質量分析データ解析装置
【課題】ＤＢ検索によるペプチド・タンパク質同定において、検索時間や擬陽性の発生の増加を抑えつつ同定の見逃しをなくし信頼性を高める。
【解決手段】全ての修飾・変異に関する情報をリスト化して予め修飾・変異ＤＢ２４に登録しておき、検索条件入力部２８によりＤＢ検索条件の１項目である非確定的修飾・変異を指定可能とする。非確定的修飾・変異の指定可能数の制約をなくす一方、２以上の非確定的修飾・変異の同時発生を考慮せず、配列同定処理部２３は、指定された非確定的修飾・変異を１つずつ選択しながら他の検索条件と組み合わせてＤＢ検索を実行する。これにより、全てのタンパク質に対し修飾や変異を網羅的に検索できるので、従来より同定見逃しが大幅に減る。一方、起こる可能性が低い２以上の非確定的修飾・変異の同時発生を考慮しないので、その分、検索回数の増大を抑えて同定所要時間を抑制できるとともに、擬陽性による誤った同定も抑えることができる。
【解決手段】全ての修飾・変異に関する情報をリスト化して予め修飾・変異ＤＢ２４に登録しておき、検索条件入力部２８によりＤＢ検索条件の１項目である非確定的修飾・変異を指定可能とする。非確定的修飾・変異の指定可能数の制約をなくす一方、２以上の非確定的修飾・変異の同時発生を考慮せず、配列同定処理部２３は、指定された非確定的修飾・変異を１つずつ選択しながら他の検索条件と組み合わせてＤＢ検索を実行する。これにより、全てのタンパク質に対し修飾や変異を網羅的に検索できるので、従来より同定見逃しが大幅に減る。一方、起こる可能性が低い２以上の非確定的修飾・変異の同時発生を考慮しないので、その分、検索回数の増大を抑えて同定所要時間を抑制できるとともに、擬陽性による誤った同定も抑えることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質由来のペプチド混合物を含む被検試料を質量分析し、これにより得られた質量分析データを用いてペプチドのアミノ酸配列を推定することによってタンパク質を同定する質量分析データ解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポストゲノム研究としてタンパク質の構造や機能の解析が急速に進められている。このようなタンパク質の構造・機能解析手法（プロテオーム解析）の一つとして、質量分析計を用いたタンパク質の発現解析や一次構造解析が広く行われるようになってきており、四重極型イオントラップや衝突誘起分解（ＣＩＤ）などによって特定のピークの捕捉と開裂を行う、いわゆるＭＳｎ分析（ｎは２以上の整数）が威力を発揮している。一般にＭＳ2（＝ＭＳ／ＭＳ）分析では、まず、分析対象物から特定のm/zを有するイオンをプリカーサイオンとして選別し、該プリカーサイオンをＣＩＤによって開裂させる。その後、開裂によって生成したイオン（プロダクトイオン）を質量分析することによって、目的とするイオンの質量や化学構造についての情報を得ることができる。
【０００３】
上記のようなＭＳｎ分析を利用してタンパク質を同定する場合、まず、タンパク質を適当な酵素で消化してペプチド断片の混合物としてから、該ペプチド混合物を質量分析してマススペクトルを取得する。続いて、ペプチド混合物のマススペクトルデータの中から、例えば単一のペプチドに由来する一組の同位体ピーク群をプリカーサイオンとして選択し、該プリカーサイオンをＣＩＤにより開裂させて生成されたイオン（プロダクトイオン）の質量分析、つまりＭＳ／ＭＳ分析を行う。また、１回の開裂操作では十分に小さな断片に開裂しない場合には、開裂操作を複数回行うこともある。
【０００４】
以上のようにして１段又は２以上の多段の開裂操作により得られたプロダクトイオンのマススペクトルパターンや上記プリカーサイオンのマススペクトルパターンを基に、例えばマトリックスサイエンス社が提供しているマスコット（MASCOT）等の検索エンジンを利用してアミノ酸配列データベースとの照合処理を実行する。これによって、被検ペプチドのアミノ酸配列を決定し、元のタンパク質を同定する。
【０００５】
上記のようなデータベース検索エンジンとしては様々なものが知られ実用に供されているが、上述したマスコットは最も広く利用されているものの１つである（非特許文献１、２参照）。図４は、コンピュータのモニタ画面上に表示される、マスコットによるＭＳ／ＭＳイオンサーチの検索設定画面の一例である。
【０００６】
ユーザが設定すべき主な検索項目としては、照合に使用するデータベース（Database）、タンパク質の分解に使用した消化酵素の種類（エンザイム：Enzyme）、確定的に起こる修飾の種類（フィックスド・モディフィケイション：Fixed modification）、起こる可能性のある（非確定的な）修飾の種類（バリアブル・モディフィケイション：Variable modification）、質量分析の精度の許容値（MS/MS tol.）などがある。これら検索項目のいくつかはプルダウンメニューとなっており、そのメニューの中からユーザが適宜に指定できるようになっている。ユーザがこれら検索条件を適宜設定した上で「スタートサーチ（Start Search）」ボタンをクリック操作して検索の実行を指示すると、コンピュータにおいて設定検索条件の下でデータベースの照合が実行され、最終的には検索上で確度が高いペプチド候補がリストアップされる。マスコットの場合には、ペプチド候補の確度はスコアと呼ばれるものである。
【０００７】
しかしながら、ユーザが常に正しく各検索項目を設定できるとは限らない。例えば、精度許容値「MS/MS tol.」を小さく見積もってしまったり正しいバリアブル・モディフィケイションを予想することが困難であったりすることは頻繁に起こり得る。このような問題を解決するため、予めタンパク質の種類を絞った上で検索条件の設定誤差を許容するエラートレラントサーチと呼ばれる方法も開発されている（非特許文献３、４参照）。
【０００８】
エラートレラントサーチ法を簡単に説明すると、まずユーザが図４に示したような検索設定画面において設定した検索条件の下でＭＳ／ＭＳイオンサーチを実行し、予め設定されたホモロジーレベルと呼ばれる閾値以上のスコアでヒットしたペプチドを含むタンパク質候補を抽出する。このＭＳ／ＭＳイオンサーチでは、バリアブル・モディフィケイションとしてユーザが設定したものを使用する。そうして抽出したタンパク質候補のペプチドにおいて、次の４つの（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）の検索条件の設定誤差を許容する条件の下でデータベース検索を試みる。
【０００９】
（Ａ）エンザイムの検索項目を「セミ・スペシフィック（semi-specific）」に設定する。ここで、セミ・スペシフィックとは、酵素による特異的切断が片側のみで起こるものである。
（Ｂ）「ミスド・クリベージ（missed cleavage）」の数を１だけ増加させる。ここで、ミスド・クリベージとは、本来は切断されるべきでない箇所で開裂により結合が切れることを意味する。
（Ｃ）全てのバリアブル・モディフィケイションを１ずつ順番に設定する。
（Ｄ）１つのアミノ酸の変異（substitution）を考慮する。
上記のようなデータベース検索によりヒットしたペプチド候補の中で、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ実行時よりもスコアが高く、且つ予め設定されたアイデンティファイレベル（上記ホモロジーレベルよりも高いレベル）と呼ばれる閾値以上のスコアでヒットしたペプチドを選択し、これを検索結果として表示する。
【００１０】
このエラートレラントサーチ法では、最初にＭＳ／ＭＳイオンサーチを実行しタンパク質を限定したうえで条件を緩和した検索を行うので、全てのタンパク質を検索対象とする通常のＭＳ／ＭＳイオンサーチよりも処理時間を短くすることが可能である。
【００１１】
しかしながら、上述のＭＳ／ＭＳイオンサーチ法及びエラートレラントサーチ法のいずれでも次のような問題がある。即ち、これら検索方法の良否の評価として、大別して、検索時間と、検索確度とがある。検索確度には、検索がヒットしないという見逃しの問題と、偽のペプチドが誤ってヒットしてしまうという擬陽性の問題、とがある。一般的に言えば、検索時間を短縮しようとすると検索確度が低下し、検索確度を上げようとすると検索時間が長くなる。
【００１２】
例えばエラートレラントサーチ法では、最初に検索対象のタンパク質を限定してしまうため、その時点で目的のタンパク質を除外してしまうと、上記手順によるデータベース検索の際に設定誤差を拡げてもヒットすることは期待できない。その結果、検索時間は短いが、見逃しが多くなる。一方、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法では、特定のタンパク質に絞る作業を行わないので、検出見逃しは相対的に少ないが、検索時間は長くなる。またマスコットでは、検索時間の増大と擬陽性の増加を防止するために、バリアブル・モディフィケイションの数を９に制限しているために、或る程度の見逃しが生じることは避けられない。
【００１３】
