血液癌前駆細胞を障害する方法およびその関連化合物
【課題】 白血病および悪性リンパ増殖性障害の検出および治療に有用である方法および化合物を提供する。
【解決手段】 ＣＤ１２３を発現している細胞を選択的に標的とすることによって、血液癌（例えば白血病およびリンパ腫）の前駆細胞を障害する方法を提供する。さらに、ＣＤ１２３に選択的に結合し、血液癌前駆細胞を障害する有用な化合物も提供する。前記化合物は、例えば放射性同位元素、化学療法剤などの細胞毒性部分を含むことができる。
【解決手段】 ＣＤ１２３を発現している細胞を選択的に標的とすることによって、血液癌（例えば白血病およびリンパ腫）の前駆細胞を障害する方法を提供する。さらに、ＣＤ１２３に選択的に結合し、血液癌前駆細胞を障害する有用な化合物も提供する。前記化合物は、例えば放射性同位元素、化学療法剤などの細胞毒性部分を含むことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０００年３月６日出願の米国特許仮出願第６０／１８７１２３号および２０００年８月２４日出願の第６０／２２７２９５号の優先権の利益を主張するもので、これらの出願の開示はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、血液癌前駆細胞に特異的な細胞表面マーカを標的とすることによって、血液癌前駆細胞を障害し、または血液癌を治療する方法に関する。本発明はさらに、血液癌を診断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞は、哺乳動物のさまざまな組織系で普通に見られる細胞である。幹細胞を定義する基準は文の前後関係によって変わってくるが、一般に２つの属性が、幹細胞集団の中心的特徴と考えられている。すなわち（１）幹細胞は、自己複製または自己再生に対してなんらかの能力を示すべきものであり、（２）幹細胞は、適当な系統に分化する能力を有していなければならない（Ｐｏｔｔｅｎ ＣＳ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｌｏｎｄｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７）。この性質の細胞は、造血系、胚系、神経系、筋系および肝系を含むいくつかの組織に対して記述されている（Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ ＩＲ．、Ｃｌｏｎａｌ、ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９１、３：３４９−５５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＪ．他、Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９５、１１：３５−７１；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＥＪ．、Ｕｓｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｒｍ ｌｉｎｅ．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ １９９１、４４：２３８−４５；Ｇａｇｅ ＦＨ．、Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００、２８７：１４３３−８；Ａｌｉｓｏｎ Ｍ．他、Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ １９９８、２９：６７６−８２）。したがって、最近になって同様の細胞が、悪性細胞集団の意味内容で論文として発表されていることはおそらく驚くことではない（Ｂｏｎｎｅｔ Ｄ．他、Ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｓ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ａｓ ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｔｈａｔ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３：７３０−７３７；Ｂｌａｉｒ Ａ．他、Ｍｏｓｔ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ＣＤ３４（＋）／ＣＤ７１（−）／ＨＬＡ−ＤＲ−、Ｂｌｏｏｄ １９９８、９２：４３２５−３５；Ｃｏｂａｌｅｄａ Ｃ．他、Ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｉｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ ２０００、９５：１００７−１３）。実際、悪性トランスフォーメーションのためには比較的に小さな生物学的変化しか必要としない幹細胞は、いくつかの観点で、理想的な標的である。幹細胞はすでに、高度に増殖性でかつ発生的に柔軟であるために必要な遺伝的なプログラムを持っているので、比較的に細微な乱れだけで十分に病気を引き起こすことができるのではないかと想像することができる。
【０００４】
最近、悪性幹細胞に起因した新生物形成の一例が、造血系における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の症例で論文として発表された。この病気は、骨髄発生の早発停止およびそれに続く多数の非機能性白血病性芽細胞の集積を特徴とする。白血病性芽細胞はたいていクローン起源であり、比較的に均質な特徴を表すが、このような集団は、正常な造血系前駆細胞と同じように階層的に組織化されることが示されている。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、およびヒトＡＭＬの異種マウス・モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで白血病性芽細胞を増殖させるのに十分な、表現型によって定義された白血病性幹細胞集団がある（Ｂｏｎｎｅｔ Ｄ．他、Ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｓ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ａｓ ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｔｈａｔ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３：７３０−７３７；Ｂｌａｉｒ Ａ．他、Ｍｏｓｔ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ＣＤ３４（＋）／ＣＤ７１（−）／ＨＬＡ−ＤＲ−、Ｂｌｏｏｄ １９９８、９２：４３２５−３５；Ｃｏｂａｌｅｄａ Ｃ．他、Ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｉｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ ２０００、９５：１００７−１３；Ｂｌａｉｒ Ａ．他、Ｌａｃｋ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｙ−１（ＣＤ９０）ｏｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｂｌｏｏｄ １９９７、８９：３１０４−１２）。ヒトの病気の原因を考える上で白血病性幹細胞（ＬＳＣ）の概念はきわめて重要となる。永続的な寛解を達成するためには、原始または前駆ＬＳＣ集団を特異的に除去することが必要であることは明らかである。しかし、過去の研究（Ｔｅｒｐｓｔｒａ Ｗ他、Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｐａｒｅｓ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｇｒｏｗｔｈ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｂｌｏｏｄ １９９６、８８：１９４４−５０）、ならびに我々のグループのデータから、ＬＳＣは、より成熟した白血病性芽細胞とは生物学的に異なっており、従来の化学療法レジーメンに反応しない可能性があることが示唆されている。この観察は、大多数の患者は明白な完全寛解を達成することができるが、ほとんどのケースで再発するというＡＭＬについて頻繁に観察される臨床プロフィールと一致する（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ ＧＪ．、Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １９９８、１２ Ｓｕｐｐｌ１：Ｓ２０−４；Ｐａｉｅｔｔａ Ｅ．、Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ １９７７、１４：５３−６０）。ＬＳＣのほうが芽細胞よりも化学療法に対して屈折力がある（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ）場合、生き残った幹細胞が白血病再発の主要な寄与因子であると提唱することは魅力的である。したがって、白血病前駆細胞を特異的に標的とする戦略は、より効果的な治療を白血病患者に提供する可能性がある。１９９７年に、ＢｏｎｎｅｔとＤｉｃｋは、ＬＳＣの表現型をＣＤ３４＋／ＣＤ３８−と記述した（Ｂｏｎｎｅｔ Ｄ．他、Ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｓ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ａｓ ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｔｈａｔ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３：７３０−７３７）。我々は、白血病性のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−造血細胞では、ＩＬ−３受容体α鎖（ＣＤ１２３）が高度に発現するが、正常なＣＤ３４＋／ＣＤ３８−造血細胞では発現しないことを報告する。現状の技術水準を考慮すれば、当技術分野では、白血病を早期に検出する診断方法ならびに白血病を治療するより有効な方法が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、血液癌（例えば白血病および悪性リンパ増殖性障害）の診断および治療において、ヒトＣＤ１２３分子（ＣＤ１２３エクトペプチド）に結合する化合物を使用する方法に関する。ＣＤ１２３に対して特異的な化合物およびミメティック（mimetics）は、血液癌または悪性疾患状態の治療用および血液癌病態の診断用の薬剤および試薬として特定の有用性を有する。一実施形態では、本発明は、血液癌前駆細胞を障害する方法であって、前記細胞を、血液癌前駆細胞（progenitor hematologic cancer cell）を障害するのに有効な量の、ＣＤ１２３に選択的に結合する化合物と接触させることを含む方法を提供する。この接触段階は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびヒトを含む動物の体内におけるｉｎ ｖｉｖｏを含むさまざまな環境で実施することができる。
【０００６】
本出願全体を通して、本発明のある実施形態を説明する際には特に白血病を参照する。しかし本発明は、白血病または悪性リンパ増殖性障害の診断および治療に限定されるわけではなく、血液癌を含め、癌細胞がＣＤ１２３を選択的に発現する任意の病気に適用されることを理解されたい。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、例えば白血病前駆細胞上のＣＤ１２３の存在を検出する方法を対象とする。したがって本発明はさらに、白血病を診断する方法を対象とする。ＣＤ１２３に結合する標識されたリガンドを使用することによって、白血病前駆細胞の存在を検出することができることを理解されたい。したがって、ＣＤ１２３を発現しているこのような白血病前駆細胞を持っている患者の白血病の発症の可能性を診断することもできる。ＣＤ１２３結合リガンドはＣＤ１２３に対する抗体とすることができ、または、ＣＤ１２３に特異的に結合するさまざまな分子の１つとすることができる。さらに、標識は、ＣＤ１２３分子に結合したリガンドの存在のリポーターの働きをする酵素化合物または非酵素化合物を含む、さまざまな分子の中から選択するができる。ただしこれらに限定されるわけではない。このような標識の例には例えば、放射、蛍光、化学発光または吸収ベースの標識、あるいはこれらの組合せが含まれる。一実施形態では、試料中の白血病前駆細胞の存在を、前記試料中のＣＤ１２３の存在を検出することによって検出する検定が提供される。ＣＤ１２３の存在の検出は、ＣＤ１２３に選択的に結合する化合物を導入し、前記化合物が前記試料の成分と結合しているかどうかを判定することによって実施することができる。
【０００８】
他の実施形態では、本発明はさらに、ＣＤ１２３に結合するペプチド、抗体、炭水化物、脂質、核酸などの化合物の一部または全体の３次元構造、抗体の場合には抗体の結合ポケットまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）の３次元構造をまねた化合物または分子（ミメティック）を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、薬剤として許容される担体、ならびに先に説明した１種または数種のＣＤ１２３特異的化合物およびミメティックを含む製剤を提供する。
他の実施形態では、本発明は、白血病の治療を必要としているヒトまたは動物に、先に説明した治療上有効な量の化合物またはそれらの薬剤ミメティックを投与することを含む、白血病の治療法を提供する。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、白血病幹細胞を骨髄から選択的に除去する方法を提供する。これらの幹細胞は、白血病前駆細胞を生じさせることでき、または自体が前駆細胞でありことができる。本発明の方法は、さまざまな化合物またはそれらのミメティックおよび細胞毒性物質を使用してこれらの幹細胞を障害する。これらの物質は骨髄試料に接触させ、または骨髄に注入することができ、それによって骨髄中の白血病幹細胞の少なくとも一部分を破壊する。
【００１１】
本発明は、以下に示す詳細な説明および添付図面からいっそう十分に理解されよう。これらは例として示すものであって、したがって本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは正常な造血細胞および白血病の造血細胞でのＣＤ１２３の発現を示す図である。正常な骨髄（パネルＡ）または原発性ＡＭＬの末梢血（パネルＢ）から得た細胞中のＣＤ１２３標識化の代表的な例を示す。パネルＡ（左側の点図）にはめ込まれた多角形は、骨髄全体のうちのＣＤ１２３の発現に関して陽性であるパーセンテージ（７％）を指示する。より小さな長方形のゲートは、骨髄全体のうちのＣＤ１２３に関して強い陽性である割合（１％）を指示する。パネルＡの中央の点図は、免疫親和性カラム上での選択によってＣＤ３４＋細胞を濃縮した骨髄を示す（方法を参照のこと）。ゲートは、ＣＤ３４＋集団全体およびＣＤ３４＋／ＣＤ３８−集団を指示する。ヒストグラムは、ゲートされた２つの集団に対するＣＤ１２３標識化を指示する。パネルＢは、原発性ＡＭＬ検体に対する同じ分析を示す。ヒストグラム中のＭ１マーカーは、アイソタイプ対照試料の９９％を超える発現レベルを指示している。それぞれの検体に対して、５０,０００〜１００,０００事象を分析した。
【図２】図２は５つの原始ＡＭＬ集団でのＣＤ１２３の発現を示す図である。５つの原発性ＡＭＬ検体はＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ１２３で標識し、フロー・サイトメトリによって分析した。この図は、それぞれの試料からのＣＤ３４＋／ＣＤ３８−ゲート集団のＣＤ１２３標識化を示す。黒い部分はＣＤ１２３染色を指示し、明るい部分は、アイソタイプ対照抗体を用いた並行した標識化を指示する。ヒストグラム中のＭ１マーカーは、アイソタイプ対照試料の９９％を超える発現レベルを指示している。それぞれの検体に対して、５０,０００〜１００,０００事象を分析した。
【図３】図３Ａおよび３ＢはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでのＣＤ１２３＋ＡＭＬ細胞の移植を示す図である。選別されたＣＤ３４＋／ＣＤ１２３＋原発性ＡＭＬ細胞を、照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した。移植６週間後、骨髄細胞を分離し、ヒト（ＣＤ４５＋）白血病細胞の存在を分析した。パネルＡは、ヒト細胞に特異的な抗体を使用した移植検体のＣＤ３４対ＣＤ４５プロフィールを示す。パネルＢは、ＣＤ４５＋ゲート・ヒト細胞集団のＣＤ３４対ＣＤ１２３プロフィールを示す。それぞれの試料に対して５０,０００事象を分析した。
【図４】図４は原発性ＡＭＬ検体のＣＤ１２３およびＣＤ１３１免疫ブロット分析を示す図である。５つの原発性ＡＭＬ試料を末梢血から得、選別してＣＤ３４＋集団を分離した。したがって実質的に純粋な白血病試料が保証される。さらに、白血病性細胞系統ＴＦ−１（ＴＦ−１）および正常な骨髄ＣＤ３４＋細胞（正常ＣＤ３４＋）を対照として含めた。それぞれの集団から溶解液を作り、変性ＰＡＧＥにかけ、抗ＣＤ１２３抗体（上パネル）または抗ＣＤ１３１抗体（下パネル）を用いて免疫ブロットによって分析した。それぞれのパネルの左側のやじり記号はそれぞれＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）およびＩＬ−３Ｒβ（ＣＤ−１３１）鎖の位置を指示する。
【図５】図５Ａ、５Ｂおよび５ＣはＩＬ−３に応答した信号トランスダクション成分のリン酸化を示す図である。３つの原発性ＡＭＬ試料（レーン１〜３）を末梢血から得、選別してＣＤ３４＋集団を分離した。試料は、２０ng／mlのＩＬ−３で１５分間処理してから（＋）、または処理せずに（−）溶解し、ＰＡＧＥにかけた。次いでそれぞれのゲルを電気ブロットにかけ、タンパク質全体またはリン酸化されたタンパク質に特異的な抗体Ａｋｔ（Ａ）、Ｓｔａｔ５（Ｂ）およびＭｅｋ−１（Ｃ）を用いて膜を調べた。それぞれのブロット上のレーンＣは抗体対照であり、＋／−５０ng／ml ＰＤＧＦ（ＡおよびＣ）で処理したＮＩＨ ３Ｔ３細胞から、または＋／−２５ng／ml ＧＭ−ＳＣＦ（Ｂ）で処理したＴＦ−１細胞から得た。
【図６】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは原発性ＡＬＬでのＣＤ１２３の発現を示す図である。３つの独立した原発性ＡＬＬ（急性リンパ性白血病）検体でのＣＤ１２３発現のフロー・サイトメトリ分析。ＣＤ１２３標識化は塗りつぶされた（黒い）プロットによって示されており、対照は白抜きのプロットによって示されている。
【図７】図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃ原発性ＣＭＬでのＣＤ１２３の発現の発現を示す図である。３つの独立した原発性ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）検体でのＣＤ１２３発現のフロー・サイトメトリ分析。ＣＤ１２３標識化は塗りつぶされた（黒い）プロットによって示されており、対照は白抜きのプロットによって示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、特定の抗原に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の断片を意味する。抗体は、免疫科学分野の熟練者には周知である。本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、無傷の抗体分子だけを意味するのではなく、抗原との結合能力を維持している抗体分子の断片も含む。このような断片も当技術分野ではよく知られており、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方でよく使用されている。具体的には、本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、無傷の免疫グロブリン分子だけを意味するのではなく、周知の活性断片Ｆ(ａｂ’)2、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、ＶHおよびＶLをも含む。
【００１４】
本明細書で使用するとき、用語「結合」は、直接かまたは間接かに関わらず、指定された受容体または受容体サブユニットに作用する任意の相互作用を意味する。
【００１５】
本明細書で使用するとき、用語「選択的に結合する」は、化合物、組成物、処方物などがＩＬ３Ｒβ鎖とはあまり結合しないが、ＩＬ３Ｒα鎖とは結合することを意味する。
【００１６】
本明細書で使用するとき、用語「ＣＤ１２３」、「ＩＬ３Ｒサブユニットα」および「ＩＬ３Ｒα」は相互に交換可能に使用され、本明細書で説明するように白血病前駆細胞中では検出されるが、本明細書で説明するように正常細胞では検出されない抗原決定基を意味する。
【００１７】
本明細書で使用するとき、用語「化合物」は、処方物、組成物、天然の動植物などを含む任意の純度の活性成分を意味する。化合物には、タンパク質、核酸、一本鎖核酸、脂質、炭水化物、抗体などの天然分子を含めることができる。しかし、ＣＤ１２３を結合する限りにおいてこれらの天然分子の合成版も作ることができる。化合物は２種類以上の成分を含むことができる。例えば化合物を、毒素に取り付けられたモノクローナル抗体とすることができる。あるいは、標識に取り付けられた脂質とすることもできる。化合物にはさらに、ミメティックおよびアプタマー（aptamers）を含めることができるが、これらは全てＣＤ１２３に対する特異性を保持する。
【００１８】
本明細書で使用するとき、用語「障害する」は、機能性または活性（成長または増殖活性を含む）の低下を意味する。
【００１９】
本明細書で使用するとき、用語「血液癌」は血液の癌を指し、特に白血病、悪性リンパ増殖性障害などを含む。「白血病」は、感染との戦いに無力な非常に多くの白血球が作られ、血小板、赤血球などの血液を構成する他の部分をこれらの白血球が押しのける血液の癌を指す。白血病の症例は急性または慢性に分類されることを理解されたい。急性白血病の癌細胞は未熟な段階で阻止される。しかし癌細胞は増え続ける。その結果として、未熟な非機能細胞の大規模な蓄積およびそれに付随した機能細胞の損失が起こる。慢性白血病はゆっくりと進行し、癌細胞は完全に成熟する。さらに、白血球は骨髄性またはリンパ性である。したがって、白血病の形態には例えば、急性リンパ性（またはリンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および骨髄異形成症候群などがある。「悪性リンパ増殖性障害」は、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）などのリンパ腫を指す。本発明の目的上、少なくとも血液癌細胞の一部は、ＣＤ１２３を発現した細胞によって特徴づけられる。さらに、本出願の目的上、白血病または悪性リンパ増殖性障害に言及するときには常に、本発明の診断および治療法は一般に血液癌に適用される。
【００２０】
