血清に安定な両性リポソーム
本発明は大きな血清に対する安定性と、オリゴヌクレオチドの細胞内送達に適した両性リポソーム製剤に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、特別な血清安定性を示し、オリゴヌクレオチドの細胞内送達に適した、血清に安定な両性リポソーム製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
いわゆる短い干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）が比較的新しい部類の潜在的な医薬作用物質を提示するが、それは特定の遺伝子の活性を下方規制しまたは遮断するために、二本鎖として挿入される。治療および診断におけるその大きな能力は、残念なことに、体液に対する強い不安定性という欠点を伴っている。とりわけ血液中では、小さな核酸は極めて素早く除去される。核酸の化学的な修飾によりこれらの分子の感度を下げることが試みられたが、そこでは欠点としてしばしば生物活性の減少ないし欠如が問題になりうる。
【０００３】
別のアプローチは担体の使用であり、これはｓｉＲＮＡを酵素の攻撃から遮断し、作用部位へと移送できるものである。リポソームは、長く医薬物質のための薬剤用担体として用いられている。
【０００４】
多数の刊行物が、インビボにおけるオリゴヌクレオチドの細胞内送達のため、大部分はカチオン性リポソームシステムの使用を扱っている（例えば「モレキュラー・メンブラン・バイオロジー(Molecular Membrane Biology)」，第１６巻，Ｐ．１２９−１４０，（１９９９年）；「ビオシミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ(BBA)」，第１４６４巻，Ｐ．２５１−２６１，（２０００年）；「レビューズ・イン・バイオロジー・アンド・バイオテクノロジー(Reviews in Biology and Biotechnology)」，第１巻，第２号，Ｐ．２７−３３，（２００１年））。しかし、これら全てのシステムは、使用した脂質混合物が、例えばＤＯＴＡＰおよび／またはＤＯＰＥのような、不飽和およびカチオン性の脂質から構成され、これらの理由から血清に安定でないという事実で共通している。これらのリポソームに封入された作用物質は非経口適用後極めて速やかに遊離される。上記の用途について、予め形成されたリポソームと核酸の複合体もまたしばしばつくられている（例えばリポプレックス）。この複合体形成物ないしはほとんどの血清中で安定でないリポソーム製剤は、オリゴヌクレオチドの長期間安定性の保証がないという結果に導く。
【０００５】
両性リポソームはリポソームの新たな部類であり、それは従来のリポソーム及び純粋なカチオン性システムに比較して細胞内送達のための有利な性質を提供するものである。核酸のような陰性に荷電した作用物質は、このリポソームに包まれた内部に有効に封入できるが、リポソームの合計荷電は生理的ｐＨで陰性のままである。細胞内におけるリポソームのエンドソーム内取り込みの際に起るような環境ｐＨの中性から弱酸性への変化により、両性リポソームの荷電がアニオン性から弱いカチオン性に変化し、このようにしてカチオン性トランスフェクション試薬の利点が利用される。国際公開第０２／６６０１２Ａ２号中にこのようなリポソームが始めて報告された。国際公開第０２／６６４９０号および国際公開第０２／６６４８９号（国際公開第０３／０７０２２０号および国際公開第０３／０７０７３５号）は、ｐＨ感受性脂質を提示しているが、これは両性リポソームの構成に適したものである。
【０００６】
ハフェッツら，「（バイオフィジカル・ジャーナル(Biophysical Journal)」，２０００年(第７９巻)，Ｐ．１４３８−４６）およびシら，「ジャーナル・オブ・コントロールド・レリース(Journal of Controlled Release)」，２００２年（第８０巻），Ｐ．３０９−３１９）は、ｐＨ感受性リポソームの製造を記載しているが、これは中性脂質を用いていない。このリポソームは、生理的ｐＨ値において陰性に荷電し、弱いアニオン性または弱いカチオン性の両親媒性物質を含有するｐＨ感受性成分を含んでいる。脂質は、中性または塩基性ｐＨでは安定なリポソームを形成する。酸性媒質中ではアニオン性ないしはカチオン性脂質がプロトン化され、それにより放電ないしは荷電の付与がされる。静電的不安定化によりリポソームは速やかに凝集し、これは膜融合を促進する。しかし、荷電した成分のみからなるリポソームはその血清中での安定性が少ないためインビボでの使用に適さない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
無菌状態、等張性、純度および毒性要件のような非経口適用に対する通常の条件のほかに、ヒト血清中におけるリポソーム製剤の安定性と無凝集性は全身適用への応用を成功させる前提である。それ故、アメリカ合衆国の監督官庁ＦＤＡのリポソーム製剤に関する指針（http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm、リポソーム薬剤製品）もまた特別な証明を定めている。そこでは、インビトロと同じくインビボにおけるカプセル化対遊離の医薬物質の比率を循環時間に対して測定することが要求されている。
【０００８】
血清成分はリポソーム膜を透過性にし、作用物質を遊離させることができる。作用物質の遊離化が速やかか、緩徐かまたは無いかは、作用物質の分子の大きさにも左右される。それ故、何千の塩基対をもつプラスミドが小さなオリゴヌクレオチドよりむしろよくリポソーム中にとどまっている。細胞内送達のためには、遊離化ができるだけ少ないことが要求される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
驚くべきことに、ＷＯ０２／６６０１２Ａ２中に開示された両性リポソームが、小さなオリゴヌクレオチドの使用に際しその血清安定性を大きく異にすることが見出された。したがって、この発明の目的は、ｓｉＲＮＡおよび／またはアンチセンス分子のような小さなオリゴヌクレオチドをその内部空間に封入し、血清条件下において全くまたは小部分しか遊離にせず、それにより非経腸投与に適合する両性リポソーム製剤を提供することである。
【００１０】
この発明は、この課題を
・１０−６０モル％の膜割合の中性脂質、
・３０−５０モル％の割合のコレステロール、
帯電性脂質として、
・５−３０モル％の割合の両性脂質か、または
・多くとも５０モル％の合計割合のカチオン性およびアニオン性脂質の混合物
を含む水性の内部空間をもち、その際製剤は少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを水性内部空間中に作用物質として含むリポソーム製剤を提供することにより、解決するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
この発明の実施形態に重要なオリゴヌクレオチドは、５−１００個、好ましくは５−４０個、特に好ましくは１０−２５個のヌクレオチドまたは塩基対から構成される。さらに、オリゴヌクレオチドは一本鎖として（例えばアンチセンスヌクレオチド）、二本鎖として（例えば短い干渉ＲＮＡ、デコイオリゴヌクレオチド）または複合折りたたみ体として（例えばアプタマー、スピーゲルマー、リボザイム）存在することができる。この発明に重要なオリゴヌクレオチドはすべてデオキシリボヌクレオチドから、またはリボヌクレオチドから、さらにはそれらの化学的に修飾された誘導体、例えばホスホロチオエートＤＮＡ（ＰＳ）、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ（ＯＭｅ）、２’−Ｏ−メトキシ−エチルＲＮＡ（ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’−ホスホロアミデート（ＮＰ）、２’−フルオロ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノホスホロアミデート（ＭＦ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）から構成される。さらに、コポリマーおよびブロックコポリマーで異なるヌクレオチド、およびいわゆるガプマーをリポソームに封入することができる。
【００１２】
この発明の一つの有利な形態では、アプタマーまたはスピーゲルマーをリポソームに封入することができる。
【００１３】
アプタマーは、複雑な三次元構造をもった、ＤＮＡまたはＲＮＡに基礎をおくオリゴヌクレオチドである。この構造に基づき、アプタマーは、たいてい細胞外で、極めて特異的におよび高親和性でたんぱく質標的に結合し、それにより治療的作用を持つ。その作用性は、モノクローナル抗体にほとんど等しい。
【００１４】
スピーゲルマーは、Ｄ−オリゴヌクレオチドと異なり、Ｌ−リボースおよびＬ−２’−デスオキシリボースを単位として構成される。アプタマーと全く同様に、この鏡像形の核酸はたんぱく質標的に特異的に結合する。キラル性が逆転しているため、スピーゲルマーは従来のＤ−オリゴヌクレオチドと対照的に酵素的分解に対して高い安定性をもつ。
【００１５】
この発明による両性リポソームの基本骨子は、膜に対する割合が５ないし６５モル％、好ましくは１０ないし６０モル％の、中性の骨格脂質から形成されている。適当な脂質は、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣおよびＰＯＰＣのようなホスファチジルコリンであり、これらは合成、天然または半合成起源のものであることができる。
【００１６】
膜中にコレステロールを添加することによりリポソームの血清安定性が高まることが、専門家に知られている。このことは、両性リポソームについても見出された。この発明のリポソームは、好適には３０ないし５０モル％、好ましくは３５ないし４５モル％の含量のコレステロールを膜中に有する。
【００１７】
両性リポソームの荷電担体として使用することができる多数の脂質は、コレステロールの化学的基本構造から派生している（例えばＷＯ０２／６６４９０およびＷＯ／０２６６４８中に開示された化合物）。
【００１８】
驚くべきことに、これらのコレステロール誘導体全般、特にＭｏＣｈｏｌ、 ＨｉｓＣｈｏｌ、Ｃｈｅｍｓ、ＨｉｓｔＣｈｏｌが天然コレステロールの安定化作用をもたず、したがってすべてのステロールに基づく脂質の合計が６０モル％を上回らないときは有利なことが見出された。
【００１９】
両性の荷電特性は二つの方法で生成することができる：両性脂質の使用によるか、またはＷＯ０２／０６６０１２中に開示されているような、ｐＨ感受性のカチオン性またはアニオン性脂質の適切な混合によるかである。両性脂質は、５および３０モル％の間、さらに好ましくは５および２０モル％の間の膜割合になるように、混合物の場合、合計荷電担体割合は好ましくは５０モル％より多からず、さらに好ましくは１５および４５モル％の間になるように、使用される。
【００２０】
この発明の一つの好ましい実施態様において、両性製剤は次の構成をもつ:
・１０ないし６０モル％のＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣの群から選ばれた基礎脂質、
・３５-４５モル％のコレステロール、
・５-２０モル％のＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧ、ｉｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ、アシルカルノシン、ＨＣＣｈｏｌの群から選ばれた両性脂質。
【００２１】
この発明の別の好ましい実施態様では、製剤は次の構成をもつ:
・１０ないし５０モル％のＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣの群から選ばれた基礎脂質、
・３５-４５モル％のコレステロール、
・ａ）カチオン性：５ないし４０モル％のＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、ＤＰＩＭ、ＣＨＩＭ、ＤＯＲＩＥ、ＤＤＡＢ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、Ｃ（１８）２Ｇｌｙ＋Ｎ， Ｎ−ジオクタデシルアミドグリシン、ＣＴＡＰ、ＣｐｙＣ、ＤＯＤＡＰ、およびＤＯＥＰＣ、
