遺伝子発現分析を増強するための方法
本出願は細胞または組織のサンプルの遺伝子発現プロファイルを歪めるｍＲＮＡ転写物またはその代表物が識別され、そして、逆転写反応の前、最中または後にｍＲＮＡ転写物の集団から除去される、遺伝子発現データを分析する進歩した方法に関する。本発明は細胞または組織のサンプル中の遺伝子発現を分析する進歩した方法を提供することにより全血遺伝子発現分析の既存の方法に関わる遺伝子発現分析の問題点を解決するものであり、ここで、細胞または組織のサンプルの相対的遺伝子発現プロファイルを歪める転写物１つ以上またはその代表物は、逆転写反応の前、最中または後に除去されるか、または実質的に抑制または不活性化される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる本表題の２００３年６月６日出願の米国仮出願６０／４７６，２３３、２００３年７月１日出願の米国仮出願６０／６２８，４８３、２００３年８月１日出願の米国仮出願６０／４９１，５２８、および、２００４年５月１１日出願の米国仮出願６０／５６９，６４６に関する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は遺伝子発現分析の分野、および、遺伝子発現を試験するために使用される増幅反応を進歩させる方法に関する。特に本発明は遺伝子発現分析を妨害するか、サンプルの相対的遺伝子発現プロファイルをスキューさせる転写物種の増幅または逆転写を抑制することによる定量的遺伝子発現分析を進歩させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
生命は実質的に情報に基づいており、その遺伝的内容が生物の生育および生殖を制御する。全ての生命系の重要な特徴であるポリペプチドのアミノ酸配列は細胞の遺伝子的物質によりコードされている。さらにまた、ポリヌクレオチドの配列もまた遺伝子発現の制御および調節に関与している。従って、この遺伝子的情報の性質を測定することは大きな科学的重要性を達成している。
【０００４】
遺伝子発現分析は研究者等に対し、どの遺伝子が特定の細胞または組織のサンプル中で「ターンオン」または「ターンオフ」されるかを知らせる。発現された遺伝子は細胞内のどのタンパク質がどの程度まで合成されるかを決定する１つの要素である。特定の発現パターンは細胞型、並びに、細胞内の生理学的条件、例えば疾患を決定する。遺伝子発現の変化を理解することは、どの遺伝子およびタンパク質が特定の疾患または生理学的状態において役割を果たしているかの証拠を研究者等に提供し、そして、遺伝子的異常、疾患の経路、疾患の作用機序および毒性機序に関する手がかりを提供できる。
【０００５】
遺伝子発現データを分析するためには全血が特に好都合なサンプルである。全血サンプルからの赤血球（ＲＢＣ）の除去、およびその後の精製および遺伝子発現に関する白血球（ＷＢＣ）の分析は、その調製が厄介で困難であるにも関わらず、最も有用なデータを提供している。実際、全血からのＷＢＣの単離を可能にするプロトコルは存在するが、これらは技術的専門知識および細胞を急速に単離するために必要な時間に起因する潜在的問題点を有し、これは殆どの増殖部分に対して理想的であるとはいえない。さらにまた、細胞を短期間で処理しない場合には、遺伝子の活性化の可能性が生じ、これはインビボ応答の正確なモニタリングを困難にする。これらの問題のため、全血からの包括的な遺伝子発現を可能にするプロトコルが有用となる。
【０００６】
一部の商業的手法は遺伝子発現データが改善されるように全血の安定化を行っている（Ｒａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｉｎ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８（１１）：１８８３−９０参照）。Ｒａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．によれば、全血中のｍＲＮＡの正確な定量はサンプルの取り扱いまたは制御できない凝血活性化により同時に起こる遺伝子転写物の分解と意図しない遺伝子誘導により困難となる。しかしながら本発明者等は、市販の遺伝子発現マイクロアレイ手法を用いて分析した場合に全血から直接単離されるＲＮＡのサンプル中において検出されない末梢白血球に検出可能な遺伝子があることを発見した。この理由により、全血単離および安定化プロトコル（即ちＴｒｉｚｏｌ，ＧＩＴＣ）の使用は全血に関わる遺伝子発現分析の問題点を解決しない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は細胞または組織のサンプル中の遺伝子発現を分析する進歩した方法を提供することにより全血遺伝子発現分析の既存の方法に関わる遺伝子発現分析の問題点を解決するものであり、ここでは、細胞または組織のサンプルの相対的遺伝子発現プロファイルを歪める転写物１つ以上またはその代表物は、逆転写反応の前、最中または後に除去されるか、または実質的に抑制または不活性化される。１つの実施形態において、特に、サンプル中の他の転写物種の遺伝子発現分析を妨害するサンプル中の赤血球ｍＲＮＡ転写物種１つ以上の増幅を抑制する方法が提供され、これは、（ａ）サンプルの赤血球核酸配列特異的干渉分子１つ以上を添加すること；および、（ｂ）赤血球核酸配列特異的干渉分子１つ以上の存在下にサンプル中の該転写物種を増幅することを含む。本発明はまた、細胞または組織のサンプルの相対的遺伝子発現プロファイルをスキューさせるｍＲＮＡ転写物種を識別する方法およびそのようなｍＲＮＡ転写物をターゲティングする干渉分子を含む組成物およびキットを提供する。
【０００８】
（定義）
本発明の方法の文脈においては、「増幅」という用語は何れかの知られた増幅の操作法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、線状増幅手法、インビトロ転写（ＩＶＴ）、即ち複数のｃＲＮＡ転写物を形成するためのｃＤＮＡによるもの等を含む物とする。本明細書において使用する増幅プロトコルは逆転写工程、例えばｍＲＮＡ分子をまず逆転写してｃＤＮＡ分子とし、次にｃＤＮＡを用いて複数コピーのｃＤＮＡまたはｃＲＮＡをＰＣＲによるか、インビトロ転写により作成する場合を含んでよいが、逆転写単独ではＲＮＡ物質種の増幅は行われないことを理解されたい。
【０００９】
「遺伝子発現分析」とはｍＲＮＡ転写物、即ち細胞または組織サンプルに由来するものの集団を作成して分析することによりどの遺伝子がサンプル中で発現されているかを調べることを包含する。典型的な遺伝子発現分析プロトコルはｍＲＮＡ転写物を逆転写してｃＤＮＡ分子とし（「ＲＴ」工程）、そして次にＴ７ＲＮＡポリメラーゼまたは他の適当なＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロの転写によりｃＤＮＡから複数の「ｃＲＮＡ」転写物を形成する（「ＩＶＴ」工程）ことを包含する。「定量的遺伝子発現分析」とは例えば反応に添加した既知量の内因性または外因性の制御配列を同時に増幅させてカリブレーション用の内標準を作成することにより、サンプル中の遺伝子発現の相対量を求める分析を包含する。
【００１０】
「遺伝子発現プロファイル」とは遺伝子発現分析の結果を与えるものであり、サンプル中に存在する転写物少なくとも１つについて遺伝子発現濃度のある尺度を示す。プロファイルはさらに遺伝子が分析すべきサンプル中に検出されるか、そして／または分析すべきサンプル中に検出されないような分析を包含する。遺伝子発現プロファイルを作成するためにいずれのプラットフォーム技術も使用してよいが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ ＵＳＡ）より入手可能なもののようなマイクロアレイプラットフォームが好ましい技術である。
【００１１】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘは存在および非存在のコールとして存在（即ち検出された）および非存在（即ち検出されない）遺伝子発現プロファイルを定義する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの「統計アルゴリズムレファレンスガイド」によれば、プローブセットにおける各プローブ対は測定された転写物が検出される（存在する）か検出されない（存在しない）かを決定する際の潜在的「投票」を有するものとみなされる。プローブ対はパーフェクトマッチ（ＰＭ）およびその相当するミスマッチ（ＭＭ）として設計された２つのプローブ細胞であるのに対し、プローブセットは特定の標的配列を検出するために設計された１１〜２０のプローブ対のコレクションである。判別スコアと称される数値が投票を記載する。判別スコアは各プローブ対について計算され、そして予め設定された閾値と比較される。閾値より高値のスコアを有するプローブ対が転写物の存在に投票するものである。閾値より低値のスコアを有するプローブ対は転写物の非存在に投票するものである。投票結果はｐ値として総括される。判別スコアが閾値より高値であるほど、ｐ値は低値となり、転写物が存在する確立がより高くなる。判別スコアが低値となるほど逆もまた真となる。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＭＡＳ５．０ソフトウエアと共に使用することにより存在および非存在のコールを決定する。
【００１２】
市販の核酸アレイ、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイは種々の既知位置における個体支持体表面上にカップリングされている種々のオリゴヌクレオチドプローブの秩序アレイへの増幅ｃＲＮＡ転写物またはｃＤＮＡのハイブリダイゼーションを介した集団内の検出可能な遺伝子の比率および実体を調べるために一般的に使用されている。ｃＲＮＡはｃＤＮＡ鋳型から転写されたアンチセンスＲＮＡである。転写物は典型的にはアレイ上での検出を容易にするために増幅の最中に標識される。このようなアレイは一般的には当該分野で報告されており、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，１４３，８５４、ＷＯ９０／１５０７０およびＷＯ９２／１１０９２に記載されている。ハイブリダイゼーションおよびアレイのスキャニングの後、ハイブリダイゼーションデータを分析することにより、標識された転写物がハイブリダイズしたプローブから決定されるものとして、転写物のうちのどれがサンプル中に存在するかを識別する。さらにまた、各存在遺伝子の蛍光水準を識別し、それらの水準を用いて遺伝子発現の匹敵する定量的水準を得ることができる。この操作法の変法は複数の固体表面に結合した（即ちＬｕｍｉｎｅｘ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ｂＤＮＡ）、または溶液中に懸濁した（Ａｃｌａｒａ）プローブの使用である。
【００１３】
パーフェクトマッチ（ＰＭ）およびミスマッチ（ＭＭ）のプローブセットの数値は遺伝子発現データの正確さを決定するために使用できる尺度である。ミスマッチの対照プローブは中央位置の一塩基相違を除いてそのパーフェクトマッチのパートナーと同一である。ＭＭプローブはバックグラウンドと交差ハイブリダイゼーションのシグナルの両方の直接の差し引きを可能とし、そして「真の」シグナルと非特異的または半特異的ハイブリダイゼーションに由来するものとの間の判別を可能とする、特異性対照として機能する。意図するＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションによりＭＭプローブよりも多いＰＭプローブに関するシグナルが生成し、偶然により起こるとは極めて考えにくい一貫したパターンが得られる。低濃度ＲＮＡの存在下であっても、ＰＭ／ＭＭプローブ対のハイブリダイゼーションは認識可能で定量的な蛍光パターンを与える。これらのパターンの強度は複合サンプル中のＲＮＡ分子の濃度に直接関係する。即ち、ＰＭ／ＭＭプローブセットにより、意図するＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションによりシグナルが生成するかどうか、調べることができるようになる。ＭＭプローブからのシグナルがＰＭプローブからのものより高値であれば、非特異的または交差ハイブリダイゼーションが起こっている。ＰＭシグナルより高値のＭＭシグナルを示したプローブ対が多数であるサンプルは通常は質の悪いサンプルの調製またはハイブリダイゼーションの結果であり、質の悪い発現データを有する。
【００１４】
本発明による所望または要望とは異なる転写物はその存在が試験すべき細胞または組織のサンプルの相対的遺伝子発現プロファイルを「スキューさせる」ものである。転写物は、転写物が欠失するかその増幅が抑制される場合と比較して増幅されたサンプル中に転写物が含有される場合に、検出可能な他の転写物種の低減があれば相対的遺伝子発現プロファイルを「スキューさせる」。転写物はまた、その存在が、サンプルのアレイ分析が質の悪い発現データをもたらすように有意に低減したＰＭ／ＭＭ比をもたらす場合に、相対的遺伝子発現プロファイルをスキューさせる。アレイ上において、相対的遺伝子発現プロファイルをスキューさせる遺伝子に対するシグナル強度は、発現されない遺伝子に対する約２０のシグナル強度（即ちバックグラウンド）または発現の有意な水準を示す遺伝子に対する約１００のシグナルと比較して、数万の桁となる。さらに比較するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）における対照遺伝子であるβアクチンおよびＧＡＤＰＨに対するシグナルは５０００の範囲にあり、そして高度に発現されるとみなされる。
【００１５】
「干渉分子」とは、本明細書においては、増幅集団における１つ以上の所望または要望とは異なる転写物種の最終的存在を、何れかの特徴において、干渉するか、または、ユーザーが干渉できるようにしたものである。従って、本発明において使用する場合の増幅の「抑制」とは、検出可能な転写物の集団からの望ましくない転写物の欠失または低減をもたらすような何れかの手段を指す。このような抑制は、例えば、転写物の逆転写または相当するｃＤＮＡのＩＶＴまたはＰＣＲを干渉することによるか、または、例えば磁気ビーズを用いてアレイハイブリダイゼーション分析の前に相当するｃＲＮＡ物質種の除去または脱離または分解を促進することにより、増幅操作法の何れかの段階において起こってよい。干渉分子はＲＮＡまたはＤＮＡ、または、ＲＮＡまたはＤＮＡの修飾された物質種であってよい。このような抑制は「進歩した」遺伝子発現プロファイル、即ち、得られる検出可能な転写物の数が、所望でない転写物の増殖、そして特に逆転写が抑制されない場合に得られる検出可能な転写物の数よりも高値である状態を達成するために使用してよい。
【００１６】
本発明の「干渉分子」とは、ターゲティングされる所望または要望とは異なる転写物種に対して「特異的」である。この点に関し、「特異的」とは、分子が、特異性をもって、所望でない標的転写物種またはその相補体、例えばそれに相当するｃＤＮＡ鎖と結合または相互作用することができることを意味する。「特異性をもって」結合または相互作用するとは、干渉分子がターゲティングされた転写物種またはその相補体とは結合または相互作用するが、他の転写物種とは実質的にそうならないことを意味する。従って、アンチセンス干渉分子については、そのような分子は一般的に結合特異性を得るためには、ターゲティングされた転写物種の相補鎖に対し配列において少なくとも約９０％同一である。しかしながら、ワトソンクリック塩基対形成が中断される位置は、ハイブリダイゼーション条件と同様に非常に重要であることに留意しなければならない。中断された塩基対形成の位置は二重らせんの脱安定化の程度を決定する際に重要である。二重らせんの末端における不正確な塩基対形成は二重らせんの中央における不正確な塩基対形成よりも脱安定化度が低い。
【００１７】
本発明によれば「逆転写酵素」とはインビトロの逆転写反応において使用してよい当該分野で知られた何れかの逆転写酵素、例えばＡＭＶ、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ、ＦＩＶ、テロメラーゼおよびｒＴｔｈである。ＡＭＶおよびＭＭＬＶはＲＮａｓｅＨ陰性または陽性であることができる。テロメラーゼはＣｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ａｎｄ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ−−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ Ａｃｔｉｎｇ ｉｎ ａ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ），６２，１２０２−１２０５により、逆転写酵素として記載されている。本発明の「ＲＮＡポリメラーゼ」はインビトロの転写反応を促進するために使用してよい当該分野で知られた何れかのＲＮＡポリメラーゼ酵素、例えばＴ７、Ｔ３、ＳＰ６または修飾された型（即ちプロセシング性を高めたもの）およびＲＮＡｐｏｌＩＩである。当該分野で知られており所望の増幅反応を実施するために有用である何れかの他の酵素も使用してよく、例えば熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ酵素等が挙げられる。
【００１８】
本発明によれば「全血」サンプルとは、多くの血球型、例えば赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、血小板等を含んでよい。血液マイクロリットル中合計数千となるＷＢＣの５種の型、すなわち顆粒球（多い順に好中球、好酸球および好塩基球）および単核細胞（リンパ球および単球）が存在する。約５００万のＲＢＣおよび３００，０００の血小板が血液ミリリットル当たり存在する。ＲＢＣ集団内において、約１％が活動的にｍＲＮＡを生成する網状赤血球である。網状赤血球はその核を放出している未成熟の赤血球である。網状赤血球は大量のＲＮＡおよびリボソームを含有しており、これらは網状赤血球が成熟して赤血球となるために必要な２日間に亘り徐々に消失する。網状赤血球はＲＮＡを使用してヘモグロビンを生産し、その合成はＲＮＡが枯渇すれば停止する。即ち網状赤血球により生産されたヘモグロビンは成熟赤血球内に存在するヘモグロビンである。網状赤血球は骨内で１日経過し、血液内で１日経過する。血中にある間は、網状赤血球は特殊な超生体染色法を用いて成熟赤血球から区別できるのみである。赤血球は網内皮細胞系により破壊されるまで約１２０日間血流中を循環する成熟した赤血球である。
【００１９】
本発明の方法は、ＲＮＡ分析よりも前にＲＢＣを除去することが困難であり、そして、そのような細胞の除去により生物学的に関連性のあるデータの一部が除去されるような全血全ＲＮＡ分析に特に有用である。しかしながら、方法はまた赤血球を含有する何れかの組織、例えば脾臓、骨髄、胎盤、血管化腫瘍、血管様腫瘍、脂肪、肺、筋肉、膵臓、心臓、脳、肝臓および出血性組織からなる群より選択された組織の遺伝子発現分析において使用することもできる。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は細胞または組織のサンプルの遺伝子発現プロファイルをスキューさせることが解っている所望ではない遺伝子転写物１つ以上を含有する細胞または組織のサンプルの遺伝子発現分析を向上させる方法に関する。さらにまた、このような方法は所定のサンプルの集団におけるこのような要望とは異なる転写物を識別することを包含する。特に、本発明者等はこのようなサンプルから、特にＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ、ＣｏｄｅＬｉｎｋＴＭ等のようなマイクロアレイプラットフォーム上で実施されるプロファイル分析で得られた相対的遺伝子発現プロファイルをスキューさせる全血および赤血球含有組織中の転写物を識別した。
【００２１】
例えば、本発明者等は、本発明の進歩なくしては、全血サンプルからの全ＲＮＡ単離の間に同時精製されている末梢血中の赤血球ＲＮＡ、例えばグロビンＲＮＡがＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ上にロードされるべきｃＲＮＡの正確な測定に干渉し、そして交差ハイブリダイゼーションを増大させることを発見した。この干渉によりより低値の全般的な存在コールおよびより少数の検出可能な遺伝子となり、その結果、全血サンプルからの遺伝子発現の数値が不正確に測定されてしまう。
【００２２】
説明すれば、赤血球（ＲＢＣ）を除去するために処理されている血液サンプルは典型的には約４０％の存在コール（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＨｕＵ１３３ＡＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ上で〜２２，０００遺伝子中〜９，０００）を示す。一方、全血から処理されたサンプルは存在コールされた遺伝子の総数は低下する（〜２２，０００遺伝子中〜５，０００、即ち〜２４％）。２つの調製物の間で、全血のＷＢＣに対する検出可能な遺伝子の重複は〜９０％である。即ち、検出された発現遺伝子はより少数である（各既知細胞型から比例的に少数となる代表）が、全血のデータは生物学的に該当している（ＲＮＡ単離の前のＲＢＣの除去は理想的な解決法ではないことを意味する）。さらにまた、検出可能な遺伝子の数の減少に加えて、ミスマッチからのシグナルがパーフェクトマッチからのものより高値となるプローブ対の数が増大する（即ちＭＭ／ＰＭ比の上昇）。ミスマッチのパーフェクトマッチプローブ対に対する比は品質管理の尺度であるため、マイクロアレイチップはＱＣ不合格となる。
【００２３】
本発明者等はまた全血全ＲＮＡ調製物中の網状赤血球ＲＮＡの質量が目視可能な優勢のＲＮＡ物質種または物質種群をｍＲＮＡ調製物および結果として生じるＩＶＴｃＲＮＡサンプルの両方にもたらすことも観察している。この物質種または転写物群はｍＲＮＡサンプルおよびｃＲＮＡ調製物をアガロースゲルにおいて観察した場合に約６００塩基対の優勢なバンドとして目視可能である。本発明者等は以外にもこの優勢なバンドが赤血球ｍＲＮＡからのヘモグロビン転写物を含有していること、および、グロビンＲＮＡの増幅を逆転写中にブロックすれば一般的な検出可能な遺伝子の数および遺伝子発現の数値の同時上昇が達成できることを発見した。
【００２４】
即ち、本発明は集団内の他の転写物と共に同時増幅した場合に相対的遺伝子発現プロファイルをスキューさせる細胞または組織のサンプル中の要望とは異なる転写物を識別する方法を包含する。本発明はまた、増幅または逆転写反応の前または最中に相対的遺伝子発現プロファイルをスキューさせる転写物１つ以上を除去することによる、サンプル中のこのような要望とは異なる転写物種１つ以上の増幅を抑制する方法を包含する。本発明はさらに、要望とは異なる転写物種１つ以上を含有するサンプルの遺伝子発現分析を進歩または増強する方法を包含し、ここでその進歩は、要望とは異なる転写物種を除去するか増幅を抑制し、そしてこれにより要望とは異なる転写物種の存在下で得られるものよりも検出可能な遺伝子の数を増大させることを包含する。
【００２５】
本発明の方法を用いてこのような所望ではない転写物１つ以上を含有する何れかのサンプルの遺伝子発現分析を改善してよいが、方法は特に、全血および赤血球含有組織から所望ではない転写物を除去するか、その作用を除去するために有用である。さらに、方法は、集団の中の個々の核酸の１つ以上がこのような転写物の増幅により集団の残余の分析が妨害される程度にまで存在している場合に、核酸の混合サンプルの増幅反応の何れかの型に適用できる。
【００２６】
本発明の方法が全血または赤血球含有組織の分析のために使用される場合、抑制方法は（ａ）サンプルに赤血球核酸配列特異的干渉分子１つ以上を添加すること；および（ｂ）該赤血球配列特異的干渉分子１つ以上の存在下にサンプル中の転写物種を増幅することを含む。特に本発明は核酸の増殖過程の最中にＲＮＡを含有するサンプル中の赤血球特異的遺伝子、例えばグロビンｍＲＮＡ分子１つ以上の増幅を抑制するための方法を包含し、これは、（ａ）サンプルにグロビン核酸配列特異的干渉分子１つ以上を添加すること；および（ｂ）該グロビン核酸配列特異的干渉分子１つ以上の存在下にサンプル中の該ＲＮＡを増幅することを含む。
【００２７】
同時に１つより多い遺伝子を測定する遺伝子発現分析の何れかの型が本発明の方法、特に「定量的」分析、例えば対照配列の既知量を同時に増幅してカリブレーション用の内標準を得るような方法から利益を被る。遺伝子発現分析は種々の増幅反応を用いながら、例えばｃＤＮＡへのサンプル中のｍＲＮＡの逆転写、そしてさらに場合によりＲＮＡポリメラーゼを用いて各ｃＤＮＡ分子からｃＲＮＡ転写物を合成することにより行ってよい。或いは、遺伝子発現分析は、例えばＰＣＲまたは他の知られた増幅反応の場合のようにＤＮＡポリメラーゼを用いてさらにｃＤＮＡ分子を合成する工程を含んでよい。
【００２８】
マイクロアレイ手法を用いて遺伝子発現をモニタリングする場合、ｍＲＮＡ分子はｃＤＮＡ分子とするための逆転写酵素の使用を介してｃＤＮＡに変換され、そして次にポリメラーゼの使用を介して２本鎖ｃＤＮＡ分子とされる場合が多い。次にｃＤＮＡ分子を用いながら種々のＲＮＡポリメラーゼの活性により複数のアンチセンスまたはｃＤＮＡのｃＲＮＡコピーを作成する。この最終増幅過程の間、修飾されたヌクレオチドが反応混合物中に、そして故にｃＲＮＡ分子中に取り込まれる。次にこれらの修飾されたヌクレオチドを用いてシグナルを含有するかシグナルを発生できる他の分子との相互作用を介して検出可能なシグナルを生成する。次に標識されたｃＲＮＡをアレイ上のプローブと反応させ、ここでｃＲＮＡはアレイ上の遺伝子特異的プローブにハイブリダイズする。
【００２９】
このような増幅反応において、増幅の抑制は増幅過程の何れかの工程において、例えばｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写の工程において、または、ＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ用いたｃＤＮＡからのｃＲＮＡまたはｃＤＮＡの合成の工程において行ってよい。増幅の抑制はまた、例えば後に詳述する切断または分解によるか、または相補オリゴヌクレオチドに結合した磁気粒子を使用することにより、分析の前に、元の所望でない赤血球ｍＲＮＡ物質種または結果として生じるｃＲＮＡ物質種を欠失させることにより行ってもよい。即ち、上記において定義した通り、「干渉分子」とは本明細書においては、逆転写酵素またはポリメラーゼ反応に干渉するのみである分子ではなく、サンプル中の標的赤血球転写物種１つ以上の最終的な存在に何れかの特徴において干渉するものである。
【００３０】
増幅過程において酵素的反応に干渉するためには、アンチセンス機序をブロックすること（種々のポリメラーゼ酵素によるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの酵素的プロセシングに対する物理的バリア）によるか、または、三重鎖（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対保有）機序により機能できる核酸分子の多数を設計することが可能である。さらに、交差結合官能基を有する配列特異的オリゴヌクレオチド（ソラレン等）を使用してｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子の酵素的読み取りを抑制することも可能である。
【００３１】
さらにまた、ターゲティングされた赤血球ｍＲＮＡのＲＮａｓｅＨ媒介の切断を誘発するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するか、所望ではない標的ｍＲＮＡの分解を媒介できる触媒性の官能基（ＥＤＴＡ等）を使用するアンチセンスオリゴマーを介するかして、全ＲＮＡプールまたは結果として得られるｃＲＮＡにおける所望ではないｍＲＮＡを特異的に分解することが可能である。
【００３２】
即ち、転写酵素またはポリメラーゼの反応に干渉するためには、未修飾のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用できる。このようなオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅＨの活性を支援するが、ＲＮａｓｅＨがヘテロ二重らせんのＲＮＡ成分を切断できるようにする十分な一過性のハイブリダイゼーションイベントが潜在的に起こりえることから、ターゲティングされていないｍＲＮＡの分解が増大するようにオペレーターには観察される。或いは、未修飾のアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドはブロッキング分子として使用してよいが、後に詳述する通り、抑制すべき増幅工程に応じて５’または３’末端にブロッキング修飾を付加することは、アンチセンスオリゴヌクレオチドからの伸長を防止するためには好都合である。
【００３３】
さらにまた、非標的のＲＮＡ物質種にハイブリダイズした場合にＲＮａｓｅＨの活性を支援する能力が最小限にされるように、ＲＮａｓｅＨ活性を支援しない修飾よりなる部分を有するキメラオリゴヌクレオチドを使用することも可能である。即ち非標的のｍＲＮＡがＲＮａｓｅＨにより意図と反して切断される可能性が低減され、ｍＲＮＡプールの全体的統合性が維持される。これはＲＮａｓｅＨ活性を支援できる配列の数を最小限にするはずであり、それゆえ、ｍＲＮＡの全体的統合性は未修飾ＤＮＡオリゴマーを使用した場合よりも高品質となるのである。適当な修飾は例えば糖修飾（２’Ｏ−アルキル修飾、例えば２’Ｏ−メチル、２’Ｏ−ブチルおよび２’Ｏ−プロピル；２’−Ｏ−ハロゲン化物修飾、例えば２’Ｏ−Ｆおよび２’Ｏ−Ｂｒ；および２’Ｏ−メトキシエトキシ）、炭素環（非酸素）糖模倣物、骨格に対する２環式糖（１’と３’位の間、または１’と４’位の間のアルキル架橋等）修飾（ＰＮＡ、２’−５’連結オリゴマー、α連結オリゴマー、ボラノ−ホスフェート修飾オリゴマー、キメラオリゴマー、例えばアニオン系、カチオン系および中性の骨格構造等）またはホスホジエステル骨格に対する修飾（ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート等）を包含する。
【００３４】
さらにまた、ＲＮａｓｅＨ活性を必ずしも支援しないがポリメラーゼおよび転写酵素がオリゴマーを転写または逆転写（「リードスルー」）することが不可能となるほど十分な強度で結合することにより核酸の倍加に対して物理的ブロックとして機能できるような修飾オリゴヌクレオチドを使用することが可能である。逆転写酵素、ポリメラーゼおよび他のタンパク質は核酸中の二次構造（二重らせん構造）を通過して「溶融」する能力を有し、従ってブロッキングオリゴマーを「リードスルー」し、そして鋳型核酸に対して逆相補の核酸の作成を完了することができる場合がある。ターゲティングされたｍＲＮＡへのオリゴマーの結合親和性を増大させる修飾を用いることにより、鋳型核酸をコピーしているポリメラーゼおよび転写酵素を抑制し、オリゴマーおよび標的ｍＲＮＡにより形成される二重らせん構造を「リードスルー」する酵素の能力を低減することにより正しい複製を防止することが可能である。修飾は例えば２’Ｏ−アルキル、２’Ｏ−Ｆ、ＰＮＡおよび５メチルＣ置換を包含する。
【００３５】
さらにまた、酵素的方法によりＲＮＡを切断して正しいコピー作成を防止する機能的ＲＮａｓｅＨ部分を自らに結合させたアンチセンスオリゴマーを使用することも可能である。この場合、ＲＮａｓｅＨ部分はヘテロ二重らせん上に折り戻され、ＲＮＡ成分を切断する。この方法はまたオリゴヌクレオチド上にＲＮａｓｅＨの活性をロックダウンすることにより、非標的ＲＮＡの擬似的切断の可能性が低減されるという点において好都合であるが、その理由は、ハイブリッドはＲＮａｓｅＨとオリゴマーの間のリンカーの長さにより決定される特定の距離で切断する能力に限定されているためである。触媒性のリボザイムもまたｍＲＮＡまたはｃＲＮＡをターゲティングするために使用でき、そして、リボザイムの活性のための配列の条件が標的ＲＮＡ内に存在する限り、切断することができる。
【００３６】
さらにまた、酵素的方法により活性化後にＲＮＡを切断して正しいコピー作成を防止するような機能的部分を連結して保有しているアンチセンスオリゴマーを使用することも可能である。このような機能的部分を活性化してＲＮＡ成分と化学結合を形成する。使用できる特定の化学物質は例えばアルドール化剤、アルキル化剤、ソラレンまたはＥＤＴＡである。活性化剤には紫外線、第二鉄／第一鉄のイオン性化合物等が包含される。リンカーによりオリゴヌクレオチドに機能性部分を結合することにより、非標的ＲＮＡへの擬似的化学結合の可能性が低減されるが、その理由は、部分が標的ＲＮＡに空間的に接近するように部分に最も近い末端においてヘテロ二重らせんを形成するように活性が限定されているためである。標的ｍＲＮＡを「攻撃する」その部分の能力はこの接近に依存している。
【００３７】
増幅を抑制するための非アンチセンス手法もまた本発明の方法に包含される。例えば、ポリメラーゼおよび逆転写酵素に対する物理的ブロックとして機能するＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対形成を介してｍＲＮＡ中のプリンまたはピリミジンのストレッチの領域において３重鎖オリゴマーを形成してよい。３重鎖は三重らせんの形成を可能にする成分配列である２つの個別のオリゴマーにより媒介されてよい。さらに、三重らせんの形成を支援する、環状の核酸、または、環状または幹状に相互に対向して位置した必要な２配列を自らの配列内部に保有しているダンベルまたは幹状ループの構造を使用することも可能である。このような構造については、非三重らせん形成配列のループの大きさはそのような構造が形成されるために十分な長さであるが、２つの三重らせん形成配列がｍＲＮＡ配列と会合するほど接近することが無いように長すぎてはならない。