【非特許文献１】「マトリックス・サイエンス−マスコット−ＭＳ／ＭＳ・イオン・サーチ（Matrix Science - Mascot - MS/MS Ions Search）」、[online]、英国マトリックス・サイエンス社（Matrix Science Ltd.）、[平成２０年６月２４日検索]、インターネット＜URL : http://www.matrixscience.com/search_form_select.html＞
【非特許文献２】飯田哲生、ほか３名、「ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦのプロテオーム解析への応用」、島津評論、Vol.63、No.1・2、p.19-28 (2006)
【非特許文献３】「エラー・トレラント・サーチ（Error Tolerant Search）」、[online]、英国マトリックス・サイエンス社（Matrix Science Ltd.）、[平成２０年６月２４日検索]、インターネット＜URL : hthttp://www.matrixscience.com/help/error_tolerant_help.html＞
【非特許文献４】デビッド（David M. Creasy）ほか１名、「エラー・トレラント・サーチング・オブ・アンインタプリテッド・タンデム・マス・スペクトロメトリー・データ（Error Tolerant Searching of Uninterpreted Tandem Mass Spectrometry Data）」、プロテオミクス（Proteomics）、Volume 2、Issue 10、p.1426-1434 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述のようにＭＳ／ＭＳイオンサーチ法とエラートレラントサーチ法とを比較した場合、後者は検索時間の点で有利である反面、確度の点では劣り、前者は確度の点で有利である反面、検索時間では劣ると言える。但し、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法でも見逃しの確率は比較的多く、同定されないタンパク質が残るという問題が顕在化している。本願発明者の検討により、その主な原因は、検索条件の１つであるバリアブル・モディフィケイションの数が９個以上であるが一定値に制限されている点にあることが明らかになった。また同時に、バリアブル・モディフィケイションを拡げれば見逃しの確率は下がるものの、検索時間が延びるのはもちろんのこと、擬陽性が増加し、全体として検索確度を上げることは難しいことも判明した。
【００１５】
本発明はこうした点に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、検索のための処理時間の増大をできるだけ抑えつつ、従来のＭＳ／ＭＳイオンサーチ法やエラートレラントサーチ法では見つけることができなかったペプチド・タンパク質を同定することができ、且つ、誤った同定も減らすことができる質量分析データ解析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本願発明者は、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法を始めとするデータベース検索の検索条件設定として、バリアブル・モディフィケイション（つまり非確定的な修飾）の数と、検索実行に際してのその検索条件の与え方に着目した。即ち、前述のように、従来の方法では、最大９種類の非確定的修飾の設定が可能であるが、検索に際しては複数の非確定的修飾の併存が許容されている。つまり、或る１つの種類の非確定的修飾と別の種類の非確定的修飾とが同時に起こり得ることも、検索の条件に組み込まれている。しかしながら、一般に、或るペプチドのアミノ酸配列において複数箇所で同時に修飾が起こることは皆無ではないが、確率としてはかなり低いと考えられる。
【００１７】
一方、本願発明者の検討によれば、アミノ酸配列の複数箇所で同時に修飾・変異が起こるとした場合、実際のアミノ酸配列とは異なるにも拘わらず検索の際に高いスコアでヒットしてしまう確率、つまり擬陽性の確率が大幅に上がることが判明した。また、アミノ酸配列の複数箇所で同時に修飾・変異が起こるという条件設定は、特に非確定的修飾・変異の数を増やす場合に検索回数の大幅な増大に繋がり、検索時間の点でも不利である。そうしたことを総合的に考慮すると、非確定的修飾・変異の複数の併存を認めない、つまり最大でも１箇所でしか修飾・変異が生じないと仮定し、その代わりに選び得る非確定的修飾・変異の種類を大幅に増加させることは、擬陽性を減らしながら或いはその増加を抑えながら、見逃しを減らすのに有効であると考えられる。また、検索時間の点でも極端な増大は抑制できると考えられる。本発明はこうした知見に基づいてなされたものである。
【００１８】
即ち、上記課題を解決するために成された本発明は、ＭＳn分析（ｎ≧２）可能な質量分析計により収集されたスペクトルデータに基づいて被検試料中のペプチド・タンパク質を同定するためにデータベース検索を行う質量分析データ解析装置において、
a)スペクトルデータに基づいて被検試料に由来するピークのピーク情報を集めたピークリストを作成するピークリスト作成手段と、
b)アミノ酸配列に起こり得る修飾・変異に関する条件を任意の数だけユーザが指定するための第１条件指定手段と、
c)該第１条件指定手段により指定される条件以外のデーベース検索のための検索条件をユーザが指定するための第２条件設定手段と、
d)前記第１条件指定手段により指定された条件を順次１つずつ選択しつつ選択した条件と前記第２条件指定手段により指定された検索条件とを組み合わせた条件の下で、それぞれ前記ピークリスト作成手段により作成されたピークリストをデータベースと照合することによりペプチド・タンパク質の候補を抽出する、という処理を、前記第１条件指定手段により指定された条件の全てが終了するまで又は所定の終了条件が満たされるまで繰り返すデータベース検索実行手段と、
e)前記データベース検索実行手段により抽出された各ペプチド・タンパク質の候補の確度に基づいた情報を出力する出力手段と、
を備えることを特徴としている。
【００１９】
本発明に係る質量分析データ解析装置では、非確定的な修飾・変異が最大でも１箇所でしか生じないとの排他的条件の下に、前記第１条件指定手段により指定可能な非確定的修飾・変異の種類の数の制約をなくす又は広げるようにしたことにより、被検試料中のペプチド・タンパク質を同定する際の擬陽性の減少又はその増加の抑制と同定見逃しの減少とを両立するとともに、検索時間の増大を抑制するようにしている。
【００２０】
現在知られている非確定的修飾・変異の種類の総数は６００程度であるため、これらを一々、検索対象に含めるか否かをキー操作やマウス操作などで指定するのは実用的でない。そこで、本発明に係る質量分析データ解析装置の一態様として、好ましくは、アミノ酸配列の修飾・変異についての既知の全ての条件を格納しておく修飾・変異データベースを備え、前記第１条件指定手段は、修飾・変異データベースを利用して任意の数の条件の指定を可能とした構成とするとよい。
【００２１】
この構成では、一例として、第１条件指定手段は、修飾・変異データベースに登録されている全ての非確定的修飾・変異を検索条件として指定するようにすることができる。また、データベース中の全ての非確定的修飾・変異について起こり得る確率の高さ等に基づく優先度を定めておき、その優先度の順に適宜の数だけ、例えば、「優先度の高い順に１００個」というように簡便に非確定的修飾・変異についての条件を設定することができる。
【００２２】
なお、第２条件設定手段により指定される検索条件とは、上述の従来のＭＳ／ＭＳイオンサーチにおいて設定可能なバリアブル・モディフィケイション以外の各項目とすることができ、例えばエンザイム、フィックスド・モディフィケイション、ミスド・クリベージなどを含む。
【００２３】
また、データベース検索実行手段は、第１条件指定手段により指定された非確定的修飾・変異の条件の全てが終了するまで検索を繰り返してもよいが、確度が相当に高いペプチド・タンパク質がヒットした時点で検索を終了するようにしておくことで、検索時間短縮の大きな効果が見込める。そこで、本発明に係る質量分析データ解析装置の一態様として、データベース検索実行手段は、抽出されたペプチド・タンパク質の候補の確度が所定の閾値以上であるものが探索された時点でデータベース検索の繰り返しを打ち切るようにしても構わない。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る質量分析データ解析装置によれば、例えばマスコットのＭＳ／ＭＳイオンサーチ法などによるデータベース検索に比べて、タンパク質・ペプチドが同定できないというケースを大幅に減らすことができるとともに、誤った同定（擬陽性）も減らすことができる。一方で、一般的に検索時間は長くなるものの、従来のマスコットのＭＳ／ＭＳイオンサーチ法で単にバリアブル・モディフィケイションの制限を拡げる場合に比べれば、検索時間の増加を抑えることができ、通常のコンピュータの使用により許容できる程度の時間に検索時間を収めることが可能となる。さらにまた、適当に良好な検索結果が得られた時点で検索を打ち切るような処理を実施することで、検索時間の短縮が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明に係る質量分析データ解析装置を用いたタンパク質同定システムの一実施例について、添付の図面を参照して説明する。図１は本実施例のタンパク質同定システムの全体構成図、図２は本システムを用いたタンパク質同定の手順を示すフローチャートである。