ｂ）アニオン性：５ないし４０モル％のＤＧＳｕｃｃ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＯＰＳ、ＰＯＰＳ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＯＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＯＰＡ、ＰＯＰＡ、ＣｈｅｍｓおよびＣｅｔｙIＰ、
の群から選ばれた、少なくとも一つのｐＨ感受性のカチオン性およびアニオン性脂質の混合物であって、リポソーム膜に対する割合が合計１５−４５モル％。
【００２２】
この発明の特に好ましい実施態様では、製剤およびその構成は表３から選ばれたものである。
【００２３】
この発明による製剤を医薬担体として使用するためには、持続性が高まり、浸透圧の調節に役立つ物質を添加することが好適でありうる。
【００２４】
この発明のリポソームの製造は、例えば所定の孔径の膜を通じた押し出し、エタノール注入または高圧ホモゲネーションのような、先行技術の方法により行うことができる。これは実施例において例示される。
【００２５】
封入されない作用物質は分離される。それには、適切な分離方法が使用され、その結果作用物質が少なくとも９０％リポソーム中に封入され、１０％より少ない作用物質がリポソームの外に見出される。この目的のために、クロマトグラフ法、遠心分離、透析または限外ろ過を使用することができる。
【００２６】
この発明によるリポソーム製剤は、哺乳類の治療的処置に使用することができる。それはまた、ヒトの治療的処置にも使用することができる。
【００２７】
この発明のリポソーム製剤は特に非経口適用に適し、静脈内適用に好適である。そのことにより、この発明はまた、この発明によるリポソーム製剤を必要に応じて適当な担体とともに含むキット、ならびに診断および治療におけるキットの使用に関するものである。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】
次にこの発明を実施例によりさらに説明するが、これの実施例に基づいて限定されるべきでない。
略号
DMPC ジミリストイルホスファチジルコリン
DPPC ジパルミトイルホスファチジルコリン
DSPC ジステアロイルホスファチジルコリン
POPC パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン
DOPC ジオレオイルホスファチジルコリン
DOPG ジオレオイルホスファチジルグリセリン
POPG パルミトイル−オレオイルホスファチジルグリセリン
DMPG ジミリストイルホスファチジルグリセリン
DPPG ジパルミトイルホスファチジルグリセリン
DMPS ジミリストイルホスファチジルセリン
DPPS ジパルミトイルホスファチジルセリン
DOPS ジオレオイルホスファチジルセリン
POPS パルミトイル−オレオイルホスファチジルセリン
DMPA ジミリストイルフォスファチジン酸
DPPA ジパルミトイルフォスファチジン酸
DOPA ジオレオイルフォスファチジン酸
POPA パルミトイル−オレオイルフォスファチジン酸
DOPE ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
Chems コレステロールヘミスクシネート
DC-Chol 3-β-[N-（N’,N’-ジメチルエタン）カルバモイル］コレステロール
CetylP 燐酸セチル
DODAP (1,2)-シ゛オレオイルオキシプロピル）-N,N-ジジメチルアンモニウムクロリド
DOEPC 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン
DAC-Chol 3-β-[N-(N,N’-ジメチルエタン)カルバモイル]コレステロール
TC-Chol 3-β-[N-(N’,N’,N’-トリメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール
DOTMA (1,2-ジオレイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド)(商標Lipofectin)
DOGS ((C18)2GlySper3+)N,N-ジオクタデシルアミド-グリシル-スペルミン(商標Transfectam)
CTAB セチル-トリメチルアンモニウムブロミド
CPyC セチル-ピリジニウムクロリド
DOTAP (1,2-ジオレオイルオキシプロピル）-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩
DMTAP (1,2-ジミリストイルオキシプロピル）-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩
DPTAP (1,2-ジパルミトイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩
DOTMA (1,2-ジオレイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド）
DORIE (1,2-ジオレイルオキシプロピル)-3 ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド)
DDAB ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド
DPIM ジパルミトイルオキシプロピル−メチルイミダゾール
CHIM ヒスタミニル−コレステロールカルバメート
MoChol 4-(2-アミノエチル)-モルホリノ-コレステロールヘミスクシネート
HisChol ヒスタミニル-コレステロールヘミスクシネート
HCChol Nα’-ヒスチジニル−コレステロールカルバメート
HistChol Nα’-ヒスチジニル-コレステロール-ヘミスクシネート
AC アシルカルノシン、ステアリル−およびパルミトイルカルノシン
HistSuccDG 1,2-ジパルミトイルグリセリン-ヘミスクシネート-Nα-ヒスチジニル-ヘミスクシネート、およびジステアロイル-、ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル−オレオイル誘導体
IsoHistSuccDG 1,2-ジパルミトイルグリセリン-Oα-ヒスチジニル-Nα-ヘミスクシネート、およびジステアロイル-、ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル-オレオイル誘導体
DGSucc 1,2-ジパルミトイルグリセリン-3-ヘミスクシネートおよびジステアロイル-、ジミリストイル-ジオレオイルまたはパルミトイル-オレオイル誘導体
【実施例１】
【００３１】
両性リポソームの製造
表１に挙げた脂質の混合物を、記載されたモル比でクロロホルムに溶解し、続いてロータリーエバポレーター中、真空で完全に乾固する。
【００３２】
脂質膜に、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５を加え、その結果１００ｍＭけんだく液を生じる。続いてこのけんだく液を５０℃の水浴中で回転しながら４５分間水和し、さらに５分間超音波槽で処理する。その後、溶液を冷凍する。
【００３３】
解凍後、リポソームを孔径４００ｎｍの膜を通じて繰り返し押し出す。
【００３４】
ＣＦ（カルボキシフルオレスセイン）充填リポソーム
製造は先出のものと同様に行うが、ただし脂質膜の水和の際、後述の色素溶液を使用する：５００ｍｇのＣＦを１３０μｌの５ＭＮａＣｌ、１２．５ｍｌの１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５および６３０μｌの５ＮＮａＯＨに溶解する。ｐＨ値を調整し、必要に応じて（ｐＨ７．５に)追加処理する。
【００３５】
封入されなかったＣＦの分離はゲルろ過で行う。
【実施例２】
【００３６】
両性リポソーム中へのＣｙ５．５アンチＣＤ４０ＯＤＮ（蛍光標識したアンチセンスオリゴヌクレオチド）の封入
ＤＭＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＧ−Ｓｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０（モル％）の脂質混合物を５０℃でクロロホルムに溶解し、続いてロータリーエバポレーター中、真空で完全に乾固する。
【００３７】
脂質膜に、Ｃｙ５．５アンチＣＤ４０ＯＤＮ（アンチセンスオリゴヌクレオチド）（１０ｍＭ酢酸Ｎａ、３００ｍＭしょ糖、ｐＨ４．５中１５０μｇ／ｍｌ）を加え、その結果１５ｍＭけんだく液を生じる。続いてこのけんだく液を５０℃の水浴中で撹拌しながら４５分間水和し、さらに５分間超音波槽で処理する。その後、溶液を冷凍する。ついで凍結解凍を３回行い、その際、解凍後毎回５分間超音波槽で処理する。
【００３８】
最後の解凍後、リポソームを孔径２００ｎｍまたは４００ｎｍの膜を通じて繰り返し押し出す（アベスチン社リポソファスト、孔経２００ｎｍまたは４００ｎｍのポリカーボネート膜）。押し出し後、１モル／リットルのＨＥＰＥＳ原液を加えてｐＨを７．５に調節する。
【００３９】
封入されたＣｙ５．５アンチＣＤ４０ＯＤＮ（アンチセンスオリゴヌクレオチド）の割合は、６００００×ｇ、４５分間の超遠心による沈降を３回行って遊離で存在する作用物質を分離後、蛍光スペクトル法で調べる。
【００４０】
オリゴヌクレオチドの封入効率は、脂質およびＯＤＮの物質投入量に対する脂質含量の測定値および蛍光法によるＣｙ５．５の測定値の比率により調べて、製剤につき５３％の結果を得る。
【実施例３】
【００４１】
血清安定性の測定
作用物質モデルとして、オリゴヌクレオチドと同様に生理的ｐＨで陰性荷電する、カルボキシフルオレスセイン（ＣＦ）を使用する。ＣＦを充填したリポソームの安定性は３７℃で合計２４時間の期間観察する。その際、リポソームからのＣＦの遊離を経時的に蛍光測定で観察する。３種の異なるリポソーム製剤を９６ウエルプレートごとに試験することができる。ＣＦに関する遊離量パーセントの測定のため、緩衝液中でインキュベートした試料を直接（基底値）およびトリトンを添加してリポソームを破壊した後（トリトン値または１００％値）に行う。
【００４２】
滅菌血清および１ｍＭリポソームを混合して５００μｌの合計量にする。同じような添加物を対照として血清の代わりに緩衝液を用いてつくる。
【００４３】
９６ウエルプレートを次のように各試料名について準備する：１列のウエル中、穴１，３，５，７，９および１１は各５μｌの緩衝液（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を入れる。穴２，４，６，８，１０および１２は各５μｌの１０％トリトンＸ-１００を入れる。
【００４４】
９６ウエルプレートを図２に示すように割り当てる。穴１−６にはそれぞれ５μｌの緩衝液中でインキュベートしたリポソームを入れ、穴７−１２には血清中でインキュベートしたものを入れる。５μｌの試料プラス５μｌの緩衝液またはトリトンに２９０μｌの緩衝液を加える。それぞれの場合に再び基底値およびトリトン値を得る。このようにして、プレート当たり３製剤を８期間にわたり試験することができる。時点は下記の通りである：ゼロ、ゼロ、１５分、３０分、１時間、３時間、５時間、２４時間。
【００４５】
蛍光の測定には、４８５／５３０ｎｍフィルターをもつプレートリーダーを使用する。測定した蛍光データから、相対的蛍光値が得られ、そのうちトリトン値が１００％遊離に相当する。表１は、一連の試験した製剤を示す。それは、この発明により構成したものだけが高い血清安定性を有することを示す。
【実施例４】
【００４６】
ＦＩＴＣ−ＯＤＮ（蛍光標識したアンチセンスＤＮＡ）の封入
使用したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は、５’末端にＦＩＴＣ標識をもつ１８マーホスホロチオエート（フルオレスセインイソチオシアネート）である。ＦＩＴＣ−ＯＤＮをもつリポソームを製造した：９μｇのＯＤＮを含む０．５ｍｌの１ｍＭ脂質溶液。アニオン性ＯＤＮ電荷に対するカチオン性脂質電荷の異なるモル比３：１および４，５：１をもつ２種の調合物。
・それぞれＤＰＰＣ／ＤＯＴＡＰ／ＤＧ−Ｓｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝２０：１０：３０：４０
・水和ないしＯＣＮ溶液：１０ｍＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５、３００ｍＭしょ糖
・封入されなかったＯＤＮの分離には、リポソームをＨｅｐ１０、ＮａＣｌ１５０中に０、０．８および１．２Ｍしょ糖をもつ不連続しょ糖勾配中でフローテーションする（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ）。