【００３８】
本発明の一部の実施形態においては、遺伝子特異的プライマーを設計し、増幅過程において酵素的反応に干渉するために使用する。例えば、複製を抑制すべきｍＲＮＡ、例えばヒトまたは他の哺乳類のグロビンｍＲＮＡに結合する選択された遺伝子特異的プライマーを使用することにより、ｃＤＮＡ合成の間にｍＲＮＡ分子の酵素的読み取りを抑制することが可能である。遺伝子特異的プライマーは転写開始プライマー（典型的にはポリ−ｄＴＴ７またはＴ３プロモーター含有プライマー）の下流に結合する。逆転写酵素の存在下においては、遺伝子特異的プライマーは転写開始プライマーと同様に３’方向に伸長されるが、このプライマーからの転写はこのｃＤＮＡが遺伝子特異的プライマーにより形成されたブロックに接近すれば停止する。ブロックは逆転写酵素のトランスロケーションを抑制する働きを有する。即ち、プロモーター領域を含有するｃＤＮＡは生成せず、これによりＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼがサンプルに添加された場合に選択された遺伝子に相当するｃＤＮＡまたはｃＲＮＡの複製が防止される。図２はどのようにして逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成が本発明の遺伝子特異的プライマーにより抑制されるかを示している。
【００３９】
本発明の一部の実施形態においては、遺伝子特異的プライマーは、プライマーの結合親和性が増大し、その後の反応における解離または「メルティングオフ」が防止されるように、その５’末端において相対的により多数のＧおよびＣ残基を含有するように設計される。本発明はまた逆転写酵素による鎖伸長をプライマーが支援する限り、キメラ遺伝子特異的プライマーの使用も意図している。遺伝子特異的プライマーからの伸長が長いほど、得られるヘテロ二重らせんはより安定となり、これによりさらに、オリゴｄＴプライマーからｃＤＮＡを伸長させる逆転写酵素の能力が弱められる。
【００４０】
本発明の方法はプライマーとして機能できないオリゴマー、例えば３−ＯＨ位においてホスフェートまたは他のブロッキング基により、または、リボースＯ−メチル基のような置換基、または、修飾されたホスフェート骨格により、上記した通りブロックされたものの使用とは対照的である。
【００４１】
本発明は、本発明者等が知る限り、本明細書に記載したパラメーターに従って、その存在がサンプルの相対的遺伝子発現をスキューさせる転写物を識別する最初のものである。従って、本発明は本明細書において識別される転写物をターゲティングする干渉分子を含有するキットおよび組成物も包含する。要望とは異なる転写物を発見する方法は例えばアガロースまたはアクリルアミドゲル上で観察されるとおり、ＲＮＡサンプルにおける優勢な転写物の配列を識別すること、または、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）または他の遺伝子発現アレイ上で分析した場合に数万のシグナル強度を有する増幅集団中の物質種を識別することを包含する。このような要望とは異なる転写物を識別する別の方法は分析すべき細胞または組織のサンプルに応じて当業者が容易に知りえるものである。
【００４２】
（例示される標的遺伝子および干渉分子）
本発明の方法は植物、脊椎動物または無脊椎動物、カビ、細菌等の何れかの種からの遺伝子発現の分析を進歩させるために使用してよい。例えば本発明の方法はヒト、ラット、ネズミ、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジおよびニワトリを包含する動物種における遺伝子発現の分析を進歩させるために使用してよい。種々の種におけるグロビン遺伝子の配列は知られており、本発明に従って干渉分子を設計するために使用してよい。グロビン干渉分子はＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。例えばヒト、ラットおよびイヌのグロビンｍＲＮＡの増幅を抑制するための適当なＲＮＡ干渉分子は以下のような配列を含有するか含んでいてよい（相当するＤＮＡ干渉分子については「Ｕ」は「Ｔ」となり、その配列は５’から３’の順に示されることに留意）。
【００４３】
【化１】
【００４４】
【化２】
【００４５】
【化３】
他の適当な配列は明細書全体を通して開示しており、例えば実施例のセクションに示すとおりである。
【００４６】
α（ＨＢＡ１、ＨＢＡ２）、β（ＨＢＢ）、γ（ＨＢＧ１、ＨＢＧ２）、δ（ＨＢＤ）、イプシロン（ＨＢＥ１）、θ（ＨＢＱ１）およびζ（ＨＢＺ）グロビン配列およびその変異体を含む赤血球含有組織の遺伝子発現分析の間にグロビンＲＮＡ配列の増殖を抑制するために特に好都合であるが、遺伝子発現分析を妨害する他の赤血球ＲＮＡ転写物種もまた単独またはグロビン転写物種の何れか、例えば、リボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３Ｌ）、Ｌ６（ＲＰＬ６）、Ｌ７（ＲＰＬ７）、Ｌ７ａ（ＲＰＬ７Ａ）、Ｌ９（ＲＰＬ９）、Ｌ１０ａ（ＲＰＬ１０Ａ）、Ｌ１１（ＲＰＬ１１）、Ｌ１２（ＲＰＬ１２）、Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、Ｌ１７（ＲＰＬ１７）、Ｌ１８（ＲＰＬ１８）、Ｌ１９（ＲＰＬ１９）、Ｌ２１、Ｌ２３ａ（ＲＰＬ２３Ａ）、Ｌ２４（ＲＰＬ２４）、Ｌ２７（ＲＰＬ２７）、Ｌ２７ａ（ＲＰＬ２７Ａ）、Ｌ２８（ＲＰＬ２８）、Ｌ３０（ＲＰＬ３０）、Ｌ３１（ＲＰＬ３１）、Ｌ３２（ＲＰＬ３２）、Ｌ３４（ＲＰＬ３４）、Ｌ３５（ＲＰＬ３５）、Ｌ３７（ＲＰＬ３７）、Ｌ３７ａ（ＲＰＬ３７Ａ）、Ｌ４１（ＲＰＬ４１）、Ｓ２（ＲＰＳ２）、Ｓ３ａ（ＲＰＳ３Ａ）、Ｓ５（ＲＰＳ５）、Ｓ６（ＲＰＳ６）、Ｓ７（ＲＰＳ７）、Ｓ１０（ＲＰＳ１０）、Ｓ１１（ＲＰＳ１１）、Ｓ１３（ＲＰＳ１３）、Ｓ１６（ＲＰＳ１６）、Ｓ１７（ＲＰＳ１７）、Ｓ１８（ＲＰＳ１８）、Ｓ２３（ＲＰＳ２３）、Ｓ２４（ＲＰＳ２４）、Ｓ２７ａ（ＲＰＳ２７Ａ）、Ｓ３１（ＲＰＳ３１）、ＳＭ、大型リボソームタンパク質ＰＯ（ＲＰＬＰＯ）、フラビン還元酵素（ＢＬＶＲＢ）、フェロケラターゼ（ＦＥＣＨ）、ミオシン軽タンパク質（ＭＹＬ４）、シヌクレイック（ｓｙｎｕｃｌｅｉｃ）α（ＳＮＣＡ）、δーアミノレブリン酸シンテターゼ２（ＡＬＳＡ２）、セレン結合タンパク質１（ＳＥＬＥＮＢＰ１）、赤血球膜タンパク質バンド４．２（ＥＰＢ４２）および赤血球膜タンパク質バンド４．９（ＥＰＢ４９）、グリコホリンＣ（ＧＹＰＣ）、抗酸化剤タンパク質２（ＡＯＰ２）、βアクチン（ＡＣＴＢ）、γアクチン１（ＡＣＴＧ１）、ビメンチン（ＶＩＭ）、脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）、真核細胞翻訳伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ｅ１）、翻訳制御１腫瘍タンパク質（ＴＰＴ１）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、フェリチン軽ポリペプチド（ＦＴＬ）、白血球レセプタークラスター（ＬＲＣ）メンバー７（ＬＥＮＧ７）、β−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、複製因子Ｃ（アクチベーター１）（ＲＦＣ１）、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ａ１（ＨＮＲＰＲ１）、フィンケル−ビスキス−ライリーネズミ肉腫ウィルス（ＦＢＲ−ＭｕＳＶ）遍在的発現物（キツネ由来）（ＦＡＵ）、ｒａｓ相同体遺伝子ファミリーメンバーＡ（ＡＲＨＡ）、コフィリン１（非筋肉）（ＣＦＬ１）、オルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素１（ＯＡＺ１）、ミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１（ＭＧＳＴ１）、早期増殖応答１（ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １）（ＥＧＲ１）、ミクソロームグルタチオンＳトランスフェラーゼ１（ＭＧＳＴ１）、ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）（ＰＰＩＡ）、癌胎児抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）、ガラクトシド結合レクチン４（ＬＧＡＬＳ４）、肝脂肪酸結合タンパク質１（ＦＡＢＰ１）、コートマータンパク質複合体サブユニットγ（イムノグロブリンλ連結３）（ＣＯＰＧ，ＩＧＬＪ３）、主要組織適合性複合体クラス１Ｂ（ＨＬＡ−Ｂ）、主要組織適合性複合体クラス１Ｃ（ＨＬＡ−Ｃ）、免疫グロブリン重μ定常物（ＩＧＨＭ）、免疫グロブリンκ定常物（ＩＧＫＣ）、溶質キャリアファミリー２５メンバー３（ＳＬＣ２５Ａ３）、Ｈ３ヒストンファミリー３Ａ（ＨＳＦＡ）、食道特異的正常粘膜１（ＮＭＥＳ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質８（ＨＳＰＡ８）、仮想タンパク質ＭＧＣ１４６９７（ＭＧＣ１４６９７）、重合体免疫グロブリンレセプター（ＰＩＧＲ）およびＦＫ５０６結合タンパク質８（ＦＫＢＰ８）、仮想タンパク質ＢＣ０１２７７５（ＬＯＣ９１３００）、寒冷ショックドメインタンパク質Ａ（ＣＳＤＡ）、Ｆボックス唯一タンパク質７（Ｆ−ｂｏｘ ｏｎｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＦＢＯＸ０７）、ＣＧＩ−４５タンパク質（ＣＧＩ−４５）、マコリンリングフィンガータンパク質１（ｍａｋｏｒｉｎ ｒｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １）（ＭＫＲＮ１）、小型ＥＤＲＫリッチ因子２（ＳＥＲＦ２）、ピニン（ｐｉｎｉｎ）（ＰＮＮ）、ＳＥＴドメイン分岐１抗酸化剤タンパク質２（ＡＯＰ２、ＳＥＴＤＢ１）、ヌクレアーゼ感受性エレメント結合タンパク質（ＮＳＥＰ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）およびユビキチンＢ（ＵＢＢ）に対する転写物と組み合わせてターゲティングしてよい。ＦＫ５０６結合タンパク質８およびセレン結合タンパク質１を抑制するための適当な干渉分子は以下の通りである。
【００４７】
【化４】
（用途）
本発明の方法は核酸物質種１つ以上が混合集団の増幅反応の分析をスキューまたは妨害するような何れかの用途において使用してよい。例えば、上記した通り、本発明の方法はＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）または他のアレイを用いた定量的遺伝子発現分析を行う際に使用してよい。本発明の方法は疾患マーカーの存在について、または、特定の疾患への罹患しやすさについて、ヒトをスクリーニングする際に使用してよい。本発明の方法はまた例えば遺伝子発現プロファイルに関する潜在的毒性化合物の作用を分析するためのＧｅｎｅＬｏｇｉｃのＴｏｘＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）システムにおいて動物の血液または組織のサンプルを分析する際にも使用してよい。その全体が参照により本明細書に組み込まれる出願番号０９／９１７，８００、１０／０６０，０８７、１０／１９１，８０３、１０／３３８，０４４、１０／３５７，５０７および６０／３９５，３５５を参照できる。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は本発明を説明および例証するために示すものである。それら自体は本発明の範囲を限定するものではない。当業者の知るとおり、多くの他の実施形態も上記および請求項に記載するとおり本発明の範囲に包含される。
【００４９】
（実施例１ 全血中の優勢な転写物種としてのグロビンｍＲＮＡ分子の識別）
遺伝子発現分析のための全血サンプル（ヒト、ラット、マウス等）の処理において、本発明者等は特定の過剰発現される遺伝子についてサンプル中に発現される他の遺伝子をモニタリングする能力を妨害する可能性があることを観察した。例えば、全血から全ＲＮＡを調製する場合、極めて高い濃度で過剰発現される独特のｍＲＮＡ少なくとも１つが生じると考えられる。遺伝子発現の典型的な分析においては、全ＲＮＡは、全ＲＮＡサンプル中の元のｍＲＮＡの各々に対して生じるｃＲＮＡの量を決定するために測定することができるシグナルの発生を可能にする修飾されたヌクレオチドを自らに取り込んでいるアンチセンスＲＮＡまたはｃＲＮＡを生成する一連の反応を介して増幅される。全血から単離した全ＲＮＡのこのような増幅を実施する場合、長さ約６００ヌクレオチドのサイズを示すｃＲＮＡプール中に存在する大量のｃＲＮＡが存在する（図１参照）。
【００５０】
末梢白血球が除去されている全血調製物と比較した場合の全血調製物の実験的分析ではこの過剰発現されたｃＲＮＡがなお存在することが示される。単離された末梢白血球に由来するｃＲＮＡを調べる場合、この過剰発現ｃＲＮＡのバンドは存在しない（図１参照）。従って、過剰発現されたｃＲＮＡのバンドは赤血球または何らかの他の非白血球の成分（例えば血小板）から誘導されたものである。
【００５１】
データをさらに分析したところ、全血球調製物中でより高い発現濃度を示すグロビン遺伝子（α、βおよびγ）に相当するプローブの独特のセットがあることがわかった。全血中において、これらのグロビン遺伝子は赤血球内で高濃度に発現され、γは胎児または新生児に検出されるが、加齢と共に減少し、αおよびβ型は誕生後により高い濃度で発現される。グロビン遺伝子の長さはαが〜５６７ヌクレオチド、βが〜６２６ヌクレオチド、そしてγが〜５７４ヌクレオチド長であることが知られている。従って、ｃＲＮＡにおいては、約６００ヌクレオチド長の増幅バンドの存在はこのバンドがこれらのグロビン遺伝子の１つ以上から誘導される場合があることを示している（電気泳動ゲルの分解能は長さの相違が十分大きくないためここのバンドを分割するのに十分ではない）。
【００５２】
（実施例２ 干渉分子の存在下および非存在下における全血サンプルの遺伝子発現分析）
現在のところ、血液のサンプルは、治療および診断に関連する白血球（ＷＢＣ）からの発現が得られるように赤血球（ＲＢＣ）を除去するように処理されている。上記した通り、これらのサンプルは典型的には約４０％の存在コール（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕ１３３Ａヒトアレイでは〜２２，０００遺伝子中〜９，０００）を示している。全血から処理されたサンプルは存在をコールされた遺伝子の総数が低減している（〜２２，０００遺伝子中〜５，０００、即ち〜２４％）。全血サンプルからの低減された存在コールに加えて、ミスマッチからのシグナルがパーフェクトマッチからのものより高値であるプローブ対の数が増大する（即ちＭＭ／ＰＭ比が増大する）。シグナルがパーフェクトマッチのプローブよりも高値であるミスマッチプローブの数が増大するに従い、遺伝子発現データの質は低下する。
【００５３】
大量のグロビンｃＲＮＡに対応するためにアレイ上にロードされるｃＲＮＡの量を増大させることにより、より多くの遺伝子がモニタリング可能になるかどうか調べた。しかしながら、ｃＲＮＡロードを増大（４０μｇまで）させても全血からの存在コールの数は有意に増大せず（２４％から２８％への〜４％の増加）、チップがＱＣ不合格となるようなＭＭ／ＰＭ比の僅かな低下が起こった。さらにまた、ポリＡ選択ｍＲＮＡを全ＲＮＡの代わりに使用したところ、存在コールは約３１％まで上昇したが、高いＭＭ／ＰＭ比は低下しなかった。結果として、このような調製ではやはり低品質の遺伝子発現データしか得られない。
【００５４】
次の実験は全血調整物中に存在する高度に発現されたグロビンｍＲＮＡからプライマー指向性逆転写酵素をブロックすることであった。３種の異なるブロッキングオリゴマー（「「ブロッカー」）をα、βおよびγグロビンの最も３’側の領域に設計した。オリゴマーはハイブリッド形成の安定性を増大させるために修飾されたＲＮＡヌクレオチド（２’Ｏ−メチル修飾）よりなるものであり、そして、種々の長さを試験することによりＲＴトランスロケーションを抑制する能力を至適化した。一部の実験においてはグロビンｍＲＮＡ物質種あたり１つより多くのオリゴマーの組み合わせが最大抑制をもたらすことがわかった。単一のブロッカーを用いた場合、完全長とトランケーションされたバンドが現れ（ｃＲＮＡＱＣゲル分析で観察）、逆転写酵素が完全に抑制されていないことが示唆された。一般的に、より長いブロッカーが短いブロッカーよりもＲＴトランスロケーションの抑制においてより有効であった。
【００５５】
以下に示す表は、９種のブロッカー（α、βおよびγグロビンの各々に対して３種の異なるブロッカー）の存在下および非存在下にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＵ１３３ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイを用いて全血全ＲＮＡを評価した場合のデータを示す。該すれば、全血より得た１μｇの初期全ＲＮＡに各オリゴマー０，１０および１００ｐｍｏｌｅのブロッカー混合物を添加し、その後、第１鎖ｃＤＮＡ合成反応を行い、そしてその後サンプルを処理してビオチン標識ｃＲＮＡとし、そして、チップハイブリダイゼーション、洗浄、染色およびデータキャプチャーに関するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＳＯＰに従って処理した。
【００５６】
ＱＣ結果（表１参照）はα、βおよびγグロビンをターゲティングした９種のブロッカーの非存在下（ＣＴＲＬ）または存在下（２つの異なる濃度）における全血全ＲＮＡ調製物から得たものである。ｃＲＮＡハイブリダイゼーション段階においてスパイクされた細菌遺伝子に対する人工的に作成されたｃＲＮＡ転写物はブロッカーの存在下において未変化であった。対数強度／対数バックグラウンド（即ちＳＮ比）にも変化は無かった。ミスマッチからのシグナルがパーフェクトマッチからのものよりも高値（即ちＭＭ／ＰＭ比）である場合のプローブ対の数が１５％減少していたことに留意すべきであり、これは性能の進歩を裏付けるものであった。Ｌｉ／Ｗｏｎｇアウトライアーの数もまた低減していた（「Ｍｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙｓ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｅｘ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｕｔｌｉｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」，Ｌｉ，Ｃ．ａｎｄ Ｗｏｎｇ，ＰＮＡＳ９８（１）：３３１−３６，２００１）。ＧＡＰＤＨおよびＢ−Ａｃｔｉｎに関する５’／３’比もまたＱＣの尺度となる。比の増大は良好なｃＤＮＡ合成およびより５’側の領域に対して設計されたチッププローブセットと反応するｃＲＮＡサンプルの能力の向上を示している。ＧＡＰＤＨおよびＢ−Ａｃｔｉｎに関する５’／３’比は１００ｐｍｏｌｅのブロッカーでそれぞれ９％および２９％増大していた。さらにまた、ブロッカーは存在コールのパーセントに対して用量依存的な応答を示していた。１０ｐｍｏｌｅの混合サンプルに対し、存在パーセントは４６％増大し、１００ｐｍｏｌｅの混合物ではゲインはブロックされていない全血サンプルと比較して６１％であった。ゲル分析によれば各ブロッカーの１００ｐｍｏｌｅの存在下において、優勢な６００塩基対のｃＲＮＡバンドは観察されなかった。
【００５７】
【表１】
全血からの増大した遺伝子発現がＷＢＣ調製物から得られたものにどのように相関しているかを調べるために、全ＲＮＡ＋ブロッカーから得られた発現データ（各濃度につきｎ＝１）をＷＢＣ調製物から得られた発現データと比較した（表２参照）。ＷＢＣデータを使用した場合、３点のＷＢＣ調製物全てにおける存在コールの遺伝子のリストは合計２２２８３中９６６２を含有していることがわかった（約４３％存在）。これらの遺伝子を３種の全血調製物（ＣＴＲＬ、１０ｐｍｏｌｅおよび１００ｐｍｏｌｅ）において生成されたものと比較した。対照チップ上の５４２９の存在遺伝子のうち、４９１５がＷＢＣフィルターリストであった（９０．５％）。１０ｐｍｏｌｅ混合チップ上の７９３９存在遺伝子のうち、７２０４がＷＢＣフィルターリストであった（９０．７％）。そして１００ｐｍｏｌｅ混合チップ上の８７６３存在遺伝子のうち、７８６１がＷＢＣフィルターリストであった（８９．７％）。これはブロッカー使用時にゲインされた存在コールがＷＢＣ遺伝子リスト上で一貫して（〜９０％）観察されたことを示している。
【００５８】
【表２】
このデータによれば、ブロッカーの使用により全血サンプル中のＷＢＣ遺伝子カバレッジは５０．９％から８１．４％（可能な９６６２中４９１５から７８６１）に増大したこと、あるいは、本質的には、プロトコルの変更が全血中のＷＢＣ発現遺伝子の総数をさらに３０．５％回復させたことを示している（これは全血サンプルより６０％増大に相当する）。
【００５９】
（実施例３ 全血中の他の優勢な転写物種の識別）
精製されたＷＢＣ中には発現され、全血ＲＮＡ＋ブロッカー中には発現されない遺伝子を比較した場合、僅か２８フラグメントが識別された。これらのうち、活性化された免疫細胞に特徴的なものは僅か３つであり、大部分は単球であり、程度も極めて軽少であった（Ｉｌ−１β、ＭＨＣＩＩおよびＣＤ６９）。残余は一般的にはある程度増殖性である細胞または造血細胞型により特徴的に発現され、これらはブロッカーを用いた全血の調製全体に亘る本操作法を用いればリッチ化されると予測される。
【００６０】
全血＋ブロッカーのみにおいて発現された遺伝子については、４３遺伝子がＷＢＣサンプル中において検出されなかった。予測されたとおり、これらの遺伝子は赤血球中で特異的または高度に発現されることが特に知られているものであった。倍数変化（ＦＣ）分析で一位であったものはＲＢＣタンパク質（赤血球膜タンパク質、ヘモグロビンζ、グリコホリン、セレン結合タンパク質およびＡＬＡＳ２）であった。
【００６１】
遺伝子リストはその発現がセットの３サンプル全てにおいて存在コールをもたらした遺伝子についてフィルタリングすることによりまず作成した。第２に、１つのサンプルセットのみ（即ちＷＢＣのみまたは１００ｐｍグロビンブロッカーのみ）において存在コールを与えた遺伝子を発見するために分析を行った。これらは１調製プロトコルにおいてのみ独特に検出される遺伝子である。最後に、倍数変化分析を実施して両方のサンプルセットに共通に発現される遺伝子の発現を調べた。２群間の遺伝子発現数値の相違の測定を行い、両側Ｔ検定により調べた場合に０．００１未満のｐ値で有意差ありとする。
【００６２】
ＷＢＣと全血ＲＮＡ＋ブロッカーのＦＣ相違分析において、全血ＲＮＡ＋ブロッカーにおいて極めて高度にアップレギュレートされた遺伝子はＲＢＣに関連する傾向を示していたが、一部のものは細胞型に関しては不明であった。特に興味深い点は、全血調製物中のαシヌクレインの極めて高い濃度であった。全血ＲＮＡ＋ブロッカーと比較した場合にＷＢＣ中で極めて高度にアップレギュレートされた遺伝子は大部分が均一してリボソームタンパク質遺伝子であった。
【００６３】
要約すれば、ブロッカーを使用することは全血プロトコル単独に対して多大な進歩となり、そして他の高度に発現されるＲＢＣタンパク質、例えばδーアミノレブリン酸シンテターゼ２（ＡＬＡＳ２）、セレン結合タンパク質、グリコホリンおよび一部の他のヘモグロビンに対してブロッカーを使用することによっても実施できる。
【００６４】
（実施例４ 霊長類全血サンプルと共に用いるためのオリゴヌクレオチドブロッカーの設計および評価）
ヒトα−グロビンブロッカーオリゴマーおよび霊長類βグロビンブロッカーオリゴマーがαグロビンおよびβグロビンｍＲＮＡに結合してグロビンｍＲＮＡのプライマー指向性逆転写酵素をブロックする能力について、カニクイザル全血調製物において試験した。
【００６５】
ヒトαグロビンおよびβグロビンをコードするヌクレオチド配列を、アカゲザルおよびカニクイザルのαおよびβグロビンヌクレオチド配列それぞれに対するコンセンサスに関して評価した。霊長類αグロビンヌクレオチド配列はヒトαグロビンヌクレオチド配列とマッチしている。この理由から、以前に評価されたヒトαグロビンブロッキングオリゴマー０４および０５を使用したが、０４は以下の通り、即ち、ＵＵＵＧＣＣＧＣＣＣＡＣＵＣＡＧＡＣＵＵＵＡＵ（配列番号３４、配列番号４＋３’末端の追加３ヌクレオチドと同じ）となるように伸長した。霊長類βグロビンヌクレオチド配列をヒトβグロビンヌクレオチド配列と比較したところ、１塩基対の相違が判明した。３つの２’−Ｏ−メチル霊長類βグロビンブロッキングオリゴマーを設計し霊長類βグロビンｍＲＮＡの逆転写を効果的にブロックするその能力について試験した。評価はＱ−ＰＣＲおよびｃＲＮＡデータの結果に基づいた。設計して試験したβグロビンブロッキングオリゴマーは以下に列挙するとおりである。
【００６６】
【化５】
分析を実施するために、カニクイザルの血液をＥＤＴＡ試験管中に採取する（１０ｍｌ血液／霊長類の１試験管）。次に全血をＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液試験管中に分注し、試験管をＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡキットハンドブックに従って処理することにより全ＲＮＡを得る。ＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡキットはαおよびβグロビンＲＮＡを含む血液中の核酸を安定化させる。
【００６７】
ＲＮＡ抽出の後、反応あたり全ＲＮＡ５μｇを用いて逆転写を実施する。逆転写工程はプライマー−アニーリング工程において反応に２’−Ｏ−メチル修飾グロビンブロッキングオリゴマーを添加した以外はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのプロトコルに従って実施する。表３はサンプルの説明である。サンプルＣｙＰ１を対照として使用した。
【００６８】
【表３】
ｃＤＮＡ／サンプル約０．９μｇづつを用いてＱ−ＰＣＲを行った。Ｑ−ＰＣＲはαグロビンおよびβグロビンｍＲＮＡの逆転写をブロックする２’−Ｏ−メチルαグロビンオリゴマーおよび２’−Ｏ−メチル−βグロビンオリゴマーの能力を評価するために使用した。Ｑ−ＰＣＲデータは被験サンプル各々（ＣｙＰ２、ＣｙＰ３およびＣｙＰ４）の平均のＣＴをブロックされていない全血ｃＤＮＡ対照（ＣｙＰ１）のものと比較することにより分析した。ブロックされていないサンプルの平均ＣＴ値と比較した場合の各ブロックサンプルの平均ＣＴ値の上昇は、対照サンプルと比較してαグロビンｍＲＮＡまたはβグロビンｍＲＮＡ逆転写をブロッカーが良好にブロックしたことを示している。全被験サンプルは相当する対照の平均ＣＴ値よりも高値の平均ＣＴ値を有しており、全てのオリゴマーが被験サンプル中のグロビンＲＮＡの逆転写をブロックしたことを示していた。
【００６９】
【表４】
ｃＤＮＡはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの標準的インビトロ転写（ＩＶＴ）のプロトコルを用いてｃＲＮＡに転写する。ｃＲＮＡの品質はＡ２６０測定により試験する。ＣｙＰ１対照サンプルは転写物がそのサンプル中でブロックされていなかったために最も高い総収量を有することが予測された。２５μｇ未満のいずれの収量も不良とみなした。全被験サンプルの総収量は高く、ＣｙＰ２サンプルは対照サンプルと統計的に同様の良好な性能を示した。サンプルＣｙＰ３およびＣｙＰ４はＣｙＰ２サンプルより低値の全ｃＲＮＡ収量であったが、これらの収量はなお十分であった。ｃＲＮＡの品質および２’−Ｏ−メチルオリゴマーがαグロビンおよびβグロビンをブロックする能力は１ＸＭＯＰＳ、１．２５％アガロースゲル上で試験した。許容基準はグロビンに相当することが実施例１でわかっている≦０．６Ｋｂのバンドが存在しないこととした。０．６Ｋｂ以下のバンドの存在は完全ではない部分的なグロビン転写のブロッキングを示唆していた。全被験サンプルにおいてグロビンが完全にブロックされたことをゲルは示していた。
【００７０】
【表５】
Ｑ−ＰＣＲおよびｃＲＮＡのデータは全オリゴマーが結合し、αおよびβグロビンＲＮＡの逆転写を効果的にブロックしたことを示していた。ＣｙＢ１オリゴマーはβグロビンｍＲＮＡの３’末端に最も近く結合するように設計した。これは他のβグロビンブロッキングオリゴマーと同様に効果的にβグロビンＲＮＡの転写をブロックし、ｃＲＮＡの最高収量をもたらした。この理由から、ＣｙＢ１（配列番号３５）は評価された最も効果的なβグロビンブロッキングオリゴマーであると考えられる。
【００７１】
（実施例５ 干渉分子の存在下および非存在下の霊長類全血サンプルの遺伝子発現分析）
カニクイザル白血球、全血および全血＋ブロッキングオリゴマーの遺伝子発現分析をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＧ＿Ｕ１３３ＡＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ上で実施する。ＲＮＡは全血中の赤血球を溶解させ、そして製造元の説明書に従ってＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙキットを用いて全ＲＮＡを抽出することにより白血球から得る。ＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡキットを用いて全血調製物から抽出された全量を抽出し、製造元の説明書に従って使用する。全ＲＮＡサンプルはＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写のプライマーアニーリング工程の間にサンプルＰＡＸ＿１００にブロッキングオリゴマーを添加する以外はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの標準的プロトコルに従ってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＧ＿Ｕ１３３ＡＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイを用いて処理した。表６はサンプルの情報を示す。
【００７２】
【表６】
各サンプルはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの標準的プロトコルに従って３ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＧ＿Ｕ１３３ＡＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ上で実施する。サンプルは交差物質種ハイブリダイゼーションにより実施例２に記載したものよりも低い存在コールを示した。白血球サンプルは約２１．５％の存在コールを示した（〜２２，０００遺伝子中〜９，０００、即ち〜２４％）。ブロッキングオリゴマー非存在下の全血サンプルは約１７．９％の存在コールを示した。これと比較して、ブロッキングオリゴマーを含有する全血サンプルは約２６．０％の存在コールを示した。このデータは白血球サンプルまたはブロッキングオリゴマー非含有全血サンプルよりも多くの遺伝子がブロッキングオリゴマー含有全血サンプル中から検出されたことを示している。
【００７３】
相関カラーマップおよびＰＣＡグラフ（図示せず）もまた白血球サンプルとブロッキングオリゴマー含有全血サンプルの存在コール遺伝子の間に高い水準の一致があったことを示していた。
【００７４】
（実施例６ イヌ全血サンプルを用いたオリゴヌクレオチドブロッカーの評価）
イヌブロッキングオリゴマーを設計し、グロビンｍＲＮＡの逆転写を効果的にブロックするその能力について評価した。イヌ血液を採取し、ＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡキットを用いて製造元の説明書に従って処理する。ｍＲＮＡを逆転写し、そして２’Ｏ−メチル修飾ブロッキングオリゴマーを被験サンプルのプライマーアニーリング工程中に１００ｐｍｏｌ／反応で添加する。設計して試験したαおよびβグロビンブロッキングオリゴマーは以下に列挙するとおりである。サンプルの説明は表７に示す。
【００７５】
【化６】
【００７６】
【表７】
サンプルは実施例２に記載する通りＱ−ＰＣＲを用いて試験する。対照サンプル（全血、ブロッカー無添加）は最低の平均αグロビンＣＴおよびβグロビンＣＴ値を全サンプルに亘り示した。このことは全てのブロッカーは、対照サンプルと比較して被験サンプル中のグロビンＲＮＡの逆転写をブロックしたことを示している。
【００７７】
ｃＤＮＡサンプルを実施例２に記載した通りｃＲＮＡに転写する。ブロッカーオリゴマーを含有しない全血サンプルは１１０．４５μｇのｃＲＮＡ総収量を示した。ブロックされたサンプルはより低値の収量を示したが、全収量とも２９μｇより高値であった。２５μｇ未満の収量は「失敗」とみなした。この理由から、全被験サンプルの総収量は十分であると考えられた。
【００７８】
