酢酸菌の発泡に関与する遺伝子、該遺伝子を修飾して育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
【課題】酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子を同定し、該遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下ないし欠損させることによる発泡を抑制させる方法、さらに、該方法により発泡が抑制された酢酸菌を用いることによる高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率良く製造する方法、及び該製造方法により製造される食酢を提供すること。
【解決手段】酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードする遺伝子を取得し、該遺伝子を修飾して発泡に関与するタンパク質の機能を低下ないしは欠損させるよう改変することによって発泡が抑制された酢酸菌を取得した。さらに、該酢酸菌を用いたより高い酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供する。
【解決手段】酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードする遺伝子を取得し、該遺伝子を修飾して発泡に関与するタンパク質の機能を低下ないしは欠損させるよう改変することによって発泡が抑制された酢酸菌を取得した。さらに、該酢酸菌を用いたより高い酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物の培養中の発泡に関与する遺伝子に関し、さらに発泡に関与する遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下ないしは欠損させて育種された、培養中の発泡能が抑制され、より多量の酢酸を生成できる酢酸菌、該酢酸菌を用いた食酢の製造方法、及び該製造方法により製造される食酢に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を利用した食品産業や化学産業において、微生物培養の際の発泡が大きな問題となっている。微生物を培養すると、特に通気攪拌を伴う培養では、多くの場合泡の発生を伴う。この泡は培養槽上部で泡沫を形成し、培養槽の有効体積を減少させたり、培養槽上部からの泡沫の流出により、培養液のロス、培地組成の変化、微生物の漏洩などの問題を生じる。このように発泡は生産効率や品質の低下、環境問題などの問題を引き起こす。このため、効率よく微生物を培養して生産物を得る上で、発泡の抑制は重要な課題であった。同様に、食酢の製造などで用いられている酢酸菌の培養においても、発泡による生産効率の低下などが問題となっている。
【０００３】
そこで、培養中の泡を消す方法として、物理的方法や化学的方法が開発されている。物理的方法としては、攪拌羽根等で泡沫にせん断力を加えて泡沫を破壊する機械的方法や、加熱によって液体の粘度を低下させて泡沫を不安定にする熱的方法、そして、通電、スパーク、電流等によって破泡する電気的方法などがある。しかし、いずれの方法も装置の導入、使用にはコストがかかる上に、その消泡効果も不十分であった。
【０００４】
また、化学的方法としては、消泡剤を添加する方法がある。消泡剤としては、アルコール類、エステル、脂肪酸、シリコン等の化合物が使用されている。しかし、消泡剤による消泡法は簡便である一方で、消泡剤によっては、微生物の生育や物質生産に重要な酸素移動速度の低下、微生物の生育阻害、分離生成工程への悪影響などを引き起こす場合があり問題であった。
【０００５】
一方、微生物培養時の発泡のメカニズムは未解明な点が多いものの、真核生物において発泡に関わる遺伝子やタンパク質がいくつか見出されている。その１つは酵母で見つかった発泡に関与する遺伝子ａｗａ１である（例えば、非特許文献１参照）。この遺伝子は真核生物に特有のグリコシルフォスファチジルイノシトールアンカータンパク質をコードしており、該タンパク質は細胞表面の疎水性に関与していて、該タンパク質をコードする遺伝子を破壊すると発泡が抑制される。
【０００６】
また、カビやきのこ等において、ハイドロフォビンと呼ばれる疎水性、又は両親媒性のタンパク質が発見されており、このハイドロフォビンをコードする遺伝子を破壊することにより、発泡が抑制されることが開示されている（特許文献１参照）。
【０００７】
しかし、原核生物においては、培養中の発泡に関与する遺伝子やタンパク質についての知見はほとんど得られていないのが現状であった。そこで、原核生物において、物理的、化学的方法に代わる新たな消泡手法として、発泡の少ない菌株の育種が求められていた。
【０００８】
一方、近年、多くの細菌で細胞密度に依存して特定の遺伝子の転写が制御される細胞間情報伝達機構の存在が明らかになっている。この情報伝達機構はクオラムセンシングシステム（quorum sensing system）（集団密度感知制御系）とよばれ、生物発光、菌体外酵素の生産、病原性の発現、バイオフィルムの形成、抗生物質生産など、様々な機能の発現制御に関わっている。
【０００９】
例えば、ビブリオ・フィッシェリ（Vibrio fischeri）等の多くのグラム陰性細菌で見出されているクオラムセンシングシステムには２つのタンパク質が関与している（例えば、非特許文献２参照）。すなわち、細胞間の情報伝達物質であるアシルホモセリンラクトンを合成するアシルホモセリンラクトン合成酵素、アシルホモセリンラクトンの受容体であり転写因子としても機能するアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子である。
【００１０】
菌体内でアシルホモセリンラクトン合成酵素によって生産されたアシルホモセリンラクトンは、菌体内外に拡散する。そして、その濃度の増加に伴い、菌体内でアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子と複合体を形成し、遺伝子の転写を制御する。
【００１１】
本発明者はこれまでに酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する２つの遺伝子、すなわちアシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子（以下、ｏｒｆ１と称する場合もある）とアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子をコードする遺伝子（以下、ｏｒｆ２と称する場合もある）を取得しており、酢酸菌のクオラムセンシングシステムが酢酸生産能に関与していることを明らかにした（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
さらに、クオラムセンシングシステムと微生物培養中の発泡との関係は全く分かっていなかったにもかかわらず、酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子として、酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子（以下、ｏｒｆ３と称する場合もある）を取得し、該遺伝子を修飾して、該遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下ないし欠損させることにより、酢酸菌の培養中の発泡を抑制できると同時に、酢酸菌の酢酸生産能を向上させることが出来ることも明らかにした（例えば、特許文献３参照）。
【００１３】
しかし、酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子群の全容はまだ充分に解明されておらず、上記遺伝子以外にも酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子が存在する可能性があり、該遺伝子が酢酸生産能をより強力に向上させうることが期待されていた。
【００１４】
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・バイオサイエンス・アンド・バイオエンジニアリング（Journal of bioscience and bioengineering）、９７巻、１号、１４−１８ページ、２００４年
【非特許文献２】バイオサイエンスとインダストリー、６０巻、４号、２１９〜２２４頁、２００２年
【特許文献１】特表２００３−５０７０５６号公報
【特許文献２】特開２００８−２０６４１３号公報
【特許文献３】特開２００８−２２８６６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、酢酸菌の培養中の発泡に関与する新規な遺伝子を取得し、該遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下ないし欠損させることによる酢酸菌の培養中の発泡能を抑制させる方法、さらに、該方法により育種された発泡能が抑制された酢酸菌を用いることによる高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率良く製造する方法、及び該製造方法により製造される食酢を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、野生株とクオラムセンシングシステムの構成因子の１つであるアシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子ｏｒｆ１の破壊株（以下、ｏｒｆ１破壊株と称する場合もある。）について、マイクロアレイ解析により、網羅的遺伝子発現解析を行なった。その結果、野生株と比較してｏｒｆ１破壊株で転写量が減少する、すなわちクオラムセンシングシステムの制御下にあると考えられる新たな遺伝子ｇｌｙＴを見出した。
【００１７】
そして、このｇｌｙＴを修飾して、ｇｌｙＴがコードするタンパク質の機能を低下ないし欠損させることによって、発泡が顕著に抑制され、酢酸発酵能が顕著に増強された酢酸菌を取得し、この酢酸菌を使用して、高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率良く製造できることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
【００１９】
（２）以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
【００２０】
（３）以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）に示されるＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｃ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｄ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００２１】
（４）（２）又は（３）に記載のＤＮＡがコードするタンパク質の機能を低下ないしは欠損させることを特徴とする発泡能が抑制された酢酸菌の生産方法。
【００２２】
（５）（４）に記載の方法により得られる、発泡能が抑制された酢酸菌。
【００２３】
（６）グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１ΔｇｌｙＴ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０６８）である（５）記載の発泡能が抑制された酢酸菌。
【００２４】
（７）（５）又は（６）に記載の酢酸菌を、アルコールを含む培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子並びに該遺伝子がコードするタンパク質が提供される。また、該遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下ないし欠損させることにより、酢酸菌の培養中の発泡を顕著に抑制する方法が提供される。
【００２６】
さらに、本発明によれば、培養時の発泡を顕著に抑制させることによって高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率的に製造する方法が提供され、また該製造方法によって製造された高濃度の酢酸を含有する食酢が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のタンパク質としては、酢酸発酵能と発泡に関与するタンパク質である。具体的には、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質や、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質に関する。本発明において、「発泡に関与するタンパク質」とは、当該タンパク質の機能を低下ないしは欠損させることにより、酢酸菌の培養中の発泡が抑制されるタンパク質をいう。
