遺伝子発現プロフィールを使用する非小細胞肺癌の診断および処置のための方法および組成物
本発明は、正常肺および患部肺からの組織における遺伝子発現を試験することにより、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に関係した遺伝子発現の変化を同定および定量する。本発明はまた、有用な診断マーカー、ならびに疾患状態、疾患進行、薬剤毒性、薬剤有効性および薬剤代謝をモニターするために有用なマーカーとして働く、発現プロフィールを同定および定量する。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮特許出願第６０／３６８，２８８号（２００２年３月２８日出願）、および第６０／３６８，４０９号（２００２年３月２８日出願）の優先権を主張し、前記出願の開示は、特にその全体が本明細書に記載されているものとされる。
【０００２】
本発明は、研究基金番号ＮＩＨ ＣＡ８５１４７および８１１２６によりなされており、前記基金は本発明に対する特定の権利を所有することができる。
背景技術
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は気管支原性癌の最も一般的な型である。より大きな効力を有する化学療法措置が開発され続けているが、最良の措置でも現在のところ、３０−５０％のみの全退行率しか与えない。この応答の欠如は、初めから存在する抵抗性、または処置に応答して顕出した抵抗性のためである。化学抵抗性の機構には、多数の遺伝子産物が関与するらしいと信じられている。腫瘍発生および増殖に関与する、特定の遺伝子の役割を明確にすること、および癌の診断、予防、モニタリングおよび処置のために、標的として働くことができる遺伝子および遺伝子産物を同定し、および定量することが重要である。
【０００３】
特定の例において、最初は有効である治療剤が、時間とともに患者に対し無効になったり、有効性が低くなる。同一の治療剤が、異なった患者に対しては、より長い期間有効であり続けることがある。さらに、前記治療剤は、さらに他の患者には、無効かまたは有害であることもある。それ故、癌および既定の治療剤に関してマーカーとして働くことができる遺伝子および／または遺伝子産物を同定することは、有益となるであろう。処置において、そのような予測および訂正が行える能力によって、患者の処置過程の早期段階で、治療措置についてより正確に決定することが可能になる。
【０００４】
現在、シスプラチンおよびカルボプラチンが、中でも最も広く使用される細胞毒性抗癌薬である。しかしながら、初めからのまたは誘導された機構を通したこれらの薬剤に対する耐性が、これらの治療可能性を害している。Ｐｅｒｅｚ，Ｒ．Ｐ．，シスプラチン耐性の細胞および分子決定因子，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９８），３４，１５３５−１５４２。最近、白金化合物に対する化学耐性の、理解できる、考えられる様式の可能性が、細胞毒性とヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）（Ｄｉｊｔ，Ｆ．，Ｆｉｔｃｈｉｎｇｅｒ−Ｓｃｈｅｐｍａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｂｅｒｅｎｄｓ，Ｆ．，Ｒｅｅｄｉｋｊ，Ｊ．，培養された正常および修復−欠損ヒト線維芽細胞におけるＤＮＡへのシスプラチン−誘導付加体の形成および修復，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９８８），４８，６０５８−６０６２。Ｚａｍｂｌｅ，Ｄ．Ｂ．，Ｌｉｐｐａｒｄ，Ｓ．Ｊ．，癌化学療法におけるシスプラチンおよびＤＮＡ修復，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ（１９９５），２０，４３５−４３９。Ｓｔａｔｅｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｒｅｅｄ，Ｅ．，シスプラチン−耐性ヒト卵巣癌において、増加したＸＰＡ ｍＲＮＡレベルはＸＰＡ突然変異または遺伝子増幅とは関連しない，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．（１９９６），１０８，２３３−２３７。Ｆｅｒｒｙ，Ｋ．Ｖ．，Ｆｉｎｋ，Ｄ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ｗ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｔ．Ｃ．，Ｈｏｗｅｌｌ，Ｓ．Ｂ．，インビトロＤＮＡ修復アッセイを使用する、誤対合修復欠損およびプロフィシエント（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）ヒト結腸直腸癌細胞株における白金−ＤＮＡ付加体修復の定量，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９７），抄録，３８，３５９。Ｊｏｒｄａｎ，Ｐ．，Ｃａｒｍｏ−Ｆｏｎｓｅｃａ，Ｍ．，シスプラチン細胞毒性に含まれる分子機構，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（２０００），５７，１２２９−１２３５。Ｋａｒｔａｌｏｕ，Ｍ．，Ｅｓｓｉｎｇｍａｎｎ，Ｊ．Ｍ．，シスプラチンに対する耐性の機構，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．（２００１），４７８，２３−４３）、または薬剤取り込み／流出（Ｋａｒｔｏｌｕｏ，Ｍ．，Ｅｓｓｉｎｇｍａｎｎ，Ｊ．Ｍ．，シスプラチンに対する耐性の機構，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．（２００１），４７８，２３−４３。Ｂｅｒｇｅｒ，Ｗ．，Ｅｌｂｌｉｎｇ，Ｌ．，Ｈａｕｐｔｍａｎｎ，Ｅ．，Ｍｉｃｋｓｃｈｅ，Ｍ．，ヒト非小細胞肺ガン細胞の多薬剤耐性−関連タンパク質（ＭＲＰ）発現および化学耐性，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９７），７３，８４−９３。Ｂｏｒｓｔ，Ｐ．，Ｋｏｏｌ，Ｍ．，Ｅｖｅｒｓ，Ｒ．，ｃＭＯＡＴ（ＭＲＰ２）、その他のＭＲＰ同族体およびＬＲＰはＭＤＲで何らかの役割を果たしているか？Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．（１９９７），８，２０５−２１３。Ｙｏｕｎｇ，Ｌ．Ｃ．，Ｃａｍｐｌｉｎｇ，Ｂ．Ｇ．，Ｖｏｓｋｏｇｌｏｕ−Ｎｏｍｉｋｏｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｅ，Ｓ．Ｐ．Ｃ．，Ｄｅｅｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．，Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｊ．Ｈ．，肺癌における多薬剤耐性タンパク質−関連遺伝子の発現：薬剤応答との関連，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９９），５，６７３−６８０。Ｂｅｒｇｅｒ，Ｗ．，Ｅｌｂｌｉｎｇ，Ｌ．，Ｍｉｃｋｓｃｈｅ，Ｍ．，ヒト非小細胞肺癌細胞における主ヴォールト（ｖａｕｌｔ）タンパク質の発現：抗新生物薬への短期暴露による活性化，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２０００），８８，２９３−３００。Ｂｏｒｓｔ，Ｐ．，Ｅｖｅｒｓ，Ｒ．，Ｋｏｏｌ，Ｍ．，Ｗｉｊｎｈｏｌｄｓ，Ｊ．，薬剤輸送体ファミリー：多薬剤耐性−関連タンパク質，Ｊ Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．（２０００），９２，１２９５−１３０２。Ｏｇｕｒｉ，Ｔ．，Ｉｓｏｂｅ，Ｔ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｏ，Ｋ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．，Ｋａｔｏｈ，Ｏ．，Ｙａｍａｋｉｄｏ，Ｍ．，ＭＲＰ５遺伝子発現の増加は、肺癌における白金薬剤への暴露に関連している，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２０００），８６，９５−１００。）を関連づける研究を通して得られている。
【０００５】
マイクロアレイおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を含む、科学技術の最新の進歩は、組織形態学に対して機能性ゲノム科学を基礎にした、癌の型の分類を可能にしている。Ｇｏｌｕｂ，Ｔ．Ｒ．，Ｓｌｏｎｉｍ，Ｄ．Ｋ．，Ｔａｍａｙｏ，Ｐ．，Ｈｕａｒｄ，Ｃ．，Ｇａａｓｅｎｂｅｅｋ，Ｍ．，Ｍｅｓｉｒｏｖ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｏｌｌｅｒ，Ｈ．，Ｌｏｈ，Ｍ．Ｌ．，Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．，Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，Ｍ．Ａ．，Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ｃ．Ｄ．，Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．，癌の分子的分類：遺伝子発現モニタリングによるクラス発見およびクラス予測，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９），２８６，５３１−５３７。Ａｌｉｚａｄｅｈ，Ａ．Ａ．，Ｅｉｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｍａ，Ｃ．，Ｌｏｓｓｏｓ，Ｉ．Ｓ．，Ｒｏｓｅｎｗａｌｄ，Ａ．，Ｂｏｌｄｒｉｃｋ，Ｊ．Ｃ．，Ｓａｂｅｔ，Ｈ．，Ｔｒａｎ，Ｔ．，Ｙｕ，Ｘ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｌ，Ｙａｎｇ，Ｌ．，Ｍａｒｔｉ，Ｇ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｔ．，Ｈｕｄｓｏｎ，Ｊｒ．，Ｊ．，Ｌｕ，Ｌ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｄ．Ｂ．，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，Ｒ．，Ｓｈｅｒｌｏｃｋ，Ｇ．，Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｔ．Ｃ．，Ｗｅｉｓｅｎｂｕｒｇｅｒ，Ｄ．Ｄ．，Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｊ．Ｏ．，Ｗａｒｎｋｅ，Ｒ．，Ｓｔａｕｄｔ，Ｌ．Ｍ．，ら，遺伝子発現プロファイリングにより同定されたびまん性大Ｂ細胞の特有の型，Ｎａｔｕｒｅ（２０００），４０３，５０３−５１１。例えば、それらは遺伝子発現プロフィールに基づいた予測的マーカーの発見を可能にすることができる。マイクロアレイスクリーニング分析は、目下、遺伝子発現プロフィールに基づいた化学療法感受性を予測するために調べられている。Ｓｃｈｅｒｆ，Ｕ．，Ｒｏｓｓ，Ｄ．Ｔ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｈ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｋ．，Ｔａｎａｂｅ，Ｌ．，Ｋｏｈｎ，Ｋ．Ｗ．，Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，Ｗ．Ｃ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｔ．Ｇ．，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｄ．Ｔ．，Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，Ｄ．Ａ．，Ｅｉｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｅ．Ａ．，Ｐｏｍｍｉｅｒ，Ｙ．，Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．，Ｗｅｉｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｎ．，癌の分子薬理学のための遺伝子発現データベース，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．（２０００），２４，２３６−２４４。Ｋｉｈａｒａ，Ｃ．Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｔ．，Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，Ｙａｍａｎａ，Ｈ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｙ．，Ｏｎｏ，Ｋ．，Ｋｉｔａｈａｒａ，Ｏ．，Ｚｅｍｂｕｔｓｕ，Ｈ．，Ｙａｎａｇａｗａ，Ｒ．，Ｈｉｒａｔａ，Ｋ．，Ｔａｋａｇｉ，Ｔ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，遺伝子発現プロフィールのｃＤＮＡマイクロアレイ分析による、アジュバント化学療法に対する食道腫瘍感受性の予測，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１），６１，６４７４−６４７９。Ｚｅｍｂｕｔｓｕ，Ｈ．，Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｙ．，Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｔ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｙ．，Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｔ．，Ｕｅｙａｍａ，Ｙ．，Ｔａｍａｏｋｉ，Ｎ．，Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．，Ｋｉｔａｈａｒａ，Ｏ．，Ｙａｎａｇａｗａ，Ｒ．，Ｈｉｒａｔａ，Ｋ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，遺伝子発現プロフィールと抗癌剤に対する８５のヒト癌異種移植片の感受性を相関付けるためのゲノム−ワイド（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ）ｃＤＮＡマイクロアレイスクリーニング，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００２），６２，５１８−５２７。マイクロアレイ分析の利点は、数千の遺伝子を同時に評価することができることである。しかし、標準化されていないため、相対的に低感度で、および検出の閾値が相対的に不十分に低く、マイクロアレイ判定は、その後の定量法で確認する必要があると一般に認識されている。ＳｔａＲＴ−ＰＣＲは、多くの遺伝子の、迅速な、再現性のある、標準化された、定量的測定を同時に可能にする方法である。Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７。Ｗｅａｖｅｒら，カルボプラチンに対して変動した感受性を有する肺癌細胞株における、マイクロアレイおよび標準化ＲＴ−ＰＣＲ分析による発現パターンの比較，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１（抄録）４２，６０６。
【０００６】
ＳｔａＲＴ−ＰＣＲはまた、少量のバイオプシ（ｂｉｏｐｓｙ）組織における肺癌をより正確に診断するためにも使用できる。Ｗａｒｎｅｒら，“高ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１はＮＳＣＬＣの細胞学的診断を増強する” Ｐｒｏｄ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４３巻，抄録３７３８，２００２年３月；Ｗｅａｖｅｒら、“ＲＴ ＳｔａｒＲＴ−ＰＣＲを利用する、非小細胞肺癌細胞株におけるシスプラチン化学耐性の遺伝子発現モデル化”，Ｐｒｏｄ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４３巻，抄録５４７１，２００２年３月。
【０００７】
発明の要約
本発明は、一つの例において、個々の遺伝子の発現値よりも化学耐性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のより有効なマーカーであり、および別の例において、少量のバイオプシ組織における肺癌をより正確に診断するために使用することができる、多数の遺伝子の発現値を含んで成る、個々の、相互作用的遺伝子発現および／または指標（ＩＧＥＩ）のパターンを同定する。
【０００８】
本発明は、治療薬に対する癌細胞の感受性を決定するために使用できるマーカーの同定および使用に関する。より具体的には、本発明は、癌組織で変化して発現され、そして治療薬に対する癌細胞の感受性を決定するために使用できる“多数のマーカー”を特色とする。さらにより具体的には、本発明は、治療薬の有用性を予測的に同定するための、生物学的試料の判定に有用な“相互作用的遺伝子発現指標”（ＩＧＥＩ）を特色とする。
【０００９】
本発明は、従って、有用な診断マーカーとして、ならびに、疾病状態、疾病進行、薬剤毒性、薬剤有効性および薬剤代謝をモニターするために使用できるマーカーとして働く、遺伝子発現プロフィールを提供する。
【００１０】
本発明はさらに、剤（agent）または剤の組合わせが、癌細胞の増殖を減少させるために使用できるかどうかを決定する、ならびに、癌処置のための新規剤を決定するための方法を提供する。
【００１１】
本発明の多様な態様は、その発現が正常組織と比較された肺癌細胞または組織の正確な診断に相関している同定されたマーカー、およびその発現が治療薬による処置に対する感受性と相関している他のマーカーの使用に関している。特に、限定されるわけではないが、本発明は：１）特定の組織が肺癌であるかまたは非癌組織であるかどうかを決定するための方法；２）癌の処置に使用された治療薬の有効性をモニタリングするための方法；３）癌処置のための新規治療薬を開発するための方法；および４）癌処置のための治療薬の組合わせを同定するための方法、を提供する。
【００１２】
癌細胞試料中の、一つまたはそれより多くの同定されたマーカーの発現を試験し、および定量することにより、どの治療薬または治療薬の組合わせが癌の増殖速度を最も減少させるようであるかを決定することがさらに可能であり、適した治療薬の選択にさらに使用することができる。
【００１３】
癌細胞試料中の、一つまたはそれより多くの同定されたマーカーの発現を試験し、および定量することにより、どの治療薬または治療薬の組合わせが癌の増殖速度を最も減少させないようであるかを決定することがさらに可能である。
【００１４】
一つまたはそれより多くの同定されたマーカーの発現を試験し、および定量することにより、不適切な治療薬を排除することも可能である。
癌細胞または癌細胞株を抗癌剤の可能性を持つ薬剤へ暴露した場合、一つまたはそれより多くの同定されたマーカーの発現を試験し、および定量することにより、新規抗癌剤の効力を同定することが可能である。
【００１５】
さらに、治療処置の過程間に、患者からとった癌細胞試料中の、一つまたはそれより多くの同定されたマーカーの発現を試験し、および定量することにより、治療処置が引き続いて有効であるかどうか、または癌が治療処置に対して耐性（抗治療性）になっているかどうかを決定することが可能である。これらの決定は、患者ごとの基準で、または剤（または剤の組合わせ）ごとの基準で行える。また、特定の治療処置が特定の患者または患者群／クラスに利益になりそうかどうか、または特定の処置を続けるべきかどうかを決定することも可能である。
【００１６】
本発明はさらに、化学療法用化合物のごとき、抗癌剤の開発のための、以前には未知のまたは認識されていない標的を提供する。
本発明の同定された相互作用的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）は、癌のための処置（単一の剤かまたは多数の剤）の開発における標的として有用である。
【００１７】
本発明は、正常肺からの組織における遺伝子発現を試験することにより、肺癌に関連した遺伝子発現の全体的な変化を同定する。本発明はまた、有用な診断マーカー、並びに、疾病状態、疾病進行、薬剤毒性、薬剤有効性および薬剤代謝をモニターするために使用できるマーカーとして働く発現プロフィールも同定する。
【００１８】
いくつかの好ましい態様において、本明細書に記載した方法、遺伝子およびＩＧＥＩは、シスプラチン耐性癌を同定するために有用である（正常組織から癌を診断するのとは対照的に）。そのような態様は、ＥＲＣＣ２、ＡＢＣＣ５、ＸＰＡおよびＸＲＣＣ１からなる群より選択される、一つまたはそれより多くの遺伝子の発現レベルを検出することを含むことができる。
【００１９】
いくつかの好ましい態様において、本方法は、ＥＲＣＣ２／ＸＰＣ、ＡＢＣＣ５／ＧＴＦ２Ｈ２、ＥＲＣＣ２／ＧＴＦ２Ｈ２、ＸＰＡ／ＸＰＣおよびＸＲＣＣ１／ＸＰＣからなる群より選択される、一つまたはそれより多くの遺伝子の発現レベルを検出することを含むことができる。
【００２０】
いくつかの好ましい態様において、本方法は、ＡＢＣＣ５／ＧＴＦ２Ｈ２およびＥＲＣＣ２／ＧＴＦ２Ｈ２からなる群より選択される、一つまたはそれより多くの遺伝子の発現レベルを検出することを含むことができる。
【００２１】
本発明はまた、ＮＳＣＬＣおよび／または分化性小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の進行、および／または転移性疾患から非転移性疾患を検出する方法も含んでいる。例えば、本発明の方法は、患者におけるＮＳＣＬＣの進行を検出することを含んでおり、前記方法は、表１および／または５からの二つまたはそれより多くの遺伝子の、組織試料中の発現レベルを検出する工程を含んでなる；ここで、表１および／または５中の遺伝子の異なった発現は、ＮＳＣＬＣ進行の指標である。いくつかの好ましい態様において、一つまたはそれより多くの遺伝子は、表５に掲げた遺伝子からなる群より選択することができる。
【００２２】
いくつかの様相において、本発明はＮＳＣＬＣを患った患者の処置をモニタリングする方法を提供し、前記方法は、患者に医薬組成物を投与し、そして患者の細胞または組織試料から遺伝子発現プロフィールを調製し、そして患者の遺伝子発現プロフィールを、正常肺細胞を含んでなる細胞集団からの遺伝子発現と、または肺癌細胞を含んでなる細胞集団からの遺伝子発現プロフィールと、またはその両方と比較することを含んでなる。いくつかの好ましい態様において、遺伝子プロフィールは表１および５の一つまたはそれより多くの遺伝子の発現レベルを含んでいるであろう。別の好ましい態様において、一つまたはそれより多くの遺伝子は、表５に掲げた遺伝子からなる群より選択することができる。
【００２３】
別の様相において、本発明はＮＳＣＬＣを患った患者を処置する方法を提供し、前記方法は、患者に表１および５の少なくとも一つの遺伝子の発現を変化させる医薬組成物を投与し、腫瘍細胞を含んでなる患者の細胞または組織試料から遺伝子発現プロフィールを調製し、そして患者の遺伝子発現プロフィールとＮＳＣＬＣ細胞を含んでなる非処置細胞集団からの遺伝子発現プロフィールを比較することを含んでなる。いくつかの好ましい態様において、一つまたはそれより多くの遺伝子は、表５に掲げた遺伝子からなる群より選択することができる。
【００２４】
本発明は患者における肺癌の存在または非存在を診断する方法を含んでおり、前記方法は、ｃ−ｍｙｃ遺伝子発現値（分子／１０６β−アクチン分子）にＥ２Ｆ−１発現値を掛け、そしてその結果をｐ２１遺伝子発現値で割る、ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１を含んで成るＩＧＥＩの、組織試料中の発現レベルを検出する工程を含んでなる（各々の遺伝子は３つのプライマー配列を有しているので、配列番号４０−４８）。
【００２５】
ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１指標はまた、例えば、肺癌の発達のような疾病進行のモニタリングのためのマーカーとしても使用することができる。例えば、患者からの肺組織試料またはその他の試料を本明細書に記載した任意の方法によりアッセイすることができ、そしてｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１の試料中の発現レベルを、正常肺組織、ＳＣＬＣからの組織、転移性肺癌またはＮＳＣＬＣ組織中に観察された発現レベルと比較することができる。発現データ、ならびに入手可能な配列またはその他の情報の比較は、研究者または診断医により行うことができ、または本明細書に記載したようなコンピューターおよびデータベースの助けを借りて行うことができる。
【００２６】
本発明はさらに、ＮＳＣＬＣの発生または進行を調節可能な剤をスクリーニングする方法も含んでおり、前記方法は、細胞を剤に暴露し；そしてｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１指標の発現レベルを検出する工程を含んでなる。
【００２７】
本発明の一つの様相に従うと、表１および５で同定された遺伝子は、例えば、肺癌細胞または組織試料のような、細胞または組織試料に対する候補薬剤または剤の効果を評価するためのマーカーとして使用することができる。候補薬剤または剤は、既定のマーカーまたはマーカー遺伝子のセット（薬剤標的）の転写または発現を刺激する、またはマーカーまたはマーカー類の転写または発現を下方制御または相殺する能力でスクリーニング可能である。本発明に従うと、遺伝子発現マーカーに対する薬剤効果の特異性も比較でき、それらを比較することが可能である。より特異的な薬剤は、より少ない転写標的を有することができる。二つの薬剤に対して、同様のマーカーのセットが同定されることは、同様の効果を示している。
【００２８】
上に記載した本発明の任意の方法は、表１および／または５またはｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１からの少なくとも二つの遺伝子の検出および定量を含むことができる。好ましい方法は、表中の遺伝子の全てまたはほとんど全てを含むことができる。いくつかの好ましい態様において、一つまたはそれより多くの遺伝子は、表５に掲げた遺伝子からなる群より選択することができる。
【００２９】
別の様相に従うと、本発明は、患者における非小細胞肺癌を診断する方法に関しており、前記方法は：（ａ）ｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の、組織試料中での発現のレベルを検出および定量することを含んでなる；ここでｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の他と異なる発現は、非小細胞肺癌の指標である。
【００３０】
別の様相において、本発明は、患者における非小細胞肺癌の進行を検出する方法に関しており、前記方法は：（ａ）ｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の、組織試料中での発現のレベルを検出および定量することを含んでなる；ここでｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の他と異なる発現は、非小細胞肺癌進行の指標である。
【００３１】
さらに別の様相において、本発明は、非小細胞肺癌の患者の処置をモニタリングする方法に関しており、前記方法は：（ａ）患者に医薬組成物を投与し；（ｂ）患者からの細胞または組織試料から遺伝子発現プロフィールを調製し；および（ｃ）患者の遺伝子発現プロフィールと、正常肺細胞および非小細胞肺癌からなる群より選択される細胞集団からの遺伝子発現を比較する、ことを含んでなる。
【００３２】
さらに別の様相において、本発明は、非小細胞肺癌の患者を処置する方法に関しており、前記方法は：（ａ）患者に医薬組成物を投与し、ここにおいて、組成物は表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の少なくとも一つの遺伝子の発現を改変する；（ｂ）処置前に得られた腫瘍細胞を含んでなる細胞または組織試料および処置後に得られた別の試料から、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用する、標準化遺伝子発現値を含んでなるＩＧＥＩを調製し；および（ｃ）処置に先立って得られた試料と処置後に得られた試料を比較する、ことを含んでなる。
【００３３】
本発明のさらに別の様相は、非小細胞肺癌の発生および進行を調節できる剤のためのスクリーニング法に関しており、前記方法は：（ａ）非小細胞癌細胞を含んでなる細胞集団の、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用する、標準化遺伝子発現値を含んでなる第一のＩＧＥＩを調製し、ここにおいて、第一のＩＧＥＩは、表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の一つまたはそれより多くの遺伝子の発現レベルを決定する；（ｂ）細胞集団を剤に暴露し；（ｃ）剤に暴露された細胞集団の、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用する、標準化遺伝子発現値を含んでなる第二のＩＧＥＩを調製し；および（ｄ）第一および第二のＩＧＥＩを比較する、ことを含んでなる。
【００３４】
別の様相において、本発明は、標準化定量的ＲＴ−ＰＣＲに従ったＰＣＲ生成物を、標準化された様式で測定するための、一つまたはそれより多くの固相ハイブリダイゼーション鋳型に関しており、ここで鋳型は以下のように形成する：
ａ）少なくとも一つの固相ハイブリダイゼーション鋳型を調製し、ここにおいて、各々の遺伝子のため、競合的鋳型（ＣＴ）および天然の鋳型（ＮＴ）の両方に特異的に結合するであろう任意の長さのオリゴヌクレオチドをフィルターにスポットし；
ｂ）フォワードプライマー（ＮＴおよびＣＴの両方に共通）およびリバースＣＴプライマーの３’２０ｂｐ間の領域が評価されるように、適したオリゴヌクレオチドを同定し；
ｃ）前もって選定された位置で、固体支持体へオリゴヌクレオチドを結合させ；
ｄ）ＣＴおよびＮＴ ＰＣＲ生成物を増幅し、そしてフィルターのスポットへハイブリダイズし、そこでは各々の遺伝子（ＮＴおよびＣＴ）が別々に増幅される；
ｅ）ハイブリダイゼーションのためにＰＣＲ生成物をプールし；および
ｆ）各々の遺伝子に対して、各々が異なった蛍光で標識されている、二つのオリゴヌクレオチドプローブを調製し、ここにおいて、一つのオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドが、ＣＴとは相同的ではなく、および異なった蛍光で標識されているＮＴの領域へ結合するように、ＰＣＲ−増幅された遺伝子のためのＮＴに特有の配列に相同的であり、およびそれに結合するであろうし、およびここにおいて、他のオリゴヌクレオチドは、この他のオリゴヌクレオチドが、リバースプライマーの３’末端に広がるＣＴ配列と相同的であり、およびそれに結合するであろうように、ＣＴへ特異的でありおよび異なった蛍光で標識されている。特定の態様において、多数の遺伝子のためのＮＴ−特異的およびＣＴ−特異的オリゴヌクレオチドを等量で混合し、フィルター上にスポットした遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドへ結合された遺伝子−特異的ＰＣＲ生成物とハイブリダイズさせる。また、スポットへ結合された蛍光間の比で、ＣＴに対するＮＴの量を定量化する。ＮＴおよびＮＴプローブ間の結合親和性と比較して、ＣＴおよびＣＴプローブ間には異なった結合親和性があるけれども、この相違は判定された異なった試料間、および一つの実験と別の実験間では一致している。鋳型は、少なくとも一つの標準化された、マイクロアレイ、マイクロビーズ、ガラススライド、または光リソグラフィーにより製造されたチップを含むことができ、および固体支持体は膜、ガラス支持体、フィルター、組織培養皿、多量化物質、ビーズおよびシリカ支持体であり得ることに注目せねばならない。特定の態様において、オリゴヌクレオチドの各々が表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子中の少なくとも一つの遺伝子へ特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる、少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを固体支持体は含んでなる。また、オリゴヌクレオチドは固体支持体に共有結合で結合されていてもよいし、または若しくは固体支持体に非共有結合で結合されていてもよいことにも注目すべきである。
正常肺組織の遺伝子のセットに対して、分子／１０６β−アクチン分子の単位での発現レベル。
【００３５】
本発明はさらに、表１および５中の少なくとも二つの遺伝子またはｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１を含んでなる遺伝子のセットの、肺組織における発現レベルを同定する情報を含んでいる、数的標準化データベースを含んでなるコンピューターシステム；および情報をみるためのユーザーインターフェイスを含んでいる。いくつかの好ましい態様において、一つまたはそれより多くの遺伝子は、表５に掲げた遺伝子からなる群より選択することができる。数的標準化データベースはさらに、遺伝子の配列情報、正常肺組織および悪性組織（転移性および非転移性）における遺伝子のセットの発現レベルを同定する情報も含んでおり、そしてＧｅｎＢａｎｋのごとき外部データベースへのリンクを含むことができる。
【００３６】
本発明はさらに、本発明の一つまたはそれより多くの方法の実行に有用なキットを含んでなる。いくつかの好ましい態様において、キットは、一つまたはそれより多くのオリゴヌクレオチドが結合された、一つまたはそれより多くの固体支持体を含むことができる。固体支持体は高密度オリゴヌクレオチドアレイであることができる。キットはさらに、アレイで使用するための一つまたはそれより多くの試薬、一つまたはそれより多くの信号検出および／またはアレイ処理装置、一つまたはそれより多くの遺伝子発現データベース、および一つまたはそれより多くの分析およびデータベース管理ソフトウェアーパッケージを含むことができる。特定の好ましい態様において、キットは、標準化マイクロアレイへ適用するための試薬と一緒にＳｔａＲＴ−ＰＣＲ試薬を有している。
【００３７】
本発明はさらにまた、組織または細胞中の、表１および５の少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを、データベースの遺伝子発現レベルを比較することを含んでなる、表１および５の少なくとも一つの遺伝子の、組織または細胞中の発現レベルを同定する現在の情報について開示されたコンピューターシステムを使用しているような、データベースを使用する方法を含んでいる。いくつかの好ましい態様において、一つまたはそれより多くの遺伝子は、表５に掲げた遺伝子からなる群より選択することができる。
【００３８】
本発明の他の特色および利点は、発明の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書に記載した材料および方法と同様なまたは均等な材料および方法を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい材料および方法は以下に説明されている。
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明は、一部、癌細胞が療法剤に対して感受性であるかどうかを決定するために使用できる、マーカーの同定および定量に基づいている。これらの同定および定量に基づき、本発明は、限定されるわけではないが、：１）療法剤（または剤の組み合わせ）が腫瘍増殖を停止させるのに、または遅延させるのに有効であるのであろうか、または有効ではないのであろうかどうかを決定するための方法；２）癌の処置に使用された療法剤（または剤の組み合わせ）の有効性をモニタリングするための方法；３）癌処置のための新規療法剤を同定するための方法；４）癌の処置に使用するための療法剤の組み合わせを同定するための方法；５）特定の患者における癌の処置に有効である、特定の療法剤および療法剤の組み合わせを同定するための方法；および癌を診断するための方法、を提供する。
【００４０】
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用されたすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により共通に理解されている意味と同一の意味を持っている。本明細書に記載した材料および方法と同様なまたは均等な材料および方法を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい材料および方法が本明細書に説明されている。本明細書に述べられたすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照文献は、その全体が本明細書に記載されているものとする。本出願を通して引用された（表を含んで）すべてのＧｅｎＢａｎｋ、およびＩＭＡＧＥ ＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍおよびＵｎｉｇｅｎｅデータベースレコードその他のデータベースレコードのコンテンツもまた、本明細書に記載されているものとする。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先するであろう。加えて、材料、方法および実施例は例示のためのみであり、それによって限定されることは意図されていない。
【００４１】
冠詞“ａ”および“ａｎ”は本明細書において、冠詞の文法的目的語が一つまたは一より多い（即ち、少なくとも一つ）ことを指すために使用される。例として、“ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ”は一つのｅｌｅｍｅｎｔまたは一より多いｅｌｅｍｅｎｔを意味している。
【００４２】
“マーカー”は、表１−５に掲げた核酸の少なくとも一つに対応する、天然に存在するポリマーである。例えば、マーカーには、限定するわけではないが、ゲノムＤＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖（即ち、その中に存在する任意のイントロンを含んで）、ゲノムＤＮＡの転写により発生したＲＮＡ（即ち、スプライシングに先立った）、ゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡのスプライシングにより発生したＲＮＡ、スプライスされたＲＮＡの翻訳により発生したタンパク質（即ち、膜貫通シグナル配列のごとき普通は切断される領域の、切断前および後の両方のタンパク質を含んで）、が含まれる。本明細書で使用するような“マーカー”はまた、ゲノムＤＮＡの転写により発生したＲＮＡ（即ち、スプライスされたＲＮＡを含んで）の逆転写により作製されたｃＤＮＡも含むことができる。
【００４３】
用語“プローブ”とは、特別に意図された標的分子へ選択的に結合できる任意の分子を指している、例えば、本発明のマーカー。プローブは、当業者により合成されるか、または適した生物学的調製試料から誘導することが可能である。標的分子の検出の目的には、プローブは、本明細書に記載されているごとく、標識されているように特別に設計することができる。プローブとして利用することができる例には、限定されるわけではないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機モノマーが含まれる。
【００４４】
マーカー発現の“正常”レベルとは、癌に苦しめられていない患者の細胞中でのマーカー発現レベルである。
本明細書で使用するような、用語“プロモーター／制御配列”とは、プロモーター／制御配列に機能可能であるように連結されている遺伝子産物の発現に必要とされる、核酸配列を意味している。いくつかの例において、この配列はコアプロモーター配列であってもよく、そして他の例では、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要とされる、エンハンサー配列および他の制御要素を含んでいてもよい。例えば、プロモーター／制御配列は、組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものであってもよい。
【００４５】
“構成的”プロモーターとは、遺伝子産物をコードまたは特定しているポリヌクレオチドと機能可能であるように連結されている場合、細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件下、生きているヒト細胞中で遺伝子産物の産生を引き起こす、ヌクレオチド配列である。
【００４６】
“転写されたポリヌクレオチド”とは、本発明のマーカーに対応する、ゲノムＤＮＡの転写、および、もしあれば、転写体の正常転写後プロセッシング（例えば、スプライシング）により作製された成熟ＲＮＡの全てまたは一部と相補的または相同的である、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡまたはｃＤＮＡの一つの類似体）である。
【００４７】
“相補的”とは、二つの核酸鎖の領域間または同一核酸鎖の二つの領域間の、配列相補性の広い概念を指している。第一の核酸領域のアデニン残基は、もし残基がチミンまたはウラシルであれば、第一の領域と逆平行である第二の核酸領域の残基と特定の水素結合を形成することができる（“塩基対形成”）ことは知られている。同様に、第一の核酸鎖のシトシン残基は、もし残基がグアニンであれば、第一の鎖と逆平行である第二の核酸鎖の残基と塩基対形成できることも知られている。もし、二つの領域が逆平行様式に配置された場合、第一の領域の少なくとも一つのヌクレオチド残基が第二の領域の残基と塩基対形成できるならば、第一の領域の核酸は、同一または異なった核酸の第二の領域と相補的である。好ましくは、第一の領域は第一の部分を含んでなり、および第二の領域は第二の部分を含んでなり、それにより、第一および第二の部分が逆平行様式に配置された場合、第一の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、および好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％は、第二の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成できる。より好ましくは、第一の部分の全ヌクレオチド残基が、第二の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成できる。
【００４８】
本明細書で使用するような“相同的”とは、同一核酸鎖の二つの領域間、または二つの異なった核酸鎖の領域間のヌクレオチド配列同一性を指している。両方の領域中のヌクレオチド残基位置が同一のヌクレオチド残基で占有されている場合、領域はその位置で相同である。二つの領域間の相同性は、同一のヌクレオチド残基により占有されている、二つの領域のヌクレオチド残基位置の割合によって表現される。好ましくは、第一の領域が第一の部分を含んでなり、および第二の領域が第二の部分を含んでなり、それにより、各々の部分のヌクレオチド残基位置の少なくとも約５０％、および好ましくは約７５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が同一のヌクレオチド残基で占有されている。より好ましくは、各々の部分の全ヌクレオチド残基位置が、同一のヌクレオチド残基で占有されている。
【００４９】
マーカーが、もし共有結合でまたは非共有結合で基質と結合されているとしたら、マーカーは基質へ“固定されて”おり、そのような基質は、基質から解離しているマーカーの実質的分画がなく、液体（例えば、標準クエン酸塩溶液、ｐＨ７．４）で洗い流すことができる。
【００５０】
本明細書で使用するような“天然に存在する”核酸分子とは、天然に存在するヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡを指している（例えば、天然のタンパク質をコードしている）。
【００５１】
もし、癌の少なくとも一つの徴候が緩解され（ａｌｌｅｖｉａｙｒｄ）、終結され（ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）、遅らされ（ｓｌｏｗｅｄ）、または防止され（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）ているならば、癌は“抑制され”ている。本明細書で使用される場合、もし、癌の再発または転移が減少され（ｒｅｄｕｃｅｄ）、遅らされ（ｓｌｏｗｅｄ）、遅延され（ｄｅｌａｙｅｄ）、または防止され（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）ているならば、癌はまた“抑制され（ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ）”ている。もし、細胞増殖が減少し、または細胞死速度が増加するならば、癌はまた抑制されている。
【００５２】
“キット”は、本発明のマーカーを特異的に検出するための、少なくとも一つの試薬、例えば、プローブを含んでなる任意の製品（例えば、包装品または容器）であり、製品は本発明の方法を実行するためのユニットとして、販売促進され、配給され、または販売されている。
【００５３】
具体的態様
以下に提供された例は、定義された化学療法剤、即ち、白金化合物に感受性を有する癌細胞株と、応答性でないものを区別するマーカーの同定および定量に関している。従って、その剤により首尾よく処置できた癌細胞を同定するために、一つまたはそれより多くのマーカーが使用できる。その剤により首尾よく処置できなかった癌細胞を同定するために、一つまたはそれより多くのマーカー発現の変化も使用できる。これらのマーカーは、それ故、剤での処置に不応になったまたは不応になる危険性がある癌を同定するための方法に使用できる。
【００５４】
同定されたマーカーの発現レベルは：１）癌が剤または剤の組み合わせにより処置できるかどうかを決定する；２）癌が剤または剤の組み合わせによる処置に応答しているかどうかを決定する；３）癌を処置するために適した剤または剤の組み合わせを選択する；４）進行中の処置の有効性をモニターする；および５）新規癌処置（単一の剤または剤の組み合わせ）を同定する、ために使用することができる。
【００５５】
特に、同定されたマーカーは、適した治療を決定するため、効力が試験されている薬剤の臨床治療およびヒト試行をモニターするため、および新規剤および治療の組み合わせを開発するために利用することができる。
【００５６】
従って、本発明は、癌細胞を抑制するために剤が使用できるかどうかを決定するための方法を提供し、前記方法は：
ａ）癌細胞の試料を得；
ｂ）表１および５に同定されたマーカーの、癌細胞中での発現レベルを決定し、および定量し；および
ｃ）マーカーが特定のレベルで発現された場合、癌細胞を抑制するために剤が使用できることを同定する、工程を含んでなる。
【００５７】
本発明はまた、剤が癌の処置において有効であるかどうかを決定するための方法も提供し、前記方法は：
ａ）癌細胞の試料を得；
ｂ）試料を剤に暴露し；
ｃ）剤へ暴露された試料中の、および剤へ暴露されていない試料中の、表１および５に同定されたマーカーの発現レベルを決定し、および定量し；および
ｄ）マーカーの発現が、剤の存在下で変化した場合、剤が癌の処置に有効であることを同定する、工程を含んでなる。
【００５８】
本発明はさらに、剤での処置を癌患者で続けるべきかどうかを決定するための方法を提供し、前記方法は：
ａ）剤での処置の過程間に、患者から癌細胞を含んでなる二つまたはそれより多くの試料を得；
ｂ）二つまたはそれより多くの試料中の、表１および５に同定されたマーカーの発現のレベルを決定し、および定量し；および
ｃ）マーカーの発現レベルが特定のレベルである、例えば、処置過程の間に著しくは変化しない場合に処置を続ける、工程を含んでなる。
【００５９】
本発明はまた、新規癌処置を同定する方法を提供し、前記方法は：
ａ）癌細胞の試料を得；
ｂ）表１および５に同定されたマーカーの発現のレベルを決定し、および定量し；
ｃ）試料を癌処置に暴露し；
ｄ）癌処置に暴露した試料中のマーカーの発現のレベルを同定し；および
ｅ）マーカーが特定のレベルで発現されている場合、前記癌処置が癌を処置することにおいて有効であることを同定する、工程を含んでなる。
【００６０】
従って、別の様相において、本発明は癌を診断する方法を提供し、前記方法は：
ａ）癌細胞を含んでいるかもしれない組織の試料を得；および
ｂ）組織中のｃ−ｍｃｙ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１指標の発現レベルを決定し、および定量する、工程を含んでなる。
【００６１】
本明細書において使用するように、剤が癌細胞の増殖を少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％減少できる場合に、剤は癌細胞の増殖速度を減少させたと言える。そのような抑制はさらに、癌細胞の生存可能性の減少、および癌細胞の死亡速度の増加を含んでいる。この決定に使用される剤の量は、選択された剤に基づいて変化するであろう。典型的には、前記の量は前もって決められた治療量であろう。
【００６２】
本明細書で使用するような、用語“剤”は、癌細胞が治療プロトコールで暴露されるであろう任意のものとして広く定義される。本発明の文脈において、そのような剤には、限定されるわけではないが、代謝拮抗剤、例えば、架橋剤、例えば、シスプラチンおよびＣＢＤＣＡのような化学療法剤、放射線および紫外光が含まれる。
