被検物質の齧歯類発がん性予測方法
【課題】遺伝子発現の差異から短期間で被検物質の齧歯類に対する発がん性を予測する、簡便な発がん性予測方法を提供する。
【解決手段】被検物質溶液を被検群に、その溶媒を対照群に投与する工程と、各群からｍＲＮＡを採取し、特定な配列からなる塩基配列を含む遺伝子から、それぞれ選択される１以上の遺伝子についてｍＲＮＡの発現量を測定する工程と、被検群と対照群の間で前記遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められるかどうかを判定する工程と、被検群と対照群の間でいずれか１の遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が遺伝子毎に予め定められる方向であるときに被検物質に発がん性有りと決定する工程と、を有する被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【解決手段】被検物質溶液を被検群に、その溶媒を対照群に投与する工程と、各群からｍＲＮＡを採取し、特定な配列からなる塩基配列を含む遺伝子から、それぞれ選択される１以上の遺伝子についてｍＲＮＡの発現量を測定する工程と、被検群と対照群の間で前記遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められるかどうかを判定する工程と、被検群と対照群の間でいずれか１の遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が遺伝子毎に予め定められる方向であるときに被検物質に発がん性有りと決定する工程と、を有する被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラット、マウス等の齧歯類に被検物質を投与した後所定の遺伝子から発現するｍＲＮＡの発現量を測定することにより、被検物質の齧歯類に対する発がん性を予測する発がん性予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学物質の有害性（ハザード）の評価項目の一つに長期毒性の評価がある。発がん性などの化学物質の長期毒性を評価するには、多額の費用と長期の試験期間を要する動物実験の実施が必要とされる。
【０００３】
化学物質の発がん性を評価する動物実験では、試験動物に癌が出現するまで、あるいは試験動物が死亡するまで化学物質の連続投与が行われる。癌は長い潜伏期間を経て出現するため、長期にわたる動物実験が必要になる。
【０００４】
一方、近年のゲノム情報に関する技術の著しい発展により、遺伝子レベルで化学物質の有害性評価が行われるようになっている。例えば、特許文献１には、化学物質を曝露した組織や細胞の遺伝子の発現の差異を検出することにより化学物質の毒性作用を予測する方法が記載されている。
【０００５】
化学物質の発がん性の評価においても発がんメカニズムに関与している遺伝子の存在が予想される。これらの遺伝子の発現の差異を検出することにより遺伝子レベルで化学物質の発がん性の評価が可能であると考えられる。しかしながら、化学物質が引き起こす遺伝子レベルでの発がんメカニズムはほとんど解明されていない。従って、遺伝子の発現の差異から化学物質の発がん性の予測を行うことは非常に困難である。
【０００６】
本発明者は、ＤＮＡマイクロアレイを利用してラットの遺伝子の発現情報を包括的に取得し、遺伝子の発現パターンから被検物質の発がん性を予測する方法を見出し、先に特許出願を行った（特許文献２）。
【０００７】
この方法においては、遺伝子発現パターンの類似性により発がん物質群を予め３つのグループに分類する。これら３グループに共通する遺伝子発現パターンと、被検物質の遺伝子発現パターンとを比較し、その一致度から被検物質の発がん性を予測する予測方法である。この方法においては、予め多数の発がん物質の遺伝子発現パターンを取得し、発がん物質のグループ毎に遺伝子発現パターンを準備しておく。次いで、準備したこれらの遺伝子発現パターンと被検物質の遺伝子発現パターンとの一致度を算出する。この一致度の算出をするためには、膨大な数のデータの取得と演算処理を行う必要がある。そのため、より簡便な被検物質の発がん性予測方法の開発が望まれている。
【特許文献１】特開２００３−３０４８８８号公報（特許請求の範囲）
【特許文献２】特開２００７−５４０２２号公報（特許請求の範囲）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、がん発生の初期段階に発がんメカニズムに関与している可能性が高い遺伝子の発現の増減を検出することにより短期間で被検物質の齧歯類に対する発がん性を予測する方法であって、膨大な数のデータの取得や煩雑な計算を必要としない、簡便な発がん性予測方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、３つの発がん物質のグループ毎に各遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量を詳細に検討した。その結果、発がん物質投与群と非発がん物質投与群との間で発現量が異なる遺伝子群が発がん物質のグループ毎に明瞭に存在することを見出した。これらの遺伝子を組み合わせて使用することにより、被検物質の発がん性が予測できることを確認し、本発明を完成するに到った。
【００１０】
即ち、上記課題を解決する本発明は以下に記載するものである。
【００１１】
〔１〕 被検物質を溶媒に溶解又は分散させて調製した被検物質溶液を被検群に、前記被検物質溶液の調製に使用した溶媒を対照群に投与する工程と、
被検物質溶液又は溶媒の各群への投与期間経過後に各群からｍＲＮＡを採取し、下記（Ａ）〜（Ｃ）
（Ａ）配列番号１〜５に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｂ）配列番号６〜８に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｃ）配列番号９〜３２に示す塩基配列を含む遺伝子
からそれぞれ選択される１以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡの発現量を測定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められるかどうかを有意差検定により判定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子のいずれか１の遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつ対照群に対する被検群の当該ｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該ｍＲＮＡを発現させる遺伝子毎に予め定められる方向に増加又は減少しているときに被検物質に発がん性有りと決定する工程と、
を有する被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【００１２】
〔２〕 被検物質を溶媒に溶解又は分散させて調製した被検物質溶液を被検群に、前記被検物質溶液の調製に使用した溶媒を対照群に投与する工程と、
被検物質溶液又は溶媒の各群への投与期間経過後に各群からｍＲＮＡを採取し、下記（Ａ）〜（Ｃ）
（Ａ）配列番号１〜５に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｂ）配列番号６〜８に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｃ）配列番号９〜３２に示す塩基配列を含む遺伝子
からそれぞれ選択される１以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡの発現量を測定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められるかどうかを有意差検定により判定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子のいずれか１の遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつ対照群に対する被検群の当該ｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該ｍＲＮＡを発現させる遺伝子毎に予め定められる方向に増加又は減少しているときに被検物質に発がん性有りと決定し、前記選択された遺伝子のいずれについても被検群と対照群の間でｍＲＮＡの発現量に有意差が認められないとき、又は前記選択された遺伝子のいずれかに有意差が認められる場合であっても対照群に対する被検群の当該遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該遺伝子毎に予め定められる方向でないときに発がん性無しと決定する工程と、
を有する被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【００１３】
〔３〕 被検物質溶液の投与期間が１〜９０日間である〔１〕又は〔２〕に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【００１４】
〔４〕 被検群及び対照群の試験動物が、ラット、マウス、ハムスター、又はモルモットである〔１〕又は〔２〕に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【００１５】
