質量分析法による指数関数的に変換されたタンパク質発現量指標に基づくタンパク質含有量の絶対定量
本発明者は、ナノＬＣ−ＭＳＭＳデータを用いてタンパク質混合物溶液中のタンパク質含有量を決定するべくタンパク質発現指標（ＰＡＩ，π）を確立した。消化されたペプチドはナノＬＣＭＳ／ＭＳによって分析され、得られた結果はタンデム質量スペクトルに基づいてマスコット（Ｍａｓｃｏｔ）タンパク質同定アルゴリズムに適用された。ＰＡＩは、１タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数で検出されたペプチドの数を除したものとして定義づけされる。異なる濃度の血清アルブミンからのＰＡＩは、タンパク質濃度の対数に対する線形関係を示した。これは、単一回のナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析されたマウス全細胞溶解物中の４７のタンパク質についても有効であった。一方で、マスコットタンパク質スコア並びにタンパク質あたりの同定されたペプチド数は、タンパク質発現量に対する相関関係が悪かった。絶対定量のためには、ＰＡＩは、タンパク質混合物中のタンパク質含有量に比例する指数関数的に修正されたＰＡＩ（ＥＭＰＡＩ，ｍπ）に転換された。全溶解物中の４７のタンパク質について、実際値に対するＥＭＰＡＩベースの濃度の偏差百分率は平均６３％以内であった。ＥＭＰＡＩは包括的タンパク質発現分析にうまく適用され、ＨＣＴ１１６ヒトガン細胞における遺伝子とタンパク質発現との間の比較研究を実施した。本発明は、タンパク質発現量指標に基づいてタンパク質含有量を定量するための方法及びコンピュータプログラムを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般的には、質量分析法を用いたタンパク質含有量の解析に関し、より具体的には、プロテオミクスにおいて質量分析法によるタンパク質発現指標に基づいてタンパク質含有量の定量を行うための方法及びコンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
今日ゲノム注釈付きデータベースと組合わされているプロテオーム液体クロマトグラフィ質量分析法（以下、「ＬＣ−ＭＳ」という。）アプローチは、１つのタンパク質混合物溶液から何千ものタンパク質を同定できるようにする［文献１］。これらのアプローチは、安定した同位元素標識を用いた相対的定量に対しても同様に適用されてきた［文献２−４］。近年になって、２つの状態の間の包括的な定量研究のみならず［文献５、６］、タンパク質−タンパク質間［文献７、８］、タンパク質−ペプチド間［文献９］及びタンパク質−薬物間［文献１０］の相互作用分析も広範に報告されてきている。しかしながら、これまでのところ、１つの試料溶液中のタンパク質濃度についての包括的なアプローチは、なおも確立されていなかった。細胞タンパク質の反応速度論／力学論は特定の領域内でのタンパク質の濃度の変化として記述されることから、タンパク質濃度は定量プロテオミクスにおいて最も基本的かつ重要なパラメータの１つである。さらに、濃度差が大き過ぎて同位体に基づく相対的定量を実施できない場合でも、２つの試料間の相対的定量のためにも試料中のタンパク質濃度を使用することができる。これまで同位体標識された合成ペプチドは、問題の特定のタンパク質の絶対定量のための内部標準として使用されてきた［文献１１、１２］。このアプローチは、包括的な解析に適用可能であるが、同位体標識されたペプチドのコスト及びゲル内でタンパク質の定量的消化を行なうことの困難さが問題となっている［文献１３］。
【０００３】
ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳの単一回の解析でさえ、データベース探索の助けを得ると、容易に長い同定されたタンパク質リストを生成し、同定におけるヒットランキング、確率評点、タンパク質あたりの同定済みペプチド数及び同定済みペプチドのイオン計数といったような付加的な情報が、生データを用いてこのリストから抽出される。定性的には、ヒットランク、評定及びタンパク質あたりのペプチド数［文献１４］といったような一部のパラメータが、解析対象の試料中のタンパク質発現量についての一種の指標となる。なかでも、ペプチドのイオン計数が、発現量を描写するための最も直接的なパラメータと思われ、異なる状態でのタンパク質発現のために使用された［文献１５］。しかしながら、検出器としての質量分析計は、制限された線形性及びバックグラウンドでのイオン化抑制効果に関して吸光度検出器ほど汎用性あるものではない［文献１６］。従って、信頼性ある定量的情報を得るためには、これらのパラメータを正規化する必要がある。この戦略に沿った第１のアプローチは、本発明者らが知るかぎり、タンパク質発現量指標（以下「ＰＡＩ」と呼ばれる）と命名され、ヒトスプライセオソーム複合体分析に適用された［文献１７］。相対的定量のためにはＬＣ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析におけるスペクトル計数及びペプチド数が使用されるという類似の概念が近年報告された［文献１８］。同様に、本発明者は、各タンパク質の平均イオン計数を算出するために少なくとも３つのペプチドが使用される正規化されたイオン計数ベースのアプローチも同様に開発した［文献１９］。このアプローチは、ペプチド相関関係プロファイリングにおける相対的定量のためにも使用されてきた［文献２０］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の開示
しかしながら、このアプローチの適用可能性は、それが正確さを保つために３つのペプチドを必要とすることを理由として、制限されていた。ここでは、本発明者はナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験からタンパク質発現量を判定するためにＰＡＩ戦略を検討している。
【０００５】
本発明の目的は、生体材料の試料中で指数関数的に修正されたＰＡＩ（以下、「ＥＭＰＡＩ」という。）に基づいてタンパク質含有量の定量を行うための方法を提供することにある。
【０００６】
本発明の一の実施形態においては、例えばコンピュータによって読取り可能でありかつ生体材料の試料中の上述のＥＭＰＡＩに基づいてタンパク質含有量の定量を行うためのコンピュータプログラムを記憶するコンピュータ読取り可能媒体といったようなコンピュータプログラム製品も提供されている。
【０００７】
本発明の別の実施形態においては、生体材料の試料中の上述のＥＭＰＡＩに基づいてタンパク質含有量の定量を行うためのコンピュータプログラムも提供されている。
【０００８】
また、本発明のさらなる実施形態においては、生体材料の試料中の上述のＥＭＰＡＩに基づいてタンパク質含有量の定量を行うための解析用装置も提供されている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述の目的を達成するため、本発明は、生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うための方法であって、（ａ）質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するステップと；（ｂ）前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するステップと；（ｃ）タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するステップと；（ｄ）ＥＭＰＡＩを得るために、ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
という式により計算するステップと、を含む方法を提供する。
【００１０】
本発明に係る方法の１つの好ましい態様においては、該方法は、
【数１】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質のＥＭＰＡＩ値の総和を表す。
【００１１】
本発明に係る方法のもう１つの好ましい態様においては、該方法は、
【数２】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす。
【００１２】
本発明に係る方法のさらなる好ましい態様においては、質量分析法は、液体クロマトグラフィ質量分析法を含む。
【００１３】
また、本発明は、生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うためのコンピュータプログラム製品であって、（ａ）質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するステップと；（ｂ）前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するステップと；（ｃ）タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するステップと；（ｄ） ＥＭＰＡＩを得るために、ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
という式により計算するステップと、を実行するため、記録媒体上に保存されたコンピュータプログラムを有するコンピュータ読取り可能な記憶媒体を含む、コンピュータプログラム製品を提供する。
【００１４】
本発明に係るコンピュータプログラム製品の１つの好ましい態様においては、該プログラムは、
【数３】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である。
【００１５】
本発明に係るコンピュータプログラム製品のもう１つの好ましい態様においては、該プログラムは、
【数４】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の前記総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす。
【００１６】
本発明に係るコンピュータプログラム製品のさらなる態様においては、製品は、コンピュータにより読取ることのできるコンピュータ読取り可能記録媒体である。
【００１７】
さらに、本発明は、生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うコンピュータプログラムであって、（ａ）質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するステップと；（ｂ）前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するステップと；（ｃ）タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するステップと；（ｄ）ＥＭＰＡＩを得るために、ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
という式により計算するステップ、を実施するステップを含むプログラムを提供する。
【００１８】
本発明に係るコンピュータプログラムの態様においては、該プログラムは、
【数５】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である。
【００１９】
本発明に係るコンピュータプログラムのもう１つの態様では、該プログラムは、
【数６】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす。
【００２０】
本発明に係るコンピュータプログラムは、このプログラムが本発明によるタンパク質含有量の定量化方法のそれぞれのステップをコンピュータによって実施させることを特徴としている。また、該コンピュータプログラムは、該プログラムが記憶される記憶媒体の形でも提供され得、かつ、インターネットといったような伝送媒体を介して供給され得る。
【００２１】
さらに、本発明は、生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うための解析用装置であって、質量分析法により得られたタンパク質の質量分析データに関する情報を受信し、質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するための同定手段と；前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するための測定手段と；タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するための算出手段と；ＥＭＰＡＩを得るために、ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１という式により計算するための計算手段と、を備える解析用装置を提供する。
【００２２】
本発明に係る解析用装置の一の態様においては、該計算手段は、
【数７】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である。
【００２３】
本発明に係る解析用装置の一の態様においては、該計算手段は、
【数８】
によりＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす。
【００２４】
本発明に係る解析用装置のさらなる態様においては、質量分析法は、液体クロマトグラフィ質量分析法を含んでいる。
【００２５】
本発明の１つの利点は、絶対的タンパク質発現量のための尺度、すなわち指数関数的に修正されたタンパク質発現指標が確立され、これがプロテオミクスにおけるタンパク質含有量の絶対定量のために使用できるという点にある。
【００２６】
本発明の上述の目的及び特徴は、添付図面を参考にして好ましい実施形態についての以下の記述からより明らかになることであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、タンパク質含有量の定量を行うための方法及び該方法を実施するためのコンピュータプログラムを含めた実施例を用いて詳細に説明される。
【００２８】
