血中ＨＤＬ増加剤または抗動脈硬化剤
【課題】ＨＤＬの血中レベルを上げるために有用な新規のＰＩポリアミドの提供。該ＰＩポリアミドを有効成分とする抗動脈硬化剤の提供。
【解決手段】ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の発現を制御し得るＰＩポリアミド（３種）を合成し、ＰＩポリアミドを有効成分とする抗動脈硬化剤を得た。
【解決手段】ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の発現を制御し得るＰＩポリアミド（３種）を合成し、ＰＩポリアミドを有効成分とする抗動脈硬化剤を得た。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のピロールイミダゾールポリアミド（以下、ＰＩポリアミドと示す）、該ＰＩポリアミドを有効成分として含む血中高比重リポ蛋白増加剤（以下、血中ＨＤＬ増加剤と示す）または抗動脈硬化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポ蛋白のひとつであるＨＤＬは、その血中レベルと動脈硬化性疾患の頻度が逆相関し、抗動脈硬化作用を示すことが知られている。そこで、アテローム性動脈硬化症等の動脈硬化性疾患の治療や予防を目的として、ＨＤＬの血中レベルを挙げる様々な物質が開発されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
ＡＢＣＡ１（ＡＴＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ Ａ１）は、ＨＤＬが末梢組織の細胞からコレステロールを引き抜く際に主要な役割を担う蛋白であり、この発現量とＨＤＬの血中レベルは相関している。そこで、ＡＢＣＡ１の発現量を大幅かつ持続的に上昇させるシステインプロテアーゼインヒビターを有効成分とした低ＨＤＬ血症改善剤および動脈硬化症予防・治療剤（例えば、特許文献２参照）や、ビスフェノール型化合物を有効成分としたＡＢＣＡ１安定化剤が開発されている（例えば、特許文献３）。これらはＨＤＬの血中レベルを挙げるために有用であるが、さらに安定かつ効果的な血中ＨＤＬ増加剤の提供が望まれていた。
【０００４】
近年、遺伝子発現制御技術において、生体内での安定性、組織・細胞への移行性に優れたＰＩポリアミドが注目されている。本発明者らはこの物質に着目し、独自の方法により、ＨＤＬの血中レベルを挙げるために効果的な、新たなＰＩポリアミドの開発に取り組んでいる。その結果、本発明において、従来の低ＨＤＬ血症改善剤および動脈硬化症予防・治療剤等よりも安定かつ効果的な血中ＨＤＬ増加剤等の提供するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００９−５２２２９３号公報
【特許文献２】国際公開第２００３／０３３０２３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００５／０６７９０４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はＨＤＬの血中レベルを上げるために有用な新規のＰＩポリアミドの提供を課題とする。さらに、該ＰＩポリアミドを有効成分とする抗動脈硬化剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＨＤＬの血中レベルに相関するＡＢＣＡ１の発現量を上昇させるため、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の発現を制御し得るＰＩポリアミド（３種）を合成し、本発明を完成するに至った。
本発明者らが合成したこれらのＰＩポリアミドは、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域に存在する負の転写制御領域であるＡＰ２結合部位に結合するものであり、ＡＰ２の結合を阻害することで、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の発現を上昇させることができる。本発明者らは、これらのＰＩポリアミドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏの試験においてＡＢＣＡ１遺伝子の発現を増加させることを確認しており、また、ｉｎ ｖｉｖｏの試験において血中ＨＤＬを増加させることも確認している。
【０００８】
すなわち、本発明は次の（１）〜（３）のＰＩポリアミド、該ＰＩポリアミドを有効成分とする血中ＨＤＬ増加剤および抗動脈硬化剤等に関する。
（１）化学式１〜３のいずれか一種以上のＰＩポリアミドを有効成分として含む血中ＨＤＬ増加剤。
【化１】
【化２】
【化３】
（２）化学式１〜３のいずれか一種以上のＰＩポリアミドを有効成分として含む抗動脈硬化剤。
（３）化学式１または２に記載のＰＩポリアミド。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって提供されるＰＩポリアミドを有効成分とする抗動脈硬化剤は、動脈硬化性疾患の予防、治療において、ＡＢＣＡ１遺伝子の発現を増加させ、ＨＤＬを増加させる、新たな作用を有する薬剤として広く利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒトＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域の塩基配列を示した図である（実施例１）。
【図２】ＰＩポリアミドが認識するＡＰ２結合部位を中心とした部位の塩基配列を示した図である（実施例１）。
【図３】ＰＩポリアミドの精製結果を示した図である（実施例１）。
【図４】ＰＩポリアミドの配列特異性を確認した図である（試験例１）。
【図５】ＡＢＣＡ１遺伝子の発現に対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例２）。
【図６】ＡＢＣＡ１遺伝子の発現に対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例２）。
【図７】細胞外への脂質の引き抜きに対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例３）。
【図８】細胞外への脂質の引き抜きに対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例３）。
【図９】ＡＢＣＡ１タンパク質の発現に対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例４）。
【図１０】ＰＩポリアミドの配列特異性を確認した図である（試験例５）。
【図１１】ＡＢＣＡ１遺伝子の発現に対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例５）。
【図１２】細胞外への脂質（遊離コレステロール）の引き抜きに対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例５）。
【図１３】細胞外への脂質（リン脂質）の引き抜きに対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例５）。
【図１４】Ｉｎ ｖｉｖｏでの血中ＨＤＬ増加作用におけるＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例５）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の「血中ＨＤＬ増加剤」とは、ヒト等の哺乳類に注射等によって投与することによって、血中のＨＤＬを増加させることができる剤のことをいう。
化学式１〜３のＰＩポリアミドを一種または組み合わせて有効成分とする剤であれば良く、有効成分以外に薬物的に許容されている担体等を含んでいても良い。
化学式１〜３のＰＩポリアミドは、従来知られているいずれのＰＩポリアミドの合成方法によっても合成することができるが、特にＰＳＳＭ−８の合成プログラムによって合成することが好ましい。
【００１２】
これらのＰＩポリアミドは、抗動脈硬化剤の有効成分とすることができる。この「抗動脈硬化剤」とは、動脈硬化性疾患の予防や治療を目的とする剤のことをいい、化学式１〜３のＰＩポリアミドを一種または組み合わせて有効成分とする剤であれば良く、有効成分以外に薬物的に許容されている担体等を含んでいても良い。
【００１３】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１４】
＜ＰＩポリアミドの作製＞
１．ＰＩポリアミドの設計
ヒトＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域のＡＰ２結合部位を中心とした部位に結合するように、次の１〜３のＰＩポリアミド（３種）を設計した。図１にヒトＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域の塩基配列を示した。このうち、青色の枠で囲われた、上にＡＰ２結合部位と記載された部分がＡＰ２結合部位の塩基配列である。以下、化学式における各記号は次の意味を示す（Ａｃ：アセチル、Ｐｙ：ピロール、Ｉｍ：イミダゾール、β：β−アラニン、γ：γ−酪酸、Ｄｐ：Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン）。