ｃＲＮＡはまた１ＸＭＯＰＳ、１．２５％アガロースゲル上で泳動することによりブロッキングオリゴマーがグロビンｍＲＮＡの逆転写を完全にブロックしたかどうか調べた。サンプルＫ９Ｐ１７に相当するゲルのレーン内の約０．６Ｋｂの弱いバンドはこのサンプルについて部分的なブロッキングのみ生じたことを示唆していた。他の被験サンプルに相当するゲルのレーンはバンドを示しておらず、これはグロビンｍＲＮＡ転写物の逆転写の完全なブロッキングが起こったことを示唆していた。この理由から、αブロッキングオリゴマーの組み合わせはαグロビンブロッキングオリゴマーＣＡＮａＧ．０４が単独でブロックするよりも効果的に逆転写をブロックすると考えられる。
【００７９】
（実施例７ 干渉分子の存在下および非存在下のイヌ全血サンプルの遺伝子発現分析）
イヌ白血球、全血およびグロビンブロッカーを含有する全血の遺伝子発現分析をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘイヌＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイプラットフォームを用いて実施する。実験は実施例５に記載した実験と並行する。白血球サンプルは赤血球を溶解することにより採取し、全ＲＮＡはＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキットを使用して抽出する。全ＲＮＡはＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡキットを用いて全血サンプルから抽出する。サンプルの説明は表８に記載するとおりである。
【００８０】
【表８】
サンプルは実施例５に記載の通り処理し、そしてサンプルは各々１つのイヌＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイとハイブリダイズする。ＷＢＣサンプルセットは３４．８％で最高パーセント存在コールを示した。ＰＡＸ＿０サンプルセットは１６．７％で最低パーセント存在コールを示した。ＰＡＸ＿１０、ＰＡＸ＿１００およびＰＡＸ＿２００サンプルセットはそれぞれ２９．９％、３１．９％および２９．３％のパーセント存在コールを示した。データはグロビンブロッキングオリゴマーを添加した場合には全血球サンプル中のパーセント存在コールが実質的に増大したことを示している。
【００８１】
ＰＡＸ＿１００サンプルセットは他の全血球調製物と比較した場合にＷＢＣサンプルセットと合致した最高水準を示した。ＷＢＣサンプルセットとＰＡＸ＿１００サンプルセットとの間の存在コール遺伝子の一致は８６．３％であった。ＷＢＣサンプルセットとＰＡＸ＿０サンプルセットとの間の存在コール遺伝子の一致は４６．５％であった。データは、遺伝子発現データは白血球サンプルと１００ｐｍｏｌブロッキングオリゴマー添加全血サンプルとの間で最も同様であることを示していた。
【００８２】
（実施例８ ラット全血サンプルの遺伝子発現分析：グロビン低減の有無による示差的遺伝子発現の分析に関するＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）およびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）プロトコルの比較）
本試験の目的はラット全血サンプルに対するグロビン低減プロトコルの有効性を評価すること、および、ＷＢＣプロトコルと比較した場合のグロビン低減プロトコル処理サンプルと未処理サンプルの遺伝子発現の差の測定における進歩の程度を評価することであった。
【００８３】
ラット１５匹に食塩水（３ｍｌ／ｋｇ、ｉｐ）を投与し、そして１５匹にＬＰＳ（３ｍｌ／ｋｇの容量で１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）を投与し、そしてラット血液から、（１）ノースカロライナ大学ＲＢＣ溶解プロトコル（ＵＮＣ）（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｇｅｎｅｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ａｎｔｉ−ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＡＮＣＡ），Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ．，６２（５）：１６３８−４９）、全血混合ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）プロトコルおよびＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）標準単離プロトコルを用いてＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡを逆転写し、２’Ｏ−メチル修飾ブロッキングオリゴマーを被験サンプルのプライマーアニーリング工程の間に５μｇ全ＲＮＡの４００ｐｍｏｌ／反応で添加する。使用されたブロッカーは以下のとおりである。
【００８４】
【化７】
次に各サンプルを１つのＲＧＵ３４ＡＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイに４５℃で２４時間ハイブリダイズし、アレイをＭｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ５．０ソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、以下のセッティング、すなわちスケーリング＝全プローブセット＠ＴＧＴ１００、規格化ファクター＝１、α１＝０．０４、α２＝０．０６、タウ＝０．０１５、γ１Ｌ＝０．００２５、γ１Ｈ＝０．００２５、γ２Ｌ＝０．００３、γ２Ｈ＝０．００３および摂動＝１．１により分析した。
【００８５】
プローブセットのリストはＡＳＣＥＮＴＡＴＭシステム（Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から入手し、これはサイトカイン遺伝子ファミリー（５３メンバー）またはＧＰＣＲ遺伝子ファミリー（２７７メンバー）の何れかのメンバーと考えられた。ｌｏｇ２変換Ｇｅｏｍｅａｎデータの比較によれば、未処理の全血サンプルよりもグロビン低減プロトコルおよびＵＮＣプロトコルで処理したＴＲＩｚｏｌ（登録商標）プロトコルおよびＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）サンプルの間に有意に増大した相関（Ｒ２）が示されていた。このことは、グロビンメッセージを除去した場合に遺伝子発現測定の正確さの有意な進歩が起こることを示している。
【００８６】
８炎症経路（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、サイトカイン炎症応答、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、サイトカインネットワーク、炎症応答、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）および有糸分裂促進物質活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ））のメンバーであり、そして対照とＬＰＳ投与ＷＢＣサンプルとの間に有意な遺伝子発現の相違を示した遺伝子のサブセットを調べた。ＷＢＣサンプルセットにおいてみられた対照とＬＰＳ投与サンプルとの間の測定された遺伝子発現の相違の程度をＴＲＩｚｏｌ（登録商標）とＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）サンプルセットのものと比較した。グロビン低減プロトコルで処理したＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）のサンプルセットの両方につき、対照およびＬＰＳ投与サンプルの間で測定された遺伝子発現の相違の計算された程度の相関は、ＷＢＣサンプルセットのものに対して、増大していた。即ち、倍数変化の規模の相関ははるかに高度であり、そして発現における倍数変化の方向は（ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）のサンプルセットの両方につき）グロビン低減後のＷＢＣサンプルのものとより合致している。
【００８７】
要約すれば、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）のＲＮＡサンプルをグロビン低減プロトコルで処理することによりＷＢＣ中の示差的遺伝子発現の正確な測定に対して顕著な利点が与えられる。αおよびβグロビンｃＲＮＡの大部分をアレイハイブリダイゼーション溶液から除去することにより、遺伝子検出の感度および測定された遺伝子発現の正確さと再現性が大きく高められる。グロビン低減プロトコルはＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）のＲＮＡ単離にさらに付け加えたプロトコル工程を含んでいるため、プロトコルはＷＢＣ単離が無いという利点も有している。
【００８８】
（実施例９ ヒトサンプル中の全血遺伝子発現プロファイリングを増強するための逆転写中のαグロビン、βグロビンおよびγグロビンのブロッキング）
本試験の目的は、（１）０．２％から２．５％の範囲の広範な網状赤血球を有するヒト全血サンプルに対するグロビン低減プロトコルの有効性を測定すること；（２）ブロッキング方法がグロビンｍＲＮＡを極めて少量または極めて大量に含有するサンプルにおいてもなお有効であるかどうか調べること；および（３）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの最近発表したＲＮａｓｅＨ系のグロビン低減プロトコル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｎｏｔｅ Ａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｃｄｓｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｐｒｅｐａｒｅ Ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（２００３））と遺伝子特異的ブロッカーとして２’Ｏ−メチル化学修飾オリゴマーを用いた本発明のグロビン低減プロトコルを比較することであった。
【００８９】
血液を異なる６ドナーの各々から採取し、網状赤血球計数分析を含む完全な血液計数分析のために処理した。全ＲＮＡは（１）後のパラグラフにおいて「ＷＢＣ」と称される「ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ」（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコル（任意のオンカラムの「ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ」（Ｑｉａｇｅｎ）ＤＮａｓｅ Ｉ処理消化を含む）；（２）ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＲＮＡ単離プロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；および（３）「ＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡキット」（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）プロトコル（任意のオンカラムの「ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ」（Ｑｉａｇｅｎ）ＤＮａｓｅ Ｉ処理消化を含む）の各々を利用しながら各サンプルの一部から単離した。
【００９０】
６ＷＢＣ全ＲＮＡ、６ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＲＮＡおよび複数のＰＡＸｇｅｎｅＴＭ全ＲＮＡサンプルの各々を「ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐ Ｋｉｔ」（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ バイオアナライザーシステム上でＲＮＡの品質について個別に評価し、そして次に「ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ）または「ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ」プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）の何れかを用いて１μｇ／μｌより高値の濃度まで濃縮した。濃縮されたＲＮＡサンプルは「ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ−Ｃｈａｐｔｅｒ ２：Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓａｍｐｌｅ ａｎｄ Ａｒｒａｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に記載されている通り、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）分析用のサンプル調製に関する標準的プロトコルに従って調製した。さらにまた、各ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭの全ＲＮＡサンプルの小分量も以下の通り本発明のグロビン低減プロトコルまたはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘグロビン低減プロトコルで処理した。
【００９１】
本発明のグロビン低減プロトコル法：初回鎖ｃＤＮＡ合成反応の開始時において、ＰＡＸｇｅｎｅＴＭおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）全ＲＮＡの両方の５μｇずつをＴ７−オリゴ（ｄＴ）プライマー１００ｐｍｏｌおよび以下の５種のグロビンｍＲＮＡブロッキングオリゴマー（２種のαブロッカー、２種のβブロッカーおよび１種のγブロッカー、反応あたり各々９０ｐｍｏｌ）の各々９０ｐｍｏｌを含有する修飾オリゴヌクレオチド（オリゴ）混合物５μｌに同時にアニーリングした。
【００９２】
【化８】
各アニーリング反応は１０分間７０℃で１２μｌの総容量中で行った（総数６サンプル２セット）。次に１２「処理」サンプル全てを「ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ−Ｃｈａｐｔｅｒ ２：Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓａｍｐｌｅ ａｎｄ Ａｒｒａｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に記載されている通りのプロトコルの残余に従ってＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）分析用に調製した。
【００９３】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのグロビン低減プロトコル法：初回鎖ｃＤＮＡ合成反応の開始前にＰＡＸｇｅｎｅＴＭおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）全ＲＮＡの両方の５μｇずつを２種のαグロビン３’末端アンチセンスプライマー各々１５ｐｍｏｌおよびβグロビン３’アンチセンスプライマー４０ｐｍｏｌに同時にアニーリングした。各アニーリング反応は５分間７０℃ｈで１０μｌの総容量で行った（合計２セット６サンプル）。次に各アニーリングサンプルを１０分間３７℃で総反応容量２０μｌ中２単位のＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で消化した。次にＲＮａｓｅＨ消化全ＲＮＡサンプルを清浄化し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）サンプルクリーンアップモジュール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）のＩＶＴｃＲＮＡクリーンアップスピンカラムを用いて１１μｌの容量に濃縮した。次に１２「処理」サンプル全てを「ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ−Ｃｈａｐｔｅｒ ２：Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓａｍｐｌｅ ａｎｄ Ａｒｒａｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に記載されている通りのプロトコルの残りの部分に従ってＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）分析用に調製した。
【００９４】
次に各ＷＢＣ、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭＲＮＡサンプル（本発明のグロビン低減法またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのグロビン低減プロトコルの何れかで処理したサンプルを含む）を各々１つのＨｕ１３３Ａアレイに４５℃で１６時間ハイブリダイズした。各アレイを「ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ−Ｃｈａｐｔｅｒ ２：Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓａｍｐｌｅ ａｎｄ Ａｒｒａｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に従って洗浄、染色およびスキャン（単一のスキャナー上）した（ＳＯＰ３０３７ｖ２および３００８ｖ３参照）。各アレイのイメージをＧｅｎｅＬｏｇｉｃの専売ＱＣワークベンチプログラムを用いて品質評価し、次にＭｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ５．０ソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて分析した。使用したＭＡＳ５．０分析のセッティングはスケーリング＝全プローブセット＠ＴＧＴ１００、規格化ファクター＝１、α１＝０．０５、α２＝０．０６５、タウ＝０．０１５、γ１Ｌ＝０．００４５、γ１Ｈ＝０．００４５、γ２Ｌ＝０．００６、γ２Ｈ＝０．００６および摂動＝１．１とした。
【００９５】
ｃＲＮＡ標的の長さに関する典型的な範囲である２００〜４，０００塩基がＷＢＣ調製物について観察できる。ＰＡＸｇｅｎｅＴＭシステムおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）の調製物を用いれば、優勢な〜６００ｂｐのバンドは著明であり、ｃＲＮＡ分布の相対強度はＷＢＣ調製物で観察されるものより低値である。何れかのグロビン低減法により調製したサンプルから得られたイメージでは優勢な〜６００ｂｐのバンドは顕著に低減され、著明ではなかった。さらに、本発明のグロビン低減プロトコルにより処理したＰＡＸｇｅｎｅＴＭシステムおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルのｃＲＮＡ標的分布の長さは再度ＷＢＣｃＲＮＡ標的と適合していた。しかしながら、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＲＮａｓｅＨ系のグロビン低減プロトコルで処理したＰＡＸｇｅｎｅＴＭシステムおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルのｃＲＮＡ標的分布の長さは僅かに低減しているように観察された。
【００９６】
赤血球溶解調製物中に発現されたものと比較してＰＡＸｇｅｎｅＴＭ調製物中で最も高度に発現された遺伝子はグロビン転写物である（データ示さず）。優勢な〜６００ｂｐのバンドは全血調製物中に存在するが他の方法では除去される網状赤血球由来のグロビンｍＲＮＡの増幅に起因する。グロビン転写物をターゲティングするためには、本発明のグロビン低減プロトコルはそれぞれＨＢＡ１、ＨＢＡ２、ＨＢＢおよびＨＢＧ１に対して設計されたグロビン転写物α、βおよびγグロビンに対する５種の遺伝子特異的ブロッキングオリゴマーを利用する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘグロビン低減プロトコルはαおよびβグロビン転写物のみをターゲティングするプライマーを利用する（ＨＢＡ１、ＨＢＡ２およびＨＢＢ配列に特異的）。しかしながら、試験した各ブロッキング方法は優勢な〜６００ｂｐのバンドを完全に除去している。〜６００ｂｐのバンドは全ＲＮＡ調製物には検出されず、ｃＲＮＡ増幅過程を実施した後にのみ生じたことに留意しなければならない。ｃＲＮＡ強度の相対的低減およびゲルイメージにおけるＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルの見かけ上の長さは豊富なグロビンメッセージと増幅および標識中の残存転写物との間の競合に起因しているか、または、単に、大量のグロビンｃＲＮＡによるサンプル中の非グロビンｃＲＮＡの希釈の結果であると考えられる。
【００９７】
一貫して低値の「パーセント存在コール」および高値のＭＭ＞ＰＭプローブ対計数がＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルにおいて観察された（データ示さず）。〜６００ｂｐのバンドの低減は増大した「パーセント存在コール」および低値のＭＭ＞ＰＭプローブ対計数と相関しているため、ＰＡＸｇｅｎｅＴＭおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）の実験における低減した感度は全血ＲＮＡ調製物中に存在する増幅されたｃＲＮＡ標的の優勢なバンドの存在による可能性が最も高い。
【００９８】
ｃＤＮＡ合成の前またはその間のグロビン転写物枯渇の効率性を調べるために、各サンプルに関するα、βおよびγグロビン遺伝子発現値を抽出した。一部の例においては６種以下の異なるプローブセットを用いて単一のグロビン遺伝子の平均の遺伝子発現を測定した。網状赤血球が高濃度であるサンプルはより高値のグロビンシグナルを示したが、両方のグロビン低減方法ともその予測される転写物に関する測定遺伝子発現シグナル値を低減した。本発明の方法のためのブロッカーカクテルはＷＢＣ調製物において測定されたものと同じかより低値であるシグナル値の範囲までα、βおよびγグロビンプローブセットのシグナル値を低減した。しかしながらＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのグロビン低減プロトコルは本発明のグロビン低減プロトコルほど顕著にはグロビンプローブセットのシグナル値を低減しなかった。
【００９９】
ＧｅｎｅＬｏｇｉｃのグロビン低減プロトコルは実際にＷＢＣプロトコルで観察された数値より僅かに低値までβグロビンの発現シグナルを低減したことに留意しなければならない。さらにまた、予測されるとおり、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘグロビン低減プロトコルはγグロビン値に対しては僅かな作用しか示さなかった（ＲＮａｓｅＨ消化についてはγグロビン転写物を特異的にターゲティングしないため）。両方のグロビン低減プロトコルは広範な網状赤血球計数を示すドナーから得たサンプルに亘ってグロビンシグナルを低減することについては、同様の有効性を示した。このことは両方のプロトコルは可変のドナーサンプル集団に対してグロビンを低減する場合には効果的であることを意味する。
【０１００】
ベースライン発現としてのＷＢＣ全ＲＮＡと異なる全血全ＲＮＡとの間の示差的発現を示した遺伝子およびグロビン枯渇方法を識別するためにスチューデントのｔ検定を用いた。各比較におけるプローブセットの大部分は２倍より小さい変化の相違を示した。しかしながら、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭ全ＲＮＡをＷＢＣ調製物と比較した場合、それぞれ８４３および１０２０プローブセットがｐ値＜０．０１でいずれかの方向に２倍の発現差があることが判明した。有意な発現の差の数は、本発明のグロビン低減法を用いれば、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルでは８４３から１２４プローブに、そしてＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルでは１０２０から３９１プローブセットにそれぞれ低減した。また、上記の場合ほど有意ではないが、有意な発現の差の数は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘグロビン低減プロトコル法を用いることで、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルでは８４３から７２６プローブに、そしてＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルでは１０２０から７９９プローブセットにそれぞれ低減した。この方法で処理されたサンプルについては有意な負の倍数変化の数の大きな増大が観察され、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルの間に起こっている非特異的またはオフターゲットの作用を示している。明らかに、本分析においては本発明のグロビン低減法が最良の性能のプロトコルであり、そして本プロトコルで処理したサンプルにおいてはオフターゲット作用は仮にあったとしても少数であることをデータは示している。
【０１０１】
細胞型特異的で遺伝子ファミリー特異的なシグネチャー遺伝子の２セットを用いて血液特異的遺伝子に基づいて試験された異なるプロトコルにより作成された遺伝子発現データを相関付けた。赤血球特異的遺伝子は全血全ＲＮＡプロトコルのいずれにおいてもより高度に発現された。顆粒球および単核細胞特異的な転写物の相関はＷＢＣ対未処理ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルについてはＲ２＝０．９０でありＷＢＣ対未処理ＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルについてはＲ２＝０．８３であったが、この相関は本発明のグロビン低減プロトコル処理サンプルのいずれにおいても０．９９超まで増大していた。Ｒ２＝０．９９の最高相関は本発明のグロビン低減プロトコルで処理されたＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルで観察された。
【０１０２】
興味深いことに、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＲＮａｓｅＨ系のグロビン低減プロトコルにより処理されたＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルはこの特定の分析においては極めて不良な性能を示した。顆粒球および単核細胞特異的な遺伝子発現の数値の相関はＷＢＣ対ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）＋ＲＮａｓｅＨについてはＲ２＝０．６６であり、ＷＢＣ対ＰＡＸｇｅｎｅＴＭ＋ＲＮａｓｅＨについてはＲ２＝０．６３であった。この遺伝子セットについてはオフターゲット作用が実際にＷＶＣサンプルデータへの相関を低下させていたことは明らかである。
【０１０３】
同様の結果がシグネチャー遺伝子の第２のセットについても観察された。ＷＢＣ対未処理ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）またはＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルについては遺伝子発現の数値の相関はそれぞれＲ２＝０．８５および０．８３であった。この相関は本発明のグロビン低減プロトコルで処理したＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルについてはそれぞれ０．９７および０．９４に増大した。さらに、顆粒球および単核細胞特異的な遺伝子とは対照的に、ＷＢＣと比較した場合のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコル処理のＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルでは相関の増大が観察された（それぞれＲ２＝０．９０および０．８９）。
【０１０４】
考えられるプロトコルのオフターゲット作用を示すプローブセットの数をさらに求めるために、各グロビン低減プロトコル（即ちＴＲＩｚｏｌ（登録商標）＋ブロッカー、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）＋ＲＮａｓｅＨ等）について幾何平均の比（各プローブセットに対する）を未処理のＰＡＸｇｅｎｅＴＭまたはＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルのデータと比較し、そして各比較についてスチューデントのｔ検定を行うことにより何れかの測定された発現の差が有意であるか調べた。最後に、未処理のＰＡＸｇｅｎｅＴＭまたはＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルセットの場合よりもＷＢＣサンプルセットにおいて高値の幾何平均のシグナル値を有していたプローブセットのみを含むようなプローブセットのフィルターリストを求めた。処理対未処理のサンプルにおいて有意な低下（１．５倍より大きいシグナル低下、ｐ＜０．０５）を示し、そして、未処理サンプルよりもＷＢＣサンプルにおいて高濃度に発現されたものとして測定されたプローブセットを計数した。〜２２，０００プローブセット中僅か６および２つが本発明のグロビン低減プロトコルで処理されたＰＡＸｇｅｎｅＴＭおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルについてこのような基準を満足した。しかしながら、３２９および５２０プローブセットがＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘグロビン低減プロトコルで処理したＰＡＸｇｅｎｅＴＭおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルについてこの同様の基準を満足した。この分析から得られる結果はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＲＮａｓｅＨ系プロトコルは有意で多数のオフターゲット作用をもたらすということである。このことはプロトコル自体の性質によるものと考えられ、ゲノムＤＮＡのフラグメントを含有する可能性のあるサンプル中の酵素的反応を使用することにより、多くの異なる非グロビンｍＲＮＡ消化が起こる可能性がある。
【０１０５】
要約すれば、本発明またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのグロビン低減プロトコルの何れかを用いて調製された６種の異なる全血サンプルから得られたＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイデータをブロックされていない全血全ＲＮＡサンプルから得たデータと比較した。これらの異なるプロトコルの性能をＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ上のハイブリダイゼーションの前および後に多くのパラメーターに対して評価した。発現データの分析によれば、本発明のプロトコルは％存在以外の全ての分析およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルの一致分析においてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのプロトコルよりも良好な性能を示した。さらに、本発明のプロトコルは全血サンプルマイクロアレイデータの感度および再現性を大きく向上させ、生産において実施できる最も平易なプロトコルであり、そして最も自動化が容易である。
【０１０６】
ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プラットフォーム用に処理したサンプルに対して本発明の転写ブロッキング法を用いれば、全血調製物由来の全ＲＮＡから誘導したものとの関連において測定可能な遺伝子の数が６６％から８６％に増大した。網状赤血球溶解プロトコルを用いて処理された同じサンプルにおける存在コールとして測定された遺伝子に対して転写ブロッキングプロトコルを用いて得られた遺伝子を比較したところ、２つのプロトコルの間には９６％の重複があった。このことは遺伝子発現の生物学的一貫性が維持されており、より関連する末梢白血球の遺伝子発現分析が得られることを示唆している。平均の変動係数は転写ブロックプロトコルにおいては３．９％低減され、それに伴うＧＡＰＤＨまたはβアクチン比較対象遺伝子のＳＮ比や５’−３’比の有意な変化は無い。ブロッキング法を用いる場合の１つの懸案事項は非ブロッカーのターゲティングされた転写の「オフターゲット」サイレンシングがある点である。しかしながら、得られたデータの分析によれば、マイクロアレイ上にタイルされた〜２２，０００遺伝子のうちオフターゲット作用の可能性を示したものは最大でも６つであった。これらの結果によれば、採取時に安定化された全血全ＲＮＡの使用は感度および再現性を失うことなく全ゲノムの遺伝子発現プロファイリングのためのサンプルとして効率的に使用できる。
