観察装置および観察方法
【課題】撮影開始後における観察対象の状態変化を観察することができる観察装置および観察方法を提供する。
【解決手段】試料Ａの画像を取得する光学顕微鏡観察部２０と、光学顕微鏡観察部２０により時間間隔をあけて取得された複数の画像を比較して、試料Ａの状態変化を判定する細胞状態判定部４３と、細胞状態判定部４３により状態変化が判定された領域を抽出する領域抽出部４４と、領域抽出部４４により抽出された領域の画像を、光学顕微鏡観察部２０よりも高解像度で取得する走査型顕微鏡観察部３０とを備える観察装置１を採用する。
【解決手段】試料Ａの画像を取得する光学顕微鏡観察部２０と、光学顕微鏡観察部２０により時間間隔をあけて取得された複数の画像を比較して、試料Ａの状態変化を判定する細胞状態判定部４３と、細胞状態判定部４３により状態変化が判定された領域を抽出する領域抽出部４４と、領域抽出部４４により抽出された領域の画像を、光学顕微鏡観察部２０よりも高解像度で取得する走査型顕微鏡観察部３０とを備える観察装置１を採用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば細胞等の生体組織を観察するための観察装置および観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、スクリーニングを開始する前にＣＣＤで試料全体を撮影して、撮影した画像を解析することで細胞の位置を特定し、細胞が存在している場所のみにレーザ光（励起光）を照射して蛍光画像を取得する走査型顕微鏡システムが知られている（例えば、特許文献１参照）。この走査型顕微鏡システムによれば、細胞の存在しない位置の画像を取得する必要がないため、速やかに細胞の画像を取得できるという効果を奏する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−１２８０８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に開示されている走査型顕微鏡システムでは、スクリーニングを開始する前に、ＣＣＤで試料全体を撮影して細胞の位置を特定してしまうので、撮影開始後に状態が変化する細胞については画像を取得できないという不都合がある。したがって、例えば、タイムラプス観察中に発現した細胞の核内の微細構造の変化については、観察を行うことができない。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、撮影開始後における観察対象の状態変化を観察することができる観察装置および観察方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明の第１の態様は、試料の画像を取得する第１の画像取得部と、該第１の画像取得部により時間間隔をあけて取得された複数の画像を比較して、前記試料の状態変化を判定する判定部と、該判定部により状態変化が判定された領域を抽出する領域抽出部と、該領域抽出部により抽出された領域の画像を、前記第１の画像取得部よりも高解像度で取得する第２の画像取得部とを備える観察装置である。
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、第１の画像取得部により試料の画像が時間間隔をあけて複数取得され、判定部によりこれらの画像が比較されて試料の状態変化が判定される。そして、領域抽出部により状態が変化したと判定された領域が抽出され、この領域の画像が、第２の画像取得部により第１の画像取得部よりも高解像度で取得される。
【０００８】
このようにすることで、観察中に状態が変化した領域（例えば、細胞核内の微細構造が変化した細胞）を高解像度で撮影することができ、その状態変化の様子を観察することができる。また、観察中に状態が変化しない領域については高解像度で画像を取得する必要性を排除することができ、状態変化が判定された領域の画像のみを速やかに且つ高解像度で取得することができる。
【０００９】
上記の第１の態様において、前記試料の状態変化を判定するための基準となるパラメータを入力するパラメータ入力部を備え、前記判定部が、前記パラメータ入力部により入力されたパラメータを用いて前記試料の状態変化を判定することとしてもよい。
このようにすることで、観察を行いたい対象に応じて、試料の状態変化を判定するための基準となるパラメータをパラメータ入力部に入力して、その状態変化を観察することができ、様々な観察対象についての状態変化の観察が可能となる。
【００１０】
上記の第１の態様において、前記パラメータが、前記試料の像を構成する画素群の輝度、画素数、色のいずれか、もしくはその組み合わせであることとしてもよい。
試料の状態変化を判定するための基準となるパラメータとして、色を採用した場合には、例えば細胞の周期によって異なる色の蛍光を発する蛍光プローブ（例えばＦＵＣＣＩ）を試料に加えることで、その状態変化、すなわち細胞周期の進行をリアルタイムで観察することができる。また、パラメータとして画素数を採用した場合には、例えば大きさの変化する細胞をリアルタイムで観察することができる。また、パラメータとして輝度を採用した場合には、例えば観察中に新たに発現した細胞の核内の微細構造の変化をリアルタイムで観察することができる。
【００１１】
上記の第１の態様において、前記第１の画像取得部が、２次元撮像素子であることとしてもよい。
第１の画像取得部を、例えばＣＣＤ等の２次元撮像素子とすることで、高速で試料の画像を取得することができ、取得した画像を試料の状態変化の判定用の画像として用いることができる。
【００１２】
上記の第１の態様において、前記第２の画像取得部が、前記試料上でレーザ光を走査する走査部と、該走査部による走査位置に対応付けて前記試料からの光を検出する光検出部とを有することとしてもよい。
第２の画像取得部をレーザ走査型顕微鏡とすることで、状態が変化した領域の画像を高解像度で取得することができる。また、レーザ光を励起光として試料からの蛍光を光検出部により検出することで、状態変化が判定された領域のみに励起光を照射し、観察中に状態が変化しない領域には励起光を照射しないようにすることができ、状態が変化しない領域の退色を防止することができる。
【００１３】
本発明の第２の態様は、時間間隔をあけて試料の画像を複数撮影する第１の画像取得ステップと、該第１の画像取得ステップにより時間間隔をあけて撮影された複数の画像を比較して、前記試料の状態変化を判定する判定ステップと、該判定ステップにより状態変化が判定された領域を抽出する領域抽出ステップと、該領域抽出ステップにより抽出された領域の画像を、前記第１の撮像ステップよりも高解像度で撮影する第２の画像取得ステップとを含む観察方法である。
【００１４】
本発明の第２の態様によれば、第１の態様と同様に、観察中に状態が変化した領域（例えば、細胞核内の微細構造が変化した細胞）を高解像度で撮影することができ、その状態変化の様子を観察することができる。また、観察中に状態が変化しない領域については高解像度で画像を取得する必要性を排除することができ、状態変化が判定された領域の画像のみを速やかに且つ高解像度で取得することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、撮影開始後における観察対象の状態変化を観察することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施形態に係る観察装置の概略構成図である。
【図２】図１の細胞状態判定部および領域抽出部による処理を説明する図であり、（ａ）は蛍光が発現した細胞がない状態、（ｂ）は蛍光が発現した細胞が出現した状態を示している。
【図３】図１の観察装置によってタイムラプス観察を行った場合における作用を説明する図であり、（ａ）から（ｃ）の順に蛍光が発現した細胞が出現していく状態を示している。
【図４】図１の観察装置による試料（ブロックＡ１）の状態変化を判定する際の処理を説明する図である。
【図５】図１の観察装置による状態変化した領域を抽出する際の処理を説明する図である。
【図６】図１の観察装置による試料（ブロックＡ２）の状態変化を判定する際の処理を説明する図である。
