転移因子の転移が抑制された納豆菌、該納豆菌を用いて製造された納豆
【課題】転移因子の転移が抑制されていることにより、植え継ぎを繰り返した場合でも、γ−ＰＧＡ生産性などの納豆製造に重要な性質が安定に保持された納豆菌を育種、開発し、該納豆菌を用いて製造された品質の良い納豆を安定して提供する。
【解決手段】ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させて、ｃｏｍＰ遺伝子への転移因子の転移を抑制することにより、植え継ぎを繰り返した場合でもγ−ＰＧＡ非生産性株の出現頻度が低い納豆菌を得る。また、該納豆菌を用いて納豆を製造する。
【解決手段】ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させて、ｃｏｍＰ遺伝子への転移因子の転移を抑制することにより、植え継ぎを繰り返した場合でもγ−ＰＧＡ非生産性株の出現頻度が低い納豆菌を得る。また、該納豆菌を用いて納豆を製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転移因子の転移が抑制された納豆菌及び該納豆菌を用いて製造された納豆に関する。さらに詳細には、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させることにより、転移因子の転移が抑制された納豆菌、ｃｏｍＰ遺伝子への転移因子の転移が抑制された納豆菌、及び、ポリグルタミン酸の非生産性株の出現が抑制された納豆菌、及び該納豆菌を用いて製造された納豆に関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆を製造する際に使用される納豆菌はバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に分類されるグラム陽性の細菌であるが、同じバシラス・サチリスに分類されている枯草菌とは異なる性質を持つことが知られている。
【０００３】
例えば、納豆菌は納豆の大きな特徴である糸引物質（粘物質）をつくり出すことができ、また生育にビオチンを要求するなどの実験室で使用されている枯草菌、特に１６８株とは異なる特徴を有しており、また最近では、枯草菌１６８株は転移因子を持たないのに対して、納豆菌は少なくとも２種以上の転移因子をその染色体上に保持していることが知られてきた（例えば、非特許文献１及び２参照）。
【０００４】
転移因子としては、トランスポゾン（以下、Ｔｎと称する場合もある）や挿入配列（以下、ＩＳと称する場合もある）などが一般に知られている。
このうちＩＳは比較的単純な遺伝子構造であり、ＩＳ自身を染色体の別の位置に転移させる酵素（トランスポザーゼ）をコードするトランスポザーゼ遺伝子と、それが逆方向反復塩基配列によって挟まれた構造を有しており、染色体上の別の位置に転移して、転移先に元々存在していた遺伝子を破壊したりする特性を持っている。
【０００５】
従来から納豆菌は自然に変異しやすい性質を有しているとされており、普通に培養しているだけで納豆菌の性質が大きく変化する場合があるが、このような自然変異に関して納豆菌の転移因子が関与している場合のあることが知られてきた。
【０００６】
例えば、納豆菌ＩＳの１種であるＩＳ４Ｂｓｕ１は、納豆の大きな特徴である糸引物質の主成分であるポリグルタミン酸（以下、γ−ＰＧＡと称する場合もある）の合成に関わる遺伝子群の一つ（ｃｏｍＰ遺伝子）に高頻度で転移し、ｃｏｍＰ遺伝子を破壊してしまう結果、γ−ＰＧＡの合成が停止して糸引物質を生産できない納豆菌が出現することが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００７】
また、転移因子ＩＳ４Ｂｓｕ１とは別に、ｃｏｍＰ遺伝子中に転移してγ−ＰＧＡの合成を停止させる転移因子ＩＳ２５６Ｂｓｕ１も同定されており（例えば、非特許文献２参照）、これらのＩＳは染色体上に複数、そして散在していることが知られている。
【０００８】
このように、納豆菌中に存在するＩＳが染色体上を転移することにより、納豆菌の性質が大きく変化し、例えば、納豆菌を特徴付ける重要な性質である糸引物質を生産できない納豆菌が出現したりする結果、種菌を調製する際や納豆の発酵工程において重大な支障が生じる場合があった。
【０００９】
そこで、納豆菌からＩＳを除去する方法や、納豆菌中でのＩＳの転移を抑制する方法などの開発が求められていたが、未だ有効な方法は全く開発されていなかった。
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、１８２巻、ｐ．２３８７−２３９２、２０００年
【非特許文献２】バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー(Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．)、７１巻、ｐ．２４５８−２４６４、２００７年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、転移因子の転移が抑制されていることにより、植え継ぎを繰り返した場合でも、γ−ＰＧＡ生産性などの納豆製造に重要な性質が安定に保持された納豆菌を育種、開発し、該納豆菌を用いて製造された品質の良い納豆を安定して提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、納豆菌の転移因子の転移機構について鋭意検討を重ねた結果、納豆菌の組換え酵素（以下、ＲｅｃＡと称する場合も有る）が、転移因子の転移を促進していることを見出した。
【００１２】
そこで、納豆菌のＲｅｃＡをコードする遺伝子（以下、ｒｅｃＡ遺伝子と称する場合もある）を欠損させた結果、植え継ぎを繰り返した場合でも、転移因子の転移が抑制されることを見出した。
【００１３】
さらに、このようなｒｅｃＡ遺伝子を欠損させた納豆菌においては、通常の納豆菌ではｃｏｍＰ遺伝子中に高頻度で転移する従来既知の２種類の転移因子（ＩＳ４Ｂｓｕ１、ＩＳ２５６Ｂｓｕ１）転移因子が転移しなくなることを確認し、その結果、γ−ＰＧＡの生産性が安定して維持できることも確認して目的の納豆菌を開発しうることを見出して本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の納豆菌及び納豆に関する。
（１）ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させることにより、転移因子の転移が抑制されたことを特徴とする納豆菌。
（２）ｃｏｍＰ遺伝子への転移因子の転移が抑制されたことを特徴とする（１）に記載の納豆菌。
（３）１２世代培養後もγ−ＰＧＡ非生産株が出現しないことを特徴とする（１）又は（２）に記載の納豆菌。
（４）バシラス・サチリス ＲＥＣ７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＥＣ７）株（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９９４）であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１つに記載の納豆菌。
（５）（１）〜（４）のいずれか１つに記載の納豆菌を用いて製造されたことを特徴とする納豆。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させて挿入因子の転移を抑制することにより、γ−ＰＧＡ非生産性株の出現頻度が低下した納豆菌を育種開発することが可能となり、該納豆菌を用いて納豆を製造することにより、品質の良い納豆を安定して製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明で育種改良に用いる元の納豆菌には特に制限はないが、納豆工業で使用されている発酵能力に優れた納豆菌、自然界から分離取得された納豆菌や、さらに改良を重ねた優れた納豆菌を用いるのが望ましい。
【００１８】
納豆菌は、枯草菌が属するバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に分類されているが、糸引物質（粘質物）などの納豆としての特徴をつくり出すことができ、納豆発酵での主体をなす細菌であって、また生育にビオチンを要求するとされるなどの特性を有していることなどから、バシラス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ）として分類されたり、枯草菌の変種としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏあるいはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ）などと、枯草菌と区別して分類する場合もある。
【００１９】
