走査型顕微鏡
【課題】光刺激をしながら蛍光観察を行なう場合において、標本の劣化を抑制する。
【解決手段】標本１７の観察時において、刺激用レーザユニット１５から射出された刺激光は、両面ミラー５２Ａで反射されてスキャニング部５３により偏向される。一方、励起用レーザユニット１６から射出された励起光は、両面ミラー５２Ａにおける、刺激光が反射された面とは異なる面で反射され、スキャニング部５４により偏向される。そして、これらの刺激光と励起光は、ハーフミラー５５Ａで合成されて、標本１７に照射される。このように、刺激光と励起光を両面ミラー５２Ａの異なる面で反射させ、ハーフミラー５５Ａで合成することで、刺激光と励起光を異なる点光源から導入することが可能となる。本発明は、走査型の共焦点顕微鏡に適用することができる。
【解決手段】標本１７の観察時において、刺激用レーザユニット１５から射出された刺激光は、両面ミラー５２Ａで反射されてスキャニング部５３により偏向される。一方、励起用レーザユニット１６から射出された励起光は、両面ミラー５２Ａにおける、刺激光が反射された面とは異なる面で反射され、スキャニング部５４により偏向される。そして、これらの刺激光と励起光は、ハーフミラー５５Ａで合成されて、標本１７に照射される。このように、刺激光と励起光を両面ミラー５２Ａの異なる面で反射させ、ハーフミラー５５Ａで合成することで、刺激光と励起光を異なる点光源から導入することが可能となる。本発明は、走査型の共焦点顕微鏡に適用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光刺激をしながら蛍光観察を行なう場合において、標本の劣化を抑制することができるようにした走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、観察対象の標本を刺激光で刺激しつつ、標本を励起光で走査して標本の観察画像を取得する走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
この走査型顕微鏡では、ダイクロイックミラーで分離された刺激光と励起光が、それぞれ異なるスキャナを介して後段のダイクロイックミラーで合成され、標本に照射される。これにより、刺激光の走査と、励起光の走査とを独立に行なうことができる。
【０００４】
例えば、このような走査型顕微鏡を用いた観察では、標本としての細胞内にPA-GFP（Photo Activatable-Green Fluorescent Protein）と呼ばれる蛍光試薬が導入され、細胞の一部に405nmの強い光量の刺激光が照射される。そして、細胞における刺激光で刺激された部位周辺が変化する様子が、488nmの励起光で励起されながら、高速で捉えられる。
【０００５】
一方、細胞内に導入した蛍光タンパク質GFPの拡散現象を捉えるための手法として、FRAP（Fluorescence Recovery After Photobleaching）と呼ばれる手法が知られている。このFRAPは、細胞の一部に488nmの強い刺激光を照射しながら、その刺激光により周囲が変化する様子を同一波長である488nmの励起光で励起させて、蛍光観察を行なう手法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００８／００４３３６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところが、上述した走査型顕微鏡でFRAPによる標本観察をしようとすると、同一光源からの488nmのレーザ光を、ハーフミラーで分離して励起光および刺激光とすることになるので、励起光と刺激光の光量を独立して調整することはできなかった。そのため、刺激光の光量を多くして、細胞に強い刺激を与えようとすると、刺激による反応を観察するための励起光の光量も多くなってしまい、細胞内の刺激したい部位以外の部位にも強い光が照射されることになる。そうすると、余計な退色が生じて、細胞が劣化してしまう。
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、光刺激をしながら蛍光観察を行なう場合において、標本の劣化を抑制することができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の走査型顕微鏡は、入射した光で観察対象の標本を走査する第１のスキャニング部と、入射した光で前記標本を走査する第２のスキャニング部と、第１の点光源から入射した第１の光を反射面で反射して、前記第１のスキャニング部に入射させるとともに、前記第１の点光源とは異なる第２の点光源から入射した第２の光を前記反射面とは異なる他の反射面で反射して、前記第２のスキャニング部に入射させる反射部と、前記第１のスキャニング部から入射した前記第１の光の少なくとも一部を透過させるとともに、前記第２のスキャニング部から入射した前記第２の光の少なくとも一部を反射することで、前記第１の光と前記第２の光を前記標本に照射する合成部とを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、光刺激をしながら蛍光観察を行なう場合において、標本の劣化を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明を適用した観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。
【図２】ダイクロイックミラーの光学特性を示す図である。
【図３】観察システムの他の構成例を示す図である。
【図４】観察システムの他の構成例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。
【００１３】
〈第１の実施の形態〉
［観察システムの構成］
図１は、本発明を適用した観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。この観察システムは、コンピュータ１１、コントローラ１２、顕微鏡１３、コンフォーカルヘッド１４、刺激用レーザユニット１５、および励起用レーザユニット１６から構成される。
【００１４】
顕微鏡１３には、共焦点観察のためのコンフォーカルヘッド１４が接続されており、これにより顕微鏡１３は、走査型の共焦点顕微鏡として機能し、図示せぬステージ上に載置された標本１７を光刺激しながら蛍光観察することが可能となる。
【００１５】
また、コンフォーカルヘッド１４には、光刺激用の刺激光を射出する刺激用レーザユニット１５と、蛍光観察用の励起光を射出する励起用レーザユニット１６とが、光ファイバ１８および光ファイバ１９により接続されている。ユーザは、コンピュータ１１を操作することで、コンピュータ１１にコントローラ１２を制御させ、コンフォーカルヘッド１４乃至励起用レーザユニット１６を動作させることができる。
【００１６】
刺激用レーザユニット１５には、刺激光としてのレーザ光を射出するレーザ光源３１とレーザ光源３２が設けられており、レーザ光源３１から射出された刺激光は、ミラー３３で反射され、さらにダイクロイックミラー３４で反射する。一方、レーザ光源３２から射出された刺激光は、そのままダイクロイックミラー３４を透過する。レーザ光源３１とレーザ光源３２からは、互いに異なる波長の刺激光が射出されるようになされており、何れか一方、または両方の波長の刺激光を射出させることが可能である。
【００１７】
なお、レーザ光源３１とレーザ光源３２から、同じ波長のレーザ光を射出させる場合には、ダイクロイックミラー３４に代えて、ハーフミラーがレーザ光の光路上に配置され、レーザ光源３１とレーザ光源３２からのレーザ光が同一光路に合成される。
【００１８】
また、ダイクロイックミラー３４からの刺激光は、音響光学フィルタ３５において適宜、波長選択および強度変調され、シャッタ３６を通ってコリメートレンズ３７により光ファイバ１８に導かれる。そして、光ファイバ１８に入射した刺激光は、光ファイバ１８を通ってコンフォーカルヘッド１４に入射する。
【００１９】
同様に、励起用レーザユニット１６には、レーザ光源４１、レーザ光源４２、ミラー４３、ダイクロイックミラー４４、音響光学フィルタ４５、シャッタ４６、およびコリメートレンズ４７が設けられている。これらのレーザ光源４１乃至コリメートレンズ４７は、刺激用レーザユニット１５に設けられたレーザ光源３１乃至コリメートレンズ３７に対応し、これらの部材と同じ機能を有している。
【００２０】
励起用レーザユニット１６においても、レーザ光源４１とレーザ光源４２からは、互いに異なる波長の励起光が射出されるようになされており、それらの何れか一方、または両方の波長の励起光を射出させることが可能である。また、コリメートレンズ４７により集光された励起光は、光ファイバ１９に導かれてコンフォーカルヘッド１４に入射する。
【００２１】
刺激用レーザユニット１５から光ファイバ１８を介して、コンフォーカルヘッド１４に入射した刺激光は、コリメートレンズ５１を通って光路選択部５２に入射する。すなわち、光ファイバ１８とコンフォーカルヘッド１４の接続部分が点光源となり、この点光源からの刺激光がコリメートレンズ５１により集光されて、光路選択部５２に入射する。