【００２８】
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、単離した天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせて本発明のタンパク質を取得することができる。
【００２９】
化学合成により本発明のタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質をそのアミノ酸配列情報に基づいて合成することもできる。
【００３０】
また、遺伝子組換え技術により本発明のタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードするＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
【００３１】
なお、遺伝子組換え技術によって本発明のタンパク質を調製する場合に、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出を行った後、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法が用いられ、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。
【００３２】
特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。
【００３３】
さらに、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示した配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。
【００３４】
例えば、配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって、あるいは該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによって、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌、あるいはそれら以外の酢酸菌より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
【００３５】
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）などを使用して、定法に従って行うことができる。
【００３６】
さらに、上記本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させて融合タンパク質とすることもできる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のタンパク質の精製や、本発明のタンパク質の検出や、本発明のタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００３７】
本発明のタンパク質が、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質であることは、例えば、かかるタンパク質の機能を低下ないしは欠損させた酢酸菌を作製し、アルコールを含有する液体培地で好気的条件下において培養して、培養中の発泡の程度を野生株における発泡の程度と比較することにより確認することができる。本発明のタンパク質の機能を低下ないしは欠損させた酢酸菌の作製は、例えば、かかるタンパク質をコードする遺伝子の部分配列を欠失させる、又は、該遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入するなどして正常に機能するタンパク質を産生しないように修飾した遺伝子を含むＤＮＡで酢酸菌を形質転換し、染色体上の正常な遺伝子との間で相同組換えを起こさせることにより、染色体上の該遺伝子を破壊することにより行うことができる。
【００３８】
また、本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列からなるＤＮＡや、配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。
【００３９】
このように、本発明の酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたタンパク質をコードするものであってもよい。
【００４０】
このような酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質としての機能を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位の塩基を欠失、置換、挿入又は付加し、あるいは逆位として塩基配列を改変することによっても取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。さらに、一般的にタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
【００４１】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を意味する。
【００４２】
また、上記「１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列を意味する。
【００４３】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、上記のように、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤を接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。
【００４４】
遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版（Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989）やカレントプロトコールズ・イン・モレキュラーバイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)）等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００４５】
上記「配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列との相同性が８５％以上であれば特に制限されるものではなく、例えば、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上であることを意味する。
【００４６】
上記「ストリジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０％以上、好ましくは７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。
【００４７】
また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
【００４８】
ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００４９】
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列情報又は配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００５０】
例えば、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明のＤＮＡに特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明のＤＮＡを取得することができる。また、これらの酢酸菌からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
【００５１】
本発明のＤＮＡは、その塩基配列が明らかとなったので、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６７）のゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるＰＣＲ反応によって、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。なお、染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特開昭６０−９４８９号公報参照に開示された方法）により取得できる。
【００５２】
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて常法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して常法に従って行なうことができる。
【００５３】
本発明のＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されるように塩基配列を改変することによって取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
【００５４】
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
【００５５】
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１（図４）に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００５６】
また、上記配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどからなる本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の酢酸菌等から、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
【００５７】
例えば、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列、又はその一部から作製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。
【００５８】
本発明で用いる酢酸菌には特に制限はなく、例えば、アルコール酸化能を有するアセトバクター属（Acetobacter）やグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）などの細菌があげられるが、具体的には以下のものが例示される。
【００５９】
すなわち、グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）に属する酢酸菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・インターメディウス（Gluconacetobacter intermedius）、グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）などがあげられ、さらに具体的には、グルコンアセトバクター・キシリヌス ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス ＤＳＭ６１６０（Gluconacetobacter europaeus DSM6160）株、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス ＡＴＣＣ４９０３７（Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037）株、アセトバクター・アルトアセチゲネス ＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051）（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６７）株などがあげられる。
【００６０】
また、アセトバクター属（Acetobacter）に属する酢酸菌としては、例えば、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）があげられ、さらに具体的には、アセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株、アセトバクター・アセチ ＩＦＯ３２８３（Acetobacter aceti IFO3283）株などがあげられる。
【００６１】