〔５〕 （Ａ）から選ばれる遺伝子が配列番号２に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｂ）から選ばれる遺伝子が配列番号７に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｃ）から選ばれる遺伝子が配列番号１０に示す塩基配列を含む遺伝子である〔１〕又は〔２〕に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【００１６】
〔６〕 被検物質を溶媒に溶解又は分散させて調製した被検物質溶液を被検群に、前記被検物質溶液の調製に使用した溶媒を対照群に投与する工程と、
被検物質溶液又は溶媒の各群への投与期間経過後に各群からｍＲＮＡを採取し、下記（Ａ）〜（Ｃ）
（Ａ）配列番号１〜５に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｂ）配列番号６〜８に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｃ）配列番号９〜３２に示す塩基配列を含む遺伝子
からそれぞれ選択される１以上の遺伝子と、下記（Ｄ）の遺伝子
（Ｄ）配列番号３３に示す塩基配列を含む遺伝子
と、から発現されるｍＲＮＡの発現量を測定する工程と、
被検群と対照群の間で前記遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められるかどうかを有意差検定により判定する工程と、
被検群と対照群の間で前記遺伝子のいずれか１から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつ対照群に対する被検群の当該ｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該ｍＲＮＡを発現させる遺伝子毎に予め定められる方向に増加又は減少しているときに被検物質に発がん性有りと決定する工程と、
を有する被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【００１７】
〔７〕 被検物質溶液の投与期間が１〜９０日間である〔６〕に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【００１８】
〔８〕 （Ａ）から選ばれる遺伝子が配列番号２に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｂ）から選ばれる遺伝子が配列番号７に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｃ）から選ばれる遺伝子が配列番号１０に示す塩基配列を含む遺伝子である〔６〕に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明においては、所定の遺伝子から発現するｍＲＮＡの発現量を測定することによりラット、マウス、ハムスター、モルモット等の齧歯類に対する被検物質の発がん性を予測できる。予測に必要な計算は、被検群と対照群との間のｍＲＮＡの発現量の有意差の計算である。ｍＲＮＡの発現量の比較は３又は４程度の遺伝子について行えばよく、極めて簡単なデータ処理しか必要としない。
【００２０】
齧歯類への被検物質の投与は１〜９０日程度の短期間である。そのため、試験動物に癌が出現するまで化合物の連続投与を行うような長期にわたる動物実験を必要としない。
【００２１】
本発明によれば短期間の試験と簡単なデータ処理により高い精度で被検物質の齧歯類に対する発がん性を予測することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の被検物質の発がん性予測方法は、以下の手順で行う。
【００２３】
まず、被検物質を被検群に投与するために、被検物質を溶媒に溶解、分散させて被検物質溶液を調製する。
【００２４】
本発明において発がん性の予測方法の対象となる被検物質は、任意の化学物質である。その形態は、固体、粉体、液体、又はこれらの混合物のいずれであってもよい。これらは適宜、溶液、分散液の形態にして試験に供される。
【００２５】
被検物質を溶解させる溶媒は、被検物質が溶解又は分散する非発がん性の媒体であれば特に制限することなく使用できる。例えば、トウモロコシ油、精製水等の動物実験に汎用的に使用される溶媒を挙げることができる。分散には、発がん性のない界面活性剤等の分散剤を用いることができる。
【００２６】
被検物質の投与量は、被検物質の刺激により試験動物のｍＲＮＡの発現量に適度な増加又は減少を引き起こす量とすることが望ましい。投与量は、被検物質の試験動物に対するＬＤ５０値を基準に決定することが可能である。１日あたりの投与量は、ＬＤ５０値の１／２５０〜１／２とすることが好ましく、１／５０〜１／２とすることがより好ましく、１／１０〜１／２とすることが更に好ましい。
【００２７】
このように調製した被検物質溶液を被検群に、被検物質溶液の調製に使用した溶媒を対照群に投与する。対照群への溶媒の投与量は、被検群へ投与した被検物質溶液と同量とする。被検群、対照群の試験動物は、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等の齧歯類である。
【００２８】
各群への投与期間は、１〜９０日程度とする。より迅速に試験する観点から、好ましくは１〜２８日、より好ましくは１〜１４日である。投与期間中は、１日１〜数回（好ましくは１日１回）被検物質溶液又は溶媒を反復して投与することが望ましい。
【００２９】
被検物質溶液又は溶媒の試験動物への投与方法は特に制限されず、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与等の汎用的な方法を使用できる。
【００３０】
投与期間の終了後、直ちに被検群と対照群の試験動物から組織を採取する。試験動物の組織からｍＲＮＡを公知の方法により抽出、精製した後、ｍＲＮＡの発現量の測定を行う。
【００３１】
ｍＲＮＡの発現量を測定するために採取する組織としては、肝臓、腸、肺、腎臓、胃、脾臓、脳、血液等がある。
【００３２】
ｍＲＮＡの発現量の測定方法としては、ｍＲＮＡと相補的な配列を有するｃＤＮＡ又はＤＮＡが固定してあるＤＮＡマイクロアレイやマイクロプレートにｍＲＮＡから調製した蛍光標識化ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを結合させる方法、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ等の公知の方法が使用できる。
【００３３】
ＤＮＡマイクロアレイを用いてｍＲＮＡの発現量の測定を行う場合、アレイには、Gene Chip（商品名、アフィメトリクス社製）、Rat Oligo Microarray Kit（商品名、アジレント社製）等の市販品を利用することが可能である。
【００３４】
発現量を測定するｍＲＮＡは、下記（Ａ）〜（Ｃ）の遺伝子から発現しているｍＲＮＡである。
（Ａ）配列番号１〜５に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｂ）配列番号６〜８に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｃ）配列番号９〜３２に示す塩基配列を含む遺伝子
本発明においては、上記（Ａ）〜（Ｃ）からそれぞれ１以上の遺伝子を選択し、選択した遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量を測定する。（Ａ）〜（Ｃ）の各群から選択する遺伝子数は、各群に属する遺伝子数を上限とする１以上の任意の数である。（Ａ）〜（Ｃ）の各群からそれぞれ選択する遺伝子数は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。発がん性の予測の精度を高く維持しつつ操作を簡略化する観点から、（Ａ）〜（Ｃ）から選択する遺伝子数はそれぞれ１〜３程度とすることが好ましく、１又は２とすることがより好ましく、１とすることが最も好ましい。
【００３５】
被検群と対照群の各群について、選択した遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量を測定する。その後、被検群と対照群との間で、測定したｍＲＮＡの発現量の比較を行う。測定したｍＲＮＡの発現量が以下の２つの条件(1)(2)のいずれも満たしている場合に、被検物質に発がん性有りと決定する。
(1)ｍＲＮＡの発現量を測定した遺伝子のうち少なくともいずれか１つから発現しているｍＲＮＡの発現量が、被検群と対照群との間で有意差があること。
(2)(1)でｍＲＮＡの発現量に有意差が見られた遺伝子のうち、少なくともいずれか１つの遺伝子の被検群におけるｍＲＮＡの発現量が、対照群におけるｍＲＮＡの発現量に対し、当該遺伝子毎に定められる方向に増加又は減少していること。
【００３６】
被検群と対照群の間でｍＲＮＡの発現量に有意差があるかどうかの判断は、有意差検定により行う。有意差検定は、t検定、U検定、F検定、Dunnet法、Tukey法、Kruskal-Wallis検定、Wilcoxon検定、Steel-Dwass法等の公知の検定方法を採用することが可能である。
【００３７】
当該遺伝子毎に定められる方向とは、齧歯類に発がん物質を投与したときに各遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量が増加と減少のいずれに変動するかを示す方向である。具体的には下記表１に示す増加又は減少の方向である。
