貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材
【課題】 噴霧装置における目詰まりの発生を確実に防止することができるとともに、被噴霧対象に貝殻焼成カルシウム粉体が付着してしまうことを防止する。
【解決手段】 ほたて貝の貝殻に焼成処理および粉砕処理を施して得られる平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体が含有された貝殻焼成カルシウム混合液の上清である貝殻焼成カルシウム上清液を含有する。
【解決手段】 ほたて貝の貝殻に焼成処理および粉砕処理を施して得られる平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体が含有された貝殻焼成カルシウム混合液の上清である貝殻焼成カルシウム上清液を含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、ほたて貝等の貝殻を粉砕、焼成して得られる貝殻焼成カルシウム粉体やこの貝殻焼成カルシウム粉体を含有する貝殻焼成カルシウム混合液が、殺菌効果や抗菌効果を有するとともに、人体等に対して刺激を及ぼさず、さらに発熱することがない等の種々の観点から、例えば野菜等の洗浄や、水質・土壌の改善、消臭剤、殺菌剤、抗菌剤等の種々の分野において多用されている。
【０００３】
また、近年の研究により、貝殻焼成カルシウム粉体や、貝殻焼成カルシウム混合液には、抗ウイルス効果があることが分かっており、貝殻焼成カルシウム粉体を利用した抗ウイルス材が考えられている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１７９５５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、従来の貝殻焼成カルシウム粉体を含有する貝殻焼成カルシウム混合液を噴霧装置によって噴霧する場合、噴霧装置において目詰まりが発生してしまったり、噴霧した貝殻焼成カルシウム混合液に含有されている貝殻焼成カルシウム粉体が、被噴霧対象に付着してしまうおそれがあるという問題を有していた。このため、噴霧装置のメンテナンス等に手間がかかり、さらには、例えば、被服の上から噴霧したり、屋内において使用する場合等、貝殻焼成カルシウム粉体を被対象物に付着させたくない種々の用途に用いることができず、被噴霧対象や噴霧場所等が限定されてしまうこととなっていた。
【０００６】
本発明はこれらの点に鑑みてなされたものであり、噴霧装置における目詰まりの発生を確実に防止することができるとともに、被噴霧対象に貝殻焼成カルシウム粉体が付着してしまうことを防止することが可能な貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するため、本発明に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材の特徴は、平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体が含有された貝殻焼成カルシウム混合液の上清である貝殻焼成カルシウム上清液を含有する点にある。
【０００８】
本発明において、前記貝殻焼成カルシウム混合液に、０．１５質量％以上の前記貝殻焼成カルシウム粉体が含有されていることが好ましい。
【０００９】
また、本発明における抗ウイルス材は、アルカリ度数が１２．５ｐＨ以上であることが好ましい。
【００１０】
さらに、本発明において、前記貝殻焼成カルシウム粉体は、二枚貝の貝殻に焼成処理および粉砕処理を施して得られることが好ましく、この二枚貝の貝殻としては、ほたて貝の貝殻であることが好ましい。
【００１１】
ここで、本発明の発明者の研究により、例えば平均粒径が１２〜１５μｍの貝殻焼成カルシウム粉体が含有された貝殻焼成カルシウム混合液の上清は、抗ウイルス効果が認められないことが分かっていた。しかし、本発明の発明者のさらなる研究の結果、平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体を含有する貝殻焼成カルシウム混合液の上清は、短時間でも抗ウイルス効果が発生することが分かった。
【００１２】
この本発明に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材によれば、平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体が含有された貝殻焼成カルシウム混合液の上清を用いるので、噴霧装置によって噴霧した場合に、抗ウイルス材によって噴霧装置に目詰まりが発生することを確実に防止することができるとともに、被噴霧対象に貝殻焼成カルシウム粉体が付着してしまうことを確実に防止することができる。
【発明の効果】
【００１３】
以上述べたように、本発明に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材によれば、噴霧装置における目詰まりの発生を防止し、さらには被噴霧対象に貝殻焼成カルシウム粉体が付着してしまうことを防止することができるので、噴霧装置のメンテナンス等が容易となり、さらには、被噴霧対象や噴霧場所が限定されることなく、例えば、被服の上から噴霧したり、屋内において使用する場合等、貝殻焼成カルシウム粉体を被対象物に付着させたくない種々の用途にも用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材の一実施形態を説明する。
【００１５】
本実施形態に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材には、平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体を含有する貝殻焼成カルシウム混合液の上清である貝殻焼成カルシウム上清液が含有されている。
【００１６】
この抗ウイルス材に用いられる貝殻焼成カルシウム粉体は、貝殻、好ましくは二枚貝の殻に焼成処理および粉砕処理を行うことにより製造される。材料として用いられる二枚貝としては、ほたて貝、アサリ、シジミ、ハマグリ、カキ、ホッキ等の種々の二枚貝を利用することが可能であるが、高い抗ウイルス効果を有する等の観点からは、特にほたて貝を用いることが好ましい。そこで、本実施形態においては、ほたて貝を用いた貝殻焼成カルシウム粉体を用いて説明する。
【００１７】
このほたて貝を用いた貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法の一例について、以下説明する。
【００１８】
まず、ほたて貝の貝殻を所定時間煮沸する殺菌・洗浄処理を行い、続いて、この貝殻を粗く粉砕する第１粉砕処理を行って、被粉砕貝殻を得る。次に、前記被粉砕貝殻を焼成する焼成処理を行って、被粉砕貝殻を酸化カルシウムとした後、焼成した被粉砕貝殻を所定の温度下において放置することにより熟成させる熟成処理を行う。この焼成処理および熟成処理により、被粉砕貝殻は、灰となって砕ける状態となる。さらに、この被粉砕貝殻をさらに細かく粉砕する第２粉砕処理を行うことにより、貝殻焼成カルシウム粉体を製造する。
【００１９】
なお、本発明に用いられる貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材における貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法は、前述の製造方法に限定されるものではなく、主成分が酸化カルシウムである貝殻焼成カルシウムを製造するものであればよい。
【００２０】
また、この抗ウイルス材に用いられる貝殻焼成カルシウム混合液は、前記貝殻焼成カルシウム粉体に、精製水等の液体を添加して製造されている。この貝殻焼成カルシウム混合液における貝殻焼成カルシウム粉体の含有量は、０．１５質量％以上であることが好ましい。
【００２１】
さらに、この抗ウイルス材の貝殻焼成カルシウム上清液は、前記貝殻焼成カルシウム混合液において貝殻焼成カルシウム粉体を沈殿させることにより得られた上清からなる。貝殻焼成カルシウム混合液において貝殻焼成カルシウム粉体を沈殿させる方法としては、例えば、貝殻焼成カルシウム混合液を遠心する方法等がある。ここで、本発明における抗ウイルス材は、貝殻焼成カルシウム上清液を含有するものであり、貝殻焼成カルシウム上清液を含有するとは、貝殻焼成カルシウム上清液のみにより構成されてもよく、または、貝殻焼成カルシウム上清液に、精製水、リン酸緩衝生理食塩水、水道水等の他の物質が添加されたものであってもよい。この貝殻焼成カルシウム上清液を含有する抗ウイルス材のアルカリ度数は、１２．５ｐＨ以上であることが好ましい。
【００２２】
本発明に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材は、インフルエンザウイルス等のエンベロープを有するウイルスだけでなく、アデノウイルス科のトリアデノウイルスやピコルナウイルス科の口蹄疫ウイルス等のエンベロープを有することなく比較的抵抗性が高いウイルス等、全てのウイルスに適用することができる。
【００２３】
以下、本実施形態に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材の実施例、およびこの抗ウイルス材の比較例の各試験例を説明する。
【００２４】
［試験例１］貝殻焼成カルシウム上清液の場合
（１）貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法
殺菌・洗浄処理工程において、ほたて貝の貝殻を１１０℃の真水で１時間ほど煮沸することにより、ほたて貝の貝殻と身を分離するとともに、貝殻および身の殺菌・洗浄を行った後、平均粒径が５〜１０ｍｍ程度となるように粉砕して第１粉砕処理工程を行い、被粉砕貝殻を得た。
【００２５】
次に、電気炉を３時間で昇温して温度を１１００℃として、被粉砕貝殻を２時間程度焼成して焼成処理工程を行った。前述の焼成条件により、前記被粉砕貝殻を、酸化カルシウムとした。続いて、熟成処理工程において、電気炉内の温度を下げながら焼成した被粉砕貝殻をそのまま４時間ほど放置して熟成させる熟成処理工程を行った。これにより、電気炉の温度は２００℃程度まで下がり、この焼成処理および熟成処理によって、被粉砕貝殻は、灰となって砕ける状態となった。さらに、熟成処理後の被粉砕貝殻を、常温において所定時間放置した。
【００２６】
さらに、粒径が１５．０μｍ以下程度となるように前記被粉砕貝殻を粉砕して第２粉砕処理工程を行い、貝殻粉体原料を得た。この貝殻粉体原料を微粉砕機を用いてさらに粉砕することにより、平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体を含有する液体を得た。
【００２７】
この貝殻焼成カルシウム粉体が含有された液体を溶媒として動的光散乱法にて測定された体積粒度分布を表１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】
表１により、前記液体には、平均粒径が１００〜５００ｎｍ程度の粒子の貝殻焼成カルシウム粉体が含有されていることが分かる。そして、この貝殻焼成カルシウム粉体が含有された液体を乾燥することにより、平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体を得た。
【００３０】
（２）試験資材の調製
