットの低位温度（ＴＡ，Ｌ）よりも低い温度範囲を含むことがある。ある実施形態では、この温度領域が、ＴＡ，Ｌ、バッファ値、および／または偏差関数Ｅ（Ｔ）の温度窓ＴＷの幅よりも低い（例えばＥｍ（Ｔ）の全てのＴについてＴＡ，Ｌ−ＢＡ，Ｌ−Ｗよりも低い）。この温度領域は、第２の融解領域（プローブ融解領域）を含み、アンプリコン融解領域を含まない。図２１Ｂを参照されたい。図２１Ａに示すように、プローブ融解領域は、（Ｅｍ（Ｔ）によって定量化される）アンプリコン融解領域ほど際立ってはいない。この理由から、第２の温度セット（例えばプローブ温度ＴＰ，ＬおよびＴＰ，Ｈ）は、第１の温度セット（ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈ）の後に、Ｅ（Ｔ）のサブセットを使用して特定することができる。しかしながら、他の実施形態および／または他のタイプの融解曲線では、これが当てはまらないこともある。したがって、本開示が、温度セットの特定の順序および／または数に限定されると解釈すべきではない。
【０１７０】
ステップ２０６２で、ステップ２０６０で特定した領域内におけるＥ（Ｔ）の最小値ｍｉｎＥを求める。上で論じたステップ２０３２を参照されたい。ｍｉｎＥを使用して、その温度領域内においてＥｍ２（Ｔ）を生成することができる（ステップ２０３２〜２０５０で論じたＥｍ（Ｔ）から区別するため、本明細書ではＥｍ２（Ｔ）と呼ぶ）。
【０１７１】
ステップ２０６４で、Ｅｍ２（Ｔ）の最大値ｍａｘＥ２を求める。上で論じたステップ２０３４を参照されたい。図２１Ａおよび２１Ｂの点２１４２も参照されたい。
【０１７２】
ステップ２０７０で、ステップ２０６４で求めた最大値ｍａｘＥ２を使用して、第２の温度セットを特定する。第２の温度セットの低位温度値ＴＰ，Ｌは、Ｅｍ２（Ｔ）の値が、定数（例えば１／ｅ）によってスケーリングされたｍａｘＥ２よりも大きい温度領域内の最も低い温度とすることができる。図２１ＢのＴＰ，Ｌ２１５４を参照されたい。第２の温度セットの高位温度値ＴＰ，Ｈは、Ｅｍ２（Ｔ）の値が、定数（例えば１／ｅ）によってスケーリングされたｍａｘＥ２以上である温度領域内の最も高い温度とすることができる。図２１ＢのＴＰ，Ｈ２１５６を参照されたい。
【０１７３】
ステップ２０８０で、対応するそれぞれの緩衝定数および／または偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成するために使用した温度窓の幅Ｗを使用して、第２の温度セットＴＰ，ＬおよびＴＰ，Ｈを変更する。上で論じたステップ２０５０を参照されたい。図２１Ｂの点２１６４および２１６６も参照されたい。
【０１７４】
ステップ２０９０で、第１および第２の温度セットを、表示、および／または１つもしくは複数の外部プロセスでの使用に対して使用可能にする。ある実施形態では、後に論じるように、これらの温度セットを使用して、指数バックグラウンド差引きプロセスを自動化する。例えば、第１の温度セット（ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈ）を使用して、アンプリコン融解領域のバックグラウンドを差し引くことができ、第２の温度セット（ＴＰ，ＬおよびＴＰ，Ｈ）を使用して、プローブ融解領域のバックグラウンド蛍光を差し引くことができる。上で論じた式１〜６を参照されたい。あるいは、またはこれに加えて、これらの温度値セットを使用して、アンプリコン融解領域および／またはプローブ融解領域の表示および／または処理（例えば、対応するそれぞれの融解領域（１つまたは複数）のスケーリングされ、および／またはズームされた図を自動的に表示すること、関連領域（１つまたは複数）内のクラスタリングを自動化することなど）を提供することができる。
【０１７５】
図２１Ａおよび２１Ｂは、アンプリコン融解領域およびプローブ融解領域を含む融解曲線を使用して生成した例示的な偏差関数Ｅｍ（Ｔ）２１１０のプロットである。
【０１７６】
図２１Ａは、前述の方法２０００のステップ２０３０〜２０５０の操作を示す。例えば、２１１２は、Ｅｍ（Ｔ）の最大値ｍａｘＥを示し、２１１４は、スケーリングファクタ（１／ｅ）によってスケーリングされた最大値ｍａｘＥ、２１２４は、Ｅｍ（Ｔ）がｍａｘＥ／ｅ以上である最も低い温度ＴＡ，Ｌ、２１２６は、Ｅｍ（Ｔ）がｍａｘＥ／ｅ以上である最も高い温度ＴＡ，Ｈである。図２１Ａに示すように、対応するそれぞれの緩衝定数２１３４および２１３６ならびに／または温度窓の幅Ｗによって、温度値ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈを変更することができる。
【０１７７】
図２１Ｂは、前述の方法２０００のステップ２０６０〜２０８０の操作を示す。プロット２１４０はプローブ融解領域を含み、このプローブ融解領域は、Ｅｍ（Ｔ）の温度範囲のサブセット（例えばＴＡ，Ｌ−ＢＡ，Ｌ−Ｗよりも低い温度範囲）を含むことができる。関数Ｅｍ２（Ｔ）は、プローブ融解領域（例えばステップ２０５０で特定した温度範囲）内の全てのＥ（Ｔ）値について、偏差関数の絶対値の最小値ｍｉｎＥを差し引くことによって生成する。Ｅｍ２（Ｔ）２１４２の最大値ｍａｘＥ２を使用して、温度値ＴＰ，Ｌ２１５４およびＴＰ，Ｈ２１５６を特定することができる。低位プローブ温度ＴＰ，Ｌ２１５４は、Ｅｍ２（Ｔ）が、スケーリングされた最大値ｍａｘＥ２（ｍａｘＥ２／ｅ）以上である最も低い温度として特定され、高位プローブ温度ＴＰ，Ｈ２１５６は、Ｅｍ２（Ｔ）が、スケーリングされた最大値ｍａｘＥ２（ｍａｘＥ２／ｅ）以上である最も高い温度として特定される。図２１Ｂに示すように、対応するそれぞれの緩衝定数２１６４および２１６６ならびに／または温度窓の幅Ｗを使用して、温度ＴＰ，ＬおよびＴＰ，Ｈを変更することができる。
【０１７８】
上で論じたように、方法２０００で特定した温度値を使用して、実験的な融解曲線からバックグラウンド蛍光信号Ｂ（Ｔ）を差し引くことができる。これは、方法２０００で特定したバックグラウンド温度値（例えばアンプリコン融解領域およびプローブ融解領域を間に挟む温度値）を使用して実行することができる。そのようにして特定した温度値を使用して、指数バックグラウンド信号を式２〜５に従ってモデル化することができる。式６に従って、その指数バックグラウンドのモデルを、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）から差し引くことができる。
【０１７９】
図２１Ｃは、カーソルプローブ領域を特定するプロセスの他の例を示す。偏差関数２１６０は例えばタンパク質融解曲線に対応する。この例示的な偏差関数２１６０は、ベースライン偏差２１６５、融解領域および（カーソルプローブ領域２１７５として示された）バックグラウンド領域を含む。偏差関数２１６０の融解領域は、それぞれが異なるタンパク質に対応する複数の融解パターンを含むことがある。しかしながら、（融解領域（１つまたは複数）の外側の）カーソルプローブ領域２１７５では、異なるタンパク質の融解曲線が類似している。このことは、複数の曲線に対して、１つのバックグラウンド領域（カーソルプローブ領域２１７５）を使用することを可能にする。融解解析は複数の曲線を比較するため、曲線ごとに個別の領域を使用するよりも、集合領域（例えば領域２１７５）を使用した方がしばしば有利である。
【０１８０】
カーソルプローブ領域２１７５は、（図２０のステップ２０４０のとおりに）バックグラウンドカーソル温度Ｔｃ２１７４を選択することによって特定することができる。バックグラウンドカーソル温度Ｔｃ２１７４は、偏差しきい値２１６４よりも大きく、および／または偏差しきい値２１６４に等しい偏差関数２１６０に沿った（温度範囲［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ］または［Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ−Ｗ］内の）最も高い温度として特定することができる。この偏差しきい値は、最大値ｍａｘＥ２１６２（または最大値ｍａｘＥ２１６２とベースライン偏差２１６５の間の高さ）と定数（例えばｅ）の比として定義することができる。上式２２および２３を参照されたい。図２１Ｃに示すように、カーソルプローブ領域２１７５は、バックグラウンドカーソル温度Ｔｃ２１７４よりも高く、および／またはバックグラウンドカーソル温度Ｔｃ２１７４に等しい温度を含むと定義することができる。
【０１８１】
上で論じたように、偏差しきい値２１６４の値は、予め決めておくことができ（定数）、および／または偏差関数Ｅ（Ｔ）の最大値ｍａｘＥ２１６２を使用していることができる。あるいは、またはこれに加えて、複数の実験的な融解曲線の偏差関数Ｅ（Ｔ）を平均することによって、しきい値２１６４を計算することもできる。この平均算出および／または比の計算は、異常値の棄却および／または他の統計的技法（例えば上で論じたネガティブ試料の特定）を含むことができる。例えば、一組の融解曲線の偏差関数Ｅ（Ｔ）の平均（ミーン）μおよび標準偏差σを計算する。ある特定の量（例えば標準偏差σの２倍）を超えてそのグループとは異なる曲線をその解析から外す。残りの融解曲線Ｆ（Ｔ）を使用して、「平均（アベレージ）最大」を計算する。この平均最大が、（例えば１／ｅ、１／３または他の比として）しきい値２１６４の基礎をなす。
【０１８２】
方法１８００および／または２０００で特定し、ならびに／または図２１Ａ〜２１Ｃを使用して特定したバックグラウンド温度領域（カーソルプローブ領域）を使用して、バックグラウンド補正プロセスを自動化することができる。図２２は、偏差解析を使用して指数バックグラウンド差引きを自動化する方法２２００の流れ図である。
【０１８３】
ステップ２２１０〜２２３０で、前述のとおりに、方法２２００を初期化し、融解曲線データにアクセスし、この融解曲線データから偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成する。
【０１８４】
ステップ２２４０で、融解曲線データ内のバックグラウンド温度領域を特定する。バックグラウンド温度領域は、図１８の方法１８００を使用して（偏差関数Ｅ（Ｔ）を１つまたは複数のしきい値と比較することによって）特定することができる。あるいは、またはこれに加えて、方法２０００に従って（例えば偏差関数Ｅ（Ｔ）のスケーリングされた最大値を使用して）バックグラウンド領域を特定することもできる。
【０１８５】
ステップ２２５０で、目的関数（Φ）にアクセスする。目的関数Φは、最適化問題（方法２２００の場合には、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）内の指数バックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）をモデル化するために使用するカーソル位置の位置設定など）に対する特定の解の望ましさ（デザイラビリティ）を定義することができる。ある実施形態では、ステップ２２５０でアクセスする目的関数Φが、以下の形の関数である。
【０１８６】
【数２４ａ】
【０１８７】
式２４で、ＴＬおよびＴＲは、温度軸に沿った正規化カーソル位置（その曲線の融解領域を間に挟む温度）を表す。式２４の目的関数は、ある種の条件に従うことがある。例えば、正規化カーソル位置ＴＬおよびＴＲの探索空間を、ステップ２２４０で特定した温度領域に限定することができる。
【０１８８】
実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）と理想融解曲線の間の誤差を最小化するように、目的関数Φを構成することができる。図２３Ａは、「理想」融解曲線の例および正規化された実験的な融解曲線
【数２４ｂ】
の一部を示す。図２３Ａに示すように、曲線２３１０および２３１２はともに、低位バックグラウンド領域２３２６、高位バックグラウンド領域２３２８および融解領域２３２５を含む。理想融解曲線２３１０では、融解領域２３２５が、滑らかな単調非増加関数としてモデル化されている。理想融解曲線２３１０と実験的な融解曲線
【数２４ｂ】