【図７】図１の観察装置によってタイムラプス観察を行った場合における作用を説明する図であり、（ａ）から（ｃ）の順に細胞周期が進行し、各細胞の色が変化していく状態を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の一実施形態に係る観察装置１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１は、生体試料中の細胞を観察する細胞観察装置であり、図１に示すように、顕微鏡本体１０と、光学顕微鏡観察部（第１の画像取得部）２０と、走査型顕微鏡観察部（第２の画像取得部）３０と、ＰＣ４０とを備えている。
【００１８】
顕微鏡本体１０は、試料Ａを載置する電動ステージ１３と、試料Ａに対向して配置された対物レンズ１４と、光学顕微鏡観察部２０からの光と走査型顕微鏡観察部３０からの光とを切り替えて対物レンズ１４に導く光路切替部１６と、対物レンズ１４と光路切替部１６との間に配置されたミラー１５とを備えている。
【００１９】
電動ステージ１３は、試料Ａを載置した状態で対物レンズ１４の光軸に直交する方向（ＸＹ方向）に動作して、試料Ａにおける対物レンズ１４の焦点位置をＸＹ方向に移動させるようになっている。
対物レンズ１４は、光学顕微鏡観察部２０（光源２１）および走査型顕微鏡観察部３０（レーザ光源３１）から発せられた光を試料Ａに照射するとともに、試料Ａからの光を集めるようになっている。
【００２０】
光路切替部１６は、光学顕微鏡観察部２０の光軸と走査型顕微鏡観察部３０の光軸との交点に配置されたミラー１７と、ミラー１７を走査型顕微鏡観察部３０の光軸に沿う方向に移動させる駆動機構（図示略）とを備えている。このような構成を有することで、光路切替部１６は、光学顕微鏡観察部２０からの光と走査型顕微鏡観察部３０からの光のいずれか一方を試料Ａに照射するとともに、試料Ａからの光を光学顕微鏡観察部２０と走査型顕微鏡観察部３０のいずれか一方に導くようになっている。
【００２１】
具体的には、光路切替部１６は、ミラー１７を光学顕微鏡観察部２０の光軸と走査型顕微鏡観察部３０の光軸との交点上に配置することで、走査型顕微鏡観察部３０からの光を対物レンズ１４（ミラー１５）に向けて反射するとともに、この際の試料Ａからの光を走査型顕微鏡観察部３０（ＸＹスキャナ３３）に向けて反射するようになっている。また、光路切替部１６は、ミラー１７を光学顕微鏡観察部２０の光軸上から外すことで、光学顕微鏡観察部２０からの光を対物レンズ１４（ミラー１５）に向けて通過させるとともに、この際の試料Ａからの光を光学顕微鏡観察部２０（ダイクロイックミラー２４）に向けて通過させるようになっている。
【００２２】
光学顕微鏡観察部２０は、光源２１と、励起フィルタ２２と、ミラー２３と、ダイクロイックミラー２４と、吸収フィルタ２５と、ＣＣＤ（２次元撮像素子）２６とを備えており、試料Ａの画像を比較的低い解像度で取得するようになっている。
【００２３】
光源２１は、例えば水銀キセノンランプであり、広帯域な波長の光を射出するようになっている。光源２１は、例えば、試料Ａ中の観察対象に特異的に付着または発現する蛍光物質を励起させる励起光を射出するようになっている。
【００２４】
励起フィルタ２２は、光源２１から射出された光から、蛍光物質の励起に必要な波長の光を抽出するようになっている。
ミラー２３は、励起フィルタ２２を透過してきた光源２１からの光をダイクロイックミラー２４に向けて反射するようになっている。
【００２５】
ダイクロイックミラー２４は、光源２１からの光を光路切替部１６に向けて反射する一方、対物レンズ１４により集光された試料Ａからの光を透過させるようになっている。これにより、ダイクロイックミラー２４は、光源２１からの光と、試料Ａからの光とを分岐するようになっている。
【００２６】
吸収フィルタ２５は、ダイクロイックミラー２４を透過してきた光のうち、試料Ａからの光以外を遮断するようになっている。
ＣＣＤ（Charge Coupled Device）２６は、吸収フィルタ２５を透過してきた試料Ａからの光を光電変換して、試料Ａの画像情報として電気信号をＰＣ４０に出力するようになっている。
【００２７】
走査型顕微鏡観察部３０は、レーザ光源３１と、光合成部３２と、ＸＹスキャナ（走査部）３３と、ミラー３４と、吸収フィルタ３５と、ＰＭＴ（光検出部）３６と、ダイクロイックミラー３７とを備えており、試料Ａの画像（後述する領域抽出部４４により抽出された領域の画像）を、光学顕微鏡観察部２０よりも高解像度で取得するようになっている。
【００２８】
レーザ光源３１は、互いに異なる波長のレーザ光を射出するレーザ光源３１ａ，３１ｂ，３１ｃを有しており、観察対象に応じて、これらレーザ光源からのレーザ光を切り替えて射出するようになっている。レーザ光源３１ａ，３１ｂ，３１ｃは、例えば、試料Ａ中の観察対象に特異的に付着または発現する蛍光物質を励起させる励起光をそれぞれ射出するようになっている。
【００２９】
光合成部３２は、レーザ光源３１ａ，３１ｂ，３１ｃからのレーザ光を同一光軸に合成するダイクロイックミラー３２ａ，３２ｂ，３２ｃを有している。具体的には、ダイクロイックミラー３２ａは、レーザ光源３１ａからのレーザ光をダイクロイックミラー３２ｂに向けて反射するようになっている。ダイクロイックミラー３２ｂは、レーザ光源３１ａからのレーザ光を透過させる一方、レーザ光源３１ｂからのレーザ光をダイクロイックミラー３２ｃに向けて反射するようになっている。ダイクロイックミラー３２ｃは、レーザ光源３１ｃからのレーザ光をＸＹスキャナ３３に向けて透過させる一方、レーザ光源３１ａおよびレーザ光源３１ｂからのレーザ光をＸＹスキャナ３３に向けて反射するようになっている。なお、ダイクロイックミラー３２ａは、レーザ光源３１ａからのレーザ光を反射すればよいため、通常のミラーとしてもよい。
【００３０】
ＸＹスキャナ３３は、例えば銀コートされた一対のガルバノミラー（図示略）を有しており、これらガルバノミラーの揺動角度を変化させ、ラスタスキャン方式で駆動されるようになっている。これにより、レーザ光源３１からのレーザ光を試料Ａ上において２次元的に走査させることができるようになっている。
【００３１】
ダイクロイックミラー３７は、レーザ光源３１からのレーザ光を透過する一方、対物レンズ１４により集光された試料Ａからの光をミラー３４に向けて反射するようになっている。これにより、ダイクロイックミラー３７は、レーザ光源３１からのレーザ光と、試料Ａからの光とを分岐するようになっている。
【００３２】
ミラー３４は、ダイクロイックミラー３７により反射された試料Ａからの光を吸収フィルタ３５に向けて反射するようになっている。
吸収フィルタ３５は、ダイクロイックミラー３７により反射された光のうち、試料Ａからの光以外を遮断するようになっている。
【００３３】
ＰＭＴ（Photomultiplier Tube：光電子増倍管）３６は、吸収フィルタ３５を透過してきた試料Ａからの光を光電変換して、試料Ａの画像情報として電気信号をＰＣ４０に出力するようになっている。
【００３４】
ＰＣ４０は、パーソナルコンピュータであり、パラメータ入力部４１と、細胞検出部４２と、細胞状態判定部（判定部）４３と、領域抽出部４４とを機能として備えており、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）および走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）から出力された画像情報から画像を生成するようになっている。
【００３５】
パラメータ入力部４１は、例えばタッチパネルやキーボードやマウス等の入力装置であり、後述する試料Ａ内の細胞を検出するための閾値や、試料Ａの状態変化を判定するための基準となるパラメータが入力されるようになっている。
【００３６】
ここで、試料Ａの状態変化を判定するための基準となるパラメータは、例えば、試料Ａの像を構成する画素群の輝度、画素数、色のいずれか、もしくはその組み合わせである。ここでは、パラメータ入力部４１に、試料Ａの状態変化を判定するための基準となるパラメータとして、試料Ａの像を構成する画素群の輝度が入力されたものとして説明する。
