酵母ベースのワクチンを生成するための方法
本発明は、中性ｐＨレベルで酵母を培養する方法を提供する。中性ｐＨ条件下で培養された酵母は、ワクチン、予防薬および治療薬の開発など、生物学的目的に有用な望ましい特徴を示す。本発明はまた、本明細書に開示された方法を用いて増殖させた酵母を含む組成物およびキットも提供する。一局面において、本発明の方法で使用される培地は、酵母養
期間の少なくとも５０％にわたって５．５〜８の間のｐＨレベルで維持されることを特徴とする。
期間の少なくとも５０％にわたって５．５〜８の間のｐＨレベルで維持されることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この特許出願は、２００８年２月２日に出願された米国第６０／８９９，２８１号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、酵母培養物の収率および特定の特徴を改善するために中性ｐＨで酵母培養物を増殖させる方法に関する。その方法はまた、これらの方法により生成された組成物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ワクチンは、医療産業が利用できる最も費用効果の高い手段の１つである。しかし、病原体による感染、癌、遺伝子欠損およびその他免疫系障害による疾患を含む、様々な疾患に対する安全で効果的なワクチンおよびアジュバントの開発が急務であることに変わりはない。ワクチンに関する出版物、例えば、非特許文献１は、経口投与することができ、好ましくは人生の初期に数回のみ投与する必要がある、安全で耐熱性のワクチンが依然として必要であると述べている。また、複数の疾患から個人を保護することができる混合ワクチン、およびアジュバントを必要とせず、粘膜免疫を誘発することができるワクチンも好ましい。これまで、これらの基準のすべてを満たすワクチンは、あったとしてもほとんどない。
【０００４】
組換えＤＮＡ技術により開発が可能になったサブユニットワクチンは、限られた免疫原性のみを示すためこれまで期待はずれであった。１つの例は、いくつかのＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）サブユニットワクチンの最近の臨床試験で、ワクチンの有効性が限られるだけでなく、免疫化された個人が後にＨＩＶに曝露した場合、いくつかの場合で疾患進行の加速を示したため、臨床試験は中止された。例えば、非特許文献２および非特許文献３を参照されたい。サブユニットワクチン、ならびに死滅ウイルスワクチンおよび組換え生ウイルスワクチンの１つの欠点は、これらが強力な体液性免疫応答を刺激するように見える一方で、防御細胞性免疫を誘発しない点である。１９９４年の国際エイズ会議での主な結論は、これまで臨床でのワクチンが不足している、ＨＩＶ感染性を予防または低減する細胞障害性Ｔ細胞媒介応答が依然として必要である、というものであった。さらに、これまで試験されたＨＩＶワクチンは、一次ＨＩＶ感染が生じる粘膜表面での免疫を誘発しなかった。
【０００５】
さらに、米国で使用が認可された唯一のアジュバントは、アルミニウム塩の水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムであり、どちらも細胞性免疫を刺激しない。さらに、アルミニウム塩製剤は、凍結または凍結乾燥することができず、このようなアジュバントはすべての抗原で効果があるわけではない。
【０００６】
酵母細胞は、上述したＨＩＶワクチン試験で試験されたもののいくつかを含む、サブユニットタンパク質ワクチンの生成に使用されてきた。酵母はまた、非特異的方法での免疫応答のプライミング（すなわち、食作用ならびに補体およびインターフェロン産生の刺激）を試みるため免疫化前に動物に給餌された。結果は曖昧であり、このようなプロトコルが防御細胞性免疫をもたらすことはなかった。例えば、非特許文献４および非特許文献５を参照されたい。
【０００７】
ワクチンの他、多くの遺伝子および薬物療法は、最大の利点の可能性を確保するのに効率的および特異的な送達ビヒクルを必要とする。適切な送達ビヒクルがないことは、遺伝子療法の適用に対する大きな障害であり、多くの薬剤の治療可能性を制限するものである。例えば、最近の報告は、遺伝子療法適用のため現在臨床で試験されているアデノウイルスベクターが、望ましくない免疫および炎症反応を刺激すること、ならびに所望の方法で組み込まれているように見えないことを指摘している。例えば、非特許文献６およびこの中に引用された参考文献を参照されたい。
【０００８】
酵母ワクチン技術に対する別の大きなハードルは、製造工程である。酵母細胞は長年研究所で培養されており、標準培養条件が確立されている。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１９４巻、Ｇｕｔｈｒｉｅら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）を参照されたい。標準操作手順は、一般に、ｐＨレベルで測定して酸性である培地で酵母を培養することを含む。しかし、酸性培地での酵母の培養は、免疫調節またはワクチン作製のため酵母を抗原提示ビヒクルとして使用するのに最適ではない、様々な生物学的特性を示す酵母をもたらす可能性がある。故に、抗原提示ビヒクルであることにより適した特性を酵母が示すように、酵母を増殖する方法が必要である。本明細書に開示された本発明は、酵母は酸性培地で増殖することができる一方、酸性培地で増殖される場合に酵母が示す生物学的特性は、酵母が中性ｐＨレベルにある培地で増殖される場合ほど望ましくないという発見に一部基づいている。
【０００９】
本明細書に引用されたすべての特許、特許出願、および出版物の開示は、全目的でこの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４年）２６５、１４０１〜１４０４頁
【非特許文献２】Ｃｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４年）２６４：１８３９頁
【非特許文献３】Ｃｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４年）２６４：６６０頁
【非特許文献４】Ｆａｔｔａｌ−Ｇｅｒｍａｎら、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ．（１９９２年）７７：１１５〜１２０頁
【非特許文献５】Ｂｉｚｚｉｎｉら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９０年）２：１５５〜１６７頁
【非特許文献６】Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４年）５：１２１７〜１２２９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、培地で酵母を培養することにより酵母を増殖させるための方法であって、培地が酵母培養期間の少なくとも５０％にわたって５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される方法を提供する。本発明はまた、培地で酵母を培養することにより酵母を増殖させるための方法であって、培地が酵母培養期間の少なくとも５０％にわたって５．５〜８の間のｐＨレベルで維持され、酵母密度が少なくとも０．５酵母単位／ｍＬである方法も提供する。
【００１２】
他の態様では、本発明は、少なくとも５．５のｐＨレベルを有する培地で酵母を培養することによる酵母の増殖を提供する。本発明はまた、培地で酵母を培養して酵母を増殖させるための方法であって、培地が５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される方法を提供する。本発明の１つの態様では、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。本発明の態様では、培地はコハク酸塩またはコハク酸で緩衝されるか、または培地はさらにソイトン（ｓｏｙｔｏｎｅ）を含有することができる。本発明の他の態様では、酵母は免疫応答を誘発する。本発明の他の態様では、酵母は抗原を発現し、いくつかの場合では抗原は異種抗原である。いくつかの場合では、異種抗原は酵母表面で発現される。
【００１３】
本発明は、上記の任意の方法および関連する態様により培養された酵母を含む組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、抗原を発現する発現系を含有する酵母を培地で培養することにより抗原発現酵母を産生するための方法であって、培地のｐＨが少なくとも５．５である方法を提供する。本発明はまた、抗原を発現する発現系を含有する酵母を培養することにより抗原発現酵母を産生するための方法であって、培地が５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される方法も提供する。１つの態様では、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。他の態様では、培地はコハク酸塩もしくはコハク酸で緩衝されるか、または培地はさらにソイトンを含有することができる。本発明の他の態様では、酵母は免疫応答を誘発する。本発明の他の態様では、酵母は抗原を発現し、いくつかの場合では抗原は異種抗原である。いくつかの場合では、異種抗原は酵母表面で発現される。いくつかの態様では、酵母が５．５未満のｐＨで増殖される場合より容易に異種抗原が他の細胞または作用物質との相互作用に到達可能である。