【００６３】
上記に加え、術語“化学療法剤”は、細胞または組織の増殖が望まれないような、増殖している細胞または組織の増殖を抑制する、化学試薬を含むことも意図されている。
本方法で試験される剤は単一剤または剤の組み合わせが可能である。例えば、本方法はシスプラチンのごとき単一の化学療法剤が癌を処置するために使用できるかどうか、または二つまたはそれより多くの剤の組み合わせが使用できるかどうかを決定するために使用できる。好ましい組み合わせは、例えば、アルキル化剤と組み合わされた抗有糸分裂剤の使用のような、異なった作用機構を有する剤を含んでいるであろう。
【００６４】
本明細書で使用するように、癌細胞とは、異常な（増加された）速度で分割する細胞を指している。特に、癌細胞には、限定されるわけではないが、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が含まれる。本方法で使用される癌細胞の起源は、本発明の方法がどのように使用されているかに基づくであろう。例えば、もし本方法が、患者の癌が剤または剤の組み合わせで処置できるかどうかを決定するために使用されているとしたら、癌細胞の好ましい起源は、患者の癌バイオプシから得られた癌細胞であろう。もしくは、処置されている癌と類似の型の癌細胞株がアッセイ可能である。例えば、もし非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が処置されているならば、（ＮＳＣＬＣ）細胞株が使用可能である。もし、本方法が療法プロトコールの有効性をモニターするために使用されているとしたら、処置されている患者からの組織試料が好ましい起源である。もし、本方法が新規療法剤または組み合わせを同定するために使用されているとしたら、例えば、癌細胞株のような任意の癌細胞が使用可能である。
【００６５】
当業者は、本方法で使用される適した癌細胞を容易に選択および入手できる。癌細胞株については、実施例で使用されるＮＣＩ細胞は、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのような供給源が好ましい。患者から得られる癌細胞については、針バイオプシのような、標準バイオプシ法を用いることができるが、ｍＲＮＡの完全性を保護するため、本技術分野で知られている必要な予防処置を講じる。
【００６６】
本発明の方法において、表１に同定されたマーカーからなる群より選択された、一つまたはそれより多くのマーカーの発現レベルまたは量を決定する。本明細書で使用するような発現のレベルまたは量とは、遺伝子によりコードされたｍＲＮＡの発現レベル、または遺伝子によりコードされたタンパク質の発現レベルを指している（即ち、癌細胞において発現が起こっているかまたは起こっていないのどちらにせよ）。それはまた、本明細書で開示した相互作用的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）の値を指すこともできる。当業者は、本発明の一つまたはそれより多くの（ＩＧＥＩ）マーカーセットによりコードされているｍＲＮＡレベル検出に使用するための、既知のｍＲＮＡ検出法を容易に適用できる。
【００６７】
癌細胞からのタンパク質は、当業者には公知の技術を使用して単離することができる。用いられたタンパク質単離法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８，抗体：実験室マニュアル，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク）に記載されているような方法が可能である。
【００６８】
試料が、既定の抗体に結合するタンパク質を含んでいるかどうかを決定するために、多様な型式を用いることができる。そのような型式の例としては、限定されるわけではないが、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット分析および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。当業者は、癌細胞が、本発明の一つまたはそれより多くの（ＩＧＥＩ）マーカーセットによりコードされているタンパク質を発現するかどうかの決定に使用するための、既知のタンパク質／抗体検出法を容易に適用できる。
【００６９】
一つの型式において、抗体または抗体断片が、発現されたタンパク質を検出するため、ウェスタンブロットまたは免疫蛍光技術のごとき方法で使用できる。そのような使用において、固体支持体上に抗体かまたはタンパク質を固定化することが好ましい。適した固相支持体または坦体には、抗原または抗体を結合できる任意の支持体が含まれる。公知の支持体または坦体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が含まれる。加えて、固体支持体は、膜、ガラス支持体、フィルター、組織培養皿、多量体材料、ビーズおよびシリカ支持体から選択できる。
【００７０】
特定の態様において、固体支持体は少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含んでなり、ここで各々のオリゴヌクレオチドは、表１および５の少なくとも一つの遺伝子へ特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる。また、固体支持体は、固体支持体に共有結合で結合されている、またはもしくは、固体支持体に非共有結合で結合されているオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００７１】
当業者は、抗体または抗原を結合するために適した坦体を知っているであろうし、そして本発明で使用するためのそのような支持体を適用できるであろう。例えば、癌細胞から単離されたタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により泳動でき、およびニトロセルロースのごとき固相支持体上へ固定化できる。支持体は、次いで、適した緩衝液で洗浄でき、続いて検出可能に標識されたマーカー生成物特異的抗体で処理する。固相支持体は、次いで、非結合抗体を除去するため、緩衝液で二回目の洗浄を行うことができる。固体支持体上の結合された標識量は、次ぎに通常の手段により検出できる。
【００７２】
本発明の別の態様は、本発明の一つまたはそれより多くの（ＩＧＥＩ）マーカーセット発現を剤が刺激するかどうかを検出する工程を含んでいる。本（ＩＧＥＩ）マーカーセットのいくつかは、非処置癌細胞においても発現されているであろうが、剤による処置によって発現を変化させることができる（またはできない）。本発明の（ＩＧＥＩ）マーカーセットの発現レベルの変化は、剤が癌細胞の増殖速度を減少させることに有効であろうか、または有効ではないであろうかどうかのさらなる指標を提供することができる。
【００７３】
そのような使用において、本発明は、剤、例えば、化学療法剤が癌細胞を抑制するために使用できるかどうかを決定するための方法を提供し、前記方法は：
ａ）癌細胞の試料を得；
ｂ）癌細胞試料を一つまたはそれより多くの試験剤へ暴露し；
ｃ）剤へ暴露した試料中の、または剤へ暴露されていない癌細胞試料中の、表１で同定されたマーカーからなる群より選択された一つまたはそれより多くのマーカーの、癌細胞中の発現のレベルを決定し、および定量し；および
ｄ）一つまたはそれより多くのマーカーの発現が前記剤の存在下で増加した場合、および／または前記剤の存在下で一つまたはそれより多くのマーカーの発現が増加しなかった場合、癌を処置するために剤が使用できることを同定する、工程を含んでなる。
【００７４】
本発明の方法のこの態様は、剤に対して癌細胞を暴露する工程を含んでいる。剤に対して癌細胞を暴露するために使用される方法は、主として、癌細胞の起源および性質、および試験されている剤に基づいているであろう。接触はインビトロまたはインビボで、試験／評価されている患者で、または癌の動物モデルで実行できる。癌細胞、細胞株および化学化合物に対して、癌細胞を暴露するとは、組織培養培地中でのように、癌細胞と化合物を接触させることを含んでいる。当業者は、癌細胞と特定の剤または剤の組み合わせを接触させるために適した手順を容易に適用できる。
【００７５】
上で議論したように、同定された（ＩＧＥＩ）マーカーセットはまた、進行中の処置（例えば、化学療法処置）に対して、腫瘍が不応になったかどうかを判定するためにも使用できる。腫瘍が処置にこれ以上応答しない場合は、腫瘍細胞の発現プロフィールが変化するであろう：一つまたはそれより多くのマーカーの発現レベルが減少するであろう、および／または一つまたはそれより多くのマーカーの発現レベルが増加するであろう。
【００７６】
そのような使用において、本発明は、癌患者で抗癌処置を続けるべきかどうかを決定するための方法を提供し、前記方法は：
ａ）抗癌療法をうけている患者から癌細胞の二つまたはそれより多くの試料を得；
ｂ）剤に暴露された試料中の、および剤に暴露されていない癌細胞試料中の、群より選択された一つまたはそれより多くのマーカー、および一つまたはそれより多くの対応する（ＩＧＥＩ）マーカーセットの発現レベルを決定し、および定量し；および
ｃ）一つまたはそれより多くの（ＩＧＥＩ）マーカーセットの発現が変化した場合、処置を中止する、工程を含んでなる。
【００７７】
本明細書で使用されるように、患者とは、癌のための処置をうけている任意の対象を指している。好ましい対象は、化学療法処置をうけているヒト患者であろう。
本発明のこの態様は、抗癌処置をうけている患者から得られた、二つまたはそれより多くの試料を比較することに頼っている。一般に、治療の開始に先立って患者から第一の試料を、そして処置間に一つまたはそれより多くの試料を得るのが好ましい。そのような使用において、治療に先立った発現のベースラインを決定し、次いで、治療の過程間に、発現のベースライン状態の変化をモニターする。もしくは、処置間に得られた二つまたはそれより多くの連続的試料が、処置前ベースライン試料の必要なしで使用できる。そのような使用においては、患者から得られた第一の試料を、特定のマーカーの発現が増加しているかまたは減少しているかどうかを決定するためのベースラインとして使用する。
【００７８】
一般に、療法処置の有効性をモニタリングする場合、患者からの二つまたはそれより多くの試料を試験する。好ましくは、少なくとも一つの処置前試料を含む、三つまたはそれより多くの連続的に得られた試料を使用する。
【００７９】
本発明はさらに、本発明の一つまたはそれより多くの（好ましくは二つまたはそれより多くの）マーカーおよび／または（ＩＧＥＩ）マーカーセットを検出するための試薬を含んでなる、区画化された容器を含んでなる、キットを提供する。本明細書で使用するように、キットは、その中に試薬が入れられている容器の、前もって包装されたセットとして定義される。キット中に含まれている試薬は、（ＩＧＥＩ）マーカーセット発現の検出に使用するためのプローブ／プライマーおよび／または抗体を含んでなる。加えて、本発明のキットは、好ましくは、適した検出アッセイを説明した説明書を含むことができる。そのようなキットは、癌の徴候を示している患者を診断するため、例えば、臨床設定に、便利に使用できる。
【００８０】
本発明の多様な様相が、以下の副節により詳細に説明されている。
核酸試料
当業者には明らかであるが、本発明の方法およびアッセイで使用される核酸試料は、任意の利用可能な方法およびプロセスにより製造することができる。全ｍＲＮＡを単離する方法もまた、当業者には公知である。そのような試料はｍＲＮＡを含むのみでなく、目的の細胞または組織から単離されたｍＲＮＡ試料から合成されたｃＤＮＡも含んでいる。そのような試料はまた、ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、および増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡを含んでいる。当業者は、ホモジネートが使用される前に、ホモジネート中に存在するＲＮａｓｅを阻害または破壊することが望ましいことを理解するであろう。
【００８１】
生物学的試料は、生物体からの生物学的組織または細胞、ならびに、細胞株および組織培養細胞のごときインビトロで生じた細胞であることができる。しばしば、試料は、患者に由来する試料である、“臨床試料”であろう。典型的な臨床試料には、限定されるわけではないが、痰、血液、血液−細胞（例えば、白血球）、組織またはファインニードル（ｆｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅ）バイオプシ試料、尿、腹膜液、および胸腔内液、またはそれらからの細胞が含まれる。生物学的試料にはまた、組織学的目的でとられた凍結切片またはホルマリン固定切片のごとき、組織切片も含まれる。
【００８２】
それ故、本発明の一つの様相は、本発明のマーカーに対応するポリペプチド、またはそのようなポリペプチドの一部をコードする核酸を含む、本発明のマーカーに対応する、単離された核酸分子に関する。本発明の単離された核酸分子はまた、例えば、核酸分子の増幅または突然変異のためのＰＣＲ反応プライマーとして使用するために適した、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸、およびそのような核酸分子の断片を含む、本発明のマーカーに対応する核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するために十分な核酸分子も含んでいる。本明細書で使用されるような、用語“核酸分子”とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、およびヌクレオチド類似体を使用して作られたＤＮＡおよびＲＮＡの類似体を含むことを意図している。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００８３】
“単離された”核酸分子とは、核酸分子の天然の供給源に存在する、他の核酸分子から分離されている核酸分子である。好ましくは、“単離された”核酸分子は、核酸分子が誘導された、生物体のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する配列（好ましくはタンパク質コード配列）を含んでいない（核酸の５’および３’末端に位置する配列）。
【００８４】
例えば、表１に掲げたマーカーに対応するタンパク質をコードしている核酸のような、本発明の核酸分子は、標準分子生物学技術および本明細書に説明したデータベース記録中の配列情報を使用して単離できる。そのような核酸配列のすべてまたは一部を使用し、本発明の核酸分子は、標準ハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，編，分子クローニング：実験室マニュアル，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク，１９８９，に記載されているような）を使用して単離できる。
【００８５】
本発明の核酸分子は、標準ＰＣＲ増幅技術に従い、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを、および適したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅できる。そのように増幅された核酸は、適したベクター内へクローン化でき、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けできる。その上、本発明の核酸分子のすべてまたは一部に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば、自動化ＤＮＡシンセサイザーを使用する、標準合成技術により製造できる。
【００８６】
別の好ましい態様において、本発明の単離された核酸分子は、本発明のマーカーに対応する核酸のヌクレオチド配列、または本発明のマーカーに対応するタンパク質をコードしている核酸のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する、核酸分子を含んでなる。既定のヌクレオチド配列に相補的である核酸分子とは、既定のヌクレオチド配列へハイブリダイズでき、それにより安定な二重鎖を形成する、既定のヌクレオチド配列と十分に相補的である配列である。
【００８７】
さらに、本発明の核酸分子は、核酸配列のほんの一部を含むことができ、ここで、完全長核酸配列は、本発明のマーカーを含んでなるか、またはそれは本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードしている。そのような核酸は、例えば、プローブまたはプライマーとして使用できる。プローブ／プライマーは、典型的には一つまたはそれより多くの実質的に精製されたオリゴヌクレオチドとして使用される。典型的には、オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下、本発明の核酸の少なくとも約７、好ましくは約１２またはそれより多い連続的ヌクレオチドへハイブリダイズする、ヌクレオチド配列領域を含んでなる。
【００８８】
本発明の核酸分子の配列に基づいたプローブは、本発明の一つまたはそれより多くのマーカーに対応する、転写体またはゲノム配列を検出するために使用できる。プローブは、それに結合された、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子のような標識基を含んでなる。そのようなプローブは、例えば、ｍＲＮＡレベルを検出し、またはタンパク質をコードしている遺伝子が突然変異を受けているまたは欠失されているかどうかを決定して、患者からの細胞試料中の、タンパク質をコードしている核酸分子のレベルを測定することによるように、タンパク質を発現しない、細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用できる。
【００８９】
本発明はさらに、同一のタンパク質をコードしているが、遺伝子コードの縮重のため、本発明のマーカーに対応するタンパク質をコードしている核酸のヌクレオチド配列と異なった核酸分子を包含する。
【００９０】
本明細書に記載されている、ＧｅｎＢａｎｋデータベース記録に記載されたヌクレオチド配列に加え、アミノ酸配列の変化を導くＤＮＡ配列多型が集団（例えば、ヒト集団）内に存在できることが、当業者には理解されるであろう。そのような遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異のため、集団内の個体間で存在できる。対立遺伝子は、既定の遺伝子座位で代わりになるものとして生じる、遺伝子の群の一つである。加えて、ＲＮＡ発現レベルに影響するＤＮＡ多型もまた存在可能であり、それはその遺伝子の全発現レベルに影響することができる（例えば、制御または分解に影響することにより）ことを理解されたい。
【００９１】
本明細書で使用するような、句“対立遺伝子変異体”とは、既定の座位で生じたヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドを指している。
【００９２】
本明細書で使用するような、用語“遺伝子”および“組換え遺伝子”とは、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードしている読み取り枠を含んでなる核酸分子を指している。そのような天然の対立遺伝子変異体は、典型的には、既定の遺伝子のヌクレオチド配列中に、１−５％の変異を生じてよい。代わりの対立遺伝子は、多数の異なった個体中の、目的とする遺伝子を配列決定することにより同定できる。このことは、多様な個体中の、同一遺伝子座位を同定するためのハイブリダイゼーションプローブを使用することにより、容易に実行できる。天然の対立遺伝子変異の結果であり、および機能的活性を変化させない、そのようなヌクレオチド変異体および結果としてのアミノ酸多型または変異体はひとつ残らず、本発明の範囲内にあることが意図されている。
【００９３】
別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも７、１５、２０、２５、３０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５５０、６５０、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３５００、４０００、４５００、またはそれより多いヌクレオチド長であり、ストリンジェント条件下、本発明のマーカーに対応する核酸、または本発明のマーカーに対応するタンパク質をコードしている核酸にハイブリダイズする。本明細書で使用するような、用語“ストリンジェント条件下でハイブリダイズする”とは、少なくとも６０％（６５％、７０％、好ましくは７５％）お互いに同一であるヌクレオチド配列がお互いにハイブリダイズして残るような、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を記述することが意図される。そのようなストリンジェント条件は、当業者には知られており、分子生物学における最新のプロトコール，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９８９）の節６．３．１−６．３．６にみることができる。好ましいストリンジェント条件の非制限的例は、６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５度Ｃでのハイブリダイゼーション、続いての０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる、５０−６５度Ｃでの１回またはそれより多くの洗浄である。
【００９４】
集団中に存在できる、本発明の核酸分子の天然に存在する対立遺伝子変異体に加え、当業者は、コードされているタンパク質の生物学的活性を変えることなく、コードされているタンパク質のアミノ酸配列に変化を導く配列変化が、突然変異により導入できることを、さらに認めるであろう。例えば、“非必須”アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導く、ヌクレオチド置換体を作製することができる。“非必須”アミノ酸残基とは、生物学的活性を変化させることなく、野生型配列から変化できる残基であり、一方、“必須”アミノ酸残基は生物学的活性に必要とされる。例えば、多様な種の相同体間で、保存されていないまたは半保存されているだけのアミノ酸残基は、活性には非必須といってもさしつかえなく、それ故、改変の標的となるようである。あるいは、多様な種（例えば、マウスおよびヒト）の相同体間で保存されているアミノ酸残基は、活性に必要であるといってもさしつかえなく、それ故、改変の標的とはならないようである。
【００９５】
従って、本発明の別の様相は、活性に必要とされないアミノ酸残基での変化を含む、本発明のポリペプチドをコードしている核酸分子に関する。そのようなポリペプチドは、本発明のマーカーに対応する天然に存在するタンパク質とは、アミノ酸配列が異なっているが、それでも生物学的活性は保持している。一つの態様において、そのようなタンパク質は、本発明のマーカーに対応するタンパク質の一つのアミノ酸配列と少なくとも４０％同一、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％同一である、アミノ酸配列を有する。
【００９６】
変異体タンパク質をコードしている単離された核酸分子は、コードされたタンパク質内へ一つまたはそれより多くのアミノ酸残基置換、付加または欠損が導入されるように、本発明の核酸のヌクレオチド配列内へ一つまたはそれより多くのヌクレオチド置換、付加または欠損を導入することにより創製できる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ−仲介突然変異誘発のような、標準的技術により導入できる。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、一つまたはそれより多くの推定非必須アミノ酸残基で行われる。“保存的アミノ酸置換”とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基により置換されることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。もしくは、飽和突然変異誘発によるように、突然変異をコード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入でき、生じた突然変異体は、活性を保持する突然変異体を同定するため、生物学的活性でスクリーニングできる。突然変異誘発に続いて、コードされているタンパク質は、組換え的に発現でき、そしてタンパク質の活性を決定できる。
【００９７】
本発明は、本発明のセンス核酸と相補的な、例えば、本発明のマーカーに対応する二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的な、または本発明のマーカーに対応するｍＲＮＡ配列と相補的な、分子であるアンチセンス核酸分子を包含する。従って、本発明のアンチセンス核酸は、本発明のセンス核酸へ水素結合（即ち、アニールする）できる。アンチセンス核酸は、全コード鎖と、またはその一部のみと、例えば、タンパク質コード領域（または読み取り枠）の全てまたは一部と相補的であり得る。アンチセンス核酸分子はまた、本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域の全てまたは一部とアンチセンスでもあり得る。非コード領域（“５’および３’非翻訳領域”）とは、コード領域に隣接し、およびアミノ酸へは翻訳されない５’および３’配列である。
【００９８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０、またはそれ以上のヌクレオチド長であることができる。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で知られている手順を使用する、化学合成および酵素的ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応を使用して構築できる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または、分子の生物学的安定性を増加させるように、またはアンチセンスおよびセンス核酸間で形成された二重鎖の物理学的安定性を増加させるように設計された、種々の修飾ヌクレオチドを使用して化学的に合成でき、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドヌクレオチドが使用できる。アンチセンス核酸を発生させるために使用できる修飾ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５−メトキシカルボキシ−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリンが含まれる。もしくは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向でサブクローン化されている発現ベクターを使用して、生物学的に産生できる（即ち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、目的とする標的核酸に対してアンチセンス配向であろう、以下の副節でさらに説明されている）。
【００９９】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、本発明の選択されたマーカーに対応するポリペプチドをコードしている細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡへハイブリダイズまたは結合し、それによりマーカーの発現を阻害（例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより）するように、対象に投与するか、または生体内原位置で発生させる。ハイブリダイゼーションでは、通常のヌクレオチド相補性により安定な二重鎖を形成するか、または例えば、アンチセンス核酸分子の場合は、二重らせん主溝中の特異的相互作用を通してＤＮＡ二重鎖へ結合する。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路例には、組織部位での直接注射、または卵巣関連体液内へのアンチセンス核酸の注入が含まれる。もしくは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするように修飾でき、そして次ぎに全身的に投与する。例えば、全身投与のためには、例えば、細胞表面レセプターまたは抗原へ結合するペプチドまたは抗体へアンチセンス核酸分子を連結することにより、選択された細胞表面上に発現されるレセプターまたは抗原へ特異的に結合するように、アンチセンス分子を修飾できる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載したベクターを使用して細胞へ送達できる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節下におかれている、ベクター構築物が好ましい。
【０１００】
本発明はまたリボザイムも包含している。リボザイムは、相補的領域を有する、ｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断できる、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。それ故、リボザイムはｍＲＮＡ転写体を触媒的に切断するために使用でき、それにより、ｍＲＮＡによりコードされているタンパク質の翻訳を阻害する。本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードしている核酸分子に特異性を有するリボザイムは、マーカーに対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計できる。
【０１０１】
本発明はまた、三重らせん構造を形成する核酸分子も包含する。例えば、本発明のポリペプチドの発現は、ポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的とし、標的細胞中の遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成させることにより、阻害できる。
【０１０２】
本発明はまた、ＲＮＡ干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）または“ＲＮＡｉ”の使用も包含しており、それは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を虫に導入した時、それが遺伝子発現を阻止できるという観察を説明するためにＦｉｒｅおよび共同研究者（Ｆｉｒｅら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８０６−８１１）により最初に造り出された用語である。ｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物体で、遺伝子特異的、転写後サイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を指図し、遺伝子機能研究のための新しい道具が提供された。
【０１０３】
ＲＮＡ干渉の現象は、Ｂａｓｓ，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４２８−２９（２００１）；Ｅｌｂａｓｈｉｒら，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−９８（２００１）；およびＦｉｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−１１（１９９８）に説明および議論されており、そこには、干渉ＲＮＡを作製する方法も議論されている。“ｓｉＲＮＡ”および“ＲＮＡｉ”は、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指しており、ｓｉＲＮＡが遺伝子または標的遺伝子と同じ細胞中で発現された場合、その二本鎖ＲＮＡは前記遺伝子または標的遺伝子の発現を減少させるまたは抑制する能力を持っている。それ故、“ｓｉＲＮＡ”は、相補的鎖により形成された二本鎖ＲＮＡを指している。ハイブリダイズして二本鎖分子を形成するｓｉＲＮＡの相補的部分は、典型的には、実質的なまたは完全な同一性を有している。一つの態様において、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子と実質的なまたは完全な同一性を有し、および二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する、核酸を指している。ｓｉＲＮＡの配列は、完全長標的遺伝子またはその副配列に一致することができる。典型的には、ｓｉＲＮＡは少なくとも約１５−５０ヌクレオチド長（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各々の相補的配列は１５−５０ヌクレオチド長であり、および二本鎖ｓｉＲＮＡは約１５−５０塩基対長である）、好ましくは約２０−３０塩基ヌクレオチド、好ましくは約２０−２５ヌクレオチド長、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長である。
【０１０４】
多様な態様において、本発明の核酸分子は、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解性を改良するため、塩基部分、糖部分またはホスフェート主鎖で修飾できる。例えば、核酸のデオキシリボースホスフェート主鎖は、ペプチド核酸を発生するように修飾できる。本明細書で使用されるような、用語“ペプチド核酸”または“ＰＮＡ”は、例えば、デオキシリボースホスフェート主鎖が偽ペプチド主鎖により置き換えられ、およびただ四つの天然の核酸塩基が保持されている、ＤＮＡ模倣体のような核酸模倣体を指している。ＰＮＡの中性主鎖は、低イオン強度条件下、ＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、標準固相ペプチド合成を使用して実施できる。
【０１０５】
ＰＮＡは治療および診断応用に使用できる。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写または翻訳停止または抑制性複製を導入することにより、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたはアンチジーン剤として使用できる。ＰＮＡはまた、例えば、ＲＮＡ方向付けＰＣＲクランピング（ｃｌａｍｐｉｎｇ）（他の酵素と組み合わせて使用した場合に人工制限酵素として）により、例えば、遺伝子中の単一塩基対の分析にも使用できる。
【０１０６】
他の態様において、オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的にするため）または細胞膜または血液脳障壁を横切った輸送を容易にする剤のごとき、他の追加の基を含むことができる。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション−引き金（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）切断剤またはインターカレーティング剤で修飾できる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション−引き金架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション−引き金切断剤などのような別の分子とコンジュゲートできる。
【０１０７】
本発明はまた、分子ビーコン（ｂｅａｃｏｎ）が試料中の本発明の核酸の存在を定量するために有用であるように、本発明の核酸と相補的である少なくとも一つの領域を有する、分子ビーコン核酸も含んでいる。“分子ビーコン”核酸とは、相補的領域のセットを含んでなり、およびそれらに付随する蛍光体および蛍光消光剤を有する、核酸である。蛍光体および消光剤は、相補的領域がお互いにアニール化された場合、蛍光体による蛍光が消光剤により消光されるように、核酸の異なった部分に付随している。核酸の相補的領域がお互いにアニール化されなかった場合、蛍光体による蛍光の消光の程度は少ない。
【０１０８】
マイクロアレイ
別の様相において、本発明は、図９ａおよび９ｂに示したように、本明細書で説明した方法によった標準化定量的ＲＴ−ＰＣＲに従い、ＰＣＲ生成物を標準化様式で測定するための、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたは固体支持体の使用を説明している。
【０１０９】
特定の態様において、高密度オリゴヌクレオチドアレイは以下の特性を有して作製できる。各々の遺伝子に対し、競合的鋳型（ＣＴ）および天然の鋳型（ＮＴ）の両方に特異的に結合するであろう、任意の長さのオリゴヌクレオチドをフィルター上にスポットする。適したオリゴヌクレオチドを同定するため、フォワードプライマー（ＮＴおよびＣＴの両方に共通）およびリバースプライマーの３’２０ｂｐ間の領域を評価する。高融点、好ましくは約摂氏７０度以上、を有するオリゴヌクレオチドを、図９ａの前もって選定された位置に、固体支持体へ結合させる；各々の遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドは異なったバー（白抜き、斜線をつけた、横線をつけた）で示されている。
【０１１０】
次ぎに、上に記載した方法に従って増幅したＣＴおよびＮＴ ＰＣＲ生成物をスポットへハイブリダイズする。各々の遺伝子（ＣＴおよびＮＴ）を別々に増幅する。次ぎに、上記および図９ａに図示したように、膜へのハイブリダイゼーションのためにＰＣＲ生成物をプールする。ＣＴおよびＮＴ ＰＣＲ生成物は、図９ａでは細い黒曲線として見られる。
【０１１１】
各々が異なった蛍光で標識されている、二つのオリゴヌクレオチドプローブを各々の遺伝子に対して調製する。一つのオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載した方法を使用してＰＣＲ−増幅した遺伝子のためのＮＴに特有の配列と相同的であり、それに結合するであろう。このオリゴヌクレオチドは、ＣＴと相同的ではないＮＴの領域へ結合し、および異なった蛍光で標識されているであろう。他のオリゴヌクレオチドは、ＣＴへ特異的であり、および異なった蛍光で標識されているであろう。それはリバースプライマーの３’末端に広がるＣＴ配列と相同的であり、およびそれに結合するであろう。多数の遺伝子のためのＮＴ−特異的およびＣＴ−特異的オリゴヌクレオチドを等量で混合し、フィルター上にスポットした遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドへ結合された遺伝子−特異的ＰＣＲ生成物とハイブリダイズさせる。スポットへ結合された蛍光間の比から、ＣＴに対するＮＴの量を数量化できるであろう。蛍光タグ付けプローブ（黒く影付けした）はＮＴに特異的であり、および蛍光タグ付けプローブ（影付けしていない）はＮＴに特異的である。
【０１１２】
このアッセイにおいて、ＮＴおよびＮＴプローブ間の結合親和性と比較して、ＣＴおよびＣＴプローブ間には異なった結合親和性があるけれども、この相違は判定された異なった試料間、および一つの実験と別の実験間では一致しているであろう。
【０１１３】
この方法はまた、例えば、マイクロビーズ、ガラススライド、または光リソグラフィーにより製造されたチップを含む、他の固相ハイブリダイゼーション鋳型でも働く。たとえどんな鋳型を使用しても、競合鋳型の標準混合物を使用した標準化ＲＴ−ＰＣＲの生成物が、マイクロビーズ遺伝子の特異性を、マイクロアレイ上の位置ではなく、ビーズの蛍光色により与えている図９ｂのマイクロビーズで示されているように、出発点であろう。
【０１１４】
シスプラチン
以下に示された例は、シス−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）、さもなくばシスプラチンとして知られている、および関連化合物に関する。シスプラチンは、関連化合物のファミリーであると当該分野で認められている、白金配位錯体のファミリー内の化学化合物である。シスプラチンは、抗悪性腫瘍特性を有することが示された最初の白金化合物である。術語“白金化合物”は、シスプラチン、シスプラチンと構造的に類似している化合物、ならびに、シスプラチンの類似体および誘導体を含むことが意図されている。術語“白金化合物”はまた、“模倣物”も含んでいる。“模倣物”は、シスプラチンと構造的に類似していなくても、インビボでシスプラチンまたは構造的に関連した化合物の治療活性を模倣する化合物を含むことも意図される。
【０１１５】
本発明の白金化合物は、対象（患者）における腫瘍増殖を抑制するために有用である化合物である。１０００以上の白金含有化合物が合成されており、そして治療特性が試験されている。これらの内の一つ、カルボプラチンは卵巣癌の処置に承認されている。シスプラチンおよびカルボプラチンの両者とも静脈内送達に敏感に反応する。しかしながら、本発明の化合物は、かなり多数の戦略により、治療的送達のために処方できる。用語白金化合物はまた、医薬として受容可能な塩および関連化合物を含むことも意図されている。白金化合物は以前に、米国特許第６，００１，８１７、５，９４５，１２２、５，９４２，３８９、５，９２２，６８９、５，９０２，６１０、５，８６６，６１７、５，８４９，７９０、５，８２４，３４６、５，６１６，６１３および５，５７８，５７１号に記載されており、それら全てが特に本明細書において援用される。
【０１１６】
シスプラチンおよび関連化合物は、拡散により細胞内へ入ると考えられており、そこで分子は代謝的処理を受けるようであり、薬剤の活性代謝物を生じ、それが次ぎに核酸およびタンパク質と反応する。シスプラチンは、二機能性アルキル化剤の生化学的特性と類似のものを有しており、ＤＮＡと架橋した鎖間、鎖内および一機能性付加物を産生する。
【０１１７】
データベース
本発明は、例えば、表１および５の遺伝子のための配列情報、ならびに多様な肺組織試料における遺伝子発現情報を含む、リレーショナル数的標準化データベースを含む。データベースはまた、配列情報に関連した遺伝子についての記述的情報、または組織試料の臨床的状態または試料が誘導された患者に関する記述的情報のごとき、既定の配列または組織試料に関連する情報も含んでいる。データベースは、例えば、配列データベースおよび遺伝子発現データベースのような異なった部分を含むように設計することができるそのようなデータベースの構造および構築のための方法は、広く入手可能である。
【０１１８】
本発明の数的標準化データベースは、外側または外部データベースとリンクすることができる。好ましい態様において、表１−５に記載されているように、外部データベースはＧｅｎＢａｎｋおよびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）により維持されている関連データベースである。
【０１１９】
配列情報、遺伝子発現情報およびデータベース内または入力として提供されている他の情報間の必要な比較を実施するため、任意の適したコンピュータープラットフォームを使用することができる。例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ、Ｃｌｉｅｎｔ−ｓｅｒｖｅｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓから入手可能なように、多数のコンピューターワークステーションが多様な製造業者から入手可能であり、データベースサーバーおよびネットワークもまた、広く入手可能であり、および本発明のデータベースのために適したプラットフォームも入手可能である。
【０１２０】
本発明の標準化数的データのデータベースは、中でも、既定の遺伝子が発現された細胞型または組織をユーザーが決定することを可能にし、および特定の組織または細胞中の、既定の遺伝子の存在または発現レベルを可能にする、電子ノーザン（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）を作るために使用することができる。
【０１２１】
本発明のデータベースはまた、組織中の表１−５の少なくとも一つの遺伝子の発現レベルとデータベース中の少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを比較する工程を含んでなる、表１−５の少なくとも一つの遺伝子を含んでなる遺伝のセットの組織または細胞での発現レベルを同定する情報を提出するためにも使用することができる。そのような方法は、試料からの、表１−５の遺伝子または遺伝子類の発現レベルと、正常肺、悪性肺またはＮＳＣＬＣからの組織で観察された発現レベルを比較することにより、既定の組織の生理学的状態を予測するために使用することができる。
【０１２２】
コンピューターシステム
別の様相において、本発明は、（ａ）表１−５の少なくとも二つの遺伝子またはｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−ａ／ｐ２１を含んでなる、遺伝子のセットの肺組織における発現レベルを同定する、標準化数的遺伝子発現情報を含んでいるデータベース；および（ｂ）情報を見るためのユーザーインターフェイス、を含んでなるコンピューターシステムに関する。データベースはさらに、一つまたはそれより多くの下記のものを含むことができる：遺伝子の配列情報；正常肺組織における遺伝子のセットの発現レベルを同定する情報；非小細胞癌組織における遺伝子のセットの発現レベルを同定する情報；外部データベースからの記述的情報を含んでいる記録、その情報は前記遺伝子と外部データベース中の記録を関連付けている；例えば、外部データベースがＧｅｎＢａｎｋの場合を含んで、および細胞または組織または患者に由来する情報または特別な特性。
【０１２３】
別の様相において、本発明は、組織または細胞中の表１および５の少なくとも一つの遺伝子の発現レベルとデータベース中の遺伝子の発現レベルを比較することにより、表１および５の少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを同定する情報を提供するため、上記のコンピューターシステムを使用する方法に関する。特定の態様において、少なくとも２、５、７および／または１０の遺伝子が比較される。
【０１２４】
さらに別の様相において、本方法は、肺癌における発現レベルと比較された、組織または細胞試料中の、少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを示すことを含んでいる。
キット
本発明はさらに、高密度オリゴヌクレオチドアレイ、マイクロアレイで使用するための試薬、遺伝子特異的プライマーおよび内部標準の標準化混合物を含む、特定された遺伝子のＳｔａＲＴ−ＰＣＲのための試薬、信号検出およびアレイプロセッシング装置、遺伝子発現データベース、および上記の分析およびデータベース管理ソフトウェア、の少なくとも一つを、異なった組合わせで、併用しているキットを含んでいる。本キットは、例えば、試験化合物の毒性応答を予測するまたはモデル化するために、疾患状態の進行をモニターするために、新規薬剤標的としての見込みを示す遺伝子を同定するために、および本明細書に議論されたような既知のおよび新規に設計された薬剤をスクリーニングするために使用することができる。
【０１２５】
特定の態様において、本キットは、前記遺伝子の遺伝子発現情報とひとまとめにされた、本明細書に記載したような少なくとも一つの固体支持体を含んでいる。特定の態様において、遺伝子発現情報は、毒素に暴露された組織または細胞試料中の遺伝子発現レベルを含んでなる。また特定の態様において、遺伝子発現情報は、例えば、本明細書に記載した標準化遺伝子発現データベースを含んでいる、電子フォーマットの形である。キットにひとまとめにされたデータベースは、ヒトまたは実験動物遺伝子および遺伝子断片（表１および５の遺伝子に対応している）からの発現パターンの編集物である。データは正常および疾患両方の組織の宝庫（ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）から集められており、再現可能で、定量的結果（即ち、既定の条件下で遺伝子が上方制御されたかまたは下方制御されたかの程度で）を提供する。
【０１２６】
キットは、薬剤開発に関連する高い費用のため、早い薬剤試験が強く必要とされている、しかしバイオインフォマティックス、特に遺伝子発現インフォマティックスが未だ欠けている、製薬工業で有用である。これらのキットは、細胞培養および実験動物を使用する伝統的な新規薬剤スクリーニングに関連する、費用、時間および危険性を減少させる。前もって群分けした患者集団の大規模薬剤スクリーニング、薬理ゲノミクス試験の結果はまた、より大きな効力およびより少ない副作用を有する薬剤を選択するためにも応用できる。本キットはまた、そのような大規模試験を行うための施設をそれ自身では有していない、より小さなバイオテクノロジー企業および研究所でも使用することができる。
【０１２７】
マイクロアレイで使用するために設計されたデータベースおよびソフトウェアは、Ｂａｌａｂａｎら、米国特許第６，２２９，９１１号、少量または大量のマイクロアレイから集められ、索引を付けた表として保存された情報を管理するためのコンピューター実行法、および米国特許第６，１８５，５６１号、多様な疑問に対する答えを出すためにデータに追加の属性を付加しおよび再配列する、遺伝子発現レベルデータを集めるためのデータ発掘能力を有する、コンピューターに基づく方法、に議論されている。Ｃｈｅｅｅｔら、米国特許第５，９７４，１６４号は、基準配列へハイブリダイズした、野生型および突然変異体配列間の、プローブ蛍光強度の相違に基づいた、核酸配列中の突然変異を同定するための、ソフトウェアに基づいた方法を開示している。
【０１２８】
治療的および薬剤スクリーニング標的のアッセイおよび同定