【００３７】
細胞検出部４２は、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）により取得された試料Ａの画像から、細胞を検出するようになっている。具体的には、細胞検出部４２は、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）により取得された試料Ａの画像のうち、予め設定された閾値以上の輝度値を有する画素のブロックを細胞として検出する。この際、画素のブロックが、所定の大きさ以上の場合にのみ、細胞として検出することとしてもよい。
【００３８】
細胞状態判定部４３は、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）により時間間隔をあけて取得された複数の画像を比較して、試料Ａの状態変化を判定するようになっている。
具体的には、細胞状態判定部４３は、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）により時間間隔をあけて取得された複数の画像について比較し、細胞検出部４２により細胞として検出された領域に変化が生じている場合には、試料Ａの状態が変化したと判定する。この際、細胞状態判定部４３は、パラメータ入力部４１に入力されたパラメータを用いて試料Ａの状態変化を判定する。
【００３９】
領域抽出部４４は、細胞状態判定部４３により状態変化が判定された領域を抽出するようになっている。
ＰＣ４０は、領域抽出部４４により抽出した領域の情報を走査型顕微鏡観察部３０に出力し、この抽出した領域の画像を、走査型顕微鏡観察部３０により高解像度で取得させるようになっている。
【００４０】
上記の処理について、図２（ａ）および図２（ｂ）に示す具体例を用いて以下に説明する。図２（ａ）および図２（ｂ）は、タイムラプス観察を行った場合における試料Ａ（ブロックＡ１）の画像を示しており、図２（ａ）は蛍光の発現した細胞がない状態、図２（ｂ）は蛍光が発現した細胞が出現した状態を示している。
【００４１】
図２（ａ）に示す状態においては、細胞状態判定部４３により、試料Ａの状態が変化したとは判断されないため、領域抽出部４４により抽出される領域がない。その結果、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により高解像度で取得させる画像はない。
【００４２】
この図２（ａ）に示す状態から図２（ｂ）に示す状態にとなった場合、細胞状態判定部４３により、試料Ａの状態が変化したと判断され、領域抽出部４４により、状態変化が判定された領域、すなわち、新たに蛍光が発現した細胞Ｂ１，Ｂ２の領域が抽出される。そして、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により、上記のように抽出された細胞Ｂ１，Ｂ２の領域の画像が高解像度で取得される。
【００４３】
上記構成を有する観察装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１においてタイムラプス観察を開始する場合には、まず、光路切替部１６によりミラー１７が、光学顕微鏡観察部２０の光軸上から外される。これにより、光学顕微鏡観察部２０（光源２１）からの光を対物レンズ１４（ミラー１５）に向けて通過させる。
【００４４】
この状態において、光源２１から光が射出され、射出された光は、励起フィルタ２２、ミラー２３、ダイクロイックミラー２４、光路切替部１６、ミラー１５を介して、対物レンズ１４により試料Ａ上に照射される。試料Ａでは、観察対象である細胞に特異的に付着または発現する蛍光物質が励起され、発生した蛍光が対物レンズ１４により集められる。
【００４５】
この蛍光は、ミラー１５、光路切替部１６、ダイクロイックミラー２４、吸収フィルタ２５を介してＣＣＤ２６に入射する。ＣＣＤ２６は、試料Ａの画像を比較的低い解像度で取得するようになっており、試料Ａからの蛍光を光電変換して、試料Ａの画像情報として電気信号をＰＣ４０に出力する（第１の画像取得ステップ）。
【００４６】
次に、細胞検出部４２により、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）により取得された試料Ａの画像から、細胞が検出される。
次に、細胞状態判定部４３により、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）により時間間隔をあけて取得された複数の画像が比較され、試料Ａの状態変化が判定される（判定ステップ）。具体的には、細胞状態判定部４３により、時間間隔をあけて取得された複数の画像について比較され、細胞検出部４２により細胞として検出された領域に変化が生じている場合には、試料Ａの状態が変化したと判定される。
【００４７】
次に、領域抽出部４４により、細胞状態判定部４３により状態変化が判定された領域が抽出される（領域抽出ステップ）。このように抽出された領域の情報は、走査型顕微鏡観察部３０に出力され、この抽出された領域の画像が、走査型顕微鏡観察部３０により高解像度で取得される（第２の画像取得ステップ）。
【００４８】
この場合には、光路切替部１６によりミラー１７が、光学顕微鏡観察部２０の光軸上に配置される。これにより、走査型顕微鏡観察部３０からのレーザ光を対物レンズ１４（ミラー１５）に向けて反射させる。この状態において、レーザ光源３１からレーザ光が射出され、射出されたレーザ光は、ＸＹスキャナ３３により２次元走査され、領域抽出部４３により抽出された領域、すなわち細胞状態判定部４２により状態変化が判定された領域に対して照射される。
【００４９】
このように走査されたレーザ光は、光路切替部１６（ミラー１７）、ミラー１５を介して、対物レンズ１４により試料Ａ上に照射される。試料Ａでは、観察対象（細胞Ｂ）に特異的に付着または発現する蛍光物質が励起され、発生した蛍光が対物レンズ１４により集められる。
【００５０】
この蛍光は、ミラー１５、光路切替部１６（ミラー１７）、ＸＹスキャナ３３、ダイクロイックミラー３７、ミラー３４、吸収フィルタ３５を介してＰＭＴ３６に入射する。ＰＭＴ３６は、試料Ａの画像を高い解像度で取得するようになっており、試料Ａからの蛍光を光電変換して、試料Ａの画像情報として電気信号をＰＣ４０に出力する。ＰＣ４０では、ＸＹスキャナ３３による試料Ａ上の走査位置とＰＭＴ３６から出力された画像情報とから、状態の変化した領域が高解像度で撮影された試料Ａの画像が生成される。
【００５１】
上記の処理について、図３から図６に示す具体例を用いて以下に説明する。
図４に示すように、例えばブロックＡ１について、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）により低解像度で画像を取得し、このブロックＡ１に状態の変化した細胞があるか否かを判定する。この際、例えば蛍光強度等の状態が変化した細胞Ｂ１，Ｂ２が検出された場合には、図５に示すように、細胞Ｂ１，Ｂ２の領域が、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により高解像度で撮影される。
【００５２】
具体的には、図３（ａ）から図３（ｃ）に示すように、試料Ａの状態の変化に応じて撮影が行われる。図３（ａ）から図３（ｃ）は、タイムラプス観察を行った場合における試料Ａ（ブロックＡ１）の画像を示しており、図３（ａ）から図３（ｃ）に従って蛍光が発現した細胞が出現していく状態を示している。
【００５３】
図３（ａ）に示す状態においては、細胞状態判定部４３により、状態変化が判定された領域、すなわち、蛍光が発現した細胞Ｂ１，Ｂ２の領域が抽出される。そして、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により、上記のように抽出された細胞Ｂ１，Ｂ２の領域の画像が高解像度で取得される。
【００５４】