本明細書で使用するとき、用語「導入する」は、単純な接触を含む任意の送達手段を意味する。ｉｎ ｖｉｖｏかｉｎ ｖｉｔｒｏかは問わない。
本明細書で使用するとき、用語「ミメティック（mimetic）」は、化合物が結合することができるＣＤ１２３上の部位の３次元構造をまねた化合物または分子を意味し、この化合物はあるいは、ＣＤ１２３に結合する分子をまねた分子であることができる。抗ＣＤ１２３抗体結合部位ないしパラトープ、すなわち活性部位の場合には、「ミメティック」が、抗体超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）の任意の組合せの３次元構造をまねた化合物を意味する。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「まねる」は、ミメティックの３次元原子配置について言い、ミメティックの原子とペプチド、抗体などの化合物の結合部位の原子との間に、同様のイオン力、共有結合力、ファンデルワールス力またはその他の力、および同様の電荷相補性または静電相補性が存在すること、ミメティックが、ＣＤ１２３に対して親化合物と同様の結合親和性を有すること、ならびに／あるいはミメティックが、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ１２３の機能に対して同様の効果を有することを意味する。
【００２２】
抗ＣＤ１２３抗体の場合、抗体の抗原結合部分には、当技術分野でよく知られているように、抗原のエピトープと直接に相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）およびパラトープの３次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）がある。Ｈ鎖Ｆｄ断片とＩｇＧ免疫グロブリンのＬ鎖の両方に、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）によってそれぞれから分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）がある。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、特にＨ鎖ＣＤＲ３は抗体特異性に対して大きな責任を負う。
【００２３】
本明細書で使用するとき、用語「正常」は、病原または病理とは無関係の細胞または状態を意味する。
本明細書で使用するとき、用語「原始」と「前駆」は相互に交換可能である。
【００２４】
ポリペプチドおよび抗体に関して本明細書で使用するとき、用語「実質的に純粋」は、ポリペプチドが、自然界またはｉｎ ｖｉｖｏ系にあるときに一緒に見つかる他の物質を実質的に、その意図した用途に対して実際的かつ適切な程度にしか含んでいないことを意味する。特にポリペプチドは十分に純粋であり、それらの宿主細胞の他の生物学的成分から十分に分離されており、そのため例えば抗体の生成、配列決定、または製剤の製造に有用である。当技術分野で周知の技法によって、本明細書に開示する核酸およびアミノ酸配列を考慮して、実質的に純粋なポリペプチドを生成することができる。本発明の実質的に精製されたポリペプチドを、薬剤として許容される担体とともに混合して製剤とすることができるので、ポリペプチドが、製剤の重量のうちの小さな割合でしかない場合がある。それでもなお、生体系の中で一緒に存在する物質から実質的に分離されているという意味でポリペプチドは実質的に純粋である。
【００２５】
化合物またはミメティックに関して本明細書で使用するとき、用語「実質的に純粋」は、化合物が、自然界またはｉｎ ｖｉｖｏ系の中で、あるいは化学合成または他の合成の結果として一緒に見つかる他の物質を実質的に、その意図した用途に対して実際的かつ適切な程度にしか含んでいないことを意味する。特に化合物は十分に純粋であり、それらの宿主細胞の他の生物学的成分から、またはそれらの合成の化学的または物理的成分から十分に分離されており、そのため製剤の製造に有用である。当技術分野で周知の技法（米国特許第５６４８３７９号；Ｃｏｌｍａｎ，Ｐ．Ｇ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３：１６８７−１６９３、１９９４；Ｍａｌｂｙ他、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：７３３−７４６、１９９４；ＭｃＣｏｙ他、Ｊ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌ．２６８：５７０−５８４、１９９７）によって、実質的に純粋な化合物またはミメティックを設計することができる。本発明の実質的に精製された化合物を、薬剤として許容される担体とともに混合して製剤とすることができるので、化合物が、製剤の重量のうちの小さな割合でしかない場合がある。それでもなお、生体系、化学系または他の系の中で一緒に存在する物質から実質的に分離されているという意味で化合物は実質的に純粋である。
【００２６】
ＣＤ１２３に結合するミメティック
ＣＤ１２３を標的とする化合物は見つけることができる。ファージ・ディスプレイ・ライブラリ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ）を使用して、ＣＤ１２３に結合するポリペプチドをコード化しているＤＮＡを決定することができる。この方法の原理は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５８３７５００号に開示されている。ＣＤ１２３に結合することができるペプチド以外の分子には核酸およびリポソームがある。ＣＤ１２３を標的とするのに炭水化物を使用することもできる。この化合物は天然の生体分子でなくともよい。このような化学物質は、当技術分野で周知のコンビナトリアル・ライブラリ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ）によって作ることができる。検定の目標はＣＤ１２３への化合物の結合である。リポソームは、ある毒素または他の細胞障害性物質を落ち着かせることができ、または細胞画像化化合物を使用して、ＣＤ１２３を標的とすることができる。白血病の検出および治療に留意しつつ、本発明の方法は、ＣＤ１２３を標的とする限りにおいて、化合物の数多くの変形物および組合せをターゲッティング・エージェントとして企図する。
【００２７】
抗ＣＤ１２３抗体のミメティック
抗イディオタイプ技術を使用して、エピトープをまねた化合物またはミメティックを分離しまたはスクリーニングすることもできる。したがって、第１のモノクローナル抗体が結合したエピトープの像である抗イディオタイプ・モノクローナル抗体は抗原として効果的に作用するので、これを使用して、ペプチド・ファージ・ディスプレイ・ライブラリなど、化合物のコンビナトリアル化学ライブラリまたは他のライブラリからミメティックを分離することができる（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０、１９９０；Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｃｒａｉｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４０−４８、１９９２；Ｂｏｎｎｙｃａｓｔｌｅ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５８：７４７−７６２、１９９６）。したがって、核酸、脂質、炭水化物または他の部分を有するものを含め、タンパク質または他の化合物をまねているペプチドまたは拘束されたペプチドをクローン化することができる（Ｈａｒｒｉｓ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９４：２４５４−２４５９、１９９７）。
【００２８】
自然界で生じず、したがって異化、排泄または分解に対してより抵抗性の純粋な合成分子は、原子の３次元配置によって、ミメティックの原子と抗原結合部位ないしエピトープの原子との間に、同様のイオン力、共有結合力、ファンデルワールス力またはその他の力、および同様の電荷相補性または静電相補性が存在するように設計することができる。次いで、これらのミメティックを、ＣＤ１２３に結合する高い親和性についてクリーニングすることができる。これらは、ＣＤ１２３を持つ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで検出し、かつ／または障害することができる。これについては後に詳細に説明する。
【００２９】
診断薬および製剤
本発明はさらに、ＣＤ１２３結合性化合物およびそのミメティックを含む診断または製剤組成物を調製する方法に関する。製剤は、薬剤として許容される担体を含む。本明細書で使用するとき、このような担体は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害しない非毒性材料を意味する。用語「生理的に許容される」は、細胞、細胞培養、組織、生体などの生体系に適合する非毒性材料を指す。担体の特性は投与経路に依存する。生理的に許容され、かつ薬剤として許容される担体には、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤および当技術分野で周知の他の材料が含まれる。
【００３０】
診断および／または製剤応用で使用するために、さまざまな手段によって抗ＣＤ１２３抗体およびミメティックを標識することができる。当業者に周知の多くの異なる標識および標識化方法がある。本発明で使用することができる標識の例としては、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物。コロイド金属、化学発光化合物および生物発光化合物などがある。当業者なら、モノクローナル抗体、そのミメティックなどのＣＤ１２３結合性化合物に結合させるのに適当な他の標識を見いだし、ルーチンの実験を使用してそれらを確認することができよう。さらに、これらの標識のＣＤ１２３特異的化合物またはそれらのミメティックへの結合は、当業者には一般的な標準技法を使用して達成することができる。
【００３１】
抗体の場合には、感度を高めることができる他の標識化技法に、抗体またはミメティックを低分子量のハプテンに結合することから成る技法がある。次いでこれらのハプテンを、第２の反応によって特異的に変更することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、特定の抗ハプテン抗体と反応することができるジニトロフェノール、ピリドキサル、フルオレセインなどのハプテンを使用することは一般的である。
【００３２】
診断および治療キット
本発明の検定で使用される材料はキットの構築に理想的に適している。このようなキットは、バイアル、管などの１つまたは複数の容器手段を受け取るよう区画が切られた持運び手段を含むことができる。容器手段はそれぞれ、その方法で使用される別個の要素の１つを含む。例えば、１つの容器手段は、診断目的に適した標識で検出可能な標識が付けられた、またはそのような標識を付けることができるモノクローナル抗体またはそのミメティック、あるいは治療が望まれる場合には細胞毒性または障害性物質などのＣＤ１２３結合性化合物を含むことができる。診断キットの場合にはキットがさらに、緩衝剤を含む容器、および／または酵素標識、蛍光標識などのリポーター分子に結合させたアビジン、ストレプトアビジンなどのビオチン結合性タンパク質などのリポーター手段を含む容器を有することができる。当然ながら化学材料の他に、キットを使用するための説明手段、好ましくは白血病を診断しまたは治療するための説明手段が含まれる。説明手段は、バイアルや管等の表面、別紙、あるいは容器の内側または外側に書くことができる。説明は、ＣＤ、コンピュータ・ディスク、ビデオなど、マルチメディア・フォーマットの形態で提供することもできる。
【００３３】
イムノトキシンの調製
当技術分野ではイムノトキシンの調製は一般に周知であるが（例えば、ともに参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４３４０５３５号およびＥＰ４４１６７を参照されたい）、イムノトキシンの調製および後の臨床投与のための精製にある好ましい技術を適用することによって、ある利点を達成できることに発明者らは気づいた。例えば、ＩｇＧベースのイムノトキシンは一般に、Ｆａｂ’ベースのイムノトキシンよりも高い結合能力と遅い血液クリアランスを示すが、Ｆａｂ’断片ベースのイムノトキシンは一般に、ＩｇＧベースのイムノトキシンに比べて高い組織侵入能力を示す。
【００３４】
さらに、ジスルフィド結合を含み、これを使用してうまく毒素部分を結合因子と連結させることができる数多くのタイプのリンカーが知られているが、薬理学的特性および能力の違いに基づいて、好ましいものとそうでないものとがある。例えば、「立体障害」されたジスルフィド結合を含むリンカーが好ましいのは、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性が大きく、したがって作用部位に結合する前に毒素部分が遊離してしまうことを防ぐためである。
【００３５】
架橋試薬は、２つの異なるタンパク質（例えば毒素と結合物質）の官能基を結びつける分子架橋を形成するのに使用される。２つの異なるタンパク質を段階的に連結するために、不必要なホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性架橋剤を使用することができる。例示的なヘテロ二官能性架橋剤は２つの反応基を含む。１つは、第一級アミン基（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド）と反応し、もう１つは、チオール基（例えばピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）と反応する。第一級アミン反応基を介して、架橋剤は、１つのタンパク質（例えば選択された抗体または断片）のリジン残基と反応することができ、チオール反応基を介して、すでに第１のタンパク質に結びついた架橋剤が、他のタンパク質（例えばｄｇＡ）のシステイン残基（遊離スルフヒドリル基）と反応する。
【００３６】
架橋剤のこれらの２つの反応基間のスペーサ・アームは、さまざまな長さおよび化学組成を有することができる。長いスペーサ・アームは連結構成要素の柔軟性を高め、一方、いくつかの特定の架橋構成要素（例えばベンゼン基）は反応基に追加の安定性を与え、またはさまざまな作用に対して高い抵抗性を持つ化学結合を与える（例えば還元剤に抵抗性のジスルフィド結合）。
【００３７】
最も好ましい架橋試薬はＳＭＰＴである。ＳＭＰＴは、隣接したベンゼン環およびメチル基によって「立体障害」されたジスルフィド結合を含む二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は、組織および血液中に存在するグルタチオンなどのチオール酸アニオンによる攻撃からジスルフィド結合を保護する働きをし、それによって、結合剤によって作用部位へ送達される前に連結がはずれるのを防ぐのに役立つと考えられている。多くの他の周知の架橋試薬と同様に、ＳＭＰＴ架橋試薬は、システインのＳＨなどの官能基または第一級アミン（例えばリジンのεアミノ基）を架橋させる能力を与える。他の可能なタイプの架橋剤には、スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリシルアミド）エチル−１,３′−ジチオプロピオナートなどの、開裂可能なジスルフィド結合を含むヘテロ二官能性光反応性フェニルアジドが含まれる。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル基は第一アミノ基と反応し、フェニルアジドは（光分解後に）任意のアミノ酸残基と非選択的に反応する。
【００３８】
本発明の実施においては「立体障害」された架橋剤が一般に好ましいが、非立体障害リンカーを使用し、それにもかかわらず本発明に基づく利点を実現することもできる。保護されたジスルフィドを含む、または生み出すとは考えられない他の有用な架橋剤には、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰおよび２−イミノチオランが含まれる。このような架橋剤の使用は当技術分野でよく理解されている。
【００３９】
連結後には、連結していないＡ鎖、結合物質などの汚染物質を除去するために連結体を精製することが重要である。連結していないＡ鎖を除去することが重要なのは、毒性が増大する可能性があるためである。さらに、連結化学種と非連結化学種との間の抗原をめぐる競合の可能性を回避するために、非連結結合物質を除去することも重要である。いずれにしても、後の「実施例」の項にいくつかの精製技法を開示する。これらは、臨床的に有用な純度にまで精製された連結体を提供することが分かっている。最も好ましい技法は一般に、ブルーセファロースおよびゲル濾過またはゲル透過段階の使用を含む。ブルーセファロースは、シバクロンブルー３ＧＡおよびアガロースから成るカラム基質であり、免疫連結体のの精製に有用であることが分かっている。ブルーセファロースの使用は、Ａ鎖結合とのイオン交換の特性と相まって、非連結結合からの連結結合の良好な分離を提供する。
【００４０】
ブルーセファロースは、連結体から遊離の（連結していない）結合物質（例えば抗体または断片）を排除することを可能にする。遊離（非連結）毒素（例えばｄｇＡ）を排除するためには、従来のゲル濾過手法または高速液体クロマトグラフィーを使用した分子排除クロマトグラフィー段階が好ましい。
【００４１】
十分に精製された連結体が用意できたら、これを、非経口的に投与することができる薬剤組成物とすることが望ましい。これは、最後の精製段階として適当な薬剤組成物を有する培地を使用することによって実行される。
【００４２】
本発明に基づく適当な薬剤組成物は一般に、所望の連結体を約１０mgから約１００mg含み、無菌水溶液などの薬剤として許容される希釈剤または賦形剤と混合され、連結体に対して約０.２５から約２.５mg／mlの最終濃度を与える。このような処方物は一般に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝剤、賦形剤などの追加の添加剤、ＢＳＡ、ＨＳＡなどの安定化剤、または塩化ナトリウムなどの塩を含む。非経口投与用のするためには一般に、無菌性、非免疫原性および非発熱性を保証することによって、このような組成物を薬剤として許容されるものとすることが望ましい。このような技法は、参照によって本明細書に含まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８０に例示されているように当技術分野では一般に周知である。内毒素汚染は最低限、安全なレベル、例えば０.５ng／mgタンパク質よりも低く保たれなければならないことを理解されたい。さらに、ヒトへの投与では、製剤は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｄａｒｄｓが求めている無菌性、発熱性、一般安全性および純度標準を満たさなければならない。
【００４３】
本発明に基づくイムノトキシンの好ましい非経口処方物は、ｐＨ７.５から９.０の０.１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液１ml中に連結体を０.２５から２.５mg含む。この製剤は、−１０℃から−７０℃で少なくとも１年間、凍結貯蔵することができる。
【００４４】
本発明の大部分の治療応用は、ＣＤ１２３白血病マーカへの毒素部分（細胞毒性物質）のターゲッティングを含むことを企図する。これは、大部分の毒素が、潜在的な他の作用物質に比べて、細胞殺滅効果を送達する非常に大きな能力を有するためである。
【００４５】
しかし、標的抗原が、イムノトキシンによる効率的な中毒と一致した経路によって内在化しないときなど、サイトカイン、代謝拮抗物質、アルキル化剤、ホルモンなどの化学療法剤を標的としたい状況が生じる可能性がある。連結した非抗体作用物質よりも優れたこれらの作用物質の利点は、抗体によって提供される追加の選択性である。例えば、ステロイド、シトシンアラビノシド、メトトレキサート、アミノプテリン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ビンカアルカロイド、デメコルチン、エトプシド、ミトラマイシンなどの作用物質を例として挙げることができる。組織への特異的送達のために薬剤作用物質を抗体に取り付けるための技術は十分に確立されているという点で、このリストはむろん例示的なものに過ぎない。
【００４６】
本発明で使用される好ましい１つの細胞毒性部分は、例えば抗ＣＤ１２３抗体に結合しまたは連結することができる放射性同位元素である。好ましい放射性同位元素には、211アスタチン、212ビスマス、213ビスマスなどのα放射体、ならびに131ヨウ素、90イット
リウム、177ルテチウム、153サマリウム、109パラジウムなどのβ放射体が含まれる。特に好ましい放射性同位元素は２１１アスタチンおよび１３１ヨウ素である。
【００４７】
本発明を細胞の画像化に応用することによって、特定の利益を達成することができることが提案される。白血病細胞の画像化は、現在利用可能な画像化技術と比較して、細胞に容易にアクセスできるという大きな利点を提供すると考えられる。
【００４８】
さらに、常磁性、放射性かつ発蛍光性のイオンを抗体に取り付けるための技術は十分に確立されている。これらの方法の多くは、例えば抗体に取り付けられたＤＴＰＡなどの有機キレート剤を使用した金属キレート錯体の使用を含む（例えば米国特許第４４７２５０９号を参照されたい）。本発明の文脈では、抗体によって選択イオンが癌の領域を狙い、取り付けられたイオンによって画像化を進める。
【００４９】
好ましい実施形態では、本発明の方法において、組換えＤＮＡ技術の使用などによる組換え体手段によって抗体をさらにタンパク質エフェクター分子に融合して、抗体とエフェクター分子の両方をコード化した核酸を生み出し、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞中でそのＤＮＡ配列を発現させる。キメラ・タンパク質をコード化しているＤＮＡを、当業者に周知の任意のクローニング手法によって、ｃＤＮＡまたはゲノム形態にクローン化することができる。例えば、参照によって本明細書に取り込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）を参照されたい。
【００５０】
さまざまな標識への抗体の融合または連結によって、抗体が検出される特定の分子を持った細胞または組織の有無を検出するのに使用することができる非常に特異的な検出可能マーカーが生み出される。あるいは抗体を、他の特異的結合部分であるエフェクター分子、例えば先に説明したようなリガンドに化学的に連結または融合させることができる。この形態で組成物は、非常に特異的な二官能性リンカーとして作用する。このリンカーは、融合タンパク質が結合する細胞または細胞構成要素間の相互作用を結合し強化する働きをすることができる。したがって例えば、融合タンパク質が、抗体または抗体断片（例えば抗体のＦｖ断片）に接合された成長因子である場合、抗体は、抗原陽性の癌細胞に特異的に結合することができ、成長因子は、免疫細胞の表面の受容体と結合する。したがって融合タンパク質は免疫応答を強化し、標的癌細胞に向かって免疫応答を導くように作用することができる。
【００５１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ検出および診断
