造血前駆細胞の分化を増強する為の手段及び方法
本発明は、造血前駆細胞、リンパ球（好ましくはＴ細胞）及び単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞を含む培養物中において、分化した造血細胞の産生を刺激する為の手段及び方法を提供する。該方法は、とりわけ、該細胞又はその前駆体を、該単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞又は該リンパ球（好ましくはＴ細胞）上に発現される共刺激性分子に特異的な結合性分子の存在下において培養することを含む。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、血球減少、髄異形成及び、白血病の発症の増加したリスクにより特徴付けられる造血疾患の異質のグループ（heterogenous group）である。
【０００２】
骨髄異形成症候群は、前白血病を含む多くの名前により以前は呼ばれていた。語「前白血病」は、それが誤解させるものであるので、もはや用いられていない。ＭＤＳを伴う患者の少数が急性白血病を発症するが、多くは発症しない。白血病への転換（leukaemic transformation）が起こるとき、それは一般に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）になる。ＭＤＳから発展するＡＭＬは典型的には、原発性ＡＭＬ（既往の骨髄疾患を有さない患者に生じる症例）よりも、処置することが困難である。
【０００３】
骨髄異形成症候群における骨髄は典型的には、正常よりも活発であり、しかしながら、循環中の血液細胞の数は減少されている。これは、骨髄において産生されている細胞の多くが、欠陥があり及び／又は、それらが骨髄を出発して血流に入る前に破壊されると考えられるからである。血液細胞の全ての種類の数の減少は、汎血球減少と呼ばれている。骨髄異形成症候群の他の共通する特徴は、骨髄及び血液細胞の様子における異常である。これらの異常（例えば正常顆粒を欠く白血球）が該状態に特徴的である。
【０００４】
骨髄異形成症候群は、活発な髄しかし不適切な血液細胞産生の異常な組み合わせの故に、処置することが困難である。潜在的に病気に効くと考えられる唯一の処置は、より若く且つより適当な患者におけるドナー幹細胞移植である。残念ながら、多くの患者は、年をとりすぎていてこれが選択肢とらない。
【０００５】
ＭＤＳと、再生不良性貧血のような免疫介在性の病因が提案されている他の髄不全症候群との間に、ある程度の重なりがある。例えば再生不良性貧血と髄が不活発であるＭＤＳのサブタイプとの間を区別することはときどき困難でありうる。
【０００６】
ＭＤＳは、いずれの齢でも診断されうるが、幼年時代はまれであり、そして若年成人では珍しい。診断時の年齢中央値は６５〜７５歳であり、患者の９０％超が診断のときに５０歳を超えている。
【０００７】
男性は、女性よりも、ＭＤＳを発症しそうである。これは典型的高齢患者集団においてもっとも著しい。若年患者に起こる症例は、男性及び女性の間に、より均一に分布されている。
【０００８】
症例の約２０％は、化学療法又は放射線療法のいずれかを、他の病気のための彼らの処置として受けた患者に生じる。これは、二次性又は治療関連（ｔ−ＭＤＳ）の処置関連ＭＤＳとして知られている。これは、比較的若い年齢でＭＤＳを発症する患者によりしばしばあてはまる。
【０００９】
２つの分類体系がある：ＦＡＢ及びＷＨＯ。１９８２年に、Ｆｒｅｎｃｈ−Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｂｒｉｔｉｓｈ共同研究グループがＭＤＳの分類に関するガイドラインを提案した。骨髄細胞系列における形態学的異形成及び骨髄芽球の数が、患者を５つの別個のサブクラスに分けた。２００１年に、ＦＡＢ分類は、ＭＤＳの世界保健機構（ＷＨＯ）分類において修正されそして最新のものとされた。この分類は、形態学に基づくだけでなく、ＭＤＳ実体を定義する為の臨床的、遺伝的、免疫表現型的及び生物学的な所見も含んだ。
【００１０】
現在用いられているとおり、ＦＡＢ体系において骨髄異形成症候群の５つのタイプがある。
【００１１】
これらは、不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、過剰な芽球を伴う不応性貧血、転換期の（in transformation）、過剰芽球を伴う不応性貧血及び慢性骨髄単球性白血病である。
【００１２】
不応性貧血（refractory anaemia：ＲＡ）
【００１３】
赤血球を産生する骨髄細胞が異常にみえる。白血球及び血小板を産生する細胞もまた異常にみえるが、原始細胞（芽球細胞）の割合は有意に増加しない。該疾患の臨床的特徴は貧血であり、これは通常は軽症から中等症であるが、重症になりうる；しばしば赤血球が正常よりも大きな平均サイズを有し、これは大赤血球症と呼ばれる。白血球及び／又は血小板の数は正常よりも低くありうる。
【００１４】
ＲＡは、症例の約３０〜４５％を占める。ＲＡの症例の約１０％は、急性白血病に転換するであろう。ＲＡを有する患者のいくつかは、５年又は１０年さえを超えて健康に生き抜くが、平均生存は２〜５年である。
【００１５】
環状鉄芽球を伴う不応性貧血（refractory anaemia with ring sideroblasts：ＲＡＲＳ）
【００１６】
ＲＡにおけるものと同じ変化がみられるが、赤血球集団における追加の異常がある。赤血球前駆体は、正常に鉄を利用することができず、そして代わりに鉄が赤血球前駆体中の特徴的環に堆積する。これらの細胞は、環状鉄芽球と呼ばれる。もし、骨髄中に１５％超の環状鉄芽球があるならば、該病気はＲＡＲＳとして分類される。貧血はやはり共通の臨床的問題である一方で、白血球及び／又は血小板の数もまた正常より低くありうる。全体的な生存はＲＡにおけるものと同じであるが、急性白血病への転換は、症例の約８％でより低い。ＭＤＳのこの形は、症例の約１５％を構成する。
【００１７】
過剰の芽球を伴う不応性貧血（refractory anaemia with excess blasts：ＲＡＥＢ）
【００１８】
この形では、骨髄中の前駆体血球細胞（芽球細胞と呼ばれる）における増加がある。正常骨髄は最大で約５％の芽球細胞を含む。
【００１９】
ＲＡＥＢを有する患者は、彼らの骨髄中に５〜２０％の芽球細胞を有する。この形を有する患者は、彼らの血液中に血小板及び／又は白血球並びに赤血球の減少された数をより有しそうである。この形は、症例の約１５％を占め、そして約１年の生存期間中央値を有する。
【００２０】
ＲＡＥＢを有する患者の約４０％が、急性白血病を発症することになるであろう。
【００２１】
以下のサブタイプが現在ＦＡＢスキームに含まれているが、世界保健機構により作られた血液及び骨髄のガンの新規提案された分類は、それらが他のカテゴリーに移されることを示唆した。
【００２２】
転換期の、過剰芽球を伴う不応性貧血（refractory anaemia with excess blasts in transformation：ＲＡＥＢ−ｔ）
【００２３】
これらの患者における所見は、ＲＡＥＢにおけるそれらと同様であるが、骨髄における芽球のより高い割合（２０〜３０％）を伴う。この形は、症例の約５〜１５％を占める。最近、これらの患者が今、急性骨髄性白血病を有すると分類されるべきであると提案された。ｏｖｅｒｔ白血病（骨髄中の３０％超の芽球）への転化の割合は高く（６０〜７５％）、そして、処置は、急性骨髄性白血病について用いられるものと同様である。
【００２４】
生存期間中央値は６ヶ月以下であるが、幹細胞移植を伴う又は伴わない化学療法が、いくつかの症例において延長された生存期間を作る。
【００２５】
慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）
【００２６】
ＣＭＭＬにおいて、赤血球前駆体は通常、異常に見える。ＣＭＭＬの決定的な特徴は、血液中の白血球（単球）の１種類の数が、１×１０９／リットル超に増加されることである。骨髄は、芽球細胞の増加した割合を含むことがあり又は含まないこともある。貧血及び／又は少ない血小板がありうる。
【００２７】
ＣＭＭＬは、骨髄が該疾患の他の形において見られるものと同様の特徴を示すので、骨髄異形成症候群の１つの形であると考えられるが、骨髄増殖性疾患として知られる関連疾病と同様の特徴も示す。新たなＷＨＯ分類は、ＣＭＭＬを、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患と呼ばれる別のカテゴリーに移す。
【００２８】
ＣＭＭＬは、骨髄異形成症候群の約１５％を占める。ＣＭＭＬの急性白血病への転換は、他の形の骨髄異形成症候群と同様の様式で起こる。生存期間中央値は、１２〜１８月のオーダーである。患者の１５〜３０％が、急性白血病に進行する。
【００２９】
大抵の患者は、彼らの疾患についての明白な原因を有さないが、いくつかのよく確立されたリスク因子がある。高水準の或る化学物質、特にはベンゼン、への曝露、及び高水準の電離放射線への曝露は、両方ともＭＤＳの推定原因と考えられる。ＭＤＳの増加した発生が、喫煙者及び元喫煙者において報告されており、タバコの煙中に存在する特定の化学物質と関連するであろう。
【００３０】
全ての患者がすぐに積極的治療を受けるわけではないであろう。なぜなら、多くの症例において、早期の処置が全体的な生存期間に影響することの証拠がないからである。処置を開始していない患者は、定期的な健診を受けるであろう。これはしばしば、経過観察（watch-and-wait）といわれる。
【００３１】
患者の過半について、処置の選択は、国際予後スコアリングシステム（ＩＰＳＳ）のリスクカテゴリー、彼らの年齢及び彼らの全身状態に基づくであろう。ＩＰＳＳは疾患ステージ、冒された細胞タイプの数及び細胞遺伝学（ＭＤＳにおいて通常見られる染色体変化）についての情報も含む。これらは全て、結果（予後）を予測すること及び最適な処置を選択することにおいて関連があると分かった。４つのリスクカテゴリーが、ＩＰＳＳ内で認められている。これらは、低リスク、中間−１及び中間−２リスク、並びに高リスクである。
【００３２】
成長因子は、体内で産生される天然物質であり、これは血液細胞の産生及び成熟を制御し、そして、処置において用いられうる。骨髄異形成症候群の処置において用いられる主な成長因子は、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、これは赤血球の産生を刺激する、及びＧ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦと呼ばれる因子、これは顆粒球（白血球）の産生を刺激する、である。残念ながら、エリトロポエチンは、ＭＤＳを有する患者の約１５〜２０％にだけ有益であると分かり、そして、これらは主に、輸血に依存しない不応性貧血を有する患者である。ＥＰＯとＧ−ＣＳＦの組み合わせにより処置されたＭＤＳ患者の約４０％が、彼らの貧血の改善を示すであろう。Ｇ−ＣＳＦ単独は、慣用の治療に応答しない重度の感染エピソードの間の短期間処置のために用いられうる。
【００３３】
実験的治療
【００３４】
ＭＤＳの処置におけるそれらの潜在的役割を決定する為の比較研究（臨床試験）において現在試験されているいくつかの処置アプローチがある。これらは、ＭＤＳ細胞が正常な成熟を受けることを誘発することを試みる、サイトカインと呼ばれる天然の生化学物質の使用を含む。
【００３５】
今まで研究されてきたサイトカインは、成長因子、インターロイキン及びインターフェロンを含む。サイトカインが生存期間を延長するであろうこと又は寛解を誘発するであろうことは予測されず、むしろそれらがＭＤＳ患者についての生活の質（quality of life）を改善するであろうこと及び輸血及び抗生物質処置のニーズを減少するであろうことが期待される。汎血球減少がＭＤＳにおける病的状態及び死亡率の主要な原因であるので（少数だけだＡＬＭへと転換するであろう）、血球減少を改善することは患者の健康状態を増加するであろう。
【００３６】
現在調査下にある他の有望な試薬は、低メチル化剤（hypomethylating agent）、サリドマイド及びその類似体レナリドマイドである。メチルトランスフェラーゼインヒビター（５−アザシチジン及び５−アザ−２'−デオキシシチジン）が現在、ＭＤＳを処置する為のＦＤＡ承認を有する唯一の薬剤である。
【００３７】
ＭＤＳの、免疫により媒介された病因
【００３８】
ＭＤＳにおけるＢＭ疾患の病因は複雑であり、そして、造血前駆細胞における内因性欠陥とこれらの前駆細胞が存在するＢＭミクロ環境との間の繊細な相互作用に関連すると考えられる（参考文献）。免疫機構が汎血球減少の病因において重要な役割を果たすことの増えている証拠がある。この証拠は、自己Ｔリンパ球がＭＤＳ前駆体増殖を抑制することのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験、及び、選択された患者におけるオリゴクローナルＴ細胞増殖の存在の報告から来ており、抗原により駆動される病態生理学を想起させる。ＢＭ疾患のプロセスにおける免疫機構の役割についての示唆は、低リスクＭＤＳ患者の最大で３０％が、免疫抑制剤、例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）及び／又は抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）など、に応答するとの観察から来る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３９】
多くの研究は、この免疫プロセスにおけるリンパ球の役割に焦点を当てた。本発明において、我々は、ＣＤ４０を発現する細胞、特には単球、が、免疫細胞関連骨髄疾患を患う患者のＢＭにおいて起こる免疫反応の一部であること、及び、これらのＣＤ４０を発現する細胞がリンパ球に呼応して作用することを示す。ＭＤＳ単球のＣＤ４０刺激が、有意に増加したＴＮＦα産生をもたらすことが示された。我々はさらに、共刺激性分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６）の単球発現が増加されることを示す。また、ＣＤ４０の天然リガンド、ＣＤ１５４が、Ｔヘルパー細胞により、有意により多く発現される。我々はさらに、これらの個体からの骨髄細胞の培養物中において、これらの共刺激性分子の１以上と特異的に相互作用する分子が、該結合性分子の無い比較培養物よりも多くの数の産生された子孫細胞を結果することを示す。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
１つの実施態様において、本発明は、造血前駆細胞、ＣＤ４０レセプターリガンドを発現する細胞、好ましくはリンパ球、及びＣＤ４０レセプターを発現する細胞、好ましくは単球 ／マクロファージ及び／又は樹状細胞を含む細胞のコレクションを培養する為の方法であって、該細胞又はその前駆体を、該ＣＤ４０レセプターリガンドを発現する細胞、好ましくはリンパ球又はＣＤ４０レセプターを発現する細胞、好ましくは単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞上に発現された共刺激性分子に特異的な結合性分子の存在下で培養することを含む上記方法を提供する。本発明はさらに、造血前駆細胞、ＣＤ４０レセプターリガンドを発現する細胞、好ましくはリンパ球、及びＣＤ４０レセプターを発現する細胞、好ましくは単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞、を含む培養物中における、分化した造血細胞の産生を刺激する為の方法であって、該細胞又はその前駆体を、該ＣＤ４０レセプターリガンドを発現する細胞、好ましくはリンパ球、及びＣＤ４０レセプターを発現する細胞、好ましくは単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞、上に発現される共刺激性分子に特異的な結合性分子の存在下で培養することを含む上記方法を提供する。そのような培養物は、そのような結合性分子の無い培養物よりも、より多くの分化した細胞を産生する。種々のタイプの培養物が用いられうる。培養は、典型的には、培養培地と一緒に該細胞をインキュベートすることを含む。該現象は、「標準の」培養物中において及びいわゆるフィーダー層上の培養物中において、いわゆる長期間骨髄培養において典型的に行われるように、検出されうる。該造血前駆細胞は、培養の開始の際に存在してよく、又は該培養物に導入されたより原始的な前駆細胞／幹細胞から産生されうる。本明細書において定義されるとき、（造血）幹細胞は、成体の造血系の少なくともいずれかの種類の造血細胞を生じさせる能力を有する細胞である。造血幹細胞又は造血前駆細胞は、血液系から得られる。他の種類の幹細胞、例えば胚性幹細胞など、は当該定義に含まれない。造血幹細胞は、赤血球、白血球及び血小板を含む、通常の血液成分を生じさせる。幹細胞は通常、骨髄中及び血液中に位置されており、そして、移植の為に回収されうる。造血幹細胞は、広範な自己再生能力を有する。該幹細胞は、より分化した前駆細胞のカスケードを介して、種々の段階で成熟最終細胞へ分化する。これらのより分化した前駆細胞は、より限定された自己再生能力を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】共刺激性分子ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の表面発現についてのＰＢ ＣＤ１４＋単球のフローサイトメトリー分析結果を示す図である。
【図２】ＣＤ４０Ｌの表面発現についてのＰＢ Ｔヘルパー細胞のフローサイトメトリー分析結果を示す図である。
【図３】精製された単球のＣＤ４０刺激は、ＭＤＳ患者において、有意により高い水準のＴＮＦ−αを誘発することを示すグラフである。
【図４】単球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ骨髄増殖を抑制し、そして、これは、ＣＤ４０レセプターをブロックすることにより克服されうることを示すグラフである。