【００１５】
本発明はまた、上記に開示された方法により培養された酵母を含む組成物も提供する。
【００１６】
本発明はまた、抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより個体におけるＴｈ１型応答を誘導する方法であって、酵母が、少なくとも５．５のｐＨレベルを有する培地で培養されている方法も提供する。
【００１７】
本発明はまた、抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより個体におけるＴｈ１型応答を誘導する方法であって、酵母が、５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地で培養されている方法も提供する。１つの態様では、組成物は、中性ｐＨで培養、維持または回収された酵母で負荷された樹状細胞を含む。別の態様では、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。他の態様では、培地はコハク酸塩もしくはコハク酸で緩衝されるか、または培地はさらにソイトンを含有することができる。本発明の他の態様では、酵母は免疫応答を誘発する。本発明の他の態様では、酵母は抗原を発現し、いくつかの場合では抗原は異種抗原である。いくつかの場合では、異種抗原は酵母表面で発現される。１つの態様では、Ｔｈ１型応答はインターフェロン−ガンマ産生である。別の態様では、Ｔｈ１型応答はＩＬ−１２産生である。
【００１８】
本発明はまた、ｐＨが少なくとも５．５である培地、および酵母を培養するための培地の使用に関する指示書を含む酵母を培養するためのキットも提供する。本発明はまた、５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地、および酵母を培養するための培地の使用に関する指示書を含む酵母を培養するためのキットも提供する。他の態様では、培地はコハク酸塩もしくはコハク酸で緩衝されるか、または培地はさらにソイトンを含有することができる。１つの態様では、キットはさらに酵母を含む。いくつかの場合では、酵母は凍結または凍結乾燥されている。いくつかの場合では、酵母は、少なくともｐＨ５．５の培地で培養されるか、または５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地で培養されている。他の場合では、酵母は複製可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】細胞増殖および培養ｐＨレベルに対する培地ｐＨレベルの効果を示す図である。
【図２】細胞壁厚に対する培地ｐＨレベルの効果を示す図である。
【図３】約６．５のｐＨで異なる緩衝剤を試験した結果を示す図である。７５−１５細胞の増殖および培養ｐＨに対する効果を示す。
【図４】グルカナーゼによる溶解で測定した、細胞壁厚に対する様々な緩衝剤の効果を示す図である。培地は、コハク酸塩またはクエン酸塩のいずれかを用いて緩衝され、培地を約６．５のｐＨレベルに緩衝した。
【図５】増殖およびｐＨレベルに対する培地処方の効果について、様々な添加剤を試験した培地処方試験の結果を示す図である。
【図６】培地処方試験の一部である酵母細胞生存の結果を示す図である。酵母細胞表面のＨＡの表面発現を、フローサイトメトリーにより測定した。
【図７】様々な添加剤を試験した、細胞増殖およびｐＨプロフィールに関する培地処方試験の結果を示す図である。
【図８】インタクトな酵母から遊離可能な血球凝集素（ＨＡ）の免疫ブロットアッセイの結果を示す図である。酵母が中性で増殖する場合対酵母がより低いｐＨ条件で増殖する場合のＨＡ到達性の差を示す。免疫ブロットは、ＹＥＸおよびＧＩ−８１０３からのＤＴＴ溶出液のウェスタンブロットである。
【図９】酵母細胞を添加した樹状細胞によるサイトカイン分泌に対する、中性および低いｐＨレベルでの酵母細胞の培養効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書に開示された本発明は、中性ｐＨ、少なくともｐＨ５．５、またはｐＨ５．５〜８の間、またはｐＨ６〜８の間で酵母を増殖することが、より望ましい生物学的特徴を有する酵母をもたらすという発見に基づく。以下に詳述されるこれらの望ましい特徴のいくつかは、酵母細胞壁を柔軟に、および細胞壁消化酵素による消化対し感受性に保ちながら、増加した細胞密度で十分に増殖する能力、ならびに他の細胞および／または作用物質に抗原をより接近できるようにする方法での抗原の提示を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
一般的技法
本発明の実施は、特に指示のない限り、当業者によく知られた、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来技術を使用する。このような技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１９４巻、Ｇｕｔｈｒｉｅら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）；Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｙｅａｓｔｓ、Ｓｋｉｎｎｅｒら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８０年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ ｍａｎｕａｌ、Ｒｏｓｅら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）；Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ： Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｇｌｅら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９７年）；Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ： Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｊｏｎｅｓら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３年）；Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ： Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ａｎｄ Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ、Ｂｒｏａｃｈら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２年）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）、（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」として本明細書に一緒に言及されている）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年、２００１年までの補遺を含む）；ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９年）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（「ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ」として本明細書に一緒に言及されている）Ｂｅａｕｃａｇｅら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００年）およびＶａｃｃｉｎｅｓ、Ｓ． ＰｌｏｔｋｉｎおよびＷ． Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ編、第３版（１９９９年）などの文献で十分に説明されている。
【００２２】
定義