ＣＤ１２３に結合する化合物およびそれらのミメティックを使用する方法は、それらを液相中で、または固相担体に結合させて利用することができるｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用、例えばイムノアッセイに適している。さらに、これらのイムノアッセイのモノクローナル抗体には、さまざまな方向で検出可能な標識を付けることができる。モノクローナル抗体およびそれらのミメティックを利用することができるタイプのイムノアッセイの例は、直接または間接フォーマットの競合および非競合イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイある。モノクローナル抗体およびそれらのミメティックを使用した抗原の検出は、生理的試料に対する免疫組織化学検定を含む、フォワード、リバースまたは同時モードで実行されるイムノアッセイを利用して実施することができる。当業者は、それほど多くの実験をしなくても他のイムノアッセイ・フォーマットを見いだし、またはそれらの容易に理解することができよう。
【００５２】
ＣＤ１２３を結合する化合物およびミメティックを多くの異なる担体に結合させることができ、これらを使用して、ＣＤ１２３を持つ、前駆細胞を含む白血病細胞の存在を検出することができる。周知の担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱が含まれる。本発明の目的上、担体の性質は可溶性であることも、または不溶性であることもできる。当業者であれば、さまざまな化合物を結合させるための他の適当な担体を見いだし、またはルーチンの実験を使用してそれらを確認することができよう。
【００５３】
本発明の目的上、ＣＤ１２３は、化合物およびそれらのミメティックによって体液および組織中に存在するときに検出されることができる。検出可能な量のＣＤ１２３エクトペプチドを含む任意の試料を使用することができる。試料は、尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体、組織、便などの固体または半固体、あるいは組織診で一般的に使用されている固体組織とすることができる。
【００５４】
ＣＤ１２３のｉｎ ｖｉｖｏ検出
ＣＤ１２３のｉｎ ｖｉｖｏ検出におけるＣＤ１２３結合性化合物およびミメティックの使用では、検出可能に標識された化合物またはそのミメティックが診断上有効な用量で与えられる。用語「診断上有効」とは、モノクローナル抗体、ミメティックなどの検出可能に標識された化合物の量が、化合物またはミメティックが特異性を有する白血病細胞を検出できる十分な量で投与されることを意味する。
【００５５】
投与される検出可能に標識された化合物またはミメティックの濃度は、ＣＤ１２３またはＣＤ１２３を持つ白血病細胞への結合が背景に比べて検出できる十分なものでなければならない。さらに、最もよい標的−背景信号比を与えるために、検出可能に標識された化合物またはミメティックが循環系から速やかにクリアされることが望ましい。
【００５６】
概して、検出可能に標識された化合物またはミメティックのｉｎ ｖｉｖｏ診断用の用量は、年齢、性、病気の程度などの因子によって変化する。化合物の用量は、約０.０１mg／kgから約５００mg／kg、好ましくは約０.１mg／kgから約２００mg／kg、より好ましくは約０.１mg／kgから約１０mg／kgである。用量は例えば、複数回の注入をするかどうか、検定対象の組織、および当業者に周知の他の因子などに応じて変化する。
【００５７】
ｉｎ ｖｉｖｏ診断画像化では、使用可能な検出機器のタイプが、適切な放射性同位元素を選択する際の主な因子である。選択される放射性同位元素は、所与のタイプの機器で検出可能な崩壊の型を有していなければならない。ｉｎ ｖｉｖｏ診断用の放射性同位元素を選択する際に重要な他の因子は、放射性同位元素の半減期が十分に長く、そのため標的による最大取込みの時点で依然として検出可能であり、かつ半減期が十分に短く、そのため宿主に対する有害な放射が許容される範囲にとどまることである。ｉｎ ｖｉｖｏ画像化に使用される放射性同位元素が粒子を放出せず、従来のガンマ・カメラによって容易に検出することができる１４０〜２５０ｋｅＶ範囲の多数の光子を生み出すことが理想的である。
【００５８】
ｉｎ ｖｉｖｏ診断では、放射性同位元素を化合物に直接に、または中間官能基を使用して間接的に結合させることができる。金属イオンとして存在する放射性同位元素を結合するのにしばしば使用される中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの二官能性キレート剤である。本発明のモノクローナル抗体およびミメティックに結合させることができる金属イオンの代表例は、111Ｉｎ、97Ｒｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、72Ａｓ、89Ｚｒ、99mＴｃ、123Ｉおよび201Ｔｌである。
【００５９】
本発明の診断方法では、ｉｎ ｖｉｖｏ診断の目的で化合物およびミメティックを、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、電子スピン共鳴法（ＥＳＲ）の場合のように常磁性同位元素で標識することもできる。一般に、診断画像化を視覚化するための従来の任意の方法を利用することができる。通常、カメラ画像化には、γ線および陽電子を放出する放射性同位元素を使用し、ＭＲＩには常磁性同位元素を使用する。このような技法に特に有用な元素には、157Ｇｄ、55Ｍｎ、162Ｄｙ、52Ｃｒおよび56Ｆｅが含まれる。
【００６０】
本発明の細胞監視法では、化合物およびミメティックをｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで使用して、白血病治療の経過を監視する。したがって例えば、このような病気に関連した生体分子の増加または減少、あるいは体内または各種体液中に存在するＣＤ１２３エクトペプチドまたはＣＤ１２３を持つ白血病細胞の濃度変化を測定することによって、上記の白血病の改善を目的とした特定の治療レジーメンが有効かどうかを判定することができよう。
【００６１】
白血病の予防および治療
ＣＤ１２３特異的化合物を、ヒトおよび他の動物の白血病の治療に使用することもできる。本発明の方法に関連して本明細書で使用するとき用語「治療上」または「治療」は、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体、それらのミメティックなどのＣＤ１２３結合性化合物を使用することを指示し、予防的投与と治療的投与の両方を意味し、さらに、実質的に精製されたポリペプチド生成物およびミメティックを用いた受動免疫法と前記生成物またはその一部分をコード化したポリヌクレオチド配列の移植による遺伝子治療の両方を意味する。したがって、化合物およびミメティックは、白血病再発の可能性および／または重症度を軽減するために危険の高い被検者に投与することができ、または活動性の白血病をすでに明白に示している被検者に投与することができる。
【００６２】
ある応用では、薬理学的作用物質が、化合物、特に白血病細胞を殺し、あるいはその成長または細胞分裂を抑制する能力を有する細胞毒性物質またはその他の反細胞作用物質に取り付けるための有用な作用物質として役に立つことが予想される。一般に本発明は、ＣＤ１２３結合性化合物に連結することができ、標的細胞に活性な形態で送達することができる薬理学的作用物質の使用を企図する。例示的な反細胞作用物質には、化学療法剤、放射性同位元素および細胞毒が含まれる。化学療法剤の場合には、ステロイドなどのホルモンなどの作用物質；シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、アミノプテリンなどの代謝拮抗物質；アントラサイクリン；マイトマイシンＣ；ビンカアルカロイド；デメコルチン；エトポシド；ミトラマイシン；カリキアミシン、ＣＣ−１０６５およびその誘導体、クロラムブシル、メルファランなどのアルキル化剤が特に好ましいと発明者は考える。他の実施形態は、凝集剤、サイトカイン、成長因子、細菌内毒素または細菌内毒素のリピドＡ部分などの作用物質を含む。いずれにしても、このような作用物質を必要に応じて、周知の連結技術を使用して、血液成分の標的白血病細胞の部位へのそれらのターゲッティング、内部移行、放出または提示が可能な方法で抗体にうまく連結することができると考えられる。
【００６３】
他の好ましい実施形態では、治療に適用する細胞毒性物質が一般に、Ａ鎖毒素、リボソーム不活化タンパク質、αサルシン、アスペルギリン、レスチリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素またはシュードモナス属菌体外毒素などの植物、真菌または細菌由来の毒素を含む。 毒素−抗体構築体の使用は、それらの抗体への取付けと同様にイムノトキシン分野ではよく知られている。これらのなかで、抗体へ取り付けるのに特に好ましい毒素は、脱グリコシル化されたリシンＡ鎖である。脱グリコシル化されたリシンＡ鎖が好ましいのは、その極端な効力、より長い半減期のためであり、臨床的な等級および規模を製造することが経済的に可能であるためである。
【００６４】
他の好ましい実施形態では、細胞毒性物質を放射性同位元素とすることができる。好ましい放射性同位元素には、211アスタチン、212ビスマス、213ビスマスなどのα放射体、ならびに131ヨウ素、90イットリウム、177ルテチウム、153サマリウム、109パラジウムなどのβ放射体が含まれる。
【００６５】
本明細書で使用するとき、化合物の「治療上有効な量」とは、白血病の症状を軽減し、または白血病の発症の可能性を小さくするという所望の効果を生み出すのに十分な用量である。しかし治療上有効な量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全などの有害な副作用を引き起こすほどの量ではない。治療上有効な量は一般に、被検者の年齢、状態、性別、病気の程度によって変化し、当業者はこれを決定することができる。合併症の場合には個々の医師または獣医が用量を調節することができる。治療上有効な量は、１日または数日にわたる日に１回または数回の投与で、約０.０１mg／kgから約５００mg／kg、好ましくは約０.１mg／kgから約２００mg／kg、より好ましくは約０.２mg／kgから約２０mg／kgである。
【００６６】
本発明の方法では、化合物およびそれらのミメティックを、注射、または時間をかけた緩やかな注入によって投与することができる。化合物およびそれらのミメティックの投与は例えば、静脈内、腹腔内、筋内、腔内、皮下または経皮投与とすることができる。
【００６７】
非経口投与用の製剤には、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、食塩水および緩衝媒質を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口用賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース／塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油が含まれる。静脈内用賦形剤には、液体および栄養補給液、電解質補給液（リンゲルのデキストロースなどを基にしたものなど）が含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤も存在することができる。
【００６８】
この病気の特定の臨床的状態に応じ、投与は、容認されている任意の全身送達系、例えば経口経路、静脈内、筋内、皮下または経皮経路などの非経口経路、または膣、眼、鼻経路を介して、例えば錠剤、坐剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、液剤、懸濁剤、クリーム、ゲル剤、インプラント、パッチ、膣坐剤、エーロゾル剤、洗眼剤、エマルジョンなどの固体、半固体または液体の剤形、好ましくは固定用量を容易に投与するのに適した単位剤形で実施することができる。製剤組成物は、従来の担体または賦形剤およびＣＤ１２３結合性化合物を含み、さらに、他の医用作用物質、薬剤用物質、担体、佐剤などを含むことができる。
【００６９】
所望ならば、投与する薬剤組成物にさらに、湿潤剤、乳化剤、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどのｐＨ緩衝剤などの小量の非毒性補助物質を含めることができる。
【００７０】
本発明の化合物は一般に、ＣＤ１２３結合性化合物とともに薬剤賦形剤を含む薬剤組成物として投与される。処方物中の薬物の量は、当業者が使用する全範囲の中で変化させることができる。例えば、処方物全体に対して薬物を約０.０１重量パーセント（wt％）から約９９.９９wt％、賦形剤を約０.０１wt％から９９.９９wt％とすることができる。
【００７１】
先に述べた条件に対して好ましい投与形態は、従来の投与レジメンを使用した経口投与である。投与レジメンは、病訴の程度に基づいて調節することができる。前記経口投与では、製剤等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどの現在使用されている賦形剤に、選択したＣＤ１２３結合性化合物を組み込むことによって、薬剤として許容される非毒性組成物を形成する。このような組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、徐放性製剤などの形態をとる。このような組成物は、本発明に基づく活性化合物を約０.０１wt％から９９.９９wt％含むことができる。
【００７２】
この組成物は、糖でコーティングされた丸剤または錠剤の形態を有し、したがって、活性成分とともに、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムなどの希釈剤、デンプンおよびその誘導体などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、デンプン、ポリビニルピロリドン、アカシア・ゴム、ゼラチン、セルロースおよびその誘導体などの結合剤を含むことが好ましい。
【００７３】
「薬剤組成物」は、ＣＤ１２３結合性化合物を、白血病を診断しまたは治療する目的で投与される物質として処方することを意味することを理解されたい。白血病の診断または治療物質としての目的とは異なる目的の試験化合物として投与するために使用する組成物は「薬剤組成物」には含まれない。
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【００７４】
最近のいくつかの研究は、ＡＭＬの発生および永続化における幹細胞の存在およびその重要性を示唆している。表現型で言えば、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−またはＣＤ３４＋／ＨＬＡ−ＤＲ−と記述される細胞が、白血病細胞集団の発生の中心的な役割を演じているように見える（Ｂｏｎｎｅｔ Ｄ．他、Ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｓ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ａｓ ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｔｈａｔ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３：７３０−７３７；Ｂｌａｉｒ Ａ．他、Ｍｏｓｔ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ＣＤ３４（＋）／ＣＤ７１（−）／ＨＬＡ−ＤＲ−、Ｂｌｏｏｄ １９９８、９２：４３２５−３５）。さらに、このような細胞が化学療法薬に比較的に抵抗性であり、したがって結果的に再発の現象に寄与することを示唆する証明がある（Ｔｅｒｐｓｔｒａ Ｗ．他、Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｐａｒｅｓ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｇｒｏｗｔｈ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｂｌｏｏｄ １９９６、８８：１９４４−５０）。したがって、ＬＳＣのより深い理解および独特なＬＳＣ抗原の特性付けがＡＭＬのより良い治療の発展に不可欠である。
【００７５】
さまざまなＡＭＬ亜型が、発生特性、表現型、サイトカイン応答性などに関して相当な多様性を示すが、より原始的な白血病細胞のレベルには顕著な機能性の保存があるようである。この特徴は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける白血病の確立にはＣＤ３４＋／ＣＤ３８−亜集団があれば十分であることを示したＢｏｎｎｅｔ他の研究によって証明された（Ｂｏｎｎｅｔ Ｄ．他、Ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｓ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ａｓ ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｔｈａｔ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３：７３０−７３７）。他の研究者による同様の研究が、ＡＭＬとＣＭＬの両方に対して白血病幹細胞の存在を裏付け、それらの比較的に均質な表現型および機能能力を確認した（Ｂｌａｉｒ Ａ．、Ｈｏｇｇｅ他、Ｍｏｓｔ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ＣＤ３４（＋）／ＣＤ７１（−）／ＨＬＡ−ＤＲ−、Ｂｌｏｏｄ １９９８、９２：４３２５−３５；Ｈｏｌｙｏａｋｅ Ｔ．他、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｂｌｏｏｄ １９９９、９４：２０５６−６４）。しかし、現在までのところ、それらの識別または除去治療のための優先ターゲッティングを可能にする骨髄性ＬＳＣの抗原特徴を識別した研究はない。本報告で我々は、正常な造血幹細胞からの識別を容易にする、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−ＡＭＬ幹細胞の追加の共通性を識別した。それがＣＤ１２３の発現である。ＡＭＬ細胞上でＣＤ１２３抗原は高いレベルで容易に検出されたが、ＩＬ−３受容体β鎖であるＣＤ１３１は検出されなかった。
【００７６】
我々の実験によれば、転写因子ＩＲＦ−１（インターフェロン調節因子１）は過剰発現する（調査した６つの原発性ＡＭＬ検体の全てで）。Ｋｏｒｐｅｌａｉｎｅｎ他の以前の研究によれば、ＩＦＮ−γを用いた内皮細胞の治療の結果、ＣＤ１２３のアップレギュレーションが生じる（Ｋｏｒｐｅｌａｉｎｅｎ ＥＩ他、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３（ＩＬ−３）ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ ｗｉｔｈ ＩＬ−３ ｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ １９９５、８６：１７６−８２）。同様に我々自身の研究によれば、ＩＦＮ−γを用いた原発性ＡＭＬ細胞の治療はＣＤ１２３の発現を増大させる（データは示さない）。したがって、インターフェロン調節分子の異常な発現は、ＡＭＬ細胞でのＣＤ１２３発現を制御する際に役割を果たす可能性がある。
【００７７】
ＣＤ１２３抗原の発現は形式上、ＬＳＣが正常な幹細胞とは生物学的に異なっていることを示す。ＣＤ１２３は、正常な造血幹細胞上では容易には見つからないので、悪性の組織を識別する目的に使用することができる固有のマーカーとなる。この特徴は、研究目的ならびにＭＲＤ（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）研究において有用である可能性がある。さらに、ＣＤ１２３エピトープは、治療戦略の対象とすることができる標的となる。以前の臨床試験では、ｉｎ ｖｉｖｏでＡＭＬ細胞に放射性同位元素を送達する手段としてモノクローナル抗体を、ＣＤ３３およびＣＤ４５抗原に対して使用した（Ａｐｐｅｌｂａｕｍ ＦＲ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９９、３６：２−８）。さらに、最近のいくつかの研究では、ＣＤ２０、ＣＤ５２、Ｈｅｒ−２などの悪性細胞上の抗原に特異的なモノクローナル抗体を使用して刺激的な結果が示された（Ｍａｌｏｎｅｙ ＤＧ．、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９８；５：２３７−４３；Ｓｉｋｉｃ ＢＩ．、Ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ １９９９、１０ Ｓｕｐｐｌ６：１４９−５３）。同じ論法でＣＤ１２３に対する抗体が有用である可能性があり、その抗体によって、白血病性幹細胞集団を特異的に標的とする細胞毒性ヒットを送達することができよう。
【００７８】
我々は、広範囲にわたる白血病の幅広い範囲のヒト検体から、ＣＤ１２３が、原始白血病細胞を識別するための固有の抗原マーカーとなることを示した。我々の研究によれば、ＣＤ１２３は一般に高レベルで発現し、それは、白血病生物学のこれまで特徴付けられなかった側面を示すことができる。
【００７９】
以下の非限定的な実施例で本発明をさらに説明する。これらの実施例は単に例示のためのものであって、本明細書に記載の材料、条件、プロセス・パラメータなどに関して請求の発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８０】
実施例１−材料および方法：細胞の処理
原発性ＡＭＬ細胞は、患者の末梢血または骨髄から得た。正常な骨髄は、病理分析または外科的な骨髄採取後の廃棄物として、あるいはＮＤＲＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ）から得た。骨髄細胞は、１５０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ＋１０ｍＭ ＮａＨＣＯ3に５分間漬け、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄することによって赤血球を除去した。血球は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）密度勾配分離にかけ、単核白血球画分を分離した。骨髄または血液から得られた白血球を次いで、免疫親和性選択および／あるいはフロー・サイトメトリ分析または選別に使用した。ＣＤ３４＋細胞の選択には、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ免疫親和性装置（ｖａｒｉｏＭＡＣＳ）をメーカの説明書に従って使用した。場合によっては、白血球を、Ｉｓｃｏｖｅｓ修正ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、４０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から成る冷凍培地中で、５×１０7細胞／mlの濃度で低温保存した。
【００８１】
実施例２−フロー・サイトメトリ
