解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査
【課題】スリット絞りに付随する深さ解像度の低下なしに、速い撮像を可能にする。
【解決手段】査型レーザ顕微鏡が提供され、この顕微鏡は、照明用放射線源（１０５）から放出された照明用放射線経路（Ｂ）内の照明用放射を試料（１０３）に向けるビーム・スプリッタ（１１３）を備えており、ビーム・スプリッタ（１１３）は、試料（１０３）で鏡面反射された照明用放射を検出器機構（１０４）へは通過させず、そのために照明用放射線経路（Ｂ）の瞳内に配置されており、かつビーム・スプリッタ面上の、光軸（ＯＡ）の突破点を中心とする円上にある少なくとも３つの点で照明用放射のためにミラー・コーティングされたビーム・スプリッタ面（１２２）を有することによって、部分的にミラー・コーティングされており、これにより、試料（１０３）一面に周期的に分布する照明スポットの形の干渉パターンが試料（１０３）内に生じる。
【解決手段】査型レーザ顕微鏡が提供され、この顕微鏡は、照明用放射線源（１０５）から放出された照明用放射線経路（Ｂ）内の照明用放射を試料（１０３）に向けるビーム・スプリッタ（１１３）を備えており、ビーム・スプリッタ（１１３）は、試料（１０３）で鏡面反射された照明用放射を検出器機構（１０４）へは通過させず、そのために照明用放射線経路（Ｂ）の瞳内に配置されており、かつビーム・スプリッタ面上の、光軸（ＯＡ）の突破点を中心とする円上にある少なくとも３つの点で照明用放射のためにミラー・コーティングされたビーム・スプリッタ面（１２２）を有することによって、部分的にミラー・コーティングされており、これにより、試料（１０３）一面に周期的に分布する照明スポットの形の干渉パターンが試料（１０３）内に生じる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査に関し、特に、検査すべきルミネセンスを発する試料を励起用放射で照明し、ルミネセンスが励起された試料の画像を取得する方法に関する。本発明はさらに、試料の解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査を行うための顕微鏡に関し、この顕微鏡は、ルミネセンスを励起するために試料に励起用放射を照射する手段および励起された試料の画像を取得するための手段を有する。
【０００２】
本発明はさらに、照明用放射線源および検出用放射線経路を備えた走査型レーザ顕微鏡に関し、この検出用放射線経路は、試料内で励起および／または後方散乱した放射を光軸に沿って検出器機構に導き、この検出用放射線経路内には、照明用放射線源から放出された照明用放射線経路内の照明用放射を試料に向けるビーム・スプリッタが設けられており、その際、ビーム・スプリッタは、試料で鏡面反射された照明用放射を検出器機構へは通過させず、そのために照明用放射線経路の瞳内に配置されており、かつ部分的にミラー・コーティングされている。
【背景技術】
【０００３】
生物プレパラートを検査するための、光学顕微鏡検査の従来の適用分野はルミネセンス顕微鏡検査である。その際、細胞の一部などの試料を特異的に標識するために、特定の色素（いわゆるリン光体または蛍光体）を使用する。前述のように、試料を励起用放射で照明し、それにより励起されたルミネセンス光を適切な検出器で捕捉する。このために光学顕微鏡には通常、２色性ビーム・スプリッタがブロック・フィルタと組み合わせて設けられており、それらによって蛍光放射が励起用放射から分離され、別々の観察が可能となる。この措置により、光学顕微鏡において、異なる色に着色された個々の細胞部分の表示が可能になる。もちろん、プレパラートの異なる構造にそれぞれ特異的に沈着する様々な色素で、プレパラートの複数の部分を同時に着色してもよい。この方法をマルチ・ルミネセンスと言う。それ自体が、つまり色素添加なしで、ルミネセンスを発する試料を測定することもできる。
【０００４】
ルミネセンスとは、ここでは通例通り、リン光および蛍光の上位概念として理解されており、したがって両方の過程を含んでいる。
さらに、試料検査に走査型レーザ顕微鏡（ＬＳＭとも略す）を使用することが知られており、このＬＳＭは、３次元で照らし出された画像から、共焦点検出構成（共焦点ＬＳＭのこと）または非線形の試料の相互作用（いわゆる多光子顕微鏡検査）によって、対物レンズの焦点面内にある平面だけを再現する。これにより１つの光学的断面が取得され、引き続き試料の様々な深度での複数の光学的断面を記録すれば、適切なデータ処理装置を用いて、様々な光学的断面から構成される試料の３次元画像を生成することができる。このため走査型レーザ顕微鏡検査は、厚いプレパラートの検査に適している。
【０００５】
もちろん、ルミネセンス顕微鏡検査と走査型レーザ顕微鏡検査とを組み合わせたものも使用されており、この場合は、ルミネセンスを発する試料を、様々な深度面において、ＬＳＭで結像させる。
【０００６】
原理的に、光学顕微鏡およびＬＳＭの光学的解像度は、物理法則により回折によって制限されている。この制限内で最良の解像を得るために、例えば４Ｐｉ構成または定在波場による構成のような特殊な照明構成が知られている。それにより解像度は、典型的なＬＳＭに比べて、特に軸方向で、明らかに改善され得る。さらに非線形のデポピュレーション過程により、回折によって制限されている共焦点ＬＳＭに比べて解像度を最高で１０倍まで高めることができる。
【０００７】
図１ａ／図１ｂは、例えば米国特許第５８６６９１１号に記載されているようなこの方法を示している。その際、解像度を高めるために、２つの波長を有する光放射を作用させる。一方の波長の光放射が、励起光線１として測定試料上に対物レンズで合焦され、そこでルミネセンス、ここでは蛍光を励起する。図１ａ／図１ｂには、簡略化のため１次元の場合のみが示されている。位置解像度の向上は、もう一方の波長を有する光線２が、励起光線によって励起された蛍光状態を部分領域でデポピュレートすることによって行われる。そのためこの光線は「デポピュレーション放射」とも呼ばれる。図１ａからよく分かるように、この場合、照射は、例えばデポピュレーション光線２の主ピークと励起光線１の主ピークが部分的に重なるように行われる。励起用放射１で照明された領域の縁部にある試料の、この「脱励起」により、図１ｂからよく分かるように、縮小されたボリューム３しか蛍光を放射しなくなる。したがって、このボリューム縮小によって解像度が首尾よく高められる。
【０００８】
図２ａ〜図２ｃは、このようなデポピュレーションを起こし得る、３つの可能なメカニズムを示している。図２ａには、誘導放出による脱励起（ＳＴＥＤ）過程が示されている。励起用放射がレベルＳ１の蛍光体に当たる（矢印Ａ）。このように励起されたレベルＳ１が、蛍光波長領域内の波長を有する光放射によって、基底レベルＳ０に向かってデポピュレートされる。矢印ＳＥはこの誘導放出を示しており、その波長は、ルミネセンス（矢印Ｆ）の波長にほぼ等しい。したがって励起波長は、デポピュレーション放射よりストークス・シフトの分だけ波長が短い。つまり、この手法に基づいて解像度を高めるには、独国特許発明第４４１６５５８号明細書の形態の現況技術も証明しているように、２つの異なる光源が必要となる。
【０００９】
図２ｂは、ルミネセンスを放射できなくなるさらに高いレベルＳ２への励起（矢印Ａ＋）を行うことにより、励起されたレベルＳ１（矢印Ａ）をデポピュレートするさらなる可能な過程を分かりやすく示している。この引き上げは、英語でＥｘｃｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ（励起状態吸収）と呼ばれ、それ故、この措置は略してＥＳＡとも呼ばれる。この過程の適切な記述は、例えば米国特許第６６３３４３２号明細書に出ている。試料または色素内のエネルギー・レベルの、より高いレベルへの間隔が縮まるので、ＥＳＡ過程でのデポピュレーションには、より低いエネルギーを、したがってより長い波長を有する光源が励起のために使用される。つまりこの場合も、２つの異なる光源が必要である。
【００１０】
さらなるデポピュレーション方法は、蛍光のための、いわゆる可逆的可飽和光学蛍光遷移（Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｓａｔｕｒａｂｌｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）であり、これは例えば独国特許出願公開第１０３２５４６０号明細書に記載されており、図２ｃに分かりやすく示されている。この手法は、空間的に高解像度の結像のために色素を使用し、この色素は、図２ｃに分かりやすく示されているように、切替用放射線４によって、蛍光を発する第１の状態５から、色素が蛍光を発しない第２の状態６に、繰り返し移行可能であり、その色素は、第２の状態６から第１の状態５に戻ることができる。色素を含む試料は、部分領域で、切替用放射線４によって第２の状態６に移行し、その際、試料の定義された領域は除外される。次いで、励起用放射線１によって蛍光７が励起され、続いて記録される。その後、予め切替用放射線４を浴びなかった試料ボリュームからだけ蛍光７が発せられる。励起用放射線１と切替用放射線４を適切に重ねることにより、蛍光７が放出されるボリュームは、励起用放射線１の解像度および切替用放射線４の零点の尖鋭度から先験的に可能であるボリュームより小さくなる。
【００１１】
つまり、図２ａ〜図２ｃに基づく前述の３つの方法のすべてにおいて、蛍光の阻止は、励起用の波長とは異なる波長の光放射を使用することによって行われている。同時にこの光放射は、少なくとも１つの鋭く制限された、放射出力の局所的零点を有していなければならず、この零点によって、検出される蛍光放射の最終的な解像度が決まる。零点が極小より上にしか形成されず、かつ完全には零まで減少しない場合はすぐに、蛍光出力が、したがってこの方法の効率がさらに低下する。このことは、例えば光学構成の収差の際またはプレパラートにおいて生じる。
【００１２】
図３は、解像度を高めるための前述の３つの方法の１つ、図３の例ではＳＴＥＤ過程を使用した、既知の装置を示している。励起用放射線源８は、試料１０内にエアリー分布を発生させ、これにより、試料が基底レベルＳ０から励起状態Ｓ１に移行する。状態Ｓ１のデポピュレーションは、位相板１２の使用により試料１０内にドーナツ形またはトーラス形の光線分布１３を有する、デポピュレーション光源１１によって行われる。デポピュレートされていない、つまり脱励起されていない色素分子のルミネセンス放射が、検出器１４によって捕捉される。このデポピュレーションにより、顕微鏡の解像度は、エアリー分布から生じる回折限界を超える。このことは、通常の顕微鏡１６に比べて縮小された、この高解像顕微鏡の点像分布１５によって表されている。
【００１３】
解像度を高めるためのさらなる方法は、欧州特許第１１５７２９７号明細書で論じられている。この場合、構造化された照明を用いて、非線形過程を利用する。その際、この明細書は、非線形性として蛍光の飽和を挙げている。記載された方法では、構造化された照明により、光学システムの伝達関数に対する対象空間スペクトルの変位を実現する必要がある。スペクトルの変位とは、具体的には、空間周波数Ｖ０−Ｖｍ（Ｖｍは構造化された照明の周波数）の場合に、対象空間周波数Ｖ０が伝達されることを意味する。これにより、このシステムによって最大限に伝達可能な所定の空間周波数の際に、対象物の水平空間周波数の伝達関数の最大周波数より高い変位周波数Ｖｍだけを、遷移することが可能となる。この手法は、画像生成のための再現アルゴリズム、および１つの画像に対する複数の記録の使用を必要とする。
【００１４】
したがって本発明は第１に、複数の波長に頼らず、または費用のかかる画像再現アルゴリズムなしで、解像度の向上を達成する、ルミネセンス顕微鏡検査方法またはルミネセンス顕微鏡を提案することを課題とする。
【００１５】
走査型レーザ顕微鏡では、例えば独国特許出願公開第１９７０２７５３号明細書で説明したされているように、共焦点結像の走査によって試料を捕捉し、したがって蛍光顕微鏡検査による生物プレパラートの検査に広く用いられている。その際、試料内で蛍光が励起され、それによって、励起用放射に対してスペクトル的にストークス・シフトされた蛍光放射が発生し、次いでこの蛍光放射が、走査型レーザ顕微鏡によって共焦点検出される。共焦点検出の代わりに、例えば多光子励起の場合には遠視野検出を行うこともできる。
【００１６】
原理的に、走査型レーザ顕微鏡の場合、大抵は照明用放射および検出用放射が共通の対物レンズを介して導かれ、つまり検出用放射を検出器に導くためにも用いられる対物レンズを介して照明用放射が入射するので、前述の蛍光顕微鏡検査においては励起用放射である照明用放射を、検出すべき放射から分離しなければならないという課題がある。したがって、試料で後方反射された照明用放射を検出器へと通過させないか、またはできるだけ僅かな量しか通過させないようにするビーム・スプリッタを介して、照明用放射をカップリングさせるのが普通である。
【００１７】
蛍光顕微鏡検査では、検出用放射と励起用放射の間のストークスに基づく波長シフトを利用しており、ビーム・スプリッタには適切な２色性要素を使用するので、ビーム・スプリッタには、カラー・スプリッタまたは主カラー・スプリッタの概念も取り入れられている。しかしながら照明用放射と検出用放射がスペクトル的に区別されない場合、この手法は役に立たなくなる。２色性ビーム・スプリッタの分離度にも限界があり、このためビーム・スプリッタより後の検出用放射線経路に、試料で後方反射された励起用放射が残り、あるいは検出用放射がビーム・スプリッタを通り抜ける際に不必要に弱められる。
【００１８】
独国特許出願公開第１０２５７２３７号明細書は、スペクトルに依存しない手法を紹介している。そこで説明されている冒頭に挙げた種類の走査型レーザ顕微鏡は、試料から来る放射が一般的にインコヒーレント、つまり試料を指向せずに放出されるのに対し、鏡面反射された励起用放射または照明用放射が指向的に検出用放射線経路にカップリングすることを利用している。したがって独国特許出願公開第１０２５７２３７号明細書は、照明用放射線経路の瞳内に、光軸の突破点では透過性で、それ以外ではミラー・コーティングされたビーム・スプリッタを挿入することを提案している。それに加え、照明用放射をこの透過性のスポットに正確に合焦させる。したがってその結果として、試料の平面的照明が達成され、同時に試料で鏡面反射された照明用放射は再びビーム・スプリッタのミラー面に達し、このミラー面により検出用放射線経路のそれ以降の部分から外れて上に鏡面反射される。これに対し、試料内で生じた拡散性の検出用放射は、合焦されず、瞳全体を満たし、ほぼ完全に透過される。つまり、照明用放射のデカップリング度として理解されるこのビーム・スプリッタの効率は、透過性のスポットに対する瞳の面積比にのみによって与えられる。この効率は、照明用放射が適切に合焦される場合、９０％をはるかに超え得る。このように独国特許出願公開第１０２５７２３７号明細書によって達成されたビーム・スプリッタによって、スペクトルに依存せず、検出用放射の高い利得が可能となる。
【００１９】
既に説明したように、走査型レーザ顕微鏡検査は、特に生物試料の検査に適している。生物試料の場合、当然、撮像に必要な時間が重要な要素であり、生体試料を検査したい場合、または速く進行する経過を分析したい場合は特にそうである。したがって、走査型レーザ顕微鏡検査では常に、撮像速度の向上に努力が払われている。そのために、最近では、試料を点状の光スポットで（つまり共焦点ポイント・スキャナを用いて）走査するのではなく、ライン状の照明および走査（つまり共焦点のスリット絞り）を使用する顕微鏡システムの記述が増えている。これに関しても、独国特許出願公開第１０２５７２３７号明細書が適切なビーム・スプリッタを提供しており、このビーム・スプリッタでは、細長い長方形のライン状の領域がミラー・コーティングされている。
【００２０】
確かにライン走査システムは高い撮像速度を達成するが、スリット絞りによる共焦点結像では、その原理上、スリット絞り方向に沿ってある程度のクロストークが起こるので、深さ解像度はポイント走査システムに比べて低くなる。
【００２１】
したがって、本発明は第２に、スリット絞りに付随する深さ解像度の低下なしに、速い撮像が可能であるように、冒頭に挙げた種類の走査型レーザ顕微鏡をさらに発展させることを課題とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
最初に挙げた課題は、本発明によれば、特定のルミネセンス放射を放出させるための励起用放射を照射することによって試料を励起し、ルミネセンスを発する試料の画像を取得する、解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査方法によって解決される。この方法では、ルミネセンスを発する試料は、励起用放射出力を上昇させることにより、特定のルミネセンス放射を放出させるための励起性が、励起用放射出力の閾値にあたる最大値まで上昇した第１のルミネセンス状態から、特定のルミネセンス放射を放出するための試料の励起性が第１の状態に比べて低減された第２のルミネセンス状態に移行可能であり、その際、試料は、閾値より高い励起用放射出力を照射することによって第２の状態に移行可能であり、この試料は、少なくとも１つの閾値より高い出力極大および少なくとも１つの閾値より低い局所的な出力極小を有する励起用放射分布で、励起用放射を照射されることにより、ある部分領域では第１の状態に移され、隣接する部分領域では第２の状態に移され、ルミネセンスを発する試料の画像は、第１の状態にある試料領域および第２の状態にある試料領域を含んでおり、その際、ルミネセンスを発する試料の画像には、主として第１の状態にある試料領域が寄与し、それにより画像は、励起用放射分布より高い空間解像度を有するようになる。
【００２３】
第１の課題はさらに、解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査のための顕微鏡によって解決される。この顕微鏡は、励起用放射を試料に照射し、それにより試料内で特定のルミネセンス放射の放出を励起するルミネセンス励起手段と、ルミネセンスを発する試料の画像を取得する手段とを備えており、その際、励起手段が、少なくとも１つの閾値より高い出力極大、および少なくとも１つの閾値より低い局所的な出力極小を有する、特定の励起用放射分布で励起用放射を照射し、その際、その閾値が、試料の２つのルミネセンス領域を分割しており、第１の、励起用放射出力が閾値より低い状態の領域では、励起用放射出力を上昇させることにより、特定のルミネセンス放射を放出させるための励起性が、閾値で達成される最大値まで上昇し、第２の、閾値より高い励起用放射出力の際および／またはそれより後の状態の領域では、試料が特定のルミネセンス放射を放出するための励起性が、第１の領域に比べて低減されており、その際、画像を取得する手段が、閾値より低い励起用放射出力で照射された第１の領域にある試料領域、および閾値より高い励起用放射出力で照射された第２の領域にある試料領域を捕捉し、その際、試料画像には、主として第１の領域にある試料領域が寄与し、それにより画像が、励起用放射分布より高い空間解像度を有するようになる。
【００２４】
つまり、ルミネセンスを発する材料が基本的に２つの状態にあり得る試料を使用し、または顕微鏡を対応する試料用に設計する。閾値より低い励起用放射出力を照射した場合に生じ、励起手段によって達成される第１の状態では、材料がルミネセンス放射を放出し、その出力は、一般的に励起用放射出力と共に増加する。閾値より高い励起用放射出力を照射した場合に存在する第２の状態では、ルミネセンスが全く起こらないか、または低減される。第１の状態に比べて変化した吸収特性、および／または第１の状態とは異なる光学特性、例えば異なるスペクトル組成、偏光、もしくは寿命を有するルミネセンス放射の放出を、生じさせてもよい。もちろん、蛍光を発するか、または自発蛍光する多くの分子で構成された試料に関しては、２つの状態の領域が生じる。第１の状態の領域では、分子の多数が第１の状態にあり、第２の状態の領域では、多数が第２の状態にある。本発明によれば、ある試料領域は第１の状態領域（または略して状態）にされ、別の試料領域は第２の状態領域（または略して状態）にされる。第１の状態にされた、つまり閾値より低い励起用放射出力に当たる領域、および第２の状態にある領域、つまり閾値より高い励起用放射出力で照射される領域の付近の場所により、励起用放射分布より解像度を著しく高めることが可能となる。
【００２５】
つまり本発明による解決策は、非線形のルミネセンス特性曲線によって解像度の向上を達成し、この特性曲線は、放出されるルミネセンス出力を、励起用放射出力の関数として記述しており、極大を有する。その際、この特性曲線が、極大の両側で比較的急な傾斜を有する場合が有利であるが、絶対に必要というわけではない。励起のために、多光子過程を使用してもよい。
【００２６】
