遺伝子送達のための改変ノダウイルスＲＮＡ
【課題】遺伝子送達のための改変ノダウイルス ＲＮＡを提供すること。
【解決手段】本発明は、改変されたノダウイルスＲＮＡ１分子を提供する。この改変されたノダウイルスＲＮＡ１分子は、そのレプリカーゼＯＲＦの下流に（好ましくはそのＢ２ ＯＲＦの下流に）異種挿入を含む。この挿入は、好ましくは、１つ以上のタンパク質コード領域を含む。改変ＲＮＡ１は、ＶＬＰ（例えば、パピローマウイスルＶＬＰ）にパッケージされ得る。小さいサイズのノダウイルスＲＮＡ１は、このノダウイルスＲＮＡ１をＨＰＶパッケージングに理想的にする。
【解決手段】本発明は、改変されたノダウイルスＲＮＡ１分子を提供する。この改変されたノダウイルスＲＮＡ１分子は、そのレプリカーゼＯＲＦの下流に（好ましくはそのＢ２ ＯＲＦの下流に）異種挿入を含む。この挿入は、好ましくは、１つ以上のタンパク質コード領域を含む。改変ＲＮＡ１は、ＶＬＰ（例えば、パピローマウイスルＶＬＰ）にパッケージされ得る。小さいサイズのノダウイルスＲＮＡ１は、このノダウイルスＲＮＡ１をＨＰＶパッケージングに理想的にする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（技術分野）
本発明は、遺伝子送達の分野、より詳細にはウイルス様粒子（ＶＬＰ）にパッケージされた改変ノダウイルスＲＮＡを用いた、発現のための遺伝子の送達の分野である。
【０００３】
（背景技術）
Ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅは、二分節のＲＮＡゲノムを有する。換言すれば、Ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅゲノムは、ＲＮＡ１およびＲＮＡ２と命名された、２つの別個の一本鎖ＲＮＡ分子からなる。これらは両方とも、同一のビリオン中にパッケージされている。ＲＮＡ１はＲＮＡレプリカーゼをコードし、ＲＮＡ２はビリオンキャプシドタンパク質をコードする。フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）において、ＲＮＡ１は３．１ｋｂ長であり、ＲＮＡ２は１．４ｋｂである。
【０００４】
ＦＨＶ ＲＮＡ１のレプリカーゼ産物は、このウイルスゲノムに特異的であり、これは、ＦＨＶが自律的に複製することを可能にする（Ｂａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３２６−３４；Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：４８１−８９）。天然の状況において、レプリカーゼは高度にテンプレート特異的であり、ウイルスＲＮＡ１およびＲＮＡ２のみを複製するが、ＲＮＡ２の非存在下においては自己複製もまた生じる。さらに、ＦＨＶは昆虫ウイルスであるにもかかわらず、植物、脊椎動物、および酵母を含む多くの異なる細胞型において自己複製し得る。
【０００５】
ＲＮＡ２およびＦＨＶキャプシドタンパク質の操作は、広範に報告されている。表面ループへのＨＩＶエピトープの挿入が報告されている（例えば、Ｓｃｏｄｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２３３−３９；Ｂｕｒａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９７：７−１８；Ｓｃｈｉａｐｐａｃａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６３：１２１−２７）。より一般的には、ビリオンは、エピトープ提示系として用いられている（Ｌｏｒｅｎｚｉ ＆ Ｂｕｒｒｏｎｅ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：２６７−７２；ＷＯ９６／０５２９３もまた参照のこと）。
【０００６】
対照的に、ＦＨＶ ＲＮＡ１およびレプリカーゼの操作は、追跡されていない。実際、ＲＮＡ１の自己複製機能は、ＲＮＡ１およびそのＯＲＦの操作に対して非常に敏感であることが示されている（Ｂａｌｌ（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６９：７２０−７２７）。
【０００７】
ＲＮＡ１の複製の間に、ＲＮＡ３と呼ばれる小さなサブゲノムＲＮＡもまた、ＲＮＡ１の３’末端から転写される。ＲＮＡ３は、未知の機能を有する以下の２つの小さなタンパク質をコードする：Ｂ１（レプリカーゼと同一のオープンリーディングフレームであり、同一の翻訳終止コドンを有する）およびＢ２（レプリカーゼに関して＋１オープンリーディングフレームである）（Ｂａｌｌ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６６：２３３５−４５；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｂａｌｌ（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７９３３−７９４２）。ＲＮＡ３の転写は、二本鎖ＲＮＡ＋／ＲＮＡ−中間体が形成される場合に活性になる内部プロモーターにより制御されるようである。
【０００８】
本発明の目的は、ＲＮＡ１分子の改変および操作を可能にして、自己複製するその能力を開発すること、およびこのような改変ＲＮＡ１分子を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の開示）
本発明は、改変ノダウイルスＲＮＡ１分子を提供し、この改変ノダウイルスＲＮＡ１分子は、このＲＮＡ１のレプリカーゼＯＲＦの下流に異種挿入を含む。この挿入は、好ましくは、上記ＲＮＡ１のレプリカーゼＯＲＦおよびＢ２ ＯＲＦの下流である。
【００１０】
（ＲＮＡ１分子）
本発明は、ノダウイルスのＲＮＡ１分子に基づく。ＲＮＡ１は、ノダウイルスゲノムを特異的に複製するＲＮＡレプリカーゼをコードし、そしていくつかのノダウイルス（例えば、フロックハウスウイルス（登録番号Ｘ７７１５６）、ゴキブリウイルス（登録番号Ｘ０２３９６およびＫ０２５６０）、シマアジ神経壊死ウイルス（ＡＢ０２５０１８）、パリアコト（ｐａｒｉａｃｏｔｏ）ウイルス（ＡＦ１７１９４２）、ノダムラウイルス（ＡＦ１７４５３３）、ゴキブリウイルス（ＮＣ＿００１４１１）およびオヒョウ神経壊死ウイルス（ＡＪ４０１１６５））由来の配列が利用可能である。
【００１１】
本発明に関して、「ノダウイルスＲＮＡ１」配列は、天然で見出される配列、ならびにそれら自体の遺伝子を特異的に増幅する能力を保持するレプリカーゼをコードするそのフラグメント、改変体、および変異体を含む。
【００１２】
本発明のＲＮＡ１分子は、標準的な分子生物学技術を用いることによりノダウイルスから獲得されるＲＮＡ１の改変により調製され得るか、あるいは酵素的および／または化学的手段により合成的に組み立てられ得ることが理解される。
【００１３】
（ＲＮＡ１分子内のＯＲＦ）
ノダウイルスの利用可能なＲＮＡ１配列（上記を参照のこと）は、レプリカーゼ（または「Ａ」）および「Ｂ２」ＯＲＦの位置を示す。本発明の分子における挿入は、レプリカーゼＯＲＦの下流であり、好ましくはＢ２ ＯＲＦの下流でもある。
【００１４】
ＦＨＶにおいて、ＲＮＡ１は、３１０７ヌクレオチド長である。レプリカーゼＯＲＦは、ヌクレオチド４０〜３０３３によりコードされ、Ｂ２ ＯＲＦは、ヌクレオチド２７３８〜３０５５によりコードされる。従って、本発明により、ＦＨＶのための異種挿入は、ヌクレオチド３０３３と３１０７との間、好ましくはヌクレオチド３０５５と３１０７との間に置かれる。
【００１５】
好ましくは、異種挿入は、レプリカーゼＯＲＦの５ヌクレオチドよりも下流（すなわち、ＦＨＶにおいては、ヌクレオチド３０３８の下流）、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｔよりも下流にある。より好ましくは、Ｂ２ ＯＲＦの５ヌクレオチドよりも下流（すなわち、ＦＨＶにおいては、ヌクレオチド３０６０の下流）、例えば、このＯＲＦの１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｔよりも下流にある。同様に、好ましくは異種挿入は、ＲＮＡ１の３’末端の５ヌクレオチドよりも上流（すなわち、ＦＨＶにおいては、ヌクレオチド３１０２の上流）、例えば、この３’末端の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｔよりも上流にある。ＲＮＡ１のネイティブの３’末端配列の長さを保持することは、ＲＮＡ１が、自己複製する能力を保持することの保証を手助けする（Ｂａｌｌ（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６９：７２０−７２）。
【００１６】
異種挿入が、レプリカーゼまたはＢ２ ＯＲＦの最後のコドンの３ヌクレオチド内（すなわち、ヌクレオチド３０３４〜３０３６または３０５６〜３０５８の間）に存在する場合、挿入の５’末端が、ＯＲＦのための終止コドン（すなわち、レプリカーゼのためにはヌクレオチド３０３４〜３０３６、またはＢ２のためには３０５６〜３０５８における終止コドン）を保持することが好ましい。
【００１７】
（異種挿入）
本発明の改変ＲＮＡ１は、異種挿入を保有する。この挿入は、好ましくはそれ自体の開始コドンおよび終止コドンを有する１つ以上のタンパク質コード領域を含む。
【００１８】
挿入は、ＲＮＡ１に対してネイティブな１つ以上のＯＲＦの下流に存在する場合、その翻訳において補助するために、異種挿入の５’部分はまた、ｃａｐ非依存性の翻訳を指向する配列を含み得る。従って、代表的に、異種配列は、タンパク質コード領域に機能的に連結された内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。Ｃ型肝炎ウイルスまたは脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳ、もしくはピコルナウイルス、口蹄疫ウイルス、ＥＣＨＯウイルス１１’、古典的な豚コレラウイルス、ｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子など由来のＩＲＥＳのような任意の適切なＩＲＥＳが、用いられ得る（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４５８−４６４）。
【００１９】
異種挿入は、コードされたレプリカーゼを介して自己複製するＲＮＡ１の能力を破壊しない。従って、改変ＲＮＡ１は、発現のための目的の遺伝子を送達し得、かつそれ自体の複製を指向し得る。
【００２０】
（改変ＲＮＡ１のパッケージング）
改変ＲＮＡ１を細胞に送達するために、例えば、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）または偽ビリオン（ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎ）中にそれをパッケージングすることが好ましい。
【００２１】
ＲＮＡ２（必要に応じて改変されたＲＮＡ２）から発現されるタンパク質を含むノダウイルス粒子が、用いられ得る。このアプローチが用いられる場合、ＲＮＡ２は、好ましくは、パッケージされる改変ＲＮＡ１と同一のノダウイルス由来である。
【００２２】
しかし、ノダウイルスは昆虫細胞に自生しているので、哺乳動物細胞への送達が所望される場合、異なるパッケージを用いることが好ましい。好ましいパッケージは、パピローマウイルスＶＬＰ（例えば、Ｔｏｕｚｅ ＆ Ｃｏｕｒｓａｇｅｔ（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２６：１３１７−１３２３；Ｋａｗａｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１０２９８−１０３００；Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｖｉｒｏｌ．２３４：９３−１１１；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｖｉｒｏｌ．２４３：４８２−４９１；Ｕｎｃｋｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２９３４−２９３９；ＷＯ９７／４６６９３；ＷＯ９８／０２５４８など）であり、これは哺乳動物細胞上のレセプターに結合し得る。
【００２３】
ＨＰＶ ＶＬＰを用いることは、様々な利点を提供する。第１に、ＨＰＶ ＶＬＰは広範な細胞型に結合し、高レベルの結合が上皮細胞および間葉細胞で観察され、そして低いレベルの抗ＶＬＰ抗体のみがヒトにおいて観察されている（Ｌｅ Ｃａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５）Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：１３８０−１３８２）。第２に、異なるＨＰＶ型のＬ１タンパク質が同様に発現され得、ＶＬＰの使用により誘導される免疫は大部分は型特異的であるので、予め存在する抗ＨＰＶ抗体の存在は回避され得、そして複数の免疫化が起こり得る。第３に、ノダウイルスＲＮＡ１は小さいので、ＨＰＶ ＶＬＰに伴う公知の制限、すなわちキャプシドに包まれる核酸に対する７〜８ｋｂｐの上限を克服し得る。従って、ノダウイルスＲＮＡは、他の核酸よりも重要な利点を提供する。
【００２４】
パピローマウイルスは、好ましくはＨＰＶ−６のようなヒトパピローマウイルスである。ＶＬＰキャプシドは、タンパク質Ｌ１およびＬ２を含み得るか、またはＬ１のみから生成され得る。
【００２５】
改変ＲＮＡ１のパッケージングを容易にするために、パッケージを形成するタンパク質（例えば、ＶＬＰにおけるキャプシドタンパク質）は、改変ＲＮＡ１と特異的に相互作用し得る配列または構造を含むように改変され得る。ＤＮＡプラスミドを用いて遭遇する問題と比較すると、ＲＮＡ／タンパク質相互作用のインビボでの特異性は、ノダウイルスＲＮＡを用いることのさらなる利点である。
【００２６】
特に有用なこの型のパッケージング系は、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＢＩＶなど）のｔａｔ／ＴＡＲ相互作用に依存する。この系において、パッケージは、改変ＲＮＡ１においてＴＡＲモチーフ（例えば、最小ＴＡＲ配列（例えば、最小５９マー）またはＷＯ９２／０２２２８に記載されるモチーフ）と特異的に相互作用するｔａｔタンパク質由来のモチーフ（例えば、最小ｔａｔ配列（例えば、ＨＩＶ ｔａｔのアミノ酸４８〜５９）；Ｄｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６５：７０１２−１５；Ｃｈｅｎ ＆ Ｆｒａｎｋｅｌ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：２７０８−２７１５；Ｐｕｇｌｉｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１２００−１２０２もまた参照のこと）を含む。従って、本発明の改変ＲＮＡ１は、ＴＡＲモチーフをさらに含む。これは、異種挿入内の遺伝子の上流または下流に存在し得るが、好ましくは下流に存在し得る。代替として、ＴＡＲモチーフは、レプリカーゼＯＲＦの上流（すなわち、ＦＨＶにおいてヌクレオチド４０の前）に配置され得る。パピローマウイルスに基づくパッケージング系において、ｔａｔ配列は、Ｌ１タンパク質に、好ましくはＣ末端にかまたはその付近に挿入され得る。この領域はキャプシド形成に必須ではないが（Ｐａｉｎｔｓｉｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２３：２３８−２４４）、この配列は、ＶＬＰの組み立てる能力を破壊するには及ばない（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３４：９３−１１１）。ｔａｔおよびＴＡＲの相互作用は、パッケージ中での改変ＲＮＡ１のパッケージングを生じる。ＢＩＶ由来のｔａｔ／ＴＡＲの相互作用の使用は、細胞因子を必要としない強力な相互作用なので、この相互作用の使用が好ましい。
【００２７】
ＶＬＰ内への核酸のパッケージングのためのｔａｔ／ＴＡＲの相互作用の使用は、本発明の改変ＲＮＡ１に限定されないことが理解される。
【００２８】
（発明のさらなる局面）
本発明の改変ＲＮＡ１は、代表的に、正のセンス方向であり、そして一本鎖である。本発明はまた、以下を提供する：（ｉ）本発明のＲＮＡ１に相補的な一本鎖核酸；（ｉｉ）（ｉ）に相補的な一本鎖核酸；（ｉｉｉ）本発明のＲＮＡ１に相補的な配列を含む一本鎖核酸；（ｉｖ）（ｉ）に相補的な核酸を含む一本鎖核酸；および（ｖ）鎖の１つが（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）である二本鎖核酸。用語「核酸」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ならびにＰＮＡ（ペプチド核酸）および骨格改変ＤＮＡ（ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ホスホロチオエートなど）のようなアナログを含む。核酸は、インビトロかまたはインビボでＲＮＡポリメラーゼにより転写されて、本発明の改変ＲＮＡ１を生成し得ることが理解される。
【００２９】
本発明はまた、本発明の核酸を含む（例えば、改変ＲＮＡ１を含む）ＶＬＰを提供する。このＶＬＰは、好ましくはパピローマウイルスＶＬＰである。
【００３０】
本発明はまた、免疫不全ウイルスのｔａｔタンパク質由来のモチーフを含むよう改変されたパピローマウイスルＬ１タンパク質を提供する。
【００３１】
本発明はまた、本発明の改変ＲＮＡ１分子を生成するためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下の工程を包含する：（ａ）ノダウイルスＲＮＡ１配列を含むかまたはコードする核酸を獲得する方法；および（ｂ）上記ＲＮＡ１配列中のレプリカーゼＯＲＦおよびＢ２ ＯＲＦの下流に異種配列を挿入する工程。ＦＨＶが用いられる場合、その複製が２８℃未満で最大活性を示すことは、注目されるべきである。
【００３２】
本発明はまた、本発明のＶＬＰを生成するためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下の工程を包含する：本発明による核酸を用いて細胞をトランスフェクトする工程；ＶＬＰキャプシドタンパク質（必要に応じて改変ＲＮＡ１に特異的なモチーフを含むよう改変されたタンパク質）をコードする核酸を用いて細胞をトランスフェクトする工程；およびこの細胞からＶＬＰを精製する工程。このプロセスは、好ましくは酵母において実施される。ＶＬＰコード核酸およびＲＮＡ１コード核酸を同一の酵母に導入するために、一倍体株を接合することが可能である（例えば、キャプシドタンパク質を発現する一倍体株が、ＲＮＡ１を発現する反対の接合型の一倍体株と接合され得る）。
【００３３】
本発明の核酸（特に改変されたＲＮＡ１）およびＶＬＰはまた、医薬として使用するために提供される。それらは特に、例えば、遺伝子療法における遺伝子送達に有用である。
【００３４】
本発明はまた、核酸配列を細胞に送達するためのプロセスを提供する。このプロセスは、本発明のＶＬＰを上記細胞に導入する工程を包含する。このプロセスは、インビトロ（培養物中の細胞）またはインビボで実施され得る。
【００３５】
（ノダウイルス）