本明細書では、用語「中性ｐＨ」の一般的使用は、少なくとも５．５のｐＨレベルを指す。中性ｐＨの範囲は、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ８の間、好ましくは約ｐＨ６〜約８の間であり得る。当業者は、ｐＨ計で測定した場合、小さな変動（例えば、１０分の１または１００分の１）が生じ得、そのため、ｐＨレベルを決定する場合はいつでもこのことを考慮すべきであることを理解されよう。
【００２３】
本明細書では、「抗原」の一般的使用は、適応免疫系により認識され得る任意の分子を指す。１つの態様では、抗原は抗体に特異的に結合する分子である。分子は、タンパク質が自然発生もしくは合成的に得られたタンパク質（ペプチド、部分タンパク質、完全長タンパク質）のいずれかの部分、または細胞組成物（全細胞、細胞溶解物または破壊細胞）の一部、生物（全生物、溶解または破壊細胞）の一部、または糖質もしくはこの部分であり得る。抗原は、単独でまたは（破砕した酵母細胞のような）アジュバントなど別の化合物の使用により、抗原特異的体液性免疫応答を誘発することができる。別の態様では、抗原は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）との関連においてＴリンパ球（すなわちＴ細胞）により認識される。別の態様では、抗原は、抗原を投与した動物の細胞および組織内で遭遇する同一または類似の抗原に対し、寛容原（ｔｏｌｅｒａｇｅｎ）として作用することができる。
【００２４】
本発明の１つの態様では、免疫応答刺激を指す場合、「抗原」は「免疫原」であり得る。免疫原は、適応免疫応答、例えば、抗体産生誘導を誘発することができる分子である。免疫原は、いくつかの場合では、抗原へ将来曝露した際に該抗原を認識する抗体を産生するであろう記憶細胞を生成することができる。この分野のすべての当業者によく知られている通り、免疫原は、Ｔリンパ球によっても認識されることができるが、Ｔリンパ球に認識される免疫原の形態は、抗体が認識する免疫原の形態とは異なる。
【００２５】
酵母の培養方法
本発明は、所望の抗原の高発現、細胞壁の柔軟性、および抗原の提示など、望ましい特徴をもたらす酵母の培養方法も提供する。
【００２６】
これらの方法は、すべての酵母に対し幅広く適用できる。酵母は、３つのクラス、すなわち、Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ、ＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓおよびＦｕｎｇｉ Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉの１つに属する単細胞微生物である。病原性酵母株、またはこの非病原性変異体を本発明により使用することができるが、１つの態様では、非病原性酵母株が使用される。非病原性酵母株の例には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｒｎｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、ＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＹａｒｒｏｗｉａが含まれる。１つの態様では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが使用される。さらに他の態様では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ ｖａｒ． ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、および、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが使用される。本発明は上記の種リストに限定されず、当業者は本明細書の教示をいずれのタイプの酵母にも適用できることが理解される。別の態様では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が本発明の方法を実施するのに使用される。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、分子操作の容易さ、および食品添加物としての使用に「一般に安全と認められる」すなわち「ＧＲＡＳ」である（ＧＲＡＳ、ＦＤＡ提案規則６２ＦＲ１８９３８、１９９７年、４月１７日）ため好ましい。
【００２７】
ｐＨレベルは、酵母の培養に重要である。当業者は、培養工程には、酵母培養の開始だけでなく、同様に培養の維持も含まれることを理解するであろう。酵母培養は、いずれのｐＨレベルでも開始することができるが、酵母培地は、時間とともにより酸性（すなわち、ｐＨ低下）になる傾向があるため、培養工程中はｐＨレベルをモニターすることを注意しなければならない。
【００２８】
本発明のいくつかの態様では、酵母は、少なくとも５．５のｐＨレベルの培地で増殖される。他の態様では、酵母は約５．５のｐＨレベルで増殖される。他の態様では、酵母は５．５〜８の間のｐＨレベルで増殖される。いくつかの場合では、酵母培養は５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される。他の態様では、酵母は６〜８の間のｐＨレベルで増殖される。いくつかの場合では、酵母培養は６〜８の間のｐＨレベルで維持される。他の態様では、酵母は６．１〜８．１の間のｐＨレベルで増殖および／または維持される。他の態様では、酵母は６．２〜８．２の間のｐＨレベルで増殖および／または維持される。他の態様では、酵母は６．３〜８．３の間のｐＨレベルで増殖および／または維持される。他の態様では、酵母は６．４〜８．４の間のｐＨレベルで増殖および／または維持される。他の態様では、酵母は５．５〜８．５の間のｐＨレベルで増殖および／または維持される。他の態様では、酵母は６．５〜８．５の間のｐＨレベルで増殖および／または維持される。他の態様では、酵母は約５．６、５．７、５．８または５．９のｐＨレベルで増殖される。別の態様では、酵母は約６のｐＨレベルで増殖される。別の態様では、酵母は約６．５のｐＨレベルで増殖される。他の態様では、酵母は約６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９または７．０のｐＨレベルで増殖される。他の態様では、酵母は約７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０のｐＨレベルで増殖される。他の態様では、酵母は８より上のレベルで増殖される。
【００２９】
１つの態様では、酵母は、培地のｐＨレベルがｐＨ５．５より下に下がらないように培養される。いくつかの場合では、ｐＨ５．５を下回る低下は５分を超えない。他の場合では、ｐＨ５．５を下回る低下は１０分、好ましくは２０、３０、４０、５０または６０分を超えない。他の場合では、ｐＨ５．５を下回る低下は１時間を超えない。別の態様では、酵母は、培地のｐＨレベルが５．０より下に下がらないように培養される。いくつかの場合では、ｐＨ５．０を下回る低下は５分を超えない。他の場合では、ｐＨ５．０を下回る低下は１０分、好ましくは２０、３０、４０、５０または６０分を超えない。他の場合では、ｐＨ５．０を下回る低下は１時間を超えない。このため、酵母が少なくともｐＨ５．５以上の培地で増殖される時間が長いほど、以下に記載された望ましい特徴を有する酵母を得ることに関し、結果は良好となるであろう。
【００３０】
１つの態様では、酵母細胞を増殖させるための中性ｐＨ方法の使用は、酵母培養期間の少なくとも５０％にわたって、酵母細胞が中性ｐＨで増殖されることを意味する。酵母培養期間の少なくとも６０％、より好ましくは酵母培養期間の少なくとも７０％、より好ましくは酵母培養期間の少なくとも８０％、および最も好ましくは酵母培養期間の少なくとも９０％にわたって、酵母が中性ｐＨで増殖されることがより好ましい。
【００３１】
別の態様では、中性ｐＨでの酵母の増殖には、中性ｐＨで少なくとも５分間、好ましくは中性ｐＨで少なくとも１５分間、より好ましくは中性ｐＨで少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも２時間、さらにより好ましくは、少なくとも３時間以上酵母細胞を培養することが含まれる。
【００３２】
先述の通り、酵母は増殖および複製するため、細胞密度が増大し、培地の酸性レベルが上昇する。このため、酵母密度が増加しているときに、酵母は少なくとも５．５のｐＨレベルで培養および／または少なくともｐＨ５．５で維持されることが推奨される。１つの態様では、酵母密度が０．５酵母単位（ＹＵ）／ｍｌ以上であるとき、酵母はｐＨ５．５〜８の間で増殖および／または維持される。他の態様では、酵母密度が少なくとも０．６ＹＵ／ｍｌ以上、好ましくは０．７ＹＵ／ｍｌ以上、０．８ＹＵ／ｍｌ以上、０．９ＹＵ／ｍｌ以上、または１ＹＵ／ｍｌ以上である場合、酵母はｐＨ５．５〜８の間で増殖および／または維持される。別の態様では、酵母密度が０．５ＹＵ／ｍｌ以上である場合、酵母はｐＨ６〜８の間で増殖および／または維持される。他の態様では、酵母密度が少なくとも０．６ＹＵ／ｍｌ以上、好ましくは０．７ＹＵ／ｍｌ以上、０．８ＹＵ／ｍｌ以上、０．９ＹＵ／ｍｌ以上、または１ＹＵ／ｍｌ以上である場合、酵母はｐＨ６〜８の間で増殖および／または維持される。