サイトカイン受容体を、以下のモノクローナル抗体で標識することによって検出した：ＣＤ１１４−ビオチン、ＣＤ１１６−ＦＩＴＣ、ＣＤ１２３−ＰＥ、ＣＤ１３１−ビオチン（以上全てＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ１１７−ＰＥ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびＣＤ１３５−ＰＥ（Ｃａｌｔａｇ）。続いてストレプトアビジン−ＰＥ（ＳＡ−ＰＥ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で標識することによって、ビオチニル化した抗体を視覚化した。原発性ＡＭＬ亜集団は、ＣＤ３４−ＦＩＴＣまたはＣＤ３４−ＰＥをＣＤ３８−ＡＰＣ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）と組み合わせて使用して識別した。原発性ＡＭＬ細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス中でヒト細胞に特異的なＣＤ４５−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して識別した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植された細胞を分析するため、移植後６〜８週に骨髄を採取した。細胞は、抗Ｆｅ受容体抗体２．４Ｇ２および２５％ヒト血清を用いて阻止し、続いてヒト特異的ＣＤ３４−ＦＩＴＣおよびＣＤ４５−ＰＥ抗体で２重標識する。対照試料は非移植マウスの骨髄細胞から成る。ＣＤ１２３抗原の持続的発現を保証するために、場合によっては細胞をさらにＣＤ１２３−ＰＥで標識した。それぞれの検体に対して５０,０００〜１００,０００事象を分析した。この方法を使用すると、ヒト細胞を、０.１％という低い頻度まで確実に検出することができた。陽性細胞が０.１％未満の分析は陰性とみなした。
【００８２】
実施例３−免疫ブロット
細胞試料は、１％ＮＰ−４０、０.５％デオキシコラート、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭバナジウム酸ナトリウム（Ｎａ3ＶＯ4）、３０μlアプロチニン（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（Ｓｉｇｍａ）、１μg／mlペプスタチンおよび１μg／mlロイペプチン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｃｈ）を含むＰＢＳ中で、２×１０7細胞／mlの濃度で溶解し、氷上で３０分間培養し、１５,０００×ｇで１０分間遠心分離して破片を除去した。次いで、得られたタンパク質溶解液を等分して−８０℃で保存した。免疫ブロット分析では、タンパク質溶解物を解凍し、試料緩衝液および還元剤（Ｎｏｖｅｘ、米カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ。メーカの説明書に従った）と混合し、７０℃で１０分間加熱した。次いで試料は直ちに、変性ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ、４〜１２％ビス−トリスまたは７％トリス−アセタートゲル）によって、４×１０5細胞／レーン相当量を使用して分析した。電気泳動に続いて、試料を、ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に電気移植し、指示された抗体を用いて調べた。ＣＤ１２３（ＩＬ−３Ｒα鎖）を検出するために、抗体Ｓ−１２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）または９Ｆ５（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用した。ＭｅｋおよびＡｋｔの分析では、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのタンパク質特異的およびリンタンパク質特異的ウサギ・ポリクローナル抗体を使用した。抗Ｓｔａｔ５ポリクローナル（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｓ）および抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ５（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、Ｓｔａｔ５のリン酸化状態を分析した。全ての一次抗体は、アルカリフォスファターゼを連結した二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＥＣＦ試薬（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）をメーカの指示に従って使用して検出した。ブロットは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＳＴＯＲＭ８６０システムおよびＩｍａｇｅｑｕａｎｔ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して視覚化した。
【００８３】
実施例４−ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス検定
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米メイン州Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ）を、137Ｃｓ源からの２２５ラドのγ照射に暴露した。検定する細胞は、２％ＦＢＳを含む０.２５mls ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液。Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁させ、尾静脈に点滴注入した。選別されたいくつかの集団の分析のため、１×１０6個の照射（２５００ラド）マウス骨髄細胞を担体として一緒に注入した。６〜８週後に動物を死亡させ、フロー・サイトメトリ（上記参照）を使用して骨髄を分析し、ヒト細胞の存在を調べた。
【００８４】
実施例５−結果
サイトカイン受容体の分析は、原始白血病細胞でのＣＤ１２３の強い発現を示すが、正常細胞については示さない。多パラメータ・フロー・サイトメトリを使用して、悪性造血細胞の成長に以前に関係したサイトカイン受容体の発現を分析した。いくつかの受容体が興味深い抗体標識パターンを表したが、観察された最も印象的な特徴は、原発性ＡＭＬ検体の間でＣＤ１２３（ＩＬ−３Ｒα鎖）の発現レベルが著しく高く、よく保存されていることであった。図１に、正常組織および白血病組織のＣＤ１２３標識化の代表例を示す。図１Ａには、正常な骨髄全体およびより原始的なそのサブセットがＣＤ１２３発現に関して示されている。骨髄全体は概して、ＣＤ１２３に対して約７％の陽性細胞を有するが、集団の約１％しか高レベルで抗原を発現しない（図１Ａのはめ込みを参照のこと）。正常な骨髄のＣＤ３４＋集団も、造血性前駆細胞を含むことが知られているに対して予想されるとおりに、容易に明らかなＣＤ１２３発現を有する（１２％、図１Ａの右側のヒストグラム）。図示の標識化プロフィールは、やはりヒトＣＤ３４＋細胞上のＩＬ−３Ｒαレベルを調べたＳａｔｏ他の以前の研究とよく一致している（Ｓａｔｏ Ｎ他、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ １９９３、８２：７５２−６１）。しかし、より原始的なＣＤ３４＋／ＣＤ３８−画分は、ＣＤ１２３をあまり発現していない（＜１％）。対照的に、原発性ＡＭＬ細胞（図１Ｂ）は高レベルのＣＤ１２３を発現した。ＣＤ３４＋集団全体とより原始的なＣＤ３４＋／ＣＤ３８−画分の両方で、９９％超の細胞がＣＤ１２３陽性であった。図２に、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−ＡＭＬ細胞上のＣＤ１２３標識化の追加の５例を示す。やはり白血病集団上でのこの抗原の強い発現が見てとれる。表１に、ＡＭＬ細胞型に対して現在までのところ実施された実験をまとめた。この表には、ＡＭＬの亜型Ｍ１、Ｍ２およびＭ４の原始細胞のＣＤ１２３レベルが示されている。調査した１８の原発性ＡＭＬ検体のうち、２例を除く全ての検体で原始白血病細胞上にＣＤ１２３が強く発現した。ＣＤ１２３レベルの低かった２つの試料（試料ＡＭＬ−１１およびＡＭＬ−１４、表１）はともに、ＣＤ１２３発現で均一なシフトを表したが、全体的な標識化強度は検定した大部分の試料よりも暗かった。多くのケース（１８試料中９試料）で、ＣＤ１２３陰性の細胞は実質的に検出されなかった（０％または１％未満）。反対に、５つの正常なＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞試料では、その３つでＣＤ１２３の発現が検出されず、残りの２つの検体もわずか（＜１％）に検出されただけであった。この結果が、特定の抗体の使用によって生じたアーチファクトでないことを保証するため、別の２種類の抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体を使用してこれらのフロー・サイトメトリ分析を確認した。
【００８５】
調査した全てのＡＭＬ亜型で高レベルのＣＤ１２３発現が見つかったことは、ＩＬ−３Ｒαが、白血病状態を生み出しまたは維持することに中心的な役割を演じている可能性があることを意味している。ＩＬ−３に対する高親和性受容体を形成するためには、α鎖とβ鎖（それぞれＣＤ１２３およびＣＤ１３１）の両方が必要である。したがって、フロー・サイトメトリによってＡＭＬ検体のＣＤ１３１発現も調べた。興味深いことに、バルクＡＭＬ集団ではいくらかの発現が見られたが、１５検体の全てのＣＤ３４＋画分でＣＤ１３１は検出されなかった（データは示さない）。
原発性ＡＬＬおよび原発性ＣＭＬ細胞ならびに非ホジキンリンパ腫でのＣＤ１２３発現を示す別のデータを、実施例８および１０で論じる。
【００８６】
実施例６−ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス中のヒトＣＤ１２３＋白血病細胞のｉｎ ｖｉｖｏ移植特性
ＬＳＣ集団を表現型上含む大多数の細胞で強いＣＤ１２３発現が観察されたことから、ＣＤ１２３がＬＳＣのマーカーとして有用であろうと思われた。そのため、ＣＤ１２３＋細胞の機能的能力を確立するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス・モデル系を使用した移植研究を実施した。ＣＤ３４＋／ＣＤ１２３＋細胞をフロー・サイトメトリによって選別し、それらを、照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植することによって、３つの原発性ＡＭＬ検体（表１のＡＭＬ−２、５および１５）を検定した。さらに、集団中の残りの細胞（ＣＤ３４−／ＣＤ１２３＋／−）も並行して選別し移植した。図３のデータは、白血病細胞の強い移植を示した１つの検体の移植後６週の代表的な例である。パネルＡは、ヒトＣＤ３４およびＣＤ４５に特異的な抗体で標識した骨髄細胞全体を示す。このフロー・サイトメトリ・プロフィールは、ヒト細胞（ＣＤ４５＋）の大集団が骨髄に存在することを明らかに指示している。さらに、この集団は、元々の白血病検体に見られたＣＤ３４標識化の割合と同様に、ＣＤ３４＋サブセットとＣＤ３４−サブセットの間で分割されている。パネルＢに、ＣＤ４５＋細胞だけでゲートした同じ骨髄試料を示す。このデータは、ｉｎ ｖｉｖｏで増殖した全ての細胞がＣＤ１２３陽性であることを指示している。表２に、検査した３つの検体のデータをまとめた。全てのケースで、ＣＤ１２３＋細胞はＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に移植することができた。さらに、１例を除き、ＣＤ１２３−集団はｉｎ ｖｉｖｏ再生に寄与しなかった。したがって、ＮＯＤ／ＳＣＩＤモデルによって明確にされたとおり、我々は、ＣＤ１２３がＬＳＣ上で発現すると結論する。
【００８７】
最後に、ＣＤ１２３陽性細胞の白血病の起源を確認する独立した手段として、フロー・サイトメトリを使用して、２つの白血病検体からＣＤ３４−／ＣＤ１２３＋細胞を選別した。これらの試料を４日間培養し、同期させ、次いで細胞遺伝学的分析のため回収した。それぞれの検体からの拡散の調査は、２０中期の全てが白血病特異的転座に対して陽性であることを示した。
【００８８】
実施例７−白血病細胞中でのＣＤ１２３発現の生物学的役割
フロー・サイトメトリによって得られたデータをさらに裏付けるため、免疫ブロット研究を実施してＩＬ−３Ｒ信号トランス濁ション成分を分析した。これらの研究では、それぞれのＡＭＬ試料を末梢血検体から得、それを選別してＣＤ３４＋集団を分離した。したがって実質的に純粋な白血病試料が保証される。最初に、ＩＬ−３Ｒαおよびβ鎖の発現を調べた。図４に示したデータ（上パネル）は、ＣＤ１２３に関して、検定した全ての白血病試料で発現したことを明らかに示している。正常な骨髄（レーン２、ＣＤ３４＋）から得たＣＤ３４＋細胞も弱い信号を示している。これは、正常なＣＤ３４＋細胞がしばしば小数のＣＤ１２３＋細胞を含むことを示す図１Ａのデータと一致している。しかし、正常細胞のより原始的なＣＤ３４＋／ＣＤ３８−サブセットでは、フロー・サイトメトリによってＣＤ１２３の発現は検出されなかった（図１Ａおよび表１）。それらの低い頻度のため、免疫ブロットによる直接分析用の正常またはＡＭＬ起源の十分なＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を得ることはできない。それにもかかわらず、ＣＤ３４＋集団全体の明瞭な信号の検出は、フロー・サイトメトリによって見られるＡＭＬ細胞の強い信号を裏付けている。留意すべき他の点は、ＣＤ１２３バンドの分子量が、ＡＭＬ試料間でわずかに変動するように見える点である。我々は、同じ検体のＲＴ−ＰＣＲフィンガープリント分析を実施し、明らかな異常を認めなかった（データは示さない）。したがって、この観察の最も有望な説明は翻訳後修飾の程度の変動であるように思われる。フロー・サイトメトリによって得られた結果と一致して、ＣＤ１３１の発現は検出されなかった（図４の下パネル）。
【００８９】
ＣＤ１２３の機能上の潜在的な役割を調べるため、我々は、ＩＬ−３に対する原発性ＡＭＬ細胞の応答を調べた。一般に、ＩＬ−３を用いて造血細胞を刺激すると、よく特徴づけられたいくつかの細胞内信号トランスダクション事象が起こる（Ｈａｒａ Ｔ他、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １９９６、１４：６０５−１８）。これらの事象間でのＭｅｋ−１、ＡｋｔおよびＳｔａｔ−５のリン酸化は一般的である（Ｓｏｎｇｙａｎｇ Ｚ他、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｙ ｔｈｅ Ａｋｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７、９４：１１３４５−５０；Ｙａｇｉｓａｗａ Ｍ他、Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９９、２７：１０６３−７６；Ｓｕｔｏｒ ＳＬ他、Ａ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ ｔｈａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃ−Ｒａｆ ａｎｄ Ａ−Ｒａｆ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９９、２７４：７００２−１０；ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ＲＰ他、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｙ ｔｈｅ ＩＬ−３／ＩＬ−５／ＧＭ―ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ．Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ １９９８、１０：６１９−２８）。したがって、これらのタンパク質に対して免疫ブロット研究を実施して、ＩＬ−３刺激のある場合またはない場合で、リン酸化の程度を評価した。図５に示したデータによれば、ＩＬ−３がない場合にはＡｋｔおよびＳｔａｔ５の検出可能なリン酸化は見られず、Ｍｅｋ−１では中位のリン酸化レベルしか見られない。さらに、検定したどのタンパク質でも、ＩＬ−３刺激に応答したリン酸化の増大はあまり見られない。これらの結果は、原発性ＡＭＬ細胞の表面に存在するＣＤ１２３が、従来のＩＬ−３媒介経路を介した信号トランスダクションにあまり寄与していないことを示唆している。
【００９０】
実施例８−原発性ＡＬＬおよび原発性ＣＭＬ細胞でのＣＤ１２３発現
実施例１から４で説明したのと同様の実験プロトコルに従って、原発性ＡＬＬおよび原発性ＣＭＬ細胞でのＣＤ１２３の発現をフロー・サイトメトリによって検定した。結果は、実施例５の原発性ＡＭＬでのＣＤ１２３の発現で得られた結果と一致していた。図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、原発性ＡＬＬ細胞がＣＤ１２３を発現することを再現的に示している。さらに、図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、原発性ＣＭＬ細胞がＣＤ１２３を発現することを再現的に示している。
【００９１】
実施例９−ＣＤ１２３標的補体殺害検定
補体殺害検定（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｋｉｌｌ ａｓｓａｙ）（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、ＤａｖｉｄＭａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＷａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社刊、１９９２）を使用することによって、この実験は、ＣＤ１２３＋細胞が優先して標的となることを示す。この実験で、我々は、代表的なＡＭＬ検体（すなわちＣＤ１２３＋）を正常な骨髄試料と比較した。それぞれの検体に対して、無処理の対照、補体だけで処理された試料および抗ＣＤ１２３＋補体で処理した試料がある。表３に示すように、ＡＭＬ検体に対しては実質的な補体殺害効果があるが、正常な骨髄に対してはない。このことは試料全体に対しても、より原始的なＣＤ３４＋細胞に対しても言える。したがって、この実験は、ＣＤ１２３に対する特異性に関して、正常細胞に対する効果と白血病細胞に対する効果の間に違いがあることを示している。
【００９２】
実施例１０−リンパ腫細胞でのＣＤ１２３発現
組織切片の免疫組織化学的分析は、「びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫」がＣＤ１２３の発現に対して強く陽性であることを示した。これは、非ホジキンリンパ腫の最も一般的な形態である。したがってＢ細胞由来の癌では、ＣＤ１２３の発現が、ＣＤ１２３がＡＬＬ細胞でも観察されたことと一致している（すなわち他のタイプのＢ細胞癌）。この観察はＢ細胞リンパ腫を、ＣＤ１２３を使用した治療および診断のための標的として直接に識別する。
【００９３】
引用した文献は全て、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
当業者なら、ルーチンの実験だけを使用して、本明細書に詳細に記載した本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識し、または確認することができよう。このような等価物は上記請求項の範囲に含まれるものとする。
【００９４】
【表１】
【００９５】
【表２】
【００９６】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０００年３月６日出願の米国特許仮出願第６０／１８７１２３号および２０００年８月２４日出願の第６０／２２７２９５号の優先権の利益を主張するもので、これらの出願の開示はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、血液癌前駆細胞に特異的な細胞表面マーカを標的とすることによって、血液癌前駆細胞を障害し、または血液癌を治療する方法に関する。本発明はさらに、血液癌を診断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞は、哺乳動物のさまざまな組織系で普通に見られる細胞である。幹細胞を定義する基準は文の前後関係によって変わってくるが、一般に２つの属性が、幹細胞集団の中心的特徴と考えられている。すなわち（１）幹細胞は、自己複製または自己再生に対してなんらかの能力を示すべきものであり、（２）幹細胞は、適当な系統に分化する能力を有していなければならない（Ｐｏｔｔｅｎ ＣＳ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｌｏｎｄｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７）。この性質の細胞は、造血系、胚系、神経系、筋系および肝系を含むいくつかの組織に対して記述されている（Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ ＩＲ．、Ｃｌｏｎａｌ、ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９１、３：３４９−５５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＪ．他、Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９５、１１：３５−７１；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＥＪ．、Ｕｓｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｒｍ ｌｉｎｅ．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ １９９１、４４：２３８−４５；Ｇａｇｅ ＦＨ．、Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００、２８７：１４３３−８；Ａｌｉｓｏｎ Ｍ．他、Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ １９９８、２９：６７６−８２）。したがって、最近になって同様の細胞が、悪性細胞集団の意味内容で論文として発表されていることはおそらく驚くことではない（Ｂｏｎｎｅｔ Ｄ．他、Ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｓ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ａｓ ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｔｈａｔ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３：７３０−７３７；Ｂｌａｉｒ Ａ．他、Ｍｏｓｔ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ＣＤ３４（＋）／ＣＤ７１（−）／ＨＬＡ−ＤＲ−、Ｂｌｏｏｄ １９９８、９２：４３２５−３５；Ｃｏｂａｌｅｄａ Ｃ．他、Ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｉｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ ２０００、９５：１００７−１３）。実際、悪性トランスフォーメーションのためには比較的に小さな生物学的変化しか必要としない幹細胞は、いくつかの観点で、理想的な標的である。幹細胞はすでに、高度に増殖性でかつ発生的に柔軟であるために必要な遺伝的なプログラムを持っているので、比較的に細微な乱れだけで十分に病気を引き起こすことができるのではないかと想像することができる。