【０１０７】
全ての出版物、特許および特許出願は参照により本明細書に組み込まれる。上記した明細書において、本発明はその特定の好ましい実施形態に関連して記載されており、多くの詳細事項は説明を目的としているが、当業者の知るとおり本発明はさらに別の実施形態が可能であり、そして本明細書に記載した詳細の特定のものは本発明の基本原理から外れることなく大幅に変更できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、白血球対全血から得たｃＲＮＡ中の約６００塩基対の顕著なバンドを示すアガロースゲルの写真である。
【図２】図２は、選択されたｍＲＮＡ配列の逆転写酵素による転写を本発明の遺伝子特異的プライマーがブロックする機序を示す説明図である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる本表題の２００３年６月６日出願の米国仮出願６０／４７６，２３３、２００３年７月１日出願の米国仮出願６０／６２８，４８３、２００３年８月１日出願の米国仮出願６０／４９１，５２８、および、２００４年５月１１日出願の米国仮出願６０／５６９，６４６に関する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は遺伝子発現分析の分野、および、遺伝子発現を試験するために使用される増幅反応を進歩させる方法に関する。特に本発明は遺伝子発現分析を妨害するか、サンプルの相対的遺伝子発現プロファイルをスキューさせる転写物種の増幅または逆転写を抑制することによる定量的遺伝子発現分析を進歩させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
生命は実質的に情報に基づいており、その遺伝的内容が生物の生育および生殖を制御する。全ての生命系の重要な特徴であるポリペプチドのアミノ酸配列は細胞の遺伝子的物質によりコードされている。さらにまた、ポリヌクレオチドの配列もまた遺伝子発現の制御および調節に関与している。従って、この遺伝子的情報の性質を測定することは大きな科学的重要性を達成している。
【０００４】
遺伝子発現分析は研究者等に対し、どの遺伝子が特定の細胞または組織のサンプル中で「ターンオン」または「ターンオフ」されるかを知らせる。発現された遺伝子は細胞内のどのタンパク質がどの程度まで合成されるかを決定する１つの要素である。特定の発現パターンは細胞型、並びに、細胞内の生理学的条件、例えば疾患を決定する。遺伝子発現の変化を理解することは、どの遺伝子およびタンパク質が特定の疾患または生理学的状態において役割を果たしているかの証拠を研究者等に提供し、そして、遺伝子的異常、疾患の経路、疾患の作用機序および毒性機序に関する手がかりを提供できる。
【０００５】
遺伝子発現データを分析するためには全血が特に好都合なサンプルである。全血サンプルからの赤血球（ＲＢＣ）の除去、およびその後の精製および遺伝子発現に関する白血球（ＷＢＣ）の分析は、その調製が厄介で困難であるにも関わらず、最も有用なデータを提供している。実際、全血からのＷＢＣの単離を可能にするプロトコルは存在するが、これらは技術的専門知識および細胞を急速に単離するために必要な時間に起因する潜在的問題点を有し、これは殆どの増殖部分に対して理想的であるとはいえない。さらにまた、細胞を短期間で処理しない場合には、遺伝子の活性化の可能性が生じ、これはインビボ応答の正確なモニタリングを困難にする。これらの問題のため、全血からの包括的な遺伝子発現を可能にするプロトコルが有用となる。
【０００６】
一部の商業的手法は遺伝子発現データが改善されるように全血の安定化を行っている（Ｒａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｉｎ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８（１１）：１８８３−９０参照）。Ｒａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．によれば、全血中のｍＲＮＡの正確な定量はサンプルの取り扱いまたは制御できない凝血活性化により同時に起こる遺伝子転写物の分解と意図しない遺伝子誘導により困難となる。しかしながら本発明者等は、市販の遺伝子発現マイクロアレイ手法を用いて分析した場合に全血から直接単離されるＲＮＡのサンプル中において検出されない末梢白血球に検出可能な遺伝子があることを発見した。この理由により、全血単離および安定化プロトコル（即ちＴｒｉｚｏｌ，ＧＩＴＣ）の使用は全血に関わる遺伝子発現分析の問題点を解決しない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は細胞または組織のサンプル中の遺伝子発現を分析する進歩した方法を提供することにより全血遺伝子発現分析の既存の方法に関わる遺伝子発現分析の問題点を解決するものであり、ここでは、細胞または組織のサンプルの相対的遺伝子発現プロファイルを歪める転写物１つ以上またはその代表物は、逆転写反応の前、最中または後に除去されるか、または実質的に抑制または不活性化される。１つの実施形態において、特に、サンプル中の他の転写物種の遺伝子発現分析を妨害するサンプル中の赤血球ｍＲＮＡ転写物種１つ以上の増幅を抑制する方法が提供され、これは、（ａ）サンプルの赤血球核酸配列特異的干渉分子１つ以上を添加すること；および、（ｂ）赤血球核酸配列特異的干渉分子１つ以上の存在下にサンプル中の該転写物種を増幅することを含む。本発明はまた、細胞または組織のサンプルの相対的遺伝子発現プロファイルをスキューさせるｍＲＮＡ転写物種を識別する方法およびそのようなｍＲＮＡ転写物をターゲティングする干渉分子を含む組成物およびキットを提供する。
【０００８】
（定義）
本発明の方法の文脈においては、「増幅」という用語は何れかの知られた増幅の操作法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、線状増幅手法、インビトロ転写（ＩＶＴ）、即ち複数のｃＲＮＡ転写物を形成するためのｃＤＮＡによるもの等を含む物とする。本明細書において使用する増幅プロトコルは逆転写工程、例えばｍＲＮＡ分子をまず逆転写してｃＤＮＡ分子とし、次にｃＤＮＡを用いて複数コピーのｃＤＮＡまたはｃＲＮＡをＰＣＲによるか、インビトロ転写により作成する場合を含んでよいが、逆転写単独ではＲＮＡ物質種の増幅は行われないことを理解されたい。
【０００９】
「遺伝子発現分析」とはｍＲＮＡ転写物、即ち細胞または組織サンプルに由来するものの集団を作成して分析することによりどの遺伝子がサンプル中で発現されているかを調べることを包含する。典型的な遺伝子発現分析プロトコルはｍＲＮＡ転写物を逆転写してｃＤＮＡ分子とし（「ＲＴ」工程）、そして次にＴ７ＲＮＡポリメラーゼまたは他の適当なＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロの転写によりｃＤＮＡから複数の「ｃＲＮＡ」転写物を形成する（「ＩＶＴ」工程）ことを包含する。「定量的遺伝子発現分析」とは例えば反応に添加した既知量の内因性または外因性の制御配列を同時に増幅させてカリブレーション用の内標準を作成することにより、サンプル中の遺伝子発現の相対量を求める分析を包含する。
【００１０】
「遺伝子発現プロファイル」とは遺伝子発現分析の結果を与えるものであり、サンプル中に存在する転写物少なくとも１つについて遺伝子発現濃度のある尺度を示す。プロファイルはさらに遺伝子が分析すべきサンプル中に検出されるか、そして／または分析すべきサンプル中に検出されないような分析を包含する。遺伝子発現プロファイルを作成するためにいずれのプラットフォーム技術も使用してよいが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ ＵＳＡ）より入手可能なもののようなマイクロアレイプラットフォームが好ましい技術である。
【００１１】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘは存在および非存在のコールとして存在（即ち検出された）および非存在（即ち検出されない）遺伝子発現プロファイルを定義する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの「統計アルゴリズムレファレンスガイド」によれば、プローブセットにおける各プローブ対は測定された転写物が検出される（存在する）か検出されない（存在しない）かを決定する際の潜在的「投票」を有するものとみなされる。プローブ対はパーフェクトマッチ（ＰＭ）およびその相当するミスマッチ（ＭＭ）として設計された２つのプローブ細胞であるのに対し、プローブセットは特定の標的配列を検出するために設計された１１〜２０のプローブ対のコレクションである。判別スコアと称される数値が投票を記載する。判別スコアは各プローブ対について計算され、そして予め設定された閾値と比較される。閾値より高値のスコアを有するプローブ対が転写物の存在に投票するものである。閾値より低値のスコアを有するプローブ対は転写物の非存在に投票するものである。投票結果はｐ値として総括される。判別スコアが閾値より高値であるほど、ｐ値は低値となり、転写物が存在する確立がより高くなる。判別スコアが低値となるほど逆もまた真となる。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＭＡＳ５．０ソフトウエアと共に使用することにより存在および非存在のコールを決定する。
【００１２】
市販の核酸アレイ、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイは種々の既知位置における個体支持体表面上にカップリングされている種々のオリゴヌクレオチドプローブの秩序アレイへの増幅ｃＲＮＡ転写物またはｃＤＮＡのハイブリダイゼーションを介した集団内の検出可能な遺伝子の比率および実体を調べるために一般的に使用されている。ｃＲＮＡはｃＤＮＡ鋳型から転写されたアンチセンスＲＮＡである。転写物は典型的にはアレイ上での検出を容易にするために増幅の最中に標識される。このようなアレイは一般的には当該分野で報告されており、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，１４３，８５４、ＷＯ９０／１５０７０およびＷＯ９２／１１０９２に記載されている。ハイブリダイゼーションおよびアレイのスキャニングの後、ハイブリダイゼーションデータを分析することにより、標識された転写物がハイブリダイズしたプローブから決定されるものとして、転写物のうちのどれがサンプル中に存在するかを識別する。さらにまた、各存在遺伝子の蛍光水準を識別し、それらの水準を用いて遺伝子発現の匹敵する定量的水準を得ることができる。この操作法の変法は複数の固体表面に結合した（即ちＬｕｍｉｎｅｘ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ｂＤＮＡ）、または溶液中に懸濁した（Ａｃｌａｒａ）プローブの使用である。
【００１３】
パーフェクトマッチ（ＰＭ）およびミスマッチ（ＭＭ）のプローブセットの数値は遺伝子発現データの正確さを決定するために使用できる尺度である。ミスマッチの対照プローブは中央位置の一塩基相違を除いてそのパーフェクトマッチのパートナーと同一である。ＭＭプローブはバックグラウンドと交差ハイブリダイゼーションのシグナルの両方の直接の差し引きを可能とし、そして「真の」シグナルと非特異的または半特異的ハイブリダイゼーションに由来するものとの間の判別を可能とする、特異性対照として機能する。意図するＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションによりＭＭプローブよりも多いＰＭプローブに関するシグナルが生成し、偶然により起こるとは極めて考えにくい一貫したパターンが得られる。低濃度ＲＮＡの存在下であっても、ＰＭ／ＭＭプローブ対のハイブリダイゼーションは認識可能で定量的な蛍光パターンを与える。これらのパターンの強度は複合サンプル中のＲＮＡ分子の濃度に直接関係する。即ち、ＰＭ／ＭＭプローブセットにより、意図するＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションによりシグナルが生成するかどうか、調べることができるようになる。ＭＭプローブからのシグナルがＰＭプローブからのものより高値であれば、非特異的または交差ハイブリダイゼーションが起こっている。ＰＭシグナルより高値のＭＭシグナルを示したプローブ対が多数であるサンプルは通常は質の悪いサンプルの調製またはハイブリダイゼーションの結果であり、質の悪い発現データを有する。
【００１４】
本発明による所望または要望とは異なる転写物はその存在が試験すべき細胞または組織のサンプルの相対的遺伝子発現プロファイルを「スキューさせる」ものである。転写物は、転写物が欠失するかその増幅が抑制される場合と比較して増幅されたサンプル中に転写物が含有される場合に、検出可能な他の転写物種の低減があれば相対的遺伝子発現プロファイルを「スキューさせる」。転写物はまた、その存在が、サンプルのアレイ分析が質の悪い発現データをもたらすように有意に低減したＰＭ／ＭＭ比をもたらす場合に、相対的遺伝子発現プロファイルをスキューさせる。アレイ上において、相対的遺伝子発現プロファイルをスキューさせる遺伝子に対するシグナル強度は、発現されない遺伝子に対する約２０のシグナル強度（即ちバックグラウンド）または発現の有意な水準を示す遺伝子に対する約１００のシグナルと比較して、数万の桁となる。さらに比較するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）における対照遺伝子であるβアクチンおよびＧＡＤＰＨに対するシグナルは５０００の範囲にあり、そして高度に発現されるとみなされる。
【００１５】
「干渉分子」とは、本明細書においては、増幅集団における１つ以上の所望または要望とは異なる転写物種の最終的存在を、何れかの特徴において、干渉するか、または、ユーザーが干渉できるようにしたものである。従って、本発明において使用する場合の増幅の「抑制」とは、検出可能な転写物の集団からの望ましくない転写物の欠失または低減をもたらすような何れかの手段を指す。このような抑制は、例えば、転写物の逆転写または相当するｃＤＮＡのＩＶＴまたはＰＣＲを干渉することによるか、または、例えば磁気ビーズを用いてアレイハイブリダイゼーション分析の前に相当するｃＲＮＡ物質種の除去または脱離または分解を促進することにより、増幅操作法の何れかの段階において起こってよい。干渉分子はＲＮＡまたはＤＮＡ、または、ＲＮＡまたはＤＮＡの修飾された物質種であってよい。このような抑制は「進歩した」遺伝子発現プロファイル、即ち、得られる検出可能な転写物の数が、所望でない転写物の増殖、そして特に逆転写が抑制されない場合に得られる検出可能な転写物の数よりも高値である状態を達成するために使用してよい。
【００１６】
本発明の「干渉分子」とは、ターゲティングされる所望または要望とは異なる転写物種に対して「特異的」である。この点に関し、「特異的」とは、分子が、特異性をもって、所望でない標的転写物種またはその相補体、例えばそれに相当するｃＤＮＡ鎖と結合または相互作用することができることを意味する。「特異性をもって」結合または相互作用するとは、干渉分子がターゲティングされた転写物種またはその相補体とは結合または相互作用するが、他の転写物種とは実質的にそうならないことを意味する。従って、アンチセンス干渉分子については、そのような分子は一般的に結合特異性を得るためには、ターゲティングされた転写物種の相補鎖に対し配列において少なくとも約９０％同一である。しかしながら、ワトソンクリック塩基対形成が中断される位置は、ハイブリダイゼーション条件と同様に非常に重要であることに留意しなければならない。中断された塩基対形成の位置は二重らせんの脱安定化の程度を決定する際に重要である。二重らせんの末端における不正確な塩基対形成は二重らせんの中央における不正確な塩基対形成よりも脱安定化度が低い。
【００１７】
本発明によれば「逆転写酵素」とはインビトロの逆転写反応において使用してよい当該分野で知られた何れかの逆転写酵素、例えばＡＭＶ、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ、ＦＩＶ、テロメラーゼおよびｒＴｔｈである。ＡＭＶおよびＭＭＬＶはＲＮａｓｅＨ陰性または陽性であることができる。テロメラーゼはＣｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ａｎｄ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ−−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ Ａｃｔｉｎｇ ｉｎ ａ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ），６２，１２０２−１２０５により、逆転写酵素として記載されている。本発明の「ＲＮＡポリメラーゼ」はインビトロの転写反応を促進するために使用してよい当該分野で知られた何れかのＲＮＡポリメラーゼ酵素、例えばＴ７、Ｔ３、ＳＰ６または修飾された型（即ちプロセシング性を高めたもの）およびＲＮＡｐｏｌＩＩである。当該分野で知られており所望の増幅反応を実施するために有用である何れかの他の酵素も使用してよく、例えば熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ酵素等が挙げられる。
【００１８】
本発明によれば「全血」サンプルとは、多くの血球型、例えば赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、血小板等を含んでよい。血液マイクロリットル中合計数千となるＷＢＣの５種の型、すなわち顆粒球（多い順に好中球、好酸球および好塩基球）および単核細胞（リンパ球および単球）が存在する。約５００万のＲＢＣおよび３００，０００の血小板が血液ミリリットル当たり存在する。ＲＢＣ集団内において、約１％が活動的にｍＲＮＡを生成する網状赤血球である。網状赤血球はその核を放出している未成熟の赤血球である。網状赤血球は大量のＲＮＡおよびリボソームを含有しており、これらは網状赤血球が成熟して赤血球となるために必要な２日間に亘り徐々に消失する。網状赤血球はＲＮＡを使用してヘモグロビンを生産し、その合成はＲＮＡが枯渇すれば停止する。即ち網状赤血球により生産されたヘモグロビンは成熟赤血球内に存在するヘモグロビンである。網状赤血球は骨内で１日経過し、血液内で１日経過する。血中にある間は、網状赤血球は特殊な超生体染色法を用いて成熟赤血球から区別できるのみである。赤血球は網内皮細胞系により破壊されるまで約１２０日間血流中を循環する成熟した赤血球である。
【００１９】
本発明の方法は、ＲＮＡ分析よりも前にＲＢＣを除去することが困難であり、そして、そのような細胞の除去により生物学的に関連性のあるデータの一部が除去されるような全血全ＲＮＡ分析に特に有用である。しかしながら、方法はまた赤血球を含有する何れかの組織、例えば脾臓、骨髄、胎盤、血管化腫瘍、血管様腫瘍、脂肪、肺、筋肉、膵臓、心臓、脳、肝臓および出血性組織からなる群より選択された組織の遺伝子発現分析において使用することもできる。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は細胞または組織のサンプルの遺伝子発現プロファイルをスキューさせることが解っている所望ではない遺伝子転写物１つ以上を含有する細胞または組織のサンプルの遺伝子発現分析を向上させる方法に関する。さらにまた、このような方法は所定のサンプルの集団におけるこのような要望とは異なる転写物を識別することを包含する。特に、本発明者等はこのようなサンプルから、特にＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ、ＣｏｄｅＬｉｎｋＴＭ等のようなマイクロアレイプラットフォーム上で実施されるプロファイル分析で得られた相対的遺伝子発現プロファイルをスキューさせる全血および赤血球含有組織中の転写物を識別した。
【００２１】
例えば、本発明者等は、本発明の進歩なくしては、全血サンプルからの全ＲＮＡ単離の間に同時精製されている末梢血中の赤血球ＲＮＡ、例えばグロビンＲＮＡがＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ上にロードされるべきｃＲＮＡの正確な測定に干渉し、そして交差ハイブリダイゼーションを増大させることを発見した。この干渉によりより低値の全般的な存在コールおよびより少数の検出可能な遺伝子となり、その結果、全血サンプルからの遺伝子発現の数値が不正確に測定されてしまう。
【００２２】
説明すれば、赤血球（ＲＢＣ）を除去するために処理されている血液サンプルは典型的には約４０％の存在コール（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＨｕＵ１３３ＡＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ上で〜２２，０００遺伝子中〜９，０００）を示す。一方、全血から処理されたサンプルは存在コールされた遺伝子の総数は低下する（〜２２，０００遺伝子中〜５，０００、即ち〜２４％）。２つの調製物の間で、全血のＷＢＣに対する検出可能な遺伝子の重複は〜９０％である。即ち、検出された発現遺伝子はより少数である（各既知細胞型から比例的に少数となる代表）が、全血のデータは生物学的に該当している（ＲＮＡ単離の前のＲＢＣの除去は理想的な解決法ではないことを意味する）。さらにまた、検出可能な遺伝子の数の減少に加えて、ミスマッチからのシグナルがパーフェクトマッチからのものより高値となるプローブ対の数が増大する（即ちＭＭ／ＰＭ比の上昇）。ミスマッチのパーフェクトマッチプローブ対に対する比は品質管理の尺度であるため、マイクロアレイチップはＱＣ不合格となる。
【００２３】
本発明者等はまた全血全ＲＮＡ調製物中の網状赤血球ＲＮＡの質量が目視可能な優勢のＲＮＡ物質種または物質種群をｍＲＮＡ調製物および結果として生じるＩＶＴｃＲＮＡサンプルの両方にもたらすことも観察している。この物質種または転写物群はｍＲＮＡサンプルおよびｃＲＮＡ調製物をアガロースゲルにおいて観察した場合に約６００塩基対の優勢なバンドとして目視可能である。本発明者等は以外にもこの優勢なバンドが赤血球ｍＲＮＡからのヘモグロビン転写物を含有していること、および、グロビンＲＮＡの増幅を逆転写中にブロックすれば一般的な検出可能な遺伝子の数および遺伝子発現の数値の同時上昇が達成できることを発見した。
【００２４】
即ち、本発明は集団内の他の転写物と共に同時増幅した場合に相対的遺伝子発現プロファイルをスキューさせる細胞または組織のサンプル中の要望とは異なる転写物を識別する方法を包含する。本発明はまた、増幅または逆転写反応の前または最中に相対的遺伝子発現プロファイルをスキューさせる転写物１つ以上を除去することによる、サンプル中のこのような要望とは異なる転写物種１つ以上の増幅を抑制する方法を包含する。本発明はさらに、要望とは異なる転写物種１つ以上を含有するサンプルの遺伝子発現分析を進歩または増強する方法を包含し、ここでその進歩は、要望とは異なる転写物種を除去するか増幅を抑制し、そしてこれにより要望とは異なる転写物種の存在下で得られるものよりも検出可能な遺伝子の数を増大させることを包含する。
【００２５】
本発明の方法を用いてこのような所望ではない転写物１つ以上を含有する何れかのサンプルの遺伝子発現分析を改善してよいが、方法は特に、全血および赤血球含有組織から所望ではない転写物を除去するか、その作用を除去するために有用である。さらに、方法は、集団の中の個々の核酸の１つ以上がこのような転写物の増幅により集団の残余の分析が妨害される程度にまで存在している場合に、核酸の混合サンプルの増幅反応の何れかの型に適用できる。
【００２６】
本発明の方法が全血または赤血球含有組織の分析のために使用される場合、抑制方法は（ａ）サンプルに赤血球核酸配列特異的干渉分子１つ以上を添加すること；および（ｂ）該赤血球配列特異的干渉分子１つ以上の存在下にサンプル中の転写物種を増幅することを含む。特に本発明は核酸の増殖過程の最中にＲＮＡを含有するサンプル中の赤血球特異的遺伝子、例えばグロビンｍＲＮＡ分子１つ以上の増幅を抑制するための方法を包含し、これは、（ａ）サンプルにグロビン核酸配列特異的干渉分子１つ以上を添加すること；および（ｂ）該グロビン核酸配列特異的干渉分子１つ以上の存在下にサンプル中の該ＲＮＡを増幅することを含む。
【００２７】
同時に１つより多い遺伝子を測定する遺伝子発現分析の何れかの型が本発明の方法、特に「定量的」分析、例えば対照配列の既知量を同時に増幅してカリブレーション用の内標準を得るような方法から利益を被る。遺伝子発現分析は種々の増幅反応を用いながら、例えばｃＤＮＡへのサンプル中のｍＲＮＡの逆転写、そしてさらに場合によりＲＮＡポリメラーゼを用いて各ｃＤＮＡ分子からｃＲＮＡ転写物を合成することにより行ってよい。或いは、遺伝子発現分析は、例えばＰＣＲまたは他の知られた増幅反応の場合のようにＤＮＡポリメラーゼを用いてさらにｃＤＮＡ分子を合成する工程を含んでよい。
【００２８】
マイクロアレイ手法を用いて遺伝子発現をモニタリングする場合、ｍＲＮＡ分子はｃＤＮＡ分子とするための逆転写酵素の使用を介してｃＤＮＡに変換され、そして次にポリメラーゼの使用を介して２本鎖ｃＤＮＡ分子とされる場合が多い。次にｃＤＮＡ分子を用いながら種々のＲＮＡポリメラーゼの活性により複数のアンチセンスまたはｃＤＮＡのｃＲＮＡコピーを作成する。この最終増幅過程の間、修飾されたヌクレオチドが反応混合物中に、そして故にｃＲＮＡ分子中に取り込まれる。次にこれらの修飾されたヌクレオチドを用いてシグナルを含有するかシグナルを発生できる他の分子との相互作用を介して検出可能なシグナルを生成する。次に標識されたｃＲＮＡをアレイ上のプローブと反応させ、ここでｃＲＮＡはアレイ上の遺伝子特異的プローブにハイブリダイズする。
【００２９】
このような増幅反応において、増幅の抑制は増幅過程の何れかの工程において、例えばｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写の工程において、または、ＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ用いたｃＤＮＡからのｃＲＮＡまたはｃＤＮＡの合成の工程において行ってよい。増幅の抑制はまた、例えば後に詳述する切断または分解によるか、または相補オリゴヌクレオチドに結合した磁気粒子を使用することにより、分析の前に、元の所望でない赤血球ｍＲＮＡ物質種または結果として生じるｃＲＮＡ物質種を欠失させることにより行ってもよい。即ち、上記において定義した通り、「干渉分子」とは本明細書においては、逆転写酵素またはポリメラーゼ反応に干渉するのみである分子ではなく、サンプル中の標的赤血球転写物種１つ以上の最終的な存在に何れかの特徴において干渉するものである。
【００３０】
増幅過程において酵素的反応に干渉するためには、アンチセンス機序をブロックすること（種々のポリメラーゼ酵素によるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの酵素的プロセシングに対する物理的バリア）によるか、または、三重鎖（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対保有）機序により機能できる核酸分子の多数を設計することが可能である。さらに、交差結合官能基を有する配列特異的オリゴヌクレオチド（ソラレン等）を使用してｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子の酵素的読み取りを抑制することも可能である。
【００３１】
さらにまた、ターゲティングされた赤血球ｍＲＮＡのＲＮａｓｅＨ媒介の切断を誘発するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するか、所望ではない標的ｍＲＮＡの分解を媒介できる触媒性の官能基（ＥＤＴＡ等）を使用するアンチセンスオリゴマーを介するかして、全ＲＮＡプールまたは結果として得られるｃＲＮＡにおける所望ではないｍＲＮＡを特異的に分解することが可能である。
【００３２】
即ち、転写酵素またはポリメラーゼの反応に干渉するためには、未修飾のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用できる。このようなオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅＨの活性を支援するが、ＲＮａｓｅＨがヘテロ二重らせんのＲＮＡ成分を切断できるようにする十分な一過性のハイブリダイゼーションイベントが潜在的に起こりえることから、ターゲティングされていないｍＲＮＡの分解が増大するようにオペレーターには観察される。或いは、未修飾のアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドはブロッキング分子として使用してよいが、後に詳述する通り、抑制すべき増幅工程に応じて５’または３’末端にブロッキング修飾を付加することは、アンチセンスオリゴヌクレオチドからの伸長を防止するためには好都合である。
【００３３】
さらにまた、非標的のＲＮＡ物質種にハイブリダイズした場合にＲＮａｓｅＨの活性を支援する能力が最小限にされるように、ＲＮａｓｅＨ活性を支援しない修飾よりなる部分を有するキメラオリゴヌクレオチドを使用することも可能である。即ち非標的のｍＲＮＡがＲＮａｓｅＨにより意図と反して切断される可能性が低減され、ｍＲＮＡプールの全体的統合性が維持される。これはＲＮａｓｅＨ活性を支援できる配列の数を最小限にするはずであり、それゆえ、ｍＲＮＡの全体的統合性は未修飾ＤＮＡオリゴマーを使用した場合よりも高品質となるのである。適当な修飾は例えば糖修飾（２’Ｏ−アルキル修飾、例えば２’Ｏ−メチル、２’Ｏ−ブチルおよび２’Ｏ−プロピル；２’−Ｏ−ハロゲン化物修飾、例えば２’Ｏ−Ｆおよび２’Ｏ−Ｂｒ；および２’Ｏ−メトキシエトキシ）、炭素環（非酸素）糖模倣物、骨格に対する２環式糖（１’と３’位の間、または１’と４’位の間のアルキル架橋等）修飾（ＰＮＡ、２’−５’連結オリゴマー、α連結オリゴマー、ボラノ−ホスフェート修飾オリゴマー、キメラオリゴマー、例えばアニオン系、カチオン系および中性の骨格構造等）またはホスホジエステル骨格に対する修飾（ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート等）を包含する。
【００３４】
さらにまた、ＲＮａｓｅＨ活性を必ずしも支援しないがポリメラーゼおよび転写酵素がオリゴマーを転写または逆転写（「リードスルー」）することが不可能となるほど十分な強度で結合することにより核酸の倍加に対して物理的ブロックとして機能できるような修飾オリゴヌクレオチドを使用することが可能である。逆転写酵素、ポリメラーゼおよび他のタンパク質は核酸中の二次構造（二重らせん構造）を通過して「溶融」する能力を有し、従ってブロッキングオリゴマーを「リードスルー」し、そして鋳型核酸に対して逆相補の核酸の作成を完了することができる場合がある。ターゲティングされたｍＲＮＡへのオリゴマーの結合親和性を増大させる修飾を用いることにより、鋳型核酸をコピーしているポリメラーゼおよび転写酵素を抑制し、オリゴマーおよび標的ｍＲＮＡにより形成される二重らせん構造を「リードスルー」する酵素の能力を低減することにより正しい複製を防止することが可能である。修飾は例えば２’Ｏ−アルキル、２’Ｏ−Ｆ、ＰＮＡおよび５メチルＣ置換を包含する。
【００３５】
さらにまた、酵素的方法によりＲＮＡを切断して正しいコピー作成を防止する機能的ＲＮａｓｅＨ部分を自らに結合させたアンチセンスオリゴマーを使用することも可能である。この場合、ＲＮａｓｅＨ部分はヘテロ二重らせん上に折り戻され、ＲＮＡ成分を切断する。この方法はまたオリゴヌクレオチド上にＲＮａｓｅＨの活性をロックダウンすることにより、非標的ＲＮＡの擬似的切断の可能性が低減されるという点において好都合であるが、その理由は、ハイブリッドはＲＮａｓｅＨとオリゴマーの間のリンカーの長さにより決定される特定の距離で切断する能力に限定されているためである。触媒性のリボザイムもまたｍＲＮＡまたはｃＲＮＡをターゲティングするために使用でき、そして、リボザイムの活性のための配列の条件が標的ＲＮＡ内に存在する限り、切断することができる。
【００３６】
さらにまた、酵素的方法により活性化後にＲＮＡを切断して正しいコピー作成を防止するような機能的部分を連結して保有しているアンチセンスオリゴマーを使用することも可能である。このような機能的部分を活性化してＲＮＡ成分と化学結合を形成する。使用できる特定の化学物質は例えばアルドール化剤、アルキル化剤、ソラレンまたはＥＤＴＡである。活性化剤には紫外線、第二鉄／第一鉄のイオン性化合物等が包含される。リンカーによりオリゴヌクレオチドに機能性部分を結合することにより、非標的ＲＮＡへの擬似的化学結合の可能性が低減されるが、その理由は、部分が標的ＲＮＡに空間的に接近するように部分に最も近い末端においてヘテロ二重らせんを形成するように活性が限定されているためである。標的ｍＲＮＡを「攻撃する」その部分の能力はこの接近に依存している。
【００３７】