本発明で用いる納豆菌としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ ＩＦＯ３００９株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３３３５株、同ＩＦＯ３３３６株、同ＩＦＯ３９３６株、同ＩＦＯ１３１６９株などがあるほか、各種の納豆菌が広く使用できる。
【００２０】
具体的には、市販納豆から分離したＯ−２株や、該株の形質転換効率を向上させた変異株であるｒ２２株（例えば、特開２０００−２２４９８２号公報参照）が挙げられ、また市販の納豆用種菌である高橋菌（Ｔ３株、東京農業大学菌株保存室）や宮城野菌（宮城野納豆製作所）など各種の納豆菌が適宜使用可能である。
【００２１】
本発明では、納豆菌ｒｅｃＡ遺伝子の機能を欠損させた株を取得するものである。
【００２２】
育種の方法のひとつとしては、ｒｅｃＡ遺伝子を遺伝子組換え法により欠損させ、その機能を欠損させる方法がある。
例えば、ｐＵＣ１９などの多コピー数プラスミドベクターに対して当該ｒｅｃＡ遺伝子中に薬剤耐性遺伝子を挿入した遺伝子破壊用プラスミドを作製し、該プラスミドを適当な制限酵素により直線化した後、既存のコンピテンス形質転換法（例えば、フェムス・マイクロバイオロジカル・レター（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．）、２３６巻、ｐ.１３−２０、２００４年参照）を利用して納豆菌に導入して相同組換えを行わせ、当該ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させる方法が採用される。
【００２３】
さらに、本発明においては、ｒｅｃＡ遺伝子の上流域にあるプロモーター領域を遺伝子組換え法や突然変異法などにより変異させて、ｒｅｃＡ遺伝子の発現を欠損させる方法も有効である。
【００２４】
また、既にｒｅｃＡ遺伝子が欠損している納豆菌を自然界から選抜するいわゆるスクリーニング法や、変異剤や紫外線、放射線などの人工的な手段により、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させる突然変異法などの、従来から実施されているような方法によっても育種が可能である。
【００２５】
なお、人工的な突然変異には物理的方法と化学的方法が用いられる。物理的方法としては、紫外線照射、放射線照射などがあり、化学的方法としては、例えばエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）やＮ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤の溶液に菌体を懸濁させる方法などがあり、これらの方法を単独または組み合わせて適宜実施することができる。このような化学的方法でｒｅｃＡ遺伝子を欠損させる場合は、ｒｅｃＡ遺伝子の内部に点突然変異が導入されることによりｒｅｃＡ遺伝子の機能が欠損した株を選択すればよい。
【００２６】
例えば、一晩３７℃で培養した納豆菌を、遠心分離して集菌し、滅菌生理食塩水で洗浄して洗浄菌体を得る。この約１０７ｃｆｕ／ｍｌの濃度の洗浄菌体に、１６０ｍｇ／ｌとなるようにＮ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を添加し、６０分間振とうして、変異処理を行う。なお、この時の生存率は約１％程度である。
【００２７】
変異処理した菌体を培養して形質を発現させ、その後に滅菌生理食塩水で洗浄して、平板培地に塗沫し、３７℃で１〜２日間培養してコロニーを形成させる。
【００２８】
ｒｅｃＡ遺伝子の機能を欠損するとＤＮＡ複製阻害剤であるナリジキシン酸やマイトマイシンＣに感受性を示すことから、例えばナリジキシン酸またはマイトマイシンＣを含む培地と含まない培地に変異処理したコロニーを植菌し、ナリジキシン酸またはマイトマイシンＣに感受性を示すコロニーを選択することによって、ｒｅｃＡ遺伝子が欠損した納豆菌を取得可能である。また、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損すると運動性も喪失するので、０．７％寒天を含む軟寒天培地に植菌した場合において、形成されるコロニーが小さく運動性が阻害されたと見られる納豆菌を選択することによっても、ｒｅｃＡ遺伝子の機能が欠損した納豆菌を取得可能である。
【００２９】
このようにしてｒｅｃＡ遺伝子の機能が欠損した納豆菌を取得することにより、転移因子の転移が抑制された納豆菌が開発できるが、開発された転移因子の転移が抑制された納豆菌と従来から利用されている通常の納豆菌の植え継ぎを繰り返した後、それぞれの納豆菌を用いて製造した納豆の糸引性を比較すると、転移因子の転移が抑制された納豆菌を用いて製造した納豆では十分な糸引きが確認され、植え継ぎによる糸引きの低下がほとんどないことが確認される。
【００３０】
本発明は、このような目的を達成するためになされたものであり、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させることにより、転移因子の転移が抑制され、特にｃｏｍＰ遺伝子への転移因子の転移が抑制された納豆菌が取得でき、その結果、１２世代植え継いでもγ−ＰＧＡ非生産性株の出現頻度が０％である新規納豆菌を開発することができたのであって、そのうちの１株をバシラス・サチリス ＲＥＣ７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＥＣ７）株と命名した。
【００３１】
バシラス・サチリス ＲＥＣ７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＥＣ７）株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、２００８年（平成２０年）８月１２日付けで受領されており、その受領番号はＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９９４である。
【００３２】
なお、本発明における世代とγ−ＰＧＡ非生産性株の出現頻度とは、以下の方法によって測定したものであると定義できる。
【００３３】
すなわち、納豆菌をＬＢ培地に濁度が０．０５となるように接種し、３７℃で１２時間振とう培養し、これを第１世代とする。そして、第１世代で培養された納豆菌を再びＬＢ培地に濁度が０．０５となるように接種し、同様にして１２時間培養する。これを第２世代とする。
【００３４】
さらに、同様にして第３世代から第１２世代まで植継ぎを継代して、各世代の納豆菌の培養液を適当な希釈倍率にて希釈後、γ−ＰＧＡ生産培地であるＧＳＰ寒天培地に塗抹培養し、全コロニーに占めるγ−ＰＧＡ非生産性コロニーの割合（％）をγ−ＰＧＡ非生産性株出現頻度とする。なお、γ−ＰＧＡ非生産性株は、上記のＧＳＰ寒天培地で培養すると、γ−ＰＧＡが生産されたことによる盛り上がった納豆菌特有のコロニーを形成せず、扁平で乾いたコロニーを形成することを指標にして、目視により区別した。
【００３５】
このようにして開発された納豆菌を用いた納豆の製造方法は、従来から実施されている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。
【００３６】
納豆は丸大豆を原料として製造されたいわゆる丸大豆納豆が一般的であるが、一部には予め挽割った大豆を原料とする挽割り納豆もある。
【００３７】
丸大豆納豆の製造方法は、一般に原料である丸大豆を冷水に十数時間浸漬した後、蒸煮釜で加圧蒸気を用いて加圧蒸煮（１．５〜２．０Ｋｇ／ｃｍ２、１２８〜１３３℃）して得られた蒸煮大豆に対して、高温状態（７０〜１００℃）で納豆菌を接種し混合した後、所定の容器に充填してから発酵室に搬入して比較的高温度（４０〜５５℃程度）で所定時間（１２〜４８時間程度）発酵させた後、５℃前後で冷蔵熟成（１２〜７２時間程度）して完成させるのが一般的である。
【００３８】
また、挽割り納豆の場合は、予め挽割った大豆を水に浸漬する以外は、通常の丸大豆納豆の場合と同様の方法で製造される。
【００３９】
このような従来の納豆の製造方法において、本発明では発酵工程で用いる納豆菌を、前記方法によって育種改良したｒｅｃＡ遺伝子を欠損させた納豆菌に代えて使用することによって製造される。
【００４０】
このようにして、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させて転移因子の転移頻度を抑制した納豆菌を用いて納豆を製造すると、γ−ＰＧＡの生産量が多く、糸引き性が強い高品質の納豆を安定して製造することが可能となる。
【実施例】
【００４１】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００４２】
（実施例１：ｒｅｃＡ欠損株の調製）
（１）使用菌株等
使用した納豆菌ｒ２２株は、市販納豆から分離された親株Ｏ−２株の形質転換能を高めた変異株であり、親株Ｏ−２株をニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて化学変異処理することにより取得された株である（例えば、特開２０００−２２４９８２号公報参照）。