【００３８】
【表１】
【００３９】
本発明者は、多数の発がん物質をそれぞれ齧歯類に投与したときに得られる遺伝子発現パターンは、その類似性により、３つのパターンに分類されることを知得している。３つのパターンに分類される発がん物質のグループは、以下のとおりである。
（グループ１）
2,4-ジアミノトルエン、キノリン、ジエチルニトロサミン、2-ニトロプロパン、N-ニトロソモルホリン、フラン、N-ニトロソジメチルアミン、N-ニトロソピペリジン、2-アセチルアミノフルオレン、2-アミノ-3,8-ジメチルイミダゾ[4,5-f]キノキサリン、メチルカルバメート、チオアセトアミド、ウレタン、アセトアミド、メタピリレン塩酸塩、3'-メチル-4-ジメチルアミノアゾベンゼン、1,4-ジオキサン
（グループ２）
サフロール、クロフィブレート、ジ(2-エチルヘキシル)フタレート、ヘキサクロロベンゼン、α-ヘキサクロロシクロヘキサン、D,L-エチオニン、クロレンド酸、2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ[4,5-b]-ピリジン、7,12-ジメチルベンズ[a]アントラセン、3-メチルコラントレン、4-ニトロキノリン-1-オキサイド、N-エチル-N-ニトロソウレア、ベンゾ[a]ピレン、4-ジメチルアミノアゾベンゼン、アルドリン、アジピン酸ジ(2-エチルヘキシル)、トリクロロエチレン、ブチル化ヒドロキシアニソール、D-リモネン、テトラクロロエチレン、1,4-ジクロロベンゼン、フェニトインナトリウム塩、トリクロロ酢酸
（グループ３)
エチニルエストラジオール、クロロホルム、ベンズ[a]アントラセン、ペンタクロロエタン、ジエチルスチルベストロール、フェノバルビタール
【００４０】
上述した（Ａ）の遺伝子はグループ１の発がん物質を、（Ｂ）の遺伝子はグループ２の発がん物質を、（Ｃ）の遺伝子はグループ３の発がん物質をそれぞれ齧歯類に投与したときに、ｍＲＮＡの発現量が表１に記載する方向に有意に増加又は減少する遺伝子である。（Ａ）〜（Ｃ）の遺伝子は、他のグループの発がん物質や、非発がん物質の投与によっては、ｍＲＮＡの発現量は有意に増減しない。従って、（Ａ）〜（Ｃ）からそれぞれ選択した遺伝子のうち、いずれかから発現しているｍＲＮＡの発現量が表１に示す方向に有意に増加又は減少したときには被検物質は発がん性有りと判定され、かかる遺伝子が１つもない場合には被検物質は発がん性無しと決定される。
【００４１】
上記（Ａ）〜（Ｃ）の遺伝子のうち、特に予測精度が高い組み合わせは、以下に示す配列番号の塩基配列を有する遺伝子から選択される組み合わせである。
【００４２】
（Ａ）配列番号１〜４
（Ｂ）配列番号６，７
（Ｃ）配列番号９、１０、１４、１５、１７、２１、２２、３０、３１、３２
【００４３】
上述した遺伝子から選択される組み合わせの中でも、以下に示す組み合わせがより好ましい。
・（Ａ）配列番号１、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１０
・（Ａ）配列番号３、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１０
・（Ａ）配列番号４、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１０
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号９
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１０
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１４
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１５
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１７
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号２１
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号２２
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号３０
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号３１
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号３２
【００４４】
更に、上述した組み合わせのうち、最も好ましい組み合わせは、（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１０に示す塩基配列を有する３つの遺伝子の組み合わせである。
【００４５】
本発明の他の予測方法として、上述した（Ａ）〜（Ｃ）の遺伝子に加えて、（Ｄ）の遺伝子として配列番号３３に示す塩基配列を含む遺伝子について、発現しているｍＲＮＡの発現量を併せて測定する方法がある。
【００４６】
（Ｄ）の遺伝子は、基本的にはグループ２の発がん物質を齧歯類に投与したときにｍＲＮＡの発現量が減少する遺伝子である。
【００４７】
グループ２の発がん物質は、肝発がん物質とそれ以外の発がん物質との間でｍＲＮＡの発現量に有意差が見られる遺伝子が異なる傾向がある。上述した（Ｂ）の遺伝子は、肝発がん物質以外の発がん物質の投与によってはｍＲＮＡの発現量に有意差が生じない場合がある。そのため、（Ｂ）の遺伝子と（Ｄ）の遺伝子とを併せて用いることにより、グループ２の発がん物質の予測精度が向上する。従って、上述した（Ａ）〜（Ｃ）の遺伝子と（Ｄ）の遺伝子とについてｍＲＮＡの発現量を測定することにより、グループ２のタイプの発がん物質を非発がん物質と誤って判断する場合が少なくなり、発がん性予測の精度がより高いものとなる。
【実施例】
【００４８】
検討例１
表２〜６に示す発がん物質、非発がん物質を、表２〜６に示す溶媒に溶解して試験溶液を調製した。調製した試験溶液と、調製に使用した溶媒を、各群のラットに強制経口投与した。ラットは日本チャールス・リバー社から入手した５週令の雄性ラット（Ｆ３４４、ＳＰＦ系統）を４匹／群に分けて使用した。媒体対照群への溶媒の投与量は、発がん物質投与群又は非発がん物質投与群に投与した試験溶液の容量と同量とした。試験溶液又は溶媒の投与は１日１回とし、２８日間行った。投与開始から２８日経過後にラットの肝臓から断片を切り出し、total RNAを抽出して精製した。自家製のオリゴDNAマイクロアレイ（2007/05/16版UniGeneデータベースに基づくUniGene ID数:6,689、１プローブあたりの遺伝子長さ:60mer）を用いてtotal RNAに含まれる各mRNA量を測定した。
【００４９】
使用した発がん物質、非発がん物質の物質番号、試験溶液の調製に使用した溶媒、ラットへの投与量を表２〜６に示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
【表３】
【００５２】
【表４】
【００５３】
【表５】
【００５４】
【表６】
【００５５】
各化学物質投与群と媒体対照群との間でｍＲＮＡの発現量を比較し、(A)〜(D)に記載する条件を満たす遺伝子をそれぞれ選定した。
【００５６】
（A）表７に示すグループ１の発がん物質（１７物質）のうちの１４物質以上について有意に発現量が変動し、かつ非発がん物質（２６物質）のうち有意に発現量が変動した物質数が８以下である遺伝子
（B）表７に示すグループ２の発がん物質（２３物質）のうちの１３物質以上について有意に発現量が変動し、かつ非発がん物質（２６物質）のうち有意に発現量が変動した物質数が８以下である遺伝子
（C）表７に示すグループ３の発がん物質（６物質）のうちの５物質以上について有意に発現量が変動し、かつ非発がん物質（２６物質）のうち有意に発現量が変動した物質数が８以下である遺伝子
（D）表７に示すグループ２の発がん物質のうち、（B）の遺伝子では発現量が変動していない発がん物質で有意に発現量が変動している遺伝子
【００５７】
【表７】
【００５８】
発がん物質投与群又は非発がん物質投与群と、媒体対照群との間でｍＲＮＡの発現量に有意差があるかどうかの判断は、以下により行った。発がん物質投与群又は非発がん物質投与群におけるｍＲＮＡの発現量が、対照群において発現している対応するｍＲＮＡの発現量に対して1.5倍以上又は1.5分の1以下である場合に有意とした。但し、有意かどうかの判断は発現量の増減の方向を考慮して行った。他の発がん物質を投与した場合と比較して増減の方向が異なるものについては、その変動は有意ではないと判断した。
【００５９】
上記の方法で選定した遺伝子の遺伝子No.、その遺伝子から発現しているmRNAの検出に使用したプローブの塩基配列を示す配列番号、遺伝子のUnigene No.、Unigeneデータベースに記載された遺伝子の塩基配列を示す配列番号、発がん物質を投与したときの発現量の変動方向、発現量が変動した物質数を表８に示す。
【００６０】
【表８】
【００６１】
以下の表９〜１４は、（A）から（D）の条件で選定された各遺伝子が化学物質を投与したときに示す挙動を表したものである。「＋」の場合は、化学物質の投与により媒体対照群との間にｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつ当該遺伝子に定められる方向にｍＲＮＡの発現量が変動したことを示している。「−」の場合は、媒体対照群との間にｍＲＮＡの発現量に有意差が認められなかったか、変動の方向が定められた方向でなかったことを示している。