図１は、本発明のＬＣ−ＭＳによる上述のＥＭＰＡＩに基づいたタンパク質含有量の定量を実施するコンピュータのためのハードウェア構造の図面を示す。本発明によるＥＭＰＡＩに基づくタンパク質含有量の定量を行うための解析用装置１０は、全てＣＰＵ１２とバス２４を介して相互接続されている、中央処理ユニット１２（以下「ＣＰＵ」と略される）、メモリー１４、表示デバイス１６、ユーザーインターフェース１８及び通信インターフェース２２を備える。装置１０は、外部記憶媒体駆動ユニット２０に接続されたＣＤ−ＲＯＭ又は磁気媒体といったような外部記憶装置（図１には例示せず）をさらに備える。装置１０は、通信インターフェース２２を通してＮＣＢＩｎｒ（ｈｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｈ．ｇｏｖ／）などのような外部データベースに接続可能である。また、装置１０は、タンパク質の分析を実施する通信インターフェース２２を介して質量分析装置にも接続可能である。
【００２９】
図２は、本発明によるＥＭＰＡＩに基づくタンパク質含有量の定量を行うための解析用装置１０の構成を説明するのに用いられるブロック図を示す。図２に示されているように、装置１０は、ＩＦ（インターフェース）手段３０と制御手段４０を含む。装置１０は、これらの手段３０，４０が、この装置を利用するユーザー及び／又は質量分析法からの質量分析データといった入力を受け、ユーザー及び／又は質量分析法へと情報を出力するような形で構築されている。通常のパーソナルコンピュータを該装置１０として使用することができる。質量分析データの例としては、質量スペクトル、質量クロマトグラム及びＭＳＭＳデータなどが含まれる。
【００３０】
ＩＦ手段３０は、情報をキーボード、質量分析法などといった入力デバイス及びディスプレイ、プリンタなどといった出力デバイスとの関係において入力及び出力できるような形で構築されている。ＩＦ手段３０を介して、解析すべき質量分析データは制御手段４０へと伝送される。
【００３１】
制御手段４０は、同定手段４２、測定手段４４、計算手段４６及び計算手段４８を備える。本発明においては、同定手段４２は、ＩＦ手段３０を介してタンパク質の質量分析データに関する情報を受信でき、質量分析法により定量されるべきタンパク質を同定する。次に、質量分析データに基づいて、測定手段４４は同定手段４２により同定された該タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定する。一方で、定量化すべきタンパク質の同定に基づいて、算出手段４６は、タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数を計算する（Ｎobsbl）。ここで、「タンパク質あたりの検出されたペプチドの数」という用語は、質量分析法によって実際に検出された定量化すべき１タンパク質あたりのペプチド数を意味する。「タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数」という用語は、ここでは該タンパク質あたりの理論的ペプチド数を意味する。なお、これらの数は、文書［１７］中で定義されている。
【００３２】
本発明に係る方法では、Ｎobsd及びＮobsbl値に基づいて、Ｎobsd及びＮobsblに関する情報を受ける計算手段４８は、ＥＭＰＡＩを得るために、以下の式によりＥＭＰＡＩを算出する：
ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
【００３３】
その結果、本発明によれば、タンパク質含有量を決定するために、指数関数的に修正されたタンパク質発現量指標（「ＥＭＰＡＩ」）がタンパク質混合物中のタンパク質含有量に対して比例することが立証される。
【００３４】
さらに、計算手段４８は、以下の２つの式により、タンパク質含有量（モル％）とタンパク質含有量（重量％）を算出する。
【数９】
【数１０】
なお、式中、Σ（ＥＭＰＡＩ）は全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和であり、ＭＷは同定された各タンパク質の分子量を表わしている。
【００３５】
必要に応じて、図２に示されていないメモリー手段内に計算された及び／又は算出されたデータを記憶することができる。
【００３６】
図３は、本発明によるＥＭＰＡＩに基づくタンパク質含有量の定量を行うためのフローチャートを示す。ステップＳ１０では、ＭＳ方法により生体材料の試料の質量分析法を実施した後、同定手段４２により対象とするタンパク質が同定される。このＭＳ方法には、ペプチドマスフィンガープリント法及びＭＳ／ＭＳ方法が含まれる。当業者であれば、以下の文書（その全体が参照により援用されている、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９３年、第９０号、５０１１−５０１５頁；Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１９９３年、第３号、３２７−３３２頁；Ｂｉｏｌ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９３年、第２２号、３３８−３４５頁；Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９８年、第２０号、４６−５０頁；Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９８年、第１４１号、９６７−９７７頁；Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０００年、第１４８号、６３５−６５１頁；Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、第４１５号、１４１−１４７頁；Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、第４１５号、１８０−１８３頁；Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００３年、第１５号、１９９−２０５頁；Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００３年、第７号、２１−２７頁）で開示されていることから容易に理解できる。次のステップＳ１１では、上記で同定されたタンパク質あたりの検出されたペプチドの数は、ＭＳデータを用いることで測定手段４４によって測定される。その後、タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数は、（ステップＳ１２に示されているように）上記で同定されたタンパク質の構造に基づいて算出手段４６により算出される。該タンパク質あたりの検出されたペプチドの測定に先立ちタンパク質あたりの検出されうるペプチドの数を計算することが可能である。
【００３７】
図４は、本発明で使用される該タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数を算出するためのフローチャートの一の実施例を示す。ステップＳ１２１では、質量範囲は、検出されたペプチド及び質量分析計のスキャン範囲を用いることにより決定される。次のステップＳ１２２では、各々の検出されたペプチド内の予測された保持時間は、ミーク（Ｍｅｅｋ）式（文献［２３］で記述されている通り）に基づいて算出される。なお、各検出されたペプチドのアミノ酸配列を、例えばＭＳ／ＭＳ方法によって決定することができ、ミーク式に従って既知のアミノ酸配列と液体クロマトグラフィ内の保持時間との間には関係が存在するという点に留意されたい。このとき、ステップＳ１２３において、予測された保持時間範囲は、上述のミーク式に基づいて検出されたペプチドの保持時間を用いることによって決定される。このとき、トリプシンにより完全消化されたペプチドは、コンピュータ内で算出される（ステップＳ１２４中）。より具体的には、トリプシンは、ペプチド結合をタンパク質中のリジン残基及びアルギニン残基のカルボキシル側で選択的に切断可能な有名なプロテアーゼであることから、トリプシンにより完全消化されたペプチドのアミノ酸配列が決定されている。かくして、このステップＳ１２４では、トリプシン消化されたペプチドの分子量（ＭＷ）及び予測保持時間がコンピュータ内で算出される。次のステップＳ１２５では、ＭＷ及び予測保持時間に従って検出されうるペプチドが分類される。最後に、ステップＳ１２６で、検出されうるペプチドのＭＷ及び予測保持時間が共に質量範囲（Ｓ１２１内）及び保持時間範囲（Ｓ１２３内）内に入ることを基礎として、タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数が計数される。
【００３８】
なお、本発明においては、図４のフローチャートに従って実施される検出されうるペプチドの数の算出に制限は全くないという点に留意すべきである。
【００３９】
タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）及びタンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）の数を使用することにより、以下の通り、算出手段４８によりＥＭＰＡＩが算出される（ステップＳ１３中）。
ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
【００４０】
ＥＭＰＡＩの値を用いて、モル及び重量百分率でのタンパク質含有量が以下のように表わされる：
【数１１】
【数１２】
なお、式中、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量であり、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である（ステップ１４及び１５に示されている通りである。）。
【００４１】
以上で説明されている図３中に例示されたタンパク質含有量の解析の流れを実行するプログラムが、外部記憶媒体駆動ユニット２０を介して外部記憶装置又はメモリー１４内に記憶される、又はプログラムがＣＤ−ＲＯＭといったような外部記憶媒体内に記憶されている場合にはＣＰＵ１２まで直接転送される。
【００４２】
なお、本発明による定量に先立ち、該タンパク質は通信インターフェース２２を通して、ＮＣＢＩｎｒデータベースといったような外部データベースを参照することにより同定されることに留意すべきである。必要に応じて、表示デバイス１６はユーザーインターフェース１８を介して本発明による定量の結果を表示する。
【００４３】
このようにして、本発明は、ＥＭＰＡＩに基づいてタンパク質含有量の定量を行うための方法及びこの方法を実施するためのコンピュータプログラムを提供する。
【００４４】
以下では、本発明の態様による典型的実施例に関して記するが、本発明の範囲はこれらに制限されるようには意図されていない。
【実施例】
【００４５】
材料及び方法
細胞溶解物の調製
オング（Ｏｎｇ）ら［文献４］のＳＩＬＡＣプロトコルに従って、13Ｃ6−Ｌｅｕ（ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａｎｄｏｖｅｒ、マサチューセッツ州）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ニューヨーク州）を調製した。この培地内での13Ｃ6−Ｌｅｕ標識のため、マウス神経芽細胞腫ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を培養した。プロテアーゼ阻害物質カクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｂａｓｅｌ、スイス）を添加し、超音波処理を用いて全タンパク質を溶解させた。説明されている通り［文献１０］、正常なＲＰＭＩ１６４０培地の中でＨＣＴ１１６−Ｃ９細胞を成長させた。プロテアーゼ阻害物質と５ｍＭのジチオトレイトールを含む５ｍＬのＭ−ＰＥＲ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州、米国）で全タンパク質を抽出した。
【００４６】
ＬＣＭＳＭＳのためのペプチド混合物の調製
細胞からのタンパク質を吸引乾燥させ、８Ｍの尿素を含有する５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）により再懸濁させた。これらの混合物を説明されている通り［文献６］、その後減量させ、アルキル化させ、Ｌｙｓ−Ｃ（和光（Ｗａｋｏ）、大阪、日本）及びトリプシン（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州、米国））により消化させた。消化された溶液をＴＦＡで酸性化させ、脱塩し、Ｅｍｐｏｒｅ Ｃ１８ディスク（３Ｍ、ミネソタ州、米国）で完全自動計器（日京テクノス（Ｎｉｋｋｙｏ Ｔｅｃｈｎｏｓ）、東京、日本）により調製されたＣ１８−ステージ Ｔｉｐｓ［文献２１］で濃縮させた。少なくとも１つのロイシン及び１つのチロシンを含有するペプチド合成用候補を、ｎｅｕｒｏ ２ａ細胞中で発現されるタンパク質からのトリプシンペプチドの配列を考慮に入れて選択した。試料調製中の酸化の問題を回避するため、メチオニン及びトリプトファンを含有するペプチドを除去した。さらに、トリプシンによる頻繁な切断ミスを考慮して、二重塩基性残基を伴うペプチドを除去した。選択された５４のペプチドは、Ｆ−ｍｏｃ化学で島津（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ＰＳＳＭ−８（京都、日本）を用いて合成し、分取ＨＰＬＣで精製させた。純度及び構造解明のためにアミノ酸分析、ペプチド質量測定及びＨＰＬＣ−ＵＶを実施した。ｎｅｕｒｏ ２ａ細胞からのペプチド混合物に対し異なる量のこれらのペプチドを添加し、上述のとおりのステージ Ｔｉｐにより精製した。
【００４７】
ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
