遺伝子解析用基板
【課題】 新規なTAGの提供、その相補体が固定されている基板の提供など。
【解決手段】 下記の(1)〜(7)の条件を満たす少なくとも２種のオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている基板。
(1)配列長が19-25merであること。
(2)融解温度（Tm）が64.0-69.0℃であること。
(3)標的核酸の配列との類似性が50%以下であること。
(4)高次構造をとらないこと。
(5)任意の２種を選んでもヘテロダイマーを形成しないこと。
(6)同一塩基の繰り返し数が４個以下であること。
(7)GC含量が40.0-60.0%であること。
遺伝子解析法、オリゴヌクレオチド及びその相補体、それらの組合せ、並びに核酸プライマー及びプローブなども提供される。
【解決手段】 下記の(1)〜(7)の条件を満たす少なくとも２種のオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている基板。
(1)配列長が19-25merであること。
(2)融解温度（Tm）が64.0-69.0℃であること。
(3)標的核酸の配列との類似性が50%以下であること。
(4)高次構造をとらないこと。
(5)任意の２種を選んでもヘテロダイマーを形成しないこと。
(6)同一塩基の繰り返し数が４個以下であること。
(7)GC含量が40.0-60.0%であること。
遺伝子解析法、オリゴヌクレオチド及びその相補体、それらの組合せ、並びに核酸プライマー及びプローブなども提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子解析用基板に関し、より詳細には、新規なTAG配列の相補体が固定されている遺伝子解析用基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAの一塩基多型解析方法として、TAGを利用する方法、すなわち、ZipCodeタグという短いオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応を利用する方法がある（特許文献１及び非特許文献１）。この方法では、SNP部位を含むゲノムDNAの特定の断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりまず増幅する。二本鎖PCR産物を、SAPとエキソヌクレアーゼIで処置して一本鎖にし、ddNTP-FITC存在化で、SNP部位にすぐ隣接するよう設計したZipCodeタグシーケンスのオリゴヌクレオチドを末端に付加したプライマーで一塩基伸長反応を行う。このプライマーはSNP部位ごとに相補なシーケンスと異なるZipCodeタグシーケンスを付加する。そして微小ビーズに固定されたアンチセンスZipCodeタグシーケンスのオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションを行い、FITCのシグナルをフローサイトメーターで検出する。シグナルが検出されたZipCodeタグの番号からSNP部位のタイプを決定する事ができる。
【０００３】
また、同じくDNAにおける一塩基多型を解析する方法として、微小ビーズに固定したTAGを利用する方法がある（非特許文献２）。この方法では、dCTP-Biotin存在化で、SNP部位にすぐ隣接するよう設計したアンチセンスTAGシーケンスのオリゴヌクレオチドを末端に付加したプライマーでアレル特異プライマー伸長反応を行う。TAGを固定した微小ビーズとハイブリダイゼーションさせ、xMAPフローサイトメーター（Luminex）で検出している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このようにTAGを使った核酸サンプルにおける遺伝子検出、一塩基多型解析方法は公知の技術であるが、本発明は、これらのTAGとは配列が異なる新規なTAG（TAGオリゴヌクレオチド配列）を提供することを目的とする。
【０００５】
また、本発明は、新規なTAGの相補体が固定されている遺伝子解析用基板を提供することを目的とする。
【０００６】
さらに、本発明は、新規なTAGの相補体が固定されている基板を用いた遺伝子解析法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、下記の(1)〜(7)の条件を満たす少なくとも２種のオリゴヌクレオチドをTAGとして選択し、その相補体の配列の各々が固定されている基板を用いて遺伝子解析を行うことに成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明の要旨は以下の通りである。
【０００９】
（１）下記の(1)〜(7)の条件を満たす少なくとも２種のオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている基板。
(1)配列長が19-25merであること。
(2)融解温度（Tm）が64.0-69.0℃であること。
(3)標的核酸の配列との類似性が50%以下であること。
(4)高次構造をとらないこと。
(5)任意の２種を選んでもヘテロダイマーを形成しないこと。
(6)同一塩基の繰り返し数が４個以下であること。
(7)GC含量が40.0-60.0%であること。
（２）ビーズ又は磁性ビーズの形状をとる（１）記載の基板。
（３）ビーズ又は磁性ビーズのそれぞれに異なるオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている（２）記載の基板。
（４）糸の形状をとる（１）記載の基板。
（５）糸の異なる位置のそれぞれに異なるオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている（４）記載の基板。
（６）標的核酸の配列がヒトゲノム配列である（１）〜（５）のいずれかに記載の基板。
（７）オリゴヌクレオチドの配列が配列番号１〜１２０のいずれかの配列である（１）〜（６）のいずれかに記載の基板。
（８）オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号２、３、６、８、１２、１４，１６、１８、２１、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５２、５３、５４、５５、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、９６、１００、１０８、１０９、１１３、１１４、１１８及び１２０で表される（７）記載の基板。
（９）オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１２、１４，１６、２１、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、９６、１００、１０８、１０９、１１４、１１８及び１２０で表される（７）記載の基板。
（１０）オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１２、１４，１６、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、１００、１０８、１０９、１１８及び１２０で表される（７）記載の基板。
（１１）オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１２、１４、２７、２８、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、８４、１００、１０８、１０９及び１２０で表される（７）記載の基板。
（１２）オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１４，２７、２８、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、８４、１００、１０８、１０９及び１２０で表される（７）記載の基板。
（１３）オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１４、２７、２８、３９、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、１００、１０８、１０９及び１２０で表される（７）記載の基板。
（１４）（１）〜（１３）のいずれかに記載の基板を用いて、遺伝子解析を行う方法。
（１５）遺伝子解析が、一塩基多型解析である（１４）記載の方法。
（１６）遺伝子解析が、遺伝子検出である（１４）記載の方法。
（１７）配列番号１〜１２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド又はその相補体。
（１８）配列番号１〜１２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの組合せであって、200ug/mlサケ精子DNAを含む２×SSC中の常温でのハイブリダイゼーションの条件下で、互いにクロスハイブリダイゼーションしないオリゴヌクレオチドの組合せ。
（１９）（１８）の組合せに含まれるオリゴヌクレオチドの相補体の組合せ。
（２０）配列番号１〜１２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドが付加された核酸プライマー又はプローブ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、新規なTAGのハイブリダイゼーション反応を利用して核酸サンプルにおける遺伝子検出、一塩基多型解析が可能となった。この方法は、任意の遺伝子検出において利用でき、反応を多重化（Multiplex）することが容易になるため、データ読み出し容量を増加することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】クロスハイブリダイゼーション有無判定のImage画像を示す。
【図２】実施例３の特異的反応による蛍光強度を示す。
【図３】実施例３の選定２の後の26種のTAGの蛍光強度を示す。
【図４】TAG109とTAG012の蛍光強度を示す。
【図５】本発明の基板（ビーズ）を用いた遺伝子解析法（一塩基多型解析）の一例の概略を示す。
【図６】実施例５のSNP部位をマルチプレックスで増幅した増幅断片を電気泳動にて分離した結果を示す。
【図７】実施例５の一塩基多型解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【図８】実施例６のRDase遺伝子を網羅的に増幅した増幅断片を電気泳動にて分離した結果を示す。
【図９】実施例６のRDase遺伝子をBISTnnerで検出した発光データの波形を示す。
【図１０】実施例６の32type のRDase遺伝子をBISTnnerで検出して得られた３回のシグナルの平均値を示す。
【図１１】実施例７の抽出ゲノムの吸光度を示す。
【図１２】実施例７のゲノム抽出物を電気泳動にて分離した結果（左）とSNP部位をマルチプレックスで増幅した増幅断片を電気泳動にて分離した結果（右）を示す。
【図１３】実施例７のSNP解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【図１４】実施例８の抽出ゲノムの吸光度を示す。
【図１５】実施例８のSNP部位をマルチプレックスで増幅した増幅断片を電気泳動にて分離した結果を示す。
【図１６】実施例８の4SNP解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【図１７】実施例９の4SNP解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【図１８】実施例１０の9SNP解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【図１９】実施例１０の9SNP解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【図２０】実施例１０の9SNP解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【図２１】実施例１０の9SNP解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、下記の(1)〜(7)の条件を満たす少なくとも２種のオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている基板を提供する。
【００１４】
(1)配列長が19-25merであること。
(2)融解温度（Tm）が64.0-69.0℃であること。
(3)標的核酸の配列との類似性が50%以下であること。
(4)高次構造をとらないこと。
(5)任意の２種を選んでもヘテロダイマーを形成しないこと。
(6)同一塩基の繰り返し数が４個以下であること。
(7)GC含量が40.0-60.0%であること。
【００１５】
本明細書において、(1)〜(7)の条件を満たす少なくとも２種のオリゴヌクレオチドのそれぞれを「TAG」、「TAGヌクレオチド」、「タグ配列」などと呼ぶこともある。
【００１６】
本発明において、TAGは配列長が19-25merである（条件(1)）。TAGは配列長があまり短ければ十分なTm値を確保できず，あまり長ければ非特異的なアニーリングが起こるため、19-25merが適当である。
【００１７】
TAGの融解温度（Tm）は64.0-69.0℃である（条件(2)）。融解温度（Tm）は、最近接法１（reslauer. et al., PNAS, vol.83:3746-3750）などの方法により、算出することができる。上記の方法における熱力学パラメーターとしては、Breslauer. et al., PNAS, vol.83:3746-3750に記載の数値を用いることができる。
【００１８】
このTmであれば、室温での100%ハイブリダイゼーションが予測できる。
【００１９】
TAGは、標的核酸の配列との類似性が50%以下である（条件(3)）。標的核酸の配列としては、ヒトゲノム配列、ヒトＲＮＡ配列などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００２０】
これらの標的核酸の配列情報は、NCBI/GenBankなどの種々のデータベースから入手することができる。
【００２１】
標的核酸の配列との類似性は、データベース中の配列を１つずつ取り出し、標的核酸配列とペアワイズにローカルアライメントを行うなどの方法により、算出することができる。標的核酸を検出するためにTAGはプライマーの末端に付加するため、類似性が高いと標的核酸とTAGの見分けがつかず、正しくPCRが行われないなど最終的には誤判定につながる可能性があるため、TAGは標的核酸の配列との類似性が50%以下であることが好ましい。
【００２２】
TAGは高次構造をとらない（条件(4)）。高次構造としては、ダイマー形成、ヘアピンループなどの二次構造などを例示することができる。
【００２３】
高次構造形成能の検証には、ウィーン大学が開発したVienna RNA パッケージ、OLIGOTM Primer Analysis Software（タカラバイオ株式会社）などを利用することができる。検証時の温度条件としては、常温(25℃)を用いるとよい。遺伝子解析法として使用するハイブリダイゼーションは、1本鎖の核酸の塩基が結合することであり、高次構造をとるとその反応をさまたげるので、TAGは高次構造をとらないことが好ましい。
【００２４】
TAGは、任意の２種を選んでもヘテロダイマーを形成しない（条件(5)）。ヘテロダイマー形成とは、１つまたはそれ以上のミスマッチによる部分的な二本鎖形成を意味する。
【００２５】
ヘテロダイマー形成能の検証には、ウィーン大学が開発したVienna RNA パッケージなどを利用することができる。検証時の温度条件としては、常温(25℃)を用いるとよい。それぞれのTAGがそれぞれの標的核酸検出に対応するため、TAG同士がヘテロダイマーを形成すると正しく遺伝子解析を行うことができないため、TAGは、任意の２種を選んでもヘテロダイマーを形成しないことが好ましい。
【００２６】
TAGは、同一塩基の繰り返し数が４個以下である（条件(6)）。「同一塩基の繰り返し数が４個以下である」という条件により、TAGは４個以上の同一タンデム配列やリピート配列を含まないことになる。得にGCは反応が強いためリピート配列があると非特異的な反応につながるため、TAGは同一塩基の繰り返し数が４個以下であることが好ましい。
【００２７】
TAGは、GC含量が40.0-60.0%である（条件(7)）。40.0-60.0%のGC含量は、一般的にプライマーの設計に適していると言われている数値である。
【００２８】
本発明の基板は、ビーズ、糸（ストランド）、磁性ビーズ、などの形状をとることができる。
【００２９】
本発明の基板がビーズ又は磁性ビーズの形状をとる場合には、ビーズ又は磁性ビーズのそれぞれに異なるオリゴヌクレオチドの相補体が固定されているとよい。
【００３０】
本発明の基板が糸の形状をとる場合には、糸の異なる位置のそれぞれに異なるオリゴヌクレオチドの相補体が固定されているとよい。
【００３１】
(1)〜(7)の条件を満たすTAGの例として、配列番号１〜１２０のTAGを例示することができる。これらの配列は、条件(3)の標的核酸の配列としてヒトゲノム配列を選択して得られたものである（後述の実施例１を参照のこと）。
【００３２】
配列番号２、３、６、８、１２、１４，１６、１８、２１、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５２、５３、５４、５５、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、９６、１００、１０８、１０９、１１３、１１４、１１８及び１２０で表されるTAGは、200ug/mlサケ精子DNAを含む２×SSC中の常温でのハイブリダイゼーション条件下で、クロスハイブリダイゼーションを起こす可能性がより低いと予想された（後述の実施例２を参照のこと）。
【００３３】
さらに、配列番号３、１２、１４，１６、２１、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、９６、１００、１０８、１０９、１１４、１１８及び１２０で表されるTAGは、Cy5オリゴヌクレオチドを用いた蛍光強度の差が小さかった（後述の実施例３（選定１）を参照のこと）。
【００３４】
さらに、配列番号３、１２、１４，１６、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、１００、１０８、１０９、１１８及び１２０で表されるTAGは、200ug/mlサケ精子DNAを含む２×SSC中の常温でのハイブリダイゼーションの条件下で、クロスハイブリダイゼーションが無かった（後述の実施例３（選定２）を参照のこと）。
【００３５】
さらに、配列番号３、１２、１４、２７、２８、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、８４、１００、１０８、１０９及び１２０で表されるTAGは、Cy5オリゴヌクレオチドを用いた蛍光強度の差がより小さかった（後述の実施例３（選定３）を参照のこと）。
【００３６】
さらに、配列番号３、１４，２７、２８、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、８４、１００、１０８、１０９及び１２０で表されるTAGは、Cy5オリゴヌクレオチドを用いた蛍光強度の差がさらに小さい（後述の実施例３（選定４）を参照のこと）。
【００３７】
さらに、配列番号３、１４、２７、２８、３９、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、１００、１０８、１０９及び１２０で表されるTAGは、クロスハイブリダイゼーションが行われず特異性のあるハイブリダイゼーションが行えることとハイブリダイゼーションシグナルにあまり差がないことから検出が比較的容易に行えることといった利点がある（後述の実施例３（選定５）を参照のこと）。
【００３８】
上記の(1)〜(7)の条件を満たすTAGの相補体が固定された基板を用いて、遺伝子解析を行うことができる。
【００３９】
基板としては、ビーズ、糸（ストランド）、磁性ビーズなどを挙げることができる。
【００４０】
ビーズは、大きさは1mm程度で、プラスチックやセラミックなどの材質のものであるとよく、このようなビーズは、特開2000-346842号公報、特表平14-534657号公報などに記載されている。
【００４１】
磁性ビーズは、大きさは数十μmで、プラスチックやセラミックなどに鉄粉等を混ぜ、磁気化したものであるとよい。このようなビーズは、特開平8-62224号公報（特許第3115501号明細書）、国際公開WO96/29602パンフレット、国際公開WO97/44671パンフレットなどに記載されている。
【００４２】
糸（ストランド）は、大きさは直径0.1mm程度で、樹脂系の材質のものであるとよく、このような糸は、特開2006-214759号公報、国際公開WO01/53831パンフレット、国際公開WO2003/7901パンフレットなどに記載されている。
【００４３】
基板表面には、TAGの相補体を結合できる官能基を生成させてもよい。例えば、基板がポリアミド系高分子の素材で作製されている場合には、ポリアミド系高分子が有するペプチド結合を加水分解することにより、カルボキシル基(-COOH)、アミノ基(-NH2)などの官能基を生成させることができる。
【００４４】
TAGの相補体は、公知のＤＮＡ合成法により、市販のＤＮＡ合成機を用いて製造することができる。
【００４５】
TAGの相補体を基板に固定するには、固体表面へＤＮＡを固定するための公知のいかなる方法を用いてもよい。例えば、基板の末端をカルボキシル基などの官能基などで修飾し、カルボジイミドなどの試薬を用いて、化学的にTAGの相補体を基板に固定することができる。また、基板をアビジン又はストレプトアビジンで被覆し、TAG相補体をビオチン化すれば、アビジンとビオチンとの間の特異的反応によって、TAGの相補体を基板に結合させることができる。あるいはまた、TAGの相補体を基板に物理的に吸着させる方法などもある。TAGの相補体にはスペーサー配列を付加してもよい。
【００４６】
TAGの相補体が固定された基板を用いて行うことができる遺伝子解析としては、一塩基多型解析、遺伝子検出などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００４７】
一塩基多型解析を行うには、A Microsphere-Based Assay for Multiplexed Single Nucleotide Polymorphism Analysis Using Single Base Chain Extension. Jingwen Chen; Marie A. Iannone; May-Sung Li; J. David Taylor; Philip Rivers; Anita J. Nelsen; Kimberly A. Slentz-Kesler; Allen Roses; Michael P. Weiner. 10:549-557 2000 by Cold Spring Harbor Laboratory Press ISSN 1088-9051/00（非特許文献１）、Analytical Validation of the TAG-It High-Throughput Microsphere-Based Universal Array Genotyping Platform: Application to the Multiplex Detection of a Panel of Thrombophilia-Associated Single-Nucleotide Polymorphisms. Susan Bortolin; Margot Black; Hemanshu Modi; Ihor Boszko; Daniel Kobler; Dan Fieldhouse; Eve Lopes; Jean-Michel Lacroix; Rebecca Grimwood; Philip Wells; Richard Janeczko; Roman Zastawny. Clinical Chemistry 50:11 2028-2036 (2004)（非特許文献２）などを参照するとよい。
【００４８】
遺伝子検出を行うには、TaqMan PCR法について記載しているAllelic discrimination using fluorogenic probes and the 5’ nuclease assay. Livak KJ. Gnenet Anal 14, 143 (1999);Rapid reverse transcription-PCR detection of Hepatitis C virus RNA in serum by using the TaqMan fluorogenic detection syste. Morris T et al. J Clin Microbiol 34, 2933 (1996)、Invader法について記載しているStructure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases. Lyamichev V et al. Science 260, 778 (1993)；Polymorphism identification and quantitative detection of genomic DNA by invasive clevage of oligonucleotide probes. Lyamichev V et al. Nat Biotechnol 17, 292 (1999)；Comparison of the 5’ nuclease activities of Taq DNA polymerase and its isolated nuclease domain. Lyamichev V et al. Proc Natl Acad Sci USA 96, 6143 (1999)；A comparison of eubacterial and archaeal structure-specific 5’-exonucleases. Kaiser MW et al. J Biol Chem 274, 21387 (1999)などを参照するとよい。