【００６２】
【表９】
【００６３】
【表１０】
【００６４】
【表１１】
【００６５】
【表１２】
【００６６】
【表１３】
【００６７】
【表１４】
【００６８】
実施例１
検討例１で選定した（Ａ）〜（Ｃ）の遺伝子を使用して、遺伝子の選定に使用した化学物質（トレーニング物質）と、遺伝子の選定に使用しなかった化学物質（検証物質）とについて、発がん性の予測を行った。予測は以下の手順で行った。
【００６９】
（Ａ）〜（Ｃ）からそれぞれ１の遺伝子を選定し、選定した遺伝子について、ｍＲＮＡの発現量を化学物質投与群と媒体対照群の間で比較した。いずれか１の遺伝子についてのｍＲＮＡの発現量が、媒体対照群に比較して有意に増加又は減少し、かつ増加又は減少の方向が表１に記載する方向である場合、その化学物質は発がん性有りと判断し、それ以外の場合は発がん性無しと判断した。
【００７０】
なお、化学物質投与群のｍＲＮＡの発現量が媒体対照群に対して有意に増減しているかどうかは、対照群のｍＲＮＡの発現量に対して1.5倍以上又は1.5分の1以下であるか否かで判断した。
【００７１】
全ての遺伝子の組み合わせについて調べるのは難しいが、以下の結果を得た。最も予測率が高かった遺伝子の組み合わせは、4846/2203/813であった。その他の遺伝子を組み合わせた場合についても、検証物質で６０％以上の予測率であった。
【００７２】
予測に使用した遺伝子No.と、正解した物質数、正解した物質数から算出した予測率を表１５、１６に示す。
【００７３】
【表１５】
【００７４】
【表１６】
【００７５】
実施例２
表７に示す（Ａ）〜（Ｃ）からそれぞれ選択した１の遺伝子と、（Ｄ）の遺伝子を使用して、実施例１と同様に化学物質の発がん性を予測した。全ての組み合わせについて調べるのは難しいが、以下の結果を得た。検証物質で６０％以上の予測率であった。予測に使用した遺伝子と、正解した物質数、正解した物質数から算出した予測率を表１７、１８に示す。
【００７６】
【表１７】
【００７７】
【表１８】
【００７８】
比較例１
実施例１において最も予測率が高かった遺伝子の組み合わせのうち、１種を検討例１で選択されなかった遺伝子に代えて、トレーニング物質、検証物質の発がん性を予測した。結果を表１９に示す。なお、本比較例において実施例１の遺伝子に代えて用いた遺伝子は、検討例１で選択されなかった遺伝子の中から無作為に抽出した遺伝子である。
【００７９】
【表１９】
【００８０】
表１５、１６より、実施例１においては、グループ１の発がん物質の予測率は80％以上であることがわかる。これに対し、No.4846の遺伝子を他の遺伝子に変更した比較例１では、表１９から明らかなように、グループ１の発がん物質の予測率は29.4％であった。同様に、No.2203の遺伝子を他の遺伝子に変更した場合にはグループ２の発がん物質の予測率が、No.813を他の遺伝子に変更した場合にはグループ３の発がん物質の予測率が大きく低下した。
【００８１】
また、実施例１では、発がん性検証物質の予測率が６０〜１００％であったのに対し、比較例１では３０〜５０％であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラット、マウス等の齧歯類に被検物質を投与した後所定の遺伝子から発現するｍＲＮＡの発現量を測定することにより、被検物質の齧歯類に対する発がん性を予測する発がん性予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学物質の有害性（ハザード）の評価項目の一つに長期毒性の評価がある。発がん性などの化学物質の長期毒性を評価するには、多額の費用と長期の試験期間を要する動物実験の実施が必要とされる。
【０００３】
化学物質の発がん性を評価する動物実験では、試験動物に癌が出現するまで、あるいは試験動物が死亡するまで化学物質の連続投与が行われる。癌は長い潜伏期間を経て出現するため、長期にわたる動物実験が必要になる。
【０００４】
一方、近年のゲノム情報に関する技術の著しい発展により、遺伝子レベルで化学物質の有害性評価が行われるようになっている。例えば、特許文献１には、化学物質を曝露した組織や細胞の遺伝子の発現の差異を検出することにより化学物質の毒性作用を予測する方法が記載されている。
【０００５】
化学物質の発がん性の評価においても発がんメカニズムに関与している遺伝子の存在が予想される。これらの遺伝子の発現の差異を検出することにより遺伝子レベルで化学物質の発がん性の評価が可能であると考えられる。しかしながら、化学物質が引き起こす遺伝子レベルでの発がんメカニズムはほとんど解明されていない。従って、遺伝子の発現の差異から化学物質の発がん性の予測を行うことは非常に困難である。
【０００６】
本発明者は、ＤＮＡマイクロアレイを利用してラットの遺伝子の発現情報を包括的に取得し、遺伝子の発現パターンから被検物質の発がん性を予測する方法を見出し、先に特許出願を行った（特許文献２）。
【０００７】
この方法においては、遺伝子発現パターンの類似性により発がん物質群を予め３つのグループに分類する。これら３グループに共通する遺伝子発現パターンと、被検物質の遺伝子発現パターンとを比較し、その一致度から被検物質の発がん性を予測する予測方法である。この方法においては、予め多数の発がん物質の遺伝子発現パターンを取得し、発がん物質のグループ毎に遺伝子発現パターンを準備しておく。次いで、準備したこれらの遺伝子発現パターンと被検物質の遺伝子発現パターンとの一致度を算出する。この一致度の算出をするためには、膨大な数のデータの取得と演算処理を行う必要がある。そのため、より簡便な被検物質の発がん性予測方法の開発が望まれている。
【特許文献１】特開２００３−３０４８８８号公報（特許請求の範囲）
【特許文献２】特開２００７−５４０２２号公報（特許請求の範囲）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、がん発生の初期段階に発がんメカニズムに関与している可能性が高い遺伝子の発現の増減を検出することにより短期間で被検物質の齧歯類に対する発がん性を予測する方法であって、膨大な数のデータの取得や煩雑な計算を必要としない、簡便な発がん性予測方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、３つの発がん物質のグループ毎に各遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量を詳細に検討した。その結果、発がん物質投与群と非発がん物質投与群との間で発現量が異なる遺伝子群が発がん物質のグループ毎に明瞭に存在することを見出した。これらの遺伝子を組み合わせて使用することにより、被検物質の発がん性が予測できることを確認し、本発明を完成するに到った。
【００１０】
即ち、上記課題を解決する本発明は以下に記載するものである。
【００１１】
〔１〕 被検物質を溶媒に溶解又は分散させて調製した被検物質溶液を被検群に、前記被検物質溶液の調製に使用した溶媒を対照群に投与する工程と、
被検物質溶液又は溶媒の各群への投与期間経過後に各群からｍＲＮＡを採取し、下記（Ａ）〜（Ｃ）
（Ａ）配列番号１〜５に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｂ）配列番号６〜８に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｃ）配列番号９〜３２に示す塩基配列を含む遺伝子
からそれぞれ選択される１以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡの発現量を測定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められるかどうかを有意差検定により判定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子のいずれか１の遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつ対照群に対する被検群の当該ｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該ｍＲＮＡを発現させる遺伝子毎に予め定められる方向に増加又は減少しているときに被検物質に発がん性有りと決定する工程と、
を有する被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【００１２】
〔２〕 被検物質を溶媒に溶解又は分散させて調製した被検物質溶液を被検群に、前記被検物質溶液の調製に使用した溶媒を対照群に投与する工程と、
被検物質溶液又は溶媒の各群への投与期間経過後に各群からｍＲＮＡを採取し、下記（Ａ）〜（Ｃ）
（Ａ）配列番号１〜５に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｂ）配列番号６〜８に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｃ）配列番号９〜３２に示す塩基配列を含む遺伝子