【００２２】
光路選択部５２は、刺激光と励起光の光路上に設けられ、入射した光の光路を選択する。すなわち、光路選択部５２は、モータにより回転駆動するターレットと、刺激光および励起光の光路上に配置され、ターレットに保持される光学部材とから構成される。
【００２３】
光路選択部５２のターレットには、光学部材として、対向する表面と裏面の両方がミラーとなっている両面ミラー５２Ａと、入射した光をそのまま通過させる中空な中空ブロック５２Ｂとが保持されている。光路選択部５２に入射した刺激光や励起光等の光は、その光の波長と、光の光路上に配置された光学部材によって、スキャニング部５３またはスキャニング部５４へと導かれる。
【００２４】
例えば、図１の例では、刺激光の光路上には両面ミラー５２Ａが配置されているので、コリメートレンズ５１から光路選択部５２に入射した刺激光は、両面ミラー５２Ａにより反射されてスキャニング部５３に入射する。なお、光路選択部５２のターレットに保持される光学部材は、その他、ダイクロイックミラーや素ガラス、ハーフミラーなどとされてもよい。
【００２５】
このように、光路上に両面ミラー５２Ａを配置すれば、コンフォーカルヘッド１４の外部から、独立して波長および光量を制御したレーザ光を、コンフォーカルヘッド１４の光路に導入し、合成することができる。
【００２６】
スキャニング部５３に入射した刺激光は、スキャニング部５３により偏向されて光路選択部５５に入射する。例えば、スキャニング部５３は、刺激光を偏向させる２つのガルバノスキャナにより構成される。
【００２７】
また、光路選択部５５も光路選択部５２と同じ構成とされており、光路選択部５５には、ハーフミラー５５Ａとダイクロイックミラー５５Ｂが保持されている。図１の例では、刺激光の光路上には、ハーフミラー５５Ａが配置されているので、光路選択部５５に入射した刺激光の一部は、ハーフミラー５５Ａを透過し、結像レンズ５６および対物レンズ５７を通って、標本１７に照射される。
【００２８】
これにより、標本１７が刺激光により刺激されることになる。なお、光路選択部５５のターレットにも、光学部材としてミラー、素ガラス、中空ブロックなどが保持されるようにしてもよい。また、コリメートレンズ５１は、刺激光の光路方向、すなわちコリメートレンズ５１の光軸方向に移動可能とされており、コリメートレンズ５１が光軸方向に移動されると、標本１７における刺激光の集光位置が対物レンズ５７の光軸方向に変化する。これにより、標本１７の深さ方向（対物レンズ５７の光軸方向）の任意の位置を、刺激光により光刺激することが可能となる。
【００２９】
さらに、励起用レーザユニット１６から光ファイバ１９を介して、コンフォーカルヘッド１４に入射した励起光は、コリメートレンズ５８を通ってダイクロイックミラー５９に入射する。すなわち、光ファイバ１９とコンフォーカルヘッド１４の接続部分が点光源となり、この点光源からの励起光がコリメートレンズ５８により集光されて、ダイクロイックミラー５９で反射し、光路選択部５２に入射する。
【００３０】
図１の例では、励起光の光路上には両面ミラー５２Ａが配置されているので、光路選択部５２に入射した励起光は、両面ミラー５２Ａで反射され、スキャニング部５４に入射する。ここで、刺激光と励起光は、それぞれ両面ミラー５２Ａの異なる反射面に入射して、反射される。
【００３１】
スキャニング部５４に入射した励起光は、スキャニング部５４により偏向されて光路選択部５５に入射する。例えば、スキャニング部５４は、励起光を偏向させるガルバノスキャナ、およびレゾナントスキャナから構成される。このスキャニング部５４によれば、スキャニング部５３と比べて、より高速に走査を行なうことができる。
【００３２】
また、スキャニング部５４から光路選択部５５に入射した励起光の一部は、光路選択部５５のハーフミラー５５Ａにより反射され、結像レンズ５６および対物レンズ５７を通って標本１７に照射される。
【００３３】
励起光が標本１７に照射されると、標本１７からは蛍光が生じ、この蛍光は対物レンズ５７および結像レンズ５６を通って光路選択部５５に入射する。図１の例では、蛍光を検出する光路上には、ハーフミラー５５Ａが配置されているので、蛍光の半分がハーフミラー５５Ａで反射され、さらにスキャニング部５４でデスキャンされて、光路選択部５２に入射する。
【００３４】
さらに光路選択部５２に入射した蛍光は、光路選択部５２の両面ミラー５２Ａで反射するとともに、ダイクロイックミラー５９を透過し、集光レンズ６０により集光される。ダイクロイックミラー５９は、励起光の波長の光を反射させ、蛍光の波長の光を透過するようになされている。
【００３５】
また、集光レンズ６０により集光された蛍光は、ピンホール６１を通って光検出器６２に入射し、受光される。ピンホール６１は、対物レンズ５７の焦点位置、つまり標本１７の観察面と共役な位置に配置されており、ピンホール６１の位置に集光された蛍光だけが光検出器６２に入射するようになされている。
【００３６】
光検出器６２は、入射した蛍光を受光して光電変換することで、蛍光を、蛍光の受光強度を示す電気信号に変換する。光電変換により得られた電気信号は、光検出器６２からコントローラ１２へと供給される。コントローラ１２は、光検出器６２から供給された電気信号に基づいて、標本１７の観察面の画像である観察画像を生成し、コンピュータ１１に供給する。また、コンピュータ１１は、コントローラ１２から供給された観察画像をディスプレイに表示する。
【００３７】
［観察システムの動作の説明１］
次に、図１の観察システムの動作について説明する。
【００３８】
まず、波長が488nmの刺激光で標本１７を刺激しながら、波長が488nmの励起光で標本１７を走査して、標本１７を蛍光観察する場合について説明する。
【００３９】
この場合、ユーザがコンピュータ１１を操作して、標本１７の観察開始を指示すると、コントローラ１２は、コンピュータ１１の指示に従って、光路選択部５２および光路選択部５５を動作させる。光路選択部５２は、コントローラ１２の制御に基づいてターレットを回転させ、両面ミラー５２Ａを刺激光および励起光の光路上に配置する。また、光路選択部５５は、コントローラ１２の制御に基づいてターレットを回転させ、ハーフミラー５５Ａを刺激光および励起光の光路上に配置する。
【００４０】
また、コントローラ１２は、刺激用レーザユニット１５および励起用レーザユニット１６に、波長が488nmの刺激光および励起光を射出させるとともに、音響光学フィルタ３５と音響光学フィルタ４５を制御して、刺激光と励起光の光量調整を行なわせる。このように、観察システムでは、同じ波長の刺激光と励起光の光量調整を、それぞれ独立に行なうことができる。したがって、標本１７に照射される光が必要以上に強くなることを防止し、その結果、退色等による標本１７の劣化を抑制することができる。
【００４１】
刺激用レーザユニット１５から射出された刺激光は、光ファイバ１８およびコリメートレンズ５１を通って両面ミラー５２Ａで反射され、スキャニング部５３に入射する。そして、両面ミラー５２Ａからの刺激光は、スキャニング部５３で偏向されてハーフミラー５５Ａ、結像レンズ５６、および対物レンズ５７を通って、標本１７に照射される。このとき、スキャニング部５３は、刺激光を偏向することにより、刺激光で標本１７の観察面を走査する。
【００４２】
また、励起用レーザユニット１６から射出された励起光は、光ファイバ１９およびコリメートレンズ５８を通ってダイクロイックミラー５９で反射され、両面ミラー５２Ａに入射する。そして、両面ミラー５２Ａに入射した励起光は、両面ミラー５２Ａの刺激光が反射された面とは異なる面で反射されて、さらにスキャニング部５４で偏向される。スキャニング部５４で偏向された励起光は、ハーフミラー５５Ａで反射され、結像レンズ５６、および対物レンズ５７を通って、標本１７に照射される。このとき、スキャニング部５４は、励起光を偏向することにより、励起光で標本１７の観察面を走査する。
【００４３】
このように、観察システムでは、異なる点光源から入射した刺激光と励起光とを、両面ミラー５２Ａの異なる面で反射させて、スキャニング部５３とスキャニング部５４に入射させ、ハーフミラー５５Ａで合成することで、刺激光と励起光の光量調整を独立して行なうことができる。
【００４４】
また、観察システムでは、刺激光と励起光を異なるスキャニング部で走査するので、標本１７の所望する部位を刺激すると同時に、刺激を与える部位とは異なる部位に励起光を照射することができる。これにより、標本１７の特定の部位に刺激光を照射する光刺激時に、標本１７全体に余計なレーザ光が照射されずに済むので、標本１７の退色を防止することができる。また、観察の自由度を向上させることもできる。
【００４５】
このようにして、標本１７に励起光が照射されると、標本１７からは蛍光が生じ、この蛍光は、対物レンズ５７と結像レンズ５６を通ってハーフミラー５５Ａで反射され、さらにスキャニング部５４でデスキャンされる。そして、スキャニング部５４から射出された蛍光は、両面ミラー５２Ａで反射されて、ダイクロイックミラー５９乃至ピンホール６１を通り、光検出器６２に受光される。