【図５】マウス５Ｄ１２の軽鎖及び重鎖の可変領域並びに脱免疫化５Ｄ１２を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の方法は、単球又はリンパ球の少なくともいずれかが、免疫細胞介在性骨髄疾患（immune cell mediated bone marrow failure）を患う個体又は患うリスクがある個体から得られた場合に特に有用である。これらの個体からの該言及された細胞が活性化され、又は活性化された細胞のより多い画分を少なくとも含むこと、及び結果としてより原始的な前駆細胞からの分化した細胞の産生が減少されることが考えられる。これは少なくとも部分的に、これらの個体の血液中の分化した細胞の観察された減少を説明する。好ましい実施態様において、該単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞は、免疫細胞介在性骨髄疾患を患う個体又は当該骨髄疾患を患うリスクのある個体から得られる。
【００４３】
免疫細胞介在性骨髄疾患病の非限定的な例は例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及びその逆、宿主対移植片（ＨＶＧ）病（ＨＶＧＤ）である。好ましい実施態様において、該免疫細胞関連骨髄疾患病は、クローン性骨髄疾患である。そのようなクローン性疾患の好ましい例は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）、骨髄線維症又は大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）である。理論にとらわれることなく、該免疫介在性疾患は、前駆細胞及び分化した細胞のより活発な発生を結果すると考えられる。このより活発な発生が最終的に、選択及びすなわちクローン性を結果する。
【００４４】
本発明はさらに、個体における血球減少及び／又は骨髄疾患の処置の為の方法であって、該個体に、単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞又はリンパ球に発現される共刺激性分子に特異的な結合性分子を与えることを含む上記方法を提供する。さらに、個体における血球減少及び／又は骨髄疾患の処置の為の方法であって、該個体に、該個体中の免疫活性化を減少し及び／又は抑制する為の結合性分子を与えることを含む上記方法が提供される。語「血球減少」は、本明細書において、血液中を循環する、細胞の数の減少又は細胞の１種類の数の減少として定義される。いくつかの種類の血球減少がある；低い赤血球数：貧血；低い白血球数：白血球減少又は好中球減少（好中球は全ての白血球の少なくとも半分を構成するので、それらは白血球減少においてはほとんどいつも低い）；低い血小板数：血小板減少；低い赤血球、白血球及び血小板の数：汎血球減少。本発明は特に、骨髄細胞系列の血球減少の処置に適当である。
【００４５】
該細胞の共刺激性分子を介した単球／マクロファージ及びＴ細胞の刺激に関与する経路の抑制が、該言及された培養物中又は該循環中のより多くの分化した細胞を結果することが示された。該共刺激性分子のいずれか１つはすなわち、免疫細胞介在性骨髄疾患の処置における標的である。共刺激性分子の好ましい例は、Ｂ７抗原、ＣＤ４０レセプター及びＣＤ４０レセプターリガンド（ＣＤ１５４）である。しかしながら、いくつかの他の共刺激性分子、例えば腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーメンバー ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ及びＯＸ４０（ＣＤ１３４）など、も存在する（参考文献：Ｗａｔｔｓ ＴＨ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５（２３）２３−６８）。ＣＤ４０は、樹状細胞（ＤＣ）上にＢ７ファミリーリガンド並びにいくつかのＴＮＦファミリーリガンドを誘発するその能力の故に、Ｔ細胞共刺激にとっての支配的なスイッチとして機能しうる（参考文献１、１３〜１８、Ｗａｔｔｓ ＴＨから）。
【００４６】
特に好ましい実施態様において、該共刺激性分子は、単球／マクロファージ上のＣＤ４０レセプター又はリンパ球上、特にはＴ細胞上、のＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）である。好ましい実施態様において、該Ｔ細胞は、刺激性Ｔ細胞である。好ましくは、該刺激性Ｔ細胞はＴヘルパー細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【００４７】
該結合性分子は、該共刺激性分子に対する特異性を有する結合性分子の任意のタイプでありうる。好ましい実施態様において、該結合性分子は、タンパク質又はタンパク質性の結合性分子である。好ましくは、該結合性分子は、非抗体足場タンパク質バインダーのいずれかのファミリー、例えばアンチカリン（anticalin）、Ｃ型レクチンドメインバインダー、アビマー（avimer）、アドネクチン（Adnectin）、及びＤＡＲＰｉｎｓ（設計されたアンキリン繰り返しタンパク質：Designed Ankyrin Repeat Proteins）などであるがこれらに限定されない、に属する（参考文献Ｓｈｅｒｉｄａｎ Ｃ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００７，（２５），３６５−３６６）。
【００４８】
好ましくは、該結合性分子は、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変ドメイン又はその等価物を少なくとも含む。そのようなタンパク質の非限定的な例は、ＶＨＨ、ナノボディ（nanobody）、Ｈｕｍａｎ Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｄＡｂ）、Ｕｎｉｂｏｄｙ、Ｓｈａｒｋ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳｈＡｒｐ）、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（ＳＭＩＰ（商標）） Ｄｒｕｇ、モノボディ（monobody）及び／又はＩＭａｂ（参考文献Ｓｈｅｒｉｄａｎ Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００７，（２５）,３６５−３６６）である。抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン又はその等価物を少なくとも有する結合性分子が好ましい。そのような結合性分子の非限定的な例は、Ｆ（ａｂ）−断片及び単鎖Ｆｖ断片である。標的に特異的に結合する為に操作されうるＩＧフォールドを有する多くの様々なタンパク質が存在する。そのような操作されるタンパク質は、抗体の等価物と考えられる。好ましい実施態様において、該結合性分子は抗体を含む。該抗体は、天然の抗体又は合成の抗体でありうる。好ましい実施態様において、抗体は、抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３領域を含む。しかしながら、例えばファージディスプレーにより選択されうるようなＣＤＲ様領域の人工的生成も、本発明に含まれる。好ましい実施態様において、該抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又はヒト様抗体である。（それらの特異性は別として）免疫系とさらに相互作用しない結合性分子が特に好ましい。抗体の場合、該抗体が、ＩｇＧ４定常領域、又はＩｇＧ４様定常領域を含むことが好ましい。好ましくは、該定常領域はヒト定常領域である。例えば、ＩｇＧ１分子の定常領域を、それがその標的に結合するともはや補体系を活性化しないように変異させることが可能である。
【００４９】
該結合性分子は好ましくは、非刺激性及び／又は拮抗性の結合性分子である。そのような分子は、それらに対し特異的である共刺激性分子に結合し、そして、該共刺激性分子を通じてシグナル伝達（活性化）を防ぎ及び／又は抑制する。好ましい実施態様において、該結合性分子は、ＣＤ４０特異的抗体又はその等価物である。好ましくは、該抗体は、非刺激性ＣＤ４０特異的抗体である。最も好ましくは、該抗体は、マウス抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体５Ｄ１２、キメラ５Ｄ１２抗体又は脱免疫化（deimmunized）５Ｄ１２抗体である。マウス５Ｄ１２並びに脱免疫化５Ｄ１２の軽鎖及び重鎖の可変領域が、図５中に描かれている。他の実施態様において、該抗体は、完全ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体１５Ｂ８である（国際公開第２００２０２８９０４号パンフレット）。
【００５０】
他の実施態様において、該結合性分子は、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）特異的抗体又はその等価物である。好ましくは該抗体は、ＡＴＣＣアクセスナンバーＨＢ−１０９１６を有するモノクローナル抗体５ｃ８又はモノクローナル抗体ＩＤＥＣ１３１（Ｄｕｍｏｎｔ ＦＪ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ．２００２ Ｍａｙ；３（５）：７２５−３４）である。
【００５１】
本発明はさらに、造血前駆細胞、リンパ球（特にはＴ細胞）及び単球／マクロファージ／樹状細胞を含む培養物中で分化した造血細胞の産生を刺激する為に、共刺激性分子に特異的な結合性分子を使用する方法を提供する。さらに、免疫細胞介在性骨髄疾患の処置の為の医薬の調製の為に、共刺激性分子に特異的な結合性分子を使用する方法が提供される。さらに他の実施態様において、本発明は、造血前駆細胞、リンパ球（特にはＴ細胞）及び単球／マクロファージ／樹状細胞を含む培養物中において分化した造血細胞の産生を刺激する為に、共刺激性分子に特異的な結合性分子を使用する方法を提供する。
【００５２】
さらに、免疫細胞介在性骨髄疾患の処置の為の医薬の調製の為に、共刺激性分子に特異的な結合性分子を使用する方法が提供される。
【実施例１】
【００５３】
患者、材料及び方法
【００５４】
患者データ及び試料
【００５５】
全ての試料の予備調製（prelevation）及び取扱いは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｌｅｕｖｅｎの地方倫理委員会のガイドライン（これはヘルシンキ宣言に従う）に従い実施された。ＭＤＳを組織学的に証明された９５の異なる患者からの試料がこの研究のために用いられた。患者の特徴は、表１にまとめられている。試料は、インフォームドコンセントの後に、ルーチンの抹消血（ＰＢ）及びＢＭサンプリングで得られた。患者の大部分（９５の患者のうち７０）は、試料が収集されたときに、ＭＤＳについての治療を受けていなかった。細胞遺伝学的分析についてのデータが、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｌｅｕｖｅｎ及びＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｌａｂ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｏｒｄｅｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｒｕｓｓｅｌｓにより提供された。
【００５６】
加えて、ＰＢ試料が、６０の健康なボランティアから得られた。フローサイトメトリー研究において用いられたドナー（ｎ＝２９）は、ＭＤＳ患者と年齢が合った（平均年齢６８、範囲５９〜８２）。１１の健康な若いボランティア（平均年齢２１、範囲１９〜２４）のＢＭ吸引物もまた、対照試料として働く為に得られた。
【００５７】
血液学的な値が、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＥ−２１００自動Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒにより決定された。血清Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度が、日立Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｄ 自動アナライザーで、粒子により増大される免疫濁度測定方法（particle-enhanced immunoturbidimetric method）により（ＣＲＰＬＸ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、測定された。
【００５８】
フローサイトメトリー
【００５９】
ＰＢ及びＢＭ試料が、ＥＤＴＡナトリウムにより被覆されたチューブ中に集められ、そしてすぐに処理された。１０：１ＮＨ４Ｃｌバッファーによる溶解及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ、ベルギー）による洗浄の後、細胞が以下の蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）及びＰｅｒｉｄｉｎｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ（ＰｅｒＣＰ）により複合体化されたモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）：抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ４５（全てＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ、ベルギー、から）により免疫染色された。適切なアイソタイプマッチ陰性対照が、それぞれの試料について用いられた。細胞が、１０μｌのモノクローナル抗体と一緒に３０分間４℃で暗所においてインキュベートされ、その後、１回洗浄されそして４００μｌのＣｅｌｌＦＩＸ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に再懸濁された。試料は、ＦＡＣＳｃａｎ又はＦＡＣＳＣａｎｔｏ Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析された。単球の表現型を決定する為に、我々はＣＤ１４＋集団について、中間の（intermediate）側方散乱（ＳＳＣ）によりゲートし、そして、ＣＤ１４及びＣＤ４０、ＣＤ１４及びＣＤ８０、並びにＣＤ１４及びＣＤ８６について二重陽性である、この集団中の細胞のパーセンテージを数えた。同様に、我々は、ＣＤ４及びＣＤ３について二重陽性である低いＳＳＣを伴う該集団についてゲートして、ＣＤ４０Ｌを発現したこの集団のパーセンテージを決定した。
【００６０】
単球の分離及び刺激
【００６１】
ＰＢ単核細胞（ＰＢＭＮＣ）が、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ、オスロ、ノルウェー）のステップ勾配上で分離され、そして、１回、ＰＢＳ中で洗浄されそしてその後ＭＡＣＳバッファー中で洗浄された。ＣＤ１４＋細胞は、製造者の指示に従い、ＣＤ１４＋磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を用いてＭＡＣＳにより分離された。分離されたＣＤ１４＋細胞は、トリパンブルー排除を用いて数えられた。それらは次に、２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のウェル中の、ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ペーズリー、英国）並びに１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、ＢＣ、カナダ）を補われたＩｓｃｏｖｅの修正Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ペーズリー、英国）中に、ｍＬ当たりウェル当たり３×１０５細胞の密度で、プレートされた。３７℃で５％のＣＯ２を伴う、加湿されたインキュベーター中において１週の培養後、培地が、リポ多糖（ＬＰＳ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ドイツ）を１μｇ／ｍＬで補われた又は１０μｇ／ｍＬでのクローン６４（アゴニスト抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体、Ｐａｎｇｅｎｅｔｉｃｓ、オランダ）及び１０００ＩＵ／ｍＬの最終濃度でのインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ドイツ）との混合物を補われた新鮮培地により置き換えられた。２４時間後、上清が回収され、そしてさらなる分析まで−２０℃で貯蔵された。
【００６２】
コロニー形成アッセイ
【００６３】
生存細胞の計数に続き、ＢＭＭＮＣ（ＭＤＳ患者について５×１０５、対照について２．５×１０５）が、３０％ＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子、１０ｎｇ／ｍＬの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−３、及び３Ｕ／ｍＬのエリトロポエチンを含むＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｈ４４３４培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、ＢＣ、カナダ）中に調製された。それぞれの試料について、ｃｈ５Ｄ１２（アンタゴニストキメラ抗ヒトＣＤ４０抗体、ＰａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、オランダ）を有さないチューブ及びｃｈ５Ｄ１２を１０μｇ／ｍＬの最終濃度で有するチューブが調製され、そしてまったく同じウェル中にプレートされた。１４日のインキュベーションに続き、プレートは倒立顕微鏡を用いてスコア化された。細胞数及びコロニーの形態学に基づき、我々は、顆粒球−単球コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）、及びＢＦＵ−Ｅとしての、シングル又はクラスターの、赤芽球コロニー形成単位を、定めた。
【００６４】
酵素連結イムノソルベントアッセイ
【００６５】
ＴＮＦ−α（ＢＤ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が、製造者の推奨により、ＥＬＩＳＡによって検出された。ＥＬＩＳＡの感度限界は１．２５ｐｇ／ｍＬであった。