【００４３】
培地は、納豆試験法（例えば、「納豆試験法」、光琳出版、ｐ．８５−９７、１９９０年参照）に記載の肉汁培地（１％ ポリペプトン、０．５％ ＮａＣｌ、０．３％ 肉エキス）、ＬＢ培地（１％ ポリペプトン、０.５％ 酵母エキス、１％ 塩化ナトリウム）、胞子形成培地（０．０６８％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５３５％ ＮＨ４Ｃｌ、０．０１０６％ Ｎａ２ＳＯ４、０．００００６％ ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．００１２６％ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．９３４％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２３８％ グルタミン酸ナトリウム一水和物、０．０２５％ ＣａＣｌ２、０．１５２％ 酵母エキス、１ｍｇ／ｍｌ ビオチン）、Ｓｐｉｚｉｚｅｎらの形質転換培地（０．５％ グルコース、５ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５％ 酵母エキス、０．６％ ＫＨ２ＰＯ４、１．４％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．１％ クエン酸ナトリウム二水和物、０．２％ 硫安、０．１μｇ／ｍｌ ビオチン）、ＧＳＰ寒天培地（１．５％ グルコース、１．５％ グルタミン酸ナトリウム、１．５％ フィトンペプトン、２．０％ 寒天）を用いた。ただし、必要な場合は各培地にスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した。
【００４４】
なお、スペクチノマイシン耐性遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＣＮｏ．Ｘ０２５８８）はトランスポゾンＴｎ５５４から、ＰＣＲにより増幅して用いた。ＰＣＲは、マニュアルに従い、サーマルサイクラーを用いて実施した。
【００４５】
（２）ｒｅｃＡ欠損株の作製
以下に記載のごとく、まずｒｅｃＡ遺伝子を欠損させるために必要なＤＮＡ断片（ｒｅｃＡ欠損用断片）を、ＰＣＲを組み合わせた方法（例えば、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）３０巻、ｐ．１−５、２００２年参照）で構築し、納豆菌にコンピテンス法により導入して、相同組換えを起こさせることによってｒｅｃＡ欠損株を作製した。
【００４６】
ｉ）ｒｅｃＡ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片の調製
染色体上のｒｅｃＡ遺伝子をスペクチノマイシン耐性遺伝子と置換してｒｅｃＡ遺伝子を欠損させるために、ｒｅｃＡ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片を、図１に示すごとく、ＰＣＲを組み合わせた以下の方法により作製した。
まず、置換に用いたスペクチノマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片は、以下のように調製した。すなわち、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているスペクチノマイシン耐性遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０２５８８）を基に、プライマー１（５´−ＧＴＡＴＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣ−３´、図４及び配列表の配列番号１参照）及びプライマー２（５´−ＴＡＡＡＴＴＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＧＣＧＴＴＣＴＣ−３´、図５及び配列表の配列番号２参照）の２種のオリゴＤＮＡを調製した。
【００４７】
これらのプライマー１及びプライマー２を用い、トランスポゾンＴｎ５５４を鋳型にしてＰＣＲを行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片（１０７７塩基）を増幅した。
【００４８】
続いて、ｒｅｃＡ遺伝子の上流域を増幅するために、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒ．１６８株の塩基配列（登録番号ＮＣ０００９６４）を基に、プライマー３（５´−ＴＣＡＣＡＣＴＡＧＣＴＡＧＡＡＴＣＧＣ−３´、図６及び配列表の配列番号３参照）及びプライマー４（５´−ＴＡＣＡＧＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＴＡＡＧＧＣＴＧＣＣＴＧＡＣＧＡＴＣＡＣＴＣ−３´、図７及び配列表の配列番号４参照）の２種のオリゴＤＮＡを調製した。
【００４９】
これらのプライマー３及び４を用い、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、ｒｅｃＡ遺伝子の上流域（２０５８塩基）を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【００５０】
さらに、ｒｅｃＡ遺伝子の下流域についても、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒ．１６８株の塩基配列（登録番号ＮＣ０００９６４）を基に、プライマー５（５´−ＴＴＡＧＡＧＡＡＣＧＣＴＴＴＡＴＴＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＡＡＴＴＴＧＡＡＧ−３´、図８及び配列表の配列番号５参照）及びプライマー６（５´−ＡＡＴＡＴＧＴＴＧＴＴＧＴＣＧＴＴＣＡＴＴＣ−３´、図９及び配列表の配列番号６に記載）の２種のオリゴＤＮＡを調製した。
【００５１】
これらのプライマー５及び６を用い、上流域と同様に、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、ｒｅｃＡ遺伝子の下流域（２０６１塩基）を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【００５２】
これらの増幅した、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片（１０７７塩基）、ｒｅｃＡ遺伝子の上流域を含むＤＮＡ断片（２０５８塩基）、及び、ｒｅｃＡ遺伝子の下流域を含むＤＮＡ断片（２０６１塩基）、を回収した後、これら３つの断片を鋳型として、プライマー３及びプライマー６を再び用いて、上流域を含むＤＮＡ断片及び下流域を含むＤＮＡ断片がスペクチノマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片の両端にアニールされるのと同時にＰＣＲを行うことで３断片を連結し、ｒｅｃＡ遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換されたｒｅｃＡ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片を得た。
【００５３】
ｉｉ）形質転換
上記のようにして調製したｒｅｃＡ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片を用いて、コンピテンス法によりｒ２２株を形質転換した。形質転換株の選択は、スペクチノマイシン耐性を指標に行った。
【００５４】
多数得られた形質転換株のうちの８株からゲノムＤＮＡを回収して、スペクチノマイシン耐性遺伝子と置換されて、ｒｅｃＡ遺伝子が欠損していることが電気泳動により確認できた５株のうち、さらにｒｅｃＡ遺伝子（１０４４塩基）中のＮ末端の２４塩基とＣ末端の２３塩基以外の９９７塩基が欠損して、スペクチノマイシン耐性遺伝子に置換されていることをシーケンスにより確認できた１株をバシラス・サチリス ＲＥＣ７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＥＣ７）株と命名し、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９９４として、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター 中央第６）に寄託した。
【００５５】
（実施例２：γ−ＰＧＡ非生産株の出現頻度の測定）
納豆菌ｒ２２株およびＲＥＣ７株を、５ｍｌのＬＢ培地を入れた試験管中で、３７℃で１２時間振とう培養し、これを第１世代とした。第１世代の培養液中の納豆菌を、濁度が０.０５となるように新たなＬＢ培地に植菌し、再び３７℃で１２時間振とう培養し、これを第２世代とした。以下、同様にして、第１２世代まで培養を継続した。