本発明のＤＮＡが、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡであることは、例えば、かかるＤＮＡを欠損させた酢酸菌を作製し、アルコールを含有する液体培地で好気的条件下において培養して、培養中の発泡の程度を野生株における発泡の程度と比較することにより確認することができる。本発明のＤＮＡを欠損させた酢酸菌の作製は、例えば、かかるＤＮＡの部分配列を欠失させる、又は、該ＤＮＡ配列の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入するなどした修飾した遺伝子を含むＤＮＡで酢酸菌を形質転換し、染色体上の正常な遺伝子との間で相同組換えを起こさせることにより、染色体上の該遺伝子を破壊することにより行うことができる。
【００６２】
本発明の酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子（すなわち、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードする遺伝子）がコードするタンパク質の機能を低下ないしは欠損させることにより酢酸菌の培養中の発泡を抑制させる方法としては、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現や、該遺伝子がコードするタンパク質の活性が阻害を受けるような物理的条件下で、該酢酸菌を培養する方法がある。
【００６３】
また、酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子を修飾して、機能を低下ないし欠損させることも有効である。また、これらの遺伝子の発現を制御するように当該遺伝子の発現に関与する遺伝子部分に突然変異を誘導することも有効である。なお、遺伝子を修飾する方法としては、物理的処理や化学的変異剤を用いて当該遺伝子に突然変異を誘導する方法が有効であり、これらの突然変異を誘導する方法としては、従来、酢酸菌で実施されてきた方法が有効である。例えば、酢酸菌を紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の変異処理に通常用いられている変異剤によって処理し、突然変異を誘発させる方法があげられる。
【００６４】
なお、酢酸菌は自然に変異を起こしやすい細菌として知られていることから、自然界から、上記酵素の発現や機能に自然に変異をおこした遺伝子を有する酢酸菌を分離することによっても酢酸菌の培養中の発泡が抑制された酢酸菌を得ることができる。また、既にこれらの遺伝子が取得され、塩基配列も明らかとなっているので、これらの遺伝子を組換えることによって変異を導入した遺伝子を元の酢酸菌中に導入し、相同組換えなどを利用して元の酢酸菌の当該遺伝子の機能を低下ないし欠損させることも有効である。
【００６５】
例えば、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードする遺伝子の部分配列を欠失させる、又は、該遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入するなどして正常に機能する酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質を産生しないように修飾した遺伝子を含むＤＮＡで酢酸菌を形質転換し、染色体上の正常な遺伝子との間で相同組換えを起こさせることにより、染色体上の該遺伝子を破壊することなどの方法が有効である。
【００６６】
また、本発明の酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子がクオラムセンシングシステムによって制御されている場合には、同システムの機能を低下ないし欠損させることによっても酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下ないしは欠損させることができる。例えば、アシルホモセリンラクトン合成酵素遺伝子（ｏｒｆ１）及び／又はアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子遺伝子（ｏｒｆ２）を破壊することにより、アシルホモセリンラクトン合成酵素及び／又はアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子の機能が低下ないし欠損した、酢酸菌の培養中の発泡が抑制された酢酸菌を作製することができる。
【００６７】
なお、酢酸菌の形質転換は、塩化カルシュウム法（例えば、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、４９巻、２０９１頁、１９８５年参照）やエレクトロポレーション法（例えば、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）、８７巻、８１３０〜８１３４頁、１９９０年参照）等によって行うことができる。
【００６８】
このようにして、アルコール酸化能を有するアセトバクター属（Acetobacter）やグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）の酢酸菌において、上記のようにして酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質の機能を低下ないしは欠損させて正常に機能しないように改変することにより、酢酸菌の培養中の発泡を抑制させることができる。
【００６９】
本発明の酢酸菌の培養中の発泡が抑制された酢酸菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１ΔｇｌｙＴ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０６８）を挙げることができる。
【００７０】
本発明の食酢の製造方法は、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質の機能を低下ないしは欠損させて正常に機能しないようにして、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめること以外は、従来公知の方法が採用される。すなわち、酢酸菌の培養は基本的には酢酸発酵が可能な条件で行えば良く、具体的には、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行えば良い。
【００７１】
また、アルコールを含有する培地としては酢酸発酵に使用する培地であれば良く、エタノールなどのアルコール成分の他、炭素源、窒素源、無機物等を含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものを用いることができる。培地は、合成培地でも天然培地でも良い。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
【００７２】
また、培養条件は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常は２５〜３５℃の範囲であり、好ましくは３０℃とする。培地のｐＨは、通常は２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することができる。通常１〜２１日間培養することによって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。このような本発明の食酢の製造方法により、酢酸菌の培養中の発泡が抑制され、高酸度の食酢をより効率良く製造することができる。
【００７３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７４】
［クオラムセンシングシステムの制御下にある遺伝子の探索］
これまでにクオラムセンシングシステムが酢酸菌の培養中の発泡を制御していることを本発明者は明らかにしてきたが、クオラムセンシングシステムによってどのような遺伝子が制御されており、また、酢酸菌の培養中の発泡にどのような遺伝子が関与しているのかがわかっていなかった。そこで、マイクロアレイ解析によって、クオラムセンシングシステム制御下にある遺伝子を同定し、酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子の探索を行なった。
【００７５】
具体的には、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６７としてブダペスト条約に基づき寄託されているグルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051）株（以下、野生株と称する場合もある）と、クオラムセンシングシステムの構成因子の１つであるアシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子（ｏｒｆ１）の破壊株であり、同じく独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６８としてブダペスト条約に基づき寄託されているグルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１Δｏｒｆ１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051Δorf1）株（以下、ｏｒｆ１破壊株と称する場合もある）とから、ＲＮＡを抽出し、一色法のマイクロアレイ解析（例えば、ラボマニュアル ＤＮＡチップとリアルタイムＰＣＲ、講談社、２００５年参照）によって発現量を比較した。
【００７６】
まず、野生株とｏｒｆ１破壊株を、５００ｍｌ容坂口フラスコを用いて、エタノール２％、グルコース３％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．３％、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムス製）１％を含む１００ｍｌの培地にて、３０℃、１２０ｓｐｍ、振とう培養を行った。両株の対数期及び定常期初期の培養液から、ＲＮｅａｓｙ（キアゲン製）を使用して、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの品質はバイオアナライザー（アジレント製）で確認した。
【００７７】
このようにして抽出した各ＲＮＡをそれぞれ鋳型にして、逆転写酵素とランダムプライマーを用いてｃＤＮＡを合成し、末端をビオチン標識した。一方で、ゲノム上に存在する全遺伝子に対応する特異的プローブを配置したマイクロアレイを設計・作成した。続いて、常法に従い、先に合成したビオチン標識ｃＤＮＡをマイクロアレイとハイブリダイズさせ、全遺伝子の発現量を数値化した。ハイブリダイゼーションは、野生株由来サンプル、ｏｒｆ１破壊株由来のサンプル、それぞれについて実施した。発現データは、Ｒｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉ−ｃｈｉｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＭＡ）法により標準化し、各遺伝子の発現強度とした。
【００７８】
以上のマイクロアレイ解析によって得られた野生株とｏｒｆ１破壊株の各遺伝子の発現強度を比較した結果、野生株と比較してｏｒｆ１破壊株で転写量が顕著に減少する遺伝子を見出した。この遺伝子（以下、ｇｌｙＴと称する場合もある）は、配列表の配列番号１（図４）の塩基番号８４６〜３７９４に示す塩基配列を有しており、該遺伝子がコードするタンパク質は配列表の配列番号２（図５）に示すアミノ酸配列を有していた。
【００７９】
ＢＬＡＳＴ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）による相同性検索の結果、ｇｌｙＴがコードするタンパク質は、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス ＰＡＬ５（Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5）株やグルコノバクター・オキシダンス ６２１Ｈ（Gluconobacter oxydans 621H）株におけるグリコシルトランスフェラーゼと推定されているタンパク質と、それぞれ、アミノ酸レベルで４４％の相同性を示した。しかしながら、これらのタンパク質の機能についてはこれまで全く解析されておらず、培養中の発泡に関与していることは全く知られておらず、また、酢酸菌の酢酸発酵能に関与していることも知られていなかった。
【００８０】
さらに、マイクロアレイ解析の結果を確認するために、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング法（例えば、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of bacteriology）、１８０巻、２５１５〜２５２１頁、１９９８年参照）によってｇｌｙＴの転写解析を行なった。その結果、野生株と比較して、ｏｒｆ１破壊株でｇｌｙＴの転写量が顕著に減少していることを確認し、ｇｌｙＴがクオラムセンシングシステムの制御下にある遺伝子であることが確認された。
【実施例２】