【００２６】
本実施例のタンパク質同定システムは、大別して、質量分析部１と、コンピュータを中心に構成される制御・処理部２と、から成る。質量分析部１はイオントラップ飛行時間型質量分析計であり、目的試料中の分子や原子をイオン化するイオン化部１０と、発生したイオンを一時的に捕捉し、必要に応じてm/zに応じたイオンの選別とＣＩＤによるイオンの開裂とを実行する３次元四重極型のイオントラップ１１と、イオントラップ１１から出射された各種イオンをm/zに応じて分離して検出する飛行時間型質量分析器（ＴＯＦＭＳ）１２と、を備える。
【００２７】
生体試料を対象としたイオン化を行うイオン化部１０としてはマトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）によるものが一般的であるが、イオン化法はこれに限るものではない。例えば、イオン化部１０として、１μｍ／分未満の微流速の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）とこれに対応したナノＥＳＩ（エレクトロスプレイイオン化）との組み合わせが有用である（非特許文献２参照）。
【００２８】
ＴＯＦＭＳ１２は、リフレクトロン電極により発生する電場によりイオンを折返し飛行させる飛行空間１３と、該飛行空間１３を飛行する間にm/zに応じて時間的に分離されたイオンを順次検出する検出器１４と、を含む。
【００２９】
制御・処理部２は、質量分析部１の各部を制御する分析制御部２０、検出器１４から得られる検出信号に基づいてマススペクトル、ＭＳ／ＭＳスペクトルなどを作成するＭＳｎデータ処理部２１と、マススペクトル、ＭＳ／ＭＳスペクトル中に現れているピークを抽出して各ピークのm/zや強度などの情報を含むピークリストを作成するピークリスト作成部２２と、アミノ酸配列の非確定的修飾・変異の情報を格納した修飾・変異データベース（ＤＢ）２４と、ペプチドのアミノ酸配列を推定するための同定用データベース（ＤＢ）２５と、これらデータベースを用いてピークリストにヒットするタンパク質・ペプチドの検索を行う配列同定処理部２３と、を機能ブロックとして含む。修飾・変異データベース２４には、その時点で既知である全ての修飾・変異の情報、即ち、修飾・変異の名称、変化するアミノ酸の種類やペプチド部位、変化質量（m/z）など、を予め登録しておくものとする。
【００３０】
制御・処理部２の実体はコンピュータであって、該コンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアが動作することにより、前述の各種機能が達成される。配列同定処理部２３に接続される検索条件入力部２８は、検索条件を入力設定するためのものであり、具体的には、コンピュータに接続されるキーボードや、マウス等のポインティングデバイスである。また、表示部２９は検索条件入力部２８による検索条件入力設定画面を表示したり、同定結果を表示するためのものである。
【００３１】
次に、本実施例のタンパク質同定システムを用いたタンパク質同定作業について、図２により説明する。なお、以下の説明ではマスコットのＭＳ／ＭＳイオンサーチ法と同じデータベース検索エンジンを用いた場合を例に挙げているが、データベース検索法はこれに限るものではなく、周知の他の方法を用いてもよいことは容易に理解できる。
【００３２】
ユーザは目的とするタンパク質を適宜の酵素により消化してペプチド混合物を含む被検試料を調製する。この被検試料を質量分析部１により質量分析し、さらにそれにより得られるマススペクトル上に現れるピークをプリカーサとして選択してＭＳ／ＭＳ分析を実行する（ステップＳ１）。プリカーサの選択方法は本発明には直接関係ないので詳細は省略するが、例えばマススペクトルに現れるピークに対し、同位体ピークの判定、多価イオンピークの判定などを行って同一成分由来のピークの重なりを除いた後に、ピーク強度を判定する等によりプリカーサとすべきイオンを決定する。
【００３３】
次にピークリスト作成部２２は、得られたマススペクトルやＭＳ／ＭＳスペクトルに現れるピークの情報を収集してピークリストを作成する（ステップＳ２）。ピークリストに掲載されるピーク情報は、ピークのm/z、強度を含む。
【００３４】
次に、データベース検索を実行する前に、ユーザは検索条件入力部２８より、非確定的修飾・変異（Variable modification and substitution）を除く他の検索条件項目を設定する（ステップＳ３）。即ち、図４に示したような検索条件設定画面を表示部２９の画面上に表示し、データベース種類（Database）、生物学的分類（Taxonomy）、酵素の種類（Enzyme）、誤開裂の許容数（missed cleavage）、確定的修飾・変異(Fixed modification and substitution、図４では「Fixed modifications」と記載の項目）、ペプチドの許容m/z範囲（Peptide tol.）、ＭＳ／ＭＳ分析時の許容m/z範囲（MS/MS tol.）、ペプチド価数（Peptide charge）、測定装置種類（Instrument）などの各項目についてプルダウンメニューからの選択、数値や文字の直接的なキー入力、或いはチェックボックスのチェック記入などを行う。これらの検索条件は主として測定対象の試料の種類や測定装置（質量分析部１）の性能などに依存するものであり、ユーザにとっては既知であるか、或いは容易に予想できるものである。
【００３５】
次にユーザはステップＳ３で設定しなかった（設定できなかった）非確定的修飾・変異（Variable modification and substitution、図４では「Variable modifications」と記載の項目）を検索条件入力部２８により指定する（ステップＳ４）。この際に、配列同定処理部２３は修飾・変異データベース２４から読み出した登録情報のリストを表示部２９の画面上に表示させ、そのリストに基づいてユーザが選択を行うようにすることができる。ここでは、指定可能な非確定的修飾・変異の数には制限がないため、最大、データベース２４に登録されている全ての非確定的修飾・変異を検索条件として指定することができる。その場合に、ユーザは検索条件入力部２８でリスト上の非確定的修飾・変異を全て選択するという指示を行えばよい。
【００３６】
また、それ以外の場合に、リストに掲載されている非確定的修飾・変異を１つずつ選択して検索条件として指定することも可能であるが、そうした作業は面倒である。上述のように修飾・変異の総数は６００程度であるが、実際には非常に低い確率でしか起こらない修飾・変異も数多く含まれる。そこで、起こる可能性の高さに基づく優先度や重要度などを各修飾・変異についてデータベース２４に登録しておき、例えばこの優先度の高い順に所定個数の修飾・変異を選択して検索条件として指定する、といった簡便な指定方法を採用するとよい。
【００３７】
上記のように検索に必要な検索条件を全て指定した上で、ユーザが検索の開始を指示すると（ステップＳ５）、配列同定処理部２３はまずステップＳ４で指定された非確定的修飾・変異のうちの１つを選択し、ステップＳ３で設定されたそれ以外の検索条件と組み合わせて検索条件とする（ステップＳ６）。多数の非確定的修飾・変異の中から１つずつ修飾・変異を選択する際には、例えば上記のように各修飾・変異に与えられている優先度の順にするとよい。そして、この検索条件の下で、ピークリスト作成部２２により作成されたピークリストに含まれるピーク情報に適合するアミノ酸配列を、同定用データベース２５と照合することにより探索する（ステップＳ７）。
【００３８】
上記データベース検索により何らかのアミノ酸配列がヒットしたならば、その検索結果情報、例えばヒットしたペプチドのアミノ酸配列、タンパク質名、スコア（信頼性の指標値）などを図示しない記憶部に保存する（ステップＳ８）。続いて、ステップＳ４で指定された全ての非確定的修飾・変異を検索条件とした検索を実行したか否かを判定し（ステップＳ９）、未検索のものがあればステップＳ６へ戻る。そして、未だ選択されていない別の非確定的修飾・変異を１つ選択した上でステップＳ７以降へ進む。ステップＳ６〜Ｓ９の繰り返しにより、ステップＳ４で指定された全ての非確定的修飾・変異を検索条件としたデータベース検索をそれぞれ実行し、各検索によりヒットしたものがある場合にはその結果が記憶部に保存される。したがって、例えば非確定的修飾・変異として２００個（種類）が指定された場合、２００回のデータベース検索を繰り返すことになる。
【００３９】