図３（ｂ）に示す状態においては、細胞状態判定部４３により、状態変化が判定された領域、すなわち、細胞Ｂ１，Ｂ２の領域に加えて、新たに蛍光が発現した細胞Ｂ３，Ｂ４の領域が抽出される。そして、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により、上記のように抽出された細胞Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４の領域の画像が高解像度で取得される。
【００５５】
図３（ｃ）に示す状態においては、細胞状態判定部４３により、状態変化が判定された領域、すなわち、細胞Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４の領域に加えて、新たに蛍光が発現した細胞Ｂ５，Ｂ６，Ｂ７の領域が抽出される。そして、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により、上記のように抽出された細胞Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４，Ｂ５，Ｂ６，Ｂ７の領域の画像が高解像度で取得される。
【００５６】
次に、図６に示すように、試料ＡのブロックＡ２についても、ブロックＡ１と同様の処理が行われ、状態の変化が検出されない場合には、高解像度での撮影を行わない。以降、同様に試料Ａの他のブロックについても、ブロックＡ１，Ａ２と同様の処理が順次行われ、試料Ａ全体について状態の変化した領域が高解像度で撮影される。
【００５７】
以上のように、本実施形態に係る観察装置１によれば、光学顕微鏡観察部２０により試料Ａの画像が時間間隔をあけて複数取得され、細胞状態判定部４３によりこれらの画像が比較されて試料Ａの状態変化が判定される。そして、領域抽出部４４により状態変化が判定された領域が抽出され、この領域の画像が、走査型顕微鏡観察部３０により光学顕微鏡観察部２０よりも高解像度で取得される。
【００５８】
このようにすることで、観察中に状態が変化した領域（例えば、細胞核内の微細構造が変化した細胞）を高解像度で撮影することができ、その状態変化の様子を観察することができる。また、観察中に状態が変化しない領域については高解像度で画像を取得する必要性を排除することができ、状態変化が判定された領域の画像のみを速やかに且つ高解像度で取得することができる。
【００５９】
また、細胞状態判定部４３が、パラメータ入力部４１により入力されたパラメータを用いて試料Ａの状態変化を判定することで、観察を行いたい対象に応じて、試料Ａの状態変化を判定するための基準となるパラメータをパラメータ入力部４１に入力して、その状態変化を観察することができ、様々な観察対象についての状態変化の観察が可能となる。なお、このパラメータは、図示しないメモリに予め記憶させておくこととしてもよい。
【００６０】
また、光学顕微鏡観察部２０を、例えばＣＣＤ等の２次元撮像素子とすることで、高速で試料Ａの画像を取得することができ、取得した画像を試料Ａの状態変化の判定用の画像として用いることができる。
【００６１】
また、走査型顕微鏡観察部３０をレーザ走査型顕微鏡とすることで、状態が変化した領域の画像を高解像度で取得することができる。また、レーザ光を励起光として試料Ａからの蛍光をＰＭＴ３６により検出することで、状態変化が判定された領域のみに励起光を照射し、観察中に状態が変化しない領域には励起光を照射しないようにすることができ、状態が変化しない領域の退色を防止することができる。
【００６２】
なお、本実施形態において、試料Ａの状態変化を判定するための基準となるパラメータとして、試料Ａの像を構成する画素群の輝度を例に挙げて説明したが、これに代えて、試料Ａの像を構成する画素群の輝度、画素数、色のいずれか、もしくはその組み合わせでよい。
【００６３】
以下に、試料Ａの状態変化を判定するための基準となるパラメータとして、色を採用した場合について説明する。
この場合には、例えば細胞の周期によって異なる色の蛍光を発する蛍光プローブ（例えばＦＵＣＣＩ）を試料Ａに加え、図７（ａ）から図７（ｃ）に示すように、試料Ａの状態の変化、すなわち色の変化に応じて撮影が行われる。
【００６４】
図７（ａ）から図７（ｃ）は、タイムラプス観察を行った場合における試料Ａ（ブロックＡ１）の画像を示しており、図７（ａ）から図７（ｃ）に従って細胞周期が進行し、各細胞の色が変化していく状態を示している。ここでは、緑蛍光（Ｓ，Ｇ２，Ｍ期）の細胞を撮影対象とした例を説明する。
【００６５】
図７（ａ）に示す状態においては、細胞Ｂ１〜Ｂ７のうち、緑蛍光を発する細胞は存在しないため、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）による撮影は行われない。
図７（ｂ）に示す状態においては、細胞Ｂ３から緑蛍光が発生しており、この状態変化が細胞状態判定部４３により判定され、細胞Ｂ３の領域が領域抽出部４４により抽出される。そして、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により、このように抽出された細胞Ｂ３の領域の画像が高解像度で取得される。
【００６６】
図７（ｃ）に示す状態においては、細胞Ｂ２，Ｂ３，Ｂ５，Ｂ６，Ｂ７から緑蛍光が発生しており、この状態変化が細胞状態判定部４３により判定され、細胞Ｂ２，Ｂ３，Ｂ５，Ｂ６，Ｂ７の領域が領域抽出部４４により抽出される。そして、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により、このように抽出された細胞Ｂ２，Ｂ３，Ｂ５，Ｂ６，Ｂ７の領域の画像が高解像度で取得される。
【００６７】
上記のように、試料Ａの状態変化を判定するための基準となるパラメータとして、色を採用した場合には、例えば細胞の周期によって異なる色の蛍光を発する蛍光プローブを試料Ａに加えることで、その状態変化、すなわち細胞周期の進行をリアルタイムで観察することができる。
また、パラメータとして画素数を採用した場合には、例えば大きさの変化する細胞をリアルタイムで観察することができる。
【００６８】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
【符号の説明】
【００６９】
Ａ 試料
１ 観察装置
１０ 顕微鏡本体
１３ 電動ステージ
１４ 対物レンズ
１６ 光路切替部
２０ 光学顕微鏡観察部（第１の画像取得部）
２１ 光源
２４ ダイクロイックミラー
２６ ＣＣＤ（２次元撮像素子）
３０ 走査型顕微鏡観察部（第２の画像取得部）
３１ レーザ光源
３２ 光合成部
３３ ＸＹスキャナ（走査部）
３６ ＰＭＴ（光検出部）
４０ ＰＣ
４１ パラメータ入力部
４２ 細胞検出部
４３ 細胞状態判定部（判定部）
４４ 領域抽出部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば細胞等の生体組織を観察するための観察装置および観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、スクリーニングを開始する前にＣＣＤで試料全体を撮影して、撮影した画像を解析することで細胞の位置を特定し、細胞が存在している場所のみにレーザ光（励起光）を照射して蛍光画像を取得する走査型顕微鏡システムが知られている（例えば、特許文献１参照）。この走査型顕微鏡システムによれば、細胞の存在しない位置の画像を取得する必要がないため、速やかに細胞の画像を取得できるという効果を奏する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−１２８０８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に開示されている走査型顕微鏡システムでは、スクリーニングを開始する前に、ＣＣＤで試料全体を撮影して細胞の位置を特定してしまうので、撮影開始後に状態が変化する細胞については画像を取得できないという不都合がある。したがって、例えば、タイムラプス観察中に発現した細胞の核内の微細構造の変化については、観察を行うことができない。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、撮影開始後における観察対象の状態変化を観察することができる観察装置および観察方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明の第１の態様は、試料の画像を取得する第１の画像取得部と、該第１の画像取得部により時間間隔をあけて取得された複数の画像を比較して、前記試料の状態変化を判定する判定部と、該判定部により状態変化が判定された領域を抽出する領域抽出部と、該領域抽出部により抽出された領域の画像を、前記第１の画像取得部よりも高解像度で取得する第２の画像取得部とを備える観察装置である。