増幅を抑制するための非アンチセンス手法もまた本発明の方法に包含される。例えば、ポリメラーゼおよび逆転写酵素に対する物理的ブロックとして機能するＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対形成を介してｍＲＮＡ中のプリンまたはピリミジンのストレッチの領域において３重鎖オリゴマーを形成してよい。３重鎖は三重らせんの形成を可能にする成分配列である２つの個別のオリゴマーにより媒介されてよい。さらに、三重らせんの形成を支援する、環状の核酸、または、環状または幹状に相互に対向して位置した必要な２配列を自らの配列内部に保有しているダンベルまたは幹状ループの構造を使用することも可能である。このような構造については、非三重らせん形成配列のループの大きさはそのような構造が形成されるために十分な長さであるが、２つの三重らせん形成配列がｍＲＮＡ配列と会合するほど接近することが無いように長すぎてはならない。
【００３８】
本発明の一部の実施形態においては、遺伝子特異的プライマーを設計し、増幅過程において酵素的反応に干渉するために使用する。例えば、複製を抑制すべきｍＲＮＡ、例えばヒトまたは他の哺乳類のグロビンｍＲＮＡに結合する選択された遺伝子特異的プライマーを使用することにより、ｃＤＮＡ合成の間にｍＲＮＡ分子の酵素的読み取りを抑制することが可能である。遺伝子特異的プライマーは転写開始プライマー（典型的にはポリ−ｄＴＴ７またはＴ３プロモーター含有プライマー）の下流に結合する。逆転写酵素の存在下においては、遺伝子特異的プライマーは転写開始プライマーと同様に３’方向に伸長されるが、このプライマーからの転写はこのｃＤＮＡが遺伝子特異的プライマーにより形成されたブロックに接近すれば停止する。ブロックは逆転写酵素のトランスロケーションを抑制する働きを有する。即ち、プロモーター領域を含有するｃＤＮＡは生成せず、これによりＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼがサンプルに添加された場合に選択された遺伝子に相当するｃＤＮＡまたはｃＲＮＡの複製が防止される。図２はどのようにして逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成が本発明の遺伝子特異的プライマーにより抑制されるかを示している。
【００３９】
本発明の一部の実施形態においては、遺伝子特異的プライマーは、プライマーの結合親和性が増大し、その後の反応における解離または「メルティングオフ」が防止されるように、その５’末端において相対的により多数のＧおよびＣ残基を含有するように設計される。本発明はまた逆転写酵素による鎖伸長をプライマーが支援する限り、キメラ遺伝子特異的プライマーの使用も意図している。遺伝子特異的プライマーからの伸長が長いほど、得られるヘテロ二重らせんはより安定となり、これによりさらに、オリゴｄＴプライマーからｃＤＮＡを伸長させる逆転写酵素の能力が弱められる。
【００４０】
本発明の方法はプライマーとして機能できないオリゴマー、例えば３−ＯＨ位においてホスフェートまたは他のブロッキング基により、または、リボースＯ−メチル基のような置換基、または、修飾されたホスフェート骨格により、上記した通りブロックされたものの使用とは対照的である。
【００４１】
本発明は、本発明者等が知る限り、本明細書に記載したパラメーターに従って、その存在がサンプルの相対的遺伝子発現をスキューさせる転写物を識別する最初のものである。従って、本発明は本明細書において識別される転写物をターゲティングする干渉分子を含有するキットおよび組成物も包含する。要望とは異なる転写物を発見する方法は例えばアガロースまたはアクリルアミドゲル上で観察されるとおり、ＲＮＡサンプルにおける優勢な転写物の配列を識別すること、または、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）または他の遺伝子発現アレイ上で分析した場合に数万のシグナル強度を有する増幅集団中の物質種を識別することを包含する。このような要望とは異なる転写物を識別する別の方法は分析すべき細胞または組織のサンプルに応じて当業者が容易に知りえるものである。
【００４２】
（例示される標的遺伝子および干渉分子）
本発明の方法は植物、脊椎動物または無脊椎動物、カビ、細菌等の何れかの種からの遺伝子発現の分析を進歩させるために使用してよい。例えば本発明の方法はヒト、ラット、ネズミ、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジおよびニワトリを包含する動物種における遺伝子発現の分析を進歩させるために使用してよい。種々の種におけるグロビン遺伝子の配列は知られており、本発明に従って干渉分子を設計するために使用してよい。グロビン干渉分子はＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。例えばヒト、ラットおよびイヌのグロビンｍＲＮＡの増幅を抑制するための適当なＲＮＡ干渉分子は以下のような配列を含有するか含んでいてよい（相当するＤＮＡ干渉分子については「Ｕ」は「Ｔ」となり、その配列は５’から３’の順に示されることに留意）。
【００４３】
【化１】
【００４４】
【化２】
【００４５】
【化３】
他の適当な配列は明細書全体を通して開示しており、例えば実施例のセクションに示すとおりである。
【００４６】
α（ＨＢＡ１、ＨＢＡ２）、β（ＨＢＢ）、γ（ＨＢＧ１、ＨＢＧ２）、δ（ＨＢＤ）、イプシロン（ＨＢＥ１）、θ（ＨＢＱ１）およびζ（ＨＢＺ）グロビン配列およびその変異体を含む赤血球含有組織の遺伝子発現分析の間にグロビンＲＮＡ配列の増殖を抑制するために特に好都合であるが、遺伝子発現分析を妨害する他の赤血球ＲＮＡ転写物種もまた単独またはグロビン転写物種の何れか、例えば、リボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３Ｌ）、Ｌ６（ＲＰＬ６）、Ｌ７（ＲＰＬ７）、Ｌ７ａ（ＲＰＬ７Ａ）、Ｌ９（ＲＰＬ９）、Ｌ１０ａ（ＲＰＬ１０Ａ）、Ｌ１１（ＲＰＬ１１）、Ｌ１２（ＲＰＬ１２）、Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、Ｌ１７（ＲＰＬ１７）、Ｌ１８（ＲＰＬ１８）、Ｌ１９（ＲＰＬ１９）、Ｌ２１、Ｌ２３ａ（ＲＰＬ２３Ａ）、Ｌ２４（ＲＰＬ２４）、Ｌ２７（ＲＰＬ２７）、Ｌ２７ａ（ＲＰＬ２７Ａ）、Ｌ２８（ＲＰＬ２８）、Ｌ３０（ＲＰＬ３０）、Ｌ３１（ＲＰＬ３１）、Ｌ３２（ＲＰＬ３２）、Ｌ３４（ＲＰＬ３４）、Ｌ３５（ＲＰＬ３５）、Ｌ３７（ＲＰＬ３７）、Ｌ３７ａ（ＲＰＬ３７Ａ）、Ｌ４１（ＲＰＬ４１）、Ｓ２（ＲＰＳ２）、Ｓ３ａ（ＲＰＳ３Ａ）、Ｓ５（ＲＰＳ５）、Ｓ６（ＲＰＳ６）、Ｓ７（ＲＰＳ７）、Ｓ１０（ＲＰＳ１０）、Ｓ１１（ＲＰＳ１１）、Ｓ１３（ＲＰＳ１３）、Ｓ１６（ＲＰＳ１６）、Ｓ１７（ＲＰＳ１７）、Ｓ１８（ＲＰＳ１８）、Ｓ２３（ＲＰＳ２３）、Ｓ２４（ＲＰＳ２４）、Ｓ２７ａ（ＲＰＳ２７Ａ）、Ｓ３１（ＲＰＳ３１）、ＳＭ、大型リボソームタンパク質ＰＯ（ＲＰＬＰＯ）、フラビン還元酵素（ＢＬＶＲＢ）、フェロケラターゼ（ＦＥＣＨ）、ミオシン軽タンパク質（ＭＹＬ４）、シヌクレイック（ｓｙｎｕｃｌｅｉｃ）α（ＳＮＣＡ）、δーアミノレブリン酸シンテターゼ２（ＡＬＳＡ２）、セレン結合タンパク質１（ＳＥＬＥＮＢＰ１）、赤血球膜タンパク質バンド４．２（ＥＰＢ４２）および赤血球膜タンパク質バンド４．９（ＥＰＢ４９）、グリコホリンＣ（ＧＹＰＣ）、抗酸化剤タンパク質２（ＡＯＰ２）、βアクチン（ＡＣＴＢ）、γアクチン１（ＡＣＴＧ１）、ビメンチン（ＶＩＭ）、脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）、真核細胞翻訳伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ｅ１）、翻訳制御１腫瘍タンパク質（ＴＰＴ１）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、フェリチン軽ポリペプチド（ＦＴＬ）、白血球レセプタークラスター（ＬＲＣ）メンバー７（ＬＥＮＧ７）、β−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、複製因子Ｃ（アクチベーター１）（ＲＦＣ１）、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ａ１（ＨＮＲＰＲ１）、フィンケル−ビスキス−ライリーネズミ肉腫ウィルス（ＦＢＲ−ＭｕＳＶ）遍在的発現物（キツネ由来）（ＦＡＵ）、ｒａｓ相同体遺伝子ファミリーメンバーＡ（ＡＲＨＡ）、コフィリン１（非筋肉）（ＣＦＬ１）、オルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素１（ＯＡＺ１）、ミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１（ＭＧＳＴ１）、早期増殖応答１（ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １）（ＥＧＲ１）、ミクソロームグルタチオンＳトランスフェラーゼ１（ＭＧＳＴ１）、ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）（ＰＰＩＡ）、癌胎児抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）、ガラクトシド結合レクチン４（ＬＧＡＬＳ４）、肝脂肪酸結合タンパク質１（ＦＡＢＰ１）、コートマータンパク質複合体サブユニットγ（イムノグロブリンλ連結３）（ＣＯＰＧ，ＩＧＬＪ３）、主要組織適合性複合体クラス１Ｂ（ＨＬＡ−Ｂ）、主要組織適合性複合体クラス１Ｃ（ＨＬＡ−Ｃ）、免疫グロブリン重μ定常物（ＩＧＨＭ）、免疫グロブリンκ定常物（ＩＧＫＣ）、溶質キャリアファミリー２５メンバー３（ＳＬＣ２５Ａ３）、Ｈ３ヒストンファミリー３Ａ（ＨＳＦＡ）、食道特異的正常粘膜１（ＮＭＥＳ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質８（ＨＳＰＡ８）、仮想タンパク質ＭＧＣ１４６９７（ＭＧＣ１４６９７）、重合体免疫グロブリンレセプター（ＰＩＧＲ）およびＦＫ５０６結合タンパク質８（ＦＫＢＰ８）、仮想タンパク質ＢＣ０１２７７５（ＬＯＣ９１３００）、寒冷ショックドメインタンパク質Ａ（ＣＳＤＡ）、Ｆボックス唯一タンパク質７（Ｆ−ｂｏｘ ｏｎｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＦＢＯＸ０７）、ＣＧＩ−４５タンパク質（ＣＧＩ−４５）、マコリンリングフィンガータンパク質１（ｍａｋｏｒｉｎ ｒｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １）（ＭＫＲＮ１）、小型ＥＤＲＫリッチ因子２（ＳＥＲＦ２）、ピニン（ｐｉｎｉｎ）（ＰＮＮ）、ＳＥＴドメイン分岐１抗酸化剤タンパク質２（ＡＯＰ２、ＳＥＴＤＢ１）、ヌクレアーゼ感受性エレメント結合タンパク質（ＮＳＥＰ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）およびユビキチンＢ（ＵＢＢ）に対する転写物と組み合わせてターゲティングしてよい。ＦＫ５０６結合タンパク質８およびセレン結合タンパク質１を抑制するための適当な干渉分子は以下の通りである。
【００４７】
【化４】
（用途）
本発明の方法は核酸物質種１つ以上が混合集団の増幅反応の分析をスキューまたは妨害するような何れかの用途において使用してよい。例えば、上記した通り、本発明の方法はＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）または他のアレイを用いた定量的遺伝子発現分析を行う際に使用してよい。本発明の方法は疾患マーカーの存在について、または、特定の疾患への罹患しやすさについて、ヒトをスクリーニングする際に使用してよい。本発明の方法はまた例えば遺伝子発現プロファイルに関する潜在的毒性化合物の作用を分析するためのＧｅｎｅＬｏｇｉｃのＴｏｘＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）システムにおいて動物の血液または組織のサンプルを分析する際にも使用してよい。その全体が参照により本明細書に組み込まれる出願番号０９／９１７，８００、１０／０６０，０８７、１０／１９１，８０３、１０／３３８，０４４、１０／３５７，５０７および６０／３９５，３５５を参照できる。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は本発明を説明および例証するために示すものである。それら自体は本発明の範囲を限定するものではない。当業者の知るとおり、多くの他の実施形態も上記および請求項に記載するとおり本発明の範囲に包含される。
【００４９】
（実施例１ 全血中の優勢な転写物種としてのグロビンｍＲＮＡ分子の識別）
遺伝子発現分析のための全血サンプル（ヒト、ラット、マウス等）の処理において、本発明者等は特定の過剰発現される遺伝子についてサンプル中に発現される他の遺伝子をモニタリングする能力を妨害する可能性があることを観察した。例えば、全血から全ＲＮＡを調製する場合、極めて高い濃度で過剰発現される独特のｍＲＮＡ少なくとも１つが生じると考えられる。遺伝子発現の典型的な分析においては、全ＲＮＡは、全ＲＮＡサンプル中の元のｍＲＮＡの各々に対して生じるｃＲＮＡの量を決定するために測定することができるシグナルの発生を可能にする修飾されたヌクレオチドを自らに取り込んでいるアンチセンスＲＮＡまたはｃＲＮＡを生成する一連の反応を介して増幅される。全血から単離した全ＲＮＡのこのような増幅を実施する場合、長さ約６００ヌクレオチドのサイズを示すｃＲＮＡプール中に存在する大量のｃＲＮＡが存在する（図１参照）。
【００５０】
末梢白血球が除去されている全血調製物と比較した場合の全血調製物の実験的分析ではこの過剰発現されたｃＲＮＡがなお存在することが示される。単離された末梢白血球に由来するｃＲＮＡを調べる場合、この過剰発現ｃＲＮＡのバンドは存在しない（図１参照）。従って、過剰発現されたｃＲＮＡのバンドは赤血球または何らかの他の非白血球の成分（例えば血小板）から誘導されたものである。
【００５１】
データをさらに分析したところ、全血球調製物中でより高い発現濃度を示すグロビン遺伝子（α、βおよびγ）に相当するプローブの独特のセットがあることがわかった。全血中において、これらのグロビン遺伝子は赤血球内で高濃度に発現され、γは胎児または新生児に検出されるが、加齢と共に減少し、αおよびβ型は誕生後により高い濃度で発現される。グロビン遺伝子の長さはαが〜５６７ヌクレオチド、βが〜６２６ヌクレオチド、そしてγが〜５７４ヌクレオチド長であることが知られている。従って、ｃＲＮＡにおいては、約６００ヌクレオチド長の増幅バンドの存在はこのバンドがこれらのグロビン遺伝子の１つ以上から誘導される場合があることを示している（電気泳動ゲルの分解能は長さの相違が十分大きくないためここのバンドを分割するのに十分ではない）。
【００５２】
（実施例２ 干渉分子の存在下および非存在下における全血サンプルの遺伝子発現分析）
現在のところ、血液のサンプルは、治療および診断に関連する白血球（ＷＢＣ）からの発現が得られるように赤血球（ＲＢＣ）を除去するように処理されている。上記した通り、これらのサンプルは典型的には約４０％の存在コール（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕ１３３Ａヒトアレイでは〜２２，０００遺伝子中〜９，０００）を示している。全血から処理されたサンプルは存在をコールされた遺伝子の総数が低減している（〜２２，０００遺伝子中〜５，０００、即ち〜２４％）。全血サンプルからの低減された存在コールに加えて、ミスマッチからのシグナルがパーフェクトマッチからのものより高値であるプローブ対の数が増大する（即ちＭＭ／ＰＭ比が増大する）。シグナルがパーフェクトマッチのプローブよりも高値であるミスマッチプローブの数が増大するに従い、遺伝子発現データの質は低下する。
【００５３】
大量のグロビンｃＲＮＡに対応するためにアレイ上にロードされるｃＲＮＡの量を増大させることにより、より多くの遺伝子がモニタリング可能になるかどうか調べた。しかしながら、ｃＲＮＡロードを増大（４０μｇまで）させても全血からの存在コールの数は有意に増大せず（２４％から２８％への〜４％の増加）、チップがＱＣ不合格となるようなＭＭ／ＰＭ比の僅かな低下が起こった。さらにまた、ポリＡ選択ｍＲＮＡを全ＲＮＡの代わりに使用したところ、存在コールは約３１％まで上昇したが、高いＭＭ／ＰＭ比は低下しなかった。結果として、このような調製ではやはり低品質の遺伝子発現データしか得られない。
【００５４】
次の実験は全血調整物中に存在する高度に発現されたグロビンｍＲＮＡからプライマー指向性逆転写酵素をブロックすることであった。３種の異なるブロッキングオリゴマー（「「ブロッカー」）をα、βおよびγグロビンの最も３’側の領域に設計した。オリゴマーはハイブリッド形成の安定性を増大させるために修飾されたＲＮＡヌクレオチド（２’Ｏ−メチル修飾）よりなるものであり、そして、種々の長さを試験することによりＲＴトランスロケーションを抑制する能力を至適化した。一部の実験においてはグロビンｍＲＮＡ物質種あたり１つより多くのオリゴマーの組み合わせが最大抑制をもたらすことがわかった。単一のブロッカーを用いた場合、完全長とトランケーションされたバンドが現れ（ｃＲＮＡＱＣゲル分析で観察）、逆転写酵素が完全に抑制されていないことが示唆された。一般的に、より長いブロッカーが短いブロッカーよりもＲＴトランスロケーションの抑制においてより有効であった。
【００５５】
以下に示す表は、９種のブロッカー（α、βおよびγグロビンの各々に対して３種の異なるブロッカー）の存在下および非存在下にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＵ１３３ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイを用いて全血全ＲＮＡを評価した場合のデータを示す。該すれば、全血より得た１μｇの初期全ＲＮＡに各オリゴマー０，１０および１００ｐｍｏｌｅのブロッカー混合物を添加し、その後、第１鎖ｃＤＮＡ合成反応を行い、そしてその後サンプルを処理してビオチン標識ｃＲＮＡとし、そして、チップハイブリダイゼーション、洗浄、染色およびデータキャプチャーに関するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＳＯＰに従って処理した。
【００５６】
ＱＣ結果（表１参照）はα、βおよびγグロビンをターゲティングした９種のブロッカーの非存在下（ＣＴＲＬ）または存在下（２つの異なる濃度）における全血全ＲＮＡ調製物から得たものである。ｃＲＮＡハイブリダイゼーション段階においてスパイクされた細菌遺伝子に対する人工的に作成されたｃＲＮＡ転写物はブロッカーの存在下において未変化であった。対数強度／対数バックグラウンド（即ちＳＮ比）にも変化は無かった。ミスマッチからのシグナルがパーフェクトマッチからのものよりも高値（即ちＭＭ／ＰＭ比）である場合のプローブ対の数が１５％減少していたことに留意すべきであり、これは性能の進歩を裏付けるものであった。Ｌｉ／Ｗｏｎｇアウトライアーの数もまた低減していた（「Ｍｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙｓ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｅｘ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｕｔｌｉｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」，Ｌｉ，Ｃ．ａｎｄ Ｗｏｎｇ，ＰＮＡＳ９８（１）：３３１−３６，２００１）。ＧＡＰＤＨおよびＢ−Ａｃｔｉｎに関する５’／３’比もまたＱＣの尺度となる。比の増大は良好なｃＤＮＡ合成およびより５’側の領域に対して設計されたチッププローブセットと反応するｃＲＮＡサンプルの能力の向上を示している。ＧＡＰＤＨおよびＢ−Ａｃｔｉｎに関する５’／３’比は１００ｐｍｏｌｅのブロッカーでそれぞれ９％および２９％増大していた。さらにまた、ブロッカーは存在コールのパーセントに対して用量依存的な応答を示していた。１０ｐｍｏｌｅの混合サンプルに対し、存在パーセントは４６％増大し、１００ｐｍｏｌｅの混合物ではゲインはブロックされていない全血サンプルと比較して６１％であった。ゲル分析によれば各ブロッカーの１００ｐｍｏｌｅの存在下において、優勢な６００塩基対のｃＲＮＡバンドは観察されなかった。
【００５７】
【表１】
全血からの増大した遺伝子発現がＷＢＣ調製物から得られたものにどのように相関しているかを調べるために、全ＲＮＡ＋ブロッカーから得られた発現データ（各濃度につきｎ＝１）をＷＢＣ調製物から得られた発現データと比較した（表２参照）。ＷＢＣデータを使用した場合、３点のＷＢＣ調製物全てにおける存在コールの遺伝子のリストは合計２２２８３中９６６２を含有していることがわかった（約４３％存在）。これらの遺伝子を３種の全血調製物（ＣＴＲＬ、１０ｐｍｏｌｅおよび１００ｐｍｏｌｅ）において生成されたものと比較した。対照チップ上の５４２９の存在遺伝子のうち、４９１５がＷＢＣフィルターリストであった（９０．５％）。１０ｐｍｏｌｅ混合チップ上の７９３９存在遺伝子のうち、７２０４がＷＢＣフィルターリストであった（９０．７％）。そして１００ｐｍｏｌｅ混合チップ上の８７６３存在遺伝子のうち、７８６１がＷＢＣフィルターリストであった（８９．７％）。これはブロッカー使用時にゲインされた存在コールがＷＢＣ遺伝子リスト上で一貫して（〜９０％）観察されたことを示している。
【００５８】
【表２】
このデータによれば、ブロッカーの使用により全血サンプル中のＷＢＣ遺伝子カバレッジは５０．９％から８１．４％（可能な９６６２中４９１５から７８６１）に増大したこと、あるいは、本質的には、プロトコルの変更が全血中のＷＢＣ発現遺伝子の総数をさらに３０．５％回復させたことを示している（これは全血サンプルより６０％増大に相当する）。
【００５９】
（実施例３ 全血中の他の優勢な転写物種の識別）
精製されたＷＢＣ中には発現され、全血ＲＮＡ＋ブロッカー中には発現されない遺伝子を比較した場合、僅か２８フラグメントが識別された。これらのうち、活性化された免疫細胞に特徴的なものは僅か３つであり、大部分は単球であり、程度も極めて軽少であった（Ｉｌ−１β、ＭＨＣＩＩおよびＣＤ６９）。残余は一般的にはある程度増殖性である細胞または造血細胞型により特徴的に発現され、これらはブロッカーを用いた全血の調製全体に亘る本操作法を用いればリッチ化されると予測される。
【００６０】
全血＋ブロッカーのみにおいて発現された遺伝子については、４３遺伝子がＷＢＣサンプル中において検出されなかった。予測されたとおり、これらの遺伝子は赤血球中で特異的または高度に発現されることが特に知られているものであった。倍数変化（ＦＣ）分析で一位であったものはＲＢＣタンパク質（赤血球膜タンパク質、ヘモグロビンζ、グリコホリン、セレン結合タンパク質およびＡＬＡＳ２）であった。
【００６１】
遺伝子リストはその発現がセットの３サンプル全てにおいて存在コールをもたらした遺伝子についてフィルタリングすることによりまず作成した。第２に、１つのサンプルセットのみ（即ちＷＢＣのみまたは１００ｐｍグロビンブロッカーのみ）において存在コールを与えた遺伝子を発見するために分析を行った。これらは１調製プロトコルにおいてのみ独特に検出される遺伝子である。最後に、倍数変化分析を実施して両方のサンプルセットに共通に発現される遺伝子の発現を調べた。２群間の遺伝子発現数値の相違の測定を行い、両側Ｔ検定により調べた場合に０．００１未満のｐ値で有意差ありとする。
【００６２】
ＷＢＣと全血ＲＮＡ＋ブロッカーのＦＣ相違分析において、全血ＲＮＡ＋ブロッカーにおいて極めて高度にアップレギュレートされた遺伝子はＲＢＣに関連する傾向を示していたが、一部のものは細胞型に関しては不明であった。特に興味深い点は、全血調製物中のαシヌクレインの極めて高い濃度であった。全血ＲＮＡ＋ブロッカーと比較した場合にＷＢＣ中で極めて高度にアップレギュレートされた遺伝子は大部分が均一してリボソームタンパク質遺伝子であった。
【００６３】
要約すれば、ブロッカーを使用することは全血プロトコル単独に対して多大な進歩となり、そして他の高度に発現されるＲＢＣタンパク質、例えばδーアミノレブリン酸シンテターゼ２（ＡＬＡＳ２）、セレン結合タンパク質、グリコホリンおよび一部の他のヘモグロビンに対してブロッカーを使用することによっても実施できる。
【００６４】
（実施例４ 霊長類全血サンプルと共に用いるためのオリゴヌクレオチドブロッカーの設計および評価）
ヒトα−グロビンブロッカーオリゴマーおよび霊長類βグロビンブロッカーオリゴマーがαグロビンおよびβグロビンｍＲＮＡに結合してグロビンｍＲＮＡのプライマー指向性逆転写酵素をブロックする能力について、カニクイザル全血調製物において試験した。
【００６５】
ヒトαグロビンおよびβグロビンをコードするヌクレオチド配列を、アカゲザルおよびカニクイザルのαおよびβグロビンヌクレオチド配列それぞれに対するコンセンサスに関して評価した。霊長類αグロビンヌクレオチド配列はヒトαグロビンヌクレオチド配列とマッチしている。この理由から、以前に評価されたヒトαグロビンブロッキングオリゴマー０４および０５を使用したが、０４は以下の通り、即ち、ＵＵＵＧＣＣＧＣＣＣＡＣＵＣＡＧＡＣＵＵＵＡＵ（配列番号３４、配列番号４＋３’末端の追加３ヌクレオチドと同じ）となるように伸長した。霊長類βグロビンヌクレオチド配列をヒトβグロビンヌクレオチド配列と比較したところ、１塩基対の相違が判明した。３つの２’−Ｏ−メチル霊長類βグロビンブロッキングオリゴマーを設計し霊長類βグロビンｍＲＮＡの逆転写を効果的にブロックするその能力について試験した。評価はＱ−ＰＣＲおよびｃＲＮＡデータの結果に基づいた。設計して試験したβグロビンブロッキングオリゴマーは以下に列挙するとおりである。
【００６６】
【化５】
分析を実施するために、カニクイザルの血液をＥＤＴＡ試験管中に採取する（１０ｍｌ血液／霊長類の１試験管）。次に全血をＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液試験管中に分注し、試験管をＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡキットハンドブックに従って処理することにより全ＲＮＡを得る。ＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡキットはαおよびβグロビンＲＮＡを含む血液中の核酸を安定化させる。
【００６７】
ＲＮＡ抽出の後、反応あたり全ＲＮＡ５μｇを用いて逆転写を実施する。逆転写工程はプライマー−アニーリング工程において反応に２’−Ｏ−メチル修飾グロビンブロッキングオリゴマーを添加した以外はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのプロトコルに従って実施する。表３はサンプルの説明である。サンプルＣｙＰ１を対照として使用した。
【００６８】
【表３】
ｃＤＮＡ／サンプル約０．９μｇづつを用いてＱ−ＰＣＲを行った。Ｑ−ＰＣＲはαグロビンおよびβグロビンｍＲＮＡの逆転写をブロックする２’−Ｏ−メチルαグロビンオリゴマーおよび２’−Ｏ−メチル−βグロビンオリゴマーの能力を評価するために使用した。Ｑ−ＰＣＲデータは被験サンプル各々（ＣｙＰ２、ＣｙＰ３およびＣｙＰ４）の平均のＣＴをブロックされていない全血ｃＤＮＡ対照（ＣｙＰ１）のものと比較することにより分析した。ブロックされていないサンプルの平均ＣＴ値と比較した場合の各ブロックサンプルの平均ＣＴ値の上昇は、対照サンプルと比較してαグロビンｍＲＮＡまたはβグロビンｍＲＮＡ逆転写をブロッカーが良好にブロックしたことを示している。全被験サンプルは相当する対照の平均ＣＴ値よりも高値の平均ＣＴ値を有しており、全てのオリゴマーが被験サンプル中のグロビンＲＮＡの逆転写をブロックしたことを示していた。
【００６９】
【表４】
ｃＤＮＡはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの標準的インビトロ転写（ＩＶＴ）のプロトコルを用いてｃＲＮＡに転写する。ｃＲＮＡの品質はＡ２６０測定により試験する。ＣｙＰ１対照サンプルは転写物がそのサンプル中でブロックされていなかったために最も高い総収量を有することが予測された。２５μｇ未満のいずれの収量も不良とみなした。全被験サンプルの総収量は高く、ＣｙＰ２サンプルは対照サンプルと統計的に同様の良好な性能を示した。サンプルＣｙＰ３およびＣｙＰ４はＣｙＰ２サンプルより低値の全ｃＲＮＡ収量であったが、これらの収量はなお十分であった。ｃＲＮＡの品質および２’−Ｏ−メチルオリゴマーがαグロビンおよびβグロビンをブロックする能力は１ＸＭＯＰＳ、１．２５％アガロースゲル上で試験した。許容基準はグロビンに相当することが実施例１でわかっている≦０．６Ｋｂのバンドが存在しないこととした。０．６Ｋｂ以下のバンドの存在は完全ではない部分的なグロビン転写のブロッキングを示唆していた。全被験サンプルにおいてグロビンが完全にブロックされたことをゲルは示していた。
【００７０】
【表５】
Ｑ−ＰＣＲおよびｃＲＮＡのデータは全オリゴマーが結合し、αおよびβグロビンＲＮＡの逆転写を効果的にブロックしたことを示していた。ＣｙＢ１オリゴマーはβグロビンｍＲＮＡの３’末端に最も近く結合するように設計した。これは他のβグロビンブロッキングオリゴマーと同様に効果的にβグロビンＲＮＡの転写をブロックし、ｃＲＮＡの最高収量をもたらした。この理由から、ＣｙＢ１（配列番号３５）は評価された最も効果的なβグロビンブロッキングオリゴマーであると考えられる。
【００７１】
（実施例５ 干渉分子の存在下および非存在下の霊長類全血サンプルの遺伝子発現分析）
カニクイザル白血球、全血および全血＋ブロッキングオリゴマーの遺伝子発現分析をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＧ＿Ｕ１３３ＡＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ上で実施する。ＲＮＡは全血中の赤血球を溶解させ、そして製造元の説明書に従ってＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙキットを用いて全ＲＮＡを抽出することにより白血球から得る。ＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡキットを用いて全血調製物から抽出された全量を抽出し、製造元の説明書に従って使用する。全ＲＮＡサンプルはＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写のプライマーアニーリング工程の間にサンプルＰＡＸ＿１００にブロッキングオリゴマーを添加する以外はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの標準的プロトコルに従ってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＧ＿Ｕ１３３ＡＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイを用いて処理した。表６はサンプルの情報を示す。
【００７２】
【表６】
各サンプルはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの標準的プロトコルに従って３ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＧ＿Ｕ１３３ＡＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ上で実施する。サンプルは交差物質種ハイブリダイゼーションにより実施例２に記載したものよりも低い存在コールを示した。白血球サンプルは約２１．５％の存在コールを示した（〜２２，０００遺伝子中〜９，０００、即ち〜２４％）。ブロッキングオリゴマー非存在下の全血サンプルは約１７．９％の存在コールを示した。これと比較して、ブロッキングオリゴマーを含有する全血サンプルは約２６．０％の存在コールを示した。このデータは白血球サンプルまたはブロッキングオリゴマー非含有全血サンプルよりも多くの遺伝子がブロッキングオリゴマー含有全血サンプル中から検出されたことを示している。
【００７３】
相関カラーマップおよびＰＣＡグラフ（図示せず）もまた白血球サンプルとブロッキングオリゴマー含有全血サンプルの存在コール遺伝子の間に高い水準の一致があったことを示していた。
【００７４】
（実施例６ イヌ全血サンプルを用いたオリゴヌクレオチドブロッカーの評価）
イヌブロッキングオリゴマーを設計し、グロビンｍＲＮＡの逆転写を効果的にブロックするその能力について評価した。イヌ血液を採取し、ＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡキットを用いて製造元の説明書に従って処理する。ｍＲＮＡを逆転写し、そして２’Ｏ−メチル修飾ブロッキングオリゴマーを被験サンプルのプライマーアニーリング工程中に１００ｐｍｏｌ／反応で添加する。設計して試験したαおよびβグロビンブロッキングオリゴマーは以下に列挙するとおりである。サンプルの説明は表７に示す。
【００７５】
【化６】
【００７６】
【表７】
サンプルは実施例２に記載する通りＱ−ＰＣＲを用いて試験する。対照サンプル（全血、ブロッカー無添加）は最低の平均αグロビンＣＴおよびβグロビンＣＴ値を全サンプルに亘り示した。このことは全てのブロッカーは、対照サンプルと比較して被験サンプル中のグロビンＲＮＡの逆転写をブロックしたことを示している。
【００７７】
ｃＤＮＡサンプルを実施例２に記載した通りｃＲＮＡに転写する。ブロッカーオリゴマーを含有しない全血サンプルは１１０．４５μｇのｃＲＮＡ総収量を示した。ブロックされたサンプルはより低値の収量を示したが、全収量とも２９μｇより高値であった。２５μｇ未満の収量は「失敗」とみなした。この理由から、全被験サンプルの総収量は十分であると考えられた。