本発明による手法の場合、できるだけ第１の状態にある試料領域だけが画像にルミネセンス放射分の寄与をし、かつ第２の状態にある試料領域は、少なくとも比較的僅かな程度にルミネセンスを発するので、試料画像は、励起用放射分布を超える構造を示し、このため解像度の向上が達成される。この強度構造は、第１の状態と第２の状態との間の放出出力の差が明らかであればあるほど明確に現れる。
【００２７】
蛍光特性曲線の極大に対応する閾値より高い励起出力を照射することにより、第１の状態より少ない蛍光が励起される。そのために、この顕微鏡では、励起用放射分布が、閾値より高い出力を有する。現況技術でこれまで必要であったような別の波長の放射はもはや必要でない。したがって本発明による顕微鏡、または本発明による方法を実施するための装置は、著しく簡略化されており、特に光源は１つしか必要なく、その解像度が画像の品質に影響を及ぼす。比較的広い波長領域をカバーする必要はないので、励起用放射のカップリングに関する色要件も、現況技術に比べて明らかに簡単になる。
【００２８】
照射される励起用放射分布が、伝導の閾値を考慮したものであるので、顕微鏡は試料に同調される。
本発明による手法では、それだけでなく、閾値より高い励起用放射出力で照射した後に永続的にまたは少なくともある程度の期間、励起性が明らかに低下する、または全くなくなる試料を使用する場合、（例えばＳＴＥＤまたはＥＳＡの手法の際に必要であるように）閾値より高い励起用放射出力で照明する試料領域を、前もって「標準」に励起することは、絶対に必要なわけではない。
【００２９】
閾値より高い励起用放射出力では、ルミネセンスを発せず、かつ／または特定のルミネセンス放射とは異なる特性を有するルミネセンス放射を放出し、かつ／または励起用放射に対し、変更された、ルミネセンスの減少をもたらす吸収特性を有する、試料または色素を使用することが好ましい。
【００３０】
したがって本発明によれば、閾値より高い励起用放射強度で照明される試料領域からは、全くまたは僅かしか、ルミネセンス放射が画像生成に寄与しないことによって、解像度の向上が達成される。第２の状態にある試料が示す、つまり閾値より高い励起用放射出力の場合および／またはそれより後で、試料が示すルミネセンス特性によっては、画像へのこの寄与の低減が、異なる方法で行われる。試料が全くルミネセンスを示さない場合、第２の状態にある試料領域からは、もはやルミネセンス放射は検出されない。これに対し第２の状態にある試料が、光学特性が変化したルミネセンス放射を示す場合は、遮蔽のために、例えばスペクトル組成または偏光に関する適切な光学フィルタリングを行う。励起されたルミネセンス状態の寿命が変化している場合は、時間フィルタリングによって遮蔽を達成する。
【００３１】
第１の状態にある試料領域をさらに限定するため、またはこの試料領域の幾つかを選択するために、共焦点検出を行うことが好ましい。その場合、ルミネセンスのために励起されたボリュームを本発明に従って回折限界より縮小することによって、標準的な共焦点検出に勝る位置解像度が達成される。
【００３２】
基本的に、励起用放射で照明された領域の全てがルミネセンス画像に寄与するのではなく、閾値より高い励起用放射出力で照明された試料領域は、画像に全くまたはより少ししか含まれず、それによりルミネセンスを発する試料のボリュームが、励起された試料のボリュームに比べて空間的に縮小されるので、自動的に、励起用放射の照射に比べて解像度が高くなる。画像中には、励起用放射分布には存在しなかった光学的構造が認められる。つまり画像の解像度は、励起用放射カップリングの解像度より高くなっている。
【００３３】
特に有利な方法では、励起用放射とは異なる光学特性を有するリセット用放射を照射することにより、第２の状態から再び（元の）第１の状態に戻すことのできる試料または色素を使用し、あるいは本発明による顕微鏡をこの試料または色素に同調させる。顕微鏡は、そのために適切な手段を有している。これは、第２の状態が、少なくともほぼ可逆的な状態にあることを意味する。閾値より高い励起用放射出力を照射することによってルミネセンス画像から遮蔽された領域は、次いでリセット用放射を照射した後に、再び第１の状態での標準のルミネセンスに励起することができる。このように、さらに発展された方法または、このように形成された顕微鏡は、試料の様々な領域を何度も結像させる適用例に適している。したがって、これは、第２の状態で、つまり閾値より高い励起用放射で照明した後に、励起用放射に対する感受性の低下を示す試料または色素を使用する適用例に好ましく、その際、励起用放射とは異なる光学特性を有するリセット用放射を照射することにより、感受性の低下が、少なくとも部分的に戻される（かつ第１の状態が回復される）。少なくとも閾値より高い励起用放射出力で照明された試料領域が、リセット用放射で照射される。その際、試料を再び第１の状態に移すリセット用放射が、解像度向上の達成に全く寄与せず、つまり、非常に大まかにしか構造化されず、または全く構造化されずに、試料にカップリングさせることもできることが重要である。
【００３４】
本発明の特に有利な変更形態では、ルミネセンス特性に関し再び第１の状態に戻し得る試料により、走査による画像生成が可能となる。その際、試料は、例えばスキャナ機構によって、例えばスポット領域、ライン領域、またはマルチ・スポット領域で走査することができる。その場合、新たなスキャン・ステップの際に、その都度新たに閾値より高いおよび低い励起用放射を照射できるように、２つのスキャン・ステップの合間にその都度リセット用放射が照射される。それにより各スキャン・ステップで解像度の向上が達成され、これは全体として、明らかに解像度が改善された画像を提供する。
【００３５】
つまり励起用放射分布の照射は、蛍光放射の局部的構造を発生させる。これは大抵、励起用放射分布に関して対称的である。特定の蛍光を発する例えば点などの面形状を所望する場合、蛍光を発する試料の一部分を遮蔽するのが有利である。隣接する蛍光を発する領域同士の間には十分な間隔をおくことができるので、これは所望の面形状の解像度に影響を及ぼさずに可能である。
【００３６】
閾値より高くまたは低く試料を励起するために、原則的に２つの変形形態が可能である。第１の変形形態では、原理的に回折によって制限される照明が行われ、その照明は、点状であってもよく、または径方向に対称的であってもよく、または既知のエアリー関数のように中心に極大を有することもできるが、しかし、かならずしもそうする必要はない。この励起分布の形状では、励起用放射分布が回折によって制限されていることが好ましい。
【００３７】
回折によって制限される励起用放射分布の場合、特に有利なことは、トーラス形の分布を使用することができ、この分布は、トーラス形の分布の核となる領域では閾値より高い励起用放射出力を有し、周縁領域では閾値より低い励起用放射出力を有する。その場合、トーラスによって画定される中心部では、回折によって制限されるエアリーの円盤よりも明らかに小さい点状のルミネセンス分布が達成される。もちろん、前述の対称の理由から、トーラスの外縁部にある試料領域も、閾値より低い励起用放射出力で照明されるので、そこでもルミネセンス放射が励起される。点状の蛍光画像を生成するためには、この領域を、例えばトーラスによって画定される中心部で発生するルミネセンス放射だけを通過させる共焦点検出によって遮蔽するのが実用的である。それでもなお、この場合、ルミネセンスを発する中心部は、共焦点検出自体の（回折によって制限される）解像度によって可能になるものより小さい。もちろん、別のやり方で遮蔽を達成することも可能である。例えば、外側領域のルミネセンス励起性を狙い通りに消すか、または画定された中心部の励起性を狙い通りに発生させることが可能である。したがって、本発明による方法または顕微鏡により、蛍光を発する領域の形状に同時に作用する場合、物理的な回折限界を超えた解像度が可能となる。
【００３８】
第２の変形形態では、平面的構造を有する照明を使用し、その際、この平面は、一方向において回折によって制限される１本または複数本の線として形成することもできる。照明された平面のうち、ある部分領域は閾値より高い励起用放射出力を有し、別の部分領域は閾値より低い励起用放射出力を有する。このような平面的な照明により、比較的大きな試料を、特に速く走査することが可能となる。もちろん、同じことが、マルチ・スポット構成にも当てはまり、このマルチ・スポット構成では、回折によって制限される複数の照明スポットが試料に当たり、これらのスポットは、明確に別々に検出できるほど、空間的に互いに離れている。平面的構造を有する試料照明としては、特に縞格子または十字格子が考慮される。
【００３９】
試料によっては、第２の状態にある試料領域がなおある程度の残余ルミネセンスを示すことがある。これは、試料自体によって、または例えば拡散によって異なる照明がなされた試料領域の間を、ルミネセンスを発する材料が移動することによって、引き起こされている可能性がある。例えば試料自体が邪魔な自発蛍光をしているか、または第２の可逆的な状態に移り得ない別の色素を含んでいる可能性がある。その結果、閾値より高い励起用放射出力で照明された領域内に、残余ルミネセンス放射が存在することになる。原理的にこの残余ルミネセンスは、検出時に適切な閾値によって抑えることができる。
【００４０】
画像信号が改善される場合、それ自体既知のロック・イン技術を使用することで、背後の放射が抑えられる。このために、第２の状態に移される試料領域、または第１の状態に留まる試料領域への励起用放射を、基準周波数に基づいて強度変調し、ルミネセンス放射の検出の際、ロック・イン技術の過程で、この基準周波数を使用する。そのためにこの顕微鏡は、変調器と、ルミネセンス検出器の後に接続されたロック・イン増幅器とを有する。このロック・イン増幅器は、変調された信号を分離し、変調されていない信号を抑え、これにより前述の残余ルミネセンスの場合にも、利用信号のピーク・レベルを下げずに、高解像度の検出が可能になる。これにより変調された信号の全てが高解像の画像に寄与する。
【００４１】
残余ルミネセンスを抑えるための可能な代替方法は、２つの画像を互いに差し引く差分法である。第１の画像は閾値より低い励起用放射出力で記録され、第２の画像は閾値より高い励起用放射出力で記録される。両方の画像の差が、残余ルミネセンスの分離を引き起こす。残余ルミネセンスを抑えるための可能な別の手法は、本発明の変形形態で使用される試料または色素のさらなる特性、例えば第１または第２の状態での異なるルミネセンス寿命の評価、第１または第２の状態でのルミネセンス放射の異なる光学特性の利用などを活用するものである。
【００４２】
さらに、有利な実施形態では、焦点深度を高めるために、検出すべき焦点面の外にある試料部分を遮蔽する。これにより同時に、軸方向の解像度が、横方向の解像度からデカップリングされる。そのためにまず試料を、構造化せずに第２の状態に移し、次いで焦点面内だけを戻す。同じことが、焦点面内に極小を有する、励起用放射強度の適切な深さ構造化によって達成される。そのために、独国特許出願公開第１０２ ５７ ４２３号明細書の原理に基づく構成を、適切に改変することができる。
【００４３】
冒頭に挙げた本発明による顕微鏡は、有利な実施形態では、上に挙げたさらなる形態の１つまたは複数を実施している。励起用放射は、ルミネセンスを励起するためにも、ルミネセンスを阻止または低減するためにも使用されるので、有利なことに励起用放射を放出する励起用放射源を１つしか備えなくてよく、この励起放射源の後には、ビーム・プロフィルに極小を好ましくは可変の深さで形成する機構が配置されており、その際、極小の出力は閾値より低い。
【００４４】
第２の課題は、本発明によれば、照明用放射線源および検出用放射線経路を備えており、この検出用放射線経路が、試料内で励起および／または後方散乱された放射を、光軸に沿って検出器機構に導き、この検出用放射線経路内に、照明用放射線源から放出された照明用放射線経路内の照明用放射を試料上に向けるビーム・スプリッタが備えられており、ビーム・スプリッタが、試料で鏡面反射された照明用放射を検出器機構へは通過させず、そのために照明用放射線経路の瞳内に配置されており、かつ部分的にミラー・コーティングされている走査型レーザ顕微鏡であって、ビーム・スプリッタが、検出用放射線経路内にあるビーム・スプリッタ面を有しており、このビーム・スプリッタ面が、ビーム・スプリッタ面の光軸突破点を中心とした円上にある３つの点でミラー・コーティングされており、照明用放射線源が、点の数に対応する数の部分放射線を発生させ、この部分放射線を、試料一面に周期的に分布する照明スポットの形の干渉パターンが試料内に生じるように、ビーム・スプリッタの点上に合焦させる、走査型レーザ顕微鏡によって解決される。
【００４５】
もちろん、本発明による解決策は、逆にビーム・スプリッタが検出用放射を外に鏡面反射し、鏡面反射された照明用放射を通過させることも可能である。そのために、照明用放射線源および検出用放射線経路を備えており、検出用放射線経路が、試料内で励起および／または後方散乱された放射を光軸に沿って検出器機構に導き、この検出用放射線経路内に、照明用放射線源から放出された照明用放射線経路内の照明用放射を試料上に向けるビーム・スプリッタが備えられており、ビーム・スプリッタが、試料で鏡面反射された照明用放射を検出器機構へは通過させず、そのために照明用放射線経路の瞳内に配置されており、かつ部分的にミラー・コーティングされている、走査型レーザ顕微鏡であって、ビーム・スプリッタが、検出用放射線経路内にある反射性のビーム・スプリッタ面を有しており、このビーム・スプリッタ面が、ビーム・スプリッタ面上の、光軸突破点を中心とする円上にある少なくとも３つの点で、照明用放射のためにミラー・コーティングされておらず、照明用放射線源が、点の数に対応する数の部分放射線を発生させ、この部分放射線を、試料一面に周期的に分布する照明スポットの形の干渉パターンが試料内に生じるように、ビーム・スプリッタの３つの点上に合焦させる、走査型レーザ顕微鏡が提供される。
【００４６】
本発明は、簡単な構成を用いて効率の高い点群生成を達成する。
本発明によれば、ビーム・スプリッタは、干渉によって生じたパターンの形の点群で試料を照明するように形成される。これにより、照明されたスポットで検出器機構が多点検出を行う場合、複数の点の並行照明およびこの同時に照明された点の並行走査が可能となる。その結果、深さ解像度を損なわずに、一点照明に比べて点の数だけ倍増された走査速度が得られる。規則的な点群パターンによる試料の照明（蛍光顕微鏡検査においては励起）は、本発明によれば、干渉効果を活用して行われ、そのため、照明源が準備する照明用放射線の数は、規則的なパターン内の照明スポットの数よりかなり少ない。干渉効果のためには、ビーム・スプリッタに少なくとも３つの反射性の点／透過性の孔があればよく、この点／孔に照明用放射が合焦されるので、少なくとも３つの照明用放射線が、ビーム・スプリッタでカップリングされる。この数の照明用放射線（本明細書での「放射線」の概念は、対応する放射線束と同義に使用される）は簡単に生成可能である。例えば出力放射線の場合は、２つのスプリッタ要素しか必要でない。したがって照明用放射線源は、レーザ放射線を放出するレーザと、レーザ放射線を少なくとも３つの部分放射線に分け、光学系機構によって点／孔上に合焦させるスプリッタ機構とを有することが好ましい。
【００４７】
反射性または透過性の点の数は、３つに限定されているわけではない。より多くの点を使用してもよく、この点は、円上に対称的に、または円の線に沿ってできるだけ整った分布または等間隔であるべきで、但し分離していなければならない。４つの点の場合、これらの点は、例えば中心に突破点がある正方形の角にあってもよい。
【００４８】
干渉を活用して照明をもたらすビーム・スプリッタを備えた本発明による顕微鏡は、既に説明したように、照明および場合によっては検出を並行に行うことによって、高い走査速度を達成する。これに加え有利な実施形態では、画像平面の走査は、周期的な点群パターンの周期内だけの変位を実施すればよいので、走査に必要な走査メカニズムに対する要件を大幅に下げることができる。つまり、例えば放射線経路内で作動する光学スキャナとして走査機構が形成されている場合、比較的小さい偏角を達成すればよい。このことは、機器の簡略化と同様に、走査速度に影響を及ぼす。したがって、一変更形態では、照明方向においてビーム・スプリッタの後方に走査機構が配置されることが好ましく、この走査機構は、試料全体の点群パターンの変位を、点群パターンの周期内で行う。その際、放射線を偏向するように作用する走査機構だけでなく、もちろん、例えばいわゆる卓上スキャナによる試料の移動を使用してもよい。
【００４９】
照明の点群パターンを干渉に基づき生成することで、光スポットの周りの暗い領域に対する光スポットの明るさを簡単に調節でき、つまり、それぞれ対角線上で向かい合って合焦された部分放射線の強度を変化させることによって調節を行うことができる。したがって本発明の一変更形態では、変化させるための適切な手段を備えており、この手段は、照明方向においてビーム・スプリッタの前に配置されており、例えば調整可能な減衰要素の形で形成されている。
【００５０】
照明用放射線経路において、基本的に、ビーム・スプリッタが中に配置された瞳の結像が試料上で行われる場合、点群パターン内の明るいスポットの数は、専ら試料上の照らし出された領域に依存する。試料の照明された領域、つまり試料点の数は、ビーム・スプリッタと試料との間の結像の焦点距離を変化させる手段によって簡単に作用され得る。言い換えれば、光学結像によって捕捉される画像面積を変化させる手段により、自動的に、干渉によって試料上に生じる照明点の数が変化する。
【００５１】
既に説明したように、試料上で同時に照明されたスポットを並行検出すると、撮像速度が高まる。検出用放射線経路が、マトリクス検出器内で終端する場合、そのような並行走査を特に簡単に達成することができ、この検出器の前には、任意で、照明パターンに同調させたピンホール・マスクを配置してもよい。しかしもちろん、マトリクス検出器の空間解像要素も、ピンホール・マスクの機能を引き受けることができる。
【００５２】
ビーム・スプリッタの反射性要素は、照明用放射だけを反射しなければならず、検出用放射は反射しない。つまりビーム・スプリッタは２色性に形成してもよい。
点群パターン内の点の間隔は、ビーム・スプリッタでの焦点の間隔を介し、つまり円半径を介して調整し得る。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ａ及びｂは現況技術の方法に関する位置依存性の出力分布図。
【図２】ａ−ｃは現況技術に基づく解像度向上のための方法を示す概略図。
【図３】現況技術に基づき解像度を高めた蛍光顕微鏡を示す図。
【図４】試料の蛍光特性曲線を示す図。
【図５】本発明による解像度向上を示す概略図。
【図６ａ】第１の方法形態に基づき解像度を高めた際に生じる１次元または２次元の出力分布図。
【図６ｂ】第２の方法形態に基づき解像度を高めた際に生じる１次元または２次元の出力分布図。
【図７】第３の方法形態を示す図６ａ／ｂと同様の図。
【図８ａ】第４の方法形態を示す図６ａ／ｂと同様の図。
【図８ｂ】第５の方法形態を示す図６ａ／ｂと同様の図。
【図９ａ】第１の解像度を高めた顕微鏡を示す概略図。
【図９ｂ】第１の解像度を高めた顕微鏡を示す概略図。
【図１０】図９の顕微鏡の作用方法を明らかにするための図６ａと同様の出力分布図。
【図１１ａ】特性曲線を示す図４と同様の図。
【図１１ｂ】第２の解像度を高めた顕微鏡を明らかにするための出力分布図。
【図１２】第２の顕微鏡の概略図。
【図１３】第３の解像度を高めた顕微鏡の概略図。
【図１４】第３の顕微鏡の機能方法を示す概略図。
【図１５ａ】第４の顕微鏡の一部の概略図。
【図１５ｂ】第４の顕微鏡の一部の概略図。
【図１６ａ】第４の顕微鏡の瞳内の励起用放射またはリセット用放射の分布図。
【図１６ｂ】第４の顕微鏡によって実現されるマルチ・スポット分布図。
【図１７】第４の顕微鏡の場合の蛍光分布図。
【図１８】第４の顕微鏡の一変形形態の瞳内の励起用放射またはリセット用放射の分布図。
【図１９】走査型レーザ顕微鏡の概略図。
【図２０】図１９の顕微鏡のための照明源の代替実施形態を示す図。
【図２１】図１９の顕微鏡のビーム・スプリッタの俯瞰図。
【図２２】図１９の顕微鏡によってもたらされる試料上の照明パターンを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
以下に本発明を、図を参照しながら具体的に、より詳細に説明する。
以下では、方法技術に関する説明および顕微鏡の説明において、解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査のための様々な実施形態を示す。これは純粋に例として、様々な蛍光顕微鏡または蛍光顕微鏡検査方法に基づき行われる。もちろん、以下に説明する例示的実施形態、つまり方法形態および顕微鏡は、それとは別のルミネセンスを発する物質、例えばリン光を発する試料または色素にも使用可能である。以下で色素について説明する場合、これも例としてのみ理解されなければならない。もちろん、試料のプレパラート作成に使用可能な色素の代わりに、直接蛍光を発する（またはリン光を発する）物質も、試料として成立可能であり、それにより色素添加をしなくて済む。別の特性を示し、第２の状態に移せないような、追加の色素も使用可能である。さらに個々の方法形態または顕微鏡に対して説明した特徴は、説明した別の方法形態または顕微鏡にも使用可能であるので、ここでは説明していない組合せも可能である。