全ての非確定的修飾・変異を検索条件としたデータベース検索が終了すると、配列同定処理部２３は、全ての検索結果を記憶部から読み出し、スコアなどを参考にした結果の妥当性の評価を行う（ステップＳ１０）。例えば一定値以上のスコアを有する結果、或いは、スコアの高い順に所定数の結果を抽出する。そして、抽出した結果、つまり妥当性の評価結果を表示部２９の画面上に表示する（ステップＳ１１）。ユーザはこれを見て最終的に、例えば最もスコアの高い結果がペプチド・タンパク質の同定結果であると判断する。
【００４０】
以上のように、本実施例のタンパク質同定システムでは、非確定的修飾・変異に関する検索条件の指定数の制約をなくす代わりに、起こり得る非確定的修飾・変異を１つに限定している。つまり、実際には起こる可能性がきわめて低い、２つ以上の非確定的修飾・変異が同時に起こる場合については検索上で考慮しないようにしている。その結果、全てのペプチド・タンパク質に対し非確定的修飾・変異が生じたものを網羅的に検索することができるので、従来のＭＳ／ＭＳイオンサーチ法では同定できなかった、ユーザが予想しにくい修飾や変異が生じたタンパク質も同定できるようになる。また、非確定的修飾・変異に関する検索条件の指定数の制約はなくなったものの、２つ以上の非確定的修飾・変異の同時生起を考慮しないため、必要な検索回数の増大を抑え、ユーザが十分に許容できる時間内に検索時間を抑えることができる。さらに、２つ以上の非確定的修飾・変異の同時生起を考慮しないことで、検索における擬陽性の増加も抑えることができ、検索結果の信頼性を上げることができる。
【００４１】
上述のように、修飾・変異データベース２４に、非確定的な修飾や変異に対する発生頻度や重要度などの情報を登録しておくことで、ステップＳ４においてユーザは、発生頻度が高い又は優先度や重要度が高い修飾・変異を選択して指定することができる。このとき、発生頻度や優先度の閾値をユーザが設定できるようにし、その閾値以上の発生頻度や優先度が与えられた修飾・変異を非確定的修飾・変異の検索条件として自動的に選択するようにすると便利である。また、検索結果として妥当性の高い、つまり高いスコアを示す非確定的修飾・変異が見い出された場合には、非確定的修飾・変異の発生頻度を自動的に加算したり優先度を上げたりする、いわば学習機能を付加するようにしてもよい。これによって、分析するサンプルの種類、サンプル調製方法、測定方法などに伴い発生するユーザに特有の非確定的修飾・変異に関する情報を加えることができるので、より確度の高い検索が可能となる。
【００４２】
なお、上記実施例では、指定された全ての非確定的修飾・変異を検索条件としたデータベース検索を実行していたが、検索の途中で十分に信頼に足る妥当な結果が得られた場合には、その時点でデータベース検索を打ち切るようにしてもよい。このように手順を変更した場合のフローチャートを図３に示す。図２と比較すれば明らかなように、ステップＳ８の後に、スコアが閾値以上であるか否かを判定し（ステップＳ１２）、スコアが閾値未満であればステップＳ９へと進み、スコアが閾値以上であればステップＳ９をパスしてＳ１０へと進むようにしている。後者の場合、それ以降の検索の繰り返しは実行されず、それまでに得られた検索結果のみを用いて妥当性を評価し、その評価結果を表示部２９に出力する。これにより、不必要な検索を実行することがなくなり、タンパク質の同定に要する時間を短縮することができる。
【００４３】
また、ステップＳ１２でスコアが閾値以上であった場合でも、同じ優先度や発生頻度を示す非確定的修飾・変異が検索条件として残っている（未検索である）場合には、その検索条件についてのデータベース検索を実行した上でステップＳ１０へ進むようにするとよい。これにより、スコアの高い結果を複数得ることも期待できる。
【００４４】
本願発明者による検討によれば、通常のＭＳ／ＭＳイオンサーチ法やエラートレラントサーチ法では同定できなかった（ハイスコアの候補ペプチドがヒットしなかった）１６個のデータの中で、本発明に係る上記のようなデータ処理方法を用いると１２個のデータで正しい修飾ペプチドを同定することができた。次に、この同定の一例として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ＝bovine serum albumin）のペプチドの同定例について説明する。
【００４５】
ＢＳＡをトリプリン酵素消化して得たペプチドを含む試料を質量分析して得られるマススペクトルに現れるm/z1910のピークをプリカーサとしたＭＳ／ＭＳ分析において、可能性が高いと予想される９種類のバリアブル・モディフィケイション（Acetyl (K)、Carbamidomethyl (C)、Carboxymethyl (C)、Dioxidation (M)、Methyl (DE)、Oxidation (M)、Phospho (ST)、Phospho (Y)、Propionamide (C)）を指定してＭＳ／ＭＳイオンサーチを行うと、順位１位の候補は、スコア２７でタンパク質「Oryza sativaのHypothetical protein」のペプチド「K.YGVASISTVDATCSTGER.E＋Methyl (DE); Phospho (ST)」であった。この検索では、スコア３９以上でホモロジーレベル、スコア６４以上でアイデンティファイレベルであるので、上記順位１位の候補の信頼度は低い。なお、本検索結果の順位２０位までの候補の中に、正しいタンパク質（ＢＳＡ）はヒットしていなかった。
【００４６】
これに対し、同じＭＳ／ＭＳデータに対して本発明に係る方法で、３５０種類のバリアブル・モディフィケイションを指定して検索を実行すると、順位１位の候補としてスコア６２でタンパク質ＢＳＡのペプチド「K.CCAADDKEACFAVEGPK.L＋Ammonia-loss (N-term C)」がヒットした。この検索では、スコア３３以上でホモロジーレベル、スコア４６以上でアイデンティファイレベルであるので、この候補の信頼度は高い。即ち、従来の方法では同定できなかったペプチドが高い確度で同定することができた。
【００４７】
なお、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の一実施例のタンパク質同定システムの全体構成図。
【図２】図１のタンパク質同定システムを用いたタンパク質同定手順を示すフローチャート。
【図３】変形したタンパク質同定手順を示すフローチャート。
【図４】コンピュータのモニタ画面上に表示されるマスコットによるＭＳ／ＭＳイオンサーチの検索設定画面の一例を示す図。
【符号の説明】
【００４９】
１…質量分析部
１０…イオン化部
１１…イオントラップ
１２…ＴＯＦＭＳ
１３…飛行空間
１４…検出器
２…制御・処理部
２０…分析制御部
２１…ＭＳｎデータ処理部
２２…ピークリスト作成部
２３…配列同定処理部
２４…修飾・変異データベース
２５…同定用データベース
２８…検索条件入力部
２９…表示部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質由来のペプチド混合物を含む被検試料を質量分析し、これにより得られた質量分析データを用いてペプチドのアミノ酸配列を推定することによってタンパク質を同定する質量分析データ解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポストゲノム研究としてタンパク質の構造や機能の解析が急速に進められている。このようなタンパク質の構造・機能解析手法（プロテオーム解析）の一つとして、質量分析計を用いたタンパク質の発現解析や一次構造解析が広く行われるようになってきており、四重極型イオントラップや衝突誘起分解（ＣＩＤ）などによって特定のピークの捕捉と開裂を行う、いわゆるＭＳｎ分析（ｎは２以上の整数）が威力を発揮している。一般にＭＳ2（＝ＭＳ／ＭＳ）分析では、まず、分析対象物から特定のm/zを有するイオンをプリカーサイオンとして選別し、該プリカーサイオンをＣＩＤによって開裂させる。その後、開裂によって生成したイオン（プロダクトイオン）を質量分析することによって、目的とするイオンの質量や化学構造についての情報を得ることができる。
【０００３】
上記のようなＭＳｎ分析を利用してタンパク質を同定する場合、まず、タンパク質を適当な酵素で消化してペプチド断片の混合物としてから、該ペプチド混合物を質量分析してマススペクトルを取得する。続いて、ペプチド混合物のマススペクトルデータの中から、例えば単一のペプチドに由来する一組の同位体ピーク群をプリカーサイオンとして選択し、該プリカーサイオンをＣＩＤにより開裂させて生成されたイオン（プロダクトイオン）の質量分析、つまりＭＳ／ＭＳ分析を行う。また、１回の開裂操作では十分に小さな断片に開裂しない場合には、開裂操作を複数回行うこともある。
【０００４】
以上のようにして１段又は２以上の多段の開裂操作により得られたプロダクトイオンのマススペクトルパターンや上記プリカーサイオンのマススペクトルパターンを基に、例えばマトリックスサイエンス社が提供しているマスコット（MASCOT）等の検索エンジンを利用してアミノ酸配列データベースとの照合処理を実行する。これによって、被検ペプチドのアミノ酸配列を決定し、元のタンパク質を同定する。