【００４７】
測定したＦＩＴＣ−ＯＤＮ蛍光（１００％）ないしは入力値の合計からのＦＩＴＣ-ＯＤＮに対する組み込みの測定値およびそれから導かれる遊離対組み込み蛍光の比率：
【００４８】
【表３】
【実施例５】
【００４９】
両性リポソームへのｓｉＲＮＡ（アンチＧＦＰ）の封入
アニオン性ｓｉＲＮＡに対するカチオン性脂質の荷電比として５：１ないし１０：１を選ぶ。ｓｉＲＮＡ（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２中）を水和緩衝液（１０ｍＭ酢酸Ｎａ、１０ｍＭＮａＣｌ、２８０ｍＭしょ糖、ｐＨ４．５）と混合し、脂質膜に加え、その結果５−１０ｍＭ脂質けんだく液が生じる。脂質を超音波処理してフラスコ壁から除く（最大１０分間）。水和は室温（担体脂質ＰＯＰＣ）または５０℃（担体脂質ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ）で、１５分間である。ついで、少なくとも３回、−７０℃（１ｍｌ容量に対して１０分間、１５ｍｌまでの容量に対して３０分間）冷凍、水浴中再解凍を行う（温度は水和と同様）。
【００５０】
フラスコを解凍し、容量が大きなときは溶液３ｍｌを採る（８ｍｌガラス管中）。残りの混合物を再び−７０℃で冷凍する。１００ｎｍフィルターを通して押出を行う。続いて１／１０容量の１ＭＨｅｐｅｓでｐＨ値をｐＨ８．０に調節する。
【００５１】
リポソームのフローテーション
リポソームフラクションに同容量のＨ２Ｏ中２．４Ｍしょ糖を加える（したがって、１．２Ｍ溶液を生じる）。勾配に、緩衝液（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）、その下に緩衝液中０．８Ｍしょ糖、最下段にＨ２Ｏ中１．２Ｍしょ糖にリポソームを入れたものを積層する。勾配の容量は最大４．５ｍｌになる。フローテーションは、超遠心機中、室温で４５分間５０，０００ｒｐｍで行う。０．８Ｍしょ糖と緩衝液層の間に見出されるリポソームをとる。
【００５２】
リボグリーンＲＮＡ定量試薬によるＲＮＡ定量分析
アッセイは、最終容量２００μｌで実施する。最初、１ｎｇと１０ｎｇの間のｓｉＲＮＡ（１０−１００μｌの１００ｎｇ／ｍｌｓｉＲＮＡ）の標準系列を調製する。
【００５３】
リボグリーンはＴＥ緩衝液中で１：２０００に希釈する。各混合物に１００μｌのリボグリーンを加え、ついで室温で５分間インキュベートし、４８５／５２０ｎｍで蛍光を測定する。混合物に各４μｌの１０％トリトン（最終濃度０．２ｍＭ）を加える。この検量線は後でリポソームに封入されたｓｉＲＮＡ量の定量に用いることができる。約１５分後、さらに一度蛍光を測定する。結果をグラフとして図に記入（それぞれトリトンありおよびなしの曲線）し、数値から標準直線とそれに関する方程式を作成する。
【００５４】
リポソームを２種の異なる濃度（例えば１：５０および１：１００）に希釈し、トリトンなしおよびありの希釈液２−３種の異なる容量（例えば希釈液５、１０および１５μｌに１００μｌのＴＥプラス１００μｌのリボグリーン試薬を加える）について測定する。
【００５５】
製剤中のｓｉＲＮＡ濃度の算出値は、別の測定値とほぼ一致するに違いない。違う場合には、ｓｉＲＮＡ量が検量線の外にあり、この値を濃度の計算に入れてはならない。ｓｉＲＮＡが種々の製剤に封入される効率は、表２に示すことができる。
【００５６】
【表４】
【００５７】
ｓｉＲＮＡ含有リポソームの血清中における試験
修飾されていないｓｉＲＮＡは血清中で極めて急速に分解される。ｓｉＲＮＡに対するリポソームの保護効果を調査するため、下記のように行う。
【００５８】
封入ｓｉＲＮＡの濃度を血清試験の前に定量する。各試験の時点において、それぞれの時点当たり４μｇのｓｉＲＮＡを入れたリポソームを用いる。試験された時点はゼロ、１時間、２時間および４時間である。
【００５９】
４μｇのｓｉＲＮＡを内部に組み込んだリポソームをリポソーム（通常１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を含む緩衝液で６０μｌ容量に希釈する。。混合物に６０μｌの血清を加え、上記の時点まで３７℃でインキュベートする。ゼロ時点は別に定量する。
【００６０】
血清成分と脂質をｓｉＲＮＡから良好に分離するために、フェノール／クロロホルム抽出をＰＬＧ−Ｅｐｐｉｓ（フェーズ・ロック・ゲル・エッペンドルフ試験管）で実施する。ＰＬＧ−Ｅｐｐｉｓは１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、氷上に置く（以下では最高４℃で作業する）。ＰＬＧ−Ｅｐｐｉｓに２８０μｌの（上記のような）緩衝液と４５μｌの５ＭＮａＣｌを加える。
【００６１】
この溶液に血清中（１２０μｌ）のリポソーム混合物を加える。そのあと直ぐに３００μｌのフェノール／クロロホルム混合物を添加する。ゼロ値についてはＰＬＧ−Ｅｐｐｉ中のＮａＣｌと緩衝液に６０μｌの血清を加える。全てを、直ちに混合する。
【００６２】
１３０００ｒｐｍ、４℃、１０分間の遠心を行う。水層には遊離ｓｉＲＮＡを含有する。勾配にさらに３００μｌのクロロホルムを加え、短時間混合する。さらに上記の様に遠心後、水層は透明であり、可能な限り充分に除去することができる。ここでｓｉＲＮＡは水層から沈降させる。ｓｉＲＮＡ溶液に１／１０容量の３ＭＮａＯＡｃ、ｐＨ５．２および２．５容量部のエタノールを加える。溶液をよく混合し、ｓｉＲＮＡを−７０℃で１時間沈降させる。さらに４℃、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心する。ｓｉＲＮＡはペレット化される。上澄を充分分離し、ペレットを７０％エタノール２００μｌで洗浄し、約１０分間乾燥する。ｓｉＲＮＡを５μｌの水に再溶解する。
【００６３】
ｓｉＲＮＡの品質は変性状態および出来得れば未変性のアクリルアミドゲルで検査する。
【００６４】
未変性アクリルアミドゲル中におけるｓｉＲＮＡ二本鎖性の証明
ｓｉＲＮＡの品質は、一本鎖完全長および二本鎖性により特徴づけられる。二本鎖ｓｉＲＮＡは一本鎖のものより未変性アクリルアミドゲル中ゆっくり移動するので、未変性アクリルアミドを用いてｓｉＲＮＡの二本鎖性を検査することができる。
【００６５】
ゲルは、必要な温度にするため、ＴＢＥ緩衝液で３０分間予備処理（８０Ｖ、１００ｍＡ）する。
【００６６】
ゲルが過負荷されないように、スロット当たり最高２μｇのｓｉＲＮＡを塗布する。合計容量９μｌの試料をとる。それに１μｌのブルージュース荷電緩衝液を加える。試料を予備処理したゲルに塗布し，１００ｍＡで１時間分離させる。
ゲルの染色：
ゲルを電気泳動後装置から取り出す。ゲルに約２００ｍｌのステインオール溶液（２０ｍｌの原液、１８０ｍｌのホルムアミド、２００ｍｌの水 を加える。ゲルを暗所でステインオール溶液中３０−６０分間染色する。その後、溶液をゲルから除去し、ゲルを明所で水中に入れて脱色する（光の強さに応じて約３０分−２時間）。ｓｉＲＮＡは染色されたままであり、それに対してバックグラウンドは完全に脱色されている。
【実施例６】
【００６７】
Ｃｙ３−ＢＣＬ２アンチセンスをもつ両性リポソームのＨｅｐＧ２細胞へのインビトロでの取り込み
ＨｅｐＧ２細胞はトランスフェクションの２日前に９６ウエルプレートに接種し、トランスフェクションの日に細胞密度が６０-８０％となるようにする（１００μｌ中に０．０２−０．２×１０５、i.d.R.１×１０４）。２個のプレート（遠心および対照インキュベーション）を用意し、これらはほかの点では同じように処理する。
【００６８】
トランスフェクション
遠心分離機（バイオフュージ・ストラトス、ヘレウス社）、マイクロタイタープレート用ローターＮＯ．３０４８を予備加熱する。Ｃｙ３−Ｂｃｌ２アンチセンス含有リポソームを１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＨＢＳ）で一定濃度に調節する（Ｃｙ−３は赤色の蛍光を出すマーカーである）。
【００６９】
リポソーム希釈液（充填物ありおよびなし）ならびに市販の対照トランスフェクション試薬（例えばリポフェクタミン２０００、オリゴフェクタミン、ｓｉポートアミン、ｓｉポートリピッド）からのトランスフェクション混合物の、無血清媒地（約１６０ｎｇアンチセンス／ウエル）を用いた９６ウエルウエルプレートでの製造。リポソーム希釈液は２５−５０μｌ容量で細胞に対して加える。
【００７０】
リポソーム希釈液を２５μｌ中に上記量のアンチセンス／ウエルを含むようにつくる場合、細胞を無血清培地で洗浄し（１回）、血清含有または無血清培地を例えば各ウエルに７５μｌ入れる。
【００７１】
マルチウエルプレートを１，５００ｒｐｍ（３４２ｇ）、１時間、３７℃で遠心分離し、対照プレートを１時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）する。続いて、２つのプレートを３時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）する。
【００７２】
全てのウエルから培地を完全に除去し、ＰＢＳで１回洗浄し、血清含有培地で２回洗浄する；全てのウエルに血清含有培地の添加、生存率について顕微鏡でチェック、続いて両プレートを一夜インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）する。
【００７３】
トランスフェクションの翌日、細胞中のリポソーム取り込みを蛍光顕微鏡で調べる。図３に細胞局在化のための位相差写真と蛍光写真とを示す。
【実施例７】
【００７４】
コレステロールおよび／またはマトリックス脂質なしおよびありの両性リポソームの血清安定性測定
両性リポソーム中へのＦＩＴＣデキストランの封入
１５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣデキストランを用いて下記の製剤を作成した（Hafez IM, Ansell S, Cullis PR : カチオン性およびアニオン性脂質から構成した調節できるｐＨ感受性リポソーム(Tunable pHsensitive liposomes composed of mixtures of cationic and anionic lipids) Biophys J. 2000 Sep; 79 (3): 1438-46.）の場合と同様、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ３．９（ＨＡｃ）中で調整）。
【００７５】
E1 DC-Chol/DOPA(66/34)
E2 DC-Chol/DOPA/Chol(40/20/40)
E3 DMPC/DC-Chol/DOPA(60/27/13)
E4 DMPC/DC-Chol/DOPA/Chol(20/27/13/40)
E5 DMPC/DC-Chol/DOPA/Chol(30/20/10/40)
E6 DMPC/DC-Chol/DOPA/Chol(40/13/7/40)
外側のＦＩＴＣデキストランを分離するため、リポソームを押し出し後フローテーションさせた。ｐＨ３．９（１０ｍＭＨｅｐｅｓ1５０ｍＭＮａＣｌ、ＨＡｃ）またはｐＨ９．０（１０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ）において、ゼータサイザーで下記のデータを測定した。
【００７６】
【表５】
【００７７】
血清中におけるＦＩＴＣデキストラン含有リポソームの試験
ヒト血清中におけるこの製剤の安定性を試験するため、ヒト血清中において〜１ｍＭのリポソームを３７℃で３時間インキュベートし、その後フローテーションさせた。非フローテーション試料中並びにフローテーション試料の下層（血清層）において蛍光を定量し、それから充填物の放出を計算した。試験開始時に対する外側のＦＩＴＣデキストランの比率は、ｐＨ３．９の緩衝液中の上記希釈と続くフローテーションにより同様の方法で測定した。
【００７８】
【表６】
【００７９】
４０％コレステロールもマトリックス脂質も含有するすべての製剤（Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６）は、コレステロールのみ（Ｅ２）またはマトリックス脂質のみ（Ｅ３）を含有または両者を含有しない（Ｅ１）製剤よりも安定である。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】脂質の化学式である。
【図２】血清安定性試験のための９６ウエルマイクロタイタープレートにおける配置であり、蛍光マーカーＣＦの遊離化が測定される。