【００５５】
図４は、本発明により使用される色素に関する蛍光特性曲線１７を例として示している。この蛍光特性曲線１７は、放出された蛍光放射Ｆの出力Ｌを、励起用放射Ａの出力Ｌの関数として表している。図から分かるように特性曲線１７は、極大１８まではほぼ線形に、少なくとも単調に上昇し、その後、励起用放射出力に関する閾値１９の先では再び下降する。それぞれ閾値１９または極大１８の左と右にある２つの状態の領域が認められる。閾値１９より低い励起用放射出力が照射される場合、色素は、主に第１の状態５にある。第１の状態の色素は、蛍光放射を放出し得る。励起用放射出力が閾値１９より高くなると、第２の状態６への色素分子の変化が起こる。第２の状態６の色素分子は、蛍光を発することができず、かつ／または光学特性が変化した蛍光放射を放出し、かつ／または第１の状態５に対して変化した吸収特性を有する。蛍光の放出または吸収に関して変化する光学特性は、蛍光放射のスペクトル組成および／または偏光および／または寿命であり得る。結果として、第２の状態の領域では、第１の状態５で放出される蛍光放射の種類に比べて、蛍光放射Ｆの出力が再び減少する。
【００５６】
本発明は、励起用放射Ａの照射が、試料のある部分だけを第１の状態領域（または略して第１の状態）５にし、しかし試料の別の部分は第２の状態領域（または略して第２の状態）６にするために、特性曲線１７を使用する。そのため閾値１９より高い励起用放射出力で照明された／される領域は、特定の蛍光放射を減少させてしか放出しない。その際、第２の状態６が可逆的な状態である場合が有利である。これは少なくともある程度の時間の後または積極的な作用によって、一度、閾値１９より高い励起用放射出力で照射された色素が、再び第１の状態５の特性を示すことを意味する。発明者が、図４に基づく特性曲線を示すものとして認識している色素の例は、出版物 Ｒ．アンドウ他（Ｒ．Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．）「Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｆａｓｔ ｎｕｃｌｅｏｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ
ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｉｎｇ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４年１１月１９日、第３０６巻、１３７０〜１３７３ページに記載されているドロンパ（Ｄｒｏｎｐａ）という名称の物質である。この色素は、アマルガム社（Ａｍａｌｇａａｍ）［米国マサチューセッツ州ウォバーン（Ｗｏｂｕｒｎ）所在］が、ドロンパ・グリーン（Ｄｒｏｎｐａ−Ｇｒｅｅｎ）、コード番号ＡＭ−Ｖ００７１の名称で提供されており、これまでは細胞膜を通る輸送特性が検査される分子の蛍光標識に関連して知られている。この色素ドロンパは、４８８ｎｍの波長で励起させることができ、第２の状態６に励起された後は、４０５ｎｍの波長での放射によって再び第１の状態５に戻し得る。
【００５７】
試料を照明する際に、適切な励起用放射分布と組み合わせることにより、図４の特性曲線または対応する特性曲線を有する色素の使用が解像度を明らかに向上させる。その際、現況技術とは違い、１つの波長の放射だけを照射し、この放射だけが解像度に寄与する。色素が自発的に第１の状態５に戻らない実施形態では、リセット用放射を照射することによりリセットを達成し得るが、しかし、このリセットは解像度の向上のためには顧慮されない。
【００５８】
励起用放射Ａにより、基底レベルから第１の励起レベル（第１の状態５）への色素分子の励起と共に、蛍光の阻止またはデポピュレーション（第２の状態６）も達成される。デポピュレーションの場合は、第１の状態から第２の状態への色素分子の遷移が行われる。両方の状態は、互いに異なる光学的な蛍光特性を有している。励起用放射Ａで励起するとすぐに、高解像の蛍光画像が取得可能であり、その際、励起用放射Ａの光学解像度に関して解像度が高くなる。色素が第２の状態から自発的に第１の状態に戻らない場合、積極的に、例えば励起用放射Ａとは異なる光学特性を有するリセット用放射Ｒによってリセットを達成する。対応する概略図が図５に示されている。
【００５９】
例えば検査する試料Ｐは、元々、蛍光放射Ｆの出力が励起用放射Ａの出力によって上昇する第１の状態５にある。励起用放射Ａの照射は、個々の試料領域Ｂ２では、励起用放射出力が閾値１９より高くなるように行われる。別の領域Ｂ１では、励起用放射出力は閾値より低い。そのため励起用放射の出力が閾値１９より高いか低いかに応じて、幾つかの試料領域は第１の状態５にあり、別の領域は第２の状態６にある。図５は、励起用放射Ａの照射による、第１の状態５にある試料領域Ｂ１（図５の下半分の右側の部分）および第２の状態６にある試料領域Ｂ２（左側の部分）への試料の遷移を概略的に示している。第２の状態６にある試料領域Ｂ２は、とりわけ閾値１９より明らかに高い励起用放射出力が使用された場合、効率よく蛍光を発することができなくなる。その際、「蛍光を発する」という概念は、特定の特性を有する蛍光放射に関する。それはつまり、第２の状態６でも蛍光放射を放出することは完全に可能であるが、但し第１の状態５での蛍光放射とは異なる特性を有する。つまり第２の状態では、試料の吸収特性または／および蛍光特性が変化している。
【００６０】
第１の状態５のままである試料領域Ｂ１は、励起用放射Ａの照射後も、同じ蛍光放射Ｆを放出する。リセット用放射Ｒの照射（図５に、この工程が、対応する矢印によって分かりやすく示されている）は、試料Ｐ全体を、再び第１の状態５に持っていき、つまり異なる蛍光を発する２つの試料領域Ｂ１およびＢ２への分割が元に戻る。
【００６１】
第１の状態５にある試料領域Ｂ１および第２の状態６にある試料領域Ｂ２への試料の分割により、蛍光放射Ｆの放出を、励起用放射Ａで照明された試料Ｐの元々のボリュームより小さく制限することが可能となる。つまりこのため、蛍光を発する画像に、元々の励起用放射分布には存在しなかった構造が達成され得る。これは特性曲線１７の非線形性を巧みに利用することによって起こる。
【００６２】
図６ａおよび図６ｂは、解像度を高めるための励起用放射分布を推測できるように、２つの方法形態を示している。両方の図は、左に励起用放射分布または蛍光放射分布の１次元断面を示す。右はそれぞれ、上から見た蛍光放射分布の２次元画像である。
【００６３】
図６ａでは、点状に分布された励起用放射Ａが照射される。この分布は、この場合、回折に制限されたエアリー分布である。これにより色素では、蛍光放射Ｆが、楕円形のドーナツ分布で励起され、この分布は、横方向の２次元画像において、蛍光を発する円形リングとして示されている。試料領域Ｂ１だけが蛍光を発する。軸方向には、蛍光を発する楕円形のリングが現れる。この試料領域Ｂ１は、励起用放射の回折限界が許容される程に小さい。
【００６４】
これに対し図６ｂに示したように、同様に回折に制限されたドーナツ形の分布で励起用放射Ａを照射した場合、リング形の蛍光を発する領域に囲まれており、かつ縮小されたエアリー分布に対応する放出性の試料領域Ｂ１が生じる。このため断面図では、蛍光放射Ｆの分布内に３つのピークが試料領域Ｂ１として示されている。ここでも点像分布１６は、回折限界が許容される程に小さい。標準の点像分布を介した解像度の改善は、主に特性曲線１７および励起用放射Ａの出力分布からの組合せに依存する。
【００６５】
リング形の外側の領域を遮蔽するため、さらに共焦点検出ボリュームＤを適切に調整することで、真ん中のピークを選び出す共焦点検出を実施し得る。これは第３の方法形態として概略的に図７に示されている。検出もされた、蛍光を発する試料領域Ｂ１は、真ん中のピークから成る。全体として、例えば画像を生成するボリュームＢ（図７の右の図における点線）が達成されており、このボリュームは、通常の点像分布の２．５分の１の細さ、それどころか共焦点の点像分布の１．７分の１の細さである。図６ｂまたは図７の右の図に引かれたカーブが示すように、ドーナツ形の励起分布の場合、画像を生成するボリュームＢの結果として生じる分布または図６ｂの点像分布の真ん中のピークは、放射方向に対称的である。照明スポットを２つ使用する場合、スポットの極大を結ぶ線に沿って、解像度が最大に高められる。
【００６６】
代替として、図６ｂにおける蛍光を発する外側のリングは、共焦点検出ボリュームＤの領域内で、色素を第２の状態６から第１の状態５に狙い通りにリセットすることにより遮蔽される。この措置／原理は以下の通りである。まず励起用放射で、検査する試料区間が完全に第２の状態に達するように励起される。続いてリセット用放射Ｒを、共焦点検出ボリュームＤに適切な分布で照射し、これにより、ある試料部分がリセットされる。図７に基づく励起用放射分布Ａで再び励起すると、この試料部分にある画像を形成する領域Ｂだけが第１の状態に達し、図７の変形形態でも残っているような真ん中のピークの形において、蛍光放射Ｆを放出する。リング形の外側の領域は第２の状態に留まり、蛍光を発しない。
【００６７】
第４の方法形態では、例えば図８ａに示されているような構造化された平面的な照明が行われる。ｘ方向に正弦状に分布した励起用放射Ａは、正弦状の出力分布の谷で蛍光放射Ｆを発する。蛍光を発する試料領域Ｂ１は縞状である。しかしながら、この縞は、励起用放射Ａの正弦状の分布の縞より明らかに細い。これに関し、励起用放射Ａの正弦状の分布は、極小として零点を有していない、または有する必要がないことが有利となる。結果として生じる蛍光放射Ｆの分布は、その高さについては、励起極小の出力に依存するが、しかし幅については依存しない。つまり正弦状の励起用放射分布の極小の深さは、縞の幅には関係なく、そのため解像度にも関係ない。例では、励起用放射Ａの正弦状の縞の分布の周期は、その解像度の限界周波数に調整されている。検出器には、例えばマトリクス検出器を使用する。縞の幅、したがって解像度は、この解像度の限界周波数に対して６倍だけ改善されている。解像度の高い画像は、この縞パターンの変位によって取得される。
【００６８】
代替として、縞状の遠視野照明の代わりに、焦線状の照明を使用してもよく、その際、この線は、その長手軸に沿って（例えば正弦状に）変調されており、そのため、出力が閾値より高い線区間および閾値より低い線区間がある。走査運動は、線に対し垂直に、および線に沿って行われる。検出器は、適切に高く解像するライン検出器である。
【００６９】
図８ｂは、図８ａの第４の方法形態のさらなる形態を示している。この第５の方法形態では、解像度放射Ａの分布の構造化が、両方の横方向の軸において、つまり試料平面において行われ、そのためマトリクス状の照明スポット分布が得られる。これが図８ｂの左半分の断面図において１次元で示されている。明るい励起スポットから成るマトリクスが、光軸に対し垂直に、試料上に結像されている。各照明スポットに１つの検出器が割り当てられている。試料に対しスポット・パターンを変位させることで、点の間の隙間を同様に測定することができる。マトリクス状のパターンの変位を行わなければならない領域は、図８ｂに、領域Ｇ１として示されている。例えば通常の走査型レーザ顕微鏡によって既知のような、スポット・マトリクスの走査により、全体として、個々の領域Ｇ１から全ての領域Ｇ２が構成される。この並行化により、非常に高い走査速度が達成される。同時に解像度は、断面図での蛍光放射Ｆの細いピークが示すように、励起用放射分布の解像度を超えて高められている。
【００７０】
ここまでは横方向の解像度だけを説明してきたが、これらの実施形態に関して、軸方向の解像度も改善されている。
図９ａは、説明した方法形態のそれぞれを実現可能な走査型レーザ顕微鏡を示している。方法形態１〜方法形態３用の走査型レーザ顕微鏡２０は、例えば一点走査型顕微鏡として形成される。この顕微鏡は、励起モジュール２１と、顕微鏡モジュール２２と、検出器モジュール２３とを有している。顕微鏡モジュール２２では、試料２４が対物レンズ２５の焦点内にあり、この対物レンズの照明方向における手前に、鏡筒レンズ２６が接続されている。この光学系の前には走査光学系２７があり、この走査光学系によりスキャナ２８と共に、試料上での焦点の変位による試料２４の走査が可能となる。主カラー・スプリッタ２９は、励起用放射モジュール２１から顕微鏡モジュール２２へと放射をカップリングさせ、試料２４に受け止められた放射を、顕微鏡モジュール２２から検出器モジュール２３へと分離する。
【００７１】
励起モジュール２１は光源３０を備えており、この光源の放射は、主カラー・スプリッタ２９を介して、試料２４内の焦点に集束される。試料２４の焦点内で励起された蛍光放射Ｆは、対物レンズ２５によって集められ、主カラー・スプリッタ２９で、励起用放射Ａに対し変化したスペクトル特性に基づき、ピンホール光学系３１へとデカップリングされ、このピンホール光学系の後方には、ピンホール３２および（任意で）ブロック・フィルタ３３が接続されている。点検出器３４が、焦点での蛍光放射Ｆの出力を捕捉する。この捕捉は、追加としてスペクトル分解、偏光分解、および／または時間分解で行われる。検出器３４の信号は、走査型レーザ顕微鏡２０の稼働全体を制御する制御装置３５によって読み取られる。
【００７２】
解像度を高めるため、特定の出力分布で、焦点２４内への励起用放射Ａの照射を行う。励起モジュール２１内には、この出力分布を予め定め、かつ調整するために適切な構成が備えられている。図９ａの設計は、光源３０の放射線出力の５０％をデカップリングさせるビーム・スプリッタ３６を有している。実施形態においてビーム・スプリッタ３６は、偏光ビーム・スプリッタである。この方法で分けられた部分放射線は、その後、さらなるビーム・スプリッタ４０を介し、再び同じ放射線へと合わせられ、その際、部分放射線の強度および位相は前もって適切に調整される。追加として、片方の部分放射線内に位相要素３９が置かれ、この位相要素は、固定的な位相要素または可変に調整可能な位相要素として形成され得る。位相要素３９は、例えば位相が変化する領域４４および位相が中立な領域４９を有しているので、放射線内にドーナツ形の出力分布を生じさせる。ビーム・スプリッタ４０以降で、両方の部分放射線を重ね合わせることにより、図１０に基づく励起用放射Ａが得られる。位相要素３９の構成が、具体例として図９ｂに示されている。重ね合わせる前の両方の部分放射線の出力割合を調整するため、各部分放射線内にはさらに、可変の減衰器３７または３８が置かれている。
【００７３】
結果として、光軸に対し垂直に走るｘ軸に沿った断面図として図１０に示されているような、励起用放射Ａの出力分布が得られる。この分布は極小４５を有しており、その深さは、例えば制御装置３５で、減衰器３８または３７を調整することにより、つまり両方の部分放射線の相対的な出力を変化させることにより、可変に調整可能である。極小４５を適合させることで、同様に図１０に記された蛍光放射Ｆの強度を、最適に調整することができる。
【００７４】
可変に調整可能な位相要素を使用することで、部分放射線を形成せずに、極小４５の深さを調整することも可能である。このような位相要素として液晶から成るマトリクスが考慮されており、その場合、個々のピクセルのそれぞれの位相を調整可能である。もちろん、調整可能な極小４５を有するドーナツ形の放射線分布を生成するための、別の機構でもよい。
【００７５】
試料領域Ｂ２を第２の状態６から第１の状態５に任意でリセットするため、リセット用放射源４１を装備可能であり、このリセット用放射源は、第３のスプリッタ４２を介して、励起モジュール２１の励起用放射線経路内に組み込まれている。しかしながら、この設計は任意であるので、図９ａではこの要素を破線でも表示している。リセット用放射源４１は、試料２４の色素が自発的に再び第１の状態に戻らず、光学的なリセット用放射Ｒによる積極的なリセットを必要とする場合だけ必要である。しかし、リセット用放射は、他の方法で試料２４上に施してもよく、例えば走査型レーザ顕微鏡の脇に取り付けたリセット用放射線源により、対物レンズ２５の光軸に対し斜めに照射することによって施すことができる。
【００７６】
図９ａの顕微鏡は、最初に説明した方法形態を実施可能である。その際、第３の方法形態は、検出器モジュール２３内のピンホール３２およびピンホール光学系３１を使用する必要がある。共焦点検出を必要としない場合は常に、そのために必要な構造（３１、３２）をなくすことができる。
【００７７】
図１１ａは、本発明による解決手段のさらなる改善の可能性を示している。部分領域Ｂ２内の試料の第１の状態から第２の状態６への移行が、完全には行われない可能性がある。それは、例えば、蛍光特性曲線１７が、最大値１８の後、つまり閾値１９より高い励起用放射Ａの出力に関し、十分に急に減少しない場合である。図１１ａの例で特性曲線１７は、高い励起用放射出力の場合も零までは戻らない。減少分４６が最大値１８に対応していないので、これは、第２の状態６にある試料領域Ｂ２での残余蛍光４７を引き起こす。その後、図９ａに基づく顕微鏡で、例えば第３の方法形態を実施して蛍光放射Ｆを測定した場合、画像を形成するボリュームＢは、解像度の低い土台部Ｓおよび解像度の高い分布Ｖから構成されるだろう。これは図１１ｂに概略的に、土台部Ｓを斜線で、および解像度の高い分布Ｖを黒で示している。
【００７８】
同じ作用が、試料内の蛍光を発する材料、例えば色素分子の多くが、強い拡散性を示す場合に生じ得る。この場合も、試料領域Ｂ２内で残余蛍光４７が生じるが、比較的ゆるやかに下降する特性曲線１７ではなく、蛍光を発する材料の拡散に基づいている。
【００７９】
適切な撮像によって、土台部Ｓを抑えることが可能である。これを実現する第２の走査型レーザ顕微鏡２０の実施形態の具体例が、図１２に示されている。図９ａの設計と一致するコンポーネントには同じ符号を付しているので、その再度の説明は省略し得る。
【００８０】
図９ａの設計とは異なり、検出器３４がロック・イン増幅器４８と接続されており、その接続は、図１２では、単に具体例として、制御装置３５を介して実現されている。もちろん、直接の接続も可能である。またロック・イン増幅器４８を制御装置３５に一体化させてもよい。ロック・イン増幅器４８は、極小４５をその振幅において変調する周波数発生器４９と接続されている。これに関し、両方の部分放射線の片方の出力が、励起モジュール２１内で適切に変調され、それは例えば両方の減衰器３７または３８の片方を制御することによって行う。図１２では、減衰器３８の制御回路が、その任意性を示唆するため破線で示されている。もちろん、減衰器の制御は、周波数発生器４９の信号を適切に評価する制御装置３５で行ってもよい。既に説明したように、ロック・イン増幅器４８および／または周波数発生器４９は、制御装置３５の構成部材であってもよい。
【００８１】
周波数発生器４９により、極小を変調させるために準備された周波数は、ロック・イン増幅器４８にも送られる。極小４５の変調によって、第１の状態５にある試料領域からの信号が変化し、それに引き換え、土台部Ｓからの信号はそのまま変わらない。ロック・イン増幅器４８は変調された信号を取り出し、土台部Ｓからの信号を抑える。結果として、土台部Ｓから分布Ｖが分離され、第２の状態６への移行が不完全な場合にも、高解像度の検出が達成される。
【００８２】
追加として、同じままの信号の部分を狙い通りに使用する場合、解像度の高くない画像データが得られる。この画像データは、例えば、異なる仕方で蛍光を発する試料領域／試料特性に関する。高解像度および低解像度のものを、随意にコード化し（例えばカラー・コード化し）重ね合わせて示してもよい。
【００８３】
このロック・イン検出の代替または追加として、２つの画像を記録することも可能である。第１の画像は極小４５を有する励起用放射分布によって記録し、第２の画像は極小４５なしで記録する。土台部Ｓから高解像の分布Ｖを分離するには、これらの画像が互いに差し引かれるだけでよい（第１の画像−第２の画像）。結果の画像には、高解像の分布Ｖによるデータしか含まれていない。低解像の土台部を抑えるためのさらなる可能な手段として、両方の状態の寿命が異なる場合など、第１の状態５および第２の状態６の異なる光学特性を利用し得る。また第１の状態５と第２の状態６との間の放出スペクトルの異なる特性または吸収スペクトルの異なる特性を使用してもよい。
【００８４】
図１３は、線状の照明による方法形態の１つを実現するための、図９ａの走査型レーザ顕微鏡２０の別の１つの変形形態を示している。ここでも図９ａと一致する要素には同じ符号が付されているので、その説明は再び省略し得る。さらに、中央の放射線だけが記されている。
【００８５】
コヒーレントな光源３０は、その放射を、２つの１次回折ｏ＋およびｏ−、ならびに１つの０次回折を発生させる格子５０を通して放出する。この格子の後方には、ここではアナモフィック要素のための例であるシリンダ・レンズ５０ａが配置されている。試料には、光軸に対し垂直な線が合焦される。