このようにして培養を継続する中で、２４時間ごと、すなわち２世代毎に、培養液を３枚のＧＳＰ寒天培地に１００μｌ塗抹し、全コロニー数と、γ−ＰＧＡ非生産コロニー数をそれぞれ測定した。
得られた全コロニー数とγ−ＰＧＡ非生産コロニー数とから、全コロニー数に占めるγ−ＰＧＡ非生産コロニーの割合を算出し、これを非γ−ＰＧＡ生産株の出現頻度（％）とした。表１に、結果を示した。
【００５６】
【表１】
【００５７】
その結果、対照としたｒ２２株では第８世代で２７％がγ−ＰＧＡ非生産性株となっており、さらに第１２世代では９１％もがγ−ＰＧＡ非生産性株となっていた。
これに対して、ＲＥＣ７株では第１２世代まで植え継いでも、γ−ＰＧＡ非生産株の出現頻度は常に０％である事が確認され、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させることにより、γ−ＰＧＡ非生産性株の出現を抑制させることが出来ることが確認できた。
【００５８】
（実施例３：ｒｅｃＡ遺伝子欠損により転移が抑制されたＩＳの確認）
ｉ）ｃｏｍＰ遺伝子へのＩＳ転移の確認
実施例２における第３世代〜第１２世代の各世代において、納豆菌ｒ２２株およびＲＥＣ７株について、ＩＳ４Ｂｓｕ１及びＩＳ２５６Ｂｓｕ１が高頻度に転移することが報告されているｃｏｍＰ遺伝子への転移をＰＣＲを用いて以下のように確認した。
【００５９】
すなわち、第３世代〜第１２世代の各世代のｒ２２株及びＲＥＣ７株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている納豆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＡＦ４のｃｏｍＰ遺伝子の塩基配列（登録番号ＡＢ０３１５５２）を基にして作製したプライマー７（５´−ＡＴＧＴＡＣＡＧＡＴＡＴＡＴＴＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡ−３’、図１０及び配列表の配列番号７参照）及びプライマー８（５’−ＴＴＡＣＡＡＴＴＣＧＡＴＴＴＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＣ−３´、図１１及び配列表の配列番号８参照）を用いてＰＣＲを行い、各々のｃｏｍＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
このようにして増幅された各世代ごとのＤＮＡ断片を電気泳動して、分子量を測定した。結果を、図２に示す。
【００６０】
その結果、対照としたｒ２２株では、第８世代以降において、正常なｃｏｍＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片（約２．３ｋｂ）よりも長くなっていて、ｃｏｍＰ遺伝子中にＩＳが転移したと予想される長さのＤＮＡ断片（約３．７ｋｂ）の存在が確認された。
これに対して、ＲＥＣ７株では第８世代以降も正常なｃｏｍＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片（約２．３ｋｂ）のみが増幅したことが確認され、ＲＥＣ７株ではｃｏｍＰ遺伝子へのＩＳの転移は確認されなかった。
【００６１】
ｉｉ）ｃｏｍＰ遺伝子へ転移するＩＳ種の同定
上記ｉ）における第１２世代のｒ２２株で検出されたｃｏｍＰ遺伝子にＩＳが転移したと予想される約３．７ｋｂのＤＮＡ断片、及び、ＰＣＲ操作の対照としてｒ２２株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＩＳ４Ｂｓｕ１とＩＳ２５６Ｂｓｕ１が有する各トランスポザーゼ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。
【００６２】
なお、ＩＳ４Ｂｓｕ１のトランスポザーゼ遺伝子の増幅にはプライマー９（５´−ＡＴＧＧＡＴＡＡＧＴＴＴＡＣＡＣＧＡ−３´、図１２及び配列表の配列番号９参照）及びプライマー１０（５´−ＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＴＣＡＴＧＡＡ−３´、図１３及び配列表の配列番号１０参照）を用い、また、ＩＳ２５６Ｂｓｕ１のトランスポザーゼ遺伝子の増幅にはプライマー１１（５´−ＴＧＧＧＧＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＧＡＧ−３´、図１４及び配列表の配列番号１１参照）及びプライマー１２（５´−ＴＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＡＣＧ−３´、図１５及び配列表の配列番号１２参照）を用いた。
【００６３】
その結果、図３に示した通り、対照として用いたｒ２２株のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合、両ＩＳのトランスポザーゼ遺伝子が増幅されたＤＮＡ断片が検出され、ＰＣＲは適切に実施できたことが確認できた。一方、ｃｏｍＰ遺伝子にＩＳが転移したと予想される約３．７ｋｂのＤＮＡ断片においても、同様に、両ＩＳのトランスポザーゼ遺伝子の存在が確認され、ｃｏｍＰ遺伝子中に高頻度で転移するとされているＩＳ４Ｂｓｕ１とＩＳ２５６Ｂｓｕ１がｒ２２株でもｃｏｍＰ遺伝子中に転移していることが確認された。
【００６４】
以上の結果から、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させていない通常の納豆菌では、ＩＳ４Ｂｓｕ１及びＩＳ２５６Ｂｓｕ１がｃｏｍＰ遺伝子に高頻度で転移するのに対して、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させることにより、これらのＩＳのｃｏｍＰ遺伝子への転移を完全に抑制できることが確認された。
【００６５】
（実施例４：納豆製造）
１２世代培養後のｒ２２株及びＲＥＣ７株から、それぞれ、常法により調製した胞子を用いて納豆を製造した。
製造された納豆について、糸引性を官能的に評価する一方、納豆１ｇ当たりのγ−ＰＧＡ量を測定した。
なお、γ−ＰＧＡは、納豆１０ｇからトリクロロ酢酸により抽出後、エタノールにより回収し、菅野らの方法（例えば、日本食品工学会誌、４２巻、ｐ．８７８−８８６、１９９５年参照）に従い、γ−ＰＧＡが臭化セチルトリメチルアンモニウムに結合する性質を利用して分光学的に定量した。
表２に結果を示した。
【００６６】
【表２】
【００６７】
その結果、第１２世代培養後のｒ２２株を用いて製造した納豆は、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させたＲＥＣ７株を用いて製造した納豆と比較して、γ−ＰＧＡ量は約５％程度と少なく、その結果、ほとんど糸を引かなくて納豆としての品質をなしていなかった。
これに対して、ＲＥＣ７株を用いて製造した場合は、納豆のγ−ＰＧＡ量は十分であり、良好な糸引きが見られ、品質のよい納豆が安定して製造できることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ｒｅｃＡ遺伝子破壊用のＤＮＡ断片作製の概略を示した図である。
【図２】ｃｏｍＰ遺伝子へのＩＳの転移を確認した結果を示す電気泳動図である（図面代用写真）。
【図３】ｃｏｍＰ遺伝子へ転移したＩＳを確認した電気泳動図である（図面代用写真）。 図３中のレーン１は鋳型として３．７ｋｂのＤＮＡ断片を使用した場合の結果を示す。 図３中のレーン２は鋳型として全ゲノムを使用した場合の結果を示す。
【図４】プライマー１の塩基配列を示す図である。
【図５】プライマー２の塩基配列を示す図である。
【図６】プライマー３の塩基配列を示す図である。
【図７】プライマー４の塩基配列を示す図である。
【図８】プライマー５の塩基配列を示す図である。
【図９】プライマー６の塩基配列を示す図である。
【図１０】プライマー７の塩基配列を示す図である。
【図１１】プライマー８の塩基配列を示す図である。
【図１２】プライマー９の塩基配列を示す図である。
【図１３】プライマー１０の塩基配列を示す図である。
【図１４】プライマー１１の塩基配列を示す図である。
【図１５】プライマー１２の塩基配列を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転移因子の転移が抑制された納豆菌及び該納豆菌を用いて製造された納豆に関する。さらに詳細には、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させることにより、転移因子の転移が抑制された納豆菌、ｃｏｍＰ遺伝子への転移因子の転移が抑制された納豆菌、及び、ポリグルタミン酸の非生産性株の出現が抑制された納豆菌、及び該納豆菌を用いて製造された納豆に関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆を製造する際に使用される納豆菌はバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に分類されるグラム陽性の細菌であるが、同じバシラス・サチリスに分類されている枯草菌とは異なる性質を持つことが知られている。