【００４９】
TaqMan PCR法（Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5’ nuclease assay. Livak KJ. Gnenet Anal 14, 143 (1999)；Rapid reverse transcription-PCR detection of Hepatitis C virus RNA in serum by using the TaqMan fluorogenic detection syste. Morris T et al. J Clin Microbiol 34, 2933 (1996)）は、蛍光標識をしたアレル特異的オリゴとTaq DNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用した方法である。アレル特異的オリゴ（TaqManプローブ）は約20塩基程度の長さであり、5’末端はFAMやVICなどの蛍光レポーター色素、3’末端がクエンチャー（消光物質）によって標識されている。このプローブが鋳型DNAの得意的な配列にハイブリダイゼーションし、同時にPCRプライマーから伸長反応が起こる。この際、TaqDNAポリメラーゼは5’ヌクレアーゼ活性を有しているため、PCRプライマーの伸長反応が進む際にハイブリダイゼーションをしたTaqManプローブを切断する。TaqManプローブが切断されると、蛍光色素がクエンチャーの影響を受けなくなり蛍光が検出される。この蛍光を検出することで、目的の遺伝子有無が確認できる方法である。
【００５０】
Invader法（Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases. Lyamichev V et al. Science 260, 778 (1993)；Polymorphism identification and quantitative detection of genomic DNA by invasive clevage of oligonucleotide probes. Lyamichev V et al. Nat Biotechnol 17, 292 (1999)；Comparison of the 5’ nuclease activities of Taq DNA polymerase and its isolated nuclease domain. Lyamichev V et al. Proc Natl Acad Sci USA 96, 6143 (1999)；A comparison of eubacterial and archaeal structure-specific 5’-exonucleases. Kaiser MW et al. J Biol Chem 274, 21387 (1999)）は、TaqMan PCR法と同様にアレル特異的オリゴと鋳型をハイブリダイゼーションさせることによりタイピングする方法である。2種類の非蛍光標識オリゴのうちひとつは、蛍光標識の代わりに鋳型の配列とは無関係な配列（フラップ）を5’側に有している（アレルプローブ）。3’側は鋳型に特異的な相補配列であり、特異的な配列の5’末端はSNP部となっている。もうひとつのオリゴは、インベーダープローブと呼ばれており、SNP部位からの鋳型の3’側に相補的に結合するように設計されている。鋳型と2つのプローブをハイブリダイゼーションさせるとSNP部分にインベーダープローブの1塩基が侵入する。このときSNP部には3つの塩基が並ぶことになり、これをエンドヌクレアーゼ活性を有する特殊な酵素（cleavase）で切断する。この切断されたフラップが、Fluorescence resonance energy transfer (FRET)プローブの3’側に配置した相補な配列と相補結合する。相補結合することで、フラップのSNP部がFRET自身の相補結合部位に侵入し、cleavaseが再びこの構造を認識して切断する。FRETプローブの5’末端にはTaqManプローブと同様の蛍光色素が標識されており、上流にはクエンチャーが結合しているため、切断されることで、クエンチャーと離れ蛍光を発する。この蛍光を検出することで、目的の遺伝子有無が確認できる方法である。
【００５１】
シグナルの検出法としては、蛍光検出と化学発光が主な検出法であり、マイクロタイタープレート検出機やスキャナー型のイメージアナライザーなどがある。
【００５２】
また、本発明は、配列番号１〜１２０のいずれかで表されるTAGからなるオリゴヌクレオチド又はその相補体；配列番号１〜１２０のいずれかで表されるTAGからなるオリゴヌクレオチドの組合せであって、200ug/mlサケ精子DNAを含む２×SSC中の常温でのハイブリダイゼーションの条件下で、互いにクロスハイブリダイゼーションしないオリゴヌクレオチドの組合せ；及び上記のオリゴヌクレオチドの組合せに含まれるオリゴヌクレオチドの相補体の組合せも提供する。配列番号１〜１２０のいずれかで表されるTAGからなるオリゴヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成法により、市販のＤＮＡ合成機を用いて製造することができ、遺伝子解析用のTAGとして利用可能である。これらのオリゴヌクレオチドはTAGとして核酸プライマーやプローブに付加されてハイブリダイゼーションに供される。そのハイブリダイゼーションの条件としては、200ug/mlサケ精子DNAを含む２×SSC中の常温でのハイブリダイゼーションという条件の他、200ug/ulサケ精子DNA 、25％ホルムアミド、0.01% Tween20を含むMES溶液の常温でのハイブリダイゼーションなどを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００５３】
さらに、本発明は、配列番号１〜１２０のいずれかで表されるTAGからなるオリゴヌクレオチドが付加された核酸プライマー又はプローブも提供する。これらの核酸プライマー及びプローブは、公知のＤＮＡ合成法により、市販のＤＮＡ合成機を用いて製造することができ、TAGの相補体が固定された基板を用いた遺伝子解析に利用可能である。
【実施例】
【００５４】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに何ら影響されることはない。
【００５５】
〔実施例１〕TAG設計
19〜25merの配列をランダムに生成し、下記の(1)〜(7)の条件を満たすTAGを選定した。選定したTAGを優先順位の高い順番に番号付けし（TAG001-TAG120）、その配列を配列番号１〜１２０に示す。
【００５６】
(1)配列長が19-25merであること。
(2)融解温度（Tm）が64.0-69.0℃であること。
(3)ヒトゲノム配列（標的核酸の配列）との類似性が50%以下であること。
(4)高次構造をとらないこと。
(5)任意の２種を選んでもヘテロダイマーを形成しないこと。
(6)同一塩基の繰り返し数が４個以下であること。
(7)GC含量が40.0-60.0%であること。
【００５７】
Tm値の算出には最近接法1の計算式を用いた。最近接法2により算出したTm値は参考値とした。
【００５８】
熱力学パラメータ：Breslauer, et al., PNAS, vol 83: 3746-3750.
最近接法1：
Tm = ΔH / (ΔS + Rln(Ct/4)) - 273.15 + 16.6log[Na+]
Ct：DNA 濃度; 500nM、Na+：ナトリウムイオン濃度; 50mM
R：気体定数（1.987cal/deg・mol）
ヒト配列との特異性(類似性)を検証には、3 つの配列データベース（NCBI RefSeq アセンブル済ゲノム配列 (BUILD 36.1; 1〜23,X,Y 染色体)、NCBI RefSeq RNA 配列 (2006/07/17 更新版; 40368 配列)、NCBI UniGene クラスタ配列 (BUILD #194;86810 配列)）を用いた。TAGはこれらのデータベースに含まれるすべての配列との類似性が、50%以下になるように設計を行った。
【００５９】
TAGの高次構造形成能（TAGの二次構造、ダイマー形成、ヘテロダイマー形成能）の検証には、ウィーン大学が開発したVienna RNA パッケージを使用した。また、二次構造、ダイマー形成、ヘテロダイマー形成能検証時の温度条件には常温(25℃)を用いた。
【００６０】
〔実施例２〕TAGの組合せ（１）
実施例１の優先順位結果、「Oligo」ソフト（OLIGOTM Primer Analysis Software（タカラバイオ株式会社））で予測したヘアピン構造の形成条件予測、Handy Bio-Strandシステム（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社）を用いたハイブリダイゼーション結果より、クロスハイブリダイゼーションを起こさないと予測される３６種（TAG002、003、006、008、012、014，016、018、021、025、027、028、030、039、040、042、049、052、053、054、055、056、061、071、073、076、081、084、096、100、108、109、113、114、118及び120）の組合せを選定した。
【００６１】
Bio−Strandを用いたハイブリダイゼーション条件は、200ug/mlサケ精子DNAを含む２×SSC溶液にCy5ラベルしたTAGを入れ、Bio-Strandチップに吸引しストランド上に固定してあるタグ相補配列と常温でハイブリダイゼーションさせ洗浄して、専用のスキャナーでCy5のシグナルを検出し、特異的な反応が起きているかどうかを判断した。選定基準はスポットシグナルが出たことを目視で判定できることとした。
【００６２】
〔実施例３〕TAGの組合せ（２）
１．実験目的
反応用ビーズに固定するプローブとして適したTAGを候補となっている36種（実施例２）から選定する。
【００６３】
２．実験方法・手順
＜使用器具・機器＞
・Handy Bio-Strand一式
Handy Bio-Strand Kenzan （PSS、Code No.D4011）
Handy Bio-Strand Strand Kit （PSS、 Code No.D4010 Lot No.A05S1300）
Handy Bio-Strand Stamper （PSS、Code No.D4001 Lot No.HTB01-003）、
Handy Bio-Strand Spinner （PSS、Code No.D4002 Lot No.HP001-003）、
Handy Bio-Strand Rotator （PSS、Code No.D4004 Lot No.HRB01-010）、
Handy Bio-Strand Scanner (PSS、Code No.D4005 Lot No.HCC01-0023)
・384穴プレート（GENETX、X6004）
・SPECTRO LINKER XL-1500UV CROSS LINKER (Spectronics、UV-C)
・SX-12GC（PSS、Code No.A1003）
・ICカード（SX-12GC用 Hybri Machine V0.5/Firmware 12GC E200）
・Water Bath
・ボルテックス
・チビタン
・Nano Drop
・Hy-Soft (PSS、Ver.0.1.7.S)
＜使用試薬＞
・Sheared Salmon Sperm DNA 10mg/ml （エッペンドルフ）
・20×SSC （Wako）
・10％SDS （Wako）
・超純水
・Marker Cy5 CFWT 合成オリゴヌクレオチド （SIGMA）
・TAG 合成オリゴヌクレオチド （SIGMA） 36種
【００６４】
【表１】
・Cy5 TAGc 合成オリゴヌクレオチド （SIGMA） 36種
【００６５】
【表２】
＜実験方法＞
１）TAG 合成オリゴヌクレオチドとCy5 TAGc 合成オリゴヌクレオチドを10uMになるよう超純水で調製し、NanoDropで濃度測定を行った。10uMに希釈したTAG 合成オリゴヌクレオチドを2uMに、Cy5 TAGc 合成オリゴヌクレオチドを1uMに超純水で希釈した。
【００６６】
２）Pre-Hybridization Bufferに使用するSheared Salmon Sperm DNA (10mg/ml)を95℃設定のWater Bathで３分ボイル後、氷上にて急冷を行った。
【００６７】
３）各Bufferの調製を行った。
【００６８】
Wash Buffer 1 ： 2×SSC、0.1%SDS
Wash Buffer 2 ： 1×SSC、0.1%SDS
Wash Buffer 3 ： 0.1×SSC、0.1%SDS
Detection Buffer ： 2×SSC
Pre-Hybridization Buffer ： 2×SSC、200ug/ml Sheared Salmon Sperm DNA
Hybridization Buffer ： 2×SSC、200ug/ml Sheared Salmon Sperm DNA、10nM Cy5 TAGc
※Hybridization反応は36種の固定化TAG 合成オリゴヌクレオチドに対し、Cy5 TAGc 合成オリゴヌクレオチドを１種類ずつ反応させるため、Hybridization BufferはCy5 TAGc 合成オリゴヌクレオチド別にそれぞれ調製した。
【００６９】
４）下記のSpot Mapに従い、2uMのTAGを384穴プレートへ5ulずつ分注した。（Spot MapにはTAGのNo.を記した。また、Mの箇所にはMarkerを分注した。）
【００７０】
【表３】
５）384穴プレートに分注したTAGをHandy Bio-Strand Stamper、KenzanおよびStrand Kitを用いて４回（各５秒）スポットを行った。
【００７１】
６）スポットしたCassetteをHandy Bio-Strand Spinnerを用いてストランドをコアピンに巻き取り、Handy Bio-Strand Rotatorにセットし、SPECTRO LINKER XL-1500UV CROSS LINKERにて70mJ/cm2のUV照射を行った。
【００７２】
７）UV照射後のコアピンをBS-2000 Tip（PSS、Handy Bio-Strand一式中に含まれている）に挿入した。
【００７３】
８）カートリッジへ下記の通り試薬分注を行い、SX-12GCおよびICカードにて常温でのハイブリダイゼーションを行った。
【００７４】
Well 1 ： Pre-Hybridization Buffer 500ul
Well 2 ： Pre-Hybridization Buffer 500ul
Well 3 ： Hybridization Buffer 500ul
Well 4 ： Wash Buffer 1 500ul
Well 5 ： Wash Buffer 2 500ul
Well 6 ： Wash Buffer 3 500ul
Well 7 ： Detection Buffer 500ul
９）Hybridization後、Handy Bio-Strand Scannerにて測定（50msec）し、Hy-softで解析を行い、特異反応スポットの蛍光強度を数値化した。
【００７５】
10）翌日、再度Handy Bio-Strand Scannerにて測定（50msec）し、目視によりクロスハイブリダイゼーションの有無を確認した。
【００７６】
＜クロスハイブリダイゼーション有無の判定方法＞
クロスハイブリダイゼーション有無の判定をHy-softのImage画像より目視で行った。目視によりスポットとして認識したTAG No.を得るため、Hy-SoftのImage画像の▼（赤三角）をスポットの場所にあわせて、plate画像の□（赤四角）が示す場所を確認した。クロスハイブリダイゼーション有無判定のImage画像を図１に示す。
【００７７】
３．実験結果・選定
＜特異的反応による蛍光強度について＞
特異的反応によるハイブリダイゼーションによって得られた蛍光強度を図２に示す。
【００７８】
（選定１）蛍光強度の差をできるだけ小さくするため、特異的反応によるハイブリダイゼーションによって得られた蛍光強度が20000以下のTAG（TAG002・TAG006・TAG008・TAG018・TAG113）と蛍光強度が40000以上のTAG（TAG052・TAG055）は除外した。
【００７９】
＜クロスハイブリダイゼーションについて＞
選定１で選定された29種のTAGについてクロスハイブリダイゼーションの有無を表４に示す。
【００８０】
【表４】
（選定２）クロスハイブリダイゼーションが２つ以上得られたTAG021・TAG096・TAG114を除外した。
【００８１】
＜選定１・２で除外されなかったTAGの蛍光強度とクロスハイブリダイゼーション＞
選定２で除外されたTAGを考慮すると、残った26種のTAGのクロスハイブリダイゼーションの有無は表５のようになった。また、26種のTAGの蛍光強度を図３に示す。
【００８２】
【表５】
（選定３）蛍光強度の差をできるだけ小さくするため、蛍光強度が25000以下のTAG（TAG016・TAG025・TAG030・TAG076・TAG118）は除外した。
【００８３】
＜選定３で除外されなかったTAGの蛍光強度とクロスハイブリダイゼーション＞
選定３で除外されたTAGを考慮すると、残った21種のTAGのクロスハイブリダイゼーションの有無は表６のようになった。また、クロスハイブリダイゼーションが見られたTAG109とTAG012のシグナルを図４に示す。
【００８４】
【表６】
（選定４）TAG012とTAG109に関してだが、特異的反応によるハイブリダイゼーションによって得られた蛍光強度の平均が約30000であることから、TAG012はクロスハイブリダイゼーションが見られないが、蛍光強度の値が平均に近いTAG109を選定した。
【００８５】
４．結論
選定１から４により下記の表７に示す20種のTAGを選定した。
【００８６】
【表７】
（選定５）
後述の実施例５に記載の一塩基多型解析を行うにあたり、TAGに付加するプライマーシーケンスとでヘアピン構造を作らないという選定基準で、TAG003、014、027、028、039、042、049、053、054、056、061、071、073、081、100、108、109、120を選定した。
【００８７】
〔実施例４〕キャピラリービーズアレイの製造
実施例３で選定したTAGの相補体が固定されたビーズをキャピラリーに充填したキャピラリービーズアレイを以下のように製造した。
【００８８】
1×PBSで洗浄した非磁性ビーズを詰めたキャピラリーを用意し、Magtration System 12GCを使って以下に示す各試薬を順に反応させ、TAGの相補体をビーズに固定化した。ここで、10種のTAG相補体を固定化させたキャピラリービーズアレイをBIST-10（TAG014、039、042、054、071、073、081、084、100、109の相補体）とし、18種のTAG相補体（TAG003、014、027、028、039、042、049、053、054、056、061、071、073、081、100、108、109、120の相補体）を固定化させたキャピラリービーズアレイをBIST-18Cとした。
【００８９】
分注試薬
well 1：0.1mg/ml Avidin溶液
well 2：PBS-T (Tween0.05%)
well 3：PBS-T (Tween0.05%)
well 4：Blocking Buffer
well 5：0.8uM TAG相補体オリゴDNA溶液
well 6：PBS-T (Tween0.05%)
well 7：PBS-T (Tween0.05%)
well 8：1%BlockAce
well 9：5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaCl
well 10：2.5mM Tis-HCl、0.25mM EDTA、0.5M NaCl
本実施例に使用する各試薬は全て製造を委託している、ジェネテイン株式会社で調達した。
【００９０】
また、以下の手順で、N-BISTを調製した。
ナイロンをコーティングした非磁性ビーズを詰めたキャピラリーを用意し、Magtration System 12GCを使って以下に示す各試薬を順に反応させ、TAGの相補体をビーズに固定化した。ここで、10種のTAG相補体を固定化させたキャピラリービーズアレイをBIST-10（TAG014、039、042、054、071、073、081、084、100、109の相補体）とし、18種のTAG相補体（TAG003、014、027、028、039、042、049、053、054、056、061、071、073、081、100、108、109、120の相補体）を固定化させたキャピラリービーズアレイをBIST-18Cとした。
【００９１】
分注試薬
well 1：41.25mg/ml EDC溶液、約6.6uM TAG相補体オリゴDNA溶液
well 2：PBS-T (Tween0.05%)
well 3：PBS-T (Tween0.05%)
well 4：超純水
well 5：超純水
【００９２】
本実施例に使用する各試薬は自社で調整した。
なお、このN-BISTは後述の実施例１０で使用した。
【００９３】
〔実施例５〕一塩基多型解析
１．実験目的
実施例４で製造したキャピラリービーズアレイを用いて一塩基多型解析を行った。操作の概略を図５に示す。
【００９４】
２．実験方法・手順
Allele Specific Primer Extensionおよび実施例４で製造したキャピラリービーズアレイ（BIST-10)を用いて自動一塩基多型解析方法を開発した。BIST中のビーズにマルチプレックス同時判定を可能にするためのTAG相補体を結合させる。一塩基多型特異的配列とTAGを両配列に含むプライマーで、DNAポリメラーゼおよび標識化デオキリボヌクレオチド存在下で伸長反応を行う。BIST検出のためにTAGはBISTビーズに固定されたTAG相補体とハイブリダイズする。BIST中のビーズの標識を検出することで、一塩基多型解析を行う。TAGを使用することで、マルチプレックスのハイブリダイゼーション条件が容易になり、複数の同時一塩基多型解析が可能になる。実施例１、２、３で選定したクロスハイブリダイゼーションを起こさないTAGで実施例４に記載の方法でBISTを製造し、他の技術により決定された遺伝子型との比較により精度を確認した。
【００９５】
本実施例に使用するHot Gold star（カタログ番号：３１４−８０２５１）ポリメラーゼは株式会社ニッポンジーンから購入した。BIOTAQ（カタログ番号：BIO-21040）ポリメラーゼはBIOLINEから購入した。Digoxigenin-11-2’-deoxy-uridine-5’-triphosphate, alkali-stable（カタログ番号：１１０９３０８８９１０）はRocheから購入した。PCRプライマー、標識化プライマーはオペロンに注文した。デオキシリボヌクレオチド（カタログ番号：D7295）、MES-free acid monohydrate（カタログ番号：M2933）、MES Sodium Salt（カタログ番号：M3058）はSIGMAから購入した。NaCl（カタログ番号：１９１−０１６６５）、EDTA2Na・2H2O（カタログ番号：３４５−０１８６５）、水酸化ナトリウム（カタログ番号：197-02125、196-05375）、Tween20（カタログ番号：１６３−１１５１２）、ホルムアミド（カタログ番号：０６６−０２３０１）は和光純薬工業株式会社から購入した。ブロックエース（カタログ番号：UK-B80）は大日本住友製薬から購入した。Guardian（カタログ番号：37548）、SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate（カタログ番号：３４０９４）はPieaceから購入した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments（カタログ番号：11644716001）はRocheから購入した。解析したゲノムDNAは女子栄養大学から提供してもらった。
【００９６】
PCR増幅
DICE（タカラバイオ）を用いてPCR反応を行った。20ul反応混合液は、15mM Tis-HCl pH8.0、50mM KCl、0.01% Tween 20、2mM MgCl2、2mM dNTP、各プライマー（表８）を0.4uM、Hot Gold star DNAポリメラーゼ 0.5ユニット、および20ngゲノムDNAを含んでいた。反応混合液は95℃にて10分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて15秒間、60℃にて15秒間、72℃にて15秒間を35サイクルさせ増幅を行った。さらに72℃にて5分間の伸長の後、反応液を4℃に保った。
【００９７】
【表８】
Label化反応（Allele Specific Primer Extension）