【００６６】
統計
【００６７】
全ての統計分析は、Ｐｒｉｓｍ３．０ソフトウェアを用いて実施された。我々は、２つの集団の間の平均値を比較する為に、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｕ検定を用いた。Ｗｉｌｃｏｘｏｎマッチドペアー検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｍａｔｃｈｅｄ ｐａｉｒｓ ｔｅｓｔ）が、ＴＮＦ−α産生の結果及びＢＭ培養物の結果を分析する為に用いられた。スピアマンの検定が、２つの変数の間の共分散を分析する為に用いられた。Ｐ値は、両側検定（double-sided test）を表す。Ｐ値＜０．０５は有意と考えられた。
【００６８】
結果
【００６９】
ＭＤＳについてのＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の増加した発現水準
【００７０】
単球
【００７１】
フローサイトメトリーを用いて、我々は６１のＭＤＳ患者のＰＢ中の循環する単球の表現型を分析した。ＦＡＢ分類に従い、３７の患者が不応性貧血（ＲＡ）と診断され、２０が環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）及び４が過剰な芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）と診断され；そしてＷＨＯ分類に従い、１の患者がＲＡと診断され、３０が多系列異形成を伴う不応性血球減少（ＲＣＭＤ）と診断され、１がＲＡＲＳと診断され、１９が他系列異形成及び環状鉄芽球を伴う不応性血球減少（ＲＣＭＤ−ＲＳ）と診断され、３が、５ｑ−症候群と診断され、３がＲＡＥＢ−１と診断され、１がＲＡＥＢ−２と診断され、及び３が分類されないＭＤＳ（ＭＤＳ−ｕ）と診断された。大部分（６１のうち４０）は、試料収集の前にＭＤＳについての処置を何ら受けなかった。ＭＤＳについての治療は、輸血（ｎ＝９）、成長因子（４のｒｈＥＰＯ、１のｒｈＧ−ＣＳＦ及び１のｒｈＥＰＯとｒｈＧ−ＣＳＦとの組み合わせ）、鉄キレート化治療単独（ｎ＝２）又はこれらの治療の組み合わせ（ｎ＝４）を含んだ。単球の表現型に対する年齢の何らかの影響を排除する為に、２９の年齢が合った対象のＰＢが、対照集団として働いた。我々は、単球を、ＣＤ１４を発現する中間のＳＳＣ特徴を有するそれら細胞として定めた。我々は、ＣＤ４０を共発現する単球のパーセンテージを計数するためにこの集団についてゲートした（図１Ｂを参照されたい）。ＣＤ４０Ｌを発現するＴ細胞により活性化すると、単球は、ＣＤ４０の発現を上方制御するが、Ｂ７分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現も上方制御する１８、１９。それ故に、我々は、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現水準も分析した。
【００７２】
循環する単球の絶対数は両方の集団において同程度であった。ＭＤＳ患者は、年齢が合った対照の対象と比較して、有意により多い循環するＣＤ４０＋（１０．２％±１．１ｖｓ．２．８％±０．３、ｐ＜０．０００１）、ＣＤ８０＋（３．８％±０．５ｖｓ．１．７％±０．２、ｐ＝０．００４）及びＣＤ８６＋（７４．１％±３．０ｖｓ．５６．９±４．３、ｐ＝０．００１）単球を有した。同じ観察が、２３の患者のＢＭにおいてなされた（データは示されていない）。我々は、ＣＤ４０＋及びＣＤ８０＋の単球のパーセンテージの間の非常に有意な相関を発見した（Ｓｐｅａｒｍａｎ ｒ＝０．５４、ｐ＜０．０００１）。これは、同じ患者において、両方の活性化マーカーが高い水準で発現されていることを示唆する。しかしながら、ＣＤ８６の発現は、ＣＤ４０又はＣＤ８０の発現水準のいずれとも有意に相関しなかった、これはおそらく、有意なＣＤ４０又はＣＤ８０の発現の不在下においてさえ、単球はすでに有意な水準のＣＤ８６を発現するからである。
【００７３】
ＭＤＳのＴヘルパー細胞上のＣＤ４０Ｌの増加した発現
【００７４】
我々は、患者及び正常対照の同じ集団におけるＴヘルパー細胞の表面のＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）の発現も評価した。Ｔヘルパー細胞は、低いＳＳＣ特徴を有するＣＤ３＋／ＣＤ４＋であると定められた。ＣＤ４０Ｌは、年齢が合った対照と比較して、ＭＤＳ患者からのＴヘルパー細胞上に有意により多く発現されることが分かった（４．２％±０．４ｖｓ．２．２％±０．２、ｐ＜０．０００１、図２を参照されたい）。これは、ＭＤＳ患者のＢＭ吸引物中に存在するＴヘルパー細胞についても見られた（５．０％±０．８ｖｓ．２．６％±０．５、ｐ＜０．０１）。
【００７５】
さらに、我々は、単球によるＣＤ４０の発現とＴヘルパー細胞によるＣＤ４０Ｌ発現との間の相関を発見した（Ｓｐｅａｒｍａｎ ｒ＝０．３２、ｐ＝０．０２）。これは単球及びリンパ球の活性化が同じ患者において起こることを示唆する。
【００７６】
ＣＤレセプターの活性化は、ＭＤＳにおけるより高いＴＮＦ−α産生を誘発する
【００７７】
我々は次に、ＭＤＳ患者からの又は健康対照ドナーからの単球がアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体又はＬＰＳにより刺激されたときに、ＴＮＦ−α産生が異なるかどうかを評価した。それ故に、我々は、２０のＭＤＳ患者及び２５の健康な対照のＰＢからのＣＤ１４＋細胞を分離した。ＦＡＢ分類に従い、これらのＭＤＳ患者は、ＲＡ（ｎ＝１２）、ＲＡＲＳ（ｎ＝６）、ＲＡＥＢ（ｎ＝２）として、並びに,ＷＨＯ分類に従いＲＣＭＤ（ｎ＝１０）、ＲＣＭＤ−ＲＳ（ｎ＝６）、ＲＡＥＢ−１（ｎ＝２）、５ｑ−症候群（ｎ＝１）及びＭＤＳ−ｕ（ｎ＝１）として診断された。成熟を誘発するための７日の培養後、ＣＤ１４＋細胞が、ＴＮＦ−α産生を誘発する為の２つの異なる刺激（ＬＰＳ又はアゴニスト抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂ（ｃｌｏｎｅ６４、ＰａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、オランダ２６）に２４時間付された。与えられた刺激に対する応答を最大化する為に、我々は高濃度のＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を用いた。同じ理由のために、我々は、ＩＦＮ−γがＣＤ４０レセプターの転写を誘発すると知られているので２７、該アゴニスト抗ＣＤ４０抗体をＩＦＮ−γ（最終濃度１０００ＩＵ／ｍＬ）と組み合わせた。
【００７８】
ＣＤ１４＋分離の平均純度は、対照について９７．１％（範囲９１．９〜９９．７％）であり、そしてＭＤＳ患者について９７．２％（範囲９５．０〜９８．９％）であった。刺激されていないＣＤ１４＋細胞のＴＮＦ−α水準は両方の集団において低かった（３±１ｐｇ／ｍＬ）。図３において示されるとおり、ＬＰＳは、患者（１２３±４４ｐｇ／ｍＬ）及び対照（１００±３２ｐｇ／ｍＬ）におけるＴＮＦ−αの同様の水準を誘発した。対照的に、ＩＦＮ−γと組み合わせられたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、正常対照と比較して、ＭＤＳ患者からのＣＤ１４＋単球による有意により高いＴＮＦ−α産生を誘発した（４４９±１３１ｖｓ．６７±２０ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝０．００９）。
【００７９】
単球によるＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現と臨床的特徴との間の相関
【００８０】
我々は、ＣＤ１４＋単球上及びＴヘルパーリンパ球上のそれぞれにおける、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの発現と、病気又は患者の特徴との間に相関があるかどうかを評価した。第一に、我々は、ＣＤ４０＋又はＣＤ８０＋単球のパーセンテージと血液学的値（ヘモグロビン水準、血小板、白血球及び好中球絶対数（ＡＮＣ））とを関係付けた。我々は、ＡＮＣと、循環するＣＤ８０＋単球のパーセンテージとの間の負の相関を観察した（ｒ＝−０．２６、ｐ＜０．０５）。同じ観察が、ＣＤ８０＋単球のパーセンテージがＢＭ採取のときでのＰＢ ＡＮＣと逆に相関するところの骨髄試料についてなされた（ｒ＝−０．５１、ｐ＜０．０５）。ＣＤ４０又はＣＤ８６の発現と血液学的パラメーターとの間に有意な相関は無かった。注目すべきは、健康なドナーにおいて、我々は、ＡＮＣとＣＤ８０＋単球のパーセンテージとの間の逆の相関も発見した（ｒ＝−０．４９、ｐ＜０．０１）。この種の分析は因果関係の実証を許すものでないが、これは、単球の活性化が、病気の状態に関係なく、より低いＡＮＣ値に関係しうることを示唆する。我々は、芽球パーセンテージと共刺激性分子の発現との間の相関を発見しなかった。我々はまた、単球上のＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６並びにＴヘルパー細胞上のＣＤ４０Ｌの発現とＣＲＰの血清濃度とを関連付けた。ＣＲＰ水準は概して低く、そして共刺激性分子の発現と独立していた。臨床的兆候又は自己免疫の病歴が５の患者において観察されたが、ＣＤ４０、ＣＤ８０又はＣＤ８６発現の水準と相関しなかった。
【００８１】
次に、我々は、単球上のＣＤ４０、ＣＤ８０又はＣＤ８６の発現が、ＦＡＢのサブタイプ、ＷＨＯのサブタイプ、ＩＰＳＳスコア、細胞遺伝学、性別又は以前の処置に従い、疾病状態に相関するかどうかを決定した。我々は、ＲＡ、ＲＡＲＳ及びＲＡＥＢの患者の間に差異を発見しなかった。興味深いことに、我々は、核型異常トリソミー８を有する患者が、循環するＣＤ４０＋単球の最も高い水準を有することを発見した。中間−１のＩＰＳＳスコアを有する患者は、低リスク患者よりも有意により多いＣＤ４０＋単球を有したが、これは、全てのトリソミー８の患者が中間−１リスクスコアを有したという事実に起因しえた。以前に処置を受けた患者と未処置の患者との間に、単球によるＣＤ４０又はＣＤ８０の発現に関して、差異は無かった。
【００８２】
最後に、我々は、ＣＤ４０を発現する単球のパーセンテージに基づき、対照集団において見られたＣＤ４０を発現する単球の最高の値をカットオフ値（６．４％）として用いて、患者を２つの集団に分けた：＜６．４％のＣＤ４０＋単球を有する患者の１集団、及び＞６．４％のＣＤ４０＋単球を有する患者の集団。高水準のＣＤ４０＋単球は、より高いＩＰＳＳスコア、中間の及び乏しい細胞遺伝学的リスクスコア、６０歳より低い年齢及びトリソミー８の存在に一致した（表２を参照されたい）。後者の２つの因子は、多変数分析において、免疫抑制的治療に対する応答の予測的な独立的因子であるとして同定された。注目すべきは、好ましい（favourable）核型異常を有する患者（ｄｅｌ（５ｑ）を有する３の患者、ｄｅｌ（２０ｑ）を有する２の患者、及びＹを有する２の男性）は、それらの循環する単球上にＣＤ４０の低い発現を有した。
【００８３】
単球上のＣＤ４０レセプターを拮抗することは、ＭＤＳにおいて増加したコロニー形成をもたらす。
【００８４】
我々は、ＣＤ４０レセプターが単球上で上方制御されること及びこのレセプターの活性化が増加したＴＮＦ−α産生をもたらすことを実証したので、我々は、ＣＤ４０シグナル伝達の干渉がｉｎ ｖｉｔｒｏでの造血前駆体増殖に影響しうるとの仮説を立てた。この仮説を試験する為に、我々は、ＣＤ４０シグナル伝達を抑制する為に、アンタゴニスト抗ＣＤ４０ｍＡｂ（ｃｈ５Ｄ１２、ＰａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、オランダ）を用いた２２。ｃｈ５Ｄ１２はキメラ抗体であり、ヒト抗体の定常領域に連結された、図５の抗体５Ｄ１２ｍの可変領域（Ｖｈ及びＶｌの両方）を有する。
【００８５】
我々は、ｃｈ５Ｄ１２の存在下又は不在下において２６の患者のＢＭＭＮＣをプレートした。患者は、ＦＡＢに従いＲＡ（ｎ＝１７）、ＲＡＲＳ（ｎ＝４）及びＲＡＥＢ（ｎ＝５）として診断され、そしてＷＨＯに従いＲＣＭＤ（ｎ＝１４）、５ｑ−（ｎ＝２）、ＭＤＳ−ｕ（ｎ＝１）、ＲＣＭＤ−ＲＳ（ｎ＝４）、ＲＡＥＢ−１（ｎ＝２）及びＲＡＥＢ−２（ｎ＝３）として診断された。有意により多いＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−Ｅが、ｃｈ５Ｄ１２の無い培養物と比較して、ｃｈ５Ｄ１２の存在下において増えた（図４Ａを参照されたい）。この効果が単球依存的であることを証明する為に、我々はまた、ＭＡＣＳカラムによりＣＤ１４陽性細胞を枯渇したＢＭＭＮＣの培養物にｃｈ５Ｄ１２を添加した。ｃｈ５Ｄ１２の存在は、ＣＤ１４を枯渇したＢＭＭＮＣのコロニー形成を変化させなかったが、ｃｈ５Ｄ１２は、全てのＢＭＭＮＣの存在下における同じ試料においてコロニー産生を増加した（図４Ｂを参照されたい）。我々は、健康な対照（ｎ＝９）のＢＭＭＮＣ培養物におけるＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−Ｅコロニー数に対するｃｈ５Ｄ１２のこの効果を観察しなかった。
【００８６】
ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用が造血前駆体に影響しうることをさらに実証する為に、我々は、ＢＭＭＮＣ内のＣＤ４０Ｌ＋Ｔヘルパー細胞又はＣＤ４０＋単球の数の間に相関が存在するかどうかを試験した。我々は、その特定の患者集団において、ＢＦＵ−Ｅの数とＣＤ４０Ｌ＋Ｔヘルパー細胞のパーセンテージとの間の逆の相関を実証した（ｒ＝−０．５４、ｐ＝０．０３）。ＣＦＵ−ＧＭのより低い数についての、ＣＤ４０＋単球のパーセンテージを増加することを伴う傾向もあったが、これは有意でなかった（ｒ＝−０．４２、ｐ＝０．０７）。
【００８７】
考察
【００８８】
血球減少は、ＭＤＳを有する大抵の患者の主症状であり、そして、病的状態及び死亡率の主要な原因である。異常クローン性前駆細胞の存在は、骨髄疾患の発症において重要な役割を果たし、そして免疫増強機構がこのプロセスにさまざまな程度で寄与する。最も前の研究は、このプロセスにおけるリンパ球の役割に焦点を当てた。自己のＴ細胞は、ＭＤＳにおける前駆細胞の増殖を抑制し２、３、そしてこの効果はＡＴＧによる成功裏の処置後に消えうる２。免疫により媒介された造血抑制の役割は、トリソミー８のＭＤＳにおいて最も広く明確にされた。ＭＤＳ患者の一般集団について示されたものと一致して４，６，７、Ｓｌｏａｎｄ及び同僚は、Ｔ細胞の拡大したクローン性集団が、トリソミー８を有する全ての患者において見られ得ることを実証した５。加えて、彼らは、これらの患者における自己Ｔ細胞の抑制作用が、この特定のクローン型を有するＣＤ８＋細胞に限定されることを示した。
【００８９】
これらの洞察にもかかわらず、免疫により媒介される機構が、ＭＤＳにおいて見られる汎血球減少にどのように寄与するのか、いまだ知られていない。免疫抑制的治療に応答するトリソミー８患者において、余分な染色体８を有する前駆細胞の数は増加し５、これは、これらの患者における該Ｔリンパ球の拡大したクローン性集団が、遺伝的に異常な造血前駆体の増殖を制御することを示唆する。該悪性クローンに特異的に方向付けられると分かるこの免疫応答に関連する骨髄疾患は、それ故に、残存する正常造血細胞に対するバイスタンダー効果（bystander effect）から来るべきである。どの因子がこのバイスタンダー現象を引き起こすかは知られておらず、そしていくつかの機構が、Ｔ細胞による正常前駆細胞のこの抑制について示唆されてきた５：活性化Ｔ細胞によるサイトカインの放出２８又は分子模倣又はエピトープスプレッディングを通じた標的の交差認識２９。
【００９０】
この研究の目的は、免疫により媒介されるこのプロセスにおける単球の可能な役割を調査することであった。単球は、ＴＮＦ−αの主な源である。活性化Ｔ細胞は、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を介して、単球によるＴＮＦ−α産生を誘発することができる。ＣＤ４０レセプターは、ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの一員である、４５〜５０ｋＤａのＩ型リンタンパク質である。単球は低水準のＣＤ４０を発現し３０、しかし活性化するとＣＤ４０遺伝子の発現は誘発され、これはＩＦＮ−γによる刺激によって最も明白である２７ことが実証された。ＴＮＦ−αの産生に加えて、ＣＤ４０ライゲーションもまた、他の炎症促進性サイトカイン及びケモカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びマクロファージ炎症性タンパク質１ａなど、の分泌を結果する１８、１９。加えて、Ｔヘルパー細胞上に存在する、ＣＤ４０ＬによるＣＤ４０のライゲーションは、共刺激性分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ分子）及びＦａｓＬの上方制御を促進する。ＣＤ４０Ｌは、活性化Ｔヘルパー細胞上に一過性に発現され、そして、いくつかの自己免疫状態においてＰＢのＴヘルパー細胞上に存在すると示された。ＭＤＳにおけるリンパ球は、活性化した表現型を有すると分かっているので７、３１、この経路は、ＭＤＳ患者のＢＭにおける単球の活性化に、ＴＮＦ−αの産生に、及び続く造血抑制に関与しうる。
【００９１】
本発明において、我々は、ＭＤＳ関連の骨髄の病因におけるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の役割を実証する。第１に、我々は、６１の主に低リスク未処置患者の大きな集団において、有意により多いＰＢ ＣＤ１４＋単球が、ＣＤ４０及びＣＤ８０を発現することを示した。加えて、有意により多いＰＢ Ｔヘルパー細胞が、ＭＤＳ患者においてＣＤ４０を発現し、そしてＴリンパ球上のＣＤ４０Ｌの発現は、ＣＤ１４＋単球のＣＤ４０発現と非常に相関した。ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの過剰発現もまた、ＢＭ試料において観察され、ここでリンパ球及び単球はそれらの機能を発揮すると考えられる。
【００９２】
ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの発現水準の測定に加えて、我々は、ＴＮＦ−α産生並びに造血前駆体の増殖及び分化に対するこの経路の刺激及び抑制のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果も分析した。アゴニスト抗ＣＤ４０ｍＡｂを用いたＭＤＳ単球上のＣＤ４０のライゲーションは、対照と比較して、増加したＴＮＦ−α産生を結果した。我々の知る限り、これはＴＮＦ−α産生に関するＭＤＳ単球の異なる挙動を実証する最初の報告である。我々のシリーズにおいて（in our series）、ＴＮＦ−α産生は、ＬＰＳにより刺激されたＭＤＳと正常単球との間で同様であり、これは他による以前の報告と一致する１７。ＭＤＳ単球上のＣＤ４０レセプターの増加した表面発現は、この異なる挙動を説明しうるが、異なる下流経路の活性化も関与しうるが３０、これはまだ調査されていない。
【００９３】
加えて、我々は、コロニー形成アッセイにおいてこの経路を抑制することの効果を、モノクローナル抗体ｃｈ５Ｄ１２（これは、炎症性腸疾患２２及び自己免疫脳脊髄炎の非ヒト霊長類モデル２４の治療において有効であると示されているアンタゴニストキメラ抗ヒトＣＤ４０抗体である）を用いて分析した。ｃｈ５Ｄ１２の存在下において、ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＭの数は、ＭＤＳのＢＭＭＮＣの培養物において有意に増加したが、コロニー形成アッセイを開始する前にＣＤ１４＋単球の枯渇は続かなかった。これは、造血に対する単球の抑制的効果が、ｃｈ５Ｄ１２を用いて、これら単球上のＣＤ４０レセプターを拮抗することにより克服されうることを証明する。ＢＦＵ−Ｅの数がＣＤ４０Ｌ＋Ｔヘルパー細胞のパーセンテージに逆相関することの観察と一緒に、これは造血に対するリンパ球の抑制的効果が、単球からの追加のサイトカイン放出に部分的に起因しうることを示唆する。しかしながら、サイトカインがこれに関係するかどうかはいまだ明らかでない。我々のＢＭ培養物中のＴＮＦ−α濃度は非常に低いので、我々は、ｃｈ５Ｄ１２の存在下におけるＴＮＦ−α水準の下方制御を観察することができなかった（データは示されていない）。
【００９４】
まとめると、これらの観察は、治療的及び診断的価値の両方を有する。第一に、我々は、ＭＤＳ単球によるＣＤ４０の発現が、ＢＭの内部で進行している免疫攻撃についてのマーカーとして働くことを示した。循環する単球上のＣＤ４０発現は、重度の敗血症を有する患者において増加されるが３２、全身的な炎症性応答は、我々の結果に関与しないようである。ＣＲＰ水準は低かった、そして、ＣＤ１４＋細胞上のＣＤ４０の発現と相関しなかった。加えて、最近の感染病歴を有する患者は、この研究から排除された。骨髄における免疫学的活性のマーカーとしてのＣＤ４０の使用はさらに、６０歳より低い年齢及びトリソミー８が、高いＣＤ４０発現と一致するとの観察により支持される。両方の因子が、ＭＤＳにおける免疫抑制的治療に対する応答についての最も強力な予測因子として同定されており１４、３３、そしてそれ故に、免疫機構は、これらの患者において特に重要な役割を果たす。
【００９５】
単球上のＣＤ４０シグナル伝達の抑制は、増加したＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＭ形成を結果する。さらに、ＣＦＵ−ＧＭの数は、統計学的な有意に達さなかったけれども、ＣＤ４０＋ ＣＤ１４＋の細胞のパーセンテージと逆相関した。加えて、共刺激性分子を共発現するＣＤ１４＋単球の増加したパーセンテージは、減少したＡＮＣと一致し、６１の血液試料において観察された。さらに、この観察は、異なる患者から得られた、２３のＢＭ試料において独立になされた。最後の観察もまた、年齢が合った対照からのＰＢにおいてなされており、それ故に、それはＭＤＳに特異的でないが、全ての免疫細胞介在性骨髄疾患における一般的な現象であることを示唆する。
【００９６】
以前の研究は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＭＤＳ患者において活性化した表現型を有することを実証した７、３１。ここに、我々は、ＣＤ４＋Ｔ細胞もまた、患者において活性化されることを示し、そして、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を通じたＭＤＳ病因におけるそれらの関与を実証する。これはさらに、Ｔヘルパー細胞によるＣＤ４０Ｌ発現が、単球によるＣＤ４０発現と一致したとの観察により支持される。さらに、ＭＤＳ ＢＭＭＮＣ培養物中のＢＦＵ−Ｅの数が、Ｔヘルパー細胞によるＣＤ４０Ｌ発現の増加に伴い有意に減少された。循環するＣＤ４０Ｌ発現性Ｔヘルパー細胞の高いパーセンテージは興味深い。それは、ＣＤ４０Ｌ発現が、ＭＤＳにおいて増加されるか又は安定化されること示す。増加したＣＤ４０Ｌ発現は、抑制性ＣＤ８クローン型の誘発において、抗原提示細胞を通じて関与しうるが、これもさらなる調査を請け負う。
【００９７】
それらの診断的価値とは別に、我々の観察は、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を拮抗することが、ＭＤＳ関連血球減少を処置する為に用いられうるので、治療的適切さも有する。ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体は現在、種々の血液学的疾患、例えば多発性骨髄腫３４、３５及び非ホジキンリンパ腫３６など、における使用について調査中である。これらの抗体の作用の様式は、抗体依存性の細胞媒介性細胞毒性に依存し３７及び悪性細胞に対する直接的アポトーシス効果よる３４。他の悪性腫瘍において、アゴニスト抗ＣＤ４０ Ｍａｂを有する単球の活性化は、腫瘍増殖を抑制することが示されている３８。しかしながら、ＭＤＳにおいて、治療的価値は、免疫応答を漸減させることにあり及び、従って血球数を改善する為に正常前駆体に対する巻き添え被害を限定することにある。この理由の故に、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路の刺激よりもむしろ抑制が治療的に、ＭＤＳにおいて適切である。本明細書において記載されたアゴニスト抗ＣＤ４０ ｃｈ５Ｄ１２は、ＭＤＳを含むヒト病理におけるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌの抑制を標的とするための適切な選択肢である。
【００９８】
表
【００９９】
【表１】
ＭＤＳ、骨髄異形成症候群；ＦＡＢ、Ｆｒｅｎｃｈ−Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｂｒｉｔｉｓｈ；ＲＡ、不応性貧血；ＲＡＲＳ、環状鉄芽球を伴う不応性貧血；ＲＡＥＢ：過剰な芽球を伴う不応性貧血；ＷＨＯ：世界保健機構；ＲＣＭＤ、多系列異形成を伴う不応性血球減少；ＲＣＭＤ−ＲＳ、多系列異形成及び環状鉄芽球を伴う不応性血球減少；ＭＤＳ−ｕ、分類されないＭＤＳ；ＩＰＳＳ、国際予後スコアリングシステム
１利用できない
【０１００】
【表２】
患者は、対照集団における最高の測定値をカットオフポイントとして用いて（６．４％）、「高い」又は「低い」集団にグループ分けされた。Ｂ／表は、（ａ）両方の集団における平均を比較する為のＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｕ検定の結果（数は平均±ＳＥＭとして表される）、及び、（ｂ）カテゴリ変数についてのＸ２検定の結果をまとめる。
１６１の患者のうち４９から、細胞遺伝学的データが、ＩＰＳＳスコアを決定する為に利用可能であった。２ＩＰＳＳは、核型異常を定義する−Ｙ、ｄｅｌ（２０ｑ）及びｄｅｌ（５ｑ）は、好ましいとして；トリソミー８、シングルの種々の異常及びダブルの種々の異常は、中間として；及び３以上の異常及び何らかの７番染色体の異常は、乏しいとして。
３ＭＤＳ処置は、成長因子（４のｒｈＥＰＯ、１のｒｈＧ−ＣＳＦ、１のｒｈＥＰＯ及びｒｈＧ−ＣＳＦの組み合わせ）、輸血（ｎ＝９）、鉄キレート治療（ｎ＝２）、又は組み合わせ（ｎ＝４）を含んだ。
４自己免疫疾患は、血管炎（ｎ＝１）、関節リウマチ（ｎ＝１）、自己免疫性溶血性貧血（ｎ＝１）、ＩＴＰと一緒の関節リウマチ（ｎ＝１）、炎症性腸疾患（ｎ＝１）を含んだ。
【０１０１】
図面の説明
【０１０２】
図１．共刺激性分子ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の表面発現についてのＰＢ ＣＤ１４＋単球のフローサイトメトリー分析
全てのＰＢ細胞が溶解され、洗浄され、そして次にＰＥ−又はＦＩＴＣ−複合体化マウス抗ヒト抗ＣＤ１４、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ８０及び抗ＣＤ８６のｍＡｂにより二重染色された。（Ａ）象限の設定の代表的ドットプロット。細胞は、適切なアイソタイプ対照抗体により染色され、そして分析は単球ゲートにおいて実施された。（Ｂ−Ｃ）ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６を発現した単球のパーセンテージの決定の代表的ドットプロット。分析は、中間のＳＳＣを有するＣＤ１４＋細胞について実施された。（Ｂ）は、共刺激性分子の低水準の発現を有する、ｄｅｌ（２０）（ｑ１２）を伴うＲＡＲＳ／ＲＣＭＤ−ＲＳを有する５７歳女性患者の結果を表す；（Ｃ）は、共刺激性分子の高い発現を有する、ＲＡ／ＲＣＭＤ及び正常な細胞遺伝学を有する７８歳女性患者の結果を表す；（Ｄ）６１の患者のＰＢ試料と２９の年齢が合った対照のＰＢ試料の結果。ＦＡＢに従う患者分布：ＲＡ（ｎ＝３７）、ＲＡＲＳ（ｎ＝２０）、ＲＡＥＢ（ｎ＝４）；ＷＨＯに従い、ＲＡ（ｎ＝１）、ＲＣＭＤ（ｎ＝３０）、ＲＣＭＤ−ＲＳ（ｎ＝１９）、ＲＡＲＳ（ｎ＝１）、５ｑ−（ｎ＝３）、ＲＡＥＢ−１（ｎ＝３）、ＲＡＥＢ−２（ｎ＝１）、ＭＤＳ−ｕ（ｎ＝３）。プロットは、対照及び患者の平均を比較する為の、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｕ検定の結果を示す。Ｐ値はそれぞれ、＜０．０００１***、０．００４**及び０．００１**であった。
【０１０３】
図２．ＣＤ４０Ｌの表面発現についてのＰＢ Ｔヘルパー細胞のフローサイトメトリー分析
ＰＢが溶解され、洗浄されそして次にＣＤ４０Ｌ−ＰＥ、ＣＤ３−ＦＩＴＣ及びＣＤ４−ＰｅｒＣｐにより三重染色された。Ｔヘルパー細胞は、低いＳＳＣ特徴を有するＣＤ３＋／ＣＤ４＋二重陽性細胞として定義された。（Ａ）活性化Ｔヘルパー細胞の増加した割合を有する患者を表す代表的ドットプロット。象限は、適切なアイソタイプ対照抗体に基づき決定された。（Ｂ）総計で、２９の年齢が合った対照及び６０の患者が、ＣＤ４０Ｌ＋Ｔヘルパー細胞の平均パーセンテージについての比較について利用可能であった（ｐ＜０．０００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｕ検定）。
【０１０４】
図３．精製された単球のＣＤ４０刺激は、ＭＤＳ患者において、有意により高い水準のＴＮＦ−αを誘発する。
ＣＤ１４＋細胞が、２５の健康な対照及びＭＤＳを有する２０の患者のＰＢから分離された。７日の培養後、これらの細胞は、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）又はクローン６４（１０μｇ／ｍＬ、活性化する抗ＣＤ４０ ｍＡｂ）及びＩＦＮ−γ（１０００ＩＵ／ｍＬ）により刺激された。上清が２４時間後に集められ、そしてＴＮＦ−α濃度がＥＬＩＳＡにより測定された。Ｐ値は、ウィルコクソン符号順位和検定（Wilcoxon matched pairs test）の結果を表す。
【０１０５】
図４．単球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ骨髄増殖を抑制し、そして、これは、ＣＤ４０レセプターをブロックすることにより克服されうる。
ＢＭＭＮＣが、標準的条件下又はｃｈ５Ｄ１２（アンタゴニストキメラ抗ＣＤ４０ ｍＡｂ）の存在下において、成長因子を補われたメチルセルロース（Ｍ４４３４、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖された。１４日後、ＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−Ｅがスコア化された。結果は、２５０×１０３のプレートされたＢＭＭＮＣごとのコロニー数として示される。（Ａ）２６の患者のＢＭＭＮＣが、ｃｈ５Ｄ１２の存在下／不在下におけるＭ４４３４中で培養された。患者は、ＦＡＢに従い、ＲＡ（ｎ＝１７）、ＲＡＲＳ（ｎ＝４）、ＲＡＥＢ（ｎ＝５）と診断され、そしてＷＨＯに従い、ＲＣＭＤ（ｎ＝１４）、５ｑ−（ｎ＝２）、ＭＤＳ−ｕ（ｎ＝１）、ＲＣＭＤ−ＲＳ（ｎ＝４）、ＲＡＥＢ−１（ｎ＝２）及びＲＡＥＢ−２（ｎ＝３）と診断された。ｃｈ５Ｄ１２の存在は、コロニー形成を有意に増加した。ｐ値は、ウィルコクソン符号順位和検定の結果を表し、そして、夫々、０．０００７***、０．００５**、及び０．０２*であった。（Ｂ）１０の患者の、ＢＭＭＮＣ及びＣＤ１４＋細胞を枯渇したＢＭＭＮＣが、ｃｈ５Ｄ１２の存在下／不在下において培養された。コロニーの合計数における有意な増加（ｐ＜０．０５*）は、ＣＤ１４を枯渇した条件下では観察されなかった。
【０１０６】
図５．５Ｄ１２ｍ：マウス抗ヒトＣＤ４０レセプター抗体。５Ｄ１２ｄｉ：５Ｄ１２ｍの重鎖及び軽鎖の変異体。Ｖｈ＝可変重鎖、Ｖｌ＝可変軽鎖。ＦＲ１〜４（フレームワーク１〜４）；Ｃｈｏｔｈｉａ；ＣＤＲ領域のＫＡＢＡＴ位置。
【０１０７】
参考文献
【背景技術】
【０００１】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、血球減少、髄異形成及び、白血病の発症の増加したリスクにより特徴付けられる造血疾患の異質のグループ（heterogenous group）である。
【０００２】
骨髄異形成症候群は、前白血病を含む多くの名前により以前は呼ばれていた。語「前白血病」は、それが誤解させるものであるので、もはや用いられていない。ＭＤＳを伴う患者の少数が急性白血病を発症するが、多くは発症しない。白血病への転換（leukaemic transformation）が起こるとき、それは一般に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）になる。ＭＤＳから発展するＡＭＬは典型的には、原発性ＡＭＬ（既往の骨髄疾患を有さない患者に生じる症例）よりも、処置することが困難である。
【０００３】
骨髄異形成症候群における骨髄は典型的には、正常よりも活発であり、しかしながら、循環中の血液細胞の数は減少されている。これは、骨髄において産生されている細胞の多くが、欠陥があり及び／又は、それらが骨髄を出発して血流に入る前に破壊されると考えられるからである。血液細胞の全ての種類の数の減少は、汎血球減少と呼ばれている。骨髄異形成症候群の他の共通する特徴は、骨髄及び血液細胞の様子における異常である。これらの異常（例えば正常顆粒を欠く白血球）が該状態に特徴的である。
【０００４】
骨髄異形成症候群は、活発な髄しかし不適切な血液細胞産生の異常な組み合わせの故に、処置することが困難である。潜在的に病気に効くと考えられる唯一の処置は、より若く且つより適当な患者におけるドナー幹細胞移植である。残念ながら、多くの患者は、年をとりすぎていてこれが選択肢とらない。
【０００５】
ＭＤＳと、再生不良性貧血のような免疫介在性の病因が提案されている他の髄不全症候群との間に、ある程度の重なりがある。例えば再生不良性貧血と髄が不活発であるＭＤＳのサブタイプとの間を区別することはときどき困難でありうる。
【０００６】
ＭＤＳは、いずれの齢でも診断されうるが、幼年時代はまれであり、そして若年成人では珍しい。診断時の年齢中央値は６５〜７５歳であり、患者の９０％超が診断のときに５０歳を超えている。
【０００７】
男性は、女性よりも、ＭＤＳを発症しそうである。これは典型的高齢患者集団においてもっとも著しい。若年患者に起こる症例は、男性及び女性の間に、より均一に分布されている。
【０００８】
症例の約２０％は、化学療法又は放射線療法のいずれかを、他の病気のための彼らの処置として受けた患者に生じる。これは、二次性又は治療関連（ｔ−ＭＤＳ）の処置関連ＭＤＳとして知られている。これは、比較的若い年齢でＭＤＳを発症する患者によりしばしばあてはまる。
【０００９】
２つの分類体系がある：ＦＡＢ及びＷＨＯ。１９８２年に、Ｆｒｅｎｃｈ−Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｂｒｉｔｉｓｈ共同研究グループがＭＤＳの分類に関するガイドラインを提案した。骨髄細胞系列における形態学的異形成及び骨髄芽球の数が、患者を５つの別個のサブクラスに分けた。２００１年に、ＦＡＢ分類は、ＭＤＳの世界保健機構（ＷＨＯ）分類において修正されそして最新のものとされた。この分類は、形態学に基づくだけでなく、ＭＤＳ実体を定義する為の臨床的、遺伝的、免疫表現型的及び生物学的な所見も含んだ。
【００１０】
現在用いられているとおり、ＦＡＢ体系において骨髄異形成症候群の５つのタイプがある。
【００１１】
これらは、不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、過剰な芽球を伴う不応性貧血、転換期の（in transformation）、過剰芽球を伴う不応性貧血及び慢性骨髄単球性白血病である。
【００１２】
不応性貧血（refractory anaemia：ＲＡ）
【００１３】
赤血球を産生する骨髄細胞が異常にみえる。白血球及び血小板を産生する細胞もまた異常にみえるが、原始細胞（芽球細胞）の割合は有意に増加しない。該疾患の臨床的特徴は貧血であり、これは通常は軽症から中等症であるが、重症になりうる；しばしば赤血球が正常よりも大きな平均サイズを有し、これは大赤血球症と呼ばれる。白血球及び／又は血小板の数は正常よりも低くありうる。
【００１４】
ＲＡは、症例の約３０〜４５％を占める。ＲＡの症例の約１０％は、急性白血病に転換するであろう。ＲＡを有する患者のいくつかは、５年又は１０年さえを超えて健康に生き抜くが、平均生存は２〜５年である。
【００１５】
環状鉄芽球を伴う不応性貧血（refractory anaemia with ring sideroblasts：ＲＡＲＳ）
【００１６】