２３１２は、バックグラウンド領域２３２６および２３２８では類似しているが、融解領域２３２５では偏差を示す。したがって、理想曲線２３１０と実験曲線２３１２の間の偏差を使用して、（例えば理想曲線２３１０と実験曲線Ｆ（Ｔ）２３１２の指数減衰率を、例えば方法１８００および２０００に関して上で説明したとおりに比較することによって、）バックグラウンド領域２３２６および２３２８を融解領域２３２５から区別することができる。
【０１８９】
領域２３２０内において、曲線２３１０と２３１２は発散する。領域２３２０は、図２３Ｂに拡大図が示されている。面積２３２２は、理想融解曲線２３１０と正規化された融解曲線２３１２の（温度Ｔに沿って積分した）全体差を示す。正規化された融解曲線
【数２４ｂ】
２３１２が、蛍光中間点（正規化後の０．５蛍光）を通る温度をＴ１／２ ２３２４と定義することができる。
【０１９０】
図２３Ａおよび２３Ｂは、単一の融解領域２３２５を含む理想融解曲線および実験的な融解曲線２３１０および２３１２を示しているが、この点に関して本開示は限定されない。当業者には理解されることだが、本開示の教示を、任意の数の融解領域（および対応するバックグラウンド領域）を含むより複雑な融解曲線に適用することもできる。
【０１９１】
ある実施形態では、ステップ２２５０でアクセスする目的関数Φが、Ｔ１／２点２３２４の前に生じる１に対する誤差を最小化し、Ｔ１／２点２３２４の後に生じる０に対する誤差を０に最小化するように構成されている。さらに、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）が、融解転移領域（例えば図２３の領域２３２５）内において、単調に減少する指数関数に一致するように、目的関数Φを構成することができる。
【０１９２】
図２２を再び参照すると、「バックグラウンド」として特定された温度領域内に限って温度カーソル位置を探索するように、ステップ２２５０でアクセスする目的関数Φを構成することができる。低位バックグラウンド領域および高位バックグラウンド領域内への拘束を含むように、目的関数Φを書き直すことができる。
【０１９３】
【数２５】
【０１９４】
上で論じたように、融解転移の前（例えば図２３のＴ１／２点２３２４の前）に生じる１に対する誤差を最小化し、融解転移の後に生じる０に対する誤差を最小化するように、目的関数Φを構成することができる。下式２６の目的関数はそのように構成されている。
【０１９５】
【数２６ａ】
【０１９６】
式２６で使用されるとき、演算子
【数２６ｂ】
（例えば
【数２６ｃ】
に適用されている）は、以下の特性を有する。
【０１９７】
【数２７】
【０１９８】
ステップ２２６０で、方法２２００は、目的関数Φを使用して、最適な正規化カーソル値を特定する。ステップ２２６０の特定は、Ｔｌｏｗ温度領域およびＴｈｉｇｈ温度領域内のさまざまな温度値において、目的関数Φを評価することを含むことができる。ある実施形態では、これらの領域を、所定の数の値（例えばそれぞれの領域内の３０個の離散温度値）に量子化する。目的関数Φを最小化する温度ＴＬおよびＴＲを、最適なカーソル位置として特定することができる。ステップ２２６０の特定は、極小検出、最急降下、勾配降下などを含む当技術分野で知られている任意の最適化技法を含むことができる。
【０１９９】
ステップ２２７０で、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）を処理して、実験的な融解曲線Ｆ（Ｔ）のバックグラウンド蛍光Ｂ（Ｔ）成分を除去する。上で論じた式１〜６を参照されたい。ステップ２２７０の除去は、最適な温度値ＴＬおよびＴＲを使用してバックグラウンド蛍光をモデル化することを含むことができる。このモデルを、上で論じた式６に従って融解曲線データから差し引くことができる。
【０２００】
ステップ２２８０で、「真の」融解曲線データＭ（Ｔ）を使用可能にする。これは、上で論じたように、この補正されたデータを表示すること、補正されたデータをコンピュータ可読記憶媒体に記憶すること、補正されたデータを別のプロセッサおよび／またはシステムに送信することなどができるようにすることを含むことができる。
【０２０１】
図２４は、バックグラウンド蛍光補償を自動化する方法２４００の他の実施形態である。方法２４００は、バックグラウンド差引きの結果に対する改善を可能にするために、フィードバックステップおよび評価ステップを含む。
【０２０２】
ステップ２４１０〜２４７０は、方法２２００に関して上で説明したステップ２２１０〜２２７０と同じように実施することができる。
【０２０３】
テップ２４７２で、処理され、および／または正規化された融解曲線データＭ（Ｔ）を使用して、追加の解析を実行する。例えば、この融解曲線データＭ（Ｔ）をＨＭＩ内に表示し、またはジェノタイピング操作、スキャニング操作、クラスタリングプロセス、グルーピングプロセスなどで使用する。
【０２０４】
ステップ２４７２で実行した解析の結果の質（クオリティ）を定量化することができることがある。例えば、ステップ２４７２の解析が、クラスタリング操作またはグルーピング操作を含む場合、クラスタ／グループ間の分離性（セパレーション）を評価して、操作の「質」を決定することができる。したがって、ステップ２４８０で、質メトリックを計算する。この質メトリックを使用して、ステップ２４６０のバックグラウンド除去の質を定量化する（例えば「最適な」カーソルＴＬおよびＴＲの質を定量化する）ことができる。
【０２０５】
式２８は、クラスタリング操作および／またはグルーピング操作の質を定量化する１つの方式を示す。
【０２０６】
【数２８ａ】
【０２０７】
式２８に示すように、質メトリックγは温度の関数である。式２８は、２つのクラスタ／グループの質を、グループ間の分離性およびグループ内の凝集性（コヒージョン）の関数として定量化する（式２８ではこれらのグループがグループ１および２として特定される）。グループ／クラスタの質は、グループ平均（ミーン）値の分離および個々のグループ分散の和によって決定される。低い質メトリックγは、グループ１および２内の大きな偏差、および／またはグループ平均（ミーン）間の小さな分離に起因する。あるいは、グループがタイトにクラスタリングされており（
【数２８ｂ】
および
【数２８ｃ】
の値が小さい）、および／またはグループどうしが広く分離されている（差μ１（Ｔ）−μ２（Ｔ）が大きい）場合、質メトリックγは「良好」となる。
【０２０８】
本明細書では質メトリックの一例を論じるが、当業者は、（ステップ２４７２の解析に関係する任意の一組の因子に応じた）任意の質メトリックを本開示の教示の下で使用することができることを理解するであろう。
【０２０９】
ステップ２４８２で、ステップ２４８０で計算した質メトリックを評価する。この評価は、融解曲線データに対する改良をさらに実行する（例えばステップ２４８４でバックグラウンド除去カーソル位置を変更する）かどうかを判定することができる。したがって、ステップ２４８２は、質メトリックを１つまたは複数のしきい値と比較することを含むことができる。あるいは、またはこれに加えて、ステップ２４８２の判定は、現在の質メトリックを、ステップ２４６０〜２４８０の以前の１回または数回の繰返しで得た質メトリックと比較することを含むこともできる。このメトリックが一貫した改善を示している（例えば改善勾配をたどっている）場合には、改良を続けることが望ましいと判定することができ、（例えば所定の数の繰返しに比べて）質メトリックが低下している場合には、改良を続けても改善が見込めない可能性がある。さらに、この判定は、最大繰返しカウンタまたは他の処理限界を評価することを含むことができる。カーソル位置のさらなる改良を実行すべきと判定された場合、フローはステップ２４８４へ続き、そうでなければ、ステップ２４９０へ続く。
【０２１０】
ステップ２４８４で、正規化カーソル位置を改良する。ステップ２４８４で加える改良は、用途に特化した改良とすることができる（例えば、ステップ２４７２で実行した解析によって定義することができる）。あるいは、またはこれに加えて、この改良は、カーソル位置の１つもしくは複数の所定のシフト、および／またはユーザが選択可能なカーソル位置の１つもしくは複数のシフトを実行することを含むことができる。ある実施形態では、ステップ２４８０で計算した質メトリックがこの改良を決定する。あるいは、またはこれに加えて、カーソル位置ＴＬおよびＴＲに対する改良を、所定のパターンに従って実施することもでき、および／または、カーソル位置ＴＬおよびＴＲに対する改良がランダムな成分を含んでもよい。ステップ２４８４の改良はさらに、改良されたカーソル位置を使用して目的関数Φを評価することを含むことができる。ある変更によって目的関数Φの結果が不良になる場合には、より良好な結果を与える別の変更のために、その変更を破棄することができる。カーソル位置を改良した後、ステップ２４６０〜２４８２のバックグラウンド除去、解析、質メトリック計算および評価を実行することができる。
【０２１１】
ステップ２４９０で、解析結果および／または処理された融解曲線データを使用可能にする。上で論じたように、データを使用可能にすることは、そのデータをＨＭＩ上に表示すること、そのデータをコンピュータ可読記憶媒体に記憶すること、そのデータを他のプロセスおよび／またはシステムに送信することなどを含むことができる。
【０２１２】
低温融解転移または幅広い温度範囲にわたる転移の偏差プロットはしばしば、他の種類のプロットよりも、正確に自動クラスタリングすることが容易であることが分かっている。例えば、Ａ＞Ｃトランスバージョンであるヒト単一塩基多様体ｒｓ＃７２９１７２を、スナップバックプライマを使用して増幅し、その遺伝子型を判定した。スナップバックプライマは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１０９８２３号の主題である。スナップバックプライマに関する追加の情報は、「Ｚｈｏｕ Ｌ．他、Ｓｎａｐｂａｃｋ Ｐｒｉｍｅｒ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ＤＮＡ Ｄｙｅ ａｎｄ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ、５４（１０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１６４８〜５６（２００８年１０月）」に出ている。
【０２１３】
一例では、偏差解析後には異なる遺伝子型が正確にクラスタリングされたが、指数バックグラウンド差引き後には正確にクラスタリングされなかった。以下のプライマを使用して、ヒトゲノムＤＮＡからの１６２ｂｐ生成物を増幅した。
【０２１４】
ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＡＴＴＡＧＣ （配列ＩＤ Ｎｏ．６）、および
【０２１５】
ｇｇＴＣＴＧＣＡＧＡＣＣＧＡＡＴＧＴＡＴＧＣＣＴＡＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＡＧＡ （配列ＩＤ Ｎｏ．７）
【０２１６】
上記配列６および７の下線が引かれた塩基は、ヒトＤＮＡターゲットと相同であり、下線が引かれていない大文字の塩基は、スナップバックプライマのプローブ要素を構成し、太字の塩基は、単一塩基多様体の位置であり、小文字の塩基は、ターゲットにミスマッチされた２塩基オーバハングである。このＰＣＲは、ＬＣ４８０リアルタイム機器（ロシュ・アプライド・サイエンスから市販されている）内で、０．５μＭの制限プライマ、０．０５μＭのスナップバックプライマ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．３、５００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、１Ｘ ＬＣＧｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、および０．０４Ｕ／μｌのＫｌｅｎＴａｑ １ポリメラーゼ（ＡＢ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含む５ｎｇ／ｐｌのヒトゲノムＤＮＡが存在する条件下で、１０μｌの反応体積で実行した。この反応混合物を９５℃に加熱して、２分置き、次いで、９５℃、４．４℃／秒、１０秒保持、５８℃、２．２℃／秒、１０秒保持、７６℃、４．４℃／秒、１５秒保持のサイクルを５０回繰り返した。続いて、４．４℃／秒で９５℃に加熱し、１０秒保持、２．２℃／秒で４２℃に冷却し、１秒保持、０．１℃／秒で９８℃に加熱する融解プロトコルを実行し、１０回／℃の取得率で蛍光をモニタした。