【００８１】
［ｇｌｙＴ破壊株の取得］
実施例１でクオラムセンシングシステムの制御下にあることを見出したｇｌｙＴが酢酸菌の培養中の発泡に関与しているかどうかを調べるため、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051）株のｇｌｙＴの破壊株を以下の手順により作製した。
【００８２】
まず、コロニーハイブリダイゼーションにより、ｇｌｙＴの一部を含む２．３ｋｂのＤＮＡ断片（配列表の配列番号１（図４）の塩基番号１〜２２５２）を取得し、該ＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＰｓｔＩサイトに挿入したプラスミドを調製した（以下、プラスミド１と称する場合もある）。次に、大腸菌トランスポゾンＴｎ５を鋳型にして、プライマー１（配列表の配列番号３（図６）参照）及びプライマー２（配列表の配列番号４（図７）参照）を使用して、ＰＣＲ法によりカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅し、該増幅産物を制限酵素ＳｍａＩ（タカラバイオ製）で処理してＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片１と称する場合もある）を調製した。
【００８３】
ライゲーション反応により、制限酵素ＥｃｏＲＶ（タカラバイオ製）で切断したプラスミド１にＤＮＡ断片１を連結した。このようにして調製したＤＮＡで大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株を形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。選択したアンピシリン耐性の形質転換株から、常法により、ｇｌｙＴ破壊用プラスミドｐＵＣΔｇｌｙＴを回収した。
【００８４】
このようにして得たｇｌｙＴ破壊用プラスミドｐＵＣΔｇｌｙＴを用いて、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051）株をエレクトロポレーション法（例えば、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）、８７巻、８１３０〜８１３４頁、１９９０年参照）によって形質転換した。
【００８５】
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．３％ポリペプトン）で選択した。選択培地上で生育したカナマイシン耐性の形質転換株は、サザンハイブリダイゼーションによって、ｇｌｙＴ中にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたことにより、ｇｌｙＴが破壊された株であることを確認した。
【００８６】
得られた形質転換株の内の１株を、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１ΔｇｌｙＴ（Gluconacetobacter intermedius NCI1051ΔglyT）と命名し（以下、ｇｌｙＴ破壊株と称する場合もある）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）にブダペスト条約に基づき寄託した。その受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０６８、受託日は、２００８年１２月２日である。
【００８７】
さらに、ｇｌｙＴ破壊株の表現型がｇｌｙＴ遺伝子の破壊によるものであることを確認するため、ｇｌｙＴ遺伝子を含む相補用プラスミドｐＧｌｙＴをｇｌｙＴ破壊株に導入して、ｇｌｙＴ相補株を作製した。
【００８８】
まず、ｇｌｙＴ遺伝子を含むプラスミドｐＧｌｙＴを以下の通り作製した。すなわち、上記のプラスミド１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩ（タカラバイオ製）で切断して、ｇｌｙＴの５’側領域を含むＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片２と称する場合もある）を調製した。
【００８９】
次に、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051）株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、プライマー３（配列表の配列番号５（図８）参照）及びプライマー４（配列表の配列番号６（図９）参照）を使用して、ＰＣＲ法によりｇｌｙＴの３’側領域を含むＤＮＡ断片を増幅し、該増幅産物を制限酵素ＡｐａＩとＸｂａＩ（タカラバイオ製）で処理してＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片３と称する場合もある）を調製した。
【００９０】
ライゲーション反応により、制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩ（タカラバイオ製）で切断した大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＭＶ２４に、ＤＮＡ断片２とＤＮＡ断片３を連結した。このようにして調製したＤＮＡで大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株を形質転換した。形質転換株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。このようにして選択したアンピシリン耐性の形質転換株から、常法により、相補用プラスミドｐＧｌｙＴを回収した。
【００９１】
このようにして得た相補用プラスミドｐＧｌｙＴを用いて、グルコンアセトバクター・インターメディウス ΔｇｌｙＴ（Gluconacetobacter intermedius NCI1051ΔglyT）株をエレクトロポレーション法によって形質転換した。
【００９２】
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．３％ポリペプトン）で選択した。選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株から、プラスミドを抽出して、ｐＧｌｙＴが導入されていることを確認した。このようにして得られた形質転換株を、ｇｌｙＴ相補株とした。
【実施例３】
【００９３】
［ｇｌｙＴ破壊株と野生株の発泡の比較］
実施例２で得られたｇｌｙＴ破壊株について、野生株及びｇｌｙＴ相補株と培養中の発泡の様子を比較した。具体的には、５００ｍｌ容坂口フラスコを用いて、エタノール２％、グルコース３％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．３％、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムス製）１％を含む１００ｍｌの培地にて、３０℃、１２０ｓｐｍで、振とう培養を行った。
【００９４】
その結果、野生株と比較して、ｇｌｙＴ破壊株は発泡が顕著に抑制されることがわかった（図１）。また、ｇｌｙＴ相補株では発泡が野生株レベルに戻ったため（図１）、ｇｌｙＴ破壊株でみられた発泡の抑制はｇｌｙＴの破壊によるものであることが確認できた。
【００９５】
次にミニジャーファーメンターでも、ｇｌｙＴ破壊株と野生株とについて、培養中の発泡の様子を比較した。なお、培養は、３リッターのミニジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製、Ｂｉｏｎｅｅｒ３００型 ３Ｌ）を用いて、エタノール３％、グルコース３％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムス製）１％、消泡剤０．０１％を含む１．５リッターの培地にて、３０℃、５００ｒｐｍ、１リッター／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。培養中は培地中のエタノール濃度を２％に制御した。
【００９６】
ミニジャーファーメンターでの発泡の様子を図２に示した。図２から明らかなように、野生株と比較して、ｇｌｙＴ破壊株は発泡が顕著に抑制された。この結果から、ｇｌｙＴは培養中の発泡に関与しており、ｇｌｙＴを破壊することにより、培養中の発泡が顕著に抑制されることが示された。
【実施例４】
【００９７】
［ｇｌｙＴ破壊株と野生株の酢酸発酵能の比較］
実施例２で得られたｇｌｙＴ破壊株について、野生株と酢酸発酵能を比較した。具体的には、３リッターのミニジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製、Ｂｉｏｎｅｅｒ３００型 ３Ｌ）を用いて、エタノール３％、グルコース３％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．３％、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムス製）１％、消泡剤０．０１％を含む１．５リッターの培地にて、３０℃、５００ｒｐｍ、１リッター／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。培養中は培地中のエタノール濃度を２％に制御した。酢酸発酵経過を図３に、また、４８時間培養後の培養液の酢酸濃度を表１に示した。
【００９８】
【表１】
【００９９】
図３から明らかなように、野生株と比較して、ｇｌｙＴ破壊株では酢酸の生産量が顕著に増加していた。また、表１に示した通り、４８時間培養後の培養液の酢酸濃度は、野生株の２．６７±０．０７％（重量/容量）に対して、ｇｌｙＴ破壊株では５．３２±０．２３％（重量/容量）であり、ｇｌｙＴ破壊株の酢酸生産量は野生株の約２倍に増加した。以上の結果から、ｇｌｙＴが酢酸生産能にも関与しており、ｇｌｙＴを破壊することにより、培養中の発泡が顕著に抑制されるだけではなく、さらに高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率良く生産することができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明によれば、酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子ならびに該遺伝子がコードするタンパク質が提供され、さらに酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下又は欠損させることにより、培養中の発泡を顕著に減少させ、より多量の酢酸を生成することが可能な酢酸菌が提供され、該酢酸菌を用いた培養中の発泡を抑制させる方法及び酢酸発酵能を顕著に増強させる方法が提供されるので、該方法により酢酸菌を用いた高濃度の酢酸を含有する食酢のより効率的な製造を行うことができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】野生株とｇｌｙＴ破壊株を坂口フラスコで培養した際の発泡の様子を示した図である。
【図２】野生株とｇｌｙＴ破壊株をミニジャーファーメンターで培養した際の発泡の様子を示した図である。
【図３】野生株とｇｌｙＴ破壊株の酢酸発酵経過を示した図である。
【図４】ｇｌｙＴを含むＤＮＡ断片の塩基配列（配列番号１）を示した図である。
【図５】ｇｌｙＴがコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示した図である。
【図６】プライマー１の塩基配列（配列番号３）を示した図である。
【図７】プライマー２の塩基配列（配列番号４）を示した図である。
【図８】プライマー３の塩基配列（配列番号５）を示した図である。
【図９】プライマー４の塩基配列（配列番号６）を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物の培養中の発泡に関与する遺伝子に関し、さらに発泡に関与する遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下ないしは欠損させて育種された、培養中の発泡能が抑制され、より多量の酢酸を生成できる酢酸菌、該酢酸菌を用いた食酢の製造方法、及び該製造方法により製造される食酢に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を利用した食品産業や化学産業において、微生物培養の際の発泡が大きな問題となっている。微生物を培養すると、特に通気攪拌を伴う培養では、多くの場合泡の発生を伴う。この泡は培養槽上部で泡沫を形成し、培養槽の有効体積を減少させたり、培養槽上部からの泡沫の流出により、培養液のロス、培地組成の変化、微生物の漏洩などの問題を生じる。このように発泡は生産効率や品質の低下、環境問題などの問題を引き起こす。このため、効率よく微生物を培養して生産物を得る上で、発泡の抑制は重要な課題であった。同様に、食酢の製造などで用いられている酢酸菌の培養においても、発泡による生産効率の低下などが問題となっている。