【００４６】
蛍光が光電変換されると、光検出器６２からコントローラ１２には、蛍光の受光量に応じた電気信号が供給されるので、コントローラ１２は、この電気信号から観察画像を生成してコンピュータ１１に供給する。これにより、ユーザは、コンピュータ１１に表示される観察画像を見て、標本１７を観察することができる。
【００４７】
なお、以上においては、光路選択部５５が、光路上にハーフミラー５５Ａを配置する例について説明したが、この例では、標本１７からの蛍光の光量は、ハーフミラー５５Ａにおいて半分に減ってしまう。そこで、蛍光の光量のロスを低減させるために、光路選択部５５が、光路上にダイクロイックミラー５５Ｂを配置するようにしてもよい。
【００４８】
例えば、蛍光の波長が500nm以上であるとすると、ダイクロイックミラー５５Ｂは、図２に示すように、入射した490nm未満の波長の光の半分を透過させ、残りの半分の光を反射させるとともに、入射した500nm以上の波長の光を反射させる特性を有するものとされる。このようなダイクロイックミラー５５Ｂを光路上に配置すれば、標本１７から入射した蛍光の殆どが、ダイクロイックミラー５５Ｂで反射されることになり、蛍光の光量低下を抑制できる。
【００４９】
なお、図２において、縦軸はダイクロイックミラー５５Ｂの反射面における光の反射率を示しており、横軸は光の波長を示している。図２の例では、波長が490nm乃至500nmの間の光は、その波長が長いものほど反射率が高くなっている。
【００５０】
［観察システムの動作の説明２］
さらに、光刺激を行なわず、励起光だけを標本１７に照射する場合には、コントローラ１２は、スキャニング部５４とスキャニング部５３の何れを用いて励起光の走査を行なうかによって、光路上に配置される光路選択用の光学部材を切り替える。
【００５１】
例えば、励起光の走査をスキャニング部５４により行なう場合、コントローラ１２は、光路選択部５２に両面ミラー５２Ａあるいは、図示せぬミラーを励起光の光路上に配置させるとともに、光路選択部５５にも図示せぬミラーを励起光の光路上に配置させる。
【００５２】
そうすると、励起用レーザユニット１６から射出された励起光は、光ファイバ１９およびコリメートレンズ５８を通ってダイクロイックミラー５９で反射され、光路選択部５２に入射する。そして、光路選択部５２に入射した励起光は、光路選択部５２のミラーにより反射され、スキャニング部５４により偏向されて光路選択部５５に入射する。さらに、光路選択部５５に入射した励起光は、光路選択部５５のミラーで反射され、結像レンズ５６および対物レンズ５７を通って標本１７に照射される。
【００５３】
また、標本１７で生じた蛍光は、励起光と逆の光路を通ってダイクロイックミラー５９に入射する。すなわち、蛍光は、光路選択部５５のミラーで反射されて、スキャニング部５４でデスキャンされ、さらに光路選択部５２のミラーで反射される。そして、蛍光は、ダイクロイックミラー５９乃至ピンホール６１を通って光検出器６２に受光される。
【００５４】
さらに、例えば、励起光の走査をスキャニング部５３により行なう場合、コントローラ１２は、光路選択部５２に中空ブロック５２Ｂを励起光の光路上に配置させるとともに、光路選択部５５にも図示せぬ中空ブロックを励起光の光路上に配置させる。
【００５５】
そうすると、励起用レーザユニット１６から射出された励起光は、ダイクロイックミラー５９で反射された後、中空ブロック５２Ｂをそのまま通ってスキャニング部５３に入射する。この励起光は、スキャニング部５３により偏向されて光路選択部５５の中空ブロック、結像レンズ５６、および対物レンズ５７を通って標本１７に照射される。
【００５６】
また、標本１７で生じた蛍光は、励起光と逆の光路を通ってダイクロイックミラー５９に入射する。すなわち、蛍光は、光路選択部５５の中空ブロックを通って、スキャニング部５３でデスキャンされ、さらに中空ブロック５２Ｂを通過する。そして、中空ブロック５２Ｂを通過した蛍光は、ダイクロイックミラー５９乃至ピンホール６１を通って光検出器６２に受光される。
【００５７】
さらに、例えば励起用レーザユニット１６からのみレーザ光を射出させ、光路選択部５２と光路選択部５５とが、光路上にハーフミラーおよびハーフミラー５５Ａを配置するようにしてもよい。この場合、スキャニング部５３とスキャニング部５４を用いて、同じ波長の異なる光路のレーザ光で、それぞれ標本１７を走査することができる。
【００５８】
例えば、このような場合には、光路選択部５２を透過したレーザ光が刺激光とされ、光路選択部５２で反射されたレーザ光が励起光とされる。この例において、例えば光路選択部５２とスキャニング部５３の間に音響光学フィルタを配置するとともに、光路選択部５２とスキャニング部５４の間に音響光学フィルタを配置すれば、これらの音響光学フィルタによって、刺激光と励起光の光量調整を独立して行なうことができる。
【００５９】
以上のように、観察システムでは、励起光や刺激光が標本１７の観察目的に合った光路を通るように、つまり所望のスキャニング部に入射するように、それらの光の光路上に光路選択部５２と光路選択部５５に保持されている光路選択用の光学部材が選択的に配置される。これにより、簡単な構成で標本１７の観察の自由度を向上させることができる。
【００６０】
［観察システムの動作の説明３］
次に、蛍光タンパク質であるKAEDEを標本１７としての細胞に導入し、波長が405nmの刺激光で標本１７を刺激しながら、波長が488nmの励起光で標本１７を走査して、標本１７を蛍光観察する場合について説明する。なお、観察される蛍光の波長は、500nm以上とされる。
【００６１】
このような場合、コントローラ１２は、コンピュータ１１の指示に従って、光路選択部５２に、両面ミラー５２Ａを刺激光および励起光の光路上に配置させ、光路選択部５５に、ダイクロイックミラー５５Ｂを刺激光および励起光の光路上に配置させる。そして、コントローラ１２は、刺激用レーザユニット１５に波長が405nmの刺激光を射出させるとともに、励起用レーザユニット１６に、波長が488nmの励起光を射出させる。
【００６２】
すると、刺激用レーザユニット１５から射出された刺激光は、光ファイバ１８およびコリメートレンズ５１を通って両面ミラー５２Ａで反射され、スキャニング部５３に入射する。そして、両面ミラー５２Ａからの刺激光は、スキャニング部５３で偏向されてダイクロイックミラー５５Ｂ乃至対物レンズ５７を通って、標本１７に照射される。このとき、スキャニング部５３は、刺激光を偏向することにより、刺激光で標本１７の観察面を走査する。
【００６３】
また、励起用レーザユニット１６から射出された励起光は、光ファイバ１９乃至ダイクロイックミラー５９を通って両面ミラー５２Ａで反射され、スキャニング部５４で偏向される。スキャニング部５４で偏向された励起光は、ダイクロイックミラー５５Ｂ乃至対物レンズ５７を通り、標本１７に照射される。このとき、スキャニング部５４は、励起光を偏向することにより、励起光で標本１７の観察面を走査する。
【００６４】
ここで、ダイクロイックミラー５５Ｂは、入射した410nm未満の波長の光を透過させ、入射した450nm以上の波長の光を反射させる特性を有するものとされる。
【００６５】
このようなダイクロイックミラー５５Ｂを光路上に配置すれば、波長が405nmの刺激光はダイクロイックミラー５５Ｂを透過し、波長が488nmの励起光、および波長が500nm以上である蛍光は、ダイクロイックミラー５５Ｂで反射することになる。したがって、この場合においても、ダイクロイックミラー５５Ｂにおける蛍光の光量低下を抑制することができる。
【００６６】
このようにして、標本１７に励起光が照射されると、標本１７からは蛍光が生じ、この蛍光は、対物レンズ５７と結像レンズ５６を通ってダイクロイックミラー５５Ｂで反射され、さらにスキャニング部５４でデスキャンされる。そして、スキャニング部５４から射出された蛍光は、両面ミラー５２Ａで反射されて、ダイクロイックミラー５９乃至ピンホール６１を通り、光検出器６２に受光される。
【００６７】
光検出器６２により蛍光が光電変換されて電気信号が得られると、コントローラ１２で、この電気信号から観察画像が生成され、コンピュータ１１で観察画像が表示される。
【００６８】
なお、励起用レーザユニット１６には、レーザ光源４１とレーザ光源４２が設けられているので、刺激光と励起光の波長が異なる場合に、刺激光と励起光を励起用レーザユニット１６から射出させるようにしてもよい。
【００６９】
そのような場合、例えば、光路選択部５２は、図示せぬダイクロイックミラーを刺激光と励起光の光路上に配置し、光路選択部５５は、ダイクロイックミラー５５Ｂを刺激光と励起光の光路上に配置する。
【００７０】
これにより、ダイクロイックミラー５９から光路選択部５２に入射した刺激光と励起光のうちの一方の光を、光路上に配置されたダイクロイックミラーによりスキャニング部５３に入射させ、他方の光をスキャニング部５４に入射させることができる。同様に、ダイクロイックミラー５５Ｂでは、互いに異なる光路を通って入射した刺激光と励起光を合成し、結像レンズ５６に入射させることができる。