ノダウイルスは、アルファノダウイルスとベータノダウイルスに分けられ、そしてノダムラウイルス、ゴキブリウイルス、Ｂｏｏｌａｒｒａウイルス、フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）、マイマイガウイスル、マナワトゥウイルス、太西洋オヒョウウイルス、トラフグ神経壊死ウイルス、マツカワ神経壊死ウイルス、日本ヒラメ神経壊死ウイルス、Ｄｉｃｅｎｔｒａｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ脳炎ウイルス、パリアコトウイルス、アロワナ（Ｄｒａｇｏｎ）神経壊死ウイルス、オヒョウ神経壊死ウイルス、Ｍａｌａｂａｒｉｃｕｓ神経壊死ウイルス、Ｒｅｄｓｐｏｔｔｅｄ ｇｒｏｕｐｅｒ神経壊死ウイルス、Ｕｍｂｒｉｎａ ｃｉｒｒｏｓａノダウイルス、およびシマアジ神経壊死ウイスルを含む。これらのウイルスのいずれか由来のＲＮＡ１分子が、本発明に従い用いられ得る。しかし、分子レベルで最も研究されているノダウイルスであるという理由で、ＦＨＶおよびノダムラウイルスが好ましい。ノダウイルスのさらなる詳細は、Ｇａｒｚｏｎ ＆ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ（Ａｔｌａｓ ｏｆ ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｖｉｒｕｓｅｓ（Ａｄａｍｓ ＆ Ｂｏｎａｍｉ編）の３５１−３７０頁、ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ（１９９２））およびＨｅｎｄｒｙ（Ｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ（Ｋｕｒｓｔａｋ編）の２２７−２７６頁、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｅｒ（１９９１））に見出され得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） ＲＮＡ１のレプリカーゼＯＲＦの下流に異種挿入を含む、改変ノダウイルスＲＮＡ１分子。
（項目２） 前記異種挿入がまた、前記ＲＮＡ１のＢ２ ＯＲＦの下流でもある、項目１に記載のＲＮＡ１分子。
（項目３） 前記異種挿入が、前記レプリカーゼＯＲＦおよびＢ２ ＯＲＦの５ヌクレオチドよりも下流である、項目２に記載のＲＮＡ１分子。
（項目４） 前記異種挿入が、ＲＮＡ１の３’末端の５ヌクレオチドよりも上流である、項目１〜３のいずれかに記載のＲＮＡ１分子。
（項目５） 前記異種挿入が、タンパク質コード領域を含む、項目１〜４のいずれかに記載のＲＮＡ１分子。
（項目６） 前記異種挿入が前記タンパク質コード領域の上流にＩＲＥＳを含む、項目５に記載のＲＮＡ１分子。
（項目７） 前記ＲＮＡ１がタンパク質配列と特異的に相互作用し得る配列を含む、項目１〜６のいずれかに記載のＲＮＡ１分子。
（項目８） 前記タンパク質配列と特異的に相互作用し得る配列がＴＡＲ配列である、項目７に記載のＲＮＡ１分子。
（項目９） 前記ＴＡＲ配列が前記異種挿入内に存在する、項目８に記載のＲＮＡ１分子。
（項目１０） 項目１〜９のいずれかに記載のＲＮＡ１分子を含む、ＶＬＰ。
（項目１１） 前記ＶＬＰがパピローマウイルスＶＬＰである、項目１０に記載のＶＬＰ。
（項目１２） 前記ＶＬＰ Ｌ１タンパク質がｔａｔ配列を含み、キャプシドに包まれたＲＮＡ１分子が項目６〜８のいずれか１項に記載のＲＮＡ１分子である、項目１１に記載のＶＬＰ。
（項目１３） ｔａｔおよびＴＡＲがＨＩＶまたはＢＩＶ由来である、項目１２に記載のＶＬＰ。
（項目１４） 項目１〜９のいずれか１項に記載のＲＮＡ１に相補的である、一本鎖核酸。
（項目１５） 項目１４に記載の核酸に相補的である、一本鎖核酸。
（項目１６） 項目１〜９のいずれか１項に記載のＲＮＡ１に相補的である配列を含む、一本鎖核酸。
（項目１７） 二本鎖核酸であって、該鎖のうちの１つが項目１４〜１６のいずれか１項に記載の一本鎖核酸である、二本鎖核酸。
（項目１８） 項目１〜９のいずれか１項に記載のＲＮＡ１を産生するためのプロセスであって、（ａ）ノダウイルスＲＮＡ１配列を含むかまたはこれをコードする核酸を得る工程；および（ｂ）該ＲＮＡ１配列内のレプリカーゼＯＲＦの下流に異種配列を挿入する工程を包含する、プロセス。
（項目１９） 項目１８に記載のプロセスであって、工程（ｂ）が、前記ＲＮＡ１配列内の前記レプリカーゼおよびＢ２ ＯＲＦの下流に異種配列を挿入する工程を包含する、プロセス。
（項目２０） 項目１０〜１３のいずれか１項に記載のＶＬＰを産生するためのプロセスであって、該プロセスは、細胞を項目１４〜１７のいずれか１項に記載の核酸でトランスフェクトする工程；細胞をＶＬＰキャプシドタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトする工程であって、該タンパク質は、必要に応じて改変されて改変ＲＮＡ１に特異的なモチーフを含む、工程；ならびにＶＬＰを該細胞から精製する工程を包含する、プロセス。
（項目２１） 目的の核酸配列を細胞に送達するためのプロセスであって、該プロセスは、項目１０〜１３のいずれか１項に記載のＶＬＰを該細胞に導入する工程を包含し、該目的の核酸配列は、該ＶＬＰ中に含まれる改変ＲＮＡ１分子である、プロセス。
（項目２２） 医薬としての使用のための、項目１〜９のいずれか１項に記載のＲＮＡ１。
（項目２３） 医薬としての使用のための、項目１０〜１３のいずれか１項に記載のＶＬＰ。
（項目２４） 項目１０〜１３のいずれか１項に記載のＶＬＰを前記細胞に導入する工程を包含する、核酸配列を細胞に送達するためのプロセス。
（項目２５） インビトロで実行される、項目２３に記載のプロセス。
（項目２６） インビボで実行される、項目２３に記載のプロセス。
（項目２７） ＶＬＰ内に核酸をパッケージングするための、ｔａｔ／ＴＡＲ相互作用の使用。
（項目２８） ノダウイルス由来のＲＮＡ１配列を含むＲＮＡであって、該ＲＮＡ１配列がそのレプリカーゼＯＲＦの下流に異種挿入を含むという点で特徴的である、ＲＮＡ。
（項目２９） 前記異種挿入がＢ２ ＯＲＦの下流である、項目２８に記載のＲＮＡ。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１−１】図１は、ＦＨＶ ＲＮＡ１由来のｃＤＮＡを示す。レプリカーゼ（４０）、Ｂ１（２７２８）、およびＢ２（２７３８）の開始コドンは、四角で囲まれている。（ａ）レプリカーゼ／Ｂ１および（ｂ）Ｂ２のリーディングフレームは、両方とも完全なゲノムで示される。Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＲａｐＡｐｅｐフラグメントの開始は、下線である。
【図１−２】図１は、ＦＨＶ ＲＮＡ１由来のｃＤＮＡを示す。レプリカーゼ（４０）、Ｂ１（２７２８）、およびＢ２（２７３８）の開始コドンは、四角で囲まれている。（ａ）レプリカーゼ／Ｂ１および（ｂ）Ｂ２のリーディングフレームは、両方とも完全なゲノムで示される。Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＲａｐＡｐｅｐフラグメントの開始は、下線である。
【図１−３】図１は、ＦＨＶ ＲＮＡ１由来のｃＤＮＡを示す。レプリカーゼ（４０）、Ｂ１（２７２８）、およびＢ２（２７３８）の開始コドンは、四角で囲まれている。（ａ）レプリカーゼ／Ｂ１および（ｂ）Ｂ２のリーディングフレームは、両方とも完全なゲノムで示される。Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＲａｐＡｐｅｐフラグメントの開始は、下線である。
【図１−４】図１は、ＦＨＶ ＲＮＡ１由来のｃＤＮＡを示す。レプリカーゼ（４０）、Ｂ１（２７２８）、およびＢ２（２７３８）の開始コドンは、四角で囲まれている。（ａ）レプリカーゼ／Ｂ１および（ｂ）Ｂ２のリーディングフレームは、両方とも完全なゲノムで示される。Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＲａｐＡｐｅｐフラグメントの開始は、下線である。
【図１−５】図１は、ＦＨＶ ＲＮＡ１由来のｃＤＮＡを示す。レプリカーゼ（４０）、Ｂ１（２７２８）、およびＢ２（２７３８）の開始コドンは、四角で囲まれている。（ａ）レプリカーゼ／Ｂ１および（ｂ）Ｂ２のリーディングフレームは、両方とも完全なゲノムで示される。Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＲａｐＡｐｅｐフラグメントの開始は、下線である。
【図１−６】図１は、ＦＨＶ ＲＮＡ１由来のｃＤＮＡを示す。レプリカーゼ（４０）、Ｂ１（２７２８）、およびＢ２（２７３８）の開始コドンは、四角で囲まれている。（ａ）レプリカーゼ／Ｂ１および（ｂ）Ｂ２のリーディングフレームは、両方とも完全なゲノムで示される。Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＲａｐＡｐｅｐフラグメントの開始は、下線である。
【図２】図２は、ｐＦＨＶ［１，０］プラスミドの概略図である。ＨＤＶリボザイムは斜線であり、そして転写終結因子は黒塗りである。
【図３】図３は、ｐＦＨＶ［１，０］のＲＮＡ１領域での制限部位を示す。
【図４】図４は、ＲＮＡ１におけるＢｓｓＨＩＩ部位の除去を示す。
【図５】図５は、ｐＦＨＶ−ＢｓｓｈＩＩΔを示す。
【図６−１】図６は、ｐＦＨＶ−ＭｕｔΔの構築を示す。
【図６−２】図６は、ｐＦＨＶ−ＭｕｔΔの構築を示す。
【図７−１】図７は、ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／ＳｐｅＩの構築を示す。
【図７−２】図７は、ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／ＳｐｅＩの構築を示す。
【図８】図８は、ｐＢＳ２４．１−６Ｌ１を示す。
【図９】図９は、ｐＳＬ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔを示す。
【図１０】図１０は、ｐＥＧＦＰ−１／ＴＡＲの構築を示す。
【図１１】図１１は、ｐＦＨＶ−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲを示す。ＴＡＲは水平のダッシュで示され、そしてＧＦＰコード領域はドットで示される。
【図１２】図１２は、ｐＦＨＶ−ＥＧＦＰ−１−ＴＡＲΔを示す。
【図１３】図１３は、ｐＦＨＶ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１の構築を示す。ＩＲＥＳは、垂直のダッシュで示される。
【図１４】図１４は、ｐＦＨＶ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１−ｂ−ＴＡＲの構築を示す。
【図１５】図１５は、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲΔ（１９．６ｋｂ）を示す。
【図１６】図１６は、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ（１８．１ｋｂ）を示す。
【図１７】図１７は、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ（−）（１８．１ｋｂ）を示す。
【図１８】図１８は、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１／ｂ−ＴＡＲ（２０．２ｋｂ）を示す。
【図１９】図１９は、図１６〜１８のベクターで形質転換された酵母由来の総ＲＮＡのノーザンブロットを示す。レーン１はネガティブコントロール（ＡＢ１１０由来の総ＲＮＡ）を示し；レーン２はＲｅｐＡ（＋）クローン５であり；レーン３はＲｅｐＡ（＋）クローン７であり；レーン４はＲｅｐＡ（−）クローン３であり；レーン５はＲｅｐＡ（−）クローン４であり；レーン６はＲｅｐＡ（＋）−ＧＦＰである。酵母ｒＲＮＡ ２６Ｓ（２２５０ｂｐ）および１８Ｓ（１６５０ｂｐ）もまた示される。
【図２０】図２０は、図１８のベクターで形質転換された酵母由来の総ＲＮＡのＥＧＦＰ−１についてのノーザンブロットを示す。レーン１は、２４時間誘導された培養物から抽出されたＲＮＡを示し；レーン２は４８時間後であり；レーン３は７２時間後であり；レーン４はネガティブコントロール（ＡＢ１１０由来の総ＲＮＡ）である。
【図２１】図２１は、レプリカーゼおよびＢ２のＨｉｓタグ化Ｅ．ｃｏｌｉ発現のための構築物を示す。
【図２２】図２２は、図２１の構築物から発現されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。２２（Ａ）のレーン１はＭＷマーカーおよび画分１４であり；レーン２〜９は画分１５〜２２であり；レーン１０はカラム流出物である。２２（Ｂ）のレーン１は細胞溶解物の可溶性画分であり；レーン２はカラム流出物であり；レーン３〜１１は画分２１〜２９であり；レーン１２はＭＷマーカーである。
【図２３】図２３は、ＲｅｐＡｐｅｐの質量分析を示す。
【図２４】図２４は、図１５のベクターで形質転換された酵母由来の総タンパク質抽出物のウェスタンブロットである。レーン１〜５は、５匹の免疫マウス由来の血清と１：５０００希釈にて免疫反応させた抽出物であり；レーン６は、免疫前の血清混合物を含むネガティブコントロールである。
【図２５】図２５は、７２時間にわたる種々の酵母株由来の総タンパク質抽出物のウェスタンブロットである。レーン１は、ネガティブコントロールであり；レーン２は、４８時間でのｐＢＤ−Ｒ１−Ｇ／ＴΔクローン５由来の総タンパク質抽出物であり；レーン３〜５は、２４、２８、および７２時間でのＲｅｐＡ（＋）−ＧＦＰ株（クローン番号７）の総タンパク質抽出物であり；レーン６〜８は、クローン番号９についての同一物を示す。
【図２６】図２６は、Ｒｅｐ（＋）−ＧＦＰ株由来の総タンパク質抽出物のウェスタンブロットである。レーン１は、ネガティブコントロール（ＡＢ１１０由来の総タンパク質抽出物）である。レーン２は、２４時間誘導された培養物由来のタンパク質を示し；レーン３は４８時間後であり；レーン４は７２時間後である。
【図２７】図２７は、ｐＢＳ−ＡＤＨ２／ＧＡＰ−６Ｌ１Δ４−Ｔａｔの構築を示す。
【図２８】図２８は、抗６Ｌ１（１：５０００）を用いた非還元状態下での、ＣｓＣｌ精製された６Ｌ１Δ４−ｔａｔタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図２９】図２９は、酵母におけるＶＬＰ中の改変ＲＮＡ１の発現およびパッケージングを示す。
【図３０】図３０は、酵母株ＲｅｐＡ（−）（レーン２は２４時間培養、レーン３は４８時間培養）、２つの異なるＲｅｐＡ（＋）株（レーン４およびレーン５は２４時間培養、レーン６およびレーン７は４８時間培養）、および株ＲｅｐＡ（＋）−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−／ｂＴａｒ（レーン８は２４時間培養、レーン９は４８時間培養）由来の総タンパク質のノーザンブロットを示す。ネガティブコントロールＲＮＡ（レーン１）およびＲＮＡ分子量マーカーもまた示される。矢印は、ＲＮＡ３に対応するシグナルの位置を示す。
【図３１】図３１は、図３０の（１）レーン３および（２）レーン６由来のＲＮＡのノーザンブロットを示す。
【図３２】図３２は、図３０に記載されるノーザンブロットを示すが、異なるプローブを用いている。矢印は、ＲＮＡ１マイナス鎖に対応するシグナルの位置を示す。
【図３３】図３３は、４８時間培養された酵母株ＲｅｐＡ（−）（レーン２）、ＲｅｐＡ（＋）（レーン３）、ＲｅｐＡ（＋）−ＥＧＦＰ／ｈＴａｒ（レーン４）、およびＲｅｐＡ（＋）−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ／ｂＴａｒ（レーン５）由来の総ＲＮＡについてのプライマー伸長実験を示す。ネガティブコントロールＲＮＡ（レーン１）およびインビトロで転写されたＲＮＡ１についてのポジティブコントロール（レーン６）もまた報告される。レーン４の文字ａ、ｂ、ｃ、およびｄは、ＲＮＡ１ ５’配列上で示されるヌクレオチドに対応するバンド（この中の３つはまた、レーン３およびレーン５においても見られる）を同定する。
【図３４】図３４は、図３３で報告された同じ総ＲＮＡを用いたＳ１マッピング実験を示す。ネガティブコントロールＲＮＡ（レーン１）およびインビトロで転写されたＲＮＡ１についてのポジティブコントロール（レーン６）を用いたＳ１反応の結果もまた報告される。
【図３５】図３５は、二倍体のＨＰＶ−６ＶＬＰ（ＲＮＡ１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ／ｈＴａｒおよびＨＰＶ−６ Ｌ１／ｈＴＡＴを同時発現する）から抽出された核酸を用いたＲＴ−ＰＣＲにより獲得された結果を示す。３５Ａは、酵母コントロールＲＮＡ（レーン１およびレーン３）およびＶＬＰ由来の核酸（レーン２およびレーン４）を示し；３５Ｂは、酵母ＲＮＡ（レーン１）、および未処理ＶＬＰ（レーン３）かまたはベンゾナーゼ処理されたＶＬＰ（レーン２）のいずれか由来の核酸を示し；３５Ｃは、内部コントロールとしてマウスＲＮＡの存在下での、酵母ＲＮＡ（レーン１）、および未処理ＶＬＰ（レーン３）かまたはＲＮＡｓｅ Ａ処理されたＶＬＰ（レーン２）のいずれか由来の核酸を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
（発明を実施するための様式）
（ＦＨＶのＲＮＡ１）
ＦＨＶゲノム由来のＲＮＡ１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて登録番号Ｘ７７１５６として与えられる。このＲＮＡ１に対応する二本鎖ｃＤＮＡ（３１０７ｂｐ）が、図１に示される。
【００３８】
このｃＤＮＡは、Ｂａｌｌ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：７２０−７２７）により記載されるプラスミドｐＦＨＶ［１，０］中に存在し、引き続く実験に用いられた。ｐＦＨＶ［１，０］はまた、以下を含む：ＲＮＡ１配列から上流の１８ｂｐのＴ７プロモーター（このプロモーターとＲＮＡ１ ５’末端との間に単一のＧが存在する）；ＲＮＡ１配列の下流に位置するデルタ肝炎ウイルスリボザイム（８９ｂｐ）（その結果、リボザイムの開裂は、ＲＮＡ１のネイティブな３’末端を生じる）；およびリボザイム活性を補助すると考えられる１３６ｂｐのＴ７転写終結因子。これは、図２に示される。
【００３９】
（クローニング目的のためのＲＮＡ１の改変）
クローニングを容易にするために、ＲＮＡ１に対して種々の変更がなされた。
【００４０】
（ＢｓｓＨＩＩ部位の除去）図３に示されるように、ネイティブのＲＮＡ１配列は、２つの近接するＢｓｓＨＩＩ制限部位（ヌクレオチド１２７０および１２７８）を含む。これらの中の１つを、レプリカーゼアミノ酸配列に影響を与えない静的な変異を導入することにより除去した。
【００４１】
ＲＮＡ１のＳｐｈＩ／ＢｓｓｈＩＩフラグメントを、プライマーＲＩ９００−ｆおよびＲＩ１２７２Ｍ−ｒ（表Ｉ）を用いて生成されたＰＣＲフラグメントにより置換した。第１のプライマーは、クローニングに必要なＳｐｈＩ部位を含んだ。一方、逆方向プライマーの配列は、１２７１位におけるＧからＡへの置換を含み、それによって、レプリカーゼＯＲＦを変更することなく、２つのＢｓｓＨＩＩ制限部位の１つを除去した（図４）。得られたプラスミドをｐＦＨＶ−ＢｓｓｈＩＩΔを呼んだ（図５）。
【００４２】