PCR産物 2ulに、Label化混合液18ul添加し20ulの反応混合液を作成した。反応混合液は、16mM (NH4)2SO4、67mM Tis-HCl pH8.8、0.01% Tween 20、2mM MgCl2、10uM dATP、10uM dGTP、10uM dCTP、1uM Digoxigenin-11-2’-deoxy-uridine-5’-triphosphate, alkali-stable、各プライマー（表９）を0.4uM、BIOTAQ DNAポリメラーゼ 1ユニット、を含んでいた。反応混合液は95℃にて2分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて20秒間、55℃にて20秒間、72℃にて15秒間を20サイクルさせ増幅を行い、反応液を4℃に保った。
【００９８】
【表９】
BIST-10とLabel化反応産物のハイブリダイゼーション
Label化反応後、対立遺伝子特異的伸長産物のそれぞれを、TAG相補体を含むBIST中のビーズにて捕獲した。25%ホルムアミド、100mM MES、１M Na、20mM EDTA、0.01% Tween20からなるMESバッファー、200ug/ulサケ精子DNAが入ったハイブリダイゼーション溶液に95ulに5ulのLabel化反応産物を添加し、BISTに80ulを吸引し室温で5分間のハイブリダイゼーションを行った。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments 1ユニット、1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にて15分間BIST中のビーズに捕獲されたラベル化反応産物をAnti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragmentsと反応させた。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。BlockAceを取り除くため、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、さらに室温にてBIST中のビーズを洗浄した。これらの反応工程は全てプレシジョン・システム・サイエンス株式会社のMagtration System 6GCもしくは12GCを用いて自動で行った。
【００９９】
BIST中ビーズの発光シグナル検出
プレシジョン・システム・サイエンス株式会社が開発したBISTnner（BIST専用検出装置）を用いてBIST中ビーズの発光シグナルを測定した。発光試薬は、SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrateを用いた。
【０１００】
３．実験結果
（１）PCR産物の電気泳動評価
結果を図６に示す。各増幅断片は、目的のSNPサイトをマルチプレックスで増幅した増幅断片を電気泳動にて分離した結果を表す。
【０１０１】
（２）BIST-10によるSNPタイピング
結果を図７に示す。図７の下図はBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。振幅の大きい波形が発光強度で、振幅の小さい波形がビーズの影を測定したデータである。ビーズがあるところは振幅の小さい波形が検出できないため谷の波形を描く。この振幅の小さい波形の谷と振幅の大きい波形の山を重ね合わせることで、何番目のビーズがいくつの発光強度を示すかがわかる。上図はこのビーズの位置情報と発光強度をSNPごとに並びかえたデータである。たとえば、検体No．112の3ARはTアレルのビーズにのみシグナルが出ているので、TTタイプとなるといえる。
【０１０２】
（３）PCR-RFLP法との答え合わせ
結果を下記の表に示す。
【０１０３】
【表１０】
４．考察
異なるシーケンスである3種類の検体全てにおいて、PCR-RFLP法の解析結果と一致した。
【０１０４】
〔実施例６〕Dehalococcoides属細菌還元的脱塩素化酵素遺伝子検出
１．実験目的
実施例４で製造したキャピラリービーズアレイ（BIST-18C）を用いてクロロエチレン類により汚染された地下水からのDehalococcoides属細菌還元的脱塩素化酵素（RDase）遺伝子を検出した。
【０１０５】
２．実験方法・手順
Allele Specific Primer Extensionおよび実施例４で製造したキャピラリービーズアレイ（BIST-18C)を用いて自動遺伝子検出方法を開発した。BIST中のビーズにマルチプレックス同時判定を可能にするためのTAG相補体を結合させる。標的遺伝子特異的配列とTAGを両配列に含むプライマーで、DNAポリメラーゼおよび標識化デオキリボヌクレオチド存在下で伸長反応を行う。BIST検出のためにTAGはBISTビーズに固定されたTAG相補体とハイブリダイズする。BIST中のビーズの標識を検出することで、標的遺伝子の検出を行う。TAGを使用することで、マルチプレックスのハイブリダイゼーション条件が容易になり、複数の同時標的遺伝子検出が可能になる。実施例１、２、３で選定したクロスハイブリダイゼーションを起こさないTAGで実施例４に記載の方法でBISTを製造し、他の技術により決定された遺伝子型との比較により精度を確認した。
【０１０６】
本実施例に使用するEx Taq（カタログ番号：RR001A）ポリメラーゼはタカラバイオ株式会社から購入した。Taq DNA（カタログ番号：E5000S）ポリメラーゼはNEW ENGLAND BioLabsから購入した。Digoxigenin-11-2’-deoxy-uridine-5’-triphosphate, alkali-stable（カタログ番号：１１０９３０８８９１０）はRocheから購入した。PCRプライマー、標識化プライマーは合成オリゴメーカーに注文した。デオキシリボヌクレオチド（カタログ番号：D7295）、MES-free acid monohydrate（カタログ番号：M2933）、MES Sodium Salt（カタログ番号：M3058）はSIGMAから購入した。NaCl（カタログ番号：１９１−０１６６５）、EDTA2Na・2H2O（カタログ番号：３４５−０１８６５）、水酸化ナトリウム（カタログ番号：197-02125、196-05375）、Tween20（カタログ番号：１６３−１１５１２）、ホルムアミド（カタログ番号：０６６−０２３０１）は和光純薬工業株式会社から購入した。ブロックエース（カタログ番号：UK-B80）は大日本住友製薬から購入した。Guardian（カタログ番号：37548）、SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate（カタログ番号：３４０９４）はPieaceから購入した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments（カタログ番号：11644716001）はRocheから購入した。解析したゲノムDNAはクロロエチレン類で汚染された地下水100mlからUltraClean Water DNA Isolation Kit（MO BIO, #14880-25）を用いて抽出した。紫外可視分光光度計V-570（JASCO）を用いて吸光度を測定し、DNA濃度を求めた。
【０１０７】
PCR増幅
DICE（タカラバイオ）を用いてPCR反応を行った。20ul反応混合液は、20mM Tis-HCl pH8.3、100mM KCl、0.1mM EDTA、0.5% Tween20、0.5% Nonidet P-40、50% Glycerol、15mM MgCl2、2mM dNTP、各プライマー（表１１）を0.5uM、Ex Taq ポリメラーゼ 2.5ユニット、および抽出したゲノム1ulを含んでいた。反応混合液は95℃にて5分間ゲノムテンプレートをDenatureして、95℃にて30秒間、50℃にて30秒間、72℃にて2分間を35サイクルさせ増幅を行った。さらに72℃にて4分間の伸長の後、反応液を4℃に保った。
【０１０８】
【表１１】
精製
PCR産物100μl中50μlを１％アガロースゲルで電気泳動し、Mag Extractor -PCR&Gel Clean up-（TOYOBO）を用いてアガロースゲルからの切り出し精製を行った。溶出はTE buffer 20μlで行った。
【０１０９】
Label化反応（Allele Specific Primer Extension）
PCR産物 5ulに、Label化混合液15ul添加し20ulの反応混合液を作成した。反応混合液は、10mM Tis-HCl pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.5uM dATP、0.5uM dGTP、0.5uM dCTP、0.5uM Digoxigenin-11-2’-deoxy-uridine-5’-triphosphate, alkali-stable、各プライマー（表１２）を0.25uM、Taq DNA ポリメラーゼ 1ユニットを含んでいた。反応混合液は95℃にて3分間保持して、テンプレートのPCR産物をDenatureさせ、95℃にて30秒間、55℃にて30秒間、72℃にて1分間を35サイクルさせ増幅を行い、反応液を4℃に保った。
【０１１０】
【表１２】
BIST-18CとLabel化反応産物のハイブリダイゼーション
Label化反応後、対立遺伝子特異的伸長生成物のそれぞれを、TAG相補体を含むBIST中のビーズにて捕獲した。25%ホルムアミド、100mM MES、１M Na、20mM EDTA、0.01% Tween20からなるMESバッファー、200ug/ulサケ精子DNAが入ったハイブリダイゼーション溶液に95ulに5ulのLabel化反応産物を添加し、BISTに80ulを吸引し室温で5分間のハイブリダイゼーションを行った。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments 1ユニット、1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にて15分間BIST中のビーズに捕獲されたラベル化反応産物をAnti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragmentsと反応させた。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。BlockAceを取り除くため、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、さらに室温にてBIST中のビーズを洗浄した。これらの反応工程は全てプレシジョン・システム・サイエンス株式会社のMagtration System 6GCもしくは12GCを用いて自動で行った。
【０１１１】
BIST中ビーズの発光シグナル検出
プレシジョン・システム・サイエンス株式会社が開発したBISTnner（BIST専用検出装置）を用いてBIST中ビーズの発光シグナルを測定した。発光試薬は、SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrateを用いた。
【０１１２】
３．実験結果
（１）地下水ゲノムDNAの濃度測定
260nmにおける吸光度から濃度を求めたところ、68ng/μlであった。
（２）PCR産物の増幅確認
結果を図８に示す。各増幅断片は、RDaseの保存されたアミノ酸配列をもとに作製した縮退プライマーを用い、複数のtypeが存在するRDase遺伝子を網羅的に増幅した増幅断片を電気泳動にて分離した結果を表す。
（３）BIST-18Cによる検出
結果を図９に示す。図９の下図はBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。振幅の大きい波形が発光強度で、振幅の小さい波形がビーズの影を測定したデータである。ビーズがあるところは光が検出できないため谷の波形を描く。この振幅の小さい波形と振幅の大きい波形の山を重ね合わせることで、何番目のビーズがいくつの発光強度を示すかがわかる。上図に示す棒グラフはこのビーズの位置情報と発光強度をTAGの番号順に並びかえて表記したデータである。
【０１１３】
図１０は、16type−(1)と(2)を合わせた32typeのRDase遺伝子typeに関して、得られた３回のシグナルの平均値をとったものをグラフ化したものである。
【０１１４】
４．考察
平均値の値が1,000以上のものを検出できたとすると、type1,2,4,8,9,10,12,17,19,23,25,26,28,34,35,36,37の17typeが検出できたと言える。また、縮退プライマーの増幅産物をベクターへ挿入→大腸菌に形質転換→培養してplasmid抽出→インサート部分のシークエンスという方法で96plasmidのシークエンスを行ったところ、type1,2,4,9,12,16,19,23,25,26,27,28,34,35,36の15typeが検出された。シークエンスで検出された15typeのうち13typeに関しては本法でも検出できており、実用的な方法として使用できることが示唆された。
【０１１５】
〔実施例７〕異なる方法によって抽出されたゲノムからのＳＮＰ解析
１．実験目的
BIST(キャピラリービーズ)を用いるSNP解析プロトコルは、利用するユーザーによって解析するゲノムの抽出法が異なることが予想できるため、それらの違いによる差がないかの検証を行った。
【０１１６】
２．実験方法・手順
（１）ゲノム抽出
２種類の血液サンプル（検体１と４）を用いて、採取した当日に、以下の４つの抽出方法でゲノムを抽出した。
(i)E2005試薬（PSS販売試薬）
SX-12GC（PSS、Code No.A1003）にE2005プレパック試薬(Lot.11S06)を搭載し、添付の取扱説明書に従って、血液200 ulからゲノムを抽出した。
(ii)QIAamp DNA Mini/DNA Blood Mini Kit（キアゲン）
添付の取扱説明書に従い、血液200 ulからゲノムを抽出した。
(iii)Genomicsキット(TALENT)
添付の取扱説明書に従い、血液2.4 mlからゲノムを抽出した。
（２）PCR
DICE（TAKARA）を用いてPCR反応を行った。20ul反応混合液は、4SNP 1st Primer Mix（3AR-5 uM, AGT1, UCP1, MTHFR-2.5 uM each）（表８）を1.6 ul、ゲノムDNAを1 ul、10xReaction Bufferを2 ul、2.5 mM dNTPを1.6 ul、25 mM MgCl2を1.6 ul、５U/ul Hot Gold starを0.1 ul、ｄH2Oを12.1 ul含んでいた。反応混合液は95℃にて10分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて15秒間、60℃にて15秒間、72℃にて15秒間を35サイクルさせ増幅を行った。さらに72℃にて5分間の伸長の後、反応液を4℃に保った。
（３）ASPE（Allele Specific Primer Extension）
PCR産物 2ulに、Label化混合液18ul添加し20ulの反応混合液を作成した。反応混合液は、ASPE Primer （3AR, AGT1は5 uM、UCP1は2.5 uM、MTHFRは0.25 uM）（表９）を1 ul、10xReaction Bufferを2 ul、100 uM dNTP（dA, dC, dG）を2 ul、10 uM DIG-dUTPを2 ul、50 mM MgCl2を0.8 ul、５U/ul BIOTAQを0.2 ul、ｄH2Oを10 ul含んでいた。反応混合液は95℃にて2分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて20秒間、55℃にて20秒間、72℃にて15秒間を20サイクルさせ増幅を行い、反応液を4℃に保った。
（４）ハイブリダイゼーション
Label化反応(ASPE)後、対立遺伝子特異的伸長生成物のそれぞれを、TAG相補体を含むBIST中のビーズにて捕獲した。25%ホルムアミド、100mM MES、１M Na、20mM EDTA、0.01% Tween20からなるMESバッファー、200ug/ulサケ精子DNAが入ったハイブリダイゼーション溶液に95ulに5ulのLabel化反応産物を添加し、BISTに80ulを吸引し室温で5分間のハイブリダイゼーションを行った。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments 1ユニット、1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にて15分間BIST中のビーズに捕獲されたラベル化反応産物をAnti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragmentsと反応させた。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。BlockAceを取り除くため、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、さらに室温にてBIST中のビーズを洗浄した。これらの反応工程は全てプレシジョン・システム・サイエンス株式会社のMagtration System 6GCもしくは12GCを用いて自動で行った。
（５）検出・解析
反応させたBIST-10に発光基質(Super Signal)40 ulを吸引し、BISTnner（PSS製品）にてビーズの発光強度を測定した。また、専用のソフトウェアで、ビーズに固定されたTag情報からSNPのタイピングを行った。
【０１１７】
３．実験結果
（１）抽出ゲノムの吸光度測定結果
結果を図１１に示す。定量データを表１３に示す。
【０１１８】
【表１３】
（２）PCR産物、マルチプレックスPCRの電気泳動評価
結果を図１２に示す。
（３）BIST-10によるSNPタイピング
結果を図１３に示す。
【０１１９】
４．考察
電気泳動の結果からすると、溶媒遠心によるGenomicsキット(TALENT)による抽出が、一番、高分子としてゲノムが回収できることがわかった。しかし、PCRの結果に大差はなく、抽出されたゲノムの量や一部に切断があっても、今回検証した4SNP解析においては問題とならないことが確認できた。
プロトコルをユーザーに提供する場合、少なくとも今回検証した抽出法によって得られたゲノムならば問題なく解析ができるといえる。
【０１２０】
〔実施例８〕ツメから抽出したゲノムの4SNP解析
１．実験目的
ツメからゲノムを抽出し肥満関連遺伝子のSNPタイピングを行った。
【０１２１】
２．実験方法・手順
（１）ツメからのゲノム抽出
チューブに入れた30mgのツメ断片にExtraction Buffer 400ulとProteinase K 5ulとRNaseA 4ul中を入れ、65度で1時間処理し、溶解操作後、その上清をMagtration System 12GCのサンプル位置にセットし、抽出操作を行った。
分注試薬
well 1：GE2-K buffer
well 2：Magnetic beads (Cortex:CM5000)
well 3：EtOH
well 4：Magnetic beads (Cortex:CM5000)
well 5：GW buffer
well 6：GW buffer
well 8：TE 50ul
well 11：sample
【０１２２】
（２）PCR
DICE（TAKARA）を用いてPCR反応を行った。20ul反応混合液は、4SNP 1st Primer Mix（3AR-5 uM, AGT1, UCP1, MTHFR-2.5 uM each）（表８）を1.6 ul、ゲノムDNA（女子栄養大学から提供）を1 ul、10xReaction Bufferを2 ul、2.5 mM dNTPを1.6 ul、25 mM MgCl2を1.6 ul、５U/ul Hot Gold starを0.1 ul、ｄH2Oを12.1 ul含んでいた。反応混合液は95℃にて10分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて15秒間、60℃にて15秒間、72℃にて15秒間を35サイクルさせ増幅を行った。さらに72℃にて5分間の伸長の後、反応液を4℃に保った。
【０１２３】
（３）ASPE
PCR産物 2ulに、Label化混合液18ul添加し20ulの反応混合液を作成した。反応混合液は、ASPE Primer （3AR, AGT1は5 uM、UCP1は2.5 uM、MTHFRは0.25 uM）（表９）を1 ul、10xReaction Bufferを2 ul、100 uM dNTP（dA, dC, dG）を2 ul、10 uM DIG-dUTPを2 ul、50 mM MgCl2を0.8 ul、５U/ul BIOTAQを0.2 ul、ｄH2Oを10 ul含んでいた。反応混合液は95℃にて2分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて20秒間、55℃にて20秒間、72℃にて15秒間を20サイクルさせ増幅を行い、反応液を4℃に保った。
【０１２４】
（４）ハイブリダイゼーション
Label化反応(ASPE)後、対立遺伝子特異的伸長生成物のそれぞれを、TAG相補体を含むBIST中のビーズにて捕獲した。25%ホルムアミド、100mM MES、１M Na、20mM EDTA、0.01% Tween20からなるMESバッファー、200ug/ulサケ精子DNAが入ったハイブリダイゼーション溶液に95ulに5ulのLabel化反応産物を添加し、BISTに80ulを吸引し室温で5分間のハイブリダイゼーションを行った。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments 1ユニット、1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にて15分間BIST中のビーズに捕獲されたラベル化反応産物をAnti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragmentsと反応させた。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。BlockAceを取り除くため、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、さらに室温にてBIST中のビーズを洗浄した。これらの反応工程は全てプレシジョン・システム・サイエンス株式会社のMagtration System 6GCもしくは12GCを用いて自動で行った。
【０１２５】
（５）検出・解析
反応させたBIST-18Cに発光基質(Super Signal)40 ulを吸引し、BISTnnerにてビーズの発光強度を測定した。また、専用のソフトウェアで、ビーズに固定されたTag情報からSNPのタイピングを行った。
【０１２６】
３．実験結果
（１）抽出ゲノムの吸光度測定結果
結果を図１４に示す。定量データを表１４に示す。
【０１２７】
【表１４】
（２）PCR産物の電気泳動評価
結果を図１５に示す。検体No.４はポジティブコントロールとして使用した血液から抽出ゲノムのPCR結果である。
（３）BIST-18CによるSNPタイピング
結果を図１６に示す。
（４）血液から抽出したゲノムによるSNP解析結果との答え合わせ
結果を表１５に示す。
【０１２８】
【表１５】
【０１２９】
４．考察
回収できたゲノム量に差はあったが、2検体どちらも4SNPのタイピングが可能で、血液から抽出ゲノムによるタイピング結果が分っている検体Mにおいてはタイピング結果も一致した。
回収できたゲノム量の違いの1つにはツメの大きさがあり、検体Mは1mm幅を10本分、検体Yは大きなかけらを3本分であった。のびきっていないツメの方が、ゲノムが抽出しやすいのかもしれない。しかし、次工程でPCRを行うため、ゲノムの収量差はBISTのシグナルには反映されずどちらの検体も同じくらい高いシグナルを得る事ができた。
以上の結果から、ツメを検体（サンプル）としたい顧客にも、BISTによるタイピングシステムを使用していただけることが明らかとなった。
【０１３０】
〔実施例９〕ASP-PCR法（１段階PCR）を用いる4SNP解析
１．実験目的
ユーザー間差の低減と信頼性の向上を目指し、工程を減らすプロトコルの検証を行った。具体的には、2段階プロトコル（実施例５、７、８）を参考に、SNP近傍配列のTAG化とラベル化、増幅を一度に行う1段階プロトコルの確立を試みた。
【０１３１】
２．実験方法・手順
（１）ASP-PCR
DICE（TAKARA）を用いてPCR反応を行った。20ul反応混合液は、4SNP ASP-PCR Primer Mix（5 uM each）（表１６）を1.6 ul、ゲノムDNA（女子栄養大学提供ゲノム#202, 203, 205 各20 ng/ul、PSS検体＃M４ 57 ng/ul）を1 ul、10xReaction Bufferを2 ul、DIG Labeling Mix Kit (roche)を2 ul、25 mM MgCl2を1.6 ul、５U/ul Hot Gold starを0.1 ul、ｄH2Oを11.7 ul含んでいた。反応混合液は95℃にて10分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて30秒間を35サイクルさせ増幅を行った。さらに72℃にて5分間の伸長、95 ℃で10分間の1本鎖化をおこなうDenature反応の後、反応液を4℃に急冷した。
【０１３２】
【表１６】
（２）ハイブリダイゼーション