【０００３】
そこで、培養中の泡を消す方法として、物理的方法や化学的方法が開発されている。物理的方法としては、攪拌羽根等で泡沫にせん断力を加えて泡沫を破壊する機械的方法や、加熱によって液体の粘度を低下させて泡沫を不安定にする熱的方法、そして、通電、スパーク、電流等によって破泡する電気的方法などがある。しかし、いずれの方法も装置の導入、使用にはコストがかかる上に、その消泡効果も不十分であった。
【０００４】
また、化学的方法としては、消泡剤を添加する方法がある。消泡剤としては、アルコール類、エステル、脂肪酸、シリコン等の化合物が使用されている。しかし、消泡剤による消泡法は簡便である一方で、消泡剤によっては、微生物の生育や物質生産に重要な酸素移動速度の低下、微生物の生育阻害、分離生成工程への悪影響などを引き起こす場合があり問題であった。
【０００５】
一方、微生物培養時の発泡のメカニズムは未解明な点が多いものの、真核生物において発泡に関わる遺伝子やタンパク質がいくつか見出されている。その１つは酵母で見つかった発泡に関与する遺伝子ａｗａ１である（例えば、非特許文献１参照）。この遺伝子は真核生物に特有のグリコシルフォスファチジルイノシトールアンカータンパク質をコードしており、該タンパク質は細胞表面の疎水性に関与していて、該タンパク質をコードする遺伝子を破壊すると発泡が抑制される。
【０００６】
また、カビやきのこ等において、ハイドロフォビンと呼ばれる疎水性、又は両親媒性のタンパク質が発見されており、このハイドロフォビンをコードする遺伝子を破壊することにより、発泡が抑制されることが開示されている（特許文献１参照）。
【０００７】
しかし、原核生物においては、培養中の発泡に関与する遺伝子やタンパク質についての知見はほとんど得られていないのが現状であった。そこで、原核生物において、物理的、化学的方法に代わる新たな消泡手法として、発泡の少ない菌株の育種が求められていた。
【０００８】
一方、近年、多くの細菌で細胞密度に依存して特定の遺伝子の転写が制御される細胞間情報伝達機構の存在が明らかになっている。この情報伝達機構はクオラムセンシングシステム（quorum sensing system）（集団密度感知制御系）とよばれ、生物発光、菌体外酵素の生産、病原性の発現、バイオフィルムの形成、抗生物質生産など、様々な機能の発現制御に関わっている。
【０００９】
例えば、ビブリオ・フィッシェリ（Vibrio fischeri）等の多くのグラム陰性細菌で見出されているクオラムセンシングシステムには２つのタンパク質が関与している（例えば、非特許文献２参照）。すなわち、細胞間の情報伝達物質であるアシルホモセリンラクトンを合成するアシルホモセリンラクトン合成酵素、アシルホモセリンラクトンの受容体であり転写因子としても機能するアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子である。
【００１０】
菌体内でアシルホモセリンラクトン合成酵素によって生産されたアシルホモセリンラクトンは、菌体内外に拡散する。そして、その濃度の増加に伴い、菌体内でアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子と複合体を形成し、遺伝子の転写を制御する。
【００１１】
本発明者はこれまでに酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する２つの遺伝子、すなわちアシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子（以下、ｏｒｆ１と称する場合もある）とアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子をコードする遺伝子（以下、ｏｒｆ２と称する場合もある）を取得しており、酢酸菌のクオラムセンシングシステムが酢酸生産能に関与していることを明らかにした（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
さらに、クオラムセンシングシステムと微生物培養中の発泡との関係は全く分かっていなかったにもかかわらず、酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子として、酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子（以下、ｏｒｆ３と称する場合もある）を取得し、該遺伝子を修飾して、該遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下ないし欠損させることにより、酢酸菌の培養中の発泡を抑制できると同時に、酢酸菌の酢酸生産能を向上させることが出来ることも明らかにした（例えば、特許文献３参照）。
【００１３】
しかし、酢酸菌のクオラムセンシングシステムに関与する遺伝子群の全容はまだ充分に解明されておらず、上記遺伝子以外にも酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子が存在する可能性があり、該遺伝子が酢酸生産能をより強力に向上させうることが期待されていた。
【００１４】
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・バイオサイエンス・アンド・バイオエンジニアリング（Journal of bioscience and bioengineering）、９７巻、１号、１４−１８ページ、２００４年
【非特許文献２】バイオサイエンスとインダストリー、６０巻、４号、２１９〜２２４頁、２００２年
【特許文献１】特表２００３−５０７０５６号公報
【特許文献２】特開２００８−２０６４１３号公報
【特許文献３】特開２００８−２２８６６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、酢酸菌の培養中の発泡に関与する新規な遺伝子を取得し、該遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下ないし欠損させることによる酢酸菌の培養中の発泡能を抑制させる方法、さらに、該方法により育種された発泡能が抑制された酢酸菌を用いることによる高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率良く製造する方法、及び該製造方法により製造される食酢を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、野生株とクオラムセンシングシステムの構成因子の１つであるアシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子ｏｒｆ１の破壊株（以下、ｏｒｆ１破壊株と称する場合もある。）について、マイクロアレイ解析により、網羅的遺伝子発現解析を行なった。その結果、野生株と比較してｏｒｆ１破壊株で転写量が減少する、すなわちクオラムセンシングシステムの制御下にあると考えられる新たな遺伝子ｇｌｙＴを見出した。
【００１７】
そして、このｇｌｙＴを修飾して、ｇｌｙＴがコードするタンパク質の機能を低下ないし欠損させることによって、発泡が顕著に抑制され、酢酸発酵能が顕著に増強された酢酸菌を取得し、この酢酸菌を使用して、高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率良く製造できることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
【００１９】
（２）以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
【００２０】
（３）以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）に示されるＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｃ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｄ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００２１】
（４）（２）又は（３）に記載のＤＮＡがコードするタンパク質の機能を低下ないしは欠損させることを特徴とする発泡能が抑制された酢酸菌の生産方法。
【００２２】
（５）（４）に記載の方法により得られる、発泡能が抑制された酢酸菌。
【００２３】
（６）グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１ΔｇｌｙＴ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０６８）である（５）記載の発泡能が抑制された酢酸菌。
【００２４】
（７）（５）又は（６）に記載の酢酸菌を、アルコールを含む培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子並びに該遺伝子がコードするタンパク質が提供される。また、該遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下ないし欠損させることにより、酢酸菌の培養中の発泡を顕著に抑制する方法が提供される。
【００２６】
さらに、本発明によれば、培養時の発泡を顕著に抑制させることによって高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率的に製造する方法が提供され、また該製造方法によって製造された高濃度の酢酸を含有する食酢が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のタンパク質としては、酢酸発酵能と発泡に関与するタンパク質である。具体的には、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質や、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質に関する。本発明において、「発泡に関与するタンパク質」とは、当該タンパク質の機能を低下ないしは欠損させることにより、酢酸菌の培養中の発泡が抑制されるタンパク質をいう。
【００２８】
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、単離した天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせて本発明のタンパク質を取得することができる。
【００２９】
化学合成により本発明のタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質をそのアミノ酸配列情報に基づいて合成することもできる。
【００３０】
また、遺伝子組換え技術により本発明のタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードするＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
【００３１】
なお、遺伝子組換え技術によって本発明のタンパク質を調製する場合に、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出を行った後、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法が用いられ、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。
【００３２】
特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。
【００３３】
さらに、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示した配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。
【００３４】
例えば、配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって、あるいは該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによって、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌、あるいはそれら以外の酢酸菌より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
【００３５】
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）などを使用して、定法に従って行うことができる。
【００３６】
さらに、上記本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させて融合タンパク質とすることもできる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のタンパク質の精製や、本発明のタンパク質の検出や、本発明のタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００３７】