【図３】細胞局在化のための蛍光顕微鏡写真と、その横に位相差顕微鏡写真を示す。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、特別な血清安定性を示し、オリゴヌクレオチドの細胞内送達に適した、血清に安定な両性リポソーム製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
いわゆる短い干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）が比較的新しい部類の潜在的な医薬作用物質を提示するが、それは特定の遺伝子の活性を下方規制しまたは遮断するために、二本鎖として挿入される。治療および診断におけるその大きな能力は、残念なことに、体液に対する強い不安定性という欠点を伴っている。とりわけ血液中では、小さな核酸は極めて素早く除去される。核酸の化学的な修飾によりこれらの分子の感度を下げることが試みられたが、そこでは欠点としてしばしば生物活性の減少ないし欠如が問題になりうる。
【０００３】
別のアプローチは担体の使用であり、これはｓｉＲＮＡを酵素の攻撃から遮断し、作用部位へと移送できるものである。リポソームは、長く医薬物質のための薬剤用担体として用いられている。
【０００４】
多数の刊行物が、インビボにおけるオリゴヌクレオチドの細胞内送達のため、大部分はカチオン性リポソームシステムの使用を扱っている（例えば「モレキュラー・メンブラン・バイオロジー(Molecular Membrane Biology)」，第１６巻，Ｐ．１２９−１４０，（１９９９年）；「ビオシミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ(BBA)」，第１４６４巻，Ｐ．２５１−２６１，（２０００年）；「レビューズ・イン・バイオロジー・アンド・バイオテクノロジー(Reviews in Biology and Biotechnology)」，第１巻，第２号，Ｐ．２７−３３，（２００１年））。しかし、これら全てのシステムは、使用した脂質混合物が、例えばＤＯＴＡＰおよび／またはＤＯＰＥのような、不飽和およびカチオン性の脂質から構成され、これらの理由から血清に安定でないという事実で共通している。これらのリポソームに封入された作用物質は非経口適用後極めて速やかに遊離される。上記の用途について、予め形成されたリポソームと核酸の複合体もまたしばしばつくられている（例えばリポプレックス）。この複合体形成物ないしはほとんどの血清中で安定でないリポソーム製剤は、オリゴヌクレオチドの長期間安定性の保証がないという結果に導く。
【０００５】
両性リポソームはリポソームの新たな部類であり、それは従来のリポソーム及び純粋なカチオン性システムに比較して細胞内送達のための有利な性質を提供するものである。核酸のような陰性に荷電した作用物質は、このリポソームに包まれた内部に有効に封入できるが、リポソームの合計荷電は生理的ｐＨで陰性のままである。細胞内におけるリポソームのエンドソーム内取り込みの際に起るような環境ｐＨの中性から弱酸性への変化により、両性リポソームの荷電がアニオン性から弱いカチオン性に変化し、このようにしてカチオン性トランスフェクション試薬の利点が利用される。国際公開第０２／６６０１２Ａ２号中にこのようなリポソームが始めて報告された。国際公開第０２／６６４９０号および国際公開第０２／６６４８９号（国際公開第０３／０７０２２０号および国際公開第０３／０７０７３５号）は、ｐＨ感受性脂質を提示しているが、これは両性リポソームの構成に適したものである。
【０００６】
ハフェッツら，「（バイオフィジカル・ジャーナル(Biophysical Journal)」，２０００年(第７９巻)，Ｐ．１４３８−４６）およびシら，「ジャーナル・オブ・コントロールド・レリース(Journal of Controlled Release)」，２００２年（第８０巻），Ｐ．３０９−３１９）は、ｐＨ感受性リポソームの製造を記載しているが、これは中性脂質を用いていない。このリポソームは、生理的ｐＨ値において陰性に荷電し、弱いアニオン性または弱いカチオン性の両親媒性物質を含有するｐＨ感受性成分を含んでいる。脂質は、中性または塩基性ｐＨでは安定なリポソームを形成する。酸性媒質中ではアニオン性ないしはカチオン性脂質がプロトン化され、それにより放電ないしは荷電の付与がされる。静電的不安定化によりリポソームは速やかに凝集し、これは膜融合を促進する。しかし、荷電した成分のみからなるリポソームはその血清中での安定性が少ないためインビボでの使用に適さない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
無菌状態、等張性、純度および毒性要件のような非経口適用に対する通常の条件のほかに、ヒト血清中におけるリポソーム製剤の安定性と無凝集性は全身適用への応用を成功させる前提である。それ故、アメリカ合衆国の監督官庁ＦＤＡのリポソーム製剤に関する指針（http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm、リポソーム薬剤製品）もまた特別な証明を定めている。そこでは、インビトロと同じくインビボにおけるカプセル化対遊離の医薬物質の比率を循環時間に対して測定することが要求されている。
【０００８】
血清成分はリポソーム膜を透過性にし、作用物質を遊離させることができる。作用物質の遊離化が速やかか、緩徐かまたは無いかは、作用物質の分子の大きさにも左右される。それ故、何千の塩基対をもつプラスミドが小さなオリゴヌクレオチドよりむしろよくリポソーム中にとどまっている。細胞内送達のためには、遊離化ができるだけ少ないことが要求される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
驚くべきことに、ＷＯ０２／６６０１２Ａ２中に開示された両性リポソームが、小さなオリゴヌクレオチドの使用に際しその血清安定性を大きく異にすることが見出された。したがって、この発明の目的は、ｓｉＲＮＡおよび／またはアンチセンス分子のような小さなオリゴヌクレオチドをその内部空間に封入し、血清条件下において全くまたは小部分しか遊離にせず、それにより非経腸投与に適合する両性リポソーム製剤を提供することである。
【００１０】
この発明は、この課題を
・１０−６０モル％の膜割合の中性脂質、
・３０−５０モル％の割合のコレステロール、
帯電性脂質として、
・５−３０モル％の割合の両性脂質か、または
・多くとも５０モル％の合計割合のカチオン性およびアニオン性脂質の混合物
を含む水性の内部空間をもち、その際製剤は少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを水性内部空間中に作用物質として含むリポソーム製剤を提供することにより、解決するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
この発明の実施形態に重要なオリゴヌクレオチドは、５−１００個、好ましくは５−４０個、特に好ましくは１０−２５個のヌクレオチドまたは塩基対から構成される。さらに、オリゴヌクレオチドは一本鎖として（例えばアンチセンスヌクレオチド）、二本鎖として（例えば短い干渉ＲＮＡ、デコイオリゴヌクレオチド）または複合折りたたみ体として（例えばアプタマー、スピーゲルマー、リボザイム）存在することができる。この発明に重要なオリゴヌクレオチドはすべてデオキシリボヌクレオチドから、またはリボヌクレオチドから、さらにはそれらの化学的に修飾された誘導体、例えばホスホロチオエートＤＮＡ（ＰＳ）、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ（ＯＭｅ）、２’−Ｏ−メトキシ−エチルＲＮＡ（ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’−ホスホロアミデート（ＮＰ）、２’−フルオロ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノホスホロアミデート（ＭＦ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）から構成される。さらに、コポリマーおよびブロックコポリマーで異なるヌクレオチド、およびいわゆるガプマーをリポソームに封入することができる。
【００１２】
この発明の一つの有利な形態では、アプタマーまたはスピーゲルマーをリポソームに封入することができる。
【００１３】
アプタマーは、複雑な三次元構造をもった、ＤＮＡまたはＲＮＡに基礎をおくオリゴヌクレオチドである。この構造に基づき、アプタマーは、たいてい細胞外で、極めて特異的におよび高親和性でたんぱく質標的に結合し、それにより治療的作用を持つ。その作用性は、モノクローナル抗体にほとんど等しい。
【００１４】
スピーゲルマーは、Ｄ−オリゴヌクレオチドと異なり、Ｌ−リボースおよびＬ−２’−デスオキシリボースを単位として構成される。アプタマーと全く同様に、この鏡像形の核酸はたんぱく質標的に特異的に結合する。キラル性が逆転しているため、スピーゲルマーは従来のＤ−オリゴヌクレオチドと対照的に酵素的分解に対して高い安定性をもつ。
【００１５】
この発明による両性リポソームの基本骨子は、膜に対する割合が５ないし６５モル％、好ましくは１０ないし６０モル％の、中性の骨格脂質から形成されている。適当な脂質は、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣおよびＰＯＰＣのようなホスファチジルコリンであり、これらは合成、天然または半合成起源のものであることができる。
【００１６】
膜中にコレステロールを添加することによりリポソームの血清安定性が高まることが、専門家に知られている。このことは、両性リポソームについても見出された。この発明のリポソームは、好適には３０ないし５０モル％、好ましくは３５ないし４５モル％の含量のコレステロールを膜中に有する。
【００１７】
両性リポソームの荷電担体として使用することができる多数の脂質は、コレステロールの化学的基本構造から派生している（例えばＷＯ０２／６６４９０およびＷＯ／０２６６４８中に開示された化合物）。
【００１８】
驚くべきことに、これらのコレステロール誘導体全般、特にＭｏＣｈｏｌ、 ＨｉｓＣｈｏｌ、Ｃｈｅｍｓ、ＨｉｓｔＣｈｏｌが天然コレステロールの安定化作用をもたず、したがってすべてのステロールに基づく脂質の合計が６０モル％を上回らないときは有利なことが見出された。
【００１９】
両性の荷電特性は二つの方法で生成することができる：両性脂質の使用によるか、またはＷＯ０２／０６６０１２中に開示されているような、ｐＨ感受性のカチオン性またはアニオン性脂質の適切な混合によるかである。両性脂質は、５および３０モル％の間、さらに好ましくは５および２０モル％の間の膜割合になるように、混合物の場合、合計荷電担体割合は好ましくは５０モル％より多からず、さらに好ましくは１５および４５モル％の間になるように、使用される。
【００２０】
この発明の一つの好ましい実施態様において、両性製剤は次の構成をもつ:
・１０ないし６０モル％のＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣの群から選ばれた基礎脂質、
・３５-４５モル％のコレステロール、
・５-２０モル％のＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧ、ｉｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ、アシルカルノシン、ＨＣＣｈｏｌの群から選ばれた両性脂質。
【００２１】
この発明の別の好ましい実施態様では、製剤は次の構成をもつ:
・１０ないし５０モル％のＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣの群から選ばれた基礎脂質、
・３５-４５モル％のコレステロール、
・ａ）カチオン性：５ないし４０モル％のＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、ＤＰＩＭ、ＣＨＩＭ、ＤＯＲＩＥ、ＤＤＡＢ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、Ｃ（１８）２Ｇｌｙ＋Ｎ， Ｎ−ジオクタデシルアミドグリシン、ＣＴＡＰ、ＣｐｙＣ、ＤＯＤＡＰ、およびＤＯＥＰＣ、
ｂ）アニオン性：５ないし４０モル％のＤＧＳｕｃｃ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＯＰＳ、ＰＯＰＳ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＯＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＯＰＡ、ＰＯＰＡ、ＣｈｅｍｓおよびＣｅｔｙIＰ、