Label化反応(ASP-PCR)後、対立遺伝子特異的伸長生成物のそれぞれを、TAG相補体を含むBIST中のビーズにて捕獲した。25%ホルムアミド、100mM MES、１M Na、20mM EDTA、0.01% Tween20からなるMESバッファー、200ug/ulサケ精子DNAが入ったハイブリダイゼーション溶液に95ulに5ulのLabel化反応産物を添加し、BISTに80ulを吸引し室温で5分間のハイブリダイゼーションを行った。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments 1ユニット、1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にて15分間BIST中のビーズに捕獲されたラベル化反応産物をAnti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragmentsと反応させた。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。BlockAceを取り除くため、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、さらに室温にてBIST中のビーズを洗浄した。これらの反応工程は全てプレシジョン・システム・サイエンス株式会社のMagtration System 6GCもしくは12GCを用いて自動で行った。
（３）検出・解析
反応させたBIST-18Cに発光基質(Super Signal)40 ulを吸引し、BISTnnerにてビーズの発光強度を測定した。また、専用のソフトウェアで、ビーズに固定されたTag情報からSNPのタイピングを行った。
【０１３３】
３．実験結果
（１）BIST-18CによるSNPタイピング
結果を図１７に示す。
（２）PCR-RFLP法との答え合わせ
結果を表１７に示す。但し、検体M4に関してはシークエンス結果と比較した。
【０１３４】
【表１７】
【０１３５】
４．考察
2段階プロトコルで使用していた1stPCR用のReverseプライマーとASPE用のForwardプライマーとｄUTPの5%にDIGがついたDIG Labeling Mix kit (roche)でPCRを行う事により、2回に分けて行っていた増幅反応とBISTハイブリ用のTAG付加とラベル化を同時に行うことができる１段階プロトコルを実現した。BISTでのタイピング結果においても、検証した4検体全て、栄養大手法(PCR-RFLP法)またはシーケンス結果と一致する良好な結果であった。
当方法を使用することで、自分たちで解析をしたいというユーザーにとっては省力化やランニングコストの低減、ユーザー間差の低減から精度の向上にもつながると考えられる。また、工程を減らせたことは、全自動化装置への展開を考慮した際に分注ロスが低減できるというメリットがある。
【０１３６】
〔実施例１０〕N-BISTを用いた肥満関連遺伝子9SNP解析
１．実験目的
産総研から提供してもらった数十種のゲノムについて、N-BISTによる肥満関連遺伝子同時９SNP解析を行う。
【０１３７】
２．実験方法・手順
N-BIST解析
（１）ASP-PCR
DICE（TAKARA）を用いてPCR反応を行った。20ul反応混合液は、9SNP ASP-PCR Primer Mix（表１８）を1.6 ul、ゲノムDNA（産総研提供検体5 各20 ng/ul）を2 ul、10xReaction Bufferを2 ul、ｄUTPの5%にBiotinがついた0.5mM dNTPを5 ul、50 mM MgCl2を0.8 ul、５U/ul Hot Gold starを0.1 ul、ｄH2Oを8.5 ul含んでいた。反応混合液は95℃にて10分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて30秒間を35サイクルさせ増幅を行った。さらに72℃にて5分間の伸長、の後、反応液を4℃に保持した。
【０１３８】
【表１８】
（２）ハイブリダイゼーション
Label化反応(ASP-PCR)後、対立遺伝子特異的伸長生成物のそれぞれを、TAG相補体を含むBIST中のビーズにて捕獲した。25%ホルムアミド、100mM MES、１M Na、20mM EDTA、0.01% Tween20からなるMESバッファー、200ug/ulサケ精子DNAが入ったハイブリダイゼーション溶液に95ulに5ulのLabel化反応産物を添加し、BISTに80ulを吸引し室温で5分間のハイブリダイゼーションを行った。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments 1ユニット、1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にて15分間BIST中のビーズに捕獲されたラベル化反応産物をAnti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragmentsと反応させた。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。BlockAceを取り除くため、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、さらに室温にてBIST中のビーズを洗浄した。これらの反応工程は全てプレシジョン・システム・サイエンス株式会社のMagtration System 6GCもしくは12GCを用いて自動で行った。
（３）検出・解析
反応させたBIST-18Cに発光基質(Super Signal)40 ulを吸引し、BISTnnerにてビーズの発光強度を測定した。また、専用のソフトウェアで、ビーズに固定されたTag情報からSNPのタイピングを行った。
【０１３９】
SNP部分のSequence解析
PCR産物の精製までを自社で行い、Macrogen社へ依頼した。
（１）PCR
DICE（TAKARA）を用いてPCR反応を行った。50ul反応混合液は、5uM Forward Primer、5uM Reverse Primer（表１９）を各4ul、ゲノムDNA（産総研提供検体 各20 ng/ul）を1 ul、10xReaction Bufferを5 ul、2.5mM each dNTPを4 ul、25 mM MgCl2を4 ul、５U/ul Hot Gold starを0.25ul、ｄH2Oを27.75 ul含んでいた。反応混合液は95℃にて10分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて30秒間を35サイクルさせ増幅を行った。
【０１４０】
【表１９】
（２）PCR Products Clean up
Magtration System 12GCのサンプル位置にPCR Productをセットし、精製操作を行った。
分注試薬
well 1：ChargeSwitch Purification Buffer、０.5% Tween 20
well 2：ChargeSwitch Magnetic beads
well 3：Washing Buffer 1
well 4：Washing Buffer 2
well 5：Washing Buffer 3
well 6：ChargeSwich Elution Buffer
【０１４１】
３．実験結果
（１）N-BIST解析結果
結果を図１８〜２１に示す。
（２）Sequence解読結果との答え合わせ
結果を表２０に示す。表中の「外注」はMacrogenによるSequence解読結果を示す。
【０１４２】
【表２０】
【０１４３】
４．考察
検体No.678を除いては、Sequence解析結果とN-BISTタイピング結果が一致し、プロトコルの精度が確認できたと考える。
検体No.678においては、N-BISTタイピングの結果とSequence解析の結果が一致していないが、Sequenceの波形を見ても、UCPにおいては「G」が、β2ARにおいては「A」の小さなピークが確認できる。N-BISTタイピングの結果においても、同様のタイプが低いシグナルとなっており、結果が一致していないとは考えにくい。従って、N-BISTを使ったBiotinラベルによる9SNP解析プロトコルを確立したといえる。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明の新規なオリゴヌクレオチドはTAGとして有用であり、このTAGの相補体を固定した基板は遺伝子解析に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１４５】
＜配列番号１〜１２０＞
配列番号１〜１２０は、新規なTAGを示す。
＜配列番号１２１＞
配列番号１２１は、3AR-mFプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２２＞
配列番号１２２は、3AR-mRプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２３＞
配列番号１２３は、UCP1-Fプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２４＞
配列番号１２４は、UCP1-Rプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２５＞
配列番号１２５は、AGT1-F-Newプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２６＞
配列番号１２６は、AGT1-R-Newプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２７＞
配列番号１２７は、MTHFR-Fプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２８＞
配列番号１２８は、MTHFR-Rプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２９＞
配列番号１２９は、3AR-ASP-PT109Tプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３０＞
配列番号１３０は、3AR-ASP-PT100Tプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３１＞
配列番号１３１は、UCP1-ASP-PT39Gプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３２＞
配列番号１３２は、UCP1-ASP-PT42Aプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３３＞
配列番号１３３は、AGT1-ASP-PT71Tプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３４＞
配列番号１３４は、AGT1-ASP-PT54Cプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３５＞
配列番号１３５は、MTHFR-ASP-PT73Cプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３６＞
配列番号１３６は、MTHFR-ASP-PT81Tプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３７＞
配列番号１３７は、RRF2プライマーの配列を示す。
＜配列番号１３８＞
配列番号１３８は、B1Rプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３９＞
配列番号１３９は、T3-type1プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４０＞
配列番号１４０は、T27-type25プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４１＞
配列番号１４１は、T28-type34プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４２＞
配列番号１４２は、T39-type24-2プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４３＞
配列番号１４３は、T42-type31-2プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４４＞
配列番号１４４は、T49-type26-2プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４５＞
配列番号１４５は、T53-type35プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４６＞
配列番号１４６は、T54-type19プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４７＞
配列番号１４７は、T56-type5プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４８＞
配列番号１４８は、T61-type27プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４９＞
配列番号１４９は、T71-type32プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５０＞
配列番号１５０は、T73-type33-2プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５１＞
配列番号１５１は、T81-type36プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５２＞
配列番号１５２は、T100-type13プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５３＞
配列番号１５３は、T109-type10プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５４＞
配列番号１５４は、T120-type28プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５５＞
配列番号１５５は、T3-type7プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５６＞
配列番号１５６は、T14-type16プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５７＞
配列番号１５７は、T27-type8プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５８＞
配列番号１５８は、T28-type17プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５９＞
配列番号１５９は、T39-type11プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６０＞
配列番号１６０は、T42-type23プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６１＞
配列番号１６１は、T49-type18プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６２＞
配列番号１６２は、T53-type29プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６３＞
配列番号１６３は、T54-type14プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６４＞
配列番号１６４は、T56-type9プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６５＞
配列番号１６５は、T61-type37プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６６＞
配列番号１６６は、T71-type12プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６７＞
配列番号１６７は、T73-type2プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６８＞
配列番号１６８は、T81-type38プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６９＞
配列番号１６９は、T100-type22プライマーの配列を示す。
＜配列番号１７０＞
配列番号１７０は、T109-type4プライマーの配列を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１４６】
【特許文献１】国際公開第WO01/048244号パンフレット
【非特許文献】
【０１４７】
【非特許文献１】A Microsphere-Based Assay for Multiplexed Single Nucleotide Polymorphism Analysis Using Single Base Chain Extension. Jingwen Chen; Marie A. Iannone; May-Sung Li; J. David Taylor; Philip Rivers; Anita J. Nelsen; Kimberly A. Slentz-Kesler; Allen Roses; Michael P. Weiner. 10:549-557 2000 by Cold Spring Harbor Laboratory Press ISSN 1088-9051/00
【非特許文献２】Analytical Validation of the Tag-It High-Throughput Microsphere-Based Universal Array Genotyping Platform: Application to the Multiplex Detection of a Panel of Thrombophilia-Associated Single-Nucleotide Polymorphisms. Susan Bortolin; Margot Black; Hemanshu Modi; Ihor Boszko; Daniel Kobler; Dan Fieldhouse; Eve Lopes; Jean-Michel Lacroix; Rebecca Grimwood; Philip Wells; Richard Janeczko; Roman Zastawny. Clinical Chemistry 50:11 2028-2036 (2004)
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子解析用基板に関し、より詳細には、新規なTAG配列の相補体が固定されている遺伝子解析用基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAの一塩基多型解析方法として、TAGを利用する方法、すなわち、ZipCodeタグという短いオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応を利用する方法がある（特許文献１及び非特許文献１）。この方法では、SNP部位を含むゲノムDNAの特定の断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりまず増幅する。二本鎖PCR産物を、SAPとエキソヌクレアーゼIで処置して一本鎖にし、ddNTP-FITC存在化で、SNP部位にすぐ隣接するよう設計したZipCodeタグシーケンスのオリゴヌクレオチドを末端に付加したプライマーで一塩基伸長反応を行う。このプライマーはSNP部位ごとに相補なシーケンスと異なるZipCodeタグシーケンスを付加する。そして微小ビーズに固定されたアンチセンスZipCodeタグシーケンスのオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションを行い、FITCのシグナルをフローサイトメーターで検出する。シグナルが検出されたZipCodeタグの番号からSNP部位のタイプを決定する事ができる。
【０００３】
また、同じくDNAにおける一塩基多型を解析する方法として、微小ビーズに固定したTAGを利用する方法がある（非特許文献２）。この方法では、dCTP-Biotin存在化で、SNP部位にすぐ隣接するよう設計したアンチセンスTAGシーケンスのオリゴヌクレオチドを末端に付加したプライマーでアレル特異プライマー伸長反応を行う。TAGを固定した微小ビーズとハイブリダイゼーションさせ、xMAPフローサイトメーター（Luminex）で検出している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このようにTAGを使った核酸サンプルにおける遺伝子検出、一塩基多型解析方法は公知の技術であるが、本発明は、これらのTAGとは配列が異なる新規なTAG（TAGオリゴヌクレオチド配列）を提供することを目的とする。
【０００５】
また、本発明は、新規なTAGの相補体が固定されている遺伝子解析用基板を提供することを目的とする。
【０００６】
さらに、本発明は、新規なTAGの相補体が固定されている基板を用いた遺伝子解析法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、下記の(1)〜(7)の条件を満たす少なくとも２種のオリゴヌクレオチドをTAGとして選択し、その相補体の配列の各々が固定されている基板を用いて遺伝子解析を行うことに成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明の要旨は以下の通りである。
【０００９】
（１）下記の(1)〜(7)の条件を満たす少なくとも２種のオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている基板。
(1)配列長が19-25merであること。
(2)融解温度（Tm）が64.0-69.0℃であること。
(3)標的核酸の配列との類似性が50%以下であること。
(4)高次構造をとらないこと。
(5)任意の２種を選んでもヘテロダイマーを形成しないこと。
(6)同一塩基の繰り返し数が４個以下であること。
(7)GC含量が40.0-60.0%であること。
（２）ビーズ又は磁性ビーズの形状をとる（１）記載の基板。
（３）ビーズ又は磁性ビーズのそれぞれに異なるオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている（２）記載の基板。
（４）糸の形状をとる（１）記載の基板。
（５）糸の異なる位置のそれぞれに異なるオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている（４）記載の基板。
（６）標的核酸の配列がヒトゲノム配列である（１）〜（５）のいずれかに記載の基板。
（７）オリゴヌクレオチドの配列が配列番号１〜１２０のいずれかの配列である（１）〜（６）のいずれかに記載の基板。
（８）オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号２、３、６、８、１２、１４，１６、１８、２１、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５２、５３、５４、５５、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、９６、１００、１０８、１０９、１１３、１１４、１１８及び１２０で表される（７）記載の基板。
（９）オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１２、１４，１６、２１、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、９６、１００、１０８、１０９、１１４、１１８及び１２０で表される（７）記載の基板。
（１０）オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１２、１４，１６、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、１００、１０８、１０９、１１８及び１２０で表される（７）記載の基板。
（１１）オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１２、１４、２７、２８、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、８４、１００、１０８、１０９及び１２０で表される（７）記載の基板。
（１２）オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１４，２７、２８、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、８４、１００、１０８、１０９及び１２０で表される（７）記載の基板。