からそれぞれ選択される１以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡの発現量を測定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められるかどうかを有意差検定により判定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子のいずれか１の遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつ対照群に対する被検群の当該ｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該ｍＲＮＡを発現させる遺伝子毎に予め定められる方向に増加又は減少しているときに被検物質に発がん性有りと決定し、前記選択された遺伝子のいずれについても被検群と対照群の間でｍＲＮＡの発現量に有意差が認められないとき、又は前記選択された遺伝子のいずれかに有意差が認められる場合であっても対照群に対する被検群の当該遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該遺伝子毎に予め定められる方向でないときに発がん性無しと決定する工程と、
を有する被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【００１３】
〔３〕 被検物質溶液の投与期間が１〜９０日間である〔１〕又は〔２〕に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【００１４】
〔４〕 被検群及び対照群の試験動物が、ラット、マウス、ハムスター、又はモルモットである〔１〕又は〔２〕に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【００１５】
〔５〕 （Ａ）から選ばれる遺伝子が配列番号２に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｂ）から選ばれる遺伝子が配列番号７に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｃ）から選ばれる遺伝子が配列番号１０に示す塩基配列を含む遺伝子である〔１〕又は〔２〕に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【００１６】
〔６〕 被検物質を溶媒に溶解又は分散させて調製した被検物質溶液を被検群に、前記被検物質溶液の調製に使用した溶媒を対照群に投与する工程と、
被検物質溶液又は溶媒の各群への投与期間経過後に各群からｍＲＮＡを採取し、下記（Ａ）〜（Ｃ）
（Ａ）配列番号１〜５に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｂ）配列番号６〜８に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｃ）配列番号９〜３２に示す塩基配列を含む遺伝子
からそれぞれ選択される１以上の遺伝子と、下記（Ｄ）の遺伝子
（Ｄ）配列番号３３に示す塩基配列を含む遺伝子
と、から発現されるｍＲＮＡの発現量を測定する工程と、
被検群と対照群の間で前記遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められるかどうかを有意差検定により判定する工程と、
被検群と対照群の間で前記遺伝子のいずれか１から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつ対照群に対する被検群の当該ｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該ｍＲＮＡを発現させる遺伝子毎に予め定められる方向に増加又は減少しているときに被検物質に発がん性有りと決定する工程と、
を有する被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【００１７】
〔７〕 被検物質溶液の投与期間が１〜９０日間である〔６〕に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【００１８】
〔８〕 （Ａ）から選ばれる遺伝子が配列番号２に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｂ）から選ばれる遺伝子が配列番号７に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｃ）から選ばれる遺伝子が配列番号１０に示す塩基配列を含む遺伝子である〔６〕に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明においては、所定の遺伝子から発現するｍＲＮＡの発現量を測定することによりラット、マウス、ハムスター、モルモット等の齧歯類に対する被検物質の発がん性を予測できる。予測に必要な計算は、被検群と対照群との間のｍＲＮＡの発現量の有意差の計算である。ｍＲＮＡの発現量の比較は３又は４程度の遺伝子について行えばよく、極めて簡単なデータ処理しか必要としない。
【００２０】
齧歯類への被検物質の投与は１〜９０日程度の短期間である。そのため、試験動物に癌が出現するまで化合物の連続投与を行うような長期にわたる動物実験を必要としない。
【００２１】
本発明によれば短期間の試験と簡単なデータ処理により高い精度で被検物質の齧歯類に対する発がん性を予測することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の被検物質の発がん性予測方法は、以下の手順で行う。
【００２３】
まず、被検物質を被検群に投与するために、被検物質を溶媒に溶解、分散させて被検物質溶液を調製する。
【００２４】
本発明において発がん性の予測方法の対象となる被検物質は、任意の化学物質である。その形態は、固体、粉体、液体、又はこれらの混合物のいずれであってもよい。これらは適宜、溶液、分散液の形態にして試験に供される。
【００２５】
被検物質を溶解させる溶媒は、被検物質が溶解又は分散する非発がん性の媒体であれば特に制限することなく使用できる。例えば、トウモロコシ油、精製水等の動物実験に汎用的に使用される溶媒を挙げることができる。分散には、発がん性のない界面活性剤等の分散剤を用いることができる。
【００２６】
被検物質の投与量は、被検物質の刺激により試験動物のｍＲＮＡの発現量に適度な増加又は減少を引き起こす量とすることが望ましい。投与量は、被検物質の試験動物に対するＬＤ５０値を基準に決定することが可能である。１日あたりの投与量は、ＬＤ５０値の１／２５０〜１／２とすることが好ましく、１／５０〜１／２とすることがより好ましく、１／１０〜１／２とすることが更に好ましい。
【００２７】
このように調製した被検物質溶液を被検群に、被検物質溶液の調製に使用した溶媒を対照群に投与する。対照群への溶媒の投与量は、被検群へ投与した被検物質溶液と同量とする。被検群、対照群の試験動物は、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等の齧歯類である。
【００２８】
各群への投与期間は、１〜９０日程度とする。より迅速に試験する観点から、好ましくは１〜２８日、より好ましくは１〜１４日である。投与期間中は、１日１〜数回（好ましくは１日１回）被検物質溶液又は溶媒を反復して投与することが望ましい。
【００２９】
被検物質溶液又は溶媒の試験動物への投与方法は特に制限されず、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与等の汎用的な方法を使用できる。
【００３０】
投与期間の終了後、直ちに被検群と対照群の試験動物から組織を採取する。試験動物の組織からｍＲＮＡを公知の方法により抽出、精製した後、ｍＲＮＡの発現量の測定を行う。
【００３１】
ｍＲＮＡの発現量を測定するために採取する組織としては、肝臓、腸、肺、腎臓、胃、脾臓、脳、血液等がある。
【００３２】
ｍＲＮＡの発現量の測定方法としては、ｍＲＮＡと相補的な配列を有するｃＤＮＡ又はＤＮＡが固定してあるＤＮＡマイクロアレイやマイクロプレートにｍＲＮＡから調製した蛍光標識化ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを結合させる方法、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ等の公知の方法が使用できる。
【００３３】
ＤＮＡマイクロアレイを用いてｍＲＮＡの発現量の測定を行う場合、アレイには、Gene Chip（商品名、アフィメトリクス社製）、Rat Oligo Microarray Kit（商品名、アジレント社製）等の市販品を利用することが可能である。
【００３４】
発現量を測定するｍＲＮＡは、下記（Ａ）〜（Ｃ）の遺伝子から発現しているｍＲＮＡである。
（Ａ）配列番号１〜５に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｂ）配列番号６〜８に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｃ）配列番号９〜３２に示す塩基配列を含む遺伝子
本発明においては、上記（Ａ）〜（Ｃ）からそれぞれ１以上の遺伝子を選択し、選択した遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量を測定する。（Ａ）〜（Ｃ）の各群から選択する遺伝子数は、各群に属する遺伝子数を上限とする１以上の任意の数である。（Ａ）〜（Ｃ）の各群からそれぞれ選択する遺伝子数は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。発がん性の予測の精度を高く維持しつつ操作を簡略化する観点から、（Ａ）〜（Ｃ）から選択する遺伝子数はそれぞれ１〜３程度とすることが好ましく、１又は２とすることがより好ましく、１とすることが最も好ましい。
【００３５】