【０００５】
上記のようなデータベース検索エンジンとしては様々なものが知られ実用に供されているが、上述したマスコットは最も広く利用されているものの１つである（非特許文献１、２参照）。図４は、コンピュータのモニタ画面上に表示される、マスコットによるＭＳ／ＭＳイオンサーチの検索設定画面の一例である。
【０００６】
ユーザが設定すべき主な検索項目としては、照合に使用するデータベース（Database）、タンパク質の分解に使用した消化酵素の種類（エンザイム：Enzyme）、確定的に起こる修飾の種類（フィックスド・モディフィケイション：Fixed modification）、起こる可能性のある（非確定的な）修飾の種類（バリアブル・モディフィケイション：Variable modification）、質量分析の精度の許容値（MS/MS tol.）などがある。これら検索項目のいくつかはプルダウンメニューとなっており、そのメニューの中からユーザが適宜に指定できるようになっている。ユーザがこれら検索条件を適宜設定した上で「スタートサーチ（Start Search）」ボタンをクリック操作して検索の実行を指示すると、コンピュータにおいて設定検索条件の下でデータベースの照合が実行され、最終的には検索上で確度が高いペプチド候補がリストアップされる。マスコットの場合には、ペプチド候補の確度はスコアと呼ばれるものである。
【０００７】
しかしながら、ユーザが常に正しく各検索項目を設定できるとは限らない。例えば、精度許容値「MS/MS tol.」を小さく見積もってしまったり正しいバリアブル・モディフィケイションを予想することが困難であったりすることは頻繁に起こり得る。このような問題を解決するため、予めタンパク質の種類を絞った上で検索条件の設定誤差を許容するエラートレラントサーチと呼ばれる方法も開発されている（非特許文献３、４参照）。
【０００８】
エラートレラントサーチ法を簡単に説明すると、まずユーザが図４に示したような検索設定画面において設定した検索条件の下でＭＳ／ＭＳイオンサーチを実行し、予め設定されたホモロジーレベルと呼ばれる閾値以上のスコアでヒットしたペプチドを含むタンパク質候補を抽出する。このＭＳ／ＭＳイオンサーチでは、バリアブル・モディフィケイションとしてユーザが設定したものを使用する。そうして抽出したタンパク質候補のペプチドにおいて、次の４つの（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）の検索条件の設定誤差を許容する条件の下でデータベース検索を試みる。
【０００９】
（Ａ）エンザイムの検索項目を「セミ・スペシフィック（semi-specific）」に設定する。ここで、セミ・スペシフィックとは、酵素による特異的切断が片側のみで起こるものである。
（Ｂ）「ミスド・クリベージ（missed cleavage）」の数を１だけ増加させる。ここで、ミスド・クリベージとは、本来は切断されるべきでない箇所で開裂により結合が切れることを意味する。
（Ｃ）全てのバリアブル・モディフィケイションを１ずつ順番に設定する。
（Ｄ）１つのアミノ酸の変異（substitution）を考慮する。
上記のようなデータベース検索によりヒットしたペプチド候補の中で、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ実行時よりもスコアが高く、且つ予め設定されたアイデンティファイレベル（上記ホモロジーレベルよりも高いレベル）と呼ばれる閾値以上のスコアでヒットしたペプチドを選択し、これを検索結果として表示する。
【００１０】
このエラートレラントサーチ法では、最初にＭＳ／ＭＳイオンサーチを実行しタンパク質を限定したうえで条件を緩和した検索を行うので、全てのタンパク質を検索対象とする通常のＭＳ／ＭＳイオンサーチよりも処理時間を短くすることが可能である。
【００１１】
しかしながら、上述のＭＳ／ＭＳイオンサーチ法及びエラートレラントサーチ法のいずれでも次のような問題がある。即ち、これら検索方法の良否の評価として、大別して、検索時間と、検索確度とがある。検索確度には、検索がヒットしないという見逃しの問題と、偽のペプチドが誤ってヒットしてしまうという擬陽性の問題、とがある。一般的に言えば、検索時間を短縮しようとすると検索確度が低下し、検索確度を上げようとすると検索時間が長くなる。
【００１２】
例えばエラートレラントサーチ法では、最初に検索対象のタンパク質を限定してしまうため、その時点で目的のタンパク質を除外してしまうと、上記手順によるデータベース検索の際に設定誤差を拡げてもヒットすることは期待できない。その結果、検索時間は短いが、見逃しが多くなる。一方、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法では、特定のタンパク質に絞る作業を行わないので、検出見逃しは相対的に少ないが、検索時間は長くなる。またマスコットでは、検索時間の増大と擬陽性の増加を防止するために、バリアブル・モディフィケイションの数を９に制限しているために、或る程度の見逃しが生じることは避けられない。
【００１３】
【非特許文献１】「マトリックス・サイエンス−マスコット−ＭＳ／ＭＳ・イオン・サーチ（Matrix Science - Mascot - MS/MS Ions Search）」、[online]、英国マトリックス・サイエンス社（Matrix Science Ltd.）、[平成２０年６月２４日検索]、インターネット＜URL : http://www.matrixscience.com/search_form_select.html＞
【非特許文献２】飯田哲生、ほか３名、「ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦのプロテオーム解析への応用」、島津評論、Vol.63、No.1・2、p.19-28 (2006)
【非特許文献３】「エラー・トレラント・サーチ（Error Tolerant Search）」、[online]、英国マトリックス・サイエンス社（Matrix Science Ltd.）、[平成２０年６月２４日検索]、インターネット＜URL : hthttp://www.matrixscience.com/help/error_tolerant_help.html＞
【非特許文献４】デビッド（David M. Creasy）ほか１名、「エラー・トレラント・サーチング・オブ・アンインタプリテッド・タンデム・マス・スペクトロメトリー・データ（Error Tolerant Searching of Uninterpreted Tandem Mass Spectrometry Data）」、プロテオミクス（Proteomics）、Volume 2、Issue 10、p.1426-1434 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述のようにＭＳ／ＭＳイオンサーチ法とエラートレラントサーチ法とを比較した場合、後者は検索時間の点で有利である反面、確度の点では劣り、前者は確度の点で有利である反面、検索時間では劣ると言える。但し、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法でも見逃しの確率は比較的多く、同定されないタンパク質が残るという問題が顕在化している。本願発明者の検討により、その主な原因は、検索条件の１つであるバリアブル・モディフィケイションの数が９個以上であるが一定値に制限されている点にあることが明らかになった。また同時に、バリアブル・モディフィケイションを拡げれば見逃しの確率は下がるものの、検索時間が延びるのはもちろんのこと、擬陽性が増加し、全体として検索確度を上げることは難しいことも判明した。
【００１５】
本発明はこうした点に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、検索のための処理時間の増大をできるだけ抑えつつ、従来のＭＳ／ＭＳイオンサーチ法やエラートレラントサーチ法では見つけることができなかったペプチド・タンパク質を同定することができ、且つ、誤った同定も減らすことができる質量分析データ解析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本願発明者は、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法を始めとするデータベース検索の検索条件設定として、バリアブル・モディフィケイション（つまり非確定的な修飾）の数と、検索実行に際してのその検索条件の与え方に着目した。即ち、前述のように、従来の方法では、最大９種類の非確定的修飾の設定が可能であるが、検索に際しては複数の非確定的修飾の併存が許容されている。つまり、或る１つの種類の非確定的修飾と別の種類の非確定的修飾とが同時に起こり得ることも、検索の条件に組み込まれている。しかしながら、一般に、或るペプチドのアミノ酸配列において複数箇所で同時に修飾が起こることは皆無ではないが、確率としてはかなり低いと考えられる。
【００１７】