本発明のタンパク質が、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質であることは、例えば、かかるタンパク質の機能を低下ないしは欠損させた酢酸菌を作製し、アルコールを含有する液体培地で好気的条件下において培養して、培養中の発泡の程度を野生株における発泡の程度と比較することにより確認することができる。本発明のタンパク質の機能を低下ないしは欠損させた酢酸菌の作製は、例えば、かかるタンパク質をコードする遺伝子の部分配列を欠失させる、又は、該遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入するなどして正常に機能するタンパク質を産生しないように修飾した遺伝子を含むＤＮＡで酢酸菌を形質転換し、染色体上の正常な遺伝子との間で相同組換えを起こさせることにより、染色体上の該遺伝子を破壊することにより行うことができる。
【００３８】
また、本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列からなるＤＮＡや、配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。
【００３９】
このように、本発明の酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたタンパク質をコードするものであってもよい。
【００４０】
このような酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質としての機能を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位の塩基を欠失、置換、挿入又は付加し、あるいは逆位として塩基配列を改変することによっても取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。さらに、一般的にタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
【００４１】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を意味する。
【００４２】
また、上記「１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列を意味する。
【００４３】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、上記のように、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤を接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。
【００４４】
遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版（Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989）やカレントプロトコールズ・イン・モレキュラーバイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)）等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００４５】
上記「配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列との相同性が８５％以上であれば特に制限されるものではなく、例えば、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上であることを意味する。
【００４６】
上記「ストリジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０％以上、好ましくは７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。
【００４７】
また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
【００４８】
ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００４９】
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列情報又は配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００５０】
例えば、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明のＤＮＡに特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明のＤＮＡを取得することができる。また、これらの酢酸菌からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
【００５１】
本発明のＤＮＡは、その塩基配列が明らかとなったので、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６７）のゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるＰＣＲ反応によって、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。なお、染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特開昭６０−９４８９号公報参照に開示された方法）により取得できる。
【００５２】
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて常法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して常法に従って行なうことができる。
【００５３】
本発明のＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されるように塩基配列を改変することによって取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
【００５４】
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
【００５５】
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１（図４）に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００５６】
また、上記配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２（図５）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどからなる本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の酢酸菌等から、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
【００５７】
例えば、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１（図４）に示される塩基配列、又はその一部から作製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。
【００５８】
本発明で用いる酢酸菌には特に制限はなく、例えば、アルコール酸化能を有するアセトバクター属（Acetobacter）やグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）などの細菌があげられるが、具体的には以下のものが例示される。
【００５９】
すなわち、グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）に属する酢酸菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・インターメディウス（Gluconacetobacter intermedius）、グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）などがあげられ、さらに具体的には、グルコンアセトバクター・キシリヌス ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス ＤＳＭ６１６０（Gluconacetobacter europaeus DSM6160）株、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス ＡＴＣＣ４９０３７（Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037）株、アセトバクター・アルトアセチゲネス ＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051）（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６７）株などがあげられる。
【００６０】
また、アセトバクター属（Acetobacter）に属する酢酸菌としては、例えば、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）があげられ、さらに具体的には、アセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株、アセトバクター・アセチ ＩＦＯ３２８３（Acetobacter aceti IFO3283）株などがあげられる。
【００６１】
本発明のＤＮＡが、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡであることは、例えば、かかるＤＮＡを欠損させた酢酸菌を作製し、アルコールを含有する液体培地で好気的条件下において培養して、培養中の発泡の程度を野生株における発泡の程度と比較することにより確認することができる。本発明のＤＮＡを欠損させた酢酸菌の作製は、例えば、かかるＤＮＡの部分配列を欠失させる、又は、該ＤＮＡ配列の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入するなどした修飾した遺伝子を含むＤＮＡで酢酸菌を形質転換し、染色体上の正常な遺伝子との間で相同組換えを起こさせることにより、染色体上の該遺伝子を破壊することにより行うことができる。
【００６２】
本発明の酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子（すなわち、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードする遺伝子）がコードするタンパク質の機能を低下ないしは欠損させることにより酢酸菌の培養中の発泡を抑制させる方法としては、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現や、該遺伝子がコードするタンパク質の活性が阻害を受けるような物理的条件下で、該酢酸菌を培養する方法がある。
【００６３】
また、酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子を修飾して、機能を低下ないし欠損させることも有効である。また、これらの遺伝子の発現を制御するように当該遺伝子の発現に関与する遺伝子部分に突然変異を誘導することも有効である。なお、遺伝子を修飾する方法としては、物理的処理や化学的変異剤を用いて当該遺伝子に突然変異を誘導する方法が有効であり、これらの突然変異を誘導する方法としては、従来、酢酸菌で実施されてきた方法が有効である。例えば、酢酸菌を紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の変異処理に通常用いられている変異剤によって処理し、突然変異を誘発させる方法があげられる。
【００６４】
なお、酢酸菌は自然に変異を起こしやすい細菌として知られていることから、自然界から、上記酵素の発現や機能に自然に変異をおこした遺伝子を有する酢酸菌を分離することによっても酢酸菌の培養中の発泡が抑制された酢酸菌を得ることができる。また、既にこれらの遺伝子が取得され、塩基配列も明らかとなっているので、これらの遺伝子を組換えることによって変異を導入した遺伝子を元の酢酸菌中に導入し、相同組換えなどを利用して元の酢酸菌の当該遺伝子の機能を低下ないし欠損させることも有効である。
【００６５】