【００３３】
いくつかの態様では、酵母培養が中性ｐＨレベルにあるのは、回収時であることが好ましい。いくつかの場合では、回収時の酵母培養は６〜８の間のｐＨレベルにあるであろう。他の場合では、回収時の酵母培養は５．５〜８の間のｐＨレベルにあるであろう。
【００３４】
培地は、任意の手段により少なくとも５．５のｐＨレベルにすることができる。１つの態様では、コハク酸（および任意の関連形態、例えば、アニオンコハク酸塩）が培地を緩衝するのに使用される。実施例にさらに詳述されている通り、培地を少なくともｐＨ５．５に緩衝するためのコハク酸塩の使用は、酵母が約２〜２時間半の倍加時間を有することが可能になる。コハク酸塩は、市販の供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）から入手できる。他の態様では、クエン酸塩は、培地を少なくともｐＨ５．５にするのに使用することができる。当業者は、酵母を生存させ続けながら、培地を少なくともｐＨ５．５にするのに使用することができる他の緩衝剤を容易に決定することができるであろう。溶液を安定したｐＨレベルに保つ緩衝剤の概念は、当技術分野でよく知られており、このため、本明細書では詳細に論じない。本発明により増殖された酵母は、医薬製剤（例えば、ワクチン）に使用されるならば、ＧＭＰグレードの材料が使用されることが推奨される。
【００３５】
さらに、培地を改善するのに他の補助剤を培地に添加することができる。培地に添加するのに特に役立つ他の補助剤にはソイトンが含まれる。ソイトンは、市販の供給源（例えば、ＢＤ Ｄｉｆｃｏ社）から容易に入手できる。実施例および図面に示される通り、培地へのソイトンの添加は、中性ｐＨでの増殖のため密度の増加を支持する。さらに、ソイトンの添加は、目的とする抗原、インフルエンザウイルスの血球凝集素（ＨＡ）の発現を支持する。
【００３６】
他の添加剤は、異種遺伝子の発現誘導など、他の目的で酵母培養に添加することができる。いくつかの態様では、血球凝集素発現の発現を誘導するのに銅が使用される。しかし、銅の使用は、中性ｐＨで増殖される酵母で発現される誘導性遺伝子の調節には、中性ｐＨでは理想的ではないため、銅以外の添加剤が推奨される。
【００３７】
酵母培養に対する中性ｐＨの効果
酵母の培養における中性ｐＨの使用は、免疫調節および／または免疫応答誘発のためのビヒクルとして酵母を使用するのに望ましい特徴である、いくつかの生物学的効果を促進する。１つの態様では、中性ｐＨでの酵母の培養は、倍加時間に何らのマイナス効果を与えることなく（例えば、倍加時間の減速）、酵母の良好な増殖を可能にする。酵母は、細胞壁の柔軟性を失うことなく高密度まで増殖し続けることができる。
【００３８】
別の態様では、少なくとも５．５のｐＨ、またはｐＨ５．５〜８の間などの中性ｐＨの使用は、柔軟な細胞壁を有する酵母および／またはすべての回収密度で細胞壁消化酵素（例えば、グルカナーゼ）に感受性を有する酵母の産生を可能にする。このため、本発明は、従来のアッセイで測定した細胞壁の柔軟性（例えば、グルカナーゼに対する感受性）を有する酵母の方法および組成物を提供する。事前実験は、酵母が、０．５ＹＵ（酵母単位）／ｍｌの回収密度で、細胞壁消化酵素による消化に対する感受性を喪失することを立証した。このため、１つの利点は、０．５ＹＵ／ｍｌでの標準的な増殖培地で培養された酵母により行われる比較を、任意の密度での中性ｐＨ増殖との比較に使用できることである。柔軟な細胞壁を有する酵母は、酵母を宿す細胞におけるサイトカイン（例えば、ＩＮＦ−ガンマ）分泌を促進するなど、独特の免疫応答を示すことができるため、この特性は望ましい。当業者が中性ｐＨの方法を使用すると考えられる別の理由は、細胞壁に位置する抗原への到達性を高められる点である。これは、フローサイトメトリーなどの標準技術で測定した、発現タンパク質の免疫原性の増大および抗体検出に有用である。
【００３９】
中性ｐＨで培養された酵母で観察されるさらに別の望ましい特徴は、免疫調節の目的で有益な方法での抗原発現である。１つの態様では、酵母は抗原発現のためのビヒクルとして使用される（例えば、米国特許第５，８３０，４６３号および第７，０８３，７８７号を参照されたい）。抗原は、天然酵母抗原、あるいは酵母により発現される異種抗原であってよい。いくつかの態様では、抗原発現のための酵母は、様々な疾患および病気（例えば、感染症または癌）と闘うワクチン、予防薬、および治療薬の開発に役立つ。中性ｐＨの方法を用いて、当業者は、抗原が他の細胞（例えば、免疫共刺激性機能または免疫制御のため）または他の作用物質（例えば、検出用抗体）により到達可能な抗原提示酵母を産生することができる。さらに、インフルエンザＨＡ抗原などのいくつかの抗原に中性ｐＨを使用することは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）による処理により、ジスルフィド結合したＨＡの遊離を可能にする。これは、ＨＡ発現酵母が、ｐＨがｐＨ５より下に低下する培地で培養される場合には不可能なことである。いくつかの場合では、これは、わずかな時間でもｐＨがｐＨ５より下に低下する場合に生じる。他の場合では、これは、１もしくは数分または１もしくは複数時間、ｐＨがｐＨ５より下に低下する場合に生じる。
【００４０】
中性ｐＨの方法に従い培養された酵母が示す別の望ましい特徴は、酵母に曝露した細胞からのＴｈ１型サイトカインの分泌である。Ｔｈ１型サイトカインの例には、インターフェロン−ガンマ、ＩＬ−１２、およびＩＬ−２が含まれるが、これらに限定されない。実施例にさらに詳述されている通り、中性ｐＨプロトコルに従い増殖された酵母で負荷された樹状細胞は、低い（酸性）ｐＨ培地で増殖された酵母に比べて、インターフェロン−ガンマ分泌および発現レベルが上昇する。中性ｐＨ培養方法を用いる場合、ＩＬ−１２分泌レベルの低下はなかった。このため、当業者は、免疫調節の目的、例えば、増大したＴｈ１型応答から恩恵を受けると考えられる、疾患または障害に苦しんでいる個体においてＴｈ１型応答を誘導するために、本明細書に開示された中性ｐＨの方法を使用することができる。
【００４１】
中性ｐＨの方法を用いて増殖された酵母組成物
本発明はまた、本明細書に開示された中性ｐＨの方法を用いて増殖された酵母を含む組成物も企図する。１つの態様では、組成物は、この表面もしくは内部のいずれか、または両方で天然抗原を発現する酵母を含む。この組成物は、アジュバントとしての投与など、様々な目的に有用であり得る。別の態様では、組成物は、この表面もしくは内部のいずれか、または両方で異種抗原を発現する酵母を含む。この組成物は、免疫調節を必要としている個体における免疫調節およびワクチン開発など、様々な目的に有用であり得る。
【００４２】
これらの組成物はまた、医薬的に許容可能な賦形剤および／または担体を含むこともできる。医薬的に許容可能な担体には、滅菌水性または非水性の溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれ得る。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水性溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル油または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補液、電解質補液（リンゲルデキストロースを基にしたものなど）などが含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような防腐剤および他の添加剤も存在することができる。医薬的に許容可能な賦形剤を有する、中性ｐＨ条件下で増殖された酵母を含む組成物製剤は、一般に当業者には日常的である。
【００４３】
本発明のキット
本発明は、中性ｐＨ条件下で酵母を培養するための培地成分を含むキットを企図する。１つの態様では、キットは、培地を少なくとも５．５のｐＨにするのに使用できるコハク酸塩またはコハク酸を含有する培地成分、およびこれを使用するための一連の指示書を含む。別の態様では、キットはさらに追加成分としてソイトンを含む。別の態様では、キットはさらに酵母細胞を含む。酵母細胞は、本明細書に開示されたプロトコルにより培養を開始するため凍結することができる。別の態様では、酵母細胞は、キットの一部として包装するため凍結される前に、本明細書に開示された方法で既に培養されていてよい。別の態様では、酵母細胞は凍結乾燥することができ、場合によりキットに含めることができる。別の態様では、キットは、本明細書に開示された方法により調製された、複製可能である酵母を含む。
【００４４】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を説明するのに提供される。これらは、どんな形であれ本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