一方、本願発明者の検討によれば、アミノ酸配列の複数箇所で同時に修飾・変異が起こるとした場合、実際のアミノ酸配列とは異なるにも拘わらず検索の際に高いスコアでヒットしてしまう確率、つまり擬陽性の確率が大幅に上がることが判明した。また、アミノ酸配列の複数箇所で同時に修飾・変異が起こるという条件設定は、特に非確定的修飾・変異の数を増やす場合に検索回数の大幅な増大に繋がり、検索時間の点でも不利である。そうしたことを総合的に考慮すると、非確定的修飾・変異の複数の併存を認めない、つまり最大でも１箇所でしか修飾・変異が生じないと仮定し、その代わりに選び得る非確定的修飾・変異の種類を大幅に増加させることは、擬陽性を減らしながら或いはその増加を抑えながら、見逃しを減らすのに有効であると考えられる。また、検索時間の点でも極端な増大は抑制できると考えられる。本発明はこうした知見に基づいてなされたものである。
【００１８】
即ち、上記課題を解決するために成された本発明は、ＭＳn分析（ｎ≧２）可能な質量分析計により収集されたスペクトルデータに基づいて被検試料中のペプチド・タンパク質を同定するためにデータベース検索を行う質量分析データ解析装置において、
a)スペクトルデータに基づいて被検試料に由来するピークのピーク情報を集めたピークリストを作成するピークリスト作成手段と、
b)アミノ酸配列に起こり得る修飾・変異に関する条件を任意の数だけユーザが指定するための第１条件指定手段と、
c)該第１条件指定手段により指定される条件以外のデーベース検索のための検索条件をユーザが指定するための第２条件設定手段と、
d)前記第１条件指定手段により指定された条件を順次１つずつ選択しつつ選択した条件と前記第２条件指定手段により指定された検索条件とを組み合わせた条件の下で、それぞれ前記ピークリスト作成手段により作成されたピークリストをデータベースと照合することによりペプチド・タンパク質の候補を抽出する、という処理を、前記第１条件指定手段により指定された条件の全てが終了するまで又は所定の終了条件が満たされるまで繰り返すデータベース検索実行手段と、
e)前記データベース検索実行手段により抽出された各ペプチド・タンパク質の候補の確度に基づいた情報を出力する出力手段と、
を備えることを特徴としている。
【００１９】
本発明に係る質量分析データ解析装置では、非確定的な修飾・変異が最大でも１箇所でしか生じないとの排他的条件の下に、前記第１条件指定手段により指定可能な非確定的修飾・変異の種類の数の制約をなくす又は広げるようにしたことにより、被検試料中のペプチド・タンパク質を同定する際の擬陽性の減少又はその増加の抑制と同定見逃しの減少とを両立するとともに、検索時間の増大を抑制するようにしている。
【００２０】
現在知られている非確定的修飾・変異の種類の総数は６００程度であるため、これらを一々、検索対象に含めるか否かをキー操作やマウス操作などで指定するのは実用的でない。そこで、本発明に係る質量分析データ解析装置の一態様として、好ましくは、アミノ酸配列の修飾・変異についての既知の全ての条件を格納しておく修飾・変異データベースを備え、前記第１条件指定手段は、修飾・変異データベースを利用して任意の数の条件の指定を可能とした構成とするとよい。
【００２１】
この構成では、一例として、第１条件指定手段は、修飾・変異データベースに登録されている全ての非確定的修飾・変異を検索条件として指定するようにすることができる。また、データベース中の全ての非確定的修飾・変異について起こり得る確率の高さ等に基づく優先度を定めておき、その優先度の順に適宜の数だけ、例えば、「優先度の高い順に１００個」というように簡便に非確定的修飾・変異についての条件を設定することができる。
【００２２】
なお、第２条件設定手段により指定される検索条件とは、上述の従来のＭＳ／ＭＳイオンサーチにおいて設定可能なバリアブル・モディフィケイション以外の各項目とすることができ、例えばエンザイム、フィックスド・モディフィケイション、ミスド・クリベージなどを含む。
【００２３】
また、データベース検索実行手段は、第１条件指定手段により指定された非確定的修飾・変異の条件の全てが終了するまで検索を繰り返してもよいが、確度が相当に高いペプチド・タンパク質がヒットした時点で検索を終了するようにしておくことで、検索時間短縮の大きな効果が見込める。そこで、本発明に係る質量分析データ解析装置の一態様として、データベース検索実行手段は、抽出されたペプチド・タンパク質の候補の確度が所定の閾値以上であるものが探索された時点でデータベース検索の繰り返しを打ち切るようにしても構わない。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る質量分析データ解析装置によれば、例えばマスコットのＭＳ／ＭＳイオンサーチ法などによるデータベース検索に比べて、タンパク質・ペプチドが同定できないというケースを大幅に減らすことができるとともに、誤った同定（擬陽性）も減らすことができる。一方で、一般的に検索時間は長くなるものの、従来のマスコットのＭＳ／ＭＳイオンサーチ法で単にバリアブル・モディフィケイションの制限を拡げる場合に比べれば、検索時間の増加を抑えることができ、通常のコンピュータの使用により許容できる程度の時間に検索時間を収めることが可能となる。さらにまた、適当に良好な検索結果が得られた時点で検索を打ち切るような処理を実施することで、検索時間の短縮が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明に係る質量分析データ解析装置を用いたタンパク質同定システムの一実施例について、添付の図面を参照して説明する。図１は本実施例のタンパク質同定システムの全体構成図、図２は本システムを用いたタンパク質同定の手順を示すフローチャートである。
【００２６】
本実施例のタンパク質同定システムは、大別して、質量分析部１と、コンピュータを中心に構成される制御・処理部２と、から成る。質量分析部１はイオントラップ飛行時間型質量分析計であり、目的試料中の分子や原子をイオン化するイオン化部１０と、発生したイオンを一時的に捕捉し、必要に応じてm/zに応じたイオンの選別とＣＩＤによるイオンの開裂とを実行する３次元四重極型のイオントラップ１１と、イオントラップ１１から出射された各種イオンをm/zに応じて分離して検出する飛行時間型質量分析器（ＴＯＦＭＳ）１２と、を備える。
【００２７】
生体試料を対象としたイオン化を行うイオン化部１０としてはマトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）によるものが一般的であるが、イオン化法はこれに限るものではない。例えば、イオン化部１０として、１μｍ／分未満の微流速の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）とこれに対応したナノＥＳＩ（エレクトロスプレイイオン化）との組み合わせが有用である（非特許文献２参照）。
【００２８】
ＴＯＦＭＳ１２は、リフレクトロン電極により発生する電場によりイオンを折返し飛行させる飛行空間１３と、該飛行空間１３を飛行する間にm/zに応じて時間的に分離されたイオンを順次検出する検出器１４と、を含む。
【００２９】
制御・処理部２は、質量分析部１の各部を制御する分析制御部２０、検出器１４から得られる検出信号に基づいてマススペクトル、ＭＳ／ＭＳスペクトルなどを作成するＭＳｎデータ処理部２１と、マススペクトル、ＭＳ／ＭＳスペクトル中に現れているピークを抽出して各ピークのm/zや強度などの情報を含むピークリストを作成するピークリスト作成部２２と、アミノ酸配列の非確定的修飾・変異の情報を格納した修飾・変異データベース（ＤＢ）２４と、ペプチドのアミノ酸配列を推定するための同定用データベース（ＤＢ）２５と、これらデータベースを用いてピークリストにヒットするタンパク質・ペプチドの検索を行う配列同定処理部２３と、を機能ブロックとして含む。修飾・変異データベース２４には、その時点で既知である全ての修飾・変異の情報、即ち、修飾・変異の名称、変化するアミノ酸の種類やペプチド部位、変化質量（m/z）など、を予め登録しておくものとする。
【００３０】
制御・処理部２の実体はコンピュータであって、該コンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアが動作することにより、前述の各種機能が達成される。配列同定処理部２３に接続される検索条件入力部２８は、検索条件を入力設定するためのものであり、具体的には、コンピュータに接続されるキーボードや、マウス等のポインティングデバイスである。また、表示部２９は検索条件入力部２８による検索条件入力設定画面を表示したり、同定結果を表示するためのものである。
【００３１】
次に、本実施例のタンパク質同定システムを用いたタンパク質同定作業について、図２により説明する。なお、以下の説明ではマスコットのＭＳ／ＭＳイオンサーチ法と同じデータベース検索エンジンを用いた場合を例に挙げているが、データベース検索法はこれに限るものではなく、周知の他の方法を用いてもよいことは容易に理解できる。
【００３２】