特定の態様において、本明細書に記載したような、特に、図９ａおよびｂに示された例に関する、マイクロアレイは特に有用であることを理解しなければならない。しかしながら、特定の他の態様において、溶液に基づいた、および固体支持体に基づいたアッセイ形式を含む、他のハイブリダイゼーションアッセイ形式を使用することができることもまた理解しなければならない。本発明の差別的に発現された遺伝子のためのオリゴヌクレオチドプローブ含有固体支持体は、フィルター、ポリビニルクロリド皿、シリコンまたはガラスチップなどであることができる。そのようなウェハースおよびハイブリダイゼーション法は広く入手可能である。直接的または間接的に、共有結合的にまたは非共有結合的にオリゴヌクレオチドを結合できる固体表面が使用できる。固体支持体の例には、高密度アレイまたはＤＮＡチップが含まれる。これらは、アレイ上の前もって決められた位置に特定のオリゴヌクレオチドプローブを含んでいる。各々の前もって決められた位置は、一つまたはそれより多くのプローブの分子を含むことができるが、前もって決められた位置内の各々の分子は同一配列を有している。そのような前もって決められた位置はフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）と名付けられた。例えば、一つの固体支持体上に、約２、１０、１００、１０００から１０，０００；１００，０００または４００，０００のそのようなフィーチャーが存在することができる。固体支持体またはその中のプローブが結合されている領域はおよそ平方センチメートル程度であることができる。
【０１２９】
発現モニタリングのためのオリゴヌクレオチドプローブアレイは、当該技術分野で知られている任意の技術に従って、作製および使用できる。そのようなプローブアレイは、本明細書に記載した、二つまたはそれより多くの遺伝子と相補的である、もしくはハイブリダイズする少なくとも二つまたはそれより多くのオリゴヌクレオチドを含むことができる。そのようなアレイはまた、本明細書に記載した、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、７０、１００またはそれより多くの遺伝子と相補的である、もしくはハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも含むことができる。
【０１３０】
最小数の合成工程でオリゴヌクレオチドの高密度アレイを形成する方法が知られている。オリゴヌクレオチド類似物アレイは、限定されるわけではないが、光指向性化学カップリング、機械的指向性カップリングを含む多様な方法により固体支持体上に合成できる。簡単には、ガラス表面でのオリゴヌクレオチドアレイの光指向性コンビナトリアル合成は、自動化ホスホロアミデート化学およびチップマスキング技術を使用して行われる。一つの具体的実行において、ガラス表面を官能基、例えば、感光性保護基によりブロックされたヒドロキシルまたはアミノ基を含んでいるシラン試薬で誘導体化する。光リソグラフィーマスクを通した光分解を、官能基を選択的に暴露するために使用すると、それらは到来する５’光保護ヌクレオシドホスホロアミデートと反応する調製ができている。ホスホロアミデートは、照射された部位（このように、感光性保護基の除去により暴露された）でのみ反応する。従って、ホスホロアミデートは、前工程で選択的に暴露された領域にのみ付加する。これらの工程を、固体表面上に配列の所望のアレイが合成されるまで繰り返す。アレイ上の異なった位置での、異なったオリゴヌクレオチド類似体のコンビナトリアル合成は、合成間の照射のパターンおよびカップリング試薬の添加の順序により決定される。
【０１３１】
前記のものに加え、単一基質上にオリゴヌクレオチドのアレイを発生させるため、追加の方法が使用できる。高密度核酸アレイはまた、あらかじめ決定された位置に、あらかじめ作製されたまたは天然核酸を沈着させることによっても製作できる。合成または天然核酸は、光指向性標的化およびオリゴヌクレオチド指向性標的化により、基質の特定の位置に沈着できる。別の態様は、特定のスポットに核酸を沈着するため、領域から領域へ移動する分配器を使用する。
【０１３２】
ＩＧＥＩの決定
既定の薬剤への感受性が知られていない癌性細胞の試料は、患者から得られる。（ＩＧＥＩ）マーカーセットとして、本明細書に特許請求されたヌクレオチド配列の一つに対応する遺伝子について、試料中の発現レベルを測定する。試料中のマーカーの発現レベルを、既知の薬剤感受性を有する細胞において以前に測定されたマーカーの発現レベルと比較する。もし、試料中のマーカーの発現レベルが、既定の薬剤に対して低い感受性を有する細胞中のマーカーの発現レベルとほとんど同様であれば、その薬剤に対する低い感受性がその試料に対して予測される。もし、試料中のマーカーの発現レベルが、既定の薬剤に対して中程度の感受性を有する細胞中のマーカーの発現レベルとほとんど同様であれば、その薬剤に対する中程度の感受性がその試料に対して予測される。もし、試料中のマーカーの発現レベルが、既定の薬剤に対して高い感受性を有する細胞中のマーカーの発現レベルとほとんど同様であれば、その薬剤に対する高い感受性がその試料に対して予測される。
【０１３３】
それ故、癌細胞の試料中の、一つまたはそれより多くの同定されたマーカーの発現を試験することにより、適した処置剤として使用するためには、どの治療剤（類）または剤の組合わせかを決定することが可能である。
【０１３４】
治療的処置の過程の間、患者からとられた癌細胞の試料における、一つまたはそれより多くの同定されたマーカーの発現を試験することにより、治療剤が引き続いて働いているかどうか、または、癌が処置プロトコールに対して抵抗性（不応）になったかどうかを決定することが可能である。これらの決定は、患者ごとの基準で、または剤ごと（または剤の混み合わせ）に行うことができる。それ故、特定の治療処置が特定の患者または患者の群／クラスのためになっているらしいかどうか、または特定の処置をつづけるかどうか、を決定することができる。
【０１３５】
同定された（ＩＧＥＩ）マーカーセットはさらに、化学療法用化合物のごとき、抗癌剤の開発のための、以前には未知のまたは認識されていない標的を提供し、そして癌処置のための単一剤処置ならびに剤の組合わせの開発における標的として使用できる。
【実施例】
【０１３６】
実施例
当業者は、本発明の剤の構造的性質については制限がないことを容易に認識できる。そのようであるので、さらなる説明なしに、前述の説明および以下の例示的実施例を使用して、当業者は、本発明の化合物を作製および利用でき、および特許請求された方法を実施できると信じられる。ゆえに、以下の作業実施例は、本発明の好ましい態様を特別に指摘しており、開示の残りをいかなる点でも制限していると解釈すべきではない。
【０１３７】
一つの態様において、シスプラチンに対する感受性の既に決定された範囲を有する、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株のセットにおける多様な多薬剤耐性遺伝子を判定するため、標準化ＲＴ（ＳｔａＲＴ）−ＰＣＲが用いられた。データは１０６β−アクチン（ＡＣＴＢ）分子と相対的な標的遺伝子分子の形で得られた。異なった細胞株間のＡＣＴＢ相違の影響を打ち消すため、個々の遺伝子発現値を、別の遺伝子に対する一つの遺伝子の比の中に組み込んだ。各々の２−遺伝子比を、多重回帰を使用して、８つのＮＳＣＬＣ細胞株の各々の化学耐性に対して、１変数として比較した。バリデーション（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）後、化学耐性と最も相関した１変数モデル（ｐ＜０．００１）を決定した。特定の態様において、変数モデルは：ＥＲＣＣ２／ＸＰＣ、ＡＢＣＣ５／ＧＴＦ２Ｈ２、ＥＲＣＣ２／ＧＴＦ２Ｈ２、ＸＰＡ／ＸＰＣおよびＸＲＣＣ１／ＸＰＣ、を含んでいた。すべての１変数モデルを、２変数モデルに達するように序列的に試験した。最も高い相関を有する２変数モデルは（ＡＢＣＣ５／ＧＴＦ２Ｈ２、ＥＲＣＣ２／ＧＴＦ２Ｈ２）であり、０．９６のＲ２値であった（ｐ＜０．００１）。特定の態様において、これらのマーカーは、シスプラチン耐性腫瘍の将来を見越して同定するための、ファインニードル吸引バイオプシのような、組織の少量試料の判定に適している。
【０１３８】
ＳｔａＲＴ−ＰＣＲは、２０のＮＳＣＬＣ細胞株間で、最も低い（Ｈ４６０）および最も高い（Ｈ１４３５）化学耐性であると以前に報告されている二つの細胞株における、ＤＮＡ修復、多薬剤耐性、細胞周期およびアポトーシスに関与している３５の遺伝子の発現を測定するために使用する、Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｚａｈｏｒｃｈａｋ，Ｒ．，Ｖａｒｎａｖａｓ，Ｌ．，Ｃａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，カルボプラチンに対して変動した感受性を有する肺癌細胞株における、マイクロアレイおよび標準化ＲＴ−ＰＣＲ分析による発現パターンの比較，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１（抄録）４２，６０６。Ｔｓａｉ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｈａｎｇ，Ｋ．Ｔ．，Ｗｕ，Ｌ．Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｙ．，Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｍｉｔｓｕｄｏｎｉ，Ｔ．，Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｐｅｒｎｇ，Ｒ．Ｐ．，非小細胞肺癌細胞株における、固有の化学耐性とＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子発現、ｐ５３突然変異および細胞増殖特性間の相関、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９６），５６，２０６−１０９。ＤＮＡ修復（ＥＲＣＣ２，ＸＲＣＣ１）および薬剤流入／流出（ＡＢＣＣ５）に関与する遺伝子が、化学耐性と関連している。これら二つのカテゴリーの各々からの遺伝子数を、総合されたＤＮＡ損傷認識および修復に関連する（ＤＤＩＴ３）、特にＮＥＲに関連する（ＬＩＧ１、ＥＲＣＣ３、ＧＴＦ２Ｈ２、ＸＰＡ、ＸＰＣ）、または薬剤輸送に関連する（ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＣ１０）、追加の代表的遺伝子を含むように拡大した。これら１２の遺伝子の発現を、変動したシスプラチン耐性を有する８つのＮＳＣＬＣ細胞株で測定した。Ｔｓａｉ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｈａｎｇ，Ｋ．Ｔ．，Ｗｕ，Ｌ．Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｙ．，Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｍｉｔｓｕｄｏｎｉ，Ｔ．，Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｐｅｒｎｇ，Ｒ．Ｐ．，非小細胞肺癌細胞株における、固有の化学耐性とＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子発現、ｐ５３突然変異および細胞増殖特性間の相関、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９６），５６，２０６−１０９。ＳｔａＲＴ−ＰＣＲデータは、基準遺伝子としてＡＣＴＢを使用して得られた。それ故、データはｍＲＮＡ分子／１０６ ＡＣＴＢ分子の形で報告されている。これらのデータは、Ｗｉｌｌｅｙ 米国特許第５，６３９，６０６、５，６４３，７６５および５，８７６，９７８号、Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７、ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｄｕｒｚｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｚａｈｅｒ，Ａ．，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｅ．Ｒ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，遺伝子発現指標ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ１／ｐ２１はヒト気管支上皮細胞における悪性表現型を高度に予知するものである，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９８），１９，１８−２４、に記載されている定量的逆転写酵素−ＰＣＲ法を使用し、表現型に直接関係する一つまたはそれより多くの遺伝子を分子に置き、および表現型に否定的に関係する一つまたはそれより多くの遺伝子を分母に置くことにより相互的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）内へ結合させた。ＩＧＥＩは、特定の癌表現型に対して、個々の遺伝子の発現レベルよりもより良好に表現型を予知するものである。Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７。ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｄｕｒｚｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｚａｈｅｒ，Ａ．，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｅ．Ｒ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，遺伝子発現指標ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ１／ｐ２１はヒト気管支上皮細胞における悪性表現型を高度に予知するものである，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９８），１９，１８−２４。Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．，Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｆｅｒｅｎｃａｋ，Ｗ．Ｊ．，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｃ．Ａ．，Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，グルタチオントランスフェラーゼＰ１、グルタチオントランスフェラーゼＭ３、およびグルタチオンペルオキシダーゼの正常気管支上皮細胞発現は、気管支原性癌を患った患者においては低い，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０００），６０，１６０９−１６１８。Ｒｏｔｓ，Ｊ．Ｇ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｊａｎｓｅｎ，Ｇ．，Ｖａｎ Ｚａｎｔｗｉｊｋ，Ｃ．Ｈ．，Ｎｏｏｒｄｈｕｉｓ，Ｐ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｋｕｉｐｅｒ，Ｅ．，Ｖｅｒｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ｐｉｅｔｅｒｓ，Ｒ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｇ．Ｊ．，標準化競合鋳型に基づいたＲＴ−ＰＣＲ法により決定した、小児期白血病におけるメトトレキセート耐性−関連タンパク質のｍＲＮＡ発現レベル，Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０００），１４，２１６６−２１７５。ＩＧＥＩのさらなる利点は、一つの細胞株と別の細胞株間での、基準遺伝子値（この場合ＡＣＴＢ）において以前に観察されている変動をＩＧＥＩが調節することである。Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７。ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｄｕｒｚｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｚａｈｅｒ，Ａ．，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｅ．Ｒ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，遺伝子発現指標ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ１／ｐ２１はヒト気管支上皮細胞における悪性表現型を高度に予知するものである，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９８），１９，１８−２４。分子の１遺伝子が、分母の別の１遺伝子で割られた場合、基準値は数学的に相殺される。ＩＧＥＩ値を、変動した耐性を有する８つのＮＳＣＬＣ細胞株間で、シスプラチン化学耐性を比較した。結果は次ぎに、追加の６つのＮＳＣＬＣ細胞株で確認した。
【０１３９】
実施例１
材料および方法
細胞培養
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）細胞株Ｈ４６０、Ｈ１１５５、Ｈ２３、Ｈ８３８、Ｈ１３３４、Ｈ１４３７、Ｈ１３５５、Ｈ１４３５、Ｈ３５８、Ｈ３２２、Ｈ４４１、Ｈ５２２、Ｈ２２６およびＨ６４７はアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックビル，ＭＤ）から入手した。全ての細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１ｍＭグルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｉｎｃ．，ロックビル，ＭＤ）中、５％ＣＯ２存在下、３７℃でインキュベートした。増殖性の、サブコンフルエント培養物を、ＲＮＡ抽出および続いての分析に使用した。
【０１４０】
試薬
Ｒａｐｉｄｃｙｃｌｅｒのための１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭトリス，ｐＨ８．３；２．５ｍｇ／μｌ ＢＳＡ；３０ｍＭ ＭｇＣｌ２）は、Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（アイダホフォールズ，ＩＤ）から入手した。Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、オリゴｄＴプライマー、ＲＮａｓｉｎ（２５Ｕ／μｌ）およびｄＮＴＰはＰｒｏｍｅｇａ（マディソン，ＷＩ）から入手した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）および５Ｘ第一鎖緩衝液（２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．３；３７５ｍＭ ＫＣｌ； １５ｍＭ ＭｇＣｌ２；５０ｍＭ ＤＴＴ）はＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（ゲイサーブルグ，ＭＤ）から入手した。色素、マトリックスおよび基準物質を含んでいるＤＮＡ ７５００アッセイキットはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（パロアルト，ＣＡ）から入手した。全ての他の化学薬品および試薬は、分子生物学用であった。
【０１４１】
ＲＮＡ抽出および逆転写
全ＲＮＡは、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔプロトコール（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，シンシナチ，ＯＨ）により、細胞培養物から単離した。Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．，細胞および組織試料からのＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質の一工程同時単離のための試薬，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９３），１５，５３６−５３７。抽出に続いて、各々の細胞株について約１μｇの全ＲＮＡを、Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｏｙ，Ｅ．，Ｂｒｏｌｌｙ，Ｃ．，Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．，Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ，Ｊ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．，Ｃａｉｒｎｓ，Ｋ．，ヒト上皮および肺胞マクロファージ細胞における生体異物代謝酵素遺伝子発現，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９６），１４，２６２−２７１、において以前に記載されているように、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマーを使用して逆転写した。
【０１４２】
定量的標準化ＲＴ（ＳｔａＲＴ）−ＰＣＲ
遺伝子発現を、米国特許第５，６３９，６０６；５，６４３，７６５；および５，８７６，９７８号、およびＷｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７、Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｏｙ，Ｅ．，Ｂｒｏｌｌｙ，Ｃ．，Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．，Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ，Ｊ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．，Ｃａｉｒｎｓ，Ｋ．，ヒト上皮および肺胞マクロファージ細胞における生体異物代謝酵素遺伝子発現，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９６），１４，２６２−２７１、Ａｐｏｓｔｏｌａｋｏｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｃｈｕｅｒｍａｎｎ，Ｗ．Ｈ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．，Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，多発性競合的ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子発現の測定，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９３），２１３，２７７−２８４．Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｏｙ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．，Ｔｏｒｒｅｓ，Ａ．，Ａｐｏｓｔｏｌａｋｏｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｏｅｈｎ，Ｇ．，Ｓｃｈｕｅｒｍａｎｎ，Ｗ．Ｈ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．，Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ，Ｊ．，Ｃｒｅｐｓｉ，Ｃ．Ｌ．Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．，喫煙者および非喫煙者の肺細胞における、チトクロームｐ４ａ５０ １Ａ１，１Ｂ１，および２Ｂ７、ミクロソームエポキシド加水分解酵素およびＮＡＤＰＨ酸化還元酵素発現の、定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）１７，１１４−１２４に記載されている定量的ＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロトコールを使用して決定した。簡単には、緩衝液、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、試料ｃＤＮＡ、Ｔａｑポリメラーゼおよび競合的鋳型（ＣＴ）混合物を含んでいるマスター混合物を調製し、その９μｌずつを、１μｌの遺伝子特異的プライマーを含んでいる０．６ｍｌの微量遠心管内へ分配した。ＣＴ混合物は、お互いに関して決められた濃度での遺伝子特異的内部標準競合的鋳型（ＣＴ）を、およびまた、すべての特異的遺伝子データの規格化を可能にする、ハウスキーピング遺伝子（ＡＣＴＢ）のためのＣＴも含んでいる。ＰＣＴのために使用されたすべてのプライマー、およびＣＴの構築に使用されたプライマーは、表１に掲げられている。ＰＣＲ反応は、Ｒａｐｉｄｃｙｃｌｅｒ（Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）中、９４℃での変性を５秒、５８℃でのアニーリングを１０秒、および７２℃での伸長を１５秒、のＰＣＲを３５サイクル行った。ＰＣＲ生成物は電気泳動で分離し、ＤＮＡ ７５００アッセイキットを用い、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で定量した。
【０１４３】
ＮＳＣＬＣ細胞株の化学耐性
いくつかの化学療法剤に対して使用されたＮＳＣＬＣ細胞株の化学耐性ＩＣ５０（μＭ）値は、Ｔｓａｉ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｈａｎｇ，Ｋ．Ｔ．，Ｗｕ，Ｌ．Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｙ．，Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｍｉｔｓｕｄｏｎｉ，Ｔ．，Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｐｅｒｎｇ，Ｒ．Ｐ．，非小細胞肺癌細胞株における、固有の化学耐性とＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子発現、ｐ５３突然変異および細胞増殖特性間の相関、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９６），５６，２０６−１０９、に記載されているように以前に決定されており、表２でシスプラチンについて要約されている。
【０１４４】
統計分析
最初の８ＮＳＣＬＣ細胞株の各々からの、別の遺伝子に対した一つの遺伝子の比を、シスプラチン耐性を最もよく予測する遺伝子の組合わせを決定するため、ＳＡＳ（バージョン６，第４版、第２巻）統計パッケージ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．，キャリー，ＮＣ）による多重回帰分析にかけた。各々の比を別々に化学耐性と比較し、次ぎに最も高いＲ２値に基づいた２変数モデルを達成するため、耐性に有意な相関（Ｒ２≧０．８８、ｐ＜０．００１）を有する比を序列的に試験した。追加の６細胞株の判定後、１４すべてのＮＳＣＬＣ細胞株の結果を合併し、説明したような分析にかけた。
【０１４５】
結果：再現性
三つまたはそれより多くの反復値が得られた、遺伝子発現測定間では、平均変動係数は３８．５％であった（生データはウェブサイトで入手可能）。これは、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲ法を使用した他の遺伝子発現研究で観察された再現性と同等である。Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７、Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．，Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｆｅｒｅｎｃａｋ，Ｗ．Ｊ．，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｃ．Ａ．，Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，グルタチオントランスフェラーゼＰ１、グルタチオントランスフェラーゼＭ３、およびグルタチオンペルオキシダーゼの正常気管支上皮細胞発現は、気管支原性癌を患った患者では低い，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０００），６０，１６０９−１６１８。
【０１４６】
個々の遺伝子発現測定および化学耐性
８細胞株についての、個々の遺伝子発現平均値対シスプラチン化学耐性の直接比較の結果が表３に示されている。すべてのＳｔａＲＴ−ＰＣＲデータ値は、分子／１０６ＡＣＴＢ分子の形で示されている。判定された遺伝子の８／１２に対して、有意な（ｐ＜０．０５）相関が存在した。
【０１４７】
相互作用的遺伝子発現比の確立
最初の８ＮＳＣＬＣ細胞株（グループ１）から得られたデータについて、一つの遺伝子の発現値を別の遺伝子の発現値で割る、全ての可能な組合わせを含んでなるＩＧＥＩを確立した。各々の発現値は、分子／１０６ＡＣＴＢ分子として計算した。それ故、これらのＩＧＥＩにおいて、基準遺伝子（ＡＣＴＢ）の影響は打ち消されている。例えば、
ＥＲＣＣ２分子／１０６ＡＣＴＢ分子÷ＸＰＣ分子／１０６ＡＣＴＢ分子＝
ＥＲＣＣ２分子／ＸＰＣ分子。
【０１４８】
各々の２遺伝子対対応するシスプラチンＩＣ５０化学耐性値の二変量分析を８細胞株間で実施した（表４）。判定される遺伝子が１２で、各々の遺伝子について１１のセットがあるため、１３２の比を生じる。各々の遺伝子に対する１１の比のセットを、最初にリストに掲げられた比のセットが、化学耐性との平均相関が最も高く、および最後にリストに掲げられた比セットが、化学耐性との平均相関が最も低くなるように、降順に組織的構成した。それ故、ＥＲＣＣ２と他の１１遺伝子の各々との間の比が、評価された１２の遺伝子間で最も明確であったので、分子にＥＲＣＣ２を有する比セットが最初にリストに掲げられた。対照的に、ＸＰＣと他の１１遺伝子の各々との間の比は、化学耐性とは最も否定的な相関を有していたので、分子にＸＰＣを有する比セットは最後にリストに掲げられた。
【０１４９】
化学耐性を有する遺伝子発現のモデル化
比、ＥＲＣＣ２／ＸＰＣ、ＡＢＣＣ５／ＧＴＦ２Ｈ２、ＥＲＣＣ２／ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ２／ＧＴＦ２Ｈ２、ＸＰＡ／ＸＰＣ、ＸＲＣＣ１／ＸＰＣおよびＡＢＣＣ５／ＸＰＣは、単純線形回帰により、最初の８ＮＳＣＬＣ細胞株中で同定された、最良の１変数モデル（即ち、それらはＲ２＞０．８７）であった（表５）。モデルへ第二の変数を加えた影響を次ぎに判定した。最良の２変数モデルは、０．９６のをＲ２を有する（ＡＢＣＣ５／ＧＴＦ２Ｈ２、ＥＲＣＣ２／ＧＴＦ２Ｈ２）であった。
【０１５０】
モデルのバリデーション
これらの１および２変数モデルを、追加の６ＮＳＣＬＣ細胞株で試験した。１４すべてのＮＳＣＬＣ細胞株について合併したデータの統計分析から、三つの一変数モデル（ＥＲＣＣ２／ＸＰＣ、ＡＢＣＣ５／ＧＴＦ２Ｈ２、ＸＲＣＣ１／ＸＰＣ）、ならびに二変数モデルについてはｐ値が改良され、またはそのままであった。ＥＲＣＣ２／ＧＴＦ２Ｈ２およびＸＰＡ／ＸＰＣに対するｐ値の下落は小さく、そして有意ではなかった。対照的に、ＥＲＣＣ２／ＸＲＣＣ１は化学耐性に関係してもはや有意ではなく、およびＡＢＣＣ５／ＸＰＣに対してはｐ値が著しく下落した。
【０１５１】
結果の分析
個々の遺伝子に対する値をＩＧＥＩ内に取り込み、そしてＩＧＥＩを化学耐性と相関付ける、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲで遺伝子発現を測定することにより得られた結果は、培養ＮＳＣＬＣ細胞におけるシスプラチン化学耐性を予言するものとして有用な、いくつかのモデルを提供する。これらのモデルは、ＡＢＣＣ５、ＥＲＣＣ２、ＸＰＡおよびＸＲＣＣ１を含んでいる、シスプラチン化学耐性に関係する遺伝子を含んでなる。ＭＲＰ５としても知られているＡＢＣＣ５の増加した発現は、インビボでの肺癌における白金薬剤への暴露、および／または生体異物への慢性薬剤応答に関係している。それ故、増加したＡＢＣＣ５レベルを伴う、白金薬剤に対して増加した耐性は、グルタチオン Ｓ−白金複合体流入によるものであろう。
【０１５２】
化学耐性に直接関係する残りの遺伝子、ＸＰＡおよびＥＲＣＣ２は、シスプラチンのごとき化学療法剤により誘導されるＤＮＡ損傷に応答する主修復応答であると一般的に認識されている、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）機構の成分である。ＮＥＲにおいて、ＸＰＡは主ＤＮＡ破壊認識タンパク質であり（Ａｓａｈｉｎａ，Ｈ．，Ｋｕｒａｏｋａ，Ｉ．，Ｓｈｉｒａｋａｗａ，Ｍ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｅ．Ｈ．，Ｍｉｕｒａ，Ｎ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｅ．，Ｏｋａｄａ，Ｙ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，ＸＰＡタンパク質は多様な種類のＤＮＡ損傷を認識する能力を有する亜鉛金属タンパク質である，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（１９９４），３１５，２２９−２３７）、および破壊部位へいくつかの他のタンパク質を動員することにより、ＮＥＲ複合体の組み立ての鍵となる要素である、Ｌｉ，Ｌ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ａ．，Ｌｕ，Ｘ．，Ｌｅｇｅｒｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，ＥＲＣＣ１の会合を妨げるＸＰＡ中の突然変異は、ヌクレオチド除去修復における欠陥を生じさせる，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９９５），１５，１９９３−１９９８。促進されたＮＥＲ遺伝子発現は、シスプラチンおよび他のＤＮＡ損傷化学療法剤に対する耐性の主な原因であることが示されており（Ｚａｍｂｌｅ，Ｄ．Ｂ．，Ｌｉｐｐａｒｄ，Ｓ．Ｊ．，癌化学療法におけるシスプラチンおよびＤＮＡ修復，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（１９９５），２０，４３５−４３９、Ｒｅｅｄ，Ｅ．，抗癌薬剤：白金類似体、癌：腫瘍学の原理および実際、中、（１９９３），３９０−３９９，編集者Ｖ．Ｔ．Ｄｅｖｉｔａ Ｊｒ．，Ｓ．ＨｅｌｌｍａｎおよびＳ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，リッピンコット，フィラデルフィア）、およびＮＥＲのＸＰＡ遺伝子成分の過剰発現は、ヒト卵巣癌におけるシスプラチンへの耐性に関係していた。Ｄａｂｈｏｌｋａｒ，Ｍ．，Ｖｉｏｎｎｅｔ，Ｊ．，Ｂｏｓｔｉｃｋ−Ｂｒｕｔｏｎ，Ｆ．，Ｙｕ，Ｊ．Ｊ．，Ｒｅｅｄ，Ｅ．，白金に基づいた化学療法への応答と相関した、卵巣癌中のＸＰＡＣおよびＥＲＣＣ１のメッセンジャーＲＮＡレベル，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９４），９４，７０３−７０８。ＥＲＣＣ２は特に、７つのポリペプチドから成る転写因子ＩＩＨ（ＴＦＩＩＨ）の成分であり（Ｍｕ，Ｄ．，Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｈ．，Ｍａｔｓｕｎａｇａ，Ｔ．，Ｈｓｕ，Ｄ．Ｓ．，Ｒｅａｒｄｏｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｓａｎｃａｒ，Ａ．，高度に限定されたシステムにおけるヒトＤＮＡ修復除去ヌクレアーゼの再構築，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５），２７０，２４１５−２４１８、Ｍｕ，Ｄ．，Ｈｕｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｓａｎｃａｒ，Ａ．，ヒトＤＮＡ修復除去ヌクレアーゼの反応機構，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６），２７１，８２８５−８２９４）、および全体として修復因子である。Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｌ．，Ｍｏｎｃｏｌｌｉｎ，Ｖ．，Ｒｏｙ，Ｒ．，Ｓｔａｕｂ，Ａ．，Ｍｅｚｚｉｎａ，Ｍ．，Ｓａｒａｓｉｎ，Ａ．，Ｗｅｅｄａ，Ｇ．，Ｈｏｅｉｊｍａｋｅｒｓ，Ｊ．Ｈ．，Ｅｇｌｙ，Ｊ．Ｍ．，ＥＲＣＣ２／ＤＮＡ修復タンパク質はクラスＩＩ ＢＴＦ２／ＴＦＩＩＨ転写因子と関係している，ＥＭＢＯ Ｊ （１９９４），１３，２３８８−２３９２、Ｄｒａｐｋｉｎ，Ｒ．，Ｒｅａｒｄｏｎ，Ｊ．Ｔ．，Ａｎｓａｒｉ，Ａ．，Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｚａｗｅｌ，Ｌ．，Ａｈｎ，Ｋ．，Ｓａｎｃａｒ，Ａ．，Ｒｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．，ＤＮＡ除去修復およびＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写における、ＴＦＩＩＨの二重の役割，Ｎａｔｕｒｅ （１９９４），３６８，７６９−７７２、Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｓｖｅｊｓｔｒｕｐ，Ｊ．Ｑ．，Ｆｅａｖｅｒ，Ｗ．Ｊ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｄ．，Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ，Ｅ．Ｃ．，転写因子ｂ（ＴＦＩＩＨ）は、酵母におけるヌクレオチド除去修復の間に必要とされる，Ｎａｔｕｒｅ（１９９４），３６８，７４−７６。ＮＥＲにおいて、ＥＲＣＣ２（またはＸＰＤ）はＴＦＩＩＨヘリカーゼ活性に必須であり（Ｐｒａｋａｓｈ，Ｓ．，Ｓｕｎｇ，Ｐ．，Ｐｒａｋａｓｈ，Ｌ．，サッカロミセス セレビジエのＤＮＡ修復遺伝子およびタンパク質，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９３），２７，３３−７０）、および、ＥＲＣＣ２はＧＴＦ２Ｈ２（またはｐ４４）と特異的に相互作用し、そしてこの相互作用は５’から３’のヘリカーゼ活性の刺激を生じることが、より最近に示されている。Ｃｏｉｎ，Ｆ．，Ｍａｒｉｎｏｎｉ，Ｊ．Ｃ．，Ｒｏｄｏｆｌｏ，Ｃ．，Ｆｒｉｂｏｕｒｇ，Ｓ．，Ｐｅｄｒｉｎｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｅｇｌｙ，Ｊ．Ｍ．，ＸＰＤヘリカーゼ遺伝子の突然変異は、ＸＰＤおよびＴＦＩＩＨのｐ４４サブユニット間の相互作用を妨げる、ＸＰおよびＴＴＤ表現型を生じる，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ，２０，１８４−１８８。
【０１５３】
マイクロアレイ分析では、数千の遺伝子が同時に判定されるので、測定された全ての遺伝子の指標は、一つのマイクロアレイと別のマイクロアレイとに添加された試料量に対する安定な基準を提供する。典型的には、定量的ＲＴ−ＰＣＲ研究においては、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、シクロフィリンまたはリボソームＲＮＡのごとき、単一の制御されない遺伝子が添加基準として使用される。しかしながら、これらの遺伝子の全てが、多数の試料間で変動することが報告されている。多数の試料間の基準遺伝子発現における試料内変動を判定する一つの方法は、二つの基準遺伝子間の変動を比較することである。β−アクチンおよびＧＡＰＤＨは、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）間のお互いに関して５０倍、およびＢＥＣおよび他の細胞型間ではさらに大きく変動する。Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７。Ｒｏｔｓ，Ｊ．Ｇ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｊａｎｓｅｎ，Ｇ．，Ｖａｎ Ｚａｎｔｗｉｊｋ，Ｃ．Ｈ．，Ｎｏｏｒｄｈｕｉｓ，Ｐ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｋｕｉｐｅｒ，Ｅ．，Ｖｅｒｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ｐｉｅｔｅｒｓ，Ｒ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｇ．Ｊ．，標準化競合鋳型に基づいたＲＴ−ＰＣＲ法により決定した、小児期白血病におけるメトトレキセート耐性−関連タンパク質のｍＲＮＡ発現レベル，Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０００），１４，２１６６−２１７５。限定された数の遺伝子が測定される状況においては（＜ ２００）、データの規格化のための全遺伝子の指標は、十分に安定ではない。試料間の基準遺伝子発現における未知の影響を取り除くため、別の遺伝子発現値に対するＳｔａＲＴ−ＰＣＲにより得られた一つの遺伝子発現値の平衡比を分析した。これらの平衡比は、比を含んでなる、個々の遺伝子の実際の細胞濃度変化を示してはいないが、しかし、別のものに対する遺伝子の発現に関係しており、化学耐性のごとき表現型決定因子を比較するためには使用される。この研究において、ＩＧＥＩ分析（表５）で、化学耐性に関する個々の遺伝子発現値の分析により得られた結果（表３）のほとんどが確認された。特に、ＸＰＣは化学耐性に関して判定された１２の遺伝子で最も安定であり、同様に８の遺伝子が、分母としてβ−アクチンを使用する場合（表３）のように、分母としてＸＰＣを使用し、化学耐性に相関していた。それ故、ｃＤＮＡ試料のこのグループ間のβ−アクチンにおいての変動は有意ではなかった。特定の態様において、いつでも可能な、基準遺伝子発現における変動の潜在的影響に関する疑問を取り除くため、ＩＧＥＩを使用することは有用である。
【０１５４】
表４に示されたように、測定された遺伝子すべてのための発現値から誘導された平衡比（ＩＧＥＩ）の経験的誘導セットを評価することにより、遺伝子のセットと表現型間の関連の強さに関する序列を確立することが可能である。さらに、他の各々に関する各々の遺伝子の二変量相関は、分析の力を著しく増強し、そしてさらなるバリデーションを必要とする潜在的アウトライアー（ｏｕｔｌｉｅｒ）を同定するのを助ける。本明細書の実施例において、最も明白なアウトライアーは、ＥＲＣＣ２／ＸＲＣＣ１と化学耐性間の高い相関である。これは、（ａ）分子にＥＲＣＣ２あるいはＸＲＣＣ１を有する比のセットは、各々の最もおよび四番目に高い範囲のｒ値を有していた、さらに、（ｂ）高いｒ値を有していた、分子にＥＲＣＣ２を有する他の比のすべてが、分母に表４の下部からの遺伝子（即ち、ＸＰＣ、ＧＴＦ２Ｈ２、ＡＢＣＣ１０、ＥＲＣＣ３およびＬＩＧ１すべてが表の最小の中に存在した）を有していた、のでアウトライアーである。ＥＲＣＣ２／ＸＲＣＣ１がアウトライアーであることと一致して、グループ２細胞株が評価された場合、ＥＲＣＣ２／ＸＲＣＣ１はもはや化学耐性とは有意に関連していない（表５）。これらの発見は、標準、数的形式で遺伝子発現を測定する価値の、さらなる証拠を提供している。それ故、ＥＲＣＣ２、ＡＢＣＣ５、ＸＰＡおよびＸＲＣＣ１と化学耐性の関係は、（ａ）多くの異なった機能的クラスを示している遺伝子の、第一回目のスクリーニング、（ｂ） 第一回目で正に関係している遺伝子により代表された遺伝子の拡大されたグループを評価し、（ｃ）正に連結されたデータを、相互作用的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）内に合併し、（ｄ）アウトライアーを同定するためにＩＧＥＩ分析を使用し、（ｅ）モデルを組み立て、および（ｆ）データをバリデーションする、ことを含んでいる、連続的プロセスを通して確立された。
【０１５５】
本発明の方法は、シスプラチン化学耐性に関与する一つより多くの遺伝子の相互作用、および化学耐性を生じさせることができる多数の経路の相互作用を評価する必要性を強調している。
【０１５６】
実施例ＩＩ
多くの遺伝子の同定および具体的表現型とのそれらの関係は、おそらく分子癌分類へと導くであろう。（Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．ヒトゲノムの配列，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：１３０４−１３５１（２００１）、Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．，ヒトゲノムの最初の配列決定および分析，Ｎａｔｕｒｅ，４０９：８６０−９２１（２００１））。この新規分類システムは重要な臨床的意味を有しており、患者看護を非常に改良することができる。特に、関係する表現型を有する特定の遺伝子型の認識は、個々の予後マーカー、化学感受性体質を明らかにし、そして患者結果を予測することができる。肺癌の分子分類は、細胞学的診断を非常に促進させることができる。肺癌は未だに、組織病理学的基準を使用して主として診断されている。肺腫瘍の不均一性は、悪性および正常、および転移性肺腫瘍および原発性腫瘍を区別することの困難さ（Ｓｈｉｒａｋｕｓａ，Ｔ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｍ．，Ｍｏｔｏｍａｇａ，Ｒ．Ａｎｄｏ，Ｋ．およびＫｕｓａｎｏ Ｔ．，Ａ．Ｓｕｒｇ．，５４：６５５−６５８，１９６６；Ｆｌｉｎｇ，Ａ．およびＬｌｏｙｄ，Ｒ．Ｖ．，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１６６：３９−４２，１９９２）を含む、しばしば相反する診断を導く（Ｓｏｒｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｈｉｒｓｃｈ，Ｆ．Ｒ．，Ｇａｚｄａｒ，Ａ．，およびＯｌｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｃａｎｃｅｒ，７１：２９７１−２９７６，１９９３）。
【０１５７】
遺伝子発現パターンは、肺および乳癌患者において、臨床結果を明白にした。Ｇａｒｂｅｒらは，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：１３８７４−１３７８９（２００１）、伝統的な形態学的分類と相関した肺腫瘍の遺伝子発現プロフィールを報告している。加えて、遺伝子発現パターンに基づいて、腺癌をさらに、患者生存率が有意に異なっている三つのサブタイプへ分割した。Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅらは，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９８：１３７９９９９０−１３７９５（２００１）、類似の結果を報告した。肺腺癌を遺伝子発現パターンに基づいて、四つのサブクラスへグループ分けし、および患者は統計的に有意な生存率の相違を有していた。彼らはまた、遺伝子発現プロフィールに基づいて、形態学的には原発性肺腫瘍と同定された、三つの転移性肺腫瘍も同定した。遺伝子発現プロフィールに基づいた乳癌腫瘍の分子分類、および患者の結果および細胞増殖速度との相関も、遺伝性乳癌、散発性乳癌およびヒト乳腺上皮細胞の場合に報告されている（Ｈｅｎｄｅｎｆａｌｋら，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３４４：５３９−５４８，２００１；Ｓｏｒｌｉｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：１０８６９−１０８７４，２００１；およびＰｅｒｏｕら，ヒト乳腺上皮細胞および乳癌における特有の遺伝子発現パターン，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６巻，１６号：９２１２−９２１７，１９９９）。
【０１５８】
ほとんどの肺癌は、主としてファインニードル吸引（ＦＮＡ）バイオプシ組織、胸膜液試料および気管支上皮細胞のブラッシング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）により診断される。これらの少量の再生できない組織試料は、遺伝子発現研究に使用するには挑戦的である。マイクロアレイ法は、多数の癌表現型に関与する可能性のある数千の遺伝子のスクリーニングには適しているが、しかし、必要とされる大量の初期ＲＮＡ量、内部標準の欠如、費用および時間のため、ＦＮＡ遺伝子発現分析には適していない。（Ｔｙａｇｉ，Ｓ．およびＫｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０８，１９９６；ＤｅＲｉｓｉ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８：６８６０−６８６６，１９９７）。標的遺伝子同定後、遺伝子発現分析を、定量的、標準化遺伝子発現法でさらに評価すべきである。
【０１５９】