ＱＳＴＡＲパルサーＩ（ＡＢＩ／ＭＤＳ−シーエックス（Ｓｃｉｅｘ）、Ｔｏｒｏｎｔｏ、カナダ）又はＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ１０勾配ポンプを備えたＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ Ａｄｖａｎｔａｇｅ（サーモエレクトロン（Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ）、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州、米国）、及び１５０μｍの流路系を有するＶａｌｃｏ Ｃ２バルブを取付けるＨＴＣ−ＰＡＬオートサンプラー（ＣＴＣアナリティックス（Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）ＡＧ、Ｚｗｉｎｇｅｎ、スイス）を用いて、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって全ての試料を分析した。「Ｓｔｏｎｅ ａｒｃｈ」フリットで分析カラム用針を調製するべく、窒素加圧型カラムローダーセル（日京）を伴う自動引抜き針（内径１００μｍ、開口６μｍ、長さ１５０ｍｍ）の中に、Ｒｅｐｒｏ Ｓｉｌ Ｃ１８材料（３μｍ、マイシュ博士（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ）、Ａｍｍｅｒｂｕｃｈ、ドイツ）を詰め込んだ［文献２２］。Ｐｒｏｘｅｏｎ ｘ−ｙ−ｚナノスプレーインターフェース（Ｏｄｅｎｓｅ、デンマーク））上にテフロンコーティングの施されたカラムホルダー（日京）を取付け、カラム針を保持しかつ適切なスプレー位置を調整するために磁石付きのＶａｌｃｏ金属コネクタを使用した。注射体積は３μＬであり、流量はティースプリッタの後２５０ｎＬ／分であった。移動相は、（Ａ）０．５％の酢酸及び（Ｂ）０．５％の酢酸及び８０％のアセトニトリルで構成されていた。この研究を通して、５分で５％Ｂ〜１０％、６０分で１０％〜３０％、５分で３０％〜１００％、そして１０分で１００％という３段階線形勾配を利用した。説明されている通り［文献２２］、金属コネクタを介して２４００Ｖのスプレー電圧を印加した。より速い走査モードを伴うＱＳＴＡＲについては、３つの強いピークを選択するために１秒間ＭＳ走査を実施し、各々０．５５秒間ずつ、後続する３回のＭＳＭＳ走査を実施した。以前に走査された親イオンを排除するため、情報依存性捕捉（ＩＤＡ）機能が３分間活動状態にあった。より低速の走査モードについては、１回のＭＳ走査（１秒）あたり４回のＭＳＭＳ走査（各１．５秒）が実施された。ＬＣＱについては、１回のＭＳ走査につき２回のＭＳＭＳ走査がＡＧＣモードで実施された。平均走査サイクルはそれぞれ、１回のＭＳについて１．１９秒、１回のＭＳＭＳについては１．１７秒であった。走査範囲は、ＱＳＴＡＲ及びＬＣＱの両方についてｍ／ｚ３００−１４００であった。
【００４８】
ＤＡＴＡ分析
ＬＣＱ及びＱＳＴＡＲの両方の生データファイルから全てのピークを抽出するために、特注のＳｐｉｃｅと呼ばれるソフトウェア（三井情報開発（Ｍｉｔｓｕｉ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）、東京、日本）を使用し、結果のピークファイルを、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔタンパク質データベースに対するタンパク質同定のためにＭａｓｃｏｔ ｖｅｒｌ．９データベースサーチエンジン（その全体が本明細書に参照により援用されているマトリックスサイエンス（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｌｏｎｄｏｎ、英国；Ｄ．Ｍ．パーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）、Ｄ．Ｊ．パピン（Ｐａｐｐｉｎ）、Ｄ．Ｍ．クリーシー（Ｃｒｅａｓｙ）、Ｊ．Ｓ．コットレル（Ｃｏｔｔｒｅｌｌ）、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ第２０号（１９９９年）、３５５１頁）に提出した。許容できる不完全消化部位の数は１に設定され、同一性を標示するためのペプチドスコアが、ＭＳＭＳスペクトルの手作業検査無しでペプチド同定のために使用された。ｈｔｔｐ：／／ｍｓｑｕａｎｔ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／からＭＳＱｕａｎｔ ｖｅｒ１．４ａをダウンロードし、合成ペプチドの既知の量を用いてタンパク質の絶対濃度についてクロマトグラム中のイオン計数を判定する目的で13Ｃ6Ｌｅｕ ＳＩＬＡＣについてそれをカスタマイズした。
【００４９】
タンパク質発現量の決定
タンパク質あたりの検出されうるペプチド数を算出するため、タンパク質をコンピュータ内で消化させ、得られたペプチドを質量分析計の測定走査範囲と比較した。さらに、発明者らのナノＬＣ条件下での保持時間は、約３０００個のペプチドに基づいて発明者ら独自の係数でミーク［文献２３］及びサカモトら［文献２４］による手順に従って算出し、過度の親水性又は疎水性をもつペプチドは除去した。ペプチド数を算出するために以下の等式（１）〜（４）に基づいた組織内ＰＨＰプログラムを書き、これを用いてＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌに全てのデータを送り出した。タンパク質あたりの検出されたペプチド数に関しては、（１）ユニーク親イオンを計数すること、（２）ユニーク配列を計数すること及び（３）不完全消化によって引き起こされる部分的修正及び重複無くユニーク配列を計数すること、といったような３つの計数方法を利用した。ＭＳＱｕａｎｔの「全ペプチドのエクスポート（Ｅｘｐｏｒｔ Ａｌｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」機能を用いてＭａｓｃｏｔ ｈｔｍｌファイルからＥｘｃｅｌスプレッドシートまでこれらの数を送り出した。
【００５０】
ＰＡＩが、式中Ｎobsd及びＮobsblがそれぞれタンパク質あたりの検出されたペプチド数及びタンパク質あたりの検出されうるペプチド数であるものとして
【数１３】
として定義される［文献１７］。次いで、ＥＭＰＡＩが、
ＥＭＰＡＩ＝１０PAI−１ （２）
として定義される。
【００５１】
かくして、モル及び重量百分率でのタンパク質含有量は、
【数１４】
（３）
【数１５】
として記述され、ここで、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量であり、ΣＥＭＰＡＩは全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である。
【００５２】
ＤＮＡマイクロアレイ分析
１０ｍＬの培地を有する直径１０ｃｍの皿の中で１皿あたり５．０×１０6細胞の割合で、ＨＣＴ１１６−Ｃ９細胞を平板固定した。２４時間のプレインキュベーションの後、細胞を０．０１５％のＤＭＳＯで１２時間処理した。確立されたプロトコルに従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨｕＧｅｎｅ ＦＬアレイを用いてデュプリケート実験を実施した。遺伝子シグナル強度を抽出するためにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐソウトウェアを用い、遺伝子記号に基づいて２つのデータセットを分類し平均をとった。
【００５３】
異なる濃度を有する単一のタンパク質からの同定されたタンパク質の数
ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより異なる量のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）トリプシンペプチドを分析し、同定されたペプチドの数を計数した。図５Ａに示されているように、ピーク面積及び同定されたペプチド数の両方共が、注入量の増加につれて増大したが、より高いＨＳＡ濃度で両方の曲線共飽和した。しかしながら、ピーク面積が線形である領域においてさえ、ペプチド数はタンパク質量に対し線形関係をもたない。興味深いことに、ペプチド数は、３ｆｍｏｌ〜５００ｆｍｏｌの注入量の対数に対し線形関係を示す（図５Ｂ）。より低速の走査を伴うＬＣＱから同じデータを得た。このことは、すなわち、各ピークが時間的に充分分離しており、より低速の走査により引き起こされる「ランダムサンプリング」の影響がこの条件下で起こらなかったということを意味している。この場合、ペプチドを計数するために、３つの方法、すなわち（１）同じペプチド配列からの異なる電荷状態を含む全ての親イオン、（２）メチオニン酸化といったような部分的修正、異なる電荷状態を除く全てのペプチド、（３）不完全消化により重複したペプチドを除く冗長性のない配列を伴うペプチド、が用いられた。これらのうち、異なる親イオン数に基づくペプチド数は、タンパク質発現量の対数に対して最高の相関関係を提供する。結果は特定の条件の下でのものではなくより一般的な現象であると考えられている。最近、２つの独立したグループがペプチド数とタンパク質濃度との間の類似した曲線を提示した。その両方共がタンパク質の対数を分析していなかったが、発明者の結果によれば、それらのデータからも同様にタンパク質濃度の対数とペプチド数との間の線形関係が観察された。タンパク質濃度の対数が何故消化されたペプチド数と相関関係を有するかは明らかでないが、それは化学ポテンシャルが濃度対数と比例し、ペプチドのイオン化に必要なエネルギーが化学ポテンシャルの増大に伴って線形的に増大するという事実により説明されるであろう。
【００５４】
複合度の高い混合物溶液中の４７のタンパク質のＰＡＩ
次に、本発明者は、全細胞溶解物中で量が既知である５４のタンパク質について調査した。13Ｃ6−Ｌｅｕで標識されたマウス神経芽細胞腫ｎｅｕｒｏ ２ａ細胞からのトリプシンペプチドを、ＱＳＴＡＲを用いて実行された単一のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定し、３３６のタンパク質を１４６２個のペプチドに基づいて同定した。本発明者は、12Ｃ6−Ｌｅｕを含有する５４の合成ペプチドをこの試料溶液に添加し、13Ｃ6−Ｌｅｕを含有する対応するトリプシンペプチドを定量した。抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ）内で重複したピークを提供したことから、７個のペプチドは定量されなかった。その結果、分子量で１３Ｋ−２２９ＫＤａの４７個のタンパク質が、表１Ａ及び１Ｂに列挙されている通り試料溶液中３０ｆｍｏｌ〜１．８ｐｍｏｌ／μＬの範囲内で定量された。
【００５５】
【表１Ａ】
【００５６】
【表１Ｂ】
【００５７】
この場合、２つの付加的な因子を考慮に入れるべきである。１つはペプチド数に対するタンパク質のサイズの影響である。一般にタンパク質が大きくなればなるほどより多くの検出可能なペプチドが生成される。したがって、保持時間に関する付加的な基準を除いて前述のとおりに、正規化のために検出されうるペプチドを使用した。この場合、多大な数のペプチドが試料中に存在していた。よって、検出されたペプチドの数は或る程度、イオン化抑制効果並びにＭＳＭＳ事象についてのランダム選択により影響されることになると思われた。図６Ａは、異なるタンパク質が１つのグラフにプロットされた場合でさえ、タンパク質あたりの検出されうるペプチド数によって正規化された検出されたペプチドの数とｌｏｇ［タンパク質］との間には同様に線形関係が存在するということを示している。Ｍａｓｃｏｔスコア及びペプチド数といったようなその他のパラメータは、タンパク質発現量と充分な相関関係をもたず、ペプチド数をタンパク質の分子量で除したものは、図６Ｂ−Ｄに示されているように、タンパク質含有量の対数に対する適度な相関関係を提供している。
【００５８】
この場合、本発明者は、バックグラウンドの影響を最小限におさえるためＱＳＴＡＲの最高のＭＳＭＳ走査速度を使用した。より低い走査速度が使用された場合、相関関係は低減させられた（ｒ＝０．９０から０．８１へ）。例えば、図７Ａを参照してみる。この効果は、イオントラップ計器が使用された場合により顕著であった（ｒ＝０．７７）。これは、トラップ能力の量の制限がより発現量が多いタンパク質についてのより偏向したピーク選択を引き起こすことに起因すると思われ、実際図７Ｂにおいてタンパク質発現量が多くなればより大きな偏差がみられた。走査がさらに速くより能力の高い線形イオントラップの最近の開発が、より高速の走査モードを伴うＱＳＴＡＲに対して類似の結果を提供することになると思われる。
【００５９】
さらに、試料の複合性の影響は、ＬＣ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ［文献２５］及びＧｅＬ ＣＭＳ（ゲル増強ＬＣ−ＭＳ、１Ｄ−ゲルとそれに続くスライシング、消化及びＬＣＭＣ分析）アプローチ［文献１５］といったようなＭＳＭＳ分析に先立ち、多次元分離を用いることによって最小限になると思われる。
【００６０】
ＥＭＰＡＩ計算の実施例
ＥＭＰＡＩ値を算出するための全プロトコルは以下の通りである：
（１） ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施する；
（２） Ｍａｓｃｏｔといったようなサーチエンジンを用いてタンパク質を同定する；
（３） タンパク質あたりのユニーク親イオン数を抽出する；
（４） タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数を計数する；及び
（５） （３）及び（４）を用いてＥＭＰＡＩ値を算出する。
【００６１】
以下に記すのは、表２中の１つの標準的な実施例を使用することによるＥＭＰＡＩ算出の実施例である。
【００６２】
【表２】
【００６３】
（３） 検出されたユニーク親イオンの抽出；
上述のプロトコル（１）及び（２）に従って、検出されたユニーク親イオンの抽出を実施した。上述の抽出の結果は、表３中で集計されている。Ｍａｓｃｏｔスコアの結果に基づいて、表３中の「諾否（Ａｃｃｅｐｔ ｏｒ ｎｏｔ）」の欄では、「Ｙｅｓ（はい）」という語は抽出が実施されることを意味し、「Ｎｏ（いいえ）」という語は検出された親イオンが、小さなＭａｓｃｏｔスコアに起因して抽出されなかったことを意味している。
【００６４】
【表３】
【００６５】
（４） タンパク質あたりの検出されうるペプチド数の計数
図４で上述した通り、この算出は以下のステップ１〜６に従って実施された。
【００６６】
ステップ１（図４中のＳ１２１を参照のこと）： 検出されたペプチド及び質量分析の走査範囲を用いた質量範囲の決定。このステップは、ペプチドの実際の観察された質量分析法、すなわち検出されたペプチド及び質量分析の走査範囲を使用することによって実施された。
【００６７】
ステップ２（図４中のＳ１２２を参照のこと）： ミークの式に基づく各々の検出されたペプチドの中の予測された保持時間の算出；図４のＳ１２２で説明されているように、各々の検出されたペプチドのアミノ酸配列は一般にＭＳ／ＭＳ方法により決定可能であることがわかっているため、検出されたペプチドの保持時間を、既知のアミノ酸配列と保持時間との間の関係が存在するミークの式に従って算出することができた。