【０２１７】
スナップバックプローブ融解転移の温度区間を、融解曲線の検査によって手動で特定し、２つの方法で処理した。図２５は、上で参照によって本明細書に組み込んだＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０３５８０６号に記載された不偏階層法によって、自動クラスタリングした偏差プロットを示す。
【０２１８】
この例では使用しないが、図２５に示したクラスタリング結果を使用し、質評価技法およびフィードバック技法を使用することによって、バックグラウンド差引きおよび／または温度領域の特定を改良することができる。このような技法を使用して融解曲線解析を改良する方法の一例を、図２４に関して説明した。図２９のステップ２４７０〜２４８２を参照されたい。式２０も参照されたい。例えば、図２５に示したグループ内の凝集性およびグループ間の分離性を定量化するように、式２８の質メトリックを適合させることができる。この質メトリックを評価して、（バックグラウンド差引きおよび／または温度領域の特定に対して使用する）温度領域を、より良好な結果（これは質メトリックによって定量化される）を与えるように改良すべきかどうかを判定することができる。
【０２１９】
このクラスタリングは、異なる遺伝子型を正確に分離し、約６６℃および７４℃にＴｍを有する予想されたホモ接合体およびヘテロ接合体を表示し、６８℃の異なるＴｍのところに予想外のヘテロ接合体を特定する。対照的に、指数バックグラウンド差引きだけによって同じデータを処理し、導関数プロットとして表示した場合には、全く同じ方法による自動クラスタリングでも、予想されたヘテロ接合体の区別に失敗する（図２６）。低温ホモ接合体とヘテロ接合体が一緒にクラスタリングされ、ジェノタイピングが不正確になる。これはおそらく、１つには、遺伝子型内の曲線の分散が大きいことが原因である。
【０２２０】
偏差解析を使用して、（方法１６００および１７００に関して上で説明したように）ネガティブ試料を特定することができる。さらに、偏差解析を使用して、クラスタリングおよびジェノタイピングのためのプローブ解析領域を自動的に求めることもできる。例えば、方法１８００および２０００は、融解曲線データ内の融解領域（１つまたは複数）を、偏差解析を使用して自動的に特定する。
【０２２１】
一例として、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる「Ｚｈｏｕ Ｌ．他、ＣＴ．Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｃａｎｎｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、５１（１０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１７７０〜７７（２００５年１０月）」に記載された方法の後に、非標識プローブを使用したＰＣＲおよび融解解析によって、Ｆ５ライデン単一塩基多様体の遺伝子型を判定した。
【０２２２】
（全体で３つの遺伝子型の）ポジティブ試料とネガティブ（テンプレート無しコントロール）試料とがチェッカー盤の形に散らばるように、９６穴プレート上に試料を置いた。ＰＣＲおよび融解解析の後、５０から９５℃までの未処理の融解曲線にアクセスした。図２７は、そのようにして得た未処理の融解曲線のプロットを示す。
【０２２３】
図２７に示すように、これらの曲線は２つのクラスタに分かれ、ポジティブ試料からなる上側のクラスタは、非標識プローブの融解転移とＰＣＲ生成物の融解転移の両方を含み、ネガティブ試料からなる下側のクラスタは予想された融解転移を示さず、その代わりに、代替生成物の意図しない増幅により、７５℃付近に予想外の転移が存在する。図２８は、（図２７では直線カットオフとして示されている）振幅カットオフ技法を使用して検出した一組の試料インジケータを示す。図２８に示すように、ネガティブ試料はいずれもこの技法を使用して正確に特定されなかった。
【０２２４】
それぞれの融解曲線に対して偏差関数Ｅ（Ｔ）を生成し、それらの偏差関数Ｅ（Ｔ）を使用して、ネガティブ試料（例えばテンプレート無しコントロール試料）を自動排除した。図１６および１７に関して上で説明したように、ネガティブ試料の特定を使用して、解析しうる信号を生成しない融解曲線を排除することができる。この例では、図１７の方法１７００に従ってネガティブ試料の特定を実行した。そのため、このネガティブ試料の特定は、区間［ＴＭＩＮ，ＴＭＡＸ−Ｗ］にわたって偏差関数Ｅ（Ｔ）の絶対値の最小ｍｉｎＥを求め、前述のとおりにＥＭ（Ｔ）を計算し（全てのＴ値についてｍｉｎＥを差し引き）、最大値ｍａｘＥおよびＥＭ（Ｔ）の平均（ミーン）または平均（アベレージ）を計算し、最大値ｍａｘＥと平均（ミーン）または平均（アベレージ）の比を計算し、その比をしきい値と比較することを含む。この例ではしきい値を５に設定した。
【０２２５】
図２９は、ネガティブ試料が除去された図２７の一組の融解曲線を示す。図２９に示すように、下側の一組の融解曲線（図２７の下部の部分に見られたネガティブ試料）はもはや、この一組の「有効」融解曲線には含まれていない。図３０は、前述の偏差解析技法を使用して検出したネガティブ試料を含む一組の試料インジケータを示す。図２８（振幅カットオフを使用したネガティブ試料の特定）と比較すると、図３０は、偏位分析の使用が、振幅カットオフ法が特定できなかったネガティブ試料の特定の成功を可能にしたことを示している。偏差解析とネガティブ試料の特定の振幅カットオフ法は、独立した解析であるため、並行して（例えば同時に）実施することができる。
【０２２６】
ネガティブデータの自動排除の後、偏差関数をさらに使用して、ＰＣＲ生成物（アンプリコン）融解領域と、プローブ融解領域と、全ての融解領域を含む全体領域とを特定した。この例では、図２０に関して上で説明したとおりに、４つの別個の温度を特定した：ＴＰ，Ｌ＜ＴＰ，Ｈ＜ＴＡ，Ｌ＜ＴＡ，Ｈ。低い方の温度対は、プローブ融解領域を間に挟みＴＰ，Ｌ＜Ｔ＜ＴＰ，Ｈ、高い方の温度対はアンプリコン融解領域を間に挟むＴＡ，Ｌ＜Ｔ＜ＴＡ，Ｈ。同時突然変異スキャニング／ジェノタイピングのための全体融解領域の自動解析の一例では、これらの４つの温度の中の極端対、すなわちＴＰ，Ｌ＜Ｔ＜ＴＡ，Ｈを使用することができ、そのため、追加の温度を計算する必要がない。
【０２２７】
アンプリコン領域は、ＴＡ，Ｌ＜Ｔ＜ＴＡ，Ｈによって特定されるが、ＴＡ，ＬおよびＴＡ，Ｈの両側のバッファ値Ｂを使用して、これらの境界の十分に外側で解析を開始した。したがって、解析領域は、ＴＡ，Ｌ−Ｂ＜Ｔ＜ＴＡ，Ｌ＋Ｂになる。図２０のステップ２０５０を参照されたい。
【０２２８】
適当なバッファ値Ｂは、機器特性（雑音、データ密度）および一般に約１℃であるデータから抽出する最小特徴サイズによって求めた。さらに、（指数バックグラウンド差引きなどの）いくつかの解析法は、計算のために両側に温度区間を必要とし、そのため、これらの区間を定義するために、それぞれの緩衝帯の外側に追加の幅（Ｗ）を含めることができる。図２０のステップ２０５０を参照されたい。
【０２２９】
これらの４つのそれぞれのＢおよびＷ値は、同じでもまたは異なっていてもよいことが理解される。複数の融解曲線を一度に解析するときには、平均（アベレージ）区間または最も外側の区間を使用することができる。
【０２３０】
アンプリコンバックグラウンド領域およびアンプリコン融解領域を特定した後、プローブ融解領域を含む温度範囲を求める。上で論じたように、この温度領域は、アンプリコン領域よりも低い［ＴＭＩＮ，ＴＡ，Ｌ−（Ｂ＋Ｗ）］を含む。図２０のステップ２０６０を参照されたい。この温度領域内で、区間［ＴＭＩＮ，ＴＡ，Ｌ−（Ｂ＋Ｗ）］内の｜Ｅ（Ｔ）｜の最小値ｍｉｎＥ２を特定し、区間［ＴＭＩＮ，ＴＡ，Ｌ−（Ｂ＋Ｗ）］にわたって関数ＥＭ２（Ｔ）を構築する（ＥＭ２（Ｔ）＝｜Ｅ（Ｔ）｜−ｍｉｎＰ）。図２０のステップ２０６２を参照されたい。ＥＭ２（Ｔ）の最大値ｍａｘＥ２を求める。図２０のステップ２０６４を参照されたい。
【０２３１】
上で特定したプローブ温度領域を評価して、プローブ融解領域が存在するかどうかを（例えば図１６および１７の方法１６００および１７００に開示したネガティブ試料の特定を使用して）判定した。この例では、対応するそれぞれの偏差プロット上のプローブピークとアンプリコンピークの比が約０．０２よりも小さい場合（ｍａｘＥ２＜ｍａｘＥ／ｅ４の場合）、そのデータ中に自動的に検出可能なプローブ融解はないと判定する。融解曲線データを取得するために使用する機器の分解能によっては、０．０２以外の値を選択することもできることが理解される。
【０２３２】
図１７の方法１７００に従って、プローブ温度値（ＴＰ，ＬおよびＴＰ，Ｈ）を特定した。したがって、温度（ＴＰ，ＬおよびＴＰ，Ｈ）を特定することは、ｍａｘＥ２が上記のしきい値（ｍａｘＥ／ｅ４）よりも大きい場合に、ＴＰ，Ｌを、［ＴＭＩＮ，ＴＡ，Ｌ−（Ｂ＋Ｗ）］内のＥＭ２（Ｔ）＞ｍａｘＥ２／ｅである最も小さなＴとすることを含む。ＴＰ，Ｈは、［ＴＭＩＮ，ＴＡ，Ｌ−（Ｂ＋Ｗ）］内のＥＭ２（Ｔ）＞ｍａｘＥ２／ｅである最も大きなＴである。図２０のステップ２０７０を参照されたい。したがって、ＴＰ，Ｌ＜Ｔ＜およびＴＰ，Ｈの外側では、ＥＭ２（Ｔ）値＞ｍａｘＥ２／ｅであり、これは、この記述が保持する［ＴＭＩＮ，ＴＡ，Ｌ−（Ｂ＋Ｗ）］の最も小さな部分区間である。
【０２３３】
プローブ解析についても、アンプリコン解析と同様に、バッファ値（Ｂ）および幅（Ｗ）区間を使用して、プローブ領域ＴＰ，Ｌ＜Ｔ＜ＴＰ，Ｈを、ＴＰ，Ｌ−Ｂ＜Ｔ＜ＴＰ，Ｈ＋ＢまたはＴＰ，Ｌ−（Ｂ＋Ｗ）＜Ｔ＜ＴＰ，Ｌ＋（Ｂ＋Ｗ）に拡張した。図２０のステップ２０８０を参照されたい。
【０２３４】
図３１は、テンプレート無しコントロールの自動排除、アンプリコン領域およびプローブ領域の自動特定、積分された偏差プロット上で試料が１から０へ変化するようにするプローブ領域偏差データの正規化、自動ジェノタイピングのための曲線のクラスタリング、および積分された偏差プロットとしての（累積偏差の百分率としての）プローブデータの作図の後の、Ｆ５プローブ解析の結果を示す。図３２のプレートマップは、遺伝子型およびネガティブコントロール試料（前述の偏差解析技法を使用して特定したネガティブ試料）の正しいパターンを示している。
【０２３５】
図３３は、融解曲線データを解析するシステム３３００のブロック図である。このシステムは、コンピューティングデバイス３３１０を含み、コンピューティングデバイス３３１０は、１つまたは複数のプロセッサ（図示せず）、メモリ（図示せず）、コンピュータ可読媒体３３１２、１つまたは複数のＨＭＩデバイス３３１４（例えば入出力デバイス、ディスプレイ、プリンタなど）、１つまたは複数の通信インタフェース３３１６（例えばネットワークインタフェース、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）インタフェースなど）などを備えることができる。あるいは、またはこれに加えて、システム３３００は、ローカルクラスタおよび／または分散クラスタ（図示せず）内に、複数のコンピューティングデバイス３３１０を備えることができる。
【０２３６】
コンピューティングデバイス３３１０を、融解曲線データ源３３２０に通信可能に結合することができ、融解曲線データ源３３２０は、融解曲線生成機器（例えばＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＧｍｂＨ．から市販されているＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）デバイス、ＨＲ−１（商標）高分解能融解機器など）を備えることができる。あるいは、またはこれに加えて、データ源３３２０は、融解曲線データを含むコンピュータ可読媒体を備えることができる。
【０２３７】