【０００４】
最近、悪性幹細胞に起因した新生物形成の一例が、造血系における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の症例で論文として発表された。この病気は、骨髄発生の早発停止およびそれに続く多数の非機能性白血病性芽細胞の集積を特徴とする。白血病性芽細胞はたいていクローン起源であり、比較的に均質な特徴を表すが、このような集団は、正常な造血系前駆細胞と同じように階層的に組織化されることが示されている。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、およびヒトＡＭＬの異種マウス・モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで白血病性芽細胞を増殖させるのに十分な、表現型によって定義された白血病性幹細胞集団がある（Ｂｏｎｎｅｔ Ｄ．他、Ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｓ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ａｓ ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｔｈａｔ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３：７３０−７３７；Ｂｌａｉｒ Ａ．他、Ｍｏｓｔ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ＣＤ３４（＋）／ＣＤ７１（−）／ＨＬＡ−ＤＲ−、Ｂｌｏｏｄ １９９８、９２：４３２５−３５；Ｃｏｂａｌｅｄａ Ｃ．他、Ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｉｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ ２０００、９５：１００７−１３；Ｂｌａｉｒ Ａ．他、Ｌａｃｋ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｙ−１（ＣＤ９０）ｏｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｂｌｏｏｄ １９９７、８９：３１０４−１２）。ヒトの病気の原因を考える上で白血病性幹細胞（ＬＳＣ）の概念はきわめて重要となる。永続的な寛解を達成するためには、原始または前駆ＬＳＣ集団を特異的に除去することが必要であることは明らかである。しかし、過去の研究（Ｔｅｒｐｓｔｒａ Ｗ他、Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｐａｒｅｓ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｇｒｏｗｔｈ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｂｌｏｏｄ １９９６、８８：１９４４−５０）、ならびに我々のグループのデータから、ＬＳＣは、より成熟した白血病性芽細胞とは生物学的に異なっており、従来の化学療法レジーメンに反応しない可能性があることが示唆されている。この観察は、大多数の患者は明白な完全寛解を達成することができるが、ほとんどのケースで再発するというＡＭＬについて頻繁に観察される臨床プロフィールと一致する（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ ＧＪ．、Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １９９８、１２ Ｓｕｐｐｌ１：Ｓ２０−４；Ｐａｉｅｔｔａ Ｅ．、Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ １９７７、１４：５３−６０）。ＬＳＣのほうが芽細胞よりも化学療法に対して屈折力がある（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ）場合、生き残った幹細胞が白血病再発の主要な寄与因子であると提唱することは魅力的である。したがって、白血病前駆細胞を特異的に標的とする戦略は、より効果的な治療を白血病患者に提供する可能性がある。１９９７年に、ＢｏｎｎｅｔとＤｉｃｋは、ＬＳＣの表現型をＣＤ３４＋／ＣＤ３８−と記述した（Ｂｏｎｎｅｔ Ｄ．他、Ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｓ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ａｓ ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｔｈａｔ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３：７３０−７３７）。我々は、白血病性のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−造血細胞では、ＩＬ−３受容体α鎖（ＣＤ１２３）が高度に発現するが、正常なＣＤ３４＋／ＣＤ３８−造血細胞では発現しないことを報告する。現状の技術水準を考慮すれば、当技術分野では、白血病を早期に検出する診断方法ならびに白血病を治療するより有効な方法が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、血液癌（例えば白血病および悪性リンパ増殖性障害）の診断および治療において、ヒトＣＤ１２３分子（ＣＤ１２３エクトペプチド）に結合する化合物を使用する方法に関する。ＣＤ１２３に対して特異的な化合物およびミメティック（mimetics）は、血液癌または悪性疾患状態の治療用および血液癌病態の診断用の薬剤および試薬として特定の有用性を有する。一実施形態では、本発明は、血液癌前駆細胞を障害する方法であって、前記細胞を、血液癌前駆細胞（progenitor hematologic cancer cell）を障害するのに有効な量の、ＣＤ１２３に選択的に結合する化合物と接触させることを含む方法を提供する。この接触段階は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびヒトを含む動物の体内におけるｉｎ ｖｉｖｏを含むさまざまな環境で実施することができる。
【０００６】
本出願全体を通して、本発明のある実施形態を説明する際には特に白血病を参照する。しかし本発明は、白血病または悪性リンパ増殖性障害の診断および治療に限定されるわけではなく、血液癌を含め、癌細胞がＣＤ１２３を選択的に発現する任意の病気に適用されることを理解されたい。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、例えば白血病前駆細胞上のＣＤ１２３の存在を検出する方法を対象とする。したがって本発明はさらに、白血病を診断する方法を対象とする。ＣＤ１２３に結合する標識されたリガンドを使用することによって、白血病前駆細胞の存在を検出することができることを理解されたい。したがって、ＣＤ１２３を発現しているこのような白血病前駆細胞を持っている患者の白血病の発症の可能性を診断することもできる。ＣＤ１２３結合リガンドはＣＤ１２３に対する抗体とすることができ、または、ＣＤ１２３に特異的に結合するさまざまな分子の１つとすることができる。さらに、標識は、ＣＤ１２３分子に結合したリガンドの存在のリポーターの働きをする酵素化合物または非酵素化合物を含む、さまざまな分子の中から選択するができる。ただしこれらに限定されるわけではない。このような標識の例には例えば、放射、蛍光、化学発光または吸収ベースの標識、あるいはこれらの組合せが含まれる。一実施形態では、試料中の白血病前駆細胞の存在を、前記試料中のＣＤ１２３の存在を検出することによって検出する検定が提供される。ＣＤ１２３の存在の検出は、ＣＤ１２３に選択的に結合する化合物を導入し、前記化合物が前記試料の成分と結合しているかどうかを判定することによって実施することができる。
【０００８】
他の実施形態では、本発明はさらに、ＣＤ１２３に結合するペプチド、抗体、炭水化物、脂質、核酸などの化合物の一部または全体の３次元構造、抗体の場合には抗体の結合ポケットまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）の３次元構造をまねた化合物または分子（ミメティック）を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、薬剤として許容される担体、ならびに先に説明した１種または数種のＣＤ１２３特異的化合物およびミメティックを含む製剤を提供する。
他の実施形態では、本発明は、白血病の治療を必要としているヒトまたは動物に、先に説明した治療上有効な量の化合物またはそれらの薬剤ミメティックを投与することを含む、白血病の治療法を提供する。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、白血病幹細胞を骨髄から選択的に除去する方法を提供する。これらの幹細胞は、白血病前駆細胞を生じさせることでき、または自体が前駆細胞でありことができる。本発明の方法は、さまざまな化合物またはそれらのミメティックおよび細胞毒性物質を使用してこれらの幹細胞を障害する。これらの物質は骨髄試料に接触させ、または骨髄に注入することができ、それによって骨髄中の白血病幹細胞の少なくとも一部分を破壊する。
【００１１】
本発明は、以下に示す詳細な説明および添付図面からいっそう十分に理解されよう。これらは例として示すものであって、したがって本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは正常な造血細胞および白血病の造血細胞でのＣＤ１２３の発現を示す図である。正常な骨髄（パネルＡ）または原発性ＡＭＬの末梢血（パネルＢ）から得た細胞中のＣＤ１２３標識化の代表的な例を示す。パネルＡ（左側の点図）にはめ込まれた多角形は、骨髄全体のうちのＣＤ１２３の発現に関して陽性であるパーセンテージ（７％）を指示する。より小さな長方形のゲートは、骨髄全体のうちのＣＤ１２３に関して強い陽性である割合（１％）を指示する。パネルＡの中央の点図は、免疫親和性カラム上での選択によってＣＤ３４＋細胞を濃縮した骨髄を示す（方法を参照のこと）。ゲートは、ＣＤ３４＋集団全体およびＣＤ３４＋／ＣＤ３８−集団を指示する。ヒストグラムは、ゲートされた２つの集団に対するＣＤ１２３標識化を指示する。パネルＢは、原発性ＡＭＬ検体に対する同じ分析を示す。ヒストグラム中のＭ１マーカーは、アイソタイプ対照試料の９９％を超える発現レベルを指示している。それぞれの検体に対して、５０,０００〜１００,０００事象を分析した。
【図２】図２は５つの原始ＡＭＬ集団でのＣＤ１２３の発現を示す図である。５つの原発性ＡＭＬ検体はＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ１２３で標識し、フロー・サイトメトリによって分析した。この図は、それぞれの試料からのＣＤ３４＋／ＣＤ３８−ゲート集団のＣＤ１２３標識化を示す。黒い部分はＣＤ１２３染色を指示し、明るい部分は、アイソタイプ対照抗体を用いた並行した標識化を指示する。ヒストグラム中のＭ１マーカーは、アイソタイプ対照試料の９９％を超える発現レベルを指示している。それぞれの検体に対して、５０,０００〜１００,０００事象を分析した。
【図３】図３Ａおよび３ＢはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでのＣＤ１２３＋ＡＭＬ細胞の移植を示す図である。選別されたＣＤ３４＋／ＣＤ１２３＋原発性ＡＭＬ細胞を、照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した。移植６週間後、骨髄細胞を分離し、ヒト（ＣＤ４５＋）白血病細胞の存在を分析した。パネルＡは、ヒト細胞に特異的な抗体を使用した移植検体のＣＤ３４対ＣＤ４５プロフィールを示す。パネルＢは、ＣＤ４５＋ゲート・ヒト細胞集団のＣＤ３４対ＣＤ１２３プロフィールを示す。それぞれの試料に対して５０,０００事象を分析した。
【図４】図４は原発性ＡＭＬ検体のＣＤ１２３およびＣＤ１３１免疫ブロット分析を示す図である。５つの原発性ＡＭＬ試料を末梢血から得、選別してＣＤ３４＋集団を分離した。したがって実質的に純粋な白血病試料が保証される。さらに、白血病性細胞系統ＴＦ−１（ＴＦ−１）および正常な骨髄ＣＤ３４＋細胞（正常ＣＤ３４＋）を対照として含めた。それぞれの集団から溶解液を作り、変性ＰＡＧＥにかけ、抗ＣＤ１２３抗体（上パネル）または抗ＣＤ１３１抗体（下パネル）を用いて免疫ブロットによって分析した。それぞれのパネルの左側のやじり記号はそれぞれＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）およびＩＬ−３Ｒβ（ＣＤ−１３１）鎖の位置を指示する。
【図５】図５Ａ、５Ｂおよび５ＣはＩＬ−３に応答した信号トランスダクション成分のリン酸化を示す図である。３つの原発性ＡＭＬ試料（レーン１〜３）を末梢血から得、選別してＣＤ３４＋集団を分離した。試料は、２０ng／mlのＩＬ−３で１５分間処理してから（＋）、または処理せずに（−）溶解し、ＰＡＧＥにかけた。次いでそれぞれのゲルを電気ブロットにかけ、タンパク質全体またはリン酸化されたタンパク質に特異的な抗体Ａｋｔ（Ａ）、Ｓｔａｔ５（Ｂ）およびＭｅｋ−１（Ｃ）を用いて膜を調べた。それぞれのブロット上のレーンＣは抗体対照であり、＋／−５０ng／ml ＰＤＧＦ（ＡおよびＣ）で処理したＮＩＨ ３Ｔ３細胞から、または＋／−２５ng／ml ＧＭ−ＳＣＦ（Ｂ）で処理したＴＦ−１細胞から得た。
【図６】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは原発性ＡＬＬでのＣＤ１２３の発現を示す図である。３つの独立した原発性ＡＬＬ（急性リンパ性白血病）検体でのＣＤ１２３発現のフロー・サイトメトリ分析。ＣＤ１２３標識化は塗りつぶされた（黒い）プロットによって示されており、対照は白抜きのプロットによって示されている。
【図７】図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃ原発性ＣＭＬでのＣＤ１２３の発現の発現を示す図である。３つの独立した原発性ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）検体でのＣＤ１２３発現のフロー・サイトメトリ分析。ＣＤ１２３標識化は塗りつぶされた（黒い）プロットによって示されており、対照は白抜きのプロットによって示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、特定の抗原に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の断片を意味する。抗体は、免疫科学分野の熟練者には周知である。本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、無傷の抗体分子だけを意味するのではなく、抗原との結合能力を維持している抗体分子の断片も含む。このような断片も当技術分野ではよく知られており、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方でよく使用されている。具体的には、本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、無傷の免疫グロブリン分子だけを意味するのではなく、周知の活性断片Ｆ(ａｂ’)2、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、ＶHおよびＶLをも含む。
【００１４】
本明細書で使用するとき、用語「結合」は、直接かまたは間接かに関わらず、指定された受容体または受容体サブユニットに作用する任意の相互作用を意味する。
【００１５】
本明細書で使用するとき、用語「選択的に結合する」は、化合物、組成物、処方物などがＩＬ３Ｒβ鎖とはあまり結合しないが、ＩＬ３Ｒα鎖とは結合することを意味する。
【００１６】
本明細書で使用するとき、用語「ＣＤ１２３」、「ＩＬ３Ｒサブユニットα」および「ＩＬ３Ｒα」は相互に交換可能に使用され、本明細書で説明するように白血病前駆細胞中では検出されるが、本明細書で説明するように正常細胞では検出されない抗原決定基を意味する。
【００１７】
本明細書で使用するとき、用語「化合物」は、処方物、組成物、天然の動植物などを含む任意の純度の活性成分を意味する。化合物には、タンパク質、核酸、一本鎖核酸、脂質、炭水化物、抗体などの天然分子を含めることができる。しかし、ＣＤ１２３を結合する限りにおいてこれらの天然分子の合成版も作ることができる。化合物は２種類以上の成分を含むことができる。例えば化合物を、毒素に取り付けられたモノクローナル抗体とすることができる。あるいは、標識に取り付けられた脂質とすることもできる。化合物にはさらに、ミメティックおよびアプタマー（aptamers）を含めることができるが、これらは全てＣＤ１２３に対する特異性を保持する。
【００１８】
本明細書で使用するとき、用語「障害する」は、機能性または活性（成長または増殖活性を含む）の低下を意味する。
【００１９】
本明細書で使用するとき、用語「血液癌」は血液の癌を指し、特に白血病、悪性リンパ増殖性障害などを含む。「白血病」は、感染との戦いに無力な非常に多くの白血球が作られ、血小板、赤血球などの血液を構成する他の部分をこれらの白血球が押しのける血液の癌を指す。白血病の症例は急性または慢性に分類されることを理解されたい。急性白血病の癌細胞は未熟な段階で阻止される。しかし癌細胞は増え続ける。その結果として、未熟な非機能細胞の大規模な蓄積およびそれに付随した機能細胞の損失が起こる。慢性白血病はゆっくりと進行し、癌細胞は完全に成熟する。さらに、白血球は骨髄性またはリンパ性である。したがって、白血病の形態には例えば、急性リンパ性（またはリンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および骨髄異形成症候群などがある。「悪性リンパ増殖性障害」は、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）などのリンパ腫を指す。本発明の目的上、少なくとも血液癌細胞の一部は、ＣＤ１２３を発現した細胞によって特徴づけられる。さらに、本出願の目的上、白血病または悪性リンパ増殖性障害に言及するときには常に、本発明の診断および治療法は一般に血液癌に適用される。
【００２０】
本明細書で使用するとき、用語「導入する」は、単純な接触を含む任意の送達手段を意味する。ｉｎ ｖｉｖｏかｉｎ ｖｉｔｒｏかは問わない。
本明細書で使用するとき、用語「ミメティック（mimetic）」は、化合物が結合することができるＣＤ１２３上の部位の３次元構造をまねた化合物または分子を意味し、この化合物はあるいは、ＣＤ１２３に結合する分子をまねた分子であることができる。抗ＣＤ１２３抗体結合部位ないしパラトープ、すなわち活性部位の場合には、「ミメティック」が、抗体超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）の任意の組合せの３次元構造をまねた化合物を意味する。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「まねる」は、ミメティックの３次元原子配置について言い、ミメティックの原子とペプチド、抗体などの化合物の結合部位の原子との間に、同様のイオン力、共有結合力、ファンデルワールス力またはその他の力、および同様の電荷相補性または静電相補性が存在すること、ミメティックが、ＣＤ１２３に対して親化合物と同様の結合親和性を有すること、ならびに／あるいはミメティックが、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ１２３の機能に対して同様の効果を有することを意味する。
【００２２】
抗ＣＤ１２３抗体の場合、抗体の抗原結合部分には、当技術分野でよく知られているように、抗原のエピトープと直接に相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）およびパラトープの３次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）がある。Ｈ鎖Ｆｄ断片とＩｇＧ免疫グロブリンのＬ鎖の両方に、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）によってそれぞれから分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）がある。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、特にＨ鎖ＣＤＲ３は抗体特異性に対して大きな責任を負う。
【００２３】
本明細書で使用するとき、用語「正常」は、病原または病理とは無関係の細胞または状態を意味する。
本明細書で使用するとき、用語「原始」と「前駆」は相互に交換可能である。
【００２４】
ポリペプチドおよび抗体に関して本明細書で使用するとき、用語「実質的に純粋」は、ポリペプチドが、自然界またはｉｎ ｖｉｖｏ系にあるときに一緒に見つかる他の物質を実質的に、その意図した用途に対して実際的かつ適切な程度にしか含んでいないことを意味する。特にポリペプチドは十分に純粋であり、それらの宿主細胞の他の生物学的成分から十分に分離されており、そのため例えば抗体の生成、配列決定、または製剤の製造に有用である。当技術分野で周知の技法によって、本明細書に開示する核酸およびアミノ酸配列を考慮して、実質的に純粋なポリペプチドを生成することができる。本発明の実質的に精製されたポリペプチドを、薬剤として許容される担体とともに混合して製剤とすることができるので、ポリペプチドが、製剤の重量のうちの小さな割合でしかない場合がある。それでもなお、生体系の中で一緒に存在する物質から実質的に分離されているという意味でポリペプチドは実質的に純粋である。
【００２５】
化合物またはミメティックに関して本明細書で使用するとき、用語「実質的に純粋」は、化合物が、自然界またはｉｎ ｖｉｖｏ系の中で、あるいは化学合成または他の合成の結果として一緒に見つかる他の物質を実質的に、その意図した用途に対して実際的かつ適切な程度にしか含んでいないことを意味する。特に化合物は十分に純粋であり、それらの宿主細胞の他の生物学的成分から、またはそれらの合成の化学的または物理的成分から十分に分離されており、そのため製剤の製造に有用である。当技術分野で周知の技法（米国特許第５６４８３７９号；Ｃｏｌｍａｎ，Ｐ．Ｇ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３：１６８７−１６９３、１９９４；Ｍａｌｂｙ他、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：７３３−７４６、１９９４；ＭｃＣｏｙ他、Ｊ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌ．２６８：５７０−５８４、１９９７）によって、実質的に純粋な化合物またはミメティックを設計することができる。本発明の実質的に精製された化合物を、薬剤として許容される担体とともに混合して製剤とすることができるので、化合物が、製剤の重量のうちの小さな割合でしかない場合がある。それでもなお、生体系、化学系または他の系の中で一緒に存在する物質から実質的に分離されているという意味で化合物は実質的に純粋である。
【００２６】