【００６８】
ステップ３（図４中のＳ１２３を参照のこと）： 検出されたペプチドを用いた保持時間範囲の決定；同様に、このステップはミークの式を使用して実施された。
【００６９】
ステップ４（図４中のＳ１２４を参照のこと）： コンピュータ内でのトリプシンにより完全消化されたペプチドの算出；図４のＳ１２４中で記されているように、トリプシン消化されたペプチドの分子量（ＭＷ）及び予測保持時間は、コンピュータ内でトリプシン判定された消化されたペプチドのアミノ酸配列から算出可能であった。
【００７０】
ステップ５（図４中のＳ１２５を参照のこと）： 検出されうるペプチドは、Ｓ１２４の結果を使用してＭＷ及び予測保持時間に従って選別された。
【００７１】
ステップ６（図４中のＳ１２６を参照のこと）： タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数は、検出されうるペプチドのＭＷ及び予測保持時間が共に質量範囲（ステップ１２１）及び予測保持時間（ステップ１２３）内に入ることを基礎として計数された。
【００７２】
表２中の試料を用いた結果に従って、表４にあるように、質量範囲及び保持時間範囲を決定した。
【００７３】
【表４】
【００７４】
上述の計数の結果は表４に集計されている。コンピュータ内での検出されうるペプチドの算出の結果に基づいて、表２中の「諾否」の欄では、「はい」という語は、検出されうるペプチドが質量範囲及び保持時間範囲の両方に入ることを意味し、「いいえ」という語は、検出されうるペプチドが質量範囲又は保持時間範囲のいずれかの外にあることを意味する。
【００７５】
（５） （３）及び（４）を用いたＥＭＰＡＩ値の算出
以上の式（１）及び（２）に従って、上述の（３）及び（４）の結果を使用することによってＥＭＰＡＩを算出した。ＥＭＰＡＩの結果は、表５に集計されている。表５から明らかなように、表２中の試料を用いたＥＭＰＡＩの値は８．３４５であった。
【００７６】
【表５】
【００７７】
ＥＭＰＡＩを用いた絶対定量
ＰＡＩはタンパク質間の発現量関係を推定することができるものの、モル分率を直接表現することはできない。したがって、本発明者は、式（２）としてタンパク質発現量の決定のセクションで説明した通り、図８は示されているようなタンパク質含有量に正比例する新しいパラメータＥＭＰＡＩをＰＡＩから導出した。絶対濃度を算出するために、ＢＣＡ検定により重量単位で合計タンパク質量を測定し、３３６のｎｅｕｒｏ２ａタンパク質の中の４７のタンパク質の重量分率を、式（４）を用いて算出した。図９に示されているように、ＥＭＰＡＩベースの濃度は、実際値（ｙ＝０．９７ｘ、ｒ＝０．９３）ときわめて一貫性をもつものであり、実際値に対する偏差百分率は３％〜２６０％の範囲にあり、平均は６３％であった。本発明者は合計タンパク質量についてＢＣＡ検定を使用したことから、これらの値は容易に変更された。にもかかわらず、このＥＭＰＡＩアプローチは、包括的絶対定量のためのきわめて正確な指標を提供する。
【００７８】
包括的タンパク質発現分析に対する適用
ＰＡＩは、ただ１回のＬＣＭＳＭＳの実行からタンパク質発現データを生成するのに実に便利である。本発明者は、ＨＣＴ１１６ヒト癌細胞中の遺伝子発現とそれを比較するためにこのアプローチを適用する。ＤＮＡマイクロアレイは４９７１個の遺伝子の発現データを提供し、一方、単一回のＬＣＭＳ実行はユニーク配列をもつ１８１１のペプチドに基づき４０２個の同定されたタンパク質を提供した。遺伝子記号とタンパク質登録番号を橋かけすることで、発現比較研究のために利用される合計２２７の遺伝子／タンパク質が結果としてもたらされた。予測通り、酵母についての以前の研究から予想されるようなわずかな相関関係が観察された［文献１８，２６］。興味深いことに、外れ値の大部分がリポソームタンパク質であった（図１０参照）。Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）といったような原核生物とは異なり、哺乳動物細胞が転写によってのみならずｍＲＮＡの輸送、翻訳及びｒＲＮＡと未会合の過剰量のタンパク質の分解によってもリポソームタンパク質の発現レベルを調節できるということは周知である［文献２７，２８］。また、本発明者は、Ｅ．ｃｏｌｉについて、ＥＭＰＡＩを用いて遺伝子とタンパク質発現との間の比較研究を行なったが、リポソームタンパク質のこのような偏差を発見しなかった［文献２９］。遺伝子及びタンパク質の発現データに両方共、例えば１０％の差を弁別するほどに正確ではないが、それは以上で示されたような簡単な概要を得るためにはきわめて有用である。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
産業上の利用可能性
本発明によれば、ＥＭＰＡＩと命名された絶対タンパク質発現量のための尺度が確立される。ＥＭＰＡＩは、Ｍａｓｃｏｔといったようなデータベースサーチエンジンの出力情報から容易に算出されることから、いかなる付加的なステップも無く定量的情報を追加するために、以前に測定された又は公表されたデータセットにこのアプローチを適用することが可能である。また、ＥＭＰＡＩは、特に比率の正確な測定には定量的変化が大きすぎること、代謝標識が不可能であること、又は感受性の制約のため化学的標識技術が許容されないことを理由として同位元素ベースのアプローチを適用できない場合において、相対的定量のためにも使用可能である。このような場合には、１つの試料中のタンパク質のＥＭＰＡＩ値は、もう１つの試料中のものと比較でき、２つの試料間のＥＭＰＡＩ相関関係からの外れ値を、増大する又は減少するタンパク質として判定することができる。
【００８０】
このＥＭＰＡＩアプローチは、１つのタンパク質から同定されるペプチド数を増やすために多次元分離−ＭＳＭＳに適用され得る。ｍ／ｚ領域に対するイオン化依存性といったようなＭＳ計器依存性パラメータを考慮するために、さらなる改善も可能であると思われる。ＥＭＰＡＩ指標は単純なスクリプトで算出できタンパク質同定実験におけるさらなる実験を必要としないことから、発明者らはプロテオミクス結果の報告におけるその日常的使用を提案する。
【００８１】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００８２】
本発明の目的及び特徴が、添付図面を参照するとともに、好ましい実施形態の説明から明らかである。
【図１】本発明による前記ＥＭＰＡＩに基づいてタンパク質含有量の定量を行うコンピュータのハードウェア構造の図面を示す。
【図２】本発明によるＥＭＰＡＩに基づいてタンパク質含有量の定量を行うための解析用装置の構成を例示するためのブロック図を示す。
【図３】本発明によるＥＭＰＡＩに基づいてタンパク質含有量の定量を行うためのフローチャートを示す。
【図４】タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数を計算するためのフローチャートの一の実施例を示す。
【図５】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の注入量に対するペプチド数及びピーク面積の依存性を例示している。図５Ａは、ピーク面積及びペプチドのユニーク親イオン数対（ＨＳＡ）の注入量の関係を示す。図５Ｂは、３つの異なるペプチド数とＨＳＡ注入量の関係を示す。
【図６】ｎｅｕｒｏ２ａ細胞中の４７個のタンパク質についての異なるパラメータとタンパク質濃度の関係を示す。図６Ａは、タンパク質濃度とＰＡＩの関係を示す。図６Ｂは、タンパク質濃度とペプチド数をタンパク質分子量で除したものの関係を示す。図６Ｃは、タンパク質濃度とＭａｓｃｏｔスコアの関係を示す。図６Ｄは、タンパク質濃度と検出されたペプチド（ユニーク親イオン）の数の関係を示す。
【図７】ＰＡＩとｌｏｇ［タンパク質］との間の線形関係に対するＭＳ測定条件の影響を示す。図７Ａは、より低速の走査を伴う飛行時間型の質量分析法（ＱＳＴＡＲ）を示す。図７Ｂは、より低速の走査を伴うイオントラップ型の質量分析法（ＬＣＱ）を示す。
【図８】ｎｅｕｒｏ２ａ細胞中の４７のタンパク質についてのタンパク質濃度とＥＭＰＡＩとの間の関係を示す。
【図９】本発明によるＥＭＰＡＩを用いたｎｅｕｒｏ２ａ中の４７のタンパク質の絶対定量の結果を示す。
【図１０】本発明の一の実施形態によるＨＣＴ１１６細胞中の遺伝子とタンパク質発現との間の比較を示す。
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般的には、質量分析法を用いたタンパク質含有量の解析に関し、より具体的には、プロテオミクスにおいて質量分析法によるタンパク質発現指標に基づいてタンパク質含有量の定量を行うための方法及びコンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
今日ゲノム注釈付きデータベースと組合わされているプロテオーム液体クロマトグラフィ質量分析法（以下、「ＬＣ−ＭＳ」という。）アプローチは、１つのタンパク質混合物溶液から何千ものタンパク質を同定できるようにする［文献１］。これらのアプローチは、安定した同位元素標識を用いた相対的定量に対しても同様に適用されてきた［文献２−４］。近年になって、２つの状態の間の包括的な定量研究のみならず［文献５、６］、タンパク質−タンパク質間［文献７、８］、タンパク質−ペプチド間［文献９］及びタンパク質−薬物間［文献１０］の相互作用分析も広範に報告されてきている。しかしながら、これまでのところ、１つの試料溶液中のタンパク質濃度についての包括的なアプローチは、なおも確立されていなかった。細胞タンパク質の反応速度論／力学論は特定の領域内でのタンパク質の濃度の変化として記述されることから、タンパク質濃度は定量プロテオミクスにおいて最も基本的かつ重要なパラメータの１つである。さらに、濃度差が大き過ぎて同位体に基づく相対的定量を実施できない場合でも、２つの試料間の相対的定量のためにも試料中のタンパク質濃度を使用することができる。これまで同位体標識された合成ペプチドは、問題の特定のタンパク質の絶対定量のための内部標準として使用されてきた［文献１１、１２］。このアプローチは、包括的な解析に適用可能であるが、同位体標識されたペプチドのコスト及びゲル内でタンパク質の定量的消化を行なうことの困難さが問題となっている［文献１３］。
【０００３】
ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳの単一回の解析でさえ、データベース探索の助けを得ると、容易に長い同定されたタンパク質リストを生成し、同定におけるヒットランキング、確率評点、タンパク質あたりの同定済みペプチド数及び同定済みペプチドのイオン計数といったような付加的な情報が、生データを用いてこのリストから抽出される。定性的には、ヒットランク、評定及びタンパク質あたりのペプチド数［文献１４］といったような一部のパラメータが、解析対象の試料中のタンパク質発現量についての一種の指標となる。なかでも、ペプチドのイオン計数が、発現量を描写するための最も直接的なパラメータと思われ、異なる状態でのタンパク質発現のために使用された［文献１５］。しかしながら、検出器としての質量分析計は、制限された線形性及びバックグラウンドでのイオン化抑制効果に関して吸光度検出器ほど汎用性あるものではない［文献１６］。従って、信頼性ある定量的情報を得るためには、これらのパラメータを正規化する必要がある。この戦略に沿った第１のアプローチは、本発明者らが知るかぎり、タンパク質発現量指標（以下「ＰＡＩ」と呼ばれる）と命名され、ヒトスプライセオソーム複合体分析に適用された［文献１７］。相対的定量のためにはＬＣ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析におけるスペクトル計数及びペプチド数が使用されるという類似の概念が近年報告された［文献１８］。同様に、本発明者は、各タンパク質の平均イオン計数を算出するために少なくとも３つのペプチドが使用される正規化されたイオン計数ベースのアプローチも同様に開発した［文献１９］。このアプローチは、ペプチド相関関係プロファイリングにおける相対的定量のためにも使用されてきた［文献２０］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の開示
しかしながら、このアプローチの適用可能性は、それが正確さを保つために３つのペプチドを必要とすることを理由として、制限されていた。ここでは、本発明者はナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験からタンパク質発現量を判定するためにＰＡＩ戦略を検討している。
【０００５】
本発明の目的は、生体材料の試料中で指数関数的に修正されたＰＡＩ（以下、「ＥＭＰＡＩ」という。）に基づいてタンパク質含有量の定量を行うための方法を提供することにある。
【０００６】
本発明の一の実施形態においては、例えばコンピュータによって読取り可能でありかつ生体材料の試料中の上述のＥＭＰＡＩに基づいてタンパク質含有量の定量を行うためのコンピュータプログラムを記憶するコンピュータ読取り可能媒体といったようなコンピュータプログラム製品も提供されている。
【０００７】
本発明の別の実施形態においては、生体材料の試料中の上述のＥＭＰＡＩに基づいてタンパク質含有量の定量を行うためのコンピュータプログラムも提供されている。
【０００８】
また、本発明のさらなる実施形態においては、生体材料の試料中の上述のＥＭＰＡＩに基づいてタンパク質含有量の定量を行うための解析用装置も提供されている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述の目的を達成するため、本発明は、生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うための方法であって、（ａ）質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するステップと；（ｂ）前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するステップと；（ｃ）タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するステップと；（ｄ）ＥＭＰＡＩを得るために、ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