前述の（１）の製造方法によって得た平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体３０ｇに対して４６０ｍｌの精製水を添加して、貝殻焼成カルシウム粉体の質量が０．１５％の貝殻焼成カルシウム混合液を得た。この貝殻焼成カルシウム混合液をマイクロチューブに採取し、１２０００ｘｇ、３分間の遠心によって貝殻焼成カルシウム粉体を沈殿させ、上清を貝殻焼成カルシウム上清液とした。
【００３１】
また、この貝殻焼成カルシウム上清液を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）によって２倍、４倍、８倍、１０倍、あるいは２０倍に希釈して、各希釈上清液を得た。
【００３２】
（３）ウイルスの調製
トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ａｏｍｏｒｉ／３９５／０４（Ｈ７Ｎ１）を１０日齢の発育鶏卵で２〜３継代して、感染漿尿液をウイルスとして分注し、使用まで−８０℃で保存した。
【００３３】
（４）細胞培養
ＭＤＣＫ細胞（２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を９６穴組織培養プレート（Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ，９６Ｗ，Ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ， ｗｉｔｈ ＬＩＤ，Ｓｔｅｒｉｌｅ， Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ‐ｏｎｅ， Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に１００μｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２ＷＡＴＥＲ‐Ｊａｃｋｅｔｅｄ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ，ＭＩＤＳＣＩ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）において培養した。
【００３４】
（５）トリインフルエンザウイルスの力価測定方法
ウイルス接種前に、ＭＤＣＫ細胞から培養液を除去し、１００μｌのＰＢＳで細胞を３回洗い、２μｇ／ｍｌのトリプシンを添加した維持培地（ＭＭ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。そこに各ウェル１００μｌずつ希釈ウイルスを接種して３日間培養し、細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察し、培養上清の赤血球凝集（ＨＡ）試験結果から、ベーレンスケルベル法を用いて、感染量、ＴＣＩＤ５０／ｍｌを算定し、ウイルス力価の指数の差（ＮＩ）が２．８以上の場合に、抗ウイルス効果があったと判定した。
【００３５】
（６）試験資材のウイルス感作
前述の（２）試験資材の調製において得た貝殻焼成カルシウム上清液、２倍希釈上清液、４倍希釈上清液、８倍希釈上清液、１０倍希釈上清液、２０倍希釈上清液を、それぞれ９００μｌマイクロチューブに採取して、１００μｌのトリインフルエンザウイルスを添加した。混和後、所定時間室温で感作した後、１０倍階段希釈して、前述の（５）の測定方法で残存ウイルスを力価測定した。この結果を、表２に示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】
表２に示すように、未処理のウイルスのウイルス力価が１０6.75ＴＣＩＤ５０／ｍｌであるのに対し、貝殻焼成カルシウム上清液のウイルス力価は、前記室温での感作時間を３０秒とした場合で、既に検出限界である１０2.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌを下回った。また、２倍希釈上清液のウイルス力価は、前記室温での感作時間が３０秒以上で１０2.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、４倍希釈上清液のウイルス力価は、前記室温での感作時間が３０秒以上で１０2.75ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果が認められた。さらに、８倍希釈上清液のウイルス力価は、前記室温での感作時間が１分間で１０3.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５分間で１０4.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果が認められた。
【００３８】
また、２倍希釈上清液および１０倍希釈上清液のウイルス力価を表３に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
表３に示すように、未処理のウイルスのウイルス力価が１０6.75ＴＣＩＤ５０／ｍｌであるのに対し、２倍希釈上清液のウイルス力価は、前記感作時間が５秒以内で１０2.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌ未満となり、抗ウイルス効果が認められた。さらに、１０倍希釈上清液のウイルス力価は、前記感作時間が６０秒間で１０4.75ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果が認められた。
【００４１】
［試験例２］貝殻焼成カルシウム上清液にアルカリ緩衝液を添加した場合（１）
貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法、ウイルスの調製、細胞培養、トリインフルエンザウイルスの力価測定方法については、前述の試験例１と同様にして、ウイルス力価を測定した。
【００４２】
（１）試験資材の調製
試験例１において調製した貝殻焼成カルシウム上清液に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）を添加することによって、２倍、１０倍に希釈して各希釈上清液を得た。
【００４３】
また、前記貝殻焼成カルシウム上清液に、アルカリ緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）を添加することによって、２倍、１０倍に希釈してアルカリ度数を下げ、各希釈液を得た。
【００４４】
（２）試験資材のウイルス感作
前述の（１）試験資材の調製において得た９００μｌの各希釈上清液、あるいは希釈液に、１００μｌのトリインフルエンザウイルスを添加し、所定時間感作した後、ウイルスを希釈して、試験例１と同様の測定方法で残存ウイルスを力価測定した。この結果を、表４に示す。
【００４５】
【表４】
【００４６】
表４に示すように、未処理のウイルスのウイルス力価が１０7.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌであるのに対し、２倍希釈液は、前記感作時間が１８０秒間であっても、ウイルス力価は１０7.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌを示し、ウイルスの不活化は認められなかった。また、１０倍希釈上清液のウイルス力価は、前記感作時間が１８０秒間でも、１０6.25ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、ウイルス不活化が認められなかった。
【００４７】
さらに、前述の各希釈上清液、あるいは各希釈液にトリインフルエンザウイルスを混合して、１０分間感作した後、赤血球凝集活性（ＨＡ価）を測定した。この結果、希釈液においては、ＨＡ価が１６０倍となり、未処理のウイルスのＨＡ価と同じ値となった。一方、２倍希釈上清液、あるいは１０倍希釈上清液のＨＡ価は、２０倍未満となった。この結果により、２倍希釈上清液、あるいは１０倍希釈上清液のアルカリによって、ウイルス表面の糖タンパク質（赤血球凝集素）が変成したと考えられる。
【００４８】
［試験例３］貝殻焼成カルシウム上清液にアルカリ緩衝液を添加した場合（２）
貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法、ウイルスの調製、細胞培養、トリインフルエンザウイルスの力価測定方法については、前述の試験例１と同様にして、ウイルス力価を測定した。
【００４９】
（１）試験資材の調製
試験例２において調製した４５０μｌの貝殻焼成カルシウム上清液に、４５０μｌのアルカリ緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）を添加することによって、２倍に希釈してアルカリ度数を下げ、２倍希釈液を得た。
【００５０】
また、２２５μｌの前記貝殻焼成カルシウム上清液に、２２５μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）および４５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌを添加することによって４倍に希釈して、アルカリ度数を下げ、４倍希釈液を得た。
【００５１】
さらに、１１２．５μｌの前記貝殻焼成カルシウム上清液に、３３７．５μｌのＰＢＳおよび４５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌを添加することによって８倍に希釈して、アルカリ度数を下げ、８倍希釈液を得た。
【００５２】
（２）試験資材のウイルス感作
前述の（１）試験資材の調製において記載した貝殻焼成カルシウム上清液、あるいは貝殻焼成カルシウム上清液およびＰＢＳを添加した希釈上清液に１００μｌのトリインフルエンザウイルスを添加した後、所定の感作時間で前述の（１）試験資材の調整に記載された前記所定量のＴｒｉｓを添加し、直ちにウイルスを希釈して、試験例１と同様の測定方法で残存ウイルスを力価測定した。この結果を表５に示す。ここで、感作時間が１秒であっても、実際には１００μｌのウイルスを添加してボルテックスした後、Ｔｒｉｓの添加までに５秒程度はかかっている。また、所定の感作時間が０秒とは、ウイルスを加える前に、Ｔｒｉｓを添加してアルカリ度数を下げたことを示す。このとき、未処理のウイルスのウイルス力価が１０7.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００５３】
【表５】
【００５４】
表５に示すように、２倍希釈上清液および４倍希釈上清液のウイルス力価は、ウイルスを添加してからＴｒｉｓを添加するまでの感作時間が１秒間であっても、それぞれ１０3.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０3.25ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果が認められ、ウイルスを瞬時に不活性化することが認められた。また、８倍希釈上清液のウイルス力価は、前記感作時間が１５秒間で、１０3.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果が認められた。
【００５５】
一方、貝殻焼成カルシウム上清液あるいは希釈上清液にウイルス添加前にＴｒｉｓを添加して中和した場合の、２倍希釈上清液および４倍希釈上清液のウイルス力価の結果を表６に示す。
【００５６】
【表６】
【００５７】