の群から選ばれた、少なくとも一つのｐＨ感受性のカチオン性およびアニオン性脂質の混合物であって、リポソーム膜に対する割合が合計１５−４５モル％。
【００２２】
この発明の特に好ましい実施態様では、製剤およびその構成は表３から選ばれたものである。
【００２３】
この発明による製剤を医薬担体として使用するためには、持続性が高まり、浸透圧の調節に役立つ物質を添加することが好適でありうる。
【００２４】
この発明のリポソームの製造は、例えば所定の孔径の膜を通じた押し出し、エタノール注入または高圧ホモゲネーションのような、先行技術の方法により行うことができる。これは実施例において例示される。
【００２５】
封入されない作用物質は分離される。それには、適切な分離方法が使用され、その結果作用物質が少なくとも９０％リポソーム中に封入され、１０％より少ない作用物質がリポソームの外に見出される。この目的のために、クロマトグラフ法、遠心分離、透析または限外ろ過を使用することができる。
【００２６】
この発明によるリポソーム製剤は、哺乳類の治療的処置に使用することができる。それはまた、ヒトの治療的処置にも使用することができる。
【００２７】
この発明のリポソーム製剤は特に非経口適用に適し、静脈内適用に好適である。そのことにより、この発明はまた、この発明によるリポソーム製剤を必要に応じて適当な担体とともに含むキット、ならびに診断および治療におけるキットの使用に関するものである。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】
次にこの発明を実施例によりさらに説明するが、これの実施例に基づいて限定されるべきでない。
略号
DMPC ジミリストイルホスファチジルコリン
DPPC ジパルミトイルホスファチジルコリン
DSPC ジステアロイルホスファチジルコリン
POPC パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン
DOPC ジオレオイルホスファチジルコリン
DOPG ジオレオイルホスファチジルグリセリン
POPG パルミトイル−オレオイルホスファチジルグリセリン
DMPG ジミリストイルホスファチジルグリセリン
DPPG ジパルミトイルホスファチジルグリセリン
DMPS ジミリストイルホスファチジルセリン
DPPS ジパルミトイルホスファチジルセリン
DOPS ジオレオイルホスファチジルセリン
POPS パルミトイル−オレオイルホスファチジルセリン
DMPA ジミリストイルフォスファチジン酸
DPPA ジパルミトイルフォスファチジン酸
DOPA ジオレオイルフォスファチジン酸
POPA パルミトイル−オレオイルフォスファチジン酸
DOPE ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
Chems コレステロールヘミスクシネート
DC-Chol 3-β-[N-（N’,N’-ジメチルエタン）カルバモイル］コレステロール
CetylP 燐酸セチル
DODAP (1,2)-シ゛オレオイルオキシプロピル）-N,N-ジジメチルアンモニウムクロリド
DOEPC 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン
DAC-Chol 3-β-[N-(N,N’-ジメチルエタン)カルバモイル]コレステロール
TC-Chol 3-β-[N-(N’,N’,N’-トリメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール
DOTMA (1,2-ジオレイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド)(商標Lipofectin)
DOGS ((C18)2GlySper3+)N,N-ジオクタデシルアミド-グリシル-スペルミン(商標Transfectam)
CTAB セチル-トリメチルアンモニウムブロミド
CPyC セチル-ピリジニウムクロリド
DOTAP (1,2-ジオレオイルオキシプロピル）-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩
DMTAP (1,2-ジミリストイルオキシプロピル）-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩
DPTAP (1,2-ジパルミトイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩
DOTMA (1,2-ジオレイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド）
DORIE (1,2-ジオレイルオキシプロピル)-3 ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド)
DDAB ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド
DPIM ジパルミトイルオキシプロピル−メチルイミダゾール
CHIM ヒスタミニル−コレステロールカルバメート
MoChol 4-(2-アミノエチル)-モルホリノ-コレステロールヘミスクシネート
HisChol ヒスタミニル-コレステロールヘミスクシネート
HCChol Nα’-ヒスチジニル−コレステロールカルバメート
HistChol Nα’-ヒスチジニル-コレステロール-ヘミスクシネート
AC アシルカルノシン、ステアリル−およびパルミトイルカルノシン
HistSuccDG 1,2-ジパルミトイルグリセリン-ヘミスクシネート-Nα-ヒスチジニル-ヘミスクシネート、およびジステアロイル-、ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル−オレオイル誘導体
IsoHistSuccDG 1,2-ジパルミトイルグリセリン-Oα-ヒスチジニル-Nα-ヘミスクシネート、およびジステアロイル-、ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル-オレオイル誘導体
DGSucc 1,2-ジパルミトイルグリセリン-3-ヘミスクシネートおよびジステアロイル-、ジミリストイル-ジオレオイルまたはパルミトイル-オレオイル誘導体
【実施例１】
【００３１】
両性リポソームの製造
表１に挙げた脂質の混合物を、記載されたモル比でクロロホルムに溶解し、続いてロータリーエバポレーター中、真空で完全に乾固する。
【００３２】
脂質膜に、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５を加え、その結果１００ｍＭけんだく液を生じる。続いてこのけんだく液を５０℃の水浴中で回転しながら４５分間水和し、さらに５分間超音波槽で処理する。その後、溶液を冷凍する。
【００３３】
解凍後、リポソームを孔径４００ｎｍの膜を通じて繰り返し押し出す。
【００３４】
ＣＦ（カルボキシフルオレスセイン）充填リポソーム
製造は先出のものと同様に行うが、ただし脂質膜の水和の際、後述の色素溶液を使用する：５００ｍｇのＣＦを１３０μｌの５ＭＮａＣｌ、１２．５ｍｌの１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５および６３０μｌの５ＮＮａＯＨに溶解する。ｐＨ値を調整し、必要に応じて（ｐＨ７．５に)追加処理する。
【００３５】
封入されなかったＣＦの分離はゲルろ過で行う。
【実施例２】
【００３６】
両性リポソーム中へのＣｙ５．５アンチＣＤ４０ＯＤＮ（蛍光標識したアンチセンスオリゴヌクレオチド）の封入
ＤＭＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＧ−Ｓｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０（モル％）の脂質混合物を５０℃でクロロホルムに溶解し、続いてロータリーエバポレーター中、真空で完全に乾固する。
【００３７】
脂質膜に、Ｃｙ５．５アンチＣＤ４０ＯＤＮ（アンチセンスオリゴヌクレオチド）（１０ｍＭ酢酸Ｎａ、３００ｍＭしょ糖、ｐＨ４．５中１５０μｇ／ｍｌ）を加え、その結果１５ｍＭけんだく液を生じる。続いてこのけんだく液を５０℃の水浴中で撹拌しながら４５分間水和し、さらに５分間超音波槽で処理する。その後、溶液を冷凍する。ついで凍結解凍を３回行い、その際、解凍後毎回５分間超音波槽で処理する。
【００３８】
最後の解凍後、リポソームを孔径２００ｎｍまたは４００ｎｍの膜を通じて繰り返し押し出す（アベスチン社リポソファスト、孔経２００ｎｍまたは４００ｎｍのポリカーボネート膜）。押し出し後、１モル／リットルのＨＥＰＥＳ原液を加えてｐＨを７．５に調節する。
【００３９】
封入されたＣｙ５．５アンチＣＤ４０ＯＤＮ（アンチセンスオリゴヌクレオチド）の割合は、６００００×ｇ、４５分間の超遠心による沈降を３回行って遊離で存在する作用物質を分離後、蛍光スペクトル法で調べる。
【００４０】
オリゴヌクレオチドの封入効率は、脂質およびＯＤＮの物質投入量に対する脂質含量の測定値および蛍光法によるＣｙ５．５の測定値の比率により調べて、製剤につき５３％の結果を得る。
【実施例３】
【００４１】
血清安定性の測定
作用物質モデルとして、オリゴヌクレオチドと同様に生理的ｐＨで陰性荷電する、カルボキシフルオレスセイン（ＣＦ）を使用する。ＣＦを充填したリポソームの安定性は３７℃で合計２４時間の期間観察する。その際、リポソームからのＣＦの遊離を経時的に蛍光測定で観察する。３種の異なるリポソーム製剤を９６ウエルプレートごとに試験することができる。ＣＦに関する遊離量パーセントの測定のため、緩衝液中でインキュベートした試料を直接（基底値）およびトリトンを添加してリポソームを破壊した後（トリトン値または１００％値）に行う。
【００４２】
滅菌血清および１ｍＭリポソームを混合して５００μｌの合計量にする。同じような添加物を対照として血清の代わりに緩衝液を用いてつくる。
【００４３】
９６ウエルプレートを次のように各試料名について準備する：１列のウエル中、穴１，３，５，７，９および１１は各５μｌの緩衝液（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を入れる。穴２，４，６，８，１０および１２は各５μｌの１０％トリトンＸ-１００を入れる。
【００４４】
９６ウエルプレートを図２に示すように割り当てる。穴１−６にはそれぞれ５μｌの緩衝液中でインキュベートしたリポソームを入れ、穴７−１２には血清中でインキュベートしたものを入れる。５μｌの試料プラス５μｌの緩衝液またはトリトンに２９０μｌの緩衝液を加える。それぞれの場合に再び基底値およびトリトン値を得る。このようにして、プレート当たり３製剤を８期間にわたり試験することができる。時点は下記の通りである：ゼロ、ゼロ、１５分、３０分、１時間、３時間、５時間、２４時間。
【００４５】
蛍光の測定には、４８５／５３０ｎｍフィルターをもつプレートリーダーを使用する。測定した蛍光データから、相対的蛍光値が得られ、そのうちトリトン値が１００％遊離に相当する。表１は、一連の試験した製剤を示す。それは、この発明により構成したものだけが高い血清安定性を有することを示す。
【実施例４】
【００４６】
ＦＩＴＣ−ＯＤＮ（蛍光標識したアンチセンスＤＮＡ）の封入
使用したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は、５’末端にＦＩＴＣ標識をもつ１８マーホスホロチオエート（フルオレスセインイソチオシアネート）である。ＦＩＴＣ−ＯＤＮをもつリポソームを製造した：９μｇのＯＤＮを含む０．５ｍｌの１ｍＭ脂質溶液。アニオン性ＯＤＮ電荷に対するカチオン性脂質電荷の異なるモル比３：１および４，５：１をもつ２種の調合物。
・それぞれＤＰＰＣ／ＤＯＴＡＰ／ＤＧ−Ｓｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝２０：１０：３０：４０
・水和ないしＯＣＮ溶液：１０ｍＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５、３００ｍＭしょ糖
・封入されなかったＯＤＮの分離には、リポソームをＨｅｐ１０、ＮａＣｌ１５０中に０、０．８および１．２Ｍしょ糖をもつ不連続しょ糖勾配中でフローテーションする（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ）。
【００４７】