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、第１の画像取得部により試料の画像が時間間隔をあけて複数取得され、判定部によりこれらの画像が比較されて試料の状態変化が判定される。そして、領域抽出部により状態が変化したと判定された領域が抽出され、この領域の画像が、第２の画像取得部により第１の画像取得部よりも高解像度で取得される。
【０００８】
このようにすることで、観察中に状態が変化した領域（例えば、細胞核内の微細構造が変化した細胞）を高解像度で撮影することができ、その状態変化の様子を観察することができる。また、観察中に状態が変化しない領域については高解像度で画像を取得する必要性を排除することができ、状態変化が判定された領域の画像のみを速やかに且つ高解像度で取得することができる。
【０００９】
上記の第１の態様において、前記試料の状態変化を判定するための基準となるパラメータを入力するパラメータ入力部を備え、前記判定部が、前記パラメータ入力部により入力されたパラメータを用いて前記試料の状態変化を判定することとしてもよい。
このようにすることで、観察を行いたい対象に応じて、試料の状態変化を判定するための基準となるパラメータをパラメータ入力部に入力して、その状態変化を観察することができ、様々な観察対象についての状態変化の観察が可能となる。
【００１０】
上記の第１の態様において、前記パラメータが、前記試料の像を構成する画素群の輝度、画素数、色のいずれか、もしくはその組み合わせであることとしてもよい。
試料の状態変化を判定するための基準となるパラメータとして、色を採用した場合には、例えば細胞の周期によって異なる色の蛍光を発する蛍光プローブ（例えばＦＵＣＣＩ）を試料に加えることで、その状態変化、すなわち細胞周期の進行をリアルタイムで観察することができる。また、パラメータとして画素数を採用した場合には、例えば大きさの変化する細胞をリアルタイムで観察することができる。また、パラメータとして輝度を採用した場合には、例えば観察中に新たに発現した細胞の核内の微細構造の変化をリアルタイムで観察することができる。
【００１１】
上記の第１の態様において、前記第１の画像取得部が、２次元撮像素子であることとしてもよい。
第１の画像取得部を、例えばＣＣＤ等の２次元撮像素子とすることで、高速で試料の画像を取得することができ、取得した画像を試料の状態変化の判定用の画像として用いることができる。
【００１２】
上記の第１の態様において、前記第２の画像取得部が、前記試料上でレーザ光を走査する走査部と、該走査部による走査位置に対応付けて前記試料からの光を検出する光検出部とを有することとしてもよい。
第２の画像取得部をレーザ走査型顕微鏡とすることで、状態が変化した領域の画像を高解像度で取得することができる。また、レーザ光を励起光として試料からの蛍光を光検出部により検出することで、状態変化が判定された領域のみに励起光を照射し、観察中に状態が変化しない領域には励起光を照射しないようにすることができ、状態が変化しない領域の退色を防止することができる。
【００１３】
本発明の第２の態様は、時間間隔をあけて試料の画像を複数撮影する第１の画像取得ステップと、該第１の画像取得ステップにより時間間隔をあけて撮影された複数の画像を比較して、前記試料の状態変化を判定する判定ステップと、該判定ステップにより状態変化が判定された領域を抽出する領域抽出ステップと、該領域抽出ステップにより抽出された領域の画像を、前記第１の撮像ステップよりも高解像度で撮影する第２の画像取得ステップとを含む観察方法である。
【００１４】
本発明の第２の態様によれば、第１の態様と同様に、観察中に状態が変化した領域（例えば、細胞核内の微細構造が変化した細胞）を高解像度で撮影することができ、その状態変化の様子を観察することができる。また、観察中に状態が変化しない領域については高解像度で画像を取得する必要性を排除することができ、状態変化が判定された領域の画像のみを速やかに且つ高解像度で取得することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、撮影開始後における観察対象の状態変化を観察することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施形態に係る観察装置の概略構成図である。
【図２】図１の細胞状態判定部および領域抽出部による処理を説明する図であり、（ａ）は蛍光が発現した細胞がない状態、（ｂ）は蛍光が発現した細胞が出現した状態を示している。
【図３】図１の観察装置によってタイムラプス観察を行った場合における作用を説明する図であり、（ａ）から（ｃ）の順に蛍光が発現した細胞が出現していく状態を示している。
【図４】図１の観察装置による試料（ブロックＡ１）の状態変化を判定する際の処理を説明する図である。
【図５】図１の観察装置による状態変化した領域を抽出する際の処理を説明する図である。
【図６】図１の観察装置による試料（ブロックＡ２）の状態変化を判定する際の処理を説明する図である。
【図７】図１の観察装置によってタイムラプス観察を行った場合における作用を説明する図であり、（ａ）から（ｃ）の順に細胞周期が進行し、各細胞の色が変化していく状態を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の一実施形態に係る観察装置１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１は、生体試料中の細胞を観察する細胞観察装置であり、図１に示すように、顕微鏡本体１０と、光学顕微鏡観察部（第１の画像取得部）２０と、走査型顕微鏡観察部（第２の画像取得部）３０と、ＰＣ４０とを備えている。
【００１８】
顕微鏡本体１０は、試料Ａを載置する電動ステージ１３と、試料Ａに対向して配置された対物レンズ１４と、光学顕微鏡観察部２０からの光と走査型顕微鏡観察部３０からの光とを切り替えて対物レンズ１４に導く光路切替部１６と、対物レンズ１４と光路切替部１６との間に配置されたミラー１５とを備えている。
【００１９】
電動ステージ１３は、試料Ａを載置した状態で対物レンズ１４の光軸に直交する方向（ＸＹ方向）に動作して、試料Ａにおける対物レンズ１４の焦点位置をＸＹ方向に移動させるようになっている。
対物レンズ１４は、光学顕微鏡観察部２０（光源２１）および走査型顕微鏡観察部３０（レーザ光源３１）から発せられた光を試料Ａに照射するとともに、試料Ａからの光を集めるようになっている。
【００２０】
光路切替部１６は、光学顕微鏡観察部２０の光軸と走査型顕微鏡観察部３０の光軸との交点に配置されたミラー１７と、ミラー１７を走査型顕微鏡観察部３０の光軸に沿う方向に移動させる駆動機構（図示略）とを備えている。このような構成を有することで、光路切替部１６は、光学顕微鏡観察部２０からの光と走査型顕微鏡観察部３０からの光のいずれか一方を試料Ａに照射するとともに、試料Ａからの光を光学顕微鏡観察部２０と走査型顕微鏡観察部３０のいずれか一方に導くようになっている。
【００２１】
具体的には、光路切替部１６は、ミラー１７を光学顕微鏡観察部２０の光軸と走査型顕微鏡観察部３０の光軸との交点上に配置することで、走査型顕微鏡観察部３０からの光を対物レンズ１４（ミラー１５）に向けて反射するとともに、この際の試料Ａからの光を走査型顕微鏡観察部３０（ＸＹスキャナ３３）に向けて反射するようになっている。また、光路切替部１６は、ミラー１７を光学顕微鏡観察部２０の光軸上から外すことで、光学顕微鏡観察部２０からの光を対物レンズ１４（ミラー１５）に向けて通過させるとともに、この際の試料Ａからの光を光学顕微鏡観察部２０（ダイクロイックミラー２４）に向けて通過させるようになっている。