【００７１】
〈第２の実施の形態〉
［観察システムの構成］
なお、以上においては、外部の刺激用レーザユニット１５と励起用レーザユニット１６から、刺激光と励起光をコンフォーカルヘッド１４に入射させると説明したが、刺激光と励起光の両方の光源、または何れか一方の光源がコンフォーカルヘッド１４内に設けられるようにしてもよい。
【００７２】
例えば、刺激光の光源がコンフォーカルヘッド１４内に設けられる場合、観察システムは、図３に示すように構成される。なお、図３において、図１における場合と対応する部分には、同一の符号を付してあり、その説明は適宜省略する。
【００７３】
図３の観察システムには、図１の観察システムの刺激用レーザユニット１５に代えて、コンフォーカルヘッド１４内部にレーザ光源９１が設けられており、その他の構成は、図１の観察システムと同じとされている。
【００７４】
レーザ光源９１は、例えばレーザダイオードなどの点光源からなり、コントローラ１２の制御に基づいて標本１７の光刺激に用いられる刺激光を射出する。レーザ光源９１から射出された刺激光は、コリメートレンズ５１により集光されて、光路選択部５２に入射する。
【００７５】
なお、図３の観察システムの動作は、刺激光を射出する光源がレーザ光源９１である点を除いて、図１の観察システムと同様であるので、その動作の説明は省略する。
【００７６】
〈第３の実施の形態〉
［観察システムの構成］
さらに、図１の例では、異なるレーザユニットからの刺激光と励起光をコンフォーカルヘッド１４に入射させると説明したが、１つのレーザユニットから、刺激光と励起光をコンフォーカルヘッド１４に入射させるようにしてもよい。
【００７７】
そのような場合、観察システムは、例えば図４に示すように構成される。なお、図４において、図１における場合と対応する部分には、同一の符号を付してあり、その説明は適宜省略する。
【００７８】
図４の観察システムには、図１の観察システムの刺激用レーザユニット１５および励起用レーザユニット１６に代えて、刺激光と励起光を射出するレーザユニット１２１が設けられており、その他の構成は、図１の観察システムと同じとされている。
【００７９】
レーザユニット１２１には、同じ波長のレーザ光を射出するレーザ光源１３１とレーザ光源１３２とが設けられており、レーザ光源１３１から射出されたレーザ光は、ミラー１３３で反射され、さらにハーフミラー１３４でその一部が反射する。一方、レーザ光源１３２から射出されたレーザ光の一部は、ハーフミラー１３４を透過する。
【００８０】
このように、レーザ光源１３１とレーザ光源１３２から射出されたレーザ光は、ハーフミラー１３４で同一光路に合成され、ハーフミラー１３５に入射する。ハーフミラー１３４からハーフミラー１３５に入射したレーザ光は、その一部がハーフミラー１３５で反射されてミラー１３６に入射し、残りのレーザ光はハーフミラー１３５を透過する。
【００８１】
ハーフミラー１３５で反射されたレーザ光は、ミラー１３６で反射され、音響光学フィルタ１３７において適宜、波長選択および強度変調され、シャッタ１３８を通ってコリメートレンズ１３９により光ファイバ１８に導かれる。そして、光ファイバ１８に入射したレーザ光は、刺激光としてコンフォーカルヘッド１４のコリメートレンズ５１に入射する。
【００８２】
一方、ハーフミラー１３５を透過したレーザ光は、音響光学フィルタ１４０において適宜、波長選択および強度変調され、シャッタ１４１を通ってコリメートレンズ１４２により光ファイバ１９に導かれる。そして、光ファイバ１９に入射したレーザ光は、励起光としてコンフォーカルヘッド１４のコリメートレンズ５８に入射する。
【００８３】
このように、レーザユニット１２１では、同じ波長のレーザ光をハーフミラー１３５で分離することで、分離されたレーザ光を、それぞれ刺激光および励起光としてコンフォーカルヘッド１４に入射させることができる。
【００８４】
また、レーザユニット１２１では、ハーフミラー１３５で分離されたレーザ光の光路に、それぞれ音響光学フィルタ１３７と音響光学フィルタ１４０を設けたので、１つのレーザユニット１２１内で、刺激光と励起光の強度（光量）の調整を独立に行なうことができる。
【００８５】
なお、図４の観察システムの動作は、刺激光と励起光を射出する光源がレーザユニット１２１である点を除いて、図１の観察システムと同様であるので、その動作の説明は省略する。例えば、刺激光と励起光として、波長が488nmのレーザ光を用い、標本１７を光刺激しながら、蛍光観察する場合には、両面ミラー５２Ａとハーフミラー５５Ａが、刺激光と励起光の光路上に配置される。
【００８６】
また、図４の観察システムでは、レーザ光源１３１とレーザ光源１３２とから、互いに異なる波長のレーザ光を射出させれば、異なる波長のレーザ光を刺激光および励起光として利用することができる。そのような場合、ハーフミラー１３４では、レーザ光源１３１およびレーザ光源１３２からの互いに異なる波長のレーザ光を合成する。
【００８７】
そして、音響光学フィルタ１３７は、ミラー１３６から入射したレーザ光のうち、刺激光とすべき波長のレーザ光のみを、コントローラ１２により指定された強度で射出し、シャッタ１３８およびコリメートレンズ１３９を介して、光ファイバ１８に入射させる。
【００８８】
同様に、音響光学フィルタ１４０は、ハーフミラー１３５から入射したレーザ光のうち、励起光とすべき波長のレーザ光のみを、コントローラ１２により指定された強度で射出し、シャッタ１４１およびコリメートレンズ１４２を介して、光ファイバ１９に入射させる。
【００８９】
なお、スキャニング部５３の位置にスキャニング部５４が配置され、スキャニング部５４の位置にスキャニング部５３が配置されるようにしてもよい。また、スキャニング部５３とスキャニング部５４が、ともに２つのガルバノスキャナから構成されてもよいし、２つのレゾナントスキャナから構成されてもよい。
【００９０】
さらに、刺激光や励起光として、可視光以外の400nm以下の波長のUV光、700nm以上の波長の近赤外光や極短パルスレーザ光が用いられてもよい。
【００９１】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００９２】
１１ コンピュータ， １２ コントローラ， １３ 顕微鏡， １４ コンフォーカルヘッド， １５ 刺激用レーザユニット， １６ 励起用レーザユニット， １７ 標本， ３５ 音響光学フィルタ， ４５ 音響光学フィルタ， ５１ コリメートレンズ， ５２ 光路選択部， ５３ スキャニング部， ５４ スキャニング部， ５５ 光路選択部， ９１ レーザ光源， １２１ レーザユニット， １３５ ハーフミラー， １３７ 音響光学フィルタ， １４０ 音響光学フィルタ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光刺激をしながら蛍光観察を行なう場合において、標本の劣化を抑制することができるようにした走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、観察対象の標本を刺激光で刺激しつつ、標本を励起光で走査して標本の観察画像を取得する走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
この走査型顕微鏡では、ダイクロイックミラーで分離された刺激光と励起光が、それぞれ異なるスキャナを介して後段のダイクロイックミラーで合成され、標本に照射される。これにより、刺激光の走査と、励起光の走査とを独立に行なうことができる。
【０００４】
例えば、このような走査型顕微鏡を用いた観察では、標本としての細胞内にPA-GFP（Photo Activatable-Green Fluorescent Protein）と呼ばれる蛍光試薬が導入され、細胞の一部に405nmの強い光量の刺激光が照射される。そして、細胞における刺激光で刺激された部位周辺が変化する様子が、488nmの励起光で励起されながら、高速で捉えられる。
【０００５】
一方、細胞内に導入した蛍光タンパク質GFPの拡散現象を捉えるための手法として、FRAP（Fluorescence Recovery After Photobleaching）と呼ばれる手法が知られている。このFRAPは、細胞の一部に488nmの強い刺激光を照射しながら、その刺激光により周囲が変化する様子を同一波長である488nmの励起光で励起させて、蛍光観察を行なう手法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００８／００４３３６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところが、上述した走査型顕微鏡でFRAPによる標本観察をしようとすると、同一光源からの488nmのレーザ光を、ハーフミラーで分離して励起光および刺激光とすることになるので、励起光と刺激光の光量を独立して調整することはできなかった。そのため、刺激光の光量を多くして、細胞に強い刺激を与えようとすると、刺激による反応を観察するための励起光の光量も多くなってしまい、細胞内の刺激したい部位以外の部位にも強い光が照射されることになる。そうすると、余計な退色が生じて、細胞が劣化してしまう。