【００８６】
これらの回折次数が、合焦時にかすりながら互いに差し込み合い、試料内で干渉に達する。タルボット効果によって、いわゆるタルボット格子が光軸ＯＡに沿って現れる。これは、図１４の上半分に概略的に示されている。＋１次と、０次と、−１次とが異なる角度で、試料２４内で差し込み、干渉が、当業者に既知のタルボット構造を生成する。
【００８７】
試料内の作用は図１４の下半分に示されており、この図は、試料の深さ断面（ｘ、ｚ面）を示している。強度が高い位置（黒い領域Ｂ２）では、試料は第２の状態６に達し、つまり色素分子の切替えにより、励起状態のデポピュレーションが達成されている。強度が低い領域Ｂ１では、試料は第１の状態５のままである（斜線領域および白い領域）。
【００８８】
検出はライン検出器３４によって行われ、この検出器は、図１３の設計では、具体例として制御装置３５と一体化されて示されている。ライン検出器３４の前に、再び（任意で）ブロック・フィルタ３３が置かれている。さらに、必要な深さの平面を共焦点選択するため、およびそれにより斜線領域だけを検出するため、ライン検出器３４の前に、（図１３では、ライン検出器３４に直接取り付けられているので図示されていない）ｘ軸に沿ったスリット絞りが配置されている。
【００８９】
スキャナ２８により、励起用放射分布が、光軸に対し垂直に、つまりｘ軸およびｙ軸に沿って、試料２４全体を移動することが可能となる。任意で、図５に分かりやすく示されているように色素を第２の状態６から第１の状態５に切り替えさせ得るリセット用放射源４１によって、例えば試料２４内のｘ軸に沿った均質な線を生成し得る。この線は、第２の状態６にある試料領域Ｂ２に適合する照明パターンを有することも可能である。この理由は、この領域しかリセットする必要がないためである。
【００９０】
つまり、図１３に基づく走査型レーザ顕微鏡は、図８ａに基づく方法形態を実現する。極小４５の深さは、格子の質または各次数の個々の減衰によって生じ得る。
図１５ａは、図８ｂに基づく方法形態を実現するための構成を示しており、この場合、走査型レーザ顕微鏡２０のうち、その他の顕微鏡モジュール２２は既に説明した構成を有しているので、ここでは励起モジュール２１だけが示されている。光源３０から、第１のビーム・スプリッタ５３により、２つの部分放射線が生成され、ここでは図の面に対し垂直方向に間隔をあけている。第２のビーム・スプリッタ５２は、全部で４つの平行に走る部分放射線を生成させる。図１５ｂは、９０°回転させた構成の断面を示している。全体として、同じ強度の４つの部分放射線５４、５５（中央の放射線が描かれている）が存在している。それぞれの図で、２つの部分放射線が同じ経路を取っているため遮られて見えていない。
【００９１】
部分放射線は、レンズを介して顕微鏡モジュール２２の瞳内へ合焦され、これにより、図１６ａに示された瞳の境界線５６内に点分布が生じる。４つの部分放射線５５、５４が正方形の角を占めている。試料２４内で部分放射線が干渉に達することにより、試料２４上に、光軸に対し垂直に、図１６ｂに基づくマルチ・スポット・パターン５８が生じる。このマルチ・スポット・パターン５８の零点の深さは、例えば、それぞれ対角線上で向かい合った放射線５４、５５の強度を変えることで変化させ得る。これに関し、調整可能な適切な減衰器（不図示）が、部分放射線のために備えられている。
【００９２】
試料２４は、図１６ｂのマルチ・スポット・パターン５８内の強度の高い位置（明るい領域Ｂ２）で第２の状態６に達している。蛍光放射Ｆは、強度の低い領域Ｂ１（暗い領域）で発生する。蛍光放射Ｆはその後、通常通り主カラー・スプリッタ２９で分離される。検出器５４は、スポット・パターンに適合させたマトリクス検出器であり、任意で、ピンホール・マスクが前に接続される。検出器要素は、領域Ｂ１に位置合わせされている。ここでも、スキャナ２８により、励起用放射分布を、ｘ方向および／またはｙ方向において試料２４全体に変位させることが可能となる。図１７は、下側の画像にマルチ・スポット・パターン５８を示し、それによって励起された蛍光パターン５９をその上に示している。
【００９３】
リセット光源４１によって、さらなる放射線５７を瞳内に合焦可能であり、それによりこの放射線は、試料２４内で均質な面を照らし出す。これにより、既に説明したように２つの走査工程の合間、および場合によっては１つの走査工程内にも、第２の状態６から第１の状態５への蛍光分子のリセットが行われる。
【００９４】
しかし領域Ｂ２だけをリセットすればよいため、リセット用放射線４７は、領域Ｂ２に対応する照明パターンを有していてもよい。これに関し、放射線４７は、部分放射線５４、５５に従い、同様に４つの部分放射線に分光され、瞳内に結像されるので、瞳の境界線５６内に、例えば図１８に示された分布を生じさせる。これに加え、リセット用放射Ｒの部分放射線５７の光軸は、励起用放射Ａの光軸に対して、試料内に生じる励起用放射Ａのマルチ・スポット・パターン５８の極小が、マルチ・スポット・リセット・パターンの極大と重なるように角度調節されている。図１８の変形形態における図１５ａに基づく実施形態は、リセット用放射を適切に構造化することにより、領域Ｂ２内だけで、試料または色素を傷めないリセットを行うための具体例である。
【００９５】
励起用放射Ａを適切に照射することによって、試料を、第１の状態にある領域Ｂ１および第２の状態にある領域Ｂ２に分けることが重要である。そのため、試料領域の第２の状態への移行を、試料平面の深さ選択のために使用することも可能であり（図１４参照）、これにより、試料領域Ｂ１は、隣接する検出器要素／検出器領域のクロストークに寄与し得ない。
【００９６】
前出の様々な変形形態の中で説明した方法または顕微鏡のために、励起用放射Ａの位置分布を特に考慮し、試料の蛍光特性に応じて、励起用放射Ａの出力を調整することが重要である。特に、その分布の励起用放射の１つまたは複数の極小４５の深さおよび対応する極大の高さが、達成可能な解像度の向上度を決定する。励起用放射Ａの位置的な出力分布の調整の最適化は、２つのやり方で実現し得る。最適化のために、例えば制御装置３５が適切に使用可能である／になる特性曲線１７が認識されている場合、所定の位置的な励起分布のために最適な出力レベルを算出し、例えば規定値の出力によって、または、それどころか励起モジュール２１を直接制御することによって、適切に調整する。
【００９７】
代替または追加として、検査する試料のテスト・プレパラートまたは参照箇所で実際の解像度を確定し、所定の励起分布での最適な出力レベルを、反復工程において確定し、その後、試料２４の結像のために使用することも可能である。
【００９８】
もちろん、出力スケーリングだけの代わりに、例えば位相要素３９を適切に調整することによる分布変更も可能である。
試料２４の蛍光特性、例えば色素の蛍光特性は既に、後の画像取得条件下での、テスト・プレパラートまたは試料の参照箇所の検査によって確定可能である。これに関し、検出される蛍光放射Ｆの出力は、試料のある点または領域での励起用放射Ａの出力に応じて確定される。特に優れた調整のために有利なのは、（放出される蛍光放射Ｆの出力とは異なり）蛍光特性、つまり特性曲線１７が、色素などの蛍光を発する材料の濃度に依存しない場合である。これにより、走査型顕微鏡２０の制御装置３５は、確定された曲線１７、もしくは供給またはメモリ内に格納された曲線１７から、最適な出力を自動的に確定し、適切に調整することができる。
【００９９】
蛍光特性の試料依存性が強く、および蛍光特性を確定するための試料の参照箇所が存在する、または見つけられない場合は常に、反復決定が有利である。この場合は、関心のある試料エリアの中または外の限定された領域、もしくは結像する試料エリア全体での画像形成に基づき、出力の最適化を行うか、または制御装置３５によって実施させる。解像度の質の基準（選択された箇所でのコントラストまたはフーリエ空間で画像内において伝達される周波数域の拡大など）に基づき、励起出力を最適化する。その際、一般的には、励起分布の極小での出力または空間的に広く分布した基礎出力を適合させれば十分である。
【０１００】
励起用放射Ａおよびリセット用放射Ｒは、１つの放射源から生成し得る。この放射源は、直接的に切替え可能であるか、または後方に選択構成を配置させることができる。
図１９は、走査型レーザ顕微鏡１００を概略的に示しており、この顕微鏡は、これまでに説明したコンセプトに依存せずに使用可能である。実線は、照明用放射線経路Ｂを示しており、破線は、検出用放射線経路１０２を示している。この走査型レーザ顕微鏡は、試料１０３を走査しながら検出器１０４に結像し、その際、試料を照明源１０５によって照明する。
【０１０１】
検出用放射線経路１０２は、光軸ＯＡに沿って試料１０３から検出器１０４の方向に、対物レンズ１０６および鏡筒レンズ１０７を備えており、それらの後に走査対物レンズ１０８ａが続き、その後にスキャナ１０９がある。放射は、リレー光学系１０８ｂ、１１０、およびピンホール光学系１１１の後に、ビーム・スプリッタ１１３を通過して、検出器１０４に達し、この場合、検出器はマトリクス検出器として形成されており、この検出器の前には、照明用放射の最終分をブロックするためにフィルタ１１２が配置されている。もちろん、検出用放射線経路１０２の別の実施形態も可能であり、例えばフィルタ１１２、ならびに図２０の設計では要素１０８ａと１０７の間にある破線で示された中間像をなくしてもよい。
【０１０２】
図１９に示された顕微鏡１００では、スキャナ１０９およびさらに説明するビーム・スプリッタ１１３を中に有する瞳面は、互いに対し、ならびに要素１０６と１０７の間に実線で記された対物レンズ１０６の後方の焦点面に対し、共役である。
【０１０３】
照明源１０５はレーザ１１４を有しており、このレーザは、さらに詳しく説明するスプリッタ機構１１６によって、図１９では中央の放射線だけが記されている４つの部分放射線Ｓａ、Ｓｂ、Ｓｃ、Ｓｄを生成する。スプリッタ機構１１６は、図１９の概略図では２つしか見えない（他の２つは図の面に対し垂直に重なっている）４つの部分放射線Ｓａ〜ｄを、ビーム・スプリッタ１１３に合焦させる。
【０１０４】
詳細には、スプリッタ機構１１６は２つのスプリッタ１１７および１１８、ならびに偏向ミラー１１９を有しており、これらが、レーザ１１４によって放出された放射線Ｓから、平行な４つの部分放射線Ｓａ、ＳｂおよびＳｃ、Ｓｄを生成する。図１９では、部分放射線ＳａおよびＳｂが重なっており、部分放射線ＳｃおよびＳｄも同様に重なっている。スプリッタ機構１１６内のレンズ１２０および１２１は、部分放射線Ｓａ〜ｃが、ビーム・スプリッタ１１３の面上の４つの点に合焦されるように、合焦を行う。
【０１０５】
もちろん、４つの部分放射線Ｓａ〜ｃの生成は、異なる形成がなされたスプリッタ機構１１６によって行われてもよく、または４つのレーザ１１４を使用するなど、根本的に異なるやり方で行ってもよい。スプリッタ機構１１６のためのさらなる可能な実施形態が、図２０に示されており、この場合、スプリッタ１１８およびミラー１１９と、スプリッタ１１７が逆になっている。
【０１０６】
図２１は、ビーム・スプリッタ１１３を、そのビーム・スプリッタ面１２２を上から見た図として示している。ビーム・スプリッタ面１２２の上には、反射性の４つのミラー面要素１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃ、および１２３ｄが配置されており、このミラー面要素は仮想正方形１２４の角の点にあり、その中心が光軸ＯＡの突破点１２５になっている。ビーム・スプリッタ面１２５は、ミラー面要素でだけ反射性であり、他の部分では、少なくとも検出用放射に対して透過性である。
【０１０７】
照明源１０５は、４つの部分放射線Ｓａ〜ｄを、４つのミラー面要素１２３ａ〜ｄに合焦させる。このように瞳内に合焦されて、反射された部分放射線は、試料１０３内で干渉に達し、それにより図２２に示されたマルチ・スポット・パターン１２８を試料内に生じさせる。このマルチ・スポット・パターン１２８は、暗い領域１２７に囲まれた光スポット１２６の規則的な構成である。光スポット１２６と暗い領域１２７の間の強度差、つまり零点の深さは、それぞれ向かい合う部分放射線Ｓａ、ＳｄおよびＳｂ、Ｓｃの強度を変えることによって変化させ得る。その際、（光軸に対して）対角線上で向かい合う部分放射線、または、それぞれ間にある部分放射線に隔てられた部分放射線を、同じ様に調整することが好ましい。部分放射線が３つの場合は、１つの部分放射線が、２つの部分放射線に対して異なって調節される（またはその逆）。
【０１０８】
パターン１２８の空間的な拡張は、試料内の、パターン１２８に覆われた画像エリアを変更することによる、顕微鏡の拡大倍率の変化（例えば１１０および１０８ｂでの焦点距離の変化）によって適合させ得る。代替として、このためにレンズ１１０、１２１の焦点距離を調整してもよい。
【０１０９】
ビーム・スプリッタ１１３の作用は、以下の通りである。
ミラー面要素１２３ａ〜ｄの幾何学的な構成およびそこに合焦された部分放射線Ｓａ〜ｄによって、試料１０３上に、規則的に配置された光スポット１２６による点パターン１２８が生じる。そのため、蛍光顕微鏡検査における適用では、光スポット１２６で蛍光が励起される。これは、空間的にインコヒーレントに生じるので、顕微鏡１０６の後方の焦点面（要素１０６と１０７の間に実線で記された）を均質に満たす。これに類するものとしては、同様に画像取得のために用い得る拡散反射がある。
【０１１０】
後方の焦点面は、ビーム・スプリッタ１１３が中に配置されている瞳と共役なので、検出するインコヒーレントな放射は、ビーム・スプリッタ１１３が中に配置されている瞳全体をも満たし、そのためビーム・スプリッタ面１２２全体を照らし出す。これに対し、鏡面反射された照明用放射は、ミラー面要素１２３ａ〜ｄに合焦されるので、照明源１０５に返される。
【０１１１】
結果として、空間的にインコヒーレント、つまり非指向性に、試料１０３内で生じた検出すべき放射だけがビーム・スプリッタ１１３を通過する。このためビーム・スプリッタ１１３は、色彩の調整を行わなくても、検出用放射と鏡面反射された照明用放射の分離を引き起こす。これは、より高い利得が達成されるだけでなく、ビーム・スプリッタ１１３が、非常に様々な照明波長および検出波長に対して使用可能であるという利点を有する。通常、カラー・スプリッタに設けられている交換メカニズムまたは変調器は必要ない。
【０１１２】
（図１９に瞳放射線経路が破線で示されている）検出は、例としてマトリクス検出器として形成された検出器１０４によって行われ、この検出器の前には、任意でピンホール・マスクを配置してもよい。その際、照明されたスポットが共焦点結像される。このマスクは、検出器の前の観察放射線経路の中間像面内に設置可能であり、または代替として、（１１０と１０８ｂの間の）リレー光学系内に設置可能である。後者は照明側でもビーム・プロフィルを改善する。
【０１１３】
試料１０３の走査はスキャナ１０９の作用によって行われる。その際、試料１０３上で照明された光スポットを、一点スキャナの場合に必要であるより非常に極僅かに変位させるだけでよい。光スポットは干渉によって試料内に現れるので、個々の光スポット１２６はスキャナ１０９によって同時に変位される。このためスキャナ１０９による移動は、隣接する光スポット１２６同士の間の暗い領域１２７が走査される移動で十分である。つまり光スポットの、走査しながらの変位は、周期的で規則的なパターン１２８の周期長内だけで行われることが好ましい。
【０１１４】
図１９に示された構成は、ビーム・スプリッタ１１３以降の検出用放射線経路と照明源１０５を交換するという趣旨で逆にすることもできる。そうすると、ビーム・スプリッタ１１３は、ミラー・コーティングに関し、図２１に示された設計と反転し、つまりミラー面要素１２３ａ〜ｄが、ミラー面における孔になる。
【０１１５】
ビーム・スプリッタ１１３は、スキャナとしてのニポウ・ディスクと組み合わせてもよく、またはスキャナを一体化させてもよい。
さらに、図１９〜図２２に基づく実施形態は、図４〜図１８に基づく設計または方法とも組み合わせ得ることが特に有利であり、その際、特徴を１つだけ（例えばビーム・スプリッタ１１３を）組み合わせてもよい。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査に関し、特に、検査すべきルミネセンスを発する試料を励起用放射で照明し、ルミネセンスが励起された試料の画像を取得する方法に関する。本発明はさらに、試料の解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査を行うための顕微鏡に関し、この顕微鏡は、ルミネセンスを励起するために試料に励起用放射を照射する手段および励起された試料の画像を取得するための手段を有する。
【０００２】
本発明はさらに、照明用放射線源および検出用放射線経路を備えた走査型レーザ顕微鏡に関し、この検出用放射線経路は、試料内で励起および／または後方散乱した放射を光軸に沿って検出器機構に導き、この検出用放射線経路内には、照明用放射線源から放出された照明用放射線経路内の照明用放射を試料に向けるビーム・スプリッタが設けられており、その際、ビーム・スプリッタは、試料で鏡面反射された照明用放射を検出器機構へは通過させず、そのために照明用放射線経路の瞳内に配置されており、かつ部分的にミラー・コーティングされている。
【背景技術】
【０００３】
生物プレパラートを検査するための、光学顕微鏡検査の従来の適用分野はルミネセンス顕微鏡検査である。その際、細胞の一部などの試料を特異的に標識するために、特定の色素（いわゆるリン光体または蛍光体）を使用する。前述のように、試料を励起用放射で照明し、それにより励起されたルミネセンス光を適切な検出器で捕捉する。このために光学顕微鏡には通常、２色性ビーム・スプリッタがブロック・フィルタと組み合わせて設けられており、それらによって蛍光放射が励起用放射から分離され、別々の観察が可能となる。この措置により、光学顕微鏡において、異なる色に着色された個々の細胞部分の表示が可能になる。もちろん、プレパラートの異なる構造にそれぞれ特異的に沈着する様々な色素で、プレパラートの複数の部分を同時に着色してもよい。この方法をマルチ・ルミネセンスと言う。それ自体が、つまり色素添加なしで、ルミネセンスを発する試料を測定することもできる。
【０００４】
ルミネセンスとは、ここでは通例通り、リン光および蛍光の上位概念として理解されており、したがって両方の過程を含んでいる。
さらに、試料検査に走査型レーザ顕微鏡（ＬＳＭとも略す）を使用することが知られており、このＬＳＭは、３次元で照らし出された画像から、共焦点検出構成（共焦点ＬＳＭのこと）または非線形の試料の相互作用（いわゆる多光子顕微鏡検査）によって、対物レンズの焦点面内にある平面だけを再現する。これにより１つの光学的断面が取得され、引き続き試料の様々な深度での複数の光学的断面を記録すれば、適切なデータ処理装置を用いて、様々な光学的断面から構成される試料の３次元画像を生成することができる。このため走査型レーザ顕微鏡検査は、厚いプレパラートの検査に適している。
【０００５】
もちろん、ルミネセンス顕微鏡検査と走査型レーザ顕微鏡検査とを組み合わせたものも使用されており、この場合は、ルミネセンスを発する試料を、様々な深度面において、ＬＳＭで結像させる。
【０００６】
原理的に、光学顕微鏡およびＬＳＭの光学的解像度は、物理法則により回折によって制限されている。この制限内で最良の解像を得るために、例えば４Ｐｉ構成または定在波場による構成のような特殊な照明構成が知られている。それにより解像度は、典型的なＬＳＭに比べて、特に軸方向で、明らかに改善され得る。さらに非線形のデポピュレーション過程により、回折によって制限されている共焦点ＬＳＭに比べて解像度を最高で１０倍まで高めることができる。
【０００７】
図１ａ／図１ｂは、例えば米国特許第５８６６９１１号に記載されているようなこの方法を示している。その際、解像度を高めるために、２つの波長を有する光放射を作用させる。一方の波長の光放射が、励起光線１として測定試料上に対物レンズで合焦され、そこでルミネセンス、ここでは蛍光を励起する。図１ａ／図１ｂには、簡略化のため１次元の場合のみが示されている。位置解像度の向上は、もう一方の波長を有する光線２が、励起光線によって励起された蛍光状態を部分領域でデポピュレートすることによって行われる。そのためこの光線は「デポピュレーション放射」とも呼ばれる。図１ａからよく分かるように、この場合、照射は、例えばデポピュレーション光線２の主ピークと励起光線１の主ピークが部分的に重なるように行われる。励起用放射１で照明された領域の縁部にある試料の、この「脱励起」により、図１ｂからよく分かるように、縮小されたボリューム３しか蛍光を放射しなくなる。したがって、このボリューム縮小によって解像度が首尾よく高められる。
【０００８】