【００２２】
光学顕微鏡観察部２０は、光源２１と、励起フィルタ２２と、ミラー２３と、ダイクロイックミラー２４と、吸収フィルタ２５と、ＣＣＤ（２次元撮像素子）２６とを備えており、試料Ａの画像を比較的低い解像度で取得するようになっている。
【００２３】
光源２１は、例えば水銀キセノンランプであり、広帯域な波長の光を射出するようになっている。光源２１は、例えば、試料Ａ中の観察対象に特異的に付着または発現する蛍光物質を励起させる励起光を射出するようになっている。
【００２４】
励起フィルタ２２は、光源２１から射出された光から、蛍光物質の励起に必要な波長の光を抽出するようになっている。
ミラー２３は、励起フィルタ２２を透過してきた光源２１からの光をダイクロイックミラー２４に向けて反射するようになっている。
【００２５】
ダイクロイックミラー２４は、光源２１からの光を光路切替部１６に向けて反射する一方、対物レンズ１４により集光された試料Ａからの光を透過させるようになっている。これにより、ダイクロイックミラー２４は、光源２１からの光と、試料Ａからの光とを分岐するようになっている。
【００２６】
吸収フィルタ２５は、ダイクロイックミラー２４を透過してきた光のうち、試料Ａからの光以外を遮断するようになっている。
ＣＣＤ（Charge Coupled Device）２６は、吸収フィルタ２５を透過してきた試料Ａからの光を光電変換して、試料Ａの画像情報として電気信号をＰＣ４０に出力するようになっている。
【００２７】
走査型顕微鏡観察部３０は、レーザ光源３１と、光合成部３２と、ＸＹスキャナ（走査部）３３と、ミラー３４と、吸収フィルタ３５と、ＰＭＴ（光検出部）３６と、ダイクロイックミラー３７とを備えており、試料Ａの画像（後述する領域抽出部４４により抽出された領域の画像）を、光学顕微鏡観察部２０よりも高解像度で取得するようになっている。
【００２８】
レーザ光源３１は、互いに異なる波長のレーザ光を射出するレーザ光源３１ａ，３１ｂ，３１ｃを有しており、観察対象に応じて、これらレーザ光源からのレーザ光を切り替えて射出するようになっている。レーザ光源３１ａ，３１ｂ，３１ｃは、例えば、試料Ａ中の観察対象に特異的に付着または発現する蛍光物質を励起させる励起光をそれぞれ射出するようになっている。
【００２９】
光合成部３２は、レーザ光源３１ａ，３１ｂ，３１ｃからのレーザ光を同一光軸に合成するダイクロイックミラー３２ａ，３２ｂ，３２ｃを有している。具体的には、ダイクロイックミラー３２ａは、レーザ光源３１ａからのレーザ光をダイクロイックミラー３２ｂに向けて反射するようになっている。ダイクロイックミラー３２ｂは、レーザ光源３１ａからのレーザ光を透過させる一方、レーザ光源３１ｂからのレーザ光をダイクロイックミラー３２ｃに向けて反射するようになっている。ダイクロイックミラー３２ｃは、レーザ光源３１ｃからのレーザ光をＸＹスキャナ３３に向けて透過させる一方、レーザ光源３１ａおよびレーザ光源３１ｂからのレーザ光をＸＹスキャナ３３に向けて反射するようになっている。なお、ダイクロイックミラー３２ａは、レーザ光源３１ａからのレーザ光を反射すればよいため、通常のミラーとしてもよい。
【００３０】
ＸＹスキャナ３３は、例えば銀コートされた一対のガルバノミラー（図示略）を有しており、これらガルバノミラーの揺動角度を変化させ、ラスタスキャン方式で駆動されるようになっている。これにより、レーザ光源３１からのレーザ光を試料Ａ上において２次元的に走査させることができるようになっている。
【００３１】
ダイクロイックミラー３７は、レーザ光源３１からのレーザ光を透過する一方、対物レンズ１４により集光された試料Ａからの光をミラー３４に向けて反射するようになっている。これにより、ダイクロイックミラー３７は、レーザ光源３１からのレーザ光と、試料Ａからの光とを分岐するようになっている。
【００３２】
ミラー３４は、ダイクロイックミラー３７により反射された試料Ａからの光を吸収フィルタ３５に向けて反射するようになっている。
吸収フィルタ３５は、ダイクロイックミラー３７により反射された光のうち、試料Ａからの光以外を遮断するようになっている。
【００３３】
ＰＭＴ（Photomultiplier Tube：光電子増倍管）３６は、吸収フィルタ３５を透過してきた試料Ａからの光を光電変換して、試料Ａの画像情報として電気信号をＰＣ４０に出力するようになっている。
【００３４】
ＰＣ４０は、パーソナルコンピュータであり、パラメータ入力部４１と、細胞検出部４２と、細胞状態判定部（判定部）４３と、領域抽出部４４とを機能として備えており、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）および走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）から出力された画像情報から画像を生成するようになっている。
【００３５】
パラメータ入力部４１は、例えばタッチパネルやキーボードやマウス等の入力装置であり、後述する試料Ａ内の細胞を検出するための閾値や、試料Ａの状態変化を判定するための基準となるパラメータが入力されるようになっている。
【００３６】
ここで、試料Ａの状態変化を判定するための基準となるパラメータは、例えば、試料Ａの像を構成する画素群の輝度、画素数、色のいずれか、もしくはその組み合わせである。ここでは、パラメータ入力部４１に、試料Ａの状態変化を判定するための基準となるパラメータとして、試料Ａの像を構成する画素群の輝度が入力されたものとして説明する。
【００３７】
細胞検出部４２は、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）により取得された試料Ａの画像から、細胞を検出するようになっている。具体的には、細胞検出部４２は、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）により取得された試料Ａの画像のうち、予め設定された閾値以上の輝度値を有する画素のブロックを細胞として検出する。この際、画素のブロックが、所定の大きさ以上の場合にのみ、細胞として検出することとしてもよい。
【００３８】
細胞状態判定部４３は、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）により時間間隔をあけて取得された複数の画像を比較して、試料Ａの状態変化を判定するようになっている。
具体的には、細胞状態判定部４３は、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）により時間間隔をあけて取得された複数の画像について比較し、細胞検出部４２により細胞として検出された領域に変化が生じている場合には、試料Ａの状態が変化したと判定する。この際、細胞状態判定部４３は、パラメータ入力部４１に入力されたパラメータを用いて試料Ａの状態変化を判定する。
【００３９】
領域抽出部４４は、細胞状態判定部４３により状態変化が判定された領域を抽出するようになっている。
ＰＣ４０は、領域抽出部４４により抽出した領域の情報を走査型顕微鏡観察部３０に出力し、この抽出した領域の画像を、走査型顕微鏡観察部３０により高解像度で取得させるようになっている。
【００４０】
上記の処理について、図２（ａ）および図２（ｂ）に示す具体例を用いて以下に説明する。図２（ａ）および図２（ｂ）は、タイムラプス観察を行った場合における試料Ａ（ブロックＡ１）の画像を示しており、図２（ａ）は蛍光の発現した細胞がない状態、図２（ｂ）は蛍光が発現した細胞が出現した状態を示している。
【００４１】
図２（ａ）に示す状態においては、細胞状態判定部４３により、試料Ａの状態が変化したとは判断されないため、領域抽出部４４により抽出される領域がない。その結果、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により高解像度で取得させる画像はない。
【００４２】