（付加的な部位の導入）異種配列をＲＮＡ１に挿入するために、以下の２つの付加的な制限部位を導入した：３０６２位にＳａｃＩＩ部位、３０７２位にＮｏｔＩ部位（レプリカーゼおよびＢ２ ＯＲＦの翻訳終止コドンから下流）。さらに、唯一のＳａｌＩ部位を、ｐＦＨＶ［０，１］のＴ７転写終結因子よりも下流（ヌクレオチド３３３７）に挿入した。これらの部位を、以下のようにＰＣＲ増幅により導入した（図６）：
−プライマーＡｐａＩ−ｆおよびＤＲＳ−ｒ（表Ｉ）は、ＡｐａＩ部位（２３４９位）と３１０１位との間のＲＮＡ１のフラグメントを増幅した。ＳａｃＩＩおよびＮｏｔＩ制限部位の導入を、ＤＲＳ−ｒプライマー中に２つの配列を導入することにより達成した（図６ａ）。
−プライマーＤＲＳ−ｆ（ＤＲＳ−ｒの相補鎖）およびＲＩ−ＫｐｎＩ−ｒは、ヌクレオチド３０３９からＫｐｎＩ部位（３３６８位）までの領域にわたるフラグメントを増幅した（図６ａ）。
【００４３】
２つのＤＮＡフラグメントの融合物を、等量の２つの増幅産物を変性および混合することにより獲得した。これらは、２つのＰＣＲフラグメント中に存在する６２ｂｐの相補的領域によりアニールした。ｄＮＴＰのみの存在下でのＴａｑポリメラーゼを用いた伸長サイクルおよびＴａｑならびにプライマーＡｐａＩ−ｆおよびＲＩ−ＫｐｎＩ−ｒの存在下での増幅サイクルの後、平滑末端のＤＮＡ融合フラグメントを獲得し（図６ｂ）、次いで、このフラグメントをｐＣＲ２．１ベクターにクローン化してＤＮＡ配列を調べた。ＡｐａＩ−ＫｐｎＩフラグメントをｐＣＲ２．１から切り取り、ｐＦＨＶ［１，０］およびｐＦＨＶ−ＢｓｓｈＩＩΔの異種フラグメントを置換するために用いて、ｐＦＨＶ−Ｍｕｔ（示されていない）と名付けられたプラスミドおよびｐＦＨＶ−ＭｕｔΔ（図６ｃ）と名付けられたプラスミドを獲得した。これらのプラスミドは、唯一のＢｓｓｈＩＩ部位および新規のＳａｃＩＩ、ＮｏｔＩ、およびＳａｌＩ制限部位を有するＲＮＡ１ ｃＤＮＡ全体を含んだ。
【００４４】
（酵母ベクターへのＲＮＡ１のクローニング）
酵母においてＲＮＡ１（およびその改変バージョン）を発現させるために、ｃＤＮＡを酵母ベクターの、酵母特異的プロモーターの下流にクローン化した。このベクターは、レプリカーゼをコードし、そして（リボザイム開裂後に）自己複製に適合する５’および３’末端を有するＲＮＡ１分子の転写を指向する。全体的なアプローチは、図７に示される。
【００４５】
（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋におけるＡＤＨ２／ＧＡＰのクローニング）発現に用いられたプロモーターは、ＡＤＨ２／ＧＡＰプロモーターであった。このプロモーターの供給源として、酵母発現ベクターｐＢＳ２４．１−６Ｌ１（図８；ＷＯ００／０９６９９もまた参照のこと）を用いた。ＤＮＡフラグメントＡＤＨ２／ＧＡＰ−６Ｌ１を、ＳａｃＩおよびＳａｌＩによる消化により、プラスミドｐＢＳ２４．１−６Ｌ１から抽出し、そして同一の酵素で消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローン化した。得られた構築物を、ｐＳＫ＋−ＡＤＨ−６Ｌ１と名付けた。
【００４６】
（酵母ＡＤＨ２／ＧＡＰプロモーターのＰＣＲ増幅）酵母プロモーターの一部を、ＳａｃＩ部位において酵母プロモーターにアニールするプライマーＡＤＨ／Ｓａｃ（表Ｉ）、および付加的にＲＮＡ１由来の１３ヌクレオチドを含む６Ｌ１遺伝子との融合物においてプロモーターにアニールする逆方向プライマーＰ−Ｒ１ｒｅｖを用いてｐＳＫ＋−ＡＤＨ−６Ｌ１上で実施したＰＣＲにより増幅した（図７ａ）。
【００４７】
（ＲＮＡ１／ＳｐｈのＰＣＲ増幅）ｐＦＨＶ［１，０］由来のＲＮＡ ｃＤＮＡの一部を、ＲＮＡ１の５’末端（＋１位置）でアニールするプライマーＲＮＡ１−ｆ、およびヌクレオチド１０２１の唯一のＳｐｈＩ制限部位でアニールする逆方向プライマーＲＮＡ１−ｒを用いて増幅した（図７ｂ）。
【００４８】
（ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／Ｓｐｈ融合物）この融合物を、図７ａおよびｂの等量の２つの増幅産物を変性および混合し、これによって両方のＰＣＲフラグメントにおいて存在する１３ｂｐの相補的領域のアニーリングを助けることにより獲得した（図７ｃ）。ｄＮＴＰのみの存在下でのＴａｑを用いた伸長サイクルおよびＴａｑ、ならびに、プライマーＡＤＨ／ＳＡＣおよびＲＮＡ１−ｒの存在下での増幅サイクルの後、融合平滑末端のＤＮＡフラグメントを獲得した。
【００４９】
（ｐＣＲ２．１におけるＡＤＨ２−ＲＮＡ１／Ｓｐｈのクローニング）この平滑末端のＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化し、プラスミドｐＣＲ−ＡＤＨ２／ＲＮＡ１を得た（図７ｄ）。そのＤＮＡ配列を調べて、そして期待されるプロモーター／ＲＮＡ１融合配列ＴＡＡＡＴＣＴＡ／ＧＴＴＴＣＧＡＡＡを確認したが、いくつかの変異が、増幅産物の他の領域に存在した。しかし、正確な増幅配列を有する唯一のクローンが、さらなる工程に必要なＳｐｈＩ部位を除去された変異を有した（図７ｄ）。
【００５０】
（ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−６Ｌ１におけるＡＤＨ２／ＲＮＡ１融合産物のクローニング）この問題を克服するために、この融合産物をＳａｃＩ−ＳｐｅフラグメントとしてｐＣＲ２．１から切り取り、同一の制限酵素で消化されたｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−６Ｌ１中にクローン化し（図７ｅ）、それによって最終産物ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／ＳｐｅＩを獲得した（図７ｆ）。
【００５１】
（酵母ベクターへの改変ＲＮＡ１の導入）ｐＦＨＶ−ＢｓｓｈＩＩΔ（図５）由来のＥａｇＩ−ＫｐｎＩフラグメントを、ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／ＳｐｅＩ（図７ｆ）の対応するフラグメントと置き換えて挿入し、ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＢｓｓｈＩＩΔと名付けられた構築物を作製した。この構築物におけるＢｓｓｈＩＩ−ＫｐｎＩフラグメントを、ｐＦＨＶ−ＭｕｔΔ（図６ｃ）由来の対応するフラグメントで置換し、ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔと名付けられたプラスミドを生成した（図９）。
【００５２】
（異種配列の挿入）
異種挿入をＲＮＡ１配列の内部に作製した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するための遺伝子（Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２−８０６）を、ＨＩＶ由来のＴＡＲ配列と共に、レプリカーゼおよびＢ２のオープンリーディングフレームの下流に挿入した。
【００５３】
異種挿入物を作製するために、開始点は、ＢｓｒｇＩおよびＮｏｔＩで消化されたプラスミドｐＥＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であった。ＢｓｒｇＩ（５’）およびＮｏｔＩ（３’）粘着末端を有し、かつ、ＨＩＶ−１ ＴＡＲ配列（ＨＩＶ−１ゲノムのヌクレオチド４５４〜５２０、登録番号Ｋ０３４５５）を含むｄｓＤＮＡ配列を、２つの相補的なオリゴヌクレオチド（ＴＡＲ−ｆおよびＴＡＲ−ｒ）をアニールさせることにより獲得し、そしてこれを消化されたｐＥＧＦＰ−１中に挿入して、ｐＥＧＦＰ−１／ＴＡＲ（図１０）を形成した。ＴＡＲオリゴはＥＧＦＰ ＯＲＦを保持し、そしてこれはまた、ＢｓｒｇＩ部位からすぐ下流（その直後に新規ＢｓｔＥＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位が続く）に翻訳終止コドンを含んだ。ＴＡＲ配列はまた、首尾よくレプリカーゼＯＲＦの上流に挿入された。
【００５４】
ＨＩＶ−１ ＴＡＲ配列の前にＧＦＰコード配列を含む、ｐＥＧＦＰ−１／ＴＡＲ由来のＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを同一の制限酵素で消化したｐＦＨＶ−Ｍｕｔにクローン化し、ｐＦＨＶ−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲと名付けられたプラスミドを獲得した（図１１）。このプラスミドのＳｐｈＩ／ＳａｃＩＩフラグメントを、ｐＦＨＶ−ＭｕｔΔ由来の対応するフラグメントで置換し（図６ｃ）、唯一のＢｓｓｈＩＩ制限部位を有するｐＦＨＶ−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲΔ（図１２）を生成した。
【００５５】
（異種挿入物の発現の促進）
ポリシストロン性ＲＮＡは、目的の２つの遺伝子間への内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の挿入によって哺乳動物において翻訳され得（Ｐａｒｋｓら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６０：３７６−３８４）、これによって、第２の（下流）遺伝子のｃａｐ非依存性翻訳を可能にする。従って、異種挿入からの発現を促進するために、脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳを、ＥＧＦＰ−１遺伝子の前に挿入した。このＩＲＥＳは、代表的に、哺乳動物細胞においてのみＥＧＦＰタンパク質の翻訳を提供する。なぜなら、ＩＲＥＳ媒介翻訳は、酵母において選択的に阻害されるからである。（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎら（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：５６２−５７２）。
【００５６】
プラスミドｐＣＭＶ−ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ−１（図１３）を、ＥｃｏＲＩで消化し、ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いてこの部位を平滑末端にし、この酵素の不活化後、ＮｏｔＩを用いて消化して、ＥＧＦＰ−１遺伝子に融合したＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含む５’平滑化−３’ＮｏｔＩフラグメントを作製した。同様に、プラスミドｐＦＨＶ−ＭｕｔΔ（図６ｃ）を、ＳａｃＩＩで消化し、ｋｌｅｎｏｗ酵素で処理し、次いで、ＮｏｔＩを用いて消化した。ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１フラグメントを、消化したこのプラスミドにクローン化し、ｐＦＨＶ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１（図１３）を得た。
【００５７】
この構築物から発現されるＲＮＡのパッケージングを補助するために、ＢＩＶ由来のＴＡＲ（ヌクレオチド５〜３０のＢＩＶゲノム、登録Ｍ３２６９０）を、ＥＧＦＰ遺伝子の下流に挿入した。ＴＡＲ配列を、ＮｏｔＩ適合性の粘着末端を有する２つの相補オリゴヌクレオチド（ｂ−ＴＡＲ−ｆおよびｂ−ＴＡＲ−ｒ）をアニーリングすることによって構築した。これはまた、２つの新規な制限部位（ＢｓｔＥＩＩ（５’ＮｏｔＩ部位の隣）およびＸｈｏＩ（３’ＮｏｔＩ部位の隣）を導入した。二本鎖ＮｏｔＩフラグメントを、ＮｏｔＩ消化したｐＦＨＶ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１にクローン化し、ｐＦＨＶ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１／ｂ−ＴＡＲ（図１４）を得た。ＮｏｔＩフラグメントの正確な向きを、確認した。
【００５８】
（酵母発現ベクターへのクローニング）
４つの酵母発現プラスミドを、以下の基本的な５’から３’の配置を用いて構築した：酵母特異的プロモーター；改変ＲＮＡ１；ＨＤＶリボザイム；Ｔ７ターミネーター；酵母ポリＡ部位。
【００５９】
最初に、ＳａｃＩ−ＢｓｓｈＩＩフラグメントのｐＢＳ２４．１−６Ｌ１（図８）を、ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／ＢｓｓｈＩＩΔ由来の対応するフラグメントと置換し、プラスミド ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／ＢｓｓｈＩＩΔ−６Ｌ１を得、ここで、ＲＮＡ１ ｃＤＮＡの一部は、Ｌ１遺伝子配列の３’末端に融合されていた（示さず）。これを、以下のように操作した：
１．ＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩ Ｌ１フラグメントを、ｐＦＨＶ−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲΔ由来のＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩフラグメントと置換して、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲΔ（図１５）を得た。
２．ＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩ Ｌ１フラグメントを、ｐＦＨＶ−ＭｕｔΔ由来のＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩフラグメントと置換して、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ（図１６）を得た。
３．ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ中の特有のＢｓｓｈＩＩ部位（１２７３）を充填し（レプリカーゼＯＲＦの妨害を伴う）、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ（−）（図１７）を作製した。
４．ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ中のＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩフラグメント（改変ＲＮＡ１ ｃＤＮＡ配列の一部を含む）の、ｐＦＨＶ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１／ｂ−ＴＡＲ由来の対応するＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩフラグメント（ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１／ｂ−ＴＡＲを含む）での置換によって、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１／ｂ−ＴＡＲ（図１８）という名のプラスミドを作製した。
【００６０】
（酵母の形質転換）
プラスミドｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲΔ、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ（−）およびｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１／ｂ−ＴＡＲ（図１５〜１８）を、実験室において以前に得たＨＰＶ−１６ Ｌ２タンパク質を発現するＡＢ１１０菌株（ＷＯ００／０９６９９）に形質転換することによって導入した。生じた菌株を、それぞれ、ｐＢＳ−ＲＩ−Ｇ／ＴΔ（選択したクローン４および５）、ｐＢＳ−ＲＩ−ＭｕｔΔ（選択したクローン１および３）、ｐＢＳ−ＲＩ−ＭｕｔΔ（−）（選択したクローン５および７）およびｐＢＳ−ＲＩ−ＩＲＥＳ−Ｇ／ｂ−ＴＡＲ（選択したクローン５および９）と命名した。
【００６１】
（自己複製の確認）
（ＲＮＡ複製の確認）総ＲＮＡを、菌株ｐＢＳ−ＲＩ−ＭｕｔΔ、ｐＢＳ−ＲＩ−ＭｕｔΔ（−）およびｐＢＳ−ＲＩ−ＩＲＥＳ−Ｇ／ｂ−ＴＡＲから抽出して、それぞれ、ＲｅｐＡ（＋）、ＲｅｐＡ（−）およびＲｅｐＡ（＋）−ＧＦＰと標識した。これらのＲＮＡを、ｃ−と標識したＡＢ１１０菌株由来のネガティブコントロールＲＮＡと一緒に、プライマーＡｐａＩ−ｆおよびｒｅｐＡ−Ｒｅｖを用いてｐＦＨＶ［１，０］に対して実行したＰＣＲによって得た非放射性ＤＮＡプローブ（ＢｒｉｇｈＳｔａｒ Ｐｓｏｒａｌｅｎ−Ｂｉｏｔｉｎ標識キット，Ａｍｂｉｏｎ）（６００ｂｐ）を用いて、ノーザンブロットによって分析した。
【００６２】
図１９は、結果を示し、高いハイブリダイゼーションシグナルは、レプリカーゼＯＲＦを発現するように設計された酵母クローンから抽出されたＲＮＡでのみ（ＲＮＡ１配列が挿入を有さない場合（レーン２および３）およびＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ／ｂＴＡＲ配列がレプリカーゼおよびＢ２ ＯＲＦの下流に導入されるされる場合（レーン６）の両方において）検出されることを示す。かなり弱いシグナルが、レプリカーゼＯＲＦが妨害されたプラスミドを用いて形質転換された酵母クローン由来のＲＮＡ（レーン４および５）を用いて検出され、一方、ネガティブコントロールＲＮＡを用いてシグナルは、検出されない。
【００６３】
これらの結果は、レプリカーゼが、異種挿入物（外来遺伝子）が野生型ＲＮＡ１配列に導入されたとしても、ＲＮＡ１の自己複製を維持し得ることを確認する。
【００６４】
自己複製する改変ＲＮＡ１がＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ／ｂ−ＴＡＲ配列を含んでいたことを確認するために、ノーザンブロットを、全ＥＧＦＰ領域の非放射性ＤＮＡプローブを用いて実行した。この実験によって、２４、４８、および７２時間における組換えＲＮＡ１の発現を確認した（図２０）。
【００６５】
（タンパク質発現の確認）ＲＮＡレベルでの自己複製の確認と同様に、タンパク質発現をまた、抗レプリカーゼ抗体を用いてアッセイした。
【００６６】
抗レプリカーゼ抗体を得るために、レプリカーゼのＣ末端部分（ＲｅｐＡｐｅｐと称されるＤＶＷＥＫ．．．ＳＮＮＲＫ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた。このタンパク質は、完全Ｂ１タンパク質を含み、従って有利に、抗ＲｅｐＡｐｅｐ抗体が、Ｂ１発現ならびにレプリカーゼを検出するはずである。同じ領域をまた、＋１フレームシフトさせて発現させ、細菌で発現されるＢ２タンパク質を得た。Ｂ１およびＢ２タンパク質の検出によって、自己複製を確認した。
【００６７】
レプリカーゼＯＲＦのＲｅｐＡｐｅｐ部分を、ＮｈｅＩ（５’）およびＸｈｏＩ（３’）制限部位を含むプライマーＲｅｐＡ−ｄｉｒおよびＲｅｐＡ−ｒｅｖを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ平滑末端産物を、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、そして異なるクローン由来の挿入物の配列を、確認した。ＮｈｅＩ（５’）−ＸｈｏＩ（３’）フラグメントを、２つの制限酵素を用いた消化によって正確なクローンのうちの１つから抽出し、そしてｐＴｒｃ−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、ＯＲＦを含むｐＴｒｃ−ＲｅｐＡｐｅｐ−Ｈｉｓ６と命名されたプラスミド（ここで、ＲｅｐＡｐｅｐはヘキサヒスチジンタグとインフレームであった）（図２１ａ）を作製した。