ＰＩポリアミドは、Ｐｙ／ＰｙやＰｙ／Ｉｍの組み合わせのように、２つを組み合わせて対をなすことでＤＮＡ二重螺旋構造の認識を可能としたものである。しかし、Ｐｙ／ＰｙやＰｙ／Ｉｍの組み合わせからなるＰＩポリアミドは構造的に非常に剛直であり、５つ以上連結するとＤＮＡ二重螺旋構造の副溝から外れてしまい結合力が低下する。そのため、３つ置きにＷ（ＡまたはＴ）を認識する柔軟なβ−アラニンペア（β／βの組み合わせ）を導入しなければＤＮＡ二重螺旋構造の副溝に結合出来ないという大きな制限がある。そのため、従来からＧＣ配列が豊富な塩基配列を認識できるＰＩポリアミドの構築は困難であった。また、４−８塩基の塩基配列を認識するＰＩポリアミドは得られているものの、ゲノム上のユニーク遺伝子を認識するには、少なくとも１２塩基以上が必要とされていることから、より長い塩基配列を認識できるＰＩポリアミドの提供が求められていた。
本発明では自動合成機ＰＳＳＭ−８を用い、その最適化によることで１２塩基を認識するＰＩポリアミドの自動合成に初めて成功した。ＰＩポリアミドの設計において、ポリアミドにヘアピン構造を取り込み、ポリアミドの２つの対がずれない構造にすると共に、従来のＰｙ／Ｐｙ、Ｐｙ／Ｉｍの組み合わせの他に、ＰｙまたはＩｍとの組み合わせで自由度を高く保ち、ＤＮＡ二重螺旋のスパイラル構造の曲がりに柔軟に対応するβ−アラニンを取り入れ、Ｐｙ／β、Ｉｍ／βの組み合わせを連続することでβ−アラニンがクロスする構造を加えた。これによって、３塩基毎のβ／βのβ−アラニンの組み合わせによるＷ（ＡまたはＴ）の配列認識の規則を必要とせず、ＧＣ、ＣＧ等の認識を配することで克服が可能となった。すなわち、本発明は、ＧＣ配列が豊富な塩基配列の認識の選択性を高めることができ、かつ螺旋構造にねじれた位置関係の自由度を持たせて結合できるヘアピン型ＰＩポリアミドを初めて得たものである。
【００１５】
１）ＰＩポリアミド（８塩基認識）
図２（２）の赤字部分に示した塩基配列（８塩基配列）を認識するように、ＡｃＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙＰｙγＩｍＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙβＤｐ（化学式１）のＰＩポリアミドを設計した。化学式はＣ８５Ｈ１０４Ｎ３７Ｏ１７＋、分子量は１９１５．９７であった。
２）ＰＩポリアミド（１２塩基認識）
図２（３）赤字部分に示した塩基配列（１２塩基配列）を認識するように、ＡｃＩｍＰｙＰｙβＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙＰｙγＩｍＩｍＰｙβＩｍＩｍβＩｍＩｍＩｍＰｙβＤｐ（化学式２）のＰＩポリアミドを設計した。化学式はＣ１２３Ｈ１４６Ｎ５５Ｏ２５＋、分子量は２７９４．８３であった。
８塩基以上の塩基配列を認識するＰＩポリアミドとして、タンデムなヘアピン構造のＰＩポリアミドやＤＮＡとの複合体は理論上可能とされているが、化学式１、２のような単純なヘアピン構造のＰＩポリアミドにおいて、８塩基以上の塩基配列を認識するものは知られていなかった。さらに、これらのＰＩポリアミドはＧＣ配列が豊富な塩基配列を認識できる新規なものであった。
３）ＰＩポリアミド（７塩基認識）
図２（１）赤字部分に示した塩基配列（７塩基配列）を認識するように、ＡｃＰｙＰｙβＰｙＰｙＩｍγＰｙＰｙＰｙβＩｍＩｍβＤｐ（化３）（化学式３）のＰＩポリアミドを設計した。化学式は１６６７．７７Ｃ７７Ｈ９６Ｎ２９Ｏ１５＋、分子量は１６６７．７７であった。
【００１６】
【化１】
【００１７】
【化２】
【００１８】
【化３】
【００１９】
２．ＰＩポリアミドの合成
＜ＨＣＴＵを用いたピロールイミダゾールポリアミドの合成＞
ＨＣＴＵ（株式会社ペプチド研究所）を縮合活性化剤として、上記１．で設計したＰＩポリアミド（３種）をそれぞれ合成した。
１．試薬の調製
１）モノマー
ＦｍｏｃＰｙＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，３６ｍｇ）、ＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，７７ｍｇ）、Ｆｍｏｃ−γ−Ａｂｕ−ＯＨ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ，３４ｍｇ）及びＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ，３２ｍｇ）を合成するＰＩポリアミドごとに必要なカップリング分用意し、レジンに対してＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨを４当量、それ以外を２当量ずつ秤量し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移した。さらにＨＣＴＵをＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨのチューブには８８ｍｇ、それ以外のチューブには４４ｍｇをそれぞれ加え、ＮＭＰ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ製）をＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨのチューブに５００μＬ、それ以外のチューブには２５０μＬ加えボルテックス及び１時間静置し完全に溶解させた。
２）合成用試薬
合成機による合成のために、表１に記載の試薬を調製して用いた。
【００２０】
【表１】
【００２１】
３．レジンの調製
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｗａｎｇ−Ｒｅｓｉｎ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）をＳｍａｌｌ Ｌｉｂｒａ Ｔｕｂｅ（ＨｉＰｅｐ研究所製）に４０ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）取り、ペプチド合成機にセットし、ＮＭＰ１ｍＬを加え２０分間膨潤させた。
【００２２】
４．ペプチド合成（自動）
上記１．で調製したＤＩＥＡを縮合活性化剤として合成機（ＰＳＳＭ−８；島津製作所製）にインストールし、また先に準備しておいた各モノマーの入ったチューブをＣ末端から順番通りに合成機内ラックに配置した。ＰＳＳＭ−８の合成プログラムをセットし、合成機をスタートさせ、Ｈ２ＮＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙＰｙγＩｍＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙβ−Ｒｅｓｉｎ、Ｈ２ＮＩｍＰｙＰｙβＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙＰｙγＩｍＩｍＰｙβＩｍＩｍβＩｍＩｍＩｍＰｙβ−ＲｅｓｉｎまたはＨ２ＮＰｙＰｙβＰｙＰｙＩｍγＰｙＰｙＰｙβＩｍＩｍβ−Ｒｅｓｉｎまで次の（１）〜（４）の反応サイクルを繰り返すことで自動合成を行った。
【００２３】
反応サイクル
（１）カップリング処理を、上記活性化剤を用いてＮＭＰ中で３０分間行った。
（２）余剰のモノマー及び活性化剤を除くため１ｍＬのＮＭＰによるレジンの洗浄を５回繰り返した。
（３）Ｆｍｏｃ脱保護溶液（３０％Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ／ＮＭＰ）を１ｍＬ加え３分間反応させ、溶液を除去後、再び同じサイクルを繰り返した。
（４）Ｆｍｏｃ脱保護溶液を除くため１ｍＬのＮＭＰによるレジンの洗浄を５回繰り返し（１）に戻った。目的産物が得られるまでこのサイクルを繰り返した。
【００２４】
５．精製
合成機からレジンを取り出し、洗浄、乾燥の後、ネジ式キャップのエッペンドルフチューブに移しＮ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ製，２ｍＬ）を５００μＬ加えてヒートブロックにより５５℃で一晩加熱することでレジンからポリアミドの切り出しを行った。反応液をＬｉｂｒａ Ｔｕｂｅに移し、濾過によりレジンを取り除き、レジンに付着している残りの反応液をＮＭＰ１ｍＬ及びメタノール１ｍＬで回収した。
溶媒を留去後、ＨＰＬＣで分取精製した。分取精製後のＨＰＬＣを図３に示した（０．１％ＡｃＯＨ：ＣＨ３ＣＮ＝１００：０〜０：１００，３０ｍｉｎ）。分取精製の後、凍結乾燥をして、上記１．で設計したＰＩポリアミド（３種）をそれぞれ得た。
【００２５】
［試験例１］
＜ＰＩポリアミドの配列特異性の確認＞
実施例１において合成したＰＩポリアミド（化学式３）のヒトＡＢＣＡ１のＡＰ２結合部位に対する配列特異性をゲルシフトアッセイによって確認した。
１．試料の作成および試験
１）ＰＩポリアミドが結合するＡＰ２結合部位を含むＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ（配列表配列番号１）とその相補鎖を委託（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）により合成した。
即ち、この相補鎖とＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｏｌｉｇｏ ＤＮＡを用い、表２に記載の組成となるよう混合したものを９５℃で５分間インキュベーションした。その後、ゆっくりと室温まで温度を下げることで、２本鎖ＤＮＡを作成した。