酵母培地処方
様々なタイプの培地を、酵母を培養するのに使用およびｐＨレベルが中性になるように調整することができる。使用することができる培地の例を以下に提供するが、本発明は、これらの培地成分または培地プロトコルの使用に限定されないことを理解されたい。
【００４６】
１つの標準的な培地処方は、以下のようなＵＬＤＭ培地である。
【００４７】
【化１】
別の標準的な培地処方は、以下のようなＵＬ２培地である。
【００４８】
【化２】
別の標準的な培地処方は、以下のようなＵＬ３培地である。
【００４９】
【化３】
別の標準的な培地処方は、以下のようなＵＬ４培地である。
【００５０】
【化４】
別の標準的な培地処方は、以下のようなＵＤＭ培地である。
【００５１】
【化５】
【００５２】
【化６】
別の標準的な培地処方は、以下のようなＵ２培地である。
【００５３】
【化７】
別の標準的な培地処方は、以下のようなＵ３培地である。
【００５４】
【化８】
【００５５】
【化９】
別の標準的な培地処方は、以下のようなＵ４培地である。
【００５６】
【化１０】
標準的な培地処方は、追加のアミノ酸を補充することができる。以下のプロトコルは例示的な培地処方である。
【００５７】
ＵＬＤＭａａ培地処方は以下の通りである。
【００５８】
【化１１】
【００５９】
【化１２】
ＵＬ２ａａ培地処方は以下の通りである。
【００６０】
【化１３】
ＵＬ３ａａ培地処方は以下の通りである。
【００６１】
【化１４】
ＵＤＭａａ培地処方は以下の通りである。
【００６２】
【化１５】
【００６３】
【化１６】
Ｕ２ａａ培地処方は以下の通りである。
【００６４】
【化１７】
Ｕ３ａａ培地処方は以下の通りである。
【００６５】
【化１８】
【００６６】
【化１９】
別の態様では、コハク酸塩含有緩衝培地を使用する。コハク酸塩含有酵母培地は以下である。ｐＨ６．９に調整したＵＤＭＳ培地処方は以下の通りである。
【００６７】
【化２０】
ｐＨ６．９に調整したＵ２Ｓ培地処方は以下の通りである。
【００６８】
【化２１】
【００６９】
【化２２】
ｐＨ６．９に調整したＵ３Ｓ培地処方は以下の通りである。
【００７０】
【化２３】
ｐＨ６．９に調整したＵ４Ｓ培地処方は以下の通りである。
【００７１】
【化２４】
（実施例２）
細胞増殖および培養ｐＨに対する培地ｐＨの効果
図１に示した通り、細胞増殖および培養ｐＨに対する培地ｐＨの効果を試験した。細胞は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．２またはリン酸緩衝液、ｐＨ７．２を補充したＵ２培地で増殖させた。対照培養物は、培地に緩衝液を添加せずにＵ２培地で増殖させた。対照として特筆される条件（培地ｐＨ５．５と同じ）または培地ｐＨ７．２としては、これらの対照物の増殖培地は、酵母を摂取する前に塩基（ＮａＯＨ）によりｐＨ５．５またはｐＨ７．２のいずれかに調整した。培養物を３０℃でインキュベートし、細胞数および培養ｐＨを最大１６時間モニターした。結果は、様々なｐＨレベルでの緩衝液が、酵母の増殖速度に影響したことを示す。図１に示した通り、倍加時間は２．８〜４．５時間の範囲であった。非緩衝ｐＨ７培地におけるｐＨは、２．０ＹＵ／ｍＬで約５．５であった。これは、ｐＨを中性レベルに保つためにいくつかの形態の緩衝剤が必要であることを示すものである。
【００７２】
（実施例３）
細胞壁厚に対する培地ｐＨの効果
培地ｐＨの効果を試験して、細胞壁厚に何らかの効果を有するかどうかを判定した。増殖培地および条件は実施例１と同じであった。培養物は、０．５〜２．０ＹＵ／ｍＬの範囲の密度で回収した。図２の凡例では、培養物を回収した密度がダッシュマークの後ろの数字で記されている。例えば、対照−０．６とは、細胞をｐＨ５．５で非緩衝培地で増殖し、次いで、細胞が０．６ＹＵ／ｍＬ密度に達したときに回収したことを意味する。フラスコ１〜３の条件（例えば１〜０．５、２〜２．０または３〜１．０）は、図の下に記載されており、回収時の細胞密度は凡例に記されている。使用した溶解アッセイプロトコルは以下の通りであった：（１）洗浄した細胞１０ＹＵを１ｍＬのＴｒｉｓ−ＢＭＥで再懸濁した；（２）「時間０」の試料を採取し、６００ｎｍでＯＤを測定する；（３）グルカナーゼ２０Ｕを添加する；（４）３０℃で回転させる；（５）１０分ごとに、試料を採取しＯＤを測定する。
【００７３】
図２に観察され得る通り、対照培養（培地ｐＨ約５．５）は、細胞密度が増加するにつれて溶解効率が低下することを示す。フラスコ２は、緩衝剤なしによるｐＨ７．２での培地の効果を示す。フラスコ２は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液によるｐＨ７．２での培地の効果を示す。フラスコ３は、リン酸緩衝液によるｐＨ７．２での培地の効果を示す。
【００７４】
故に、結果は、約ｐＨ５．５以上で緩衝した酵母の増殖が、すべての回収密度で、細胞壁を柔軟に、および細胞壁消化酵素による消化（例えば、リチカーゼ／グルカナーゼによるスフェロプラストの作製）に対し感受性に保つことを示している。反対に、多くの酵母研究所で一般に使用される標準工程では、感受性は回収密度＞０．５ＹＵ／ｍＬで失われた。比較を容易にするため、標準的な増殖培地による０．５ＹＵ／ｍＬが、任意の密度での中性ｐＨ増殖との比較に多く使用される。
【００７５】
（実施例４）
７５−１５細胞の構築
ＴＫ７５−１５で表される融合タンパク質は、ＴＥＦ２プロモーターに誘導されるＡｇａ２配列を用いて細胞壁にインフルエンザＨＡタンパク質を発現するように設計した。このコンストラクトでは、Ａｇａ２配列にＨＡ配列Ｃ末端が対応するタンパク質を構築した。このタンパク質は、Ａｇａ１ｐ（この場合では、ＣＵＰ１プロモーターに誘導される）も発現する細胞で発現した場合、酵母細胞の外側の細胞壁、およびサイトゾルに局在する。インフルエンザＨＡ抗原を含む融合タンパク質は、ＮからＣ末端のフレームで融合される以下の配列要素を有する単一のポリペプチドである（融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書に配列番号１で表される）：１）天然の１８アミノ酸ＥＲ標的シグナル配列（配列番号１の位置１〜１８）を含む、完全長のＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２タンパク質配列（配列番号１の位置１〜８７）；２）ＨＡ本体からＡｇａ２を隔てるスペーサー（位置８８および８９）；３）シグナル配列（配列番号１の位置９０〜６００）を欠く、およびＨＡの３６Ｃ末端残基を欠き、それによってＣ末端膜アンカーおよび細胞質尾部が排除された、インフルエンザＨＡタンパク質；４）ヒスチジンタグからＨＡタンパク質本体を隔てるトリグリシンスペーサー（配列番号１の位置６０１〜６０３）；および５）Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１の位置６０４〜６０９）。配列番号１の融合タンパク質をコードする核酸配列は、本明細書に配列番号２で表される。この融合タンパク質およびこれを発現するタルモゲン（Ｔａｒｍｏｇｅｎ）は、７５−１５と呼ぶことができる。
【００７６】
使用したタンパク質配列は次の通りである（配列番号１）
【００７７】
【化２５】
対応する核酸配列は次の通りである（配列番号２）
【００７８】
【化２６】
【００７９】
【化２７】
（実施例５）
７５−１５細胞増殖および培養ｐＨに対する異なる緩衝剤（ｐＨ６．５培地）の効果
細胞増殖に対する効果および培養ｐＨに対する効果を判定するため、異なる緩衝剤を７５−１５細胞で試験した。これらの緩衝剤を図３に示す。これらの緩衝剤には、コハク酸塩、クエン酸塩、および炭酸塩が含まれる。いずれの緩衝剤も沈殿形成をもたらすことはなかった。使用した緩衝剤のすべてのが、標準的な増殖培地に十分に溶解した。すべての試験培養物のｐＨを、酵母培養物の摂取前にｐＨ６．５に調整した。培養物を、次いで、振盪フラスコで３０℃で最大１５時間増殖させた。細胞を炭酸塩緩衝剤で増殖させた場合には、最少の増殖が見られた、または増殖は見られなかった。図３に見られる通り、異なる緩衝剤の使用は、増殖速度に影響した。増殖は、中性ｐＨ（少なくともｐＨ５．５）で速かった。特に、コハク酸塩緩衝剤を有する培地は、倍加時間に関して最良であった（約２．５時間の倍加時間）。反対に、酵母細胞をｐＨ５．５未満（より酸性条件）で増殖させた場合、倍加時間は約３．５時間で減速した。クエン酸塩は同様の倍加時間であった（約３．５時間）。０．０５Ｍでのクエン酸塩は、０．０２Ｍでのコハク酸塩より緩衝能力が増大した。これらの実験では、発現誘導のため培養物すべてに０．３５ｍＭの銅を入れた。
【００８０】
（実施例６）
細胞溶解に対する様々な緩衝剤の効果