ＣＤ１２３に結合するミメティック
ＣＤ１２３を標的とする化合物は見つけることができる。ファージ・ディスプレイ・ライブラリ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ）を使用して、ＣＤ１２３に結合するポリペプチドをコード化しているＤＮＡを決定することができる。この方法の原理は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５８３７５００号に開示されている。ＣＤ１２３に結合することができるペプチド以外の分子には核酸およびリポソームがある。ＣＤ１２３を標的とするのに炭水化物を使用することもできる。この化合物は天然の生体分子でなくともよい。このような化学物質は、当技術分野で周知のコンビナトリアル・ライブラリ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ）によって作ることができる。検定の目標はＣＤ１２３への化合物の結合である。リポソームは、ある毒素または他の細胞障害性物質を落ち着かせることができ、または細胞画像化化合物を使用して、ＣＤ１２３を標的とすることができる。白血病の検出および治療に留意しつつ、本発明の方法は、ＣＤ１２３を標的とする限りにおいて、化合物の数多くの変形物および組合せをターゲッティング・エージェントとして企図する。
【００２７】
抗ＣＤ１２３抗体のミメティック
抗イディオタイプ技術を使用して、エピトープをまねた化合物またはミメティックを分離しまたはスクリーニングすることもできる。したがって、第１のモノクローナル抗体が結合したエピトープの像である抗イディオタイプ・モノクローナル抗体は抗原として効果的に作用するので、これを使用して、ペプチド・ファージ・ディスプレイ・ライブラリなど、化合物のコンビナトリアル化学ライブラリまたは他のライブラリからミメティックを分離することができる（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０、１９９０；Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｃｒａｉｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４０−４８、１９９２；Ｂｏｎｎｙｃａｓｔｌｅ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５８：７４７−７６２、１９９６）。したがって、核酸、脂質、炭水化物または他の部分を有するものを含め、タンパク質または他の化合物をまねているペプチドまたは拘束されたペプチドをクローン化することができる（Ｈａｒｒｉｓ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９４：２４５４−２４５９、１９９７）。
【００２８】
自然界で生じず、したがって異化、排泄または分解に対してより抵抗性の純粋な合成分子は、原子の３次元配置によって、ミメティックの原子と抗原結合部位ないしエピトープの原子との間に、同様のイオン力、共有結合力、ファンデルワールス力またはその他の力、および同様の電荷相補性または静電相補性が存在するように設計することができる。次いで、これらのミメティックを、ＣＤ１２３に結合する高い親和性についてクリーニングすることができる。これらは、ＣＤ１２３を持つ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで検出し、かつ／または障害することができる。これについては後に詳細に説明する。
【００２９】
診断薬および製剤
本発明はさらに、ＣＤ１２３結合性化合物およびそのミメティックを含む診断または製剤組成物を調製する方法に関する。製剤は、薬剤として許容される担体を含む。本明細書で使用するとき、このような担体は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害しない非毒性材料を意味する。用語「生理的に許容される」は、細胞、細胞培養、組織、生体などの生体系に適合する非毒性材料を指す。担体の特性は投与経路に依存する。生理的に許容され、かつ薬剤として許容される担体には、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤および当技術分野で周知の他の材料が含まれる。
【００３０】
診断および／または製剤応用で使用するために、さまざまな手段によって抗ＣＤ１２３抗体およびミメティックを標識することができる。当業者に周知の多くの異なる標識および標識化方法がある。本発明で使用することができる標識の例としては、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物。コロイド金属、化学発光化合物および生物発光化合物などがある。当業者なら、モノクローナル抗体、そのミメティックなどのＣＤ１２３結合性化合物に結合させるのに適当な他の標識を見いだし、ルーチンの実験を使用してそれらを確認することができよう。さらに、これらの標識のＣＤ１２３特異的化合物またはそれらのミメティックへの結合は、当業者には一般的な標準技法を使用して達成することができる。
【００３１】
抗体の場合には、感度を高めることができる他の標識化技法に、抗体またはミメティックを低分子量のハプテンに結合することから成る技法がある。次いでこれらのハプテンを、第２の反応によって特異的に変更することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、特定の抗ハプテン抗体と反応することができるジニトロフェノール、ピリドキサル、フルオレセインなどのハプテンを使用することは一般的である。
【００３２】
診断および治療キット
本発明の検定で使用される材料はキットの構築に理想的に適している。このようなキットは、バイアル、管などの１つまたは複数の容器手段を受け取るよう区画が切られた持運び手段を含むことができる。容器手段はそれぞれ、その方法で使用される別個の要素の１つを含む。例えば、１つの容器手段は、診断目的に適した標識で検出可能な標識が付けられた、またはそのような標識を付けることができるモノクローナル抗体またはそのミメティック、あるいは治療が望まれる場合には細胞毒性または障害性物質などのＣＤ１２３結合性化合物を含むことができる。診断キットの場合にはキットがさらに、緩衝剤を含む容器、および／または酵素標識、蛍光標識などのリポーター分子に結合させたアビジン、ストレプトアビジンなどのビオチン結合性タンパク質などのリポーター手段を含む容器を有することができる。当然ながら化学材料の他に、キットを使用するための説明手段、好ましくは白血病を診断しまたは治療するための説明手段が含まれる。説明手段は、バイアルや管等の表面、別紙、あるいは容器の内側または外側に書くことができる。説明は、ＣＤ、コンピュータ・ディスク、ビデオなど、マルチメディア・フォーマットの形態で提供することもできる。
【００３３】
イムノトキシンの調製
当技術分野ではイムノトキシンの調製は一般に周知であるが（例えば、ともに参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４３４０５３５号およびＥＰ４４１６７を参照されたい）、イムノトキシンの調製および後の臨床投与のための精製にある好ましい技術を適用することによって、ある利点を達成できることに発明者らは気づいた。例えば、ＩｇＧベースのイムノトキシンは一般に、Ｆａｂ’ベースのイムノトキシンよりも高い結合能力と遅い血液クリアランスを示すが、Ｆａｂ’断片ベースのイムノトキシンは一般に、ＩｇＧベースのイムノトキシンに比べて高い組織侵入能力を示す。
【００３４】
さらに、ジスルフィド結合を含み、これを使用してうまく毒素部分を結合因子と連結させることができる数多くのタイプのリンカーが知られているが、薬理学的特性および能力の違いに基づいて、好ましいものとそうでないものとがある。例えば、「立体障害」されたジスルフィド結合を含むリンカーが好ましいのは、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性が大きく、したがって作用部位に結合する前に毒素部分が遊離してしまうことを防ぐためである。
【００３５】
架橋試薬は、２つの異なるタンパク質（例えば毒素と結合物質）の官能基を結びつける分子架橋を形成するのに使用される。２つの異なるタンパク質を段階的に連結するために、不必要なホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性架橋剤を使用することができる。例示的なヘテロ二官能性架橋剤は２つの反応基を含む。１つは、第一級アミン基（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド）と反応し、もう１つは、チオール基（例えばピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）と反応する。第一級アミン反応基を介して、架橋剤は、１つのタンパク質（例えば選択された抗体または断片）のリジン残基と反応することができ、チオール反応基を介して、すでに第１のタンパク質に結びついた架橋剤が、他のタンパク質（例えばｄｇＡ）のシステイン残基（遊離スルフヒドリル基）と反応する。
【００３６】
架橋剤のこれらの２つの反応基間のスペーサ・アームは、さまざまな長さおよび化学組成を有することができる。長いスペーサ・アームは連結構成要素の柔軟性を高め、一方、いくつかの特定の架橋構成要素（例えばベンゼン基）は反応基に追加の安定性を与え、またはさまざまな作用に対して高い抵抗性を持つ化学結合を与える（例えば還元剤に抵抗性のジスルフィド結合）。
【００３７】
最も好ましい架橋試薬はＳＭＰＴである。ＳＭＰＴは、隣接したベンゼン環およびメチル基によって「立体障害」されたジスルフィド結合を含む二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は、組織および血液中に存在するグルタチオンなどのチオール酸アニオンによる攻撃からジスルフィド結合を保護する働きをし、それによって、結合剤によって作用部位へ送達される前に連結がはずれるのを防ぐのに役立つと考えられている。多くの他の周知の架橋試薬と同様に、ＳＭＰＴ架橋試薬は、システインのＳＨなどの官能基または第一級アミン（例えばリジンのεアミノ基）を架橋させる能力を与える。他の可能なタイプの架橋剤には、スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリシルアミド）エチル−１,３′−ジチオプロピオナートなどの、開裂可能なジスルフィド結合を含むヘテロ二官能性光反応性フェニルアジドが含まれる。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル基は第一アミノ基と反応し、フェニルアジドは（光分解後に）任意のアミノ酸残基と非選択的に反応する。
【００３８】
本発明の実施においては「立体障害」された架橋剤が一般に好ましいが、非立体障害リンカーを使用し、それにもかかわらず本発明に基づく利点を実現することもできる。保護されたジスルフィドを含む、または生み出すとは考えられない他の有用な架橋剤には、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰおよび２−イミノチオランが含まれる。このような架橋剤の使用は当技術分野でよく理解されている。
【００３９】
連結後には、連結していないＡ鎖、結合物質などの汚染物質を除去するために連結体を精製することが重要である。連結していないＡ鎖を除去することが重要なのは、毒性が増大する可能性があるためである。さらに、連結化学種と非連結化学種との間の抗原をめぐる競合の可能性を回避するために、非連結結合物質を除去することも重要である。いずれにしても、後の「実施例」の項にいくつかの精製技法を開示する。これらは、臨床的に有用な純度にまで精製された連結体を提供することが分かっている。最も好ましい技法は一般に、ブルーセファロースおよびゲル濾過またはゲル透過段階の使用を含む。ブルーセファロースは、シバクロンブルー３ＧＡおよびアガロースから成るカラム基質であり、免疫連結体のの精製に有用であることが分かっている。ブルーセファロースの使用は、Ａ鎖結合とのイオン交換の特性と相まって、非連結結合からの連結結合の良好な分離を提供する。
【００４０】
ブルーセファロースは、連結体から遊離の（連結していない）結合物質（例えば抗体または断片）を排除することを可能にする。遊離（非連結）毒素（例えばｄｇＡ）を排除するためには、従来のゲル濾過手法または高速液体クロマトグラフィーを使用した分子排除クロマトグラフィー段階が好ましい。
【００４１】
十分に精製された連結体が用意できたら、これを、非経口的に投与することができる薬剤組成物とすることが望ましい。これは、最後の精製段階として適当な薬剤組成物を有する培地を使用することによって実行される。
【００４２】
本発明に基づく適当な薬剤組成物は一般に、所望の連結体を約１０mgから約１００mg含み、無菌水溶液などの薬剤として許容される希釈剤または賦形剤と混合され、連結体に対して約０.２５から約２.５mg／mlの最終濃度を与える。このような処方物は一般に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝剤、賦形剤などの追加の添加剤、ＢＳＡ、ＨＳＡなどの安定化剤、または塩化ナトリウムなどの塩を含む。非経口投与用のするためには一般に、無菌性、非免疫原性および非発熱性を保証することによって、このような組成物を薬剤として許容されるものとすることが望ましい。このような技法は、参照によって本明細書に含まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８０に例示されているように当技術分野では一般に周知である。内毒素汚染は最低限、安全なレベル、例えば０.５ng／mgタンパク質よりも低く保たれなければならないことを理解されたい。さらに、ヒトへの投与では、製剤は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｄａｒｄｓが求めている無菌性、発熱性、一般安全性および純度標準を満たさなければならない。
【００４３】
本発明に基づくイムノトキシンの好ましい非経口処方物は、ｐＨ７.５から９.０の０.１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液１ml中に連結体を０.２５から２.５mg含む。この製剤は、−１０℃から−７０℃で少なくとも１年間、凍結貯蔵することができる。
【００４４】
本発明の大部分の治療応用は、ＣＤ１２３白血病マーカへの毒素部分（細胞毒性物質）のターゲッティングを含むことを企図する。これは、大部分の毒素が、潜在的な他の作用物質に比べて、細胞殺滅効果を送達する非常に大きな能力を有するためである。
【００４５】
しかし、標的抗原が、イムノトキシンによる効率的な中毒と一致した経路によって内在化しないときなど、サイトカイン、代謝拮抗物質、アルキル化剤、ホルモンなどの化学療法剤を標的としたい状況が生じる可能性がある。連結した非抗体作用物質よりも優れたこれらの作用物質の利点は、抗体によって提供される追加の選択性である。例えば、ステロイド、シトシンアラビノシド、メトトレキサート、アミノプテリン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ビンカアルカロイド、デメコルチン、エトプシド、ミトラマイシンなどの作用物質を例として挙げることができる。組織への特異的送達のために薬剤作用物質を抗体に取り付けるための技術は十分に確立されているという点で、このリストはむろん例示的なものに過ぎない。
【００４６】
本発明で使用される好ましい１つの細胞毒性部分は、例えば抗ＣＤ１２３抗体に結合しまたは連結することができる放射性同位元素である。好ましい放射性同位元素には、211アスタチン、212ビスマス、213ビスマスなどのα放射体、ならびに131ヨウ素、90イット
リウム、177ルテチウム、153サマリウム、109パラジウムなどのβ放射体が含まれる。特に好ましい放射性同位元素は２１１アスタチンおよび１３１ヨウ素である。
【００４７】
本発明を細胞の画像化に応用することによって、特定の利益を達成することができることが提案される。白血病細胞の画像化は、現在利用可能な画像化技術と比較して、細胞に容易にアクセスできるという大きな利点を提供すると考えられる。
【００４８】
さらに、常磁性、放射性かつ発蛍光性のイオンを抗体に取り付けるための技術は十分に確立されている。これらの方法の多くは、例えば抗体に取り付けられたＤＴＰＡなどの有機キレート剤を使用した金属キレート錯体の使用を含む（例えば米国特許第４４７２５０９号を参照されたい）。本発明の文脈では、抗体によって選択イオンが癌の領域を狙い、取り付けられたイオンによって画像化を進める。
【００４９】
好ましい実施形態では、本発明の方法において、組換えＤＮＡ技術の使用などによる組換え体手段によって抗体をさらにタンパク質エフェクター分子に融合して、抗体とエフェクター分子の両方をコード化した核酸を生み出し、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞中でそのＤＮＡ配列を発現させる。キメラ・タンパク質をコード化しているＤＮＡを、当業者に周知の任意のクローニング手法によって、ｃＤＮＡまたはゲノム形態にクローン化することができる。例えば、参照によって本明細書に取り込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）を参照されたい。
【００５０】
さまざまな標識への抗体の融合または連結によって、抗体が検出される特定の分子を持った細胞または組織の有無を検出するのに使用することができる非常に特異的な検出可能マーカーが生み出される。あるいは抗体を、他の特異的結合部分であるエフェクター分子、例えば先に説明したようなリガンドに化学的に連結または融合させることができる。この形態で組成物は、非常に特異的な二官能性リンカーとして作用する。このリンカーは、融合タンパク質が結合する細胞または細胞構成要素間の相互作用を結合し強化する働きをすることができる。したがって例えば、融合タンパク質が、抗体または抗体断片（例えば抗体のＦｖ断片）に接合された成長因子である場合、抗体は、抗原陽性の癌細胞に特異的に結合することができ、成長因子は、免疫細胞の表面の受容体と結合する。したがって融合タンパク質は免疫応答を強化し、標的癌細胞に向かって免疫応答を導くように作用することができる。
【００５１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ検出および診断
ＣＤ１２３に結合する化合物およびそれらのミメティックを使用する方法は、それらを液相中で、または固相担体に結合させて利用することができるｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用、例えばイムノアッセイに適している。さらに、これらのイムノアッセイのモノクローナル抗体には、さまざまな方向で検出可能な標識を付けることができる。モノクローナル抗体およびそれらのミメティックを利用することができるタイプのイムノアッセイの例は、直接または間接フォーマットの競合および非競合イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイある。モノクローナル抗体およびそれらのミメティックを使用した抗原の検出は、生理的試料に対する免疫組織化学検定を含む、フォワード、リバースまたは同時モードで実行されるイムノアッセイを利用して実施することができる。当業者は、それほど多くの実験をしなくても他のイムノアッセイ・フォーマットを見いだし、またはそれらの容易に理解することができよう。
【００５２】
ＣＤ１２３を結合する化合物およびミメティックを多くの異なる担体に結合させることができ、これらを使用して、ＣＤ１２３を持つ、前駆細胞を含む白血病細胞の存在を検出することができる。周知の担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱が含まれる。本発明の目的上、担体の性質は可溶性であることも、または不溶性であることもできる。当業者であれば、さまざまな化合物を結合させるための他の適当な担体を見いだし、またはルーチンの実験を使用してそれらを確認することができよう。
【００５３】
本発明の目的上、ＣＤ１２３は、化合物およびそれらのミメティックによって体液および組織中に存在するときに検出されることができる。検出可能な量のＣＤ１２３エクトペプチドを含む任意の試料を使用することができる。試料は、尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体、組織、便などの固体または半固体、あるいは組織診で一般的に使用されている固体組織とすることができる。
【００５４】
ＣＤ１２３のｉｎ ｖｉｖｏ検出
ＣＤ１２３のｉｎ ｖｉｖｏ検出におけるＣＤ１２３結合性化合物およびミメティックの使用では、検出可能に標識された化合物またはそのミメティックが診断上有効な用量で与えられる。用語「診断上有効」とは、モノクローナル抗体、ミメティックなどの検出可能に標識された化合物の量が、化合物またはミメティックが特異性を有する白血病細胞を検出できる十分な量で投与されることを意味する。
【００５５】
投与される検出可能に標識された化合物またはミメティックの濃度は、ＣＤ１２３またはＣＤ１２３を持つ白血病細胞への結合が背景に比べて検出できる十分なものでなければならない。さらに、最もよい標的−背景信号比を与えるために、検出可能に標識された化合物またはミメティックが循環系から速やかにクリアされることが望ましい。
【００５６】
概して、検出可能に標識された化合物またはミメティックのｉｎ ｖｉｖｏ診断用の用量は、年齢、性、病気の程度などの因子によって変化する。化合物の用量は、約０.０１mg／kgから約５００mg／kg、好ましくは約０.１mg／kgから約２００mg／kg、より好ましくは約０.１mg／kgから約１０mg／kgである。用量は例えば、複数回の注入をするかどうか、検定対象の組織、および当業者に周知の他の因子などに応じて変化する。
【００５７】
ｉｎ ｖｉｖｏ診断画像化では、使用可能な検出機器のタイプが、適切な放射性同位元素を選択する際の主な因子である。選択される放射性同位元素は、所与のタイプの機器で検出可能な崩壊の型を有していなければならない。ｉｎ ｖｉｖｏ診断用の放射性同位元素を選択する際に重要な他の因子は、放射性同位元素の半減期が十分に長く、そのため標的による最大取込みの時点で依然として検出可能であり、かつ半減期が十分に短く、そのため宿主に対する有害な放射が許容される範囲にとどまることである。ｉｎ ｖｉｖｏ画像化に使用される放射性同位元素が粒子を放出せず、従来のガンマ・カメラによって容易に検出することができる１４０〜２５０ｋｅＶ範囲の多数の光子を生み出すことが理想的である。
【００５８】
ｉｎ ｖｉｖｏ診断では、放射性同位元素を化合物に直接に、または中間官能基を使用して間接的に結合させることができる。金属イオンとして存在する放射性同位元素を結合するのにしばしば使用される中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの二官能性キレート剤である。本発明のモノクローナル抗体およびミメティックに結合させることができる金属イオンの代表例は、111Ｉｎ、97Ｒｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、72Ａｓ、89Ｚｒ、99mＴｃ、123Ｉおよび201Ｔｌである。
【００５９】