２）上記１）の２本鎖ＤＮＡをそのまま用いた（図４、１．）
３）上記１）の２本鎖ＤＮＡと等量（等モル）のＰＩポリアミド（化学式３）を用い、表３に記載の組成となるように混合したものを室温で１時間インキュベートした（図４、２．）。
４）特異的ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒとして、ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｏｌｉｇｏ ＤＮＡに対し１０倍量のｎｏｎ−ｌａｂｅｌｅｄ ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ（ＦＩＴＣの修飾がないｏｌｉｇｏ ＤＮＡ）を加え、２本鎖ＤＮＡとＰＩポリアミド（化学式３）を用い、表４に記載の組成となるように混合したものを室温で１時間インキュベートした（図４、３．）。
５）ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｏｌｉｇｏ ＤＮＡと実施例１と同様の方法により独自に作製したミスマッチＰＩポリアミド（ＡｃＰｙＰｙβＰｙＩｍＰｙγＰｙＰｙＰｙβＩｍＰｙβＤｐ、化学式：Ｃ８９Ｈ１０８Ｎ３３Ｏ１７、分子量：１６６６．６）を用い、表５に記載の組成となるように混合したものを室温で１時間インキュベートした（図４、４．）。
６）上記２）〜５）をそれぞれ、あらかじめ０．５×ＴＢＥバッファー（組成：４４．５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４４．５ｍＭ ｂｏｒｉｃ ａｃｉｄ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で３５０Ｖ、２０分泳動しておいた２０％ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌで、３５０Ｖで３時間泳動した。
７）泳動が終わったｇｅｌをＬＡＳ３０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ製）で撮影した。結果を図４に示した。
【００２６】
【表２】
【００２７】
【表３】
【００２８】
【表４】
【００２９】
【表５】
【００３０】
２．結果
図４、１．において、２本鎖ＤＮＡがＰＩポリアミドと結合することにより、移動度が変わり２．の位置にシフトすることが確認された。
また、図４、３．において、ＰＩポリアミドがｎｏｎ−ｌａｂｅｌｅｄ ｏｌｉｇｏ ＤＮＡにも結合したため、ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｏｌｉｇｏ ＤＮＡとの結合が減少することが確認された。この結果より、２本鎖ＤＮＡとＰＩポリアミドが配列特異的に結合していることが示された。
さらに、図４、４．において、２本鎖ＤＮＡとミスマッチＰＩポリアミドとが結合しないこと確認され、配列がマッチしていないと結合がおこらないことが示された。
実施例１において合成したＰＩポリアミド（化学式１、化学式２）においても同様に、ヒトＡＢＣＡ１のＡＰ２結合部位に対する配列特異性が確認された。
【００３１】
［試験例２］
＜ＡＢＣＡ１遺伝子の発現に対するＰＩポリアミドの効果＞
１．試料
１）ＰＩポリアミド
実施例１で合成したＰＩポリアミド（化学式１〜３）をそれぞれ用いた。
２）細胞
Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋより分譲を受けたＴＨＰ−１細胞（ＪＣＲＢ０１１２）（Ｈｕｍａｎ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ，ａｃｕｔｅ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ，ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ））を、１０％ＦＢＳ含ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで培養した。細胞はｐｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）３．２×１０−７Ｍ（最終濃度）で７２時間培養してＴＨＰ−１マクロファージに分化させた。すべての細胞は５％ＣＯ２ガス、３７℃で培養を行った。
【００３２】
２．ＡＢＣＡ１遺伝子の発現の確認
上記１．２）のＴＨＰ−１マクロファージを、ＰＩポリアミド１ｕＭ、ドクサゾシン（Ｄｏｘｓａｚｏｓｉｎ、Ｓｉｇｍａ製（Ｄ９８１５））１０ｕＭ（ポジティブコントロール）またはＧｏ６９８３（Ｓｉｇｍａ製（Ｇ１９１８））１０ｎＭ（ポジティブコントロール）をそれぞれ添加した１０％ＦＢＳ含ＲＰＭＩ−１６４０培地で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで１６時間培養した。
１６時間後に培地を捨て、細胞をトライゾール（ＴＲＩｚｏｌ）で回収し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）。精製したｔｏｔａｌ ＲＮＡは Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）で逆転写を行なった。
その後、委託（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により合成したＰｒｉｍｅｒ（配列表配列番号２，３）を用い、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製（４３６７６５９））を使用してｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行なった。また、Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ法（ｈｕｍａｎ １８Ｓ ｒＲＮＡ：ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（製品番号４３５２９３０Ｅ）ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ II， ｗｉｔｈ ＵＮＧ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製（４４４００３８））にてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７５００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用してｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行なった。
得られたデータを１８ＳｒＲＮＡの結果で補正し、図５、６に示した。
【００３３】
３．結果
図５に示したように、ＰＩポリアミド（化学式３）（図５、ＰｙＩｍ）を用いた場合でも、１μＭという低濃度にもかかわらず、ドクサゾシン（図５、Ｄｏｘａｚｏｓｉｎ）またはＧｏ６９８３を用いた場合と同様に、ＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現が、コントロールと比べて有意に上昇することが確認された。
また、図６に示したように、ＰＩポリアミド（化学式１〜３）（図６、７ｍｅｒ：化学式３、８ｍｅｒ：化学式１、１２ｍｅｒ：化学式２）のいずれを用いた場合でも、１μＭという低濃度にもかかわらず、ＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現が上昇することが確認された。
【００３４】
［試験例３］
＜Ａｐｏ−ＡI存在下での細胞外への脂質の引き抜きに対するＰＩポリアミドの効果＞
１．試料
実施例１で合成したＰＩポリアミド（化学式１〜３）および試験例２と同様に得たＴＨＰ−１マクロファージを用いた。
【００３５】
２．Ａｐｏ−ＡI存在下での細胞外への脂質の引き抜きの確認
ＴＨＰ−１マクロファージを、ＰＩポリアミド １ｕＭ、ドクサゾシン １０ｕＭ（ポジティブコントロール）またはＧｏ６９８３ １０ｎＭ（ポジティブコントロール）をそれぞれ添加した０．１％ＢＳＡ、ａｐｏ−ＡI １０ｕｇ／ｍｌ含ＲＰＭＩ−１６４０培地で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで１６時間培養した。Ａｐｏ Ａ−Iはヒトの血漿から超遠心法によりＨＤＬ画分を採取し、エタノール：エーテル（３：２）で脱脂後、Ｓｅｐｈａｃｒｙ Ｓ−２００ ゲルクロマトグラフィーによって得たものを用いた。
１６時間後に各ｗｅｌｌの培地を回収し、これに含まれる脂質をクロロホルム：メタノール（２：１）混液で抽出し、減圧乾固の後にイソプロパノールで溶解した。抽出した脂質に含まれる遊離コレステロールおよびリン脂質を遊離コレステロールＥ−テストワコー（Ｗａｋｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製（４３５−３５８０１））またはリン脂質Ｃ−テストワコー（Ｗａｋｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製（４３３−３６２０１））によって、それぞれ測定した。