（１３）オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１４、２７、２８、３９、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、１００、１０８、１０９及び１２０で表される（７）記載の基板。
（１４）（１）〜（１３）のいずれかに記載の基板を用いて、遺伝子解析を行う方法。
（１５）遺伝子解析が、一塩基多型解析である（１４）記載の方法。
（１６）遺伝子解析が、遺伝子検出である（１４）記載の方法。
（１７）配列番号１〜１２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド又はその相補体。
（１８）配列番号１〜１２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの組合せであって、200ug/mlサケ精子DNAを含む２×SSC中の常温でのハイブリダイゼーションの条件下で、互いにクロスハイブリダイゼーションしないオリゴヌクレオチドの組合せ。
（１９）（１８）の組合せに含まれるオリゴヌクレオチドの相補体の組合せ。
（２０）配列番号１〜１２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドが付加された核酸プライマー又はプローブ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、新規なTAGのハイブリダイゼーション反応を利用して核酸サンプルにおける遺伝子検出、一塩基多型解析が可能となった。この方法は、任意の遺伝子検出において利用でき、反応を多重化（Multiplex）することが容易になるため、データ読み出し容量を増加することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】クロスハイブリダイゼーション有無判定のImage画像を示す。
【図２】実施例３の特異的反応による蛍光強度を示す。
【図３】実施例３の選定２の後の26種のTAGの蛍光強度を示す。
【図４】TAG109とTAG012の蛍光強度を示す。
【図５】本発明の基板（ビーズ）を用いた遺伝子解析法（一塩基多型解析）の一例の概略を示す。
【図６】実施例５のSNP部位をマルチプレックスで増幅した増幅断片を電気泳動にて分離した結果を示す。
【図７】実施例５の一塩基多型解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【図８】実施例６のRDase遺伝子を網羅的に増幅した増幅断片を電気泳動にて分離した結果を示す。
【図９】実施例６のRDase遺伝子をBISTnnerで検出した発光データの波形を示す。
【図１０】実施例６の32type のRDase遺伝子をBISTnnerで検出して得られた３回のシグナルの平均値を示す。
【図１１】実施例７の抽出ゲノムの吸光度を示す。
【図１２】実施例７のゲノム抽出物を電気泳動にて分離した結果（左）とSNP部位をマルチプレックスで増幅した増幅断片を電気泳動にて分離した結果（右）を示す。
【図１３】実施例７のSNP解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【図１４】実施例８の抽出ゲノムの吸光度を示す。
【図１５】実施例８のSNP部位をマルチプレックスで増幅した増幅断片を電気泳動にて分離した結果を示す。
【図１６】実施例８の4SNP解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【図１７】実施例９の4SNP解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【図１８】実施例１０の9SNP解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【図１９】実施例１０の9SNP解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【図２０】実施例１０の9SNP解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【図２１】実施例１０の9SNP解析をBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、下記の(1)〜(7)の条件を満たす少なくとも２種のオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている基板を提供する。
【００１４】
(1)配列長が19-25merであること。
(2)融解温度（Tm）が64.0-69.0℃であること。
(3)標的核酸の配列との類似性が50%以下であること。
(4)高次構造をとらないこと。
(5)任意の２種を選んでもヘテロダイマーを形成しないこと。
(6)同一塩基の繰り返し数が４個以下であること。
(7)GC含量が40.0-60.0%であること。
【００１５】
本明細書において、(1)〜(7)の条件を満たす少なくとも２種のオリゴヌクレオチドのそれぞれを「TAG」、「TAGヌクレオチド」、「タグ配列」などと呼ぶこともある。
【００１６】
本発明において、TAGは配列長が19-25merである（条件(1)）。TAGは配列長があまり短ければ十分なTm値を確保できず，あまり長ければ非特異的なアニーリングが起こるため、19-25merが適当である。
【００１７】
TAGの融解温度（Tm）は64.0-69.0℃である（条件(2)）。融解温度（Tm）は、最近接法１（reslauer. et al., PNAS, vol.83:3746-3750）などの方法により、算出することができる。上記の方法における熱力学パラメーターとしては、Breslauer. et al., PNAS, vol.83:3746-3750に記載の数値を用いることができる。
【００１８】
このTmであれば、室温での100%ハイブリダイゼーションが予測できる。
【００１９】
TAGは、標的核酸の配列との類似性が50%以下である（条件(3)）。標的核酸の配列としては、ヒトゲノム配列、ヒトＲＮＡ配列などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００２０】
これらの標的核酸の配列情報は、NCBI/GenBankなどの種々のデータベースから入手することができる。
【００２１】
標的核酸の配列との類似性は、データベース中の配列を１つずつ取り出し、標的核酸配列とペアワイズにローカルアライメントを行うなどの方法により、算出することができる。標的核酸を検出するためにTAGはプライマーの末端に付加するため、類似性が高いと標的核酸とTAGの見分けがつかず、正しくPCRが行われないなど最終的には誤判定につながる可能性があるため、TAGは標的核酸の配列との類似性が50%以下であることが好ましい。
【００２２】
TAGは高次構造をとらない（条件(4)）。高次構造としては、ダイマー形成、ヘアピンループなどの二次構造などを例示することができる。
【００２３】
高次構造形成能の検証には、ウィーン大学が開発したVienna RNA パッケージ、OLIGOTM Primer Analysis Software（タカラバイオ株式会社）などを利用することができる。検証時の温度条件としては、常温(25℃)を用いるとよい。遺伝子解析法として使用するハイブリダイゼーションは、1本鎖の核酸の塩基が結合することであり、高次構造をとるとその反応をさまたげるので、TAGは高次構造をとらないことが好ましい。
【００２４】
TAGは、任意の２種を選んでもヘテロダイマーを形成しない（条件(5)）。ヘテロダイマー形成とは、１つまたはそれ以上のミスマッチによる部分的な二本鎖形成を意味する。
【００２５】
ヘテロダイマー形成能の検証には、ウィーン大学が開発したVienna RNA パッケージなどを利用することができる。検証時の温度条件としては、常温(25℃)を用いるとよい。それぞれのTAGがそれぞれの標的核酸検出に対応するため、TAG同士がヘテロダイマーを形成すると正しく遺伝子解析を行うことができないため、TAGは、任意の２種を選んでもヘテロダイマーを形成しないことが好ましい。
【００２６】
TAGは、同一塩基の繰り返し数が４個以下である（条件(6)）。「同一塩基の繰り返し数が４個以下である」という条件により、TAGは４個以上の同一タンデム配列やリピート配列を含まないことになる。得にGCは反応が強いためリピート配列があると非特異的な反応につながるため、TAGは同一塩基の繰り返し数が４個以下であることが好ましい。
【００２７】
TAGは、GC含量が40.0-60.0%である（条件(7)）。40.0-60.0%のGC含量は、一般的にプライマーの設計に適していると言われている数値である。
【００２８】
本発明の基板は、ビーズ、糸（ストランド）、磁性ビーズ、などの形状をとることができる。
【００２９】
本発明の基板がビーズ又は磁性ビーズの形状をとる場合には、ビーズ又は磁性ビーズのそれぞれに異なるオリゴヌクレオチドの相補体が固定されているとよい。
【００３０】
本発明の基板が糸の形状をとる場合には、糸の異なる位置のそれぞれに異なるオリゴヌクレオチドの相補体が固定されているとよい。
【００３１】
(1)〜(7)の条件を満たすTAGの例として、配列番号１〜１２０のTAGを例示することができる。これらの配列は、条件(3)の標的核酸の配列としてヒトゲノム配列を選択して得られたものである（後述の実施例１を参照のこと）。
【００３２】
配列番号２、３、６、８、１２、１４，１６、１８、２１、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５２、５３、５４、５５、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、９６、１００、１０８、１０９、１１３、１１４、１１８及び１２０で表されるTAGは、200ug/mlサケ精子DNAを含む２×SSC中の常温でのハイブリダイゼーション条件下で、クロスハイブリダイゼーションを起こす可能性がより低いと予想された（後述の実施例２を参照のこと）。
【００３３】
さらに、配列番号３、１２、１４，１６、２１、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、９６、１００、１０８、１０９、１１４、１１８及び１２０で表されるTAGは、Cy5オリゴヌクレオチドを用いた蛍光強度の差が小さかった（後述の実施例３（選定１）を参照のこと）。
【００３４】
さらに、配列番号３、１２、１４，１６、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、１００、１０８、１０９、１１８及び１２０で表されるTAGは、200ug/mlサケ精子DNAを含む２×SSC中の常温でのハイブリダイゼーションの条件下で、クロスハイブリダイゼーションが無かった（後述の実施例３（選定２）を参照のこと）。
【００３５】
さらに、配列番号３、１２、１４、２７、２８、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、８４、１００、１０８、１０９及び１２０で表されるTAGは、Cy5オリゴヌクレオチドを用いた蛍光強度の差がより小さかった（後述の実施例３（選定３）を参照のこと）。
【００３６】
さらに、配列番号３、１４，２７、２８、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、８４、１００、１０８、１０９及び１２０で表されるTAGは、Cy5オリゴヌクレオチドを用いた蛍光強度の差がさらに小さい（後述の実施例３（選定４）を参照のこと）。
【００３７】
さらに、配列番号３、１４、２７、２８、３９、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、１００、１０８、１０９及び１２０で表されるTAGは、クロスハイブリダイゼーションが行われず特異性のあるハイブリダイゼーションが行えることとハイブリダイゼーションシグナルにあまり差がないことから検出が比較的容易に行えることといった利点がある（後述の実施例３（選定５）を参照のこと）。
【００３８】
上記の(1)〜(7)の条件を満たすTAGの相補体が固定された基板を用いて、遺伝子解析を行うことができる。
【００３９】
基板としては、ビーズ、糸（ストランド）、磁性ビーズなどを挙げることができる。
【００４０】
ビーズは、大きさは1mm程度で、プラスチックやセラミックなどの材質のものであるとよく、このようなビーズは、特開2000-346842号公報、特表平14-534657号公報などに記載されている。
【００４１】
磁性ビーズは、大きさは数十μmで、プラスチックやセラミックなどに鉄粉等を混ぜ、磁気化したものであるとよい。このようなビーズは、特開平8-62224号公報（特許第3115501号明細書）、国際公開WO96/29602パンフレット、国際公開WO97/44671パンフレットなどに記載されている。
【００４２】
糸（ストランド）は、大きさは直径0.1mm程度で、樹脂系の材質のものであるとよく、このような糸は、特開2006-214759号公報、国際公開WO01/53831パンフレット、国際公開WO2003/7901パンフレットなどに記載されている。
【００４３】
基板表面には、TAGの相補体を結合できる官能基を生成させてもよい。例えば、基板がポリアミド系高分子の素材で作製されている場合には、ポリアミド系高分子が有するペプチド結合を加水分解することにより、カルボキシル基(-COOH)、アミノ基(-NH2)などの官能基を生成させることができる。
【００４４】
TAGの相補体は、公知のＤＮＡ合成法により、市販のＤＮＡ合成機を用いて製造することができる。
【００４５】
TAGの相補体を基板に固定するには、固体表面へＤＮＡを固定するための公知のいかなる方法を用いてもよい。例えば、基板の末端をカルボキシル基などの官能基などで修飾し、カルボジイミドなどの試薬を用いて、化学的にTAGの相補体を基板に固定することができる。また、基板をアビジン又はストレプトアビジンで被覆し、TAG相補体をビオチン化すれば、アビジンとビオチンとの間の特異的反応によって、TAGの相補体を基板に結合させることができる。あるいはまた、TAGの相補体を基板に物理的に吸着させる方法などもある。TAGの相補体にはスペーサー配列を付加してもよい。
【００４６】
TAGの相補体が固定された基板を用いて行うことができる遺伝子解析としては、一塩基多型解析、遺伝子検出などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００４７】
一塩基多型解析を行うには、A Microsphere-Based Assay for Multiplexed Single Nucleotide Polymorphism Analysis Using Single Base Chain Extension. Jingwen Chen; Marie A. Iannone; May-Sung Li; J. David Taylor; Philip Rivers; Anita J. Nelsen; Kimberly A. Slentz-Kesler; Allen Roses; Michael P. Weiner. 10:549-557 2000 by Cold Spring Harbor Laboratory Press ISSN 1088-9051/00（非特許文献１）、Analytical Validation of the TAG-It High-Throughput Microsphere-Based Universal Array Genotyping Platform: Application to the Multiplex Detection of a Panel of Thrombophilia-Associated Single-Nucleotide Polymorphisms. Susan Bortolin; Margot Black; Hemanshu Modi; Ihor Boszko; Daniel Kobler; Dan Fieldhouse; Eve Lopes; Jean-Michel Lacroix; Rebecca Grimwood; Philip Wells; Richard Janeczko; Roman Zastawny. Clinical Chemistry 50:11 2028-2036 (2004)（非特許文献２）などを参照するとよい。
【００４８】
遺伝子検出を行うには、TaqMan PCR法について記載しているAllelic discrimination using fluorogenic probes and the 5’ nuclease assay. Livak KJ. Gnenet Anal 14, 143 (1999);Rapid reverse transcription-PCR detection of Hepatitis C virus RNA in serum by using the TaqMan fluorogenic detection syste. Morris T et al. J Clin Microbiol 34, 2933 (1996)、Invader法について記載しているStructure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases. Lyamichev V et al. Science 260, 778 (1993)；Polymorphism identification and quantitative detection of genomic DNA by invasive clevage of oligonucleotide probes. Lyamichev V et al. Nat Biotechnol 17, 292 (1999)；Comparison of the 5’ nuclease activities of Taq DNA polymerase and its isolated nuclease domain. Lyamichev V et al. Proc Natl Acad Sci USA 96, 6143 (1999)；A comparison of eubacterial and archaeal structure-specific 5’-exonucleases. Kaiser MW et al. J Biol Chem 274, 21387 (1999)などを参照するとよい。
【００４９】
TaqMan PCR法（Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5’ nuclease assay. Livak KJ. Gnenet Anal 14, 143 (1999)；Rapid reverse transcription-PCR detection of Hepatitis C virus RNA in serum by using the TaqMan fluorogenic detection syste. Morris T et al. J Clin Microbiol 34, 2933 (1996)）は、蛍光標識をしたアレル特異的オリゴとTaq DNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用した方法である。アレル特異的オリゴ（TaqManプローブ）は約20塩基程度の長さであり、5’末端はFAMやVICなどの蛍光レポーター色素、3’末端がクエンチャー（消光物質）によって標識されている。このプローブが鋳型DNAの得意的な配列にハイブリダイゼーションし、同時にPCRプライマーから伸長反応が起こる。この際、TaqDNAポリメラーゼは5’ヌクレアーゼ活性を有しているため、PCRプライマーの伸長反応が進む際にハイブリダイゼーションをしたTaqManプローブを切断する。TaqManプローブが切断されると、蛍光色素がクエンチャーの影響を受けなくなり蛍光が検出される。この蛍光を検出することで、目的の遺伝子有無が確認できる方法である。
【００５０】
Invader法（Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases. Lyamichev V et al. Science 260, 778 (1993)；Polymorphism identification and quantitative detection of genomic DNA by invasive clevage of oligonucleotide probes. Lyamichev V et al. Nat Biotechnol 17, 292 (1999)；Comparison of the 5’ nuclease activities of Taq DNA polymerase and its isolated nuclease domain. Lyamichev V et al. Proc Natl Acad Sci USA 96, 6143 (1999)；A comparison of eubacterial and archaeal structure-specific 5’-exonucleases. Kaiser MW et al. J Biol Chem 274, 21387 (1999)）は、TaqMan PCR法と同様にアレル特異的オリゴと鋳型をハイブリダイゼーションさせることによりタイピングする方法である。2種類の非蛍光標識オリゴのうちひとつは、蛍光標識の代わりに鋳型の配列とは無関係な配列（フラップ）を5’側に有している（アレルプローブ）。3’側は鋳型に特異的な相補配列であり、特異的な配列の5’末端はSNP部となっている。もうひとつのオリゴは、インベーダープローブと呼ばれており、SNP部位からの鋳型の3’側に相補的に結合するように設計されている。鋳型と2つのプローブをハイブリダイゼーションさせるとSNP部分にインベーダープローブの1塩基が侵入する。このときSNP部には3つの塩基が並ぶことになり、これをエンドヌクレアーゼ活性を有する特殊な酵素（cleavase）で切断する。この切断されたフラップが、Fluorescence resonance energy transfer (FRET)プローブの3’側に配置した相補な配列と相補結合する。相補結合することで、フラップのSNP部がFRET自身の相補結合部位に侵入し、cleavaseが再びこの構造を認識して切断する。FRETプローブの5’末端にはTaqManプローブと同様の蛍光色素が標識されており、上流にはクエンチャーが結合しているため、切断されることで、クエンチャーと離れ蛍光を発する。この蛍光を検出することで、目的の遺伝子有無が確認できる方法である。
【００５１】
シグナルの検出法としては、蛍光検出と化学発光が主な検出法であり、マイクロタイタープレート検出機やスキャナー型のイメージアナライザーなどがある。
【００５２】
また、本発明は、配列番号１〜１２０のいずれかで表されるTAGからなるオリゴヌクレオチド又はその相補体；配列番号１〜１２０のいずれかで表されるTAGからなるオリゴヌクレオチドの組合せであって、200ug/mlサケ精子DNAを含む２×SSC中の常温でのハイブリダイゼーションの条件下で、互いにクロスハイブリダイゼーションしないオリゴヌクレオチドの組合せ；及び上記のオリゴヌクレオチドの組合せに含まれるオリゴヌクレオチドの相補体の組合せも提供する。配列番号１〜１２０のいずれかで表されるTAGからなるオリゴヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成法により、市販のＤＮＡ合成機を用いて製造することができ、遺伝子解析用のTAGとして利用可能である。これらのオリゴヌクレオチドはTAGとして核酸プライマーやプローブに付加されてハイブリダイゼーションに供される。そのハイブリダイゼーションの条件としては、200ug/mlサケ精子DNAを含む２×SSC中の常温でのハイブリダイゼーションという条件の他、200ug/ulサケ精子DNA 、25％ホルムアミド、0.01% Tween20を含むMES溶液の常温でのハイブリダイゼーションなどを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００５３】
さらに、本発明は、配列番号１〜１２０のいずれかで表されるTAGからなるオリゴヌクレオチドが付加された核酸プライマー又はプローブも提供する。これらの核酸プライマー及びプローブは、公知のＤＮＡ合成法により、市販のＤＮＡ合成機を用いて製造することができ、TAGの相補体が固定された基板を用いた遺伝子解析に利用可能である。
【実施例】
【００５４】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに何ら影響されることはない。
【００５５】
〔実施例１〕TAG設計
19〜25merの配列をランダムに生成し、下記の(1)〜(7)の条件を満たすTAGを選定した。選定したTAGを優先順位の高い順番に番号付けし（TAG001-TAG120）、その配列を配列番号１〜１２０に示す。
【００５６】
(1)配列長が19-25merであること。
(2)融解温度（Tm）が64.0-69.0℃であること。
(3)ヒトゲノム配列（標的核酸の配列）との類似性が50%以下であること。
(4)高次構造をとらないこと。
(5)任意の２種を選んでもヘテロダイマーを形成しないこと。
(6)同一塩基の繰り返し数が４個以下であること。
(7)GC含量が40.0-60.0%であること。
【００５７】
Tm値の算出には最近接法1の計算式を用いた。最近接法2により算出したTm値は参考値とした。
【００５８】
熱力学パラメータ：Breslauer, et al., PNAS, vol 83: 3746-3750.