コンピュータ可読媒体３３１２からコンピュータ可読プログラムコードをロードするように、コンピューティングデバイス３３１０を構成することができる。このプログラムコードは、本明細書に開示したシステムおよび方法（例えば方法３００、１６００、１７００、２０００、２２００、２４００など）またはそれらの変型システムおよび方法のうちの１つまたは複数のシステムまたは方法を実現するプロセッサ実行可能命令またはプロセッサ解釈可能命令を含むことができる。これらの命令は、コンピュータ可読媒体３３１２上の１つまたは複数の別個のソフトウェアモジュールとして具体化することができる。これらのモジュールは、データ源３３２０の融解曲線データにアクセスするように構成されたデータ取得モジュール３３３２、バックグラウンド蛍光のモデルにアクセスするように構成されたモデル化モジュール３３３４、融解曲線データに対して偏差解析を実行する（例えば、とりわけ図３の方法３００に従って偏差関数を生成する）ように構成された解析モジュール３３３６、（ＨＭＩ３３１４を介した）融解曲線データの表示、および／または前述の偏差解析技法を使用した融解曲線データの追加の処理（例えば自動ネガティブ試料の特定、指数バックグラウンド差引き、融解領域の特定、クラスタリングなど）を提供するように構成された処理モジュール３３３８、ならびに人間ユーザ（図示せず）によるシステム３３００の制御、および／または他のコンピューティングデバイスもしくはエージェント（図示せず）などの１つもしくは複数の外部プロセス（図示せず）によるシステム３３００の制御を提供するように構成された制御モジュール３３３９を備えることができる。
【０２３８】
制御モジュール３３３９は、前述のとおりに、融解曲線データを取得し、かつ／もしくは融解曲線データにアクセスし、融解曲線データに対する偏差解析を実行し、および／または解析されたデータを表示するように、システム３３００を導くことを可能にすることができる。例えば、制御モジュール３３３９は、融解曲線データ、クラスタリングの結果、ジェノタイピングの結果、スキャニングの結果などのＨＭＩ３３１４上への表示を提供することができる。したがって、制御モジュール３３３９は、ユーザインタフェース制御をＨＭＩ３３１４上に表示し、および／またはＨＭＩ３３１４からユーザ入力を受け取るように構成されたユーザインタフェース（図示せず）を備えることができる。さらに、１つまたは複数の通信インタフェース３３１６を介してコマンドおよび／または命令を（例えばリモートコンピューティングデバイス、エージェントなどから）受け取るように、制御モジュール３３３９を構成することもできる。制御モジュール３３３９は、自動ネガティブ試料の特定、融解領域の特定、バックグラウンド差引き、表示、クラスタリングおよび他のプロセスを実行するため、ユーザおよび／または外部プロセスからプログラミングコマンドを受け取ることができる。さらに、偏差解析処理の結果をコンピュータ可読媒体３３１２に記憶し、および／または１つまたは複数の通信インタフェース３３１６上でそれらの結果を送信するように、制御モジュール３３３９を構成することもできる。
【０２３９】
ある実施形態では、本明細書に開示した偏差解析技法（例えば方法３００、１６００、１７００、２０００、２２００、２４００またはこれらの方法の変型法）を使用して、ジェノタイピングプロセスおよび／またはスキャニングプロセスを自発的に実行するように、システム３３００が構成される。上で論じたとおり、本明細書に開示した偏差解析技法は、特定の一組の融解曲線解析用途だけに限定されず、本明細書に開示した偏差解析技法を使用して多数の融解曲線解析用途を実現するように、システム３３００を構成することができる。したがって、本開示およびシステム３３００が、特定の一組の融解曲線偏差解析用途に限定されると解釈すべきではない。
【０２４０】
以上の説明では、本明細書に記載した実施形態を完全に理解できるように、多数の具体的な詳細を示した。しかしながら、それらの具体的な詳細のうちの１つもしくは複数の詳細を省くことができ、または、その他の方法、構成要素もしくは材料を使用することができることを、当業者なら理解するであろう。いくつかの場合には、操作を詳細には示さず、または説明しなかった。
【０２４１】
さらに、１つまたは複数の実施形態において、記載した特徴、操作または特性を適当な方法で組み合わせることができる。当業者には明らかなことだが、開示した実施形態に関して説明した方法のステップまたは実行の順序を変更することができることも容易に理解される。したがって、図面または詳細な説明内における順序は、例示だけが目的であり、その順序が必須であると明示されない限り、どの順序も、必須の順序であることを含意するものではない。
【０２４２】
実施形態は、さまざまなステップを含むことがあり、それらのさまざまなステップは、汎用または専用コンピュータ（または他の電子デバイス）によって実行される機械実行可能命令として具体化することができる。それらの機械実行可能命令は、コンピュータ可読記憶媒体上において具体化することができる。ある実施形態では、これらの命令が、１つまたは複数の別個のソフトウェアモジュールとして具体化される。あるいは、１つまたは複数のステップを、それらのステップを実行する特定の論理を含むハードウェアコンポーネントによって、または、ハードウェア、ソフトウェアおよび／またはファームウェアの組合せによって実行することができる。
【０２４３】
実施形態は、本明細書に記載したプロセスを実行するようにコンピュータ（または他の電子デバイス）をプログラムするのに使用することができる命令を記憶したコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品として提供することもできる。このコンピュータ可読媒体には、限定はされないが、ハードドライブ、フロッピーディスケット、光ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、磁気もしくは光学カード、固体メモリデバイス、または電子的な命令を記憶するのに適した他のタイプの媒体／機械可読媒体が含まれる。
【０２４４】
本明細書で使用するとき、ソフトウェアモジュールまたはコンポーネントは、メモリデバイスおよび／またはコンピュータ可読記憶媒体内に位置する任意のタイプのコンピュータ命令またはコンピュータ実行可能コードを含むことができる。ソフトウェアモジュールは例えば、１つまたは複数のタスクを実行し、または特定の抽象データ型を実現するルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などとして編成することができるコンピュータ命令の１つまたは複数の物理または論理ブロックを含むことができる。
【０２４５】
ある種の実施形態では、特定のソフトウェアモジュールが、メモリデバイスの異なる位置に記憶された異種の命令を含み、それらの命令は、協力して、そのモジュールの記載された機能を実現する。そのモジュールは、コンピュータ可読記憶媒体上において具体化し、および／または記憶媒体上の別個のモジュールとして具体化することができる。モジュールは、単一の命令または多くの命令を含むことができ、異なるいくつかのコードセグメントにわたって、異なるプログラムの中に、および／またはいくつかのメモリデバイスにわたって分散させることができる。ある実施形態は、通信ネットワークを介してリンクされたリモート処理デバイスによってタスクが実行される分散コンピューティング環境で実施することができる。分散コンピューティング環境では、ソフトウェアモジュールを、ローカルメモリ記憶デバイスおよび／またはリモートメモリ記憶デバイス内に配置することができる。さらに、データベースレコードとして連結されまたは一緒にされているデータは、同じメモリデバイス内に、またはいくつかのメモリデバイスにわたって常駐していることがあり、ネットワークにわたってデータベース内のあるレコードのフィールド内でリンクされていることがある。
【０２４６】
根底にある本発明の原理から逸脱することなく前述の実施形態の詳細に多くの変更を実施することができることを当業者なら理解するであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融解曲線データを解析する方法であって、
前記方法は、
蛍光染料を含む化合物を融解させることによって得た複数の電気光学（ＥＯ）放射測定値を温度の関数として含む実験的な融解曲線データであって、バックグラウンドＥＯ放射信号を含む実験的な融解曲線データにアクセスすることと、
前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルにアクセスすることと、
前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差を温度の関数として定量化する偏差関数を計算することと、
前記化合物の解析において使用するため、前記偏差関数をコンピュータ可読記憶媒体上に記憶することと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記実験的な融解曲線データが、前記蛍光染料を含む前記化合物にエネルギー勾配を与えることによって得たものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルが、指数減衰関数および２次関数からなるグループの中の一方の関数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記偏差関数を、人間−機械インタフェースデバイス上でユーザに提示することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記偏差関数を計算することが、
前記実験的な融解曲線データを、前記実験的な融解曲線データのある領域内にそれぞれ定義された複数の窓に分割することと、
前記窓のうちの対応するそれぞれの窓内でそれぞれ計算され、前記対応するそれぞれの窓内における前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差を定量化する複数のフィットパラメータを計算することと、
を含み、
前記偏差関数が前記フィットパラメータから形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が核酸試料を含み、選択された窓のフィットパラメータが、前記実験的な融解曲線データを、
【数２９】
の形の前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルにフィットさせることによって計算され、Ｃｉおよびａｉがフィッティングパラメータ、Ｔが温度、Ｔｉが窓の索引、Ｗが、前記選択された窓の幅である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記偏差関数を計算することがさらに、前記偏差関数から前記偏差関数の最小値を差し引くことを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記偏差関数の最大値と前記偏差関数の平均（アベレージ）値と平均（ミーン）値のうちの一方の比を計算し、前記比がしきい値よりも大きいときに、前記実験的な融解曲線データが有効な融解転移領域を含むと判定することによって、
前記実験的な融解曲線データが有効な融解転移領域を含むかどうかを判定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記偏差関数の第１の温度領域内の高位バックグラウンド除去カーソルおよび低位バックグラウンド除去カーソルを特定することと、
前記高位バックグラウンド除去カーソルおよび前記低位バックグラウンド除去カーソルを使用して、バックグラウンド補正された融解曲線を計算することと、
をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も高い温度として第１のバックグラウンド温度を特定することと、
前記第１のバックグラウンド温度よりも高い、および／または、前記第１のバックグラウンド温度に等しい温度を含むカーソルプローブ領域を定義することと、
前記カーソルプローブ領域から、前記高位バックグラウンド除去カーソルおよび前記低位バックグラウンド除去カーソルを選択することと、
をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物がタンパク質試料を含み、
前記方法がさらに、
前記実験的な融解曲線データ内の凝集信号の導関数のモデルにアクセスすることと、
前記凝集信号モデルを使用して、前記バックグラウンド補正された融解曲線から前記凝集信号を除去することと、
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が核酸試料を含み、
前記方法がさらに、
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も高い温度に第１の緩衝定数を加えたものとして、高位バックグラウンド温度を特定することと、
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も低い温度から第２の緩衝定数を差し引いたものとして、低位バックグラウンド温度を特定することと、
前記高位バックグラウンド温度よりも高い、および／または、前記高位バックグラウンド温度に等しい温度を含み、所定の幅を有する高位プローブ領域を定義することと、
前記低位バックグラウンド温度よりも低い、および／または、前記低位バックグラウンド温度に等しい温度を含み、所定の幅を有する低位プローブ領域を定義することと、
前記高位バックグラウンド除去カーソルを前記高プローブ領域から選択し、前記低位バックグラウンド除去カーソルを前記低位プローブ領域から選択することと、
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記低位バックグラウンド除去カーソルおよび前記高位バックグラウンド除去カーソルが、目的関数を最小化することによって選択され、前記目的関数が、前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルとの間の誤差を定量化するように構成された、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
バックグラウンド補正された複数の融解曲線を互いに比較することと、
前記比較に基づいて、前記バックグラウンド補正された複数の融解曲線を２つ以上のグループにクラスタリングすることと、
前記２つ以上のクラスタ内の偏差および前記２つ以上のクラスタ間の偏差に基づいて、クラスタリング質メトリックを計算することと、
前記クラスタリング質メトリックに基づいて、前記バックグラウンド除去カーソルを改良するかどうかを判定することと、
前記バックグラウンド除去カーソルを改良するときに、前記バックグラウンド除去カーソルを変更し、変更されたバックグラウンド除去カーソルを使用して、バックグラウンド補正され、変更された融解曲線を計算し、前記クラスタ質メトリックを再計算することと、
をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が核酸試料を含み、
前記方法がさらに、
前記核酸試料を増幅することと、
前記核酸試料と蛍光染料とを含む溶液にエネルギー勾配を与えることによって、前記溶液を融解させることと、
複数のＥＯ放射測定値を温度の関数として取得することと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物がタンパク質試料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
融解曲線データを解析する方法をコンピューティングデバイスに実行させるように構成されたコンピュータ可読命令を含むコンピュータ可読記憶媒体であって、
前記方法が、
蛍光染料を含む化合物を融解させることによって得た複数の電気光学（ＥＯ）放射測定値を温度の関数として含む実験的な融解曲線データであって、バックグラウンドＥＯ放射信号を含む実験的な融解曲線データにアクセスすることと、
前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルにアクセスすることと、
前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差を温度の関数として定量化する偏差関数を計算することと、
を含むことを特徴とするコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１８】
前記実験的な融解曲線データが、前記蛍光染料を含む前記化合物にエネルギー勾配を与えることによって得たものである、請求項１７に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１９】
前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルが、指数減衰関数および２次関数からなるグループの中の一方の関数を含む、請求項１７に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２０】
前記方法がさらに、前記偏差関数を、人間−機械インタフェースデバイス上でユーザに提示することを含む、請求項１７に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２１】
前記偏差関数を計算することが、
前記実験的な融解曲線データを、前記実験的な融解曲線データのある温度範囲内にそれぞれ定義された複数の窓に分割することと、
前記窓のうちの対応するそれぞれの窓内でそれぞれ計算され、前記対応するそれぞれの窓内における前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差を定量化する複数のフィットパラメータを計算することと、
を含み、
前記偏差関数が前記フィットパラメータから形成される、請求項１７に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２２】
前記化合物が核酸試料を含み、選択された窓のフィットパラメータが、前記実験的な融解曲線データを、
【数２９】
の形の前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルにフィットさせることによって計算され、Ｃｉおよびａｉがフィッティングパラメータ、Ｔが温度、Ｔｉが窓の索引、Ｗが、前記選択された窓の幅である、請求項２１に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２３】
前記偏差関数を計算することがさらに、前記偏差関数から前記偏差関数の最小値を差し引くことを含む、請求項２２に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２４】
前記方法がさらに、
前記偏差関数の最大値と前記偏差関数の平均（アベレージ）値と平均（ミーン）値のうちの一方の比を計算し、前記比がしきい値よりも大きいときに、前記実験的な融解曲線データが有効な融解転移領域を含むと判定することによって、
前記実験的な融解曲線データが有効な融解転移領域を含むかどうかを判定することを含む、請求項２３に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２５】
前記方法がさらに、
前記偏差関数の第１の温度領域内の高位バックグラウンド除去カーソルおよび低位バックグラウンド除去カーソルを特定することと、
前記高位バックグラウンド除去カーソルおよび前記低位バックグラウンド除去カーソルを使用して、バックグラウンド補正された融解曲線を計算することと、
を含む、請求項２３に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２６】
前記方法がさらに、
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も高い温度として第１のバックグラウンド温度を特定することと、
前記第１のバックグラウンド温度よりも高い、および／または、前記第１のバックグラウンド温度に等しい温度を含むカーソルプローブ領域を定義することと、
前記カーソルプローブ領域から、前記高位バックグラウンド除去カーソルおよび前記低位バックグラウンド除去カーソルを選択することと、
を含む、請求項２５に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２７】
前記化合物がタンパク質試料を含み、
前記方法がさらに、
前記実験的な融解曲線データ内の凝集信号の導関数のモデルにアクセスすることと、
前記凝集信号モデルを使用して、前記バックグラウンド補正された融解曲線から前記凝集信号を除去することと、
を含む、請求項２６に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２８】
前記化合物が核酸試料を含み、
前記方法がさらに、
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も高い温度に第１の緩衝定数を加えたものとして、高位バックグラウンド温度を特定することと、
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も低い温度から第２の緩衝定数を差し引いたものとして、低位バックグラウンド温度を特定することと、
前記高位バックグラウンド温度よりも高い、および／または、前記高位バックグラウンド温度に等しい温度を含み、所定の幅を有する高位プローブ領域を定義することと、
前記低位バックグラウンド温度よりも低い、および／または、前記低位バックグラウンド温度に等しい温度を含み、所定の幅を有する低位プローブ領域を定義することと、
前記高位バックグラウンド除去カーソルを前記高プローブ領域から選択し、前記低位バックグラウンド除去カーソルを前記低位プローブ領域から選択することと、
を含む、請求項２５に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２９】
前記低位バックグラウンド除去カーソルおよび前記高位バックグラウンド除去カーソルが、目的関数を最小化することによって選択され、前記目的関数が、前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルとの間の誤差を定量化するように構成された、請求項２５に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項３０】
前記方法がさらに、
バックグラウンド補正された複数の融解曲線を互いに比較することと、
前記比較に基づいて、前記バックグラウンド補正された複数の融解曲線を２つ以上のグループにクラスタリングすることと、
前記２つ以上のクラスタ内の偏差および前記２つ以上のクラスタ間の偏差に基づいて、クラスタリング質メトリックを計算することと、
前記クラスタリング質メトリックに基づいて、前記バックグラウンド除去カーソルを改良するかどうかを判定することと、
前記バックグラウンド除去カーソルを改良するときに、前記バックグラウンド除去カーソルを変更し、変更されたバックグラウンド除去カーソルを使用して、バックグラウンド補正され、変更された融解曲線を計算し、前記クラスタ質メトリックを再計算することと、
を含む、請求項２５に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項３１】
前記化合物が核酸試料を含み、
前記方法がさらに、
前記核酸試料を増幅することと、
前記化合物にエネルギー勾配を与えること、および、前記化合物のイオン濃度を増大させることのうちの一方によって、前記化合物を融解させることと、
複数のＥＯ放射測定値を、温度とイオン濃度のうちの一方の関数として取得することと、
を含む、請求項１７に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項３２】
融解曲線データを解析する装置であって、
プロセッサを備えるコンピューティングデバイスと、