細胞はＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ製（０８７１４））で溶解し、ＢＣＡ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製（＃２３２２７））にてタンパク質量を測定した。測定した遊離コレステロールおよびリン脂質の量はタンパク質量で補正し、図７、８に示した。
【００３６】
３．結果
図７（ＦＣ：遊離コレステロール（Ｆｒｅｅ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ），ＰＬ：リン脂質（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ））に示したように、ＰＩポリアミド（化学式３）を用いた場合でも、１μＭという低濃度にもかかわらず、ドクサゾシン（図７、Ｄｏｘａｚｏｓｉｎ）またはＧｏ６９８３を用いた場合と同様に、遊離コレステロールおよびリン脂質の量がコントロールと比べて多く、ＰＩポリアミド（図７、ＰｙＩｍ）が細胞外への脂質の引き抜きに有用であることが確認された。
また、図８に示したように、ＰＩポリアミド（化学式１〜３）（図８、７ｍｅｒ：化学式３、８ｍｅｒ：化学式１、１２ｍｅｒ：化学式２）のいずれを用いた場合でも、１μＭという低濃度にもかかわらず、リン脂質の量がコントロールと比べて多く、ＰＩポリアミド（化学式１〜３）のいずれもが細胞外への脂質の引き抜きに有用であることが確認された。
【００３７】
［試験例４］
＜ＡＢＣＡ１タンパク質の発現に対するＰＩポリアミドの効果＞
１．試料
実施例１で合成したＰＩポリアミド（化学式３）および試験例２と同様に得たＴＨＰ−１マクロファージを用いた。
【００３８】
２．ＡＢＣＡ１タンパク質の発現確認
ＴＨＰ−１マクロファージを、ＰＩポリアミド １ｕＭ、ドクサゾシン １０ｕＭ（ポジティブコントロール）またはＧｏ６９８３ １０ｎＭ（ポジティブコントロール）をそれぞれ添加した１０％ＦＢＳ含ＲＰＭＩ−１６４０培地で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで２４時間培養した。
２４時間後に培地を捨て、細胞をＰＢＳで洗った後、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，２ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含むＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ製（０８７１４））で溶解した。４−２０％ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜に転写後、抗ＡＢＣＡ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製（ＳＣ−５４９１））を用い、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製（ＲＰＮ２１３２））にて発現したＡＢＣＡ１タンパク質を検出した。
【００３９】
３．結果
図９に示したように、ＰＩポリアミド（化学式３）（図９、ＰｙＩｍ）を用いた場合でも、１μＭという低濃度にもかかわらず、ドクサゾシン（図９、Ｄｏｘａｚｏｓｉｎ）またはＧｏ６９８３を用いた場合と同様に、ＡＢＣＡ１タンパク質の発現が、コントロールと比べて上昇することが確認された。
【実施例２】
【００４０】
＜抗動脈硬化剤＞
実施例１において合成した１種以上のＰＩポリアミドを有効成分として、抗動脈硬化剤を製造した。
【００４１】
［試験例５］
＜Ｉｎ ｖｉｖｏでの血中ＨＤＬ増加作用におけるＰＩポリアミドの効果＞
１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＩポリアミドの効果の確認
マウスＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域のＡＰ２結合部位を中心とした部位（認識部位：図２（４）の赤字部分に示した塩基配列（７塩基配列））に結合するように設計し、実施例１と同様の方法により独自に作製したＰＩポリアミド（ＡｃＰｙＰｙＩｍβＩｍＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙＩｍβＤｐ（化学式４）以下、ｍＡＢＣ１と示す）、化学式：Ｃ７６Ｈ９５Ｎ３０Ｏ１５＋、分子量：１６６６．９３）を用い、試験例１と同様の方法で、マウスＡＢＣＡ１のＡＰ２結合部位に対する配列特異性をゲルシフトアッセイによって確認した。その結果、図１０に示すように、ｍＡＢＣ１はマウスＡＢＣＡ１のＡＰ２結合部位に対する配列特異性に対し、配列特異性を有することが確認された。
次に、理研バイオリソースセンターより分譲を受けたマウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４ｃｅｌｌ）を用いて、試験例２と同様の方法で、マウスＡＢＣＡ１遺伝子の発現を確認し、試験例３と同様の方法でＡｐｏ−ＡI存在下での細胞外への脂質の引き抜きに対する効果を確認した。
その結果、図１１に示すように、コントロールに対してｍＡＢＣ１（図１１、ＰｙＩｍ）はＲＡＷ２６４ｃｅｌにおけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現をポジティブコントロールであるドクサゾシン（図１１、Ｄｏｘ）と同様に有意に増加させた。また、細胞外への脂質の引き抜きにおいても遊離コレステロール（図１２）、リン脂質（図１３）ともにｍＡＢＣ１（図１２、１３、ＰｙＩｍ）はその引き抜きを有意に増加させることが確認された。
【００４２】
【化４】
【００４３】
２．Ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＩポリアミドの効果の確認
室温２２±５℃でマウスラットハムスター用の飼料ＭＦ（オリエンタル酵母株式会社）と水を不断給餌にて飼育したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス９週令雄（オリエンタル酵母株式会社）を用いた。
マウスをミスマッチＰＩポリアミド（試験例１、５）で用いているものと同じもの）を投与するコントロール群と実験群（ＰＩポリアミド（以下、ｍＡＢＣ１とする）投与）群に分け（ｎ＝５）、各ＰＩポリアミドを０．１％酢酸に溶解し、１ｍｇ／ｋｇ ＢＷを尾静脈より１日おきに４回投与し、１０日目に麻酔下で心臓からの採血と肝臓の摘出を行なった。
この血液より血漿を分離し、アガロースゲル電気泳動を行なった。その結果、図１４に示したように、ｍＡＢＣ１投与群（図１４、Ｐ−２〜Ｐ−５）において、コントロール群（図１４、Ｃ−３〜Ｃ−６）と比べてＨＤＬ分画の増加が認められた。さらにＨＰＬＣで詳細な変化を検討したところ、ｍＡＢＣ１投与群でｌａｒｇｅ ＨＤＬおよびｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ ＨＤＬが増加していることが確認された。
さらにＨＰＬＣにて詳細な血漿中のリポタンパク解析を行なうとともに、血液中の白血球と肝臓組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡを採取し、ＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現を調べた。その結果、白血球中のＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現は有意な差はないもののＰＩポリアミド投与群で高くなることが確認された。また肝臓におけるＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量はコントロール群に対して有意に増加することが確認された。
【００４４】
これらの結果より、マウスＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域のＡＰ２結合部位を中心とした部位に結合するＰＩポリアミドがｉｎ ｖｉｖｏにおいて、血中ＨＤＬを増加させる作用や肝臓のＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量を増加させる作用を有することが確認できたことから、本発明において作成したヒトＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域のＡＰ２結合部位を中心とした部位に結合するＰＩポリアミド（化学式１〜３）も同様の作用を有するものと予測された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明によって提供されるＰＩポリアミドは、安定かつ効果的な血中ＨＤＬ増加剤および抗動脈硬化剤の有効成分として利用できる。また、ＰＩポリアミドを有効成分とする薬剤の提供により、動脈硬化性疾患の予防、治療において、さらに有用なＰＩポリアミドの合成を行うことが可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のピロールイミダゾールポリアミド（以下、ＰＩポリアミドと示す）、該ＰＩポリアミドを有効成分として含む血中高比重リポ蛋白増加剤（以下、血中ＨＤＬ増加剤と示す）または抗動脈硬化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポ蛋白のひとつであるＨＤＬは、その血中レベルと動脈硬化性疾患の頻度が逆相関し、抗動脈硬化作用を示すことが知られている。そこで、アテローム性動脈硬化症等の動脈硬化性疾患の治療や予防を目的として、ＨＤＬの血中レベルを挙げる様々な物質が開発されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