図２ａ〜図２ｃは、このようなデポピュレーションを起こし得る、３つの可能なメカニズムを示している。図２ａには、誘導放出による脱励起（ＳＴＥＤ）過程が示されている。励起用放射がレベルＳ１の蛍光体に当たる（矢印Ａ）。このように励起されたレベルＳ１が、蛍光波長領域内の波長を有する光放射によって、基底レベルＳ０に向かってデポピュレートされる。矢印ＳＥはこの誘導放出を示しており、その波長は、ルミネセンス（矢印Ｆ）の波長にほぼ等しい。したがって励起波長は、デポピュレーション放射よりストークス・シフトの分だけ波長が短い。つまり、この手法に基づいて解像度を高めるには、独国特許発明第４４１６５５８号明細書の形態の現況技術も証明しているように、２つの異なる光源が必要となる。
【０００９】
図２ｂは、ルミネセンスを放射できなくなるさらに高いレベルＳ２への励起（矢印Ａ＋）を行うことにより、励起されたレベルＳ１（矢印Ａ）をデポピュレートするさらなる可能な過程を分かりやすく示している。この引き上げは、英語でＥｘｃｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ（励起状態吸収）と呼ばれ、それ故、この措置は略してＥＳＡとも呼ばれる。この過程の適切な記述は、例えば米国特許第６６３３４３２号明細書に出ている。試料または色素内のエネルギー・レベルの、より高いレベルへの間隔が縮まるので、ＥＳＡ過程でのデポピュレーションには、より低いエネルギーを、したがってより長い波長を有する光源が励起のために使用される。つまりこの場合も、２つの異なる光源が必要である。
【００１０】
さらなるデポピュレーション方法は、蛍光のための、いわゆる可逆的可飽和光学蛍光遷移（Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｓａｔｕｒａｂｌｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）であり、これは例えば独国特許出願公開第１０３２５４６０号明細書に記載されており、図２ｃに分かりやすく示されている。この手法は、空間的に高解像度の結像のために色素を使用し、この色素は、図２ｃに分かりやすく示されているように、切替用放射線４によって、蛍光を発する第１の状態５から、色素が蛍光を発しない第２の状態６に、繰り返し移行可能であり、その色素は、第２の状態６から第１の状態５に戻ることができる。色素を含む試料は、部分領域で、切替用放射線４によって第２の状態６に移行し、その際、試料の定義された領域は除外される。次いで、励起用放射線１によって蛍光７が励起され、続いて記録される。その後、予め切替用放射線４を浴びなかった試料ボリュームからだけ蛍光７が発せられる。励起用放射線１と切替用放射線４を適切に重ねることにより、蛍光７が放出されるボリュームは、励起用放射線１の解像度および切替用放射線４の零点の尖鋭度から先験的に可能であるボリュームより小さくなる。
【００１１】
つまり、図２ａ〜図２ｃに基づく前述の３つの方法のすべてにおいて、蛍光の阻止は、励起用の波長とは異なる波長の光放射を使用することによって行われている。同時にこの光放射は、少なくとも１つの鋭く制限された、放射出力の局所的零点を有していなければならず、この零点によって、検出される蛍光放射の最終的な解像度が決まる。零点が極小より上にしか形成されず、かつ完全には零まで減少しない場合はすぐに、蛍光出力が、したがってこの方法の効率がさらに低下する。このことは、例えば光学構成の収差の際またはプレパラートにおいて生じる。
【００１２】
図３は、解像度を高めるための前述の３つの方法の１つ、図３の例ではＳＴＥＤ過程を使用した、既知の装置を示している。励起用放射線源８は、試料１０内にエアリー分布を発生させ、これにより、試料が基底レベルＳ０から励起状態Ｓ１に移行する。状態Ｓ１のデポピュレーションは、位相板１２の使用により試料１０内にドーナツ形またはトーラス形の光線分布１３を有する、デポピュレーション光源１１によって行われる。デポピュレートされていない、つまり脱励起されていない色素分子のルミネセンス放射が、検出器１４によって捕捉される。このデポピュレーションにより、顕微鏡の解像度は、エアリー分布から生じる回折限界を超える。このことは、通常の顕微鏡１６に比べて縮小された、この高解像顕微鏡の点像分布１５によって表されている。
【００１３】
解像度を高めるためのさらなる方法は、欧州特許第１１５７２９７号明細書で論じられている。この場合、構造化された照明を用いて、非線形過程を利用する。その際、この明細書は、非線形性として蛍光の飽和を挙げている。記載された方法では、構造化された照明により、光学システムの伝達関数に対する対象空間スペクトルの変位を実現する必要がある。スペクトルの変位とは、具体的には、空間周波数Ｖ０−Ｖｍ（Ｖｍは構造化された照明の周波数）の場合に、対象空間周波数Ｖ０が伝達されることを意味する。これにより、このシステムによって最大限に伝達可能な所定の空間周波数の際に、対象物の水平空間周波数の伝達関数の最大周波数より高い変位周波数Ｖｍだけを、遷移することが可能となる。この手法は、画像生成のための再現アルゴリズム、および１つの画像に対する複数の記録の使用を必要とする。
【００１４】
したがって本発明は第１に、複数の波長に頼らず、または費用のかかる画像再現アルゴリズムなしで、解像度の向上を達成する、ルミネセンス顕微鏡検査方法またはルミネセンス顕微鏡を提案することを課題とする。
【００１５】
走査型レーザ顕微鏡では、例えば独国特許出願公開第１９７０２７５３号明細書で説明したされているように、共焦点結像の走査によって試料を捕捉し、したがって蛍光顕微鏡検査による生物プレパラートの検査に広く用いられている。その際、試料内で蛍光が励起され、それによって、励起用放射に対してスペクトル的にストークス・シフトされた蛍光放射が発生し、次いでこの蛍光放射が、走査型レーザ顕微鏡によって共焦点検出される。共焦点検出の代わりに、例えば多光子励起の場合には遠視野検出を行うこともできる。
【００１６】
原理的に、走査型レーザ顕微鏡の場合、大抵は照明用放射および検出用放射が共通の対物レンズを介して導かれ、つまり検出用放射を検出器に導くためにも用いられる対物レンズを介して照明用放射が入射するので、前述の蛍光顕微鏡検査においては励起用放射である照明用放射を、検出すべき放射から分離しなければならないという課題がある。したがって、試料で後方反射された照明用放射を検出器へと通過させないか、またはできるだけ僅かな量しか通過させないようにするビーム・スプリッタを介して、照明用放射をカップリングさせるのが普通である。
【００１７】
蛍光顕微鏡検査では、検出用放射と励起用放射の間のストークスに基づく波長シフトを利用しており、ビーム・スプリッタには適切な２色性要素を使用するので、ビーム・スプリッタには、カラー・スプリッタまたは主カラー・スプリッタの概念も取り入れられている。しかしながら照明用放射と検出用放射がスペクトル的に区別されない場合、この手法は役に立たなくなる。２色性ビーム・スプリッタの分離度にも限界があり、このためビーム・スプリッタより後の検出用放射線経路に、試料で後方反射された励起用放射が残り、あるいは検出用放射がビーム・スプリッタを通り抜ける際に不必要に弱められる。
【００１８】
独国特許出願公開第１０２５７２３７号明細書は、スペクトルに依存しない手法を紹介している。そこで説明されている冒頭に挙げた種類の走査型レーザ顕微鏡は、試料から来る放射が一般的にインコヒーレント、つまり試料を指向せずに放出されるのに対し、鏡面反射された励起用放射または照明用放射が指向的に検出用放射線経路にカップリングすることを利用している。したがって独国特許出願公開第１０２５７２３７号明細書は、照明用放射線経路の瞳内に、光軸の突破点では透過性で、それ以外ではミラー・コーティングされたビーム・スプリッタを挿入することを提案している。それに加え、照明用放射をこの透過性のスポットに正確に合焦させる。したがってその結果として、試料の平面的照明が達成され、同時に試料で鏡面反射された照明用放射は再びビーム・スプリッタのミラー面に達し、このミラー面により検出用放射線経路のそれ以降の部分から外れて上に鏡面反射される。これに対し、試料内で生じた拡散性の検出用放射は、合焦されず、瞳全体を満たし、ほぼ完全に透過される。つまり、照明用放射のデカップリング度として理解されるこのビーム・スプリッタの効率は、透過性のスポットに対する瞳の面積比にのみによって与えられる。この効率は、照明用放射が適切に合焦される場合、９０％をはるかに超え得る。このように独国特許出願公開第１０２５７２３７号明細書によって達成されたビーム・スプリッタによって、スペクトルに依存せず、検出用放射の高い利得が可能となる。
【００１９】
既に説明したように、走査型レーザ顕微鏡検査は、特に生物試料の検査に適している。生物試料の場合、当然、撮像に必要な時間が重要な要素であり、生体試料を検査したい場合、または速く進行する経過を分析したい場合は特にそうである。したがって、走査型レーザ顕微鏡検査では常に、撮像速度の向上に努力が払われている。そのために、最近では、試料を点状の光スポットで（つまり共焦点ポイント・スキャナを用いて）走査するのではなく、ライン状の照明および走査（つまり共焦点のスリット絞り）を使用する顕微鏡システムの記述が増えている。これに関しても、独国特許出願公開第１０２５７２３７号明細書が適切なビーム・スプリッタを提供しており、このビーム・スプリッタでは、細長い長方形のライン状の領域がミラー・コーティングされている。
【００２０】
確かにライン走査システムは高い撮像速度を達成するが、スリット絞りによる共焦点結像では、その原理上、スリット絞り方向に沿ってある程度のクロストークが起こるので、深さ解像度はポイント走査システムに比べて低くなる。
【００２１】
したがって、本発明は第２に、スリット絞りに付随する深さ解像度の低下なしに、速い撮像が可能であるように、冒頭に挙げた種類の走査型レーザ顕微鏡をさらに発展させることを課題とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
最初に挙げた課題は、本発明によれば、特定のルミネセンス放射を放出させるための励起用放射を照射することによって試料を励起し、ルミネセンスを発する試料の画像を取得する、解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査方法によって解決される。この方法では、ルミネセンスを発する試料は、励起用放射出力を上昇させることにより、特定のルミネセンス放射を放出させるための励起性が、励起用放射出力の閾値にあたる最大値まで上昇した第１のルミネセンス状態から、特定のルミネセンス放射を放出するための試料の励起性が第１の状態に比べて低減された第２のルミネセンス状態に移行可能であり、その際、試料は、閾値より高い励起用放射出力を照射することによって第２の状態に移行可能であり、この試料は、少なくとも１つの閾値より高い出力極大および少なくとも１つの閾値より低い局所的な出力極小を有する励起用放射分布で、励起用放射を照射されることにより、ある部分領域では第１の状態に移され、隣接する部分領域では第２の状態に移され、ルミネセンスを発する試料の画像は、第１の状態にある試料領域および第２の状態にある試料領域を含んでおり、その際、ルミネセンスを発する試料の画像には、主として第１の状態にある試料領域が寄与し、それにより画像は、励起用放射分布より高い空間解像度を有するようになる。
【００２３】
第１の課題はさらに、解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査のための顕微鏡によって解決される。この顕微鏡は、励起用放射を試料に照射し、それにより試料内で特定のルミネセンス放射の放出を励起するルミネセンス励起手段と、ルミネセンスを発する試料の画像を取得する手段とを備えており、その際、励起手段が、少なくとも１つの閾値より高い出力極大、および少なくとも１つの閾値より低い局所的な出力極小を有する、特定の励起用放射分布で励起用放射を照射し、その際、その閾値が、試料の２つのルミネセンス領域を分割しており、第１の、励起用放射出力が閾値より低い状態の領域では、励起用放射出力を上昇させることにより、特定のルミネセンス放射を放出させるための励起性が、閾値で達成される最大値まで上昇し、第２の、閾値より高い励起用放射出力の際および／またはそれより後の状態の領域では、試料が特定のルミネセンス放射を放出するための励起性が、第１の領域に比べて低減されており、その際、画像を取得する手段が、閾値より低い励起用放射出力で照射された第１の領域にある試料領域、および閾値より高い励起用放射出力で照射された第２の領域にある試料領域を捕捉し、その際、試料画像には、主として第１の領域にある試料領域が寄与し、それにより画像が、励起用放射分布より高い空間解像度を有するようになる。
【００２４】
つまり、ルミネセンスを発する材料が基本的に２つの状態にあり得る試料を使用し、または顕微鏡を対応する試料用に設計する。閾値より低い励起用放射出力を照射した場合に生じ、励起手段によって達成される第１の状態では、材料がルミネセンス放射を放出し、その出力は、一般的に励起用放射出力と共に増加する。閾値より高い励起用放射出力を照射した場合に存在する第２の状態では、ルミネセンスが全く起こらないか、または低減される。第１の状態に比べて変化した吸収特性、および／または第１の状態とは異なる光学特性、例えば異なるスペクトル組成、偏光、もしくは寿命を有するルミネセンス放射の放出を、生じさせてもよい。もちろん、蛍光を発するか、または自発蛍光する多くの分子で構成された試料に関しては、２つの状態の領域が生じる。第１の状態の領域では、分子の多数が第１の状態にあり、第２の状態の領域では、多数が第２の状態にある。本発明によれば、ある試料領域は第１の状態領域（または略して状態）にされ、別の試料領域は第２の状態領域（または略して状態）にされる。第１の状態にされた、つまり閾値より低い励起用放射出力に当たる領域、および第２の状態にある領域、つまり閾値より高い励起用放射出力で照射される領域の付近の場所により、励起用放射分布より解像度を著しく高めることが可能となる。
【００２５】
つまり本発明による解決策は、非線形のルミネセンス特性曲線によって解像度の向上を達成し、この特性曲線は、放出されるルミネセンス出力を、励起用放射出力の関数として記述しており、極大を有する。その際、この特性曲線が、極大の両側で比較的急な傾斜を有する場合が有利であるが、絶対に必要というわけではない。励起のために、多光子過程を使用してもよい。
【００２６】
本発明による手法の場合、できるだけ第１の状態にある試料領域だけが画像にルミネセンス放射分の寄与をし、かつ第２の状態にある試料領域は、少なくとも比較的僅かな程度にルミネセンスを発するので、試料画像は、励起用放射分布を超える構造を示し、このため解像度の向上が達成される。この強度構造は、第１の状態と第２の状態との間の放出出力の差が明らかであればあるほど明確に現れる。
【００２７】
蛍光特性曲線の極大に対応する閾値より高い励起出力を照射することにより、第１の状態より少ない蛍光が励起される。そのために、この顕微鏡では、励起用放射分布が、閾値より高い出力を有する。現況技術でこれまで必要であったような別の波長の放射はもはや必要でない。したがって本発明による顕微鏡、または本発明による方法を実施するための装置は、著しく簡略化されており、特に光源は１つしか必要なく、その解像度が画像の品質に影響を及ぼす。比較的広い波長領域をカバーする必要はないので、励起用放射のカップリングに関する色要件も、現況技術に比べて明らかに簡単になる。
【００２８】
照射される励起用放射分布が、伝導の閾値を考慮したものであるので、顕微鏡は試料に同調される。
本発明による手法では、それだけでなく、閾値より高い励起用放射出力で照射した後に永続的にまたは少なくともある程度の期間、励起性が明らかに低下する、または全くなくなる試料を使用する場合、（例えばＳＴＥＤまたはＥＳＡの手法の際に必要であるように）閾値より高い励起用放射出力で照明する試料領域を、前もって「標準」に励起することは、絶対に必要なわけではない。
【００２９】
閾値より高い励起用放射出力では、ルミネセンスを発せず、かつ／または特定のルミネセンス放射とは異なる特性を有するルミネセンス放射を放出し、かつ／または励起用放射に対し、変更された、ルミネセンスの減少をもたらす吸収特性を有する、試料または色素を使用することが好ましい。
【００３０】
したがって本発明によれば、閾値より高い励起用放射強度で照明される試料領域からは、全くまたは僅かしか、ルミネセンス放射が画像生成に寄与しないことによって、解像度の向上が達成される。第２の状態にある試料が示す、つまり閾値より高い励起用放射出力の場合および／またはそれより後で、試料が示すルミネセンス特性によっては、画像へのこの寄与の低減が、異なる方法で行われる。試料が全くルミネセンスを示さない場合、第２の状態にある試料領域からは、もはやルミネセンス放射は検出されない。これに対し第２の状態にある試料が、光学特性が変化したルミネセンス放射を示す場合は、遮蔽のために、例えばスペクトル組成または偏光に関する適切な光学フィルタリングを行う。励起されたルミネセンス状態の寿命が変化している場合は、時間フィルタリングによって遮蔽を達成する。
【００３１】
第１の状態にある試料領域をさらに限定するため、またはこの試料領域の幾つかを選択するために、共焦点検出を行うことが好ましい。その場合、ルミネセンスのために励起されたボリュームを本発明に従って回折限界より縮小することによって、標準的な共焦点検出に勝る位置解像度が達成される。
【００３２】
基本的に、励起用放射で照明された領域の全てがルミネセンス画像に寄与するのではなく、閾値より高い励起用放射出力で照明された試料領域は、画像に全くまたはより少ししか含まれず、それによりルミネセンスを発する試料のボリュームが、励起された試料のボリュームに比べて空間的に縮小されるので、自動的に、励起用放射の照射に比べて解像度が高くなる。画像中には、励起用放射分布には存在しなかった光学的構造が認められる。つまり画像の解像度は、励起用放射カップリングの解像度より高くなっている。
【００３３】
特に有利な方法では、励起用放射とは異なる光学特性を有するリセット用放射を照射することにより、第２の状態から再び（元の）第１の状態に戻すことのできる試料または色素を使用し、あるいは本発明による顕微鏡をこの試料または色素に同調させる。顕微鏡は、そのために適切な手段を有している。これは、第２の状態が、少なくともほぼ可逆的な状態にあることを意味する。閾値より高い励起用放射出力を照射することによってルミネセンス画像から遮蔽された領域は、次いでリセット用放射を照射した後に、再び第１の状態での標準のルミネセンスに励起することができる。このように、さらに発展された方法または、このように形成された顕微鏡は、試料の様々な領域を何度も結像させる適用例に適している。したがって、これは、第２の状態で、つまり閾値より高い励起用放射で照明した後に、励起用放射に対する感受性の低下を示す試料または色素を使用する適用例に好ましく、その際、励起用放射とは異なる光学特性を有するリセット用放射を照射することにより、感受性の低下が、少なくとも部分的に戻される（かつ第１の状態が回復される）。少なくとも閾値より高い励起用放射出力で照明された試料領域が、リセット用放射で照射される。その際、試料を再び第１の状態に移すリセット用放射が、解像度向上の達成に全く寄与せず、つまり、非常に大まかにしか構造化されず、または全く構造化されずに、試料にカップリングさせることもできることが重要である。
【００３４】
本発明の特に有利な変更形態では、ルミネセンス特性に関し再び第１の状態に戻し得る試料により、走査による画像生成が可能となる。その際、試料は、例えばスキャナ機構によって、例えばスポット領域、ライン領域、またはマルチ・スポット領域で走査することができる。その場合、新たなスキャン・ステップの際に、その都度新たに閾値より高いおよび低い励起用放射を照射できるように、２つのスキャン・ステップの合間にその都度リセット用放射が照射される。それにより各スキャン・ステップで解像度の向上が達成され、これは全体として、明らかに解像度が改善された画像を提供する。
【００３５】
つまり励起用放射分布の照射は、蛍光放射の局部的構造を発生させる。これは大抵、励起用放射分布に関して対称的である。特定の蛍光を発する例えば点などの面形状を所望する場合、蛍光を発する試料の一部分を遮蔽するのが有利である。隣接する蛍光を発する領域同士の間には十分な間隔をおくことができるので、これは所望の面形状の解像度に影響を及ぼさずに可能である。
【００３６】
閾値より高くまたは低く試料を励起するために、原則的に２つの変形形態が可能である。第１の変形形態では、原理的に回折によって制限される照明が行われ、その照明は、点状であってもよく、または径方向に対称的であってもよく、または既知のエアリー関数のように中心に極大を有することもできるが、しかし、かならずしもそうする必要はない。この励起分布の形状では、励起用放射分布が回折によって制限されていることが好ましい。
【００３７】