ＳｔａＲＴ−ＰＣＲ（標準化逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）は、少量の臨床試料で使用するには理想的な遺伝子発現法である。それは数百の遺伝子を同時に測定するのに有用であり、少量のＲＮＡしか必要とせず、安価な装置を使用し、感度が高く、標準化されており、および高度に再現できる（Ｗｉｌｌｅｙら、，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：６−１７，１９９８、Ｃｒａｗｆｏｒｄら，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｇｏｄｆｒｉｄｕｓ，Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｎｏｏｒｄｈｕｉｓ，Ｐ．，Ｒｏｔｓ，Ｍ．Ｇ．，Ｖｏｎｄｒａｃｅｋ，Ｍ．，Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｌｉｅｕａｌｌｅｎ，Ｋ．，Ｌｅｎｎｏｎ，Ｇ．，Ｚａｈｏｒｃｈａｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｇｅｏｒｇｅｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｌｉ，Ａ．，Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．，Ｆａｎ，Ｐ−Ｓ．，Ｋａｈａｌｅｈ，Ｂ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，およびＷｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．（２００１），標準化ＲＴ（ＳｔａＲＴ）−ＰＣＲを使用する、盲検試験で得られた、多実験室間の再現性のある遺伝子発現測定，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ６：２１７−２２５，２００１）。悪性、化学耐性および転移性表現型は、多くの遺伝子の相互作用的影響から生じるようである。ＳｔａＲＴ−ＰＣＲ研究においてはデータが数的であるため、表現型は相互作用的遺伝子発現指標（（ＩＧＥＩ）により表すことができる。Ｄｅｍｕｔｈらは、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：１８−２４，１９９８、ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１の遺伝子発現指標は、測定された個々の遺伝子よりも良好にヒト気管支上皮細胞における悪性度を予測することを報告している。同様の研究において、ｍＧＳＴ ｘ ＧＳＴＭ３ ｘ ＧＳＨＰＸ Ｘ ＧＳＨＰＸＡ ｘ ＧＳＴＰ１の胃が指標は感度が高く（９０％）、そして気管支原性癌の患者からの正常気管支原性上皮細胞の検出が７６％特異的であった（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６０：１６０９−１６１８，２０００）。特に、この相互作用的遺伝子発現指標は、任意の単一遺伝子よりも良好に気管支原性癌発生の危険性を有する個体を同定した。
【０１６０】
ＳｔｓＲＴ−ＰＣＲ反応ごとに標準化された競合鋳型を包含させることによって、直接的実験室内および実験室間データ比較が可能になる（Ｗｉｌｌｅｙら，１９９８）。Ｃｒａｗｆｏｒｄら（２００１）は、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用する高実験室間再現性を報告している（Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｇｏｄｆｒｉｄｕｓ，Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｎｏｏｒｄｈｕｉｓ，Ｐ．，Ｒｏｔｓ，Ｍ．Ｇ．，Ｖｏｎｄｒａｃｅｋ，Ｍ．，Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｌｉｅｕａｌｌｅｎ，Ｋ．，Ｌｅｎｎｏｎ，Ｇ．，Ｚａｈｏｒｃｈａｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｇｅｏｒｇｅｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｌｉ，Ａ．，Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．，Ｆａｎ，Ｐ−Ｓ．，Ｋａｈａｌｅｈ，Ｂ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，およびＷｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．（２００１），標準化ＲＴ（ＳｔａＲＴ）−ＰＣＲを使用する、盲検試験で得られた、多実験室間の再現性のある遺伝子発現測定，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ６：２１７−２２５，２００１）標準化された数的データの産生は、共通の多施設データベースを確立するために必要とされる。多重標準化ＲＴ−ＰＣＲと称される、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲの最近の改変は、遺伝子発現研究に必要とされる出発材料の量をさらに減少させた（Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｚａｈｏｒｃｈａｋ，Ｒ．Ｊ．，およびＷｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，少量の臨床試料における多くの遺伝子の発現分析のための多重標準化ＲＴ−ＰＣＲ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２９３：５０９−５１６，２００２）。多重ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用し、少なくとも９６の遺伝子が、１つの遺伝子の測定のために普通使用されるｃＤＮＡ量と同じ量を使用して、同時に評価することができる（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、上記文献）。この方法は、ＦＮＡにより得られた気管支原性癌試料中の、化学耐性に関連すると推定される１８の遺伝子を、同時に測定するために使用した。
【０１６１】
この実施例は、高いｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１遺伝子発現指標が気管支原性癌の細胞病理学的診断を増強できるかどうかを決定する。ｃ− ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１の標準化遺伝子発現値および相互作用的遺伝子悪性度指標は、８つの原発性肺ＦＮＡ試料について決定した。
【０１６２】
材料および方法
細胞培養
Ｈ１１５５ヒトＮＳＣＬＣ細胞株はＡＴＣＣ（マナサス，ＶＡ）から購入し、ゲンタマイシン（０．１％）（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，ロックビル，ＭＤ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，セントルイス，ＭＯ）を補給したＲＰＭＩ中で培養した（３７℃、５．０％ＣＯ２）。
【０１６３】
ＲＮＡ保存、抽出および逆転写の評価
Ｈ１１５５ヒトＮＳＣＬＣ細胞株（１．０ Ｅ６）を、ＲＮＡ抽出に先立って、Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔ（ＣＹＴＹＣ／ボックスボロー，ＭＡ）、ＲＮＡ−Ｌａｔｅｒ Ａｍｂｉｏｎ／オースチン，テキサス）またはＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，シンシナチ，ＯＨ）に置いた。ＲＮＡの質が評価された時間点および温度は、１、３、１０および３０日および室温、４℃および−２０℃であった。ＲＮＡは、製造業者のプロトコールに従って、Ｔｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して抽出した。抽出後、ＲＮＡの質を、１８ｓおよび２８ｓリボソームピーク検出のためのＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで評価した。ｍＲＮＡ試料は、前に記載したようにＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ゲイサーブルグ，ＭＤ）およびオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ，マディソン，ＷＩ）を使用して逆転写した。（ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｄｕｒｚｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｚａｈｅｒ，Ａ．，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｅ．Ｒ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，遺伝子発現指標ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ１／ｐ２１はヒト気管支上皮細胞における悪性表現型を高度に予知するものである，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９８），１９，１８−２、Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．，Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｆｅｒｅｎｃａｋ，Ｗ．Ｊ．，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｃ．Ａ．，Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，グルタチオントランスフェラーゼＰ１、グルタチオントランスフェラーゼＭ３、およびグルタチオンペルオキシダーゼの正常気管支上皮細胞発現は、気管支原性癌を患った患者では低い，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０００），６０，１６０９−１６１８）。
【０１６４】
ユニプレックス（ｕｎｉｐｌｅｘ）−ＳｔａＲＴ−ＰＣＲ
ＳｔａＲＴ−ＰＣＲは、Ｇ．Ｅ．Ｎ．Ｅシステム１発現キット（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ，Ｉｎｃ．）を用い、以前に公表されているプロトコールを使用して実施した（Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７、ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｄｕｒｚｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｚａｈｅｒ，Ａ．，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｅ．Ｒ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，遺伝子発現指標ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ１／ｐ２１はヒト気管支上皮細胞における悪性表現型を高度に予知するものである，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９８），１９，１８−２、Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．，Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｆｅｒｅｎｃａｋ，Ｗ．Ｊ．，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｃ．Ａ．，Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，グルタチオントランスフェラーゼＰ１、グルタチオントランスフェラーゼＭ３、およびグルタチオンペルオキシダーゼの正常気管支上皮細胞発現は、気管支原性癌を患った患者では低い，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０００），６０，１６０９−１６１８、Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｇｏｄｆｒｉｄｕｓ，Ｊ．Ｐ．， Ｎｏｏｒｄｈｕｉｓ，Ｐ．，Ｒｏｔｓ，Ｍ．Ｇ．，Ｖｏｎｄｒａｃｅｋ，Ｍ．，Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｌｉｅｕａｌｌｅｎ，Ｋ．，Ｌｅｎｎｏｎ，Ｇ．，Ｚａｈｏｒｃｈａｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｇｅｏｒｇｅｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｌｉ，Ａ．，Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．，Ｆａｎ，Ｐ−Ｓ．，Ｋａｈａｌｅｈ，Ｂ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，（２００１），標準化ＲＴ（ＳｔａＲＴ）−ＰＣＲを使用する、盲検試験で得られた、多実験室間の再現性のある遺伝子発現測定，投稿中、遺伝子発現システム１説明書、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ，Ｉｎｃ．（２０００），ｗｗｗ．ｇｅｎｅｘｎａｔ．ｃｏｍ．）。
【０１６５】
システム１キットには、６つのＣＴ混合物Ａ−Ｆおよび適切なプライマーが含まれている。“標的遺伝子”ＣＴの濃度は、“基準遺伝子”アクチンの濃度と比較し、各々の混合物中で変化する。マスター混合物は、ＲＮａｓｅを含まない水、ＭｇＣｌ２緩衝液、ｄＮＴＰ、ｃＤＮＡ、Ｇ．Ｅ．Ｎ．Ｅ．システム１キットからのＣＴ混合物、およびＴａｑポリメラーゼを含んでいた。マスター混合物を、個々の遺伝子プライマーを含んでいるチューブに入れ、Ｒａｐｉｄｃｙｃｌｅｒ（Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，アイダホフォールズ，ＩＤ）でサイクルを回した。各々のサイクルに対し、変性温度は９４℃であり、アニーリング温度は５８℃であり、および伸長温度は７２℃であった。増幅後、各々のＰＣＲ生成物を、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ試験機でのキャピラリー電気泳動により分析した。遺伝子発現値を決定するため、各々の天然鋳型（ＮＴ）の曲線下の領域を、その関係する競合鋳型（ＣＴ）の領域と比較した。各々の発現値の単位は、１０６β−アクチン分子数当たりの分子数であった。
【０１６６】
気管支原性癌試料の取得
原発性肺癌のファインニードル吸引（ＦＮＡ）物は、オハイオの医科大学で患者から得られた。各々の手順に先立って、ＮＩＨおよび施設のガイドラインに従って、通知され、署名された同意を患者から得た。ほとんどの細胞は、診断目的のため、スライド上に直接置いた。診断目的に必要とされない細胞は、Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔ（登録商号）溶液（ＣＹＴＹＣ／ボックスボロー，ＭＡ）に集めた。最後の細胞病理学的診断後、Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔ中に残っている細胞を、我々の実験室でペレット化し、そしてＲＮＡを抽出した。細胞数および生存度を、ガラススライド上の細胞の分析を通して細胞で評価した。
【０１６７】
結果
ＦＮＡ検体におけるＲＮＡの最適収集および保存を決定するための試みにおいて、Ｈ１１５５細胞（ＮＳＣＬＣ）を３つの保存試薬ＲＮＡ Ｌａｔｅｒ、ＰｒｅｓｅｒｖｃｙｔおよびＴｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔ、に置いた。ＲＮＡに対する時間および温度の影響を決定するため、Ｈ１１５５を４℃または−２０℃で、１、３、１０および３０日保った。
【０１６８】
＋＋として示されている高質ＲＮＡ（１８ｓおよび２８ｓリボソームバンドの存在を示した）は、各々の試薬中で１０日まで保存されたＨ１１５５ ＮＳＣＬＣ細胞で検出された（表６）。３０日保存後でも、ＰｒｅｓｅｒｖｃｙｔおよびＴｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔ中では、同じように良好に保存された。ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｌａｔｅｒ中、３０日保存後に、４℃では部分的に分解しており（＋−）、−２０℃では保存されなかった。
【０１６９】
ＲＮＡがＳｔａＲＴ−ＰＣＲに適しているかどうかを決定するため、それを逆転写し、そしてβ−アクチン発現を評価した。高質または部分的に分解したＲＮＡを示しているすべての試料でβ−アクチンを検出した（図６−表６）。予想されるように、ＲＮＡ Ｌａｔｅｒ中、−２０℃で３０日保存した細胞においては、β−アクチンが検出されなかった。ＲＮＡの質は、ＰＣＲ増幅される能力と高度に相関した。短期保存（１−１０日）のための最適保存試薬はＰｒｅｓｅｒｖｃｙｔおよびＲＮＡ Ｌａｔｅｒであり、１０日を超える長期保存のためには、Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔが推薦される。Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔはまた、細胞学的分析にＴｈｉｎ Ｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを利用する施設で使用するためにも便利である。
【０１７０】
最適収集および保存条件の決定後、肺ＦＮＡ検体は、Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔ中に置き、４℃で保存した。Ｈ１１５５細胞と同様に、ＦＮＡ検体１０の内の９でＲＮＡの質を評価した（図７−表７）。５つの試料が高質（＋＋）または部分的に分解された（＋−）ＲＮＡを有していた。予想されるように、５つすべての試料がＰＣＲ増幅可能であり、そしてβ−アクチンが検出された。逆転写に先立って、１つの試料は評価されてなく（ＮＥ）、および４つの試料は低質ＲＮＡ（― ―）を示した。β−アクチンがＮＥ検体で検出され、意外にも、２つのＲＮＡ（― ―）試料でβ−アクチンが検出された。高質ＲＮＡが存在する場合、それはＰＣＲ実験に高度に適している。低質ＲＮＡが存在する場合、ＰＣＲ増幅可能ではないようであるが、それにもかかわらず使用することができる。
【０１７１】
どうして４試料が低質ＲＮＡを有するのかを決定する試みにおいて、各々の検体に対して、病理学者により独立して細胞学的特性が決定された。細胞性、生存度およびパーセント腫瘍／正常細胞を各々の試料で決定した（表７）。１０試料の内の７つが、低細胞性（Ｌ）および低生存度（Ｌ）を有していた。これらの試料の内の３つが（＋＋）または（＋−）ＲＮＡ状態を有しており、すべてがＰＣＲ増幅可能であった（＋β−アクチン）。低細胞性および低生存度を有する残りの４試料で、２つはＰＣＲ増幅可能であったが、２つは不可能であった。１０試料の内の３つは、中程度（Ｉ）または高（Ｈ）細胞性および生存度を有していた。３つすべてが良好な質のＲＮＡを有しており、ＰＣＲ増幅可能であった。細胞性が抽出されたＲＮＡ量に関係しているようであり、および生存度が、これらの細胞から得られたＲＮＡの質に関係しているかもしれない。中程度から高細胞性の検体は、遺伝子発現研究に最適であり、低細胞性および低生存度の細胞も、７つの内の５つがＰＣＲ増幅可能であったので、それにもかかわらず適している。
【０１７２】
１０試料の内の７つにおいて、腫瘍細胞の％は６０から９０％まで変動していた。２つの試料は２０％腫瘍細胞を有し、１つは１０％腫瘍細胞であった。同一取得時に決定されたＦＮＡ診断は、６試料でＮＳＣＬＣ、および４試料で非定型であった。悪性表現型の存在を確認するため、悪性度に関係する３遺伝子、ｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１を、１０ＦＮＡの内の８つで評価し、悪性度指標、ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１を決定した（図８−表８）。予想されたように、＋ＮＳＣＬＣの５つは、１．０Ｅ４から３．６Ｅ６（１０６β−アクチン分子当たりの分子として）の範囲にわたる非常に高い指標値を有していた。４つの非定型試料の内の３つもまた、７．２Ｅ３−５．０Ｅ４の範囲にわたる値を有する高い遺伝子発現指標を示した。追加の分析後、遺伝子発現データが得られた３つの非定型試料は、後に小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）であると確認された。非定型試料中の腫瘍細胞のパーセンテージは２０から８０％の範囲であり、少数の異常細胞でも十分であり、遺伝子発現指標ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１により検出されたことを示している。
【０１７３】
肺小結節のＦＮＡ分析が通常の診断法であるが、本方法は、ヒト肺ＦＮＡ試料に対して標準化、定量的遺伝子発現法を使用することの最初の例である。これら少量の再生できない細胞集団の遺伝子発現プロフィールは診断的および予後的意味を有しており、個別化された患者看護を導く。異なった遺伝子発現パターンはＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ間を識別するために有用であり、悪性表現型の早期同定は、臨床処置を最適化するであろう。加えて、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲはまた、遺伝子発現パターン、および患者の予後を改善するための、例えば、化学耐性および転移可能性のような、それらに関係する臨床関連表現型を同定するためにも有用である。
【０１７４】
この実施例において、最初にＮＳＣＬＣと診断され、そして後にＮＳＣＬＣであると確認されたＦＮＡ試料の内の５つは、高い指標値を有していた。これら＋ＮＳＣＬＣ検体の発現の範囲は、１．０Ｅ４から３．６Ｅ６であった。この試料セットにおいて、４つは９０．０％腫瘍細胞であり、そして試料＃１７２は２０％のみの腫瘍細胞しか有していなかったが、それでも最も高い指標値、６．５Ｅ５を有していた。細胞学的に非定型と診断され、後になってＳＣＬＣであると確認された、ＦＮＡ試料の内の３つもまた、高い指標値を有していた。それらは、１０６分子β−アクチンｍＲＮＡ当たり７．２Ｅ３−５．０Ｅ４ｍＲＮＡ分子の範囲であった。これらの試料における腫瘍細胞のパーセンテージは２０−８０％の範囲であった。
【０１７５】
他の態様
本明細書に記載した遺伝子およびＩＧＥＩマーカーセットは、ＮＳＣＬＣに対する新規薬剤標的の同定のための価値ある情報を提供し、そしてその情報は、他の組織における発癌の研究に使用するために拡大することができる。これらの配列は、本発明の方法において使用することができ、そして本発明のプローブおよびアレイを産生するために使用することができる。
【０１７６】
本発明は、本明細書に記載した具体的態様による範囲に制限されるわけではなく、本発明の個々の様相の一つの例示として意図されており、そして、本明細書に示されおよび説明されたものに加え、機能的に均等な方法および成分は本発明の範囲内であり、上記の説明および付随する図面から、それは当業者には明らかになるであろう。そのような改変は、付記された特許請求の範囲内であることが意図されている。
【０１７７】
雑誌論文、特許およびデータベースを含む、本明細書に引用したすべての参考文献は、特に本明細書において援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１ａ】図１ａおよび１ｂは、ＰＣＲ増幅に使用したプライマーを示している表１である。表１はＰＣＲ増幅に使用したプライマーを示しており、遺伝子名称、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号、配列番号、プライマー、ｃＤＮＡ中のｂｐ位置、および生成物長を含んでいる（ｂｐ）。発現マーカー遺伝子の配列は公開データベース中に存在する。表１および５はこれらの遺伝子のためのＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を提供している。ＧｅｎＢａｎｋ中の遺伝子の配列は、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の公開データベースに存在する均等物および関連配列のように、本明細書において特に援用される。“配列番号”と表示されたカラムは、表に掲げられた遺伝子を、本出願の配列表内に提供されているような配列情報と相関させている配列同定番号を指している。
【図１ｂ】図１ａおよび１ｂは、ＰＣＲ増幅に使用したプライマーを示している表１である。表１はＰＣＲ増幅に使用したプライマーを示しており、遺伝子名称、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号、配列番号、プライマー、ｃＤＮＡ中のｂｐ位置、および生成物長を含んでいる（ｂｐ）。発現マーカー遺伝子の配列は公開データベース中に存在する。表１および５はこれらの遺伝子のためのＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を提供している。ＧｅｎＢａｎｋ中の遺伝子の配列は、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の公開データベースに存在する均等物および関連配列のように、本明細書において特に援用される。“配列番号”と表示されたカラムは、表に掲げられた遺伝子を、本出願の配列表内に提供されているような配列情報と相関させている配列同定番号を指している。
【図２】図２は、ＮＳＣＬＣ細胞株のＩＣ５０およびシスプラチンレベルを示している表２である。
【図３ａ】図３ａおよび３ｂは、ＮＳＣＬＣ細胞株における遺伝子発現（ｍＲＮＡ／１０６ ＡＣＴＢ ｍＲＮＡ）を示している表３である。
【図３ｂ】図３ａおよび３ｂは、ＮＳＣＬＣ細胞株における遺伝子発現（ｍＲＮＡ／１０６ ＡＣＴＢ ｍＲＮＡ）を示している表３である。
【図４】図４は、ＮＳＣＬＣ細胞株における遺伝子発現とシスプラチン化学耐性の相関を示している表４である。
【図５】図５は、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるシスプラチン化学耐性モデルの統計判定を示している表５である。
【図６】図６は、肺癌診断のためのファインニードル（Ｆｉｎｅ Ｎｅｅｄｌｅ）分析（ＦＮＡ）に使用されたＩＥＧＩに関連する、実施例ＩＩのＨ１１５５ヒトＮＳＣＬＣ細胞におけるＲＮＡの質に対する収集法の影響を示している表６である。
【図７】図７は、実施例におけるＦＮＡ検体細胞の細胞学的情報および診断を示している表７である。
【図８】図８は、ＦＮＡ試料中のｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ１およびｐ２１の遺伝子発現値および指標値を示している表８である。
【図９ａ】図９ａは、マイクロアレイおよびマイクロビーズを用いる標準化ＲＴ−ＰＣＲ生成物の分析を図により例示している：図９ａは、遺伝子の同一性がマイクロアレイの位置により区別できる、マイクロアレイを示している。
【図９ｂ】図９ｂは、マイクロアレイおよびマイクロビーズを用いる標準化ＲＴ−ＰＣＲ生成物の分析を図により例示している：図９ｂは、ビーズの蛍光色により区別できる、マイクロビーズを示している。
【配列表】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮特許出願第６０／３６８，２８８号（２００２年３月２８日出願）、および第６０／３６８，４０９号（２００２年３月２８日出願）の優先権を主張し、前記出願の開示は、特にその全体が本明細書に記載されているものとされる。
【０００２】
本発明は、研究基金番号ＮＩＨ ＣＡ８５１４７および８１１２６によりなされており、前記基金は本発明に対する特定の権利を所有することができる。
背景技術
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は気管支原性癌の最も一般的な型である。より大きな効力を有する化学療法措置が開発され続けているが、最良の措置でも現在のところ、３０−５０％のみの全退行率しか与えない。この応答の欠如は、初めから存在する抵抗性、または処置に応答して顕出した抵抗性のためである。化学抵抗性の機構には、多数の遺伝子産物が関与するらしいと信じられている。腫瘍発生および増殖に関与する、特定の遺伝子の役割を明確にすること、および癌の診断、予防、モニタリングおよび処置のために、標的として働くことができる遺伝子および遺伝子産物を同定し、および定量することが重要である。
【０００３】
特定の例において、最初は有効である治療剤が、時間とともに患者に対し無効になったり、有効性が低くなる。同一の治療剤が、異なった患者に対しては、より長い期間有効であり続けることがある。さらに、前記治療剤は、さらに他の患者には、無効かまたは有害であることもある。それ故、癌および既定の治療剤に関してマーカーとして働くことができる遺伝子および／または遺伝子産物を同定することは、有益となるであろう。処置において、そのような予測および訂正が行える能力によって、患者の処置過程の早期段階で、治療措置についてより正確に決定することが可能になる。
【０００４】
現在、シスプラチンおよびカルボプラチンが、中でも最も広く使用される細胞毒性抗癌薬である。しかしながら、初めからのまたは誘導された機構を通したこれらの薬剤に対する耐性が、これらの治療可能性を害している。Ｐｅｒｅｚ，Ｒ．Ｐ．，シスプラチン耐性の細胞および分子決定因子，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９８），３４，１５３５−１５４２。最近、白金化合物に対する化学耐性の、理解できる、考えられる様式の可能性が、細胞毒性とヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）（Ｄｉｊｔ，Ｆ．，Ｆｉｔｃｈｉｎｇｅｒ−Ｓｃｈｅｐｍａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｂｅｒｅｎｄｓ，Ｆ．，Ｒｅｅｄｉｋｊ，Ｊ．，培養された正常および修復−欠損ヒト線維芽細胞におけるＤＮＡへのシスプラチン−誘導付加体の形成および修復，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９８８），４８，６０５８−６０６２。Ｚａｍｂｌｅ，Ｄ．Ｂ．，Ｌｉｐｐａｒｄ，Ｓ．Ｊ．，癌化学療法におけるシスプラチンおよびＤＮＡ修復，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ（１９９５），２０，４３５−４３９。Ｓｔａｔｅｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｒｅｅｄ，Ｅ．，シスプラチン−耐性ヒト卵巣癌において、増加したＸＰＡ ｍＲＮＡレベルはＸＰＡ突然変異または遺伝子増幅とは関連しない，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．（１９９６），１０８，２３３−２３７。Ｆｅｒｒｙ，Ｋ．Ｖ．，Ｆｉｎｋ，Ｄ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ｗ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｔ．Ｃ．，Ｈｏｗｅｌｌ，Ｓ．Ｂ．，インビトロＤＮＡ修復アッセイを使用する、誤対合修復欠損およびプロフィシエント（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）ヒト結腸直腸癌細胞株における白金−ＤＮＡ付加体修復の定量，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９７），抄録，３８，３５９。Ｊｏｒｄａｎ，Ｐ．，Ｃａｒｍｏ−Ｆｏｎｓｅｃａ，Ｍ．，シスプラチン細胞毒性に含まれる分子機構，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（２０００），５７，１２２９−１２３５。Ｋａｒｔａｌｏｕ，Ｍ．，Ｅｓｓｉｎｇｍａｎｎ，Ｊ．Ｍ．，シスプラチンに対する耐性の機構，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．（２００１），４７８，２３−４３）、または薬剤取り込み／流出（Ｋａｒｔｏｌｕｏ，Ｍ．，Ｅｓｓｉｎｇｍａｎｎ，Ｊ．Ｍ．，シスプラチンに対する耐性の機構，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．（２００１），４７８，２３−４３。Ｂｅｒｇｅｒ，Ｗ．，Ｅｌｂｌｉｎｇ，Ｌ．，Ｈａｕｐｔｍａｎｎ，Ｅ．，Ｍｉｃｋｓｃｈｅ，Ｍ．，ヒト非小細胞肺ガン細胞の多薬剤耐性−関連タンパク質（ＭＲＰ）発現および化学耐性，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９７），７３，８４−９３。Ｂｏｒｓｔ，Ｐ．，Ｋｏｏｌ，Ｍ．，Ｅｖｅｒｓ，Ｒ．，ｃＭＯＡＴ（ＭＲＰ２）、その他のＭＲＰ同族体およびＬＲＰはＭＤＲで何らかの役割を果たしているか？Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．（１９９７），８，２０５−２１３。Ｙｏｕｎｇ，Ｌ．Ｃ．，Ｃａｍｐｌｉｎｇ，Ｂ．Ｇ．，Ｖｏｓｋｏｇｌｏｕ−Ｎｏｍｉｋｏｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｅ，Ｓ．Ｐ．Ｃ．，Ｄｅｅｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．，Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｊ．Ｈ．，肺癌における多薬剤耐性タンパク質−関連遺伝子の発現：薬剤応答との関連，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９９），５，６７３−６８０。Ｂｅｒｇｅｒ，Ｗ．，Ｅｌｂｌｉｎｇ，Ｌ．，Ｍｉｃｋｓｃｈｅ，Ｍ．，ヒト非小細胞肺癌細胞における主ヴォールト（ｖａｕｌｔ）タンパク質の発現：抗新生物薬への短期暴露による活性化，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２０００），８８，２９３−３００。Ｂｏｒｓｔ，Ｐ．，Ｅｖｅｒｓ，Ｒ．，Ｋｏｏｌ，Ｍ．，Ｗｉｊｎｈｏｌｄｓ，Ｊ．，薬剤輸送体ファミリー：多薬剤耐性−関連タンパク質，Ｊ Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．（２０００），９２，１２９５−１３０２。Ｏｇｕｒｉ，Ｔ．，Ｉｓｏｂｅ，Ｔ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｏ，Ｋ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．，Ｋａｔｏｈ，Ｏ．，Ｙａｍａｋｉｄｏ，Ｍ．，ＭＲＰ５遺伝子発現の増加は、肺癌における白金薬剤への暴露に関連している，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２０００），８６，９５−１００。）を関連づける研究を通して得られている。
【０００５】
マイクロアレイおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を含む、科学技術の最新の進歩は、組織形態学に対して機能性ゲノム科学を基礎にした、癌の型の分類を可能にしている。Ｇｏｌｕｂ，Ｔ．Ｒ．，Ｓｌｏｎｉｍ，Ｄ．Ｋ．，Ｔａｍａｙｏ，Ｐ．，Ｈｕａｒｄ，Ｃ．，Ｇａａｓｅｎｂｅｅｋ，Ｍ．，Ｍｅｓｉｒｏｖ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｏｌｌｅｒ，Ｈ．，Ｌｏｈ，Ｍ．Ｌ．，Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．，Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，Ｍ．Ａ．，Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ｃ．Ｄ．，Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．，癌の分子的分類：遺伝子発現モニタリングによるクラス発見およびクラス予測，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９），２８６，５３１−５３７。Ａｌｉｚａｄｅｈ，Ａ．Ａ．，Ｅｉｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｍａ，Ｃ．，Ｌｏｓｓｏｓ，Ｉ．Ｓ．，Ｒｏｓｅｎｗａｌｄ，Ａ．，Ｂｏｌｄｒｉｃｋ，Ｊ．Ｃ．，Ｓａｂｅｔ，Ｈ．，Ｔｒａｎ，Ｔ．，Ｙｕ，Ｘ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｌ，Ｙａｎｇ，Ｌ．，Ｍａｒｔｉ，Ｇ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｔ．，Ｈｕｄｓｏｎ，Ｊｒ．，Ｊ．，Ｌｕ，Ｌ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｄ．Ｂ．，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，Ｒ．，Ｓｈｅｒｌｏｃｋ，Ｇ．，Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｔ．Ｃ．，Ｗｅｉｓｅｎｂｕｒｇｅｒ，Ｄ．Ｄ．，Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｊ．Ｏ．，Ｗａｒｎｋｅ，Ｒ．，Ｓｔａｕｄｔ，Ｌ．Ｍ．，ら，遺伝子発現プロファイリングにより同定されたびまん性大Ｂ細胞の特有の型，Ｎａｔｕｒｅ（２０００），４０３，５０３−５１１。例えば、それらは遺伝子発現プロフィールに基づいた予測的マーカーの発見を可能にすることができる。マイクロアレイスクリーニング分析は、目下、遺伝子発現プロフィールに基づいた化学療法感受性を予測するために調べられている。Ｓｃｈｅｒｆ，Ｕ．，Ｒｏｓｓ，Ｄ．Ｔ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｈ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｋ．，Ｔａｎａｂｅ，Ｌ．，Ｋｏｈｎ，Ｋ．Ｗ．，Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，Ｗ．Ｃ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｔ．Ｇ．，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｄ．Ｔ．，Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，Ｄ．Ａ．，Ｅｉｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｅ．Ａ．，Ｐｏｍｍｉｅｒ，Ｙ．，Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．，Ｗｅｉｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｎ．，癌の分子薬理学のための遺伝子発現データベース，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．（２０００），２４，２３６−２４４。Ｋｉｈａｒａ，Ｃ．Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｔ．，Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，Ｙａｍａｎａ，Ｈ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｙ．，Ｏｎｏ，Ｋ．，Ｋｉｔａｈａｒａ，Ｏ．，Ｚｅｍｂｕｔｓｕ，Ｈ．，Ｙａｎａｇａｗａ，Ｒ．，Ｈｉｒａｔａ，Ｋ．，Ｔａｋａｇｉ，Ｔ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，遺伝子発現プロフィールのｃＤＮＡマイクロアレイ分析による、アジュバント化学療法に対する食道腫瘍感受性の予測，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１），６１，６４７４−６４７９。Ｚｅｍｂｕｔｓｕ，Ｈ．，Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｙ．，Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｔ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｙ．，Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｔ．，Ｕｅｙａｍａ，Ｙ．，Ｔａｍａｏｋｉ，Ｎ．，Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．，Ｋｉｔａｈａｒａ，Ｏ．，Ｙａｎａｇａｗａ，Ｒ．，Ｈｉｒａｔａ，Ｋ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，遺伝子発現プロフィールと抗癌剤に対する８５のヒト癌異種移植片の感受性を相関付けるためのゲノム−ワイド（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ）ｃＤＮＡマイクロアレイスクリーニング，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００２），６２，５１８−５２７。マイクロアレイ分析の利点は、数千の遺伝子を同時に評価することができることである。しかし、標準化されていないため、相対的に低感度で、および検出の閾値が相対的に不十分に低く、マイクロアレイ判定は、その後の定量法で確認する必要があると一般に認識されている。ＳｔａＲＴ−ＰＣＲは、多くの遺伝子の、迅速な、再現性のある、標準化された、定量的測定を同時に可能にする方法である。Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７。Ｗｅａｖｅｒら，カルボプラチンに対して変動した感受性を有する肺癌細胞株における、マイクロアレイおよび標準化ＲＴ−ＰＣＲ分析による発現パターンの比較，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１（抄録）４２，６０６。
【０００６】
ＳｔａＲＴ−ＰＣＲはまた、少量のバイオプシ（ｂｉｏｐｓｙ）組織における肺癌をより正確に診断するためにも使用できる。Ｗａｒｎｅｒら，“高ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１はＮＳＣＬＣの細胞学的診断を増強する” Ｐｒｏｄ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４３巻，抄録３７３８，２００２年３月；Ｗｅａｖｅｒら、“ＲＴ ＳｔａｒＲＴ−ＰＣＲを利用する、非小細胞肺癌細胞株におけるシスプラチン化学耐性の遺伝子発現モデル化”，Ｐｒｏｄ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４３巻，抄録５４７１，２００２年３月。
【０００７】
発明の要約
本発明は、一つの例において、個々の遺伝子の発現値よりも化学耐性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のより有効なマーカーであり、および別の例において、少量のバイオプシ組織における肺癌をより正確に診断するために使用することができる、多数の遺伝子の発現値を含んで成る、個々の、相互作用的遺伝子発現および／または指標（ＩＧＥＩ）のパターンを同定する。
【０００８】
本発明は、治療薬に対する癌細胞の感受性を決定するために使用できるマーカーの同定および使用に関する。より具体的には、本発明は、癌組織で変化して発現され、そして治療薬に対する癌細胞の感受性を決定するために使用できる“多数のマーカー”を特色とする。さらにより具体的には、本発明は、治療薬の有用性を予測的に同定するための、生物学的試料の判定に有用な“相互作用的遺伝子発現指標”（ＩＧＥＩ）を特色とする。
【０００９】
本発明は、従って、有用な診断マーカーとして、ならびに、疾病状態、疾病進行、薬剤毒性、薬剤有効性および薬剤代謝をモニターするために使用できるマーカーとして働く、遺伝子発現プロフィールを提供する。
【００１０】
本発明はさらに、剤（agent）または剤の組合わせが、癌細胞の増殖を減少させるために使用できるかどうかを決定する、ならびに、癌処置のための新規剤を決定するための方法を提供する。
【００１１】
本発明の多様な態様は、その発現が正常組織と比較された肺癌細胞または組織の正確な診断に相関している同定されたマーカー、およびその発現が治療薬による処置に対する感受性と相関している他のマーカーの使用に関している。特に、限定されるわけではないが、本発明は：１）特定の組織が肺癌であるかまたは非癌組織であるかどうかを決定するための方法；２）癌の処置に使用された治療薬の有効性をモニタリングするための方法；３）癌処置のための新規治療薬を開発するための方法；および４）癌処置のための治療薬の組合わせを同定するための方法、を提供する。
【００１２】
癌細胞試料中の、一つまたはそれより多くの同定されたマーカーの発現を試験し、および定量することにより、どの治療薬または治療薬の組合わせが癌の増殖速度を最も減少させるようであるかを決定することがさらに可能であり、適した治療薬の選択にさらに使用することができる。
【００１３】
癌細胞試料中の、一つまたはそれより多くの同定されたマーカーの発現を試験し、および定量することにより、どの治療薬または治療薬の組合わせが癌の増殖速度を最も減少させないようであるかを決定することがさらに可能である。
【００１４】
一つまたはそれより多くの同定されたマーカーの発現を試験し、および定量することにより、不適切な治療薬を排除することも可能である。
癌細胞または癌細胞株を抗癌剤の可能性を持つ薬剤へ暴露した場合、一つまたはそれより多くの同定されたマーカーの発現を試験し、および定量することにより、新規抗癌剤の効力を同定することが可能である。
【００１５】
さらに、治療処置の過程間に、患者からとった癌細胞試料中の、一つまたはそれより多くの同定されたマーカーの発現を試験し、および定量することにより、治療処置が引き続いて有効であるかどうか、または癌が治療処置に対して耐性（抗治療性）になっているかどうかを決定することが可能である。これらの決定は、患者ごとの基準で、または剤（または剤の組合わせ）ごとの基準で行える。また、特定の治療処置が特定の患者または患者群／クラスに利益になりそうかどうか、または特定の処置を続けるべきかどうかを決定することも可能である。
【００１６】
本発明はさらに、化学療法用化合物のごとき、抗癌剤の開発のための、以前には未知のまたは認識されていない標的を提供する。
本発明の同定された相互作用的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）は、癌のための処置（単一の剤かまたは多数の剤）の開発における標的として有用である。
【００１７】
本発明は、正常肺からの組織における遺伝子発現を試験することにより、肺癌に関連した遺伝子発現の全体的な変化を同定する。本発明はまた、有用な診断マーカー、並びに、疾病状態、疾病進行、薬剤毒性、薬剤有効性および薬剤代謝をモニターするために使用できるマーカーとして働く発現プロフィールも同定する。
【００１８】
いくつかの好ましい態様において、本明細書に記載した方法、遺伝子およびＩＧＥＩは、シスプラチン耐性癌を同定するために有用である（正常組織から癌を診断するのとは対照的に）。そのような態様は、ＥＲＣＣ２、ＡＢＣＣ５、ＸＰＡおよびＸＲＣＣ１からなる群より選択される、一つまたはそれより多くの遺伝子の発現レベルを検出することを含むことができる。
【００１９】
いくつかの好ましい態様において、本方法は、ＥＲＣＣ２／ＸＰＣ、ＡＢＣＣ５／ＧＴＦ２Ｈ２、ＥＲＣＣ２／ＧＴＦ２Ｈ２、ＸＰＡ／ＸＰＣおよびＸＲＣＣ１／ＸＰＣからなる群より選択される、一つまたはそれより多くの遺伝子の発現レベルを検出することを含むことができる。
【００２０】
いくつかの好ましい態様において、本方法は、ＡＢＣＣ５／ＧＴＦ２Ｈ２およびＥＲＣＣ２／ＧＴＦ２Ｈ２からなる群より選択される、一つまたはそれより多くの遺伝子の発現レベルを検出することを含むことができる。
【００２１】
本発明はまた、ＮＳＣＬＣおよび／または分化性小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の進行、および／または転移性疾患から非転移性疾患を検出する方法も含んでいる。例えば、本発明の方法は、患者におけるＮＳＣＬＣの進行を検出することを含んでおり、前記方法は、表１および／または５からの二つまたはそれより多くの遺伝子の、組織試料中の発現レベルを検出する工程を含んでなる；ここで、表１および／または５中の遺伝子の異なった発現は、ＮＳＣＬＣ進行の指標である。いくつかの好ましい態様において、一つまたはそれより多くの遺伝子は、表５に掲げた遺伝子からなる群より選択することができる。
【００２２】