ＡＢＣＡ１（ＡＴＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ Ａ１）は、ＨＤＬが末梢組織の細胞からコレステロールを引き抜く際に主要な役割を担う蛋白であり、この発現量とＨＤＬの血中レベルは相関している。そこで、ＡＢＣＡ１の発現量を大幅かつ持続的に上昇させるシステインプロテアーゼインヒビターを有効成分とした低ＨＤＬ血症改善剤および動脈硬化症予防・治療剤（例えば、特許文献２参照）や、ビスフェノール型化合物を有効成分としたＡＢＣＡ１安定化剤が開発されている（例えば、特許文献３）。これらはＨＤＬの血中レベルを挙げるために有用であるが、さらに安定かつ効果的な血中ＨＤＬ増加剤の提供が望まれていた。
【０００４】
近年、遺伝子発現制御技術において、生体内での安定性、組織・細胞への移行性に優れたＰＩポリアミドが注目されている。本発明者らはこの物質に着目し、独自の方法により、ＨＤＬの血中レベルを挙げるために効果的な、新たなＰＩポリアミドの開発に取り組んでいる。その結果、本発明において、従来の低ＨＤＬ血症改善剤および動脈硬化症予防・治療剤等よりも安定かつ効果的な血中ＨＤＬ増加剤等の提供するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００９−５２２２９３号公報
【特許文献２】国際公開第２００３／０３３０２３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００５／０６７９０４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はＨＤＬの血中レベルを上げるために有用な新規のＰＩポリアミドの提供を課題とする。さらに、該ＰＩポリアミドを有効成分とする抗動脈硬化剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＨＤＬの血中レベルに相関するＡＢＣＡ１の発現量を上昇させるため、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の発現を制御し得るＰＩポリアミド（３種）を合成し、本発明を完成するに至った。
本発明者らが合成したこれらのＰＩポリアミドは、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域に存在する負の転写制御領域であるＡＰ２結合部位に結合するものであり、ＡＰ２の結合を阻害することで、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の発現を上昇させることができる。本発明者らは、これらのＰＩポリアミドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏの試験においてＡＢＣＡ１遺伝子の発現を増加させることを確認しており、また、ｉｎ ｖｉｖｏの試験において血中ＨＤＬを増加させることも確認している。
【０００８】
すなわち、本発明は次の（１）〜（３）のＰＩポリアミド、該ＰＩポリアミドを有効成分とする血中ＨＤＬ増加剤および抗動脈硬化剤等に関する。
（１）化学式１〜３のいずれか一種以上のＰＩポリアミドを有効成分として含む血中ＨＤＬ増加剤。
【化１】
【化２】
【化３】
（２）化学式１〜３のいずれか一種以上のＰＩポリアミドを有効成分として含む抗動脈硬化剤。
（３）化学式１または２に記載のＰＩポリアミド。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって提供されるＰＩポリアミドを有効成分とする抗動脈硬化剤は、動脈硬化性疾患の予防、治療において、ＡＢＣＡ１遺伝子の発現を増加させ、ＨＤＬを増加させる、新たな作用を有する薬剤として広く利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒトＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域の塩基配列を示した図である（実施例１）。
【図２】ＰＩポリアミドが認識するＡＰ２結合部位を中心とした部位の塩基配列を示した図である（実施例１）。
【図３】ＰＩポリアミドの精製結果を示した図である（実施例１）。
【図４】ＰＩポリアミドの配列特異性を確認した図である（試験例１）。
【図５】ＡＢＣＡ１遺伝子の発現に対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例２）。
【図６】ＡＢＣＡ１遺伝子の発現に対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例２）。
【図７】細胞外への脂質の引き抜きに対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例３）。
【図８】細胞外への脂質の引き抜きに対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例３）。
【図９】ＡＢＣＡ１タンパク質の発現に対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例４）。
【図１０】ＰＩポリアミドの配列特異性を確認した図である（試験例５）。
【図１１】ＡＢＣＡ１遺伝子の発現に対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例５）。
【図１２】細胞外への脂質（遊離コレステロール）の引き抜きに対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例５）。
【図１３】細胞外への脂質（リン脂質）の引き抜きに対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例５）。
【図１４】Ｉｎ ｖｉｖｏでの血中ＨＤＬ増加作用におけるＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例５）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の「血中ＨＤＬ増加剤」とは、ヒト等の哺乳類に注射等によって投与することによって、血中のＨＤＬを増加させることができる剤のことをいう。
化学式１〜３のＰＩポリアミドを一種または組み合わせて有効成分とする剤であれば良く、有効成分以外に薬物的に許容されている担体等を含んでいても良い。
化学式１〜３のＰＩポリアミドは、従来知られているいずれのＰＩポリアミドの合成方法によっても合成することができるが、特にＰＳＳＭ−８の合成プログラムによって合成することが好ましい。
【００１２】
これらのＰＩポリアミドは、抗動脈硬化剤の有効成分とすることができる。この「抗動脈硬化剤」とは、動脈硬化性疾患の予防や治療を目的とする剤のことをいい、化学式１〜３のＰＩポリアミドを一種または組み合わせて有効成分とする剤であれば良く、有効成分以外に薬物的に許容されている担体等を含んでいても良い。
【００１３】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１４】
＜ＰＩポリアミドの作製＞
１．ＰＩポリアミドの設計
ヒトＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域のＡＰ２結合部位を中心とした部位に結合するように、次の１〜３のＰＩポリアミド（３種）を設計した。図１にヒトＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域の塩基配列を示した。このうち、青色の枠で囲われた、上にＡＰ２結合部位と記載された部分がＡＰ２結合部位の塩基配列である。以下、化学式における各記号は次の意味を示す（Ａｃ：アセチル、Ｐｙ：ピロール、Ｉｍ：イミダゾール、β：β−アラニン、γ：γ−酪酸、Ｄｐ：Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン）。
ＰＩポリアミドは、Ｐｙ／ＰｙやＰｙ／Ｉｍの組み合わせのように、２つを組み合わせて対をなすことでＤＮＡ二重螺旋構造の認識を可能としたものである。しかし、Ｐｙ／ＰｙやＰｙ／Ｉｍの組み合わせからなるＰＩポリアミドは構造的に非常に剛直であり、５つ以上連結するとＤＮＡ二重螺旋構造の副溝から外れてしまい結合力が低下する。そのため、３つ置きにＷ（ＡまたはＴ）を認識する柔軟なβ−アラニンペア（β／βの組み合わせ）を導入しなければＤＮＡ二重螺旋構造の副溝に結合出来ないという大きな制限がある。そのため、従来からＧＣ配列が豊富な塩基配列を認識できるＰＩポリアミドの構築は困難であった。また、４−８塩基の塩基配列を認識するＰＩポリアミドは得られているものの、ゲノム上のユニーク遺伝子を認識するには、少なくとも１２塩基以上が必要とされていることから、より長い塩基配列を認識できるＰＩポリアミドの提供が求められていた。