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、光刺激をしながら蛍光観察を行なう場合において、標本の劣化を抑制することができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の走査型顕微鏡は、入射した光で観察対象の標本を走査する第１のスキャニング部と、入射した光で前記標本を走査する第２のスキャニング部と、第１の点光源から入射した第１の光を反射面で反射して、前記第１のスキャニング部に入射させるとともに、前記第１の点光源とは異なる第２の点光源から入射した第２の光を前記反射面とは異なる他の反射面で反射して、前記第２のスキャニング部に入射させる反射部と、前記第１のスキャニング部から入射した前記第１の光の少なくとも一部を透過させるとともに、前記第２のスキャニング部から入射した前記第２の光の少なくとも一部を反射することで、前記第１の光と前記第２の光を前記標本に照射する合成部とを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、光刺激をしながら蛍光観察を行なう場合において、標本の劣化を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明を適用した観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。
【図２】ダイクロイックミラーの光学特性を示す図である。
【図３】観察システムの他の構成例を示す図である。
【図４】観察システムの他の構成例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。
【００１３】
〈第１の実施の形態〉
［観察システムの構成］
図１は、本発明を適用した観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。この観察システムは、コンピュータ１１、コントローラ１２、顕微鏡１３、コンフォーカルヘッド１４、刺激用レーザユニット１５、および励起用レーザユニット１６から構成される。
【００１４】
顕微鏡１３には、共焦点観察のためのコンフォーカルヘッド１４が接続されており、これにより顕微鏡１３は、走査型の共焦点顕微鏡として機能し、図示せぬステージ上に載置された標本１７を光刺激しながら蛍光観察することが可能となる。
【００１５】
また、コンフォーカルヘッド１４には、光刺激用の刺激光を射出する刺激用レーザユニット１５と、蛍光観察用の励起光を射出する励起用レーザユニット１６とが、光ファイバ１８および光ファイバ１９により接続されている。ユーザは、コンピュータ１１を操作することで、コンピュータ１１にコントローラ１２を制御させ、コンフォーカルヘッド１４乃至励起用レーザユニット１６を動作させることができる。
【００１６】
刺激用レーザユニット１５には、刺激光としてのレーザ光を射出するレーザ光源３１とレーザ光源３２が設けられており、レーザ光源３１から射出された刺激光は、ミラー３３で反射され、さらにダイクロイックミラー３４で反射する。一方、レーザ光源３２から射出された刺激光は、そのままダイクロイックミラー３４を透過する。レーザ光源３１とレーザ光源３２からは、互いに異なる波長の刺激光が射出されるようになされており、何れか一方、または両方の波長の刺激光を射出させることが可能である。
【００１７】
なお、レーザ光源３１とレーザ光源３２から、同じ波長のレーザ光を射出させる場合には、ダイクロイックミラー３４に代えて、ハーフミラーがレーザ光の光路上に配置され、レーザ光源３１とレーザ光源３２からのレーザ光が同一光路に合成される。
【００１８】
また、ダイクロイックミラー３４からの刺激光は、音響光学フィルタ３５において適宜、波長選択および強度変調され、シャッタ３６を通ってコリメートレンズ３７により光ファイバ１８に導かれる。そして、光ファイバ１８に入射した刺激光は、光ファイバ１８を通ってコンフォーカルヘッド１４に入射する。
【００１９】
同様に、励起用レーザユニット１６には、レーザ光源４１、レーザ光源４２、ミラー４３、ダイクロイックミラー４４、音響光学フィルタ４５、シャッタ４６、およびコリメートレンズ４７が設けられている。これらのレーザ光源４１乃至コリメートレンズ４７は、刺激用レーザユニット１５に設けられたレーザ光源３１乃至コリメートレンズ３７に対応し、これらの部材と同じ機能を有している。
【００２０】
励起用レーザユニット１６においても、レーザ光源４１とレーザ光源４２からは、互いに異なる波長の励起光が射出されるようになされており、それらの何れか一方、または両方の波長の励起光を射出させることが可能である。また、コリメートレンズ４７により集光された励起光は、光ファイバ１９に導かれてコンフォーカルヘッド１４に入射する。
【００２１】
刺激用レーザユニット１５から光ファイバ１８を介して、コンフォーカルヘッド１４に入射した刺激光は、コリメートレンズ５１を通って光路選択部５２に入射する。すなわち、光ファイバ１８とコンフォーカルヘッド１４の接続部分が点光源となり、この点光源からの刺激光がコリメートレンズ５１により集光されて、光路選択部５２に入射する。
【００２２】
光路選択部５２は、刺激光と励起光の光路上に設けられ、入射した光の光路を選択する。すなわち、光路選択部５２は、モータにより回転駆動するターレットと、刺激光および励起光の光路上に配置され、ターレットに保持される光学部材とから構成される。
【００２３】
光路選択部５２のターレットには、光学部材として、対向する表面と裏面の両方がミラーとなっている両面ミラー５２Ａと、入射した光をそのまま通過させる中空な中空ブロック５２Ｂとが保持されている。光路選択部５２に入射した刺激光や励起光等の光は、その光の波長と、光の光路上に配置された光学部材によって、スキャニング部５３またはスキャニング部５４へと導かれる。
【００２４】
例えば、図１の例では、刺激光の光路上には両面ミラー５２Ａが配置されているので、コリメートレンズ５１から光路選択部５２に入射した刺激光は、両面ミラー５２Ａにより反射されてスキャニング部５３に入射する。なお、光路選択部５２のターレットに保持される光学部材は、その他、ダイクロイックミラーや素ガラス、ハーフミラーなどとされてもよい。
【００２５】
このように、光路上に両面ミラー５２Ａを配置すれば、コンフォーカルヘッド１４の外部から、独立して波長および光量を制御したレーザ光を、コンフォーカルヘッド１４の光路に導入し、合成することができる。
【００２６】
スキャニング部５３に入射した刺激光は、スキャニング部５３により偏向されて光路選択部５５に入射する。例えば、スキャニング部５３は、刺激光を偏向させる２つのガルバノスキャナにより構成される。
【００２７】
また、光路選択部５５も光路選択部５２と同じ構成とされており、光路選択部５５には、ハーフミラー５５Ａとダイクロイックミラー５５Ｂが保持されている。図１の例では、刺激光の光路上には、ハーフミラー５５Ａが配置されているので、光路選択部５５に入射した刺激光の一部は、ハーフミラー５５Ａを透過し、結像レンズ５６および対物レンズ５７を通って、標本１７に照射される。
【００２８】
これにより、標本１７が刺激光により刺激されることになる。なお、光路選択部５５のターレットにも、光学部材としてミラー、素ガラス、中空ブロックなどが保持されるようにしてもよい。また、コリメートレンズ５１は、刺激光の光路方向、すなわちコリメートレンズ５１の光軸方向に移動可能とされており、コリメートレンズ５１が光軸方向に移動されると、標本１７における刺激光の集光位置が対物レンズ５７の光軸方向に変化する。これにより、標本１７の深さ方向（対物レンズ５７の光軸方向）の任意の位置を、刺激光により光刺激することが可能となる。
【００２９】
さらに、励起用レーザユニット１６から光ファイバ１９を介して、コンフォーカルヘッド１４に入射した励起光は、コリメートレンズ５８を通ってダイクロイックミラー５９に入射する。すなわち、光ファイバ１９とコンフォーカルヘッド１４の接続部分が点光源となり、この点光源からの励起光がコリメートレンズ５８により集光されて、ダイクロイックミラー５９で反射し、光路選択部５２に入射する。
【００３０】
図１の例では、励起光の光路上には両面ミラー５２Ａが配置されているので、光路選択部５２に入射した励起光は、両面ミラー５２Ａで反射され、スキャニング部５４に入射する。ここで、刺激光と励起光は、それぞれ両面ミラー５２Ａの異なる反射面に入射して、反射される。
【００３１】
スキャニング部５４に入射した励起光は、スキャニング部５４により偏向されて光路選択部５５に入射する。例えば、スキャニング部５４は、励起光を偏向させるガルバノスキャナ、およびレゾナントスキャナから構成される。このスキャニング部５４によれば、スキャニング部５３と比べて、より高速に走査を行なうことができる。