本発明の診断方法では、ｉｎ ｖｉｖｏ診断の目的で化合物およびミメティックを、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、電子スピン共鳴法（ＥＳＲ）の場合のように常磁性同位元素で標識することもできる。一般に、診断画像化を視覚化するための従来の任意の方法を利用することができる。通常、カメラ画像化には、γ線および陽電子を放出する放射性同位元素を使用し、ＭＲＩには常磁性同位元素を使用する。このような技法に特に有用な元素には、157Ｇｄ、55Ｍｎ、162Ｄｙ、52Ｃｒおよび56Ｆｅが含まれる。
【００６０】
本発明の細胞監視法では、化合物およびミメティックをｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで使用して、白血病治療の経過を監視する。したがって例えば、このような病気に関連した生体分子の増加または減少、あるいは体内または各種体液中に存在するＣＤ１２３エクトペプチドまたはＣＤ１２３を持つ白血病細胞の濃度変化を測定することによって、上記の白血病の改善を目的とした特定の治療レジーメンが有効かどうかを判定することができよう。
【００６１】
白血病の予防および治療
ＣＤ１２３特異的化合物を、ヒトおよび他の動物の白血病の治療に使用することもできる。本発明の方法に関連して本明細書で使用するとき用語「治療上」または「治療」は、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体、それらのミメティックなどのＣＤ１２３結合性化合物を使用することを指示し、予防的投与と治療的投与の両方を意味し、さらに、実質的に精製されたポリペプチド生成物およびミメティックを用いた受動免疫法と前記生成物またはその一部分をコード化したポリヌクレオチド配列の移植による遺伝子治療の両方を意味する。したがって、化合物およびミメティックは、白血病再発の可能性および／または重症度を軽減するために危険の高い被検者に投与することができ、または活動性の白血病をすでに明白に示している被検者に投与することができる。
【００６２】
ある応用では、薬理学的作用物質が、化合物、特に白血病細胞を殺し、あるいはその成長または細胞分裂を抑制する能力を有する細胞毒性物質またはその他の反細胞作用物質に取り付けるための有用な作用物質として役に立つことが予想される。一般に本発明は、ＣＤ１２３結合性化合物に連結することができ、標的細胞に活性な形態で送達することができる薬理学的作用物質の使用を企図する。例示的な反細胞作用物質には、化学療法剤、放射性同位元素および細胞毒が含まれる。化学療法剤の場合には、ステロイドなどのホルモンなどの作用物質；シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、アミノプテリンなどの代謝拮抗物質；アントラサイクリン；マイトマイシンＣ；ビンカアルカロイド；デメコルチン；エトポシド；ミトラマイシン；カリキアミシン、ＣＣ−１０６５およびその誘導体、クロラムブシル、メルファランなどのアルキル化剤が特に好ましいと発明者は考える。他の実施形態は、凝集剤、サイトカイン、成長因子、細菌内毒素または細菌内毒素のリピドＡ部分などの作用物質を含む。いずれにしても、このような作用物質を必要に応じて、周知の連結技術を使用して、血液成分の標的白血病細胞の部位へのそれらのターゲッティング、内部移行、放出または提示が可能な方法で抗体にうまく連結することができると考えられる。
【００６３】
他の好ましい実施形態では、治療に適用する細胞毒性物質が一般に、Ａ鎖毒素、リボソーム不活化タンパク質、αサルシン、アスペルギリン、レスチリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素またはシュードモナス属菌体外毒素などの植物、真菌または細菌由来の毒素を含む。 毒素−抗体構築体の使用は、それらの抗体への取付けと同様にイムノトキシン分野ではよく知られている。これらのなかで、抗体へ取り付けるのに特に好ましい毒素は、脱グリコシル化されたリシンＡ鎖である。脱グリコシル化されたリシンＡ鎖が好ましいのは、その極端な効力、より長い半減期のためであり、臨床的な等級および規模を製造することが経済的に可能であるためである。
【００６４】
他の好ましい実施形態では、細胞毒性物質を放射性同位元素とすることができる。好ましい放射性同位元素には、211アスタチン、212ビスマス、213ビスマスなどのα放射体、ならびに131ヨウ素、90イットリウム、177ルテチウム、153サマリウム、109パラジウムなどのβ放射体が含まれる。
【００６５】
本明細書で使用するとき、化合物の「治療上有効な量」とは、白血病の症状を軽減し、または白血病の発症の可能性を小さくするという所望の効果を生み出すのに十分な用量である。しかし治療上有効な量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全などの有害な副作用を引き起こすほどの量ではない。治療上有効な量は一般に、被検者の年齢、状態、性別、病気の程度によって変化し、当業者はこれを決定することができる。合併症の場合には個々の医師または獣医が用量を調節することができる。治療上有効な量は、１日または数日にわたる日に１回または数回の投与で、約０.０１mg／kgから約５００mg／kg、好ましくは約０.１mg／kgから約２００mg／kg、より好ましくは約０.２mg／kgから約２０mg／kgである。
【００６６】
本発明の方法では、化合物およびそれらのミメティックを、注射、または時間をかけた緩やかな注入によって投与することができる。化合物およびそれらのミメティックの投与は例えば、静脈内、腹腔内、筋内、腔内、皮下または経皮投与とすることができる。
【００６７】
非経口投与用の製剤には、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、食塩水および緩衝媒質を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口用賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース／塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油が含まれる。静脈内用賦形剤には、液体および栄養補給液、電解質補給液（リンゲルのデキストロースなどを基にしたものなど）が含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤も存在することができる。
【００６８】
この病気の特定の臨床的状態に応じ、投与は、容認されている任意の全身送達系、例えば経口経路、静脈内、筋内、皮下または経皮経路などの非経口経路、または膣、眼、鼻経路を介して、例えば錠剤、坐剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、液剤、懸濁剤、クリーム、ゲル剤、インプラント、パッチ、膣坐剤、エーロゾル剤、洗眼剤、エマルジョンなどの固体、半固体または液体の剤形、好ましくは固定用量を容易に投与するのに適した単位剤形で実施することができる。製剤組成物は、従来の担体または賦形剤およびＣＤ１２３結合性化合物を含み、さらに、他の医用作用物質、薬剤用物質、担体、佐剤などを含むことができる。
【００６９】
所望ならば、投与する薬剤組成物にさらに、湿潤剤、乳化剤、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどのｐＨ緩衝剤などの小量の非毒性補助物質を含めることができる。
【００７０】
本発明の化合物は一般に、ＣＤ１２３結合性化合物とともに薬剤賦形剤を含む薬剤組成物として投与される。処方物中の薬物の量は、当業者が使用する全範囲の中で変化させることができる。例えば、処方物全体に対して薬物を約０.０１重量パーセント（wt％）から約９９.９９wt％、賦形剤を約０.０１wt％から９９.９９wt％とすることができる。
【００７１】
先に述べた条件に対して好ましい投与形態は、従来の投与レジメンを使用した経口投与である。投与レジメンは、病訴の程度に基づいて調節することができる。前記経口投与では、製剤等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどの現在使用されている賦形剤に、選択したＣＤ１２３結合性化合物を組み込むことによって、薬剤として許容される非毒性組成物を形成する。このような組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、徐放性製剤などの形態をとる。このような組成物は、本発明に基づく活性化合物を約０.０１wt％から９９.９９wt％含むことができる。
【００７２】
この組成物は、糖でコーティングされた丸剤または錠剤の形態を有し、したがって、活性成分とともに、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムなどの希釈剤、デンプンおよびその誘導体などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、デンプン、ポリビニルピロリドン、アカシア・ゴム、ゼラチン、セルロースおよびその誘導体などの結合剤を含むことが好ましい。
【００７３】
「薬剤組成物」は、ＣＤ１２３結合性化合物を、白血病を診断しまたは治療する目的で投与される物質として処方することを意味することを理解されたい。白血病の診断または治療物質としての目的とは異なる目的の試験化合物として投与するために使用する組成物は「薬剤組成物」には含まれない。
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【００７４】
最近のいくつかの研究は、ＡＭＬの発生および永続化における幹細胞の存在およびその重要性を示唆している。表現型で言えば、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−またはＣＤ３４＋／ＨＬＡ−ＤＲ−と記述される細胞が、白血病細胞集団の発生の中心的な役割を演じているように見える（Ｂｏｎｎｅｔ Ｄ．他、Ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｓ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ａｓ ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｔｈａｔ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３：７３０−７３７；Ｂｌａｉｒ Ａ．他、Ｍｏｓｔ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ＣＤ３４（＋）／ＣＤ７１（−）／ＨＬＡ−ＤＲ−、Ｂｌｏｏｄ １９９８、９２：４３２５−３５）。さらに、このような細胞が化学療法薬に比較的に抵抗性であり、したがって結果的に再発の現象に寄与することを示唆する証明がある（Ｔｅｒｐｓｔｒａ Ｗ．他、Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｐａｒｅｓ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｇｒｏｗｔｈ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｂｌｏｏｄ １９９６、８８：１９４４−５０）。したがって、ＬＳＣのより深い理解および独特なＬＳＣ抗原の特性付けがＡＭＬのより良い治療の発展に不可欠である。
【００７５】
さまざまなＡＭＬ亜型が、発生特性、表現型、サイトカイン応答性などに関して相当な多様性を示すが、より原始的な白血病細胞のレベルには顕著な機能性の保存があるようである。この特徴は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける白血病の確立にはＣＤ３４＋／ＣＤ３８−亜集団があれば十分であることを示したＢｏｎｎｅｔ他の研究によって証明された（Ｂｏｎｎｅｔ Ｄ．他、Ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｓ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ａｓ ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｔｈａｔ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３：７３０−７３７）。他の研究者による同様の研究が、ＡＭＬとＣＭＬの両方に対して白血病幹細胞の存在を裏付け、それらの比較的に均質な表現型および機能能力を確認した（Ｂｌａｉｒ Ａ．、Ｈｏｇｇｅ他、Ｍｏｓｔ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ＣＤ３４（＋）／ＣＤ７１（−）／ＨＬＡ−ＤＲ−、Ｂｌｏｏｄ １９９８、９２：４３２５−３５；Ｈｏｌｙｏａｋｅ Ｔ．他、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｂｌｏｏｄ １９９９、９４：２０５６−６４）。しかし、現在までのところ、それらの識別または除去治療のための優先ターゲッティングを可能にする骨髄性ＬＳＣの抗原特徴を識別した研究はない。本報告で我々は、正常な造血幹細胞からの識別を容易にする、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−ＡＭＬ幹細胞の追加の共通性を識別した。それがＣＤ１２３の発現である。ＡＭＬ細胞上でＣＤ１２３抗原は高いレベルで容易に検出されたが、ＩＬ−３受容体β鎖であるＣＤ１３１は検出されなかった。
【００７６】
我々の実験によれば、転写因子ＩＲＦ−１（インターフェロン調節因子１）は過剰発現する（調査した６つの原発性ＡＭＬ検体の全てで）。Ｋｏｒｐｅｌａｉｎｅｎ他の以前の研究によれば、ＩＦＮ−γを用いた内皮細胞の治療の結果、ＣＤ１２３のアップレギュレーションが生じる（Ｋｏｒｐｅｌａｉｎｅｎ ＥＩ他、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３（ＩＬ−３）ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ ｗｉｔｈ ＩＬ−３ ｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ １９９５、８６：１７６−８２）。同様に我々自身の研究によれば、ＩＦＮ−γを用いた原発性ＡＭＬ細胞の治療はＣＤ１２３の発現を増大させる（データは示さない）。したがって、インターフェロン調節分子の異常な発現は、ＡＭＬ細胞でのＣＤ１２３発現を制御する際に役割を果たす可能性がある。
【００７７】
ＣＤ１２３抗原の発現は形式上、ＬＳＣが正常な幹細胞とは生物学的に異なっていることを示す。ＣＤ１２３は、正常な造血幹細胞上では容易には見つからないので、悪性の組織を識別する目的に使用することができる固有のマーカーとなる。この特徴は、研究目的ならびにＭＲＤ（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）研究において有用である可能性がある。さらに、ＣＤ１２３エピトープは、治療戦略の対象とすることができる標的となる。以前の臨床試験では、ｉｎ ｖｉｖｏでＡＭＬ細胞に放射性同位元素を送達する手段としてモノクローナル抗体を、ＣＤ３３およびＣＤ４５抗原に対して使用した（Ａｐｐｅｌｂａｕｍ ＦＲ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９９、３６：２−８）。さらに、最近のいくつかの研究では、ＣＤ２０、ＣＤ５２、Ｈｅｒ−２などの悪性細胞上の抗原に特異的なモノクローナル抗体を使用して刺激的な結果が示された（Ｍａｌｏｎｅｙ ＤＧ．、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９８；５：２３７−４３；Ｓｉｋｉｃ ＢＩ．、Ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ １９９９、１０ Ｓｕｐｐｌ６：１４９−５３）。同じ論法でＣＤ１２３に対する抗体が有用である可能性があり、その抗体によって、白血病性幹細胞集団を特異的に標的とする細胞毒性ヒットを送達することができよう。
【００７８】
我々は、広範囲にわたる白血病の幅広い範囲のヒト検体から、ＣＤ１２３が、原始白血病細胞を識別するための固有の抗原マーカーとなることを示した。我々の研究によれば、ＣＤ１２３は一般に高レベルで発現し、それは、白血病生物学のこれまで特徴付けられなかった側面を示すことができる。
【００７９】
以下の非限定的な実施例で本発明をさらに説明する。これらの実施例は単に例示のためのものであって、本明細書に記載の材料、条件、プロセス・パラメータなどに関して請求の発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８０】
実施例１−材料および方法：細胞の処理
原発性ＡＭＬ細胞は、患者の末梢血または骨髄から得た。正常な骨髄は、病理分析または外科的な骨髄採取後の廃棄物として、あるいはＮＤＲＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ）から得た。骨髄細胞は、１５０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ＋１０ｍＭ ＮａＨＣＯ3に５分間漬け、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄することによって赤血球を除去した。血球は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）密度勾配分離にかけ、単核白血球画分を分離した。骨髄または血液から得られた白血球を次いで、免疫親和性選択および／あるいはフロー・サイトメトリ分析または選別に使用した。ＣＤ３４＋細胞の選択には、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ免疫親和性装置（ｖａｒｉｏＭＡＣＳ）をメーカの説明書に従って使用した。場合によっては、白血球を、Ｉｓｃｏｖｅｓ修正ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、４０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から成る冷凍培地中で、５×１０7細胞／mlの濃度で低温保存した。
【００８１】
実施例２−フロー・サイトメトリ
サイトカイン受容体を、以下のモノクローナル抗体で標識することによって検出した：ＣＤ１１４−ビオチン、ＣＤ１１６−ＦＩＴＣ、ＣＤ１２３−ＰＥ、ＣＤ１３１−ビオチン（以上全てＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ１１７−ＰＥ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびＣＤ１３５−ＰＥ（Ｃａｌｔａｇ）。続いてストレプトアビジン−ＰＥ（ＳＡ−ＰＥ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で標識することによって、ビオチニル化した抗体を視覚化した。原発性ＡＭＬ亜集団は、ＣＤ３４−ＦＩＴＣまたはＣＤ３４−ＰＥをＣＤ３８−ＡＰＣ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）と組み合わせて使用して識別した。原発性ＡＭＬ細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス中でヒト細胞に特異的なＣＤ４５−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して識別した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植された細胞を分析するため、移植後６〜８週に骨髄を採取した。細胞は、抗Ｆｅ受容体抗体２．４Ｇ２および２５％ヒト血清を用いて阻止し、続いてヒト特異的ＣＤ３４−ＦＩＴＣおよびＣＤ４５−ＰＥ抗体で２重標識する。対照試料は非移植マウスの骨髄細胞から成る。ＣＤ１２３抗原の持続的発現を保証するために、場合によっては細胞をさらにＣＤ１２３−ＰＥで標識した。それぞれの検体に対して５０,０００〜１００,０００事象を分析した。この方法を使用すると、ヒト細胞を、０.１％という低い頻度まで確実に検出することができた。陽性細胞が０.１％未満の分析は陰性とみなした。
【００８２】
実施例３−免疫ブロット
細胞試料は、１％ＮＰ−４０、０.５％デオキシコラート、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭバナジウム酸ナトリウム（Ｎａ3ＶＯ4）、３０μlアプロチニン（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（Ｓｉｇｍａ）、１μg／mlペプスタチンおよび１μg／mlロイペプチン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｃｈ）を含むＰＢＳ中で、２×１０7細胞／mlの濃度で溶解し、氷上で３０分間培養し、１５,０００×ｇで１０分間遠心分離して破片を除去した。次いで、得られたタンパク質溶解液を等分して−８０℃で保存した。免疫ブロット分析では、タンパク質溶解物を解凍し、試料緩衝液および還元剤（Ｎｏｖｅｘ、米カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ。メーカの説明書に従った）と混合し、７０℃で１０分間加熱した。次いで試料は直ちに、変性ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ、４〜１２％ビス−トリスまたは７％トリス−アセタートゲル）によって、４×１０5細胞／レーン相当量を使用して分析した。電気泳動に続いて、試料を、ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に電気移植し、指示された抗体を用いて調べた。ＣＤ１２３（ＩＬ−３Ｒα鎖）を検出するために、抗体Ｓ−１２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）または９Ｆ５（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用した。ＭｅｋおよびＡｋｔの分析では、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのタンパク質特異的およびリンタンパク質特異的ウサギ・ポリクローナル抗体を使用した。抗Ｓｔａｔ５ポリクローナル（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｓ）および抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ５（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、Ｓｔａｔ５のリン酸化状態を分析した。全ての一次抗体は、アルカリフォスファターゼを連結した二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＥＣＦ試薬（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）をメーカの指示に従って使用して検出した。ブロットは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＳＴＯＲＭ８６０システムおよびＩｍａｇｅｑｕａｎｔ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して視覚化した。
【００８３】
実施例４−ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス検定