【００６８】
全Ｂ２ ＯＲＦを、同じＮｈｅＩ部位およびＸｈｏＩ部位を含むプライマーであるＢ２−ｄｉｒおよびＢ２−ｒｅｖを用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、２つの酵素を用いて消化し、ｐＴｒｃ−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接クローン化し、ＯＲＦを含むｐＴｒｃ−Ｂ２−Ｈｉｓ６と命名されたプラスミド（ここで、Ｂ２は、ヘキサヒスチジンタグとインフレームであった）（図２１ｂ）を作製した。
【００６９】
２つの組換えタンパク質のいずれかを発現する細菌クローン由来の総可溶性タンパク質の抽出物を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）を用いてＩＭＡＣに供し、ＲｅｐＡｐｅｐおよびＢ２タンパク質が富化された画分を、収集した（図２２）。ＲｅｐＡｐｅｐタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて予期せぬ移動プロフィールを示し、そして精製したタンパク質を、質量分析法に供し（図２３）、これによって予期した１５〜１６ｋＤａのＭＷを確認した。
【００７０】
富化されたタンパク質を含む分画をプールし、ＰＢＳに対して透析し、そしてタンパク質含量を、ＢＣＡ試験（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。このタンパク質を、５匹のマウスの群を、３回（ｒｅｐＡｐｅｐ、５０μｇ／用量）または４回（タンパク質Ｂ２、２５μｇ／用量）のいずれかで２週間間隔で免疫するために使用した。ワクチンを、２００μｌの抗原および同じ容量のＭＦ５９を用いて腹腔内（ＩＰ）投与した。［Ｏｔｔら（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎの２７７〜２９６頁。Ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ
ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ］。免疫前血清を、免疫の前に収集し、そして血清サンプルを、各免疫後に２週間で採取した。
【００７１】
ＲｅｐＡｐｅｐを用いて免疫した５匹のマウスの血清サンプルを、酵母菌株ｐＢＳ−ＲＩ−Ｇ／ＴΔ（クローン４）から調製した総タンパク質抽出物に対して１：５０００希釈で試験し、約１１０ｋＤａのタンパク質の検出を、これらの全てにおいて観察し、これは酵母によって発現されるレプリカーゼの存在と一致した（図２４）。
【００７２】
図２４のレーン４に使用した同じ希釈の血清を、変化させた期間、誘導条件下で増殖させた異なる酵母菌株由来の総タンパク質抽出物に対するウエスタンブロット分析に使用した。この実験によって、ＲＮＡ１レプリカーゼが、改変ＲＮＡ１を発現する菌株において、２４、４８、および７２時間目に存在することを確認した（図２５）。
【００７３】
図２４のレーン４で使用した血清を、ｐＢＳ−ＲＩ−Ｇ／ＴΔを保有する酵母菌株から、２４、４８、および７２時間の誘導で調製された総タンパク質抽出物に対するウエスタンブロット分析に使用した（図２６）。タンパク質のバンド（レーン２および３）を、２０ｋＤａのＭＷマーカーと７ｋＤａのＭＷマーカーとの間で検出した。これは、ネガティブコントロール抽出物（レーン１）および誘導後７２時間で調製された抽出物（レーン４）において存在しない。これは、酵母におけるＢ１タンパク質の合成と一致し、再び、改変ＲＮＡ１の自己複製が確認された。７２時間目におけるＢ１タンパク質の非存在は、哺乳動物細胞において以前に得られたＢ１およびＢ２発現データと一致する［Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｂａｌｌ （１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７９３３−７９４２］。
【００７４】
（ＲＮＡ３発現の確認）総ＲＮＡを、２４時間および４８時間増殖させたプラスミドｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１ＭｕｔΔ（−）、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１ＭｕｔΔおよびｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１／ｂ−Ｔａｒを発現する酵母菌株から抽出し、そしてそれぞれ、ＲｅｐＡ（−）、ＲｅｐＡ（＋）およびＲｅｐＡ（＋）ＩＧＦＰ／ｂ−Ｔａｒと標識した。これらのＲＮＡを、図１９のような非放射性二本鎖ＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット分析によって分析した。図３０は、フィルムを過剰に露光することによって、移動するＲＮＡ種に対応する弱いシグナルが明らかになることを示し、これは、ＲＮＡ３が菌株ＲｅｐＡ（＋）の２４時間および４８時間（レーン４〜７）の両方で検出されることを予想する。ノーザンブロットを、レーン６由来のＲＮＡを用いて長期間アガロースゲル上で実行し、そのフィルターを、ＲＮＡ３が存在した領域のみを含むように、ハイブリダイゼーション前に切断した（図３１）。これによって、ＲＮＡ３の存在を確認する。菌株ＲｅｐＡ（＋）ＩＧＦＰ／ｂ−Ｔａｒ由来のＲＮＡの場合（図３０、レーン８および９）、挿入に起因してよりゆっくりと移動する対応するＲＮＡ３は、おそらく、強いＲＮＡ１ハイブリダイゼーションシグナルによってマスクされ、観察され得なかった。
【００７５】
（ＲＮＡマイナス鎖の確認）２４時間および４８時間増殖させた菌株ＲｅｐＡ（−）、ＲｅｐＡ（＋）およびＲｅｐＡ（＋）ＩＧＦＰ／ｂ−Ｔａｒから抽出したＲＮＡを、鎖特異的非放射性プローブ（ＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ Ｐｓｏｒａｌｅｎ−Ｂｉｏｔｉｎ標識キット、Ａｍｂｉｏｎ）を用いたノーザンブロットによって分析し、ＲＮＡマイナス鎖を検出した。鎖特異的プローブは、ＳａｃＩＩで直鎖にされたプラスミドｐＦＨＶ−ＭｕｔΔを用いることによって得たインビトロ転写物であった。図３２は、予期したサイズのＲＮＡに対応する強いハイブリダイゼーションシグナルが、レプリカーゼタンパク質を発現するクローンにおいてのみ（ＲＮＡ１配列が挿入を有さない場合（レーン４および５）およびＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ／ｂ−Ｔａｒ配列がＢ２ ＯＲＦの下流に導入されている場合（レーン６および７）の両方において）検出されることを示す。コントロールＲＮＡ（レーン１）およびレプリカーゼＯＲＦが妨害されている場合（レーン２および３）、シグナルは検出されない。
【００７６】
（ＲＮＡ１のプライマー伸長およびＳ１マッピング分析）標準的なプライマー伸長分析を、菌株ＲｅｐＡ（−）、ＲｅｐＡ（＋）およびＲｅｐＡ（＋）ＩＧＦＰ／ｂ−Ｔａｒ由来の総ＲＮＡに対してＡＭＶ逆転写酵素およびＴ４キナーゼ標識したオリゴヌクレオチドＲｌ−１２０を用いて実行した。
【００７７】
同じプライマーを用いてプラスミドｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／ＳｐｅＩ（図７ｆ）に対して実行したコントロール配列と共に、伸長産物を８％変性ポリアクリルアミド／尿素ゲル上で泳動した。図３３は、より短い伸長産物が検出され得ることを示す。
【００７８】
Ｓ１マッピング分析を、同じＲＮＡを用いて実行した。プローブは、オリゴＡＺ１５−ｆｏｒ（プラスミド中のｎｔ ６２８５）およびＲ１−１２０を用いてプラスミドｐＳＶ４０−ＦＨＶ［０，０］から得た二本鎖ＰＣＲフラグメントであった。このＰＣＲフラグメントを、Ｔ４キナーゼを用いて標識し、ＮｃｏＩを用いて消化し、検出されるｍＲＮＡの同じ極性を有する鎖から放射性標識を、取り除き、そしてゲル精製した。放射性プローブのアリコートを、総ＲＮＡにハイブリダイズさせ、そしてＳ１ヌクレアーゼを用いた消化を、標準的な条件下で実行した。コントロールとして、ｐＦＨＶ［１，０］由来のＴ７でインビトロ転写されたＲＮＡ１をまた、このプローブに対してハイブリダイズさせ、そしてＳ１消化した。Ｓ１処理された産物を、プライマーＲ１−９０ｒｅｖを用いて獲得しかつＲＮＡ１に相補的であるＤＮＡ配列と共に、８％変性ポリアクリルアミド／尿素ゲル上で泳動した。
【００７９】
図３４に示されるように、全長ＲＮＡに対応するバンドを、ＧＦＰおよびＩＲＥＳ−ＧＦＰ挿入を有さないかまたは有するレプリカーゼＡを発現するサンプルで検出し得た（レーン３、４および５）。
【００８０】
（ＲＮＡ１の５’末端のクローニングおよび配列決定）菌株ＲｅｐＡ（＋）−ＩＧＦＰ／ｂ−Ｔａｒ由来の総ＲＮＡを使用して、ＲＮＡ１種の５’末端をクローン化した。クローニングは、Ａｍｂｉｏｎ ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅＴＭ ＲＬＭ−ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（これは、キャップされたｍＲＮＡ分子の選択的なクローニングを可能にする）を用いることによって実行した。使用したプライマーは、以下であった：
１）Ｒ１−ｒｅｖを用いた逆転写
２）キットで供給される外部ＲＮＡアダプタープライマーおよび逆方向プライマーＡＺ−９ｒｅｖ（ＲＮＡ１上のｎｔ４２６）を用いた外部ＰＣＲ
３）キットで供給される内部ＲＮＡアダプタープライマーおよびＲ１−１２０を用いた内部ＰＣＲ。
【００８１】
最終ＰＣＲ産物のクローニングを、ｐＺｅｒｏ平滑ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に実行した。１０個のクローンの配列決定によって、これら全てのクローン化された配列が、ＡＡＡＡＣＡＧ（ＲＮＡ１配列のヌクレオチド１６）で始まることが明らかになった。これは、図３３において示される産物ｃに対応する。従って、図３３のバンドｂは、ｃの分解産物を示し得、そしてバンドｂは、キャップされた形態であり得る。
【００８２】
（ＲＮＡ３の５’末端のクローニングおよび配列決定）同じ実験手順を使用することによって、ＲＮＡ３の５’領域を、同じ酵母クローンからクローン化した。使用したプライマーは以下であった：
１）ＡＺ−５ｒｅｖ（ＲＮＡ１のｎｔ ３１０１）を用いた逆転写
２）キットで供給される外部ＲＮＡアダプタープライマーおよび逆方向プライマーＡＺ−５ｒｅｖを用いた外部ＰＣＲ
３）キットで供給される内部ＲＮＡアダプタープライマーおよびＲ３−２８０９ｒｅｖ（ＲＮＡ１上のｎｔ ２８３０）を用いた内部ＰＣＲ。
【００８３】
最終ＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩ（ＲＮＡ１上のｎｔ ２８０１）およびＢａｍＨＩ（内部アダプタープライマー内）を用いて消化し、そして同じ酵素を用いて消化したｐＴＲＣ−ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。
【００８４】
ＲｅｐＡ（＋）菌株由来のＲＮＡを用いて実行したＲＴ−ＰＣＲからの１０個のクローンの配列決定によって、各場合での同じ配列（ＲＮＡ１のヌクレオチド２７２１で始まる（ＧＴＴＡＣＣＡＡ．．．））が明らかになった。これは、文献ですでに報告されたＲＮＡ３開始部位に対応する。
【００８５】
ＲｅｐＡ（＋）−ＩＧＦＰ／ｂ−Ｔａｒ菌株由来のＲＮＡを用いて実行したＲＴ−ＰＣＲからの１８個のクローンの配列決定によって、いずれもＲＮＡ３転写開始部位に対応しないが、これらの全てが、ＲＮＡ１に属する上流の配列で開始することが明らかになった。
【００８６】
（ＨＰＶ ＶＬＰにおけるパッケージング）
ＴＡＲ挿入物を保有する改変ＲＮＡ１のパッケージングを促進するために、ＨＰＶ−６のＬ１コートタンパク質を、相補的なｔａｔモチーフをそのＣ末端に含むように改変した。
【００８７】
これを達成するための酵母発現ベクターの構築は、いくつかの工程を含んだ（図２７）。最初に、プラスミドｐＢＳ２４．１−６Ｌ１（図８）を、ＢｓｓｈＩＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、このようにしてＬ１タンパク質の最後の４アミノ酸を排除した。このプラスミドは、酵母においてＨＰＶ−６ Ｌ１キャプシドタンパク質を発現する。相補的なオリゴヌクレオチド６Ｌ１Δ４および６Ｌ１Δ４ｉｎｖをアニーリングすることによって得た短いＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩ ｄｓＤＮＡを挿入し、これによって、Ｌ１ ＯＲＦを再構築し、これに翻訳終止コドンおよび新しいＮｏｔＩ制限部位を与えた。生じた酵母発現プラスミドを、ｐＢＳ２４．１−６Ｌ１Δ４と命名した。ｔａｔのＨＩＶ−１ ＴＡＲ−結合ドメイン（アミノ酸３６〜７２）のＰＣＲ増幅を、プライマーＴａｔ−ｄｉｒおよびＴａｔ−ｒｅｖを用いることによってＨＩＶ−１菌株ＩＩＩＢのｃＤＮＡを含むプラスミドに対して実行し、これはまた、５’末端にＢｓｓｈＩＩ部位を、そして３’部位にＮｏｔＩおよびＳａｌＩ部位を含んだ。生じた平滑末端のフラグメントを、ｐＣＲ２．１プラスミドにクローン化し、そして配列決定した。ＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＣＲ２．１から抽出し、そして同じ制限酵素を用いて消化したｐＢＳ２４．１−６Ｌ１Δ４に連結した。生じたプラスミドを、ｐＢＳ２４．１−６Ｌ１Δ４−Ｔａｔと命名した。
【００８８】
ｐＢＳ２４．１−６Ｌ１Δ４−Ｔａｔを、実験室で以前に獲得しかつＨＰＶ−６ Ｌ２タンパク質を発現するＪＳＣ３１０菌株（ＷＯ００／０９６９９）への、形質転換によって導入した。形質転換実験からの異なるクローンを、６Ｌ１Δ４−Ｔａｔ発現に関して分析し、クローン２を、更なる実験のために選択した。
【００８９】
クローン２を、誘導条件下で増殖させ、ＶＬＰの塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配精製を、ＷＯ００／０９６９９に記載されるように実行した。１．２８〜１．２９ｇ／ｃｍ３の密度に対応するＣｓＣｌ分画を、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、抗６Ｌ１抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した（図２８）。１１５ｋＤａのＭｗのタンパク質マーカーよりもゆっくりと移動したバンドの検出は、異なるＬ１／Ｔａｔ単量体間でジスルフィド結合が形成されることを示し、これは、ＨＰＶ ＶＬＰの効率的な自己アセンブリの公知の必要条件である（Ｓａｐｐら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６１８６−８９）。
【００９０】
レプリカーゼの発現、ＴＡＲ挿入物を保有する改変ＲＮＡ１の自己複製、Ｌ１−Ｔａｔの発現、および改変ＲＮＡ１のパッケージングが、図２９に示される。全ての工程は、同じ酵母細胞で起こり、目的の遺伝子を哺乳動物細胞に送達するための感染性ＶＬＰを生じる。
【００９１】
プラスミドｐＢＳ２４．１−６Ｌ１Δ４−Ｔａｔを含む酵母菌株ＪＳＣ３１０（クローン２）を、プラスミドｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲΔを含む菌株ＡＢ１１０と接合させ、組換えＲＮＡ１誘導体（ＧＦＰ遺伝子およびヒトＴＡＲ配列を含む）および組換えＨＰＶ６ Ｌ１／ｈＴＡＴタンパク質を同時発現する二倍体クローンを得た。接合実験からの異なるクローンを、Ｌ１およびレプリカーゼＡタンパク質発現に関して試験し、そしてＲＮＡ１−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲ転写レベルに関して試験した。１つの二倍体クローンを選択し、そして誘導条件下で増殖させた。ＶＬＰのＣｓＣｌ勾配精製を、ＷＯ００／０９６９９に記載されるように実行した。
【００９２】
１．２８〜１．２９ｇ／ｃｍ３の密度に対応するＣｓＣｌ分画をプールし、そしてＰＢＳに対して透析した。透析したＶＬＰを、以下の異なる手順に従って実行した異なる実験に使用し、そして図３５に報告する。
【００９３】
図３５Ａにおいて、ＶＬＰを、フェノール沈澱、フェノール−クロロホルム沈澱、クロロホルム沈澱、およびエタノール沈澱で処理し、タンパク質を欠く材料を得た。水中に懸濁した最終核酸ペレットのアリコートを、さらなる処理をいずれも行わずに、ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてこのキットの指示書に従ってＲＴ−ＰＣＲに供した。使用したプライマーは、Ｒ１−２３５ｆｏｒ（ＲＮＡ１上のｎｔ ２３５）およびＲ１−１２７２Ｍ−ｒであり、予期した１０３７ ｎｔのバンドを生じた（レーン２および４、これらは、２つの異なるＲＴ−ＰＣＲ分析で繰り返した同じサンプルである）。関連しない酵母ＲＮＡを、コントロールとして含めた。
【００９４】
図３５Ｂにおいて、プールしたＶＬＰの１００μｌのアリコートを、フェノール（ｆｅｎｏｌ）／クロロホルム抽出前に、２５単位のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて３７℃で２４時間の処理に供した。最終核酸ペレットを、前のものと同じプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲに供した。ＶＬＰを事前にＢｅｎｚｏｎａｓｅで処理した場合（レーン２）およびいずれのＢｅｎｚｏｎａｓｅ処理も行わない場合の両方において、１０３７ ｎｔのバンドを観察した。
【００９５】
図３５Ｃにおいて、プールしたＶＬＰの１００μｌのアリコートを、フェノール／クロロホルム抽出前に、１μｇ ＲＮＡｓｅ Ａを用いて３７℃で１時間の処理に供した。総マウスＲＮＡを、ＲＮＡｓｅ処理の内部コントロールとしてこのサンプルに含めた。フェノール／クロロホルム抽出後、最終核酸ペレットを、２つの異なるセットのプライマー（図３５Ａにおいて使用した２つのＲＮＡ１プライマーおよびマウスＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対応する約６００ｎｔ長のバンドを増幅する２つのプライマー）を用いてＲＴ−ＰＣＲに供した。ＶＬＰを事前にＲＮＡｓｅで処理した場合（レーン２）およびいずれのＲＮＡｓｅ処理も行わなかった場合（レーン３）の両方において、ＲＮＡ１のバンド（白い矢印）が目に見えたが、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡが未処理サンプルから増幅され得（黒い矢印）（レーン３）、これはＲＮＡｓｅ処理後はほとんど見えない。
【００９６】
本発明は例によってのみ記載され、そして本発明の範囲および精神内で維持しながら改変がなされ得ることは、理解される。
【００９７】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（技術分野）
本発明は、遺伝子送達の分野、より詳細にはウイルス様粒子（ＶＬＰ）にパッケージされた改変ノダウイルスＲＮＡを用いた、発現のための遺伝子の送達の分野である。
【０００３】
（背景技術）
Ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅは、二分節のＲＮＡゲノムを有する。換言すれば、Ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅゲノムは、ＲＮＡ１およびＲＮＡ２と命名された、２つの別個の一本鎖ＲＮＡ分子からなる。これらは両方とも、同一のビリオン中にパッケージされている。ＲＮＡ１はＲＮＡレプリカーゼをコードし、ＲＮＡ２はビリオンキャプシドタンパク質をコードする。フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）において、ＲＮＡ１は３．１ｋｂ長であり、ＲＮＡ２は１．４ｋｂである。
【０００４】
ＦＨＶ ＲＮＡ１のレプリカーゼ産物は、このウイルスゲノムに特異的であり、これは、ＦＨＶが自律的に複製することを可能にする（Ｂａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３２６−３４；Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：４８１−８９）。天然の状況において、レプリカーゼは高度にテンプレート特異的であり、ウイルスＲＮＡ１およびＲＮＡ２のみを複製するが、ＲＮＡ２の非存在下においては自己複製もまた生じる。さらに、ＦＨＶは昆虫ウイルスであるにもかかわらず、植物、脊椎動物、および酵母を含む多くの異なる細胞型において自己複製し得る。
【０００５】
ＲＮＡ２およびＦＨＶキャプシドタンパク質の操作は、広範に報告されている。表面ループへのＨＩＶエピトープの挿入が報告されている（例えば、Ｓｃｏｄｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２３３−３９；Ｂｕｒａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９７：７−１８；Ｓｃｈｉａｐｐａｃａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６３：１２１−２７）。より一般的には、ビリオンは、エピトープ提示系として用いられている（Ｌｏｒｅｎｚｉ ＆ Ｂｕｒｒｏｎｅ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：２６７−７２；ＷＯ９６／０５２９３もまた参照のこと）。
【０００６】
対照的に、ＦＨＶ ＲＮＡ１およびレプリカーゼの操作は、追跡されていない。実際、ＲＮＡ１の自己複製機能は、ＲＮＡ１およびそのＯＲＦの操作に対して非常に敏感であることが示されている（Ｂａｌｌ（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６９：７２０−７２７）。
【０００７】
ＲＮＡ１の複製の間に、ＲＮＡ３と呼ばれる小さなサブゲノムＲＮＡもまた、ＲＮＡ１の３’末端から転写される。ＲＮＡ３は、未知の機能を有する以下の２つの小さなタンパク質をコードする：Ｂ１（レプリカーゼと同一のオープンリーディングフレームであり、同一の翻訳終止コドンを有する）およびＢ２（レプリカーゼに関して＋１オープンリーディングフレームである）（Ｂａｌｌ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６６：２３３５−４５；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｂａｌｌ（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７９３３−７９４２）。ＲＮＡ３の転写は、二本鎖ＲＮＡ＋／ＲＮＡ−中間体が形成される場合に活性になる内部プロモーターにより制御されるようである。
【０００８】
本発明の目的は、ＲＮＡ１分子の改変および操作を可能にして、自己複製するその能力を開発すること、およびこのような改変ＲＮＡ１分子を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の開示）
本発明は、改変ノダウイルスＲＮＡ１分子を提供し、この改変ノダウイルスＲＮＡ１分子は、このＲＮＡ１のレプリカーゼＯＲＦの下流に異種挿入を含む。この挿入は、好ましくは、上記ＲＮＡ１のレプリカーゼＯＲＦおよびＢ２ ＯＲＦの下流である。
【００１０】
（ＲＮＡ１分子）
本発明は、ノダウイルスのＲＮＡ１分子に基づく。ＲＮＡ１は、ノダウイルスゲノムを特異的に複製するＲＮＡレプリカーゼをコードし、そしていくつかのノダウイルス（例えば、フロックハウスウイルス（登録番号Ｘ７７１５６）、ゴキブリウイルス（登録番号Ｘ０２３９６およびＫ０２５６０）、シマアジ神経壊死ウイルス（ＡＢ０２５０１８）、パリアコト（ｐａｒｉａｃｏｔｏ）ウイルス（ＡＦ１７１９４２）、ノダムラウイルス（ＡＦ１７４５３３）、ゴキブリウイルス（ＮＣ＿００１４１１）およびオヒョウ神経壊死ウイルス（ＡＪ４０１１６５））由来の配列が利用可能である。
【００１１】
本発明に関して、「ノダウイルスＲＮＡ１」配列は、天然で見出される配列、ならびにそれら自体の遺伝子を特異的に増幅する能力を保持するレプリカーゼをコードするそのフラグメント、改変体、および変異体を含む。
【００１２】
本発明のＲＮＡ１分子は、標準的な分子生物学技術を用いることによりノダウイルスから獲得されるＲＮＡ１の改変により調製され得るか、あるいは酵素的および／または化学的手段により合成的に組み立てられ得ることが理解される。
【００１３】
（ＲＮＡ１分子内のＯＲＦ）
ノダウイルスの利用可能なＲＮＡ１配列（上記を参照のこと）は、レプリカーゼ（または「Ａ」）および「Ｂ２」ＯＲＦの位置を示す。本発明の分子における挿入は、レプリカーゼＯＲＦの下流であり、好ましくはＢ２ ＯＲＦの下流でもある。
【００１４】
ＦＨＶにおいて、ＲＮＡ１は、３１０７ヌクレオチド長である。レプリカーゼＯＲＦは、ヌクレオチド４０〜３０３３によりコードされ、Ｂ２ ＯＲＦは、ヌクレオチド２７３８〜３０５５によりコードされる。従って、本発明により、ＦＨＶのための異種挿入は、ヌクレオチド３０３３と３１０７との間、好ましくはヌクレオチド３０５５と３１０７との間に置かれる。
【００１５】
好ましくは、異種挿入は、レプリカーゼＯＲＦの５ヌクレオチドよりも下流（すなわち、ＦＨＶにおいては、ヌクレオチド３０３８の下流）、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｔよりも下流にある。より好ましくは、Ｂ２ ＯＲＦの５ヌクレオチドよりも下流（すなわち、ＦＨＶにおいては、ヌクレオチド３０６０の下流）、例えば、このＯＲＦの１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｔよりも下流にある。同様に、好ましくは異種挿入は、ＲＮＡ１の３’末端の５ヌクレオチドよりも上流（すなわち、ＦＨＶにおいては、ヌクレオチド３１０２の上流）、例えば、この３’末端の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｔよりも上流にある。ＲＮＡ１のネイティブの３’末端配列の長さを保持することは、ＲＮＡ１が、自己複製する能力を保持することの保証を手助けする（Ｂａｌｌ（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６９：７２０−７２）。
【００１６】
異種挿入が、レプリカーゼまたはＢ２ ＯＲＦの最後のコドンの３ヌクレオチド内（すなわち、ヌクレオチド３０３４〜３０３６または３０５６〜３０５８の間）に存在する場合、挿入の５’末端が、ＯＲＦのための終止コドン（すなわち、レプリカーゼのためにはヌクレオチド３０３４〜３０３６、またはＢ２のためには３０５６〜３０５８における終止コドン）を保持することが好ましい。
【００１７】
（異種挿入）
本発明の改変ＲＮＡ１は、異種挿入を保有する。この挿入は、好ましくはそれ自体の開始コドンおよび終止コドンを有する１つ以上のタンパク質コード領域を含む。
【００１８】
挿入は、ＲＮＡ１に対してネイティブな１つ以上のＯＲＦの下流に存在する場合、その翻訳において補助するために、異種挿入の５’部分はまた、ｃａｐ非依存性の翻訳を指向する配列を含み得る。従って、代表的に、異種配列は、タンパク質コード領域に機能的に連結された内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。Ｃ型肝炎ウイルスまたは脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳ、もしくはピコルナウイルス、口蹄疫ウイルス、ＥＣＨＯウイルス１１’、古典的な豚コレラウイルス、ｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子など由来のＩＲＥＳのような任意の適切なＩＲＥＳが、用いられ得る（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４５８−４６４）。
【００１９】
異種挿入は、コードされたレプリカーゼを介して自己複製するＲＮＡ１の能力を破壊しない。従って、改変ＲＮＡ１は、発現のための目的の遺伝子を送達し得、かつそれ自体の複製を指向し得る。
【００２０】
（改変ＲＮＡ１のパッケージング）
改変ＲＮＡ１を細胞に送達するために、例えば、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）または偽ビリオン（ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎ）中にそれをパッケージングすることが好ましい。
【００２１】
ＲＮＡ２（必要に応じて改変されたＲＮＡ２）から発現されるタンパク質を含むノダウイルス粒子が、用いられ得る。このアプローチが用いられる場合、ＲＮＡ２は、好ましくは、パッケージされる改変ＲＮＡ１と同一のノダウイルス由来である。
【００２２】
しかし、ノダウイルスは昆虫細胞に自生しているので、哺乳動物細胞への送達が所望される場合、異なるパッケージを用いることが好ましい。好ましいパッケージは、パピローマウイルスＶＬＰ（例えば、Ｔｏｕｚｅ ＆ Ｃｏｕｒｓａｇｅｔ（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２６：１３１７−１３２３；Ｋａｗａｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１０２９８−１０３００；Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｖｉｒｏｌ．２３４：９３−１１１；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｖｉｒｏｌ．２４３：４８２−４９１；Ｕｎｃｋｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２９３４−２９３９；ＷＯ９７／４６６９３；ＷＯ９８／０２５４８など）であり、これは哺乳動物細胞上のレセプターに結合し得る。
【００２３】
ＨＰＶ ＶＬＰを用いることは、様々な利点を提供する。第１に、ＨＰＶ ＶＬＰは広範な細胞型に結合し、高レベルの結合が上皮細胞および間葉細胞で観察され、そして低いレベルの抗ＶＬＰ抗体のみがヒトにおいて観察されている（Ｌｅ Ｃａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５）Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：１３８０−１３８２）。第２に、異なるＨＰＶ型のＬ１タンパク質が同様に発現され得、ＶＬＰの使用により誘導される免疫は大部分は型特異的であるので、予め存在する抗ＨＰＶ抗体の存在は回避され得、そして複数の免疫化が起こり得る。第３に、ノダウイルスＲＮＡ１は小さいので、ＨＰＶ ＶＬＰに伴う公知の制限、すなわちキャプシドに包まれる核酸に対する７〜８ｋｂｐの上限を克服し得る。従って、ノダウイルスＲＮＡは、他の核酸よりも重要な利点を提供する。
【００２４】
パピローマウイルスは、好ましくはＨＰＶ−６のようなヒトパピローマウイルスである。ＶＬＰキャプシドは、タンパク質Ｌ１およびＬ２を含み得るか、またはＬ１のみから生成され得る。
【００２５】
改変ＲＮＡ１のパッケージングを容易にするために、パッケージを形成するタンパク質（例えば、ＶＬＰにおけるキャプシドタンパク質）は、改変ＲＮＡ１と特異的に相互作用し得る配列または構造を含むように改変され得る。ＤＮＡプラスミドを用いて遭遇する問題と比較すると、ＲＮＡ／タンパク質相互作用のインビボでの特異性は、ノダウイルスＲＮＡを用いることのさらなる利点である。
【００２６】
特に有用なこの型のパッケージング系は、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＢＩＶなど）のｔａｔ／ＴＡＲ相互作用に依存する。この系において、パッケージは、改変ＲＮＡ１においてＴＡＲモチーフ（例えば、最小ＴＡＲ配列（例えば、最小５９マー）またはＷＯ９２／０２２２８に記載されるモチーフ）と特異的に相互作用するｔａｔタンパク質由来のモチーフ（例えば、最小ｔａｔ配列（例えば、ＨＩＶ ｔａｔのアミノ酸４８〜５９）；Ｄｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６５：７０１２−１５；Ｃｈｅｎ ＆ Ｆｒａｎｋｅｌ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：２７０８−２７１５；Ｐｕｇｌｉｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１２００−１２０２もまた参照のこと）を含む。従って、本発明の改変ＲＮＡ１は、ＴＡＲモチーフをさらに含む。これは、異種挿入内の遺伝子の上流または下流に存在し得るが、好ましくは下流に存在し得る。代替として、ＴＡＲモチーフは、レプリカーゼＯＲＦの上流（すなわち、ＦＨＶにおいてヌクレオチド４０の前）に配置され得る。パピローマウイルスに基づくパッケージング系において、ｔａｔ配列は、Ｌ１タンパク質に、好ましくはＣ末端にかまたはその付近に挿入され得る。この領域はキャプシド形成に必須ではないが（Ｐａｉｎｔｓｉｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２３：２３８−２４４）、この配列は、ＶＬＰの組み立てる能力を破壊するには及ばない（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３４：９３−１１１）。ｔａｔおよびＴＡＲの相互作用は、パッケージ中での改変ＲＮＡ１のパッケージングを生じる。ＢＩＶ由来のｔａｔ／ＴＡＲの相互作用の使用は、細胞因子を必要としない強力な相互作用なので、この相互作用の使用が好ましい。
【００２７】
ＶＬＰ内への核酸のパッケージングのためのｔａｔ／ＴＡＲの相互作用の使用は、本発明の改変ＲＮＡ１に限定されないことが理解される。
【００２８】
（発明のさらなる局面）
本発明の改変ＲＮＡ１は、代表的に、正のセンス方向であり、そして一本鎖である。本発明はまた、以下を提供する：（ｉ）本発明のＲＮＡ１に相補的な一本鎖核酸；（ｉｉ）（ｉ）に相補的な一本鎖核酸；（ｉｉｉ）本発明のＲＮＡ１に相補的な配列を含む一本鎖核酸；（ｉｖ）（ｉ）に相補的な核酸を含む一本鎖核酸；および（ｖ）鎖の１つが（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）である二本鎖核酸。用語「核酸」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ならびにＰＮＡ（ペプチド核酸）および骨格改変ＤＮＡ（ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ホスホロチオエートなど）のようなアナログを含む。核酸は、インビトロかまたはインビボでＲＮＡポリメラーゼにより転写されて、本発明の改変ＲＮＡ１を生成し得ることが理解される。
【００２９】
本発明はまた、本発明の核酸を含む（例えば、改変ＲＮＡ１を含む）ＶＬＰを提供する。このＶＬＰは、好ましくはパピローマウイルスＶＬＰである。
【００３０】
本発明はまた、免疫不全ウイルスのｔａｔタンパク質由来のモチーフを含むよう改変されたパピローマウイスルＬ１タンパク質を提供する。
【００３１】
本発明はまた、本発明の改変ＲＮＡ１分子を生成するためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下の工程を包含する：（ａ）ノダウイルスＲＮＡ１配列を含むかまたはコードする核酸を獲得する方法；および（ｂ）上記ＲＮＡ１配列中のレプリカーゼＯＲＦおよびＢ２ ＯＲＦの下流に異種配列を挿入する工程。ＦＨＶが用いられる場合、その複製が２８℃未満で最大活性を示すことは、注目されるべきである。
【００３２】
本発明はまた、本発明のＶＬＰを生成するためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下の工程を包含する：本発明による核酸を用いて細胞をトランスフェクトする工程；ＶＬＰキャプシドタンパク質（必要に応じて改変ＲＮＡ１に特異的なモチーフを含むよう改変されたタンパク質）をコードする核酸を用いて細胞をトランスフェクトする工程；およびこの細胞からＶＬＰを精製する工程。このプロセスは、好ましくは酵母において実施される。ＶＬＰコード核酸およびＲＮＡ１コード核酸を同一の酵母に導入するために、一倍体株を接合することが可能である（例えば、キャプシドタンパク質を発現する一倍体株が、ＲＮＡ１を発現する反対の接合型の一倍体株と接合され得る）。
【００３３】
本発明の核酸（特に改変されたＲＮＡ１）およびＶＬＰはまた、医薬として使用するために提供される。それらは特に、例えば、遺伝子療法における遺伝子送達に有用である。
【００３４】
本発明はまた、核酸配列を細胞に送達するためのプロセスを提供する。このプロセスは、本発明のＶＬＰを上記細胞に導入する工程を包含する。このプロセスは、インビトロ（培養物中の細胞）またはインビボで実施され得る。
【００３５】
（ノダウイルス）
ノダウイルスは、アルファノダウイルスとベータノダウイルスに分けられ、そしてノダムラウイルス、ゴキブリウイルス、Ｂｏｏｌａｒｒａウイルス、フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）、マイマイガウイスル、マナワトゥウイルス、太西洋オヒョウウイルス、トラフグ神経壊死ウイルス、マツカワ神経壊死ウイルス、日本ヒラメ神経壊死ウイルス、Ｄｉｃｅｎｔｒａｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ脳炎ウイルス、パリアコトウイルス、アロワナ（Ｄｒａｇｏｎ）神経壊死ウイルス、オヒョウ神経壊死ウイルス、Ｍａｌａｂａｒｉｃｕｓ神経壊死ウイルス、Ｒｅｄｓｐｏｔｔｅｄ ｇｒｏｕｐｅｒ神経壊死ウイルス、Ｕｍｂｒｉｎａ ｃｉｒｒｏｓａノダウイルス、およびシマアジ神経壊死ウイスルを含む。これらのウイルスのいずれか由来のＲＮＡ１分子が、本発明に従い用いられ得る。しかし、分子レベルで最も研究されているノダウイルスであるという理由で、ＦＨＶおよびノダムラウイルスが好ましい。ノダウイルスのさらなる詳細は、Ｇａｒｚｏｎ ＆ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ（Ａｔｌａｓ ｏｆ ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｖｉｒｕｓｅｓ（Ａｄａｍｓ ＆ Ｂｏｎａｍｉ編）の３５１−３７０頁、ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ（１９９２））およびＨｅｎｄｒｙ（Ｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ（Ｋｕｒｓｔａｋ編）の２２７−２７６頁、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｅｒ（１９９１））に見出され得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） ＲＮＡ１のレプリカーゼＯＲＦの下流に異種挿入を含む、改変ノダウイルスＲＮＡ１分子。