表６に示すように、貝殻焼成カルシウム上清液あるいは希釈上清液にウイルス添加前にＴｒｉｓを添加して中和してしまうと、２倍希釈上清液のウイルス力価は、１０6.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、また、４倍希釈上清液のウイルス力価は、１０6.75ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果は消失した。
【００５８】
さらに、前記各希釈液の各処理後に、トリインフルエンザウイルスの特徴である赤血球凝集活性（ＨＡ価）を測定した結果を表７に示す。
【００５９】
【表７】
【００６０】
表７に示すように、未処理のウイルスのＨＡ価は、３２０であったのに対し、前記感作時間が１秒の場合に、２倍および４倍に希釈した各希釈液のＨＡ価は、それぞれ２０以下、８倍希釈液のＨＡ価は３２０となった。さらに、前記感作時間が０秒の場合に、２倍希釈液のＨＡ価は３２０となった。
【００６１】
〔試験例４〕貝殻焼成カルシウム混合液の場合
貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法、ウイルスの調製、細胞培養、トリインフルエンザウイルスの力価測定方法については、前述の試験例１と同様にして、ウイルス力価を測定した。
【００６２】
（１）試験資材の調製
前述の試験例１（１）の製造方法によって得た粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体３０ｇに対して４６０ｍｌの精製水を添加して、貝殻焼成カルシウム粉体の質量が０．１５％の貝殻焼成カルシウム混合液とした。
【００６３】
また、この貝殻焼成カルシウム混合液をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）によって１０倍、４０倍、あるいは１００倍に希釈して、各希釈混合液を得た。
【００６４】
（２）試験資材のウイルス感作
前述の（１）試験資材の調製において得た貝殻焼成カルシウム混合液、１０倍希釈混合液、４０倍希釈混合液、１００倍希釈混合液を、それぞれ９００μｌマイクロチューブに採取して、１００μｌのトリインフルエンザウイルスを添加し、所定時間室温で感作させた。感作後、１２０００ｘｇ、３分間の遠心によって貝殻焼成カルシウム粉体を沈殿させ、上清をさらに１０倍階段希釈して、試験例１の（５）の測定方法で残存ウイルスを力価測定した。
【００６５】
この結果、前記室温での感作時間を５分間とした場合、貝殻焼成カルシウム混合液および１０倍希釈混合液のウイルス力価は、１０2.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌ未満、１００倍希釈混合液のウイルス力価は、１０6.75ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなった。このとき、未処理ウイルスのウイルス力価が１０7.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌであったので、１０倍希釈混合液および１００倍希釈混合液の抗ウイルス効果が認められた。
【００６６】
また、前記室温での感作時間を３分間とした場合、貝殻焼成カルシウム混合液のウイルス力価は、１０3.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなった。このとき、未処理ウイルスのウイルス力価が１０6.83ＴＣＩＤ５０／ｍｌであったので、貝殻焼成カルシウム混合液の抗ウイルス効果が認められた。
【００６７】
さらに、１０倍希釈混合液、４０倍希釈混合液について、所定時間感作した場合のウイルス力価の結果を表８に示す。このとき、未処理ウイルスのウイルス力価は、１０7.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００６８】
【表８】
【００６９】
表８に示すように、１０倍希釈混合液のウイルス力価は、前記室温での感作時間を３０秒間あるいは１分間とした場合で１０4.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、３分間とした場合で１０4.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果が認められた。また、４０倍希釈混合液のウイルス力価は、前記室温での感作時間を３分間とした場合に１０5.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果が認められた。
【００７０】
〔試験例５〕貝殻焼成カルシウム粉体、貝殻焼成カルシウム粉体を用いた貝殻焼成カルシウム混合液、貝殻焼成カルシウム混合液を用いた貝殻焼成カルシウム上清液の場合
（１）貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法
殺菌・洗浄処理工程において、ほたて貝の貝殻を１１０℃の真水で１時間ほど煮沸することにより、ほたて貝の貝殻と身を分離するとともに、貝殻および身の殺菌・洗浄を行った後、平均粒径が５〜１０ｍｍ程度となるように粉砕して第１粉砕処理工程を行い、被粉砕貝殻を得た。
【００７１】
次に、電気炉を３時間で昇温して温度を１１００℃として、被粉砕貝殻を２時間程度焼成して焼成処理工程を行った。前述の焼成条件により、前記被粉砕貝殻を、酸化カルシウムとした。続いて、熟成処理工程において、電気炉内の温度を下げながら焼成した被粉砕貝殻をそのまま４時間ほど放置して熟成させる熟成処理工程を行った。これにより、電気炉の温度は２００℃程度まで下がり、この焼成処理および熟成処理によって、被粉砕貝殻は、灰となって砕ける状態となった。さらに、熟成処理後の被粉砕貝殻を、常温において所定時間放置した。
【００７２】
さらに、被粉砕貝殻を粉砕して第２粉砕処理工程を行うことにより、平均粒径が１２．０〜１５．０μｍ程度の貝殻焼成カルシウム粉体を得た。この試験例５の貝殻焼成カルシウム粉体の体積粒度分布を表９に示す。
【００７３】
【表９】
【００７４】
（２）試験資材の調整
（ａ）前記貝殻焼成カルシウム粉体をそのまま試験資材とした。
（ｂ）０．０５ｇ、０．２５ｇあるいは０．５ｇの貝殻焼成カルシウム粉体に、それぞれ再蒸留水を５０ｍｌ添加して、それぞれ貝殻焼成カルシウム粉体の質量が０．１％、０．５％または１％の貝殻焼成カルシウム混合液を得た。
（ｃ）前記１％の貝殻焼成カルシウム混合液を遠心して、貝殻焼成カルシウム上清液を得た。
【００７５】
（３）ウイルスの調製
（ａ）トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ａｏｍｏｒｉ／３９５／０４（Ｈ７Ｎ１）［４］を１０日齢の発育鶏卵（小岩井農場、岩手県）で２〜３継代して、感染漿尿液をウイルスとして分注し、使用まで−８０℃で保存した。
（ｂ）トリアデノウイルスは、鶏腎培養細（ＣＫ細胞）で継代し、感染培養液をウイルスとして分注し、使用まで−８０℃で保存した。
【００７６】
（４）細胞培養
（ａ）ＭＤＣＫ細胞（０．８〜１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を９６穴組織培養プレート（Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ，９６Ｗ，Ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ， ｗｉｔｈ ＬＩＤ，Ｓｔｅｒｉｌｅ，Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ‐ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に１００μｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２ ＷＡＴＥＲ‐Ｊａｃｋｅｔｅｄ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ，ＭＩＤＳＣＩ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）において培養した。
（ｂ）ＣＫ細胞（細胞濃度：０．３％）を細胞培養シャーレ（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｄｉｓｈｉｅｓ，ＰＳ，６０×１５ｍｍ，ｗｉｔｈ ｖｅｎｔｓ，ｓｔｅｒｉｌｅ，Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ‐ｏｎｅ）に４ｍｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて培養した。
【００７７】
（５）ウイルスの力価測定方法
（ａ）トリインフルエンザウイルスのウイルスの力価は、ウイルス接種前に、ＭＤＣＫ細胞から培養上清を除去し、１００μのＰＢＳで細胞を３回洗い、２μｇ／ｍｌのトリプシンを添加した維持培地（ＭＭ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。そこに各ウェル１００μずつ希釈ウイルスを接種し、３日間培養し、細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察し、培養上清の赤血球凝集（ＨＡ）試験結果から、ベーレンスケルベル法を用い、感染量、ＴＣＩＤ５０／ｍｌを算定した。ＡＩＶ力価の検出限界を１０1.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌとし、ウイルス不活化指数（ＮＩ）が２．８以上を示した場合、抗ウイルス効果があったと判定した。
（ｂ）トリアデノウイルスのウイルス力価は、階段希釈したウイルスをＣＫ細胞に接種（１００μｌ／ｄｉｓｈ，２ ｄｉｓｈｅｓ／ｓａｍｐｌｅ）し、接種１時間後、接種液を除去し、１次重層用寒天培地を３ｍｌ重層、さらに５日後に２次重層用寒天培地を３ｍｌ重層し、接種７日後にプラックカウントを行い、プラック形成単位（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ：以下ＰＦＵ／ｍｌ）を算出した。ＡＡＶ力価の検出限界を１０２ＰＦＵ／ｍｌとし、ウイルス不活化指数（ＮＩ）が２．８以上を示した場合、抗ウイルス効果があったと判定した。
【００７８】
（６） 試験資材のウイルス感作
（ａ）トリインフルエンザウイルス
（ｉ）前述の（２）の試験資材の調製において得た貝殻焼成カルシウム粉体、あるいは陰性対照として小麦粉をマイクロチューブに２００ｍｇ入れ、そこへウイルス液１００μｌを添加し、室温で所定時間感作させた。感作後、９００μｌのＭＭを加えて混和し、粉体を浮遊させた後、１２，０００ｘｇ、３分間遠心した。得られた上清を１０倍希釈ウイルス液とし、さらにＭＭで１０倍階段希釈し、前述の（５）（ａ）のウイルスの測定方法で残存ウイルスの力価を測定した。
【００７９】
この結果、貝殻焼成カルシウム粉体による処理後のウイルス力価は、８時間感作、２０時間感作で、ともに１０1.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以下となった。一方、このときの未処理ウイルスのウイルス力価は、８時間、２０時間で、それぞれ１０6.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０7.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。これにより、貝殻焼成カルシウム粉体による処理においては、ＮＩがそれぞれ５以下、６以下となり、貝殻焼成カルシウム粉体の抗ウイルス効果が認められた。