【０００３】
例えば、納豆菌は納豆の大きな特徴である糸引物質（粘物質）をつくり出すことができ、また生育にビオチンを要求するなどの実験室で使用されている枯草菌、特に１６８株とは異なる特徴を有しており、また最近では、枯草菌１６８株は転移因子を持たないのに対して、納豆菌は少なくとも２種以上の転移因子をその染色体上に保持していることが知られてきた（例えば、非特許文献１及び２参照）。
【０００４】
転移因子としては、トランスポゾン（以下、Ｔｎと称する場合もある）や挿入配列（以下、ＩＳと称する場合もある）などが一般に知られている。
このうちＩＳは比較的単純な遺伝子構造であり、ＩＳ自身を染色体の別の位置に転移させる酵素（トランスポザーゼ）をコードするトランスポザーゼ遺伝子と、それが逆方向反復塩基配列によって挟まれた構造を有しており、染色体上の別の位置に転移して、転移先に元々存在していた遺伝子を破壊したりする特性を持っている。
【０００５】
従来から納豆菌は自然に変異しやすい性質を有しているとされており、普通に培養しているだけで納豆菌の性質が大きく変化する場合があるが、このような自然変異に関して納豆菌の転移因子が関与している場合のあることが知られてきた。
【０００６】
例えば、納豆菌ＩＳの１種であるＩＳ４Ｂｓｕ１は、納豆の大きな特徴である糸引物質の主成分であるポリグルタミン酸（以下、γ−ＰＧＡと称する場合もある）の合成に関わる遺伝子群の一つ（ｃｏｍＰ遺伝子）に高頻度で転移し、ｃｏｍＰ遺伝子を破壊してしまう結果、γ−ＰＧＡの合成が停止して糸引物質を生産できない納豆菌が出現することが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００７】
また、転移因子ＩＳ４Ｂｓｕ１とは別に、ｃｏｍＰ遺伝子中に転移してγ−ＰＧＡの合成を停止させる転移因子ＩＳ２５６Ｂｓｕ１も同定されており（例えば、非特許文献２参照）、これらのＩＳは染色体上に複数、そして散在していることが知られている。
【０００８】
このように、納豆菌中に存在するＩＳが染色体上を転移することにより、納豆菌の性質が大きく変化し、例えば、納豆菌を特徴付ける重要な性質である糸引物質を生産できない納豆菌が出現したりする結果、種菌を調製する際や納豆の発酵工程において重大な支障が生じる場合があった。
【０００９】
そこで、納豆菌からＩＳを除去する方法や、納豆菌中でのＩＳの転移を抑制する方法などの開発が求められていたが、未だ有効な方法は全く開発されていなかった。
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、１８２巻、ｐ．２３８７−２３９２、２０００年
【非特許文献２】バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー(Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．)、７１巻、ｐ．２４５８−２４６４、２００７年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、転移因子の転移が抑制されていることにより、植え継ぎを繰り返した場合でも、γ−ＰＧＡ生産性などの納豆製造に重要な性質が安定に保持された納豆菌を育種、開発し、該納豆菌を用いて製造された品質の良い納豆を安定して提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、納豆菌の転移因子の転移機構について鋭意検討を重ねた結果、納豆菌の組換え酵素（以下、ＲｅｃＡと称する場合も有る）が、転移因子の転移を促進していることを見出した。
【００１２】
そこで、納豆菌のＲｅｃＡをコードする遺伝子（以下、ｒｅｃＡ遺伝子と称する場合もある）を欠損させた結果、植え継ぎを繰り返した場合でも、転移因子の転移が抑制されることを見出した。
【００１３】
さらに、このようなｒｅｃＡ遺伝子を欠損させた納豆菌においては、通常の納豆菌ではｃｏｍＰ遺伝子中に高頻度で転移する従来既知の２種類の転移因子（ＩＳ４Ｂｓｕ１、ＩＳ２５６Ｂｓｕ１）転移因子が転移しなくなることを確認し、その結果、γ−ＰＧＡの生産性が安定して維持できることも確認して目的の納豆菌を開発しうることを見出して本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の納豆菌及び納豆に関する。
（１）ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させることにより、転移因子の転移が抑制されたことを特徴とする納豆菌。
（２）ｃｏｍＰ遺伝子への転移因子の転移が抑制されたことを特徴とする（１）に記載の納豆菌。
（３）１２世代培養後もγ−ＰＧＡ非生産株が出現しないことを特徴とする（１）又は（２）に記載の納豆菌。
（４）バシラス・サチリス ＲＥＣ７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＥＣ７）株（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９９４）であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１つに記載の納豆菌。
（５）（１）〜（４）のいずれか１つに記載の納豆菌を用いて製造されたことを特徴とする納豆。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させて挿入因子の転移を抑制することにより、γ−ＰＧＡ非生産性株の出現頻度が低下した納豆菌を育種開発することが可能となり、該納豆菌を用いて納豆を製造することにより、品質の良い納豆を安定して製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明で育種改良に用いる元の納豆菌には特に制限はないが、納豆工業で使用されている発酵能力に優れた納豆菌、自然界から分離取得された納豆菌や、さらに改良を重ねた優れた納豆菌を用いるのが望ましい。
【００１８】
納豆菌は、枯草菌が属するバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に分類されているが、糸引物質（粘質物）などの納豆としての特徴をつくり出すことができ、納豆発酵での主体をなす細菌であって、また生育にビオチンを要求するとされるなどの特性を有していることなどから、バシラス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ）として分類されたり、枯草菌の変種としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏあるいはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ）などと、枯草菌と区別して分類する場合もある。
【００１９】
本発明で用いる納豆菌としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ ＩＦＯ３００９株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３３３５株、同ＩＦＯ３３３６株、同ＩＦＯ３９３６株、同ＩＦＯ１３１６９株などがあるほか、各種の納豆菌が広く使用できる。
【００２０】
具体的には、市販納豆から分離したＯ−２株や、該株の形質転換効率を向上させた変異株であるｒ２２株（例えば、特開２０００−２２４９８２号公報参照）が挙げられ、また市販の納豆用種菌である高橋菌（Ｔ３株、東京農業大学菌株保存室）や宮城野菌（宮城野納豆製作所）など各種の納豆菌が適宜使用可能である。
【００２１】
本発明では、納豆菌ｒｅｃＡ遺伝子の機能を欠損させた株を取得するものである。
【００２２】
育種の方法のひとつとしては、ｒｅｃＡ遺伝子を遺伝子組換え法により欠損させ、その機能を欠損させる方法がある。
例えば、ｐＵＣ１９などの多コピー数プラスミドベクターに対して当該ｒｅｃＡ遺伝子中に薬剤耐性遺伝子を挿入した遺伝子破壊用プラスミドを作製し、該プラスミドを適当な制限酵素により直線化した後、既存のコンピテンス形質転換法（例えば、フェムス・マイクロバイオロジカル・レター（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．）、２３６巻、ｐ.１３−２０、２００４年参照）を利用して納豆菌に導入して相同組換えを行わせ、当該ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させる方法が採用される。
【００２３】
さらに、本発明においては、ｒｅｃＡ遺伝子の上流域にあるプロモーター領域を遺伝子組換え法や突然変異法などにより変異させて、ｒｅｃＡ遺伝子の発現を欠損させる方法も有効である。
【００２４】