測定したＦＩＴＣ−ＯＤＮ蛍光（１００％）ないしは入力値の合計からのＦＩＴＣ-ＯＤＮに対する組み込みの測定値およびそれから導かれる遊離対組み込み蛍光の比率：
【００４８】
【表３】
【実施例５】
【００４９】
両性リポソームへのｓｉＲＮＡ（アンチＧＦＰ）の封入
アニオン性ｓｉＲＮＡに対するカチオン性脂質の荷電比として５：１ないし１０：１を選ぶ。ｓｉＲＮＡ（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２中）を水和緩衝液（１０ｍＭ酢酸Ｎａ、１０ｍＭＮａＣｌ、２８０ｍＭしょ糖、ｐＨ４．５）と混合し、脂質膜に加え、その結果５−１０ｍＭ脂質けんだく液が生じる。脂質を超音波処理してフラスコ壁から除く（最大１０分間）。水和は室温（担体脂質ＰＯＰＣ）または５０℃（担体脂質ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ）で、１５分間である。ついで、少なくとも３回、−７０℃（１ｍｌ容量に対して１０分間、１５ｍｌまでの容量に対して３０分間）冷凍、水浴中再解凍を行う（温度は水和と同様）。
【００５０】
フラスコを解凍し、容量が大きなときは溶液３ｍｌを採る（８ｍｌガラス管中）。残りの混合物を再び−７０℃で冷凍する。１００ｎｍフィルターを通して押出を行う。続いて１／１０容量の１ＭＨｅｐｅｓでｐＨ値をｐＨ８．０に調節する。
【００５１】
リポソームのフローテーション
リポソームフラクションに同容量のＨ２Ｏ中２．４Ｍしょ糖を加える（したがって、１．２Ｍ溶液を生じる）。勾配に、緩衝液（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）、その下に緩衝液中０．８Ｍしょ糖、最下段にＨ２Ｏ中１．２Ｍしょ糖にリポソームを入れたものを積層する。勾配の容量は最大４．５ｍｌになる。フローテーションは、超遠心機中、室温で４５分間５０，０００ｒｐｍで行う。０．８Ｍしょ糖と緩衝液層の間に見出されるリポソームをとる。
【００５２】
リボグリーンＲＮＡ定量試薬によるＲＮＡ定量分析
アッセイは、最終容量２００μｌで実施する。最初、１ｎｇと１０ｎｇの間のｓｉＲＮＡ（１０−１００μｌの１００ｎｇ／ｍｌｓｉＲＮＡ）の標準系列を調製する。
【００５３】
リボグリーンはＴＥ緩衝液中で１：２０００に希釈する。各混合物に１００μｌのリボグリーンを加え、ついで室温で５分間インキュベートし、４８５／５２０ｎｍで蛍光を測定する。混合物に各４μｌの１０％トリトン（最終濃度０．２ｍＭ）を加える。この検量線は後でリポソームに封入されたｓｉＲＮＡ量の定量に用いることができる。約１５分後、さらに一度蛍光を測定する。結果をグラフとして図に記入（それぞれトリトンありおよびなしの曲線）し、数値から標準直線とそれに関する方程式を作成する。
【００５４】
リポソームを２種の異なる濃度（例えば１：５０および１：１００）に希釈し、トリトンなしおよびありの希釈液２−３種の異なる容量（例えば希釈液５、１０および１５μｌに１００μｌのＴＥプラス１００μｌのリボグリーン試薬を加える）について測定する。
【００５５】
製剤中のｓｉＲＮＡ濃度の算出値は、別の測定値とほぼ一致するに違いない。違う場合には、ｓｉＲＮＡ量が検量線の外にあり、この値を濃度の計算に入れてはならない。ｓｉＲＮＡが種々の製剤に封入される効率は、表２に示すことができる。
【００５６】
【表４】
【００５７】
ｓｉＲＮＡ含有リポソームの血清中における試験
修飾されていないｓｉＲＮＡは血清中で極めて急速に分解される。ｓｉＲＮＡに対するリポソームの保護効果を調査するため、下記のように行う。
【００５８】
封入ｓｉＲＮＡの濃度を血清試験の前に定量する。各試験の時点において、それぞれの時点当たり４μｇのｓｉＲＮＡを入れたリポソームを用いる。試験された時点はゼロ、１時間、２時間および４時間である。
【００５９】
４μｇのｓｉＲＮＡを内部に組み込んだリポソームをリポソーム（通常１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を含む緩衝液で６０μｌ容量に希釈する。。混合物に６０μｌの血清を加え、上記の時点まで３７℃でインキュベートする。ゼロ時点は別に定量する。
【００６０】
血清成分と脂質をｓｉＲＮＡから良好に分離するために、フェノール／クロロホルム抽出をＰＬＧ−Ｅｐｐｉｓ（フェーズ・ロック・ゲル・エッペンドルフ試験管）で実施する。ＰＬＧ−Ｅｐｐｉｓは１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、氷上に置く（以下では最高４℃で作業する）。ＰＬＧ−Ｅｐｐｉｓに２８０μｌの（上記のような）緩衝液と４５μｌの５ＭＮａＣｌを加える。
【００６１】
この溶液に血清中（１２０μｌ）のリポソーム混合物を加える。そのあと直ぐに３００μｌのフェノール／クロロホルム混合物を添加する。ゼロ値についてはＰＬＧ−Ｅｐｐｉ中のＮａＣｌと緩衝液に６０μｌの血清を加える。全てを、直ちに混合する。
【００６２】
１３０００ｒｐｍ、４℃、１０分間の遠心を行う。水層には遊離ｓｉＲＮＡを含有する。勾配にさらに３００μｌのクロロホルムを加え、短時間混合する。さらに上記の様に遠心後、水層は透明であり、可能な限り充分に除去することができる。ここでｓｉＲＮＡは水層から沈降させる。ｓｉＲＮＡ溶液に１／１０容量の３ＭＮａＯＡｃ、ｐＨ５．２および２．５容量部のエタノールを加える。溶液をよく混合し、ｓｉＲＮＡを−７０℃で１時間沈降させる。さらに４℃、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心する。ｓｉＲＮＡはペレット化される。上澄を充分分離し、ペレットを７０％エタノール２００μｌで洗浄し、約１０分間乾燥する。ｓｉＲＮＡを５μｌの水に再溶解する。
【００６３】
ｓｉＲＮＡの品質は変性状態および出来得れば未変性のアクリルアミドゲルで検査する。
【００６４】
未変性アクリルアミドゲル中におけるｓｉＲＮＡ二本鎖性の証明
ｓｉＲＮＡの品質は、一本鎖完全長および二本鎖性により特徴づけられる。二本鎖ｓｉＲＮＡは一本鎖のものより未変性アクリルアミドゲル中ゆっくり移動するので、未変性アクリルアミドを用いてｓｉＲＮＡの二本鎖性を検査することができる。
【００６５】
ゲルは、必要な温度にするため、ＴＢＥ緩衝液で３０分間予備処理（８０Ｖ、１００ｍＡ）する。
【００６６】
ゲルが過負荷されないように、スロット当たり最高２μｇのｓｉＲＮＡを塗布する。合計容量９μｌの試料をとる。それに１μｌのブルージュース荷電緩衝液を加える。試料を予備処理したゲルに塗布し，１００ｍＡで１時間分離させる。
ゲルの染色：
ゲルを電気泳動後装置から取り出す。ゲルに約２００ｍｌのステインオール溶液（２０ｍｌの原液、１８０ｍｌのホルムアミド、２００ｍｌの水 を加える。ゲルを暗所でステインオール溶液中３０−６０分間染色する。その後、溶液をゲルから除去し、ゲルを明所で水中に入れて脱色する（光の強さに応じて約３０分−２時間）。ｓｉＲＮＡは染色されたままであり、それに対してバックグラウンドは完全に脱色されている。
【実施例６】
【００６７】
Ｃｙ３−ＢＣＬ２アンチセンスをもつ両性リポソームのＨｅｐＧ２細胞へのインビトロでの取り込み
ＨｅｐＧ２細胞はトランスフェクションの２日前に９６ウエルプレートに接種し、トランスフェクションの日に細胞密度が６０-８０％となるようにする（１００μｌ中に０．０２−０．２×１０５、i.d.R.１×１０４）。２個のプレート（遠心および対照インキュベーション）を用意し、これらはほかの点では同じように処理する。
【００６８】
トランスフェクション
遠心分離機（バイオフュージ・ストラトス、ヘレウス社）、マイクロタイタープレート用ローターＮＯ．３０４８を予備加熱する。Ｃｙ３−Ｂｃｌ２アンチセンス含有リポソームを１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＨＢＳ）で一定濃度に調節する（Ｃｙ−３は赤色の蛍光を出すマーカーである）。
【００６９】
リポソーム希釈液（充填物ありおよびなし）ならびに市販の対照トランスフェクション試薬（例えばリポフェクタミン２０００、オリゴフェクタミン、ｓｉポートアミン、ｓｉポートリピッド）からのトランスフェクション混合物の、無血清媒地（約１６０ｎｇアンチセンス／ウエル）を用いた９６ウエルウエルプレートでの製造。リポソーム希釈液は２５−５０μｌ容量で細胞に対して加える。
【００７０】
リポソーム希釈液を２５μｌ中に上記量のアンチセンス／ウエルを含むようにつくる場合、細胞を無血清培地で洗浄し（１回）、血清含有または無血清培地を例えば各ウエルに７５μｌ入れる。
【００７１】
マルチウエルプレートを１，５００ｒｐｍ（３４２ｇ）、１時間、３７℃で遠心分離し、対照プレートを１時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）する。続いて、２つのプレートを３時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）する。
【００７２】
全てのウエルから培地を完全に除去し、ＰＢＳで１回洗浄し、血清含有培地で２回洗浄する；全てのウエルに血清含有培地の添加、生存率について顕微鏡でチェック、続いて両プレートを一夜インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）する。
【００７３】
トランスフェクションの翌日、細胞中のリポソーム取り込みを蛍光顕微鏡で調べる。図３に細胞局在化のための位相差写真と蛍光写真とを示す。
【実施例７】
【００７４】
コレステロールおよび／またはマトリックス脂質なしおよびありの両性リポソームの血清安定性測定
両性リポソーム中へのＦＩＴＣデキストランの封入
１５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣデキストランを用いて下記の製剤を作成した（Hafez IM, Ansell S, Cullis PR : カチオン性およびアニオン性脂質から構成した調節できるｐＨ感受性リポソーム(Tunable pHsensitive liposomes composed of mixtures of cationic and anionic lipids) Biophys J. 2000 Sep; 79 (3): 1438-46.）の場合と同様、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ３．９（ＨＡｃ）中で調整）。
【００７５】
E1 DC-Chol/DOPA(66/34)
E2 DC-Chol/DOPA/Chol(40/20/40)
E3 DMPC/DC-Chol/DOPA(60/27/13)
E4 DMPC/DC-Chol/DOPA/Chol(20/27/13/40)
E5 DMPC/DC-Chol/DOPA/Chol(30/20/10/40)
E6 DMPC/DC-Chol/DOPA/Chol(40/13/7/40)
外側のＦＩＴＣデキストランを分離するため、リポソームを押し出し後フローテーションさせた。ｐＨ３．９（１０ｍＭＨｅｐｅｓ1５０ｍＭＮａＣｌ、ＨＡｃ）またはｐＨ９．０（１０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ）において、ゼータサイザーで下記のデータを測定した。
【００７６】
【表５】
【００７７】
血清中におけるＦＩＴＣデキストラン含有リポソームの試験
ヒト血清中におけるこの製剤の安定性を試験するため、ヒト血清中において〜１ｍＭのリポソームを３７℃で３時間インキュベートし、その後フローテーションさせた。非フローテーション試料中並びにフローテーション試料の下層（血清層）において蛍光を定量し、それから充填物の放出を計算した。試験開始時に対する外側のＦＩＴＣデキストランの比率は、ｐＨ３．９の緩衝液中の上記希釈と続くフローテーションにより同様の方法で測定した。
【００７８】
【表６】
【００７９】
４０％コレステロールもマトリックス脂質も含有するすべての製剤（Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６）は、コレステロールのみ（Ｅ２）またはマトリックス脂質のみ（Ｅ３）を含有または両者を含有しない（Ｅ１）製剤よりも安定である。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】脂質の化学式である。
【図２】血清安定性試験のための９６ウエルマイクロタイタープレートにおける配置であり、蛍光マーカーＣＦの遊離化が測定される。
【図３】細胞局在化のための蛍光顕微鏡写真と、その横に位相差顕微鏡写真を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームが
・１０−６０モル％の膜割合の中性脂質と、
・３０−５０モル％の割合のコレステロールと、
帯電性脂質として、
・５−３０モル％の割合の両性脂質か、または
・最大５０モル％の合計割合のカチオン性およびアニオン性脂質の混合物と、
少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなる作用物質と、
を有することを特徴とする、水性の内部空間中に少なくとも一つの作用物質を有する血清に安定な両性リポソーム製剤。
【請求項２】
コレステロールが３５−４５モル％の割合、両性脂質が５−２０モル％の割合、および／または前記混合物が１５−４５モル％の割合を示す請求項1に記載のリポソーム製剤。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが５−１００個、好ましくは５−４０個、特に好ましくは１０−２５個のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの化学修飾された誘導体から構成されている請求項1又は２に記載のリポソーム製剤。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが、一本鎖として、二本鎖として、または複合折りたたみ体で存在する請求項1乃至３の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項５】
一本鎖がアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、二本鎖が短い干渉ＲＮＡおよび／またはデコイオリゴヌクレオチドとして、および／または複合折りたたみ体がアプタマーおよび／またはスピーゲルマーとして、存在する請求項４に記載のリポソーム製剤。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドがアプタマーである請求項1乃至５の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドがスピーゲルマーである請求項1乃至６の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項８】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＰＳ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項９】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＡＣ／Ｃｈｏｌ＝５０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１０】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＰＰＳ／Ｃｈｏｌ＝３５：１０：１５：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１１】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＩｓｏｈｉｓｔｓｕｃｃＤＧ／Ｃｈｏｌ＝５０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１２】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＭＯＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝３５：１０：１５：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１３】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１４】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝３５：１０：１５：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１５】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ／Ｃｈｏｌ＝５０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１６】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＰＰＳ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１７】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＤＯＴＡＰ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝２０：１０：３０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１８】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＨｉｓｔＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ＝５０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１９】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ／Ｃｈｏｌ＝４０：２０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２０】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝２０：１０：３０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２１】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＨｃＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２２】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＨｃＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２３】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＨｉｓｔＰＳ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２４】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＨｉｓｔＰＳ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２５】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＡＣ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２６】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＡＣ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２７】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＨｉｓｔＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２８】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＨｉｓｔＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至５の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２９】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝２０：１０：３０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３０】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３１】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＩｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３２】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３３】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＩｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３４】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝２０：１０：３０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３５】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３６】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＨｉｓｔＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ＝５０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３７】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｅｍｓ／Ｃｈｏｌ＝３０：１０：２０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３８】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＨｉｓｔＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３９】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＨｉｓｔＣｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項４０】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項４１】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝３０：２０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項４２】
哺乳類の治療的処置のための医薬の製造における前記請求項１に記載のリポソーム製剤の使用。
【請求項４３】
哺乳類がヒトである請求項１に記載のリポソーム製剤の使用。
【請求項４４】
非経口適用、好ましくは静脈内適用のための、請求項４２または４３に記載のリポソーム製剤の使用。
【請求項４５】
一種またはそれ以上の作用物質を含有することを特徴とする、請求項1乃至４１の何れか組成１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１】
リポソームが
・１０−６０モル％の膜割合の中性脂質と、
・３０−５０モル％の割合のコレステロールと、
帯電性脂質として、
・５−３０モル％の割合の両性脂質か、または
・最大５０モル％の合計割合のカチオン性およびアニオン性脂質の混合物と、
少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなる作用物質と、
を有することを特徴とする、水性の内部空間中に少なくとも一つの作用物質を有する血清に安定な両性リポソーム製剤。
【請求項２】