（項目２） 前記異種挿入がまた、前記ＲＮＡ１のＢ２ ＯＲＦの下流でもある、項目１に記載のＲＮＡ１分子。
（項目３） 前記異種挿入が、前記レプリカーゼＯＲＦおよびＢ２ ＯＲＦの５ヌクレオチドよりも下流である、項目２に記載のＲＮＡ１分子。
（項目４） 前記異種挿入が、ＲＮＡ１の３’末端の５ヌクレオチドよりも上流である、項目１〜３のいずれかに記載のＲＮＡ１分子。
（項目５） 前記異種挿入が、タンパク質コード領域を含む、項目１〜４のいずれかに記載のＲＮＡ１分子。
（項目６） 前記異種挿入が前記タンパク質コード領域の上流にＩＲＥＳを含む、項目５に記載のＲＮＡ１分子。
（項目７） 前記ＲＮＡ１がタンパク質配列と特異的に相互作用し得る配列を含む、項目１〜６のいずれかに記載のＲＮＡ１分子。
（項目８） 前記タンパク質配列と特異的に相互作用し得る配列がＴＡＲ配列である、項目７に記載のＲＮＡ１分子。
（項目９） 前記ＴＡＲ配列が前記異種挿入内に存在する、項目８に記載のＲＮＡ１分子。
（項目１０） 項目１〜９のいずれかに記載のＲＮＡ１分子を含む、ＶＬＰ。
（項目１１） 前記ＶＬＰがパピローマウイルスＶＬＰである、項目１０に記載のＶＬＰ。
（項目１２） 前記ＶＬＰ Ｌ１タンパク質がｔａｔ配列を含み、キャプシドに包まれたＲＮＡ１分子が項目６〜８のいずれか１項に記載のＲＮＡ１分子である、項目１１に記載のＶＬＰ。
（項目１３） ｔａｔおよびＴＡＲがＨＩＶまたはＢＩＶ由来である、項目１２に記載のＶＬＰ。
（項目１４） 項目１〜９のいずれか１項に記載のＲＮＡ１に相補的である、一本鎖核酸。
（項目１５） 項目１４に記載の核酸に相補的である、一本鎖核酸。
（項目１６） 項目１〜９のいずれか１項に記載のＲＮＡ１に相補的である配列を含む、一本鎖核酸。
（項目１７） 二本鎖核酸であって、該鎖のうちの１つが項目１４〜１６のいずれか１項に記載の一本鎖核酸である、二本鎖核酸。
（項目１８） 項目１〜９のいずれか１項に記載のＲＮＡ１を産生するためのプロセスであって、（ａ）ノダウイルスＲＮＡ１配列を含むかまたはこれをコードする核酸を得る工程；および（ｂ）該ＲＮＡ１配列内のレプリカーゼＯＲＦの下流に異種配列を挿入する工程を包含する、プロセス。
（項目１９） 項目１８に記載のプロセスであって、工程（ｂ）が、前記ＲＮＡ１配列内の前記レプリカーゼおよびＢ２ ＯＲＦの下流に異種配列を挿入する工程を包含する、プロセス。
（項目２０） 項目１０〜１３のいずれか１項に記載のＶＬＰを産生するためのプロセスであって、該プロセスは、細胞を項目１４〜１７のいずれか１項に記載の核酸でトランスフェクトする工程；細胞をＶＬＰキャプシドタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトする工程であって、該タンパク質は、必要に応じて改変されて改変ＲＮＡ１に特異的なモチーフを含む、工程；ならびにＶＬＰを該細胞から精製する工程を包含する、プロセス。
（項目２１） 目的の核酸配列を細胞に送達するためのプロセスであって、該プロセスは、項目１０〜１３のいずれか１項に記載のＶＬＰを該細胞に導入する工程を包含し、該目的の核酸配列は、該ＶＬＰ中に含まれる改変ＲＮＡ１分子である、プロセス。
（項目２２） 医薬としての使用のための、項目１〜９のいずれか１項に記載のＲＮＡ１。
（項目２３） 医薬としての使用のための、項目１０〜１３のいずれか１項に記載のＶＬＰ。
（項目２４） 項目１０〜１３のいずれか１項に記載のＶＬＰを前記細胞に導入する工程を包含する、核酸配列を細胞に送達するためのプロセス。
（項目２５） インビトロで実行される、項目２３に記載のプロセス。
（項目２６） インビボで実行される、項目２３に記載のプロセス。
（項目２７） ＶＬＰ内に核酸をパッケージングするための、ｔａｔ／ＴＡＲ相互作用の使用。
（項目２８） ノダウイルス由来のＲＮＡ１配列を含むＲＮＡであって、該ＲＮＡ１配列がそのレプリカーゼＯＲＦの下流に異種挿入を含むという点で特徴的である、ＲＮＡ。
（項目２９） 前記異種挿入がＢ２ ＯＲＦの下流である、項目２８に記載のＲＮＡ。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１−１】図１は、ＦＨＶ ＲＮＡ１由来のｃＤＮＡを示す。レプリカーゼ（４０）、Ｂ１（２７２８）、およびＢ２（２７３８）の開始コドンは、四角で囲まれている。（ａ）レプリカーゼ／Ｂ１および（ｂ）Ｂ２のリーディングフレームは、両方とも完全なゲノムで示される。Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＲａｐＡｐｅｐフラグメントの開始は、下線である。
【図１−２】図１は、ＦＨＶ ＲＮＡ１由来のｃＤＮＡを示す。レプリカーゼ（４０）、Ｂ１（２７２８）、およびＢ２（２７３８）の開始コドンは、四角で囲まれている。（ａ）レプリカーゼ／Ｂ１および（ｂ）Ｂ２のリーディングフレームは、両方とも完全なゲノムで示される。Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＲａｐＡｐｅｐフラグメントの開始は、下線である。
【図１−３】図１は、ＦＨＶ ＲＮＡ１由来のｃＤＮＡを示す。レプリカーゼ（４０）、Ｂ１（２７２８）、およびＢ２（２７３８）の開始コドンは、四角で囲まれている。（ａ）レプリカーゼ／Ｂ１および（ｂ）Ｂ２のリーディングフレームは、両方とも完全なゲノムで示される。Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＲａｐＡｐｅｐフラグメントの開始は、下線である。
【図１−４】図１は、ＦＨＶ ＲＮＡ１由来のｃＤＮＡを示す。レプリカーゼ（４０）、Ｂ１（２７２８）、およびＢ２（２７３８）の開始コドンは、四角で囲まれている。（ａ）レプリカーゼ／Ｂ１および（ｂ）Ｂ２のリーディングフレームは、両方とも完全なゲノムで示される。Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＲａｐＡｐｅｐフラグメントの開始は、下線である。
【図１−５】図１は、ＦＨＶ ＲＮＡ１由来のｃＤＮＡを示す。レプリカーゼ（４０）、Ｂ１（２７２８）、およびＢ２（２７３８）の開始コドンは、四角で囲まれている。（ａ）レプリカーゼ／Ｂ１および（ｂ）Ｂ２のリーディングフレームは、両方とも完全なゲノムで示される。Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＲａｐＡｐｅｐフラグメントの開始は、下線である。
【図１−６】図１は、ＦＨＶ ＲＮＡ１由来のｃＤＮＡを示す。レプリカーゼ（４０）、Ｂ１（２７２８）、およびＢ２（２７３８）の開始コドンは、四角で囲まれている。（ａ）レプリカーゼ／Ｂ１および（ｂ）Ｂ２のリーディングフレームは、両方とも完全なゲノムで示される。Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＲａｐＡｐｅｐフラグメントの開始は、下線である。
【図２】図２は、ｐＦＨＶ［１，０］プラスミドの概略図である。ＨＤＶリボザイムは斜線であり、そして転写終結因子は黒塗りである。
【図３】図３は、ｐＦＨＶ［１，０］のＲＮＡ１領域での制限部位を示す。
【図４】図４は、ＲＮＡ１におけるＢｓｓＨＩＩ部位の除去を示す。
【図５】図５は、ｐＦＨＶ−ＢｓｓｈＩＩΔを示す。
【図６−１】図６は、ｐＦＨＶ−ＭｕｔΔの構築を示す。
【図６−２】図６は、ｐＦＨＶ−ＭｕｔΔの構築を示す。
【図７−１】図７は、ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／ＳｐｅＩの構築を示す。
【図７−２】図７は、ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／ＳｐｅＩの構築を示す。
【図８】図８は、ｐＢＳ２４．１−６Ｌ１を示す。
【図９】図９は、ｐＳＬ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔを示す。
【図１０】図１０は、ｐＥＧＦＰ−１／ＴＡＲの構築を示す。
【図１１】図１１は、ｐＦＨＶ−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲを示す。ＴＡＲは水平のダッシュで示され、そしてＧＦＰコード領域はドットで示される。
【図１２】図１２は、ｐＦＨＶ−ＥＧＦＰ−１−ＴＡＲΔを示す。
【図１３】図１３は、ｐＦＨＶ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１の構築を示す。ＩＲＥＳは、垂直のダッシュで示される。
【図１４】図１４は、ｐＦＨＶ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１−ｂ−ＴＡＲの構築を示す。
【図１５】図１５は、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲΔ（１９．６ｋｂ）を示す。
【図１６】図１６は、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ（１８．１ｋｂ）を示す。
【図１７】図１７は、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ（−）（１８．１ｋｂ）を示す。
【図１８】図１８は、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１／ｂ−ＴＡＲ（２０．２ｋｂ）を示す。
【図１９】図１９は、図１６〜１８のベクターで形質転換された酵母由来の総ＲＮＡのノーザンブロットを示す。レーン１はネガティブコントロール（ＡＢ１１０由来の総ＲＮＡ）を示し；レーン２はＲｅｐＡ（＋）クローン５であり；レーン３はＲｅｐＡ（＋）クローン７であり；レーン４はＲｅｐＡ（−）クローン３であり；レーン５はＲｅｐＡ（−）クローン４であり；レーン６はＲｅｐＡ（＋）−ＧＦＰである。酵母ｒＲＮＡ ２６Ｓ（２２５０ｂｐ）および１８Ｓ（１６５０ｂｐ）もまた示される。
【図２０】図２０は、図１８のベクターで形質転換された酵母由来の総ＲＮＡのＥＧＦＰ−１についてのノーザンブロットを示す。レーン１は、２４時間誘導された培養物から抽出されたＲＮＡを示し；レーン２は４８時間後であり；レーン３は７２時間後であり；レーン４はネガティブコントロール（ＡＢ１１０由来の総ＲＮＡ）である。
【図２１】図２１は、レプリカーゼおよびＢ２のＨｉｓタグ化Ｅ．ｃｏｌｉ発現のための構築物を示す。
【図２２】図２２は、図２１の構築物から発現されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。２２（Ａ）のレーン１はＭＷマーカーおよび画分１４であり；レーン２〜９は画分１５〜２２であり；レーン１０はカラム流出物である。２２（Ｂ）のレーン１は細胞溶解物の可溶性画分であり；レーン２はカラム流出物であり；レーン３〜１１は画分２１〜２９であり；レーン１２はＭＷマーカーである。
【図２３】図２３は、ＲｅｐＡｐｅｐの質量分析を示す。
【図２４】図２４は、図１５のベクターで形質転換された酵母由来の総タンパク質抽出物のウェスタンブロットである。レーン１〜５は、５匹の免疫マウス由来の血清と１：５０００希釈にて免疫反応させた抽出物であり；レーン６は、免疫前の血清混合物を含むネガティブコントロールである。
【図２５】図２５は、７２時間にわたる種々の酵母株由来の総タンパク質抽出物のウェスタンブロットである。レーン１は、ネガティブコントロールであり；レーン２は、４８時間でのｐＢＤ−Ｒ１−Ｇ／ＴΔクローン５由来の総タンパク質抽出物であり；レーン３〜５は、２４、２８、および７２時間でのＲｅｐＡ（＋）−ＧＦＰ株（クローン番号７）の総タンパク質抽出物であり；レーン６〜８は、クローン番号９についての同一物を示す。
【図２６】図２６は、Ｒｅｐ（＋）−ＧＦＰ株由来の総タンパク質抽出物のウェスタンブロットである。レーン１は、ネガティブコントロール（ＡＢ１１０由来の総タンパク質抽出物）である。レーン２は、２４時間誘導された培養物由来のタンパク質を示し；レーン３は４８時間後であり；レーン４は７２時間後である。
【図２７】図２７は、ｐＢＳ−ＡＤＨ２／ＧＡＰ−６Ｌ１Δ４−Ｔａｔの構築を示す。
【図２８】図２８は、抗６Ｌ１（１：５０００）を用いた非還元状態下での、ＣｓＣｌ精製された６Ｌ１Δ４−ｔａｔタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図２９】図２９は、酵母におけるＶＬＰ中の改変ＲＮＡ１の発現およびパッケージングを示す。
【図３０】図３０は、酵母株ＲｅｐＡ（−）（レーン２は２４時間培養、レーン３は４８時間培養）、２つの異なるＲｅｐＡ（＋）株（レーン４およびレーン５は２４時間培養、レーン６およびレーン７は４８時間培養）、および株ＲｅｐＡ（＋）−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−／ｂＴａｒ（レーン８は２４時間培養、レーン９は４８時間培養）由来の総タンパク質のノーザンブロットを示す。ネガティブコントロールＲＮＡ（レーン１）およびＲＮＡ分子量マーカーもまた示される。矢印は、ＲＮＡ３に対応するシグナルの位置を示す。
【図３１】図３１は、図３０の（１）レーン３および（２）レーン６由来のＲＮＡのノーザンブロットを示す。
【図３２】図３２は、図３０に記載されるノーザンブロットを示すが、異なるプローブを用いている。矢印は、ＲＮＡ１マイナス鎖に対応するシグナルの位置を示す。
【図３３】図３３は、４８時間培養された酵母株ＲｅｐＡ（−）（レーン２）、ＲｅｐＡ（＋）（レーン３）、ＲｅｐＡ（＋）−ＥＧＦＰ／ｈＴａｒ（レーン４）、およびＲｅｐＡ（＋）−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ／ｂＴａｒ（レーン５）由来の総ＲＮＡについてのプライマー伸長実験を示す。ネガティブコントロールＲＮＡ（レーン１）およびインビトロで転写されたＲＮＡ１についてのポジティブコントロール（レーン６）もまた報告される。レーン４の文字ａ、ｂ、ｃ、およびｄは、ＲＮＡ１ ５’配列上で示されるヌクレオチドに対応するバンド（この中の３つはまた、レーン３およびレーン５においても見られる）を同定する。
【図３４】図３４は、図３３で報告された同じ総ＲＮＡを用いたＳ１マッピング実験を示す。ネガティブコントロールＲＮＡ（レーン１）およびインビトロで転写されたＲＮＡ１についてのポジティブコントロール（レーン６）を用いたＳ１反応の結果もまた報告される。
【図３５】図３５は、二倍体のＨＰＶ−６ＶＬＰ（ＲＮＡ１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ／ｈＴａｒおよびＨＰＶ−６ Ｌ１／ｈＴＡＴを同時発現する）から抽出された核酸を用いたＲＴ−ＰＣＲにより獲得された結果を示す。３５Ａは、酵母コントロールＲＮＡ（レーン１およびレーン３）およびＶＬＰ由来の核酸（レーン２およびレーン４）を示し；３５Ｂは、酵母ＲＮＡ（レーン１）、および未処理ＶＬＰ（レーン３）かまたはベンゾナーゼ処理されたＶＬＰ（レーン２）のいずれか由来の核酸を示し；３５Ｃは、内部コントロールとしてマウスＲＮＡの存在下での、酵母ＲＮＡ（レーン１）、および未処理ＶＬＰ（レーン３）かまたはＲＮＡｓｅ Ａ処理されたＶＬＰ（レーン２）のいずれか由来の核酸を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
（発明を実施するための様式）
（ＦＨＶのＲＮＡ１）
ＦＨＶゲノム由来のＲＮＡ１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて登録番号Ｘ７７１５６として与えられる。このＲＮＡ１に対応する二本鎖ｃＤＮＡ（３１０７ｂｐ）が、図１に示される。
【００３８】
このｃＤＮＡは、Ｂａｌｌ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：７２０−７２７）により記載されるプラスミドｐＦＨＶ［１，０］中に存在し、引き続く実験に用いられた。ｐＦＨＶ［１，０］はまた、以下を含む：ＲＮＡ１配列から上流の１８ｂｐのＴ７プロモーター（このプロモーターとＲＮＡ１ ５’末端との間に単一のＧが存在する）；ＲＮＡ１配列の下流に位置するデルタ肝炎ウイルスリボザイム（８９ｂｐ）（その結果、リボザイムの開裂は、ＲＮＡ１のネイティブな３’末端を生じる）；およびリボザイム活性を補助すると考えられる１３６ｂｐのＴ７転写終結因子。これは、図２に示される。
【００３９】
（クローニング目的のためのＲＮＡ１の改変）
クローニングを容易にするために、ＲＮＡ１に対して種々の変更がなされた。
【００４０】
（ＢｓｓＨＩＩ部位の除去）図３に示されるように、ネイティブのＲＮＡ１配列は、２つの近接するＢｓｓＨＩＩ制限部位（ヌクレオチド１２７０および１２７８）を含む。これらの中の１つを、レプリカーゼアミノ酸配列に影響を与えない静的な変異を導入することにより除去した。
【００４１】
ＲＮＡ１のＳｐｈＩ／ＢｓｓｈＩＩフラグメントを、プライマーＲＩ９００−ｆおよびＲＩ１２７２Ｍ−ｒ（表Ｉ）を用いて生成されたＰＣＲフラグメントにより置換した。第１のプライマーは、クローニングに必要なＳｐｈＩ部位を含んだ。一方、逆方向プライマーの配列は、１２７１位におけるＧからＡへの置換を含み、それによって、レプリカーゼＯＲＦを変更することなく、２つのＢｓｓＨＩＩ制限部位の１つを除去した（図４）。得られたプラスミドをｐＦＨＶ−ＢｓｓｈＩＩΔを呼んだ（図５）。
【００４２】
（付加的な部位の導入）異種配列をＲＮＡ１に挿入するために、以下の２つの付加的な制限部位を導入した：３０６２位にＳａｃＩＩ部位、３０７２位にＮｏｔＩ部位（レプリカーゼおよびＢ２ ＯＲＦの翻訳終止コドンから下流）。さらに、唯一のＳａｌＩ部位を、ｐＦＨＶ［０，１］のＴ７転写終結因子よりも下流（ヌクレオチド３３３７）に挿入した。これらの部位を、以下のようにＰＣＲ増幅により導入した（図６）：
−プライマーＡｐａＩ−ｆおよびＤＲＳ−ｒ（表Ｉ）は、ＡｐａＩ部位（２３４９位）と３１０１位との間のＲＮＡ１のフラグメントを増幅した。ＳａｃＩＩおよびＮｏｔＩ制限部位の導入を、ＤＲＳ−ｒプライマー中に２つの配列を導入することにより達成した（図６ａ）。
−プライマーＤＲＳ−ｆ（ＤＲＳ−ｒの相補鎖）およびＲＩ−ＫｐｎＩ−ｒは、ヌクレオチド３０３９からＫｐｎＩ部位（３３６８位）までの領域にわたるフラグメントを増幅した（図６ａ）。
【００４３】
２つのＤＮＡフラグメントの融合物を、等量の２つの増幅産物を変性および混合することにより獲得した。これらは、２つのＰＣＲフラグメント中に存在する６２ｂｐの相補的領域によりアニールした。ｄＮＴＰのみの存在下でのＴａｑポリメラーゼを用いた伸長サイクルおよびＴａｑならびにプライマーＡｐａＩ−ｆおよびＲＩ−ＫｐｎＩ−ｒの存在下での増幅サイクルの後、平滑末端のＤＮＡ融合フラグメントを獲得し（図６ｂ）、次いで、このフラグメントをｐＣＲ２．１ベクターにクローン化してＤＮＡ配列を調べた。ＡｐａＩ−ＫｐｎＩフラグメントをｐＣＲ２．１から切り取り、ｐＦＨＶ［１，０］およびｐＦＨＶ−ＢｓｓｈＩＩΔの異種フラグメントを置換するために用いて、ｐＦＨＶ−Ｍｕｔ（示されていない）と名付けられたプラスミドおよびｐＦＨＶ−ＭｕｔΔ（図６ｃ）と名付けられたプラスミドを獲得した。これらのプラスミドは、唯一のＢｓｓｈＩＩ部位および新規のＳａｃＩＩ、ＮｏｔＩ、およびＳａｌＩ制限部位を有するＲＮＡ１ ｃＤＮＡ全体を含んだ。