図４は、コハク酸塩およびクエン酸塩など、様々な緩衝剤で行った実験結果を示す。培養物は、実施例１に記載された通りに増殖させた。グルカナーゼにより溶解される酵母の能力を、上記の溶解アッセイプロトコルを用いて測定した。対照培養（培地ｐＨ約５．２）での酵母は、細胞密度が増加するにつれ（図２に関する上述の通り、ダッシュの後ろの数字で示される細胞密度）、グルカナーゼによる溶解効率の低下を示した。しかし、コハク酸塩およびクエン酸塩緩衝培地のいずれについても、回収時の細胞密度は、上述した溶解アッセイにおいて細胞壁消化酵素により溶解される酵母の能力に何ら効果を与えなかった。コハク酸塩およびクエン酸塩緩衝培地での酵母は、増加する細胞密度（例えば、０．５ＹＵ／ｍｌ、０．９ＹＵ／ｍｌおよび２．１または２．２ＹＵ／ｍｌ）での溶解に依然として感受性であった。
【００８１】
（実施例７）
培地処方試験
酵母培地に添加される他の剤の寄与を試験し、結果を５に示す。Ｕ２またはＵ４は、基本的な培地組成物を指す。タンパク質発現は、銅誘導性ＣＵＰＩプロモーターの調節下にあるため、ＨＡタンパク質を発現するのに誘導される酵母細胞用の培地に、０．３５ｍＭの銅を添加する。ソイトン（図５のＳｏｙ）は、大豆のペプシン消化により得られる栄養素の市販の複合体混合物である。ソイトンの添加は、最速の増殖および最高収量（３０ＹＵ／ｍＬ）をもたらした。０．０８Ｍのコハク酸の使用は、より良好な緩衝能力を示した。細胞は、３０℃で、ｘ軸に示した時間の間増殖させた。
【００８２】
図６は、細胞の生存の判定にＧｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを使用した培地処方試験の結果を示す。銅誘導性Ａｇａ２−ＨＡを発現する酵母株７５−１５を、振盪フラスコで３０℃で増殖させた。銅を培養物に添加した場合、Ａｇａ２−ＨＡタンパク質が発現され、細胞表面に現れる。該タンパク質は、表面にＨＡを示す酵母細胞の数を表している（％陽性シグナル）。細胞の生存は、他の方法（例えば、血球計またはトリパンブルー）を用いて判定することもできる。最も高いシグナルは、（細胞が増殖速度を減速する傾向にある細胞密度を超える）細胞密度８ＹＵ／ｍＬですら、Ｕ２で観察された。ソイトンを用いた培養物は、高密度がタンパク質の減少を示し、細胞密度の明らかな効果を示した。Ｕ４の使用は、全般に低いシグナルをもたらした。細胞壁、および表面発現タンパク質を検出するＨＡ特異的抗体の能力にｐＨが与える効果から、これらの結果も検出の容易性を証明するものである。
【００８３】
異なるソイトン濃度を用いて、追加の実験を行った。図７はこの結果を示す。０．５ｇ／ｌおよび１ｇ／ｌソイトンの間に、増殖またはｐＨの差は観察されなかった。Ｕ４−ＹＮＢ培地ではＵ２培地よりも速い増殖が観察された。
【００８４】
（実施例８）
酵母が中性ｐＨ条件で増殖される場合のＨＡ到達性の差
検出用抗体などの他の作用物質からの相互作用に対する特定抗原の到達性を、様々な培地ｐＨレベルにより評価した。図８は、酵母細胞をｐＨ５未満で増殖させた場合、および同様に酵母を６を超えるｐＨで増殖させた場合に、インタクトな酵母から遊離可能なインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）の免疫ブロットアッセイを示す。中性ｐＨで増殖させた酵母は、表面に提示されたＨＡを、ＨＡを発現する細胞数および細胞あたりのＨＡ量のいずれにおいても、フローサイトメトリー染色で判定される抗体検出によりずっと利用しやすいものにする。さらに、中性ｐＨで増殖させた酵母は、ジチオスレイトール（ジスルフィド還元剤）による処理により、ジスルフィド結合したＨＡを遊離する操作がより簡単であった。
【００８５】
（実施例９）
サイトカイン産生に対する中性ｐＨの効果
ｐＨが、ｐＨ５．５より上であった、またはｐＨ５．５より上で維持されなかった培地で増殖させたＹＶＥＣ酵母（異種抗原を発現していない）を添加した、樹状細胞（ＤＣ）を用いて、中性ｐＨで酵母を培養することがサイトカイン産生に与える効果を実験した。マウス骨髄由来樹状細胞に、ＤＣあたり１０酵母を、ＲＰＭ１培地で４８時間、３７℃で一緒にインキュベートして添加した。次いで、上清を、分泌されたサイトカインについて分析した。図９はこれらの実験結果を示す。下のパネルは、中性ｐＨ（すなわち、少なくとも５．５以上）で増殖される酵母で負荷された樹状細胞からのＩＦＮ−ガンマ分泌は著しく増加すること、酵母がｐＨを５．５未満に低下させた培地で培養される場合には、著しい増加は見られないことを示す。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この特許出願は、２００８年２月２日に出願された米国第６０／８９９，２８１号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、酵母培養物の収率および特定の特徴を改善するために中性ｐＨで酵母培養物を増殖させる方法に関する。その方法はまた、これらの方法により生成された組成物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ワクチンは、医療産業が利用できる最も費用効果の高い手段の１つである。しかし、病原体による感染、癌、遺伝子欠損およびその他免疫系障害による疾患を含む、様々な疾患に対する安全で効果的なワクチンおよびアジュバントの開発が急務であることに変わりはない。ワクチンに関する出版物、例えば、非特許文献１は、経口投与することができ、好ましくは人生の初期に数回のみ投与する必要がある、安全で耐熱性のワクチンが依然として必要であると述べている。また、複数の疾患から個人を保護することができる混合ワクチン、およびアジュバントを必要とせず、粘膜免疫を誘発することができるワクチンも好ましい。これまで、これらの基準のすべてを満たすワクチンは、あったとしてもほとんどない。
【０００４】
組換えＤＮＡ技術により開発が可能になったサブユニットワクチンは、限られた免疫原性のみを示すためこれまで期待はずれであった。１つの例は、いくつかのＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）サブユニットワクチンの最近の臨床試験で、ワクチンの有効性が限られるだけでなく、免疫化された個人が後にＨＩＶに曝露した場合、いくつかの場合で疾患進行の加速を示したため、臨床試験は中止された。例えば、非特許文献２および非特許文献３を参照されたい。サブユニットワクチン、ならびに死滅ウイルスワクチンおよび組換え生ウイルスワクチンの１つの欠点は、これらが強力な体液性免疫応答を刺激するように見える一方で、防御細胞性免疫を誘発しない点である。１９９４年の国際エイズ会議での主な結論は、これまで臨床でのワクチンが不足している、ＨＩＶ感染性を予防または低減する細胞障害性Ｔ細胞媒介応答が依然として必要である、というものであった。さらに、これまで試験されたＨＩＶワクチンは、一次ＨＩＶ感染が生じる粘膜表面での免疫を誘発しなかった。
【０００５】
さらに、米国で使用が認可された唯一のアジュバントは、アルミニウム塩の水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムであり、どちらも細胞性免疫を刺激しない。さらに、アルミニウム塩製剤は、凍結または凍結乾燥することができず、このようなアジュバントはすべての抗原で効果があるわけではない。
【０００６】
酵母細胞は、上述したＨＩＶワクチン試験で試験されたもののいくつかを含む、サブユニットタンパク質ワクチンの生成に使用されてきた。酵母はまた、非特異的方法での免疫応答のプライミング（すなわち、食作用ならびに補体およびインターフェロン産生の刺激）を試みるため免疫化前に動物に給餌された。結果は曖昧であり、このようなプロトコルが防御細胞性免疫をもたらすことはなかった。例えば、非特許文献４および非特許文献５を参照されたい。
【０００７】
ワクチンの他、多くの遺伝子および薬物療法は、最大の利点の可能性を確保するのに効率的および特異的な送達ビヒクルを必要とする。適切な送達ビヒクルがないことは、遺伝子療法の適用に対する大きな障害であり、多くの薬剤の治療可能性を制限するものである。例えば、最近の報告は、遺伝子療法適用のため現在臨床で試験されているアデノウイルスベクターが、望ましくない免疫および炎症反応を刺激すること、ならびに所望の方法で組み込まれているように見えないことを指摘している。例えば、非特許文献６およびこの中に引用された参考文献を参照されたい。
【０００８】
酵母ワクチン技術に対する別の大きなハードルは、製造工程である。酵母細胞は長年研究所で培養されており、標準培養条件が確立されている。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１９４巻、Ｇｕｔｈｒｉｅら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）を参照されたい。標準操作手順は、一般に、ｐＨレベルで測定して酸性である培地で酵母を培養することを含む。しかし、酸性培地での酵母の培養は、免疫調節またはワクチン作製のため酵母を抗原提示ビヒクルとして使用するのに最適ではない、様々な生物学的特性を示す酵母をもたらす可能性がある。故に、抗原提示ビヒクルであることにより適した特性を酵母が示すように、酵母を増殖する方法が必要である。本明細書に開示された本発明は、酵母は酸性培地で増殖することができる一方、酸性培地で増殖される場合に酵母が示す生物学的特性は、酵母が中性ｐＨレベルにある培地で増殖される場合ほど望ましくないという発見に一部基づいている。