【００３２】
また、スキャニング部５４から光路選択部５５に入射した励起光の一部は、光路選択部５５のハーフミラー５５Ａにより反射され、結像レンズ５６および対物レンズ５７を通って標本１７に照射される。
【００３３】
励起光が標本１７に照射されると、標本１７からは蛍光が生じ、この蛍光は対物レンズ５７および結像レンズ５６を通って光路選択部５５に入射する。図１の例では、蛍光を検出する光路上には、ハーフミラー５５Ａが配置されているので、蛍光の半分がハーフミラー５５Ａで反射され、さらにスキャニング部５４でデスキャンされて、光路選択部５２に入射する。
【００３４】
さらに光路選択部５２に入射した蛍光は、光路選択部５２の両面ミラー５２Ａで反射するとともに、ダイクロイックミラー５９を透過し、集光レンズ６０により集光される。ダイクロイックミラー５９は、励起光の波長の光を反射させ、蛍光の波長の光を透過するようになされている。
【００３５】
また、集光レンズ６０により集光された蛍光は、ピンホール６１を通って光検出器６２に入射し、受光される。ピンホール６１は、対物レンズ５７の焦点位置、つまり標本１７の観察面と共役な位置に配置されており、ピンホール６１の位置に集光された蛍光だけが光検出器６２に入射するようになされている。
【００３６】
光検出器６２は、入射した蛍光を受光して光電変換することで、蛍光を、蛍光の受光強度を示す電気信号に変換する。光電変換により得られた電気信号は、光検出器６２からコントローラ１２へと供給される。コントローラ１２は、光検出器６２から供給された電気信号に基づいて、標本１７の観察面の画像である観察画像を生成し、コンピュータ１１に供給する。また、コンピュータ１１は、コントローラ１２から供給された観察画像をディスプレイに表示する。
【００３７】
［観察システムの動作の説明１］
次に、図１の観察システムの動作について説明する。
【００３８】
まず、波長が488nmの刺激光で標本１７を刺激しながら、波長が488nmの励起光で標本１７を走査して、標本１７を蛍光観察する場合について説明する。
【００３９】
この場合、ユーザがコンピュータ１１を操作して、標本１７の観察開始を指示すると、コントローラ１２は、コンピュータ１１の指示に従って、光路選択部５２および光路選択部５５を動作させる。光路選択部５２は、コントローラ１２の制御に基づいてターレットを回転させ、両面ミラー５２Ａを刺激光および励起光の光路上に配置する。また、光路選択部５５は、コントローラ１２の制御に基づいてターレットを回転させ、ハーフミラー５５Ａを刺激光および励起光の光路上に配置する。
【００４０】
また、コントローラ１２は、刺激用レーザユニット１５および励起用レーザユニット１６に、波長が488nmの刺激光および励起光を射出させるとともに、音響光学フィルタ３５と音響光学フィルタ４５を制御して、刺激光と励起光の光量調整を行なわせる。このように、観察システムでは、同じ波長の刺激光と励起光の光量調整を、それぞれ独立に行なうことができる。したがって、標本１７に照射される光が必要以上に強くなることを防止し、その結果、退色等による標本１７の劣化を抑制することができる。
【００４１】
刺激用レーザユニット１５から射出された刺激光は、光ファイバ１８およびコリメートレンズ５１を通って両面ミラー５２Ａで反射され、スキャニング部５３に入射する。そして、両面ミラー５２Ａからの刺激光は、スキャニング部５３で偏向されてハーフミラー５５Ａ、結像レンズ５６、および対物レンズ５７を通って、標本１７に照射される。このとき、スキャニング部５３は、刺激光を偏向することにより、刺激光で標本１７の観察面を走査する。
【００４２】
また、励起用レーザユニット１６から射出された励起光は、光ファイバ１９およびコリメートレンズ５８を通ってダイクロイックミラー５９で反射され、両面ミラー５２Ａに入射する。そして、両面ミラー５２Ａに入射した励起光は、両面ミラー５２Ａの刺激光が反射された面とは異なる面で反射されて、さらにスキャニング部５４で偏向される。スキャニング部５４で偏向された励起光は、ハーフミラー５５Ａで反射され、結像レンズ５６、および対物レンズ５７を通って、標本１７に照射される。このとき、スキャニング部５４は、励起光を偏向することにより、励起光で標本１７の観察面を走査する。
【００４３】
このように、観察システムでは、異なる点光源から入射した刺激光と励起光とを、両面ミラー５２Ａの異なる面で反射させて、スキャニング部５３とスキャニング部５４に入射させ、ハーフミラー５５Ａで合成することで、刺激光と励起光の光量調整を独立して行なうことができる。
【００４４】
また、観察システムでは、刺激光と励起光を異なるスキャニング部で走査するので、標本１７の所望する部位を刺激すると同時に、刺激を与える部位とは異なる部位に励起光を照射することができる。これにより、標本１７の特定の部位に刺激光を照射する光刺激時に、標本１７全体に余計なレーザ光が照射されずに済むので、標本１７の退色を防止することができる。また、観察の自由度を向上させることもできる。
【００４５】
このようにして、標本１７に励起光が照射されると、標本１７からは蛍光が生じ、この蛍光は、対物レンズ５７と結像レンズ５６を通ってハーフミラー５５Ａで反射され、さらにスキャニング部５４でデスキャンされる。そして、スキャニング部５４から射出された蛍光は、両面ミラー５２Ａで反射されて、ダイクロイックミラー５９乃至ピンホール６１を通り、光検出器６２に受光される。
【００４６】
蛍光が光電変換されると、光検出器６２からコントローラ１２には、蛍光の受光量に応じた電気信号が供給されるので、コントローラ１２は、この電気信号から観察画像を生成してコンピュータ１１に供給する。これにより、ユーザは、コンピュータ１１に表示される観察画像を見て、標本１７を観察することができる。
【００４７】
なお、以上においては、光路選択部５５が、光路上にハーフミラー５５Ａを配置する例について説明したが、この例では、標本１７からの蛍光の光量は、ハーフミラー５５Ａにおいて半分に減ってしまう。そこで、蛍光の光量のロスを低減させるために、光路選択部５５が、光路上にダイクロイックミラー５５Ｂを配置するようにしてもよい。
【００４８】
例えば、蛍光の波長が500nm以上であるとすると、ダイクロイックミラー５５Ｂは、図２に示すように、入射した490nm未満の波長の光の半分を透過させ、残りの半分の光を反射させるとともに、入射した500nm以上の波長の光を反射させる特性を有するものとされる。このようなダイクロイックミラー５５Ｂを光路上に配置すれば、標本１７から入射した蛍光の殆どが、ダイクロイックミラー５５Ｂで反射されることになり、蛍光の光量低下を抑制できる。
【００４９】
なお、図２において、縦軸はダイクロイックミラー５５Ｂの反射面における光の反射率を示しており、横軸は光の波長を示している。図２の例では、波長が490nm乃至500nmの間の光は、その波長が長いものほど反射率が高くなっている。
【００５０】
［観察システムの動作の説明２］
さらに、光刺激を行なわず、励起光だけを標本１７に照射する場合には、コントローラ１２は、スキャニング部５４とスキャニング部５３の何れを用いて励起光の走査を行なうかによって、光路上に配置される光路選択用の光学部材を切り替える。
【００５１】
例えば、励起光の走査をスキャニング部５４により行なう場合、コントローラ１２は、光路選択部５２に両面ミラー５２Ａあるいは、図示せぬミラーを励起光の光路上に配置させるとともに、光路選択部５５にも図示せぬミラーを励起光の光路上に配置させる。
【００５２】
そうすると、励起用レーザユニット１６から射出された励起光は、光ファイバ１９およびコリメートレンズ５８を通ってダイクロイックミラー５９で反射され、光路選択部５２に入射する。そして、光路選択部５２に入射した励起光は、光路選択部５２のミラーにより反射され、スキャニング部５４により偏向されて光路選択部５５に入射する。さらに、光路選択部５５に入射した励起光は、光路選択部５５のミラーで反射され、結像レンズ５６および対物レンズ５７を通って標本１７に照射される。
【００５３】
また、標本１７で生じた蛍光は、励起光と逆の光路を通ってダイクロイックミラー５９に入射する。すなわち、蛍光は、光路選択部５５のミラーで反射されて、スキャニング部５４でデスキャンされ、さらに光路選択部５２のミラーで反射される。そして、蛍光は、ダイクロイックミラー５９乃至ピンホール６１を通って光検出器６２に受光される。
【００５４】
さらに、例えば、励起光の走査をスキャニング部５３により行なう場合、コントローラ１２は、光路選択部５２に中空ブロック５２Ｂを励起光の光路上に配置させるとともに、光路選択部５５にも図示せぬ中空ブロックを励起光の光路上に配置させる。
【００５５】
そうすると、励起用レーザユニット１６から射出された励起光は、ダイクロイックミラー５９で反射された後、中空ブロック５２Ｂをそのまま通ってスキャニング部５３に入射する。この励起光は、スキャニング部５３により偏向されて光路選択部５５の中空ブロック、結像レンズ５６、および対物レンズ５７を通って標本１７に照射される。
【００５６】