【００４４】
（酵母ベクターへのＲＮＡ１のクローニング）
酵母においてＲＮＡ１（およびその改変バージョン）を発現させるために、ｃＤＮＡを酵母ベクターの、酵母特異的プロモーターの下流にクローン化した。このベクターは、レプリカーゼをコードし、そして（リボザイム開裂後に）自己複製に適合する５’および３’末端を有するＲＮＡ１分子の転写を指向する。全体的なアプローチは、図７に示される。
【００４５】
（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋におけるＡＤＨ２／ＧＡＰのクローニング）発現に用いられたプロモーターは、ＡＤＨ２／ＧＡＰプロモーターであった。このプロモーターの供給源として、酵母発現ベクターｐＢＳ２４．１−６Ｌ１（図８；ＷＯ００／０９６９９もまた参照のこと）を用いた。ＤＮＡフラグメントＡＤＨ２／ＧＡＰ−６Ｌ１を、ＳａｃＩおよびＳａｌＩによる消化により、プラスミドｐＢＳ２４．１−６Ｌ１から抽出し、そして同一の酵素で消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローン化した。得られた構築物を、ｐＳＫ＋−ＡＤＨ−６Ｌ１と名付けた。
【００４６】
（酵母ＡＤＨ２／ＧＡＰプロモーターのＰＣＲ増幅）酵母プロモーターの一部を、ＳａｃＩ部位において酵母プロモーターにアニールするプライマーＡＤＨ／Ｓａｃ（表Ｉ）、および付加的にＲＮＡ１由来の１３ヌクレオチドを含む６Ｌ１遺伝子との融合物においてプロモーターにアニールする逆方向プライマーＰ−Ｒ１ｒｅｖを用いてｐＳＫ＋−ＡＤＨ−６Ｌ１上で実施したＰＣＲにより増幅した（図７ａ）。
【００４７】
（ＲＮＡ１／ＳｐｈのＰＣＲ増幅）ｐＦＨＶ［１，０］由来のＲＮＡ ｃＤＮＡの一部を、ＲＮＡ１の５’末端（＋１位置）でアニールするプライマーＲＮＡ１−ｆ、およびヌクレオチド１０２１の唯一のＳｐｈＩ制限部位でアニールする逆方向プライマーＲＮＡ１−ｒを用いて増幅した（図７ｂ）。
【００４８】
（ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／Ｓｐｈ融合物）この融合物を、図７ａおよびｂの等量の２つの増幅産物を変性および混合し、これによって両方のＰＣＲフラグメントにおいて存在する１３ｂｐの相補的領域のアニーリングを助けることにより獲得した（図７ｃ）。ｄＮＴＰのみの存在下でのＴａｑを用いた伸長サイクルおよびＴａｑ、ならびに、プライマーＡＤＨ／ＳＡＣおよびＲＮＡ１−ｒの存在下での増幅サイクルの後、融合平滑末端のＤＮＡフラグメントを獲得した。
【００４９】
（ｐＣＲ２．１におけるＡＤＨ２−ＲＮＡ１／Ｓｐｈのクローニング）この平滑末端のＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化し、プラスミドｐＣＲ−ＡＤＨ２／ＲＮＡ１を得た（図７ｄ）。そのＤＮＡ配列を調べて、そして期待されるプロモーター／ＲＮＡ１融合配列ＴＡＡＡＴＣＴＡ／ＧＴＴＴＣＧＡＡＡを確認したが、いくつかの変異が、増幅産物の他の領域に存在した。しかし、正確な増幅配列を有する唯一のクローンが、さらなる工程に必要なＳｐｈＩ部位を除去された変異を有した（図７ｄ）。
【００５０】
（ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−６Ｌ１におけるＡＤＨ２／ＲＮＡ１融合産物のクローニング）この問題を克服するために、この融合産物をＳａｃＩ−ＳｐｅフラグメントとしてｐＣＲ２．１から切り取り、同一の制限酵素で消化されたｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−６Ｌ１中にクローン化し（図７ｅ）、それによって最終産物ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／ＳｐｅＩを獲得した（図７ｆ）。
【００５１】
（酵母ベクターへの改変ＲＮＡ１の導入）ｐＦＨＶ−ＢｓｓｈＩＩΔ（図５）由来のＥａｇＩ−ＫｐｎＩフラグメントを、ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／ＳｐｅＩ（図７ｆ）の対応するフラグメントと置き換えて挿入し、ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＢｓｓｈＩＩΔと名付けられた構築物を作製した。この構築物におけるＢｓｓｈＩＩ−ＫｐｎＩフラグメントを、ｐＦＨＶ−ＭｕｔΔ（図６ｃ）由来の対応するフラグメントで置換し、ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔと名付けられたプラスミドを生成した（図９）。
【００５２】
（異種配列の挿入）
異種挿入をＲＮＡ１配列の内部に作製した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するための遺伝子（Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２−８０６）を、ＨＩＶ由来のＴＡＲ配列と共に、レプリカーゼおよびＢ２のオープンリーディングフレームの下流に挿入した。
【００５３】
異種挿入物を作製するために、開始点は、ＢｓｒｇＩおよびＮｏｔＩで消化されたプラスミドｐＥＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であった。ＢｓｒｇＩ（５’）およびＮｏｔＩ（３’）粘着末端を有し、かつ、ＨＩＶ−１ ＴＡＲ配列（ＨＩＶ−１ゲノムのヌクレオチド４５４〜５２０、登録番号Ｋ０３４５５）を含むｄｓＤＮＡ配列を、２つの相補的なオリゴヌクレオチド（ＴＡＲ−ｆおよびＴＡＲ−ｒ）をアニールさせることにより獲得し、そしてこれを消化されたｐＥＧＦＰ−１中に挿入して、ｐＥＧＦＰ−１／ＴＡＲ（図１０）を形成した。ＴＡＲオリゴはＥＧＦＰ ＯＲＦを保持し、そしてこれはまた、ＢｓｒｇＩ部位からすぐ下流（その直後に新規ＢｓｔＥＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位が続く）に翻訳終止コドンを含んだ。ＴＡＲ配列はまた、首尾よくレプリカーゼＯＲＦの上流に挿入された。
【００５４】
ＨＩＶ−１ ＴＡＲ配列の前にＧＦＰコード配列を含む、ｐＥＧＦＰ−１／ＴＡＲ由来のＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを同一の制限酵素で消化したｐＦＨＶ−Ｍｕｔにクローン化し、ｐＦＨＶ−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲと名付けられたプラスミドを獲得した（図１１）。このプラスミドのＳｐｈＩ／ＳａｃＩＩフラグメントを、ｐＦＨＶ−ＭｕｔΔ由来の対応するフラグメントで置換し（図６ｃ）、唯一のＢｓｓｈＩＩ制限部位を有するｐＦＨＶ−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲΔ（図１２）を生成した。
【００５５】
（異種挿入物の発現の促進）
ポリシストロン性ＲＮＡは、目的の２つの遺伝子間への内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の挿入によって哺乳動物において翻訳され得（Ｐａｒｋｓら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６０：３７６−３８４）、これによって、第２の（下流）遺伝子のｃａｐ非依存性翻訳を可能にする。従って、異種挿入からの発現を促進するために、脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳを、ＥＧＦＰ−１遺伝子の前に挿入した。このＩＲＥＳは、代表的に、哺乳動物細胞においてのみＥＧＦＰタンパク質の翻訳を提供する。なぜなら、ＩＲＥＳ媒介翻訳は、酵母において選択的に阻害されるからである。（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎら（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：５６２−５７２）。
【００５６】
プラスミドｐＣＭＶ−ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ−１（図１３）を、ＥｃｏＲＩで消化し、ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いてこの部位を平滑末端にし、この酵素の不活化後、ＮｏｔＩを用いて消化して、ＥＧＦＰ−１遺伝子に融合したＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含む５’平滑化−３’ＮｏｔＩフラグメントを作製した。同様に、プラスミドｐＦＨＶ−ＭｕｔΔ（図６ｃ）を、ＳａｃＩＩで消化し、ｋｌｅｎｏｗ酵素で処理し、次いで、ＮｏｔＩを用いて消化した。ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１フラグメントを、消化したこのプラスミドにクローン化し、ｐＦＨＶ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１（図１３）を得た。
【００５７】
この構築物から発現されるＲＮＡのパッケージングを補助するために、ＢＩＶ由来のＴＡＲ（ヌクレオチド５〜３０のＢＩＶゲノム、登録Ｍ３２６９０）を、ＥＧＦＰ遺伝子の下流に挿入した。ＴＡＲ配列を、ＮｏｔＩ適合性の粘着末端を有する２つの相補オリゴヌクレオチド（ｂ−ＴＡＲ−ｆおよびｂ−ＴＡＲ−ｒ）をアニーリングすることによって構築した。これはまた、２つの新規な制限部位（ＢｓｔＥＩＩ（５’ＮｏｔＩ部位の隣）およびＸｈｏＩ（３’ＮｏｔＩ部位の隣）を導入した。二本鎖ＮｏｔＩフラグメントを、ＮｏｔＩ消化したｐＦＨＶ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１にクローン化し、ｐＦＨＶ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１／ｂ−ＴＡＲ（図１４）を得た。ＮｏｔＩフラグメントの正確な向きを、確認した。
【００５８】
（酵母発現ベクターへのクローニング）
４つの酵母発現プラスミドを、以下の基本的な５’から３’の配置を用いて構築した：酵母特異的プロモーター；改変ＲＮＡ１；ＨＤＶリボザイム；Ｔ７ターミネーター；酵母ポリＡ部位。
【００５９】
最初に、ＳａｃＩ−ＢｓｓｈＩＩフラグメントのｐＢＳ２４．１−６Ｌ１（図８）を、ｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／ＢｓｓｈＩＩΔ由来の対応するフラグメントと置換し、プラスミド ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／ＢｓｓｈＩＩΔ−６Ｌ１を得、ここで、ＲＮＡ１ ｃＤＮＡの一部は、Ｌ１遺伝子配列の３’末端に融合されていた（示さず）。これを、以下のように操作した：
１．ＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩ Ｌ１フラグメントを、ｐＦＨＶ−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲΔ由来のＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩフラグメントと置換して、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲΔ（図１５）を得た。
２．ＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩ Ｌ１フラグメントを、ｐＦＨＶ−ＭｕｔΔ由来のＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩフラグメントと置換して、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ（図１６）を得た。
３．ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ中の特有のＢｓｓｈＩＩ部位（１２７３）を充填し（レプリカーゼＯＲＦの妨害を伴う）、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ（−）（図１７）を作製した。
４．ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ中のＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩフラグメント（改変ＲＮＡ１ ｃＤＮＡ配列の一部を含む）の、ｐＦＨＶ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１／ｂ−ＴＡＲ由来の対応するＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩフラグメント（ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１／ｂ−ＴＡＲを含む）での置換によって、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１／ｂ−ＴＡＲ（図１８）という名のプラスミドを作製した。
【００６０】
（酵母の形質転換）
プラスミドｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲΔ、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＭｕｔΔ（−）およびｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１／ｂ−ＴＡＲ（図１５〜１８）を、実験室において以前に得たＨＰＶ−１６ Ｌ２タンパク質を発現するＡＢ１１０菌株（ＷＯ００／０９６９９）に形質転換することによって導入した。生じた菌株を、それぞれ、ｐＢＳ−ＲＩ−Ｇ／ＴΔ（選択したクローン４および５）、ｐＢＳ−ＲＩ−ＭｕｔΔ（選択したクローン１および３）、ｐＢＳ−ＲＩ−ＭｕｔΔ（−）（選択したクローン５および７）およびｐＢＳ−ＲＩ−ＩＲＥＳ−Ｇ／ｂ−ＴＡＲ（選択したクローン５および９）と命名した。
【００６１】
（自己複製の確認）
（ＲＮＡ複製の確認）総ＲＮＡを、菌株ｐＢＳ−ＲＩ−ＭｕｔΔ、ｐＢＳ−ＲＩ−ＭｕｔΔ（−）およびｐＢＳ−ＲＩ−ＩＲＥＳ−Ｇ／ｂ−ＴＡＲから抽出して、それぞれ、ＲｅｐＡ（＋）、ＲｅｐＡ（−）およびＲｅｐＡ（＋）−ＧＦＰと標識した。これらのＲＮＡを、ｃ−と標識したＡＢ１１０菌株由来のネガティブコントロールＲＮＡと一緒に、プライマーＡｐａＩ−ｆおよびｒｅｐＡ−Ｒｅｖを用いてｐＦＨＶ［１，０］に対して実行したＰＣＲによって得た非放射性ＤＮＡプローブ（ＢｒｉｇｈＳｔａｒ Ｐｓｏｒａｌｅｎ−Ｂｉｏｔｉｎ標識キット，Ａｍｂｉｏｎ）（６００ｂｐ）を用いて、ノーザンブロットによって分析した。
【００６２】
図１９は、結果を示し、高いハイブリダイゼーションシグナルは、レプリカーゼＯＲＦを発現するように設計された酵母クローンから抽出されたＲＮＡでのみ（ＲＮＡ１配列が挿入を有さない場合（レーン２および３）およびＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ／ｂＴＡＲ配列がレプリカーゼおよびＢ２ ＯＲＦの下流に導入されるされる場合（レーン６）の両方において）検出されることを示す。かなり弱いシグナルが、レプリカーゼＯＲＦが妨害されたプラスミドを用いて形質転換された酵母クローン由来のＲＮＡ（レーン４および５）を用いて検出され、一方、ネガティブコントロールＲＮＡを用いてシグナルは、検出されない。
【００６３】
これらの結果は、レプリカーゼが、異種挿入物（外来遺伝子）が野生型ＲＮＡ１配列に導入されたとしても、ＲＮＡ１の自己複製を維持し得ることを確認する。
【００６４】
自己複製する改変ＲＮＡ１がＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ／ｂ−ＴＡＲ配列を含んでいたことを確認するために、ノーザンブロットを、全ＥＧＦＰ領域の非放射性ＤＮＡプローブを用いて実行した。この実験によって、２４、４８、および７２時間における組換えＲＮＡ１の発現を確認した（図２０）。
【００６５】
（タンパク質発現の確認）ＲＮＡレベルでの自己複製の確認と同様に、タンパク質発現をまた、抗レプリカーゼ抗体を用いてアッセイした。
【００６６】
抗レプリカーゼ抗体を得るために、レプリカーゼのＣ末端部分（ＲｅｐＡｐｅｐと称されるＤＶＷＥＫ．．．ＳＮＮＲＫ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた。このタンパク質は、完全Ｂ１タンパク質を含み、従って有利に、抗ＲｅｐＡｐｅｐ抗体が、Ｂ１発現ならびにレプリカーゼを検出するはずである。同じ領域をまた、＋１フレームシフトさせて発現させ、細菌で発現されるＢ２タンパク質を得た。Ｂ１およびＢ２タンパク質の検出によって、自己複製を確認した。
【００６７】
レプリカーゼＯＲＦのＲｅｐＡｐｅｐ部分を、ＮｈｅＩ（５’）およびＸｈｏＩ（３’）制限部位を含むプライマーＲｅｐＡ−ｄｉｒおよびＲｅｐＡ−ｒｅｖを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ平滑末端産物を、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、そして異なるクローン由来の挿入物の配列を、確認した。ＮｈｅＩ（５’）−ＸｈｏＩ（３’）フラグメントを、２つの制限酵素を用いた消化によって正確なクローンのうちの１つから抽出し、そしてｐＴｒｃ−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、ＯＲＦを含むｐＴｒｃ−ＲｅｐＡｐｅｐ−Ｈｉｓ６と命名されたプラスミド（ここで、ＲｅｐＡｐｅｐはヘキサヒスチジンタグとインフレームであった）（図２１ａ）を作製した。
【００６８】
全Ｂ２ ＯＲＦを、同じＮｈｅＩ部位およびＸｈｏＩ部位を含むプライマーであるＢ２−ｄｉｒおよびＢ２−ｒｅｖを用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、２つの酵素を用いて消化し、ｐＴｒｃ−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接クローン化し、ＯＲＦを含むｐＴｒｃ−Ｂ２−Ｈｉｓ６と命名されたプラスミド（ここで、Ｂ２は、ヘキサヒスチジンタグとインフレームであった）（図２１ｂ）を作製した。
【００６９】
２つの組換えタンパク質のいずれかを発現する細菌クローン由来の総可溶性タンパク質の抽出物を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）を用いてＩＭＡＣに供し、ＲｅｐＡｐｅｐおよびＢ２タンパク質が富化された画分を、収集した（図２２）。ＲｅｐＡｐｅｐタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて予期せぬ移動プロフィールを示し、そして精製したタンパク質を、質量分析法に供し（図２３）、これによって予期した１５〜１６ｋＤａのＭＷを確認した。
【００７０】