回折によって制限される励起用放射分布の場合、特に有利なことは、トーラス形の分布を使用することができ、この分布は、トーラス形の分布の核となる領域では閾値より高い励起用放射出力を有し、周縁領域では閾値より低い励起用放射出力を有する。その場合、トーラスによって画定される中心部では、回折によって制限されるエアリーの円盤よりも明らかに小さい点状のルミネセンス分布が達成される。もちろん、前述の対称の理由から、トーラスの外縁部にある試料領域も、閾値より低い励起用放射出力で照明されるので、そこでもルミネセンス放射が励起される。点状の蛍光画像を生成するためには、この領域を、例えばトーラスによって画定される中心部で発生するルミネセンス放射だけを通過させる共焦点検出によって遮蔽するのが実用的である。それでもなお、この場合、ルミネセンスを発する中心部は、共焦点検出自体の（回折によって制限される）解像度によって可能になるものより小さい。もちろん、別のやり方で遮蔽を達成することも可能である。例えば、外側領域のルミネセンス励起性を狙い通りに消すか、または画定された中心部の励起性を狙い通りに発生させることが可能である。したがって、本発明による方法または顕微鏡により、蛍光を発する領域の形状に同時に作用する場合、物理的な回折限界を超えた解像度が可能となる。
【００３８】
第２の変形形態では、平面的構造を有する照明を使用し、その際、この平面は、一方向において回折によって制限される１本または複数本の線として形成することもできる。照明された平面のうち、ある部分領域は閾値より高い励起用放射出力を有し、別の部分領域は閾値より低い励起用放射出力を有する。このような平面的な照明により、比較的大きな試料を、特に速く走査することが可能となる。もちろん、同じことが、マルチ・スポット構成にも当てはまり、このマルチ・スポット構成では、回折によって制限される複数の照明スポットが試料に当たり、これらのスポットは、明確に別々に検出できるほど、空間的に互いに離れている。平面的構造を有する試料照明としては、特に縞格子または十字格子が考慮される。
【００３９】
試料によっては、第２の状態にある試料領域がなおある程度の残余ルミネセンスを示すことがある。これは、試料自体によって、または例えば拡散によって異なる照明がなされた試料領域の間を、ルミネセンスを発する材料が移動することによって、引き起こされている可能性がある。例えば試料自体が邪魔な自発蛍光をしているか、または第２の可逆的な状態に移り得ない別の色素を含んでいる可能性がある。その結果、閾値より高い励起用放射出力で照明された領域内に、残余ルミネセンス放射が存在することになる。原理的にこの残余ルミネセンスは、検出時に適切な閾値によって抑えることができる。
【００４０】
画像信号が改善される場合、それ自体既知のロック・イン技術を使用することで、背後の放射が抑えられる。このために、第２の状態に移される試料領域、または第１の状態に留まる試料領域への励起用放射を、基準周波数に基づいて強度変調し、ルミネセンス放射の検出の際、ロック・イン技術の過程で、この基準周波数を使用する。そのためにこの顕微鏡は、変調器と、ルミネセンス検出器の後に接続されたロック・イン増幅器とを有する。このロック・イン増幅器は、変調された信号を分離し、変調されていない信号を抑え、これにより前述の残余ルミネセンスの場合にも、利用信号のピーク・レベルを下げずに、高解像度の検出が可能になる。これにより変調された信号の全てが高解像の画像に寄与する。
【００４１】
残余ルミネセンスを抑えるための可能な代替方法は、２つの画像を互いに差し引く差分法である。第１の画像は閾値より低い励起用放射出力で記録され、第２の画像は閾値より高い励起用放射出力で記録される。両方の画像の差が、残余ルミネセンスの分離を引き起こす。残余ルミネセンスを抑えるための可能な別の手法は、本発明の変形形態で使用される試料または色素のさらなる特性、例えば第１または第２の状態での異なるルミネセンス寿命の評価、第１または第２の状態でのルミネセンス放射の異なる光学特性の利用などを活用するものである。
【００４２】
さらに、有利な実施形態では、焦点深度を高めるために、検出すべき焦点面の外にある試料部分を遮蔽する。これにより同時に、軸方向の解像度が、横方向の解像度からデカップリングされる。そのためにまず試料を、構造化せずに第２の状態に移し、次いで焦点面内だけを戻す。同じことが、焦点面内に極小を有する、励起用放射強度の適切な深さ構造化によって達成される。そのために、独国特許出願公開第１０２ ５７ ４２３号明細書の原理に基づく構成を、適切に改変することができる。
【００４３】
冒頭に挙げた本発明による顕微鏡は、有利な実施形態では、上に挙げたさらなる形態の１つまたは複数を実施している。励起用放射は、ルミネセンスを励起するためにも、ルミネセンスを阻止または低減するためにも使用されるので、有利なことに励起用放射を放出する励起用放射源を１つしか備えなくてよく、この励起放射源の後には、ビーム・プロフィルに極小を好ましくは可変の深さで形成する機構が配置されており、その際、極小の出力は閾値より低い。
【００４４】
第２の課題は、本発明によれば、照明用放射線源および検出用放射線経路を備えており、この検出用放射線経路が、試料内で励起および／または後方散乱された放射を、光軸に沿って検出器機構に導き、この検出用放射線経路内に、照明用放射線源から放出された照明用放射線経路内の照明用放射を試料上に向けるビーム・スプリッタが備えられており、ビーム・スプリッタが、試料で鏡面反射された照明用放射を検出器機構へは通過させず、そのために照明用放射線経路の瞳内に配置されており、かつ部分的にミラー・コーティングされている走査型レーザ顕微鏡であって、ビーム・スプリッタが、検出用放射線経路内にあるビーム・スプリッタ面を有しており、このビーム・スプリッタ面が、ビーム・スプリッタ面の光軸突破点を中心とした円上にある３つの点でミラー・コーティングされており、照明用放射線源が、点の数に対応する数の部分放射線を発生させ、この部分放射線を、試料一面に周期的に分布する照明スポットの形の干渉パターンが試料内に生じるように、ビーム・スプリッタの点上に合焦させる、走査型レーザ顕微鏡によって解決される。
【００４５】
もちろん、本発明による解決策は、逆にビーム・スプリッタが検出用放射を外に鏡面反射し、鏡面反射された照明用放射を通過させることも可能である。そのために、照明用放射線源および検出用放射線経路を備えており、検出用放射線経路が、試料内で励起および／または後方散乱された放射を光軸に沿って検出器機構に導き、この検出用放射線経路内に、照明用放射線源から放出された照明用放射線経路内の照明用放射を試料上に向けるビーム・スプリッタが備えられており、ビーム・スプリッタが、試料で鏡面反射された照明用放射を検出器機構へは通過させず、そのために照明用放射線経路の瞳内に配置されており、かつ部分的にミラー・コーティングされている、走査型レーザ顕微鏡であって、ビーム・スプリッタが、検出用放射線経路内にある反射性のビーム・スプリッタ面を有しており、このビーム・スプリッタ面が、ビーム・スプリッタ面上の、光軸突破点を中心とする円上にある少なくとも３つの点で、照明用放射のためにミラー・コーティングされておらず、照明用放射線源が、点の数に対応する数の部分放射線を発生させ、この部分放射線を、試料一面に周期的に分布する照明スポットの形の干渉パターンが試料内に生じるように、ビーム・スプリッタの３つの点上に合焦させる、走査型レーザ顕微鏡が提供される。
【００４６】
本発明は、簡単な構成を用いて効率の高い点群生成を達成する。
本発明によれば、ビーム・スプリッタは、干渉によって生じたパターンの形の点群で試料を照明するように形成される。これにより、照明されたスポットで検出器機構が多点検出を行う場合、複数の点の並行照明およびこの同時に照明された点の並行走査が可能となる。その結果、深さ解像度を損なわずに、一点照明に比べて点の数だけ倍増された走査速度が得られる。規則的な点群パターンによる試料の照明（蛍光顕微鏡検査においては励起）は、本発明によれば、干渉効果を活用して行われ、そのため、照明源が準備する照明用放射線の数は、規則的なパターン内の照明スポットの数よりかなり少ない。干渉効果のためには、ビーム・スプリッタに少なくとも３つの反射性の点／透過性の孔があればよく、この点／孔に照明用放射が合焦されるので、少なくとも３つの照明用放射線が、ビーム・スプリッタでカップリングされる。この数の照明用放射線（本明細書での「放射線」の概念は、対応する放射線束と同義に使用される）は簡単に生成可能である。例えば出力放射線の場合は、２つのスプリッタ要素しか必要でない。したがって照明用放射線源は、レーザ放射線を放出するレーザと、レーザ放射線を少なくとも３つの部分放射線に分け、光学系機構によって点／孔上に合焦させるスプリッタ機構とを有することが好ましい。
【００４７】
反射性または透過性の点の数は、３つに限定されているわけではない。より多くの点を使用してもよく、この点は、円上に対称的に、または円の線に沿ってできるだけ整った分布または等間隔であるべきで、但し分離していなければならない。４つの点の場合、これらの点は、例えば中心に突破点がある正方形の角にあってもよい。
【００４８】
干渉を活用して照明をもたらすビーム・スプリッタを備えた本発明による顕微鏡は、既に説明したように、照明および場合によっては検出を並行に行うことによって、高い走査速度を達成する。これに加え有利な実施形態では、画像平面の走査は、周期的な点群パターンの周期内だけの変位を実施すればよいので、走査に必要な走査メカニズムに対する要件を大幅に下げることができる。つまり、例えば放射線経路内で作動する光学スキャナとして走査機構が形成されている場合、比較的小さい偏角を達成すればよい。このことは、機器の簡略化と同様に、走査速度に影響を及ぼす。したがって、一変更形態では、照明方向においてビーム・スプリッタの後方に走査機構が配置されることが好ましく、この走査機構は、試料全体の点群パターンの変位を、点群パターンの周期内で行う。その際、放射線を偏向するように作用する走査機構だけでなく、もちろん、例えばいわゆる卓上スキャナによる試料の移動を使用してもよい。
【００４９】
照明の点群パターンを干渉に基づき生成することで、光スポットの周りの暗い領域に対する光スポットの明るさを簡単に調節でき、つまり、それぞれ対角線上で向かい合って合焦された部分放射線の強度を変化させることによって調節を行うことができる。したがって本発明の一変更形態では、変化させるための適切な手段を備えており、この手段は、照明方向においてビーム・スプリッタの前に配置されており、例えば調整可能な減衰要素の形で形成されている。
【００５０】
照明用放射線経路において、基本的に、ビーム・スプリッタが中に配置された瞳の結像が試料上で行われる場合、点群パターン内の明るいスポットの数は、専ら試料上の照らし出された領域に依存する。試料の照明された領域、つまり試料点の数は、ビーム・スプリッタと試料との間の結像の焦点距離を変化させる手段によって簡単に作用され得る。言い換えれば、光学結像によって捕捉される画像面積を変化させる手段により、自動的に、干渉によって試料上に生じる照明点の数が変化する。
【００５１】
既に説明したように、試料上で同時に照明されたスポットを並行検出すると、撮像速度が高まる。検出用放射線経路が、マトリクス検出器内で終端する場合、そのような並行走査を特に簡単に達成することができ、この検出器の前には、任意で、照明パターンに同調させたピンホール・マスクを配置してもよい。しかしもちろん、マトリクス検出器の空間解像要素も、ピンホール・マスクの機能を引き受けることができる。
【００５２】
ビーム・スプリッタの反射性要素は、照明用放射だけを反射しなければならず、検出用放射は反射しない。つまりビーム・スプリッタは２色性に形成してもよい。
点群パターン内の点の間隔は、ビーム・スプリッタでの焦点の間隔を介し、つまり円半径を介して調整し得る。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ａ及びｂは現況技術の方法に関する位置依存性の出力分布図。
【図２】ａ−ｃは現況技術に基づく解像度向上のための方法を示す概略図。
【図３】現況技術に基づき解像度を高めた蛍光顕微鏡を示す図。
【図４】試料の蛍光特性曲線を示す図。
【図５】本発明による解像度向上を示す概略図。
【図６ａ】第１の方法形態に基づき解像度を高めた際に生じる１次元または２次元の出力分布図。
【図６ｂ】第２の方法形態に基づき解像度を高めた際に生じる１次元または２次元の出力分布図。
【図７】第３の方法形態を示す図６ａ／ｂと同様の図。
【図８ａ】第４の方法形態を示す図６ａ／ｂと同様の図。
【図８ｂ】第５の方法形態を示す図６ａ／ｂと同様の図。
【図９ａ】第１の解像度を高めた顕微鏡を示す概略図。
【図９ｂ】第１の解像度を高めた顕微鏡を示す概略図。
【図１０】図９の顕微鏡の作用方法を明らかにするための図６ａと同様の出力分布図。
【図１１ａ】特性曲線を示す図４と同様の図。
【図１１ｂ】第２の解像度を高めた顕微鏡を明らかにするための出力分布図。
【図１２】第２の顕微鏡の概略図。
【図１３】第３の解像度を高めた顕微鏡の概略図。
【図１４】第３の顕微鏡の機能方法を示す概略図。
【図１５ａ】第４の顕微鏡の一部の概略図。
【図１５ｂ】第４の顕微鏡の一部の概略図。
【図１６ａ】第４の顕微鏡の瞳内の励起用放射またはリセット用放射の分布図。
【図１６ｂ】第４の顕微鏡によって実現されるマルチ・スポット分布図。
【図１７】第４の顕微鏡の場合の蛍光分布図。
【図１８】第４の顕微鏡の一変形形態の瞳内の励起用放射またはリセット用放射の分布図。
【図１９】走査型レーザ顕微鏡の概略図。
【図２０】図１９の顕微鏡のための照明源の代替実施形態を示す図。
【図２１】図１９の顕微鏡のビーム・スプリッタの俯瞰図。
【図２２】図１９の顕微鏡によってもたらされる試料上の照明パターンを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
以下に本発明を、図を参照しながら具体的に、より詳細に説明する。
以下では、方法技術に関する説明および顕微鏡の説明において、解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査のための様々な実施形態を示す。これは純粋に例として、様々な蛍光顕微鏡または蛍光顕微鏡検査方法に基づき行われる。もちろん、以下に説明する例示的実施形態、つまり方法形態および顕微鏡は、それとは別のルミネセンスを発する物質、例えばリン光を発する試料または色素にも使用可能である。以下で色素について説明する場合、これも例としてのみ理解されなければならない。もちろん、試料のプレパラート作成に使用可能な色素の代わりに、直接蛍光を発する（またはリン光を発する）物質も、試料として成立可能であり、それにより色素添加をしなくて済む。別の特性を示し、第２の状態に移せないような、追加の色素も使用可能である。さらに個々の方法形態または顕微鏡に対して説明した特徴は、説明した別の方法形態または顕微鏡にも使用可能であるので、ここでは説明していない組合せも可能である。
【００５５】
図４は、本発明により使用される色素に関する蛍光特性曲線１７を例として示している。この蛍光特性曲線１７は、放出された蛍光放射Ｆの出力Ｌを、励起用放射Ａの出力Ｌの関数として表している。図から分かるように特性曲線１７は、極大１８まではほぼ線形に、少なくとも単調に上昇し、その後、励起用放射出力に関する閾値１９の先では再び下降する。それぞれ閾値１９または極大１８の左と右にある２つの状態の領域が認められる。閾値１９より低い励起用放射出力が照射される場合、色素は、主に第１の状態５にある。第１の状態の色素は、蛍光放射を放出し得る。励起用放射出力が閾値１９より高くなると、第２の状態６への色素分子の変化が起こる。第２の状態６の色素分子は、蛍光を発することができず、かつ／または光学特性が変化した蛍光放射を放出し、かつ／または第１の状態５に対して変化した吸収特性を有する。蛍光の放出または吸収に関して変化する光学特性は、蛍光放射のスペクトル組成および／または偏光および／または寿命であり得る。結果として、第２の状態の領域では、第１の状態５で放出される蛍光放射の種類に比べて、蛍光放射Ｆの出力が再び減少する。
【００５６】
本発明は、励起用放射Ａの照射が、試料のある部分だけを第１の状態領域（または略して第１の状態）５にし、しかし試料の別の部分は第２の状態領域（または略して第２の状態）６にするために、特性曲線１７を使用する。そのため閾値１９より高い励起用放射出力で照明された／される領域は、特定の蛍光放射を減少させてしか放出しない。その際、第２の状態６が可逆的な状態である場合が有利である。これは少なくともある程度の時間の後または積極的な作用によって、一度、閾値１９より高い励起用放射出力で照射された色素が、再び第１の状態５の特性を示すことを意味する。発明者が、図４に基づく特性曲線を示すものとして認識している色素の例は、出版物 Ｒ．アンドウ他（Ｒ．Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．）「Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｆａｓｔ ｎｕｃｌｅｏｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ
ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｉｎｇ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４年１１月１９日、第３０６巻、１３７０〜１３７３ページに記載されているドロンパ（Ｄｒｏｎｐａ）という名称の物質である。この色素は、アマルガム社（Ａｍａｌｇａａｍ）［米国マサチューセッツ州ウォバーン（Ｗｏｂｕｒｎ）所在］が、ドロンパ・グリーン（Ｄｒｏｎｐａ−Ｇｒｅｅｎ）、コード番号ＡＭ−Ｖ００７１の名称で提供されており、これまでは細胞膜を通る輸送特性が検査される分子の蛍光標識に関連して知られている。この色素ドロンパは、４８８ｎｍの波長で励起させることができ、第２の状態６に励起された後は、４０５ｎｍの波長での放射によって再び第１の状態５に戻し得る。
【００５７】
試料を照明する際に、適切な励起用放射分布と組み合わせることにより、図４の特性曲線または対応する特性曲線を有する色素の使用が解像度を明らかに向上させる。その際、現況技術とは違い、１つの波長の放射だけを照射し、この放射だけが解像度に寄与する。色素が自発的に第１の状態５に戻らない実施形態では、リセット用放射を照射することによりリセットを達成し得るが、しかし、このリセットは解像度の向上のためには顧慮されない。
【００５８】
励起用放射Ａにより、基底レベルから第１の励起レベル（第１の状態５）への色素分子の励起と共に、蛍光の阻止またはデポピュレーション（第２の状態６）も達成される。デポピュレーションの場合は、第１の状態から第２の状態への色素分子の遷移が行われる。両方の状態は、互いに異なる光学的な蛍光特性を有している。励起用放射Ａで励起するとすぐに、高解像の蛍光画像が取得可能であり、その際、励起用放射Ａの光学解像度に関して解像度が高くなる。色素が第２の状態から自発的に第１の状態に戻らない場合、積極的に、例えば励起用放射Ａとは異なる光学特性を有するリセット用放射Ｒによってリセットを達成する。対応する概略図が図５に示されている。
【００５９】
例えば検査する試料Ｐは、元々、蛍光放射Ｆの出力が励起用放射Ａの出力によって上昇する第１の状態５にある。励起用放射Ａの照射は、個々の試料領域Ｂ２では、励起用放射出力が閾値１９より高くなるように行われる。別の領域Ｂ１では、励起用放射出力は閾値より低い。そのため励起用放射の出力が閾値１９より高いか低いかに応じて、幾つかの試料領域は第１の状態５にあり、別の領域は第２の状態６にある。図５は、励起用放射Ａの照射による、第１の状態５にある試料領域Ｂ１（図５の下半分の右側の部分）および第２の状態６にある試料領域Ｂ２（左側の部分）への試料の遷移を概略的に示している。第２の状態６にある試料領域Ｂ２は、とりわけ閾値１９より明らかに高い励起用放射出力が使用された場合、効率よく蛍光を発することができなくなる。その際、「蛍光を発する」という概念は、特定の特性を有する蛍光放射に関する。それはつまり、第２の状態６でも蛍光放射を放出することは完全に可能であるが、但し第１の状態５での蛍光放射とは異なる特性を有する。つまり第２の状態では、試料の吸収特性または／および蛍光特性が変化している。
【００６０】
第１の状態５のままである試料領域Ｂ１は、励起用放射Ａの照射後も、同じ蛍光放射Ｆを放出する。リセット用放射Ｒの照射（図５に、この工程が、対応する矢印によって分かりやすく示されている）は、試料Ｐ全体を、再び第１の状態５に持っていき、つまり異なる蛍光を発する２つの試料領域Ｂ１およびＢ２への分割が元に戻る。
【００６１】
第１の状態５にある試料領域Ｂ１および第２の状態６にある試料領域Ｂ２への試料の分割により、蛍光放射Ｆの放出を、励起用放射Ａで照明された試料Ｐの元々のボリュームより小さく制限することが可能となる。つまりこのため、蛍光を発する画像に、元々の励起用放射分布には存在しなかった構造が達成され得る。これは特性曲線１７の非線形性を巧みに利用することによって起こる。
【００６２】