また、標本１７で生じた蛍光は、励起光と逆の光路を通ってダイクロイックミラー５９に入射する。すなわち、蛍光は、光路選択部５５の中空ブロックを通って、スキャニング部５３でデスキャンされ、さらに中空ブロック５２Ｂを通過する。そして、中空ブロック５２Ｂを通過した蛍光は、ダイクロイックミラー５９乃至ピンホール６１を通って光検出器６２に受光される。
【００５７】
さらに、例えば励起用レーザユニット１６からのみレーザ光を射出させ、光路選択部５２と光路選択部５５とが、光路上にハーフミラーおよびハーフミラー５５Ａを配置するようにしてもよい。この場合、スキャニング部５３とスキャニング部５４を用いて、同じ波長の異なる光路のレーザ光で、それぞれ標本１７を走査することができる。
【００５８】
例えば、このような場合には、光路選択部５２を透過したレーザ光が刺激光とされ、光路選択部５２で反射されたレーザ光が励起光とされる。この例において、例えば光路選択部５２とスキャニング部５３の間に音響光学フィルタを配置するとともに、光路選択部５２とスキャニング部５４の間に音響光学フィルタを配置すれば、これらの音響光学フィルタによって、刺激光と励起光の光量調整を独立して行なうことができる。
【００５９】
以上のように、観察システムでは、励起光や刺激光が標本１７の観察目的に合った光路を通るように、つまり所望のスキャニング部に入射するように、それらの光の光路上に光路選択部５２と光路選択部５５に保持されている光路選択用の光学部材が選択的に配置される。これにより、簡単な構成で標本１７の観察の自由度を向上させることができる。
【００６０】
［観察システムの動作の説明３］
次に、蛍光タンパク質であるKAEDEを標本１７としての細胞に導入し、波長が405nmの刺激光で標本１７を刺激しながら、波長が488nmの励起光で標本１７を走査して、標本１７を蛍光観察する場合について説明する。なお、観察される蛍光の波長は、500nm以上とされる。
【００６１】
このような場合、コントローラ１２は、コンピュータ１１の指示に従って、光路選択部５２に、両面ミラー５２Ａを刺激光および励起光の光路上に配置させ、光路選択部５５に、ダイクロイックミラー５５Ｂを刺激光および励起光の光路上に配置させる。そして、コントローラ１２は、刺激用レーザユニット１５に波長が405nmの刺激光を射出させるとともに、励起用レーザユニット１６に、波長が488nmの励起光を射出させる。
【００６２】
すると、刺激用レーザユニット１５から射出された刺激光は、光ファイバ１８およびコリメートレンズ５１を通って両面ミラー５２Ａで反射され、スキャニング部５３に入射する。そして、両面ミラー５２Ａからの刺激光は、スキャニング部５３で偏向されてダイクロイックミラー５５Ｂ乃至対物レンズ５７を通って、標本１７に照射される。このとき、スキャニング部５３は、刺激光を偏向することにより、刺激光で標本１７の観察面を走査する。
【００６３】
また、励起用レーザユニット１６から射出された励起光は、光ファイバ１９乃至ダイクロイックミラー５９を通って両面ミラー５２Ａで反射され、スキャニング部５４で偏向される。スキャニング部５４で偏向された励起光は、ダイクロイックミラー５５Ｂ乃至対物レンズ５７を通り、標本１７に照射される。このとき、スキャニング部５４は、励起光を偏向することにより、励起光で標本１７の観察面を走査する。
【００６４】
ここで、ダイクロイックミラー５５Ｂは、入射した410nm未満の波長の光を透過させ、入射した450nm以上の波長の光を反射させる特性を有するものとされる。
【００６５】
このようなダイクロイックミラー５５Ｂを光路上に配置すれば、波長が405nmの刺激光はダイクロイックミラー５５Ｂを透過し、波長が488nmの励起光、および波長が500nm以上である蛍光は、ダイクロイックミラー５５Ｂで反射することになる。したがって、この場合においても、ダイクロイックミラー５５Ｂにおける蛍光の光量低下を抑制することができる。
【００６６】
このようにして、標本１７に励起光が照射されると、標本１７からは蛍光が生じ、この蛍光は、対物レンズ５７と結像レンズ５６を通ってダイクロイックミラー５５Ｂで反射され、さらにスキャニング部５４でデスキャンされる。そして、スキャニング部５４から射出された蛍光は、両面ミラー５２Ａで反射されて、ダイクロイックミラー５９乃至ピンホール６１を通り、光検出器６２に受光される。
【００６７】
光検出器６２により蛍光が光電変換されて電気信号が得られると、コントローラ１２で、この電気信号から観察画像が生成され、コンピュータ１１で観察画像が表示される。
【００６８】
なお、励起用レーザユニット１６には、レーザ光源４１とレーザ光源４２が設けられているので、刺激光と励起光の波長が異なる場合に、刺激光と励起光を励起用レーザユニット１６から射出させるようにしてもよい。
【００６９】
そのような場合、例えば、光路選択部５２は、図示せぬダイクロイックミラーを刺激光と励起光の光路上に配置し、光路選択部５５は、ダイクロイックミラー５５Ｂを刺激光と励起光の光路上に配置する。
【００７０】
これにより、ダイクロイックミラー５９から光路選択部５２に入射した刺激光と励起光のうちの一方の光を、光路上に配置されたダイクロイックミラーによりスキャニング部５３に入射させ、他方の光をスキャニング部５４に入射させることができる。同様に、ダイクロイックミラー５５Ｂでは、互いに異なる光路を通って入射した刺激光と励起光を合成し、結像レンズ５６に入射させることができる。
【００７１】
〈第２の実施の形態〉
［観察システムの構成］
なお、以上においては、外部の刺激用レーザユニット１５と励起用レーザユニット１６から、刺激光と励起光をコンフォーカルヘッド１４に入射させると説明したが、刺激光と励起光の両方の光源、または何れか一方の光源がコンフォーカルヘッド１４内に設けられるようにしてもよい。
【００７２】
例えば、刺激光の光源がコンフォーカルヘッド１４内に設けられる場合、観察システムは、図３に示すように構成される。なお、図３において、図１における場合と対応する部分には、同一の符号を付してあり、その説明は適宜省略する。
【００７３】
図３の観察システムには、図１の観察システムの刺激用レーザユニット１５に代えて、コンフォーカルヘッド１４内部にレーザ光源９１が設けられており、その他の構成は、図１の観察システムと同じとされている。
【００７４】
レーザ光源９１は、例えばレーザダイオードなどの点光源からなり、コントローラ１２の制御に基づいて標本１７の光刺激に用いられる刺激光を射出する。レーザ光源９１から射出された刺激光は、コリメートレンズ５１により集光されて、光路選択部５２に入射する。
【００７５】
なお、図３の観察システムの動作は、刺激光を射出する光源がレーザ光源９１である点を除いて、図１の観察システムと同様であるので、その動作の説明は省略する。
【００７６】
〈第３の実施の形態〉
［観察システムの構成］
さらに、図１の例では、異なるレーザユニットからの刺激光と励起光をコンフォーカルヘッド１４に入射させると説明したが、１つのレーザユニットから、刺激光と励起光をコンフォーカルヘッド１４に入射させるようにしてもよい。
【００７７】
そのような場合、観察システムは、例えば図４に示すように構成される。なお、図４において、図１における場合と対応する部分には、同一の符号を付してあり、その説明は適宜省略する。
【００７８】
図４の観察システムには、図１の観察システムの刺激用レーザユニット１５および励起用レーザユニット１６に代えて、刺激光と励起光を射出するレーザユニット１２１が設けられており、その他の構成は、図１の観察システムと同じとされている。
【００７９】
レーザユニット１２１には、同じ波長のレーザ光を射出するレーザ光源１３１とレーザ光源１３２とが設けられており、レーザ光源１３１から射出されたレーザ光は、ミラー１３３で反射され、さらにハーフミラー１３４でその一部が反射する。一方、レーザ光源１３２から射出されたレーザ光の一部は、ハーフミラー１３４を透過する。
【００８０】
このように、レーザ光源１３１とレーザ光源１３２から射出されたレーザ光は、ハーフミラー１３４で同一光路に合成され、ハーフミラー１３５に入射する。ハーフミラー１３４からハーフミラー１３５に入射したレーザ光は、その一部がハーフミラー１３５で反射されてミラー１３６に入射し、残りのレーザ光はハーフミラー１３５を透過する。
【００８１】
ハーフミラー１３５で反射されたレーザ光は、ミラー１３６で反射され、音響光学フィルタ１３７において適宜、波長選択および強度変調され、シャッタ１３８を通ってコリメートレンズ１３９により光ファイバ１８に導かれる。そして、光ファイバ１８に入射したレーザ光は、刺激光としてコンフォーカルヘッド１４のコリメートレンズ５１に入射する。
【００８２】
一方、ハーフミラー１３５を透過したレーザ光は、音響光学フィルタ１４０において適宜、波長選択および強度変調され、シャッタ１４１を通ってコリメートレンズ１４２により光ファイバ１９に導かれる。そして、光ファイバ１９に入射したレーザ光は、励起光としてコンフォーカルヘッド１４のコリメートレンズ５８に入射する。
【００８３】