という式により計算するステップと、を含む方法を提供する。
【００１０】
本発明に係る方法の１つの好ましい態様においては、該方法は、
【数１】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質のＥＭＰＡＩ値の総和を表す。
【００１１】
本発明に係る方法のもう１つの好ましい態様においては、該方法は、
【数２】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす。
【００１２】
本発明に係る方法のさらなる好ましい態様においては、質量分析法は、液体クロマトグラフィ質量分析法を含む。
【００１３】
また、本発明は、生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うためのコンピュータプログラム製品であって、（ａ）質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するステップと；（ｂ）前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するステップと；（ｃ）タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するステップと；（ｄ） ＥＭＰＡＩを得るために、ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
という式により計算するステップと、を実行するため、記録媒体上に保存されたコンピュータプログラムを有するコンピュータ読取り可能な記憶媒体を含む、コンピュータプログラム製品を提供する。
【００１４】
本発明に係るコンピュータプログラム製品の１つの好ましい態様においては、該プログラムは、
【数３】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である。
【００１５】
本発明に係るコンピュータプログラム製品のもう１つの好ましい態様においては、該プログラムは、
【数４】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の前記総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす。
【００１６】
本発明に係るコンピュータプログラム製品のさらなる態様においては、製品は、コンピュータにより読取ることのできるコンピュータ読取り可能記録媒体である。
【００１７】
さらに、本発明は、生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うコンピュータプログラムであって、（ａ）質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するステップと；（ｂ）前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するステップと；（ｃ）タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するステップと；（ｄ）ＥＭＰＡＩを得るために、ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
という式により計算するステップ、を実施するステップを含むプログラムを提供する。
【００１８】
本発明に係るコンピュータプログラムの態様においては、該プログラムは、
【数５】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である。
【００１９】
本発明に係るコンピュータプログラムのもう１つの態様では、該プログラムは、
【数６】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす。
【００２０】
本発明に係るコンピュータプログラムは、このプログラムが本発明によるタンパク質含有量の定量化方法のそれぞれのステップをコンピュータによって実施させることを特徴としている。また、該コンピュータプログラムは、該プログラムが記憶される記憶媒体の形でも提供され得、かつ、インターネットといったような伝送媒体を介して供給され得る。
【００２１】
さらに、本発明は、生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うための解析用装置であって、質量分析法により得られたタンパク質の質量分析データに関する情報を受信し、質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するための同定手段と；前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するための測定手段と；タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するための算出手段と；ＥＭＰＡＩを得るために、ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１という式により計算するための計算手段と、を備える解析用装置を提供する。
【００２２】
本発明に係る解析用装置の一の態様においては、該計算手段は、
【数７】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である。
【００２３】
本発明に係る解析用装置の一の態様においては、該計算手段は、
【数８】
によりＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす。
【００２４】
本発明に係る解析用装置のさらなる態様においては、質量分析法は、液体クロマトグラフィ質量分析法を含んでいる。
【００２５】
本発明の１つの利点は、絶対的タンパク質発現量のための尺度、すなわち指数関数的に修正されたタンパク質発現指標が確立され、これがプロテオミクスにおけるタンパク質含有量の絶対定量のために使用できるという点にある。
【００２６】
本発明の上述の目的及び特徴は、添付図面を参考にして好ましい実施形態についての以下の記述からより明らかになることであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、タンパク質含有量の定量を行うための方法及び該方法を実施するためのコンピュータプログラムを含めた実施例を用いて詳細に説明される。
【００２８】
図１は、本発明のＬＣ−ＭＳによる上述のＥＭＰＡＩに基づいたタンパク質含有量の定量を実施するコンピュータのためのハードウェア構造の図面を示す。本発明によるＥＭＰＡＩに基づくタンパク質含有量の定量を行うための解析用装置１０は、全てＣＰＵ１２とバス２４を介して相互接続されている、中央処理ユニット１２（以下「ＣＰＵ」と略される）、メモリー１４、表示デバイス１６、ユーザーインターフェース１８及び通信インターフェース２２を備える。装置１０は、外部記憶媒体駆動ユニット２０に接続されたＣＤ−ＲＯＭ又は磁気媒体といったような外部記憶装置（図１には例示せず）をさらに備える。装置１０は、通信インターフェース２２を通してＮＣＢＩｎｒ（ｈｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｈ．ｇｏｖ／）などのような外部データベースに接続可能である。また、装置１０は、タンパク質の分析を実施する通信インターフェース２２を介して質量分析装置にも接続可能である。
【００２９】
図２は、本発明によるＥＭＰＡＩに基づくタンパク質含有量の定量を行うための解析用装置１０の構成を説明するのに用いられるブロック図を示す。図２に示されているように、装置１０は、ＩＦ（インターフェース）手段３０と制御手段４０を含む。装置１０は、これらの手段３０，４０が、この装置を利用するユーザー及び／又は質量分析法からの質量分析データといった入力を受け、ユーザー及び／又は質量分析法へと情報を出力するような形で構築されている。通常のパーソナルコンピュータを該装置１０として使用することができる。質量分析データの例としては、質量スペクトル、質量クロマトグラム及びＭＳＭＳデータなどが含まれる。
【００３０】
ＩＦ手段３０は、情報をキーボード、質量分析法などといった入力デバイス及びディスプレイ、プリンタなどといった出力デバイスとの関係において入力及び出力できるような形で構築されている。ＩＦ手段３０を介して、解析すべき質量分析データは制御手段４０へと伝送される。
【００３１】
制御手段４０は、同定手段４２、測定手段４４、計算手段４６及び計算手段４８を備える。本発明においては、同定手段４２は、ＩＦ手段３０を介してタンパク質の質量分析データに関する情報を受信でき、質量分析法により定量されるべきタンパク質を同定する。次に、質量分析データに基づいて、測定手段４４は同定手段４２により同定された該タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定する。一方で、定量化すべきタンパク質の同定に基づいて、算出手段４６は、タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数を計算する（Ｎobsbl）。ここで、「タンパク質あたりの検出されたペプチドの数」という用語は、質量分析法によって実際に検出された定量化すべき１タンパク質あたりのペプチド数を意味する。「タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数」という用語は、ここでは該タンパク質あたりの理論的ペプチド数を意味する。なお、これらの数は、文書［１７］中で定義されている。
【００３２】
本発明に係る方法では、Ｎobsd及びＮobsbl値に基づいて、Ｎobsd及びＮobsblに関する情報を受ける計算手段４８は、ＥＭＰＡＩを得るために、以下の式によりＥＭＰＡＩを算出する：
ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
【００３３】
その結果、本発明によれば、タンパク質含有量を決定するために、指数関数的に修正されたタンパク質発現量指標（「ＥＭＰＡＩ」）がタンパク質混合物中のタンパク質含有量に対して比例することが立証される。
【００３４】
さらに、計算手段４８は、以下の２つの式により、タンパク質含有量（モル％）とタンパク質含有量（重量％）を算出する。
【数９】
【数１０】
なお、式中、Σ（ＥＭＰＡＩ）は全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和であり、ＭＷは同定された各タンパク質の分子量を表わしている。
【００３５】
必要に応じて、図２に示されていないメモリー手段内に計算された及び／又は算出されたデータを記憶することができる。
【００３６】
図３は、本発明によるＥＭＰＡＩに基づくタンパク質含有量の定量を行うためのフローチャートを示す。ステップＳ１０では、ＭＳ方法により生体材料の試料の質量分析法を実施した後、同定手段４２により対象とするタンパク質が同定される。このＭＳ方法には、ペプチドマスフィンガープリント法及びＭＳ／ＭＳ方法が含まれる。当業者であれば、以下の文書（その全体が参照により援用されている、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９３年、第９０号、５０１１−５０１５頁；Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１９９３年、第３号、３２７−３３２頁；Ｂｉｏｌ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９３年、第２２号、３３８−３４５頁；Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９８年、第２０号、４６−５０頁；Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９８年、第１４１号、９６７−９７７頁；Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０００年、第１４８号、６３５−６５１頁；Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、第４１５号、１４１−１４７頁；Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、第４１５号、１８０−１８３頁；Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００３年、第１５号、１９９−２０５頁；Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００３年、第７号、２１−２７頁）で開示されていることから容易に理解できる。次のステップＳ１１では、上記で同定されたタンパク質あたりの検出されたペプチドの数は、ＭＳデータを用いることで測定手段４４によって測定される。その後、タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数は、（ステップＳ１２に示されているように）上記で同定されたタンパク質の構造に基づいて算出手段４６により算出される。該タンパク質あたりの検出されたペプチドの測定に先立ちタンパク質あたりの検出されうるペプチドの数を計算することが可能である。
【００３７】
図４は、本発明で使用される該タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数を算出するためのフローチャートの一の実施例を示す。ステップＳ１２１では、質量範囲は、検出されたペプチド及び質量分析計のスキャン範囲を用いることにより決定される。次のステップＳ１２２では、各々の検出されたペプチド内の予測された保持時間は、ミーク（Ｍｅｅｋ）式（文献［２３］で記述されている通り）に基づいて算出される。なお、各検出されたペプチドのアミノ酸配列を、例えばＭＳ／ＭＳ方法によって決定することができ、ミーク式に従って既知のアミノ酸配列と液体クロマトグラフィ内の保持時間との間には関係が存在するという点に留意されたい。このとき、ステップＳ１２３において、予測された保持時間範囲は、上述のミーク式に基づいて検出されたペプチドの保持時間を用いることによって決定される。このとき、トリプシンにより完全消化されたペプチドは、コンピュータ内で算出される（ステップＳ１２４中）。より具体的には、トリプシンは、ペプチド結合をタンパク質中のリジン残基及びアルギニン残基のカルボキシル側で選択的に切断可能な有名なプロテアーゼであることから、トリプシンにより完全消化されたペプチドのアミノ酸配列が決定されている。かくして、このステップＳ１２４では、トリプシン消化されたペプチドの分子量（ＭＷ）及び予測保持時間がコンピュータ内で算出される。次のステップＳ１２５では、ＭＷ及び予測保持時間に従って検出されうるペプチドが分類される。最後に、ステップＳ１２６で、検出されうるペプチドのＭＷ及び予測保持時間が共に質量範囲（Ｓ１２１内）及び保持時間範囲（Ｓ１２３内）内に入ることを基礎として、タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数が計数される。