被検群と対照群の各群について、選択した遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量を測定する。その後、被検群と対照群との間で、測定したｍＲＮＡの発現量の比較を行う。測定したｍＲＮＡの発現量が以下の２つの条件(1)(2)のいずれも満たしている場合に、被検物質に発がん性有りと決定する。
(1)ｍＲＮＡの発現量を測定した遺伝子のうち少なくともいずれか１つから発現しているｍＲＮＡの発現量が、被検群と対照群との間で有意差があること。
(2)(1)でｍＲＮＡの発現量に有意差が見られた遺伝子のうち、少なくともいずれか１つの遺伝子の被検群におけるｍＲＮＡの発現量が、対照群におけるｍＲＮＡの発現量に対し、当該遺伝子毎に定められる方向に増加又は減少していること。
【００３６】
被検群と対照群の間でｍＲＮＡの発現量に有意差があるかどうかの判断は、有意差検定により行う。有意差検定は、t検定、U検定、F検定、Dunnet法、Tukey法、Kruskal-Wallis検定、Wilcoxon検定、Steel-Dwass法等の公知の検定方法を採用することが可能である。
【００３７】
当該遺伝子毎に定められる方向とは、齧歯類に発がん物質を投与したときに各遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量が増加と減少のいずれに変動するかを示す方向である。具体的には下記表１に示す増加又は減少の方向である。
【００３８】
【表１】
【００３９】
本発明者は、多数の発がん物質をそれぞれ齧歯類に投与したときに得られる遺伝子発現パターンは、その類似性により、３つのパターンに分類されることを知得している。３つのパターンに分類される発がん物質のグループは、以下のとおりである。
（グループ１）
2,4-ジアミノトルエン、キノリン、ジエチルニトロサミン、2-ニトロプロパン、N-ニトロソモルホリン、フラン、N-ニトロソジメチルアミン、N-ニトロソピペリジン、2-アセチルアミノフルオレン、2-アミノ-3,8-ジメチルイミダゾ[4,5-f]キノキサリン、メチルカルバメート、チオアセトアミド、ウレタン、アセトアミド、メタピリレン塩酸塩、3'-メチル-4-ジメチルアミノアゾベンゼン、1,4-ジオキサン
（グループ２）
サフロール、クロフィブレート、ジ(2-エチルヘキシル)フタレート、ヘキサクロロベンゼン、α-ヘキサクロロシクロヘキサン、D,L-エチオニン、クロレンド酸、2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ[4,5-b]-ピリジン、7,12-ジメチルベンズ[a]アントラセン、3-メチルコラントレン、4-ニトロキノリン-1-オキサイド、N-エチル-N-ニトロソウレア、ベンゾ[a]ピレン、4-ジメチルアミノアゾベンゼン、アルドリン、アジピン酸ジ(2-エチルヘキシル)、トリクロロエチレン、ブチル化ヒドロキシアニソール、D-リモネン、テトラクロロエチレン、1,4-ジクロロベンゼン、フェニトインナトリウム塩、トリクロロ酢酸
（グループ３)
エチニルエストラジオール、クロロホルム、ベンズ[a]アントラセン、ペンタクロロエタン、ジエチルスチルベストロール、フェノバルビタール
【００４０】
上述した（Ａ）の遺伝子はグループ１の発がん物質を、（Ｂ）の遺伝子はグループ２の発がん物質を、（Ｃ）の遺伝子はグループ３の発がん物質をそれぞれ齧歯類に投与したときに、ｍＲＮＡの発現量が表１に記載する方向に有意に増加又は減少する遺伝子である。（Ａ）〜（Ｃ）の遺伝子は、他のグループの発がん物質や、非発がん物質の投与によっては、ｍＲＮＡの発現量は有意に増減しない。従って、（Ａ）〜（Ｃ）からそれぞれ選択した遺伝子のうち、いずれかから発現しているｍＲＮＡの発現量が表１に示す方向に有意に増加又は減少したときには被検物質は発がん性有りと判定され、かかる遺伝子が１つもない場合には被検物質は発がん性無しと決定される。
【００４１】
上記（Ａ）〜（Ｃ）の遺伝子のうち、特に予測精度が高い組み合わせは、以下に示す配列番号の塩基配列を有する遺伝子から選択される組み合わせである。
【００４２】
（Ａ）配列番号１〜４
（Ｂ）配列番号６，７
（Ｃ）配列番号９、１０、１４、１５、１７、２１、２２、３０、３１、３２
【００４３】
上述した遺伝子から選択される組み合わせの中でも、以下に示す組み合わせがより好ましい。
・（Ａ）配列番号１、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１０
・（Ａ）配列番号３、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１０
・（Ａ）配列番号４、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１０
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号９
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１０
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１４
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１５
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１７
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号２１
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号２２
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号３０
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号３１
・（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号３２
【００４４】
更に、上述した組み合わせのうち、最も好ましい組み合わせは、（Ａ）配列番号２、（Ｂ）配列番号７、（Ｃ）配列番号１０に示す塩基配列を有する３つの遺伝子の組み合わせである。
【００４５】
本発明の他の予測方法として、上述した（Ａ）〜（Ｃ）の遺伝子に加えて、（Ｄ）の遺伝子として配列番号３３に示す塩基配列を含む遺伝子について、発現しているｍＲＮＡの発現量を併せて測定する方法がある。
【００４６】
（Ｄ）の遺伝子は、基本的にはグループ２の発がん物質を齧歯類に投与したときにｍＲＮＡの発現量が減少する遺伝子である。
【００４７】
グループ２の発がん物質は、肝発がん物質とそれ以外の発がん物質との間でｍＲＮＡの発現量に有意差が見られる遺伝子が異なる傾向がある。上述した（Ｂ）の遺伝子は、肝発がん物質以外の発がん物質の投与によってはｍＲＮＡの発現量に有意差が生じない場合がある。そのため、（Ｂ）の遺伝子と（Ｄ）の遺伝子とを併せて用いることにより、グループ２の発がん物質の予測精度が向上する。従って、上述した（Ａ）〜（Ｃ）の遺伝子と（Ｄ）の遺伝子とについてｍＲＮＡの発現量を測定することにより、グループ２のタイプの発がん物質を非発がん物質と誤って判断する場合が少なくなり、発がん性予測の精度がより高いものとなる。
【実施例】
【００４８】
検討例１
表２〜６に示す発がん物質、非発がん物質を、表２〜６に示す溶媒に溶解して試験溶液を調製した。調製した試験溶液と、調製に使用した溶媒を、各群のラットに強制経口投与した。ラットは日本チャールス・リバー社から入手した５週令の雄性ラット（Ｆ３４４、ＳＰＦ系統）を４匹／群に分けて使用した。媒体対照群への溶媒の投与量は、発がん物質投与群又は非発がん物質投与群に投与した試験溶液の容量と同量とした。試験溶液又は溶媒の投与は１日１回とし、２８日間行った。投与開始から２８日経過後にラットの肝臓から断片を切り出し、total RNAを抽出して精製した。自家製のオリゴDNAマイクロアレイ（2007/05/16版UniGeneデータベースに基づくUniGene ID数:6,689、１プローブあたりの遺伝子長さ:60mer）を用いてtotal RNAに含まれる各mRNA量を測定した。
【００４９】
使用した発がん物質、非発がん物質の物質番号、試験溶液の調製に使用した溶媒、ラットへの投与量を表２〜６に示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
【表３】
【００５２】
【表４】
【００５３】
【表５】
【００５４】
【表６】
【００５５】
各化学物質投与群と媒体対照群との間でｍＲＮＡの発現量を比較し、(A)〜(D)に記載する条件を満たす遺伝子をそれぞれ選定した。
【００５６】
（A）表７に示すグループ１の発がん物質（１７物質）のうちの１４物質以上について有意に発現量が変動し、かつ非発がん物質（２６物質）のうち有意に発現量が変動した物質数が８以下である遺伝子
（B）表７に示すグループ２の発がん物質（２３物質）のうちの１３物質以上について有意に発現量が変動し、かつ非発がん物質（２６物質）のうち有意に発現量が変動した物質数が８以下である遺伝子
（C）表７に示すグループ３の発がん物質（６物質）のうちの５物質以上について有意に発現量が変動し、かつ非発がん物質（２６物質）のうち有意に発現量が変動した物質数が８以下である遺伝子
（D）表７に示すグループ２の発がん物質のうち、（B）の遺伝子では発現量が変動していない発がん物質で有意に発現量が変動している遺伝子
【００５７】
【表７】
【００５８】