【００８０】
また、前述の（１）の貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法において平均粒径が１２〜１５μｍ程度の貝殻焼成カルシウム粉体を製造する際、熟成処理後の被粉砕貝殻を、常温において所定時間放置した後、被粉砕貝殻を５ｍｍ程度の篩にかけることにより、平均粒径が２．５〜５ｍｍ程度の貝殻焼成カルシウム粉体を製造することができる。このような平均粒径が２．５〜５ｍｍ程度の貝殻焼成カルシウム粉体にも抗ウイルス効果が認められており、このような粒径の貝殻焼成カルシウム粉体であれば、屋外において散布した場合でも飛散することを防止することができるので、抗ウイルス材として、前記貝殻焼成カルシウム粉体を例えば家畜舎等の屋外に散布することにより、抗ウイルス材が飛散することなく、家畜等がウイルスに感染してしまうことを予防することができる。
【００８１】
（ｉｉ）前述の（２）の試験資材の調製において得た０．１％貝殻焼成カルシウム混合液、０．５％貝殻焼成カルシウム混合液、１％貝殻焼成カルシウム混合液を、それぞれマイクロチューブに４００μｌもしくは８００μｌ採取して、１００μｌのトリインフルエンザウイルスを添加した。所定の感作時間毎に１Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ （ｐＨ７．２）を５００μｌまたは１００μｌ加えて、各貝殻焼成カルシウム混合液を中和し、前記ＭＤＣＫ細胞で力価測定を行った。
【００８２】
前記各混合液について、感作時間を１０分、３０分、６０分とした場合の結果を、表１０に示す。一方、このときの未処理ウイルスのウイルス力価は、１０8.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００８３】
【表１０】
【００８４】
表１０によれば、０．１％貝殻焼成カルシウム混合液については、１０分間の感作を行った場合、ＮＩは２．０を下回り、３０分間感作ではＮＩ２．５となったが、６０分間感作でもＮＩは２．７５であった。この結果、０．１％貝殻焼成カルシウム混合液では、６０分間の感作でも、抗ウイルス効果が認められなかった。
【００８５】
０．５％貝殻焼成カルシウム混合液については、１０分間の感作を行った場合、ＮＩは５となり、３０分間感作ではＮＩ４．８となり、さらに６０分間感作ではＮＩが４．３となり、いずれも抗ウイルス効果が認められた。
【００８６】
１％貝殻焼成カルシウム混合液については、１０分間の感作を行った場合のＮＩは６．５となり、３０分間感作ではＮＩが６以下、６０分間感作ではＮＩが４．５となり、いずれも抗ウイルス効果が認められた。
【００８７】
一方、あらかじめ１％貝殻焼成カルシウム混合液を、等量の１Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で中和したものにウイルスを添加してウイルス力価を測定したところ（感作時間０分）、ＮＩは２．２５となった。
【００８８】
さらに、１％貝殻焼成カルシウム混合液について、感作時間を短縮して、５秒間、１０秒間、３０秒間および１０分間とした場合のウイルス力価の結果を、表１１に示す。このときの未処理ウイルスのウイルス力価は、１０7.75ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００８９】
【表１１】
【００９０】
表１１によれば、５秒間の感作でＮＩが−０．２５であり、１０秒間の感作でＮＩが０．５であり、３０秒間の感作でＮＩが０．２５であり、１０分間の感作でもＮＩが１．２５以下であった。また、あらかじめ１％貝殻焼成カルシウム混合液を、等量の１Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で中和したものにウイルスを添加したもののウイルス力価は、未処理ウイルスのウイルス力価と同値であった。
【００９１】
次に、１％貝殻焼成カルシウム混合液について、感作時の温度の違いで効果に差が生じるかを調べるため、感作時の温度を室温（ＲＴ：約２５℃）、３７℃、および４℃として、それぞれ０分間、１０分間、６０分間感作させた。この結果を表１２に示す。このときの未処理ウイルスのウイルス力価は、１０8.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。なお、感作時間が０分間とは、あらかじめ１％貝殻焼成カルシウム混合液を、等量の１Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で中和したものを使用した場合である。
【００９２】
【表１２】
【００９３】
表１２によれば、感作時の温度を室温とした場合、０分間感作ではＮＩが０．７５であったが、１０分間感作ではＮＩが３．５となり、さらに６０分間感作ではＮＩが５となり、１０分間および６０分間の感作で抗ウイルス効果が認められた。また、感作時の温度を３７℃とした場合、０分間感作ではＮＩが０．５であったが、１０分間感作ではＮＩが５．５以上、６０分間感作でも同様にＮＩが５．５以上となり、１０分間および６０分間の感作で抗ウイルス効果が認められた。さらに、感作時の温度を４℃とした場合、０分間感作ではＮＩ０．５であり、１０分間の感作でＮＩが１．７５であり、６０分間の感作でもＮＩが１．７５であり、いずれも抗ウイルス効果は認められなかった。
【００９４】
さらに、１％貝殻焼成カルシウム混合液について、感作時の温度を室温、３７℃とし、感作時間を短縮して、それぞれ０分間、１分間、５分間、１０分間、３０分間感作させた場合の、ウイルス力価の結果を表１３に示す。このときの未処理ウイルスのウイルス力価は、１０6.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００９５】
【表１３】
【００９６】
表１３によれば、感作時の温度を室温とした場合、１分間および５分間の感作では、ＮＩが０であり、１０分間の感作ではＮＩが０．５以下となったが、３０分間の感作でもＮＩは１．５以下であり、いずれも抗ウイルス効果が認められなかった。また、感作時の温度を３７℃とした場合、１分間の感作ではＮＩが０であり、５分間の感作でもＮＩが２．７５であり、さらに１０分間の感作でもＮＩが２．５以下であり、いずれも抗ウイルス効果が認められなかった。
【００９７】
（ｉｉｉ）前述の試験資材の調製において得た貝殻焼成カルシウム上清液９００μｌに、１００μｌのウイルス液を添加し、感作時の温度を、室温（２５℃）、３７℃として、所定の感作時間毎に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を加えて貝殻焼成カルシウム上清液を中和し、ウイルス力価の測定を行った。このときの未処理ウイルスのウイルス力価は、１０7.80ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。なお、前記上清液のｐＨは、１２．８を示した。
【００９８】
前記各上清液について、それぞれ感作時間を０分間、１分間、５分間、１０分間および３０分間とした場合の結果を表１４に示す。感作時間が０分間とは、あらかじめ貝殻焼成カルシウム上清液を、等量の１Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で中和したものを使用した場合である。
【００９９】
【表１４】
【０１００】
表１４によれば、感作時の温度が室温の場合、１分間、５分間、１０分間、３０分間の感作では、いずれもＮＩがすべて０であり、抗ウイルス効果が認められなかった。また、感作時の温度が３７℃の場合、１分間の感作ではＮＩが０であり、５分間の感作でＮＩが１．２５以下、１０分間の感作ではＮＩが０．２５であり、さらに３０分間の感作でもＮＩが２．５以下であり、いずれも抗ウイルス効果が認められなかった。
【０１０１】
（ａ）トリアデノウイルス
前述の（２）の試験資材の調製において得た貝殻焼成カルシウム粉体にトリアデノウイルスを感作させ、トリアデノウイルスのウイルス力価を測定した。この結果を表１５に示す。
【０１０２】
【表１５】
【０１０３】
この結果、未処理ウイルスのウイルス力価が１０8.60ＴＣＩＤ５０／ｍｌであったのに対し、貝殻焼成カルシウム粉体による処理後のウイルス力価は、８時間感作で１０3.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、ＮＩが５．６となり、抗ウイルス効果が認められた。
【０１０４】
本実施形態に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材によれば、前述のとおり平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体が含有された貝殻焼成カルシウム混合液の上清を用いることにより、抗ウイルス効果が認められ、抗ウイルス材として利用することができる。そして、この抗ウイルス材を噴霧装置によって噴霧した場合、抗ウイルス材によって噴霧装置に目詰まりが発生することを確実に防止することができるとともに、被噴霧対象に貝殻焼成カルシウム粉体が付着してしまうことを確実に防止することができる。
【０１０５】
したがって、このような抗ウイルス材によれば、噴霧装置のメンテナンス等が容易となり、さらには、被噴霧対象や噴霧場所が限定されることなく、例えば、被服の上から噴霧する場合や、空港や駅、店舗等の人が多く集まる屋内において散布する場合等、貝殻焼成カルシウム粉体を被対象物に付着させたくない種々の用途にも用いることができる。
【０１０６】
また、本実施形態に係る抗ウイルス材は、産業廃棄物として問題になっているほたて貝等の貝殻により得ることができるので、ほたて貝の貝殻を有効に利用することができ、産業廃棄物の問題を解消することができる。また、本実施形態に係る抗ウイルス材は、トリインフルエンザウイルス等種々のウイルスに適用することができ、バイオセキュリティ強化資材として有効に利用することができ、近年問題になっているインフルエンザ等のウイルス予防として、種々の場面において利用することができる。
【０１０７】
なお、本発明は前記実施形態に限定されるものではなく、必要に応じて種々変更することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、ほたて貝等の貝殻を粉砕、焼成して得られる貝殻焼成カルシウム粉体やこの貝殻焼成カルシウム粉体を含有する貝殻焼成カルシウム混合液が、殺菌効果や抗菌効果を有するとともに、人体等に対して刺激を及ぼさず、さらに発熱することがない等の種々の観点から、例えば野菜等の洗浄や、水質・土壌の改善、消臭剤、殺菌剤、抗菌剤等の種々の分野において多用されている。
【０００３】
また、近年の研究により、貝殻焼成カルシウム粉体や、貝殻焼成カルシウム混合液には、抗ウイルス効果があることが分かっており、貝殻焼成カルシウム粉体を利用した抗ウイルス材が考えられている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１７９５５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、従来の貝殻焼成カルシウム粉体を含有する貝殻焼成カルシウム混合液を噴霧装置によって噴霧する場合、噴霧装置において目詰まりが発生してしまったり、噴霧した貝殻焼成カルシウム混合液に含有されている貝殻焼成カルシウム粉体が、被噴霧対象に付着してしまうおそれがあるという問題を有していた。このため、噴霧装置のメンテナンス等に手間がかかり、さらには、例えば、被服の上から噴霧したり、屋内において使用する場合等、貝殻焼成カルシウム粉体を被対象物に付着させたくない種々の用途に用いることができず、被噴霧対象や噴霧場所等が限定されてしまうこととなっていた。