ユーザは目的とするタンパク質を適宜の酵素により消化してペプチド混合物を含む被検試料を調製する。この被検試料を質量分析部１により質量分析し、さらにそれにより得られるマススペクトル上に現れるピークをプリカーサとして選択してＭＳ／ＭＳ分析を実行する（ステップＳ１）。プリカーサの選択方法は本発明には直接関係ないので詳細は省略するが、例えばマススペクトルに現れるピークに対し、同位体ピークの判定、多価イオンピークの判定などを行って同一成分由来のピークの重なりを除いた後に、ピーク強度を判定する等によりプリカーサとすべきイオンを決定する。
【００３３】
次にピークリスト作成部２２は、得られたマススペクトルやＭＳ／ＭＳスペクトルに現れるピークの情報を収集してピークリストを作成する（ステップＳ２）。ピークリストに掲載されるピーク情報は、ピークのm/z、強度を含む。
【００３４】
次に、データベース検索を実行する前に、ユーザは検索条件入力部２８より、非確定的修飾・変異（Variable modification and substitution）を除く他の検索条件項目を設定する（ステップＳ３）。即ち、図４に示したような検索条件設定画面を表示部２９の画面上に表示し、データベース種類（Database）、生物学的分類（Taxonomy）、酵素の種類（Enzyme）、誤開裂の許容数（missed cleavage）、確定的修飾・変異(Fixed modification and substitution、図４では「Fixed modifications」と記載の項目）、ペプチドの許容m/z範囲（Peptide tol.）、ＭＳ／ＭＳ分析時の許容m/z範囲（MS/MS tol.）、ペプチド価数（Peptide charge）、測定装置種類（Instrument）などの各項目についてプルダウンメニューからの選択、数値や文字の直接的なキー入力、或いはチェックボックスのチェック記入などを行う。これらの検索条件は主として測定対象の試料の種類や測定装置（質量分析部１）の性能などに依存するものであり、ユーザにとっては既知であるか、或いは容易に予想できるものである。
【００３５】
次にユーザはステップＳ３で設定しなかった（設定できなかった）非確定的修飾・変異（Variable modification and substitution、図４では「Variable modifications」と記載の項目）を検索条件入力部２８により指定する（ステップＳ４）。この際に、配列同定処理部２３は修飾・変異データベース２４から読み出した登録情報のリストを表示部２９の画面上に表示させ、そのリストに基づいてユーザが選択を行うようにすることができる。ここでは、指定可能な非確定的修飾・変異の数には制限がないため、最大、データベース２４に登録されている全ての非確定的修飾・変異を検索条件として指定することができる。その場合に、ユーザは検索条件入力部２８でリスト上の非確定的修飾・変異を全て選択するという指示を行えばよい。
【００３６】
また、それ以外の場合に、リストに掲載されている非確定的修飾・変異を１つずつ選択して検索条件として指定することも可能であるが、そうした作業は面倒である。上述のように修飾・変異の総数は６００程度であるが、実際には非常に低い確率でしか起こらない修飾・変異も数多く含まれる。そこで、起こる可能性の高さに基づく優先度や重要度などを各修飾・変異についてデータベース２４に登録しておき、例えばこの優先度の高い順に所定個数の修飾・変異を選択して検索条件として指定する、といった簡便な指定方法を採用するとよい。
【００３７】
上記のように検索に必要な検索条件を全て指定した上で、ユーザが検索の開始を指示すると（ステップＳ５）、配列同定処理部２３はまずステップＳ４で指定された非確定的修飾・変異のうちの１つを選択し、ステップＳ３で設定されたそれ以外の検索条件と組み合わせて検索条件とする（ステップＳ６）。多数の非確定的修飾・変異の中から１つずつ修飾・変異を選択する際には、例えば上記のように各修飾・変異に与えられている優先度の順にするとよい。そして、この検索条件の下で、ピークリスト作成部２２により作成されたピークリストに含まれるピーク情報に適合するアミノ酸配列を、同定用データベース２５と照合することにより探索する（ステップＳ７）。
【００３８】
上記データベース検索により何らかのアミノ酸配列がヒットしたならば、その検索結果情報、例えばヒットしたペプチドのアミノ酸配列、タンパク質名、スコア（信頼性の指標値）などを図示しない記憶部に保存する（ステップＳ８）。続いて、ステップＳ４で指定された全ての非確定的修飾・変異を検索条件とした検索を実行したか否かを判定し（ステップＳ９）、未検索のものがあればステップＳ６へ戻る。そして、未だ選択されていない別の非確定的修飾・変異を１つ選択した上でステップＳ７以降へ進む。ステップＳ６〜Ｓ９の繰り返しにより、ステップＳ４で指定された全ての非確定的修飾・変異を検索条件としたデータベース検索をそれぞれ実行し、各検索によりヒットしたものがある場合にはその結果が記憶部に保存される。したがって、例えば非確定的修飾・変異として２００個（種類）が指定された場合、２００回のデータベース検索を繰り返すことになる。
【００３９】
全ての非確定的修飾・変異を検索条件としたデータベース検索が終了すると、配列同定処理部２３は、全ての検索結果を記憶部から読み出し、スコアなどを参考にした結果の妥当性の評価を行う（ステップＳ１０）。例えば一定値以上のスコアを有する結果、或いは、スコアの高い順に所定数の結果を抽出する。そして、抽出した結果、つまり妥当性の評価結果を表示部２９の画面上に表示する（ステップＳ１１）。ユーザはこれを見て最終的に、例えば最もスコアの高い結果がペプチド・タンパク質の同定結果であると判断する。
【００４０】
以上のように、本実施例のタンパク質同定システムでは、非確定的修飾・変異に関する検索条件の指定数の制約をなくす代わりに、起こり得る非確定的修飾・変異を１つに限定している。つまり、実際には起こる可能性がきわめて低い、２つ以上の非確定的修飾・変異が同時に起こる場合については検索上で考慮しないようにしている。その結果、全てのペプチド・タンパク質に対し非確定的修飾・変異が生じたものを網羅的に検索することができるので、従来のＭＳ／ＭＳイオンサーチ法では同定できなかった、ユーザが予想しにくい修飾や変異が生じたタンパク質も同定できるようになる。また、非確定的修飾・変異に関する検索条件の指定数の制約はなくなったものの、２つ以上の非確定的修飾・変異の同時生起を考慮しないため、必要な検索回数の増大を抑え、ユーザが十分に許容できる時間内に検索時間を抑えることができる。さらに、２つ以上の非確定的修飾・変異の同時生起を考慮しないことで、検索における擬陽性の増加も抑えることができ、検索結果の信頼性を上げることができる。
【００４１】
上述のように、修飾・変異データベース２４に、非確定的な修飾や変異に対する発生頻度や重要度などの情報を登録しておくことで、ステップＳ４においてユーザは、発生頻度が高い又は優先度や重要度が高い修飾・変異を選択して指定することができる。このとき、発生頻度や優先度の閾値をユーザが設定できるようにし、その閾値以上の発生頻度や優先度が与えられた修飾・変異を非確定的修飾・変異の検索条件として自動的に選択するようにすると便利である。また、検索結果として妥当性の高い、つまり高いスコアを示す非確定的修飾・変異が見い出された場合には、非確定的修飾・変異の発生頻度を自動的に加算したり優先度を上げたりする、いわば学習機能を付加するようにしてもよい。これによって、分析するサンプルの種類、サンプル調製方法、測定方法などに伴い発生するユーザに特有の非確定的修飾・変異に関する情報を加えることができるので、より確度の高い検索が可能となる。
【００４２】
なお、上記実施例では、指定された全ての非確定的修飾・変異を検索条件としたデータベース検索を実行していたが、検索の途中で十分に信頼に足る妥当な結果が得られた場合には、その時点でデータベース検索を打ち切るようにしてもよい。このように手順を変更した場合のフローチャートを図３に示す。図２と比較すれば明らかなように、ステップＳ８の後に、スコアが閾値以上であるか否かを判定し（ステップＳ１２）、スコアが閾値未満であればステップＳ９へと進み、スコアが閾値以上であればステップＳ９をパスしてＳ１０へと進むようにしている。後者の場合、それ以降の検索の繰り返しは実行されず、それまでに得られた検索結果のみを用いて妥当性を評価し、その評価結果を表示部２９に出力する。これにより、不必要な検索を実行することがなくなり、タンパク質の同定に要する時間を短縮することができる。
【００４３】
また、ステップＳ１２でスコアが閾値以上であった場合でも、同じ優先度や発生頻度を示す非確定的修飾・変異が検索条件として残っている（未検索である）場合には、その検索条件についてのデータベース検索を実行した上でステップＳ１０へ進むようにするとよい。これにより、スコアの高い結果を複数得ることも期待できる。
【００４４】