コレステロールが３５−４５モル％の割合、両性脂質が５−２０モル％の割合、および／または前記混合物が１５−４５モル％の割合を示す請求項1に記載のリポソーム製剤。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが５−１００個、好ましくは５−４０個、特に好ましくは１０−２５個のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの化学修飾された誘導体から構成されている請求項1又は２に記載のリポソーム製剤。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが、一本鎖として、二本鎖として、または複合折りたたみ体で存在する請求項1乃至３の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項５】
一本鎖がアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、二本鎖が短い干渉ＲＮＡおよび／またはデコイオリゴヌクレオチドとして、および／または複合折りたたみ体がアプタマーおよび／またはスピーゲルマーとして、存在する請求項４に記載のリポソーム製剤。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドがアプタマーである請求項1乃至５の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドがスピーゲルマーである請求項1乃至６の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項８】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＰＳ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項９】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＡＣ／Ｃｈｏｌ＝５０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１０】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＰＰＳ／Ｃｈｏｌ＝３５：１０：１５：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１１】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＩｓｏｈｉｓｔｓｕｃｃＤＧ／Ｃｈｏｌ＝５０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１２】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＭＯＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝３５：１０：１５：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１３】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１４】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝３５：１０：１５：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１５】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ／Ｃｈｏｌ＝５０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１６】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＰＰＳ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１７】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＤＯＴＡＰ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝２０：１０：３０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１８】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＨｉｓｔＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ＝５０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１９】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ／Ｃｈｏｌ＝４０：２０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２０】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝２０：１０：３０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２１】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＨｃＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２２】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＨｃＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２３】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＨｉｓｔＰＳ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２４】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＨｉｓｔＰＳ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２５】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＡＣ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２６】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＡＣ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２７】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＨｉｓｔＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２８】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＨｉｓｔＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至５の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項２９】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝２０：１０：３０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３０】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３１】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＩｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３２】
リポソーム膜がモル組成ＤＰＰＣ／ＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３３】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＩｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ／Ｃｈｏｌ＝５０：１５：３５を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３４】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝２０：１０：３０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３５】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３６】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＨｉｓｔＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ＝５０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３７】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｅｍｓ／Ｃｈｏｌ＝３０：１０：２０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３８】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＨｉｓｔＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項３９】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＨｉｓｔＣｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項４０】
リポソーム膜がモル組成ＤＭＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ／Ｃｈｏｌ＝４０：１０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項４１】
リポソーム膜がモル組成ＰＯＰＣ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＧＳｕｃｃ／Ｃｈｏｌ＝３０：２０：１０：４０を有する請求項1乃至７の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項４２】
哺乳類の治療的処置のための医薬の製造における前記請求項１に記載のリポソーム製剤の使用。
【請求項４３】
哺乳類がヒトである請求項１に記載のリポソーム製剤の使用。
【請求項４４】
非経口適用、好ましくは静脈内適用のための、請求項４２または４３に記載のリポソーム製剤の使用。
【請求項４５】
一種またはそれ以上の作用物質を含有することを特徴とする、請求項1乃至４１の何れか組成１項に記載のリポソーム製剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５３０４６２（Ｐ２００７−５３０４６２Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０４２５１（Ｐ２００７−５０４２５１）
【出願日】平成１７年３月２９日（２００５．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２００５／０００５８９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９４７８３
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（５０２３１６７１７）ノボソム アーゲー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２９日（２００５．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２００５／０００５８９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９４７８３
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（５０２３１６７１７）ノボソム アーゲー (2)
【Ｆターム（参考）】
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