本発明では自動合成機ＰＳＳＭ−８を用い、その最適化によることで１２塩基を認識するＰＩポリアミドの自動合成に初めて成功した。ＰＩポリアミドの設計において、ポリアミドにヘアピン構造を取り込み、ポリアミドの２つの対がずれない構造にすると共に、従来のＰｙ／Ｐｙ、Ｐｙ／Ｉｍの組み合わせの他に、ＰｙまたはＩｍとの組み合わせで自由度を高く保ち、ＤＮＡ二重螺旋のスパイラル構造の曲がりに柔軟に対応するβ−アラニンを取り入れ、Ｐｙ／β、Ｉｍ／βの組み合わせを連続することでβ−アラニンがクロスする構造を加えた。これによって、３塩基毎のβ／βのβ−アラニンの組み合わせによるＷ（ＡまたはＴ）の配列認識の規則を必要とせず、ＧＣ、ＣＧ等の認識を配することで克服が可能となった。すなわち、本発明は、ＧＣ配列が豊富な塩基配列の認識の選択性を高めることができ、かつ螺旋構造にねじれた位置関係の自由度を持たせて結合できるヘアピン型ＰＩポリアミドを初めて得たものである。
【００１５】
１）ＰＩポリアミド（８塩基認識）
図２（２）の赤字部分に示した塩基配列（８塩基配列）を認識するように、ＡｃＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙＰｙγＩｍＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙβＤｐ（化学式１）のＰＩポリアミドを設計した。化学式はＣ８５Ｈ１０４Ｎ３７Ｏ１７＋、分子量は１９１５．９７であった。
２）ＰＩポリアミド（１２塩基認識）
図２（３）赤字部分に示した塩基配列（１２塩基配列）を認識するように、ＡｃＩｍＰｙＰｙβＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙＰｙγＩｍＩｍＰｙβＩｍＩｍβＩｍＩｍＩｍＰｙβＤｐ（化学式２）のＰＩポリアミドを設計した。化学式はＣ１２３Ｈ１４６Ｎ５５Ｏ２５＋、分子量は２７９４．８３であった。
８塩基以上の塩基配列を認識するＰＩポリアミドとして、タンデムなヘアピン構造のＰＩポリアミドやＤＮＡとの複合体は理論上可能とされているが、化学式１、２のような単純なヘアピン構造のＰＩポリアミドにおいて、８塩基以上の塩基配列を認識するものは知られていなかった。さらに、これらのＰＩポリアミドはＧＣ配列が豊富な塩基配列を認識できる新規なものであった。
３）ＰＩポリアミド（７塩基認識）
図２（１）赤字部分に示した塩基配列（７塩基配列）を認識するように、ＡｃＰｙＰｙβＰｙＰｙＩｍγＰｙＰｙＰｙβＩｍＩｍβＤｐ（化３）（化学式３）のＰＩポリアミドを設計した。化学式は１６６７．７７Ｃ７７Ｈ９６Ｎ２９Ｏ１５＋、分子量は１６６７．７７であった。
【００１６】
【化１】
【００１７】
【化２】
【００１８】
【化３】
【００１９】
２．ＰＩポリアミドの合成
＜ＨＣＴＵを用いたピロールイミダゾールポリアミドの合成＞
ＨＣＴＵ（株式会社ペプチド研究所）を縮合活性化剤として、上記１．で設計したＰＩポリアミド（３種）をそれぞれ合成した。
１．試薬の調製
１）モノマー
ＦｍｏｃＰｙＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，３６ｍｇ）、ＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，７７ｍｇ）、Ｆｍｏｃ−γ−Ａｂｕ−ＯＨ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ，３４ｍｇ）及びＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ，３２ｍｇ）を合成するＰＩポリアミドごとに必要なカップリング分用意し、レジンに対してＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨを４当量、それ以外を２当量ずつ秤量し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移した。さらにＨＣＴＵをＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨのチューブには８８ｍｇ、それ以外のチューブには４４ｍｇをそれぞれ加え、ＮＭＰ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ製）をＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨのチューブに５００μＬ、それ以外のチューブには２５０μＬ加えボルテックス及び１時間静置し完全に溶解させた。
２）合成用試薬
合成機による合成のために、表１に記載の試薬を調製して用いた。
【００２０】
【表１】
【００２１】
３．レジンの調製
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｗａｎｇ−Ｒｅｓｉｎ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）をＳｍａｌｌ Ｌｉｂｒａ Ｔｕｂｅ（ＨｉＰｅｐ研究所製）に４０ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）取り、ペプチド合成機にセットし、ＮＭＰ１ｍＬを加え２０分間膨潤させた。
【００２２】
４．ペプチド合成（自動）
上記１．で調製したＤＩＥＡを縮合活性化剤として合成機（ＰＳＳＭ−８；島津製作所製）にインストールし、また先に準備しておいた各モノマーの入ったチューブをＣ末端から順番通りに合成機内ラックに配置した。ＰＳＳＭ−８の合成プログラムをセットし、合成機をスタートさせ、Ｈ２ＮＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙＰｙγＩｍＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙβ−Ｒｅｓｉｎ、Ｈ２ＮＩｍＰｙＰｙβＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙＰｙγＩｍＩｍＰｙβＩｍＩｍβＩｍＩｍＩｍＰｙβ−ＲｅｓｉｎまたはＨ２ＮＰｙＰｙβＰｙＰｙＩｍγＰｙＰｙＰｙβＩｍＩｍβ−Ｒｅｓｉｎまで次の（１）〜（４）の反応サイクルを繰り返すことで自動合成を行った。
【００２３】
反応サイクル
（１）カップリング処理を、上記活性化剤を用いてＮＭＰ中で３０分間行った。
（２）余剰のモノマー及び活性化剤を除くため１ｍＬのＮＭＰによるレジンの洗浄を５回繰り返した。
（３）Ｆｍｏｃ脱保護溶液（３０％Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ／ＮＭＰ）を１ｍＬ加え３分間反応させ、溶液を除去後、再び同じサイクルを繰り返した。
（４）Ｆｍｏｃ脱保護溶液を除くため１ｍＬのＮＭＰによるレジンの洗浄を５回繰り返し（１）に戻った。目的産物が得られるまでこのサイクルを繰り返した。
【００２４】
５．精製
合成機からレジンを取り出し、洗浄、乾燥の後、ネジ式キャップのエッペンドルフチューブに移しＮ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ製，２ｍＬ）を５００μＬ加えてヒートブロックにより５５℃で一晩加熱することでレジンからポリアミドの切り出しを行った。反応液をＬｉｂｒａ Ｔｕｂｅに移し、濾過によりレジンを取り除き、レジンに付着している残りの反応液をＮＭＰ１ｍＬ及びメタノール１ｍＬで回収した。
溶媒を留去後、ＨＰＬＣで分取精製した。分取精製後のＨＰＬＣを図３に示した（０．１％ＡｃＯＨ：ＣＨ３ＣＮ＝１００：０〜０：１００，３０ｍｉｎ）。分取精製の後、凍結乾燥をして、上記１．で設計したＰＩポリアミド（３種）をそれぞれ得た。
【００２５】
［試験例１］
＜ＰＩポリアミドの配列特異性の確認＞
実施例１において合成したＰＩポリアミド（化学式３）のヒトＡＢＣＡ１のＡＰ２結合部位に対する配列特異性をゲルシフトアッセイによって確認した。
１．試料の作成および試験
１）ＰＩポリアミドが結合するＡＰ２結合部位を含むＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ（配列表配列番号１）とその相補鎖を委託（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）により合成した。
即ち、この相補鎖とＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｏｌｉｇｏ ＤＮＡを用い、表２に記載の組成となるよう混合したものを９５℃で５分間インキュベーションした。その後、ゆっくりと室温まで温度を下げることで、２本鎖ＤＮＡを作成した。
２）上記１）の２本鎖ＤＮＡをそのまま用いた（図４、１．）
３）上記１）の２本鎖ＤＮＡと等量（等モル）のＰＩポリアミド（化学式３）を用い、表３に記載の組成となるように混合したものを室温で１時間インキュベートした（図４、２．）。
４）特異的ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒとして、ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｏｌｉｇｏ ＤＮＡに対し１０倍量のｎｏｎ−ｌａｂｅｌｅｄ ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ（ＦＩＴＣの修飾がないｏｌｉｇｏ ＤＮＡ）を加え、２本鎖ＤＮＡとＰＩポリアミド（化学式３）を用い、表４に記載の組成となるように混合したものを室温で１時間インキュベートした（図４、３．）。