【０００６】
本発明はこれらの点に鑑みてなされたものであり、噴霧装置における目詰まりの発生を確実に防止することができるとともに、被噴霧対象に貝殻焼成カルシウム粉体が付着してしまうことを防止することが可能な貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するため、本発明に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材の特徴は、平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体が含有された貝殻焼成カルシウム混合液の上清である貝殻焼成カルシウム上清液を含有する点にある。
【０００８】
本発明において、前記貝殻焼成カルシウム混合液に、０．１５質量％以上の前記貝殻焼成カルシウム粉体が含有されていることが好ましい。
【０００９】
また、本発明における抗ウイルス材は、アルカリ度数が１２．５ｐＨ以上であることが好ましい。
【００１０】
さらに、本発明において、前記貝殻焼成カルシウム粉体は、二枚貝の貝殻に焼成処理および粉砕処理を施して得られることが好ましく、この二枚貝の貝殻としては、ほたて貝の貝殻であることが好ましい。
【００１１】
ここで、本発明の発明者の研究により、例えば平均粒径が１２〜１５μｍの貝殻焼成カルシウム粉体が含有された貝殻焼成カルシウム混合液の上清は、抗ウイルス効果が認められないことが分かっていた。しかし、本発明の発明者のさらなる研究の結果、平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体を含有する貝殻焼成カルシウム混合液の上清は、短時間でも抗ウイルス効果が発生することが分かった。
【００１２】
この本発明に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材によれば、平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体が含有された貝殻焼成カルシウム混合液の上清を用いるので、噴霧装置によって噴霧した場合に、抗ウイルス材によって噴霧装置に目詰まりが発生することを確実に防止することができるとともに、被噴霧対象に貝殻焼成カルシウム粉体が付着してしまうことを確実に防止することができる。
【発明の効果】
【００１３】
以上述べたように、本発明に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材によれば、噴霧装置における目詰まりの発生を防止し、さらには被噴霧対象に貝殻焼成カルシウム粉体が付着してしまうことを防止することができるので、噴霧装置のメンテナンス等が容易となり、さらには、被噴霧対象や噴霧場所が限定されることなく、例えば、被服の上から噴霧したり、屋内において使用する場合等、貝殻焼成カルシウム粉体を被対象物に付着させたくない種々の用途にも用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材の一実施形態を説明する。
【００１５】
本実施形態に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材には、平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体を含有する貝殻焼成カルシウム混合液の上清である貝殻焼成カルシウム上清液が含有されている。
【００１６】
この抗ウイルス材に用いられる貝殻焼成カルシウム粉体は、貝殻、好ましくは二枚貝の殻に焼成処理および粉砕処理を行うことにより製造される。材料として用いられる二枚貝としては、ほたて貝、アサリ、シジミ、ハマグリ、カキ、ホッキ等の種々の二枚貝を利用することが可能であるが、高い抗ウイルス効果を有する等の観点からは、特にほたて貝を用いることが好ましい。そこで、本実施形態においては、ほたて貝を用いた貝殻焼成カルシウム粉体を用いて説明する。
【００１７】
このほたて貝を用いた貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法の一例について、以下説明する。
【００１８】
まず、ほたて貝の貝殻を所定時間煮沸する殺菌・洗浄処理を行い、続いて、この貝殻を粗く粉砕する第１粉砕処理を行って、被粉砕貝殻を得る。次に、前記被粉砕貝殻を焼成する焼成処理を行って、被粉砕貝殻を酸化カルシウムとした後、焼成した被粉砕貝殻を所定の温度下において放置することにより熟成させる熟成処理を行う。この焼成処理および熟成処理により、被粉砕貝殻は、灰となって砕ける状態となる。さらに、この被粉砕貝殻をさらに細かく粉砕する第２粉砕処理を行うことにより、貝殻焼成カルシウム粉体を製造する。
【００１９】
なお、本発明に用いられる貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材における貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法は、前述の製造方法に限定されるものではなく、主成分が酸化カルシウムである貝殻焼成カルシウムを製造するものであればよい。
【００２０】
また、この抗ウイルス材に用いられる貝殻焼成カルシウム混合液は、前記貝殻焼成カルシウム粉体に、精製水等の液体を添加して製造されている。この貝殻焼成カルシウム混合液における貝殻焼成カルシウム粉体の含有量は、０．１５質量％以上であることが好ましい。
【００２１】
さらに、この抗ウイルス材の貝殻焼成カルシウム上清液は、前記貝殻焼成カルシウム混合液において貝殻焼成カルシウム粉体を沈殿させることにより得られた上清からなる。貝殻焼成カルシウム混合液において貝殻焼成カルシウム粉体を沈殿させる方法としては、例えば、貝殻焼成カルシウム混合液を遠心する方法等がある。ここで、本発明における抗ウイルス材は、貝殻焼成カルシウム上清液を含有するものであり、貝殻焼成カルシウム上清液を含有するとは、貝殻焼成カルシウム上清液のみにより構成されてもよく、または、貝殻焼成カルシウム上清液に、精製水、リン酸緩衝生理食塩水、水道水等の他の物質が添加されたものであってもよい。この貝殻焼成カルシウム上清液を含有する抗ウイルス材のアルカリ度数は、１２．５ｐＨ以上であることが好ましい。
【００２２】
本発明に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材は、インフルエンザウイルス等のエンベロープを有するウイルスだけでなく、アデノウイルス科のトリアデノウイルスやピコルナウイルス科の口蹄疫ウイルス等のエンベロープを有することなく比較的抵抗性が高いウイルス等、全てのウイルスに適用することができる。
【００２３】
以下、本実施形態に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材の実施例、およびこの抗ウイルス材の比較例の各試験例を説明する。
【００２４】
［試験例１］貝殻焼成カルシウム上清液の場合
（１）貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法
殺菌・洗浄処理工程において、ほたて貝の貝殻を１１０℃の真水で１時間ほど煮沸することにより、ほたて貝の貝殻と身を分離するとともに、貝殻および身の殺菌・洗浄を行った後、平均粒径が５〜１０ｍｍ程度となるように粉砕して第１粉砕処理工程を行い、被粉砕貝殻を得た。
【００２５】
次に、電気炉を３時間で昇温して温度を１１００℃として、被粉砕貝殻を２時間程度焼成して焼成処理工程を行った。前述の焼成条件により、前記被粉砕貝殻を、酸化カルシウムとした。続いて、熟成処理工程において、電気炉内の温度を下げながら焼成した被粉砕貝殻をそのまま４時間ほど放置して熟成させる熟成処理工程を行った。これにより、電気炉の温度は２００℃程度まで下がり、この焼成処理および熟成処理によって、被粉砕貝殻は、灰となって砕ける状態となった。さらに、熟成処理後の被粉砕貝殻を、常温において所定時間放置した。
【００２６】
さらに、粒径が１５．０μｍ以下程度となるように前記被粉砕貝殻を粉砕して第２粉砕処理工程を行い、貝殻粉体原料を得た。この貝殻粉体原料を微粉砕機を用いてさらに粉砕することにより、平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体を含有する液体を得た。
【００２７】
この貝殻焼成カルシウム粉体が含有された液体を溶媒として動的光散乱法にて測定された体積粒度分布を表１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】
表１により、前記液体には、平均粒径が１００〜５００ｎｍ程度の粒子の貝殻焼成カルシウム粉体が含有されていることが分かる。そして、この貝殻焼成カルシウム粉体が含有された液体を乾燥することにより、平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体を得た。
【００３０】
（２）試験資材の調製
前述の（１）の製造方法によって得た平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体３０ｇに対して４６０ｍｌの精製水を添加して、貝殻焼成カルシウム粉体の質量が０．１５％の貝殻焼成カルシウム混合液を得た。この貝殻焼成カルシウム混合液をマイクロチューブに採取し、１２０００ｘｇ、３分間の遠心によって貝殻焼成カルシウム粉体を沈殿させ、上清を貝殻焼成カルシウム上清液とした。
【００３１】
また、この貝殻焼成カルシウム上清液を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）によって２倍、４倍、８倍、１０倍、あるいは２０倍に希釈して、各希釈上清液を得た。
【００３２】
（３）ウイルスの調製
トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ａｏｍｏｒｉ／３９５／０４（Ｈ７Ｎ１）を１０日齢の発育鶏卵で２〜３継代して、感染漿尿液をウイルスとして分注し、使用まで−８０℃で保存した。
【００３３】
（４）細胞培養
ＭＤＣＫ細胞（２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を９６穴組織培養プレート（Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ，９６Ｗ，Ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ， ｗｉｔｈ ＬＩＤ，Ｓｔｅｒｉｌｅ， Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ‐ｏｎｅ， Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に１００μｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２ＷＡＴＥＲ‐Ｊａｃｋｅｔｅｄ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ，ＭＩＤＳＣＩ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）において培養した。