また、既にｒｅｃＡ遺伝子が欠損している納豆菌を自然界から選抜するいわゆるスクリーニング法や、変異剤や紫外線、放射線などの人工的な手段により、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させる突然変異法などの、従来から実施されているような方法によっても育種が可能である。
【００２５】
なお、人工的な突然変異には物理的方法と化学的方法が用いられる。物理的方法としては、紫外線照射、放射線照射などがあり、化学的方法としては、例えばエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）やＮ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤の溶液に菌体を懸濁させる方法などがあり、これらの方法を単独または組み合わせて適宜実施することができる。このような化学的方法でｒｅｃＡ遺伝子を欠損させる場合は、ｒｅｃＡ遺伝子の内部に点突然変異が導入されることによりｒｅｃＡ遺伝子の機能が欠損した株を選択すればよい。
【００２６】
例えば、一晩３７℃で培養した納豆菌を、遠心分離して集菌し、滅菌生理食塩水で洗浄して洗浄菌体を得る。この約１０７ｃｆｕ／ｍｌの濃度の洗浄菌体に、１６０ｍｇ／ｌとなるようにＮ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を添加し、６０分間振とうして、変異処理を行う。なお、この時の生存率は約１％程度である。
【００２７】
変異処理した菌体を培養して形質を発現させ、その後に滅菌生理食塩水で洗浄して、平板培地に塗沫し、３７℃で１〜２日間培養してコロニーを形成させる。
【００２８】
ｒｅｃＡ遺伝子の機能を欠損するとＤＮＡ複製阻害剤であるナリジキシン酸やマイトマイシンＣに感受性を示すことから、例えばナリジキシン酸またはマイトマイシンＣを含む培地と含まない培地に変異処理したコロニーを植菌し、ナリジキシン酸またはマイトマイシンＣに感受性を示すコロニーを選択することによって、ｒｅｃＡ遺伝子が欠損した納豆菌を取得可能である。また、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損すると運動性も喪失するので、０．７％寒天を含む軟寒天培地に植菌した場合において、形成されるコロニーが小さく運動性が阻害されたと見られる納豆菌を選択することによっても、ｒｅｃＡ遺伝子の機能が欠損した納豆菌を取得可能である。
【００２９】
このようにしてｒｅｃＡ遺伝子の機能が欠損した納豆菌を取得することにより、転移因子の転移が抑制された納豆菌が開発できるが、開発された転移因子の転移が抑制された納豆菌と従来から利用されている通常の納豆菌の植え継ぎを繰り返した後、それぞれの納豆菌を用いて製造した納豆の糸引性を比較すると、転移因子の転移が抑制された納豆菌を用いて製造した納豆では十分な糸引きが確認され、植え継ぎによる糸引きの低下がほとんどないことが確認される。
【００３０】
本発明は、このような目的を達成するためになされたものであり、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させることにより、転移因子の転移が抑制され、特にｃｏｍＰ遺伝子への転移因子の転移が抑制された納豆菌が取得でき、その結果、１２世代植え継いでもγ−ＰＧＡ非生産性株の出現頻度が０％である新規納豆菌を開発することができたのであって、そのうちの１株をバシラス・サチリス ＲＥＣ７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＥＣ７）株と命名した。
【００３１】
バシラス・サチリス ＲＥＣ７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＥＣ７）株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、２００８年（平成２０年）８月１２日付けで受領されており、その受領番号はＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９９４である。
【００３２】
なお、本発明における世代とγ−ＰＧＡ非生産性株の出現頻度とは、以下の方法によって測定したものであると定義できる。
【００３３】
すなわち、納豆菌をＬＢ培地に濁度が０．０５となるように接種し、３７℃で１２時間振とう培養し、これを第１世代とする。そして、第１世代で培養された納豆菌を再びＬＢ培地に濁度が０．０５となるように接種し、同様にして１２時間培養する。これを第２世代とする。
【００３４】
さらに、同様にして第３世代から第１２世代まで植継ぎを継代して、各世代の納豆菌の培養液を適当な希釈倍率にて希釈後、γ−ＰＧＡ生産培地であるＧＳＰ寒天培地に塗抹培養し、全コロニーに占めるγ−ＰＧＡ非生産性コロニーの割合（％）をγ−ＰＧＡ非生産性株出現頻度とする。なお、γ−ＰＧＡ非生産性株は、上記のＧＳＰ寒天培地で培養すると、γ−ＰＧＡが生産されたことによる盛り上がった納豆菌特有のコロニーを形成せず、扁平で乾いたコロニーを形成することを指標にして、目視により区別した。
【００３５】
このようにして開発された納豆菌を用いた納豆の製造方法は、従来から実施されている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。
【００３６】
納豆は丸大豆を原料として製造されたいわゆる丸大豆納豆が一般的であるが、一部には予め挽割った大豆を原料とする挽割り納豆もある。
【００３７】
丸大豆納豆の製造方法は、一般に原料である丸大豆を冷水に十数時間浸漬した後、蒸煮釜で加圧蒸気を用いて加圧蒸煮（１．５〜２．０Ｋｇ／ｃｍ２、１２８〜１３３℃）して得られた蒸煮大豆に対して、高温状態（７０〜１００℃）で納豆菌を接種し混合した後、所定の容器に充填してから発酵室に搬入して比較的高温度（４０〜５５℃程度）で所定時間（１２〜４８時間程度）発酵させた後、５℃前後で冷蔵熟成（１２〜７２時間程度）して完成させるのが一般的である。
【００３８】
また、挽割り納豆の場合は、予め挽割った大豆を水に浸漬する以外は、通常の丸大豆納豆の場合と同様の方法で製造される。
【００３９】
このような従来の納豆の製造方法において、本発明では発酵工程で用いる納豆菌を、前記方法によって育種改良したｒｅｃＡ遺伝子を欠損させた納豆菌に代えて使用することによって製造される。
【００４０】
このようにして、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させて転移因子の転移頻度を抑制した納豆菌を用いて納豆を製造すると、γ−ＰＧＡの生産量が多く、糸引き性が強い高品質の納豆を安定して製造することが可能となる。
【実施例】
【００４１】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００４２】
（実施例１：ｒｅｃＡ欠損株の調製）
（１）使用菌株等
使用した納豆菌ｒ２２株は、市販納豆から分離された親株Ｏ−２株の形質転換能を高めた変異株であり、親株Ｏ−２株をニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて化学変異処理することにより取得された株である（例えば、特開２０００−２２４９８２号公報参照）。
【００４３】
培地は、納豆試験法（例えば、「納豆試験法」、光琳出版、ｐ．８５−９７、１９９０年参照）に記載の肉汁培地（１％ ポリペプトン、０．５％ ＮａＣｌ、０．３％ 肉エキス）、ＬＢ培地（１％ ポリペプトン、０.５％ 酵母エキス、１％ 塩化ナトリウム）、胞子形成培地（０．０６８％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５３５％ ＮＨ４Ｃｌ、０．０１０６％ Ｎａ２ＳＯ４、０．００００６％ ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．００１２６％ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．９３４％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２３８％ グルタミン酸ナトリウム一水和物、０．０２５％ ＣａＣｌ２、０．１５２％ 酵母エキス、１ｍｇ／ｍｌ ビオチン）、Ｓｐｉｚｉｚｅｎらの形質転換培地（０．５％ グルコース、５ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５％ 酵母エキス、０．６％ ＫＨ２ＰＯ４、１．４％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．１％ クエン酸ナトリウム二水和物、０．２％ 硫安、０．１μｇ／ｍｌ ビオチン）、ＧＳＰ寒天培地（１．５％ グルコース、１．５％ グルタミン酸ナトリウム、１．５％ フィトンペプトン、２．０％ 寒天）を用いた。ただし、必要な場合は各培地にスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した。
【００４４】