最近接法1：
Tm = ΔH / (ΔS + Rln(Ct/4)) - 273.15 + 16.6log[Na+]
Ct：DNA 濃度; 500nM、Na+：ナトリウムイオン濃度; 50mM
R：気体定数（1.987cal/deg・mol）
ヒト配列との特異性(類似性)を検証には、3 つの配列データベース（NCBI RefSeq アセンブル済ゲノム配列 (BUILD 36.1; 1〜23,X,Y 染色体)、NCBI RefSeq RNA 配列 (2006/07/17 更新版; 40368 配列)、NCBI UniGene クラスタ配列 (BUILD #194;86810 配列)）を用いた。TAGはこれらのデータベースに含まれるすべての配列との類似性が、50%以下になるように設計を行った。
【００５９】
TAGの高次構造形成能（TAGの二次構造、ダイマー形成、ヘテロダイマー形成能）の検証には、ウィーン大学が開発したVienna RNA パッケージを使用した。また、二次構造、ダイマー形成、ヘテロダイマー形成能検証時の温度条件には常温(25℃)を用いた。
【００６０】
〔実施例２〕TAGの組合せ（１）
実施例１の優先順位結果、「Oligo」ソフト（OLIGOTM Primer Analysis Software（タカラバイオ株式会社））で予測したヘアピン構造の形成条件予測、Handy Bio-Strandシステム（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社）を用いたハイブリダイゼーション結果より、クロスハイブリダイゼーションを起こさないと予測される３６種（TAG002、003、006、008、012、014，016、018、021、025、027、028、030、039、040、042、049、052、053、054、055、056、061、071、073、076、081、084、096、100、108、109、113、114、118及び120）の組合せを選定した。
【００６１】
Bio−Strandを用いたハイブリダイゼーション条件は、200ug/mlサケ精子DNAを含む２×SSC溶液にCy5ラベルしたTAGを入れ、Bio-Strandチップに吸引しストランド上に固定してあるタグ相補配列と常温でハイブリダイゼーションさせ洗浄して、専用のスキャナーでCy5のシグナルを検出し、特異的な反応が起きているかどうかを判断した。選定基準はスポットシグナルが出たことを目視で判定できることとした。
【００６２】
〔実施例３〕TAGの組合せ（２）
１．実験目的
反応用ビーズに固定するプローブとして適したTAGを候補となっている36種（実施例２）から選定する。
【００６３】
２．実験方法・手順
＜使用器具・機器＞
・Handy Bio-Strand一式
Handy Bio-Strand Kenzan （PSS、Code No.D4011）
Handy Bio-Strand Strand Kit （PSS、 Code No.D4010 Lot No.A05S1300）
Handy Bio-Strand Stamper （PSS、Code No.D4001 Lot No.HTB01-003）、
Handy Bio-Strand Spinner （PSS、Code No.D4002 Lot No.HP001-003）、
Handy Bio-Strand Rotator （PSS、Code No.D4004 Lot No.HRB01-010）、
Handy Bio-Strand Scanner (PSS、Code No.D4005 Lot No.HCC01-0023)
・384穴プレート（GENETX、X6004）
・SPECTRO LINKER XL-1500UV CROSS LINKER (Spectronics、UV-C)
・SX-12GC（PSS、Code No.A1003）
・ICカード（SX-12GC用 Hybri Machine V0.5/Firmware 12GC E200）
・Water Bath
・ボルテックス
・チビタン
・Nano Drop
・Hy-Soft (PSS、Ver.0.1.7.S)
＜使用試薬＞
・Sheared Salmon Sperm DNA 10mg/ml （エッペンドルフ）
・20×SSC （Wako）
・10％SDS （Wako）
・超純水
・Marker Cy5 CFWT 合成オリゴヌクレオチド （SIGMA）
・TAG 合成オリゴヌクレオチド （SIGMA） 36種
【００６４】
【表１】
・Cy5 TAGc 合成オリゴヌクレオチド （SIGMA） 36種
【００６５】
【表２】
＜実験方法＞
１）TAG 合成オリゴヌクレオチドとCy5 TAGc 合成オリゴヌクレオチドを10uMになるよう超純水で調製し、NanoDropで濃度測定を行った。10uMに希釈したTAG 合成オリゴヌクレオチドを2uMに、Cy5 TAGc 合成オリゴヌクレオチドを1uMに超純水で希釈した。
【００６６】
２）Pre-Hybridization Bufferに使用するSheared Salmon Sperm DNA (10mg/ml)を95℃設定のWater Bathで３分ボイル後、氷上にて急冷を行った。
【００６７】
３）各Bufferの調製を行った。
【００６８】
Wash Buffer 1 ： 2×SSC、0.1%SDS
Wash Buffer 2 ： 1×SSC、0.1%SDS
Wash Buffer 3 ： 0.1×SSC、0.1%SDS
Detection Buffer ： 2×SSC
Pre-Hybridization Buffer ： 2×SSC、200ug/ml Sheared Salmon Sperm DNA
Hybridization Buffer ： 2×SSC、200ug/ml Sheared Salmon Sperm DNA、10nM Cy5 TAGc
※Hybridization反応は36種の固定化TAG 合成オリゴヌクレオチドに対し、Cy5 TAGc 合成オリゴヌクレオチドを１種類ずつ反応させるため、Hybridization BufferはCy5 TAGc 合成オリゴヌクレオチド別にそれぞれ調製した。
【００６９】
４）下記のSpot Mapに従い、2uMのTAGを384穴プレートへ5ulずつ分注した。（Spot MapにはTAGのNo.を記した。また、Mの箇所にはMarkerを分注した。）
【００７０】
【表３】
５）384穴プレートに分注したTAGをHandy Bio-Strand Stamper、KenzanおよびStrand Kitを用いて４回（各５秒）スポットを行った。
【００７１】
６）スポットしたCassetteをHandy Bio-Strand Spinnerを用いてストランドをコアピンに巻き取り、Handy Bio-Strand Rotatorにセットし、SPECTRO LINKER XL-1500UV CROSS LINKERにて70mJ/cm2のUV照射を行った。
【００７２】
７）UV照射後のコアピンをBS-2000 Tip（PSS、Handy Bio-Strand一式中に含まれている）に挿入した。
【００７３】
８）カートリッジへ下記の通り試薬分注を行い、SX-12GCおよびICカードにて常温でのハイブリダイゼーションを行った。
【００７４】
Well 1 ： Pre-Hybridization Buffer 500ul
Well 2 ： Pre-Hybridization Buffer 500ul
Well 3 ： Hybridization Buffer 500ul
Well 4 ： Wash Buffer 1 500ul
Well 5 ： Wash Buffer 2 500ul
Well 6 ： Wash Buffer 3 500ul
Well 7 ： Detection Buffer 500ul
９）Hybridization後、Handy Bio-Strand Scannerにて測定（50msec）し、Hy-softで解析を行い、特異反応スポットの蛍光強度を数値化した。
【００７５】
10）翌日、再度Handy Bio-Strand Scannerにて測定（50msec）し、目視によりクロスハイブリダイゼーションの有無を確認した。
【００７６】
＜クロスハイブリダイゼーション有無の判定方法＞
クロスハイブリダイゼーション有無の判定をHy-softのImage画像より目視で行った。目視によりスポットとして認識したTAG No.を得るため、Hy-SoftのImage画像の▼（赤三角）をスポットの場所にあわせて、plate画像の□（赤四角）が示す場所を確認した。クロスハイブリダイゼーション有無判定のImage画像を図１に示す。
【００７７】
３．実験結果・選定
＜特異的反応による蛍光強度について＞
特異的反応によるハイブリダイゼーションによって得られた蛍光強度を図２に示す。
【００７８】
（選定１）蛍光強度の差をできるだけ小さくするため、特異的反応によるハイブリダイゼーションによって得られた蛍光強度が20000以下のTAG（TAG002・TAG006・TAG008・TAG018・TAG113）と蛍光強度が40000以上のTAG（TAG052・TAG055）は除外した。
【００７９】
＜クロスハイブリダイゼーションについて＞
選定１で選定された29種のTAGについてクロスハイブリダイゼーションの有無を表４に示す。
【００８０】
【表４】
（選定２）クロスハイブリダイゼーションが２つ以上得られたTAG021・TAG096・TAG114を除外した。
【００８１】
＜選定１・２で除外されなかったTAGの蛍光強度とクロスハイブリダイゼーション＞
選定２で除外されたTAGを考慮すると、残った26種のTAGのクロスハイブリダイゼーションの有無は表５のようになった。また、26種のTAGの蛍光強度を図３に示す。
【００８２】
【表５】
（選定３）蛍光強度の差をできるだけ小さくするため、蛍光強度が25000以下のTAG（TAG016・TAG025・TAG030・TAG076・TAG118）は除外した。
【００８３】
＜選定３で除外されなかったTAGの蛍光強度とクロスハイブリダイゼーション＞
選定３で除外されたTAGを考慮すると、残った21種のTAGのクロスハイブリダイゼーションの有無は表６のようになった。また、クロスハイブリダイゼーションが見られたTAG109とTAG012のシグナルを図４に示す。
【００８４】
【表６】
（選定４）TAG012とTAG109に関してだが、特異的反応によるハイブリダイゼーションによって得られた蛍光強度の平均が約30000であることから、TAG012はクロスハイブリダイゼーションが見られないが、蛍光強度の値が平均に近いTAG109を選定した。
【００８５】
４．結論
選定１から４により下記の表７に示す20種のTAGを選定した。
【００８６】
【表７】
（選定５）
後述の実施例５に記載の一塩基多型解析を行うにあたり、TAGに付加するプライマーシーケンスとでヘアピン構造を作らないという選定基準で、TAG003、014、027、028、039、042、049、053、054、056、061、071、073、081、100、108、109、120を選定した。
【００８７】
〔実施例４〕キャピラリービーズアレイの製造
実施例３で選定したTAGの相補体が固定されたビーズをキャピラリーに充填したキャピラリービーズアレイを以下のように製造した。
【００８８】
1×PBSで洗浄した非磁性ビーズを詰めたキャピラリーを用意し、Magtration System 12GCを使って以下に示す各試薬を順に反応させ、TAGの相補体をビーズに固定化した。ここで、10種のTAG相補体を固定化させたキャピラリービーズアレイをBIST-10（TAG014、039、042、054、071、073、081、084、100、109の相補体）とし、18種のTAG相補体（TAG003、014、027、028、039、042、049、053、054、056、061、071、073、081、100、108、109、120の相補体）を固定化させたキャピラリービーズアレイをBIST-18Cとした。
【００８９】
分注試薬
well 1：0.1mg/ml Avidin溶液
well 2：PBS-T (Tween0.05%)
well 3：PBS-T (Tween0.05%)
well 4：Blocking Buffer
well 5：0.8uM TAG相補体オリゴDNA溶液
well 6：PBS-T (Tween0.05%)
well 7：PBS-T (Tween0.05%)
well 8：1%BlockAce
well 9：5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaCl
well 10：2.5mM Tis-HCl、0.25mM EDTA、0.5M NaCl
本実施例に使用する各試薬は全て製造を委託している、ジェネテイン株式会社で調達した。
【００９０】
また、以下の手順で、N-BISTを調製した。
ナイロンをコーティングした非磁性ビーズを詰めたキャピラリーを用意し、Magtration System 12GCを使って以下に示す各試薬を順に反応させ、TAGの相補体をビーズに固定化した。ここで、10種のTAG相補体を固定化させたキャピラリービーズアレイをBIST-10（TAG014、039、042、054、071、073、081、084、100、109の相補体）とし、18種のTAG相補体（TAG003、014、027、028、039、042、049、053、054、056、061、071、073、081、100、108、109、120の相補体）を固定化させたキャピラリービーズアレイをBIST-18Cとした。
【００９１】
分注試薬
well 1：41.25mg/ml EDC溶液、約6.6uM TAG相補体オリゴDNA溶液
well 2：PBS-T (Tween0.05%)
well 3：PBS-T (Tween0.05%)
well 4：超純水
well 5：超純水
【００９２】
本実施例に使用する各試薬は自社で調整した。
なお、このN-BISTは後述の実施例１０で使用した。
【００９３】
〔実施例５〕一塩基多型解析
１．実験目的
実施例４で製造したキャピラリービーズアレイを用いて一塩基多型解析を行った。操作の概略を図５に示す。
【００９４】
２．実験方法・手順
Allele Specific Primer Extensionおよび実施例４で製造したキャピラリービーズアレイ（BIST-10)を用いて自動一塩基多型解析方法を開発した。BIST中のビーズにマルチプレックス同時判定を可能にするためのTAG相補体を結合させる。一塩基多型特異的配列とTAGを両配列に含むプライマーで、DNAポリメラーゼおよび標識化デオキリボヌクレオチド存在下で伸長反応を行う。BIST検出のためにTAGはBISTビーズに固定されたTAG相補体とハイブリダイズする。BIST中のビーズの標識を検出することで、一塩基多型解析を行う。TAGを使用することで、マルチプレックスのハイブリダイゼーション条件が容易になり、複数の同時一塩基多型解析が可能になる。実施例１、２、３で選定したクロスハイブリダイゼーションを起こさないTAGで実施例４に記載の方法でBISTを製造し、他の技術により決定された遺伝子型との比較により精度を確認した。
【００９５】
本実施例に使用するHot Gold star（カタログ番号：３１４−８０２５１）ポリメラーゼは株式会社ニッポンジーンから購入した。BIOTAQ（カタログ番号：BIO-21040）ポリメラーゼはBIOLINEから購入した。Digoxigenin-11-2’-deoxy-uridine-5’-triphosphate, alkali-stable（カタログ番号：１１０９３０８８９１０）はRocheから購入した。PCRプライマー、標識化プライマーはオペロンに注文した。デオキシリボヌクレオチド（カタログ番号：D7295）、MES-free acid monohydrate（カタログ番号：M2933）、MES Sodium Salt（カタログ番号：M3058）はSIGMAから購入した。NaCl（カタログ番号：１９１−０１６６５）、EDTA2Na・2H2O（カタログ番号：３４５−０１８６５）、水酸化ナトリウム（カタログ番号：197-02125、196-05375）、Tween20（カタログ番号：１６３−１１５１２）、ホルムアミド（カタログ番号：０６６−０２３０１）は和光純薬工業株式会社から購入した。ブロックエース（カタログ番号：UK-B80）は大日本住友製薬から購入した。Guardian（カタログ番号：37548）、SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate（カタログ番号：３４０９４）はPieaceから購入した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments（カタログ番号：11644716001）はRocheから購入した。解析したゲノムDNAは女子栄養大学から提供してもらった。
【００９６】
PCR増幅
DICE（タカラバイオ）を用いてPCR反応を行った。20ul反応混合液は、15mM Tis-HCl pH8.0、50mM KCl、0.01% Tween 20、2mM MgCl2、2mM dNTP、各プライマー（表８）を0.4uM、Hot Gold star DNAポリメラーゼ 0.5ユニット、および20ngゲノムDNAを含んでいた。反応混合液は95℃にて10分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて15秒間、60℃にて15秒間、72℃にて15秒間を35サイクルさせ増幅を行った。さらに72℃にて5分間の伸長の後、反応液を4℃に保った。
【００９７】
【表８】
Label化反応（Allele Specific Primer Extension）
PCR産物 2ulに、Label化混合液18ul添加し20ulの反応混合液を作成した。反応混合液は、16mM (NH4)2SO4、67mM Tis-HCl pH8.8、0.01% Tween 20、2mM MgCl2、10uM dATP、10uM dGTP、10uM dCTP、1uM Digoxigenin-11-2’-deoxy-uridine-5’-triphosphate, alkali-stable、各プライマー（表９）を0.4uM、BIOTAQ DNAポリメラーゼ 1ユニット、を含んでいた。反応混合液は95℃にて2分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて20秒間、55℃にて20秒間、72℃にて15秒間を20サイクルさせ増幅を行い、反応液を4℃に保った。
【００９８】
【表９】
BIST-10とLabel化反応産物のハイブリダイゼーション
Label化反応後、対立遺伝子特異的伸長産物のそれぞれを、TAG相補体を含むBIST中のビーズにて捕獲した。25%ホルムアミド、100mM MES、１M Na、20mM EDTA、0.01% Tween20からなるMESバッファー、200ug/ulサケ精子DNAが入ったハイブリダイゼーション溶液に95ulに5ulのLabel化反応産物を添加し、BISTに80ulを吸引し室温で5分間のハイブリダイゼーションを行った。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments 1ユニット、1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にて15分間BIST中のビーズに捕獲されたラベル化反応産物をAnti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragmentsと反応させた。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。BlockAceを取り除くため、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、さらに室温にてBIST中のビーズを洗浄した。これらの反応工程は全てプレシジョン・システム・サイエンス株式会社のMagtration System 6GCもしくは12GCを用いて自動で行った。
【００９９】
BIST中ビーズの発光シグナル検出
プレシジョン・システム・サイエンス株式会社が開発したBISTnner（BIST専用検出装置）を用いてBIST中ビーズの発光シグナルを測定した。発光試薬は、SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrateを用いた。
【０１００】
３．実験結果
（１）PCR産物の電気泳動評価
結果を図６に示す。各増幅断片は、目的のSNPサイトをマルチプレックスで増幅した増幅断片を電気泳動にて分離した結果を表す。
【０１０１】
（２）BIST-10によるSNPタイピング
結果を図７に示す。図７の下図はBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。振幅の大きい波形が発光強度で、振幅の小さい波形がビーズの影を測定したデータである。ビーズがあるところは振幅の小さい波形が検出できないため谷の波形を描く。この振幅の小さい波形の谷と振幅の大きい波形の山を重ね合わせることで、何番目のビーズがいくつの発光強度を示すかがわかる。上図はこのビーズの位置情報と発光強度をSNPごとに並びかえたデータである。たとえば、検体No．112の3ARはTアレルのビーズにのみシグナルが出ているので、TTタイプとなるといえる。
【０１０２】
（３）PCR-RFLP法との答え合わせ
結果を下記の表に示す。
【０１０３】
【表１０】
４．考察
異なるシーケンスである3種類の検体全てにおいて、PCR-RFLP法の解析結果と一致した。
【０１０４】
〔実施例６〕Dehalococcoides属細菌還元的脱塩素化酵素遺伝子検出
１．実験目的
実施例４で製造したキャピラリービーズアレイ（BIST-18C）を用いてクロロエチレン類により汚染された地下水からのDehalococcoides属細菌還元的脱塩素化酵素（RDase）遺伝子を検出した。
【０１０５】
２．実験方法・手順
Allele Specific Primer Extensionおよび実施例４で製造したキャピラリービーズアレイ（BIST-18C)を用いて自動遺伝子検出方法を開発した。BIST中のビーズにマルチプレックス同時判定を可能にするためのTAG相補体を結合させる。標的遺伝子特異的配列とTAGを両配列に含むプライマーで、DNAポリメラーゼおよび標識化デオキリボヌクレオチド存在下で伸長反応を行う。BIST検出のためにTAGはBISTビーズに固定されたTAG相補体とハイブリダイズする。BIST中のビーズの標識を検出することで、標的遺伝子の検出を行う。TAGを使用することで、マルチプレックスのハイブリダイゼーション条件が容易になり、複数の同時標的遺伝子検出が可能になる。実施例１、２、３で選定したクロスハイブリダイゼーションを起こさないTAGで実施例４に記載の方法でBISTを製造し、他の技術により決定された遺伝子型との比較により精度を確認した。
【０１０６】
本実施例に使用するEx Taq（カタログ番号：RR001A）ポリメラーゼはタカラバイオ株式会社から購入した。Taq DNA（カタログ番号：E5000S）ポリメラーゼはNEW ENGLAND BioLabsから購入した。Digoxigenin-11-2’-deoxy-uridine-5’-triphosphate, alkali-stable（カタログ番号：１１０９３０８８９１０）はRocheから購入した。PCRプライマー、標識化プライマーは合成オリゴメーカーに注文した。デオキシリボヌクレオチド（カタログ番号：D7295）、MES-free acid monohydrate（カタログ番号：M2933）、MES Sodium Salt（カタログ番号：M3058）はSIGMAから購入した。NaCl（カタログ番号：１９１−０１６６５）、EDTA2Na・2H2O（カタログ番号：３４５−０１８６５）、水酸化ナトリウム（カタログ番号：197-02125、196-05375）、Tween20（カタログ番号：１６３−１１５１２）、ホルムアミド（カタログ番号：０６６−０２３０１）は和光純薬工業株式会社から購入した。ブロックエース（カタログ番号：UK-B80）は大日本住友製薬から購入した。Guardian（カタログ番号：37548）、SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate（カタログ番号：３４０９４）はPieaceから購入した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments（カタログ番号：11644716001）はRocheから購入した。解析したゲノムDNAはクロロエチレン類で汚染された地下水100mlからUltraClean Water DNA Isolation Kit（MO BIO, #14880-25）を用いて抽出した。紫外可視分光光度計V-570（JASCO）を用いて吸光度を測定し、DNA濃度を求めた。