前記プロセッサ上で動作可能である、実験的な融解曲線データにアクセスするように構成された取得モジュールであって、前記実験的な融解曲線データが、蛍光染料を含む化合物を融解させることによって得た複数の電気光学（ＥＯ）放射測定値を含み、前記実験的な融解曲線データがバックグラウンドＥＯ放射信号を含む、取得モジュールと、
前記プロセッサ上で動作可能なモデル化モジュールであり、前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルにアクセスするように構成されたモデル化モジュールと、
前記プロセッサ上で動作可能な処理モジュールであり、前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差を定量化する偏差関数を計算するように構成された処理モジュールと、
を備え、
前記処理モジュールが、前記実験的な融解曲線データを、前記実験的な融解曲線データのある領域内にそれぞれ定義された複数の窓に分割し、前記窓のうちの対応するそれぞれの窓内でそれぞれ計算される複数のフィットパラメータを計算し、前記対応するそれぞれの窓内における前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差を定量化することによって、前記偏差関数を計算し、前記偏差関数が前記フィットパラメータから形成されることを特徴とする装置。
【請求項３３】
前記窓の幅が、前記実験的な融解曲線データの分解能、前記実験的な融解曲線データ内の関心の特徴の特性および性能メトリックのうちの１つに基づいて選択される、請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
前記窓のうちの選択された窓のフィットパラメータが、前記実験的な融解曲線データを、
【数２９】
の形の前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルにフィットさせることによって計算され、Ｃｉおよびａｉがフィッティングパラメータ、Ｔが温度、Ｔｉが窓の索引、Ｗが、前記選択された窓の幅である、請求項３２に記載の装置。
【請求項３５】
前記処理モジュールが、前記偏差関数から前記偏差関数の最小値を差し引くように構成された、請求項３２に記載の装置。
【請求項３６】
前記偏差関数の最大値と前記偏差関数の平均（アベレージ）値と平均（ミーン）値のうちの一方の比を計算し、前記比がしきい値よりも大きいときに、前記実験的な融解曲線データが有効な融解転移領域を含むと判定し、前記比が前記しきい値以下であるときに、前記実験的な融解曲線データが有効な融解転移領域を含まないと判定することによって、前記実験的な融解曲線データが有効な融解転移領域を含むかどうかを判定するように、前記処理モジュールが構成された、請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
前記しきい値が、複数の偏差関数を使用して計算され、前記複数の偏差関数がそれぞれ、対応するそれぞれの異なる実験的な融解曲線データを使用して計算され、前記しきい値が、前記対応するそれぞれの偏差関数のそれぞれの関数の最大値と、前記対応するそれぞれの偏差関数の前記それぞれの関数の平均（アベレージ）および平均（ミーン）のうちの一方との比の平均（アベレージ）および平均（ミーン）のうちの一方を使用して計算される、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
前記しきい値が、前記複数の偏差関数の前記比の標準偏差に基づく、請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】
前記偏差関数の第１の温度領域内の高位バックグラウンド除去カーソルおよび低位バックグラウンド除去カーソルを特定し、前記高位バックグラウンド除去カーソルおよび前記低位バックグラウンド除去カーソルを使用して、バックグラウンド補正された融解曲線データを計算するように、前記処理モジュールが構成された、請求項３７に記載の装置。
【請求項４０】
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も高い温度として第１のバックグラウンド温度を特定し、前記第１のバックグラウンド温度よりも高い、および／または、前記第１のバックグラウンド温度に等しい温度を含むカーソルプローブ領域を定義し、前記カーソルプローブ領域から、前記高位バックグラウンド除去カーソルおよび前記低位バックグラウンド除去カーソルを選択するように、前記処理モジュールが構成された、請求項３９に記載の装置。
【請求項４１】
前記化合物がタンパク質試料を含み、前記実験的な融解曲線データ内の凝集信号の導関数のモデルにアクセスし、前記凝集信号モデルを使用して、前記バックグラウンド補正された融解曲線から前記凝集信号を除去するように、前記処理モジュールが構成された、請求項４０に記載の装置。
【請求項４２】
前記処理モジュールが、
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も高い温度に第１の緩衝定数を加えたものとして、高位バックグラウンド温度を特定し、
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も低い温度から第２の緩衝定数を差し引いたものとして、低位バックグラウンド温度を特定し、
前記高位バックグラウンド温度よりも高い、および／または、前記高位バックグラウンド温度に等しい温度を含み、所定の幅を有する高位プローブ領域を定義し、
前記低位バックグラウンド温度よりも低い、および／または、前記低位バックグラウンド温度に等しい温度を含み、所定の幅を有する低位プローブ領域を定義し、
前記高位バックグラウンド除去カーソルを前記高プローブ領域から選択し、前記低位バックグラウンド除去カーソルを前記低位プローブ領域から選択するように構成された、請求項３９に記載の装置。
【請求項４３】
前記処理モジュールが、目的関数を最小化することによって前記低位バックグラウンド除去カーソルおよび前記高位バックグラウンド除去カーソルを選択するように構成され、前記目的関数が、前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルとの間の誤差を定量化するように構成された、請求項３９に記載の装置。
【請求項４４】
前記処理モジュールが、
バックグラウンド補正された複数の融解曲線を互いに比較し、
前記比較に基づいて、前記バックグラウンド補正された複数の融解曲線を２つ以上のグループにクラスタリングし、
前記２つ以上のクラスタ内の偏差および前記２つ以上のクラスタ間の偏差に基づいて、クラスタリング質メトリックを計算し、
前記クラスタリング質メトリックに基づいて、前記バックグラウンド除去カーソルを改良するかどうかを判定し、
前記バックグラウンド除去カーソルを改良するときに、前記バックグラウンド除去カーソルを変更し、変更されたバックグラウンド除去カーソルを使用して、バックグラウンド補正され、変更された融解曲線を計算し、前記クラスタ質メトリックを再計算するように構成された、請求項３９に記載の装置。
【請求項４５】
前記化合物が核酸試料を含み、前記装置がさらに、前記実験的な融解曲線データを取得するように構成された機器を備え、前記機器が、前記化合物を保持するための容器を備える、請求項３２に記載の装置。
【請求項４６】
前記機器がサーモサイクラを備える、請求項４５に記載の装置。
【請求項４７】
融解曲線データを解析する方法であって、
ＥＯ放射放出染料を含む化合物に融解勾配を与えることによって得られた、前記融解勾配に沿った複数の電気光学（ＥＯ）放射測定値を含む実験的な融解曲線データであって、バックグラウンドＥＯ放射信号を含む実験的な融解局線データにアクセスすること、
前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルにアクセスすること、
前記実験的な融解曲線データを、前記実験的な融解曲線データのある領域内にそれぞれ定義された複数の窓に分割し、対応するそれぞれの窓内における前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差をそれぞれが定量化する複数のフィットパラメータを計算し、前記フィットパラメータから前記偏位関数を形成することによって、前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差を前記融解勾配の関数として定量化する偏差関数を計算することと、
前記化合物の解析において使用するため、前記偏差関数をコンピュータ可読記憶媒体上に記憶することと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４８】
前記実験的な融解曲線データが、前記化合物にエネルギー勾配を与えること、および前記化合物のイオン濃度を増大させることのうちの一方により、前記化合物を融解させることによって得たものである、請求項４７に記載の方法。
【請求項１】
融解曲線データを解析する方法であって、
前記方法は、
蛍光染料を含む化合物を融解させることによって得た複数の電気光学（ＥＯ）放射測定値を温度の関数として含む実験的な融解曲線データであって、バックグラウンドＥＯ放射信号を含む実験的な融解曲線データにアクセスすることと、
前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルにアクセスすることと、
前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差を温度の関数として定量化する偏差関数を計算することと、
前記化合物の解析において使用するため、前記偏差関数をコンピュータ可読記憶媒体上に記憶することと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記実験的な融解曲線データが、前記蛍光染料を含む前記化合物にエネルギー勾配を与えることによって得たものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルが、指数減衰関数および２次関数からなるグループの中の一方の関数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記偏差関数を、人間−機械インタフェースデバイス上でユーザに提示することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記偏差関数を計算することが、
前記実験的な融解曲線データを、前記実験的な融解曲線データのある領域内にそれぞれ定義された複数の窓に分割することと、
前記窓のうちの対応するそれぞれの窓内でそれぞれ計算され、前記対応するそれぞれの窓内における前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差を定量化する複数のフィットパラメータを計算することと、
を含み、
前記偏差関数が前記フィットパラメータから形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が核酸試料を含み、選択された窓のフィットパラメータが、前記実験的な融解曲線データを、
【数２９】
の形の前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルにフィットさせることによって計算され、Ｃｉおよびａｉがフィッティングパラメータ、Ｔが温度、Ｔｉが窓の索引、Ｗが、前記選択された窓の幅である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記偏差関数を計算することがさらに、前記偏差関数から前記偏差関数の最小値を差し引くことを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記偏差関数の最大値と前記偏差関数の平均（アベレージ）値と平均（ミーン）値のうちの一方の比を計算し、前記比がしきい値よりも大きいときに、前記実験的な融解曲線データが有効な融解転移領域を含むと判定することによって、
前記実験的な融解曲線データが有効な融解転移領域を含むかどうかを判定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記偏差関数の第１の温度領域内の高位バックグラウンド除去カーソルおよび低位バックグラウンド除去カーソルを特定することと、