図６ａおよび図６ｂは、解像度を高めるための励起用放射分布を推測できるように、２つの方法形態を示している。両方の図は、左に励起用放射分布または蛍光放射分布の１次元断面を示す。右はそれぞれ、上から見た蛍光放射分布の２次元画像である。
【００６３】
図６ａでは、点状に分布された励起用放射Ａが照射される。この分布は、この場合、回折に制限されたエアリー分布である。これにより色素では、蛍光放射Ｆが、楕円形のドーナツ分布で励起され、この分布は、横方向の２次元画像において、蛍光を発する円形リングとして示されている。試料領域Ｂ１だけが蛍光を発する。軸方向には、蛍光を発する楕円形のリングが現れる。この試料領域Ｂ１は、励起用放射の回折限界が許容される程に小さい。
【００６４】
これに対し図６ｂに示したように、同様に回折に制限されたドーナツ形の分布で励起用放射Ａを照射した場合、リング形の蛍光を発する領域に囲まれており、かつ縮小されたエアリー分布に対応する放出性の試料領域Ｂ１が生じる。このため断面図では、蛍光放射Ｆの分布内に３つのピークが試料領域Ｂ１として示されている。ここでも点像分布１６は、回折限界が許容される程に小さい。標準の点像分布を介した解像度の改善は、主に特性曲線１７および励起用放射Ａの出力分布からの組合せに依存する。
【００６５】
リング形の外側の領域を遮蔽するため、さらに共焦点検出ボリュームＤを適切に調整することで、真ん中のピークを選び出す共焦点検出を実施し得る。これは第３の方法形態として概略的に図７に示されている。検出もされた、蛍光を発する試料領域Ｂ１は、真ん中のピークから成る。全体として、例えば画像を生成するボリュームＢ（図７の右の図における点線）が達成されており、このボリュームは、通常の点像分布の２．５分の１の細さ、それどころか共焦点の点像分布の１．７分の１の細さである。図６ｂまたは図７の右の図に引かれたカーブが示すように、ドーナツ形の励起分布の場合、画像を生成するボリュームＢの結果として生じる分布または図６ｂの点像分布の真ん中のピークは、放射方向に対称的である。照明スポットを２つ使用する場合、スポットの極大を結ぶ線に沿って、解像度が最大に高められる。
【００６６】
代替として、図６ｂにおける蛍光を発する外側のリングは、共焦点検出ボリュームＤの領域内で、色素を第２の状態６から第１の状態５に狙い通りにリセットすることにより遮蔽される。この措置／原理は以下の通りである。まず励起用放射で、検査する試料区間が完全に第２の状態に達するように励起される。続いてリセット用放射Ｒを、共焦点検出ボリュームＤに適切な分布で照射し、これにより、ある試料部分がリセットされる。図７に基づく励起用放射分布Ａで再び励起すると、この試料部分にある画像を形成する領域Ｂだけが第１の状態に達し、図７の変形形態でも残っているような真ん中のピークの形において、蛍光放射Ｆを放出する。リング形の外側の領域は第２の状態に留まり、蛍光を発しない。
【００６７】
第４の方法形態では、例えば図８ａに示されているような構造化された平面的な照明が行われる。ｘ方向に正弦状に分布した励起用放射Ａは、正弦状の出力分布の谷で蛍光放射Ｆを発する。蛍光を発する試料領域Ｂ１は縞状である。しかしながら、この縞は、励起用放射Ａの正弦状の分布の縞より明らかに細い。これに関し、励起用放射Ａの正弦状の分布は、極小として零点を有していない、または有する必要がないことが有利となる。結果として生じる蛍光放射Ｆの分布は、その高さについては、励起極小の出力に依存するが、しかし幅については依存しない。つまり正弦状の励起用放射分布の極小の深さは、縞の幅には関係なく、そのため解像度にも関係ない。例では、励起用放射Ａの正弦状の縞の分布の周期は、その解像度の限界周波数に調整されている。検出器には、例えばマトリクス検出器を使用する。縞の幅、したがって解像度は、この解像度の限界周波数に対して６倍だけ改善されている。解像度の高い画像は、この縞パターンの変位によって取得される。
【００６８】
代替として、縞状の遠視野照明の代わりに、焦線状の照明を使用してもよく、その際、この線は、その長手軸に沿って（例えば正弦状に）変調されており、そのため、出力が閾値より高い線区間および閾値より低い線区間がある。走査運動は、線に対し垂直に、および線に沿って行われる。検出器は、適切に高く解像するライン検出器である。
【００６９】
図８ｂは、図８ａの第４の方法形態のさらなる形態を示している。この第５の方法形態では、解像度放射Ａの分布の構造化が、両方の横方向の軸において、つまり試料平面において行われ、そのためマトリクス状の照明スポット分布が得られる。これが図８ｂの左半分の断面図において１次元で示されている。明るい励起スポットから成るマトリクスが、光軸に対し垂直に、試料上に結像されている。各照明スポットに１つの検出器が割り当てられている。試料に対しスポット・パターンを変位させることで、点の間の隙間を同様に測定することができる。マトリクス状のパターンの変位を行わなければならない領域は、図８ｂに、領域Ｇ１として示されている。例えば通常の走査型レーザ顕微鏡によって既知のような、スポット・マトリクスの走査により、全体として、個々の領域Ｇ１から全ての領域Ｇ２が構成される。この並行化により、非常に高い走査速度が達成される。同時に解像度は、断面図での蛍光放射Ｆの細いピークが示すように、励起用放射分布の解像度を超えて高められている。
【００７０】
ここまでは横方向の解像度だけを説明してきたが、これらの実施形態に関して、軸方向の解像度も改善されている。
図９ａは、説明した方法形態のそれぞれを実現可能な走査型レーザ顕微鏡を示している。方法形態１〜方法形態３用の走査型レーザ顕微鏡２０は、例えば一点走査型顕微鏡として形成される。この顕微鏡は、励起モジュール２１と、顕微鏡モジュール２２と、検出器モジュール２３とを有している。顕微鏡モジュール２２では、試料２４が対物レンズ２５の焦点内にあり、この対物レンズの照明方向における手前に、鏡筒レンズ２６が接続されている。この光学系の前には走査光学系２７があり、この走査光学系によりスキャナ２８と共に、試料上での焦点の変位による試料２４の走査が可能となる。主カラー・スプリッタ２９は、励起用放射モジュール２１から顕微鏡モジュール２２へと放射をカップリングさせ、試料２４に受け止められた放射を、顕微鏡モジュール２２から検出器モジュール２３へと分離する。
【００７１】
励起モジュール２１は光源３０を備えており、この光源の放射は、主カラー・スプリッタ２９を介して、試料２４内の焦点に集束される。試料２４の焦点内で励起された蛍光放射Ｆは、対物レンズ２５によって集められ、主カラー・スプリッタ２９で、励起用放射Ａに対し変化したスペクトル特性に基づき、ピンホール光学系３１へとデカップリングされ、このピンホール光学系の後方には、ピンホール３２および（任意で）ブロック・フィルタ３３が接続されている。点検出器３４が、焦点での蛍光放射Ｆの出力を捕捉する。この捕捉は、追加としてスペクトル分解、偏光分解、および／または時間分解で行われる。検出器３４の信号は、走査型レーザ顕微鏡２０の稼働全体を制御する制御装置３５によって読み取られる。
【００７２】
解像度を高めるため、特定の出力分布で、焦点２４内への励起用放射Ａの照射を行う。励起モジュール２１内には、この出力分布を予め定め、かつ調整するために適切な構成が備えられている。図９ａの設計は、光源３０の放射線出力の５０％をデカップリングさせるビーム・スプリッタ３６を有している。実施形態においてビーム・スプリッタ３６は、偏光ビーム・スプリッタである。この方法で分けられた部分放射線は、その後、さらなるビーム・スプリッタ４０を介し、再び同じ放射線へと合わせられ、その際、部分放射線の強度および位相は前もって適切に調整される。追加として、片方の部分放射線内に位相要素３９が置かれ、この位相要素は、固定的な位相要素または可変に調整可能な位相要素として形成され得る。位相要素３９は、例えば位相が変化する領域４４および位相が中立な領域４９を有しているので、放射線内にドーナツ形の出力分布を生じさせる。ビーム・スプリッタ４０以降で、両方の部分放射線を重ね合わせることにより、図１０に基づく励起用放射Ａが得られる。位相要素３９の構成が、具体例として図９ｂに示されている。重ね合わせる前の両方の部分放射線の出力割合を調整するため、各部分放射線内にはさらに、可変の減衰器３７または３８が置かれている。
【００７３】
結果として、光軸に対し垂直に走るｘ軸に沿った断面図として図１０に示されているような、励起用放射Ａの出力分布が得られる。この分布は極小４５を有しており、その深さは、例えば制御装置３５で、減衰器３８または３７を調整することにより、つまり両方の部分放射線の相対的な出力を変化させることにより、可変に調整可能である。極小４５を適合させることで、同様に図１０に記された蛍光放射Ｆの強度を、最適に調整することができる。
【００７４】
可変に調整可能な位相要素を使用することで、部分放射線を形成せずに、極小４５の深さを調整することも可能である。このような位相要素として液晶から成るマトリクスが考慮されており、その場合、個々のピクセルのそれぞれの位相を調整可能である。もちろん、調整可能な極小４５を有するドーナツ形の放射線分布を生成するための、別の機構でもよい。
【００７５】
試料領域Ｂ２を第２の状態６から第１の状態５に任意でリセットするため、リセット用放射源４１を装備可能であり、このリセット用放射源は、第３のスプリッタ４２を介して、励起モジュール２１の励起用放射線経路内に組み込まれている。しかしながら、この設計は任意であるので、図９ａではこの要素を破線でも表示している。リセット用放射源４１は、試料２４の色素が自発的に再び第１の状態に戻らず、光学的なリセット用放射Ｒによる積極的なリセットを必要とする場合だけ必要である。しかし、リセット用放射は、他の方法で試料２４上に施してもよく、例えば走査型レーザ顕微鏡の脇に取り付けたリセット用放射線源により、対物レンズ２５の光軸に対し斜めに照射することによって施すことができる。
【００７６】
図９ａの顕微鏡は、最初に説明した方法形態を実施可能である。その際、第３の方法形態は、検出器モジュール２３内のピンホール３２およびピンホール光学系３１を使用する必要がある。共焦点検出を必要としない場合は常に、そのために必要な構造（３１、３２）をなくすことができる。
【００７７】
図１１ａは、本発明による解決手段のさらなる改善の可能性を示している。部分領域Ｂ２内の試料の第１の状態から第２の状態６への移行が、完全には行われない可能性がある。それは、例えば、蛍光特性曲線１７が、最大値１８の後、つまり閾値１９より高い励起用放射Ａの出力に関し、十分に急に減少しない場合である。図１１ａの例で特性曲線１７は、高い励起用放射出力の場合も零までは戻らない。減少分４６が最大値１８に対応していないので、これは、第２の状態６にある試料領域Ｂ２での残余蛍光４７を引き起こす。その後、図９ａに基づく顕微鏡で、例えば第３の方法形態を実施して蛍光放射Ｆを測定した場合、画像を形成するボリュームＢは、解像度の低い土台部Ｓおよび解像度の高い分布Ｖから構成されるだろう。これは図１１ｂに概略的に、土台部Ｓを斜線で、および解像度の高い分布Ｖを黒で示している。
【００７８】
同じ作用が、試料内の蛍光を発する材料、例えば色素分子の多くが、強い拡散性を示す場合に生じ得る。この場合も、試料領域Ｂ２内で残余蛍光４７が生じるが、比較的ゆるやかに下降する特性曲線１７ではなく、蛍光を発する材料の拡散に基づいている。
【００７９】
適切な撮像によって、土台部Ｓを抑えることが可能である。これを実現する第２の走査型レーザ顕微鏡２０の実施形態の具体例が、図１２に示されている。図９ａの設計と一致するコンポーネントには同じ符号を付しているので、その再度の説明は省略し得る。
【００８０】
図９ａの設計とは異なり、検出器３４がロック・イン増幅器４８と接続されており、その接続は、図１２では、単に具体例として、制御装置３５を介して実現されている。もちろん、直接の接続も可能である。またロック・イン増幅器４８を制御装置３５に一体化させてもよい。ロック・イン増幅器４８は、極小４５をその振幅において変調する周波数発生器４９と接続されている。これに関し、両方の部分放射線の片方の出力が、励起モジュール２１内で適切に変調され、それは例えば両方の減衰器３７または３８の片方を制御することによって行う。図１２では、減衰器３８の制御回路が、その任意性を示唆するため破線で示されている。もちろん、減衰器の制御は、周波数発生器４９の信号を適切に評価する制御装置３５で行ってもよい。既に説明したように、ロック・イン増幅器４８および／または周波数発生器４９は、制御装置３５の構成部材であってもよい。
【００８１】
周波数発生器４９により、極小を変調させるために準備された周波数は、ロック・イン増幅器４８にも送られる。極小４５の変調によって、第１の状態５にある試料領域からの信号が変化し、それに引き換え、土台部Ｓからの信号はそのまま変わらない。ロック・イン増幅器４８は変調された信号を取り出し、土台部Ｓからの信号を抑える。結果として、土台部Ｓから分布Ｖが分離され、第２の状態６への移行が不完全な場合にも、高解像度の検出が達成される。
【００８２】
追加として、同じままの信号の部分を狙い通りに使用する場合、解像度の高くない画像データが得られる。この画像データは、例えば、異なる仕方で蛍光を発する試料領域／試料特性に関する。高解像度および低解像度のものを、随意にコード化し（例えばカラー・コード化し）重ね合わせて示してもよい。
【００８３】
このロック・イン検出の代替または追加として、２つの画像を記録することも可能である。第１の画像は極小４５を有する励起用放射分布によって記録し、第２の画像は極小４５なしで記録する。土台部Ｓから高解像の分布Ｖを分離するには、これらの画像が互いに差し引かれるだけでよい（第１の画像−第２の画像）。結果の画像には、高解像の分布Ｖによるデータしか含まれていない。低解像の土台部を抑えるためのさらなる可能な手段として、両方の状態の寿命が異なる場合など、第１の状態５および第２の状態６の異なる光学特性を利用し得る。また第１の状態５と第２の状態６との間の放出スペクトルの異なる特性または吸収スペクトルの異なる特性を使用してもよい。
【００８４】
図１３は、線状の照明による方法形態の１つを実現するための、図９ａの走査型レーザ顕微鏡２０の別の１つの変形形態を示している。ここでも図９ａと一致する要素には同じ符号が付されているので、その説明は再び省略し得る。さらに、中央の放射線だけが記されている。
【００８５】
コヒーレントな光源３０は、その放射を、２つの１次回折ｏ＋およびｏ−、ならびに１つの０次回折を発生させる格子５０を通して放出する。この格子の後方には、ここではアナモフィック要素のための例であるシリンダ・レンズ５０ａが配置されている。試料には、光軸に対し垂直な線が合焦される。
【００８６】
これらの回折次数が、合焦時にかすりながら互いに差し込み合い、試料内で干渉に達する。タルボット効果によって、いわゆるタルボット格子が光軸ＯＡに沿って現れる。これは、図１４の上半分に概略的に示されている。＋１次と、０次と、−１次とが異なる角度で、試料２４内で差し込み、干渉が、当業者に既知のタルボット構造を生成する。
【００８７】
試料内の作用は図１４の下半分に示されており、この図は、試料の深さ断面（ｘ、ｚ面）を示している。強度が高い位置（黒い領域Ｂ２）では、試料は第２の状態６に達し、つまり色素分子の切替えにより、励起状態のデポピュレーションが達成されている。強度が低い領域Ｂ１では、試料は第１の状態５のままである（斜線領域および白い領域）。
【００８８】
検出はライン検出器３４によって行われ、この検出器は、図１３の設計では、具体例として制御装置３５と一体化されて示されている。ライン検出器３４の前に、再び（任意で）ブロック・フィルタ３３が置かれている。さらに、必要な深さの平面を共焦点選択するため、およびそれにより斜線領域だけを検出するため、ライン検出器３４の前に、（図１３では、ライン検出器３４に直接取り付けられているので図示されていない）ｘ軸に沿ったスリット絞りが配置されている。
【００８９】
スキャナ２８により、励起用放射分布が、光軸に対し垂直に、つまりｘ軸およびｙ軸に沿って、試料２４全体を移動することが可能となる。任意で、図５に分かりやすく示されているように色素を第２の状態６から第１の状態５に切り替えさせ得るリセット用放射源４１によって、例えば試料２４内のｘ軸に沿った均質な線を生成し得る。この線は、第２の状態６にある試料領域Ｂ２に適合する照明パターンを有することも可能である。この理由は、この領域しかリセットする必要がないためである。
【００９０】
つまり、図１３に基づく走査型レーザ顕微鏡は、図８ａに基づく方法形態を実現する。極小４５の深さは、格子の質または各次数の個々の減衰によって生じ得る。
図１５ａは、図８ｂに基づく方法形態を実現するための構成を示しており、この場合、走査型レーザ顕微鏡２０のうち、その他の顕微鏡モジュール２２は既に説明した構成を有しているので、ここでは励起モジュール２１だけが示されている。光源３０から、第１のビーム・スプリッタ５３により、２つの部分放射線が生成され、ここでは図の面に対し垂直方向に間隔をあけている。第２のビーム・スプリッタ５２は、全部で４つの平行に走る部分放射線を生成させる。図１５ｂは、９０°回転させた構成の断面を示している。全体として、同じ強度の４つの部分放射線５４、５５（中央の放射線が描かれている）が存在している。それぞれの図で、２つの部分放射線が同じ経路を取っているため遮られて見えていない。
【００９１】
部分放射線は、レンズを介して顕微鏡モジュール２２の瞳内へ合焦され、これにより、図１６ａに示された瞳の境界線５６内に点分布が生じる。４つの部分放射線５５、５４が正方形の角を占めている。試料２４内で部分放射線が干渉に達することにより、試料２４上に、光軸に対し垂直に、図１６ｂに基づくマルチ・スポット・パターン５８が生じる。このマルチ・スポット・パターン５８の零点の深さは、例えば、それぞれ対角線上で向かい合った放射線５４、５５の強度を変えることで変化させ得る。これに関し、調整可能な適切な減衰器（不図示）が、部分放射線のために備えられている。
【００９２】
試料２４は、図１６ｂのマルチ・スポット・パターン５８内の強度の高い位置（明るい領域Ｂ２）で第２の状態６に達している。蛍光放射Ｆは、強度の低い領域Ｂ１（暗い領域）で発生する。蛍光放射Ｆはその後、通常通り主カラー・スプリッタ２９で分離される。検出器５４は、スポット・パターンに適合させたマトリクス検出器であり、任意で、ピンホール・マスクが前に接続される。検出器要素は、領域Ｂ１に位置合わせされている。ここでも、スキャナ２８により、励起用放射分布を、ｘ方向および／またはｙ方向において試料２４全体に変位させることが可能となる。図１７は、下側の画像にマルチ・スポット・パターン５８を示し、それによって励起された蛍光パターン５９をその上に示している。
【００９３】
リセット光源４１によって、さらなる放射線５７を瞳内に合焦可能であり、それによりこの放射線は、試料２４内で均質な面を照らし出す。これにより、既に説明したように２つの走査工程の合間、および場合によっては１つの走査工程内にも、第２の状態６から第１の状態５への蛍光分子のリセットが行われる。
【００９４】
しかし領域Ｂ２だけをリセットすればよいため、リセット用放射線４７は、領域Ｂ２に対応する照明パターンを有していてもよい。これに関し、放射線４７は、部分放射線５４、５５に従い、同様に４つの部分放射線に分光され、瞳内に結像されるので、瞳の境界線５６内に、例えば図１８に示された分布を生じさせる。これに加え、リセット用放射Ｒの部分放射線５７の光軸は、励起用放射Ａの光軸に対して、試料内に生じる励起用放射Ａのマルチ・スポット・パターン５８の極小が、マルチ・スポット・リセット・パターンの極大と重なるように角度調節されている。図１８の変形形態における図１５ａに基づく実施形態は、リセット用放射を適切に構造化することにより、領域Ｂ２内だけで、試料または色素を傷めないリセットを行うための具体例である。
【００９５】
励起用放射Ａを適切に照射することによって、試料を、第１の状態にある領域Ｂ１および第２の状態にある領域Ｂ２に分けることが重要である。そのため、試料領域の第２の状態への移行を、試料平面の深さ選択のために使用することも可能であり（図１４参照）、これにより、試料領域Ｂ１は、隣接する検出器要素／検出器領域のクロストークに寄与し得ない。
【００９６】
前出の様々な変形形態の中で説明した方法または顕微鏡のために、励起用放射Ａの位置分布を特に考慮し、試料の蛍光特性に応じて、励起用放射Ａの出力を調整することが重要である。特に、その分布の励起用放射の１つまたは複数の極小４５の深さおよび対応する極大の高さが、達成可能な解像度の向上度を決定する。励起用放射Ａの位置的な出力分布の調整の最適化は、２つのやり方で実現し得る。最適化のために、例えば制御装置３５が適切に使用可能である／になる特性曲線１７が認識されている場合、所定の位置的な励起分布のために最適な出力レベルを算出し、例えば規定値の出力によって、または、それどころか励起モジュール２１を直接制御することによって、適切に調整する。
【００９７】
代替または追加として、検査する試料のテスト・プレパラートまたは参照箇所で実際の解像度を確定し、所定の励起分布での最適な出力レベルを、反復工程において確定し、その後、試料２４の結像のために使用することも可能である。