【０１０７】
PCR増幅
DICE（タカラバイオ）を用いてPCR反応を行った。20ul反応混合液は、20mM Tis-HCl pH8.3、100mM KCl、0.1mM EDTA、0.5% Tween20、0.5% Nonidet P-40、50% Glycerol、15mM MgCl2、2mM dNTP、各プライマー（表１１）を0.5uM、Ex Taq ポリメラーゼ 2.5ユニット、および抽出したゲノム1ulを含んでいた。反応混合液は95℃にて5分間ゲノムテンプレートをDenatureして、95℃にて30秒間、50℃にて30秒間、72℃にて2分間を35サイクルさせ増幅を行った。さらに72℃にて4分間の伸長の後、反応液を4℃に保った。
【０１０８】
【表１１】
精製
PCR産物100μl中50μlを１％アガロースゲルで電気泳動し、Mag Extractor -PCR&Gel Clean up-（TOYOBO）を用いてアガロースゲルからの切り出し精製を行った。溶出はTE buffer 20μlで行った。
【０１０９】
Label化反応（Allele Specific Primer Extension）
PCR産物 5ulに、Label化混合液15ul添加し20ulの反応混合液を作成した。反応混合液は、10mM Tis-HCl pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.5uM dATP、0.5uM dGTP、0.5uM dCTP、0.5uM Digoxigenin-11-2’-deoxy-uridine-5’-triphosphate, alkali-stable、各プライマー（表１２）を0.25uM、Taq DNA ポリメラーゼ 1ユニットを含んでいた。反応混合液は95℃にて3分間保持して、テンプレートのPCR産物をDenatureさせ、95℃にて30秒間、55℃にて30秒間、72℃にて1分間を35サイクルさせ増幅を行い、反応液を4℃に保った。
【０１１０】
【表１２】
BIST-18CとLabel化反応産物のハイブリダイゼーション
Label化反応後、対立遺伝子特異的伸長生成物のそれぞれを、TAG相補体を含むBIST中のビーズにて捕獲した。25%ホルムアミド、100mM MES、１M Na、20mM EDTA、0.01% Tween20からなるMESバッファー、200ug/ulサケ精子DNAが入ったハイブリダイゼーション溶液に95ulに5ulのLabel化反応産物を添加し、BISTに80ulを吸引し室温で5分間のハイブリダイゼーションを行った。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments 1ユニット、1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にて15分間BIST中のビーズに捕獲されたラベル化反応産物をAnti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragmentsと反応させた。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。BlockAceを取り除くため、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、さらに室温にてBIST中のビーズを洗浄した。これらの反応工程は全てプレシジョン・システム・サイエンス株式会社のMagtration System 6GCもしくは12GCを用いて自動で行った。
【０１１１】
BIST中ビーズの発光シグナル検出
プレシジョン・システム・サイエンス株式会社が開発したBISTnner（BIST専用検出装置）を用いてBIST中ビーズの発光シグナルを測定した。発光試薬は、SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrateを用いた。
【０１１２】
３．実験結果
（１）地下水ゲノムDNAの濃度測定
260nmにおける吸光度から濃度を求めたところ、68ng/μlであった。
（２）PCR産物の増幅確認
結果を図８に示す。各増幅断片は、RDaseの保存されたアミノ酸配列をもとに作製した縮退プライマーを用い、複数のtypeが存在するRDase遺伝子を網羅的に増幅した増幅断片を電気泳動にて分離した結果を表す。
（３）BIST-18Cによる検出
結果を図９に示す。図９の下図はBISTnnerで検出した発光強度の波形を示す。振幅の大きい波形が発光強度で、振幅の小さい波形がビーズの影を測定したデータである。ビーズがあるところは光が検出できないため谷の波形を描く。この振幅の小さい波形と振幅の大きい波形の山を重ね合わせることで、何番目のビーズがいくつの発光強度を示すかがわかる。上図に示す棒グラフはこのビーズの位置情報と発光強度をTAGの番号順に並びかえて表記したデータである。
【０１１３】
図１０は、16type−(1)と(2)を合わせた32typeのRDase遺伝子typeに関して、得られた３回のシグナルの平均値をとったものをグラフ化したものである。
【０１１４】
４．考察
平均値の値が1,000以上のものを検出できたとすると、type1,2,4,8,9,10,12,17,19,23,25,26,28,34,35,36,37の17typeが検出できたと言える。また、縮退プライマーの増幅産物をベクターへ挿入→大腸菌に形質転換→培養してplasmid抽出→インサート部分のシークエンスという方法で96plasmidのシークエンスを行ったところ、type1,2,4,9,12,16,19,23,25,26,27,28,34,35,36の15typeが検出された。シークエンスで検出された15typeのうち13typeに関しては本法でも検出できており、実用的な方法として使用できることが示唆された。
【０１１５】
〔実施例７〕異なる方法によって抽出されたゲノムからのＳＮＰ解析
１．実験目的
BIST(キャピラリービーズ)を用いるSNP解析プロトコルは、利用するユーザーによって解析するゲノムの抽出法が異なることが予想できるため、それらの違いによる差がないかの検証を行った。
【０１１６】
２．実験方法・手順
（１）ゲノム抽出
２種類の血液サンプル（検体１と４）を用いて、採取した当日に、以下の４つの抽出方法でゲノムを抽出した。
(i)E2005試薬（PSS販売試薬）
SX-12GC（PSS、Code No.A1003）にE2005プレパック試薬(Lot.11S06)を搭載し、添付の取扱説明書に従って、血液200 ulからゲノムを抽出した。
(ii)QIAamp DNA Mini/DNA Blood Mini Kit（キアゲン）
添付の取扱説明書に従い、血液200 ulからゲノムを抽出した。
(iii)Genomicsキット(TALENT)
添付の取扱説明書に従い、血液2.4 mlからゲノムを抽出した。
（２）PCR
DICE（TAKARA）を用いてPCR反応を行った。20ul反応混合液は、4SNP 1st Primer Mix（3AR-5 uM, AGT1, UCP1, MTHFR-2.5 uM each）（表８）を1.6 ul、ゲノムDNAを1 ul、10xReaction Bufferを2 ul、2.5 mM dNTPを1.6 ul、25 mM MgCl2を1.6 ul、５U/ul Hot Gold starを0.1 ul、ｄH2Oを12.1 ul含んでいた。反応混合液は95℃にて10分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて15秒間、60℃にて15秒間、72℃にて15秒間を35サイクルさせ増幅を行った。さらに72℃にて5分間の伸長の後、反応液を4℃に保った。
（３）ASPE（Allele Specific Primer Extension）
PCR産物 2ulに、Label化混合液18ul添加し20ulの反応混合液を作成した。反応混合液は、ASPE Primer （3AR, AGT1は5 uM、UCP1は2.5 uM、MTHFRは0.25 uM）（表９）を1 ul、10xReaction Bufferを2 ul、100 uM dNTP（dA, dC, dG）を2 ul、10 uM DIG-dUTPを2 ul、50 mM MgCl2を0.8 ul、５U/ul BIOTAQを0.2 ul、ｄH2Oを10 ul含んでいた。反応混合液は95℃にて2分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて20秒間、55℃にて20秒間、72℃にて15秒間を20サイクルさせ増幅を行い、反応液を4℃に保った。
（４）ハイブリダイゼーション
Label化反応(ASPE)後、対立遺伝子特異的伸長生成物のそれぞれを、TAG相補体を含むBIST中のビーズにて捕獲した。25%ホルムアミド、100mM MES、１M Na、20mM EDTA、0.01% Tween20からなるMESバッファー、200ug/ulサケ精子DNAが入ったハイブリダイゼーション溶液に95ulに5ulのLabel化反応産物を添加し、BISTに80ulを吸引し室温で5分間のハイブリダイゼーションを行った。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments 1ユニット、1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にて15分間BIST中のビーズに捕獲されたラベル化反応産物をAnti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragmentsと反応させた。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。BlockAceを取り除くため、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、さらに室温にてBIST中のビーズを洗浄した。これらの反応工程は全てプレシジョン・システム・サイエンス株式会社のMagtration System 6GCもしくは12GCを用いて自動で行った。
（５）検出・解析
反応させたBIST-10に発光基質(Super Signal)40 ulを吸引し、BISTnner（PSS製品）にてビーズの発光強度を測定した。また、専用のソフトウェアで、ビーズに固定されたTag情報からSNPのタイピングを行った。
【０１１７】
３．実験結果
（１）抽出ゲノムの吸光度測定結果
結果を図１１に示す。定量データを表１３に示す。
【０１１８】
【表１３】
（２）PCR産物、マルチプレックスPCRの電気泳動評価
結果を図１２に示す。
（３）BIST-10によるSNPタイピング
結果を図１３に示す。
【０１１９】
４．考察
電気泳動の結果からすると、溶媒遠心によるGenomicsキット(TALENT)による抽出が、一番、高分子としてゲノムが回収できることがわかった。しかし、PCRの結果に大差はなく、抽出されたゲノムの量や一部に切断があっても、今回検証した4SNP解析においては問題とならないことが確認できた。
プロトコルをユーザーに提供する場合、少なくとも今回検証した抽出法によって得られたゲノムならば問題なく解析ができるといえる。
【０１２０】
〔実施例８〕ツメから抽出したゲノムの4SNP解析
１．実験目的
ツメからゲノムを抽出し肥満関連遺伝子のSNPタイピングを行った。
【０１２１】
２．実験方法・手順
（１）ツメからのゲノム抽出
チューブに入れた30mgのツメ断片にExtraction Buffer 400ulとProteinase K 5ulとRNaseA 4ul中を入れ、65度で1時間処理し、溶解操作後、その上清をMagtration System 12GCのサンプル位置にセットし、抽出操作を行った。
分注試薬
well 1：GE2-K buffer
well 2：Magnetic beads (Cortex:CM5000)
well 3：EtOH
well 4：Magnetic beads (Cortex:CM5000)
well 5：GW buffer
well 6：GW buffer
well 8：TE 50ul
well 11：sample
【０１２２】
（２）PCR
DICE（TAKARA）を用いてPCR反応を行った。20ul反応混合液は、4SNP 1st Primer Mix（3AR-5 uM, AGT1, UCP1, MTHFR-2.5 uM each）（表８）を1.6 ul、ゲノムDNA（女子栄養大学から提供）を1 ul、10xReaction Bufferを2 ul、2.5 mM dNTPを1.6 ul、25 mM MgCl2を1.6 ul、５U/ul Hot Gold starを0.1 ul、ｄH2Oを12.1 ul含んでいた。反応混合液は95℃にて10分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて15秒間、60℃にて15秒間、72℃にて15秒間を35サイクルさせ増幅を行った。さらに72℃にて5分間の伸長の後、反応液を4℃に保った。
【０１２３】
（３）ASPE
PCR産物 2ulに、Label化混合液18ul添加し20ulの反応混合液を作成した。反応混合液は、ASPE Primer （3AR, AGT1は5 uM、UCP1は2.5 uM、MTHFRは0.25 uM）（表９）を1 ul、10xReaction Bufferを2 ul、100 uM dNTP（dA, dC, dG）を2 ul、10 uM DIG-dUTPを2 ul、50 mM MgCl2を0.8 ul、５U/ul BIOTAQを0.2 ul、ｄH2Oを10 ul含んでいた。反応混合液は95℃にて2分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて20秒間、55℃にて20秒間、72℃にて15秒間を20サイクルさせ増幅を行い、反応液を4℃に保った。
【０１２４】
（４）ハイブリダイゼーション
Label化反応(ASPE)後、対立遺伝子特異的伸長生成物のそれぞれを、TAG相補体を含むBIST中のビーズにて捕獲した。25%ホルムアミド、100mM MES、１M Na、20mM EDTA、0.01% Tween20からなるMESバッファー、200ug/ulサケ精子DNAが入ったハイブリダイゼーション溶液に95ulに5ulのLabel化反応産物を添加し、BISTに80ulを吸引し室温で5分間のハイブリダイゼーションを行った。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments 1ユニット、1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にて15分間BIST中のビーズに捕獲されたラベル化反応産物をAnti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragmentsと反応させた。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。BlockAceを取り除くため、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、さらに室温にてBIST中のビーズを洗浄した。これらの反応工程は全てプレシジョン・システム・サイエンス株式会社のMagtration System 6GCもしくは12GCを用いて自動で行った。
【０１２５】
（５）検出・解析
反応させたBIST-18Cに発光基質(Super Signal)40 ulを吸引し、BISTnnerにてビーズの発光強度を測定した。また、専用のソフトウェアで、ビーズに固定されたTag情報からSNPのタイピングを行った。
【０１２６】
３．実験結果
（１）抽出ゲノムの吸光度測定結果
結果を図１４に示す。定量データを表１４に示す。
【０１２７】
【表１４】
（２）PCR産物の電気泳動評価
結果を図１５に示す。検体No.４はポジティブコントロールとして使用した血液から抽出ゲノムのPCR結果である。
（３）BIST-18CによるSNPタイピング
結果を図１６に示す。
（４）血液から抽出したゲノムによるSNP解析結果との答え合わせ
結果を表１５に示す。
【０１２８】
【表１５】
【０１２９】
４．考察
回収できたゲノム量に差はあったが、2検体どちらも4SNPのタイピングが可能で、血液から抽出ゲノムによるタイピング結果が分っている検体Mにおいてはタイピング結果も一致した。
回収できたゲノム量の違いの1つにはツメの大きさがあり、検体Mは1mm幅を10本分、検体Yは大きなかけらを3本分であった。のびきっていないツメの方が、ゲノムが抽出しやすいのかもしれない。しかし、次工程でPCRを行うため、ゲノムの収量差はBISTのシグナルには反映されずどちらの検体も同じくらい高いシグナルを得る事ができた。
以上の結果から、ツメを検体（サンプル）としたい顧客にも、BISTによるタイピングシステムを使用していただけることが明らかとなった。
【０１３０】
〔実施例９〕ASP-PCR法（１段階PCR）を用いる4SNP解析
１．実験目的
ユーザー間差の低減と信頼性の向上を目指し、工程を減らすプロトコルの検証を行った。具体的には、2段階プロトコル（実施例５、７、８）を参考に、SNP近傍配列のTAG化とラベル化、増幅を一度に行う1段階プロトコルの確立を試みた。
【０１３１】
２．実験方法・手順
（１）ASP-PCR
DICE（TAKARA）を用いてPCR反応を行った。20ul反応混合液は、4SNP ASP-PCR Primer Mix（5 uM each）（表１６）を1.6 ul、ゲノムDNA（女子栄養大学提供ゲノム#202, 203, 205 各20 ng/ul、PSS検体＃M４ 57 ng/ul）を1 ul、10xReaction Bufferを2 ul、DIG Labeling Mix Kit (roche)を2 ul、25 mM MgCl2を1.6 ul、５U/ul Hot Gold starを0.1 ul、ｄH2Oを11.7 ul含んでいた。反応混合液は95℃にて10分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて30秒間を35サイクルさせ増幅を行った。さらに72℃にて5分間の伸長、95 ℃で10分間の1本鎖化をおこなうDenature反応の後、反応液を4℃に急冷した。
【０１３２】
【表１６】
（２）ハイブリダイゼーション
Label化反応(ASP-PCR)後、対立遺伝子特異的伸長生成物のそれぞれを、TAG相補体を含むBIST中のビーズにて捕獲した。25%ホルムアミド、100mM MES、１M Na、20mM EDTA、0.01% Tween20からなるMESバッファー、200ug/ulサケ精子DNAが入ったハイブリダイゼーション溶液に95ulに5ulのLabel化反応産物を添加し、BISTに80ulを吸引し室温で5分間のハイブリダイゼーションを行った。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments 1ユニット、1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にて15分間BIST中のビーズに捕獲されたラベル化反応産物をAnti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragmentsと反応させた。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。BlockAceを取り除くため、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、さらに室温にてBIST中のビーズを洗浄した。これらの反応工程は全てプレシジョン・システム・サイエンス株式会社のMagtration System 6GCもしくは12GCを用いて自動で行った。
（３）検出・解析
反応させたBIST-18Cに発光基質(Super Signal)40 ulを吸引し、BISTnnerにてビーズの発光強度を測定した。また、専用のソフトウェアで、ビーズに固定されたTag情報からSNPのタイピングを行った。
【０１３３】
３．実験結果
（１）BIST-18CによるSNPタイピング
結果を図１７に示す。
（２）PCR-RFLP法との答え合わせ
結果を表１７に示す。但し、検体M4に関してはシークエンス結果と比較した。
【０１３４】
【表１７】
【０１３５】
４．考察
2段階プロトコルで使用していた1stPCR用のReverseプライマーとASPE用のForwardプライマーとｄUTPの5%にDIGがついたDIG Labeling Mix kit (roche)でPCRを行う事により、2回に分けて行っていた増幅反応とBISTハイブリ用のTAG付加とラベル化を同時に行うことができる１段階プロトコルを実現した。BISTでのタイピング結果においても、検証した4検体全て、栄養大手法(PCR-RFLP法)またはシーケンス結果と一致する良好な結果であった。
当方法を使用することで、自分たちで解析をしたいというユーザーにとっては省力化やランニングコストの低減、ユーザー間差の低減から精度の向上にもつながると考えられる。また、工程を減らせたことは、全自動化装置への展開を考慮した際に分注ロスが低減できるというメリットがある。
【０１３６】
〔実施例１０〕N-BISTを用いた肥満関連遺伝子9SNP解析
１．実験目的
産総研から提供してもらった数十種のゲノムについて、N-BISTによる肥満関連遺伝子同時９SNP解析を行う。
【０１３７】
２．実験方法・手順
N-BIST解析
（１）ASP-PCR
DICE（TAKARA）を用いてPCR反応を行った。20ul反応混合液は、9SNP ASP-PCR Primer Mix（表１８）を1.6 ul、ゲノムDNA（産総研提供検体5 各20 ng/ul）を2 ul、10xReaction Bufferを2 ul、ｄUTPの5%にBiotinがついた0.5mM dNTPを5 ul、50 mM MgCl2を0.8 ul、５U/ul Hot Gold starを0.1 ul、ｄH2Oを8.5 ul含んでいた。反応混合液は95℃にて10分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて30秒間を35サイクルさせ増幅を行った。さらに72℃にて5分間の伸長、の後、反応液を4℃に保持した。
【０１３８】
【表１８】
（２）ハイブリダイゼーション
Label化反応(ASP-PCR)後、対立遺伝子特異的伸長生成物のそれぞれを、TAG相補体を含むBIST中のビーズにて捕獲した。25%ホルムアミド、100mM MES、１M Na、20mM EDTA、0.01% Tween20からなるMESバッファー、200ug/ulサケ精子DNAが入ったハイブリダイゼーション溶液に95ulに5ulのLabel化反応産物を添加し、BISTに80ulを吸引し室温で5分間のハイブリダイゼーションを行った。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。Anti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragments 1ユニット、1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にて15分間BIST中のビーズに捕獲されたラベル化反応産物をAnti-Digoxigenin-POD(Poly), Fab fragmentsと反応させた。1% BlockAce、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、室温にてBIST中のビーズを洗浄した。BlockAceを取り除くため、5mM Tis-HCl、0.5mM EDTA、1M NaClとBIST中の溶液を入れ替え、さらに室温にてBIST中のビーズを洗浄した。これらの反応工程は全てプレシジョン・システム・サイエンス株式会社のMagtration System 6GCもしくは12GCを用いて自動で行った。
（３）検出・解析