【００７８】
ｃＲＮＡはまた１ＸＭＯＰＳ、１．２５％アガロースゲル上で泳動することによりブロッキングオリゴマーがグロビンｍＲＮＡの逆転写を完全にブロックしたかどうか調べた。サンプルＫ９Ｐ１７に相当するゲルのレーン内の約０．６Ｋｂの弱いバンドはこのサンプルについて部分的なブロッキングのみ生じたことを示唆していた。他の被験サンプルに相当するゲルのレーンはバンドを示しておらず、これはグロビンｍＲＮＡ転写物の逆転写の完全なブロッキングが起こったことを示唆していた。この理由から、αブロッキングオリゴマーの組み合わせはαグロビンブロッキングオリゴマーＣＡＮａＧ．０４が単独でブロックするよりも効果的に逆転写をブロックすると考えられる。
【００７９】
（実施例７ 干渉分子の存在下および非存在下のイヌ全血サンプルの遺伝子発現分析）
イヌ白血球、全血およびグロビンブロッカーを含有する全血の遺伝子発現分析をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘイヌＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイプラットフォームを用いて実施する。実験は実施例５に記載した実験と並行する。白血球サンプルは赤血球を溶解することにより採取し、全ＲＮＡはＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキットを使用して抽出する。全ＲＮＡはＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡキットを用いて全血サンプルから抽出する。サンプルの説明は表８に記載するとおりである。
【００８０】
【表８】
サンプルは実施例５に記載の通り処理し、そしてサンプルは各々１つのイヌＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイとハイブリダイズする。ＷＢＣサンプルセットは３４．８％で最高パーセント存在コールを示した。ＰＡＸ＿０サンプルセットは１６．７％で最低パーセント存在コールを示した。ＰＡＸ＿１０、ＰＡＸ＿１００およびＰＡＸ＿２００サンプルセットはそれぞれ２９．９％、３１．９％および２９．３％のパーセント存在コールを示した。データはグロビンブロッキングオリゴマーを添加した場合には全血球サンプル中のパーセント存在コールが実質的に増大したことを示している。
【００８１】
ＰＡＸ＿１００サンプルセットは他の全血球調製物と比較した場合にＷＢＣサンプルセットと合致した最高水準を示した。ＷＢＣサンプルセットとＰＡＸ＿１００サンプルセットとの間の存在コール遺伝子の一致は８６．３％であった。ＷＢＣサンプルセットとＰＡＸ＿０サンプルセットとの間の存在コール遺伝子の一致は４６．５％であった。データは、遺伝子発現データは白血球サンプルと１００ｐｍｏｌブロッキングオリゴマー添加全血サンプルとの間で最も同様であることを示していた。
【００８２】
（実施例８ ラット全血サンプルの遺伝子発現分析：グロビン低減の有無による示差的遺伝子発現の分析に関するＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）およびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）プロトコルの比較）
本試験の目的はラット全血サンプルに対するグロビン低減プロトコルの有効性を評価すること、および、ＷＢＣプロトコルと比較した場合のグロビン低減プロトコル処理サンプルと未処理サンプルの遺伝子発現の差の測定における進歩の程度を評価することであった。
【００８３】
ラット１５匹に食塩水（３ｍｌ／ｋｇ、ｉｐ）を投与し、そして１５匹にＬＰＳ（３ｍｌ／ｋｇの容量で１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）を投与し、そしてラット血液から、（１）ノースカロライナ大学ＲＢＣ溶解プロトコル（ＵＮＣ）（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｇｅｎｅｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ａｎｔｉ−ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＡＮＣＡ），Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ．，６２（５）：１６３８−４９）、全血混合ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）プロトコルおよびＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）標準単離プロトコルを用いてＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡを逆転写し、２’Ｏ−メチル修飾ブロッキングオリゴマーを被験サンプルのプライマーアニーリング工程の間に５μｇ全ＲＮＡの４００ｐｍｏｌ／反応で添加する。使用されたブロッカーは以下のとおりである。
【００８４】
【化７】
次に各サンプルを１つのＲＧＵ３４ＡＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイに４５℃で２４時間ハイブリダイズし、アレイをＭｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ５．０ソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、以下のセッティング、すなわちスケーリング＝全プローブセット＠ＴＧＴ１００、規格化ファクター＝１、α１＝０．０４、α２＝０．０６、タウ＝０．０１５、γ１Ｌ＝０．００２５、γ１Ｈ＝０．００２５、γ２Ｌ＝０．００３、γ２Ｈ＝０．００３および摂動＝１．１により分析した。
【００８５】
プローブセットのリストはＡＳＣＥＮＴＡＴＭシステム（Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から入手し、これはサイトカイン遺伝子ファミリー（５３メンバー）またはＧＰＣＲ遺伝子ファミリー（２７７メンバー）の何れかのメンバーと考えられた。ｌｏｇ２変換Ｇｅｏｍｅａｎデータの比較によれば、未処理の全血サンプルよりもグロビン低減プロトコルおよびＵＮＣプロトコルで処理したＴＲＩｚｏｌ（登録商標）プロトコルおよびＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）サンプルの間に有意に増大した相関（Ｒ２）が示されていた。このことは、グロビンメッセージを除去した場合に遺伝子発現測定の正確さの有意な進歩が起こることを示している。
【００８６】
８炎症経路（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、サイトカイン炎症応答、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、サイトカインネットワーク、炎症応答、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）および有糸分裂促進物質活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ））のメンバーであり、そして対照とＬＰＳ投与ＷＢＣサンプルとの間に有意な遺伝子発現の相違を示した遺伝子のサブセットを調べた。ＷＢＣサンプルセットにおいてみられた対照とＬＰＳ投与サンプルとの間の測定された遺伝子発現の相違の程度をＴＲＩｚｏｌ（登録商標）とＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）サンプルセットのものと比較した。グロビン低減プロトコルで処理したＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）のサンプルセットの両方につき、対照およびＬＰＳ投与サンプルの間で測定された遺伝子発現の相違の計算された程度の相関は、ＷＢＣサンプルセットのものに対して、増大していた。即ち、倍数変化の規模の相関ははるかに高度であり、そして発現における倍数変化の方向は（ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）のサンプルセットの両方につき）グロビン低減後のＷＢＣサンプルのものとより合致している。
【００８７】
要約すれば、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）のＲＮＡサンプルをグロビン低減プロトコルで処理することによりＷＢＣ中の示差的遺伝子発現の正確な測定に対して顕著な利点が与えられる。αおよびβグロビンｃＲＮＡの大部分をアレイハイブリダイゼーション溶液から除去することにより、遺伝子検出の感度および測定された遺伝子発現の正確さと再現性が大きく高められる。グロビン低減プロトコルはＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）のＲＮＡ単離にさらに付け加えたプロトコル工程を含んでいるため、プロトコルはＷＢＣ単離が無いという利点も有している。
【００８８】
（実施例９ ヒトサンプル中の全血遺伝子発現プロファイリングを増強するための逆転写中のαグロビン、βグロビンおよびγグロビンのブロッキング）
本試験の目的は、（１）０．２％から２．５％の範囲の広範な網状赤血球を有するヒト全血サンプルに対するグロビン低減プロトコルの有効性を測定すること；（２）ブロッキング方法がグロビンｍＲＮＡを極めて少量または極めて大量に含有するサンプルにおいてもなお有効であるかどうか調べること；および（３）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの最近発表したＲＮａｓｅＨ系のグロビン低減プロトコル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｎｏｔｅ Ａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｃｄｓｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｐｒｅｐａｒｅ Ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（２００３））と遺伝子特異的ブロッカーとして２’Ｏ−メチル化学修飾オリゴマーを用いた本発明のグロビン低減プロトコルを比較することであった。
【００８９】
血液を異なる６ドナーの各々から採取し、網状赤血球計数分析を含む完全な血液計数分析のために処理した。全ＲＮＡは（１）後のパラグラフにおいて「ＷＢＣ」と称される「ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ」（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコル（任意のオンカラムの「ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ」（Ｑｉａｇｅｎ）ＤＮａｓｅ Ｉ処理消化を含む）；（２）ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＲＮＡ単離プロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；および（３）「ＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡキット」（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）プロトコル（任意のオンカラムの「ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ」（Ｑｉａｇｅｎ）ＤＮａｓｅ Ｉ処理消化を含む）の各々を利用しながら各サンプルの一部から単離した。
【００９０】
６ＷＢＣ全ＲＮＡ、６ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＲＮＡおよび複数のＰＡＸｇｅｎｅＴＭ全ＲＮＡサンプルの各々を「ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐ Ｋｉｔ」（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ バイオアナライザーシステム上でＲＮＡの品質について個別に評価し、そして次に「ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ）または「ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ」プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）の何れかを用いて１μｇ／μｌより高値の濃度まで濃縮した。濃縮されたＲＮＡサンプルは「ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ−Ｃｈａｐｔｅｒ ２：Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓａｍｐｌｅ ａｎｄ Ａｒｒａｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に記載されている通り、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）分析用のサンプル調製に関する標準的プロトコルに従って調製した。さらにまた、各ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭの全ＲＮＡサンプルの小分量も以下の通り本発明のグロビン低減プロトコルまたはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘグロビン低減プロトコルで処理した。
【００９１】
本発明のグロビン低減プロトコル法：初回鎖ｃＤＮＡ合成反応の開始時において、ＰＡＸｇｅｎｅＴＭおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）全ＲＮＡの両方の５μｇずつをＴ７−オリゴ（ｄＴ）プライマー１００ｐｍｏｌおよび以下の５種のグロビンｍＲＮＡブロッキングオリゴマー（２種のαブロッカー、２種のβブロッカーおよび１種のγブロッカー、反応あたり各々９０ｐｍｏｌ）の各々９０ｐｍｏｌを含有する修飾オリゴヌクレオチド（オリゴ）混合物５μｌに同時にアニーリングした。
【００９２】
【化８】
各アニーリング反応は１０分間７０℃で１２μｌの総容量中で行った（総数６サンプル２セット）。次に１２「処理」サンプル全てを「ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ−Ｃｈａｐｔｅｒ ２：Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓａｍｐｌｅ ａｎｄ Ａｒｒａｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に記載されている通りのプロトコルの残余に従ってＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）分析用に調製した。
【００９３】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのグロビン低減プロトコル法：初回鎖ｃＤＮＡ合成反応の開始前にＰＡＸｇｅｎｅＴＭおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）全ＲＮＡの両方の５μｇずつを２種のαグロビン３’末端アンチセンスプライマー各々１５ｐｍｏｌおよびβグロビン３’アンチセンスプライマー４０ｐｍｏｌに同時にアニーリングした。各アニーリング反応は５分間７０℃ｈで１０μｌの総容量で行った（合計２セット６サンプル）。次に各アニーリングサンプルを１０分間３７℃で総反応容量２０μｌ中２単位のＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で消化した。次にＲＮａｓｅＨ消化全ＲＮＡサンプルを清浄化し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）サンプルクリーンアップモジュール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）のＩＶＴｃＲＮＡクリーンアップスピンカラムを用いて１１μｌの容量に濃縮した。次に１２「処理」サンプル全てを「ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ−Ｃｈａｐｔｅｒ ２：Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓａｍｐｌｅ ａｎｄ Ａｒｒａｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に記載されている通りのプロトコルの残りの部分に従ってＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）分析用に調製した。
【００９４】
次に各ＷＢＣ、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭＲＮＡサンプル（本発明のグロビン低減法またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのグロビン低減プロトコルの何れかで処理したサンプルを含む）を各々１つのＨｕ１３３Ａアレイに４５℃で１６時間ハイブリダイズした。各アレイを「ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ−Ｃｈａｐｔｅｒ ２：Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓａｍｐｌｅ ａｎｄ Ａｒｒａｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に従って洗浄、染色およびスキャン（単一のスキャナー上）した（ＳＯＰ３０３７ｖ２および３００８ｖ３参照）。各アレイのイメージをＧｅｎｅＬｏｇｉｃの専売ＱＣワークベンチプログラムを用いて品質評価し、次にＭｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ５．０ソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて分析した。使用したＭＡＳ５．０分析のセッティングはスケーリング＝全プローブセット＠ＴＧＴ１００、規格化ファクター＝１、α１＝０．０５、α２＝０．０６５、タウ＝０．０１５、γ１Ｌ＝０．００４５、γ１Ｈ＝０．００４５、γ２Ｌ＝０．００６、γ２Ｈ＝０．００６および摂動＝１．１とした。
【００９５】
ｃＲＮＡ標的の長さに関する典型的な範囲である２００〜４，０００塩基がＷＢＣ調製物について観察できる。ＰＡＸｇｅｎｅＴＭシステムおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）の調製物を用いれば、優勢な〜６００ｂｐのバンドは著明であり、ｃＲＮＡ分布の相対強度はＷＢＣ調製物で観察されるものより低値である。何れかのグロビン低減法により調製したサンプルから得られたイメージでは優勢な〜６００ｂｐのバンドは顕著に低減され、著明ではなかった。さらに、本発明のグロビン低減プロトコルにより処理したＰＡＸｇｅｎｅＴＭシステムおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルのｃＲＮＡ標的分布の長さは再度ＷＢＣｃＲＮＡ標的と適合していた。しかしながら、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＲＮａｓｅＨ系のグロビン低減プロトコルで処理したＰＡＸｇｅｎｅＴＭシステムおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルのｃＲＮＡ標的分布の長さは僅かに低減しているように観察された。
【００９６】
赤血球溶解調製物中に発現されたものと比較してＰＡＸｇｅｎｅＴＭ調製物中で最も高度に発現された遺伝子はグロビン転写物である（データ示さず）。優勢な〜６００ｂｐのバンドは全血調製物中に存在するが他の方法では除去される網状赤血球由来のグロビンｍＲＮＡの増幅に起因する。グロビン転写物をターゲティングするためには、本発明のグロビン低減プロトコルはそれぞれＨＢＡ１、ＨＢＡ２、ＨＢＢおよびＨＢＧ１に対して設計されたグロビン転写物α、βおよびγグロビンに対する５種の遺伝子特異的ブロッキングオリゴマーを利用する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘグロビン低減プロトコルはαおよびβグロビン転写物のみをターゲティングするプライマーを利用する（ＨＢＡ１、ＨＢＡ２およびＨＢＢ配列に特異的）。しかしながら、試験した各ブロッキング方法は優勢な〜６００ｂｐのバンドを完全に除去している。〜６００ｂｐのバンドは全ＲＮＡ調製物には検出されず、ｃＲＮＡ増幅過程を実施した後にのみ生じたことに留意しなければならない。ｃＲＮＡ強度の相対的低減およびゲルイメージにおけるＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルの見かけ上の長さは豊富なグロビンメッセージと増幅および標識中の残存転写物との間の競合に起因しているか、または、単に、大量のグロビンｃＲＮＡによるサンプル中の非グロビンｃＲＮＡの希釈の結果であると考えられる。
【００９７】
一貫して低値の「パーセント存在コール」および高値のＭＭ＞ＰＭプローブ対計数がＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルにおいて観察された（データ示さず）。〜６００ｂｐのバンドの低減は増大した「パーセント存在コール」および低値のＭＭ＞ＰＭプローブ対計数と相関しているため、ＰＡＸｇｅｎｅＴＭおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）の実験における低減した感度は全血ＲＮＡ調製物中に存在する増幅されたｃＲＮＡ標的の優勢なバンドの存在による可能性が最も高い。
【００９８】
ｃＤＮＡ合成の前またはその間のグロビン転写物枯渇の効率性を調べるために、各サンプルに関するα、βおよびγグロビン遺伝子発現値を抽出した。一部の例においては６種以下の異なるプローブセットを用いて単一のグロビン遺伝子の平均の遺伝子発現を測定した。網状赤血球が高濃度であるサンプルはより高値のグロビンシグナルを示したが、両方のグロビン低減方法ともその予測される転写物に関する測定遺伝子発現シグナル値を低減した。本発明の方法のためのブロッカーカクテルはＷＢＣ調製物において測定されたものと同じかより低値であるシグナル値の範囲までα、βおよびγグロビンプローブセットのシグナル値を低減した。しかしながらＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのグロビン低減プロトコルは本発明のグロビン低減プロトコルほど顕著にはグロビンプローブセットのシグナル値を低減しなかった。
【００９９】
ＧｅｎｅＬｏｇｉｃのグロビン低減プロトコルは実際にＷＢＣプロトコルで観察された数値より僅かに低値までβグロビンの発現シグナルを低減したことに留意しなければならない。さらにまた、予測されるとおり、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘグロビン低減プロトコルはγグロビン値に対しては僅かな作用しか示さなかった（ＲＮａｓｅＨ消化についてはγグロビン転写物を特異的にターゲティングしないため）。両方のグロビン低減プロトコルは広範な網状赤血球計数を示すドナーから得たサンプルに亘ってグロビンシグナルを低減することについては、同様の有効性を示した。このことは両方のプロトコルは可変のドナーサンプル集団に対してグロビンを低減する場合には効果的であることを意味する。
【０１００】
ベースライン発現としてのＷＢＣ全ＲＮＡと異なる全血全ＲＮＡとの間の示差的発現を示した遺伝子およびグロビン枯渇方法を識別するためにスチューデントのｔ検定を用いた。各比較におけるプローブセットの大部分は２倍より小さい変化の相違を示した。しかしながら、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭ全ＲＮＡをＷＢＣ調製物と比較した場合、それぞれ８４３および１０２０プローブセットがｐ値＜０．０１でいずれかの方向に２倍の発現差があることが判明した。有意な発現の差の数は、本発明のグロビン低減法を用いれば、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルでは８４３から１２４プローブに、そしてＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルでは１０２０から３９１プローブセットにそれぞれ低減した。また、上記の場合ほど有意ではないが、有意な発現の差の数は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘグロビン低減プロトコル法を用いることで、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルでは８４３から７２６プローブに、そしてＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルでは１０２０から７９９プローブセットにそれぞれ低減した。この方法で処理されたサンプルについては有意な負の倍数変化の数の大きな増大が観察され、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルの間に起こっている非特異的またはオフターゲットの作用を示している。明らかに、本分析においては本発明のグロビン低減法が最良の性能のプロトコルであり、そして本プロトコルで処理したサンプルにおいてはオフターゲット作用は仮にあったとしても少数であることをデータは示している。
【０１０１】
細胞型特異的で遺伝子ファミリー特異的なシグネチャー遺伝子の２セットを用いて血液特異的遺伝子に基づいて試験された異なるプロトコルにより作成された遺伝子発現データを相関付けた。赤血球特異的遺伝子は全血全ＲＮＡプロトコルのいずれにおいてもより高度に発現された。顆粒球および単核細胞特異的な転写物の相関はＷＢＣ対未処理ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルについてはＲ２＝０．９０でありＷＢＣ対未処理ＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルについてはＲ２＝０．８３であったが、この相関は本発明のグロビン低減プロトコル処理サンプルのいずれにおいても０．９９超まで増大していた。Ｒ２＝０．９９の最高相関は本発明のグロビン低減プロトコルで処理されたＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルで観察された。
【０１０２】
興味深いことに、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＲＮａｓｅＨ系のグロビン低減プロトコルにより処理されたＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルはこの特定の分析においては極めて不良な性能を示した。顆粒球および単核細胞特異的な遺伝子発現の数値の相関はＷＢＣ対ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）＋ＲＮａｓｅＨについてはＲ２＝０．６６であり、ＷＢＣ対ＰＡＸｇｅｎｅＴＭ＋ＲＮａｓｅＨについてはＲ２＝０．６３であった。この遺伝子セットについてはオフターゲット作用が実際にＷＶＣサンプルデータへの相関を低下させていたことは明らかである。
【０１０３】
同様の結果がシグネチャー遺伝子の第２のセットについても観察された。ＷＢＣ対未処理ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）またはＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルについては遺伝子発現の数値の相関はそれぞれＲ２＝０．８５および０．８３であった。この相関は本発明のグロビン低減プロトコルで処理したＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルについてはそれぞれ０．９７および０．９４に増大した。さらに、顆粒球および単核細胞特異的な遺伝子とは対照的に、ＷＢＣと比較した場合のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコル処理のＴＲＩｚｏｌ（登録商標）およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルでは相関の増大が観察された（それぞれＲ２＝０．９０および０．８９）。
【０１０４】
考えられるプロトコルのオフターゲット作用を示すプローブセットの数をさらに求めるために、各グロビン低減プロトコル（即ちＴＲＩｚｏｌ（登録商標）＋ブロッカー、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）＋ＲＮａｓｅＨ等）について幾何平均の比（各プローブセットに対する）を未処理のＰＡＸｇｅｎｅＴＭまたはＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルのデータと比較し、そして各比較についてスチューデントのｔ検定を行うことにより何れかの測定された発現の差が有意であるか調べた。最後に、未処理のＰＡＸｇｅｎｅＴＭまたはＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルセットの場合よりもＷＢＣサンプルセットにおいて高値の幾何平均のシグナル値を有していたプローブセットのみを含むようなプローブセットのフィルターリストを求めた。処理対未処理のサンプルにおいて有意な低下（１．５倍より大きいシグナル低下、ｐ＜０．０５）を示し、そして、未処理サンプルよりもＷＢＣサンプルにおいて高濃度に発現されたものとして測定されたプローブセットを計数した。〜２２，０００プローブセット中僅か６および２つが本発明のグロビン低減プロトコルで処理されたＰＡＸｇｅｎｅＴＭおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルについてこのような基準を満足した。しかしながら、３２９および５２０プローブセットがＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘグロビン低減プロトコルで処理したＰＡＸｇｅｎｅＴＭおよびＴＲＩｚｏｌ（登録商標）サンプルについてこの同様の基準を満足した。この分析から得られる結果はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＲＮａｓｅＨ系プロトコルは有意で多数のオフターゲット作用をもたらすということである。このことはプロトコル自体の性質によるものと考えられ、ゲノムＤＮＡのフラグメントを含有する可能性のあるサンプル中の酵素的反応を使用することにより、多くの異なる非グロビンｍＲＮＡ消化が起こる可能性がある。
【０１０５】
要約すれば、本発明またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのグロビン低減プロトコルの何れかを用いて調製された６種の異なる全血サンプルから得られたＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイデータをブロックされていない全血全ＲＮＡサンプルから得たデータと比較した。これらの異なるプロトコルの性能をＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ上のハイブリダイゼーションの前および後に多くのパラメーターに対して評価した。発現データの分析によれば、本発明のプロトコルは％存在以外の全ての分析およびＰＡＸｇｅｎｅＴＭサンプルの一致分析においてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのプロトコルよりも良好な性能を示した。さらに、本発明のプロトコルは全血サンプルマイクロアレイデータの感度および再現性を大きく向上させ、生産において実施できる最も平易なプロトコルであり、そして最も自動化が容易である。
【０１０６】
ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プラットフォーム用に処理したサンプルに対して本発明の転写ブロッキング法を用いれば、全血調製物由来の全ＲＮＡから誘導したものとの関連において測定可能な遺伝子の数が６６％から８６％に増大した。網状赤血球溶解プロトコルを用いて処理された同じサンプルにおける存在コールとして測定された遺伝子に対して転写ブロッキングプロトコルを用いて得られた遺伝子を比較したところ、２つのプロトコルの間には９６％の重複があった。このことは遺伝子発現の生物学的一貫性が維持されており、より関連する末梢白血球の遺伝子発現分析が得られることを示唆している。平均の変動係数は転写ブロックプロトコルにおいては３．９％低減され、それに伴うＧＡＰＤＨまたはβアクチン比較対象遺伝子のＳＮ比や５’−３’比の有意な変化は無い。ブロッキング法を用いる場合の１つの懸案事項は非ブロッカーのターゲティングされた転写の「オフターゲット」サイレンシングがある点である。しかしながら、得られたデータの分析によれば、マイクロアレイ上にタイルされた〜２２，０００遺伝子のうちオフターゲット作用の可能性を示したものは最大でも６つであった。これらの結果によれば、採取時に安定化された全血全ＲＮＡの使用は感度および再現性を失うことなく全ゲノムの遺伝子発現プロファイリングのためのサンプルとして効率的に使用できる。