いくつかの様相において、本発明はＮＳＣＬＣを患った患者の処置をモニタリングする方法を提供し、前記方法は、患者に医薬組成物を投与し、そして患者の細胞または組織試料から遺伝子発現プロフィールを調製し、そして患者の遺伝子発現プロフィールを、正常肺細胞を含んでなる細胞集団からの遺伝子発現と、または肺癌細胞を含んでなる細胞集団からの遺伝子発現プロフィールと、またはその両方と比較することを含んでなる。いくつかの好ましい態様において、遺伝子プロフィールは表１および５の一つまたはそれより多くの遺伝子の発現レベルを含んでいるであろう。別の好ましい態様において、一つまたはそれより多くの遺伝子は、表５に掲げた遺伝子からなる群より選択することができる。
【００２３】
別の様相において、本発明はＮＳＣＬＣを患った患者を処置する方法を提供し、前記方法は、患者に表１および５の少なくとも一つの遺伝子の発現を変化させる医薬組成物を投与し、腫瘍細胞を含んでなる患者の細胞または組織試料から遺伝子発現プロフィールを調製し、そして患者の遺伝子発現プロフィールとＮＳＣＬＣ細胞を含んでなる非処置細胞集団からの遺伝子発現プロフィールを比較することを含んでなる。いくつかの好ましい態様において、一つまたはそれより多くの遺伝子は、表５に掲げた遺伝子からなる群より選択することができる。
【００２４】
本発明は患者における肺癌の存在または非存在を診断する方法を含んでおり、前記方法は、ｃ−ｍｙｃ遺伝子発現値（分子／１０６β−アクチン分子）にＥ２Ｆ−１発現値を掛け、そしてその結果をｐ２１遺伝子発現値で割る、ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１を含んで成るＩＧＥＩの、組織試料中の発現レベルを検出する工程を含んでなる（各々の遺伝子は３つのプライマー配列を有しているので、配列番号４０−４８）。
【００２５】
ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１指標はまた、例えば、肺癌の発達のような疾病進行のモニタリングのためのマーカーとしても使用することができる。例えば、患者からの肺組織試料またはその他の試料を本明細書に記載した任意の方法によりアッセイすることができ、そしてｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１の試料中の発現レベルを、正常肺組織、ＳＣＬＣからの組織、転移性肺癌またはＮＳＣＬＣ組織中に観察された発現レベルと比較することができる。発現データ、ならびに入手可能な配列またはその他の情報の比較は、研究者または診断医により行うことができ、または本明細書に記載したようなコンピューターおよびデータベースの助けを借りて行うことができる。
【００２６】
本発明はさらに、ＮＳＣＬＣの発生または進行を調節可能な剤をスクリーニングする方法も含んでおり、前記方法は、細胞を剤に暴露し；そしてｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１指標の発現レベルを検出する工程を含んでなる。
【００２７】
本発明の一つの様相に従うと、表１および５で同定された遺伝子は、例えば、肺癌細胞または組織試料のような、細胞または組織試料に対する候補薬剤または剤の効果を評価するためのマーカーとして使用することができる。候補薬剤または剤は、既定のマーカーまたはマーカー遺伝子のセット（薬剤標的）の転写または発現を刺激する、またはマーカーまたはマーカー類の転写または発現を下方制御または相殺する能力でスクリーニング可能である。本発明に従うと、遺伝子発現マーカーに対する薬剤効果の特異性も比較でき、それらを比較することが可能である。より特異的な薬剤は、より少ない転写標的を有することができる。二つの薬剤に対して、同様のマーカーのセットが同定されることは、同様の効果を示している。
【００２８】
上に記載した本発明の任意の方法は、表１および／または５またはｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１からの少なくとも二つの遺伝子の検出および定量を含むことができる。好ましい方法は、表中の遺伝子の全てまたはほとんど全てを含むことができる。いくつかの好ましい態様において、一つまたはそれより多くの遺伝子は、表５に掲げた遺伝子からなる群より選択することができる。
【００２９】
別の様相に従うと、本発明は、患者における非小細胞肺癌を診断する方法に関しており、前記方法は：（ａ）ｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の、組織試料中での発現のレベルを検出および定量することを含んでなる；ここでｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の他と異なる発現は、非小細胞肺癌の指標である。
【００３０】
別の様相において、本発明は、患者における非小細胞肺癌の進行を検出する方法に関しており、前記方法は：（ａ）ｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の、組織試料中での発現のレベルを検出および定量することを含んでなる；ここでｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の他と異なる発現は、非小細胞肺癌進行の指標である。
【００３１】
さらに別の様相において、本発明は、非小細胞肺癌の患者の処置をモニタリングする方法に関しており、前記方法は：（ａ）患者に医薬組成物を投与し；（ｂ）患者からの細胞または組織試料から遺伝子発現プロフィールを調製し；および（ｃ）患者の遺伝子発現プロフィールと、正常肺細胞および非小細胞肺癌からなる群より選択される細胞集団からの遺伝子発現を比較する、ことを含んでなる。
【００３２】
さらに別の様相において、本発明は、非小細胞肺癌の患者を処置する方法に関しており、前記方法は：（ａ）患者に医薬組成物を投与し、ここにおいて、組成物は表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の少なくとも一つの遺伝子の発現を改変する；（ｂ）処置前に得られた腫瘍細胞を含んでなる細胞または組織試料および処置後に得られた別の試料から、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用する、標準化遺伝子発現値を含んでなるＩＧＥＩを調製し；および（ｃ）処置に先立って得られた試料と処置後に得られた試料を比較する、ことを含んでなる。
【００３３】
本発明のさらに別の様相は、非小細胞肺癌の発生および進行を調節できる剤のためのスクリーニング法に関しており、前記方法は：（ａ）非小細胞癌細胞を含んでなる細胞集団の、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用する、標準化遺伝子発現値を含んでなる第一のＩＧＥＩを調製し、ここにおいて、第一のＩＧＥＩは、表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の一つまたはそれより多くの遺伝子の発現レベルを決定する；（ｂ）細胞集団を剤に暴露し；（ｃ）剤に暴露された細胞集団の、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用する、標準化遺伝子発現値を含んでなる第二のＩＧＥＩを調製し；および（ｄ）第一および第二のＩＧＥＩを比較する、ことを含んでなる。
【００３４】
別の様相において、本発明は、標準化定量的ＲＴ−ＰＣＲに従ったＰＣＲ生成物を、標準化された様式で測定するための、一つまたはそれより多くの固相ハイブリダイゼーション鋳型に関しており、ここで鋳型は以下のように形成する：
ａ）少なくとも一つの固相ハイブリダイゼーション鋳型を調製し、ここにおいて、各々の遺伝子のため、競合的鋳型（ＣＴ）および天然の鋳型（ＮＴ）の両方に特異的に結合するであろう任意の長さのオリゴヌクレオチドをフィルターにスポットし；
ｂ）フォワードプライマー（ＮＴおよびＣＴの両方に共通）およびリバースＣＴプライマーの３’２０ｂｐ間の領域が評価されるように、適したオリゴヌクレオチドを同定し；
ｃ）前もって選定された位置で、固体支持体へオリゴヌクレオチドを結合させ；
ｄ）ＣＴおよびＮＴ ＰＣＲ生成物を増幅し、そしてフィルターのスポットへハイブリダイズし、そこでは各々の遺伝子（ＮＴおよびＣＴ）が別々に増幅される；
ｅ）ハイブリダイゼーションのためにＰＣＲ生成物をプールし；および
ｆ）各々の遺伝子に対して、各々が異なった蛍光で標識されている、二つのオリゴヌクレオチドプローブを調製し、ここにおいて、一つのオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドが、ＣＴとは相同的ではなく、および異なった蛍光で標識されているＮＴの領域へ結合するように、ＰＣＲ−増幅された遺伝子のためのＮＴに特有の配列に相同的であり、およびそれに結合するであろうし、およびここにおいて、他のオリゴヌクレオチドは、この他のオリゴヌクレオチドが、リバースプライマーの３’末端に広がるＣＴ配列と相同的であり、およびそれに結合するであろうように、ＣＴへ特異的でありおよび異なった蛍光で標識されている。特定の態様において、多数の遺伝子のためのＮＴ−特異的およびＣＴ−特異的オリゴヌクレオチドを等量で混合し、フィルター上にスポットした遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドへ結合された遺伝子−特異的ＰＣＲ生成物とハイブリダイズさせる。また、スポットへ結合された蛍光間の比で、ＣＴに対するＮＴの量を定量化する。ＮＴおよびＮＴプローブ間の結合親和性と比較して、ＣＴおよびＣＴプローブ間には異なった結合親和性があるけれども、この相違は判定された異なった試料間、および一つの実験と別の実験間では一致している。鋳型は、少なくとも一つの標準化された、マイクロアレイ、マイクロビーズ、ガラススライド、または光リソグラフィーにより製造されたチップを含むことができ、および固体支持体は膜、ガラス支持体、フィルター、組織培養皿、多量化物質、ビーズおよびシリカ支持体であり得ることに注目せねばならない。特定の態様において、オリゴヌクレオチドの各々が表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子中の少なくとも一つの遺伝子へ特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる、少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを固体支持体は含んでなる。また、オリゴヌクレオチドは固体支持体に共有結合で結合されていてもよいし、または若しくは固体支持体に非共有結合で結合されていてもよいことにも注目すべきである。
正常肺組織の遺伝子のセットに対して、分子／１０６β−アクチン分子の単位での発現レベル。
【００３５】
本発明はさらに、表１および５中の少なくとも二つの遺伝子またはｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１を含んでなる遺伝子のセットの、肺組織における発現レベルを同定する情報を含んでいる、数的標準化データベースを含んでなるコンピューターシステム；および情報をみるためのユーザーインターフェイスを含んでいる。いくつかの好ましい態様において、一つまたはそれより多くの遺伝子は、表５に掲げた遺伝子からなる群より選択することができる。数的標準化データベースはさらに、遺伝子の配列情報、正常肺組織および悪性組織（転移性および非転移性）における遺伝子のセットの発現レベルを同定する情報も含んでおり、そしてＧｅｎＢａｎｋのごとき外部データベースへのリンクを含むことができる。
【００３６】
本発明はさらに、本発明の一つまたはそれより多くの方法の実行に有用なキットを含んでなる。いくつかの好ましい態様において、キットは、一つまたはそれより多くのオリゴヌクレオチドが結合された、一つまたはそれより多くの固体支持体を含むことができる。固体支持体は高密度オリゴヌクレオチドアレイであることができる。キットはさらに、アレイで使用するための一つまたはそれより多くの試薬、一つまたはそれより多くの信号検出および／またはアレイ処理装置、一つまたはそれより多くの遺伝子発現データベース、および一つまたはそれより多くの分析およびデータベース管理ソフトウェアーパッケージを含むことができる。特定の好ましい態様において、キットは、標準化マイクロアレイへ適用するための試薬と一緒にＳｔａＲＴ−ＰＣＲ試薬を有している。
【００３７】
本発明はさらにまた、組織または細胞中の、表１および５の少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを、データベースの遺伝子発現レベルを比較することを含んでなる、表１および５の少なくとも一つの遺伝子の、組織または細胞中の発現レベルを同定する現在の情報について開示されたコンピューターシステムを使用しているような、データベースを使用する方法を含んでいる。いくつかの好ましい態様において、一つまたはそれより多くの遺伝子は、表５に掲げた遺伝子からなる群より選択することができる。
【００３８】
本発明の他の特色および利点は、発明の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書に記載した材料および方法と同様なまたは均等な材料および方法を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい材料および方法は以下に説明されている。
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明は、一部、癌細胞が療法剤に対して感受性であるかどうかを決定するために使用できる、マーカーの同定および定量に基づいている。これらの同定および定量に基づき、本発明は、限定されるわけではないが、：１）療法剤（または剤の組み合わせ）が腫瘍増殖を停止させるのに、または遅延させるのに有効であるのであろうか、または有効ではないのであろうかどうかを決定するための方法；２）癌の処置に使用された療法剤（または剤の組み合わせ）の有効性をモニタリングするための方法；３）癌処置のための新規療法剤を同定するための方法；４）癌の処置に使用するための療法剤の組み合わせを同定するための方法；５）特定の患者における癌の処置に有効である、特定の療法剤および療法剤の組み合わせを同定するための方法；および癌を診断するための方法、を提供する。
【００４０】
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用されたすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により共通に理解されている意味と同一の意味を持っている。本明細書に記載した材料および方法と同様なまたは均等な材料および方法を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい材料および方法が本明細書に説明されている。本明細書に述べられたすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照文献は、その全体が本明細書に記載されているものとする。本出願を通して引用された（表を含んで）すべてのＧｅｎＢａｎｋ、およびＩＭＡＧＥ ＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍおよびＵｎｉｇｅｎｅデータベースレコードその他のデータベースレコードのコンテンツもまた、本明細書に記載されているものとする。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先するであろう。加えて、材料、方法および実施例は例示のためのみであり、それによって限定されることは意図されていない。
【００４１】
冠詞“ａ”および“ａｎ”は本明細書において、冠詞の文法的目的語が一つまたは一より多い（即ち、少なくとも一つ）ことを指すために使用される。例として、“ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ”は一つのｅｌｅｍｅｎｔまたは一より多いｅｌｅｍｅｎｔを意味している。
【００４２】
“マーカー”は、表１−５に掲げた核酸の少なくとも一つに対応する、天然に存在するポリマーである。例えば、マーカーには、限定するわけではないが、ゲノムＤＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖（即ち、その中に存在する任意のイントロンを含んで）、ゲノムＤＮＡの転写により発生したＲＮＡ（即ち、スプライシングに先立った）、ゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡのスプライシングにより発生したＲＮＡ、スプライスされたＲＮＡの翻訳により発生したタンパク質（即ち、膜貫通シグナル配列のごとき普通は切断される領域の、切断前および後の両方のタンパク質を含んで）、が含まれる。本明細書で使用するような“マーカー”はまた、ゲノムＤＮＡの転写により発生したＲＮＡ（即ち、スプライスされたＲＮＡを含んで）の逆転写により作製されたｃＤＮＡも含むことができる。
【００４３】
用語“プローブ”とは、特別に意図された標的分子へ選択的に結合できる任意の分子を指している、例えば、本発明のマーカー。プローブは、当業者により合成されるか、または適した生物学的調製試料から誘導することが可能である。標的分子の検出の目的には、プローブは、本明細書に記載されているごとく、標識されているように特別に設計することができる。プローブとして利用することができる例には、限定されるわけではないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機モノマーが含まれる。
【００４４】
マーカー発現の“正常”レベルとは、癌に苦しめられていない患者の細胞中でのマーカー発現レベルである。
本明細書で使用するような、用語“プロモーター／制御配列”とは、プロモーター／制御配列に機能可能であるように連結されている遺伝子産物の発現に必要とされる、核酸配列を意味している。いくつかの例において、この配列はコアプロモーター配列であってもよく、そして他の例では、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要とされる、エンハンサー配列および他の制御要素を含んでいてもよい。例えば、プロモーター／制御配列は、組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものであってもよい。
【００４５】
“構成的”プロモーターとは、遺伝子産物をコードまたは特定しているポリヌクレオチドと機能可能であるように連結されている場合、細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件下、生きているヒト細胞中で遺伝子産物の産生を引き起こす、ヌクレオチド配列である。
【００４６】
“転写されたポリヌクレオチド”とは、本発明のマーカーに対応する、ゲノムＤＮＡの転写、および、もしあれば、転写体の正常転写後プロセッシング（例えば、スプライシング）により作製された成熟ＲＮＡの全てまたは一部と相補的または相同的である、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡまたはｃＤＮＡの一つの類似体）である。
【００４７】
“相補的”とは、二つの核酸鎖の領域間または同一核酸鎖の二つの領域間の、配列相補性の広い概念を指している。第一の核酸領域のアデニン残基は、もし残基がチミンまたはウラシルであれば、第一の領域と逆平行である第二の核酸領域の残基と特定の水素結合を形成することができる（“塩基対形成”）ことは知られている。同様に、第一の核酸鎖のシトシン残基は、もし残基がグアニンであれば、第一の鎖と逆平行である第二の核酸鎖の残基と塩基対形成できることも知られている。もし、二つの領域が逆平行様式に配置された場合、第一の領域の少なくとも一つのヌクレオチド残基が第二の領域の残基と塩基対形成できるならば、第一の領域の核酸は、同一または異なった核酸の第二の領域と相補的である。好ましくは、第一の領域は第一の部分を含んでなり、および第二の領域は第二の部分を含んでなり、それにより、第一および第二の部分が逆平行様式に配置された場合、第一の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、および好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％は、第二の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成できる。より好ましくは、第一の部分の全ヌクレオチド残基が、第二の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成できる。
【００４８】
本明細書で使用するような“相同的”とは、同一核酸鎖の二つの領域間、または二つの異なった核酸鎖の領域間のヌクレオチド配列同一性を指している。両方の領域中のヌクレオチド残基位置が同一のヌクレオチド残基で占有されている場合、領域はその位置で相同である。二つの領域間の相同性は、同一のヌクレオチド残基により占有されている、二つの領域のヌクレオチド残基位置の割合によって表現される。好ましくは、第一の領域が第一の部分を含んでなり、および第二の領域が第二の部分を含んでなり、それにより、各々の部分のヌクレオチド残基位置の少なくとも約５０％、および好ましくは約７５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が同一のヌクレオチド残基で占有されている。より好ましくは、各々の部分の全ヌクレオチド残基位置が、同一のヌクレオチド残基で占有されている。
【００４９】
マーカーが、もし共有結合でまたは非共有結合で基質と結合されているとしたら、マーカーは基質へ“固定されて”おり、そのような基質は、基質から解離しているマーカーの実質的分画がなく、液体（例えば、標準クエン酸塩溶液、ｐＨ７．４）で洗い流すことができる。
【００５０】
本明細書で使用するような“天然に存在する”核酸分子とは、天然に存在するヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡを指している（例えば、天然のタンパク質をコードしている）。
【００５１】
もし、癌の少なくとも一つの徴候が緩解され（ａｌｌｅｖｉａｙｒｄ）、終結され（ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）、遅らされ（ｓｌｏｗｅｄ）、または防止され（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）ているならば、癌は“抑制され”ている。本明細書で使用される場合、もし、癌の再発または転移が減少され（ｒｅｄｕｃｅｄ）、遅らされ（ｓｌｏｗｅｄ）、遅延され（ｄｅｌａｙｅｄ）、または防止され（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）ているならば、癌はまた“抑制され（ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ）”ている。もし、細胞増殖が減少し、または細胞死速度が増加するならば、癌はまた抑制されている。
【００５２】
“キット”は、本発明のマーカーを特異的に検出するための、少なくとも一つの試薬、例えば、プローブを含んでなる任意の製品（例えば、包装品または容器）であり、製品は本発明の方法を実行するためのユニットとして、販売促進され、配給され、または販売されている。
【００５３】
具体的態様
以下に提供された例は、定義された化学療法剤、即ち、白金化合物に感受性を有する癌細胞株と、応答性でないものを区別するマーカーの同定および定量に関している。従って、その剤により首尾よく処置できた癌細胞を同定するために、一つまたはそれより多くのマーカーが使用できる。その剤により首尾よく処置できなかった癌細胞を同定するために、一つまたはそれより多くのマーカー発現の変化も使用できる。これらのマーカーは、それ故、剤での処置に不応になったまたは不応になる危険性がある癌を同定するための方法に使用できる。
【００５４】
同定されたマーカーの発現レベルは：１）癌が剤または剤の組み合わせにより処置できるかどうかを決定する；２）癌が剤または剤の組み合わせによる処置に応答しているかどうかを決定する；３）癌を処置するために適した剤または剤の組み合わせを選択する；４）進行中の処置の有効性をモニターする；および５）新規癌処置（単一の剤または剤の組み合わせ）を同定する、ために使用することができる。
【００５５】
特に、同定されたマーカーは、適した治療を決定するため、効力が試験されている薬剤の臨床治療およびヒト試行をモニターするため、および新規剤および治療の組み合わせを開発するために利用することができる。
【００５６】
従って、本発明は、癌細胞を抑制するために剤が使用できるかどうかを決定するための方法を提供し、前記方法は：
ａ）癌細胞の試料を得；
ｂ）表１および５に同定されたマーカーの、癌細胞中での発現レベルを決定し、および定量し；および
ｃ）マーカーが特定のレベルで発現された場合、癌細胞を抑制するために剤が使用できることを同定する、工程を含んでなる。
【００５７】
本発明はまた、剤が癌の処置において有効であるかどうかを決定するための方法も提供し、前記方法は：
ａ）癌細胞の試料を得；
ｂ）試料を剤に暴露し；
ｃ）剤へ暴露された試料中の、および剤へ暴露されていない試料中の、表１および５に同定されたマーカーの発現レベルを決定し、および定量し；および
ｄ）マーカーの発現が、剤の存在下で変化した場合、剤が癌の処置に有効であることを同定する、工程を含んでなる。
【００５８】
本発明はさらに、剤での処置を癌患者で続けるべきかどうかを決定するための方法を提供し、前記方法は：
ａ）剤での処置の過程間に、患者から癌細胞を含んでなる二つまたはそれより多くの試料を得；
ｂ）二つまたはそれより多くの試料中の、表１および５に同定されたマーカーの発現のレベルを決定し、および定量し；および
ｃ）マーカーの発現レベルが特定のレベルである、例えば、処置過程の間に著しくは変化しない場合に処置を続ける、工程を含んでなる。
【００５９】
本発明はまた、新規癌処置を同定する方法を提供し、前記方法は：
ａ）癌細胞の試料を得；
ｂ）表１および５に同定されたマーカーの発現のレベルを決定し、および定量し；
ｃ）試料を癌処置に暴露し；
ｄ）癌処置に暴露した試料中のマーカーの発現のレベルを同定し；および
ｅ）マーカーが特定のレベルで発現されている場合、前記癌処置が癌を処置することにおいて有効であることを同定する、工程を含んでなる。
【００６０】
従って、別の様相において、本発明は癌を診断する方法を提供し、前記方法は：
ａ）癌細胞を含んでいるかもしれない組織の試料を得；および
ｂ）組織中のｃ−ｍｃｙ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１指標の発現レベルを決定し、および定量する、工程を含んでなる。
【００６１】
本明細書において使用するように、剤が癌細胞の増殖を少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％減少できる場合に、剤は癌細胞の増殖速度を減少させたと言える。そのような抑制はさらに、癌細胞の生存可能性の減少、および癌細胞の死亡速度の増加を含んでいる。この決定に使用される剤の量は、選択された剤に基づいて変化するであろう。典型的には、前記の量は前もって決められた治療量であろう。
【００６２】
本明細書で使用するような、用語“剤”は、癌細胞が治療プロトコールで暴露されるであろう任意のものとして広く定義される。本発明の文脈において、そのような剤には、限定されるわけではないが、代謝拮抗剤、例えば、架橋剤、例えば、シスプラチンおよびＣＢＤＣＡのような化学療法剤、放射線および紫外光が含まれる。
【００６３】
上記に加え、術語“化学療法剤”は、細胞または組織の増殖が望まれないような、増殖している細胞または組織の増殖を抑制する、化学試薬を含むことも意図されている。
本方法で試験される剤は単一剤または剤の組み合わせが可能である。例えば、本方法はシスプラチンのごとき単一の化学療法剤が癌を処置するために使用できるかどうか、または二つまたはそれより多くの剤の組み合わせが使用できるかどうかを決定するために使用できる。好ましい組み合わせは、例えば、アルキル化剤と組み合わされた抗有糸分裂剤の使用のような、異なった作用機構を有する剤を含んでいるであろう。
【００６４】
本明細書で使用するように、癌細胞とは、異常な（増加された）速度で分割する細胞を指している。特に、癌細胞には、限定されるわけではないが、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が含まれる。本方法で使用される癌細胞の起源は、本発明の方法がどのように使用されているかに基づくであろう。例えば、もし本方法が、患者の癌が剤または剤の組み合わせで処置できるかどうかを決定するために使用されているとしたら、癌細胞の好ましい起源は、患者の癌バイオプシから得られた癌細胞であろう。もしくは、処置されている癌と類似の型の癌細胞株がアッセイ可能である。例えば、もし非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が処置されているならば、（ＮＳＣＬＣ）細胞株が使用可能である。もし、本方法が療法プロトコールの有効性をモニターするために使用されているとしたら、処置されている患者からの組織試料が好ましい起源である。もし、本方法が新規療法剤または組み合わせを同定するために使用されているとしたら、例えば、癌細胞株のような任意の癌細胞が使用可能である。
【００６５】
当業者は、本方法で使用される適した癌細胞を容易に選択および入手できる。癌細胞株については、実施例で使用されるＮＣＩ細胞は、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのような供給源が好ましい。患者から得られる癌細胞については、針バイオプシのような、標準バイオプシ法を用いることができるが、ｍＲＮＡの完全性を保護するため、本技術分野で知られている必要な予防処置を講じる。
【００６６】
本発明の方法において、表１に同定されたマーカーからなる群より選択された、一つまたはそれより多くのマーカーの発現レベルまたは量を決定する。本明細書で使用するような発現のレベルまたは量とは、遺伝子によりコードされたｍＲＮＡの発現レベル、または遺伝子によりコードされたタンパク質の発現レベルを指している（即ち、癌細胞において発現が起こっているかまたは起こっていないのどちらにせよ）。それはまた、本明細書で開示した相互作用的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）の値を指すこともできる。当業者は、本発明の一つまたはそれより多くの（ＩＧＥＩ）マーカーセットによりコードされているｍＲＮＡレベル検出に使用するための、既知のｍＲＮＡ検出法を容易に適用できる。
【００６７】
癌細胞からのタンパク質は、当業者には公知の技術を使用して単離することができる。用いられたタンパク質単離法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８，抗体：実験室マニュアル，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク）に記載されているような方法が可能である。
【００６８】
試料が、既定の抗体に結合するタンパク質を含んでいるかどうかを決定するために、多様な型式を用いることができる。そのような型式の例としては、限定されるわけではないが、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット分析および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。当業者は、癌細胞が、本発明の一つまたはそれより多くの（ＩＧＥＩ）マーカーセットによりコードされているタンパク質を発現するかどうかの決定に使用するための、既知のタンパク質／抗体検出法を容易に適用できる。
【００６９】
一つの型式において、抗体または抗体断片が、発現されたタンパク質を検出するため、ウェスタンブロットまたは免疫蛍光技術のごとき方法で使用できる。そのような使用において、固体支持体上に抗体かまたはタンパク質を固定化することが好ましい。適した固相支持体または坦体には、抗原または抗体を結合できる任意の支持体が含まれる。公知の支持体または坦体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が含まれる。加えて、固体支持体は、膜、ガラス支持体、フィルター、組織培養皿、多量体材料、ビーズおよびシリカ支持体から選択できる。
【００７０】
特定の態様において、固体支持体は少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含んでなり、ここで各々のオリゴヌクレオチドは、表１および５の少なくとも一つの遺伝子へ特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる。また、固体支持体は、固体支持体に共有結合で結合されている、またはもしくは、固体支持体に非共有結合で結合されているオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００７１】
当業者は、抗体または抗原を結合するために適した坦体を知っているであろうし、そして本発明で使用するためのそのような支持体を適用できるであろう。例えば、癌細胞から単離されたタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により泳動でき、およびニトロセルロースのごとき固相支持体上へ固定化できる。支持体は、次いで、適した緩衝液で洗浄でき、続いて検出可能に標識されたマーカー生成物特異的抗体で処理する。固相支持体は、次いで、非結合抗体を除去するため、緩衝液で二回目の洗浄を行うことができる。固体支持体上の結合された標識量は、次ぎに通常の手段により検出できる。
【００７２】
本発明の別の態様は、本発明の一つまたはそれより多くの（ＩＧＥＩ）マーカーセット発現を剤が刺激するかどうかを検出する工程を含んでいる。本（ＩＧＥＩ）マーカーセットのいくつかは、非処置癌細胞においても発現されているであろうが、剤による処置によって発現を変化させることができる（またはできない）。本発明の（ＩＧＥＩ）マーカーセットの発現レベルの変化は、剤が癌細胞の増殖速度を減少させることに有効であろうか、または有効ではないであろうかどうかのさらなる指標を提供することができる。
【００７３】
そのような使用において、本発明は、剤、例えば、化学療法剤が癌細胞を抑制するために使用できるかどうかを決定するための方法を提供し、前記方法は：
ａ）癌細胞の試料を得；
ｂ）癌細胞試料を一つまたはそれより多くの試験剤へ暴露し；
ｃ）剤へ暴露した試料中の、または剤へ暴露されていない癌細胞試料中の、表１で同定されたマーカーからなる群より選択された一つまたはそれより多くのマーカーの、癌細胞中の発現のレベルを決定し、および定量し；および
ｄ）一つまたはそれより多くのマーカーの発現が前記剤の存在下で増加した場合、および／または前記剤の存在下で一つまたはそれより多くのマーカーの発現が増加しなかった場合、癌を処置するために剤が使用できることを同定する、工程を含んでなる。
【００７４】
本発明の方法のこの態様は、剤に対して癌細胞を暴露する工程を含んでいる。剤に対して癌細胞を暴露するために使用される方法は、主として、癌細胞の起源および性質、および試験されている剤に基づいているであろう。接触はインビトロまたはインビボで、試験／評価されている患者で、または癌の動物モデルで実行できる。癌細胞、細胞株および化学化合物に対して、癌細胞を暴露するとは、組織培養培地中でのように、癌細胞と化合物を接触させることを含んでいる。当業者は、癌細胞と特定の剤または剤の組み合わせを接触させるために適した手順を容易に適用できる。
【００７５】
上で議論したように、同定された（ＩＧＥＩ）マーカーセットはまた、進行中の処置（例えば、化学療法処置）に対して、腫瘍が不応になったかどうかを判定するためにも使用できる。腫瘍が処置にこれ以上応答しない場合は、腫瘍細胞の発現プロフィールが変化するであろう：一つまたはそれより多くのマーカーの発現レベルが減少するであろう、および／または一つまたはそれより多くのマーカーの発現レベルが増加するであろう。
【００７６】
そのような使用において、本発明は、癌患者で抗癌処置を続けるべきかどうかを決定するための方法を提供し、前記方法は：
ａ）抗癌療法をうけている患者から癌細胞の二つまたはそれより多くの試料を得；
ｂ）剤に暴露された試料中の、および剤に暴露されていない癌細胞試料中の、群より選択された一つまたはそれより多くのマーカー、および一つまたはそれより多くの対応する（ＩＧＥＩ）マーカーセットの発現レベルを決定し、および定量し；および
ｃ）一つまたはそれより多くの（ＩＧＥＩ）マーカーセットの発現が変化した場合、処置を中止する、工程を含んでなる。
【００７７】
本明細書で使用されるように、患者とは、癌のための処置をうけている任意の対象を指している。好ましい対象は、化学療法処置をうけているヒト患者であろう。
本発明のこの態様は、抗癌処置をうけている患者から得られた、二つまたはそれより多くの試料を比較することに頼っている。一般に、治療の開始に先立って患者から第一の試料を、そして処置間に一つまたはそれより多くの試料を得るのが好ましい。そのような使用において、治療に先立った発現のベースラインを決定し、次いで、治療の過程間に、発現のベースライン状態の変化をモニターする。もしくは、処置間に得られた二つまたはそれより多くの連続的試料が、処置前ベースライン試料の必要なしで使用できる。そのような使用においては、患者から得られた第一の試料を、特定のマーカーの発現が増加しているかまたは減少しているかどうかを決定するためのベースラインとして使用する。
【００７８】
一般に、療法処置の有効性をモニタリングする場合、患者からの二つまたはそれより多くの試料を試験する。好ましくは、少なくとも一つの処置前試料を含む、三つまたはそれより多くの連続的に得られた試料を使用する。
【００７９】
本発明はさらに、本発明の一つまたはそれより多くの（好ましくは二つまたはそれより多くの）マーカーおよび／または（ＩＧＥＩ）マーカーセットを検出するための試薬を含んでなる、区画化された容器を含んでなる、キットを提供する。本明細書で使用するように、キットは、その中に試薬が入れられている容器の、前もって包装されたセットとして定義される。キット中に含まれている試薬は、（ＩＧＥＩ）マーカーセット発現の検出に使用するためのプローブ／プライマーおよび／または抗体を含んでなる。加えて、本発明のキットは、好ましくは、適した検出アッセイを説明した説明書を含むことができる。そのようなキットは、癌の徴候を示している患者を診断するため、例えば、臨床設定に、便利に使用できる。
【００８０】
本発明の多様な様相が、以下の副節により詳細に説明されている。
核酸試料
当業者には明らかであるが、本発明の方法およびアッセイで使用される核酸試料は、任意の利用可能な方法およびプロセスにより製造することができる。全ｍＲＮＡを単離する方法もまた、当業者には公知である。そのような試料はｍＲＮＡを含むのみでなく、目的の細胞または組織から単離されたｍＲＮＡ試料から合成されたｃＤＮＡも含んでいる。そのような試料はまた、ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、および増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡを含んでいる。当業者は、ホモジネートが使用される前に、ホモジネート中に存在するＲＮａｓｅを阻害または破壊することが望ましいことを理解するであろう。
【００８１】
生物学的試料は、生物体からの生物学的組織または細胞、ならびに、細胞株および組織培養細胞のごときインビトロで生じた細胞であることができる。しばしば、試料は、患者に由来する試料である、“臨床試料”であろう。典型的な臨床試料には、限定されるわけではないが、痰、血液、血液−細胞（例えば、白血球）、組織またはファインニードル（ｆｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅ）バイオプシ試料、尿、腹膜液、および胸腔内液、またはそれらからの細胞が含まれる。生物学的試料にはまた、組織学的目的でとられた凍結切片またはホルマリン固定切片のごとき、組織切片も含まれる。
【００８２】
それ故、本発明の一つの様相は、本発明のマーカーに対応するポリペプチド、またはそのようなポリペプチドの一部をコードする核酸を含む、本発明のマーカーに対応する、単離された核酸分子に関する。本発明の単離された核酸分子はまた、例えば、核酸分子の増幅または突然変異のためのＰＣＲ反応プライマーとして使用するために適した、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸、およびそのような核酸分子の断片を含む、本発明のマーカーに対応する核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するために十分な核酸分子も含んでいる。本明細書で使用されるような、用語“核酸分子”とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、およびヌクレオチド類似体を使用して作られたＤＮＡおよびＲＮＡの類似体を含むことを意図している。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００８３】
“単離された”核酸分子とは、核酸分子の天然の供給源に存在する、他の核酸分子から分離されている核酸分子である。好ましくは、“単離された”核酸分子は、核酸分子が誘導された、生物体のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する配列（好ましくはタンパク質コード配列）を含んでいない（核酸の５’および３’末端に位置する配列）。
【００８４】
例えば、表１に掲げたマーカーに対応するタンパク質をコードしている核酸のような、本発明の核酸分子は、標準分子生物学技術および本明細書に説明したデータベース記録中の配列情報を使用して単離できる。そのような核酸配列のすべてまたは一部を使用し、本発明の核酸分子は、標準ハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，編，分子クローニング：実験室マニュアル，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク，１９８９，に記載されているような）を使用して単離できる。
【００８５】
本発明の核酸分子は、標準ＰＣＲ増幅技術に従い、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを、および適したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅できる。そのように増幅された核酸は、適したベクター内へクローン化でき、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けできる。その上、本発明の核酸分子のすべてまたは一部に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば、自動化ＤＮＡシンセサイザーを使用する、標準合成技術により製造できる。
【００８６】
別の好ましい態様において、本発明の単離された核酸分子は、本発明のマーカーに対応する核酸のヌクレオチド配列、または本発明のマーカーに対応するタンパク質をコードしている核酸のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する、核酸分子を含んでなる。既定のヌクレオチド配列に相補的である核酸分子とは、既定のヌクレオチド配列へハイブリダイズでき、それにより安定な二重鎖を形成する、既定のヌクレオチド配列と十分に相補的である配列である。
【００８７】
さらに、本発明の核酸分子は、核酸配列のほんの一部を含むことができ、ここで、完全長核酸配列は、本発明のマーカーを含んでなるか、またはそれは本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードしている。そのような核酸は、例えば、プローブまたはプライマーとして使用できる。プローブ／プライマーは、典型的には一つまたはそれより多くの実質的に精製されたオリゴヌクレオチドとして使用される。典型的には、オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下、本発明の核酸の少なくとも約７、好ましくは約１２またはそれより多い連続的ヌクレオチドへハイブリダイズする、ヌクレオチド配列領域を含んでなる。
【００８８】
本発明の核酸分子の配列に基づいたプローブは、本発明の一つまたはそれより多くのマーカーに対応する、転写体またはゲノム配列を検出するために使用できる。プローブは、それに結合された、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子のような標識基を含んでなる。そのようなプローブは、例えば、ｍＲＮＡレベルを検出し、またはタンパク質をコードしている遺伝子が突然変異を受けているまたは欠失されているかどうかを決定して、患者からの細胞試料中の、タンパク質をコードしている核酸分子のレベルを測定することによるように、タンパク質を発現しない、細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用できる。
【００８９】
本発明はさらに、同一のタンパク質をコードしているが、遺伝子コードの縮重のため、本発明のマーカーに対応するタンパク質をコードしている核酸のヌクレオチド配列と異なった核酸分子を包含する。
【００９０】
本明細書に記載されている、ＧｅｎＢａｎｋデータベース記録に記載されたヌクレオチド配列に加え、アミノ酸配列の変化を導くＤＮＡ配列多型が集団（例えば、ヒト集団）内に存在できることが、当業者には理解されるであろう。そのような遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異のため、集団内の個体間で存在できる。対立遺伝子は、既定の遺伝子座位で代わりになるものとして生じる、遺伝子の群の一つである。加えて、ＲＮＡ発現レベルに影響するＤＮＡ多型もまた存在可能であり、それはその遺伝子の全発現レベルに影響することができる（例えば、制御または分解に影響することにより）ことを理解されたい。
【００９１】
本明細書で使用するような、句“対立遺伝子変異体”とは、既定の座位で生じたヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドを指している。
【００９２】
本明細書で使用するような、用語“遺伝子”および“組換え遺伝子”とは、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードしている読み取り枠を含んでなる核酸分子を指している。そのような天然の対立遺伝子変異体は、典型的には、既定の遺伝子のヌクレオチド配列中に、１−５％の変異を生じてよい。代わりの対立遺伝子は、多数の異なった個体中の、目的とする遺伝子を配列決定することにより同定できる。このことは、多様な個体中の、同一遺伝子座位を同定するためのハイブリダイゼーションプローブを使用することにより、容易に実行できる。天然の対立遺伝子変異の結果であり、および機能的活性を変化させない、そのようなヌクレオチド変異体および結果としてのアミノ酸多型または変異体はひとつ残らず、本発明の範囲内にあることが意図されている。
【００９３】
別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも７、１５、２０、２５、３０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５５０、６５０、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３５００、４０００、４５００、またはそれより多いヌクレオチド長であり、ストリンジェント条件下、本発明のマーカーに対応する核酸、または本発明のマーカーに対応するタンパク質をコードしている核酸にハイブリダイズする。本明細書で使用するような、用語“ストリンジェント条件下でハイブリダイズする”とは、少なくとも６０％（６５％、７０％、好ましくは７５％）お互いに同一であるヌクレオチド配列がお互いにハイブリダイズして残るような、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を記述することが意図される。そのようなストリンジェント条件は、当業者には知られており、分子生物学における最新のプロトコール，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９８９）の節６．３．１−６．３．６にみることができる。好ましいストリンジェント条件の非制限的例は、６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５度Ｃでのハイブリダイゼーション、続いての０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる、５０−６５度Ｃでの１回またはそれより多くの洗浄である。
【００９４】
集団中に存在できる、本発明の核酸分子の天然に存在する対立遺伝子変異体に加え、当業者は、コードされているタンパク質の生物学的活性を変えることなく、コードされているタンパク質のアミノ酸配列に変化を導く配列変化が、突然変異により導入できることを、さらに認めるであろう。例えば、“非必須”アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導く、ヌクレオチド置換体を作製することができる。“非必須”アミノ酸残基とは、生物学的活性を変化させることなく、野生型配列から変化できる残基であり、一方、“必須”アミノ酸残基は生物学的活性に必要とされる。例えば、多様な種の相同体間で、保存されていないまたは半保存されているだけのアミノ酸残基は、活性には非必須といってもさしつかえなく、それ故、改変の標的となるようである。あるいは、多様な種（例えば、マウスおよびヒト）の相同体間で保存されているアミノ酸残基は、活性に必要であるといってもさしつかえなく、それ故、改変の標的とはならないようである。
【００９５】
従って、本発明の別の様相は、活性に必要とされないアミノ酸残基での変化を含む、本発明のポリペプチドをコードしている核酸分子に関する。そのようなポリペプチドは、本発明のマーカーに対応する天然に存在するタンパク質とは、アミノ酸配列が異なっているが、それでも生物学的活性は保持している。一つの態様において、そのようなタンパク質は、本発明のマーカーに対応するタンパク質の一つのアミノ酸配列と少なくとも４０％同一、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％同一である、アミノ酸配列を有する。