本願発明者による検討によれば、通常のＭＳ／ＭＳイオンサーチ法やエラートレラントサーチ法では同定できなかった（ハイスコアの候補ペプチドがヒットしなかった）１６個のデータの中で、本発明に係る上記のようなデータ処理方法を用いると１２個のデータで正しい修飾ペプチドを同定することができた。次に、この同定の一例として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ＝bovine serum albumin）のペプチドの同定例について説明する。
【００４５】
ＢＳＡをトリプリン酵素消化して得たペプチドを含む試料を質量分析して得られるマススペクトルに現れるm/z1910のピークをプリカーサとしたＭＳ／ＭＳ分析において、可能性が高いと予想される９種類のバリアブル・モディフィケイション（Acetyl (K)、Carbamidomethyl (C)、Carboxymethyl (C)、Dioxidation (M)、Methyl (DE)、Oxidation (M)、Phospho (ST)、Phospho (Y)、Propionamide (C)）を指定してＭＳ／ＭＳイオンサーチを行うと、順位１位の候補は、スコア２７でタンパク質「Oryza sativaのHypothetical protein」のペプチド「K.YGVASISTVDATCSTGER.E＋Methyl (DE); Phospho (ST)」であった。この検索では、スコア３９以上でホモロジーレベル、スコア６４以上でアイデンティファイレベルであるので、上記順位１位の候補の信頼度は低い。なお、本検索結果の順位２０位までの候補の中に、正しいタンパク質（ＢＳＡ）はヒットしていなかった。
【００４６】
これに対し、同じＭＳ／ＭＳデータに対して本発明に係る方法で、３５０種類のバリアブル・モディフィケイションを指定して検索を実行すると、順位１位の候補としてスコア６２でタンパク質ＢＳＡのペプチド「K.CCAADDKEACFAVEGPK.L＋Ammonia-loss (N-term C)」がヒットした。この検索では、スコア３３以上でホモロジーレベル、スコア４６以上でアイデンティファイレベルであるので、この候補の信頼度は高い。即ち、従来の方法では同定できなかったペプチドが高い確度で同定することができた。
【００４７】
なお、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の一実施例のタンパク質同定システムの全体構成図。
【図２】図１のタンパク質同定システムを用いたタンパク質同定手順を示すフローチャート。
【図３】変形したタンパク質同定手順を示すフローチャート。
【図４】コンピュータのモニタ画面上に表示されるマスコットによるＭＳ／ＭＳイオンサーチの検索設定画面の一例を示す図。
【符号の説明】
【００４９】
１…質量分析部
１０…イオン化部
１１…イオントラップ
１２…ＴＯＦＭＳ
１３…飛行空間
１４…検出器
２…制御・処理部
２０…分析制御部
２１…ＭＳｎデータ処理部
２２…ピークリスト作成部
２３…配列同定処理部
２４…修飾・変異データベース
２５…同定用データベース
２８…検索条件入力部
２９…表示部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＳn分析（ｎ≧２）可能な質量分析計により収集されたスペクトルデータに基づいて被検試料中のペプチド・タンパク質を同定するためにデータベース検索を行う質量分析データ解析装置において、
a)スペクトルデータに基づいて被検試料に由来するピークのピーク情報を集めたピークリストを作成するピークリスト作成手段と、
b)アミノ酸配列に起こり得る修飾・変異に関する条件を任意の数だけユーザが指定するための第１条件指定手段と、
c)該第１条件指定手段により指定される条件以外のデーベース検索のための検索条件をユーザが指定するための第２条件設定手段と、
d)前記第１条件指定手段により指定された条件を順次１つずつ選択しつつ選択した条件と前記第２条件指定手段により指定された検索条件とを組み合わせた条件の下で、それぞれ前記ピークリスト作成手段により作成されたピークリストをデータベースと照合することによりペプチド・タンパク質の候補を抽出する、という処理を、前記第１条件指定手段により指定された条件の全てが終了するまで又は所定の終了条件が満たされるまで繰り返すデータベース検索実行手段と、
e)前記データベース検索実行手段により抽出された各ペプチド・タンパク質の候補の確度に基づいた情報を出力する出力手段と、
を備えることを特徴とする質量分析データ解析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の質量分析データ解析装置であって、
非確定的な修飾・変異が最大でも１箇所でしか生じないとの排他的条件の下に、前記第１条件指定手段により指定可能な非確定的修飾・変異の種類の数の制約をなくす又は広げるようにしたことにより、被検試料中のペプチド・タンパク質を同定する際の擬陽性の減少又はその増加の抑制と同定見逃しの減少とを両立するとともに検索時間の増大を抑制するようにしたことを特徴とする質量分析データ解析装置。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の質量分析データ解析装置であって、
アミノ酸配列の修飾・変異についての既知の全ての条件を格納しておく修飾・変異データベースを備え、前記第１条件指定手段は、修飾・変異データベースを利用して任意の数の条件の指定を可能としたことを特徴とする質量分析データ解析装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の質量分析データ解析装置であって、
前記データベース検索実行手段は、抽出されたペプチド・タンパク質の候補の確度が所定の閾値以上であるものが探索された時点でデータベース検索の繰り返しを打ち切ることを特徴とする質量分析データ解析装置。
【請求項１】
ＭＳn分析（ｎ≧２）可能な質量分析計により収集されたスペクトルデータに基づいて被検試料中のペプチド・タンパク質を同定するためにデータベース検索を行う質量分析データ解析装置において、
a)スペクトルデータに基づいて被検試料に由来するピークのピーク情報を集めたピークリストを作成するピークリスト作成手段と、
b)アミノ酸配列に起こり得る修飾・変異に関する条件を任意の数だけユーザが指定するための第１条件指定手段と、
c)該第１条件指定手段により指定される条件以外のデーベース検索のための検索条件をユーザが指定するための第２条件設定手段と、
d)前記第１条件指定手段により指定された条件を順次１つずつ選択しつつ選択した条件と前記第２条件指定手段により指定された検索条件とを組み合わせた条件の下で、それぞれ前記ピークリスト作成手段により作成されたピークリストをデータベースと照合することによりペプチド・タンパク質の候補を抽出する、という処理を、前記第１条件指定手段により指定された条件の全てが終了するまで又は所定の終了条件が満たされるまで繰り返すデータベース検索実行手段と、
e)前記データベース検索実行手段により抽出された各ペプチド・タンパク質の候補の確度に基づいた情報を出力する出力手段と、
を備えることを特徴とする質量分析データ解析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の質量分析データ解析装置であって、
非確定的な修飾・変異が最大でも１箇所でしか生じないとの排他的条件の下に、前記第１条件指定手段により指定可能な非確定的修飾・変異の種類の数の制約をなくす又は広げるようにしたことにより、被検試料中のペプチド・タンパク質を同定する際の擬陽性の減少又はその増加の抑制と同定見逃しの減少とを両立するとともに検索時間の増大を抑制するようにしたことを特徴とする質量分析データ解析装置。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の質量分析データ解析装置であって、
アミノ酸配列の修飾・変異についての既知の全ての条件を格納しておく修飾・変異データベースを備え、前記第１条件指定手段は、修飾・変異データベースを利用して任意の数の条件の指定を可能としたことを特徴とする質量分析データ解析装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の質量分析データ解析装置であって、
前記データベース検索実行手段は、抽出されたペプチド・タンパク質の候補の確度が所定の閾値以上であるものが探索された時点でデータベース検索の繰り返しを打ち切ることを特徴とする質量分析データ解析装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−３８６６４（Ｐ２０１０−３８６６４Ａ）
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２００３３２（Ｐ２００８−２００３３２）
【出願日】平成２０年８月４日（２００８．８．４）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月４日（２００８．８．４）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
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