ＲＡにおけるものと同じ変化がみられるが、赤血球集団における追加の異常がある。赤血球前駆体は、正常に鉄を利用することができず、そして代わりに鉄が赤血球前駆体中の特徴的環に堆積する。これらの細胞は、環状鉄芽球と呼ばれる。もし、骨髄中に１５％超の環状鉄芽球があるならば、該病気はＲＡＲＳとして分類される。貧血はやはり共通の臨床的問題である一方で、白血球及び／又は血小板の数もまた正常より低くありうる。全体的な生存はＲＡにおけるものと同じであるが、急性白血病への転換は、症例の約８％でより低い。ＭＤＳのこの形は、症例の約１５％を構成する。
【００１７】
過剰の芽球を伴う不応性貧血（refractory anaemia with excess blasts：ＲＡＥＢ）
【００１８】
この形では、骨髄中の前駆体血球細胞（芽球細胞と呼ばれる）における増加がある。正常骨髄は最大で約５％の芽球細胞を含む。
【００１９】
ＲＡＥＢを有する患者は、彼らの骨髄中に５〜２０％の芽球細胞を有する。この形を有する患者は、彼らの血液中に血小板及び／又は白血球並びに赤血球の減少された数をより有しそうである。この形は、症例の約１５％を占め、そして約１年の生存期間中央値を有する。
【００２０】
ＲＡＥＢを有する患者の約４０％が、急性白血病を発症することになるであろう。
【００２１】
以下のサブタイプが現在ＦＡＢスキームに含まれているが、世界保健機構により作られた血液及び骨髄のガンの新規提案された分類は、それらが他のカテゴリーに移されることを示唆した。
【００２２】
転換期の、過剰芽球を伴う不応性貧血（refractory anaemia with excess blasts in transformation：ＲＡＥＢ−ｔ）
【００２３】
これらの患者における所見は、ＲＡＥＢにおけるそれらと同様であるが、骨髄における芽球のより高い割合（２０〜３０％）を伴う。この形は、症例の約５〜１５％を占める。最近、これらの患者が今、急性骨髄性白血病を有すると分類されるべきであると提案された。ｏｖｅｒｔ白血病（骨髄中の３０％超の芽球）への転化の割合は高く（６０〜７５％）、そして、処置は、急性骨髄性白血病について用いられるものと同様である。
【００２４】
生存期間中央値は６ヶ月以下であるが、幹細胞移植を伴う又は伴わない化学療法が、いくつかの症例において延長された生存期間を作る。
【００２５】
慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）
【００２６】
ＣＭＭＬにおいて、赤血球前駆体は通常、異常に見える。ＣＭＭＬの決定的な特徴は、血液中の白血球（単球）の１種類の数が、１×１０９／リットル超に増加されることである。骨髄は、芽球細胞の増加した割合を含むことがあり又は含まないこともある。貧血及び／又は少ない血小板がありうる。
【００２７】
ＣＭＭＬは、骨髄が該疾患の他の形において見られるものと同様の特徴を示すので、骨髄異形成症候群の１つの形であると考えられるが、骨髄増殖性疾患として知られる関連疾病と同様の特徴も示す。新たなＷＨＯ分類は、ＣＭＭＬを、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患と呼ばれる別のカテゴリーに移す。
【００２８】
ＣＭＭＬは、骨髄異形成症候群の約１５％を占める。ＣＭＭＬの急性白血病への転換は、他の形の骨髄異形成症候群と同様の様式で起こる。生存期間中央値は、１２〜１８月のオーダーである。患者の１５〜３０％が、急性白血病に進行する。
【００２９】
大抵の患者は、彼らの疾患についての明白な原因を有さないが、いくつかのよく確立されたリスク因子がある。高水準の或る化学物質、特にはベンゼン、への曝露、及び高水準の電離放射線への曝露は、両方ともＭＤＳの推定原因と考えられる。ＭＤＳの増加した発生が、喫煙者及び元喫煙者において報告されており、タバコの煙中に存在する特定の化学物質と関連するであろう。
【００３０】
全ての患者がすぐに積極的治療を受けるわけではないであろう。なぜなら、多くの症例において、早期の処置が全体的な生存期間に影響することの証拠がないからである。処置を開始していない患者は、定期的な健診を受けるであろう。これはしばしば、経過観察（watch-and-wait）といわれる。
【００３１】
患者の過半について、処置の選択は、国際予後スコアリングシステム（ＩＰＳＳ）のリスクカテゴリー、彼らの年齢及び彼らの全身状態に基づくであろう。ＩＰＳＳは疾患ステージ、冒された細胞タイプの数及び細胞遺伝学（ＭＤＳにおいて通常見られる染色体変化）についての情報も含む。これらは全て、結果（予後）を予測すること及び最適な処置を選択することにおいて関連があると分かった。４つのリスクカテゴリーが、ＩＰＳＳ内で認められている。これらは、低リスク、中間−１及び中間−２リスク、並びに高リスクである。
【００３２】
成長因子は、体内で産生される天然物質であり、これは血液細胞の産生及び成熟を制御し、そして、処置において用いられうる。骨髄異形成症候群の処置において用いられる主な成長因子は、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、これは赤血球の産生を刺激する、及びＧ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦと呼ばれる因子、これは顆粒球（白血球）の産生を刺激する、である。残念ながら、エリトロポエチンは、ＭＤＳを有する患者の約１５〜２０％にだけ有益であると分かり、そして、これらは主に、輸血に依存しない不応性貧血を有する患者である。ＥＰＯとＧ−ＣＳＦの組み合わせにより処置されたＭＤＳ患者の約４０％が、彼らの貧血の改善を示すであろう。Ｇ−ＣＳＦ単独は、慣用の治療に応答しない重度の感染エピソードの間の短期間処置のために用いられうる。
【００３３】
実験的治療
【００３４】
ＭＤＳの処置におけるそれらの潜在的役割を決定する為の比較研究（臨床試験）において現在試験されているいくつかの処置アプローチがある。これらは、ＭＤＳ細胞が正常な成熟を受けることを誘発することを試みる、サイトカインと呼ばれる天然の生化学物質の使用を含む。
【００３５】
今まで研究されてきたサイトカインは、成長因子、インターロイキン及びインターフェロンを含む。サイトカインが生存期間を延長するであろうこと又は寛解を誘発するであろうことは予測されず、むしろそれらがＭＤＳ患者についての生活の質（quality of life）を改善するであろうこと及び輸血及び抗生物質処置のニーズを減少するであろうことが期待される。汎血球減少がＭＤＳにおける病的状態及び死亡率の主要な原因であるので（少数だけだＡＬＭへと転換するであろう）、血球減少を改善することは患者の健康状態を増加するであろう。
【００３６】
現在調査下にある他の有望な試薬は、低メチル化剤（hypomethylating agent）、サリドマイド及びその類似体レナリドマイドである。メチルトランスフェラーゼインヒビター（５−アザシチジン及び５−アザ−２'−デオキシシチジン）が現在、ＭＤＳを処置する為のＦＤＡ承認を有する唯一の薬剤である。
【００３７】
ＭＤＳの、免疫により媒介された病因
【００３８】
ＭＤＳにおけるＢＭ疾患の病因は複雑であり、そして、造血前駆細胞における内因性欠陥とこれらの前駆細胞が存在するＢＭミクロ環境との間の繊細な相互作用に関連すると考えられる（参考文献）。免疫機構が汎血球減少の病因において重要な役割を果たすことの増えている証拠がある。この証拠は、自己Ｔリンパ球がＭＤＳ前駆体増殖を抑制することのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験、及び、選択された患者におけるオリゴクローナルＴ細胞増殖の存在の報告から来ており、抗原により駆動される病態生理学を想起させる。ＢＭ疾患のプロセスにおける免疫機構の役割についての示唆は、低リスクＭＤＳ患者の最大で３０％が、免疫抑制剤、例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）及び／又は抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）など、に応答するとの観察から来る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３９】
多くの研究は、この免疫プロセスにおけるリンパ球の役割に焦点を当てた。本発明において、我々は、ＣＤ４０を発現する細胞、特には単球、が、免疫細胞関連骨髄疾患を患う患者のＢＭにおいて起こる免疫反応の一部であること、及び、これらのＣＤ４０を発現する細胞がリンパ球に呼応して作用することを示す。ＭＤＳ単球のＣＤ４０刺激が、有意に増加したＴＮＦα産生をもたらすことが示された。我々はさらに、共刺激性分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６）の単球発現が増加されることを示す。また、ＣＤ４０の天然リガンド、ＣＤ１５４が、Ｔヘルパー細胞により、有意により多く発現される。我々はさらに、これらの個体からの骨髄細胞の培養物中において、これらの共刺激性分子の１以上と特異的に相互作用する分子が、該結合性分子の無い比較培養物よりも多くの数の産生された子孫細胞を結果することを示す。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
１つの実施態様において、本発明は、造血前駆細胞、ＣＤ４０レセプターリガンドを発現する細胞、好ましくはリンパ球、及びＣＤ４０レセプターを発現する細胞、好ましくは単球 ／マクロファージ及び／又は樹状細胞を含む細胞のコレクションを培養する為の方法であって、該細胞又はその前駆体を、該ＣＤ４０レセプターリガンドを発現する細胞、好ましくはリンパ球又はＣＤ４０レセプターを発現する細胞、好ましくは単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞上に発現された共刺激性分子に特異的な結合性分子の存在下で培養することを含む上記方法を提供する。本発明はさらに、造血前駆細胞、ＣＤ４０レセプターリガンドを発現する細胞、好ましくはリンパ球、及びＣＤ４０レセプターを発現する細胞、好ましくは単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞、を含む培養物中における、分化した造血細胞の産生を刺激する為の方法であって、該細胞又はその前駆体を、該ＣＤ４０レセプターリガンドを発現する細胞、好ましくはリンパ球、及びＣＤ４０レセプターを発現する細胞、好ましくは単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞、上に発現される共刺激性分子に特異的な結合性分子の存在下で培養することを含む上記方法を提供する。そのような培養物は、そのような結合性分子の無い培養物よりも、より多くの分化した細胞を産生する。種々のタイプの培養物が用いられうる。培養は、典型的には、培養培地と一緒に該細胞をインキュベートすることを含む。該現象は、「標準の」培養物中において及びいわゆるフィーダー層上の培養物中において、いわゆる長期間骨髄培養において典型的に行われるように、検出されうる。該造血前駆細胞は、培養の開始の際に存在してよく、又は該培養物に導入されたより原始的な前駆細胞／幹細胞から産生されうる。本明細書において定義されるとき、（造血）幹細胞は、成体の造血系の少なくともいずれかの種類の造血細胞を生じさせる能力を有する細胞である。造血幹細胞又は造血前駆細胞は、血液系から得られる。他の種類の幹細胞、例えば胚性幹細胞など、は当該定義に含まれない。造血幹細胞は、赤血球、白血球及び血小板を含む、通常の血液成分を生じさせる。幹細胞は通常、骨髄中及び血液中に位置されており、そして、移植の為に回収されうる。造血幹細胞は、広範な自己再生能力を有する。該幹細胞は、より分化した前駆細胞のカスケードを介して、種々の段階で成熟最終細胞へ分化する。これらのより分化した前駆細胞は、より限定された自己再生能力を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】共刺激性分子ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の表面発現についてのＰＢ ＣＤ１４＋単球のフローサイトメトリー分析結果を示す図である。
【図２】ＣＤ４０Ｌの表面発現についてのＰＢ Ｔヘルパー細胞のフローサイトメトリー分析結果を示す図である。
【図３】精製された単球のＣＤ４０刺激は、ＭＤＳ患者において、有意により高い水準のＴＮＦ−αを誘発することを示すグラフである。
【図４】単球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ骨髄増殖を抑制し、そして、これは、ＣＤ４０レセプターをブロックすることにより克服されうることを示すグラフである。
【図５】マウス５Ｄ１２の軽鎖及び重鎖の可変領域並びに脱免疫化５Ｄ１２を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の方法は、単球又はリンパ球の少なくともいずれかが、免疫細胞介在性骨髄疾患（immune cell mediated bone marrow failure）を患う個体又は患うリスクがある個体から得られた場合に特に有用である。これらの個体からの該言及された細胞が活性化され、又は活性化された細胞のより多い画分を少なくとも含むこと、及び結果としてより原始的な前駆細胞からの分化した細胞の産生が減少されることが考えられる。これは少なくとも部分的に、これらの個体の血液中の分化した細胞の観察された減少を説明する。好ましい実施態様において、該単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞は、免疫細胞介在性骨髄疾患を患う個体又は当該骨髄疾患を患うリスクのある個体から得られる。
【００４３】
免疫細胞介在性骨髄疾患病の非限定的な例は例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及びその逆、宿主対移植片（ＨＶＧ）病（ＨＶＧＤ）である。好ましい実施態様において、該免疫細胞関連骨髄疾患病は、クローン性骨髄疾患である。そのようなクローン性疾患の好ましい例は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）、骨髄線維症又は大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）である。理論にとらわれることなく、該免疫介在性疾患は、前駆細胞及び分化した細胞のより活発な発生を結果すると考えられる。このより活発な発生が最終的に、選択及びすなわちクローン性を結果する。
【００４４】
本発明はさらに、個体における血球減少及び／又は骨髄疾患の処置の為の方法であって、該個体に、単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞又はリンパ球に発現される共刺激性分子に特異的な結合性分子を与えることを含む上記方法を提供する。さらに、個体における血球減少及び／又は骨髄疾患の処置の為の方法であって、該個体に、該個体中の免疫活性化を減少し及び／又は抑制する為の結合性分子を与えることを含む上記方法が提供される。語「血球減少」は、本明細書において、血液中を循環する、細胞の数の減少又は細胞の１種類の数の減少として定義される。いくつかの種類の血球減少がある；低い赤血球数：貧血；低い白血球数：白血球減少又は好中球減少（好中球は全ての白血球の少なくとも半分を構成するので、それらは白血球減少においてはほとんどいつも低い）；低い血小板数：血小板減少；低い赤血球、白血球及び血小板の数：汎血球減少。本発明は特に、骨髄細胞系列の血球減少の処置に適当である。
【００４５】
該細胞の共刺激性分子を介した単球／マクロファージ及びＴ細胞の刺激に関与する経路の抑制が、該言及された培養物中又は該循環中のより多くの分化した細胞を結果することが示された。該共刺激性分子のいずれか１つはすなわち、免疫細胞介在性骨髄疾患の処置における標的である。共刺激性分子の好ましい例は、Ｂ７抗原、ＣＤ４０レセプター及びＣＤ４０レセプターリガンド（ＣＤ１５４）である。しかしながら、いくつかの他の共刺激性分子、例えば腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーメンバー ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ及びＯＸ４０（ＣＤ１３４）など、も存在する（参考文献：Ｗａｔｔｓ ＴＨ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５（２３）２３−６８）。ＣＤ４０は、樹状細胞（ＤＣ）上にＢ７ファミリーリガンド並びにいくつかのＴＮＦファミリーリガンドを誘発するその能力の故に、Ｔ細胞共刺激にとっての支配的なスイッチとして機能しうる（参考文献１、１３〜１８、Ｗａｔｔｓ ＴＨから）。
【００４６】
特に好ましい実施態様において、該共刺激性分子は、単球／マクロファージ上のＣＤ４０レセプター又はリンパ球上、特にはＴ細胞上、のＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）である。好ましい実施態様において、該Ｔ細胞は、刺激性Ｔ細胞である。好ましくは、該刺激性Ｔ細胞はＴヘルパー細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【００４７】
該結合性分子は、該共刺激性分子に対する特異性を有する結合性分子の任意のタイプでありうる。好ましい実施態様において、該結合性分子は、タンパク質又はタンパク質性の結合性分子である。好ましくは、該結合性分子は、非抗体足場タンパク質バインダーのいずれかのファミリー、例えばアンチカリン（anticalin）、Ｃ型レクチンドメインバインダー、アビマー（avimer）、アドネクチン（Adnectin）、及びＤＡＲＰｉｎｓ（設計されたアンキリン繰り返しタンパク質：Designed Ankyrin Repeat Proteins）などであるがこれらに限定されない、に属する（参考文献Ｓｈｅｒｉｄａｎ Ｃ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００７，（２５），３６５−３６６）。
【００４８】