反応させたBIST-18Cに発光基質(Super Signal)40 ulを吸引し、BISTnnerにてビーズの発光強度を測定した。また、専用のソフトウェアで、ビーズに固定されたTag情報からSNPのタイピングを行った。
【０１３９】
SNP部分のSequence解析
PCR産物の精製までを自社で行い、Macrogen社へ依頼した。
（１）PCR
DICE（TAKARA）を用いてPCR反応を行った。50ul反応混合液は、5uM Forward Primer、5uM Reverse Primer（表１９）を各4ul、ゲノムDNA（産総研提供検体 各20 ng/ul）を1 ul、10xReaction Bufferを5 ul、2.5mM each dNTPを4 ul、25 mM MgCl2を4 ul、５U/ul Hot Gold starを0.25ul、ｄH2Oを27.75 ul含んでいた。反応混合液は95℃にて10分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて30秒間を35サイクルさせ増幅を行った。
【０１４０】
【表１９】
（２）PCR Products Clean up
Magtration System 12GCのサンプル位置にPCR Productをセットし、精製操作を行った。
分注試薬
well 1：ChargeSwitch Purification Buffer、０.5% Tween 20
well 2：ChargeSwitch Magnetic beads
well 3：Washing Buffer 1
well 4：Washing Buffer 2
well 5：Washing Buffer 3
well 6：ChargeSwich Elution Buffer
【０１４１】
３．実験結果
（１）N-BIST解析結果
結果を図１８〜２１に示す。
（２）Sequence解読結果との答え合わせ
結果を表２０に示す。表中の「外注」はMacrogenによるSequence解読結果を示す。
【０１４２】
【表２０】
【０１４３】
４．考察
検体No.678を除いては、Sequence解析結果とN-BISTタイピング結果が一致し、プロトコルの精度が確認できたと考える。
検体No.678においては、N-BISTタイピングの結果とSequence解析の結果が一致していないが、Sequenceの波形を見ても、UCPにおいては「G」が、β2ARにおいては「A」の小さなピークが確認できる。N-BISTタイピングの結果においても、同様のタイプが低いシグナルとなっており、結果が一致していないとは考えにくい。従って、N-BISTを使ったBiotinラベルによる9SNP解析プロトコルを確立したといえる。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明の新規なオリゴヌクレオチドはTAGとして有用であり、このTAGの相補体を固定した基板は遺伝子解析に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１４５】
＜配列番号１〜１２０＞
配列番号１〜１２０は、新規なTAGを示す。
＜配列番号１２１＞
配列番号１２１は、3AR-mFプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２２＞
配列番号１２２は、3AR-mRプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２３＞
配列番号１２３は、UCP1-Fプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２４＞
配列番号１２４は、UCP1-Rプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２５＞
配列番号１２５は、AGT1-F-Newプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２６＞
配列番号１２６は、AGT1-R-Newプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２７＞
配列番号１２７は、MTHFR-Fプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２８＞
配列番号１２８は、MTHFR-Rプライマーの配列を示す。
＜配列番号１２９＞
配列番号１２９は、3AR-ASP-PT109Tプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３０＞
配列番号１３０は、3AR-ASP-PT100Tプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３１＞
配列番号１３１は、UCP1-ASP-PT39Gプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３２＞
配列番号１３２は、UCP1-ASP-PT42Aプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３３＞
配列番号１３３は、AGT1-ASP-PT71Tプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３４＞
配列番号１３４は、AGT1-ASP-PT54Cプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３５＞
配列番号１３５は、MTHFR-ASP-PT73Cプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３６＞
配列番号１３６は、MTHFR-ASP-PT81Tプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３７＞
配列番号１３７は、RRF2プライマーの配列を示す。
＜配列番号１３８＞
配列番号１３８は、B1Rプライマーの配列を示す。
＜配列番号１３９＞
配列番号１３９は、T3-type1プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４０＞
配列番号１４０は、T27-type25プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４１＞
配列番号１４１は、T28-type34プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４２＞
配列番号１４２は、T39-type24-2プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４３＞
配列番号１４３は、T42-type31-2プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４４＞
配列番号１４４は、T49-type26-2プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４５＞
配列番号１４５は、T53-type35プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４６＞
配列番号１４６は、T54-type19プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４７＞
配列番号１４７は、T56-type5プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４８＞
配列番号１４８は、T61-type27プライマーの配列を示す。
＜配列番号１４９＞
配列番号１４９は、T71-type32プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５０＞
配列番号１５０は、T73-type33-2プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５１＞
配列番号１５１は、T81-type36プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５２＞
配列番号１５２は、T100-type13プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５３＞
配列番号１５３は、T109-type10プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５４＞
配列番号１５４は、T120-type28プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５５＞
配列番号１５５は、T3-type7プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５６＞
配列番号１５６は、T14-type16プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５７＞
配列番号１５７は、T27-type8プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５８＞
配列番号１５８は、T28-type17プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５９＞
配列番号１５９は、T39-type11プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６０＞
配列番号１６０は、T42-type23プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６１＞
配列番号１６１は、T49-type18プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６２＞
配列番号１６２は、T53-type29プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６３＞
配列番号１６３は、T54-type14プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６４＞
配列番号１６４は、T56-type9プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６５＞
配列番号１６５は、T61-type37プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６６＞
配列番号１６６は、T71-type12プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６７＞
配列番号１６７は、T73-type2プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６８＞
配列番号１６８は、T81-type38プライマーの配列を示す。
＜配列番号１６９＞
配列番号１６９は、T100-type22プライマーの配列を示す。
＜配列番号１７０＞
配列番号１７０は、T109-type4プライマーの配列を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１４６】
【特許文献１】国際公開第WO01/048244号パンフレット
【非特許文献】
【０１４７】
【非特許文献１】A Microsphere-Based Assay for Multiplexed Single Nucleotide Polymorphism Analysis Using Single Base Chain Extension. Jingwen Chen; Marie A. Iannone; May-Sung Li; J. David Taylor; Philip Rivers; Anita J. Nelsen; Kimberly A. Slentz-Kesler; Allen Roses; Michael P. Weiner. 10:549-557 2000 by Cold Spring Harbor Laboratory Press ISSN 1088-9051/00
【非特許文献２】Analytical Validation of the Tag-It High-Throughput Microsphere-Based Universal Array Genotyping Platform: Application to the Multiplex Detection of a Panel of Thrombophilia-Associated Single-Nucleotide Polymorphisms. Susan Bortolin; Margot Black; Hemanshu Modi; Ihor Boszko; Daniel Kobler; Dan Fieldhouse; Eve Lopes; Jean-Michel Lacroix; Rebecca Grimwood; Philip Wells; Richard Janeczko; Roman Zastawny. Clinical Chemistry 50:11 2028-2036 (2004)
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(1)〜(7)の条件を満たす少なくとも２種のオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている基板。
(1)配列長が19-25merであること。
(2)融解温度（Tm）が64.0-69.0℃であること。
(3)標的核酸の配列との類似性が50%以下であること。
(4)高次構造をとらないこと。
(5)任意の２種を選んでもヘテロダイマーを形成しないこと。
(6)同一塩基の繰り返し数が４個以下であること。
(7)GC含量が40.0-60.0%であること。
【請求項２】
ビーズ又は磁性ビーズの形状をとる請求項１記載の基板。
【請求項３】
ビーズ又は磁性ビーズのそれぞれに異なるオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている請求項２記載の基板。
【請求項４】
糸の形状をとる請求項１記載の基板。
【請求項５】
糸の異なる位置のそれぞれに異なるオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている請求項４記載の基板。
【請求項６】
標的核酸の配列がヒトゲノム配列である請求項１〜５のいずれかに記載の基板。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドの配列が配列番号１〜１２０のいずれかの配列である請求項１〜６のいずれかに記載の基板。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号２、３、６、８、１２、１４，１６、１８、２１、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５２、５３、５４、５５、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、９６、１００、１０８、１０９、１１３、１１４、１１８及び１２０で表される請求項７記載の基板。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１２、１４，１６、２１、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、９６、１００、１０８、１０９、１１４、１１８及び１２０で表される請求項７記載の基板。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１２、１４，１６、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、１００、１０８、１０９、１１８及び１２０で表される請求項７記載の基板。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１２、１４、２７、２８、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、８４、１００、１０８、１０９及び１２０で表される請求項７記載の基板。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１４，２７、２８、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、８４、１００、１０８、１０９及び１２０で表される請求項７記載の基板。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１４、２７、２８、３９、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、１００、１０８、１０９及び１２０で表される請求項７記載の基板。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の基板を用いて、遺伝子解析を行う方法。
【請求項１５】
遺伝子解析が、一塩基多型解析である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子解析が、遺伝子検出である請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
配列番号１〜１２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド又はその相補体。
【請求項１８】
配列番号１〜１２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの組合せであって、200ug/mlサケ精子DNAを含む２×SSC中の常温でのハイブリダイゼーションの条件下で、互いにクロスハイブリダイゼーションしないオリゴヌクレオチドの組合せ。
【請求項１９】
請求項１８の組合せに含まれるオリゴヌクレオチドの相補体の組合せ。
【請求項２０】
配列番号１〜１２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドが付加された核酸プライマー又はプローブ。
【請求項１】
下記の(1)〜(7)の条件を満たす少なくとも２種のオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている基板。
(1)配列長が19-25merであること。
(2)融解温度（Tm）が64.0-69.0℃であること。
(3)標的核酸の配列との類似性が50%以下であること。
(4)高次構造をとらないこと。
(5)任意の２種を選んでもヘテロダイマーを形成しないこと。
(6)同一塩基の繰り返し数が４個以下であること。
(7)GC含量が40.0-60.0%であること。
【請求項２】
ビーズ又は磁性ビーズの形状をとる請求項１記載の基板。
【請求項３】
ビーズ又は磁性ビーズのそれぞれに異なるオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている請求項２記載の基板。
【請求項４】
糸の形状をとる請求項１記載の基板。
【請求項５】
糸の異なる位置のそれぞれに異なるオリゴヌクレオチドの相補体が固定されている請求項４記載の基板。
【請求項６】
標的核酸の配列がヒトゲノム配列である請求項１〜５のいずれかに記載の基板。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドの配列が配列番号１〜１２０のいずれかの配列である請求項１〜６のいずれかに記載の基板。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号２、３、６、８、１２、１４，１６、１８、２１、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５２、５３、５４、５５、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、９６、１００、１０８、１０９、１１３、１１４、１１８及び１２０で表される請求項７記載の基板。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１２、１４，１６、２１、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、９６、１００、１０８、１０９、１１４、１１８及び１２０で表される請求項７記載の基板。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１２、１４，１６、２５、２７、２８、３０、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、７６、８１、８４、１００、１０８、１０９、１１８及び１２０で表される請求項７記載の基板。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１２、１４、２７、２８、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、８４、１００、１０８、１０９及び１２０で表される請求項７記載の基板。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１４，２７、２８、３９、４０、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、８４、１００、１０８、１０９及び１２０で表される請求項７記載の基板。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドの配列が、それぞれ、配列番号３、１４、２７、２８、３９、４２、４９、５３、５４、５６、６１、７１、７３、８１、１００、１０８、１０９及び１２０で表される請求項７記載の基板。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の基板を用いて、遺伝子解析を行う方法。
【請求項１５】
遺伝子解析が、一塩基多型解析である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子解析が、遺伝子検出である請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
配列番号１〜１２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド又はその相補体。
【請求項１８】
配列番号１〜１２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの組合せであって、200ug/mlサケ精子DNAを含む２×SSC中の常温でのハイブリダイゼーションの条件下で、互いにクロスハイブリダイゼーションしないオリゴヌクレオチドの組合せ。
【請求項１９】
請求項１８の組合せに含まれるオリゴヌクレオチドの相補体の組合せ。
【請求項２０】
配列番号１〜１２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドが付加された核酸プライマー又はプローブ。
【図２】
【図３】
【図４】
【図１０】
【図１】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図３】
【図４】
【図１０】
【図１】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公開番号】特開２０１０−２９１８４（Ｐ２０１０−２９１８４Ａ）
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５５５１１（Ｐ２００９−１５５５１１）
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【出願人】（５０２３３８２９２）ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【出願人】（５０２３３８２９２）ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
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