【０００９】
本明細書に引用されたすべての特許、特許出願、および出版物の開示は、全目的でこの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４年）２６５、１４０１〜１４０４頁
【非特許文献２】Ｃｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４年）２６４：１８３９頁
【非特許文献３】Ｃｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４年）２６４：６６０頁
【非特許文献４】Ｆａｔｔａｌ−Ｇｅｒｍａｎら、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ．（１９９２年）７７：１１５〜１２０頁
【非特許文献５】Ｂｉｚｚｉｎｉら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９０年）２：１５５〜１６７頁
【非特許文献６】Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４年）５：１２１７〜１２２９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、培地で酵母を培養することにより酵母を増殖させるための方法であって、培地が酵母培養期間の少なくとも５０％にわたって５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される方法を提供する。本発明はまた、培地で酵母を培養することにより酵母を増殖させるための方法であって、培地が酵母培養期間の少なくとも５０％にわたって５．５〜８の間のｐＨレベルで維持され、酵母密度が少なくとも０．５酵母単位／ｍＬである方法も提供する。
【００１２】
他の態様では、本発明は、少なくとも５．５のｐＨレベルを有する培地で酵母を培養することによる酵母の増殖を提供する。本発明はまた、培地で酵母を培養して酵母を増殖させるための方法であって、培地が５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される方法を提供する。本発明の１つの態様では、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。本発明の態様では、培地はコハク酸塩またはコハク酸で緩衝されるか、または培地はさらにソイトン（ｓｏｙｔｏｎｅ）を含有することができる。本発明の他の態様では、酵母は免疫応答を誘発する。本発明の他の態様では、酵母は抗原を発現し、いくつかの場合では抗原は異種抗原である。いくつかの場合では、異種抗原は酵母表面で発現される。
【００１３】
本発明は、上記の任意の方法および関連する態様により培養された酵母を含む組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、抗原を発現する発現系を含有する酵母を培地で培養することにより抗原発現酵母を産生するための方法であって、培地のｐＨが少なくとも５．５である方法を提供する。本発明はまた、抗原を発現する発現系を含有する酵母を培養することにより抗原発現酵母を産生するための方法であって、培地が５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される方法も提供する。１つの態様では、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。他の態様では、培地はコハク酸塩もしくはコハク酸で緩衝されるか、または培地はさらにソイトンを含有することができる。本発明の他の態様では、酵母は免疫応答を誘発する。本発明の他の態様では、酵母は抗原を発現し、いくつかの場合では抗原は異種抗原である。いくつかの場合では、異種抗原は酵母表面で発現される。いくつかの態様では、酵母が５．５未満のｐＨで増殖される場合より容易に異種抗原が他の細胞または作用物質との相互作用に到達可能である。
【００１５】
本発明はまた、上記に開示された方法により培養された酵母を含む組成物も提供する。
【００１６】
本発明はまた、抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより個体におけるＴｈ１型応答を誘導する方法であって、酵母が、少なくとも５．５のｐＨレベルを有する培地で培養されている方法も提供する。
【００１７】
本発明はまた、抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより個体におけるＴｈ１型応答を誘導する方法であって、酵母が、５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地で培養されている方法も提供する。１つの態様では、組成物は、中性ｐＨで培養、維持または回収された酵母で負荷された樹状細胞を含む。別の態様では、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。他の態様では、培地はコハク酸塩もしくはコハク酸で緩衝されるか、または培地はさらにソイトンを含有することができる。本発明の他の態様では、酵母は免疫応答を誘発する。本発明の他の態様では、酵母は抗原を発現し、いくつかの場合では抗原は異種抗原である。いくつかの場合では、異種抗原は酵母表面で発現される。１つの態様では、Ｔｈ１型応答はインターフェロン−ガンマ産生である。別の態様では、Ｔｈ１型応答はＩＬ−１２産生である。
【００１８】
本発明はまた、ｐＨが少なくとも５．５である培地、および酵母を培養するための培地の使用に関する指示書を含む酵母を培養するためのキットも提供する。本発明はまた、５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地、および酵母を培養するための培地の使用に関する指示書を含む酵母を培養するためのキットも提供する。他の態様では、培地はコハク酸塩もしくはコハク酸で緩衝されるか、または培地はさらにソイトンを含有することができる。１つの態様では、キットはさらに酵母を含む。いくつかの場合では、酵母は凍結または凍結乾燥されている。いくつかの場合では、酵母は、少なくともｐＨ５．５の培地で培養されるか、または５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地で培養されている。他の場合では、酵母は複製可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】細胞増殖および培養ｐＨレベルに対する培地ｐＨレベルの効果を示す図である。
【図２】細胞壁厚に対する培地ｐＨレベルの効果を示す図である。
【図３】約６．５のｐＨで異なる緩衝剤を試験した結果を示す図である。７５−１５細胞の増殖および培養ｐＨに対する効果を示す。
【図４】グルカナーゼによる溶解で測定した、細胞壁厚に対する様々な緩衝剤の効果を示す図である。培地は、コハク酸塩またはクエン酸塩のいずれかを用いて緩衝され、培地を約６．５のｐＨレベルに緩衝した。
【図５】増殖およびｐＨレベルに対する培地処方の効果について、様々な添加剤を試験した培地処方試験の結果を示す図である。
【図６】培地処方試験の一部である酵母細胞生存の結果を示す図である。酵母細胞表面のＨＡの表面発現を、フローサイトメトリーにより測定した。
【図７】様々な添加剤を試験した、細胞増殖およびｐＨプロフィールに関する培地処方試験の結果を示す図である。
【図８】インタクトな酵母から遊離可能な血球凝集素（ＨＡ）の免疫ブロットアッセイの結果を示す図である。酵母が中性で増殖する場合対酵母がより低いｐＨ条件で増殖する場合のＨＡ到達性の差を示す。免疫ブロットは、ＹＥＸおよびＧＩ−８１０３からのＤＴＴ溶出液のウェスタンブロットである。
【図９】酵母細胞を添加した樹状細胞によるサイトカイン分泌に対する、中性および低いｐＨレベルでの酵母細胞の培養効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書に開示された本発明は、中性ｐＨ、少なくともｐＨ５．５、またはｐＨ５．５〜８の間、またはｐＨ６〜８の間で酵母を増殖することが、より望ましい生物学的特徴を有する酵母をもたらすという発見に基づく。以下に詳述されるこれらの望ましい特徴のいくつかは、酵母細胞壁を柔軟に、および細胞壁消化酵素による消化対し感受性に保ちながら、増加した細胞密度で十分に増殖する能力、ならびに他の細胞および／または作用物質に抗原をより接近できるようにする方法での抗原の提示を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
一般的技法