【００９６】
変異体タンパク質をコードしている単離された核酸分子は、コードされたタンパク質内へ一つまたはそれより多くのアミノ酸残基置換、付加または欠損が導入されるように、本発明の核酸のヌクレオチド配列内へ一つまたはそれより多くのヌクレオチド置換、付加または欠損を導入することにより創製できる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ−仲介突然変異誘発のような、標準的技術により導入できる。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、一つまたはそれより多くの推定非必須アミノ酸残基で行われる。“保存的アミノ酸置換”とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基により置換されることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。もしくは、飽和突然変異誘発によるように、突然変異をコード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入でき、生じた突然変異体は、活性を保持する突然変異体を同定するため、生物学的活性でスクリーニングできる。突然変異誘発に続いて、コードされているタンパク質は、組換え的に発現でき、そしてタンパク質の活性を決定できる。
【００９７】
本発明は、本発明のセンス核酸と相補的な、例えば、本発明のマーカーに対応する二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的な、または本発明のマーカーに対応するｍＲＮＡ配列と相補的な、分子であるアンチセンス核酸分子を包含する。従って、本発明のアンチセンス核酸は、本発明のセンス核酸へ水素結合（即ち、アニールする）できる。アンチセンス核酸は、全コード鎖と、またはその一部のみと、例えば、タンパク質コード領域（または読み取り枠）の全てまたは一部と相補的であり得る。アンチセンス核酸分子はまた、本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域の全てまたは一部とアンチセンスでもあり得る。非コード領域（“５’および３’非翻訳領域”）とは、コード領域に隣接し、およびアミノ酸へは翻訳されない５’および３’配列である。
【００９８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０、またはそれ以上のヌクレオチド長であることができる。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で知られている手順を使用する、化学合成および酵素的ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応を使用して構築できる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または、分子の生物学的安定性を増加させるように、またはアンチセンスおよびセンス核酸間で形成された二重鎖の物理学的安定性を増加させるように設計された、種々の修飾ヌクレオチドを使用して化学的に合成でき、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドヌクレオチドが使用できる。アンチセンス核酸を発生させるために使用できる修飾ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５−メトキシカルボキシ−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリンが含まれる。もしくは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向でサブクローン化されている発現ベクターを使用して、生物学的に産生できる（即ち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、目的とする標的核酸に対してアンチセンス配向であろう、以下の副節でさらに説明されている）。
【００９９】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、本発明の選択されたマーカーに対応するポリペプチドをコードしている細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡへハイブリダイズまたは結合し、それによりマーカーの発現を阻害（例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより）するように、対象に投与するか、または生体内原位置で発生させる。ハイブリダイゼーションでは、通常のヌクレオチド相補性により安定な二重鎖を形成するか、または例えば、アンチセンス核酸分子の場合は、二重らせん主溝中の特異的相互作用を通してＤＮＡ二重鎖へ結合する。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路例には、組織部位での直接注射、または卵巣関連体液内へのアンチセンス核酸の注入が含まれる。もしくは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするように修飾でき、そして次ぎに全身的に投与する。例えば、全身投与のためには、例えば、細胞表面レセプターまたは抗原へ結合するペプチドまたは抗体へアンチセンス核酸分子を連結することにより、選択された細胞表面上に発現されるレセプターまたは抗原へ特異的に結合するように、アンチセンス分子を修飾できる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載したベクターを使用して細胞へ送達できる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節下におかれている、ベクター構築物が好ましい。
【０１００】
本発明はまたリボザイムも包含している。リボザイムは、相補的領域を有する、ｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断できる、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。それ故、リボザイムはｍＲＮＡ転写体を触媒的に切断するために使用でき、それにより、ｍＲＮＡによりコードされているタンパク質の翻訳を阻害する。本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードしている核酸分子に特異性を有するリボザイムは、マーカーに対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計できる。
【０１０１】
本発明はまた、三重らせん構造を形成する核酸分子も包含する。例えば、本発明のポリペプチドの発現は、ポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的とし、標的細胞中の遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成させることにより、阻害できる。
【０１０２】
本発明はまた、ＲＮＡ干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）または“ＲＮＡｉ”の使用も包含しており、それは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を虫に導入した時、それが遺伝子発現を阻止できるという観察を説明するためにＦｉｒｅおよび共同研究者（Ｆｉｒｅら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８０６−８１１）により最初に造り出された用語である。ｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物体で、遺伝子特異的、転写後サイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を指図し、遺伝子機能研究のための新しい道具が提供された。
【０１０３】
ＲＮＡ干渉の現象は、Ｂａｓｓ，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４２８−２９（２００１）；Ｅｌｂａｓｈｉｒら，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−９８（２００１）；およびＦｉｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−１１（１９９８）に説明および議論されており、そこには、干渉ＲＮＡを作製する方法も議論されている。“ｓｉＲＮＡ”および“ＲＮＡｉ”は、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指しており、ｓｉＲＮＡが遺伝子または標的遺伝子と同じ細胞中で発現された場合、その二本鎖ＲＮＡは前記遺伝子または標的遺伝子の発現を減少させるまたは抑制する能力を持っている。それ故、“ｓｉＲＮＡ”は、相補的鎖により形成された二本鎖ＲＮＡを指している。ハイブリダイズして二本鎖分子を形成するｓｉＲＮＡの相補的部分は、典型的には、実質的なまたは完全な同一性を有している。一つの態様において、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子と実質的なまたは完全な同一性を有し、および二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する、核酸を指している。ｓｉＲＮＡの配列は、完全長標的遺伝子またはその副配列に一致することができる。典型的には、ｓｉＲＮＡは少なくとも約１５−５０ヌクレオチド長（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各々の相補的配列は１５−５０ヌクレオチド長であり、および二本鎖ｓｉＲＮＡは約１５−５０塩基対長である）、好ましくは約２０−３０塩基ヌクレオチド、好ましくは約２０−２５ヌクレオチド長、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長である。
【０１０４】
多様な態様において、本発明の核酸分子は、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解性を改良するため、塩基部分、糖部分またはホスフェート主鎖で修飾できる。例えば、核酸のデオキシリボースホスフェート主鎖は、ペプチド核酸を発生するように修飾できる。本明細書で使用されるような、用語“ペプチド核酸”または“ＰＮＡ”は、例えば、デオキシリボースホスフェート主鎖が偽ペプチド主鎖により置き換えられ、およびただ四つの天然の核酸塩基が保持されている、ＤＮＡ模倣体のような核酸模倣体を指している。ＰＮＡの中性主鎖は、低イオン強度条件下、ＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、標準固相ペプチド合成を使用して実施できる。
【０１０５】
ＰＮＡは治療および診断応用に使用できる。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写または翻訳停止または抑制性複製を導入することにより、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたはアンチジーン剤として使用できる。ＰＮＡはまた、例えば、ＲＮＡ方向付けＰＣＲクランピング（ｃｌａｍｐｉｎｇ）（他の酵素と組み合わせて使用した場合に人工制限酵素として）により、例えば、遺伝子中の単一塩基対の分析にも使用できる。
【０１０６】
他の態様において、オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的にするため）または細胞膜または血液脳障壁を横切った輸送を容易にする剤のごとき、他の追加の基を含むことができる。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション−引き金（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）切断剤またはインターカレーティング剤で修飾できる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション−引き金架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション−引き金切断剤などのような別の分子とコンジュゲートできる。
【０１０７】
本発明はまた、分子ビーコン（ｂｅａｃｏｎ）が試料中の本発明の核酸の存在を定量するために有用であるように、本発明の核酸と相補的である少なくとも一つの領域を有する、分子ビーコン核酸も含んでいる。“分子ビーコン”核酸とは、相補的領域のセットを含んでなり、およびそれらに付随する蛍光体および蛍光消光剤を有する、核酸である。蛍光体および消光剤は、相補的領域がお互いにアニール化された場合、蛍光体による蛍光が消光剤により消光されるように、核酸の異なった部分に付随している。核酸の相補的領域がお互いにアニール化されなかった場合、蛍光体による蛍光の消光の程度は少ない。
【０１０８】
マイクロアレイ
別の様相において、本発明は、図９ａおよび９ｂに示したように、本明細書で説明した方法によった標準化定量的ＲＴ−ＰＣＲに従い、ＰＣＲ生成物を標準化様式で測定するための、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたは固体支持体の使用を説明している。
【０１０９】
特定の態様において、高密度オリゴヌクレオチドアレイは以下の特性を有して作製できる。各々の遺伝子に対し、競合的鋳型（ＣＴ）および天然の鋳型（ＮＴ）の両方に特異的に結合するであろう、任意の長さのオリゴヌクレオチドをフィルター上にスポットする。適したオリゴヌクレオチドを同定するため、フォワードプライマー（ＮＴおよびＣＴの両方に共通）およびリバースプライマーの３’２０ｂｐ間の領域を評価する。高融点、好ましくは約摂氏７０度以上、を有するオリゴヌクレオチドを、図９ａの前もって選定された位置に、固体支持体へ結合させる；各々の遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドは異なったバー（白抜き、斜線をつけた、横線をつけた）で示されている。
【０１１０】
次ぎに、上に記載した方法に従って増幅したＣＴおよびＮＴ ＰＣＲ生成物をスポットへハイブリダイズする。各々の遺伝子（ＣＴおよびＮＴ）を別々に増幅する。次ぎに、上記および図９ａに図示したように、膜へのハイブリダイゼーションのためにＰＣＲ生成物をプールする。ＣＴおよびＮＴ ＰＣＲ生成物は、図９ａでは細い黒曲線として見られる。
【０１１１】
各々が異なった蛍光で標識されている、二つのオリゴヌクレオチドプローブを各々の遺伝子に対して調製する。一つのオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載した方法を使用してＰＣＲ−増幅した遺伝子のためのＮＴに特有の配列と相同的であり、それに結合するであろう。このオリゴヌクレオチドは、ＣＴと相同的ではないＮＴの領域へ結合し、および異なった蛍光で標識されているであろう。他のオリゴヌクレオチドは、ＣＴへ特異的であり、および異なった蛍光で標識されているであろう。それはリバースプライマーの３’末端に広がるＣＴ配列と相同的であり、およびそれに結合するであろう。多数の遺伝子のためのＮＴ−特異的およびＣＴ−特異的オリゴヌクレオチドを等量で混合し、フィルター上にスポットした遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドへ結合された遺伝子−特異的ＰＣＲ生成物とハイブリダイズさせる。スポットへ結合された蛍光間の比から、ＣＴに対するＮＴの量を数量化できるであろう。蛍光タグ付けプローブ（黒く影付けした）はＮＴに特異的であり、および蛍光タグ付けプローブ（影付けしていない）はＮＴに特異的である。
【０１１２】
このアッセイにおいて、ＮＴおよびＮＴプローブ間の結合親和性と比較して、ＣＴおよびＣＴプローブ間には異なった結合親和性があるけれども、この相違は判定された異なった試料間、および一つの実験と別の実験間では一致しているであろう。
【０１１３】
この方法はまた、例えば、マイクロビーズ、ガラススライド、または光リソグラフィーにより製造されたチップを含む、他の固相ハイブリダイゼーション鋳型でも働く。たとえどんな鋳型を使用しても、競合鋳型の標準混合物を使用した標準化ＲＴ−ＰＣＲの生成物が、マイクロビーズ遺伝子の特異性を、マイクロアレイ上の位置ではなく、ビーズの蛍光色により与えている図９ｂのマイクロビーズで示されているように、出発点であろう。
【０１１４】
シスプラチン
以下に示された例は、シス−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）、さもなくばシスプラチンとして知られている、および関連化合物に関する。シスプラチンは、関連化合物のファミリーであると当該分野で認められている、白金配位錯体のファミリー内の化学化合物である。シスプラチンは、抗悪性腫瘍特性を有することが示された最初の白金化合物である。術語“白金化合物”は、シスプラチン、シスプラチンと構造的に類似している化合物、ならびに、シスプラチンの類似体および誘導体を含むことが意図されている。術語“白金化合物”はまた、“模倣物”も含んでいる。“模倣物”は、シスプラチンと構造的に類似していなくても、インビボでシスプラチンまたは構造的に関連した化合物の治療活性を模倣する化合物を含むことも意図される。
【０１１５】
本発明の白金化合物は、対象（患者）における腫瘍増殖を抑制するために有用である化合物である。１０００以上の白金含有化合物が合成されており、そして治療特性が試験されている。これらの内の一つ、カルボプラチンは卵巣癌の処置に承認されている。シスプラチンおよびカルボプラチンの両者とも静脈内送達に敏感に反応する。しかしながら、本発明の化合物は、かなり多数の戦略により、治療的送達のために処方できる。用語白金化合物はまた、医薬として受容可能な塩および関連化合物を含むことも意図されている。白金化合物は以前に、米国特許第６，００１，８１７、５，９４５，１２２、５，９４２，３８９、５，９２２，６８９、５，９０２，６１０、５，８６６，６１７、５，８４９，７９０、５，８２４，３４６、５，６１６，６１３および５，５７８，５７１号に記載されており、それら全てが特に本明細書において援用される。
【０１１６】
シスプラチンおよび関連化合物は、拡散により細胞内へ入ると考えられており、そこで分子は代謝的処理を受けるようであり、薬剤の活性代謝物を生じ、それが次ぎに核酸およびタンパク質と反応する。シスプラチンは、二機能性アルキル化剤の生化学的特性と類似のものを有しており、ＤＮＡと架橋した鎖間、鎖内および一機能性付加物を産生する。
【０１１７】
データベース
本発明は、例えば、表１および５の遺伝子のための配列情報、ならびに多様な肺組織試料における遺伝子発現情報を含む、リレーショナル数的標準化データベースを含む。データベースはまた、配列情報に関連した遺伝子についての記述的情報、または組織試料の臨床的状態または試料が誘導された患者に関する記述的情報のごとき、既定の配列または組織試料に関連する情報も含んでいる。データベースは、例えば、配列データベースおよび遺伝子発現データベースのような異なった部分を含むように設計することができるそのようなデータベースの構造および構築のための方法は、広く入手可能である。
【０１１８】
本発明の数的標準化データベースは、外側または外部データベースとリンクすることができる。好ましい態様において、表１−５に記載されているように、外部データベースはＧｅｎＢａｎｋおよびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）により維持されている関連データベースである。
【０１１９】
配列情報、遺伝子発現情報およびデータベース内または入力として提供されている他の情報間の必要な比較を実施するため、任意の適したコンピュータープラットフォームを使用することができる。例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ、Ｃｌｉｅｎｔ−ｓｅｒｖｅｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓから入手可能なように、多数のコンピューターワークステーションが多様な製造業者から入手可能であり、データベースサーバーおよびネットワークもまた、広く入手可能であり、および本発明のデータベースのために適したプラットフォームも入手可能である。
【０１２０】
本発明の標準化数的データのデータベースは、中でも、既定の遺伝子が発現された細胞型または組織をユーザーが決定することを可能にし、および特定の組織または細胞中の、既定の遺伝子の存在または発現レベルを可能にする、電子ノーザン（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）を作るために使用することができる。
【０１２１】
本発明のデータベースはまた、組織中の表１−５の少なくとも一つの遺伝子の発現レベルとデータベース中の少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを比較する工程を含んでなる、表１−５の少なくとも一つの遺伝子を含んでなる遺伝のセットの組織または細胞での発現レベルを同定する情報を提出するためにも使用することができる。そのような方法は、試料からの、表１−５の遺伝子または遺伝子類の発現レベルと、正常肺、悪性肺またはＮＳＣＬＣからの組織で観察された発現レベルを比較することにより、既定の組織の生理学的状態を予測するために使用することができる。
【０１２２】
コンピューターシステム
別の様相において、本発明は、（ａ）表１−５の少なくとも二つの遺伝子またはｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−ａ／ｐ２１を含んでなる、遺伝子のセットの肺組織における発現レベルを同定する、標準化数的遺伝子発現情報を含んでいるデータベース；および（ｂ）情報を見るためのユーザーインターフェイス、を含んでなるコンピューターシステムに関する。データベースはさらに、一つまたはそれより多くの下記のものを含むことができる：遺伝子の配列情報；正常肺組織における遺伝子のセットの発現レベルを同定する情報；非小細胞癌組織における遺伝子のセットの発現レベルを同定する情報；外部データベースからの記述的情報を含んでいる記録、その情報は前記遺伝子と外部データベース中の記録を関連付けている；例えば、外部データベースがＧｅｎＢａｎｋの場合を含んで、および細胞または組織または患者に由来する情報または特別な特性。
【０１２３】
別の様相において、本発明は、組織または細胞中の表１および５の少なくとも一つの遺伝子の発現レベルとデータベース中の遺伝子の発現レベルを比較することにより、表１および５の少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを同定する情報を提供するため、上記のコンピューターシステムを使用する方法に関する。特定の態様において、少なくとも２、５、７および／または１０の遺伝子が比較される。
【０１２４】
さらに別の様相において、本方法は、肺癌における発現レベルと比較された、組織または細胞試料中の、少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを示すことを含んでいる。
キット
本発明はさらに、高密度オリゴヌクレオチドアレイ、マイクロアレイで使用するための試薬、遺伝子特異的プライマーおよび内部標準の標準化混合物を含む、特定された遺伝子のＳｔａＲＴ−ＰＣＲのための試薬、信号検出およびアレイプロセッシング装置、遺伝子発現データベース、および上記の分析およびデータベース管理ソフトウェア、の少なくとも一つを、異なった組合わせで、併用しているキットを含んでいる。本キットは、例えば、試験化合物の毒性応答を予測するまたはモデル化するために、疾患状態の進行をモニターするために、新規薬剤標的としての見込みを示す遺伝子を同定するために、および本明細書に議論されたような既知のおよび新規に設計された薬剤をスクリーニングするために使用することができる。
【０１２５】
特定の態様において、本キットは、前記遺伝子の遺伝子発現情報とひとまとめにされた、本明細書に記載したような少なくとも一つの固体支持体を含んでいる。特定の態様において、遺伝子発現情報は、毒素に暴露された組織または細胞試料中の遺伝子発現レベルを含んでなる。また特定の態様において、遺伝子発現情報は、例えば、本明細書に記載した標準化遺伝子発現データベースを含んでいる、電子フォーマットの形である。キットにひとまとめにされたデータベースは、ヒトまたは実験動物遺伝子および遺伝子断片（表１および５の遺伝子に対応している）からの発現パターンの編集物である。データは正常および疾患両方の組織の宝庫（ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）から集められており、再現可能で、定量的結果（即ち、既定の条件下で遺伝子が上方制御されたかまたは下方制御されたかの程度で）を提供する。
【０１２６】
キットは、薬剤開発に関連する高い費用のため、早い薬剤試験が強く必要とされている、しかしバイオインフォマティックス、特に遺伝子発現インフォマティックスが未だ欠けている、製薬工業で有用である。これらのキットは、細胞培養および実験動物を使用する伝統的な新規薬剤スクリーニングに関連する、費用、時間および危険性を減少させる。前もって群分けした患者集団の大規模薬剤スクリーニング、薬理ゲノミクス試験の結果はまた、より大きな効力およびより少ない副作用を有する薬剤を選択するためにも応用できる。本キットはまた、そのような大規模試験を行うための施設をそれ自身では有していない、より小さなバイオテクノロジー企業および研究所でも使用することができる。
【０１２７】
マイクロアレイで使用するために設計されたデータベースおよびソフトウェアは、Ｂａｌａｂａｎら、米国特許第６，２２９，９１１号、少量または大量のマイクロアレイから集められ、索引を付けた表として保存された情報を管理するためのコンピューター実行法、および米国特許第６，１８５，５６１号、多様な疑問に対する答えを出すためにデータに追加の属性を付加しおよび再配列する、遺伝子発現レベルデータを集めるためのデータ発掘能力を有する、コンピューターに基づく方法、に議論されている。Ｃｈｅｅｅｔら、米国特許第５，９７４，１６４号は、基準配列へハイブリダイズした、野生型および突然変異体配列間の、プローブ蛍光強度の相違に基づいた、核酸配列中の突然変異を同定するための、ソフトウェアに基づいた方法を開示している。
【０１２８】
治療的および薬剤スクリーニング標的のアッセイおよび同定
特定の態様において、本明細書に記載したような、特に、図９ａおよびｂに示された例に関する、マイクロアレイは特に有用であることを理解しなければならない。しかしながら、特定の他の態様において、溶液に基づいた、および固体支持体に基づいたアッセイ形式を含む、他のハイブリダイゼーションアッセイ形式を使用することができることもまた理解しなければならない。本発明の差別的に発現された遺伝子のためのオリゴヌクレオチドプローブ含有固体支持体は、フィルター、ポリビニルクロリド皿、シリコンまたはガラスチップなどであることができる。そのようなウェハースおよびハイブリダイゼーション法は広く入手可能である。直接的または間接的に、共有結合的にまたは非共有結合的にオリゴヌクレオチドを結合できる固体表面が使用できる。固体支持体の例には、高密度アレイまたはＤＮＡチップが含まれる。これらは、アレイ上の前もって決められた位置に特定のオリゴヌクレオチドプローブを含んでいる。各々の前もって決められた位置は、一つまたはそれより多くのプローブの分子を含むことができるが、前もって決められた位置内の各々の分子は同一配列を有している。そのような前もって決められた位置はフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）と名付けられた。例えば、一つの固体支持体上に、約２、１０、１００、１０００から１０，０００；１００，０００または４００，０００のそのようなフィーチャーが存在することができる。固体支持体またはその中のプローブが結合されている領域はおよそ平方センチメートル程度であることができる。
【０１２９】
発現モニタリングのためのオリゴヌクレオチドプローブアレイは、当該技術分野で知られている任意の技術に従って、作製および使用できる。そのようなプローブアレイは、本明細書に記載した、二つまたはそれより多くの遺伝子と相補的である、もしくはハイブリダイズする少なくとも二つまたはそれより多くのオリゴヌクレオチドを含むことができる。そのようなアレイはまた、本明細書に記載した、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、７０、１００またはそれより多くの遺伝子と相補的である、もしくはハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも含むことができる。
【０１３０】
最小数の合成工程でオリゴヌクレオチドの高密度アレイを形成する方法が知られている。オリゴヌクレオチド類似物アレイは、限定されるわけではないが、光指向性化学カップリング、機械的指向性カップリングを含む多様な方法により固体支持体上に合成できる。簡単には、ガラス表面でのオリゴヌクレオチドアレイの光指向性コンビナトリアル合成は、自動化ホスホロアミデート化学およびチップマスキング技術を使用して行われる。一つの具体的実行において、ガラス表面を官能基、例えば、感光性保護基によりブロックされたヒドロキシルまたはアミノ基を含んでいるシラン試薬で誘導体化する。光リソグラフィーマスクを通した光分解を、官能基を選択的に暴露するために使用すると、それらは到来する５’光保護ヌクレオシドホスホロアミデートと反応する調製ができている。ホスホロアミデートは、照射された部位（このように、感光性保護基の除去により暴露された）でのみ反応する。従って、ホスホロアミデートは、前工程で選択的に暴露された領域にのみ付加する。これらの工程を、固体表面上に配列の所望のアレイが合成されるまで繰り返す。アレイ上の異なった位置での、異なったオリゴヌクレオチド類似体のコンビナトリアル合成は、合成間の照射のパターンおよびカップリング試薬の添加の順序により決定される。
【０１３１】
前記のものに加え、単一基質上にオリゴヌクレオチドのアレイを発生させるため、追加の方法が使用できる。高密度核酸アレイはまた、あらかじめ決定された位置に、あらかじめ作製されたまたは天然核酸を沈着させることによっても製作できる。合成または天然核酸は、光指向性標的化およびオリゴヌクレオチド指向性標的化により、基質の特定の位置に沈着できる。別の態様は、特定のスポットに核酸を沈着するため、領域から領域へ移動する分配器を使用する。
【０１３２】
ＩＧＥＩの決定
既定の薬剤への感受性が知られていない癌性細胞の試料は、患者から得られる。（ＩＧＥＩ）マーカーセットとして、本明細書に特許請求されたヌクレオチド配列の一つに対応する遺伝子について、試料中の発現レベルを測定する。試料中のマーカーの発現レベルを、既知の薬剤感受性を有する細胞において以前に測定されたマーカーの発現レベルと比較する。もし、試料中のマーカーの発現レベルが、既定の薬剤に対して低い感受性を有する細胞中のマーカーの発現レベルとほとんど同様であれば、その薬剤に対する低い感受性がその試料に対して予測される。もし、試料中のマーカーの発現レベルが、既定の薬剤に対して中程度の感受性を有する細胞中のマーカーの発現レベルとほとんど同様であれば、その薬剤に対する中程度の感受性がその試料に対して予測される。もし、試料中のマーカーの発現レベルが、既定の薬剤に対して高い感受性を有する細胞中のマーカーの発現レベルとほとんど同様であれば、その薬剤に対する高い感受性がその試料に対して予測される。
【０１３３】
それ故、癌細胞の試料中の、一つまたはそれより多くの同定されたマーカーの発現を試験することにより、適した処置剤として使用するためには、どの治療剤（類）または剤の組合わせかを決定することが可能である。
【０１３４】
治療的処置の過程の間、患者からとられた癌細胞の試料における、一つまたはそれより多くの同定されたマーカーの発現を試験することにより、治療剤が引き続いて働いているかどうか、または、癌が処置プロトコールに対して抵抗性（不応）になったかどうかを決定することが可能である。これらの決定は、患者ごとの基準で、または剤ごと（または剤の混み合わせ）に行うことができる。それ故、特定の治療処置が特定の患者または患者の群／クラスのためになっているらしいかどうか、または特定の処置をつづけるかどうか、を決定することができる。
【０１３５】
同定された（ＩＧＥＩ）マーカーセットはさらに、化学療法用化合物のごとき、抗癌剤の開発のための、以前には未知のまたは認識されていない標的を提供し、そして癌処置のための単一剤処置ならびに剤の組合わせの開発における標的として使用できる。
【実施例】
【０１３６】
実施例
当業者は、本発明の剤の構造的性質については制限がないことを容易に認識できる。そのようであるので、さらなる説明なしに、前述の説明および以下の例示的実施例を使用して、当業者は、本発明の化合物を作製および利用でき、および特許請求された方法を実施できると信じられる。ゆえに、以下の作業実施例は、本発明の好ましい態様を特別に指摘しており、開示の残りをいかなる点でも制限していると解釈すべきではない。
【０１３７】
一つの態様において、シスプラチンに対する感受性の既に決定された範囲を有する、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株のセットにおける多様な多薬剤耐性遺伝子を判定するため、標準化ＲＴ（ＳｔａＲＴ）−ＰＣＲが用いられた。データは１０６β−アクチン（ＡＣＴＢ）分子と相対的な標的遺伝子分子の形で得られた。異なった細胞株間のＡＣＴＢ相違の影響を打ち消すため、個々の遺伝子発現値を、別の遺伝子に対する一つの遺伝子の比の中に組み込んだ。各々の２−遺伝子比を、多重回帰を使用して、８つのＮＳＣＬＣ細胞株の各々の化学耐性に対して、１変数として比較した。バリデーション（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）後、化学耐性と最も相関した１変数モデル（ｐ＜０．００１）を決定した。特定の態様において、変数モデルは：ＥＲＣＣ２／ＸＰＣ、ＡＢＣＣ５／ＧＴＦ２Ｈ２、ＥＲＣＣ２／ＧＴＦ２Ｈ２、ＸＰＡ／ＸＰＣおよびＸＲＣＣ１／ＸＰＣ、を含んでいた。すべての１変数モデルを、２変数モデルに達するように序列的に試験した。最も高い相関を有する２変数モデルは（ＡＢＣＣ５／ＧＴＦ２Ｈ２、ＥＲＣＣ２／ＧＴＦ２Ｈ２）であり、０．９６のＲ２値であった（ｐ＜０．００１）。特定の態様において、これらのマーカーは、シスプラチン耐性腫瘍の将来を見越して同定するための、ファインニードル吸引バイオプシのような、組織の少量試料の判定に適している。
【０１３８】
ＳｔａＲＴ−ＰＣＲは、２０のＮＳＣＬＣ細胞株間で、最も低い（Ｈ４６０）および最も高い（Ｈ１４３５）化学耐性であると以前に報告されている二つの細胞株における、ＤＮＡ修復、多薬剤耐性、細胞周期およびアポトーシスに関与している３５の遺伝子の発現を測定するために使用する、Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｚａｈｏｒｃｈａｋ，Ｒ．，Ｖａｒｎａｖａｓ，Ｌ．，Ｃａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，カルボプラチンに対して変動した感受性を有する肺癌細胞株における、マイクロアレイおよび標準化ＲＴ−ＰＣＲ分析による発現パターンの比較，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１（抄録）４２，６０６。Ｔｓａｉ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｈａｎｇ，Ｋ．Ｔ．，Ｗｕ，Ｌ．Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｙ．，Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｍｉｔｓｕｄｏｎｉ，Ｔ．，Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｐｅｒｎｇ，Ｒ．Ｐ．，非小細胞肺癌細胞株における、固有の化学耐性とＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子発現、ｐ５３突然変異および細胞増殖特性間の相関、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９６），５６，２０６−１０９。ＤＮＡ修復（ＥＲＣＣ２，ＸＲＣＣ１）および薬剤流入／流出（ＡＢＣＣ５）に関与する遺伝子が、化学耐性と関連している。これら二つのカテゴリーの各々からの遺伝子数を、総合されたＤＮＡ損傷認識および修復に関連する（ＤＤＩＴ３）、特にＮＥＲに関連する（ＬＩＧ１、ＥＲＣＣ３、ＧＴＦ２Ｈ２、ＸＰＡ、ＸＰＣ）、または薬剤輸送に関連する（ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＣ１０）、追加の代表的遺伝子を含むように拡大した。これら１２の遺伝子の発現を、変動したシスプラチン耐性を有する８つのＮＳＣＬＣ細胞株で測定した。Ｔｓａｉ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｈａｎｇ，Ｋ．Ｔ．，Ｗｕ，Ｌ．Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｙ．，Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｍｉｔｓｕｄｏｎｉ，Ｔ．，Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｐｅｒｎｇ，Ｒ．Ｐ．，非小細胞肺癌細胞株における、固有の化学耐性とＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子発現、ｐ５３突然変異および細胞増殖特性間の相関、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９６），５６，２０６−１０９。ＳｔａＲＴ−ＰＣＲデータは、基準遺伝子としてＡＣＴＢを使用して得られた。それ故、データはｍＲＮＡ分子／１０６ ＡＣＴＢ分子の形で報告されている。これらのデータは、Ｗｉｌｌｅｙ 米国特許第５，６３９，６０６、５，６４３，７６５および５，８７６，９７８号、Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７、ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｄｕｒｚｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｚａｈｅｒ，Ａ．，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｅ．Ｒ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，遺伝子発現指標ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ１／ｐ２１はヒト気管支上皮細胞における悪性表現型を高度に予知するものである，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９８），１９，１８−２４、に記載されている定量的逆転写酵素−ＰＣＲ法を使用し、表現型に直接関係する一つまたはそれより多くの遺伝子を分子に置き、および表現型に否定的に関係する一つまたはそれより多くの遺伝子を分母に置くことにより相互的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）内へ結合させた。ＩＧＥＩは、特定の癌表現型に対して、個々の遺伝子の発現レベルよりもより良好に表現型を予知するものである。Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７。ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｄｕｒｚｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｚａｈｅｒ，Ａ．，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｅ．Ｒ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，遺伝子発現指標ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ１／ｐ２１はヒト気管支上皮細胞における悪性表現型を高度に予知するものである，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９８），１９，１８−２４。Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．，Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｆｅｒｅｎｃａｋ，Ｗ．Ｊ．，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｃ．Ａ．，Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，グルタチオントランスフェラーゼＰ１、グルタチオントランスフェラーゼＭ３、およびグルタチオンペルオキシダーゼの正常気管支上皮細胞発現は、気管支原性癌を患った患者においては低い，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０００），６０，１６０９−１６１８。Ｒｏｔｓ，Ｊ．Ｇ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｊａｎｓｅｎ，Ｇ．，Ｖａｎ Ｚａｎｔｗｉｊｋ，Ｃ．Ｈ．，Ｎｏｏｒｄｈｕｉｓ，Ｐ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｋｕｉｐｅｒ，Ｅ．，Ｖｅｒｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ｐｉｅｔｅｒｓ，Ｒ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｇ．Ｊ．，標準化競合鋳型に基づいたＲＴ−ＰＣＲ法により決定した、小児期白血病におけるメトトレキセート耐性−関連タンパク質のｍＲＮＡ発現レベル，Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０００），１４，２１６６−２１７５。ＩＧＥＩのさらなる利点は、一つの細胞株と別の細胞株間での、基準遺伝子値（この場合ＡＣＴＢ）において以前に観察されている変動をＩＧＥＩが調節することである。Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７。ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｄｕｒｚｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｚａｈｅｒ，Ａ．，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｅ．Ｒ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，遺伝子発現指標ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ１／ｐ２１はヒト気管支上皮細胞における悪性表現型を高度に予知するものである，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９８），１９，１８−２４。分子の１遺伝子が、分母の別の１遺伝子で割られた場合、基準値は数学的に相殺される。ＩＧＥＩ値を、変動した耐性を有する８つのＮＳＣＬＣ細胞株間で、シスプラチン化学耐性を比較した。結果は次ぎに、追加の６つのＮＳＣＬＣ細胞株で確認した。
【０１３９】
実施例１
材料および方法
細胞培養
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）細胞株Ｈ４６０、Ｈ１１５５、Ｈ２３、Ｈ８３８、Ｈ１３３４、Ｈ１４３７、Ｈ１３５５、Ｈ１４３５、Ｈ３５８、Ｈ３２２、Ｈ４４１、Ｈ５２２、Ｈ２２６およびＨ６４７はアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックビル，ＭＤ）から入手した。全ての細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１ｍＭグルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｉｎｃ．，ロックビル，ＭＤ）中、５％ＣＯ２存在下、３７℃でインキュベートした。増殖性の、サブコンフルエント培養物を、ＲＮＡ抽出および続いての分析に使用した。
【０１４０】
試薬
Ｒａｐｉｄｃｙｃｌｅｒのための１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭトリス，ｐＨ８．３；２．５ｍｇ／μｌ ＢＳＡ；３０ｍＭ ＭｇＣｌ２）は、Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（アイダホフォールズ，ＩＤ）から入手した。Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、オリゴｄＴプライマー、ＲＮａｓｉｎ（２５Ｕ／μｌ）およびｄＮＴＰはＰｒｏｍｅｇａ（マディソン，ＷＩ）から入手した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）および５Ｘ第一鎖緩衝液（２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．３；３７５ｍＭ ＫＣｌ； １５ｍＭ ＭｇＣｌ２；５０ｍＭ ＤＴＴ）はＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（ゲイサーブルグ，ＭＤ）から入手した。色素、マトリックスおよび基準物質を含んでいるＤＮＡ ７５００アッセイキットはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（パロアルト，ＣＡ）から入手した。全ての他の化学薬品および試薬は、分子生物学用であった。
【０１４１】
ＲＮＡ抽出および逆転写
全ＲＮＡは、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔプロトコール（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，シンシナチ，ＯＨ）により、細胞培養物から単離した。Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．，細胞および組織試料からのＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質の一工程同時単離のための試薬，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９３），１５，５３６−５３７。抽出に続いて、各々の細胞株について約１μｇの全ＲＮＡを、Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｏｙ，Ｅ．，Ｂｒｏｌｌｙ，Ｃ．，Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．，Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ，Ｊ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．，Ｃａｉｒｎｓ，Ｋ．，ヒト上皮および肺胞マクロファージ細胞における生体異物代謝酵素遺伝子発現，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９６），１４，２６２−２７１、において以前に記載されているように、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマーを使用して逆転写した。
【０１４２】
定量的標準化ＲＴ（ＳｔａＲＴ）−ＰＣＲ