前記高位バックグラウンド除去カーソルおよび前記低位バックグラウンド除去カーソルを使用して、バックグラウンド補正された融解曲線を計算することと、
をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も高い温度として第１のバックグラウンド温度を特定することと、
前記第１のバックグラウンド温度よりも高い、および／または、前記第１のバックグラウンド温度に等しい温度を含むカーソルプローブ領域を定義することと、
前記カーソルプローブ領域から、前記高位バックグラウンド除去カーソルおよび前記低位バックグラウンド除去カーソルを選択することと、
をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物がタンパク質試料を含み、
前記方法がさらに、
前記実験的な融解曲線データ内の凝集信号の導関数のモデルにアクセスすることと、
前記凝集信号モデルを使用して、前記バックグラウンド補正された融解曲線から前記凝集信号を除去することと、
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が核酸試料を含み、
前記方法がさらに、
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も高い温度に第１の緩衝定数を加えたものとして、高位バックグラウンド温度を特定することと、
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も低い温度から第２の緩衝定数を差し引いたものとして、低位バックグラウンド温度を特定することと、
前記高位バックグラウンド温度よりも高い、および／または、前記高位バックグラウンド温度に等しい温度を含み、所定の幅を有する高位プローブ領域を定義することと、
前記低位バックグラウンド温度よりも低い、および／または、前記低位バックグラウンド温度に等しい温度を含み、所定の幅を有する低位プローブ領域を定義することと、
前記高位バックグラウンド除去カーソルを前記高プローブ領域から選択し、前記低位バックグラウンド除去カーソルを前記低位プローブ領域から選択することと、
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記低位バックグラウンド除去カーソルおよび前記高位バックグラウンド除去カーソルが、目的関数を最小化することによって選択され、前記目的関数が、前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルとの間の誤差を定量化するように構成された、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
バックグラウンド補正された複数の融解曲線を互いに比較することと、
前記比較に基づいて、前記バックグラウンド補正された複数の融解曲線を２つ以上のグループにクラスタリングすることと、
前記２つ以上のクラスタ内の偏差および前記２つ以上のクラスタ間の偏差に基づいて、クラスタリング質メトリックを計算することと、
前記クラスタリング質メトリックに基づいて、前記バックグラウンド除去カーソルを改良するかどうかを判定することと、
前記バックグラウンド除去カーソルを改良するときに、前記バックグラウンド除去カーソルを変更し、変更されたバックグラウンド除去カーソルを使用して、バックグラウンド補正され、変更された融解曲線を計算し、前記クラスタ質メトリックを再計算することと、
をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が核酸試料を含み、
前記方法がさらに、
前記核酸試料を増幅することと、
前記核酸試料と蛍光染料とを含む溶液にエネルギー勾配を与えることによって、前記溶液を融解させることと、
複数のＥＯ放射測定値を温度の関数として取得することと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物がタンパク質試料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
融解曲線データを解析する方法をコンピューティングデバイスに実行させるように構成されたコンピュータ可読命令を含むコンピュータ可読記憶媒体であって、
前記方法が、
蛍光染料を含む化合物を融解させることによって得た複数の電気光学（ＥＯ）放射測定値を温度の関数として含む実験的な融解曲線データであって、バックグラウンドＥＯ放射信号を含む実験的な融解曲線データにアクセスすることと、
前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルにアクセスすることと、
前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差を温度の関数として定量化する偏差関数を計算することと、
を含むことを特徴とするコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１８】
前記実験的な融解曲線データが、前記蛍光染料を含む前記化合物にエネルギー勾配を与えることによって得たものである、請求項１７に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１９】
前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルが、指数減衰関数および２次関数からなるグループの中の一方の関数を含む、請求項１７に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２０】
前記方法がさらに、前記偏差関数を、人間−機械インタフェースデバイス上でユーザに提示することを含む、請求項１７に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２１】
前記偏差関数を計算することが、
前記実験的な融解曲線データを、前記実験的な融解曲線データのある温度範囲内にそれぞれ定義された複数の窓に分割することと、
前記窓のうちの対応するそれぞれの窓内でそれぞれ計算され、前記対応するそれぞれの窓内における前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差を定量化する複数のフィットパラメータを計算することと、
を含み、
前記偏差関数が前記フィットパラメータから形成される、請求項１７に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２２】
前記化合物が核酸試料を含み、選択された窓のフィットパラメータが、前記実験的な融解曲線データを、
【数２９】
の形の前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルにフィットさせることによって計算され、Ｃｉおよびａｉがフィッティングパラメータ、Ｔが温度、Ｔｉが窓の索引、Ｗが、前記選択された窓の幅である、請求項２１に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２３】
前記偏差関数を計算することがさらに、前記偏差関数から前記偏差関数の最小値を差し引くことを含む、請求項２２に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２４】
前記方法がさらに、
前記偏差関数の最大値と前記偏差関数の平均（アベレージ）値と平均（ミーン）値のうちの一方の比を計算し、前記比がしきい値よりも大きいときに、前記実験的な融解曲線データが有効な融解転移領域を含むと判定することによって、
前記実験的な融解曲線データが有効な融解転移領域を含むかどうかを判定することを含む、請求項２３に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２５】
前記方法がさらに、
前記偏差関数の第１の温度領域内の高位バックグラウンド除去カーソルおよび低位バックグラウンド除去カーソルを特定することと、
前記高位バックグラウンド除去カーソルおよび前記低位バックグラウンド除去カーソルを使用して、バックグラウンド補正された融解曲線を計算することと、
を含む、請求項２３に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２６】
前記方法がさらに、
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も高い温度として第１のバックグラウンド温度を特定することと、
前記第１のバックグラウンド温度よりも高い、および／または、前記第１のバックグラウンド温度に等しい温度を含むカーソルプローブ領域を定義することと、
前記カーソルプローブ領域から、前記高位バックグラウンド除去カーソルおよび前記低位バックグラウンド除去カーソルを選択することと、
を含む、請求項２５に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２７】
前記化合物がタンパク質試料を含み、
前記方法がさらに、
前記実験的な融解曲線データ内の凝集信号の導関数のモデルにアクセスすることと、
前記凝集信号モデルを使用して、前記バックグラウンド補正された融解曲線から前記凝集信号を除去することと、
を含む、請求項２６に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２８】
前記化合物が核酸試料を含み、
前記方法がさらに、
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も高い温度に第１の緩衝定数を加えたものとして、高位バックグラウンド温度を特定することと、
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も低い温度から第２の緩衝定数を差し引いたものとして、低位バックグラウンド温度を特定することと、
前記高位バックグラウンド温度よりも高い、および／または、前記高位バックグラウンド温度に等しい温度を含み、所定の幅を有する高位プローブ領域を定義することと、
前記低位バックグラウンド温度よりも低い、および／または、前記低位バックグラウンド温度に等しい温度を含み、所定の幅を有する低位プローブ領域を定義することと、
前記高位バックグラウンド除去カーソルを前記高プローブ領域から選択し、前記低位バックグラウンド除去カーソルを前記低位プローブ領域から選択することと、
を含む、請求項２５に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２９】
前記低位バックグラウンド除去カーソルおよび前記高位バックグラウンド除去カーソルが、目的関数を最小化することによって選択され、前記目的関数が、前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルとの間の誤差を定量化するように構成された、請求項２５に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項３０】
前記方法がさらに、
バックグラウンド補正された複数の融解曲線を互いに比較することと、
前記比較に基づいて、前記バックグラウンド補正された複数の融解曲線を２つ以上のグループにクラスタリングすることと、
前記２つ以上のクラスタ内の偏差および前記２つ以上のクラスタ間の偏差に基づいて、クラスタリング質メトリックを計算することと、
前記クラスタリング質メトリックに基づいて、前記バックグラウンド除去カーソルを改良するかどうかを判定することと、
前記バックグラウンド除去カーソルを改良するときに、前記バックグラウンド除去カーソルを変更し、変更されたバックグラウンド除去カーソルを使用して、バックグラウンド補正され、変更された融解曲線を計算し、前記クラスタ質メトリックを再計算することと、
を含む、請求項２５に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項３１】