５）ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｏｌｉｇｏ ＤＮＡと実施例１と同様の方法により独自に作製したミスマッチＰＩポリアミド（ＡｃＰｙＰｙβＰｙＩｍＰｙγＰｙＰｙＰｙβＩｍＰｙβＤｐ、化学式：Ｃ８９Ｈ１０８Ｎ３３Ｏ１７、分子量：１６６６．６）を用い、表５に記載の組成となるように混合したものを室温で１時間インキュベートした（図４、４．）。
６）上記２）〜５）をそれぞれ、あらかじめ０．５×ＴＢＥバッファー（組成：４４．５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４４．５ｍＭ ｂｏｒｉｃ ａｃｉｄ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で３５０Ｖ、２０分泳動しておいた２０％ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌで、３５０Ｖで３時間泳動した。
７）泳動が終わったｇｅｌをＬＡＳ３０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ製）で撮影した。結果を図４に示した。
【００２６】
【表２】
【００２７】
【表３】
【００２８】
【表４】
【００２９】
【表５】
【００３０】
２．結果
図４、１．において、２本鎖ＤＮＡがＰＩポリアミドと結合することにより、移動度が変わり２．の位置にシフトすることが確認された。
また、図４、３．において、ＰＩポリアミドがｎｏｎ−ｌａｂｅｌｅｄ ｏｌｉｇｏ ＤＮＡにも結合したため、ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｏｌｉｇｏ ＤＮＡとの結合が減少することが確認された。この結果より、２本鎖ＤＮＡとＰＩポリアミドが配列特異的に結合していることが示された。
さらに、図４、４．において、２本鎖ＤＮＡとミスマッチＰＩポリアミドとが結合しないこと確認され、配列がマッチしていないと結合がおこらないことが示された。
実施例１において合成したＰＩポリアミド（化学式１、化学式２）においても同様に、ヒトＡＢＣＡ１のＡＰ２結合部位に対する配列特異性が確認された。
【００３１】
［試験例２］
＜ＡＢＣＡ１遺伝子の発現に対するＰＩポリアミドの効果＞
１．試料
１）ＰＩポリアミド
実施例１で合成したＰＩポリアミド（化学式１〜３）をそれぞれ用いた。
２）細胞
Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋより分譲を受けたＴＨＰ−１細胞（ＪＣＲＢ０１１２）（Ｈｕｍａｎ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ，ａｃｕｔｅ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ，ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ））を、１０％ＦＢＳ含ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで培養した。細胞はｐｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）３．２×１０−７Ｍ（最終濃度）で７２時間培養してＴＨＰ−１マクロファージに分化させた。すべての細胞は５％ＣＯ２ガス、３７℃で培養を行った。
【００３２】
２．ＡＢＣＡ１遺伝子の発現の確認
上記１．２）のＴＨＰ−１マクロファージを、ＰＩポリアミド１ｕＭ、ドクサゾシン（Ｄｏｘｓａｚｏｓｉｎ、Ｓｉｇｍａ製（Ｄ９８１５））１０ｕＭ（ポジティブコントロール）またはＧｏ６９８３（Ｓｉｇｍａ製（Ｇ１９１８））１０ｎＭ（ポジティブコントロール）をそれぞれ添加した１０％ＦＢＳ含ＲＰＭＩ−１６４０培地で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで１６時間培養した。
１６時間後に培地を捨て、細胞をトライゾール（ＴＲＩｚｏｌ）で回収し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）。精製したｔｏｔａｌ ＲＮＡは Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）で逆転写を行なった。
その後、委託（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により合成したＰｒｉｍｅｒ（配列表配列番号２，３）を用い、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製（４３６７６５９））を使用してｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行なった。また、Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ法（ｈｕｍａｎ １８Ｓ ｒＲＮＡ：ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（製品番号４３５２９３０Ｅ）ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ II， ｗｉｔｈ ＵＮＧ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製（４４４００３８））にてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７５００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用してｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行なった。
得られたデータを１８ＳｒＲＮＡの結果で補正し、図５、６に示した。
【００３３】
３．結果
図５に示したように、ＰＩポリアミド（化学式３）（図５、ＰｙＩｍ）を用いた場合でも、１μＭという低濃度にもかかわらず、ドクサゾシン（図５、Ｄｏｘａｚｏｓｉｎ）またはＧｏ６９８３を用いた場合と同様に、ＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現が、コントロールと比べて有意に上昇することが確認された。
また、図６に示したように、ＰＩポリアミド（化学式１〜３）（図６、７ｍｅｒ：化学式３、８ｍｅｒ：化学式１、１２ｍｅｒ：化学式２）のいずれを用いた場合でも、１μＭという低濃度にもかかわらず、ＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現が上昇することが確認された。
【００３４】
［試験例３］
＜Ａｐｏ−ＡI存在下での細胞外への脂質の引き抜きに対するＰＩポリアミドの効果＞
１．試料
実施例１で合成したＰＩポリアミド（化学式１〜３）および試験例２と同様に得たＴＨＰ−１マクロファージを用いた。
【００３５】
２．Ａｐｏ−ＡI存在下での細胞外への脂質の引き抜きの確認
ＴＨＰ−１マクロファージを、ＰＩポリアミド １ｕＭ、ドクサゾシン １０ｕＭ（ポジティブコントロール）またはＧｏ６９８３ １０ｎＭ（ポジティブコントロール）をそれぞれ添加した０．１％ＢＳＡ、ａｐｏ−ＡI １０ｕｇ／ｍｌ含ＲＰＭＩ−１６４０培地で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで１６時間培養した。Ａｐｏ Ａ−Iはヒトの血漿から超遠心法によりＨＤＬ画分を採取し、エタノール：エーテル（３：２）で脱脂後、Ｓｅｐｈａｃｒｙ Ｓ−２００ ゲルクロマトグラフィーによって得たものを用いた。
１６時間後に各ｗｅｌｌの培地を回収し、これに含まれる脂質をクロロホルム：メタノール（２：１）混液で抽出し、減圧乾固の後にイソプロパノールで溶解した。抽出した脂質に含まれる遊離コレステロールおよびリン脂質を遊離コレステロールＥ−テストワコー（Ｗａｋｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製（４３５−３５８０１））またはリン脂質Ｃ−テストワコー（Ｗａｋｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製（４３３−３６２０１））によって、それぞれ測定した。
細胞はＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ製（０８７１４））で溶解し、ＢＣＡ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製（＃２３２２７））にてタンパク質量を測定した。測定した遊離コレステロールおよびリン脂質の量はタンパク質量で補正し、図７、８に示した。
【００３６】
３．結果
図７（ＦＣ：遊離コレステロール（Ｆｒｅｅ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ），ＰＬ：リン脂質（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ））に示したように、ＰＩポリアミド（化学式３）を用いた場合でも、１μＭという低濃度にもかかわらず、ドクサゾシン（図７、Ｄｏｘａｚｏｓｉｎ）またはＧｏ６９８３を用いた場合と同様に、遊離コレステロールおよびリン脂質の量がコントロールと比べて多く、ＰＩポリアミド（図７、ＰｙＩｍ）が細胞外への脂質の引き抜きに有用であることが確認された。