富化されたタンパク質を含む分画をプールし、ＰＢＳに対して透析し、そしてタンパク質含量を、ＢＣＡ試験（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。このタンパク質を、５匹のマウスの群を、３回（ｒｅｐＡｐｅｐ、５０μｇ／用量）または４回（タンパク質Ｂ２、２５μｇ／用量）のいずれかで２週間間隔で免疫するために使用した。ワクチンを、２００μｌの抗原および同じ容量のＭＦ５９を用いて腹腔内（ＩＰ）投与した。［Ｏｔｔら（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎの２７７〜２９６頁。Ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ
ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ］。免疫前血清を、免疫の前に収集し、そして血清サンプルを、各免疫後に２週間で採取した。
【００７１】
ＲｅｐＡｐｅｐを用いて免疫した５匹のマウスの血清サンプルを、酵母菌株ｐＢＳ−ＲＩ−Ｇ／ＴΔ（クローン４）から調製した総タンパク質抽出物に対して１：５０００希釈で試験し、約１１０ｋＤａのタンパク質の検出を、これらの全てにおいて観察し、これは酵母によって発現されるレプリカーゼの存在と一致した（図２４）。
【００７２】
図２４のレーン４に使用した同じ希釈の血清を、変化させた期間、誘導条件下で増殖させた異なる酵母菌株由来の総タンパク質抽出物に対するウエスタンブロット分析に使用した。この実験によって、ＲＮＡ１レプリカーゼが、改変ＲＮＡ１を発現する菌株において、２４、４８、および７２時間目に存在することを確認した（図２５）。
【００７３】
図２４のレーン４で使用した血清を、ｐＢＳ−ＲＩ−Ｇ／ＴΔを保有する酵母菌株から、２４、４８、および７２時間の誘導で調製された総タンパク質抽出物に対するウエスタンブロット分析に使用した（図２６）。タンパク質のバンド（レーン２および３）を、２０ｋＤａのＭＷマーカーと７ｋＤａのＭＷマーカーとの間で検出した。これは、ネガティブコントロール抽出物（レーン１）および誘導後７２時間で調製された抽出物（レーン４）において存在しない。これは、酵母におけるＢ１タンパク質の合成と一致し、再び、改変ＲＮＡ１の自己複製が確認された。７２時間目におけるＢ１タンパク質の非存在は、哺乳動物細胞において以前に得られたＢ１およびＢ２発現データと一致する［Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｂａｌｌ （１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７９３３−７９４２］。
【００７４】
（ＲＮＡ３発現の確認）総ＲＮＡを、２４時間および４８時間増殖させたプラスミドｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１ＭｕｔΔ（−）、ｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１ＭｕｔΔおよびｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−１／ｂ−Ｔａｒを発現する酵母菌株から抽出し、そしてそれぞれ、ＲｅｐＡ（−）、ＲｅｐＡ（＋）およびＲｅｐＡ（＋）ＩＧＦＰ／ｂ−Ｔａｒと標識した。これらのＲＮＡを、図１９のような非放射性二本鎖ＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット分析によって分析した。図３０は、フィルムを過剰に露光することによって、移動するＲＮＡ種に対応する弱いシグナルが明らかになることを示し、これは、ＲＮＡ３が菌株ＲｅｐＡ（＋）の２４時間および４８時間（レーン４〜７）の両方で検出されることを予想する。ノーザンブロットを、レーン６由来のＲＮＡを用いて長期間アガロースゲル上で実行し、そのフィルターを、ＲＮＡ３が存在した領域のみを含むように、ハイブリダイゼーション前に切断した（図３１）。これによって、ＲＮＡ３の存在を確認する。菌株ＲｅｐＡ（＋）ＩＧＦＰ／ｂ−Ｔａｒ由来のＲＮＡの場合（図３０、レーン８および９）、挿入に起因してよりゆっくりと移動する対応するＲＮＡ３は、おそらく、強いＲＮＡ１ハイブリダイゼーションシグナルによってマスクされ、観察され得なかった。
【００７５】
（ＲＮＡマイナス鎖の確認）２４時間および４８時間増殖させた菌株ＲｅｐＡ（−）、ＲｅｐＡ（＋）およびＲｅｐＡ（＋）ＩＧＦＰ／ｂ−Ｔａｒから抽出したＲＮＡを、鎖特異的非放射性プローブ（ＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ Ｐｓｏｒａｌｅｎ−Ｂｉｏｔｉｎ標識キット、Ａｍｂｉｏｎ）を用いたノーザンブロットによって分析し、ＲＮＡマイナス鎖を検出した。鎖特異的プローブは、ＳａｃＩＩで直鎖にされたプラスミドｐＦＨＶ−ＭｕｔΔを用いることによって得たインビトロ転写物であった。図３２は、予期したサイズのＲＮＡに対応する強いハイブリダイゼーションシグナルが、レプリカーゼタンパク質を発現するクローンにおいてのみ（ＲＮＡ１配列が挿入を有さない場合（レーン４および５）およびＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ／ｂ−Ｔａｒ配列がＢ２ ＯＲＦの下流に導入されている場合（レーン６および７）の両方において）検出されることを示す。コントロールＲＮＡ（レーン１）およびレプリカーゼＯＲＦが妨害されている場合（レーン２および３）、シグナルは検出されない。
【００７６】
（ＲＮＡ１のプライマー伸長およびＳ１マッピング分析）標準的なプライマー伸長分析を、菌株ＲｅｐＡ（−）、ＲｅｐＡ（＋）およびＲｅｐＡ（＋）ＩＧＦＰ／ｂ−Ｔａｒ由来の総ＲＮＡに対してＡＭＶ逆転写酵素およびＴ４キナーゼ標識したオリゴヌクレオチドＲｌ−１２０を用いて実行した。
【００７７】
同じプライマーを用いてプラスミドｐＳＫ＋−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１／ＳｐｅＩ（図７ｆ）に対して実行したコントロール配列と共に、伸長産物を８％変性ポリアクリルアミド／尿素ゲル上で泳動した。図３３は、より短い伸長産物が検出され得ることを示す。
【００７８】
Ｓ１マッピング分析を、同じＲＮＡを用いて実行した。プローブは、オリゴＡＺ１５−ｆｏｒ（プラスミド中のｎｔ ６２８５）およびＲ１−１２０を用いてプラスミドｐＳＶ４０−ＦＨＶ［０，０］から得た二本鎖ＰＣＲフラグメントであった。このＰＣＲフラグメントを、Ｔ４キナーゼを用いて標識し、ＮｃｏＩを用いて消化し、検出されるｍＲＮＡの同じ極性を有する鎖から放射性標識を、取り除き、そしてゲル精製した。放射性プローブのアリコートを、総ＲＮＡにハイブリダイズさせ、そしてＳ１ヌクレアーゼを用いた消化を、標準的な条件下で実行した。コントロールとして、ｐＦＨＶ［１，０］由来のＴ７でインビトロ転写されたＲＮＡ１をまた、このプローブに対してハイブリダイズさせ、そしてＳ１消化した。Ｓ１処理された産物を、プライマーＲ１−９０ｒｅｖを用いて獲得しかつＲＮＡ１に相補的であるＤＮＡ配列と共に、８％変性ポリアクリルアミド／尿素ゲル上で泳動した。
【００７９】
図３４に示されるように、全長ＲＮＡに対応するバンドを、ＧＦＰおよびＩＲＥＳ−ＧＦＰ挿入を有さないかまたは有するレプリカーゼＡを発現するサンプルで検出し得た（レーン３、４および５）。
【００８０】
（ＲＮＡ１の５’末端のクローニングおよび配列決定）菌株ＲｅｐＡ（＋）−ＩＧＦＰ／ｂ−Ｔａｒ由来の総ＲＮＡを使用して、ＲＮＡ１種の５’末端をクローン化した。クローニングは、Ａｍｂｉｏｎ ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅＴＭ ＲＬＭ−ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（これは、キャップされたｍＲＮＡ分子の選択的なクローニングを可能にする）を用いることによって実行した。使用したプライマーは、以下であった：
１）Ｒ１−ｒｅｖを用いた逆転写
２）キットで供給される外部ＲＮＡアダプタープライマーおよび逆方向プライマーＡＺ−９ｒｅｖ（ＲＮＡ１上のｎｔ４２６）を用いた外部ＰＣＲ
３）キットで供給される内部ＲＮＡアダプタープライマーおよびＲ１−１２０を用いた内部ＰＣＲ。
【００８１】
最終ＰＣＲ産物のクローニングを、ｐＺｅｒｏ平滑ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に実行した。１０個のクローンの配列決定によって、これら全てのクローン化された配列が、ＡＡＡＡＣＡＧ（ＲＮＡ１配列のヌクレオチド１６）で始まることが明らかになった。これは、図３３において示される産物ｃに対応する。従って、図３３のバンドｂは、ｃの分解産物を示し得、そしてバンドｂは、キャップされた形態であり得る。
【００８２】
（ＲＮＡ３の５’末端のクローニングおよび配列決定）同じ実験手順を使用することによって、ＲＮＡ３の５’領域を、同じ酵母クローンからクローン化した。使用したプライマーは以下であった：
１）ＡＺ−５ｒｅｖ（ＲＮＡ１のｎｔ ３１０１）を用いた逆転写
２）キットで供給される外部ＲＮＡアダプタープライマーおよび逆方向プライマーＡＺ−５ｒｅｖを用いた外部ＰＣＲ
３）キットで供給される内部ＲＮＡアダプタープライマーおよびＲ３−２８０９ｒｅｖ（ＲＮＡ１上のｎｔ ２８３０）を用いた内部ＰＣＲ。
【００８３】
最終ＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩ（ＲＮＡ１上のｎｔ ２８０１）およびＢａｍＨＩ（内部アダプタープライマー内）を用いて消化し、そして同じ酵素を用いて消化したｐＴＲＣ−ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。
【００８４】
ＲｅｐＡ（＋）菌株由来のＲＮＡを用いて実行したＲＴ−ＰＣＲからの１０個のクローンの配列決定によって、各場合での同じ配列（ＲＮＡ１のヌクレオチド２７２１で始まる（ＧＴＴＡＣＣＡＡ．．．））が明らかになった。これは、文献ですでに報告されたＲＮＡ３開始部位に対応する。
【００８５】
ＲｅｐＡ（＋）−ＩＧＦＰ／ｂ−Ｔａｒ菌株由来のＲＮＡを用いて実行したＲＴ−ＰＣＲからの１８個のクローンの配列決定によって、いずれもＲＮＡ３転写開始部位に対応しないが、これらの全てが、ＲＮＡ１に属する上流の配列で開始することが明らかになった。
【００８６】
（ＨＰＶ ＶＬＰにおけるパッケージング）
ＴＡＲ挿入物を保有する改変ＲＮＡ１のパッケージングを促進するために、ＨＰＶ−６のＬ１コートタンパク質を、相補的なｔａｔモチーフをそのＣ末端に含むように改変した。
【００８７】
これを達成するための酵母発現ベクターの構築は、いくつかの工程を含んだ（図２７）。最初に、プラスミドｐＢＳ２４．１−６Ｌ１（図８）を、ＢｓｓｈＩＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、このようにしてＬ１タンパク質の最後の４アミノ酸を排除した。このプラスミドは、酵母においてＨＰＶ−６ Ｌ１キャプシドタンパク質を発現する。相補的なオリゴヌクレオチド６Ｌ１Δ４および６Ｌ１Δ４ｉｎｖをアニーリングすることによって得た短いＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩ ｄｓＤＮＡを挿入し、これによって、Ｌ１ ＯＲＦを再構築し、これに翻訳終止コドンおよび新しいＮｏｔＩ制限部位を与えた。生じた酵母発現プラスミドを、ｐＢＳ２４．１−６Ｌ１Δ４と命名した。ｔａｔのＨＩＶ−１ ＴＡＲ−結合ドメイン（アミノ酸３６〜７２）のＰＣＲ増幅を、プライマーＴａｔ−ｄｉｒおよびＴａｔ−ｒｅｖを用いることによってＨＩＶ−１菌株ＩＩＩＢのｃＤＮＡを含むプラスミドに対して実行し、これはまた、５’末端にＢｓｓｈＩＩ部位を、そして３’部位にＮｏｔＩおよびＳａｌＩ部位を含んだ。生じた平滑末端のフラグメントを、ｐＣＲ２．１プラスミドにクローン化し、そして配列決定した。ＢｓｓｈＩＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＣＲ２．１から抽出し、そして同じ制限酵素を用いて消化したｐＢＳ２４．１−６Ｌ１Δ４に連結した。生じたプラスミドを、ｐＢＳ２４．１−６Ｌ１Δ４−Ｔａｔと命名した。
【００８８】
ｐＢＳ２４．１−６Ｌ１Δ４−Ｔａｔを、実験室で以前に獲得しかつＨＰＶ−６ Ｌ２タンパク質を発現するＪＳＣ３１０菌株（ＷＯ００／０９６９９）への、形質転換によって導入した。形質転換実験からの異なるクローンを、６Ｌ１Δ４−Ｔａｔ発現に関して分析し、クローン２を、更なる実験のために選択した。
【００８９】
クローン２を、誘導条件下で増殖させ、ＶＬＰの塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配精製を、ＷＯ００／０９６９９に記載されるように実行した。１．２８〜１．２９ｇ／ｃｍ３の密度に対応するＣｓＣｌ分画を、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、抗６Ｌ１抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した（図２８）。１１５ｋＤａのＭｗのタンパク質マーカーよりもゆっくりと移動したバンドの検出は、異なるＬ１／Ｔａｔ単量体間でジスルフィド結合が形成されることを示し、これは、ＨＰＶ ＶＬＰの効率的な自己アセンブリの公知の必要条件である（Ｓａｐｐら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６１８６−８９）。
【００９０】
レプリカーゼの発現、ＴＡＲ挿入物を保有する改変ＲＮＡ１の自己複製、Ｌ１−Ｔａｔの発現、および改変ＲＮＡ１のパッケージングが、図２９に示される。全ての工程は、同じ酵母細胞で起こり、目的の遺伝子を哺乳動物細胞に送達するための感染性ＶＬＰを生じる。
【００９１】
プラスミドｐＢＳ２４．１−６Ｌ１Δ４−Ｔａｔを含む酵母菌株ＪＳＣ３１０（クローン２）を、プラスミドｐＢＳ−ＡＤＨ２−ＲＮＡ１−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲΔを含む菌株ＡＢ１１０と接合させ、組換えＲＮＡ１誘導体（ＧＦＰ遺伝子およびヒトＴＡＲ配列を含む）および組換えＨＰＶ６ Ｌ１／ｈＴＡＴタンパク質を同時発現する二倍体クローンを得た。接合実験からの異なるクローンを、Ｌ１およびレプリカーゼＡタンパク質発現に関して試験し、そしてＲＮＡ１−ＥＧＦＰ−１／ＴＡＲ転写レベルに関して試験した。１つの二倍体クローンを選択し、そして誘導条件下で増殖させた。ＶＬＰのＣｓＣｌ勾配精製を、ＷＯ００／０９６９９に記載されるように実行した。
【００９２】
１．２８〜１．２９ｇ／ｃｍ３の密度に対応するＣｓＣｌ分画をプールし、そしてＰＢＳに対して透析した。透析したＶＬＰを、以下の異なる手順に従って実行した異なる実験に使用し、そして図３５に報告する。
【００９３】
図３５Ａにおいて、ＶＬＰを、フェノール沈澱、フェノール−クロロホルム沈澱、クロロホルム沈澱、およびエタノール沈澱で処理し、タンパク質を欠く材料を得た。水中に懸濁した最終核酸ペレットのアリコートを、さらなる処理をいずれも行わずに、ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてこのキットの指示書に従ってＲＴ−ＰＣＲに供した。使用したプライマーは、Ｒ１−２３５ｆｏｒ（ＲＮＡ１上のｎｔ ２３５）およびＲ１−１２７２Ｍ−ｒであり、予期した１０３７ ｎｔのバンドを生じた（レーン２および４、これらは、２つの異なるＲＴ−ＰＣＲ分析で繰り返した同じサンプルである）。関連しない酵母ＲＮＡを、コントロールとして含めた。
【００９４】
図３５Ｂにおいて、プールしたＶＬＰの１００μｌのアリコートを、フェノール（ｆｅｎｏｌ）／クロロホルム抽出前に、２５単位のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて３７℃で２４時間の処理に供した。最終核酸ペレットを、前のものと同じプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲに供した。ＶＬＰを事前にＢｅｎｚｏｎａｓｅで処理した場合（レーン２）およびいずれのＢｅｎｚｏｎａｓｅ処理も行わない場合の両方において、１０３７ ｎｔのバンドを観察した。
【００９５】
図３５Ｃにおいて、プールしたＶＬＰの１００μｌのアリコートを、フェノール／クロロホルム抽出前に、１μｇ ＲＮＡｓｅ Ａを用いて３７℃で１時間の処理に供した。総マウスＲＮＡを、ＲＮＡｓｅ処理の内部コントロールとしてこのサンプルに含めた。フェノール／クロロホルム抽出後、最終核酸ペレットを、２つの異なるセットのプライマー（図３５Ａにおいて使用した２つのＲＮＡ１プライマーおよびマウスＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対応する約６００ｎｔ長のバンドを増幅する２つのプライマー）を用いてＲＴ−ＰＣＲに供した。ＶＬＰを事前にＲＮＡｓｅで処理した場合（レーン２）およびいずれのＲＮＡｓｅ処理も行わなかった場合（レーン３）の両方において、ＲＮＡ１のバンド（白い矢印）が目に見えたが、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡが未処理サンプルから増幅され得（黒い矢印）（レーン３）、これはＲＮＡｓｅ処理後はほとんど見えない。
【００９６】
本発明は例によってのみ記載され、そして本発明の範囲および精神内で維持しながら改変がなされ得ることは、理解される。
【００９７】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図１−６】
【図２】
【図４】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図２１】
【図２９】
【図３】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図１−６】
【図２】
【図４】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図２１】
【図２９】
【図３】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【公開番号】特開２０１１−１３５８９７（Ｐ２０１１−１３５８９７Ａ）
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−８６８４５（Ｐ２０１１−８６８４５）
【出願日】平成２３年４月８日（２０１１．４．８）
【分割の表示】特願２００１−５６９３９８（Ｐ２００１−５６９３９８）の分割
【原出願日】平成１３年３月２６日（２００１．３．２６）
【出願人】（５９２２４３７９３）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (107)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８６８４５（Ｐ２０１１−８６８４５）
【出願日】平成２３年４月８日（２０１１．４．８）
【分割の表示】特願２００１−５６９３９８（Ｐ２００１−５６９３９８）の分割
【原出願日】平成１３年３月２６日（２００１．３．２６）
【出願人】（５９２２４３７９３）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (107)
【Ｆターム（参考）】
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