【０１０７】
全ての出版物、特許および特許出願は参照により本明細書に組み込まれる。上記した明細書において、本発明はその特定の好ましい実施形態に関連して記載されており、多くの詳細事項は説明を目的としているが、当業者の知るとおり本発明はさらに別の実施形態が可能であり、そして本明細書に記載した詳細の特定のものは本発明の基本原理から外れることなく大幅に変更できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、白血球対全血から得たｃＲＮＡ中の約６００塩基対の顕著なバンドを示すアガロースゲルの写真である。
【図２】図２は、選択されたｍＲＮＡ配列の逆転写酵素による転写を本発明の遺伝子特異的プライマーがブロックする機序を示す説明図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高赤血球含量を有する血液または組織のサンプルの遺伝子発現分析を改良する方法であって、以下：
（ａ）該血液または組織からＲＮＡのサンプルを得る工程；
（ｂ）該サンプルに、一種以上の赤血球（ＲＢＣ）核酸配列特異的干渉分子を添加する工程；
（ｃ）該サンプル中のＲＮＡ転写物を増幅する工程；および、
（ｄ）該サンプルの遺伝子発現プロファイルを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記一種以上のＲＢＣ核酸配列特異的干渉分子が、ｃＤＮＡへの一種以上のＲＢＣ ｍＲＮＡ転写物種の逆転写をブロックする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血液または組織が全血である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記一種以上のＲＢＣ ｍＲＮＡ転写物種がグロビンであり、そして、前記一種以上のＲＢＣ核酸配列特異的干渉分子がグロビン核酸配列特異的干渉分子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡを含有するサンプル中の一種以上のＲＢＣ ＲＮＡ転写物種の核酸増幅プロセスの間に増幅を阻害する方法であって、以下：
（ａ）該サンプルに一種以上のＲＢＣ核酸配列特異的干渉分子を添加する工程；および、
（ｂ）該サンプル中のＲＮＡ転写物を増幅する工程；
を包含する、方法。
【請求項６】
前記一種以上のＲＢＣ核酸配列特異的干渉分子が、ｃＤＮＡへの一種以上のＲＢＣ ｍＲＮＡ転写物種の逆転写をブロックする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが全血から得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記一種以上のＲＢＣ ｍＲＮＡ転写物種がグロビンであり、そして、前記一種以上のＲＢＣ核酸配列特異的干渉分子がグロビン核酸配列特異的干渉分子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
サンプル中の他の転写物種の遺伝子発現分析を妨害する、サンプル中の一種以上の赤血球ＲＮＡ転写物種の増幅を阻害する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルに、一種以上の赤血球核酸配列特異的干渉分子を添加する工程；および、
（ｂ）一種以上の該赤血球核酸配列特異的干渉分子の存在下で、該サンプル中の転写物を増幅する工程；
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記増幅が前記転写物種の逆転写を包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルが全血であるか、または高赤血球含量の組織より得られたＲＮＡ調製物であり、該組織が必要に応じて脾臓、骨髄、胎盤、血管化腫瘍、血管様腫瘍、脂肪、肺、筋肉、膵臓、心臓、肝臓および出血性組織からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子発現分析が定量的である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記赤血球転写物種が、リボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３Ｌ）、Ｌ６（ＲＰＬ６）、Ｌ７（ＲＰＬ７）、Ｌ７ａ（ＲＰＬ７Ａ）、Ｌ９（ＲＰＬ９）、Ｌ１０ａ（ＲＰＬ１０Ａ）、Ｌ１１（ＲＰＬ１１）、Ｌ１２（ＲＰＬ１２）、Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、Ｌ１７（ＲＰＬ１７）、Ｌ１８（ＲＰＬ１８）、Ｌ１９（ＲＰＬ１９）、Ｌ２１、Ｌ２３ａ（ＲＰＬ２３Ａ）、Ｌ２４（ＲＰＬ２４）、Ｌ２７（ＲＰＬ２７）、Ｌ２７ａ（ＲＰＬ２７Ａ）、Ｌ２８（ＲＰＬ２８）、Ｌ３０（ＲＰＬ３０）、Ｌ３１（ＲＰＬ３１）、Ｌ３２（ＲＰＬ３２）、Ｌ３４（ＲＰＬ３４）、Ｌ３５（ＲＰＬ３５）、Ｌ３７（ＲＰＬ３７）、Ｌ３７ａ（ＲＰＬ３７Ａ）、Ｌ４１（ＲＰＬ４１）、Ｓ２（ＲＰＳ２）、Ｓ３ａ（ＲＰＳ３Ａ）、Ｓ５（ＲＰＳ５）、Ｓ６（ＲＰＳ６）、Ｓ７（ＲＰＳ７）、Ｓ１０（ＲＰＳ１０）、Ｓ１１（ＲＰＳ１１）、Ｓ１３（ＲＰＳ１３）、Ｓ１６（ＲＰＳ１６）、Ｓ１７（ＲＰＳ１７）、Ｓ１８（ＲＰＳ１８）、Ｓ２３（ＲＰＳ２３）、Ｓ２４（ＲＰＳ２４）、Ｓ２７ａ（ＲＰＳ２７Ａ）、Ｓ３１（ＲＰＳ３１）、ＳＭ、大型リボソームタンパク質ＰＯ（ＲＰＬＰＯ）、フラビン還元酵素（ＢＬＶＲＢ）、フェロケラターゼ（ＦＥＣＨ）、ミオシン軽タンパク質（ＭＹＬ４）、シヌクレイックα（ＳＮＣＡ）、δーアミノレブリン酸シンテターゼ２（ＡＬＳＡ２）、セレン結合タンパク質１（ＳＥＬＥＮＢＰ１）、赤血球膜タンパク質バンド４．２（ＥＰＢ４２）および赤血球膜タンパク質バンド４．９（ＥＰＢ４９）、グリコホリンＣ（ＧＹＰＣ）、抗酸化剤タンパク質２（ＡＯＰ２）、βアクチン（ＡＣＴＢ）、γアクチン１（ＡＣＴＧ１）、ビメンチン（ＶＩＭ）、脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）、真核細胞翻訳伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ｅ１）、翻訳制御１腫瘍タンパク質（ＴＰＴ１）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、フェリチン軽ポリペプチド（ＦＴＬ）、白血球レセプタークラスター（ＬＲＣ）メンバー７（ＬＥＮＧ７）、β−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、複製因子Ｃ（アクチベーター１）（ＲＦＣ１）、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ａ１（ＨＮＲＰＲ１）、フィンケル−ビスキス−ライリーネズミ肉腫ウィルス（ＦＢＲ−ＭｕＳＶ）遍在的発現物（キツネ由来）（ＦＡＵ）、ｒａｓ相同体遺伝子ファミリーメンバーＡ（ＡＲＨＡ）、コフィリン１（非筋肉）（ＣＦＬ１）、オルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素１（ＯＡＺ１）、ミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１（ＭＧＳＴ１）、早期増殖応答１（ＥＧＲ１）、ミクソロームグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ１（ＭＧＳＴ１）、ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）（ＰＰＩＡ）、癌胎児抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）、ガラクトシド結合レクチン４（ＬＧＡＬＳ４）、肝脂肪酸結合タンパク質１（ＦＡＢＰ１）、コートマータンパク質複合体サブユニットγ（イムノグロブリンλ連結３）（ＣＯＰＧ，ＩＧＬＪ３）、主要組織適合性複合体クラス１Ｂ（ＨＬＡ−Ｂ）、主要組織適合性複合体クラス１Ｃ（ＨＬＡ−Ｃ）、免疫グロブリン重μ定常物（ＩＧＨＭ）、免疫グロブリンκ定常物（ＩＧＫＣ）、溶質キャリアファミリー２５メンバー３（ＳＬＣ２５Ａ３）、Ｈ３ヒストンファミリー３Ａ（Ｈ３ＦＡ）、食道特異的正常粘膜１（ＮＭＥＳ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質８（ＨＳＰＡ８）、仮想タンパク質ＭＧＣ１４６９７（ＭＧＣ１４６９７）、重合体免疫グロブリンレセプター（ＰＩＧＲ）およびＦＫ５０６結合タンパク質８（ＦＫＢＰ８）、仮想タンパク質ＢＣ０１２７７５（ＬＯＣ９１３００）、寒冷ショックドメインタンパク質Ａ（ＣＳＤＡ）、Ｆ−ボックス唯一タンパク質７（ＦＢＸ０７）、ＣＧＩ−４５タンパク質（ＣＧＩ−４５）、マコリンリングフィンガータンパク質１（ＭＫＲＮ１）、小型ＥＤＲＫリッチ因子２（ＳＥＲＦ２）、ピニン（ＰＮＮ）、ＳＥＴドメイン分岐１抗酸化剤タンパク質２（ＡＯＰ２、ＳＥＴＤＢ１）、ヌクレアーゼ感受性エレメント結合タンパク質（ＮＳＥＰ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）およびユビキチンＢ（ＵＢＢ）に対する転写物からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
サンプル中の他の転写物種の遺伝子発現分析を妨害する、サンプル中の一種以上の赤血球転写物種の逆転写を阻害する工程を包含する、定量的遺伝子発現分析を増強する方法であって、該阻害が、以下：
（ａ）該サンプルに、一種以上の赤血球核酸配列特異的干渉分子を添加する工程；および、
（ｂ）該一種以上の赤血球核酸配列特異的干渉分子の存在下で、該サンプル中のＲＮＡを逆転写する工程；
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記サンプルが全血であるか、または高赤血球含量の組織より得たＲＮＡ調製物であり、該組織が必要に応じて脾臓、骨髄、胎盤、血管化腫瘍、血管様腫瘍、脂肪、肺、筋肉、膵臓、肝臓、心臓および出血性組織からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記赤血球転写物種が、リボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３Ｌ）、Ｌ６（ＲＰＬ６）、Ｌ７（ＲＰＬ７）、Ｌ７ａ（ＲＰＬ７Ａ）、Ｌ９（ＲＰＬ９）、Ｌ１０ａ（ＲＰＬ１０Ａ）、Ｌ１１（ＲＰＬ１１）、Ｌ１２（ＲＰＬ１２）、Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、Ｌ１７（ＲＰＬ１７）、Ｌ１８（ＲＰＬ１８）、Ｌ１９（ＲＰＬ１９）、Ｌ２１、Ｌ２３ａ（ＲＰＬ２３Ａ）、Ｌ２４（ＲＰＬ２４）、Ｌ２７（ＲＰＬ２７）、Ｌ２７ａ（ＲＰＬ２７Ａ）、Ｌ２８（ＲＰＬ２８）、Ｌ３０（ＲＰＬ３０）、Ｌ３１（ＲＰＬ３１）、Ｌ３２（ＲＰＬ３２）、Ｌ３４（ＲＰＬ３４）、Ｌ３５（ＲＰＬ３５）、Ｌ３７（ＲＰＬ３７）、Ｌ３７ａ（ＲＰＬ３７Ａ）、Ｌ４１（ＲＰＬ４１）、Ｓ２（ＲＰＳ２）、Ｓ３ａ（ＲＰＳ３Ａ）、Ｓ５（ＲＰＳ５）、Ｓ６（ＲＰＳ６）、Ｓ７（ＲＰＳ７）、Ｓ１０（ＲＰＳ１０）、Ｓ１１（ＲＰＳ１１）、Ｓ１３（ＲＰＳ１３）、Ｓ１６（ＲＰＳ１６）、Ｓ１７（ＲＰＳ１７）、Ｓ１８（ＲＰＳ１８）、Ｓ２３（ＲＰＳ２３）、Ｓ２４（ＲＰＳ２４）、Ｓ２７ａ（ＲＰＳ２７Ａ）、Ｓ３１（ＲＰＳ３１）、ＳＭ、大型リボソームタンパク質ＰＯ（ＲＰＬＰＯ）、フラビン還元酵素（ＢＬＶＲＢ）、フェロケラターゼ（ＦＥＣＨ）、ミオシン軽タンパク質（ＭＹＬ４）、シヌクレイックα（ＳＮＣＡ）、δーアミノレブリン酸シンテターゼ２（ＡＬＳＡ２）、セレン結合タンパク質１（ＳＥＬＥＮＢＰ１）、赤血球膜タンパク質バンド４．２（ＥＰＢ４２）および赤血球膜タンパク質バンド４．９（ＥＰＢ４９）、グリコホリンＣ（ＧＹＰＣ）、抗酸化剤タンパク質２（ＡＯＰ２）、βアクチン（ＡＣＴＢ）、γアクチン１（ＡＣＴＧ１）、ビメンチン（ＶＩＭ）、脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）、真核細胞翻訳伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ｅ１）、翻訳制御１腫瘍タンパク質（ＴＰＴ１）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、フェリチン軽ポリペプチド（ＦＴＬ）、白血球レセプタークラスター（ＬＲＣ）メンバー７（ＬＥＮＧ７）、β−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、複製因子Ｃ（アクチベーター１）（ＲＦＣ１）、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ａ１（ＨＮＲＰＲ１）、フィンケル−ビスキス−ライリーネズミ肉腫ウィルス（ＦＢＲ−ＭｕＳＶ）遍在的発現物（キツネ由来）（ＦＡＵ）、ｒａｓ相同体遺伝子ファミリーメンバーＡ（ＡＲＨＡ）、コフィリン１（非筋肉）（ＣＦＬ１）、オルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素１（ＯＡＺ１）、ミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１（ＭＧＳＴ１）、早期増殖応答１（ＥＧＲ１）、ミクソロームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１（ＭＧＳＴ１）、ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）（ＰＰＩＡ）、癌胎児抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）、ガラクトシド結合レクチン４（ＬＧＡＬＳ４）、肝脂肪酸結合タンパク質１（ＦＡＢＰ１）、コートマータンパク質複合体サブユニットγ（イムノグロブリンλ連結３）（ＣＯＰＧ，ＩＧＬＪ３）、主要組織適合性複合体クラス１Ｂ（ＨＬＡ−Ｂ）、主要組織適合性複合体クラス１Ｃ（ＨＬＡ−Ｃ）、免疫グロブリン重μ定常物（ＩＧＨＭ）、免疫グロブリンκ定常物（ＩＧＫＣ）、溶質キャリアファミリー２５メンバー３（ＳＬＣ２５Ａ３）、Ｈ３ヒストンファミリー３Ａ（Ｈ３ＦＡ）、食道特異的正常粘膜１（ＮＭＥＳ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質８（ＨＳＰＡ８）、仮想タンパク質ＭＧＣ１４６９７（ＭＧＣ１４６９７）、重合体免疫グロブリンレセプター（ＰＩＧＲ）およびＦＫ５０６結合タンパク質８（ＦＫＢＰ８）、仮想タンパク質ＢＣ０１２７７５（ＬＯＣ９１３００）、寒冷ショックドメインタンパク質Ａ（ＣＳＤＡ）、Ｆ−ボックス唯一タンパク質７（ＦＢＸ０７）、ＣＧＩ−４５タンパク質（ＣＧＩ−４５）、マコリンリングフィンガータンパク質１（ＭＫＲＮ１）、小型ＥＤＲＫリッチ因子２（ＳＥＲＦ２）、ピニン（ＰＮＮ）、ＳＥＴドメイン分岐１抗酸化剤タンパク質２（ＡＯＰ２、ＳＥＴＤＢ１）、ヌクレアーゼ感受性エレメント結合タンパク質（ＮＳＥＰ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）およびユビキチンＢ（ＵＢＢ）に対する転写物からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
細胞または組織のサンプル中の遺伝子発現を分析する改良された方法であって、該改良は、該細胞または組織のサンプルの相対的遺伝子発現プロファイルを歪める逆転写反応の前またはその間に、一種以上の転写物を除去する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記一種以上の転写物が、該一種以上の転写物を一種以上の転写物配列特異的干渉分子に接触させる工程により、または、磁気ビーズに結合させた一種以上の転写物配列特異的核酸分子とハイブリダイズさせる工程により除去され、該一種以上の転写物配列特異的干渉分子が、細胞または組織のサンプルの相対的遺伝子発現プロファイルを歪める該一種以上の転写物の逆転写をブロックし得る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記改良が、遺伝子発現プロファイルを得る工程をさらに包含し、ここで得られる検出可能な遺伝子の数は、望ましくない転写物の逆転写が阻害されない場合に得られる検出可能な遺伝子の数よりも大きい、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
核酸増幅プロセスの間に、ＲＮＡを含有するサンプル中の一種以上のグロビンｍＲＮＡ分子の増幅を阻害するための方法であって、以下：
（ａ）該サンプルに、一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子を添加する工程；および、
（ｂ）該一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子の存在下で、該サンプル中の該ＲＮＡを増幅する工程；
を包含する、方法。
【請求項２１】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、αグロビン、βグロビン、γグロビン、δグロビン、θグロビンおよびζグロビンならびにそれらの改変体からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルが、全血から、または高赤血球含量の組織から得たＲＮＡ調製物であり、該組織が、必要に応じて脾臓、骨髄、胎盤、血管化腫瘍、血管様腫瘍、脂肪、肺、筋肉、膵臓、肝臓、心臓および出血性組織からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡ、グロビンｃＤＮＡまたはグロビンｃＲＮＡに対する相補性を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、逆転写酵素またはＲＮＡポリメラーゼの反応に干渉する工程によりグロビンｍＲＮＡの増幅を阻害する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡのグロビンｃＤＮＡへの逆転写をブロックし、そして／または、グロビンｃＲＮＡの重合、もしくはグロビンｃＤＮＡからのｃＤＮＡの第２鎖の重合をブロックする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、修飾および未修飾のアンチセンス分子および三重鎖形成オリゴマーからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記修飾アンチセンス分子が、前記グロビンｍＲＮＡの切断を生じる窒素性塩基（複素環）修飾、糖修飾、骨格修飾、末端修飾および機能的修飾からなる群より選択される一種以上の修飾を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記一種以上の糖修飾が、２’Ｏ−アルキル修飾および２’Ｏ−ハロゲン化物修飾、炭素環糖模倣物および２環式の糖からなる群より選択され、前記一種以上の骨格修飾が、ホスホロチオエート修飾、ジホスホロチオエート修飾、ホスホロアミデート修飾およびメチルホスホネート修飾、ＰＮＡ、２’−５’連結オリゴマー、α−連結オリゴマー、ボラノ−ホスフェート修飾オリゴマー、キメラオリゴマー、アニオン性の骨格構造、カチオン性の骨格構造および中性の骨格構造からなる群より選択され、前記機能的修飾が、ＲＮＡｓｅ付加、リボザイム付加、活性化されるとグロビンｍＲＮＡを切断し得る化学基の付加、および分子をロックダウンすることにより逆転写酵素またはポリメラーゼが分子を融解してグロビンＲＮＡを放出することを防ぐ結合からなる群より選択され、前記化学基の結合が必要に応じてアルドール化剤、アルキル化剤、ソラレンおよびＥＤＴＡからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡまたはｃＲＮＡの分解または切断を支援する工程によりグロビンｍＲＮＡの増幅を阻害し、該分解または切断は、必要に応じてＲＮＡｓｅ活性によるか、または、リボザイム活性により引き起こされる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡまたはｃＲＮＡの分解または切断を支援するためにさらに使用される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、ヒト、ラット、ネズミ、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、 ヒツジおよびニワトリからなる群より選択される種に由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号３４からなる群より選択されるヒトαグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１９および配列番号４４からなる群より選択されるヒトβグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群より選択されるヒトγグロビンｍＲＮＡ分子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９からなる群より選択されるラットαグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群より選択されるラットβグロビンｍＲＮＡ分子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＲＮＡが、遺伝子発現プロファイルを得るために使用され、該遺伝子発現プロファイルは、前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子の非存在下において得られる遺伝子発現プロファイルと比較して改良されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子を備える、核酸増幅プロセスの間にＲＮＡを含有するサンプル中の一種以上のグロビンｍＲＮＡ分子の増幅を阻害するためのキット。
【請求項３６】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、αグロビン、βグロビン、γグロビン、δグロビン、θグロビンおよびζグロビンからなる群より選択される、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡ、グロビンｃＤＮＡまたはグロビンｃＲＮＡに対する相補性を有する、請求項３５に記載のキット。
【請求項３８】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、逆転写酵素またはＲＮＡポリメラーゼの反応を干渉する工程により、グロビンｍＲＮＡの増幅を阻害する、請求項３５に記載のキット。
【請求項３９】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡのグロビンｃＤＮＡへの逆転写をブロックし、そして／または、グロビンｃＲＮＡの重合、もしくはグロビンｃＤＮＡからのｃＤＮＡ第２鎖の重合をブロックする、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、修飾および未修飾のアンチセンス分子ならびに三重鎖形成オリゴマーからなる群より選択される、請求項３５に記載のキット。
【請求項４１】
前記修飾アンチセンス分子が、前記グロビンｍＲＮＡの切断を生じる窒素性塩基（複素環）修飾、糖修飾、骨格修飾、末端修飾および機能的修飾からなる群より選択される一種以上の修飾を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記一種以上の糖修飾が、２’Ｏ−アルキルおよび２’Ｏ−ハロゲン化物修飾、炭素環糖模倣物および２環式の糖からなる群より選択され、前記一種以上の骨格修飾が、ホスホロチオエート修飾、ジホスホロチオエート修飾、ホスホロアミデート修飾およびメチルホスホネート修飾、ＰＮＡ、２’−５’連結オリゴマー、α−連結オリゴマー、ボラノ−ホスフェート修飾オリゴマー、キメラオリゴマー、アニオン性の骨格構造、カチオン性の骨格構造および中性の骨格構造からなる群より選択され、前記機能的修飾が、ＲＮＡｓｅ付加、リボザイム付加および活性化されるとグロビンｍＲＮＡを切断し得る化学基の付加からなる群より選択され、前記化学基の結合が、必要に応じてアルドール化剤、アルキル化剤、ソラレンおよびＥＤＴＡからなる群より選択される、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡまたはｃＲＮＡの分解または切断を支援する工程によりグロビンｍＲＮＡの増幅を阻害し、該分解または切断は、必要に応じてＲＮＡｓｅ活性によるか、または、リボザイム活性により引き起こされる、請求項３７に記載のキット。
【請求項４４】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡまたはｃＲＮＡの分解または切断を支援するためにさらに使用される、請求項３８に記載のキット。
【請求項４５】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、ヒト、ラット、ネズミ、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、 ヒツジおよびニワトリからなる群より選択される種に由来する、請求項３５に記載のキット。
【請求項４６】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号３４からなる群より選択されるヒトαグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１９および配列番号４４からなる群より選択されるヒトβグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群より選択されるヒトγグロビンｍＲＮＡ分子である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９からなる群より選択されるラットαグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群より選択されるラットβグロビンｍＲＮＡ分子である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４８】
細胞または組織のサンプルの相対的遺伝子発現プロファイルを歪める一種以上の転写物の配列に対して特異的な一種以上の干渉分子を含む、細胞または組織のサンプルの改良された遺伝子発現プロファイルを得るために有用な組成物。
【請求項４９】
前記一種以上の干渉分子が、前記一種以上の転写物と少なくとも９０％同一であるか、または、該一種以上の転写物に相補的な核酸と少なくとも９０％同一である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記サンプルが全血であり、そして前記一種以上の転写物が赤血球転写物である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
前記一種以上の赤血球転写物がグロビン転写物であり、そして該一種以上のグロビン転写物が、必要に応じてαグロビン、βグロビン、γグロビン、δグロビン、θグロビンおよびζグロビンならびにそれらの改変体からなる群より選択される、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記一種以上の干渉分子が、修飾および未修飾のアンチセンス分子および三重鎖形成オリゴマーからなる群より選択される、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５３】
前記修飾アンチセンス分子が、前記グロビンｍＲＮＡの切断を生じる窒素性塩基（複素環）修飾、糖修飾、骨格修飾、末端修飾および機能的修飾からなる群より選択される一種以上の修飾を含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記一種以上の糖修飾が、２’Ｏ−アルキルおよび２’Ｏ−ハロゲン化物修飾、炭素環糖模倣物および２環式の糖からなる群より選択され、前記一種以上の骨格修飾が、ホスホロチオエート修飾、ジホスホロチオエート修飾、ホスホロアミデート修飾およびメチルホスホネート修飾、ＰＮＡ、２’−５’連結オリゴマー、α−連結オリゴマー、ボラノ−ホスフェート修飾オリゴマー、キメラオリゴマー、アニオン性の骨格構造、カチオン性の骨格構造および中性の骨格構造からなる群より選択され、前記機能的修飾が、ＲＮＡｓｅ付加、リボザイム付加、活性化されるとグロビンｍＲＮＡを切断し得る化学基の付加および分子をロックダウンすることにより逆転写酵素またはポリメラーゼが分子を融解してグロビンＲＮＡを放出することを防ぐ付加からなる群より選択され、前記化学基の結合が、必要に応じてアルドール化剤、アルキル化剤、ソラレンおよびＥＤＴＡからなる群より選択される、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記一種以上の干渉分子が、グロビンｍＲＮＡ、グロビンｃＤＮＡまたはグロビンｃＲＮＡに対する相補性を有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５６】
前記一種以上の干渉分子が、グロビンｍＲＮＡまたはｃＲＮＡの分解または切断を支援する工程によりグロビンｍＲＮＡの増幅を阻害し、該分解または切断は、必要に応じてＲＮＡｓｅ活性によるか、または、リボザイム活性により引き起こされる、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、ヒト、ラット、ネズミ、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、 ヒツジおよびニワトリからなる群より選択される種に由来する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５８】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号３４からなる群より選択されるヒトαグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１９および配列番号４４からなる群より選択されるヒトβグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群より選択されるヒトγグロビンｍＲＮＡ分子である、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９からなる群より選択されるラットαグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群より選択されるラットβグロビンｍＲＮＡ分子である、請求項５７に記載の組成物。
【請求項６０】
前記配列特異的干渉分子が、ｍＲＮＡの逆転写を実質的にブロックする遺伝子特異的プライマーである、請求項１、５、９、１４または２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記プライマーが高Ｇ／Ｃ含量を有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記プライマーが、逆転写酵素により３’方向に伸長され、転写開始プライマーからのｃＤＮＡ鎖の合成をブロックする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記配列特異的干渉分子が、ｍＲＮＡの逆転写を実質的にブロックする遺伝子特異的プライマーである、請求項３５に記載のキット。
【請求項６４】
前記プライマーが高Ｇ／Ｃ含量を有する、請求項６３に記載のキット。
【請求項６５】
前記プライマーが、逆転写酵素により３’方向に伸長され、転写開始プライマーからのｃＤＮＡ鎖の合成をブロックする、請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
前記干渉分子が、前記一種以上の転写物の逆転写を実質的にブロックする遺伝子特異的プライマーである、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６７】
前記プライマーが高Ｇ／Ｃ含量を有する、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記プライマーが、逆転写酵素により３’方向に伸長され、転写開始プライマーからのｃＤＮＡ鎖の合成をブロックする、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記増幅が前記転写物種の逆転写を含む、請求項１、５、１４または２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