発がん物質投与群又は非発がん物質投与群と、媒体対照群との間でｍＲＮＡの発現量に有意差があるかどうかの判断は、以下により行った。発がん物質投与群又は非発がん物質投与群におけるｍＲＮＡの発現量が、対照群において発現している対応するｍＲＮＡの発現量に対して1.5倍以上又は1.5分の1以下である場合に有意とした。但し、有意かどうかの判断は発現量の増減の方向を考慮して行った。他の発がん物質を投与した場合と比較して増減の方向が異なるものについては、その変動は有意ではないと判断した。
【００５９】
上記の方法で選定した遺伝子の遺伝子No.、その遺伝子から発現しているmRNAの検出に使用したプローブの塩基配列を示す配列番号、遺伝子のUnigene No.、Unigeneデータベースに記載された遺伝子の塩基配列を示す配列番号、発がん物質を投与したときの発現量の変動方向、発現量が変動した物質数を表８に示す。
【００６０】
【表８】
【００６１】
以下の表９〜１４は、（A）から（D）の条件で選定された各遺伝子が化学物質を投与したときに示す挙動を表したものである。「＋」の場合は、化学物質の投与により媒体対照群との間にｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつ当該遺伝子に定められる方向にｍＲＮＡの発現量が変動したことを示している。「−」の場合は、媒体対照群との間にｍＲＮＡの発現量に有意差が認められなかったか、変動の方向が定められた方向でなかったことを示している。
【００６２】
【表９】
【００６３】
【表１０】
【００６４】
【表１１】
【００６５】
【表１２】
【００６６】
【表１３】
【００６７】
【表１４】
【００６８】
実施例１
検討例１で選定した（Ａ）〜（Ｃ）の遺伝子を使用して、遺伝子の選定に使用した化学物質（トレーニング物質）と、遺伝子の選定に使用しなかった化学物質（検証物質）とについて、発がん性の予測を行った。予測は以下の手順で行った。
【００６９】
（Ａ）〜（Ｃ）からそれぞれ１の遺伝子を選定し、選定した遺伝子について、ｍＲＮＡの発現量を化学物質投与群と媒体対照群の間で比較した。いずれか１の遺伝子についてのｍＲＮＡの発現量が、媒体対照群に比較して有意に増加又は減少し、かつ増加又は減少の方向が表１に記載する方向である場合、その化学物質は発がん性有りと判断し、それ以外の場合は発がん性無しと判断した。
【００７０】
なお、化学物質投与群のｍＲＮＡの発現量が媒体対照群に対して有意に増減しているかどうかは、対照群のｍＲＮＡの発現量に対して1.5倍以上又は1.5分の1以下であるか否かで判断した。
【００７１】
全ての遺伝子の組み合わせについて調べるのは難しいが、以下の結果を得た。最も予測率が高かった遺伝子の組み合わせは、4846/2203/813であった。その他の遺伝子を組み合わせた場合についても、検証物質で６０％以上の予測率であった。
【００７２】
予測に使用した遺伝子No.と、正解した物質数、正解した物質数から算出した予測率を表１５、１６に示す。
【００７３】
【表１５】
【００７４】
【表１６】
【００７５】
実施例２
表７に示す（Ａ）〜（Ｃ）からそれぞれ選択した１の遺伝子と、（Ｄ）の遺伝子を使用して、実施例１と同様に化学物質の発がん性を予測した。全ての組み合わせについて調べるのは難しいが、以下の結果を得た。検証物質で６０％以上の予測率であった。予測に使用した遺伝子と、正解した物質数、正解した物質数から算出した予測率を表１７、１８に示す。
【００７６】
【表１７】
【００７７】
【表１８】
【００７８】
比較例１
実施例１において最も予測率が高かった遺伝子の組み合わせのうち、１種を検討例１で選択されなかった遺伝子に代えて、トレーニング物質、検証物質の発がん性を予測した。結果を表１９に示す。なお、本比較例において実施例１の遺伝子に代えて用いた遺伝子は、検討例１で選択されなかった遺伝子の中から無作為に抽出した遺伝子である。
【００７９】
【表１９】
【００８０】
表１５、１６より、実施例１においては、グループ１の発がん物質の予測率は80％以上であることがわかる。これに対し、No.4846の遺伝子を他の遺伝子に変更した比較例１では、表１９から明らかなように、グループ１の発がん物質の予測率は29.4％であった。同様に、No.2203の遺伝子を他の遺伝子に変更した場合にはグループ２の発がん物質の予測率が、No.813を他の遺伝子に変更した場合にはグループ３の発がん物質の予測率が大きく低下した。
【００８１】
また、実施例１では、発がん性検証物質の予測率が６０〜１００％であったのに対し、比較例１では３０〜５０％であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質を溶媒に溶解又は分散させて調製した被検物質溶液を被検群に、前記被検物質溶液の調製に使用した溶媒を対照群に投与する工程と、
被検物質溶液又は溶媒の各群への投与期間経過後に各群からｍＲＮＡを採取し、下記（Ａ）〜（Ｃ）
（Ａ）配列番号１〜５に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｂ）配列番号６〜８に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｃ）配列番号９〜３２に示す塩基配列を含む遺伝子
からそれぞれ選択される１以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡの発現量を測定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められるかどうかを有意差検定により判定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子のいずれか１の遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつ対照群に対する被検群の当該ｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該ｍＲＮＡを発現させる遺伝子毎に予め定められる方向に増加又は減少しているときに被検物質に発がん性有りと決定する工程と、
を有する被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【請求項２】
被検物質を溶媒に溶解又は分散させて調製した被検物質溶液を被検群に、前記被検物質溶液の調製に使用した溶媒を対照群に投与する工程と、
被検物質溶液又は溶媒の各群への投与期間経過後に各群からｍＲＮＡを採取し、下記（Ａ）〜（Ｃ）
（Ａ）配列番号１〜５に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｂ）配列番号６〜８に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｃ）配列番号９〜３２に示す塩基配列を含む遺伝子
からそれぞれ選択される１以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡの発現量を測定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められるかどうかを有意差検定により判定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子のいずれか１の遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつ対照群に対する被検群の当該ｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該ｍＲＮＡを発現させる遺伝子毎に予め定められる方向に増加又は減少しているときに被検物質に発がん性有りと決定し、前記選択された遺伝子のいずれについても被検群と対照群の間でｍＲＮＡの発現量に有意差が認められないとき、又は前記選択された遺伝子のいずれかに有意差が認められる場合であっても対照群に対する被検群の当該遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該遺伝子毎に予め定められる方向でないときに発がん性無しと決定する工程と、
を有する被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【請求項３】
被検物質溶液の投与期間が１〜９０日間である請求項１又は２に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【請求項４】
被検群及び対照群の試験動物が、ラット、マウス、ハムスター、又はモルモットである請求項１又は２に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【請求項５】
（Ａ）から選ばれる遺伝子が配列番号２に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｂ）から選ばれる遺伝子が配列番号７に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｃ）から選ばれる遺伝子が配列番号１０に示す塩基配列を含む遺伝子である請求項１又は２に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【請求項６】
被検物質を溶媒に溶解又は分散させて調製した被検物質溶液を被検群に、前記被検物質溶液の調製に使用した溶媒を対照群に投与する工程と、
被検物質溶液又は溶媒の各群への投与期間経過後に各群からｍＲＮＡを採取し、下記（Ａ）〜（Ｃ）
（Ａ）配列番号１〜５に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｂ）配列番号６〜８に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｃ）配列番号９〜３２に示す塩基配列を含む遺伝子