好ましくは、該結合性分子は、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変ドメイン又はその等価物を少なくとも含む。そのようなタンパク質の非限定的な例は、ＶＨＨ、ナノボディ（nanobody）、Ｈｕｍａｎ Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｄＡｂ）、Ｕｎｉｂｏｄｙ、Ｓｈａｒｋ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳｈＡｒｐ）、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（ＳＭＩＰ（商標）） Ｄｒｕｇ、モノボディ（monobody）及び／又はＩＭａｂ（参考文献Ｓｈｅｒｉｄａｎ Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００７，（２５）,３６５−３６６）である。抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン又はその等価物を少なくとも有する結合性分子が好ましい。そのような結合性分子の非限定的な例は、Ｆ（ａｂ）−断片及び単鎖Ｆｖ断片である。標的に特異的に結合する為に操作されうるＩＧフォールドを有する多くの様々なタンパク質が存在する。そのような操作されるタンパク質は、抗体の等価物と考えられる。好ましい実施態様において、該結合性分子は抗体を含む。該抗体は、天然の抗体又は合成の抗体でありうる。好ましい実施態様において、抗体は、抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３領域を含む。しかしながら、例えばファージディスプレーにより選択されうるようなＣＤＲ様領域の人工的生成も、本発明に含まれる。好ましい実施態様において、該抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又はヒト様抗体である。（それらの特異性は別として）免疫系とさらに相互作用しない結合性分子が特に好ましい。抗体の場合、該抗体が、ＩｇＧ４定常領域、又はＩｇＧ４様定常領域を含むことが好ましい。好ましくは、該定常領域はヒト定常領域である。例えば、ＩｇＧ１分子の定常領域を、それがその標的に結合するともはや補体系を活性化しないように変異させることが可能である。
【００４９】
該結合性分子は好ましくは、非刺激性及び／又は拮抗性の結合性分子である。そのような分子は、それらに対し特異的である共刺激性分子に結合し、そして、該共刺激性分子を通じてシグナル伝達（活性化）を防ぎ及び／又は抑制する。好ましい実施態様において、該結合性分子は、ＣＤ４０特異的抗体又はその等価物である。好ましくは、該抗体は、非刺激性ＣＤ４０特異的抗体である。最も好ましくは、該抗体は、マウス抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体５Ｄ１２、キメラ５Ｄ１２抗体又は脱免疫化（deimmunized）５Ｄ１２抗体である。マウス５Ｄ１２並びに脱免疫化５Ｄ１２の軽鎖及び重鎖の可変領域が、図５中に描かれている。他の実施態様において、該抗体は、完全ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体１５Ｂ８である（国際公開第２００２０２８９０４号パンフレット）。
【００５０】
他の実施態様において、該結合性分子は、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）特異的抗体又はその等価物である。好ましくは該抗体は、ＡＴＣＣアクセスナンバーＨＢ−１０９１６を有するモノクローナル抗体５ｃ８又はモノクローナル抗体ＩＤＥＣ１３１（Ｄｕｍｏｎｔ ＦＪ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ．２００２ Ｍａｙ；３（５）：７２５−３４）である。
【００５１】
本発明はさらに、造血前駆細胞、リンパ球（特にはＴ細胞）及び単球／マクロファージ／樹状細胞を含む培養物中で分化した造血細胞の産生を刺激する為に、共刺激性分子に特異的な結合性分子を使用する方法を提供する。さらに、免疫細胞介在性骨髄疾患の処置の為の医薬の調製の為に、共刺激性分子に特異的な結合性分子を使用する方法が提供される。さらに他の実施態様において、本発明は、造血前駆細胞、リンパ球（特にはＴ細胞）及び単球／マクロファージ／樹状細胞を含む培養物中において分化した造血細胞の産生を刺激する為に、共刺激性分子に特異的な結合性分子を使用する方法を提供する。
【００５２】
さらに、免疫細胞介在性骨髄疾患の処置の為の医薬の調製の為に、共刺激性分子に特異的な結合性分子を使用する方法が提供される。
【実施例１】
【００５３】
患者、材料及び方法
【００５４】
患者データ及び試料
【００５５】
全ての試料の予備調製（prelevation）及び取扱いは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｌｅｕｖｅｎの地方倫理委員会のガイドライン（これはヘルシンキ宣言に従う）に従い実施された。ＭＤＳを組織学的に証明された９５の異なる患者からの試料がこの研究のために用いられた。患者の特徴は、表１にまとめられている。試料は、インフォームドコンセントの後に、ルーチンの抹消血（ＰＢ）及びＢＭサンプリングで得られた。患者の大部分（９５の患者のうち７０）は、試料が収集されたときに、ＭＤＳについての治療を受けていなかった。細胞遺伝学的分析についてのデータが、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｌｅｕｖｅｎ及びＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｌａｂ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｏｒｄｅｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｒｕｓｓｅｌｓにより提供された。
【００５６】
加えて、ＰＢ試料が、６０の健康なボランティアから得られた。フローサイトメトリー研究において用いられたドナー（ｎ＝２９）は、ＭＤＳ患者と年齢が合った（平均年齢６８、範囲５９〜８２）。１１の健康な若いボランティア（平均年齢２１、範囲１９〜２４）のＢＭ吸引物もまた、対照試料として働く為に得られた。
【００５７】
血液学的な値が、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＥ−２１００自動Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒにより決定された。血清Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度が、日立Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｄ 自動アナライザーで、粒子により増大される免疫濁度測定方法（particle-enhanced immunoturbidimetric method）により（ＣＲＰＬＸ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、測定された。
【００５８】
フローサイトメトリー
【００５９】
ＰＢ及びＢＭ試料が、ＥＤＴＡナトリウムにより被覆されたチューブ中に集められ、そしてすぐに処理された。１０：１ＮＨ４Ｃｌバッファーによる溶解及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ、ベルギー）による洗浄の後、細胞が以下の蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）及びＰｅｒｉｄｉｎｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ（ＰｅｒＣＰ）により複合体化されたモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）：抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ４５（全てＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ、ベルギー、から）により免疫染色された。適切なアイソタイプマッチ陰性対照が、それぞれの試料について用いられた。細胞が、１０μｌのモノクローナル抗体と一緒に３０分間４℃で暗所においてインキュベートされ、その後、１回洗浄されそして４００μｌのＣｅｌｌＦＩＸ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に再懸濁された。試料は、ＦＡＣＳｃａｎ又はＦＡＣＳＣａｎｔｏ Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析された。単球の表現型を決定する為に、我々はＣＤ１４＋集団について、中間の（intermediate）側方散乱（ＳＳＣ）によりゲートし、そして、ＣＤ１４及びＣＤ４０、ＣＤ１４及びＣＤ８０、並びにＣＤ１４及びＣＤ８６について二重陽性である、この集団中の細胞のパーセンテージを数えた。同様に、我々は、ＣＤ４及びＣＤ３について二重陽性である低いＳＳＣを伴う該集団についてゲートして、ＣＤ４０Ｌを発現したこの集団のパーセンテージを決定した。
【００６０】
単球の分離及び刺激
【００６１】
ＰＢ単核細胞（ＰＢＭＮＣ）が、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ、オスロ、ノルウェー）のステップ勾配上で分離され、そして、１回、ＰＢＳ中で洗浄されそしてその後ＭＡＣＳバッファー中で洗浄された。ＣＤ１４＋細胞は、製造者の指示に従い、ＣＤ１４＋磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を用いてＭＡＣＳにより分離された。分離されたＣＤ１４＋細胞は、トリパンブルー排除を用いて数えられた。それらは次に、２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のウェル中の、ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ペーズリー、英国）並びに１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、ＢＣ、カナダ）を補われたＩｓｃｏｖｅの修正Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ペーズリー、英国）中に、ｍＬ当たりウェル当たり３×１０５細胞の密度で、プレートされた。３７℃で５％のＣＯ２を伴う、加湿されたインキュベーター中において１週の培養後、培地が、リポ多糖（ＬＰＳ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ドイツ）を１μｇ／ｍＬで補われた又は１０μｇ／ｍＬでのクローン６４（アゴニスト抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体、Ｐａｎｇｅｎｅｔｉｃｓ、オランダ）及び１０００ＩＵ／ｍＬの最終濃度でのインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ドイツ）との混合物を補われた新鮮培地により置き換えられた。２４時間後、上清が回収され、そしてさらなる分析まで−２０℃で貯蔵された。
【００６２】
コロニー形成アッセイ
【００６３】
生存細胞の計数に続き、ＢＭＭＮＣ（ＭＤＳ患者について５×１０５、対照について２．５×１０５）が、３０％ＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子、１０ｎｇ／ｍＬの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−３、及び３Ｕ／ｍＬのエリトロポエチンを含むＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｈ４４３４培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、ＢＣ、カナダ）中に調製された。それぞれの試料について、ｃｈ５Ｄ１２（アンタゴニストキメラ抗ヒトＣＤ４０抗体、ＰａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、オランダ）を有さないチューブ及びｃｈ５Ｄ１２を１０μｇ／ｍＬの最終濃度で有するチューブが調製され、そしてまったく同じウェル中にプレートされた。１４日のインキュベーションに続き、プレートは倒立顕微鏡を用いてスコア化された。細胞数及びコロニーの形態学に基づき、我々は、顆粒球−単球コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）、及びＢＦＵ−Ｅとしての、シングル又はクラスターの、赤芽球コロニー形成単位を、定めた。
【００６４】
酵素連結イムノソルベントアッセイ
【００６５】
ＴＮＦ−α（ＢＤ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が、製造者の推奨により、ＥＬＩＳＡによって検出された。ＥＬＩＳＡの感度限界は１．２５ｐｇ／ｍＬであった。
【００６６】
統計
【００６７】
全ての統計分析は、Ｐｒｉｓｍ３．０ソフトウェアを用いて実施された。我々は、２つの集団の間の平均値を比較する為に、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｕ検定を用いた。Ｗｉｌｃｏｘｏｎマッチドペアー検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｍａｔｃｈｅｄ ｐａｉｒｓ ｔｅｓｔ）が、ＴＮＦ−α産生の結果及びＢＭ培養物の結果を分析する為に用いられた。スピアマンの検定が、２つの変数の間の共分散を分析する為に用いられた。Ｐ値は、両側検定（double-sided test）を表す。Ｐ値＜０．０５は有意と考えられた。
【００６８】
結果
【００６９】
ＭＤＳについてのＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の増加した発現水準
【００７０】
単球
【００７１】
フローサイトメトリーを用いて、我々は６１のＭＤＳ患者のＰＢ中の循環する単球の表現型を分析した。ＦＡＢ分類に従い、３７の患者が不応性貧血（ＲＡ）と診断され、２０が環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）及び４が過剰な芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）と診断され；そしてＷＨＯ分類に従い、１の患者がＲＡと診断され、３０が多系列異形成を伴う不応性血球減少（ＲＣＭＤ）と診断され、１がＲＡＲＳと診断され、１９が他系列異形成及び環状鉄芽球を伴う不応性血球減少（ＲＣＭＤ−ＲＳ）と診断され、３が、５ｑ−症候群と診断され、３がＲＡＥＢ−１と診断され、１がＲＡＥＢ−２と診断され、及び３が分類されないＭＤＳ（ＭＤＳ−ｕ）と診断された。大部分（６１のうち４０）は、試料収集の前にＭＤＳについての処置を何ら受けなかった。ＭＤＳについての治療は、輸血（ｎ＝９）、成長因子（４のｒｈＥＰＯ、１のｒｈＧ−ＣＳＦ及び１のｒｈＥＰＯとｒｈＧ−ＣＳＦとの組み合わせ）、鉄キレート化治療単独（ｎ＝２）又はこれらの治療の組み合わせ（ｎ＝４）を含んだ。単球の表現型に対する年齢の何らかの影響を排除する為に、２９の年齢が合った対象のＰＢが、対照集団として働いた。我々は、単球を、ＣＤ１４を発現する中間のＳＳＣ特徴を有するそれら細胞として定めた。我々は、ＣＤ４０を共発現する単球のパーセンテージを計数するためにこの集団についてゲートした（図１Ｂを参照されたい）。ＣＤ４０Ｌを発現するＴ細胞により活性化すると、単球は、ＣＤ４０の発現を上方制御するが、Ｂ７分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現も上方制御する１８、１９。それ故に、我々は、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現水準も分析した。
【００７２】
循環する単球の絶対数は両方の集団において同程度であった。ＭＤＳ患者は、年齢が合った対照の対象と比較して、有意により多い循環するＣＤ４０＋（１０．２％±１．１ｖｓ．２．８％±０．３、ｐ＜０．０００１）、ＣＤ８０＋（３．８％±０．５ｖｓ．１．７％±０．２、ｐ＝０．００４）及びＣＤ８６＋（７４．１％±３．０ｖｓ．５６．９±４．３、ｐ＝０．００１）単球を有した。同じ観察が、２３の患者のＢＭにおいてなされた（データは示されていない）。我々は、ＣＤ４０＋及びＣＤ８０＋の単球のパーセンテージの間の非常に有意な相関を発見した（Ｓｐｅａｒｍａｎ ｒ＝０．５４、ｐ＜０．０００１）。これは、同じ患者において、両方の活性化マーカーが高い水準で発現されていることを示唆する。しかしながら、ＣＤ８６の発現は、ＣＤ４０又はＣＤ８０の発現水準のいずれとも有意に相関しなかった、これはおそらく、有意なＣＤ４０又はＣＤ８０の発現の不在下においてさえ、単球はすでに有意な水準のＣＤ８６を発現するからである。
【００７３】
ＭＤＳのＴヘルパー細胞上のＣＤ４０Ｌの増加した発現
【００７４】
我々は、患者及び正常対照の同じ集団におけるＴヘルパー細胞の表面のＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）の発現も評価した。Ｔヘルパー細胞は、低いＳＳＣ特徴を有するＣＤ３＋／ＣＤ４＋であると定められた。ＣＤ４０Ｌは、年齢が合った対照と比較して、ＭＤＳ患者からのＴヘルパー細胞上に有意により多く発現されることが分かった（４．２％±０．４ｖｓ．２．２％±０．２、ｐ＜０．０００１、図２を参照されたい）。これは、ＭＤＳ患者のＢＭ吸引物中に存在するＴヘルパー細胞についても見られた（５．０％±０．８ｖｓ．２．６％±０．５、ｐ＜０．０１）。
【００７５】
さらに、我々は、単球によるＣＤ４０の発現とＴヘルパー細胞によるＣＤ４０Ｌ発現との間の相関を発見した（Ｓｐｅａｒｍａｎ ｒ＝０．３２、ｐ＝０．０２）。これは単球及びリンパ球の活性化が同じ患者において起こることを示唆する。
【００７６】
ＣＤレセプターの活性化は、ＭＤＳにおけるより高いＴＮＦ−α産生を誘発する
【００７７】