【００３８】
なお、本発明においては、図４のフローチャートに従って実施される検出されうるペプチドの数の算出に制限は全くないという点に留意すべきである。
【００３９】
タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）及びタンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）の数を使用することにより、以下の通り、算出手段４８によりＥＭＰＡＩが算出される（ステップＳ１３中）。
ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
【００４０】
ＥＭＰＡＩの値を用いて、モル及び重量百分率でのタンパク質含有量が以下のように表わされる：
【数１１】
【数１２】
なお、式中、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量であり、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である（ステップ１４及び１５に示されている通りである。）。
【００４１】
以上で説明されている図３中に例示されたタンパク質含有量の解析の流れを実行するプログラムが、外部記憶媒体駆動ユニット２０を介して外部記憶装置又はメモリー１４内に記憶される、又はプログラムがＣＤ−ＲＯＭといったような外部記憶媒体内に記憶されている場合にはＣＰＵ１２まで直接転送される。
【００４２】
なお、本発明による定量に先立ち、該タンパク質は通信インターフェース２２を通して、ＮＣＢＩｎｒデータベースといったような外部データベースを参照することにより同定されることに留意すべきである。必要に応じて、表示デバイス１６はユーザーインターフェース１８を介して本発明による定量の結果を表示する。
【００４３】
このようにして、本発明は、ＥＭＰＡＩに基づいてタンパク質含有量の定量を行うための方法及びこの方法を実施するためのコンピュータプログラムを提供する。
【００４４】
以下では、本発明の態様による典型的実施例に関して記するが、本発明の範囲はこれらに制限されるようには意図されていない。
【実施例】
【００４５】
材料及び方法
細胞溶解物の調製
オング（Ｏｎｇ）ら［文献４］のＳＩＬＡＣプロトコルに従って、13Ｃ6−Ｌｅｕ（ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａｎｄｏｖｅｒ、マサチューセッツ州）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ニューヨーク州）を調製した。この培地内での13Ｃ6−Ｌｅｕ標識のため、マウス神経芽細胞腫ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を培養した。プロテアーゼ阻害物質カクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｂａｓｅｌ、スイス）を添加し、超音波処理を用いて全タンパク質を溶解させた。説明されている通り［文献１０］、正常なＲＰＭＩ１６４０培地の中でＨＣＴ１１６−Ｃ９細胞を成長させた。プロテアーゼ阻害物質と５ｍＭのジチオトレイトールを含む５ｍＬのＭ−ＰＥＲ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州、米国）で全タンパク質を抽出した。
【００４６】
ＬＣＭＳＭＳのためのペプチド混合物の調製
細胞からのタンパク質を吸引乾燥させ、８Ｍの尿素を含有する５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）により再懸濁させた。これらの混合物を説明されている通り［文献６］、その後減量させ、アルキル化させ、Ｌｙｓ−Ｃ（和光（Ｗａｋｏ）、大阪、日本）及びトリプシン（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州、米国））により消化させた。消化された溶液をＴＦＡで酸性化させ、脱塩し、Ｅｍｐｏｒｅ Ｃ１８ディスク（３Ｍ、ミネソタ州、米国）で完全自動計器（日京テクノス（Ｎｉｋｋｙｏ Ｔｅｃｈｎｏｓ）、東京、日本）により調製されたＣ１８−ステージ Ｔｉｐｓ［文献２１］で濃縮させた。少なくとも１つのロイシン及び１つのチロシンを含有するペプチド合成用候補を、ｎｅｕｒｏ ２ａ細胞中で発現されるタンパク質からのトリプシンペプチドの配列を考慮に入れて選択した。試料調製中の酸化の問題を回避するため、メチオニン及びトリプトファンを含有するペプチドを除去した。さらに、トリプシンによる頻繁な切断ミスを考慮して、二重塩基性残基を伴うペプチドを除去した。選択された５４のペプチドは、Ｆ−ｍｏｃ化学で島津（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ＰＳＳＭ−８（京都、日本）を用いて合成し、分取ＨＰＬＣで精製させた。純度及び構造解明のためにアミノ酸分析、ペプチド質量測定及びＨＰＬＣ−ＵＶを実施した。ｎｅｕｒｏ ２ａ細胞からのペプチド混合物に対し異なる量のこれらのペプチドを添加し、上述のとおりのステージ Ｔｉｐにより精製した。
【００４７】
ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
ＱＳＴＡＲパルサーＩ（ＡＢＩ／ＭＤＳ−シーエックス（Ｓｃｉｅｘ）、Ｔｏｒｏｎｔｏ、カナダ）又はＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ１０勾配ポンプを備えたＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ Ａｄｖａｎｔａｇｅ（サーモエレクトロン（Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ）、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州、米国）、及び１５０μｍの流路系を有するＶａｌｃｏ Ｃ２バルブを取付けるＨＴＣ−ＰＡＬオートサンプラー（ＣＴＣアナリティックス（Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）ＡＧ、Ｚｗｉｎｇｅｎ、スイス）を用いて、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって全ての試料を分析した。「Ｓｔｏｎｅ ａｒｃｈ」フリットで分析カラム用針を調製するべく、窒素加圧型カラムローダーセル（日京）を伴う自動引抜き針（内径１００μｍ、開口６μｍ、長さ１５０ｍｍ）の中に、Ｒｅｐｒｏ Ｓｉｌ Ｃ１８材料（３μｍ、マイシュ博士（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ）、Ａｍｍｅｒｂｕｃｈ、ドイツ）を詰め込んだ［文献２２］。Ｐｒｏｘｅｏｎ ｘ−ｙ−ｚナノスプレーインターフェース（Ｏｄｅｎｓｅ、デンマーク））上にテフロンコーティングの施されたカラムホルダー（日京）を取付け、カラム針を保持しかつ適切なスプレー位置を調整するために磁石付きのＶａｌｃｏ金属コネクタを使用した。注射体積は３μＬであり、流量はティースプリッタの後２５０ｎＬ／分であった。移動相は、（Ａ）０．５％の酢酸及び（Ｂ）０．５％の酢酸及び８０％のアセトニトリルで構成されていた。この研究を通して、５分で５％Ｂ〜１０％、６０分で１０％〜３０％、５分で３０％〜１００％、そして１０分で１００％という３段階線形勾配を利用した。説明されている通り［文献２２］、金属コネクタを介して２４００Ｖのスプレー電圧を印加した。より速い走査モードを伴うＱＳＴＡＲについては、３つの強いピークを選択するために１秒間ＭＳ走査を実施し、各々０．５５秒間ずつ、後続する３回のＭＳＭＳ走査を実施した。以前に走査された親イオンを排除するため、情報依存性捕捉（ＩＤＡ）機能が３分間活動状態にあった。より低速の走査モードについては、１回のＭＳ走査（１秒）あたり４回のＭＳＭＳ走査（各１．５秒）が実施された。ＬＣＱについては、１回のＭＳ走査につき２回のＭＳＭＳ走査がＡＧＣモードで実施された。平均走査サイクルはそれぞれ、１回のＭＳについて１．１９秒、１回のＭＳＭＳについては１．１７秒であった。走査範囲は、ＱＳＴＡＲ及びＬＣＱの両方についてｍ／ｚ３００−１４００であった。
【００４８】
ＤＡＴＡ分析
ＬＣＱ及びＱＳＴＡＲの両方の生データファイルから全てのピークを抽出するために、特注のＳｐｉｃｅと呼ばれるソフトウェア（三井情報開発（Ｍｉｔｓｕｉ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）、東京、日本）を使用し、結果のピークファイルを、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔタンパク質データベースに対するタンパク質同定のためにＭａｓｃｏｔ ｖｅｒｌ．９データベースサーチエンジン（その全体が本明細書に参照により援用されているマトリックスサイエンス（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｌｏｎｄｏｎ、英国；Ｄ．Ｍ．パーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）、Ｄ．Ｊ．パピン（Ｐａｐｐｉｎ）、Ｄ．Ｍ．クリーシー（Ｃｒｅａｓｙ）、Ｊ．Ｓ．コットレル（Ｃｏｔｔｒｅｌｌ）、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ第２０号（１９９９年）、３５５１頁）に提出した。許容できる不完全消化部位の数は１に設定され、同一性を標示するためのペプチドスコアが、ＭＳＭＳスペクトルの手作業検査無しでペプチド同定のために使用された。ｈｔｔｐ：／／ｍｓｑｕａｎｔ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／からＭＳＱｕａｎｔ ｖｅｒ１．４ａをダウンロードし、合成ペプチドの既知の量を用いてタンパク質の絶対濃度についてクロマトグラム中のイオン計数を判定する目的で13Ｃ6Ｌｅｕ ＳＩＬＡＣについてそれをカスタマイズした。
【００４９】
タンパク質発現量の決定
タンパク質あたりの検出されうるペプチド数を算出するため、タンパク質をコンピュータ内で消化させ、得られたペプチドを質量分析計の測定走査範囲と比較した。さらに、発明者らのナノＬＣ条件下での保持時間は、約３０００個のペプチドに基づいて発明者ら独自の係数でミーク［文献２３］及びサカモトら［文献２４］による手順に従って算出し、過度の親水性又は疎水性をもつペプチドは除去した。ペプチド数を算出するために以下の等式（１）〜（４）に基づいた組織内ＰＨＰプログラムを書き、これを用いてＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌに全てのデータを送り出した。タンパク質あたりの検出されたペプチド数に関しては、（１）ユニーク親イオンを計数すること、（２）ユニーク配列を計数すること及び（３）不完全消化によって引き起こされる部分的修正及び重複無くユニーク配列を計数すること、といったような３つの計数方法を利用した。ＭＳＱｕａｎｔの「全ペプチドのエクスポート（Ｅｘｐｏｒｔ Ａｌｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」機能を用いてＭａｓｃｏｔ ｈｔｍｌファイルからＥｘｃｅｌスプレッドシートまでこれらの数を送り出した。
【００５０】
ＰＡＩが、式中Ｎobsd及びＮobsblがそれぞれタンパク質あたりの検出されたペプチド数及びタンパク質あたりの検出されうるペプチド数であるものとして
【数１３】
として定義される［文献１７］。次いで、ＥＭＰＡＩが、
ＥＭＰＡＩ＝１０PAI−１ （２）
として定義される。
【００５１】
かくして、モル及び重量百分率でのタンパク質含有量は、
【数１４】
（３）
【数１５】
として記述され、ここで、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量であり、ΣＥＭＰＡＩは全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である。
【００５２】
ＤＮＡマイクロアレイ分析
１０ｍＬの培地を有する直径１０ｃｍの皿の中で１皿あたり５．０×１０6細胞の割合で、ＨＣＴ１１６−Ｃ９細胞を平板固定した。２４時間のプレインキュベーションの後、細胞を０．０１５％のＤＭＳＯで１２時間処理した。確立されたプロトコルに従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨｕＧｅｎｅ ＦＬアレイを用いてデュプリケート実験を実施した。遺伝子シグナル強度を抽出するためにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐソウトウェアを用い、遺伝子記号に基づいて２つのデータセットを分類し平均をとった。
【００５３】
異なる濃度を有する単一のタンパク質からの同定されたタンパク質の数
ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより異なる量のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）トリプシンペプチドを分析し、同定されたペプチドの数を計数した。図５Ａに示されているように、ピーク面積及び同定されたペプチド数の両方共が、注入量の増加につれて増大したが、より高いＨＳＡ濃度で両方の曲線共飽和した。しかしながら、ピーク面積が線形である領域においてさえ、ペプチド数はタンパク質量に対し線形関係をもたない。興味深いことに、ペプチド数は、３ｆｍｏｌ〜５００ｆｍｏｌの注入量の対数に対し線形関係を示す（図５Ｂ）。より低速の走査を伴うＬＣＱから同じデータを得た。このことは、すなわち、各ピークが時間的に充分分離しており、より低速の走査により引き起こされる「ランダムサンプリング」の影響がこの条件下で起こらなかったということを意味している。この場合、ペプチドを計数するために、３つの方法、すなわち（１）同じペプチド配列からの異なる電荷状態を含む全ての親イオン、（２）メチオニン酸化といったような部分的修正、異なる電荷状態を除く全てのペプチド、（３）不完全消化により重複したペプチドを除く冗長性のない配列を伴うペプチド、が用いられた。これらのうち、異なる親イオン数に基づくペプチド数は、タンパク質発現量の対数に対して最高の相関関係を提供する。結果は特定の条件の下でのものではなくより一般的な現象であると考えられている。最近、２つの独立したグループがペプチド数とタンパク質濃度との間の類似した曲線を提示した。その両方共がタンパク質の対数を分析していなかったが、発明者の結果によれば、それらのデータからも同様にタンパク質濃度の対数とペプチド数との間の線形関係が観察された。タンパク質濃度の対数が何故消化されたペプチド数と相関関係を有するかは明らかでないが、それは化学ポテンシャルが濃度対数と比例し、ペプチドのイオン化に必要なエネルギーが化学ポテンシャルの増大に伴って線形的に増大するという事実により説明されるであろう。
【００５４】
複合度の高い混合物溶液中の４７のタンパク質のＰＡＩ
次に、本発明者は、全細胞溶解物中で量が既知である５４のタンパク質について調査した。13Ｃ6−Ｌｅｕで標識されたマウス神経芽細胞腫ｎｅｕｒｏ ２ａ細胞からのトリプシンペプチドを、ＱＳＴＡＲを用いて実行された単一のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定し、３３６のタンパク質を１４６２個のペプチドに基づいて同定した。本発明者は、12Ｃ6−Ｌｅｕを含有する５４の合成ペプチドをこの試料溶液に添加し、13Ｃ6−Ｌｅｕを含有する対応するトリプシンペプチドを定量した。抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ）内で重複したピークを提供したことから、７個のペプチドは定量されなかった。その結果、分子量で１３Ｋ−２２９ＫＤａの４７個のタンパク質が、表１Ａ及び１Ｂに列挙されている通り試料溶液中３０ｆｍｏｌ〜１．８ｐｍｏｌ／μＬの範囲内で定量された。
【００５５】
【表１Ａ】
【００５６】
【表１Ｂ】
【００５７】
この場合、２つの付加的な因子を考慮に入れるべきである。１つはペプチド数に対するタンパク質のサイズの影響である。一般にタンパク質が大きくなればなるほどより多くの検出可能なペプチドが生成される。したがって、保持時間に関する付加的な基準を除いて前述のとおりに、正規化のために検出されうるペプチドを使用した。この場合、多大な数のペプチドが試料中に存在していた。よって、検出されたペプチドの数は或る程度、イオン化抑制効果並びにＭＳＭＳ事象についてのランダム選択により影響されることになると思われた。図６Ａは、異なるタンパク質が１つのグラフにプロットされた場合でさえ、タンパク質あたりの検出されうるペプチド数によって正規化された検出されたペプチドの数とｌｏｇ［タンパク質］との間には同様に線形関係が存在するということを示している。Ｍａｓｃｏｔスコア及びペプチド数といったようなその他のパラメータは、タンパク質発現量と充分な相関関係をもたず、ペプチド数をタンパク質の分子量で除したものは、図６Ｂ−Ｄに示されているように、タンパク質含有量の対数に対する適度な相関関係を提供している。
【００５８】
この場合、本発明者は、バックグラウンドの影響を最小限におさえるためＱＳＴＡＲの最高のＭＳＭＳ走査速度を使用した。より低い走査速度が使用された場合、相関関係は低減させられた（ｒ＝０．９０から０．８１へ）。例えば、図７Ａを参照してみる。この効果は、イオントラップ計器が使用された場合により顕著であった（ｒ＝０．７７）。これは、トラップ能力の量の制限がより発現量が多いタンパク質についてのより偏向したピーク選択を引き起こすことに起因すると思われ、実際図７Ｂにおいてタンパク質発現量が多くなればより大きな偏差がみられた。走査がさらに速くより能力の高い線形イオントラップの最近の開発が、より高速の走査モードを伴うＱＳＴＡＲに対して類似の結果を提供することになると思われる。
【００５９】
さらに、試料の複合性の影響は、ＬＣ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ［文献２５］及びＧｅＬ ＣＭＳ（ゲル増強ＬＣ−ＭＳ、１Ｄ−ゲルとそれに続くスライシング、消化及びＬＣＭＣ分析）アプローチ［文献１５］といったようなＭＳＭＳ分析に先立ち、多次元分離を用いることによって最小限になると思われる。
【００６０】
ＥＭＰＡＩ計算の実施例
ＥＭＰＡＩ値を算出するための全プロトコルは以下の通りである：
（１） ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施する；
（２） Ｍａｓｃｏｔといったようなサーチエンジンを用いてタンパク質を同定する；
（３） タンパク質あたりのユニーク親イオン数を抽出する；
（４） タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数を計数する；及び
（５） （３）及び（４）を用いてＥＭＰＡＩ値を算出する。
【００６１】
以下に記すのは、表２中の１つの標準的な実施例を使用することによるＥＭＰＡＩ算出の実施例である。
【００６２】
【表２】
【００６３】
（３） 検出されたユニーク親イオンの抽出；
上述のプロトコル（１）及び（２）に従って、検出されたユニーク親イオンの抽出を実施した。上述の抽出の結果は、表３中で集計されている。Ｍａｓｃｏｔスコアの結果に基づいて、表３中の「諾否（Ａｃｃｅｐｔ ｏｒ ｎｏｔ）」の欄では、「Ｙｅｓ（はい）」という語は抽出が実施されることを意味し、「Ｎｏ（いいえ）」という語は検出された親イオンが、小さなＭａｓｃｏｔスコアに起因して抽出されなかったことを意味している。
【００６４】
【表３】
【００６５】
（４） タンパク質あたりの検出されうるペプチド数の計数
図４で上述した通り、この算出は以下のステップ１〜６に従って実施された。
【００６６】
ステップ１（図４中のＳ１２１を参照のこと）： 検出されたペプチド及び質量分析の走査範囲を用いた質量範囲の決定。このステップは、ペプチドの実際の観察された質量分析法、すなわち検出されたペプチド及び質量分析の走査範囲を使用することによって実施された。
【００６７】
ステップ２（図４中のＳ１２２を参照のこと）： ミークの式に基づく各々の検出されたペプチドの中の予測された保持時間の算出；図４のＳ１２２で説明されているように、各々の検出されたペプチドのアミノ酸配列は一般にＭＳ／ＭＳ方法により決定可能であることがわかっているため、検出されたペプチドの保持時間を、既知のアミノ酸配列と保持時間との間の関係が存在するミークの式に従って算出することができた。
【００６８】
ステップ３（図４中のＳ１２３を参照のこと）： 検出されたペプチドを用いた保持時間範囲の決定；同様に、このステップはミークの式を使用して実施された。
【００６９】
ステップ４（図４中のＳ１２４を参照のこと）： コンピュータ内でのトリプシンにより完全消化されたペプチドの算出；図４のＳ１２４中で記されているように、トリプシン消化されたペプチドの分子量（ＭＷ）及び予測保持時間は、コンピュータ内でトリプシン判定された消化されたペプチドのアミノ酸配列から算出可能であった。
【００７０】
ステップ５（図４中のＳ１２５を参照のこと）： 検出されうるペプチドは、Ｓ１２４の結果を使用してＭＷ及び予測保持時間に従って選別された。
【００７１】
ステップ６（図４中のＳ１２６を参照のこと）： タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数は、検出されうるペプチドのＭＷ及び予測保持時間が共に質量範囲（ステップ１２１）及び予測保持時間（ステップ１２３）内に入ることを基礎として計数された。
【００７２】
表２中の試料を用いた結果に従って、表４にあるように、質量範囲及び保持時間範囲を決定した。
【００７３】
【表４】
【００７４】
上述の計数の結果は表４に集計されている。コンピュータ内での検出されうるペプチドの算出の結果に基づいて、表２中の「諾否」の欄では、「はい」という語は、検出されうるペプチドが質量範囲及び保持時間範囲の両方に入ることを意味し、「いいえ」という語は、検出されうるペプチドが質量範囲又は保持時間範囲のいずれかの外にあることを意味する。
【００７５】
（５） （３）及び（４）を用いたＥＭＰＡＩ値の算出
以上の式（１）及び（２）に従って、上述の（３）及び（４）の結果を使用することによってＥＭＰＡＩを算出した。ＥＭＰＡＩの結果は、表５に集計されている。表５から明らかなように、表２中の試料を用いたＥＭＰＡＩの値は８．３４５であった。
【００７６】
【表５】
【００７７】
ＥＭＰＡＩを用いた絶対定量
ＰＡＩはタンパク質間の発現量関係を推定することができるものの、モル分率を直接表現することはできない。したがって、本発明者は、式（２）としてタンパク質発現量の決定のセクションで説明した通り、図８は示されているようなタンパク質含有量に正比例する新しいパラメータＥＭＰＡＩをＰＡＩから導出した。絶対濃度を算出するために、ＢＣＡ検定により重量単位で合計タンパク質量を測定し、３３６のｎｅｕｒｏ２ａタンパク質の中の４７のタンパク質の重量分率を、式（４）を用いて算出した。図９に示されているように、ＥＭＰＡＩベースの濃度は、実際値（ｙ＝０．９７ｘ、ｒ＝０．９３）ときわめて一貫性をもつものであり、実際値に対する偏差百分率は３％〜２６０％の範囲にあり、平均は６３％であった。本発明者は合計タンパク質量についてＢＣＡ検定を使用したことから、これらの値は容易に変更された。にもかかわらず、このＥＭＰＡＩアプローチは、包括的絶対定量のためのきわめて正確な指標を提供する。
【００７８】
包括的タンパク質発現分析に対する適用
ＰＡＩは、ただ１回のＬＣＭＳＭＳの実行からタンパク質発現データを生成するのに実に便利である。本発明者は、ＨＣＴ１１６ヒト癌細胞中の遺伝子発現とそれを比較するためにこのアプローチを適用する。ＤＮＡマイクロアレイは４９７１個の遺伝子の発現データを提供し、一方、単一回のＬＣＭＳ実行はユニーク配列をもつ１８１１のペプチドに基づき４０２個の同定されたタンパク質を提供した。遺伝子記号とタンパク質登録番号を橋かけすることで、発現比較研究のために利用される合計２２７の遺伝子／タンパク質が結果としてもたらされた。予測通り、酵母についての以前の研究から予想されるようなわずかな相関関係が観察された［文献１８，２６］。興味深いことに、外れ値の大部分がリポソームタンパク質であった（図１０参照）。Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）といったような原核生物とは異なり、哺乳動物細胞が転写によってのみならずｍＲＮＡの輸送、翻訳及びｒＲＮＡと未会合の過剰量のタンパク質の分解によってもリポソームタンパク質の発現レベルを調節できるということは周知である［文献２７，２８］。また、本発明者は、Ｅ．ｃｏｌｉについて、ＥＭＰＡＩを用いて遺伝子とタンパク質発現との間の比較研究を行なったが、リポソームタンパク質のこのような偏差を発見しなかった［文献２９］。遺伝子及びタンパク質の発現データに両方共、例えば１０％の差を弁別するほどに正確ではないが、それは以上で示されたような簡単な概要を得るためにはきわめて有用である。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
産業上の利用可能性
本発明によれば、ＥＭＰＡＩと命名された絶対タンパク質発現量のための尺度が確立される。ＥＭＰＡＩは、Ｍａｓｃｏｔといったようなデータベースサーチエンジンの出力情報から容易に算出されることから、いかなる付加的なステップも無く定量的情報を追加するために、以前に測定された又は公表されたデータセットにこのアプローチを適用することが可能である。また、ＥＭＰＡＩは、特に比率の正確な測定には定量的変化が大きすぎること、代謝標識が不可能であること、又は感受性の制約のため化学的標識技術が許容されないことを理由として同位元素ベースのアプローチを適用できない場合において、相対的定量のためにも使用可能である。このような場合には、１つの試料中のタンパク質のＥＭＰＡＩ値は、もう１つの試料中のものと比較でき、２つの試料間のＥＭＰＡＩ相関関係からの外れ値を、増大する又は減少するタンパク質として判定することができる。
【００８０】
このＥＭＰＡＩアプローチは、１つのタンパク質から同定されるペプチド数を増やすために多次元分離−ＭＳＭＳに適用され得る。ｍ／ｚ領域に対するイオン化依存性といったようなＭＳ計器依存性パラメータを考慮するために、さらなる改善も可能であると思われる。ＥＭＰＡＩ指標は単純なスクリプトで算出できタンパク質同定実験におけるさらなる実験を必要としないことから、発明者らはプロテオミクス結果の報告におけるその日常的使用を提案する。
【００８１】
参考文献
本書に引用されている以下の参考文献は、その全体が本明細書に参照により援用されている。
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[29] Y. Ishihama, D. Frishman, M. Mann, Unpublished data.
【図面の簡単な説明】
【００８２】
本発明の目的及び特徴が、添付図面を参照するとともに、好ましい実施形態の説明から明らかである。
【図１】本発明による前記ＥＭＰＡＩに基づいてタンパク質含有量の定量を行うコンピュータのハードウェア構造の図面を示す。
【図２】本発明によるＥＭＰＡＩに基づいてタンパク質含有量の定量を行うための解析用装置の構成を例示するためのブロック図を示す。
【図３】本発明によるＥＭＰＡＩに基づいてタンパク質含有量の定量を行うためのフローチャートを示す。
【図４】タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数を計算するためのフローチャートの一の実施例を示す。
【図５】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の注入量に対するペプチド数及びピーク面積の依存性を例示している。図５Ａは、ピーク面積及びペプチドのユニーク親イオン数対（ＨＳＡ）の注入量の関係を示す。図５Ｂは、３つの異なるペプチド数とＨＳＡ注入量の関係を示す。