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米メイン州Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ）を、137Ｃｓ源からの２２５ラドのγ照射に暴露した。検定する細胞は、２％ＦＢＳを含む０.２５mls ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液。Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁させ、尾静脈に点滴注入した。選別されたいくつかの集団の分析のため、１×１０6個の照射（２５００ラド）マウス骨髄細胞を担体として一緒に注入した。６〜８週後に動物を死亡させ、フロー・サイトメトリ（上記参照）を使用して骨髄を分析し、ヒト細胞の存在を調べた。
【００８４】
実施例５−結果
サイトカイン受容体の分析は、原始白血病細胞でのＣＤ１２３の強い発現を示すが、正常細胞については示さない。多パラメータ・フロー・サイトメトリを使用して、悪性造血細胞の成長に以前に関係したサイトカイン受容体の発現を分析した。いくつかの受容体が興味深い抗体標識パターンを表したが、観察された最も印象的な特徴は、原発性ＡＭＬ検体の間でＣＤ１２３（ＩＬ−３Ｒα鎖）の発現レベルが著しく高く、よく保存されていることであった。図１に、正常組織および白血病組織のＣＤ１２３標識化の代表例を示す。図１Ａには、正常な骨髄全体およびより原始的なそのサブセットがＣＤ１２３発現に関して示されている。骨髄全体は概して、ＣＤ１２３に対して約７％の陽性細胞を有するが、集団の約１％しか高レベルで抗原を発現しない（図１Ａのはめ込みを参照のこと）。正常な骨髄のＣＤ３４＋集団も、造血性前駆細胞を含むことが知られているに対して予想されるとおりに、容易に明らかなＣＤ１２３発現を有する（１２％、図１Ａの右側のヒストグラム）。図示の標識化プロフィールは、やはりヒトＣＤ３４＋細胞上のＩＬ−３Ｒαレベルを調べたＳａｔｏ他の以前の研究とよく一致している（Ｓａｔｏ Ｎ他、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ １９９３、８２：７５２−６１）。しかし、より原始的なＣＤ３４＋／ＣＤ３８−画分は、ＣＤ１２３をあまり発現していない（＜１％）。対照的に、原発性ＡＭＬ細胞（図１Ｂ）は高レベルのＣＤ１２３を発現した。ＣＤ３４＋集団全体とより原始的なＣＤ３４＋／ＣＤ３８−画分の両方で、９９％超の細胞がＣＤ１２３陽性であった。図２に、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−ＡＭＬ細胞上のＣＤ１２３標識化の追加の５例を示す。やはり白血病集団上でのこの抗原の強い発現が見てとれる。表１に、ＡＭＬ細胞型に対して現在までのところ実施された実験をまとめた。この表には、ＡＭＬの亜型Ｍ１、Ｍ２およびＭ４の原始細胞のＣＤ１２３レベルが示されている。調査した１８の原発性ＡＭＬ検体のうち、２例を除く全ての検体で原始白血病細胞上にＣＤ１２３が強く発現した。ＣＤ１２３レベルの低かった２つの試料（試料ＡＭＬ−１１およびＡＭＬ−１４、表１）はともに、ＣＤ１２３発現で均一なシフトを表したが、全体的な標識化強度は検定した大部分の試料よりも暗かった。多くのケース（１８試料中９試料）で、ＣＤ１２３陰性の細胞は実質的に検出されなかった（０％または１％未満）。反対に、５つの正常なＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞試料では、その３つでＣＤ１２３の発現が検出されず、残りの２つの検体もわずか（＜１％）に検出されただけであった。この結果が、特定の抗体の使用によって生じたアーチファクトでないことを保証するため、別の２種類の抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体を使用してこれらのフロー・サイトメトリ分析を確認した。
【００８５】
調査した全てのＡＭＬ亜型で高レベルのＣＤ１２３発現が見つかったことは、ＩＬ−３Ｒαが、白血病状態を生み出しまたは維持することに中心的な役割を演じている可能性があることを意味している。ＩＬ−３に対する高親和性受容体を形成するためには、α鎖とβ鎖（それぞれＣＤ１２３およびＣＤ１３１）の両方が必要である。したがって、フロー・サイトメトリによってＡＭＬ検体のＣＤ１３１発現も調べた。興味深いことに、バルクＡＭＬ集団ではいくらかの発現が見られたが、１５検体の全てのＣＤ３４＋画分でＣＤ１３１は検出されなかった（データは示さない）。
原発性ＡＬＬおよび原発性ＣＭＬ細胞ならびに非ホジキンリンパ腫でのＣＤ１２３発現を示す別のデータを、実施例８および１０で論じる。
【００８６】
実施例６−ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス中のヒトＣＤ１２３＋白血病細胞のｉｎ ｖｉｖｏ移植特性
ＬＳＣ集団を表現型上含む大多数の細胞で強いＣＤ１２３発現が観察されたことから、ＣＤ１２３がＬＳＣのマーカーとして有用であろうと思われた。そのため、ＣＤ１２３＋細胞の機能的能力を確立するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス・モデル系を使用した移植研究を実施した。ＣＤ３４＋／ＣＤ１２３＋細胞をフロー・サイトメトリによって選別し、それらを、照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植することによって、３つの原発性ＡＭＬ検体（表１のＡＭＬ−２、５および１５）を検定した。さらに、集団中の残りの細胞（ＣＤ３４−／ＣＤ１２３＋／−）も並行して選別し移植した。図３のデータは、白血病細胞の強い移植を示した１つの検体の移植後６週の代表的な例である。パネルＡは、ヒトＣＤ３４およびＣＤ４５に特異的な抗体で標識した骨髄細胞全体を示す。このフロー・サイトメトリ・プロフィールは、ヒト細胞（ＣＤ４５＋）の大集団が骨髄に存在することを明らかに指示している。さらに、この集団は、元々の白血病検体に見られたＣＤ３４標識化の割合と同様に、ＣＤ３４＋サブセットとＣＤ３４−サブセットの間で分割されている。パネルＢに、ＣＤ４５＋細胞だけでゲートした同じ骨髄試料を示す。このデータは、ｉｎ ｖｉｖｏで増殖した全ての細胞がＣＤ１２３陽性であることを指示している。表２に、検査した３つの検体のデータをまとめた。全てのケースで、ＣＤ１２３＋細胞はＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に移植することができた。さらに、１例を除き、ＣＤ１２３−集団はｉｎ ｖｉｖｏ再生に寄与しなかった。したがって、ＮＯＤ／ＳＣＩＤモデルによって明確にされたとおり、我々は、ＣＤ１２３がＬＳＣ上で発現すると結論する。
【００８７】
最後に、ＣＤ１２３陽性細胞の白血病の起源を確認する独立した手段として、フロー・サイトメトリを使用して、２つの白血病検体からＣＤ３４−／ＣＤ１２３＋細胞を選別した。これらの試料を４日間培養し、同期させ、次いで細胞遺伝学的分析のため回収した。それぞれの検体からの拡散の調査は、２０中期の全てが白血病特異的転座に対して陽性であることを示した。
【００８８】
実施例７−白血病細胞中でのＣＤ１２３発現の生物学的役割
フロー・サイトメトリによって得られたデータをさらに裏付けるため、免疫ブロット研究を実施してＩＬ−３Ｒ信号トランス濁ション成分を分析した。これらの研究では、それぞれのＡＭＬ試料を末梢血検体から得、それを選別してＣＤ３４＋集団を分離した。したがって実質的に純粋な白血病試料が保証される。最初に、ＩＬ−３Ｒαおよびβ鎖の発現を調べた。図４に示したデータ（上パネル）は、ＣＤ１２３に関して、検定した全ての白血病試料で発現したことを明らかに示している。正常な骨髄（レーン２、ＣＤ３４＋）から得たＣＤ３４＋細胞も弱い信号を示している。これは、正常なＣＤ３４＋細胞がしばしば小数のＣＤ１２３＋細胞を含むことを示す図１Ａのデータと一致している。しかし、正常細胞のより原始的なＣＤ３４＋／ＣＤ３８−サブセットでは、フロー・サイトメトリによってＣＤ１２３の発現は検出されなかった（図１Ａおよび表１）。それらの低い頻度のため、免疫ブロットによる直接分析用の正常またはＡＭＬ起源の十分なＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を得ることはできない。それにもかかわらず、ＣＤ３４＋集団全体の明瞭な信号の検出は、フロー・サイトメトリによって見られるＡＭＬ細胞の強い信号を裏付けている。留意すべき他の点は、ＣＤ１２３バンドの分子量が、ＡＭＬ試料間でわずかに変動するように見える点である。我々は、同じ検体のＲＴ−ＰＣＲフィンガープリント分析を実施し、明らかな異常を認めなかった（データは示さない）。したがって、この観察の最も有望な説明は翻訳後修飾の程度の変動であるように思われる。フロー・サイトメトリによって得られた結果と一致して、ＣＤ１３１の発現は検出されなかった（図４の下パネル）。
【００８９】
ＣＤ１２３の機能上の潜在的な役割を調べるため、我々は、ＩＬ−３に対する原発性ＡＭＬ細胞の応答を調べた。一般に、ＩＬ−３を用いて造血細胞を刺激すると、よく特徴づけられたいくつかの細胞内信号トランスダクション事象が起こる（Ｈａｒａ Ｔ他、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １９９６、１４：６０５−１８）。これらの事象間でのＭｅｋ−１、ＡｋｔおよびＳｔａｔ−５のリン酸化は一般的である（Ｓｏｎｇｙａｎｇ Ｚ他、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｙ ｔｈｅ Ａｋｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７、９４：１１３４５−５０；Ｙａｇｉｓａｗａ Ｍ他、Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９９、２７：１０６３−７６；Ｓｕｔｏｒ ＳＬ他、Ａ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ ｔｈａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃ−Ｒａｆ ａｎｄ Ａ−Ｒａｆ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９９、２７４：７００２−１０；ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ＲＰ他、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｙ ｔｈｅ ＩＬ−３／ＩＬ−５／ＧＭ―ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ．Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ １９９８、１０：６１９−２８）。したがって、これらのタンパク質に対して免疫ブロット研究を実施して、ＩＬ−３刺激のある場合またはない場合で、リン酸化の程度を評価した。図５に示したデータによれば、ＩＬ−３がない場合にはＡｋｔおよびＳｔａｔ５の検出可能なリン酸化は見られず、Ｍｅｋ−１では中位のリン酸化レベルしか見られない。さらに、検定したどのタンパク質でも、ＩＬ−３刺激に応答したリン酸化の増大はあまり見られない。これらの結果は、原発性ＡＭＬ細胞の表面に存在するＣＤ１２３が、従来のＩＬ−３媒介経路を介した信号トランスダクションにあまり寄与していないことを示唆している。
【００９０】
実施例８−原発性ＡＬＬおよび原発性ＣＭＬ細胞でのＣＤ１２３発現
実施例１から４で説明したのと同様の実験プロトコルに従って、原発性ＡＬＬおよび原発性ＣＭＬ細胞でのＣＤ１２３の発現をフロー・サイトメトリによって検定した。結果は、実施例５の原発性ＡＭＬでのＣＤ１２３の発現で得られた結果と一致していた。図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、原発性ＡＬＬ細胞がＣＤ１２３を発現することを再現的に示している。さらに、図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、原発性ＣＭＬ細胞がＣＤ１２３を発現することを再現的に示している。
【００９１】
実施例９−ＣＤ１２３標的補体殺害検定
補体殺害検定（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｋｉｌｌ ａｓｓａｙ）（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、ＤａｖｉｄＭａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＷａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社刊、１９９２）を使用することによって、この実験は、ＣＤ１２３＋細胞が優先して標的となることを示す。この実験で、我々は、代表的なＡＭＬ検体（すなわちＣＤ１２３＋）を正常な骨髄試料と比較した。それぞれの検体に対して、無処理の対照、補体だけで処理された試料および抗ＣＤ１２３＋補体で処理した試料がある。表３に示すように、ＡＭＬ検体に対しては実質的な補体殺害効果があるが、正常な骨髄に対してはない。このことは試料全体に対しても、より原始的なＣＤ３４＋細胞に対しても言える。したがって、この実験は、ＣＤ１２３に対する特異性に関して、正常細胞に対する効果と白血病細胞に対する効果の間に違いがあることを示している。
【００９２】
実施例１０−リンパ腫細胞でのＣＤ１２３発現
組織切片の免疫組織化学的分析は、「びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫」がＣＤ１２３の発現に対して強く陽性であることを示した。これは、非ホジキンリンパ腫の最も一般的な形態である。したがってＢ細胞由来の癌では、ＣＤ１２３の発現が、ＣＤ１２３がＡＬＬ細胞でも観察されたことと一致している（すなわち他のタイプのＢ細胞癌）。この観察はＢ細胞リンパ腫を、ＣＤ１２３を使用した治療および診断のための標的として直接に識別する。
【００９３】
引用した文献は全て、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
当業者なら、ルーチンの実験だけを使用して、本明細書に詳細に記載した本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識し、または確認することができよう。このような等価物は上記請求項の範囲に含まれるものとする。
【００９４】
【表１】
【００９５】
【表２】
【００９６】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液癌の治療を必要としている患者の血液癌を治療するための方法であって、血液癌前駆細胞の障害を引き起こすのに有効な量のＣＤ１２３に選択的に結合する化合物を、前記患者に投与することを含む方法。
【請求項２】
化合物が抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物がさらに細胞毒性物質を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞毒性物質が放射性同位元素である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
放射性同位元素が、211アスタチンおよび131ヨウ素から成るグループから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
障害が細胞死である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
血液癌が白血病または悪性リンパ増殖性疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、メロディスプラスティック症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病および骨髄異形成症候群から成るグループから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
悪性リンパ増殖性疾患がリンパ腫である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
リンパ腫が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）から成るグループから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
血液癌前駆細胞を障害するための方法であって、血液癌前駆細胞を、その細胞の障害を引き起こすのに有効な量のＣＤ１２３に選択的に結合する化合物と接触させることを含む方法。
【請求項１２】
化合物が抗体を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
化合物がさらに細胞毒性物質を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞毒性物質が放射性同位元素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
放射性同位元素が、211アスタチンおよび131ヨウ素から成るグループから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
障害が細胞死である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＤ１２３に選択的に結合し、血液癌前駆細胞を障害する化合物。
【請求項１８】
抗体を含む、請求項１７に記載の化合物
【請求項１９】
細胞毒性物質をさらに含む、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
細胞毒性物質が放射性同位元素である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
放射性同位元素が、211アスタチンおよび131ヨウ素から成るグループから選択される、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
試料中の血液癌前駆細胞の存在を検出するための検定であって、前記試料中のＣＤ１２３の存在を検出することを含むアッセイ。
【請求項２３】
ＣＤ１２３の存在が、ＣＤ１２３に選択的に結合する化合物を導入し、その化合物が試料の成分と結合しているかどうかを判定することによって検出される、請求項２２に記載のアッセイ。
【請求項１】
血液癌の治療を必要としている患者の血液癌を治療するための方法であって、血液癌前駆細胞の障害を引き起こすのに有効な量のＣＤ１２３に選択的に結合する化合物を、前記患者に投与することを含む方法。
【請求項２】
化合物が抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物がさらに細胞毒性物質を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞毒性物質が放射性同位元素である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
放射性同位元素が、211アスタチンおよび131ヨウ素から成るグループから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
障害が細胞死である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
血液癌が白血病または悪性リンパ増殖性疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、メロディスプラスティック症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病および骨髄異形成症候群から成るグループから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
悪性リンパ増殖性疾患がリンパ腫である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
リンパ腫が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）から成るグループから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
血液癌前駆細胞を障害するための方法であって、血液癌前駆細胞を、その細胞の障害を引き起こすのに有効な量のＣＤ１２３に選択的に結合する化合物と接触させることを含む方法。
【請求項１２】
化合物が抗体を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
化合物がさらに細胞毒性物質を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞毒性物質が放射性同位元素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
放射性同位元素が、211アスタチンおよび131ヨウ素から成るグループから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
障害が細胞死である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＤ１２３に選択的に結合し、血液癌前駆細胞を障害する化合物。
【請求項１８】
抗体を含む、請求項１７に記載の化合物
【請求項１９】
細胞毒性物質をさらに含む、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
細胞毒性物質が放射性同位元素である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
放射性同位元素が、211アスタチンおよび131ヨウ素から成るグループから選択される、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
試料中の血液癌前駆細胞の存在を検出するための検定であって、前記試料中のＣＤ１２３の存在を検出することを含むアッセイ。
【請求項２３】
ＣＤ１２３の存在が、ＣＤ１２３に選択的に結合する化合物を導入し、その化合物が試料の成分と結合しているかどうかを判定することによって検出される、請求項２２に記載のアッセイ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−２０１８９４（Ｐ２０１１−２０１８９４Ａ）
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０４２９７（Ｐ２０１１−１０４２９７）
【出願日】平成２３年５月９日（２０１１．５．９）
【分割の表示】特願２００１−５６４７９１（Ｐ２００１−５６４７９１）の分割
【原出願日】平成１３年３月６日（２００１．３．６）
【出願人】（５００４５１０９０）ユニヴァーシティ オブ ケンタッキー リサーチ ファンデーション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月９日（２０１１．５．９）
【分割の表示】特願２００１−５６４７９１（Ｐ２００１−５６４７９１）の分割
【原出願日】平成１３年３月６日（２００１．３．６）
【出願人】（５００４５１０９０）ユニヴァーシティ オブ ケンタッキー リサーチ ファンデーション (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]