【００３４】
（５）トリインフルエンザウイルスの力価測定方法
ウイルス接種前に、ＭＤＣＫ細胞から培養液を除去し、１００μｌのＰＢＳで細胞を３回洗い、２μｇ／ｍｌのトリプシンを添加した維持培地（ＭＭ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。そこに各ウェル１００μｌずつ希釈ウイルスを接種して３日間培養し、細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察し、培養上清の赤血球凝集（ＨＡ）試験結果から、ベーレンスケルベル法を用いて、感染量、ＴＣＩＤ５０／ｍｌを算定し、ウイルス力価の指数の差（ＮＩ）が２．８以上の場合に、抗ウイルス効果があったと判定した。
【００３５】
（６）試験資材のウイルス感作
前述の（２）試験資材の調製において得た貝殻焼成カルシウム上清液、２倍希釈上清液、４倍希釈上清液、８倍希釈上清液、１０倍希釈上清液、２０倍希釈上清液を、それぞれ９００μｌマイクロチューブに採取して、１００μｌのトリインフルエンザウイルスを添加した。混和後、所定時間室温で感作した後、１０倍階段希釈して、前述の（５）の測定方法で残存ウイルスを力価測定した。この結果を、表２に示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】
表２に示すように、未処理のウイルスのウイルス力価が１０6.75ＴＣＩＤ５０／ｍｌであるのに対し、貝殻焼成カルシウム上清液のウイルス力価は、前記室温での感作時間を３０秒とした場合で、既に検出限界である１０2.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌを下回った。また、２倍希釈上清液のウイルス力価は、前記室温での感作時間が３０秒以上で１０2.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、４倍希釈上清液のウイルス力価は、前記室温での感作時間が３０秒以上で１０2.75ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果が認められた。さらに、８倍希釈上清液のウイルス力価は、前記室温での感作時間が１分間で１０3.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、５分間で１０4.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果が認められた。
【００３８】
また、２倍希釈上清液および１０倍希釈上清液のウイルス力価を表３に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
表３に示すように、未処理のウイルスのウイルス力価が１０6.75ＴＣＩＤ５０／ｍｌであるのに対し、２倍希釈上清液のウイルス力価は、前記感作時間が５秒以内で１０2.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌ未満となり、抗ウイルス効果が認められた。さらに、１０倍希釈上清液のウイルス力価は、前記感作時間が６０秒間で１０4.75ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果が認められた。
【００４１】
［試験例２］貝殻焼成カルシウム上清液にアルカリ緩衝液を添加した場合（１）
貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法、ウイルスの調製、細胞培養、トリインフルエンザウイルスの力価測定方法については、前述の試験例１と同様にして、ウイルス力価を測定した。
【００４２】
（１）試験資材の調製
試験例１において調製した貝殻焼成カルシウム上清液に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）を添加することによって、２倍、１０倍に希釈して各希釈上清液を得た。
【００４３】
また、前記貝殻焼成カルシウム上清液に、アルカリ緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）を添加することによって、２倍、１０倍に希釈してアルカリ度数を下げ、各希釈液を得た。
【００４４】
（２）試験資材のウイルス感作
前述の（１）試験資材の調製において得た９００μｌの各希釈上清液、あるいは希釈液に、１００μｌのトリインフルエンザウイルスを添加し、所定時間感作した後、ウイルスを希釈して、試験例１と同様の測定方法で残存ウイルスを力価測定した。この結果を、表４に示す。
【００４５】
【表４】
【００４６】
表４に示すように、未処理のウイルスのウイルス力価が１０7.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌであるのに対し、２倍希釈液は、前記感作時間が１８０秒間であっても、ウイルス力価は１０7.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌを示し、ウイルスの不活化は認められなかった。また、１０倍希釈上清液のウイルス力価は、前記感作時間が１８０秒間でも、１０6.25ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、ウイルス不活化が認められなかった。
【００４７】
さらに、前述の各希釈上清液、あるいは各希釈液にトリインフルエンザウイルスを混合して、１０分間感作した後、赤血球凝集活性（ＨＡ価）を測定した。この結果、希釈液においては、ＨＡ価が１６０倍となり、未処理のウイルスのＨＡ価と同じ値となった。一方、２倍希釈上清液、あるいは１０倍希釈上清液のＨＡ価は、２０倍未満となった。この結果により、２倍希釈上清液、あるいは１０倍希釈上清液のアルカリによって、ウイルス表面の糖タンパク質（赤血球凝集素）が変成したと考えられる。
【００４８】
［試験例３］貝殻焼成カルシウム上清液にアルカリ緩衝液を添加した場合（２）
貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法、ウイルスの調製、細胞培養、トリインフルエンザウイルスの力価測定方法については、前述の試験例１と同様にして、ウイルス力価を測定した。
【００４９】
（１）試験資材の調製
試験例２において調製した４５０μｌの貝殻焼成カルシウム上清液に、４５０μｌのアルカリ緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）を添加することによって、２倍に希釈してアルカリ度数を下げ、２倍希釈液を得た。
【００５０】
また、２２５μｌの前記貝殻焼成カルシウム上清液に、２２５μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）および４５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌを添加することによって４倍に希釈して、アルカリ度数を下げ、４倍希釈液を得た。
【００５１】
さらに、１１２．５μｌの前記貝殻焼成カルシウム上清液に、３３７．５μｌのＰＢＳおよび４５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌを添加することによって８倍に希釈して、アルカリ度数を下げ、８倍希釈液を得た。
【００５２】
（２）試験資材のウイルス感作
前述の（１）試験資材の調製において記載した貝殻焼成カルシウム上清液、あるいは貝殻焼成カルシウム上清液およびＰＢＳを添加した希釈上清液に１００μｌのトリインフルエンザウイルスを添加した後、所定の感作時間で前述の（１）試験資材の調整に記載された前記所定量のＴｒｉｓを添加し、直ちにウイルスを希釈して、試験例１と同様の測定方法で残存ウイルスを力価測定した。この結果を表５に示す。ここで、感作時間が１秒であっても、実際には１００μｌのウイルスを添加してボルテックスした後、Ｔｒｉｓの添加までに５秒程度はかかっている。また、所定の感作時間が０秒とは、ウイルスを加える前に、Ｔｒｉｓを添加してアルカリ度数を下げたことを示す。このとき、未処理のウイルスのウイルス力価が１０7.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００５３】
【表５】
【００５４】
表５に示すように、２倍希釈上清液および４倍希釈上清液のウイルス力価は、ウイルスを添加してからＴｒｉｓを添加するまでの感作時間が１秒間であっても、それぞれ１０3.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０3.25ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果が認められ、ウイルスを瞬時に不活性化することが認められた。また、８倍希釈上清液のウイルス力価は、前記感作時間が１５秒間で、１０3.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果が認められた。
【００５５】
一方、貝殻焼成カルシウム上清液あるいは希釈上清液にウイルス添加前にＴｒｉｓを添加して中和した場合の、２倍希釈上清液および４倍希釈上清液のウイルス力価の結果を表６に示す。
【００５６】
【表６】
【００５７】
表６に示すように、貝殻焼成カルシウム上清液あるいは希釈上清液にウイルス添加前にＴｒｉｓを添加して中和してしまうと、２倍希釈上清液のウイルス力価は、１０6.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、また、４倍希釈上清液のウイルス力価は、１０6.75ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果は消失した。
【００５８】
さらに、前記各希釈液の各処理後に、トリインフルエンザウイルスの特徴である赤血球凝集活性（ＨＡ価）を測定した結果を表７に示す。
【００５９】
【表７】
【００６０】
表７に示すように、未処理のウイルスのＨＡ価は、３２０であったのに対し、前記感作時間が１秒の場合に、２倍および４倍に希釈した各希釈液のＨＡ価は、それぞれ２０以下、８倍希釈液のＨＡ価は３２０となった。さらに、前記感作時間が０秒の場合に、２倍希釈液のＨＡ価は３２０となった。
【００６１】
〔試験例４〕貝殻焼成カルシウム混合液の場合
貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法、ウイルスの調製、細胞培養、トリインフルエンザウイルスの力価測定方法については、前述の試験例１と同様にして、ウイルス力価を測定した。
【００６２】
（１）試験資材の調製
前述の試験例１（１）の製造方法によって得た粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体３０ｇに対して４６０ｍｌの精製水を添加して、貝殻焼成カルシウム粉体の質量が０．１５％の貝殻焼成カルシウム混合液とした。
【００６３】
また、この貝殻焼成カルシウム混合液をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）によって１０倍、４０倍、あるいは１００倍に希釈して、各希釈混合液を得た。
【００６４】
（２）試験資材のウイルス感作