【００９８】
もちろん、出力スケーリングだけの代わりに、例えば位相要素３９を適切に調整することによる分布変更も可能である。
試料２４の蛍光特性、例えば色素の蛍光特性は既に、後の画像取得条件下での、テスト・プレパラートまたは試料の参照箇所の検査によって確定可能である。これに関し、検出される蛍光放射Ｆの出力は、試料のある点または領域での励起用放射Ａの出力に応じて確定される。特に優れた調整のために有利なのは、（放出される蛍光放射Ｆの出力とは異なり）蛍光特性、つまり特性曲線１７が、色素などの蛍光を発する材料の濃度に依存しない場合である。これにより、走査型顕微鏡２０の制御装置３５は、確定された曲線１７、もしくは供給またはメモリ内に格納された曲線１７から、最適な出力を自動的に確定し、適切に調整することができる。
【００９９】
蛍光特性の試料依存性が強く、および蛍光特性を確定するための試料の参照箇所が存在する、または見つけられない場合は常に、反復決定が有利である。この場合は、関心のある試料エリアの中または外の限定された領域、もしくは結像する試料エリア全体での画像形成に基づき、出力の最適化を行うか、または制御装置３５によって実施させる。解像度の質の基準（選択された箇所でのコントラストまたはフーリエ空間で画像内において伝達される周波数域の拡大など）に基づき、励起出力を最適化する。その際、一般的には、励起分布の極小での出力または空間的に広く分布した基礎出力を適合させれば十分である。
【０１００】
励起用放射Ａおよびリセット用放射Ｒは、１つの放射源から生成し得る。この放射源は、直接的に切替え可能であるか、または後方に選択構成を配置させることができる。
図１９は、走査型レーザ顕微鏡１００を概略的に示しており、この顕微鏡は、これまでに説明したコンセプトに依存せずに使用可能である。実線は、照明用放射線経路Ｂを示しており、破線は、検出用放射線経路１０２を示している。この走査型レーザ顕微鏡は、試料１０３を走査しながら検出器１０４に結像し、その際、試料を照明源１０５によって照明する。
【０１０１】
検出用放射線経路１０２は、光軸ＯＡに沿って試料１０３から検出器１０４の方向に、対物レンズ１０６および鏡筒レンズ１０７を備えており、それらの後に走査対物レンズ１０８ａが続き、その後にスキャナ１０９がある。放射は、リレー光学系１０８ｂ、１１０、およびピンホール光学系１１１の後に、ビーム・スプリッタ１１３を通過して、検出器１０４に達し、この場合、検出器はマトリクス検出器として形成されており、この検出器の前には、照明用放射の最終分をブロックするためにフィルタ１１２が配置されている。もちろん、検出用放射線経路１０２の別の実施形態も可能であり、例えばフィルタ１１２、ならびに図２０の設計では要素１０８ａと１０７の間にある破線で示された中間像をなくしてもよい。
【０１０２】
図１９に示された顕微鏡１００では、スキャナ１０９およびさらに説明するビーム・スプリッタ１１３を中に有する瞳面は、互いに対し、ならびに要素１０６と１０７の間に実線で記された対物レンズ１０６の後方の焦点面に対し、共役である。
【０１０３】
照明源１０５はレーザ１１４を有しており、このレーザは、さらに詳しく説明するスプリッタ機構１１６によって、図１９では中央の放射線だけが記されている４つの部分放射線Ｓａ、Ｓｂ、Ｓｃ、Ｓｄを生成する。スプリッタ機構１１６は、図１９の概略図では２つしか見えない（他の２つは図の面に対し垂直に重なっている）４つの部分放射線Ｓａ〜ｄを、ビーム・スプリッタ１１３に合焦させる。
【０１０４】
詳細には、スプリッタ機構１１６は２つのスプリッタ１１７および１１８、ならびに偏向ミラー１１９を有しており、これらが、レーザ１１４によって放出された放射線Ｓから、平行な４つの部分放射線Ｓａ、ＳｂおよびＳｃ、Ｓｄを生成する。図１９では、部分放射線ＳａおよびＳｂが重なっており、部分放射線ＳｃおよびＳｄも同様に重なっている。スプリッタ機構１１６内のレンズ１２０および１２１は、部分放射線Ｓａ〜ｃが、ビーム・スプリッタ１１３の面上の４つの点に合焦されるように、合焦を行う。
【０１０５】
もちろん、４つの部分放射線Ｓａ〜ｃの生成は、異なる形成がなされたスプリッタ機構１１６によって行われてもよく、または４つのレーザ１１４を使用するなど、根本的に異なるやり方で行ってもよい。スプリッタ機構１１６のためのさらなる可能な実施形態が、図２０に示されており、この場合、スプリッタ１１８およびミラー１１９と、スプリッタ１１７が逆になっている。
【０１０６】
図２１は、ビーム・スプリッタ１１３を、そのビーム・スプリッタ面１２２を上から見た図として示している。ビーム・スプリッタ面１２２の上には、反射性の４つのミラー面要素１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃ、および１２３ｄが配置されており、このミラー面要素は仮想正方形１２４の角の点にあり、その中心が光軸ＯＡの突破点１２５になっている。ビーム・スプリッタ面１２５は、ミラー面要素でだけ反射性であり、他の部分では、少なくとも検出用放射に対して透過性である。
【０１０７】
照明源１０５は、４つの部分放射線Ｓａ〜ｄを、４つのミラー面要素１２３ａ〜ｄに合焦させる。このように瞳内に合焦されて、反射された部分放射線は、試料１０３内で干渉に達し、それにより図２２に示されたマルチ・スポット・パターン１２８を試料内に生じさせる。このマルチ・スポット・パターン１２８は、暗い領域１２７に囲まれた光スポット１２６の規則的な構成である。光スポット１２６と暗い領域１２７の間の強度差、つまり零点の深さは、それぞれ向かい合う部分放射線Ｓａ、ＳｄおよびＳｂ、Ｓｃの強度を変えることによって変化させ得る。その際、（光軸に対して）対角線上で向かい合う部分放射線、または、それぞれ間にある部分放射線に隔てられた部分放射線を、同じ様に調整することが好ましい。部分放射線が３つの場合は、１つの部分放射線が、２つの部分放射線に対して異なって調節される（またはその逆）。
【０１０８】
パターン１２８の空間的な拡張は、試料内の、パターン１２８に覆われた画像エリアを変更することによる、顕微鏡の拡大倍率の変化（例えば１１０および１０８ｂでの焦点距離の変化）によって適合させ得る。代替として、このためにレンズ１１０、１２１の焦点距離を調整してもよい。
【０１０９】
ビーム・スプリッタ１１３の作用は、以下の通りである。
ミラー面要素１２３ａ〜ｄの幾何学的な構成およびそこに合焦された部分放射線Ｓａ〜ｄによって、試料１０３上に、規則的に配置された光スポット１２６による点パターン１２８が生じる。そのため、蛍光顕微鏡検査における適用では、光スポット１２６で蛍光が励起される。これは、空間的にインコヒーレントに生じるので、顕微鏡１０６の後方の焦点面（要素１０６と１０７の間に実線で記された）を均質に満たす。これに類するものとしては、同様に画像取得のために用い得る拡散反射がある。
【０１１０】
後方の焦点面は、ビーム・スプリッタ１１３が中に配置されている瞳と共役なので、検出するインコヒーレントな放射は、ビーム・スプリッタ１１３が中に配置されている瞳全体をも満たし、そのためビーム・スプリッタ面１２２全体を照らし出す。これに対し、鏡面反射された照明用放射は、ミラー面要素１２３ａ〜ｄに合焦されるので、照明源１０５に返される。
【０１１１】
結果として、空間的にインコヒーレント、つまり非指向性に、試料１０３内で生じた検出すべき放射だけがビーム・スプリッタ１１３を通過する。このためビーム・スプリッタ１１３は、色彩の調整を行わなくても、検出用放射と鏡面反射された照明用放射の分離を引き起こす。これは、より高い利得が達成されるだけでなく、ビーム・スプリッタ１１３が、非常に様々な照明波長および検出波長に対して使用可能であるという利点を有する。通常、カラー・スプリッタに設けられている交換メカニズムまたは変調器は必要ない。
【０１１２】
（図１９に瞳放射線経路が破線で示されている）検出は、例としてマトリクス検出器として形成された検出器１０４によって行われ、この検出器の前には、任意でピンホール・マスクを配置してもよい。その際、照明されたスポットが共焦点結像される。このマスクは、検出器の前の観察放射線経路の中間像面内に設置可能であり、または代替として、（１１０と１０８ｂの間の）リレー光学系内に設置可能である。後者は照明側でもビーム・プロフィルを改善する。
【０１１３】
試料１０３の走査はスキャナ１０９の作用によって行われる。その際、試料１０３上で照明された光スポットを、一点スキャナの場合に必要であるより非常に極僅かに変位させるだけでよい。光スポットは干渉によって試料内に現れるので、個々の光スポット１２６はスキャナ１０９によって同時に変位される。このためスキャナ１０９による移動は、隣接する光スポット１２６同士の間の暗い領域１２７が走査される移動で十分である。つまり光スポットの、走査しながらの変位は、周期的で規則的なパターン１２８の周期長内だけで行われることが好ましい。
【０１１４】
図１９に示された構成は、ビーム・スプリッタ１１３以降の検出用放射線経路と照明源１０５を交換するという趣旨で逆にすることもできる。そうすると、ビーム・スプリッタ１１３は、ミラー・コーティングに関し、図２１に示された設計と反転し、つまりミラー面要素１２３ａ〜ｄが、ミラー面における孔になる。
【０１１５】
ビーム・スプリッタ１１３は、スキャナとしてのニポウ・ディスクと組み合わせてもよく、またはスキャナを一体化させてもよい。
さらに、図１９〜図２２に基づく実施形態は、図４〜図１８に基づく設計または方法とも組み合わせ得ることが特に有利であり、その際、特徴を１つだけ（例えばビーム・スプリッタ１１３を）組み合わせてもよい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明用放射線源（１０５）および検出用放射線経路（１０２）を備えており、該検出用放射線経路が、試料（１０３）内で励起および／または後方散乱された放射を、光軸（ＯＡ）に沿って検出器機構（１０４）へ導き、該検出用放射線経路内に、該照明用放射線源（１０５）から放出された照明用放射線経路（Ｂ）内の照明用放射を、該試料（１０３）上に向けるビーム・スプリッタ（１１３）が備えられており、該ビーム・スプリッタ（１１３）が、該試料（１０３）で鏡面反射された照明用放射を該検出器機構（１０４）へは通過させず、そのために該照明用放射線経路（Ｂ）の瞳内に配置されており、かつ部分的にミラー・コーティングされている、走査型レーザ顕微鏡において、該ビーム・スプリッタ（１１３）が、該検出用放射線経路（１０２）内にあるビーム・スプリッタ面（１２２）を有しており、該ビーム・スプリッタ面（１２２）が、該ビーム・スプリッタ面（１２２）上の、該光軸（ＯＡ）の突破点（１２５）を中心とする円上にある少なくとも３つの点（１２３ａ〜ｄ）で該照明用放射のためにミラー・コーティングされており、該照明用放射線源（１０５）が、該点の数に対応する数の部分放射線（Ｓａ〜ｄ）を発生させ、該部分放射線を、該試料（１１３）一面に周期的に分布する照明スポット（１２６）の形の干渉パターン（１２８）が該試料（１０３）内に生じるように、該ビーム・スプリッタ（１１３）の該３つの点（１２３ａ〜ｄ）上に合焦させることを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
【請求項２】
照明用放射線源（１０５）および検出用放射線経路（１０２）を備えており、該検出用放射線経路が、試料（１０３）内で励起および／または後方散乱された放射を、光軸（ＯＡ）に沿って検出器機構（１０４）へ導き、該検出用放射線経路内に、該照明用放射線源（１０５）から放出された照明用放射線経路（Ｂ）内の照明用放射を、該試料（１０３）上に向けるビーム・スプリッタ（１１３）が備えられており、該ビーム・スプリッタ（１１３）が、該試料（１０３）で鏡面反射された照明用放射を該検出器機構（１０４）へは通過させず、そのために該照明用放射線経路（Ｂ）の瞳内に配置されており、かつ部分的にミラー・コーティングされている、走査型レーザ顕微鏡において、該ビーム・スプリッタ（１１３）が、該検出用放射線経路（１０２）内にある反射性のビーム・スプリッタ面（１２２）を有しており、該ビーム・スプリッタ面（１２２）が、該ビーム・スプリッタ面（１２２）の、該光軸（ＯＡ）の突破点（１２５）を中心とする円上にある少なくとも３つの点（１２３ａ〜ｄ）で該照明用放射のためにミラー・コーティングされておらず、該照明用放射線源（１０５）が、該点の数に対応する数の部分放射線（Ｓａ〜ｄ）を発生させ、該部分放射線を、該試料（１１３）一面に周期的に分布する照明スポット（１２６）の形の干渉パターン（１２８）が該試料（１０３）内に生じるように、該ビーム・スプリッタ（１１３）の該３つの点（１２３ａ〜ｄ）上に合焦させることを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記照明用放射線源（１０５）が、レーザ放射線（Ｓ）を放出するレーザ（１１４）と、該レーザ放射線（Ｓ）を前記部分放射線（Ｓａ〜ｄ）に分け、光学系機構（１２０、１２１）を用いて前記点（１２３ａ〜ｄ）上に合焦させるスプリッタ機構（１１６）とを有することを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
照明方向において前記ビーム・スプリッタ（１１３）の後方に配置されており、前記試料（１０３）上での前記干渉パターン（１２８）の変位によって走査を行い、該変位が、周期的に分布する前記照明スポット（１２６）の周期内で行われる走査機構（１０８）を特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項５】
それぞれ対角線上で向かい合って合焦される部分放射線（Ｓａ、Ｓｃ；Ｓｂ、Ｓｄ）の強度を変更する手段を特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記検出用放射線経路が、マトリクス検出器（１０４）内で終端することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項７】
ビーム・スプリッタ（１１３）と試料（１０３）との間の焦点距離変更手段（１１０、１０８ａ、１０８ｂ）を特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項１】
照明用放射線源（１０５）および検出用放射線経路（１０２）を備えており、該検出用放射線経路が、試料（１０３）内で励起および／または後方散乱された放射を、光軸（ＯＡ）に沿って検出器機構（１０４）へ導き、該検出用放射線経路内に、該照明用放射線源（１０５）から放出された照明用放射線経路（Ｂ）内の照明用放射を、該試料（１０３）上に向けるビーム・スプリッタ（１１３）が備えられており、該ビーム・スプリッタ（１１３）が、該試料（１０３）で鏡面反射された照明用放射を該検出器機構（１０４）へは通過させず、そのために該照明用放射線経路（Ｂ）の瞳内に配置されており、かつ部分的にミラー・コーティングされている、走査型レーザ顕微鏡において、該ビーム・スプリッタ（１１３）が、該検出用放射線経路（１０２）内にあるビーム・スプリッタ面（１２２）を有しており、該ビーム・スプリッタ面（１２２）が、該ビーム・スプリッタ面（１２２）上の、該光軸（ＯＡ）の突破点（１２５）を中心とする円上にある少なくとも３つの点（１２３ａ〜ｄ）で該照明用放射のためにミラー・コーティングされており、該照明用放射線源（１０５）が、該点の数に対応する数の部分放射線（Ｓａ〜ｄ）を発生させ、該部分放射線を、該試料（１１３）一面に周期的に分布する照明スポット（１２６）の形の干渉パターン（１２８）が該試料（１０３）内に生じるように、該ビーム・スプリッタ（１１３）の該３つの点（１２３ａ〜ｄ）上に合焦させることを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
【請求項２】
照明用放射線源（１０５）および検出用放射線経路（１０２）を備えており、該検出用放射線経路が、試料（１０３）内で励起および／または後方散乱された放射を、光軸（ＯＡ）に沿って検出器機構（１０４）へ導き、該検出用放射線経路内に、該照明用放射線源（１０５）から放出された照明用放射線経路（Ｂ）内の照明用放射を、該試料（１０３）上に向けるビーム・スプリッタ（１１３）が備えられており、該ビーム・スプリッタ（１１３）が、該試料（１０３）で鏡面反射された照明用放射を該検出器機構（１０４）へは通過させず、そのために該照明用放射線経路（Ｂ）の瞳内に配置されており、かつ部分的にミラー・コーティングされている、走査型レーザ顕微鏡において、該ビーム・スプリッタ（１１３）が、該検出用放射線経路（１０２）内にある反射性のビーム・スプリッタ面（１２２）を有しており、該ビーム・スプリッタ面（１２２）が、該ビーム・スプリッタ面（１２２）の、該光軸（ＯＡ）の突破点（１２５）を中心とする円上にある少なくとも３つの点（１２３ａ〜ｄ）で該照明用放射のためにミラー・コーティングされておらず、該照明用放射線源（１０５）が、該点の数に対応する数の部分放射線（Ｓａ〜ｄ）を発生させ、該部分放射線を、該試料（１１３）一面に周期的に分布する照明スポット（１２６）の形の干渉パターン（１２８）が該試料（１０３）内に生じるように、該ビーム・スプリッタ（１１３）の該３つの点（１２３ａ〜ｄ）上に合焦させることを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記照明用放射線源（１０５）が、レーザ放射線（Ｓ）を放出するレーザ（１１４）と、該レーザ放射線（Ｓ）を前記部分放射線（Ｓａ〜ｄ）に分け、光学系機構（１２０、１２１）を用いて前記点（１２３ａ〜ｄ）上に合焦させるスプリッタ機構（１１６）とを有することを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
照明方向において前記ビーム・スプリッタ（１１３）の後方に配置されており、前記試料（１０３）上での前記干渉パターン（１２８）の変位によって走査を行い、該変位が、周期的に分布する前記照明スポット（１２６）の周期内で行われる走査機構（１０８）を特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項５】
それぞれ対角線上で向かい合って合焦される部分放射線（Ｓａ、Ｓｃ；Ｓｂ、Ｓｄ）の強度を変更する手段を特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記検出用放射線経路が、マトリクス検出器（１０４）内で終端することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項７】
ビーム・スプリッタ（１１３）と試料（１０３）との間の焦点距離変更手段（１１０、１０８ａ、１０８ｂ）を特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５ａ】
【図１５ｂ】
【図１６ａ】
【図１６ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５ａ】
【図１５ｂ】
【図１６ａ】
【図１６ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２０１３−１９９０８（Ｐ２０１３−１９９０８Ａ）
【公開日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２２８００３（Ｐ２０１２−２２８００３）
【出願日】平成２４年１０月１５日（２０１２．１０．１５）
【分割の表示】特願２００８−５２１９０６（Ｐ２００８−５２１９０６）の分割
【原出願日】平成１８年７月２１日（２００６．７．２１）
【出願人】（５０６１５１６５９）カール ツァイス マイクロスコピー ゲーエムベーハー (71)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＲＬ ＺＥＩＳＳ ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ ＧＭＢＨ
【出願人】（５９７１４１９２２）カール ツァイス イェナ ゲーエムベーハー (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１０月１５日（２０１２．１０．１５）
【分割の表示】特願２００８−５２１９０６（Ｐ２００８−５２１９０６）の分割
【原出願日】平成１８年７月２１日（２００６．７．２１）
【出願人】（５０６１５１６５９）カール ツァイス マイクロスコピー ゲーエムベーハー (71)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＲＬ ＺＥＩＳＳ ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ ＧＭＢＨ
【出願人】（５９７１４１９２２）カール ツァイス イェナ ゲーエムベーハー (12)
【Ｆターム（参考）】
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