我々は次に、ＭＤＳ患者からの又は健康対照ドナーからの単球がアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体又はＬＰＳにより刺激されたときに、ＴＮＦ−α産生が異なるかどうかを評価した。それ故に、我々は、２０のＭＤＳ患者及び２５の健康な対照のＰＢからのＣＤ１４＋細胞を分離した。ＦＡＢ分類に従い、これらのＭＤＳ患者は、ＲＡ（ｎ＝１２）、ＲＡＲＳ（ｎ＝６）、ＲＡＥＢ（ｎ＝２）として、並びに,ＷＨＯ分類に従いＲＣＭＤ（ｎ＝１０）、ＲＣＭＤ−ＲＳ（ｎ＝６）、ＲＡＥＢ−１（ｎ＝２）、５ｑ−症候群（ｎ＝１）及びＭＤＳ−ｕ（ｎ＝１）として診断された。成熟を誘発するための７日の培養後、ＣＤ１４＋細胞が、ＴＮＦ−α産生を誘発する為の２つの異なる刺激（ＬＰＳ又はアゴニスト抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂ（ｃｌｏｎｅ６４、ＰａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、オランダ２６）に２４時間付された。与えられた刺激に対する応答を最大化する為に、我々は高濃度のＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を用いた。同じ理由のために、我々は、ＩＦＮ−γがＣＤ４０レセプターの転写を誘発すると知られているので２７、該アゴニスト抗ＣＤ４０抗体をＩＦＮ−γ（最終濃度１０００ＩＵ／ｍＬ）と組み合わせた。
【００７８】
ＣＤ１４＋分離の平均純度は、対照について９７．１％（範囲９１．９〜９９．７％）であり、そしてＭＤＳ患者について９７．２％（範囲９５．０〜９８．９％）であった。刺激されていないＣＤ１４＋細胞のＴＮＦ−α水準は両方の集団において低かった（３±１ｐｇ／ｍＬ）。図３において示されるとおり、ＬＰＳは、患者（１２３±４４ｐｇ／ｍＬ）及び対照（１００±３２ｐｇ／ｍＬ）におけるＴＮＦ−αの同様の水準を誘発した。対照的に、ＩＦＮ−γと組み合わせられたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、正常対照と比較して、ＭＤＳ患者からのＣＤ１４＋単球による有意により高いＴＮＦ−α産生を誘発した（４４９±１３１ｖｓ．６７±２０ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝０．００９）。
【００７９】
単球によるＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現と臨床的特徴との間の相関
【００８０】
我々は、ＣＤ１４＋単球上及びＴヘルパーリンパ球上のそれぞれにおける、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの発現と、病気又は患者の特徴との間に相関があるかどうかを評価した。第一に、我々は、ＣＤ４０＋又はＣＤ８０＋単球のパーセンテージと血液学的値（ヘモグロビン水準、血小板、白血球及び好中球絶対数（ＡＮＣ））とを関係付けた。我々は、ＡＮＣと、循環するＣＤ８０＋単球のパーセンテージとの間の負の相関を観察した（ｒ＝−０．２６、ｐ＜０．０５）。同じ観察が、ＣＤ８０＋単球のパーセンテージがＢＭ採取のときでのＰＢ ＡＮＣと逆に相関するところの骨髄試料についてなされた（ｒ＝−０．５１、ｐ＜０．０５）。ＣＤ４０又はＣＤ８６の発現と血液学的パラメーターとの間に有意な相関は無かった。注目すべきは、健康なドナーにおいて、我々は、ＡＮＣとＣＤ８０＋単球のパーセンテージとの間の逆の相関も発見した（ｒ＝−０．４９、ｐ＜０．０１）。この種の分析は因果関係の実証を許すものでないが、これは、単球の活性化が、病気の状態に関係なく、より低いＡＮＣ値に関係しうることを示唆する。我々は、芽球パーセンテージと共刺激性分子の発現との間の相関を発見しなかった。我々はまた、単球上のＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６並びにＴヘルパー細胞上のＣＤ４０Ｌの発現とＣＲＰの血清濃度とを関連付けた。ＣＲＰ水準は概して低く、そして共刺激性分子の発現と独立していた。臨床的兆候又は自己免疫の病歴が５の患者において観察されたが、ＣＤ４０、ＣＤ８０又はＣＤ８６発現の水準と相関しなかった。
【００８１】
次に、我々は、単球上のＣＤ４０、ＣＤ８０又はＣＤ８６の発現が、ＦＡＢのサブタイプ、ＷＨＯのサブタイプ、ＩＰＳＳスコア、細胞遺伝学、性別又は以前の処置に従い、疾病状態に相関するかどうかを決定した。我々は、ＲＡ、ＲＡＲＳ及びＲＡＥＢの患者の間に差異を発見しなかった。興味深いことに、我々は、核型異常トリソミー８を有する患者が、循環するＣＤ４０＋単球の最も高い水準を有することを発見した。中間−１のＩＰＳＳスコアを有する患者は、低リスク患者よりも有意により多いＣＤ４０＋単球を有したが、これは、全てのトリソミー８の患者が中間−１リスクスコアを有したという事実に起因しえた。以前に処置を受けた患者と未処置の患者との間に、単球によるＣＤ４０又はＣＤ８０の発現に関して、差異は無かった。
【００８２】
最後に、我々は、ＣＤ４０を発現する単球のパーセンテージに基づき、対照集団において見られたＣＤ４０を発現する単球の最高の値をカットオフ値（６．４％）として用いて、患者を２つの集団に分けた：＜６．４％のＣＤ４０＋単球を有する患者の１集団、及び＞６．４％のＣＤ４０＋単球を有する患者の集団。高水準のＣＤ４０＋単球は、より高いＩＰＳＳスコア、中間の及び乏しい細胞遺伝学的リスクスコア、６０歳より低い年齢及びトリソミー８の存在に一致した（表２を参照されたい）。後者の２つの因子は、多変数分析において、免疫抑制的治療に対する応答の予測的な独立的因子であるとして同定された。注目すべきは、好ましい（favourable）核型異常を有する患者（ｄｅｌ（５ｑ）を有する３の患者、ｄｅｌ（２０ｑ）を有する２の患者、及びＹを有する２の男性）は、それらの循環する単球上にＣＤ４０の低い発現を有した。
【００８３】
単球上のＣＤ４０レセプターを拮抗することは、ＭＤＳにおいて増加したコロニー形成をもたらす。
【００８４】
我々は、ＣＤ４０レセプターが単球上で上方制御されること及びこのレセプターの活性化が増加したＴＮＦ−α産生をもたらすことを実証したので、我々は、ＣＤ４０シグナル伝達の干渉がｉｎ ｖｉｔｒｏでの造血前駆体増殖に影響しうるとの仮説を立てた。この仮説を試験する為に、我々は、ＣＤ４０シグナル伝達を抑制する為に、アンタゴニスト抗ＣＤ４０ｍＡｂ（ｃｈ５Ｄ１２、ＰａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、オランダ）を用いた２２。ｃｈ５Ｄ１２はキメラ抗体であり、ヒト抗体の定常領域に連結された、図５の抗体５Ｄ１２ｍの可変領域（Ｖｈ及びＶｌの両方）を有する。
【００８５】
我々は、ｃｈ５Ｄ１２の存在下又は不在下において２６の患者のＢＭＭＮＣをプレートした。患者は、ＦＡＢに従いＲＡ（ｎ＝１７）、ＲＡＲＳ（ｎ＝４）及びＲＡＥＢ（ｎ＝５）として診断され、そしてＷＨＯに従いＲＣＭＤ（ｎ＝１４）、５ｑ−（ｎ＝２）、ＭＤＳ−ｕ（ｎ＝１）、ＲＣＭＤ−ＲＳ（ｎ＝４）、ＲＡＥＢ−１（ｎ＝２）及びＲＡＥＢ−２（ｎ＝３）として診断された。有意により多いＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−Ｅが、ｃｈ５Ｄ１２の無い培養物と比較して、ｃｈ５Ｄ１２の存在下において増えた（図４Ａを参照されたい）。この効果が単球依存的であることを証明する為に、我々はまた、ＭＡＣＳカラムによりＣＤ１４陽性細胞を枯渇したＢＭＭＮＣの培養物にｃｈ５Ｄ１２を添加した。ｃｈ５Ｄ１２の存在は、ＣＤ１４を枯渇したＢＭＭＮＣのコロニー形成を変化させなかったが、ｃｈ５Ｄ１２は、全てのＢＭＭＮＣの存在下における同じ試料においてコロニー産生を増加した（図４Ｂを参照されたい）。我々は、健康な対照（ｎ＝９）のＢＭＭＮＣ培養物におけるＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−Ｅコロニー数に対するｃｈ５Ｄ１２のこの効果を観察しなかった。
【００８６】
ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用が造血前駆体に影響しうることをさらに実証する為に、我々は、ＢＭＭＮＣ内のＣＤ４０Ｌ＋Ｔヘルパー細胞又はＣＤ４０＋単球の数の間に相関が存在するかどうかを試験した。我々は、その特定の患者集団において、ＢＦＵ−Ｅの数とＣＤ４０Ｌ＋Ｔヘルパー細胞のパーセンテージとの間の逆の相関を実証した（ｒ＝−０．５４、ｐ＝０．０３）。ＣＦＵ−ＧＭのより低い数についての、ＣＤ４０＋単球のパーセンテージを増加することを伴う傾向もあったが、これは有意でなかった（ｒ＝−０．４２、ｐ＝０．０７）。
【００８７】
考察
【００８８】
血球減少は、ＭＤＳを有する大抵の患者の主症状であり、そして、病的状態及び死亡率の主要な原因である。異常クローン性前駆細胞の存在は、骨髄疾患の発症において重要な役割を果たし、そして免疫増強機構がこのプロセスにさまざまな程度で寄与する。最も前の研究は、このプロセスにおけるリンパ球の役割に焦点を当てた。自己のＴ細胞は、ＭＤＳにおける前駆細胞の増殖を抑制し２、３、そしてこの効果はＡＴＧによる成功裏の処置後に消えうる２。免疫により媒介された造血抑制の役割は、トリソミー８のＭＤＳにおいて最も広く明確にされた。ＭＤＳ患者の一般集団について示されたものと一致して４，６，７、Ｓｌｏａｎｄ及び同僚は、Ｔ細胞の拡大したクローン性集団が、トリソミー８を有する全ての患者において見られ得ることを実証した５。加えて、彼らは、これらの患者における自己Ｔ細胞の抑制作用が、この特定のクローン型を有するＣＤ８＋細胞に限定されることを示した。
【００８９】
これらの洞察にもかかわらず、免疫により媒介される機構が、ＭＤＳにおいて見られる汎血球減少にどのように寄与するのか、いまだ知られていない。免疫抑制的治療に応答するトリソミー８患者において、余分な染色体８を有する前駆細胞の数は増加し５、これは、これらの患者における該Ｔリンパ球の拡大したクローン性集団が、遺伝的に異常な造血前駆体の増殖を制御することを示唆する。該悪性クローンに特異的に方向付けられると分かるこの免疫応答に関連する骨髄疾患は、それ故に、残存する正常造血細胞に対するバイスタンダー効果（bystander effect）から来るべきである。どの因子がこのバイスタンダー現象を引き起こすかは知られておらず、そしていくつかの機構が、Ｔ細胞による正常前駆細胞のこの抑制について示唆されてきた５：活性化Ｔ細胞によるサイトカインの放出２８又は分子模倣又はエピトープスプレッディングを通じた標的の交差認識２９。
【００９０】
この研究の目的は、免疫により媒介されるこのプロセスにおける単球の可能な役割を調査することであった。単球は、ＴＮＦ−αの主な源である。活性化Ｔ細胞は、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を介して、単球によるＴＮＦ−α産生を誘発することができる。ＣＤ４０レセプターは、ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの一員である、４５〜５０ｋＤａのＩ型リンタンパク質である。単球は低水準のＣＤ４０を発現し３０、しかし活性化するとＣＤ４０遺伝子の発現は誘発され、これはＩＦＮ−γによる刺激によって最も明白である２７ことが実証された。ＴＮＦ−αの産生に加えて、ＣＤ４０ライゲーションもまた、他の炎症促進性サイトカイン及びケモカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びマクロファージ炎症性タンパク質１ａなど、の分泌を結果する１８、１９。加えて、Ｔヘルパー細胞上に存在する、ＣＤ４０ＬによるＣＤ４０のライゲーションは、共刺激性分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ分子）及びＦａｓＬの上方制御を促進する。ＣＤ４０Ｌは、活性化Ｔヘルパー細胞上に一過性に発現され、そして、いくつかの自己免疫状態においてＰＢのＴヘルパー細胞上に存在すると示された。ＭＤＳにおけるリンパ球は、活性化した表現型を有すると分かっているので７、３１、この経路は、ＭＤＳ患者のＢＭにおける単球の活性化に、ＴＮＦ−αの産生に、及び続く造血抑制に関与しうる。
【００９１】
本発明において、我々は、ＭＤＳ関連の骨髄の病因におけるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の役割を実証する。第１に、我々は、６１の主に低リスク未処置患者の大きな集団において、有意により多いＰＢ ＣＤ１４＋単球が、ＣＤ４０及びＣＤ８０を発現することを示した。加えて、有意により多いＰＢ Ｔヘルパー細胞が、ＭＤＳ患者においてＣＤ４０を発現し、そしてＴリンパ球上のＣＤ４０Ｌの発現は、ＣＤ１４＋単球のＣＤ４０発現と非常に相関した。ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの過剰発現もまた、ＢＭ試料において観察され、ここでリンパ球及び単球はそれらの機能を発揮すると考えられる。
【００９２】
ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの発現水準の測定に加えて、我々は、ＴＮＦ−α産生並びに造血前駆体の増殖及び分化に対するこの経路の刺激及び抑制のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果も分析した。アゴニスト抗ＣＤ４０ｍＡｂを用いたＭＤＳ単球上のＣＤ４０のライゲーションは、対照と比較して、増加したＴＮＦ−α産生を結果した。我々の知る限り、これはＴＮＦ−α産生に関するＭＤＳ単球の異なる挙動を実証する最初の報告である。我々のシリーズにおいて（in our series）、ＴＮＦ−α産生は、ＬＰＳにより刺激されたＭＤＳと正常単球との間で同様であり、これは他による以前の報告と一致する１７。ＭＤＳ単球上のＣＤ４０レセプターの増加した表面発現は、この異なる挙動を説明しうるが、異なる下流経路の活性化も関与しうるが３０、これはまだ調査されていない。
【００９３】
加えて、我々は、コロニー形成アッセイにおいてこの経路を抑制することの効果を、モノクローナル抗体ｃｈ５Ｄ１２（これは、炎症性腸疾患２２及び自己免疫脳脊髄炎の非ヒト霊長類モデル２４の治療において有効であると示されているアンタゴニストキメラ抗ヒトＣＤ４０抗体である）を用いて分析した。ｃｈ５Ｄ１２の存在下において、ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＭの数は、ＭＤＳのＢＭＭＮＣの培養物において有意に増加したが、コロニー形成アッセイを開始する前にＣＤ１４＋単球の枯渇は続かなかった。これは、造血に対する単球の抑制的効果が、ｃｈ５Ｄ１２を用いて、これら単球上のＣＤ４０レセプターを拮抗することにより克服されうることを証明する。ＢＦＵ−Ｅの数がＣＤ４０Ｌ＋Ｔヘルパー細胞のパーセンテージに逆相関することの観察と一緒に、これは造血に対するリンパ球の抑制的効果が、単球からの追加のサイトカイン放出に部分的に起因しうることを示唆する。しかしながら、サイトカインがこれに関係するかどうかはいまだ明らかでない。我々のＢＭ培養物中のＴＮＦ−α濃度は非常に低いので、我々は、ｃｈ５Ｄ１２の存在下におけるＴＮＦ−α水準の下方制御を観察することができなかった（データは示されていない）。
【００９４】
まとめると、これらの観察は、治療的及び診断的価値の両方を有する。第一に、我々は、ＭＤＳ単球によるＣＤ４０の発現が、ＢＭの内部で進行している免疫攻撃についてのマーカーとして働くことを示した。循環する単球上のＣＤ４０発現は、重度の敗血症を有する患者において増加されるが３２、全身的な炎症性応答は、我々の結果に関与しないようである。ＣＲＰ水準は低かった、そして、ＣＤ１４＋細胞上のＣＤ４０の発現と相関しなかった。加えて、最近の感染病歴を有する患者は、この研究から排除された。骨髄における免疫学的活性のマーカーとしてのＣＤ４０の使用はさらに、６０歳より低い年齢及びトリソミー８が、高いＣＤ４０発現と一致するとの観察により支持される。両方の因子が、ＭＤＳにおける免疫抑制的治療に対する応答についての最も強力な予測因子として同定されており１４、３３、そしてそれ故に、免疫機構は、これらの患者において特に重要な役割を果たす。
【００９５】
単球上のＣＤ４０シグナル伝達の抑制は、増加したＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＭ形成を結果する。さらに、ＣＦＵ−ＧＭの数は、統計学的な有意に達さなかったけれども、ＣＤ４０＋ ＣＤ１４＋の細胞のパーセンテージと逆相関した。加えて、共刺激性分子を共発現するＣＤ１４＋単球の増加したパーセンテージは、減少したＡＮＣと一致し、６１の血液試料において観察された。さらに、この観察は、異なる患者から得られた、２３のＢＭ試料において独立になされた。最後の観察もまた、年齢が合った対照からのＰＢにおいてなされており、それ故に、それはＭＤＳに特異的でないが、全ての免疫細胞介在性骨髄疾患における一般的な現象であることを示唆する。
【００９６】
以前の研究は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＭＤＳ患者において活性化した表現型を有することを実証した７、３１。ここに、我々は、ＣＤ４＋Ｔ細胞もまた、患者において活性化されることを示し、そして、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を通じたＭＤＳ病因におけるそれらの関与を実証する。これはさらに、Ｔヘルパー細胞によるＣＤ４０Ｌ発現が、単球によるＣＤ４０発現と一致したとの観察により支持される。さらに、ＭＤＳ ＢＭＭＮＣ培養物中のＢＦＵ−Ｅの数が、Ｔヘルパー細胞によるＣＤ４０Ｌ発現の増加に伴い有意に減少された。循環するＣＤ４０Ｌ発現性Ｔヘルパー細胞の高いパーセンテージは興味深い。それは、ＣＤ４０Ｌ発現が、ＭＤＳにおいて増加されるか又は安定化されること示す。増加したＣＤ４０Ｌ発現は、抑制性ＣＤ８クローン型の誘発において、抗原提示細胞を通じて関与しうるが、これもさらなる調査を請け負う。
【００９７】
それらの診断的価値とは別に、我々の観察は、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を拮抗することが、ＭＤＳ関連血球減少を処置する為に用いられうるので、治療的適切さも有する。ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体は現在、種々の血液学的疾患、例えば多発性骨髄腫３４、３５及び非ホジキンリンパ腫３６など、における使用について調査中である。これらの抗体の作用の様式は、抗体依存性の細胞媒介性細胞毒性に依存し３７及び悪性細胞に対する直接的アポトーシス効果よる３４。他の悪性腫瘍において、アゴニスト抗ＣＤ４０ Ｍａｂを有する単球の活性化は、腫瘍増殖を抑制することが示されている３８。しかしながら、ＭＤＳにおいて、治療的価値は、免疫応答を漸減させることにあり及び、従って血球数を改善する為に正常前駆体に対する巻き添え被害を限定することにある。この理由の故に、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路の刺激よりもむしろ抑制が治療的に、ＭＤＳにおいて適切である。本明細書において記載されたアゴニスト抗ＣＤ４０ ｃｈ５Ｄ１２は、ＭＤＳを含むヒト病理におけるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌの抑制を標的とするための適切な選択肢である。