なお、スペクチノマイシン耐性遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＣＮｏ．Ｘ０２５８８）はトランスポゾンＴｎ５５４から、ＰＣＲにより増幅して用いた。ＰＣＲは、マニュアルに従い、サーマルサイクラーを用いて実施した。
【００４５】
（２）ｒｅｃＡ欠損株の作製
以下に記載のごとく、まずｒｅｃＡ遺伝子を欠損させるために必要なＤＮＡ断片（ｒｅｃＡ欠損用断片）を、ＰＣＲを組み合わせた方法（例えば、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）３０巻、ｐ．１−５、２００２年参照）で構築し、納豆菌にコンピテンス法により導入して、相同組換えを起こさせることによってｒｅｃＡ欠損株を作製した。
【００４６】
ｉ）ｒｅｃＡ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片の調製
染色体上のｒｅｃＡ遺伝子をスペクチノマイシン耐性遺伝子と置換してｒｅｃＡ遺伝子を欠損させるために、ｒｅｃＡ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片を、図１に示すごとく、ＰＣＲを組み合わせた以下の方法により作製した。
まず、置換に用いたスペクチノマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片は、以下のように調製した。すなわち、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているスペクチノマイシン耐性遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０２５８８）を基に、プライマー１（５´−ＧＴＡＴＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣ−３´、図４及び配列表の配列番号１参照）及びプライマー２（５´−ＴＡＡＡＴＴＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＧＣＧＴＴＣＴＣ−３´、図５及び配列表の配列番号２参照）の２種のオリゴＤＮＡを調製した。
【００４７】
これらのプライマー１及びプライマー２を用い、トランスポゾンＴｎ５５４を鋳型にしてＰＣＲを行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片（１０７７塩基）を増幅した。
【００４８】
続いて、ｒｅｃＡ遺伝子の上流域を増幅するために、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒ．１６８株の塩基配列（登録番号ＮＣ０００９６４）を基に、プライマー３（５´−ＴＣＡＣＡＣＴＡＧＣＴＡＧＡＡＴＣＧＣ−３´、図６及び配列表の配列番号３参照）及びプライマー４（５´−ＴＡＣＡＧＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＴＡＡＧＧＣＴＧＣＣＴＧＡＣＧＡＴＣＡＣＴＣ−３´、図７及び配列表の配列番号４参照）の２種のオリゴＤＮＡを調製した。
【００４９】
これらのプライマー３及び４を用い、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、ｒｅｃＡ遺伝子の上流域（２０５８塩基）を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【００５０】
さらに、ｒｅｃＡ遺伝子の下流域についても、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒ．１６８株の塩基配列（登録番号ＮＣ０００９６４）を基に、プライマー５（５´−ＴＴＡＧＡＧＡＡＣＧＣＴＴＴＡＴＴＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＡＡＴＴＴＧＡＡＧ−３´、図８及び配列表の配列番号５参照）及びプライマー６（５´−ＡＡＴＡＴＧＴＴＧＴＴＧＴＣＧＴＴＣＡＴＴＣ−３´、図９及び配列表の配列番号６に記載）の２種のオリゴＤＮＡを調製した。
【００５１】
これらのプライマー５及び６を用い、上流域と同様に、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、ｒｅｃＡ遺伝子の下流域（２０６１塩基）を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【００５２】
これらの増幅した、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片（１０７７塩基）、ｒｅｃＡ遺伝子の上流域を含むＤＮＡ断片（２０５８塩基）、及び、ｒｅｃＡ遺伝子の下流域を含むＤＮＡ断片（２０６１塩基）、を回収した後、これら３つの断片を鋳型として、プライマー３及びプライマー６を再び用いて、上流域を含むＤＮＡ断片及び下流域を含むＤＮＡ断片がスペクチノマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片の両端にアニールされるのと同時にＰＣＲを行うことで３断片を連結し、ｒｅｃＡ遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換されたｒｅｃＡ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片を得た。
【００５３】
ｉｉ）形質転換
上記のようにして調製したｒｅｃＡ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片を用いて、コンピテンス法によりｒ２２株を形質転換した。形質転換株の選択は、スペクチノマイシン耐性を指標に行った。
【００５４】
多数得られた形質転換株のうちの８株からゲノムＤＮＡを回収して、スペクチノマイシン耐性遺伝子と置換されて、ｒｅｃＡ遺伝子が欠損していることが電気泳動により確認できた５株のうち、さらにｒｅｃＡ遺伝子（１０４４塩基）中のＮ末端の２４塩基とＣ末端の２３塩基以外の９９７塩基が欠損して、スペクチノマイシン耐性遺伝子に置換されていることをシーケンスにより確認できた１株をバシラス・サチリス ＲＥＣ７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＥＣ７）株と命名し、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９９４として、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター 中央第６）に寄託した。
【００５５】
（実施例２：γ−ＰＧＡ非生産株の出現頻度の測定）
納豆菌ｒ２２株およびＲＥＣ７株を、５ｍｌのＬＢ培地を入れた試験管中で、３７℃で１２時間振とう培養し、これを第１世代とした。第１世代の培養液中の納豆菌を、濁度が０.０５となるように新たなＬＢ培地に植菌し、再び３７℃で１２時間振とう培養し、これを第２世代とした。以下、同様にして、第１２世代まで培養を継続した。
このようにして培養を継続する中で、２４時間ごと、すなわち２世代毎に、培養液を３枚のＧＳＰ寒天培地に１００μｌ塗抹し、全コロニー数と、γ−ＰＧＡ非生産コロニー数をそれぞれ測定した。
得られた全コロニー数とγ−ＰＧＡ非生産コロニー数とから、全コロニー数に占めるγ−ＰＧＡ非生産コロニーの割合を算出し、これを非γ−ＰＧＡ生産株の出現頻度（％）とした。表１に、結果を示した。
【００５６】
【表１】
【００５７】
その結果、対照としたｒ２２株では第８世代で２７％がγ−ＰＧＡ非生産性株となっており、さらに第１２世代では９１％もがγ−ＰＧＡ非生産性株となっていた。
これに対して、ＲＥＣ７株では第１２世代まで植え継いでも、γ−ＰＧＡ非生産株の出現頻度は常に０％である事が確認され、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させることにより、γ−ＰＧＡ非生産性株の出現を抑制させることが出来ることが確認できた。
【００５８】
（実施例３：ｒｅｃＡ遺伝子欠損により転移が抑制されたＩＳの確認）
ｉ）ｃｏｍＰ遺伝子へのＩＳ転移の確認
実施例２における第３世代〜第１２世代の各世代において、納豆菌ｒ２２株およびＲＥＣ７株について、ＩＳ４Ｂｓｕ１及びＩＳ２５６Ｂｓｕ１が高頻度に転移することが報告されているｃｏｍＰ遺伝子への転移をＰＣＲを用いて以下のように確認した。
【００５９】
すなわち、第３世代〜第１２世代の各世代のｒ２２株及びＲＥＣ７株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている納豆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＡＦ４のｃｏｍＰ遺伝子の塩基配列（登録番号ＡＢ０３１５５２）を基にして作製したプライマー７（５´−ＡＴＧＴＡＣＡＧＡＴＡＴＡＴＴＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡ−３’、図１０及び配列表の配列番号７参照）及びプライマー８（５’−ＴＴＡＣＡＡＴＴＣＧＡＴＴＴＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＣ−３´、図１１及び配列表の配列番号８参照）を用いてＰＣＲを行い、各々のｃｏｍＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