前述の（１）試験資材の調製において得た貝殻焼成カルシウム混合液、１０倍希釈混合液、４０倍希釈混合液、１００倍希釈混合液を、それぞれ９００μｌマイクロチューブに採取して、１００μｌのトリインフルエンザウイルスを添加し、所定時間室温で感作させた。感作後、１２０００ｘｇ、３分間の遠心によって貝殻焼成カルシウム粉体を沈殿させ、上清をさらに１０倍階段希釈して、試験例１の（５）の測定方法で残存ウイルスを力価測定した。
【００６５】
この結果、前記室温での感作時間を５分間とした場合、貝殻焼成カルシウム混合液および１０倍希釈混合液のウイルス力価は、１０2.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌ未満、１００倍希釈混合液のウイルス力価は、１０6.75ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなった。このとき、未処理ウイルスのウイルス力価が１０7.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌであったので、１０倍希釈混合液および１００倍希釈混合液の抗ウイルス効果が認められた。
【００６６】
また、前記室温での感作時間を３分間とした場合、貝殻焼成カルシウム混合液のウイルス力価は、１０3.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなった。このとき、未処理ウイルスのウイルス力価が１０6.83ＴＣＩＤ５０／ｍｌであったので、貝殻焼成カルシウム混合液の抗ウイルス効果が認められた。
【００６７】
さらに、１０倍希釈混合液、４０倍希釈混合液について、所定時間感作した場合のウイルス力価の結果を表８に示す。このとき、未処理ウイルスのウイルス力価は、１０7.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００６８】
【表８】
【００６９】
表８に示すように、１０倍希釈混合液のウイルス力価は、前記室温での感作時間を３０秒間あるいは１分間とした場合で１０4.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、３分間とした場合で１０4.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果が認められた。また、４０倍希釈混合液のウイルス力価は、前記室温での感作時間を３分間とした場合に１０5.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌとなり、抗ウイルス効果が認められた。
【００７０】
〔試験例５〕貝殻焼成カルシウム粉体、貝殻焼成カルシウム粉体を用いた貝殻焼成カルシウム混合液、貝殻焼成カルシウム混合液を用いた貝殻焼成カルシウム上清液の場合
（１）貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法
殺菌・洗浄処理工程において、ほたて貝の貝殻を１１０℃の真水で１時間ほど煮沸することにより、ほたて貝の貝殻と身を分離するとともに、貝殻および身の殺菌・洗浄を行った後、平均粒径が５〜１０ｍｍ程度となるように粉砕して第１粉砕処理工程を行い、被粉砕貝殻を得た。
【００７１】
次に、電気炉を３時間で昇温して温度を１１００℃として、被粉砕貝殻を２時間程度焼成して焼成処理工程を行った。前述の焼成条件により、前記被粉砕貝殻を、酸化カルシウムとした。続いて、熟成処理工程において、電気炉内の温度を下げながら焼成した被粉砕貝殻をそのまま４時間ほど放置して熟成させる熟成処理工程を行った。これにより、電気炉の温度は２００℃程度まで下がり、この焼成処理および熟成処理によって、被粉砕貝殻は、灰となって砕ける状態となった。さらに、熟成処理後の被粉砕貝殻を、常温において所定時間放置した。
【００７２】
さらに、被粉砕貝殻を粉砕して第２粉砕処理工程を行うことにより、平均粒径が１２．０〜１５．０μｍ程度の貝殻焼成カルシウム粉体を得た。この試験例５の貝殻焼成カルシウム粉体の体積粒度分布を表９に示す。
【００７３】
【表９】
【００７４】
（２）試験資材の調整
（ａ）前記貝殻焼成カルシウム粉体をそのまま試験資材とした。
（ｂ）０．０５ｇ、０．２５ｇあるいは０．５ｇの貝殻焼成カルシウム粉体に、それぞれ再蒸留水を５０ｍｌ添加して、それぞれ貝殻焼成カルシウム粉体の質量が０．１％、０．５％または１％の貝殻焼成カルシウム混合液を得た。
（ｃ）前記１％の貝殻焼成カルシウム混合液を遠心して、貝殻焼成カルシウム上清液を得た。
【００７５】
（３）ウイルスの調製
（ａ）トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ａｏｍｏｒｉ／３９５／０４（Ｈ７Ｎ１）［４］を１０日齢の発育鶏卵（小岩井農場、岩手県）で２〜３継代して、感染漿尿液をウイルスとして分注し、使用まで−８０℃で保存した。
（ｂ）トリアデノウイルスは、鶏腎培養細（ＣＫ細胞）で継代し、感染培養液をウイルスとして分注し、使用まで−８０℃で保存した。
【００７６】
（４）細胞培養
（ａ）ＭＤＣＫ細胞（０．８〜１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を９６穴組織培養プレート（Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ，９６Ｗ，Ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ， ｗｉｔｈ ＬＩＤ，Ｓｔｅｒｉｌｅ，Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ‐ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に１００μｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２ ＷＡＴＥＲ‐Ｊａｃｋｅｔｅｄ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ，ＭＩＤＳＣＩ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）において培養した。
（ｂ）ＣＫ細胞（細胞濃度：０．３％）を細胞培養シャーレ（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｄｉｓｈｉｅｓ，ＰＳ，６０×１５ｍｍ，ｗｉｔｈ ｖｅｎｔｓ，ｓｔｅｒｉｌｅ，Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ‐ｏｎｅ）に４ｍｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて培養した。
【００７７】
（５）ウイルスの力価測定方法
（ａ）トリインフルエンザウイルスのウイルスの力価は、ウイルス接種前に、ＭＤＣＫ細胞から培養上清を除去し、１００μのＰＢＳで細胞を３回洗い、２μｇ／ｍｌのトリプシンを添加した維持培地（ＭＭ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。そこに各ウェル１００μずつ希釈ウイルスを接種し、３日間培養し、細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察し、培養上清の赤血球凝集（ＨＡ）試験結果から、ベーレンスケルベル法を用い、感染量、ＴＣＩＤ５０／ｍｌを算定した。ＡＩＶ力価の検出限界を１０1.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌとし、ウイルス不活化指数（ＮＩ）が２．８以上を示した場合、抗ウイルス効果があったと判定した。
（ｂ）トリアデノウイルスのウイルス力価は、階段希釈したウイルスをＣＫ細胞に接種（１００μｌ／ｄｉｓｈ，２ ｄｉｓｈｅｓ／ｓａｍｐｌｅ）し、接種１時間後、接種液を除去し、１次重層用寒天培地を３ｍｌ重層、さらに５日後に２次重層用寒天培地を３ｍｌ重層し、接種７日後にプラックカウントを行い、プラック形成単位（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ：以下ＰＦＵ／ｍｌ）を算出した。ＡＡＶ力価の検出限界を１０２ＰＦＵ／ｍｌとし、ウイルス不活化指数（ＮＩ）が２．８以上を示した場合、抗ウイルス効果があったと判定した。
【００７８】
（６） 試験資材のウイルス感作
（ａ）トリインフルエンザウイルス
（ｉ）前述の（２）の試験資材の調製において得た貝殻焼成カルシウム粉体、あるいは陰性対照として小麦粉をマイクロチューブに２００ｍｇ入れ、そこへウイルス液１００μｌを添加し、室温で所定時間感作させた。感作後、９００μｌのＭＭを加えて混和し、粉体を浮遊させた後、１２，０００ｘｇ、３分間遠心した。得られた上清を１０倍希釈ウイルス液とし、さらにＭＭで１０倍階段希釈し、前述の（５）（ａ）のウイルスの測定方法で残存ウイルスの力価を測定した。
【００７９】
この結果、貝殻焼成カルシウム粉体による処理後のウイルス力価は、８時間感作、２０時間感作で、ともに１０1.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以下となった。一方、このときの未処理ウイルスのウイルス力価は、８時間、２０時間で、それぞれ１０6.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０7.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。これにより、貝殻焼成カルシウム粉体による処理においては、ＮＩがそれぞれ５以下、６以下となり、貝殻焼成カルシウム粉体の抗ウイルス効果が認められた。
【００８０】
また、前述の（１）の貝殻焼成カルシウム粉体の製造方法において平均粒径が１２〜１５μｍ程度の貝殻焼成カルシウム粉体を製造する際、熟成処理後の被粉砕貝殻を、常温において所定時間放置した後、被粉砕貝殻を５ｍｍ程度の篩にかけることにより、平均粒径が２．５〜５ｍｍ程度の貝殻焼成カルシウム粉体を製造することができる。このような平均粒径が２．５〜５ｍｍ程度の貝殻焼成カルシウム粉体にも抗ウイルス効果が認められており、このような粒径の貝殻焼成カルシウム粉体であれば、屋外において散布した場合でも飛散することを防止することができるので、抗ウイルス材として、前記貝殻焼成カルシウム粉体を例えば家畜舎等の屋外に散布することにより、抗ウイルス材が飛散することなく、家畜等がウイルスに感染してしまうことを予防することができる。
【００８１】
（ｉｉ）前述の（２）の試験資材の調製において得た０．１％貝殻焼成カルシウム混合液、０．５％貝殻焼成カルシウム混合液、１％貝殻焼成カルシウム混合液を、それぞれマイクロチューブに４００μｌもしくは８００μｌ採取して、１００μｌのトリインフルエンザウイルスを添加した。所定の感作時間毎に１Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ （ｐＨ７．２）を５００μｌまたは１００μｌ加えて、各貝殻焼成カルシウム混合液を中和し、前記ＭＤＣＫ細胞で力価測定を行った。
【００８２】
前記各混合液について、感作時間を１０分、３０分、６０分とした場合の結果を、表１０に示す。一方、このときの未処理ウイルスのウイルス力価は、１０8.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００８３】