例えば、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードする遺伝子の部分配列を欠失させる、又は、該遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入するなどして正常に機能する酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質を産生しないように修飾した遺伝子を含むＤＮＡで酢酸菌を形質転換し、染色体上の正常な遺伝子との間で相同組換えを起こさせることにより、染色体上の該遺伝子を破壊することなどの方法が有効である。
【００６６】
また、本発明の酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子がクオラムセンシングシステムによって制御されている場合には、同システムの機能を低下ないし欠損させることによっても酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下ないしは欠損させることができる。例えば、アシルホモセリンラクトン合成酵素遺伝子（ｏｒｆ１）及び／又はアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子遺伝子（ｏｒｆ２）を破壊することにより、アシルホモセリンラクトン合成酵素及び／又はアシルホモセリンラクトン受容体型転写因子の機能が低下ないし欠損した、酢酸菌の培養中の発泡が抑制された酢酸菌を作製することができる。
【００６７】
なお、酢酸菌の形質転換は、塩化カルシュウム法（例えば、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、４９巻、２０９１頁、１９８５年参照）やエレクトロポレーション法（例えば、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）、８７巻、８１３０〜８１３４頁、１９９０年参照）等によって行うことができる。
【００６８】
このようにして、アルコール酸化能を有するアセトバクター属（Acetobacter）やグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）の酢酸菌において、上記のようにして酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質の機能を低下ないしは欠損させて正常に機能しないように改変することにより、酢酸菌の培養中の発泡を抑制させることができる。
【００６９】
本発明の酢酸菌の培養中の発泡が抑制された酢酸菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１ΔｇｌｙＴ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０６８）を挙げることができる。
【００７０】
本発明の食酢の製造方法は、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質の機能を低下ないしは欠損させて正常に機能しないようにして、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめること以外は、従来公知の方法が採用される。すなわち、酢酸菌の培養は基本的には酢酸発酵が可能な条件で行えば良く、具体的には、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行えば良い。
【００７１】
また、アルコールを含有する培地としては酢酸発酵に使用する培地であれば良く、エタノールなどのアルコール成分の他、炭素源、窒素源、無機物等を含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものを用いることができる。培地は、合成培地でも天然培地でも良い。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
【００７２】
また、培養条件は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常は２５〜３５℃の範囲であり、好ましくは３０℃とする。培地のｐＨは、通常は２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することができる。通常１〜２１日間培養することによって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。このような本発明の食酢の製造方法により、酢酸菌の培養中の発泡が抑制され、高酸度の食酢をより効率良く製造することができる。
【００７３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７４】
［クオラムセンシングシステムの制御下にある遺伝子の探索］
これまでにクオラムセンシングシステムが酢酸菌の培養中の発泡を制御していることを本発明者は明らかにしてきたが、クオラムセンシングシステムによってどのような遺伝子が制御されており、また、酢酸菌の培養中の発泡にどのような遺伝子が関与しているのかがわかっていなかった。そこで、マイクロアレイ解析によって、クオラムセンシングシステム制御下にある遺伝子を同定し、酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子の探索を行なった。
【００７５】
具体的には、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６７としてブダペスト条約に基づき寄託されているグルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051）株（以下、野生株と称する場合もある）と、クオラムセンシングシステムの構成因子の１つであるアシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子（ｏｒｆ１）の破壊株であり、同じく独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６８としてブダペスト条約に基づき寄託されているグルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１Δｏｒｆ１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051Δorf1）株（以下、ｏｒｆ１破壊株と称する場合もある）とから、ＲＮＡを抽出し、一色法のマイクロアレイ解析（例えば、ラボマニュアル ＤＮＡチップとリアルタイムＰＣＲ、講談社、２００５年参照）によって発現量を比較した。
【００７６】
まず、野生株とｏｒｆ１破壊株を、５００ｍｌ容坂口フラスコを用いて、エタノール２％、グルコース３％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．３％、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムス製）１％を含む１００ｍｌの培地にて、３０℃、１２０ｓｐｍ、振とう培養を行った。両株の対数期及び定常期初期の培養液から、ＲＮｅａｓｙ（キアゲン製）を使用して、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの品質はバイオアナライザー（アジレント製）で確認した。
【００７７】
このようにして抽出した各ＲＮＡをそれぞれ鋳型にして、逆転写酵素とランダムプライマーを用いてｃＤＮＡを合成し、末端をビオチン標識した。一方で、ゲノム上に存在する全遺伝子に対応する特異的プローブを配置したマイクロアレイを設計・作成した。続いて、常法に従い、先に合成したビオチン標識ｃＤＮＡをマイクロアレイとハイブリダイズさせ、全遺伝子の発現量を数値化した。ハイブリダイゼーションは、野生株由来サンプル、ｏｒｆ１破壊株由来のサンプル、それぞれについて実施した。発現データは、Ｒｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉ−ｃｈｉｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＭＡ）法により標準化し、各遺伝子の発現強度とした。
【００７８】
以上のマイクロアレイ解析によって得られた野生株とｏｒｆ１破壊株の各遺伝子の発現強度を比較した結果、野生株と比較してｏｒｆ１破壊株で転写量が顕著に減少する遺伝子を見出した。この遺伝子（以下、ｇｌｙＴと称する場合もある）は、配列表の配列番号１（図４）の塩基番号８４６〜３７９４に示す塩基配列を有しており、該遺伝子がコードするタンパク質は配列表の配列番号２（図５）に示すアミノ酸配列を有していた。
【００７９】
ＢＬＡＳＴ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）による相同性検索の結果、ｇｌｙＴがコードするタンパク質は、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス ＰＡＬ５（Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5）株やグルコノバクター・オキシダンス ６２１Ｈ（Gluconobacter oxydans 621H）株におけるグリコシルトランスフェラーゼと推定されているタンパク質と、それぞれ、アミノ酸レベルで４４％の相同性を示した。しかしながら、これらのタンパク質の機能についてはこれまで全く解析されておらず、培養中の発泡に関与していることは全く知られておらず、また、酢酸菌の酢酸発酵能に関与していることも知られていなかった。
【００８０】
さらに、マイクロアレイ解析の結果を確認するために、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング法（例えば、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of bacteriology）、１８０巻、２５１５〜２５２１頁、１９９８年参照）によってｇｌｙＴの転写解析を行なった。その結果、野生株と比較して、ｏｒｆ１破壊株でｇｌｙＴの転写量が顕著に減少していることを確認し、ｇｌｙＴがクオラムセンシングシステムの制御下にある遺伝子であることが確認された。
【実施例２】
【００８１】
［ｇｌｙＴ破壊株の取得］
実施例１でクオラムセンシングシステムの制御下にあることを見出したｇｌｙＴが酢酸菌の培養中の発泡に関与しているかどうかを調べるため、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051）株のｇｌｙＴの破壊株を以下の手順により作製した。
【００８２】
まず、コロニーハイブリダイゼーションにより、ｇｌｙＴの一部を含む２．３ｋｂのＤＮＡ断片（配列表の配列番号１（図４）の塩基番号１〜２２５２）を取得し、該ＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＰｓｔＩサイトに挿入したプラスミドを調製した（以下、プラスミド１と称する場合もある）。次に、大腸菌トランスポゾンＴｎ５を鋳型にして、プライマー１（配列表の配列番号３（図６）参照）及びプライマー２（配列表の配列番号４（図７）参照）を使用して、ＰＣＲ法によりカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅し、該増幅産物を制限酵素ＳｍａＩ（タカラバイオ製）で処理してＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片１と称する場合もある）を調製した。
【００８３】
ライゲーション反応により、制限酵素ＥｃｏＲＶ（タカラバイオ製）で切断したプラスミド１にＤＮＡ断片１を連結した。このようにして調製したＤＮＡで大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株を形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。選択したアンピシリン耐性の形質転換株から、常法により、ｇｌｙＴ破壊用プラスミドｐＵＣΔｇｌｙＴを回収した。
【００８４】
このようにして得たｇｌｙＴ破壊用プラスミドｐＵＣΔｇｌｙＴを用いて、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051）株をエレクトロポレーション法（例えば、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）、８７巻、８１３０〜８１３４頁、１９９０年参照）によって形質転換した。
【００８５】
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．３％ポリペプトン）で選択した。選択培地上で生育したカナマイシン耐性の形質転換株は、サザンハイブリダイゼーションによって、ｇｌｙＴ中にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたことにより、ｇｌｙＴが破壊された株であることを確認した。
【００８６】