このようにして増幅された各世代ごとのＤＮＡ断片を電気泳動して、分子量を測定した。結果を、図２に示す。
【００６０】
その結果、対照としたｒ２２株では、第８世代以降において、正常なｃｏｍＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片（約２．３ｋｂ）よりも長くなっていて、ｃｏｍＰ遺伝子中にＩＳが転移したと予想される長さのＤＮＡ断片（約３．７ｋｂ）の存在が確認された。
これに対して、ＲＥＣ７株では第８世代以降も正常なｃｏｍＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片（約２．３ｋｂ）のみが増幅したことが確認され、ＲＥＣ７株ではｃｏｍＰ遺伝子へのＩＳの転移は確認されなかった。
【００６１】
ｉｉ）ｃｏｍＰ遺伝子へ転移するＩＳ種の同定
上記ｉ）における第１２世代のｒ２２株で検出されたｃｏｍＰ遺伝子にＩＳが転移したと予想される約３．７ｋｂのＤＮＡ断片、及び、ＰＣＲ操作の対照としてｒ２２株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＩＳ４Ｂｓｕ１とＩＳ２５６Ｂｓｕ１が有する各トランスポザーゼ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。
【００６２】
なお、ＩＳ４Ｂｓｕ１のトランスポザーゼ遺伝子の増幅にはプライマー９（５´−ＡＴＧＧＡＴＡＡＧＴＴＴＡＣＡＣＧＡ−３´、図１２及び配列表の配列番号９参照）及びプライマー１０（５´−ＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＴＣＡＴＧＡＡ−３´、図１３及び配列表の配列番号１０参照）を用い、また、ＩＳ２５６Ｂｓｕ１のトランスポザーゼ遺伝子の増幅にはプライマー１１（５´−ＴＧＧＧＧＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＧＡＧ−３´、図１４及び配列表の配列番号１１参照）及びプライマー１２（５´−ＴＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＡＣＧ−３´、図１５及び配列表の配列番号１２参照）を用いた。
【００６３】
その結果、図３に示した通り、対照として用いたｒ２２株のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合、両ＩＳのトランスポザーゼ遺伝子が増幅されたＤＮＡ断片が検出され、ＰＣＲは適切に実施できたことが確認できた。一方、ｃｏｍＰ遺伝子にＩＳが転移したと予想される約３．７ｋｂのＤＮＡ断片においても、同様に、両ＩＳのトランスポザーゼ遺伝子の存在が確認され、ｃｏｍＰ遺伝子中に高頻度で転移するとされているＩＳ４Ｂｓｕ１とＩＳ２５６Ｂｓｕ１がｒ２２株でもｃｏｍＰ遺伝子中に転移していることが確認された。
【００６４】
以上の結果から、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させていない通常の納豆菌では、ＩＳ４Ｂｓｕ１及びＩＳ２５６Ｂｓｕ１がｃｏｍＰ遺伝子に高頻度で転移するのに対して、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させることにより、これらのＩＳのｃｏｍＰ遺伝子への転移を完全に抑制できることが確認された。
【００６５】
（実施例４：納豆製造）
１２世代培養後のｒ２２株及びＲＥＣ７株から、それぞれ、常法により調製した胞子を用いて納豆を製造した。
製造された納豆について、糸引性を官能的に評価する一方、納豆１ｇ当たりのγ−ＰＧＡ量を測定した。
なお、γ−ＰＧＡは、納豆１０ｇからトリクロロ酢酸により抽出後、エタノールにより回収し、菅野らの方法（例えば、日本食品工学会誌、４２巻、ｐ．８７８−８８６、１９９５年参照）に従い、γ−ＰＧＡが臭化セチルトリメチルアンモニウムに結合する性質を利用して分光学的に定量した。
表２に結果を示した。
【００６６】
【表２】
【００６７】
その結果、第１２世代培養後のｒ２２株を用いて製造した納豆は、ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させたＲＥＣ７株を用いて製造した納豆と比較して、γ−ＰＧＡ量は約５％程度と少なく、その結果、ほとんど糸を引かなくて納豆としての品質をなしていなかった。
これに対して、ＲＥＣ７株を用いて製造した場合は、納豆のγ−ＰＧＡ量は十分であり、良好な糸引きが見られ、品質のよい納豆が安定して製造できることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ｒｅｃＡ遺伝子破壊用のＤＮＡ断片作製の概略を示した図である。
【図２】ｃｏｍＰ遺伝子へのＩＳの転移を確認した結果を示す電気泳動図である（図面代用写真）。
【図３】ｃｏｍＰ遺伝子へ転移したＩＳを確認した電気泳動図である（図面代用写真）。 図３中のレーン１は鋳型として３．７ｋｂのＤＮＡ断片を使用した場合の結果を示す。 図３中のレーン２は鋳型として全ゲノムを使用した場合の結果を示す。
【図４】プライマー１の塩基配列を示す図である。
【図５】プライマー２の塩基配列を示す図である。
【図６】プライマー３の塩基配列を示す図である。
【図７】プライマー４の塩基配列を示す図である。
【図８】プライマー５の塩基配列を示す図である。
【図９】プライマー６の塩基配列を示す図である。
【図１０】プライマー７の塩基配列を示す図である。
【図１１】プライマー８の塩基配列を示す図である。
【図１２】プライマー９の塩基配列を示す図である。
【図１３】プライマー１０の塩基配列を示す図である。
【図１４】プライマー１１の塩基配列を示す図である。
【図１５】プライマー１２の塩基配列を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させることにより、転移因子の転移が抑制されたことを特徴とする納豆菌。
【請求項２】
ｃｏｍＰ遺伝子への転移因子の転移が抑制されたことを特徴とする請求項１に記載の納豆菌。
【請求項３】
１２世代培養後もγ−ＰＧＡ非生産株が出現しないことを特徴とする請求項１又は２に記載の納豆菌。
【請求項４】
バシラス・サチリス ＲＥＣ７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＥＣ７）株（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９９４）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の納豆菌。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて製造されたことを特徴とする納豆。
【請求項１】
ｒｅｃＡ遺伝子を欠損させることにより、転移因子の転移が抑制されたことを特徴とする納豆菌。
【請求項２】
ｃｏｍＰ遺伝子への転移因子の転移が抑制されたことを特徴とする請求項１に記載の納豆菌。
【請求項３】
１２世代培養後もγ−ＰＧＡ非生産株が出現しないことを特徴とする請求項１又は２に記載の納豆菌。
【請求項４】
バシラス・サチリス ＲＥＣ７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＥＣ７）株（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９９４）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の納豆菌。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて製造されたことを特徴とする納豆。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１０−５７３８８（Ｐ２０１０−５７３８８Ａ）
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２２３９９０（Ｐ２００８−２２３９９０）
【出願日】平成２０年９月１日（２００８．９．１）
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１日（２００８．９．１）
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
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