【表１０】
【００８４】
表１０によれば、０．１％貝殻焼成カルシウム混合液については、１０分間の感作を行った場合、ＮＩは２．０を下回り、３０分間感作ではＮＩ２．５となったが、６０分間感作でもＮＩは２．７５であった。この結果、０．１％貝殻焼成カルシウム混合液では、６０分間の感作でも、抗ウイルス効果が認められなかった。
【００８５】
０．５％貝殻焼成カルシウム混合液については、１０分間の感作を行った場合、ＮＩは５となり、３０分間感作ではＮＩ４．８となり、さらに６０分間感作ではＮＩが４．３となり、いずれも抗ウイルス効果が認められた。
【００８６】
１％貝殻焼成カルシウム混合液については、１０分間の感作を行った場合のＮＩは６．５となり、３０分間感作ではＮＩが６以下、６０分間感作ではＮＩが４．５となり、いずれも抗ウイルス効果が認められた。
【００８７】
一方、あらかじめ１％貝殻焼成カルシウム混合液を、等量の１Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で中和したものにウイルスを添加してウイルス力価を測定したところ（感作時間０分）、ＮＩは２．２５となった。
【００８８】
さらに、１％貝殻焼成カルシウム混合液について、感作時間を短縮して、５秒間、１０秒間、３０秒間および１０分間とした場合のウイルス力価の結果を、表１１に示す。このときの未処理ウイルスのウイルス力価は、１０7.75ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００８９】
【表１１】
【００９０】
表１１によれば、５秒間の感作でＮＩが−０．２５であり、１０秒間の感作でＮＩが０．５であり、３０秒間の感作でＮＩが０．２５であり、１０分間の感作でもＮＩが１．２５以下であった。また、あらかじめ１％貝殻焼成カルシウム混合液を、等量の１Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で中和したものにウイルスを添加したもののウイルス力価は、未処理ウイルスのウイルス力価と同値であった。
【００９１】
次に、１％貝殻焼成カルシウム混合液について、感作時の温度の違いで効果に差が生じるかを調べるため、感作時の温度を室温（ＲＴ：約２５℃）、３７℃、および４℃として、それぞれ０分間、１０分間、６０分間感作させた。この結果を表１２に示す。このときの未処理ウイルスのウイルス力価は、１０8.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。なお、感作時間が０分間とは、あらかじめ１％貝殻焼成カルシウム混合液を、等量の１Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で中和したものを使用した場合である。
【００９２】
【表１２】
【００９３】
表１２によれば、感作時の温度を室温とした場合、０分間感作ではＮＩが０．７５であったが、１０分間感作ではＮＩが３．５となり、さらに６０分間感作ではＮＩが５となり、１０分間および６０分間の感作で抗ウイルス効果が認められた。また、感作時の温度を３７℃とした場合、０分間感作ではＮＩが０．５であったが、１０分間感作ではＮＩが５．５以上、６０分間感作でも同様にＮＩが５．５以上となり、１０分間および６０分間の感作で抗ウイルス効果が認められた。さらに、感作時の温度を４℃とした場合、０分間感作ではＮＩ０．５であり、１０分間の感作でＮＩが１．７５であり、６０分間の感作でもＮＩが１．７５であり、いずれも抗ウイルス効果は認められなかった。
【００９４】
さらに、１％貝殻焼成カルシウム混合液について、感作時の温度を室温、３７℃とし、感作時間を短縮して、それぞれ０分間、１分間、５分間、１０分間、３０分間感作させた場合の、ウイルス力価の結果を表１３に示す。このときの未処理ウイルスのウイルス力価は、１０6.50ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００９５】
【表１３】
【００９６】
表１３によれば、感作時の温度を室温とした場合、１分間および５分間の感作では、ＮＩが０であり、１０分間の感作ではＮＩが０．５以下となったが、３０分間の感作でもＮＩは１．５以下であり、いずれも抗ウイルス効果が認められなかった。また、感作時の温度を３７℃とした場合、１分間の感作ではＮＩが０であり、５分間の感作でもＮＩが２．７５であり、さらに１０分間の感作でもＮＩが２．５以下であり、いずれも抗ウイルス効果が認められなかった。
【００９７】
（ｉｉｉ）前述の試験資材の調製において得た貝殻焼成カルシウム上清液９００μｌに、１００μｌのウイルス液を添加し、感作時の温度を、室温（２５℃）、３７℃として、所定の感作時間毎に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を加えて貝殻焼成カルシウム上清液を中和し、ウイルス力価の測定を行った。このときの未処理ウイルスのウイルス力価は、１０7.80ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。なお、前記上清液のｐＨは、１２．８を示した。
【００９８】
前記各上清液について、それぞれ感作時間を０分間、１分間、５分間、１０分間および３０分間とした場合の結果を表１４に示す。感作時間が０分間とは、あらかじめ貝殻焼成カルシウム上清液を、等量の１Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で中和したものを使用した場合である。
【００９９】
【表１４】
【０１００】
表１４によれば、感作時の温度が室温の場合、１分間、５分間、１０分間、３０分間の感作では、いずれもＮＩがすべて０であり、抗ウイルス効果が認められなかった。また、感作時の温度が３７℃の場合、１分間の感作ではＮＩが０であり、５分間の感作でＮＩが１．２５以下、１０分間の感作ではＮＩが０．２５であり、さらに３０分間の感作でもＮＩが２．５以下であり、いずれも抗ウイルス効果が認められなかった。
【０１０１】
（ａ）トリアデノウイルス
前述の（２）の試験資材の調製において得た貝殻焼成カルシウム粉体にトリアデノウイルスを感作させ、トリアデノウイルスのウイルス力価を測定した。この結果を表１５に示す。
【０１０２】
【表１５】
【０１０３】
この結果、未処理ウイルスのウイルス力価が１０8.60ＴＣＩＤ５０／ｍｌであったのに対し、貝殻焼成カルシウム粉体による処理後のウイルス力価は、８時間感作で１０3.00ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、ＮＩが５．６となり、抗ウイルス効果が認められた。
【０１０４】
本実施形態に係る貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材によれば、前述のとおり平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体が含有された貝殻焼成カルシウム混合液の上清を用いることにより、抗ウイルス効果が認められ、抗ウイルス材として利用することができる。そして、この抗ウイルス材を噴霧装置によって噴霧した場合、抗ウイルス材によって噴霧装置に目詰まりが発生することを確実に防止することができるとともに、被噴霧対象に貝殻焼成カルシウム粉体が付着してしまうことを確実に防止することができる。
【０１０５】
したがって、このような抗ウイルス材によれば、噴霧装置のメンテナンス等が容易となり、さらには、被噴霧対象や噴霧場所が限定されることなく、例えば、被服の上から噴霧する場合や、空港や駅、店舗等の人が多く集まる屋内において散布する場合等、貝殻焼成カルシウム粉体を被対象物に付着させたくない種々の用途にも用いることができる。
【０１０６】
また、本実施形態に係る抗ウイルス材は、産業廃棄物として問題になっているほたて貝等の貝殻により得ることができるので、ほたて貝の貝殻を有効に利用することができ、産業廃棄物の問題を解消することができる。また、本実施形態に係る抗ウイルス材は、トリインフルエンザウイルス等種々のウイルスに適用することができ、バイオセキュリティ強化資材として有効に利用することができ、近年問題になっているインフルエンザ等のウイルス予防として、種々の場面において利用することができる。
【０１０７】
なお、本発明は前記実施形態に限定されるものではなく、必要に応じて種々変更することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体が含有された貝殻焼成カルシウム混合液の上清である貝殻焼成カルシウム上清液を含有する貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材。
【請求項２】
前記貝殻焼成カルシウム混合液に、０．１５質量％以上の前記貝殻焼成カルシウム粉体が含有されていることを特徴とする請求項１に記載の貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材。
【請求項３】
１２．５ｐＨ以上であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材。
【請求項４】
前記貝殻焼成カルシウム粉体は、二枚貝の貝殻に焼成処理および粉砕処理を施して得られることを特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材。
【請求項５】
前記二枚貝の貝殻は、ほたて貝の貝殻であることを特徴とする請求項４に記載の貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材。
【請求項１】
平均粒径が１００〜５００ｎｍの貝殻焼成カルシウム粉体が含有された貝殻焼成カルシウム混合液の上清である貝殻焼成カルシウム上清液を含有する貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材。
【請求項２】
前記貝殻焼成カルシウム混合液に、０．１５質量％以上の前記貝殻焼成カルシウム粉体が含有されていることを特徴とする請求項１に記載の貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材。
【請求項３】
１２．５ｐＨ以上であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材。
【請求項４】
前記貝殻焼成カルシウム粉体は、二枚貝の貝殻に焼成処理および粉砕処理を施して得られることを特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材。
【請求項５】
前記二枚貝の貝殻は、ほたて貝の貝殻であることを特徴とする請求項４に記載の貝殻焼成カルシウム粉体を用いた抗ウイルス材。
【公開番号】特開２０１２−６２２５７（Ｐ２０１２−６２２５７Ａ）
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０６１４６（Ｐ２０１０−２０６１４６）
【出願日】平成２２年９月１４日（２０１０．９．１４）
【出願人】（５０９２９３１９８）
【出願人】（５０１３９５４８７）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１４日（２０１０．９．１４）
【出願人】（５０９２９３１９８）
【出願人】（５０１３９５４８７）
【Ｆターム（参考）】
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