遺伝子発現を、米国特許第５，６３９，６０６；５，６４３，７６５；および５，８７６，９７８号、およびＷｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７、Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｏｙ，Ｅ．，Ｂｒｏｌｌｙ，Ｃ．，Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．，Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ，Ｊ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．，Ｃａｉｒｎｓ，Ｋ．，ヒト上皮および肺胞マクロファージ細胞における生体異物代謝酵素遺伝子発現，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９６），１４，２６２−２７１、Ａｐｏｓｔｏｌａｋｏｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｃｈｕｅｒｍａｎｎ，Ｗ．Ｈ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．，Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，多発性競合的ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子発現の測定，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９３），２１３，２７７−２８４．Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｏｙ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．，Ｔｏｒｒｅｓ，Ａ．，Ａｐｏｓｔｏｌａｋｏｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｏｅｈｎ，Ｇ．，Ｓｃｈｕｅｒｍａｎｎ，Ｗ．Ｈ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．，Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ，Ｊ．，Ｃｒｅｐｓｉ，Ｃ．Ｌ．Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．，喫煙者および非喫煙者の肺細胞における、チトクロームｐ４ａ５０ １Ａ１，１Ｂ１，および２Ｂ７、ミクロソームエポキシド加水分解酵素およびＮＡＤＰＨ酸化還元酵素発現の、定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）１７，１１４−１２４に記載されている定量的ＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロトコールを使用して決定した。簡単には、緩衝液、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、試料ｃＤＮＡ、Ｔａｑポリメラーゼおよび競合的鋳型（ＣＴ）混合物を含んでいるマスター混合物を調製し、その９μｌずつを、１μｌの遺伝子特異的プライマーを含んでいる０．６ｍｌの微量遠心管内へ分配した。ＣＴ混合物は、お互いに関して決められた濃度での遺伝子特異的内部標準競合的鋳型（ＣＴ）を、およびまた、すべての特異的遺伝子データの規格化を可能にする、ハウスキーピング遺伝子（ＡＣＴＢ）のためのＣＴも含んでいる。ＰＣＴのために使用されたすべてのプライマー、およびＣＴの構築に使用されたプライマーは、表１に掲げられている。ＰＣＲ反応は、Ｒａｐｉｄｃｙｃｌｅｒ（Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）中、９４℃での変性を５秒、５８℃でのアニーリングを１０秒、および７２℃での伸長を１５秒、のＰＣＲを３５サイクル行った。ＰＣＲ生成物は電気泳動で分離し、ＤＮＡ ７５００アッセイキットを用い、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で定量した。
【０１４３】
ＮＳＣＬＣ細胞株の化学耐性
いくつかの化学療法剤に対して使用されたＮＳＣＬＣ細胞株の化学耐性ＩＣ５０（μＭ）値は、Ｔｓａｉ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｈａｎｇ，Ｋ．Ｔ．，Ｗｕ，Ｌ．Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｙ．，Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｍｉｔｓｕｄｏｎｉ，Ｔ．，Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｐｅｒｎｇ，Ｒ．Ｐ．，非小細胞肺癌細胞株における、固有の化学耐性とＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子発現、ｐ５３突然変異および細胞増殖特性間の相関、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９６），５６，２０６−１０９、に記載されているように以前に決定されており、表２でシスプラチンについて要約されている。
【０１４４】
統計分析
最初の８ＮＳＣＬＣ細胞株の各々からの、別の遺伝子に対した一つの遺伝子の比を、シスプラチン耐性を最もよく予測する遺伝子の組合わせを決定するため、ＳＡＳ（バージョン６，第４版、第２巻）統計パッケージ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．，キャリー，ＮＣ）による多重回帰分析にかけた。各々の比を別々に化学耐性と比較し、次ぎに最も高いＲ２値に基づいた２変数モデルを達成するため、耐性に有意な相関（Ｒ２≧０．８８、ｐ＜０．００１）を有する比を序列的に試験した。追加の６細胞株の判定後、１４すべてのＮＳＣＬＣ細胞株の結果を合併し、説明したような分析にかけた。
【０１４５】
結果：再現性
三つまたはそれより多くの反復値が得られた、遺伝子発現測定間では、平均変動係数は３８．５％であった（生データはウェブサイトで入手可能）。これは、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲ法を使用した他の遺伝子発現研究で観察された再現性と同等である。Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７、Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．，Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｆｅｒｅｎｃａｋ，Ｗ．Ｊ．，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｃ．Ａ．，Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，グルタチオントランスフェラーゼＰ１、グルタチオントランスフェラーゼＭ３、およびグルタチオンペルオキシダーゼの正常気管支上皮細胞発現は、気管支原性癌を患った患者では低い，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０００），６０，１６０９−１６１８。
【０１４６】
個々の遺伝子発現測定および化学耐性
８細胞株についての、個々の遺伝子発現平均値対シスプラチン化学耐性の直接比較の結果が表３に示されている。すべてのＳｔａＲＴ−ＰＣＲデータ値は、分子／１０６ＡＣＴＢ分子の形で示されている。判定された遺伝子の８／１２に対して、有意な（ｐ＜０．０５）相関が存在した。
【０１４７】
相互作用的遺伝子発現比の確立
最初の８ＮＳＣＬＣ細胞株（グループ１）から得られたデータについて、一つの遺伝子の発現値を別の遺伝子の発現値で割る、全ての可能な組合わせを含んでなるＩＧＥＩを確立した。各々の発現値は、分子／１０６ＡＣＴＢ分子として計算した。それ故、これらのＩＧＥＩにおいて、基準遺伝子（ＡＣＴＢ）の影響は打ち消されている。例えば、
ＥＲＣＣ２分子／１０６ＡＣＴＢ分子÷ＸＰＣ分子／１０６ＡＣＴＢ分子＝
ＥＲＣＣ２分子／ＸＰＣ分子。
【０１４８】
各々の２遺伝子対対応するシスプラチンＩＣ５０化学耐性値の二変量分析を８細胞株間で実施した（表４）。判定される遺伝子が１２で、各々の遺伝子について１１のセットがあるため、１３２の比を生じる。各々の遺伝子に対する１１の比のセットを、最初にリストに掲げられた比のセットが、化学耐性との平均相関が最も高く、および最後にリストに掲げられた比セットが、化学耐性との平均相関が最も低くなるように、降順に組織的構成した。それ故、ＥＲＣＣ２と他の１１遺伝子の各々との間の比が、評価された１２の遺伝子間で最も明確であったので、分子にＥＲＣＣ２を有する比セットが最初にリストに掲げられた。対照的に、ＸＰＣと他の１１遺伝子の各々との間の比は、化学耐性とは最も否定的な相関を有していたので、分子にＸＰＣを有する比セットは最後にリストに掲げられた。
【０１４９】
化学耐性を有する遺伝子発現のモデル化
比、ＥＲＣＣ２／ＸＰＣ、ＡＢＣＣ５／ＧＴＦ２Ｈ２、ＥＲＣＣ２／ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ２／ＧＴＦ２Ｈ２、ＸＰＡ／ＸＰＣ、ＸＲＣＣ１／ＸＰＣおよびＡＢＣＣ５／ＸＰＣは、単純線形回帰により、最初の８ＮＳＣＬＣ細胞株中で同定された、最良の１変数モデル（即ち、それらはＲ２＞０．８７）であった（表５）。モデルへ第二の変数を加えた影響を次ぎに判定した。最良の２変数モデルは、０．９６のをＲ２を有する（ＡＢＣＣ５／ＧＴＦ２Ｈ２、ＥＲＣＣ２／ＧＴＦ２Ｈ２）であった。
【０１５０】
モデルのバリデーション
これらの１および２変数モデルを、追加の６ＮＳＣＬＣ細胞株で試験した。１４すべてのＮＳＣＬＣ細胞株について合併したデータの統計分析から、三つの一変数モデル（ＥＲＣＣ２／ＸＰＣ、ＡＢＣＣ５／ＧＴＦ２Ｈ２、ＸＲＣＣ１／ＸＰＣ）、ならびに二変数モデルについてはｐ値が改良され、またはそのままであった。ＥＲＣＣ２／ＧＴＦ２Ｈ２およびＸＰＡ／ＸＰＣに対するｐ値の下落は小さく、そして有意ではなかった。対照的に、ＥＲＣＣ２／ＸＲＣＣ１は化学耐性に関係してもはや有意ではなく、およびＡＢＣＣ５／ＸＰＣに対してはｐ値が著しく下落した。
【０１５１】
結果の分析
個々の遺伝子に対する値をＩＧＥＩ内に取り込み、そしてＩＧＥＩを化学耐性と相関付ける、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲで遺伝子発現を測定することにより得られた結果は、培養ＮＳＣＬＣ細胞におけるシスプラチン化学耐性を予言するものとして有用な、いくつかのモデルを提供する。これらのモデルは、ＡＢＣＣ５、ＥＲＣＣ２、ＸＰＡおよびＸＲＣＣ１を含んでいる、シスプラチン化学耐性に関係する遺伝子を含んでなる。ＭＲＰ５としても知られているＡＢＣＣ５の増加した発現は、インビボでの肺癌における白金薬剤への暴露、および／または生体異物への慢性薬剤応答に関係している。それ故、増加したＡＢＣＣ５レベルを伴う、白金薬剤に対して増加した耐性は、グルタチオン Ｓ−白金複合体流入によるものであろう。
【０１５２】
化学耐性に直接関係する残りの遺伝子、ＸＰＡおよびＥＲＣＣ２は、シスプラチンのごとき化学療法剤により誘導されるＤＮＡ損傷に応答する主修復応答であると一般的に認識されている、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）機構の成分である。ＮＥＲにおいて、ＸＰＡは主ＤＮＡ破壊認識タンパク質であり（Ａｓａｈｉｎａ，Ｈ．，Ｋｕｒａｏｋａ，Ｉ．，Ｓｈｉｒａｋａｗａ，Ｍ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｅ．Ｈ．，Ｍｉｕｒａ，Ｎ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｅ．，Ｏｋａｄａ，Ｙ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，ＸＰＡタンパク質は多様な種類のＤＮＡ損傷を認識する能力を有する亜鉛金属タンパク質である，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（１９９４），３１５，２２９−２３７）、および破壊部位へいくつかの他のタンパク質を動員することにより、ＮＥＲ複合体の組み立ての鍵となる要素である、Ｌｉ，Ｌ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ａ．，Ｌｕ，Ｘ．，Ｌｅｇｅｒｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，ＥＲＣＣ１の会合を妨げるＸＰＡ中の突然変異は、ヌクレオチド除去修復における欠陥を生じさせる，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９９５），１５，１９９３−１９９８。促進されたＮＥＲ遺伝子発現は、シスプラチンおよび他のＤＮＡ損傷化学療法剤に対する耐性の主な原因であることが示されており（Ｚａｍｂｌｅ，Ｄ．Ｂ．，Ｌｉｐｐａｒｄ，Ｓ．Ｊ．，癌化学療法におけるシスプラチンおよびＤＮＡ修復，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（１９９５），２０，４３５−４３９、Ｒｅｅｄ，Ｅ．，抗癌薬剤：白金類似体、癌：腫瘍学の原理および実際、中、（１９９３），３９０−３９９，編集者Ｖ．Ｔ．Ｄｅｖｉｔａ Ｊｒ．，Ｓ．ＨｅｌｌｍａｎおよびＳ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，リッピンコット，フィラデルフィア）、およびＮＥＲのＸＰＡ遺伝子成分の過剰発現は、ヒト卵巣癌におけるシスプラチンへの耐性に関係していた。Ｄａｂｈｏｌｋａｒ，Ｍ．，Ｖｉｏｎｎｅｔ，Ｊ．，Ｂｏｓｔｉｃｋ−Ｂｒｕｔｏｎ，Ｆ．，Ｙｕ，Ｊ．Ｊ．，Ｒｅｅｄ，Ｅ．，白金に基づいた化学療法への応答と相関した、卵巣癌中のＸＰＡＣおよびＥＲＣＣ１のメッセンジャーＲＮＡレベル，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９４），９４，７０３−７０８。ＥＲＣＣ２は特に、７つのポリペプチドから成る転写因子ＩＩＨ（ＴＦＩＩＨ）の成分であり（Ｍｕ，Ｄ．，Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｈ．，Ｍａｔｓｕｎａｇａ，Ｔ．，Ｈｓｕ，Ｄ．Ｓ．，Ｒｅａｒｄｏｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｓａｎｃａｒ，Ａ．，高度に限定されたシステムにおけるヒトＤＮＡ修復除去ヌクレアーゼの再構築，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５），２７０，２４１５−２４１８、Ｍｕ，Ｄ．，Ｈｕｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｓａｎｃａｒ，Ａ．，ヒトＤＮＡ修復除去ヌクレアーゼの反応機構，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６），２７１，８２８５−８２９４）、および全体として修復因子である。Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｌ．，Ｍｏｎｃｏｌｌｉｎ，Ｖ．，Ｒｏｙ，Ｒ．，Ｓｔａｕｂ，Ａ．，Ｍｅｚｚｉｎａ，Ｍ．，Ｓａｒａｓｉｎ，Ａ．，Ｗｅｅｄａ，Ｇ．，Ｈｏｅｉｊｍａｋｅｒｓ，Ｊ．Ｈ．，Ｅｇｌｙ，Ｊ．Ｍ．，ＥＲＣＣ２／ＤＮＡ修復タンパク質はクラスＩＩ ＢＴＦ２／ＴＦＩＩＨ転写因子と関係している，ＥＭＢＯ Ｊ （１９９４），１３，２３８８−２３９２、Ｄｒａｐｋｉｎ，Ｒ．，Ｒｅａｒｄｏｎ，Ｊ．Ｔ．，Ａｎｓａｒｉ，Ａ．，Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｚａｗｅｌ，Ｌ．，Ａｈｎ，Ｋ．，Ｓａｎｃａｒ，Ａ．，Ｒｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．，ＤＮＡ除去修復およびＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写における、ＴＦＩＩＨの二重の役割，Ｎａｔｕｒｅ （１９９４），３６８，７６９−７７２、Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｓｖｅｊｓｔｒｕｐ，Ｊ．Ｑ．，Ｆｅａｖｅｒ，Ｗ．Ｊ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｄ．，Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ，Ｅ．Ｃ．，転写因子ｂ（ＴＦＩＩＨ）は、酵母におけるヌクレオチド除去修復の間に必要とされる，Ｎａｔｕｒｅ（１９９４），３６８，７４−７６。ＮＥＲにおいて、ＥＲＣＣ２（またはＸＰＤ）はＴＦＩＩＨヘリカーゼ活性に必須であり（Ｐｒａｋａｓｈ，Ｓ．，Ｓｕｎｇ，Ｐ．，Ｐｒａｋａｓｈ，Ｌ．，サッカロミセス セレビジエのＤＮＡ修復遺伝子およびタンパク質，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９３），２７，３３−７０）、および、ＥＲＣＣ２はＧＴＦ２Ｈ２（またはｐ４４）と特異的に相互作用し、そしてこの相互作用は５’から３’のヘリカーゼ活性の刺激を生じることが、より最近に示されている。Ｃｏｉｎ，Ｆ．，Ｍａｒｉｎｏｎｉ，Ｊ．Ｃ．，Ｒｏｄｏｆｌｏ，Ｃ．，Ｆｒｉｂｏｕｒｇ，Ｓ．，Ｐｅｄｒｉｎｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｅｇｌｙ，Ｊ．Ｍ．，ＸＰＤヘリカーゼ遺伝子の突然変異は、ＸＰＤおよびＴＦＩＩＨのｐ４４サブユニット間の相互作用を妨げる、ＸＰおよびＴＴＤ表現型を生じる，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ，２０，１８４−１８８。
【０１５３】
マイクロアレイ分析では、数千の遺伝子が同時に判定されるので、測定された全ての遺伝子の指標は、一つのマイクロアレイと別のマイクロアレイとに添加された試料量に対する安定な基準を提供する。典型的には、定量的ＲＴ−ＰＣＲ研究においては、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、シクロフィリンまたはリボソームＲＮＡのごとき、単一の制御されない遺伝子が添加基準として使用される。しかしながら、これらの遺伝子の全てが、多数の試料間で変動することが報告されている。多数の試料間の基準遺伝子発現における試料内変動を判定する一つの方法は、二つの基準遺伝子間の変動を比較することである。β−アクチンおよびＧＡＰＤＨは、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）間のお互いに関して５０倍、およびＢＥＣおよび他の細胞型間ではさらに大きく変動する。Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７。Ｒｏｔｓ，Ｊ．Ｇ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｊａｎｓｅｎ，Ｇ．，Ｖａｎ Ｚａｎｔｗｉｊｋ，Ｃ．Ｈ．，Ｎｏｏｒｄｈｕｉｓ，Ｐ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｋｕｉｐｅｒ，Ｅ．，Ｖｅｒｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ｐｉｅｔｅｒｓ，Ｒ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｇ．Ｊ．，標準化競合鋳型に基づいたＲＴ−ＰＣＲ法により決定した、小児期白血病におけるメトトレキセート耐性−関連タンパク質のｍＲＮＡ発現レベル，Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０００），１４，２１６６−２１７５。限定された数の遺伝子が測定される状況においては（＜ ２００）、データの規格化のための全遺伝子の指標は、十分に安定ではない。試料間の基準遺伝子発現における未知の影響を取り除くため、別の遺伝子発現値に対するＳｔａＲＴ−ＰＣＲにより得られた一つの遺伝子発現値の平衡比を分析した。これらの平衡比は、比を含んでなる、個々の遺伝子の実際の細胞濃度変化を示してはいないが、しかし、別のものに対する遺伝子の発現に関係しており、化学耐性のごとき表現型決定因子を比較するためには使用される。この研究において、ＩＧＥＩ分析（表５）で、化学耐性に関する個々の遺伝子発現値の分析により得られた結果（表３）のほとんどが確認された。特に、ＸＰＣは化学耐性に関して判定された１２の遺伝子で最も安定であり、同様に８の遺伝子が、分母としてβ−アクチンを使用する場合（表３）のように、分母としてＸＰＣを使用し、化学耐性に相関していた。それ故、ｃＤＮＡ試料のこのグループ間のβ−アクチンにおいての変動は有意ではなかった。特定の態様において、いつでも可能な、基準遺伝子発現における変動の潜在的影響に関する疑問を取り除くため、ＩＧＥＩを使用することは有用である。
【０１５４】
表４に示されたように、測定された遺伝子すべてのための発現値から誘導された平衡比（ＩＧＥＩ）の経験的誘導セットを評価することにより、遺伝子のセットと表現型間の関連の強さに関する序列を確立することが可能である。さらに、他の各々に関する各々の遺伝子の二変量相関は、分析の力を著しく増強し、そしてさらなるバリデーションを必要とする潜在的アウトライアー（ｏｕｔｌｉｅｒ）を同定するのを助ける。本明細書の実施例において、最も明白なアウトライアーは、ＥＲＣＣ２／ＸＲＣＣ１と化学耐性間の高い相関である。これは、（ａ）分子にＥＲＣＣ２あるいはＸＲＣＣ１を有する比のセットは、各々の最もおよび四番目に高い範囲のｒ値を有していた、さらに、（ｂ）高いｒ値を有していた、分子にＥＲＣＣ２を有する他の比のすべてが、分母に表４の下部からの遺伝子（即ち、ＸＰＣ、ＧＴＦ２Ｈ２、ＡＢＣＣ１０、ＥＲＣＣ３およびＬＩＧ１すべてが表の最小の中に存在した）を有していた、のでアウトライアーである。ＥＲＣＣ２／ＸＲＣＣ１がアウトライアーであることと一致して、グループ２細胞株が評価された場合、ＥＲＣＣ２／ＸＲＣＣ１はもはや化学耐性とは有意に関連していない（表５）。これらの発見は、標準、数的形式で遺伝子発現を測定する価値の、さらなる証拠を提供している。それ故、ＥＲＣＣ２、ＡＢＣＣ５、ＸＰＡおよびＸＲＣＣ１と化学耐性の関係は、（ａ）多くの異なった機能的クラスを示している遺伝子の、第一回目のスクリーニング、（ｂ） 第一回目で正に関係している遺伝子により代表された遺伝子の拡大されたグループを評価し、（ｃ）正に連結されたデータを、相互作用的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）内に合併し、（ｄ）アウトライアーを同定するためにＩＧＥＩ分析を使用し、（ｅ）モデルを組み立て、および（ｆ）データをバリデーションする、ことを含んでいる、連続的プロセスを通して確立された。
【０１５５】
本発明の方法は、シスプラチン化学耐性に関与する一つより多くの遺伝子の相互作用、および化学耐性を生じさせることができる多数の経路の相互作用を評価する必要性を強調している。
【０１５６】
実施例ＩＩ
多くの遺伝子の同定および具体的表現型とのそれらの関係は、おそらく分子癌分類へと導くであろう。（Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．ヒトゲノムの配列，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：１３０４−１３５１（２００１）、Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．，ヒトゲノムの最初の配列決定および分析，Ｎａｔｕｒｅ，４０９：８６０−９２１（２００１））。この新規分類システムは重要な臨床的意味を有しており、患者看護を非常に改良することができる。特に、関係する表現型を有する特定の遺伝子型の認識は、個々の予後マーカー、化学感受性体質を明らかにし、そして患者結果を予測することができる。肺癌の分子分類は、細胞学的診断を非常に促進させることができる。肺癌は未だに、組織病理学的基準を使用して主として診断されている。肺腫瘍の不均一性は、悪性および正常、および転移性肺腫瘍および原発性腫瘍を区別することの困難さ（Ｓｈｉｒａｋｕｓａ，Ｔ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｍ．，Ｍｏｔｏｍａｇａ，Ｒ．Ａｎｄｏ，Ｋ．およびＫｕｓａｎｏ Ｔ．，Ａ．Ｓｕｒｇ．，５４：６５５−６５８，１９６６；Ｆｌｉｎｇ，Ａ．およびＬｌｏｙｄ，Ｒ．Ｖ．，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１６６：３９−４２，１９９２）を含む、しばしば相反する診断を導く（Ｓｏｒｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｈｉｒｓｃｈ，Ｆ．Ｒ．，Ｇａｚｄａｒ，Ａ．，およびＯｌｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｃａｎｃｅｒ，７１：２９７１−２９７６，１９９３）。
【０１５７】
遺伝子発現パターンは、肺および乳癌患者において、臨床結果を明白にした。Ｇａｒｂｅｒらは，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：１３８７４−１３７８９（２００１）、伝統的な形態学的分類と相関した肺腫瘍の遺伝子発現プロフィールを報告している。加えて、遺伝子発現パターンに基づいて、腺癌をさらに、患者生存率が有意に異なっている三つのサブタイプへ分割した。Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅらは，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９８：１３７９９９９０−１３７９５（２００１）、類似の結果を報告した。肺腺癌を遺伝子発現パターンに基づいて、四つのサブクラスへグループ分けし、および患者は統計的に有意な生存率の相違を有していた。彼らはまた、遺伝子発現プロフィールに基づいて、形態学的には原発性肺腫瘍と同定された、三つの転移性肺腫瘍も同定した。遺伝子発現プロフィールに基づいた乳癌腫瘍の分子分類、および患者の結果および細胞増殖速度との相関も、遺伝性乳癌、散発性乳癌およびヒト乳腺上皮細胞の場合に報告されている（Ｈｅｎｄｅｎｆａｌｋら，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３４４：５３９−５４８，２００１；Ｓｏｒｌｉｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：１０８６９−１０８７４，２００１；およびＰｅｒｏｕら，ヒト乳腺上皮細胞および乳癌における特有の遺伝子発現パターン，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６巻，１６号：９２１２−９２１７，１９９９）。
【０１５８】
ほとんどの肺癌は、主としてファインニードル吸引（ＦＮＡ）バイオプシ組織、胸膜液試料および気管支上皮細胞のブラッシング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）により診断される。これらの少量の再生できない組織試料は、遺伝子発現研究に使用するには挑戦的である。マイクロアレイ法は、多数の癌表現型に関与する可能性のある数千の遺伝子のスクリーニングには適しているが、しかし、必要とされる大量の初期ＲＮＡ量、内部標準の欠如、費用および時間のため、ＦＮＡ遺伝子発現分析には適していない。（Ｔｙａｇｉ，Ｓ．およびＫｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０８，１９９６；ＤｅＲｉｓｉ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８：６８６０−６８６６，１９９７）。標的遺伝子同定後、遺伝子発現分析を、定量的、標準化遺伝子発現法でさらに評価すべきである。
【０１５９】
ＳｔａＲＴ−ＰＣＲ（標準化逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）は、少量の臨床試料で使用するには理想的な遺伝子発現法である。それは数百の遺伝子を同時に測定するのに有用であり、少量のＲＮＡしか必要とせず、安価な装置を使用し、感度が高く、標準化されており、および高度に再現できる（Ｗｉｌｌｅｙら、，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：６−１７，１９９８、Ｃｒａｗｆｏｒｄら，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｇｏｄｆｒｉｄｕｓ，Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｎｏｏｒｄｈｕｉｓ，Ｐ．，Ｒｏｔｓ，Ｍ．Ｇ．，Ｖｏｎｄｒａｃｅｋ，Ｍ．，Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｌｉｅｕａｌｌｅｎ，Ｋ．，Ｌｅｎｎｏｎ，Ｇ．，Ｚａｈｏｒｃｈａｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｇｅｏｒｇｅｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｌｉ，Ａ．，Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．，Ｆａｎ，Ｐ−Ｓ．，Ｋａｈａｌｅｈ，Ｂ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，およびＷｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．（２００１），標準化ＲＴ（ＳｔａＲＴ）−ＰＣＲを使用する、盲検試験で得られた、多実験室間の再現性のある遺伝子発現測定，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ６：２１７−２２５，２００１）。悪性、化学耐性および転移性表現型は、多くの遺伝子の相互作用的影響から生じるようである。ＳｔａＲＴ−ＰＣＲ研究においてはデータが数的であるため、表現型は相互作用的遺伝子発現指標（（ＩＧＥＩ）により表すことができる。Ｄｅｍｕｔｈらは、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：１８−２４，１９９８、ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１の遺伝子発現指標は、測定された個々の遺伝子よりも良好にヒト気管支上皮細胞における悪性度を予測することを報告している。同様の研究において、ｍＧＳＴ ｘ ＧＳＴＭ３ ｘ ＧＳＨＰＸ Ｘ ＧＳＨＰＸＡ ｘ ＧＳＴＰ１の胃が指標は感度が高く（９０％）、そして気管支原性癌の患者からの正常気管支原性上皮細胞の検出が７６％特異的であった（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６０：１６０９−１６１８，２０００）。特に、この相互作用的遺伝子発現指標は、任意の単一遺伝子よりも良好に気管支原性癌発生の危険性を有する個体を同定した。
【０１６０】
ＳｔｓＲＴ−ＰＣＲ反応ごとに標準化された競合鋳型を包含させることによって、直接的実験室内および実験室間データ比較が可能になる（Ｗｉｌｌｅｙら，１９９８）。Ｃｒａｗｆｏｒｄら（２００１）は、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用する高実験室間再現性を報告している（Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｇｏｄｆｒｉｄｕｓ，Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｎｏｏｒｄｈｕｉｓ，Ｐ．，Ｒｏｔｓ，Ｍ．Ｇ．，Ｖｏｎｄｒａｃｅｋ，Ｍ．，Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｌｉｅｕａｌｌｅｎ，Ｋ．，Ｌｅｎｎｏｎ，Ｇ．，Ｚａｈｏｒｃｈａｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｇｅｏｒｇｅｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｌｉ，Ａ．，Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．，Ｆａｎ，Ｐ−Ｓ．，Ｋａｈａｌｅｈ，Ｂ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，およびＷｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．（２００１），標準化ＲＴ（ＳｔａＲＴ）−ＰＣＲを使用する、盲検試験で得られた、多実験室間の再現性のある遺伝子発現測定，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ６：２１７−２２５，２００１）標準化された数的データの産生は、共通の多施設データベースを確立するために必要とされる。多重標準化ＲＴ−ＰＣＲと称される、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲの最近の改変は、遺伝子発現研究に必要とされる出発材料の量をさらに減少させた（Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｚａｈｏｒｃｈａｋ，Ｒ．Ｊ．，およびＷｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，少量の臨床試料における多くの遺伝子の発現分析のための多重標準化ＲＴ−ＰＣＲ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２９３：５０９−５１６，２００２）。多重ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用し、少なくとも９６の遺伝子が、１つの遺伝子の測定のために普通使用されるｃＤＮＡ量と同じ量を使用して、同時に評価することができる（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、上記文献）。この方法は、ＦＮＡにより得られた気管支原性癌試料中の、化学耐性に関連すると推定される１８の遺伝子を、同時に測定するために使用した。
【０１６１】
この実施例は、高いｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１遺伝子発現指標が気管支原性癌の細胞病理学的診断を増強できるかどうかを決定する。ｃ− ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１の標準化遺伝子発現値および相互作用的遺伝子悪性度指標は、８つの原発性肺ＦＮＡ試料について決定した。
【０１６２】
材料および方法
細胞培養
Ｈ１１５５ヒトＮＳＣＬＣ細胞株はＡＴＣＣ（マナサス，ＶＡ）から購入し、ゲンタマイシン（０．１％）（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，ロックビル，ＭＤ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，セントルイス，ＭＯ）を補給したＲＰＭＩ中で培養した（３７℃、５．０％ＣＯ２）。
【０１６３】
ＲＮＡ保存、抽出および逆転写の評価
Ｈ１１５５ヒトＮＳＣＬＣ細胞株（１．０ Ｅ６）を、ＲＮＡ抽出に先立って、Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔ（ＣＹＴＹＣ／ボックスボロー，ＭＡ）、ＲＮＡ−Ｌａｔｅｒ Ａｍｂｉｏｎ／オースチン，テキサス）またはＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，シンシナチ，ＯＨ）に置いた。ＲＮＡの質が評価された時間点および温度は、１、３、１０および３０日および室温、４℃および−２０℃であった。ＲＮＡは、製造業者のプロトコールに従って、Ｔｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して抽出した。抽出後、ＲＮＡの質を、１８ｓおよび２８ｓリボソームピーク検出のためのＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで評価した。ｍＲＮＡ試料は、前に記載したようにＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ゲイサーブルグ，ＭＤ）およびオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ，マディソン，ＷＩ）を使用して逆転写した。（ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｄｕｒｚｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｚａｈｅｒ，Ａ．，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｅ．Ｒ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，遺伝子発現指標ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ１／ｐ２１はヒト気管支上皮細胞における悪性表現型を高度に予知するものである，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９８），１９，１８−２、Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．，Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｆｅｒｅｎｃａｋ，Ｗ．Ｊ．，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｃ．Ａ．，Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，グルタチオントランスフェラーゼＰ１、グルタチオントランスフェラーゼＭ３、およびグルタチオンペルオキシダーゼの正常気管支上皮細胞発現は、気管支原性癌を患った患者では低い，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０００），６０，１６０９−１６１８）。
【０１６４】
ユニプレックス（ｕｎｉｐｌｅｘ）−ＳｔａＲＴ−ＰＣＲ
ＳｔａＲＴ−ＰＣＲは、Ｇ．Ｅ．Ｎ．Ｅシステム１発現キット（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ，Ｉｎｃ．）を用い、以前に公表されているプロトコールを使用して実施した（Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｏｂａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，競合鋳型の標準化混合物を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、多くの遺伝子の同時発現測定，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８），１９，６−１７、ＤｅＭｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｄｕｒｚｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｚａｈｅｒ，Ａ．，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｅ．Ｒ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，遺伝子発現指標ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ１／ｐ２１はヒト気管支上皮細胞における悪性表現型を高度に予知するものである，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９８），１９，１８−２、Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｍ．，Ｕｔｅｌｌ，Ｍ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｆｅｒｅｎｃａｋ，Ｗ．Ｊ．，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｃ．Ａ．，Ｈａｍｍｅｒｓｌｅｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，グルタチオントランスフェラーゼＰ１、グルタチオントランスフェラーゼＭ３、およびグルタチオンペルオキシダーゼの正常気管支上皮細胞発現は、気管支原性癌を患った患者では低い，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０００），６０，１６０９−１６１８、Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．，Ｇｏｄｆｒｉｄｕｓ，Ｊ．Ｐ．， Ｎｏｏｒｄｈｕｉｓ，Ｐ．，Ｒｏｔｓ，Ｍ．Ｇ．，Ｖｏｎｄｒａｃｅｋ，Ｍ．，Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｌｉｅｕａｌｌｅｎ，Ｋ．，Ｌｅｎｎｏｎ，Ｇ．，Ｚａｈｏｒｃｈａｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｇｅｏｒｇｅｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｌｉ，Ａ．，Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．，Ｆａｎ，Ｐ−Ｓ．，Ｋａｈａｌｅｈ，Ｂ．，Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．，（２００１），標準化ＲＴ（ＳｔａＲＴ）−ＰＣＲを使用する、盲検試験で得られた、多実験室間の再現性のある遺伝子発現測定，投稿中、遺伝子発現システム１説明書、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ，Ｉｎｃ．（２０００），ｗｗｗ．ｇｅｎｅｘｎａｔ．ｃｏｍ．）。
【０１６５】
システム１キットには、６つのＣＴ混合物Ａ−Ｆおよび適切なプライマーが含まれている。“標的遺伝子”ＣＴの濃度は、“基準遺伝子”アクチンの濃度と比較し、各々の混合物中で変化する。マスター混合物は、ＲＮａｓｅを含まない水、ＭｇＣｌ２緩衝液、ｄＮＴＰ、ｃＤＮＡ、Ｇ．Ｅ．Ｎ．Ｅ．システム１キットからのＣＴ混合物、およびＴａｑポリメラーゼを含んでいた。マスター混合物を、個々の遺伝子プライマーを含んでいるチューブに入れ、Ｒａｐｉｄｃｙｃｌｅｒ（Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，アイダホフォールズ，ＩＤ）でサイクルを回した。各々のサイクルに対し、変性温度は９４℃であり、アニーリング温度は５８℃であり、および伸長温度は７２℃であった。増幅後、各々のＰＣＲ生成物を、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ試験機でのキャピラリー電気泳動により分析した。遺伝子発現値を決定するため、各々の天然鋳型（ＮＴ）の曲線下の領域を、その関係する競合鋳型（ＣＴ）の領域と比較した。各々の発現値の単位は、１０６β−アクチン分子数当たりの分子数であった。
【０１６６】
気管支原性癌試料の取得
原発性肺癌のファインニードル吸引（ＦＮＡ）物は、オハイオの医科大学で患者から得られた。各々の手順に先立って、ＮＩＨおよび施設のガイドラインに従って、通知され、署名された同意を患者から得た。ほとんどの細胞は、診断目的のため、スライド上に直接置いた。診断目的に必要とされない細胞は、Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔ（登録商号）溶液（ＣＹＴＹＣ／ボックスボロー，ＭＡ）に集めた。最後の細胞病理学的診断後、Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔ中に残っている細胞を、我々の実験室でペレット化し、そしてＲＮＡを抽出した。細胞数および生存度を、ガラススライド上の細胞の分析を通して細胞で評価した。
【０１６７】
結果
ＦＮＡ検体におけるＲＮＡの最適収集および保存を決定するための試みにおいて、Ｈ１１５５細胞（ＮＳＣＬＣ）を３つの保存試薬ＲＮＡ Ｌａｔｅｒ、ＰｒｅｓｅｒｖｃｙｔおよびＴｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔ、に置いた。ＲＮＡに対する時間および温度の影響を決定するため、Ｈ１１５５を４℃または−２０℃で、１、３、１０および３０日保った。
【０１６８】
＋＋として示されている高質ＲＮＡ（１８ｓおよび２８ｓリボソームバンドの存在を示した）は、各々の試薬中で１０日まで保存されたＨ１１５５ ＮＳＣＬＣ細胞で検出された（表６）。３０日保存後でも、ＰｒｅｓｅｒｖｃｙｔおよびＴｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔ中では、同じように良好に保存された。ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｌａｔｅｒ中、３０日保存後に、４℃では部分的に分解しており（＋−）、−２０℃では保存されなかった。
【０１６９】
ＲＮＡがＳｔａＲＴ−ＰＣＲに適しているかどうかを決定するため、それを逆転写し、そしてβ−アクチン発現を評価した。高質または部分的に分解したＲＮＡを示しているすべての試料でβ−アクチンを検出した（図６−表６）。予想されるように、ＲＮＡ Ｌａｔｅｒ中、−２０℃で３０日保存した細胞においては、β−アクチンが検出されなかった。ＲＮＡの質は、ＰＣＲ増幅される能力と高度に相関した。短期保存（１−１０日）のための最適保存試薬はＰｒｅｓｅｒｖｃｙｔおよびＲＮＡ Ｌａｔｅｒであり、１０日を超える長期保存のためには、Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔが推薦される。Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔはまた、細胞学的分析にＴｈｉｎ Ｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを利用する施設で使用するためにも便利である。
【０１７０】
最適収集および保存条件の決定後、肺ＦＮＡ検体は、Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔ中に置き、４℃で保存した。Ｈ１１５５細胞と同様に、ＦＮＡ検体１０の内の９でＲＮＡの質を評価した（図７−表７）。５つの試料が高質（＋＋）または部分的に分解された（＋−）ＲＮＡを有していた。予想されるように、５つすべての試料がＰＣＲ増幅可能であり、そしてβ−アクチンが検出された。逆転写に先立って、１つの試料は評価されてなく（ＮＥ）、および４つの試料は低質ＲＮＡ（― ―）を示した。β−アクチンがＮＥ検体で検出され、意外にも、２つのＲＮＡ（― ―）試料でβ−アクチンが検出された。高質ＲＮＡが存在する場合、それはＰＣＲ実験に高度に適している。低質ＲＮＡが存在する場合、ＰＣＲ増幅可能ではないようであるが、それにもかかわらず使用することができる。
【０１７１】
どうして４試料が低質ＲＮＡを有するのかを決定する試みにおいて、各々の検体に対して、病理学者により独立して細胞学的特性が決定された。細胞性、生存度およびパーセント腫瘍／正常細胞を各々の試料で決定した（表７）。１０試料の内の７つが、低細胞性（Ｌ）および低生存度（Ｌ）を有していた。これらの試料の内の３つが（＋＋）または（＋−）ＲＮＡ状態を有しており、すべてがＰＣＲ増幅可能であった（＋β−アクチン）。低細胞性および低生存度を有する残りの４試料で、２つはＰＣＲ増幅可能であったが、２つは不可能であった。１０試料の内の３つは、中程度（Ｉ）または高（Ｈ）細胞性および生存度を有していた。３つすべてが良好な質のＲＮＡを有しており、ＰＣＲ増幅可能であった。細胞性が抽出されたＲＮＡ量に関係しているようであり、および生存度が、これらの細胞から得られたＲＮＡの質に関係しているかもしれない。中程度から高細胞性の検体は、遺伝子発現研究に最適であり、低細胞性および低生存度の細胞も、７つの内の５つがＰＣＲ増幅可能であったので、それにもかかわらず適している。
【０１７２】
１０試料の内の７つにおいて、腫瘍細胞の％は６０から９０％まで変動していた。２つの試料は２０％腫瘍細胞を有し、１つは１０％腫瘍細胞であった。同一取得時に決定されたＦＮＡ診断は、６試料でＮＳＣＬＣ、および４試料で非定型であった。悪性表現型の存在を確認するため、悪性度に関係する３遺伝子、ｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１を、１０ＦＮＡの内の８つで評価し、悪性度指標、ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１を決定した（図８−表８）。予想されたように、＋ＮＳＣＬＣの５つは、１．０Ｅ４から３．６Ｅ６（１０６β−アクチン分子当たりの分子として）の範囲にわたる非常に高い指標値を有していた。４つの非定型試料の内の３つもまた、７．２Ｅ３−５．０Ｅ４の範囲にわたる値を有する高い遺伝子発現指標を示した。追加の分析後、遺伝子発現データが得られた３つの非定型試料は、後に小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）であると確認された。非定型試料中の腫瘍細胞のパーセンテージは２０から８０％の範囲であり、少数の異常細胞でも十分であり、遺伝子発現指標ｃ−ｍｙｃ ｘ Ｅ２Ｆ−１／ｐ２１により検出されたことを示している。
【０１７３】
肺小結節のＦＮＡ分析が通常の診断法であるが、本方法は、ヒト肺ＦＮＡ試料に対して標準化、定量的遺伝子発現法を使用することの最初の例である。これら少量の再生できない細胞集団の遺伝子発現プロフィールは診断的および予後的意味を有しており、個別化された患者看護を導く。異なった遺伝子発現パターンはＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ間を識別するために有用であり、悪性表現型の早期同定は、臨床処置を最適化するであろう。加えて、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲはまた、遺伝子発現パターン、および患者の予後を改善するための、例えば、化学耐性および転移可能性のような、それらに関係する臨床関連表現型を同定するためにも有用である。
【０１７４】