この図２（ａ）に示す状態から図２（ｂ）に示す状態にとなった場合、細胞状態判定部４３により、試料Ａの状態が変化したと判断され、領域抽出部４４により、状態変化が判定された領域、すなわち、新たに蛍光が発現した細胞Ｂ１，Ｂ２の領域が抽出される。そして、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により、上記のように抽出された細胞Ｂ１，Ｂ２の領域の画像が高解像度で取得される。
【００４３】
上記構成を有する観察装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１においてタイムラプス観察を開始する場合には、まず、光路切替部１６によりミラー１７が、光学顕微鏡観察部２０の光軸上から外される。これにより、光学顕微鏡観察部２０（光源２１）からの光を対物レンズ１４（ミラー１５）に向けて通過させる。
【００４４】
この状態において、光源２１から光が射出され、射出された光は、励起フィルタ２２、ミラー２３、ダイクロイックミラー２４、光路切替部１６、ミラー１５を介して、対物レンズ１４により試料Ａ上に照射される。試料Ａでは、観察対象である細胞に特異的に付着または発現する蛍光物質が励起され、発生した蛍光が対物レンズ１４により集められる。
【００４５】
この蛍光は、ミラー１５、光路切替部１６、ダイクロイックミラー２４、吸収フィルタ２５を介してＣＣＤ２６に入射する。ＣＣＤ２６は、試料Ａの画像を比較的低い解像度で取得するようになっており、試料Ａからの蛍光を光電変換して、試料Ａの画像情報として電気信号をＰＣ４０に出力する（第１の画像取得ステップ）。
【００４６】
次に、細胞検出部４２により、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）により取得された試料Ａの画像から、細胞が検出される。
次に、細胞状態判定部４３により、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）により時間間隔をあけて取得された複数の画像が比較され、試料Ａの状態変化が判定される（判定ステップ）。具体的には、細胞状態判定部４３により、時間間隔をあけて取得された複数の画像について比較され、細胞検出部４２により細胞として検出された領域に変化が生じている場合には、試料Ａの状態が変化したと判定される。
【００４７】
次に、領域抽出部４４により、細胞状態判定部４３により状態変化が判定された領域が抽出される（領域抽出ステップ）。このように抽出された領域の情報は、走査型顕微鏡観察部３０に出力され、この抽出された領域の画像が、走査型顕微鏡観察部３０により高解像度で取得される（第２の画像取得ステップ）。
【００４８】
この場合には、光路切替部１６によりミラー１７が、光学顕微鏡観察部２０の光軸上に配置される。これにより、走査型顕微鏡観察部３０からのレーザ光を対物レンズ１４（ミラー１５）に向けて反射させる。この状態において、レーザ光源３１からレーザ光が射出され、射出されたレーザ光は、ＸＹスキャナ３３により２次元走査され、領域抽出部４３により抽出された領域、すなわち細胞状態判定部４２により状態変化が判定された領域に対して照射される。
【００４９】
このように走査されたレーザ光は、光路切替部１６（ミラー１７）、ミラー１５を介して、対物レンズ１４により試料Ａ上に照射される。試料Ａでは、観察対象（細胞Ｂ）に特異的に付着または発現する蛍光物質が励起され、発生した蛍光が対物レンズ１４により集められる。
【００５０】
この蛍光は、ミラー１５、光路切替部１６（ミラー１７）、ＸＹスキャナ３３、ダイクロイックミラー３７、ミラー３４、吸収フィルタ３５を介してＰＭＴ３６に入射する。ＰＭＴ３６は、試料Ａの画像を高い解像度で取得するようになっており、試料Ａからの蛍光を光電変換して、試料Ａの画像情報として電気信号をＰＣ４０に出力する。ＰＣ４０では、ＸＹスキャナ３３による試料Ａ上の走査位置とＰＭＴ３６から出力された画像情報とから、状態の変化した領域が高解像度で撮影された試料Ａの画像が生成される。
【００５１】
上記の処理について、図３から図６に示す具体例を用いて以下に説明する。
図４に示すように、例えばブロックＡ１について、光学顕微鏡観察部２０（ＣＣＤ２６）により低解像度で画像を取得し、このブロックＡ１に状態の変化した細胞があるか否かを判定する。この際、例えば蛍光強度等の状態が変化した細胞Ｂ１，Ｂ２が検出された場合には、図５に示すように、細胞Ｂ１，Ｂ２の領域が、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により高解像度で撮影される。
【００５２】
具体的には、図３（ａ）から図３（ｃ）に示すように、試料Ａの状態の変化に応じて撮影が行われる。図３（ａ）から図３（ｃ）は、タイムラプス観察を行った場合における試料Ａ（ブロックＡ１）の画像を示しており、図３（ａ）から図３（ｃ）に従って蛍光が発現した細胞が出現していく状態を示している。
【００５３】
図３（ａ）に示す状態においては、細胞状態判定部４３により、状態変化が判定された領域、すなわち、蛍光が発現した細胞Ｂ１，Ｂ２の領域が抽出される。そして、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により、上記のように抽出された細胞Ｂ１，Ｂ２の領域の画像が高解像度で取得される。
【００５４】
図３（ｂ）に示す状態においては、細胞状態判定部４３により、状態変化が判定された領域、すなわち、細胞Ｂ１，Ｂ２の領域に加えて、新たに蛍光が発現した細胞Ｂ３，Ｂ４の領域が抽出される。そして、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により、上記のように抽出された細胞Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４の領域の画像が高解像度で取得される。
【００５５】
図３（ｃ）に示す状態においては、細胞状態判定部４３により、状態変化が判定された領域、すなわち、細胞Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４の領域に加えて、新たに蛍光が発現した細胞Ｂ５，Ｂ６，Ｂ７の領域が抽出される。そして、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により、上記のように抽出された細胞Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４，Ｂ５，Ｂ６，Ｂ７の領域の画像が高解像度で取得される。
【００５６】
次に、図６に示すように、試料ＡのブロックＡ２についても、ブロックＡ１と同様の処理が行われ、状態の変化が検出されない場合には、高解像度での撮影を行わない。以降、同様に試料Ａの他のブロックについても、ブロックＡ１，Ａ２と同様の処理が順次行われ、試料Ａ全体について状態の変化した領域が高解像度で撮影される。
【００５７】
以上のように、本実施形態に係る観察装置１によれば、光学顕微鏡観察部２０により試料Ａの画像が時間間隔をあけて複数取得され、細胞状態判定部４３によりこれらの画像が比較されて試料Ａの状態変化が判定される。そして、領域抽出部４４により状態変化が判定された領域が抽出され、この領域の画像が、走査型顕微鏡観察部３０により光学顕微鏡観察部２０よりも高解像度で取得される。
【００５８】
このようにすることで、観察中に状態が変化した領域（例えば、細胞核内の微細構造が変化した細胞）を高解像度で撮影することができ、その状態変化の様子を観察することができる。また、観察中に状態が変化しない領域については高解像度で画像を取得する必要性を排除することができ、状態変化が判定された領域の画像のみを速やかに且つ高解像度で取得することができる。
【００５９】
また、細胞状態判定部４３が、パラメータ入力部４１により入力されたパラメータを用いて試料Ａの状態変化を判定することで、観察を行いたい対象に応じて、試料Ａの状態変化を判定するための基準となるパラメータをパラメータ入力部４１に入力して、その状態変化を観察することができ、様々な観察対象についての状態変化の観察が可能となる。なお、このパラメータは、図示しないメモリに予め記憶させておくこととしてもよい。