このように、レーザユニット１２１では、同じ波長のレーザ光をハーフミラー１３５で分離することで、分離されたレーザ光を、それぞれ刺激光および励起光としてコンフォーカルヘッド１４に入射させることができる。
【００８４】
また、レーザユニット１２１では、ハーフミラー１３５で分離されたレーザ光の光路に、それぞれ音響光学フィルタ１３７と音響光学フィルタ１４０を設けたので、１つのレーザユニット１２１内で、刺激光と励起光の強度（光量）の調整を独立に行なうことができる。
【００８５】
なお、図４の観察システムの動作は、刺激光と励起光を射出する光源がレーザユニット１２１である点を除いて、図１の観察システムと同様であるので、その動作の説明は省略する。例えば、刺激光と励起光として、波長が488nmのレーザ光を用い、標本１７を光刺激しながら、蛍光観察する場合には、両面ミラー５２Ａとハーフミラー５５Ａが、刺激光と励起光の光路上に配置される。
【００８６】
また、図４の観察システムでは、レーザ光源１３１とレーザ光源１３２とから、互いに異なる波長のレーザ光を射出させれば、異なる波長のレーザ光を刺激光および励起光として利用することができる。そのような場合、ハーフミラー１３４では、レーザ光源１３１およびレーザ光源１３２からの互いに異なる波長のレーザ光を合成する。
【００８７】
そして、音響光学フィルタ１３７は、ミラー１３６から入射したレーザ光のうち、刺激光とすべき波長のレーザ光のみを、コントローラ１２により指定された強度で射出し、シャッタ１３８およびコリメートレンズ１３９を介して、光ファイバ１８に入射させる。
【００８８】
同様に、音響光学フィルタ１４０は、ハーフミラー１３５から入射したレーザ光のうち、励起光とすべき波長のレーザ光のみを、コントローラ１２により指定された強度で射出し、シャッタ１４１およびコリメートレンズ１４２を介して、光ファイバ１９に入射させる。
【００８９】
なお、スキャニング部５３の位置にスキャニング部５４が配置され、スキャニング部５４の位置にスキャニング部５３が配置されるようにしてもよい。また、スキャニング部５３とスキャニング部５４が、ともに２つのガルバノスキャナから構成されてもよいし、２つのレゾナントスキャナから構成されてもよい。
【００９０】
さらに、刺激光や励起光として、可視光以外の400nm以下の波長のUV光、700nm以上の波長の近赤外光や極短パルスレーザ光が用いられてもよい。
【００９１】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００９２】
１１ コンピュータ， １２ コントローラ， １３ 顕微鏡， １４ コンフォーカルヘッド， １５ 刺激用レーザユニット， １６ 励起用レーザユニット， １７ 標本， ３５ 音響光学フィルタ， ４５ 音響光学フィルタ， ５１ コリメートレンズ， ５２ 光路選択部， ５３ スキャニング部， ５４ スキャニング部， ５５ 光路選択部， ９１ レーザ光源， １２１ レーザユニット， １３５ ハーフミラー， １３７ 音響光学フィルタ， １４０ 音響光学フィルタ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
入射した光で観察対象の標本を走査する第１のスキャニング部と、
入射した光で前記標本を走査する第２のスキャニング部と、
第１の点光源から入射した第１の光を反射面で反射して、前記第１のスキャニング部に入射させるとともに、前記第１の点光源とは異なる第２の点光源から入射した第２の光を前記反射面とは異なる他の反射面で反射して、前記第２のスキャニング部に入射させる反射部と、
前記第１のスキャニング部から入射した前記第１の光の少なくとも一部を透過させるとともに、前記第２のスキャニング部から入射した前記第２の光の少なくとも一部を反射することで、前記第１の光と前記第２の光を前記標本に照射する合成部と
を備えることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記反射部を含む複数の第１の光学部材を保持するとともに、前記複数の前記第１の光学部材のうちの何れかを、前記第１の光および前記第２の光の光路上に配置する第１の光路選択部をさらに備える
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記第１の光路選択部は、前記第１の光と前記第２の光の波長が同じである場合、前記反射部を前記光路上に配置する
ことを特徴とする請求項２に記載の走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記合成部を含む複数の第２の光学部材を保持するとともに、前記複数の前記第２の光学部材のうちの何れかを、前記第１の光および前記第２の光の光路上に配置する第２の光路選択部をさらに備える
ことを特徴とする請求項３に記載の走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記第１の点光源と前記第１のスキャニング部との間に配置され、前記標本における前記第１の光の集光位置を、前記第１の光の光路方向に変化させる集光部をさらに備える
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項６】
光源から射出されたレーザ光を、前記第１の光と前記第２の光とに分離する分離部と、
前記分離部からの前記第１の光の光量を調整して、光量調整後の前記第１の光を前記反射部に入射させる第１の光量調整部と、
前記分離部からの前記第２の光の光量を調整して、光量調整後の前記第２の光を前記反射部に入射させる第２の光量調整部と
をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記反射部の前記他の反射面は、前記反射面の裏面である
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項１】
入射した光で観察対象の標本を走査する第１のスキャニング部と、
入射した光で前記標本を走査する第２のスキャニング部と、
第１の点光源から入射した第１の光を反射面で反射して、前記第１のスキャニング部に入射させるとともに、前記第１の点光源とは異なる第２の点光源から入射した第２の光を前記反射面とは異なる他の反射面で反射して、前記第２のスキャニング部に入射させる反射部と、
前記第１のスキャニング部から入射した前記第１の光の少なくとも一部を透過させるとともに、前記第２のスキャニング部から入射した前記第２の光の少なくとも一部を反射することで、前記第１の光と前記第２の光を前記標本に照射する合成部と
を備えることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記反射部を含む複数の第１の光学部材を保持するとともに、前記複数の前記第１の光学部材のうちの何れかを、前記第１の光および前記第２の光の光路上に配置する第１の光路選択部をさらに備える
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記第１の光路選択部は、前記第１の光と前記第２の光の波長が同じである場合、前記反射部を前記光路上に配置する
ことを特徴とする請求項２に記載の走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記合成部を含む複数の第２の光学部材を保持するとともに、前記複数の前記第２の光学部材のうちの何れかを、前記第１の光および前記第２の光の光路上に配置する第２の光路選択部をさらに備える
ことを特徴とする請求項３に記載の走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記第１の点光源と前記第１のスキャニング部との間に配置され、前記標本における前記第１の光の集光位置を、前記第１の光の光路方向に変化させる集光部をさらに備える
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項６】
光源から射出されたレーザ光を、前記第１の光と前記第２の光とに分離する分離部と、
前記分離部からの前記第１の光の光量を調整して、光量調整後の前記第１の光を前記反射部に入射させる第１の光量調整部と、
前記分離部からの前記第２の光の光量を調整して、光量調整後の前記第２の光を前記反射部に入射させる第２の光量調整部と
をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記反射部の前記他の反射面は、前記反射面の裏面である
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１３９９５（Ｐ２０１２−１３９９５Ａ）
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５１１０２（Ｐ２０１０−１５１１０２）
【出願日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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