また、図８に示したように、ＰＩポリアミド（化学式１〜３）（図８、７ｍｅｒ：化学式３、８ｍｅｒ：化学式１、１２ｍｅｒ：化学式２）のいずれを用いた場合でも、１μＭという低濃度にもかかわらず、リン脂質の量がコントロールと比べて多く、ＰＩポリアミド（化学式１〜３）のいずれもが細胞外への脂質の引き抜きに有用であることが確認された。
【００３７】
［試験例４］
＜ＡＢＣＡ１タンパク質の発現に対するＰＩポリアミドの効果＞
１．試料
実施例１で合成したＰＩポリアミド（化学式３）および試験例２と同様に得たＴＨＰ−１マクロファージを用いた。
【００３８】
２．ＡＢＣＡ１タンパク質の発現確認
ＴＨＰ−１マクロファージを、ＰＩポリアミド １ｕＭ、ドクサゾシン １０ｕＭ（ポジティブコントロール）またはＧｏ６９８３ １０ｎＭ（ポジティブコントロール）をそれぞれ添加した１０％ＦＢＳ含ＲＰＭＩ−１６４０培地で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで２４時間培養した。
２４時間後に培地を捨て、細胞をＰＢＳで洗った後、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，２ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含むＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ製（０８７１４））で溶解した。４−２０％ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜に転写後、抗ＡＢＣＡ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製（ＳＣ−５４９１））を用い、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製（ＲＰＮ２１３２））にて発現したＡＢＣＡ１タンパク質を検出した。
【００３９】
３．結果
図９に示したように、ＰＩポリアミド（化学式３）（図９、ＰｙＩｍ）を用いた場合でも、１μＭという低濃度にもかかわらず、ドクサゾシン（図９、Ｄｏｘａｚｏｓｉｎ）またはＧｏ６９８３を用いた場合と同様に、ＡＢＣＡ１タンパク質の発現が、コントロールと比べて上昇することが確認された。
【実施例２】
【００４０】
＜抗動脈硬化剤＞
実施例１において合成した１種以上のＰＩポリアミドを有効成分として、抗動脈硬化剤を製造した。
【００４１】
［試験例５］
＜Ｉｎ ｖｉｖｏでの血中ＨＤＬ増加作用におけるＰＩポリアミドの効果＞
１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＩポリアミドの効果の確認
マウスＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域のＡＰ２結合部位を中心とした部位（認識部位：図２（４）の赤字部分に示した塩基配列（７塩基配列））に結合するように設計し、実施例１と同様の方法により独自に作製したＰＩポリアミド（ＡｃＰｙＰｙＩｍβＩｍＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙＩｍβＤｐ（化学式４）以下、ｍＡＢＣ１と示す）、化学式：Ｃ７６Ｈ９５Ｎ３０Ｏ１５＋、分子量：１６６６．９３）を用い、試験例１と同様の方法で、マウスＡＢＣＡ１のＡＰ２結合部位に対する配列特異性をゲルシフトアッセイによって確認した。その結果、図１０に示すように、ｍＡＢＣ１はマウスＡＢＣＡ１のＡＰ２結合部位に対する配列特異性に対し、配列特異性を有することが確認された。
次に、理研バイオリソースセンターより分譲を受けたマウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４ｃｅｌｌ）を用いて、試験例２と同様の方法で、マウスＡＢＣＡ１遺伝子の発現を確認し、試験例３と同様の方法でＡｐｏ−ＡI存在下での細胞外への脂質の引き抜きに対する効果を確認した。
その結果、図１１に示すように、コントロールに対してｍＡＢＣ１（図１１、ＰｙＩｍ）はＲＡＷ２６４ｃｅｌにおけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現をポジティブコントロールであるドクサゾシン（図１１、Ｄｏｘ）と同様に有意に増加させた。また、細胞外への脂質の引き抜きにおいても遊離コレステロール（図１２）、リン脂質（図１３）ともにｍＡＢＣ１（図１２、１３、ＰｙＩｍ）はその引き抜きを有意に増加させることが確認された。
【００４２】
【化４】
【００４３】
２．Ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＩポリアミドの効果の確認
室温２２±５℃でマウスラットハムスター用の飼料ＭＦ（オリエンタル酵母株式会社）と水を不断給餌にて飼育したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス９週令雄（オリエンタル酵母株式会社）を用いた。
マウスをミスマッチＰＩポリアミド（試験例１、５）で用いているものと同じもの）を投与するコントロール群と実験群（ＰＩポリアミド（以下、ｍＡＢＣ１とする）投与）群に分け（ｎ＝５）、各ＰＩポリアミドを０．１％酢酸に溶解し、１ｍｇ／ｋｇ ＢＷを尾静脈より１日おきに４回投与し、１０日目に麻酔下で心臓からの採血と肝臓の摘出を行なった。
この血液より血漿を分離し、アガロースゲル電気泳動を行なった。その結果、図１４に示したように、ｍＡＢＣ１投与群（図１４、Ｐ−２〜Ｐ−５）において、コントロール群（図１４、Ｃ−３〜Ｃ−６）と比べてＨＤＬ分画の増加が認められた。さらにＨＰＬＣで詳細な変化を検討したところ、ｍＡＢＣ１投与群でｌａｒｇｅ ＨＤＬおよびｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ ＨＤＬが増加していることが確認された。
さらにＨＰＬＣにて詳細な血漿中のリポタンパク解析を行なうとともに、血液中の白血球と肝臓組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡを採取し、ＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現を調べた。その結果、白血球中のＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現は有意な差はないもののＰＩポリアミド投与群で高くなることが確認された。また肝臓におけるＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量はコントロール群に対して有意に増加することが確認された。
【００４４】
これらの結果より、マウスＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域のＡＰ２結合部位を中心とした部位に結合するＰＩポリアミドがｉｎ ｖｉｖｏにおいて、血中ＨＤＬを増加させる作用や肝臓のＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量を増加させる作用を有することが確認できたことから、本発明において作成したヒトＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域のＡＰ２結合部位を中心とした部位に結合するＰＩポリアミド（化学式１〜３）も同様の作用を有するものと予測された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明によって提供されるＰＩポリアミドは、安定かつ効果的な血中ＨＤＬ増加剤および抗動脈硬化剤の有効成分として利用できる。また、ＰＩポリアミドを有効成分とする薬剤の提供により、動脈硬化性疾患の予防、治療において、さらに有用なＰＩポリアミドの合成を行うことが可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式１〜３のいずれか一種以上のＰＩポリアミドを有効成分として含む血中ＨＤＬ増加剤。
［化学式１］
［化学式２］
［化学式３］
【請求項２】
化学式１〜３のいずれか一種以上のＰＩポリアミドを有効成分として含む抗動脈硬化剤。
【請求項３】
化学式１または２に記載のＰＩポリアミド。
【請求項１】
化学式１〜３のいずれか一種以上のＰＩポリアミドを有効成分として含む血中ＨＤＬ増加剤。
［化学式１］
［化学式２］
［化学式３］
【請求項２】
化学式１〜３のいずれか一種以上のＰＩポリアミドを有効成分として含む抗動脈硬化剤。
【請求項３】
化学式１または２に記載のＰＩポリアミド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１２−６８９７（Ｐ２０１２−６８９７Ａ）
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４６９８５（Ｐ２０１０−１４６９８５）
【出願日】平成２２年６月２８日（２０１０．６．２８）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２８日（２０１０．６．２８）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
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