【００６０】
また、光学顕微鏡観察部２０を、例えばＣＣＤ等の２次元撮像素子とすることで、高速で試料Ａの画像を取得することができ、取得した画像を試料Ａの状態変化の判定用の画像として用いることができる。
【００６１】
また、走査型顕微鏡観察部３０をレーザ走査型顕微鏡とすることで、状態が変化した領域の画像を高解像度で取得することができる。また、レーザ光を励起光として試料Ａからの蛍光をＰＭＴ３６により検出することで、状態変化が判定された領域のみに励起光を照射し、観察中に状態が変化しない領域には励起光を照射しないようにすることができ、状態が変化しない領域の退色を防止することができる。
【００６２】
なお、本実施形態において、試料Ａの状態変化を判定するための基準となるパラメータとして、試料Ａの像を構成する画素群の輝度を例に挙げて説明したが、これに代えて、試料Ａの像を構成する画素群の輝度、画素数、色のいずれか、もしくはその組み合わせでよい。
【００６３】
以下に、試料Ａの状態変化を判定するための基準となるパラメータとして、色を採用した場合について説明する。
この場合には、例えば細胞の周期によって異なる色の蛍光を発する蛍光プローブ（例えばＦＵＣＣＩ）を試料Ａに加え、図７（ａ）から図７（ｃ）に示すように、試料Ａの状態の変化、すなわち色の変化に応じて撮影が行われる。
【００６４】
図７（ａ）から図７（ｃ）は、タイムラプス観察を行った場合における試料Ａ（ブロックＡ１）の画像を示しており、図７（ａ）から図７（ｃ）に従って細胞周期が進行し、各細胞の色が変化していく状態を示している。ここでは、緑蛍光（Ｓ，Ｇ２，Ｍ期）の細胞を撮影対象とした例を説明する。
【００６５】
図７（ａ）に示す状態においては、細胞Ｂ１〜Ｂ７のうち、緑蛍光を発する細胞は存在しないため、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）による撮影は行われない。
図７（ｂ）に示す状態においては、細胞Ｂ３から緑蛍光が発生しており、この状態変化が細胞状態判定部４３により判定され、細胞Ｂ３の領域が領域抽出部４４により抽出される。そして、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により、このように抽出された細胞Ｂ３の領域の画像が高解像度で取得される。
【００６６】
図７（ｃ）に示す状態においては、細胞Ｂ２，Ｂ３，Ｂ５，Ｂ６，Ｂ７から緑蛍光が発生しており、この状態変化が細胞状態判定部４３により判定され、細胞Ｂ２，Ｂ３，Ｂ５，Ｂ６，Ｂ７の領域が領域抽出部４４により抽出される。そして、走査型顕微鏡観察部３０（ＰＭＴ３６）により、このように抽出された細胞Ｂ２，Ｂ３，Ｂ５，Ｂ６，Ｂ７の領域の画像が高解像度で取得される。
【００６７】
上記のように、試料Ａの状態変化を判定するための基準となるパラメータとして、色を採用した場合には、例えば細胞の周期によって異なる色の蛍光を発する蛍光プローブを試料Ａに加えることで、その状態変化、すなわち細胞周期の進行をリアルタイムで観察することができる。
また、パラメータとして画素数を採用した場合には、例えば大きさの変化する細胞をリアルタイムで観察することができる。
【００６８】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
【符号の説明】
【００６９】
Ａ 試料
１ 観察装置
１０ 顕微鏡本体
１３ 電動ステージ
１４ 対物レンズ
１６ 光路切替部
２０ 光学顕微鏡観察部（第１の画像取得部）
２１ 光源
２４ ダイクロイックミラー
２６ ＣＣＤ（２次元撮像素子）
３０ 走査型顕微鏡観察部（第２の画像取得部）
３１ レーザ光源
３２ 光合成部
３３ ＸＹスキャナ（走査部）
３６ ＰＭＴ（光検出部）
４０ ＰＣ
４１ パラメータ入力部
４２ 細胞検出部
４３ 細胞状態判定部（判定部）
４４ 領域抽出部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の画像を取得する第１の画像取得部と、
該第１の画像取得部により時間間隔をあけて取得された複数の画像を比較して、前記試料の状態変化を判定する判定部と、
該判定部により状態変化が判定された領域を抽出する領域抽出部と、
該領域抽出部により抽出された領域の画像を、前記第１の画像取得部よりも高解像度で取得する第２の画像取得部とを備える観察装置。
【請求項２】
前記試料の状態変化を判定するための基準となるパラメータを入力するパラメータ入力部を備え、
前記判定部が、前記パラメータ入力部により入力されたパラメータを用いて前記試料の状態変化を判定する請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記パラメータが、前記試料の像を構成する画素群の輝度、画素数、色のいずれか、もしくはその組み合わせである請求項２に記載の観察装置。
【請求項４】
前記第１の画像取得部が、２次元撮像素子である請求項１に記載の観察装置。
【請求項５】
前記第２の画像取得部が、
前記試料上でレーザ光を走査する走査部と、
該走査部による走査位置に対応付けて前記試料からの光を検出する光検出部とを有する請求項１に記載の観察装置。
【請求項６】
時間間隔をあけて試料の画像を複数撮影する第１の画像取得ステップと、
該第１の画像取得ステップにより時間間隔をあけて撮影された複数の画像を比較して、前記試料の状態変化を判定する判定ステップと、
該判定ステップにより状態変化が判定された領域を抽出する領域抽出ステップと、
該領域抽出ステップにより抽出された領域の画像を、前記第１の撮像ステップよりも高解像度で撮影する第２の画像取得ステップとを含む観察方法。
【請求項１】
試料の画像を取得する第１の画像取得部と、
該第１の画像取得部により時間間隔をあけて取得された複数の画像を比較して、前記試料の状態変化を判定する判定部と、
該判定部により状態変化が判定された領域を抽出する領域抽出部と、
該領域抽出部により抽出された領域の画像を、前記第１の画像取得部よりも高解像度で取得する第２の画像取得部とを備える観察装置。
【請求項２】
前記試料の状態変化を判定するための基準となるパラメータを入力するパラメータ入力部を備え、
前記判定部が、前記パラメータ入力部により入力されたパラメータを用いて前記試料の状態変化を判定する請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記パラメータが、前記試料の像を構成する画素群の輝度、画素数、色のいずれか、もしくはその組み合わせである請求項２に記載の観察装置。
【請求項４】
前記第１の画像取得部が、２次元撮像素子である請求項１に記載の観察装置。
【請求項５】
前記第２の画像取得部が、
前記試料上でレーザ光を走査する走査部と、
該走査部による走査位置に対応付けて前記試料からの光を検出する光検出部とを有する請求項１に記載の観察装置。
【請求項６】
時間間隔をあけて試料の画像を複数撮影する第１の画像取得ステップと、
該第１の画像取得ステップにより時間間隔をあけて撮影された複数の画像を比較して、前記試料の状態変化を判定する判定ステップと、
該判定ステップにより状態変化が判定された領域を抽出する領域抽出ステップと、
該領域抽出ステップにより抽出された領域の画像を、前記第１の撮像ステップよりも高解像度で撮影する第２の画像取得ステップとを含む観察方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−１１８１２６（Ｐ２０１２−１１８１２６Ａ）
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２６５４４１（Ｐ２０１０−２６５４４１）
【出願日】平成２２年１１月２９日（２０１０．１１．２９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月２９日（２０１０．１１．２９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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