【図６】ｎｅｕｒｏ２ａ細胞中の４７個のタンパク質についての異なるパラメータとタンパク質濃度の関係を示す。図６Ａは、タンパク質濃度とＰＡＩの関係を示す。図６Ｂは、タンパク質濃度とペプチド数をタンパク質分子量で除したものの関係を示す。図６Ｃは、タンパク質濃度とＭａｓｃｏｔスコアの関係を示す。図６Ｄは、タンパク質濃度と検出されたペプチド（ユニーク親イオン）の数の関係を示す。
【図７】ＰＡＩとｌｏｇ［タンパク質］との間の線形関係に対するＭＳ測定条件の影響を示す。図７Ａは、より低速の走査を伴う飛行時間型の質量分析法（ＱＳＴＡＲ）を示す。図７Ｂは、より低速の走査を伴うイオントラップ型の質量分析法（ＬＣＱ）を示す。
【図８】ｎｅｕｒｏ２ａ細胞中の４７のタンパク質についてのタンパク質濃度とＥＭＰＡＩとの間の関係を示す。
【図９】本発明によるＥＭＰＡＩを用いたｎｅｕｒｏ２ａ中の４７のタンパク質の絶対定量の結果を示す。
【図１０】本発明の一の実施形態によるＨＣＴ１１６細胞中の遺伝子とタンパク質発現との間の比較を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うための方法であって、
（ａ）質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するステップと；
（ｂ）前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するステップと；
（ｃ）タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するステップと；
（ｄ）ＥＭＰＡＩを得るために、
ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
という式により計算するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
【数１】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
【数２】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記質量分析法が、液体クロマトグラフィ質量分析法を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うためのコンピュータプログラム製品であって、
（ａ）質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するステップと；
（ｂ）前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するステップと；
（ｃ）タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するステップと；
（ｄ）ＥＭＰＡＩを得るために、
ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
という式により計算するステップと、
を実行するため、記録媒体上に保存されたコンピュータプログラムを有するコンピュータ読取り可能な記憶媒体を含む、コンピュータプログラム製品。
【請求項６】
【数３】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である、請求項５に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項７】
【数４】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の前記総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす、請求項５に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項８】
前記製品が、コンピュータにより読取ることのできるコンピュータ読取り可能記録媒体である、請求項５〜８のいずれか一項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項９】
生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うコンピュータプログラムであって、
（ａ）質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するステップと；
（ｂ）前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するステップと；
（ｃ）タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するステップと；
（ｄ）ＥＭＰＡＩを得るために、
ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
という式により計算するステップ、
を実施するステップを含むプログラム。
【請求項１０】
【数５】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である、請求項９に記載のプログラム。
【請求項１１】
【数６】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす、請求項９に記載のプログラム。
【請求項１２】
生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うための解析用装置であって、
質量分析法により得られたタンパク質の質量分析データに関する情報を受信し、質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するための同定手段と；
前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するための測定手段と；
タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するための算出手段と；
ＥＭＰＡＩを得るために、
ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
という式により計算するための計算手段と、
を備える解析用装置。
【請求項１３】
【数７】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定済みタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
【数８】
によりＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定済みタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす、請求項１２に記載の装置。
【請求項１５】
前記質量分析法が、液体クロマトグラフィ質量分析法を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１】
生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うための方法であって、
（ａ）質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するステップと；
（ｂ）前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するステップと；
（ｃ）タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するステップと；
（ｄ）ＥＭＰＡＩを得るために、
ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
という式により計算するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
【数１】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
【数２】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記質量分析法が、液体クロマトグラフィ質量分析法を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うためのコンピュータプログラム製品であって、
（ａ）質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するステップと；
（ｂ）前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するステップと；
（ｃ）タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するステップと；
（ｄ）ＥＭＰＡＩを得るために、
ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
という式により計算するステップと、
を実行するため、記録媒体上に保存されたコンピュータプログラムを有するコンピュータ読取り可能な記憶媒体を含む、コンピュータプログラム製品。
【請求項６】
【数３】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である、請求項５に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項７】
【数４】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の前記総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす、請求項５に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項８】
前記製品が、コンピュータにより読取ることのできるコンピュータ読取り可能記録媒体である、請求項５〜８のいずれか一項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項９】
生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うコンピュータプログラムであって、
（ａ）質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するステップと；
（ｂ）前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するステップと；
（ｃ）タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するステップと；
（ｄ）ＥＭＰＡＩを得るために、
ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
という式により計算するステップ、
を実施するステップを含むプログラム。
【請求項１０】
【数５】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である、請求項９に記載のプログラム。
【請求項１１】
【数６】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定されたタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす、請求項９に記載のプログラム。
【請求項１２】
生体材料の試料中のタンパク質含有量の定量を行うための解析用装置であって、
質量分析法により得られたタンパク質の質量分析データに関する情報を受信し、質量分析法により定量化すべきタンパク質を同定するための同定手段と；
前記タンパク質あたりの検出されたペプチドの数（Ｎobsd）を測定するための測定手段と；
タンパク質あたりの検出されうるペプチドの数（Ｎobsbl）を算出するための算出手段と；
ＥＭＰＡＩを得るために、
ＥＭＰＡＩ＝１０Nobsd/Nobsbl−１
という式により計算するための計算手段と、
を備える解析用装置。
【請求項１３】
【数７】
により、ＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（モル％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定済みタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和である、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
【数８】
によりＥＭＰＡＩの値に基づいてタンパク質含有量（重量％）を算出するステップをさらに含み、ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、全ての同定済みタンパク質についてのＥＭＰＡＩ値の総和であり、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表わす、請求項１２に記載の装置。
【請求項１５】
前記質量分析法が、液体クロマトグラフィ質量分析法を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００８−５０８５００（Ｐ２００８−５０８５００Ａ）
【公表日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５４３８９（Ｐ２００６−５５４３８９）
【出願日】平成１７年７月４日（２００５．７．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０１２７０５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１１３５１
【国際公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月４日（２００５．７．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０１２７０５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１１３５１
【国際公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【Ｆターム（参考）】
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