高赤血球含量を有する血液または組織のサンプルの遺伝子発現分析を改良する方法であって、以下：
（ａ）該血液または組織からＲＮＡのサンプルを得る工程；
（ｂ）該サンプルに、一種以上の赤血球（ＲＢＣ）核酸配列特異的干渉分子を添加する工程；
（ｃ）該サンプル中のＲＮＡ転写物を増幅する工程；および、
（ｄ）該サンプルの遺伝子発現プロファイルを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記一種以上のＲＢＣ核酸配列特異的干渉分子が、ｃＤＮＡへの一種以上のＲＢＣ ｍＲＮＡ転写物種の逆転写をブロックする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血液または組織が全血である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記一種以上のＲＢＣ ｍＲＮＡ転写物種がグロビンであり、そして、前記一種以上のＲＢＣ核酸配列特異的干渉分子がグロビン核酸配列特異的干渉分子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡを含有するサンプル中の一種以上のＲＢＣ ＲＮＡ転写物種の核酸増幅プロセスの間に増幅を阻害する方法であって、以下：
（ａ）該サンプルに一種以上のＲＢＣ核酸配列特異的干渉分子を添加する工程；および、
（ｂ）該サンプル中のＲＮＡ転写物を増幅する工程；
を包含する、方法。
【請求項６】
前記一種以上のＲＢＣ核酸配列特異的干渉分子が、ｃＤＮＡへの一種以上のＲＢＣ ｍＲＮＡ転写物種の逆転写をブロックする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが全血から得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記一種以上のＲＢＣ ｍＲＮＡ転写物種がグロビンであり、そして、前記一種以上のＲＢＣ核酸配列特異的干渉分子がグロビン核酸配列特異的干渉分子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
サンプル中の他の転写物種の遺伝子発現分析を妨害する、サンプル中の一種以上の赤血球ＲＮＡ転写物種の増幅を阻害する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルに、一種以上の赤血球核酸配列特異的干渉分子を添加する工程；および、
（ｂ）一種以上の該赤血球核酸配列特異的干渉分子の存在下で、該サンプル中の転写物を増幅する工程；
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記増幅が前記転写物種の逆転写を包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルが全血であるか、または高赤血球含量の組織より得られたＲＮＡ調製物であり、該組織が必要に応じて脾臓、骨髄、胎盤、血管化腫瘍、血管様腫瘍、脂肪、肺、筋肉、膵臓、心臓、肝臓および出血性組織からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子発現分析が定量的である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記赤血球転写物種が、リボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３Ｌ）、Ｌ６（ＲＰＬ６）、Ｌ７（ＲＰＬ７）、Ｌ７ａ（ＲＰＬ７Ａ）、Ｌ９（ＲＰＬ９）、Ｌ１０ａ（ＲＰＬ１０Ａ）、Ｌ１１（ＲＰＬ１１）、Ｌ１２（ＲＰＬ１２）、Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、Ｌ１７（ＲＰＬ１７）、Ｌ１８（ＲＰＬ１８）、Ｌ１９（ＲＰＬ１９）、Ｌ２１、Ｌ２３ａ（ＲＰＬ２３Ａ）、Ｌ２４（ＲＰＬ２４）、Ｌ２７（ＲＰＬ２７）、Ｌ２７ａ（ＲＰＬ２７Ａ）、Ｌ２８（ＲＰＬ２８）、Ｌ３０（ＲＰＬ３０）、Ｌ３１（ＲＰＬ３１）、Ｌ３２（ＲＰＬ３２）、Ｌ３４（ＲＰＬ３４）、Ｌ３５（ＲＰＬ３５）、Ｌ３７（ＲＰＬ３７）、Ｌ３７ａ（ＲＰＬ３７Ａ）、Ｌ４１（ＲＰＬ４１）、Ｓ２（ＲＰＳ２）、Ｓ３ａ（ＲＰＳ３Ａ）、Ｓ５（ＲＰＳ５）、Ｓ６（ＲＰＳ６）、Ｓ７（ＲＰＳ７）、Ｓ１０（ＲＰＳ１０）、Ｓ１１（ＲＰＳ１１）、Ｓ１３（ＲＰＳ１３）、Ｓ１６（ＲＰＳ１６）、Ｓ１７（ＲＰＳ１７）、Ｓ１８（ＲＰＳ１８）、Ｓ２３（ＲＰＳ２３）、Ｓ２４（ＲＰＳ２４）、Ｓ２７ａ（ＲＰＳ２７Ａ）、Ｓ３１（ＲＰＳ３１）、ＳＭ、大型リボソームタンパク質ＰＯ（ＲＰＬＰＯ）、フラビン還元酵素（ＢＬＶＲＢ）、フェロケラターゼ（ＦＥＣＨ）、ミオシン軽タンパク質（ＭＹＬ４）、シヌクレイックα（ＳＮＣＡ）、δーアミノレブリン酸シンテターゼ２（ＡＬＳＡ２）、セレン結合タンパク質１（ＳＥＬＥＮＢＰ１）、赤血球膜タンパク質バンド４．２（ＥＰＢ４２）および赤血球膜タンパク質バンド４．９（ＥＰＢ４９）、グリコホリンＣ（ＧＹＰＣ）、抗酸化剤タンパク質２（ＡＯＰ２）、βアクチン（ＡＣＴＢ）、γアクチン１（ＡＣＴＧ１）、ビメンチン（ＶＩＭ）、脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）、真核細胞翻訳伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ｅ１）、翻訳制御１腫瘍タンパク質（ＴＰＴ１）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、フェリチン軽ポリペプチド（ＦＴＬ）、白血球レセプタークラスター（ＬＲＣ）メンバー７（ＬＥＮＧ７）、β−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、複製因子Ｃ（アクチベーター１）（ＲＦＣ１）、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ａ１（ＨＮＲＰＲ１）、フィンケル−ビスキス−ライリーネズミ肉腫ウィルス（ＦＢＲ−ＭｕＳＶ）遍在的発現物（キツネ由来）（ＦＡＵ）、ｒａｓ相同体遺伝子ファミリーメンバーＡ（ＡＲＨＡ）、コフィリン１（非筋肉）（ＣＦＬ１）、オルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素１（ＯＡＺ１）、ミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１（ＭＧＳＴ１）、早期増殖応答１（ＥＧＲ１）、ミクソロームグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ１（ＭＧＳＴ１）、ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）（ＰＰＩＡ）、癌胎児抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）、ガラクトシド結合レクチン４（ＬＧＡＬＳ４）、肝脂肪酸結合タンパク質１（ＦＡＢＰ１）、コートマータンパク質複合体サブユニットγ（イムノグロブリンλ連結３）（ＣＯＰＧ，ＩＧＬＪ３）、主要組織適合性複合体クラス１Ｂ（ＨＬＡ−Ｂ）、主要組織適合性複合体クラス１Ｃ（ＨＬＡ−Ｃ）、免疫グロブリン重μ定常物（ＩＧＨＭ）、免疫グロブリンκ定常物（ＩＧＫＣ）、溶質キャリアファミリー２５メンバー３（ＳＬＣ２５Ａ３）、Ｈ３ヒストンファミリー３Ａ（Ｈ３ＦＡ）、食道特異的正常粘膜１（ＮＭＥＳ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質８（ＨＳＰＡ８）、仮想タンパク質ＭＧＣ１４６９７（ＭＧＣ１４６９７）、重合体免疫グロブリンレセプター（ＰＩＧＲ）およびＦＫ５０６結合タンパク質８（ＦＫＢＰ８）、仮想タンパク質ＢＣ０１２７７５（ＬＯＣ９１３００）、寒冷ショックドメインタンパク質Ａ（ＣＳＤＡ）、Ｆ−ボックス唯一タンパク質７（ＦＢＸ０７）、ＣＧＩ−４５タンパク質（ＣＧＩ−４５）、マコリンリングフィンガータンパク質１（ＭＫＲＮ１）、小型ＥＤＲＫリッチ因子２（ＳＥＲＦ２）、ピニン（ＰＮＮ）、ＳＥＴドメイン分岐１抗酸化剤タンパク質２（ＡＯＰ２、ＳＥＴＤＢ１）、ヌクレアーゼ感受性エレメント結合タンパク質（ＮＳＥＰ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）およびユビキチンＢ（ＵＢＢ）に対する転写物からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
サンプル中の他の転写物種の遺伝子発現分析を妨害する、サンプル中の一種以上の赤血球転写物種の逆転写を阻害する工程を包含する、定量的遺伝子発現分析を増強する方法であって、該阻害が、以下：
（ａ）該サンプルに、一種以上の赤血球核酸配列特異的干渉分子を添加する工程；および、
（ｂ）該一種以上の赤血球核酸配列特異的干渉分子の存在下で、該サンプル中のＲＮＡを逆転写する工程；
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記サンプルが全血であるか、または高赤血球含量の組織より得たＲＮＡ調製物であり、該組織が必要に応じて脾臓、骨髄、胎盤、血管化腫瘍、血管様腫瘍、脂肪、肺、筋肉、膵臓、肝臓、心臓および出血性組織からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記赤血球転写物種が、リボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３Ｌ）、Ｌ６（ＲＰＬ６）、Ｌ７（ＲＰＬ７）、Ｌ７ａ（ＲＰＬ７Ａ）、Ｌ９（ＲＰＬ９）、Ｌ１０ａ（ＲＰＬ１０Ａ）、Ｌ１１（ＲＰＬ１１）、Ｌ１２（ＲＰＬ１２）、Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、Ｌ１７（ＲＰＬ１７）、Ｌ１８（ＲＰＬ１８）、Ｌ１９（ＲＰＬ１９）、Ｌ２１、Ｌ２３ａ（ＲＰＬ２３Ａ）、Ｌ２４（ＲＰＬ２４）、Ｌ２７（ＲＰＬ２７）、Ｌ２７ａ（ＲＰＬ２７Ａ）、Ｌ２８（ＲＰＬ２８）、Ｌ３０（ＲＰＬ３０）、Ｌ３１（ＲＰＬ３１）、Ｌ３２（ＲＰＬ３２）、Ｌ３４（ＲＰＬ３４）、Ｌ３５（ＲＰＬ３５）、Ｌ３７（ＲＰＬ３７）、Ｌ３７ａ（ＲＰＬ３７Ａ）、Ｌ４１（ＲＰＬ４１）、Ｓ２（ＲＰＳ２）、Ｓ３ａ（ＲＰＳ３Ａ）、Ｓ５（ＲＰＳ５）、Ｓ６（ＲＰＳ６）、Ｓ７（ＲＰＳ７）、Ｓ１０（ＲＰＳ１０）、Ｓ１１（ＲＰＳ１１）、Ｓ１３（ＲＰＳ１３）、Ｓ１６（ＲＰＳ１６）、Ｓ１７（ＲＰＳ１７）、Ｓ１８（ＲＰＳ１８）、Ｓ２３（ＲＰＳ２３）、Ｓ２４（ＲＰＳ２４）、Ｓ２７ａ（ＲＰＳ２７Ａ）、Ｓ３１（ＲＰＳ３１）、ＳＭ、大型リボソームタンパク質ＰＯ（ＲＰＬＰＯ）、フラビン還元酵素（ＢＬＶＲＢ）、フェロケラターゼ（ＦＥＣＨ）、ミオシン軽タンパク質（ＭＹＬ４）、シヌクレイックα（ＳＮＣＡ）、δーアミノレブリン酸シンテターゼ２（ＡＬＳＡ２）、セレン結合タンパク質１（ＳＥＬＥＮＢＰ１）、赤血球膜タンパク質バンド４．２（ＥＰＢ４２）および赤血球膜タンパク質バンド４．９（ＥＰＢ４９）、グリコホリンＣ（ＧＹＰＣ）、抗酸化剤タンパク質２（ＡＯＰ２）、βアクチン（ＡＣＴＢ）、γアクチン１（ＡＣＴＧ１）、ビメンチン（ＶＩＭ）、脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）、真核細胞翻訳伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ｅ１）、翻訳制御１腫瘍タンパク質（ＴＰＴ１）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、フェリチン軽ポリペプチド（ＦＴＬ）、白血球レセプタークラスター（ＬＲＣ）メンバー７（ＬＥＮＧ７）、β−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、複製因子Ｃ（アクチベーター１）（ＲＦＣ１）、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ａ１（ＨＮＲＰＲ１）、フィンケル−ビスキス−ライリーネズミ肉腫ウィルス（ＦＢＲ−ＭｕＳＶ）遍在的発現物（キツネ由来）（ＦＡＵ）、ｒａｓ相同体遺伝子ファミリーメンバーＡ（ＡＲＨＡ）、コフィリン１（非筋肉）（ＣＦＬ１）、オルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素１（ＯＡＺ１）、ミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１（ＭＧＳＴ１）、早期増殖応答１（ＥＧＲ１）、ミクソロームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１（ＭＧＳＴ１）、ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）（ＰＰＩＡ）、癌胎児抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）、ガラクトシド結合レクチン４（ＬＧＡＬＳ４）、肝脂肪酸結合タンパク質１（ＦＡＢＰ１）、コートマータンパク質複合体サブユニットγ（イムノグロブリンλ連結３）（ＣＯＰＧ，ＩＧＬＪ３）、主要組織適合性複合体クラス１Ｂ（ＨＬＡ−Ｂ）、主要組織適合性複合体クラス１Ｃ（ＨＬＡ−Ｃ）、免疫グロブリン重μ定常物（ＩＧＨＭ）、免疫グロブリンκ定常物（ＩＧＫＣ）、溶質キャリアファミリー２５メンバー３（ＳＬＣ２５Ａ３）、Ｈ３ヒストンファミリー３Ａ（Ｈ３ＦＡ）、食道特異的正常粘膜１（ＮＭＥＳ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質８（ＨＳＰＡ８）、仮想タンパク質ＭＧＣ１４６９７（ＭＧＣ１４６９７）、重合体免疫グロブリンレセプター（ＰＩＧＲ）およびＦＫ５０６結合タンパク質８（ＦＫＢＰ８）、仮想タンパク質ＢＣ０１２７７５（ＬＯＣ９１３００）、寒冷ショックドメインタンパク質Ａ（ＣＳＤＡ）、Ｆ−ボックス唯一タンパク質７（ＦＢＸ０７）、ＣＧＩ−４５タンパク質（ＣＧＩ−４５）、マコリンリングフィンガータンパク質１（ＭＫＲＮ１）、小型ＥＤＲＫリッチ因子２（ＳＥＲＦ２）、ピニン（ＰＮＮ）、ＳＥＴドメイン分岐１抗酸化剤タンパク質２（ＡＯＰ２、ＳＥＴＤＢ１）、ヌクレアーゼ感受性エレメント結合タンパク質（ＮＳＥＰ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）およびユビキチンＢ（ＵＢＢ）に対する転写物からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
細胞または組織のサンプル中の遺伝子発現を分析する改良された方法であって、該改良は、該細胞または組織のサンプルの相対的遺伝子発現プロファイルを歪める逆転写反応の前またはその間に、一種以上の転写物を除去する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記一種以上の転写物が、該一種以上の転写物を一種以上の転写物配列特異的干渉分子に接触させる工程により、または、磁気ビーズに結合させた一種以上の転写物配列特異的核酸分子とハイブリダイズさせる工程により除去され、該一種以上の転写物配列特異的干渉分子が、細胞または組織のサンプルの相対的遺伝子発現プロファイルを歪める該一種以上の転写物の逆転写をブロックし得る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記改良が、遺伝子発現プロファイルを得る工程をさらに包含し、ここで得られる検出可能な遺伝子の数は、望ましくない転写物の逆転写が阻害されない場合に得られる検出可能な遺伝子の数よりも大きい、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
核酸増幅プロセスの間に、ＲＮＡを含有するサンプル中の一種以上のグロビンｍＲＮＡ分子の増幅を阻害するための方法であって、以下：
（ａ）該サンプルに、一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子を添加する工程；および、
（ｂ）該一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子の存在下で、該サンプル中の該ＲＮＡを増幅する工程；
を包含する、方法。
【請求項２１】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、αグロビン、βグロビン、γグロビン、δグロビン、θグロビンおよびζグロビンならびにそれらの改変体からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルが、全血から、または高赤血球含量の組織から得たＲＮＡ調製物であり、該組織が、必要に応じて脾臓、骨髄、胎盤、血管化腫瘍、血管様腫瘍、脂肪、肺、筋肉、膵臓、肝臓、心臓および出血性組織からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡ、グロビンｃＤＮＡまたはグロビンｃＲＮＡに対する相補性を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、逆転写酵素またはＲＮＡポリメラーゼの反応に干渉する工程によりグロビンｍＲＮＡの増幅を阻害する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡのグロビンｃＤＮＡへの逆転写をブロックし、そして／または、グロビンｃＲＮＡの重合、もしくはグロビンｃＤＮＡからのｃＤＮＡの第２鎖の重合をブロックする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、修飾および未修飾のアンチセンス分子および三重鎖形成オリゴマーからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記修飾アンチセンス分子が、前記グロビンｍＲＮＡの切断を生じる窒素性塩基（複素環）修飾、糖修飾、骨格修飾、末端修飾および機能的修飾からなる群より選択される一種以上の修飾を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記一種以上の糖修飾が、２’Ｏ−アルキル修飾および２’Ｏ−ハロゲン化物修飾、炭素環糖模倣物および２環式の糖からなる群より選択され、前記一種以上の骨格修飾が、ホスホロチオエート修飾、ジホスホロチオエート修飾、ホスホロアミデート修飾およびメチルホスホネート修飾、ＰＮＡ、２’−５’連結オリゴマー、α−連結オリゴマー、ボラノ−ホスフェート修飾オリゴマー、キメラオリゴマー、アニオン性の骨格構造、カチオン性の骨格構造および中性の骨格構造からなる群より選択され、前記機能的修飾が、ＲＮＡｓｅ付加、リボザイム付加、活性化されるとグロビンｍＲＮＡを切断し得る化学基の付加、および分子をロックダウンすることにより逆転写酵素またはポリメラーゼが分子を融解してグロビンＲＮＡを放出することを防ぐ結合からなる群より選択され、前記化学基の結合が必要に応じてアルドール化剤、アルキル化剤、ソラレンおよびＥＤＴＡからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡまたはｃＲＮＡの分解または切断を支援する工程によりグロビンｍＲＮＡの増幅を阻害し、該分解または切断は、必要に応じてＲＮＡｓｅ活性によるか、または、リボザイム活性により引き起こされる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡまたはｃＲＮＡの分解または切断を支援するためにさらに使用される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、ヒト、ラット、ネズミ、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、 ヒツジおよびニワトリからなる群より選択される種に由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号３４からなる群より選択されるヒトαグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１９および配列番号４４からなる群より選択されるヒトβグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群より選択されるヒトγグロビンｍＲＮＡ分子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９からなる群より選択されるラットαグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群より選択されるラットβグロビンｍＲＮＡ分子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＲＮＡが、遺伝子発現プロファイルを得るために使用され、該遺伝子発現プロファイルは、前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子の非存在下において得られる遺伝子発現プロファイルと比較して改良されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子を備える、核酸増幅プロセスの間にＲＮＡを含有するサンプル中の一種以上のグロビンｍＲＮＡ分子の増幅を阻害するためのキット。
【請求項３６】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、αグロビン、βグロビン、γグロビン、δグロビン、θグロビンおよびζグロビンからなる群より選択される、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡ、グロビンｃＤＮＡまたはグロビンｃＲＮＡに対する相補性を有する、請求項３５に記載のキット。
【請求項３８】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、逆転写酵素またはＲＮＡポリメラーゼの反応を干渉する工程により、グロビンｍＲＮＡの増幅を阻害する、請求項３５に記載のキット。
【請求項３９】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡのグロビンｃＤＮＡへの逆転写をブロックし、そして／または、グロビンｃＲＮＡの重合、もしくはグロビンｃＤＮＡからのｃＤＮＡ第２鎖の重合をブロックする、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、修飾および未修飾のアンチセンス分子ならびに三重鎖形成オリゴマーからなる群より選択される、請求項３５に記載のキット。
【請求項４１】
前記修飾アンチセンス分子が、前記グロビンｍＲＮＡの切断を生じる窒素性塩基（複素環）修飾、糖修飾、骨格修飾、末端修飾および機能的修飾からなる群より選択される一種以上の修飾を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記一種以上の糖修飾が、２’Ｏ−アルキルおよび２’Ｏ−ハロゲン化物修飾、炭素環糖模倣物および２環式の糖からなる群より選択され、前記一種以上の骨格修飾が、ホスホロチオエート修飾、ジホスホロチオエート修飾、ホスホロアミデート修飾およびメチルホスホネート修飾、ＰＮＡ、２’−５’連結オリゴマー、α−連結オリゴマー、ボラノ−ホスフェート修飾オリゴマー、キメラオリゴマー、アニオン性の骨格構造、カチオン性の骨格構造および中性の骨格構造からなる群より選択され、前記機能的修飾が、ＲＮＡｓｅ付加、リボザイム付加および活性化されるとグロビンｍＲＮＡを切断し得る化学基の付加からなる群より選択され、前記化学基の結合が、必要に応じてアルドール化剤、アルキル化剤、ソラレンおよびＥＤＴＡからなる群より選択される、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡまたはｃＲＮＡの分解または切断を支援する工程によりグロビンｍＲＮＡの増幅を阻害し、該分解または切断は、必要に応じてＲＮＡｓｅ活性によるか、または、リボザイム活性により引き起こされる、請求項３７に記載のキット。
【請求項４４】
前記一種以上のグロビン核酸配列特異的干渉分子が、グロビンｍＲＮＡまたはｃＲＮＡの分解または切断を支援するためにさらに使用される、請求項３８に記載のキット。
【請求項４５】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、ヒト、ラット、ネズミ、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、 ヒツジおよびニワトリからなる群より選択される種に由来する、請求項３５に記載のキット。
【請求項４６】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号３４からなる群より選択されるヒトαグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１９および配列番号４４からなる群より選択されるヒトβグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群より選択されるヒトγグロビンｍＲＮＡ分子である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９からなる群より選択されるラットαグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群より選択されるラットβグロビンｍＲＮＡ分子である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４８】
細胞または組織のサンプルの相対的遺伝子発現プロファイルを歪める一種以上の転写物の配列に対して特異的な一種以上の干渉分子を含む、細胞または組織のサンプルの改良された遺伝子発現プロファイルを得るために有用な組成物。
【請求項４９】
前記一種以上の干渉分子が、前記一種以上の転写物と少なくとも９０％同一であるか、または、該一種以上の転写物に相補的な核酸と少なくとも９０％同一である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記サンプルが全血であり、そして前記一種以上の転写物が赤血球転写物である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
前記一種以上の赤血球転写物がグロビン転写物であり、そして該一種以上のグロビン転写物が、必要に応じてαグロビン、βグロビン、γグロビン、δグロビン、θグロビンおよびζグロビンならびにそれらの改変体からなる群より選択される、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記一種以上の干渉分子が、修飾および未修飾のアンチセンス分子および三重鎖形成オリゴマーからなる群より選択される、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５３】
前記修飾アンチセンス分子が、前記グロビンｍＲＮＡの切断を生じる窒素性塩基（複素環）修飾、糖修飾、骨格修飾、末端修飾および機能的修飾からなる群より選択される一種以上の修飾を含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記一種以上の糖修飾が、２’Ｏ−アルキルおよび２’Ｏ−ハロゲン化物修飾、炭素環糖模倣物および２環式の糖からなる群より選択され、前記一種以上の骨格修飾が、ホスホロチオエート修飾、ジホスホロチオエート修飾、ホスホロアミデート修飾およびメチルホスホネート修飾、ＰＮＡ、２’−５’連結オリゴマー、α−連結オリゴマー、ボラノ−ホスフェート修飾オリゴマー、キメラオリゴマー、アニオン性の骨格構造、カチオン性の骨格構造および中性の骨格構造からなる群より選択され、前記機能的修飾が、ＲＮＡｓｅ付加、リボザイム付加、活性化されるとグロビンｍＲＮＡを切断し得る化学基の付加および分子をロックダウンすることにより逆転写酵素またはポリメラーゼが分子を融解してグロビンＲＮＡを放出することを防ぐ付加からなる群より選択され、前記化学基の結合が、必要に応じてアルドール化剤、アルキル化剤、ソラレンおよびＥＤＴＡからなる群より選択される、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記一種以上の干渉分子が、グロビンｍＲＮＡ、グロビンｃＤＮＡまたはグロビンｃＲＮＡに対する相補性を有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５６】
前記一種以上の干渉分子が、グロビンｍＲＮＡまたはｃＲＮＡの分解または切断を支援する工程によりグロビンｍＲＮＡの増幅を阻害し、該分解または切断は、必要に応じてＲＮＡｓｅ活性によるか、または、リボザイム活性により引き起こされる、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、ヒト、ラット、ネズミ、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、 ヒツジおよびニワトリからなる群より選択される種に由来する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５８】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号３４からなる群より選択されるヒトαグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１９および配列番号４４からなる群より選択されるヒトβグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群より選択されるヒトγグロビンｍＲＮＡ分子である、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記グロビンｍＲＮＡ分子が、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９からなる群より選択されるラットαグロビンｍＲＮＡ分子、ならびに／または、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群より選択されるラットβグロビンｍＲＮＡ分子である、請求項５７に記載の組成物。
【請求項６０】
前記配列特異的干渉分子が、ｍＲＮＡの逆転写を実質的にブロックする遺伝子特異的プライマーである、請求項１、５、９、１４または２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記プライマーが高Ｇ／Ｃ含量を有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記プライマーが、逆転写酵素により３’方向に伸長され、転写開始プライマーからのｃＤＮＡ鎖の合成をブロックする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記配列特異的干渉分子が、ｍＲＮＡの逆転写を実質的にブロックする遺伝子特異的プライマーである、請求項３５に記載のキット。
【請求項６４】
前記プライマーが高Ｇ／Ｃ含量を有する、請求項６３に記載のキット。
【請求項６５】
前記プライマーが、逆転写酵素により３’方向に伸長され、転写開始プライマーからのｃＤＮＡ鎖の合成をブロックする、請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
前記干渉分子が、前記一種以上の転写物の逆転写を実質的にブロックする遺伝子特異的プライマーである、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６７】
前記プライマーが高Ｇ／Ｃ含量を有する、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記プライマーが、逆転写酵素により３’方向に伸長され、転写開始プライマーからのｃＤＮＡ鎖の合成をブロックする、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記増幅が前記転写物種の逆転写を含む、請求項１、５、１４または２０のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５００００２（Ｐ２００８−５００００２Ａ）
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１５１６５（Ｐ２００６−５１５１６５）
【出願日】平成１６年６月４日（２００４．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１７６２１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３３７０
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０４３７３７５０）ジーン ロジック インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月４日（２００４．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１７６２１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３３７０
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０４３７３７５０）ジーン ロジック インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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