この実施例において、最初にＮＳＣＬＣと診断され、そして後にＮＳＣＬＣであると確認されたＦＮＡ試料の内の５つは、高い指標値を有していた。これら＋ＮＳＣＬＣ検体の発現の範囲は、１．０Ｅ４から３．６Ｅ６であった。この試料セットにおいて、４つは９０．０％腫瘍細胞であり、そして試料＃１７２は２０％のみの腫瘍細胞しか有していなかったが、それでも最も高い指標値、６．５Ｅ５を有していた。細胞学的に非定型と診断され、後になってＳＣＬＣであると確認された、ＦＮＡ試料の内の３つもまた、高い指標値を有していた。それらは、１０６分子β−アクチンｍＲＮＡ当たり７．２Ｅ３−５．０Ｅ４ｍＲＮＡ分子の範囲であった。これらの試料における腫瘍細胞のパーセンテージは２０−８０％の範囲であった。
【０１７５】
他の態様
本明細書に記載した遺伝子およびＩＧＥＩマーカーセットは、ＮＳＣＬＣに対する新規薬剤標的の同定のための価値ある情報を提供し、そしてその情報は、他の組織における発癌の研究に使用するために拡大することができる。これらの配列は、本発明の方法において使用することができ、そして本発明のプローブおよびアレイを産生するために使用することができる。
【０１７６】
本発明は、本明細書に記載した具体的態様による範囲に制限されるわけではなく、本発明の個々の様相の一つの例示として意図されており、そして、本明細書に示されおよび説明されたものに加え、機能的に均等な方法および成分は本発明の範囲内であり、上記の説明および付随する図面から、それは当業者には明らかになるであろう。そのような改変は、付記された特許請求の範囲内であることが意図されている。
【０１７７】
雑誌論文、特許およびデータベースを含む、本明細書に引用したすべての参考文献は、特に本明細書において援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１ａ】図１ａおよび１ｂは、ＰＣＲ増幅に使用したプライマーを示している表１である。表１はＰＣＲ増幅に使用したプライマーを示しており、遺伝子名称、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号、配列番号、プライマー、ｃＤＮＡ中のｂｐ位置、および生成物長を含んでいる（ｂｐ）。発現マーカー遺伝子の配列は公開データベース中に存在する。表１および５はこれらの遺伝子のためのＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を提供している。ＧｅｎＢａｎｋ中の遺伝子の配列は、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の公開データベースに存在する均等物および関連配列のように、本明細書において特に援用される。“配列番号”と表示されたカラムは、表に掲げられた遺伝子を、本出願の配列表内に提供されているような配列情報と相関させている配列同定番号を指している。
【図１ｂ】図１ａおよび１ｂは、ＰＣＲ増幅に使用したプライマーを示している表１である。表１はＰＣＲ増幅に使用したプライマーを示しており、遺伝子名称、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号、配列番号、プライマー、ｃＤＮＡ中のｂｐ位置、および生成物長を含んでいる（ｂｐ）。発現マーカー遺伝子の配列は公開データベース中に存在する。表１および５はこれらの遺伝子のためのＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を提供している。ＧｅｎＢａｎｋ中の遺伝子の配列は、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の公開データベースに存在する均等物および関連配列のように、本明細書において特に援用される。“配列番号”と表示されたカラムは、表に掲げられた遺伝子を、本出願の配列表内に提供されているような配列情報と相関させている配列同定番号を指している。
【図２】図２は、ＮＳＣＬＣ細胞株のＩＣ５０およびシスプラチンレベルを示している表２である。
【図３ａ】図３ａおよび３ｂは、ＮＳＣＬＣ細胞株における遺伝子発現（ｍＲＮＡ／１０６ ＡＣＴＢ ｍＲＮＡ）を示している表３である。
【図３ｂ】図３ａおよび３ｂは、ＮＳＣＬＣ細胞株における遺伝子発現（ｍＲＮＡ／１０６ ＡＣＴＢ ｍＲＮＡ）を示している表３である。
【図４】図４は、ＮＳＣＬＣ細胞株における遺伝子発現とシスプラチン化学耐性の相関を示している表４である。
【図５】図５は、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるシスプラチン化学耐性モデルの統計判定を示している表５である。
【図６】図６は、肺癌診断のためのファインニードル（Ｆｉｎｅ Ｎｅｅｄｌｅ）分析（ＦＮＡ）に使用されたＩＥＧＩに関連する、実施例ＩＩのＨ１１５５ヒトＮＳＣＬＣ細胞におけるＲＮＡの質に対する収集法の影響を示している表６である。
【図７】図７は、実施例におけるＦＮＡ検体細胞の細胞学的情報および診断を示している表７である。
【図８】図８は、ＦＮＡ試料中のｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ１およびｐ２１の遺伝子発現値および指標値を示している表８である。
【図９ａ】図９ａは、マイクロアレイおよびマイクロビーズを用いる標準化ＲＴ−ＰＣＲ生成物の分析を図により例示している：図９ａは、遺伝子の同一性がマイクロアレイの位置により区別できる、マイクロアレイを示している。
【図９ｂ】図９ｂは、マイクロアレイおよびマイクロビーズを用いる標準化ＲＴ−ＰＣＲ生成物の分析を図により例示している：図９ｂは、ビーズの蛍光色により区別できる、マイクロビーズを示している。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
剤が、癌細胞の増殖を減少させるために、および／または、癌細胞の死を起こさせるために、または癌細胞集団の増殖を阻害するために使用できるかどうかを決定するための方法であって、
ａ）癌細胞の試料を得る工程；
ｂ）表１および５に同定されたマーカーの、癌細胞中での発現のレベルを決定および定量する工程；および
ｃ）マーカーが特定のレベルで発現されている場合、剤が、該癌細胞の増殖を減少させるために、および／または、死を起こすために使用できることを同定する工程：
を含んでなる前記方法。
【請求項２】
試料中のマーカーの発現のレベルが、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の試料中の存在を検出することにより判定される、ここにおいて、転写されたポリヌクレオチドはマーカーを含んでなる、請求項１の方法。
【請求項３】
転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項２の方法。
【請求項４】
転写されたポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項２の方法。
【請求項５】
試料中のマーカーの発現のレベルが、マーカーに対応しているタンパク質またはタンパク質断片の試料中の存在を検出することにより判定される、請求項１の方法。
【請求項６】
検出する工程がさらに、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含んでなる、請求項２の方法。
【請求項７】
発現のレベルを検出する工程が：
異なった機能的クラスを表している複数の遺伝子を最初にスクリーニングし、
最初のスクリーニングにおいて、正にまたは負に関係している遺伝子により代表される遺伝子の拡大されたグループを評価し、
少なくとも一つの相互作用的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）をつくるため、正におよび負に関係している遺伝子の発現を比較し、
個々の遺伝子分析およびＩＧＥＩ分析を使用し、および
表１および５に同定されたマーカーの少なくとも一つの、発現の検出のレベルと、減少した増殖および／または増加した死の間の関係を記述する、レベルの少なくとも一つのモデルを開発する、ことを含む、請求項６の方法。
【請求項８】
タンパク質またはタンパク質断片の存在が、タンパク質またはタンパク質断片と特異的に結合する試薬を使用して検出される、請求項５の方法。
【請求項９】
試薬が、抗体、抗体誘導体、および抗体断片から成る群より選択される、請求項８の方法。
【請求項１０】
癌細胞が、癌細胞株および患者から得られた癌細胞から成る群より選択される、請求項１の方法。
【請求項１１】
剤が化学療法用化合物である、請求項１の方法。
【請求項１２】
剤が白金化合物である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
剤がシスプラチンである、請求項１２の方法。
【請求項１４】
剤が癌の処置に有効であるかどうかを決定するための方法であって、
ａ）癌細胞の試料を得る工程；
ｂ）試料を剤に暴露する工程；
ｃ）剤へ暴露された試料中、および剤へ暴露されていない試料中の、表１および５に同定されたマーカーの発現のレベルを決定および定量する工程；および
ｄ）マーカーの発現が、該剤の存在下で変化した場合、剤が癌の処置に有効であることを同定する工程；
を含んでなる前記方法。
【請求項１５】
試料中のマーカーの発現のレベルが、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の、試料中の存在を検出することにより判定される、ここにおいて、転写されたポリヌクレオチドはマーカーを含んでなる、請求項１４の方法。
【請求項１６】
転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
転写されたポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項１５の方法。
【請求項１８】
試料中のマーカーの発現のレベルが、マーカーに対応しているタンパク質またはタンパク質断片の試料中の存在を検出することにより判定される、請求項１４の方法。
【請求項１９】
検出する工程がさらに、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含んでなる、請求項１５の方法。
【請求項２０】
発現のレベルを検出する工程が：
異なった機能的クラスを表している複数の遺伝子を最初にスクリーニングし、
最初のスクリーニングにおいて、正に関係している遺伝子により代表される遺伝子の拡大されたグループを評価し、
少なくとも一つの相互作用的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）をつくるため、正におよび負に関係している遺伝子の発現を比較し、
ＩＧＥＩ分析を使用し、および
表１および５に同定されたマーカーの少なくとも一つの、発現の検出のレベルと、減少した増殖および／または細胞死の間の関係を記述する、少なくとも一つのモデルを開発する、ことを含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
タンパク質またはタンパク質断片の存在が、タンパク質またはタンパク質断片と特異的に結合する試薬を使用して検出される、請求項１９の方法。
【請求項２２】
試薬が、抗体、抗体誘導体、および抗体断片から成る群より選択される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
癌細胞が、癌細胞株および患者から得られた癌細胞から成る群より選択される、請求項１４の方法。
【請求項２４】
剤が化学療法用化合物である、請求項１４の方法。
【請求項２５】
剤が白金化合物である、請求項２４の方法。
【請求項２６】
剤がシスプラチンである、請求項２５の方法。
【請求項２７】
癌患者において、剤による処置を続けるべきかどうかを決定するための方法であって、
ａ）剤による処置の過程間に、患者から癌細胞を含んでなる二つまたはそれより多くの試料を得る工程；
ｂ）二つまたはそれより多くの試料中の、表１および５に同定されたマーカーの発現のレベルを決定および定量する工程；および
ｃ）処置過程の間に、マーカーの発現レベルが著しくは変化しない場合に処置を続ける、工程
を含んでなる前記方法。
【請求項２８】
試料中のマーカーの発現のレベルが、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の、試料中の存在を検出することにより判定される、ここにおいて、転写されたポリヌクレオチドはマーカーを含んでなる、請求項２７の方法。
【請求項２９】
転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項２８の方法。
【請求項３０】
転写されたポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項２８の方法。
【請求項３１】
試料中のマーカーの発現のレベルが、マーカーに対応しているタンパク質またはタンパク質断片の試料中の存在を検出することにより判定される、請求項２７の方法。
【請求項３２】
検出する工程がさらに、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含んでなる、請求項２８の方法。
【請求項３３】
発現のレベルを検出する工程が：
異なった機能的クラスを表している複数の遺伝子を最初にスクリーニングし、
最初のスクリーニングにおいて、正にまたは負に関係している遺伝子により代表される遺伝子の拡大グループを評価し、
少なくとも一つの相互作用的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）をつくるため、正におよび負に関係している遺伝子の発現を比較し、
ＩＧＥＩ分析を使用し、および
表１および５に同定されたマーカーの少なくとも一つの、発現の検出のレベルと、減少した増殖および／または細胞死の間の関係を記述する、少なくとも一つのモデルを開発する、
ことを含む、請求項３２の方法。
【請求項３４】
タンパク質またはタンパク質断片の存在が、タンパク質またはタンパク質断片と特異的に結合する試薬を使用して検出される、請求項３１の方法。
【請求項３５】
試薬が、抗体、抗体誘導体、および抗体断片から成る群より選択される、請求項３４の方法。
【請求項３６】
癌細胞が、癌細胞株および患者から得られた癌細胞から成る群より選択される、請求項２７の方法。
【請求項３７】
剤が化学療法用化合物である、請求項２９の方法。
【請求項３８】
剤が白金化合物である、請求項３７の方法。
【請求項３９】
剤がシスプラチンである、請求項３８の方法。
【請求項４０】
新規癌処置を同定するための方法であって、
ａ）癌細胞の試料を得る工程；
ｂ）表１および５に同定されたマーカーの発現のレベルを決定および定量する工程；
ｃ）試料を癌処置に暴露する工程；
ｄ）癌処置に暴露された試料中のマーカーの発現のレベルを決定する工程；および
ｅ）特定のレベルでマーカーが発現されている場合、癌処置が癌を処置することにおいて有効であることを同定する工程
を含んでなる前記方法。
【請求項４１】
試料中のマーカーの発現のレベルが、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の、試料中の存在を検出することにより判定される、ここにおいて、転写されたポリヌクレオチドはマーカーを含んでなる、請求項４０の方法。
【請求項４２】
転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項４１の方法。
【請求項４３】
転写されたポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項４１の方法。
【請求項４４】
試料中のマーカーの発現のレベルが、マーカーに対応しているタンパク質またはタンパク質断片の試料中の存在を検出することにより判定される、請求項４０の方法。
【請求項４５】
検出する工程がさらに、ＲＴ−ＰＣＲを使用する、転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含んでなる、請求項４０の方法。
【請求項４６】
発現のレベルを検出する工程が：
異なった機能的クラスを表している複数の遺伝子を最初にスクリーニングし、
最初のスクリーニングにおいて、正にまたは負に関係している遺伝子により代表される遺伝子の拡大されたグループを評価し、
少なくとも一つの相互作用的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）をつくるため、正におよび負に関係している遺伝子の発現を比較し、
ＩＧＥＩ分析を使用し、および
表１および５に同定されたマーカーの少なくとも一つの、発現の検出のレベルと、減少した増殖および／または細胞死の間の関係を記述する、少なくとも一つのモデルを開発する、
ことを含む、請求項４５の方法。
【請求項４７】
タンパク質またはタンパク質断片の存在が、タンパク質またはタンパク質断片と特異的に結合する試薬を使用して検出される、請求項４４の方法。
【請求項４８】
試薬が、抗体、抗体誘導体、および抗体断片から成る群より選択される、請求項４７の方法。
【請求項４９】
癌細胞が、癌細胞株および患者から得られた癌細胞から成る群より選択される、請求項４０の方法。
【請求項５０】
剤が化学療法用化合物である、請求項４０の方法。
【請求項５１】
剤が白金化合物である、請求項５０の方法。
【請求項５２】
剤がシスプラチンである、請求項５１の方法。
【請求項５３】
患者における非小細胞肺癌を診断する方法であって、
（ａ）ｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の、組織試料中での発現のレベルを検出および定量する工程；ここにおいて、ｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の他と異なる発現は非小細胞肺癌の指標である、を含んでなる、前記方法。
【請求項５４】
患者における非小細胞肺癌の進行を検出する方法であって、
（ａ）二つまたはそれより多くのｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の、組織試料中での発現のレベルを検出および定量する工程；ここにおいて、ｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の他と異なる発現は非小細胞肺癌進行の指標である、を含んでなる、前記方法。
【請求項５５】
非小細胞肺癌の患者の処置をモニタリングする方法であって、
（ａ）患者に医薬組成物を投与し；
（ｂ）患者からの細胞または組織試料から遺伝子発現プロフィールを調製し；および
（ｃ）患者の遺伝子発現プロフィールと、正常肺細胞および非小細胞肺癌からなる群より選択される細胞集団からの遺伝子発現を比較する、
ことを含んでなる前記方法。
【請求項５６】
非小細胞肺癌の患者を処置する方法であって、
（ａ）患者に医薬組成物を投与し、ここにおいて、組成物は表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の少なくとも一つの遺伝子の発現を改変する；
（ｂ）処置前に得られた腫瘍細胞を含んでなる細胞または組織試料および処置後に得られた別の試料から、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用して、標準化遺伝子発現値を含んでなるＩＧＥＩを調製し；および
（ｃ）処置に先立って得られた試料と処置後に得られた試料とを比較する、
ことを含んでなる前記方法。
【請求項５７】
非小細胞肺癌の発生および進行を調節可能な剤のためのスクリーニング法であって、
（ａ）非小細胞癌細胞を含んでなる細胞集団の、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用して、標準化遺伝子発現値を含んでなる第一のＩＧＥＩを調製し、ここにおいて、第一のＩＧＥＩは、表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の一つまたはそれより多くの遺伝子の発現レベルを決定する；
（ｂ）細胞集団を剤に暴露し；
（ｃ）剤に暴露された細胞集団の、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用して、標準化遺伝子発現値を含んでなる第二のＩＧＥＩを調製し；および
（ｄ）第一および第二のＩＧＥＩを比較する、
ことを含んでなる前記方法。
【請求項５８】
標準化定量的ＲＴ−ＰＣＲに従ったＰＣＲ生成物を、標準化された様式で測定するための、固相ハイブリダイゼーション鋳型であって：
ａ）少なくとも一つの固相ハイブリダイゼーション鋳型を調製し、ここにおいて、各々の遺伝子のため、競合的鋳型（ＣＴ）および天然の鋳型（ＮＴ）の両方に特異的に結合するであろう任意の長さのオリゴヌクレオチドをフィルターにスポットし；
ｂ）フォワードプライマー（ＮＴおよびＣＴの両方に共通）およびリバースＣＴプライマーの３’２０ｂｐ間の領域が評価されるように、適したオリゴヌクレオチドを同定し；
ｃ）前もって選定された位置で、固体支持体へオリゴヌクレオチドを結合させ；
ｄ）ＣＴおよびＮＴ ＰＣＲ生成物を増幅し、そしてフィルターのスポットへハイブリダイズし、そこでは各々の遺伝子（ＮＴおよびＣＴ）が別々に増幅される；
ｅ）ハイブリダイゼーションのためにＰＣＲ生成物をプールし；および
ｆ）各々の遺伝子に対して、各々が異なった蛍光で標識されている、二つのオリゴヌクレオチドプローブを調製し、ここにおいて、一つのオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドが、ＣＴとは相同的ではなく、および異なった蛍光で標識されているＮＴの領域へ結合するように、ＰＣＲ−増幅された遺伝子のためのＮＴに特有の配列に相同的であり、およびそれに結合するであろうし、およびここにおいて、他のオリゴヌクレオチドは、この他のオリゴヌクレオチドが、リバースプライマーの３’末端に広がるＣＴ配列と相同的であり、およびそれに結合するであろうように、ＣＴへ特異的でありおよび異なった蛍光で標識されている、ことを含んでなる前記鋳型。
【請求項５９】
多数の遺伝子のためのＮＴ−特異的およびＣＴ−特異的オリゴヌクレオチドが等量で混合され、フィルター上にスポットした遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドへ結合された遺伝子−特異的ＰＣＲ生成物とハイブリダイズされる、請求項５８の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６０】
スポットへ結合された蛍光間の比で、ＣＴに対するＮＴの量を定量化する、請求項５９の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６１】
ＮＴおよびＮＴプローブ間の結合親和性と比較して、ＣＴおよびＣＴプローブ間には異なった結合親和性があるけれども、この相違は判定された異なった試料間、および一つの実験と別の実験間では一致している、請求項６０の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６２】
鋳型が、少なくとも一つの標準化された、マイクロアレイ、マイクロビーズ、ガラススライド、または光リソグラフィーにより製造されたチップを含んでなる、請求項５８の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６３】
固体支持体が少なくとも一つの膜、ガラス支持体、フィルター、組織培養皿、多量体化物質、ビーズおよびシリカ支持体を含んでなる、請求項６０の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６４】
固体支持体が少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含んでなる、ここにおいて、オリゴヌクレオチドの各々が表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１またはｐ２１遺伝子の少なくとも一つの遺伝子へ特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる、請求項６３の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６５】
オリゴヌクレオチドが固体支持体へ共有結合で結合されている、請求項６４の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６６】
オリゴヌクレオチドが固体支持体へ非共有結合で結合されている、請求項６４の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６７】
（ａ）表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の少なくとも二つの遺伝子を含んでなる、遺伝子のセットの肺組織における、分子／１０６β−アクチン分子の単位での、標準化数的発現レベルを同定する情報を含んでいるデータベース；および
（ｂ）情報を見るためのユーザーインターフェイス、
を含んでなるコンピューターシステム。
【請求項６８】
データベースが遺伝子の配列情報をさらに含んでなる、請求項６７のコンピューターシステム。
【請求項６９】
データベースが、正常肺組織における遺伝子のセットための、分子／１０６β−アクチン分子の単位での、標準化数的発現レベルを同定する情報をさらに含んでなる、請求項６７のコンピューターシステム。
【請求項７０】
データベースが、非小細胞癌組織における遺伝子のセットための、分子／１０６β−アクチン分子の単位での、標準化数的発現レベルを同定する情報をさらに含んでなる、請求項６７のコンピューターシステム。
【請求項７１】
外部データベースからの記述的情報を含んでいる記録をさらに含んでなる、ここにおいて、その情報は該遺伝子を外部データベースの記録と相関させる、請求項６７−７０の任意の項のコンピューターシステム。
【請求項７２】
外部データベースがＧｅｎＢａｎｋである、請求項７１のコンピューターシステム。
【請求項７３】
表１および５およびｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の少なくとも一つの遺伝子の、組織または細胞における標準化数的発現レベルを同定する情報を示すため、請求項６７−７２の任意の１項のコンピューターシステムを使用する方法であって、
（ａ）組織または細胞中の、表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の少なくとも一つの遺伝子の標準化数的発現レベルを、データベース中の遺伝子の発現のレベルと比較する、
ことを含んでなる前記方法。
【請求項７４】
少なくとも二つの遺伝子の発現レベルが比較される、請求項７３の方法。
【請求項７５】
少なくとも五つの遺伝子の発現レベルが比較される、請求項７３の方法。
【請求項７６】
少なくとも１０の遺伝子の発現レベルが比較される、請求項７３の方法。
【請求項７７】
肺癌または正常肺組織における発現のレベルと比較された、組織または細胞中の少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを示すことをさらに含んでなる、請求項７３の方法。
【請求項７８】
該遺伝子のための遺伝子発現情報と共に包装された、請求項６４−６６のいずれか１項の少なくとも一つの固体支持体を含んでなるキット。
【請求項７９】
遺伝子発現情報が、毒素へ暴露された組織または細胞中の遺伝子発現レベルを含んでなる、請求項７８のキット。
【請求項８０】
遺伝子発現情報が電子フォーマットである、請求項７９のキット。
【請求項１】
剤が、癌細胞の増殖を減少させるために、および／または、癌細胞の死を起こさせるために、または癌細胞集団の増殖を阻害するために使用できるかどうかを決定するための方法であって、
ａ）癌細胞の試料を得る工程；
ｂ）表１および５に同定されたマーカーの、癌細胞中での発現のレベルを決定および定量する工程；および
ｃ）マーカーが特定のレベルで発現されている場合、剤が、該癌細胞の増殖を減少させるために、および／または、死を起こすために使用できることを同定する工程：
を含んでなる前記方法。
【請求項２】
試料中のマーカーの発現のレベルが、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の試料中の存在を検出することにより判定される、ここにおいて、転写されたポリヌクレオチドはマーカーを含んでなる、請求項１の方法。
【請求項３】
転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項２の方法。
【請求項４】
転写されたポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項２の方法。
【請求項５】
試料中のマーカーの発現のレベルが、マーカーに対応しているタンパク質またはタンパク質断片の試料中の存在を検出することにより判定される、請求項１の方法。
【請求項６】
検出する工程がさらに、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含んでなる、請求項２の方法。
【請求項７】
発現のレベルを検出する工程が：
異なった機能的クラスを表している複数の遺伝子を最初にスクリーニングし、
最初のスクリーニングにおいて、正にまたは負に関係している遺伝子により代表される遺伝子の拡大されたグループを評価し、
少なくとも一つの相互作用的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）をつくるため、正におよび負に関係している遺伝子の発現を比較し、
個々の遺伝子分析およびＩＧＥＩ分析を使用し、および
表１および５に同定されたマーカーの少なくとも一つの、発現の検出のレベルと、減少した増殖および／または増加した死の間の関係を記述する、レベルの少なくとも一つのモデルを開発する、ことを含む、請求項６の方法。
【請求項８】
タンパク質またはタンパク質断片の存在が、タンパク質またはタンパク質断片と特異的に結合する試薬を使用して検出される、請求項５の方法。
【請求項９】
試薬が、抗体、抗体誘導体、および抗体断片から成る群より選択される、請求項８の方法。
【請求項１０】
癌細胞が、癌細胞株および患者から得られた癌細胞から成る群より選択される、請求項１の方法。
【請求項１１】
剤が化学療法用化合物である、請求項１の方法。
【請求項１２】
剤が白金化合物である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
剤がシスプラチンである、請求項１２の方法。
【請求項１４】
剤が癌の処置に有効であるかどうかを決定するための方法であって、
ａ）癌細胞の試料を得る工程；
ｂ）試料を剤に暴露する工程；
ｃ）剤へ暴露された試料中、および剤へ暴露されていない試料中の、表１および５に同定されたマーカーの発現のレベルを決定および定量する工程；および
ｄ）マーカーの発現が、該剤の存在下で変化した場合、剤が癌の処置に有効であることを同定する工程；
を含んでなる前記方法。
【請求項１５】
試料中のマーカーの発現のレベルが、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の、試料中の存在を検出することにより判定される、ここにおいて、転写されたポリヌクレオチドはマーカーを含んでなる、請求項１４の方法。
【請求項１６】
転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
転写されたポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項１５の方法。
【請求項１８】
試料中のマーカーの発現のレベルが、マーカーに対応しているタンパク質またはタンパク質断片の試料中の存在を検出することにより判定される、請求項１４の方法。
【請求項１９】
検出する工程がさらに、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含んでなる、請求項１５の方法。
【請求項２０】
発現のレベルを検出する工程が：
異なった機能的クラスを表している複数の遺伝子を最初にスクリーニングし、
最初のスクリーニングにおいて、正に関係している遺伝子により代表される遺伝子の拡大されたグループを評価し、
少なくとも一つの相互作用的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）をつくるため、正におよび負に関係している遺伝子の発現を比較し、
ＩＧＥＩ分析を使用し、および
表１および５に同定されたマーカーの少なくとも一つの、発現の検出のレベルと、減少した増殖および／または細胞死の間の関係を記述する、少なくとも一つのモデルを開発する、ことを含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
タンパク質またはタンパク質断片の存在が、タンパク質またはタンパク質断片と特異的に結合する試薬を使用して検出される、請求項１９の方法。
【請求項２２】
試薬が、抗体、抗体誘導体、および抗体断片から成る群より選択される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
癌細胞が、癌細胞株および患者から得られた癌細胞から成る群より選択される、請求項１４の方法。
【請求項２４】
剤が化学療法用化合物である、請求項１４の方法。
【請求項２５】
剤が白金化合物である、請求項２４の方法。
【請求項２６】
剤がシスプラチンである、請求項２５の方法。
【請求項２７】
癌患者において、剤による処置を続けるべきかどうかを決定するための方法であって、
ａ）剤による処置の過程間に、患者から癌細胞を含んでなる二つまたはそれより多くの試料を得る工程；
ｂ）二つまたはそれより多くの試料中の、表１および５に同定されたマーカーの発現のレベルを決定および定量する工程；および
ｃ）処置過程の間に、マーカーの発現レベルが著しくは変化しない場合に処置を続ける、工程
を含んでなる前記方法。
【請求項２８】
試料中のマーカーの発現のレベルが、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の、試料中の存在を検出することにより判定される、ここにおいて、転写されたポリヌクレオチドはマーカーを含んでなる、請求項２７の方法。
【請求項２９】
転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項２８の方法。
【請求項３０】
転写されたポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項２８の方法。
【請求項３１】
試料中のマーカーの発現のレベルが、マーカーに対応しているタンパク質またはタンパク質断片の試料中の存在を検出することにより判定される、請求項２７の方法。
【請求項３２】
検出する工程がさらに、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含んでなる、請求項２８の方法。
【請求項３３】
発現のレベルを検出する工程が：
異なった機能的クラスを表している複数の遺伝子を最初にスクリーニングし、
最初のスクリーニングにおいて、正にまたは負に関係している遺伝子により代表される遺伝子の拡大グループを評価し、
少なくとも一つの相互作用的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）をつくるため、正におよび負に関係している遺伝子の発現を比較し、
ＩＧＥＩ分析を使用し、および
表１および５に同定されたマーカーの少なくとも一つの、発現の検出のレベルと、減少した増殖および／または細胞死の間の関係を記述する、少なくとも一つのモデルを開発する、
ことを含む、請求項３２の方法。
【請求項３４】
タンパク質またはタンパク質断片の存在が、タンパク質またはタンパク質断片と特異的に結合する試薬を使用して検出される、請求項３１の方法。
【請求項３５】
試薬が、抗体、抗体誘導体、および抗体断片から成る群より選択される、請求項３４の方法。
【請求項３６】
癌細胞が、癌細胞株および患者から得られた癌細胞から成る群より選択される、請求項２７の方法。
【請求項３７】
剤が化学療法用化合物である、請求項２９の方法。
【請求項３８】
剤が白金化合物である、請求項３７の方法。
【請求項３９】
剤がシスプラチンである、請求項３８の方法。
【請求項４０】
新規癌処置を同定するための方法であって、
ａ）癌細胞の試料を得る工程；
ｂ）表１および５に同定されたマーカーの発現のレベルを決定および定量する工程；
ｃ）試料を癌処置に暴露する工程；
ｄ）癌処置に暴露された試料中のマーカーの発現のレベルを決定する工程；および
ｅ）特定のレベルでマーカーが発現されている場合、癌処置が癌を処置することにおいて有効であることを同定する工程
を含んでなる前記方法。
【請求項４１】
試料中のマーカーの発現のレベルが、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の、試料中の存在を検出することにより判定される、ここにおいて、転写されたポリヌクレオチドはマーカーを含んでなる、請求項４０の方法。
【請求項４２】
転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項４１の方法。
【請求項４３】
転写されたポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項４１の方法。
【請求項４４】
試料中のマーカーの発現のレベルが、マーカーに対応しているタンパク質またはタンパク質断片の試料中の存在を検出することにより判定される、請求項４０の方法。
【請求項４５】
検出する工程がさらに、ＲＴ−ＰＣＲを使用する、転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含んでなる、請求項４０の方法。
【請求項４６】
発現のレベルを検出する工程が：
異なった機能的クラスを表している複数の遺伝子を最初にスクリーニングし、
最初のスクリーニングにおいて、正にまたは負に関係している遺伝子により代表される遺伝子の拡大されたグループを評価し、
少なくとも一つの相互作用的遺伝子発現指標（ＩＧＥＩ）をつくるため、正におよび負に関係している遺伝子の発現を比較し、
ＩＧＥＩ分析を使用し、および
表１および５に同定されたマーカーの少なくとも一つの、発現の検出のレベルと、減少した増殖および／または細胞死の間の関係を記述する、少なくとも一つのモデルを開発する、
ことを含む、請求項４５の方法。
【請求項４７】
タンパク質またはタンパク質断片の存在が、タンパク質またはタンパク質断片と特異的に結合する試薬を使用して検出される、請求項４４の方法。
【請求項４８】
試薬が、抗体、抗体誘導体、および抗体断片から成る群より選択される、請求項４７の方法。
【請求項４９】
癌細胞が、癌細胞株および患者から得られた癌細胞から成る群より選択される、請求項４０の方法。
【請求項５０】
剤が化学療法用化合物である、請求項４０の方法。
【請求項５１】
剤が白金化合物である、請求項５０の方法。
【請求項５２】
剤がシスプラチンである、請求項５１の方法。
【請求項５３】
患者における非小細胞肺癌を診断する方法であって、
（ａ）ｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の、組織試料中での発現のレベルを検出および定量する工程；ここにおいて、ｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の他と異なる発現は非小細胞肺癌の指標である、を含んでなる、前記方法。
【請求項５４】
患者における非小細胞肺癌の進行を検出する方法であって、
（ａ）二つまたはそれより多くのｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の、組織試料中での発現のレベルを検出および定量する工程；ここにおいて、ｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の他と異なる発現は非小細胞肺癌進行の指標である、を含んでなる、前記方法。
【請求項５５】
非小細胞肺癌の患者の処置をモニタリングする方法であって、
（ａ）患者に医薬組成物を投与し；
（ｂ）患者からの細胞または組織試料から遺伝子発現プロフィールを調製し；および
（ｃ）患者の遺伝子発現プロフィールと、正常肺細胞および非小細胞肺癌からなる群より選択される細胞集団からの遺伝子発現を比較する、
ことを含んでなる前記方法。
【請求項５６】
非小細胞肺癌の患者を処置する方法であって、
（ａ）患者に医薬組成物を投与し、ここにおいて、組成物は表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の少なくとも一つの遺伝子の発現を改変する；
（ｂ）処置前に得られた腫瘍細胞を含んでなる細胞または組織試料および処置後に得られた別の試料から、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用して、標準化遺伝子発現値を含んでなるＩＧＥＩを調製し；および
（ｃ）処置に先立って得られた試料と処置後に得られた試料とを比較する、
ことを含んでなる前記方法。
【請求項５７】
非小細胞肺癌の発生および進行を調節可能な剤のためのスクリーニング法であって、
（ａ）非小細胞癌細胞を含んでなる細胞集団の、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用して、標準化遺伝子発現値を含んでなる第一のＩＧＥＩを調製し、ここにおいて、第一のＩＧＥＩは、表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の一つまたはそれより多くの遺伝子の発現レベルを決定する；
（ｂ）細胞集団を剤に暴露し；
（ｃ）剤に暴露された細胞集団の、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用して、標準化遺伝子発現値を含んでなる第二のＩＧＥＩを調製し；および
（ｄ）第一および第二のＩＧＥＩを比較する、
ことを含んでなる前記方法。
【請求項５８】
標準化定量的ＲＴ−ＰＣＲに従ったＰＣＲ生成物を、標準化された様式で測定するための、固相ハイブリダイゼーション鋳型であって：
ａ）少なくとも一つの固相ハイブリダイゼーション鋳型を調製し、ここにおいて、各々の遺伝子のため、競合的鋳型（ＣＴ）および天然の鋳型（ＮＴ）の両方に特異的に結合するであろう任意の長さのオリゴヌクレオチドをフィルターにスポットし；
ｂ）フォワードプライマー（ＮＴおよびＣＴの両方に共通）およびリバースＣＴプライマーの３’２０ｂｐ間の領域が評価されるように、適したオリゴヌクレオチドを同定し；
ｃ）前もって選定された位置で、固体支持体へオリゴヌクレオチドを結合させ；
ｄ）ＣＴおよびＮＴ ＰＣＲ生成物を増幅し、そしてフィルターのスポットへハイブリダイズし、そこでは各々の遺伝子（ＮＴおよびＣＴ）が別々に増幅される；
ｅ）ハイブリダイゼーションのためにＰＣＲ生成物をプールし；および
ｆ）各々の遺伝子に対して、各々が異なった蛍光で標識されている、二つのオリゴヌクレオチドプローブを調製し、ここにおいて、一つのオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドが、ＣＴとは相同的ではなく、および異なった蛍光で標識されているＮＴの領域へ結合するように、ＰＣＲ−増幅された遺伝子のためのＮＴに特有の配列に相同的であり、およびそれに結合するであろうし、およびここにおいて、他のオリゴヌクレオチドは、この他のオリゴヌクレオチドが、リバースプライマーの３’末端に広がるＣＴ配列と相同的であり、およびそれに結合するであろうように、ＣＴへ特異的でありおよび異なった蛍光で標識されている、ことを含んでなる前記鋳型。
【請求項５９】
多数の遺伝子のためのＮＴ−特異的およびＣＴ−特異的オリゴヌクレオチドが等量で混合され、フィルター上にスポットした遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドへ結合された遺伝子−特異的ＰＣＲ生成物とハイブリダイズされる、請求項５８の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６０】
スポットへ結合された蛍光間の比で、ＣＴに対するＮＴの量を定量化する、請求項５９の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６１】
ＮＴおよびＮＴプローブ間の結合親和性と比較して、ＣＴおよびＣＴプローブ間には異なった結合親和性があるけれども、この相違は判定された異なった試料間、および一つの実験と別の実験間では一致している、請求項６０の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６２】
鋳型が、少なくとも一つの標準化された、マイクロアレイ、マイクロビーズ、ガラススライド、または光リソグラフィーにより製造されたチップを含んでなる、請求項５８の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６３】
固体支持体が少なくとも一つの膜、ガラス支持体、フィルター、組織培養皿、多量体化物質、ビーズおよびシリカ支持体を含んでなる、請求項６０の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６４】
固体支持体が少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含んでなる、ここにおいて、オリゴヌクレオチドの各々が表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１またはｐ２１遺伝子の少なくとも一つの遺伝子へ特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる、請求項６３の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６５】
オリゴヌクレオチドが固体支持体へ共有結合で結合されている、請求項６４の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６６】
オリゴヌクレオチドが固体支持体へ非共有結合で結合されている、請求項６４の固相ハイブリダイゼーション鋳型。
【請求項６７】
（ａ）表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の少なくとも二つの遺伝子を含んでなる、遺伝子のセットの肺組織における、分子／１０６β−アクチン分子の単位での、標準化数的発現レベルを同定する情報を含んでいるデータベース；および
（ｂ）情報を見るためのユーザーインターフェイス、
を含んでなるコンピューターシステム。
【請求項６８】
データベースが遺伝子の配列情報をさらに含んでなる、請求項６７のコンピューターシステム。
【請求項６９】
データベースが、正常肺組織における遺伝子のセットための、分子／１０６β−アクチン分子の単位での、標準化数的発現レベルを同定する情報をさらに含んでなる、請求項６７のコンピューターシステム。
【請求項７０】
データベースが、非小細胞癌組織における遺伝子のセットための、分子／１０６β−アクチン分子の単位での、標準化数的発現レベルを同定する情報をさらに含んでなる、請求項６７のコンピューターシステム。
【請求項７１】
外部データベースからの記述的情報を含んでいる記録をさらに含んでなる、ここにおいて、その情報は該遺伝子を外部データベースの記録と相関させる、請求項６７−７０の任意の項のコンピューターシステム。
【請求項７２】
外部データベースがＧｅｎＢａｎｋである、請求項７１のコンピューターシステム。
【請求項７３】
表１および５およびｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の少なくとも一つの遺伝子の、組織または細胞における標準化数的発現レベルを同定する情報を示すため、請求項６７−７２の任意の１項のコンピューターシステムを使用する方法であって、
（ａ）組織または細胞中の、表１および５またはｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１遺伝子の少なくとも一つの遺伝子の標準化数的発現レベルを、データベース中の遺伝子の発現のレベルと比較する、
ことを含んでなる前記方法。
【請求項７４】
少なくとも二つの遺伝子の発現レベルが比較される、請求項７３の方法。
【請求項７５】
少なくとも五つの遺伝子の発現レベルが比較される、請求項７３の方法。
【請求項７６】
少なくとも１０の遺伝子の発現レベルが比較される、請求項７３の方法。
【請求項７７】
肺癌または正常肺組織における発現のレベルと比較された、組織または細胞中の少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを示すことをさらに含んでなる、請求項７３の方法。
【請求項７８】
該遺伝子のための遺伝子発現情報と共に包装された、請求項６４−６６のいずれか１項の少なくとも一つの固体支持体を含んでなるキット。
【請求項７９】
遺伝子発現情報が、毒素へ暴露された組織または細胞中の遺伝子発現レベルを含んでなる、請求項７８のキット。
【請求項８０】
遺伝子発現情報が電子フォーマットである、請求項７９のキット。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【公表番号】特表２００６−５０６９４５（Ｐ２００６−５０６９４５Ａ）
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−５７９６２７（Ｐ２００３−５７９６２７）
【出願日】平成１５年３月２７日（２００３．３．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００９４２８
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０８２０７８
【国際公開日】平成１５年１０月９日（２００３．１０．９）
【出願人】（５０４３６３４８５）メディカル・カレッジ・オブ・オハイオ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年３月２７日（２００３．３．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００９４２８
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０８２０７８
【国際公開日】平成１５年１０月９日（２００３．１０．９）
【出願人】（５０４３６３４８５）メディカル・カレッジ・オブ・オハイオ (1)
【Ｆターム（参考）】
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