からそれぞれ選択される１以上の遺伝子と、下記（Ｄ）の遺伝子
（Ｄ）配列番号３３に示す塩基配列を含む遺伝子
と、から発現されるｍＲＮＡの発現量を測定する工程と、
被検群と対照群の間で前記遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められるかどうかを有意差検定により判定する工程と、
被検群と対照群の間で前記遺伝子のいずれか１から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつ対照群に対する被検群の当該ｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該ｍＲＮＡを発現させる遺伝子毎に予め定められる方向に増加又は減少しているときに被検物質に発がん性有りと決定する工程と、
を有する被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【請求項７】
被検物質溶液の投与期間が１〜９０日間である請求項６に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【請求項８】
（Ａ）から選ばれる遺伝子が配列番号２に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｂ）から選ばれる遺伝子が配列番号７に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｃ）から選ばれる遺伝子が配列番号１０に示す塩基配列を含む遺伝子である請求項６に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【請求項１】
被検物質を溶媒に溶解又は分散させて調製した被検物質溶液を被検群に、前記被検物質溶液の調製に使用した溶媒を対照群に投与する工程と、
被検物質溶液又は溶媒の各群への投与期間経過後に各群からｍＲＮＡを採取し、下記（Ａ）〜（Ｃ）
（Ａ）配列番号１〜５に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｂ）配列番号６〜８に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｃ）配列番号９〜３２に示す塩基配列を含む遺伝子
からそれぞれ選択される１以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡの発現量を測定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められるかどうかを有意差検定により判定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子のいずれか１の遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつ対照群に対する被検群の当該ｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該ｍＲＮＡを発現させる遺伝子毎に予め定められる方向に増加又は減少しているときに被検物質に発がん性有りと決定する工程と、
を有する被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【請求項２】
被検物質を溶媒に溶解又は分散させて調製した被検物質溶液を被検群に、前記被検物質溶液の調製に使用した溶媒を対照群に投与する工程と、
被検物質溶液又は溶媒の各群への投与期間経過後に各群からｍＲＮＡを採取し、下記（Ａ）〜（Ｃ）
（Ａ）配列番号１〜５に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｂ）配列番号６〜８に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｃ）配列番号９〜３２に示す塩基配列を含む遺伝子
からそれぞれ選択される１以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡの発現量を測定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められるかどうかを有意差検定により判定する工程と、
被検群と対照群の間で前記選択された遺伝子のいずれか１の遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつ対照群に対する被検群の当該ｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該ｍＲＮＡを発現させる遺伝子毎に予め定められる方向に増加又は減少しているときに被検物質に発がん性有りと決定し、前記選択された遺伝子のいずれについても被検群と対照群の間でｍＲＮＡの発現量に有意差が認められないとき、又は前記選択された遺伝子のいずれかに有意差が認められる場合であっても対照群に対する被検群の当該遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該遺伝子毎に予め定められる方向でないときに発がん性無しと決定する工程と、
を有する被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【請求項３】
被検物質溶液の投与期間が１〜９０日間である請求項１又は２に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【請求項４】
被検群及び対照群の試験動物が、ラット、マウス、ハムスター、又はモルモットである請求項１又は２に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【請求項５】
（Ａ）から選ばれる遺伝子が配列番号２に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｂ）から選ばれる遺伝子が配列番号７に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｃ）から選ばれる遺伝子が配列番号１０に示す塩基配列を含む遺伝子である請求項１又は２に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【請求項６】
被検物質を溶媒に溶解又は分散させて調製した被検物質溶液を被検群に、前記被検物質溶液の調製に使用した溶媒を対照群に投与する工程と、
被検物質溶液又は溶媒の各群への投与期間経過後に各群からｍＲＮＡを採取し、下記（Ａ）〜（Ｃ）
（Ａ）配列番号１〜５に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｂ）配列番号６〜８に示す塩基配列を含む遺伝子
（Ｃ）配列番号９〜３２に示す塩基配列を含む遺伝子
からそれぞれ選択される１以上の遺伝子と、下記（Ｄ）の遺伝子
（Ｄ）配列番号３３に示す塩基配列を含む遺伝子
と、から発現されるｍＲＮＡの発現量を測定する工程と、
被検群と対照群の間で前記遺伝子から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められるかどうかを有意差検定により判定する工程と、
被検群と対照群の間で前記遺伝子のいずれか１から発現しているｍＲＮＡの発現量に有意差が認められ、かつ対照群に対する被検群の当該ｍＲＮＡの発現量の増加又は減少の方向が当該ｍＲＮＡを発現させる遺伝子毎に予め定められる方向に増加又は減少しているときに被検物質に発がん性有りと決定する工程と、
を有する被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【請求項７】
被検物質溶液の投与期間が１〜９０日間である請求項６に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【請求項８】
（Ａ）から選ばれる遺伝子が配列番号２に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｂ）から選ばれる遺伝子が配列番号７に示す塩基配列を含む遺伝子であり、（Ｃ）から選ばれる遺伝子が配列番号１０に示す塩基配列を含む遺伝子である請求項６に記載の被検物質の齧歯類発がん性予測方法。
【公開番号】特開２００９−１５９８５２（Ｐ２００９−１５９８５２Ａ）
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３４０４０６（Ｐ２００７−３４０４０６）
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【出願人】（０００１７３５６６）財団法人化学物質評価研究機構 (14)
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【出願人】（５０１０５４７４６）株式会社三菱化学安全科学研究所 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【出願人】（０００１７３５６６）財団法人化学物質評価研究機構 (14)
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【出願人】（５０１０５４７４６）株式会社三菱化学安全科学研究所 (3)
【Ｆターム（参考）】
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