前記化合物が核酸試料を含み、
前記方法がさらに、
前記核酸試料を増幅することと、
前記化合物にエネルギー勾配を与えること、および、前記化合物のイオン濃度を増大させることのうちの一方によって、前記化合物を融解させることと、
複数のＥＯ放射測定値を、温度とイオン濃度のうちの一方の関数として取得することと、
を含む、請求項１７に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項３２】
融解曲線データを解析する装置であって、
プロセッサを備えるコンピューティングデバイスと、
前記プロセッサ上で動作可能である、実験的な融解曲線データにアクセスするように構成された取得モジュールであって、前記実験的な融解曲線データが、蛍光染料を含む化合物を融解させることによって得た複数の電気光学（ＥＯ）放射測定値を含み、前記実験的な融解曲線データがバックグラウンドＥＯ放射信号を含む、取得モジュールと、
前記プロセッサ上で動作可能なモデル化モジュールであり、前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルにアクセスするように構成されたモデル化モジュールと、
前記プロセッサ上で動作可能な処理モジュールであり、前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差を定量化する偏差関数を計算するように構成された処理モジュールと、
を備え、
前記処理モジュールが、前記実験的な融解曲線データを、前記実験的な融解曲線データのある領域内にそれぞれ定義された複数の窓に分割し、前記窓のうちの対応するそれぞれの窓内でそれぞれ計算される複数のフィットパラメータを計算し、前記対応するそれぞれの窓内における前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差を定量化することによって、前記偏差関数を計算し、前記偏差関数が前記フィットパラメータから形成されることを特徴とする装置。
【請求項３３】
前記窓の幅が、前記実験的な融解曲線データの分解能、前記実験的な融解曲線データ内の関心の特徴の特性および性能メトリックのうちの１つに基づいて選択される、請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
前記窓のうちの選択された窓のフィットパラメータが、前記実験的な融解曲線データを、
【数２９】
の形の前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルにフィットさせることによって計算され、Ｃｉおよびａｉがフィッティングパラメータ、Ｔが温度、Ｔｉが窓の索引、Ｗが、前記選択された窓の幅である、請求項３２に記載の装置。
【請求項３５】
前記処理モジュールが、前記偏差関数から前記偏差関数の最小値を差し引くように構成された、請求項３２に記載の装置。
【請求項３６】
前記偏差関数の最大値と前記偏差関数の平均（アベレージ）値と平均（ミーン）値のうちの一方の比を計算し、前記比がしきい値よりも大きいときに、前記実験的な融解曲線データが有効な融解転移領域を含むと判定し、前記比が前記しきい値以下であるときに、前記実験的な融解曲線データが有効な融解転移領域を含まないと判定することによって、前記実験的な融解曲線データが有効な融解転移領域を含むかどうかを判定するように、前記処理モジュールが構成された、請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
前記しきい値が、複数の偏差関数を使用して計算され、前記複数の偏差関数がそれぞれ、対応するそれぞれの異なる実験的な融解曲線データを使用して計算され、前記しきい値が、前記対応するそれぞれの偏差関数のそれぞれの関数の最大値と、前記対応するそれぞれの偏差関数の前記それぞれの関数の平均（アベレージ）および平均（ミーン）のうちの一方との比の平均（アベレージ）および平均（ミーン）のうちの一方を使用して計算される、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
前記しきい値が、前記複数の偏差関数の前記比の標準偏差に基づく、請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】
前記偏差関数の第１の温度領域内の高位バックグラウンド除去カーソルおよび低位バックグラウンド除去カーソルを特定し、前記高位バックグラウンド除去カーソルおよび前記低位バックグラウンド除去カーソルを使用して、バックグラウンド補正された融解曲線データを計算するように、前記処理モジュールが構成された、請求項３７に記載の装置。
【請求項４０】
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も高い温度として第１のバックグラウンド温度を特定し、前記第１のバックグラウンド温度よりも高い、および／または、前記第１のバックグラウンド温度に等しい温度を含むカーソルプローブ領域を定義し、前記カーソルプローブ領域から、前記高位バックグラウンド除去カーソルおよび前記低位バックグラウンド除去カーソルを選択するように、前記処理モジュールが構成された、請求項３９に記載の装置。
【請求項４１】
前記化合物がタンパク質試料を含み、前記実験的な融解曲線データ内の凝集信号の導関数のモデルにアクセスし、前記凝集信号モデルを使用して、前記バックグラウンド補正された融解曲線から前記凝集信号を除去するように、前記処理モジュールが構成された、請求項４０に記載の装置。
【請求項４２】
前記処理モジュールが、
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も高い温度に第１の緩衝定数を加えたものとして、高位バックグラウンド温度を特定し、
前記偏差関数がしきい値よりも大きい前記第１の温度領域内の最も低い温度から第２の緩衝定数を差し引いたものとして、低位バックグラウンド温度を特定し、
前記高位バックグラウンド温度よりも高い、および／または、前記高位バックグラウンド温度に等しい温度を含み、所定の幅を有する高位プローブ領域を定義し、
前記低位バックグラウンド温度よりも低い、および／または、前記低位バックグラウンド温度に等しい温度を含み、所定の幅を有する低位プローブ領域を定義し、
前記高位バックグラウンド除去カーソルを前記高プローブ領域から選択し、前記低位バックグラウンド除去カーソルを前記低位プローブ領域から選択するように構成された、請求項３９に記載の装置。
【請求項４３】
前記処理モジュールが、目的関数を最小化することによって前記低位バックグラウンド除去カーソルおよび前記高位バックグラウンド除去カーソルを選択するように構成され、前記目的関数が、前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルとの間の誤差を定量化するように構成された、請求項３９に記載の装置。
【請求項４４】
前記処理モジュールが、
バックグラウンド補正された複数の融解曲線を互いに比較し、
前記比較に基づいて、前記バックグラウンド補正された複数の融解曲線を２つ以上のグループにクラスタリングし、
前記２つ以上のクラスタ内の偏差および前記２つ以上のクラスタ間の偏差に基づいて、クラスタリング質メトリックを計算し、
前記クラスタリング質メトリックに基づいて、前記バックグラウンド除去カーソルを改良するかどうかを判定し、
前記バックグラウンド除去カーソルを改良するときに、前記バックグラウンド除去カーソルを変更し、変更されたバックグラウンド除去カーソルを使用して、バックグラウンド補正され、変更された融解曲線を計算し、前記クラスタ質メトリックを再計算するように構成された、請求項３９に記載の装置。
【請求項４５】
前記化合物が核酸試料を含み、前記装置がさらに、前記実験的な融解曲線データを取得するように構成された機器を備え、前記機器が、前記化合物を保持するための容器を備える、請求項３２に記載の装置。
【請求項４６】
前記機器がサーモサイクラを備える、請求項４５に記載の装置。
【請求項４７】
融解曲線データを解析する方法であって、
ＥＯ放射放出染料を含む化合物に融解勾配を与えることによって得られた、前記融解勾配に沿った複数の電気光学（ＥＯ）放射測定値を含む実験的な融解曲線データであって、バックグラウンドＥＯ放射信号を含む実験的な融解局線データにアクセスすること、
前記バックグラウンドＥＯ放射信号のモデルにアクセスすること、
前記実験的な融解曲線データを、前記実験的な融解曲線データのある領域内にそれぞれ定義された複数の窓に分割し、対応するそれぞれの窓内における前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差をそれぞれが定量化する複数のフィットパラメータを計算し、前記フィットパラメータから前記偏位関数を形成することによって、前記実験的な融解曲線データと前記バックグラウンドＥＯ放射信号の前記モデルとの間の偏差を前記融解勾配の関数として定量化する偏差関数を計算することと、
前記化合物の解析において使用するため、前記偏差関数をコンピュータ可読記憶媒体上に記憶することと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４８】
前記実験的な融解曲線データが、前記化合物にエネルギー勾配を与えること、および前記化合物のイオン濃度を増大させることのうちの一方により、前記化合物を融解させることによって得たものである、請求項４７に記載の方法。
【図１１】
【図１２Ｂ】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２Ａ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２２】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図１２Ｂ】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２Ａ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２２】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【公表番号】特表２０１２−５２６５６０（Ｐ２０１２−５２６５６０Ａ）
【公表日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１１０５０（Ｐ２０１２−５１１０５０）
【出願日】平成２２年５月１４日（２０１０．５．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３４９６９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３２８１３
【国際公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．フロッピー
【出願人】（５０２４２０３７９）アイダホ テクノロジー インコーポレーテッド (6)
【出願人】（５０６０５１４２９）ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション (25)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１４日（２０１０．５．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３４９６９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３２８１３
【国際公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．フロッピー
【出願人】（５０２４２０３７９）アイダホ テクノロジー インコーポレーテッド (6)
【出願人】（５０６０５１４２９）ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション (25)
【Ｆターム（参考）】
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