【００９８】
表
【００９９】
【表１】
ＭＤＳ、骨髄異形成症候群；ＦＡＢ、Ｆｒｅｎｃｈ−Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｂｒｉｔｉｓｈ；ＲＡ、不応性貧血；ＲＡＲＳ、環状鉄芽球を伴う不応性貧血；ＲＡＥＢ：過剰な芽球を伴う不応性貧血；ＷＨＯ：世界保健機構；ＲＣＭＤ、多系列異形成を伴う不応性血球減少；ＲＣＭＤ−ＲＳ、多系列異形成及び環状鉄芽球を伴う不応性血球減少；ＭＤＳ−ｕ、分類されないＭＤＳ；ＩＰＳＳ、国際予後スコアリングシステム
１利用できない
【０１００】
【表２】
患者は、対照集団における最高の測定値をカットオフポイントとして用いて（６．４％）、「高い」又は「低い」集団にグループ分けされた。Ｂ／表は、（ａ）両方の集団における平均を比較する為のＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｕ検定の結果（数は平均±ＳＥＭとして表される）、及び、（ｂ）カテゴリ変数についてのＸ２検定の結果をまとめる。
１６１の患者のうち４９から、細胞遺伝学的データが、ＩＰＳＳスコアを決定する為に利用可能であった。２ＩＰＳＳは、核型異常を定義する−Ｙ、ｄｅｌ（２０ｑ）及びｄｅｌ（５ｑ）は、好ましいとして；トリソミー８、シングルの種々の異常及びダブルの種々の異常は、中間として；及び３以上の異常及び何らかの７番染色体の異常は、乏しいとして。
３ＭＤＳ処置は、成長因子（４のｒｈＥＰＯ、１のｒｈＧ−ＣＳＦ、１のｒｈＥＰＯ及びｒｈＧ−ＣＳＦの組み合わせ）、輸血（ｎ＝９）、鉄キレート治療（ｎ＝２）、又は組み合わせ（ｎ＝４）を含んだ。
４自己免疫疾患は、血管炎（ｎ＝１）、関節リウマチ（ｎ＝１）、自己免疫性溶血性貧血（ｎ＝１）、ＩＴＰと一緒の関節リウマチ（ｎ＝１）、炎症性腸疾患（ｎ＝１）を含んだ。
【０１０１】
図面の説明
【０１０２】
図１．共刺激性分子ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の表面発現についてのＰＢ ＣＤ１４＋単球のフローサイトメトリー分析
全てのＰＢ細胞が溶解され、洗浄され、そして次にＰＥ−又はＦＩＴＣ−複合体化マウス抗ヒト抗ＣＤ１４、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ８０及び抗ＣＤ８６のｍＡｂにより二重染色された。（Ａ）象限の設定の代表的ドットプロット。細胞は、適切なアイソタイプ対照抗体により染色され、そして分析は単球ゲートにおいて実施された。（Ｂ−Ｃ）ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６を発現した単球のパーセンテージの決定の代表的ドットプロット。分析は、中間のＳＳＣを有するＣＤ１４＋細胞について実施された。（Ｂ）は、共刺激性分子の低水準の発現を有する、ｄｅｌ（２０）（ｑ１２）を伴うＲＡＲＳ／ＲＣＭＤ−ＲＳを有する５７歳女性患者の結果を表す；（Ｃ）は、共刺激性分子の高い発現を有する、ＲＡ／ＲＣＭＤ及び正常な細胞遺伝学を有する７８歳女性患者の結果を表す；（Ｄ）６１の患者のＰＢ試料と２９の年齢が合った対照のＰＢ試料の結果。ＦＡＢに従う患者分布：ＲＡ（ｎ＝３７）、ＲＡＲＳ（ｎ＝２０）、ＲＡＥＢ（ｎ＝４）；ＷＨＯに従い、ＲＡ（ｎ＝１）、ＲＣＭＤ（ｎ＝３０）、ＲＣＭＤ−ＲＳ（ｎ＝１９）、ＲＡＲＳ（ｎ＝１）、５ｑ−（ｎ＝３）、ＲＡＥＢ−１（ｎ＝３）、ＲＡＥＢ−２（ｎ＝１）、ＭＤＳ−ｕ（ｎ＝３）。プロットは、対照及び患者の平均を比較する為の、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｕ検定の結果を示す。Ｐ値はそれぞれ、＜０．０００１***、０．００４**及び０．００１**であった。
【０１０３】
図２．ＣＤ４０Ｌの表面発現についてのＰＢ Ｔヘルパー細胞のフローサイトメトリー分析
ＰＢが溶解され、洗浄されそして次にＣＤ４０Ｌ−ＰＥ、ＣＤ３−ＦＩＴＣ及びＣＤ４−ＰｅｒＣｐにより三重染色された。Ｔヘルパー細胞は、低いＳＳＣ特徴を有するＣＤ３＋／ＣＤ４＋二重陽性細胞として定義された。（Ａ）活性化Ｔヘルパー細胞の増加した割合を有する患者を表す代表的ドットプロット。象限は、適切なアイソタイプ対照抗体に基づき決定された。（Ｂ）総計で、２９の年齢が合った対照及び６０の患者が、ＣＤ４０Ｌ＋Ｔヘルパー細胞の平均パーセンテージについての比較について利用可能であった（ｐ＜０．０００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｕ検定）。
【０１０４】
図３．精製された単球のＣＤ４０刺激は、ＭＤＳ患者において、有意により高い水準のＴＮＦ−αを誘発する。
ＣＤ１４＋細胞が、２５の健康な対照及びＭＤＳを有する２０の患者のＰＢから分離された。７日の培養後、これらの細胞は、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）又はクローン６４（１０μｇ／ｍＬ、活性化する抗ＣＤ４０ ｍＡｂ）及びＩＦＮ−γ（１０００ＩＵ／ｍＬ）により刺激された。上清が２４時間後に集められ、そしてＴＮＦ−α濃度がＥＬＩＳＡにより測定された。Ｐ値は、ウィルコクソン符号順位和検定（Wilcoxon matched pairs test）の結果を表す。
【０１０５】
図４．単球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ骨髄増殖を抑制し、そして、これは、ＣＤ４０レセプターをブロックすることにより克服されうる。
ＢＭＭＮＣが、標準的条件下又はｃｈ５Ｄ１２（アンタゴニストキメラ抗ＣＤ４０ ｍＡｂ）の存在下において、成長因子を補われたメチルセルロース（Ｍ４４３４、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖された。１４日後、ＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−Ｅがスコア化された。結果は、２５０×１０３のプレートされたＢＭＭＮＣごとのコロニー数として示される。（Ａ）２６の患者のＢＭＭＮＣが、ｃｈ５Ｄ１２の存在下／不在下におけるＭ４４３４中で培養された。患者は、ＦＡＢに従い、ＲＡ（ｎ＝１７）、ＲＡＲＳ（ｎ＝４）、ＲＡＥＢ（ｎ＝５）と診断され、そしてＷＨＯに従い、ＲＣＭＤ（ｎ＝１４）、５ｑ−（ｎ＝２）、ＭＤＳ−ｕ（ｎ＝１）、ＲＣＭＤ−ＲＳ（ｎ＝４）、ＲＡＥＢ−１（ｎ＝２）及びＲＡＥＢ−２（ｎ＝３）と診断された。ｃｈ５Ｄ１２の存在は、コロニー形成を有意に増加した。ｐ値は、ウィルコクソン符号順位和検定の結果を表し、そして、夫々、０．０００７***、０．００５**、及び０．０２*であった。（Ｂ）１０の患者の、ＢＭＭＮＣ及びＣＤ１４＋細胞を枯渇したＢＭＭＮＣが、ｃｈ５Ｄ１２の存在下／不在下において培養された。コロニーの合計数における有意な増加（ｐ＜０．０５*）は、ＣＤ１４を枯渇した条件下では観察されなかった。
【０１０６】
図５．５Ｄ１２ｍ：マウス抗ヒトＣＤ４０レセプター抗体。５Ｄ１２ｄｉ：５Ｄ１２ｍの重鎖及び軽鎖の変異体。Ｖｈ＝可変重鎖、Ｖｌ＝可変軽鎖。ＦＲ１〜４（フレームワーク１〜４）；Ｃｈｏｔｈｉａ；ＣＤＲ領域のＫＡＢＡＴ位置。
【０１０７】
参考文献
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血前駆細胞、リンパ球（好ましくはＴ細胞）及び単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞を含む細胞のコレクションを培養する為の方法であって、該細胞又はその前駆体を、該単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞又は該リンパ球（好ましくはＴ細胞）上に発現される共刺激性分子に特異的な結合性分子の存在下において培養することを含む上記方法。
【請求項２】
造血前駆細胞、リンパ球（好ましくはＴ細胞）及び単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞を含む培養物中で、分化した造血細胞の産生を刺激する為の方法であって、該細胞又はその前駆体を、該単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞又は該リンパ球（好ましくはＴ細胞）上に発現される共刺激性分子に特異的な結合性分子の存在下において培養することを含む上記方法。
【請求項３】
該単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞が、免疫細胞介在性骨髄疾患を患う個体又は患うリスクのある個体から得られたものである、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該免疫細胞介在性骨髄疾患が、クローン性骨髄疾患を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該クローン性骨髄疾患が、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）、骨髄線維症又は大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）である、請求項３又は請求項４に記載の方法。
【請求項６】
個体における血球減少及び／又は骨髄疾患の処置の為の方法であって、該個体に、単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞又はリンパ球（好ましくはＴ細胞）上に発現される共刺激性分子に特異的な結合性分子を与えることを含む上記方法。
【請求項７】
個体における血球減少及び／又は骨髄疾患の処置の為の方法であって、該個体に、該個体中における免疫細胞活性化を減少し及び／又は抑制する為の結合性分子を与えることを含む上記方法。
【請求項８】
該共刺激性分子が、ＣＤ４０又はＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該リンパ球が、Ｔ細胞、好ましくは刺激性Ｔ細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該結合性分子が抗体を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体又はヒト様抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該結合性分子が、非刺激性の及び／又は拮抗性の結合性分子である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該結合性分子がＣＤ４０特異的抗体を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
該抗体が非刺激性のＣＤ４０特異的抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該造血前駆細胞が骨髄系列のものである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
該造血前駆細胞が、分化した顆粒球及び／又は単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞を産生する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
造血前駆細胞、リンパ球（特にはＴ細胞）及び単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞を含む培養物中において、分化した造血細胞の産生を刺激する為に、共刺激性分子に特異的な結合性分子を使用する方法。
【請求項１８】
免疫細胞介在性骨髄疾患の処置の為の医薬の調製の為に、共刺激性分子に特異的な結合性分子を使用する方法。
【請求項１】
造血前駆細胞、リンパ球（好ましくはＴ細胞）及び単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞を含む細胞のコレクションを培養する為の方法であって、該細胞又はその前駆体を、該単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞又は該リンパ球（好ましくはＴ細胞）上に発現される共刺激性分子に特異的な結合性分子の存在下において培養することを含む上記方法。
【請求項２】
造血前駆細胞、リンパ球（好ましくはＴ細胞）及び単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞を含む培養物中で、分化した造血細胞の産生を刺激する為の方法であって、該細胞又はその前駆体を、該単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞又は該リンパ球（好ましくはＴ細胞）上に発現される共刺激性分子に特異的な結合性分子の存在下において培養することを含む上記方法。
【請求項３】
該単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞が、免疫細胞介在性骨髄疾患を患う個体又は患うリスクのある個体から得られたものである、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該免疫細胞介在性骨髄疾患が、クローン性骨髄疾患を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該クローン性骨髄疾患が、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）、骨髄線維症又は大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）である、請求項３又は請求項４に記載の方法。
【請求項６】
個体における血球減少及び／又は骨髄疾患の処置の為の方法であって、該個体に、単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞又はリンパ球（好ましくはＴ細胞）上に発現される共刺激性分子に特異的な結合性分子を与えることを含む上記方法。
【請求項７】
個体における血球減少及び／又は骨髄疾患の処置の為の方法であって、該個体に、該個体中における免疫細胞活性化を減少し及び／又は抑制する為の結合性分子を与えることを含む上記方法。
【請求項８】
該共刺激性分子が、ＣＤ４０又はＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該リンパ球が、Ｔ細胞、好ましくは刺激性Ｔ細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該結合性分子が抗体を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体又はヒト様抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該結合性分子が、非刺激性の及び／又は拮抗性の結合性分子である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該結合性分子がＣＤ４０特異的抗体を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
該抗体が非刺激性のＣＤ４０特異的抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該造血前駆細胞が骨髄系列のものである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
該造血前駆細胞が、分化した顆粒球及び／又は単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞を産生する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
造血前駆細胞、リンパ球（特にはＴ細胞）及び単球／マクロファージ及び／又は樹状細胞を含む培養物中において、分化した造血細胞の産生を刺激する為に、共刺激性分子に特異的な結合性分子を使用する方法。
【請求項１８】
免疫細胞介在性骨髄疾患の処置の為の医薬の調製の為に、共刺激性分子に特異的な結合性分子を使用する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５２６５５４（Ｐ２０１０−５２６５５４Ａ）
【公表日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０８３２２（Ｐ２０１０−５０８３２２）
【出願日】平成１９年５月１６日（２００７．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０５０２２８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４０２９６
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（５０７００６２９３）パンジェネティクス ビー．ブイ． (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１６日（２００７．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０５０２２８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４０２９６
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（５０７００６２９３）パンジェネティクス ビー．ブイ． (2)
【Ｆターム（参考）】
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