得られた形質転換株の内の１株を、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１ΔｇｌｙＴ（Gluconacetobacter intermedius NCI1051ΔglyT）と命名し（以下、ｇｌｙＴ破壊株と称する場合もある）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）にブダペスト条約に基づき寄託した。その受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０６８、受託日は、２００８年１２月２日である。
【００８７】
さらに、ｇｌｙＴ破壊株の表現型がｇｌｙＴ遺伝子の破壊によるものであることを確認するため、ｇｌｙＴ遺伝子を含む相補用プラスミドｐＧｌｙＴをｇｌｙＴ破壊株に導入して、ｇｌｙＴ相補株を作製した。
【００８８】
まず、ｇｌｙＴ遺伝子を含むプラスミドｐＧｌｙＴを以下の通り作製した。すなわち、上記のプラスミド１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩ（タカラバイオ製）で切断して、ｇｌｙＴの５’側領域を含むＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片２と称する場合もある）を調製した。
【００８９】
次に、グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１（Gluconacetobacter intermedius NCI1051）株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、プライマー３（配列表の配列番号５（図８）参照）及びプライマー４（配列表の配列番号６（図９）参照）を使用して、ＰＣＲ法によりｇｌｙＴの３’側領域を含むＤＮＡ断片を増幅し、該増幅産物を制限酵素ＡｐａＩとＸｂａＩ（タカラバイオ製）で処理してＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片３と称する場合もある）を調製した。
【００９０】
ライゲーション反応により、制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩ（タカラバイオ製）で切断した大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＭＶ２４に、ＤＮＡ断片２とＤＮＡ断片３を連結した。このようにして調製したＤＮＡで大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株を形質転換した。形質転換株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。このようにして選択したアンピシリン耐性の形質転換株から、常法により、相補用プラスミドｐＧｌｙＴを回収した。
【００９１】
このようにして得た相補用プラスミドｐＧｌｙＴを用いて、グルコンアセトバクター・インターメディウス ΔｇｌｙＴ（Gluconacetobacter intermedius NCI1051ΔglyT）株をエレクトロポレーション法によって形質転換した。
【００９２】
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．３％ポリペプトン）で選択した。選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株から、プラスミドを抽出して、ｐＧｌｙＴが導入されていることを確認した。このようにして得られた形質転換株を、ｇｌｙＴ相補株とした。
【実施例３】
【００９３】
［ｇｌｙＴ破壊株と野生株の発泡の比較］
実施例２で得られたｇｌｙＴ破壊株について、野生株及びｇｌｙＴ相補株と培養中の発泡の様子を比較した。具体的には、５００ｍｌ容坂口フラスコを用いて、エタノール２％、グルコース３％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．３％、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムス製）１％を含む１００ｍｌの培地にて、３０℃、１２０ｓｐｍで、振とう培養を行った。
【００９４】
その結果、野生株と比較して、ｇｌｙＴ破壊株は発泡が顕著に抑制されることがわかった（図１）。また、ｇｌｙＴ相補株では発泡が野生株レベルに戻ったため（図１）、ｇｌｙＴ破壊株でみられた発泡の抑制はｇｌｙＴの破壊によるものであることが確認できた。
【００９５】
次にミニジャーファーメンターでも、ｇｌｙＴ破壊株と野生株とについて、培養中の発泡の様子を比較した。なお、培養は、３リッターのミニジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製、Ｂｉｏｎｅｅｒ３００型 ３Ｌ）を用いて、エタノール３％、グルコース３％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムス製）１％、消泡剤０．０１％を含む１．５リッターの培地にて、３０℃、５００ｒｐｍ、１リッター／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。培養中は培地中のエタノール濃度を２％に制御した。
【００９６】
ミニジャーファーメンターでの発泡の様子を図２に示した。図２から明らかなように、野生株と比較して、ｇｌｙＴ破壊株は発泡が顕著に抑制された。この結果から、ｇｌｙＴは培養中の発泡に関与しており、ｇｌｙＴを破壊することにより、培養中の発泡が顕著に抑制されることが示された。
【実施例４】
【００９７】
［ｇｌｙＴ破壊株と野生株の酢酸発酵能の比較］
実施例２で得られたｇｌｙＴ破壊株について、野生株と酢酸発酵能を比較した。具体的には、３リッターのミニジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製、Ｂｉｏｎｅｅｒ３００型 ３Ｌ）を用いて、エタノール３％、グルコース３％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．３％、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムス製）１％、消泡剤０．０１％を含む１．５リッターの培地にて、３０℃、５００ｒｐｍ、１リッター／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。培養中は培地中のエタノール濃度を２％に制御した。酢酸発酵経過を図３に、また、４８時間培養後の培養液の酢酸濃度を表１に示した。
【００９８】
【表１】
【００９９】
図３から明らかなように、野生株と比較して、ｇｌｙＴ破壊株では酢酸の生産量が顕著に増加していた。また、表１に示した通り、４８時間培養後の培養液の酢酸濃度は、野生株の２．６７±０．０７％（重量/容量）に対して、ｇｌｙＴ破壊株では５．３２±０．２３％（重量/容量）であり、ｇｌｙＴ破壊株の酢酸生産量は野生株の約２倍に増加した。以上の結果から、ｇｌｙＴが酢酸生産能にも関与しており、ｇｌｙＴを破壊することにより、培養中の発泡が顕著に抑制されるだけではなく、さらに高濃度の酢酸を含有する食酢をより効率良く生産することができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明によれば、酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子ならびに該遺伝子がコードするタンパク質が提供され、さらに酢酸菌の培養中の発泡に関与する遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下又は欠損させることにより、培養中の発泡を顕著に減少させ、より多量の酢酸を生成することが可能な酢酸菌が提供され、該酢酸菌を用いた培養中の発泡を抑制させる方法及び酢酸発酵能を顕著に増強させる方法が提供されるので、該方法により酢酸菌を用いた高濃度の酢酸を含有する食酢のより効率的な製造を行うことができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】野生株とｇｌｙＴ破壊株を坂口フラスコで培養した際の発泡の様子を示した図である。
【図２】野生株とｇｌｙＴ破壊株をミニジャーファーメンターで培養した際の発泡の様子を示した図である。
【図３】野生株とｇｌｙＴ破壊株の酢酸発酵経過を示した図である。
【図４】ｇｌｙＴを含むＤＮＡ断片の塩基配列（配列番号１）を示した図である。
【図５】ｇｌｙＴがコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示した図である。
【図６】プライマー１の塩基配列（配列番号３）を示した図である。
【図７】プライマー２の塩基配列（配列番号４）を示した図である。
【図８】プライマー３の塩基配列（配列番号５）を示した図である。
【図９】プライマー４の塩基配列（配列番号６）を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
【請求項２】
以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
【請求項３】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）に示されるＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｃ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｄ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載のＤＮＡがコードするタンパク質の機能を低下ないしは欠損させることを特徴とする発泡能が抑制された酢酸菌の生産方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法により得られる、発泡能が抑制された酢酸菌。
【請求項６】
グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１ΔｇｌｙＴ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０６８）である請求項５記載の発泡能が抑制された酢酸菌。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の酢酸菌を、アルコールを含む培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【請求項１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
【請求項２】
以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質
【請求項３】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）に示されるＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｃ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｄ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号８４６〜３７９４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつ、酢酸菌の培養中の発泡に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載のＤＮＡがコードするタンパク質の機能を低下ないしは欠損させることを特徴とする発泡能が抑制された酢酸菌の生産方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法により得られる、発泡能が抑制された酢酸菌。
【請求項６】
グルコンアセトバクター・インターメディウス ＮＣＩ１０５１ΔｇｌｙＴ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０６８）である請求項５記載の発泡能が抑制された酢酸菌。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の酢酸菌を、アルコールを含む培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−１４８３８１（Ｐ２０１０−１４８３８１Ａ）
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３２７７９５（Ｐ２００８−３２７７９５）
【出願日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
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