本発明の実施は、特に指示のない限り、当業者によく知られた、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来技術を使用する。このような技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１９４巻、Ｇｕｔｈｒｉｅら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）；Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｙｅａｓｔｓ、Ｓｋｉｎｎｅｒら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８０年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ ｍａｎｕａｌ、Ｒｏｓｅら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）；Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ： Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｇｌｅら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９７年）；Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ： Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｊｏｎｅｓら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３年）；Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ： Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ａｎｄ Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ、Ｂｒｏａｃｈら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２年）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）、（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」として本明細書に一緒に言及されている）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年、２００１年までの補遺を含む）；ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９年）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（「ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ」として本明細書に一緒に言及されている）Ｂｅａｕｃａｇｅら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００年）およびＶａｃｃｉｎｅｓ、Ｓ． ＰｌｏｔｋｉｎおよびＷ． Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ編、第３版（１９９９年）などの文献で十分に説明されている。
【００２２】
定義
本明細書では、用語「中性ｐＨ」の一般的使用は、少なくとも５．５のｐＨレベルを指す。中性ｐＨの範囲は、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ８の間、好ましくは約ｐＨ６〜約８の間であり得る。当業者は、ｐＨ計で測定した場合、小さな変動（例えば、１０分の１または１００分の１）が生じ得、そのため、ｐＨレベルを決定する場合はいつでもこのことを考慮すべきであることを理解されよう。
【００２３】
本明細書では、「抗原」の一般的使用は、適応免疫系により認識され得る任意の分子を指す。１つの態様では、抗原は抗体に特異的に結合する分子である。分子は、タンパク質が自然発生もしくは合成的に得られたタンパク質（ペプチド、部分タンパク質、完全長タンパク質）のいずれかの部分、または細胞組成物（全細胞、細胞溶解物または破壊細胞）の一部、生物（全生物、溶解または破壊細胞）の一部、または糖質もしくはこの部分であり得る。抗原は、単独でまたは（破砕した酵母細胞のような）アジュバントなど別の化合物の使用により、抗原特異的体液性免疫応答を誘発することができる。別の態様では、抗原は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）との関連においてＴリンパ球（すなわちＴ細胞）により認識される。別の態様では、抗原は、抗原を投与した動物の細胞および組織内で遭遇する同一または類似の抗原に対し、寛容原（ｔｏｌｅｒａｇｅｎ）として作用することができる。
【００２４】
本発明の１つの態様では、免疫応答刺激を指す場合、「抗原」は「免疫原」であり得る。免疫原は、適応免疫応答、例えば、抗体産生誘導を誘発することができる分子である。免疫原は、いくつかの場合では、抗原へ将来曝露した際に該抗原を認識する抗体を産生するであろう記憶細胞を生成することができる。この分野のすべての当業者によく知られている通り、免疫原は、Ｔリンパ球によっても認識されることができるが、Ｔリンパ球に認識される免疫原の形態は、抗体が認識する免疫原の形態とは異なる。
【００２５】
酵母の培養方法
本発明は、所望の抗原の高発現、細胞壁の柔軟性、および抗原の提示など、望ましい特徴をもたらす酵母の培養方法も提供する。
【００２６】
これらの方法は、すべての酵母に対し幅広く適用できる。酵母は、３つのクラス、すなわち、Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ、ＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓおよびＦｕｎｇｉ Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉの１つに属する単細胞微生物である。病原性酵母株、またはこの非病原性変異体を本発明により使用することができるが、１つの態様では、非病原性酵母株が使用される。非病原性酵母株の例には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｒｎｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、ＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＹａｒｒｏｗｉａが含まれる。１つの態様では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが使用される。さらに他の態様では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ ｖａｒ． ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、および、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが使用される。本発明は上記の種リストに限定されず、当業者は本明細書の教示をいずれのタイプの酵母にも適用できることが理解される。別の態様では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が本発明の方法を実施するのに使用される。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、分子操作の容易さ、および食品添加物としての使用に「一般に安全と認められる」すなわち「ＧＲＡＳ」である（ＧＲＡＳ、ＦＤＡ提案規則６２ＦＲ１８９３８、１９９７年、４月１７日）ため好ましい。
【００２７】
ｐＨレベルは、酵母の培養に重要である。当業者は、培養工程には、酵母培養の開始だけでなく、同様に培養の維持も含まれることを理解するであろう。酵母培養は、いずれのｐＨレベルでも開始することができるが、酵母培地は、時間とともにより酸性（すなわち、ｐＨ低下）になる傾向があるため、培養工程中はｐＨレベルをモニターすることを注意しなければならない。
【００２８】
本発明のいくつかの態様では、酵母は、少なくとも５．５のｐＨレベルの培地で増殖される。他の態様では、酵母は約５．５のｐＨレベルで増殖される。他の態様では、酵母は５．５〜８の間のｐＨレベルで増殖される。いくつかの場合では、酵母培養は５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される。他の態様では、酵母は６〜８の間のｐＨレベルで増殖される。いくつかの場合では、酵母培養は６〜８の間のｐＨレベルで維持される。他の態様では、酵母は６．１〜８．１の間のｐＨレベルで増殖および／または維持される。他の態様では、酵母は６．２〜８．２の間のｐＨレベルで増殖および／または維持される。他の態様では、酵母は６．３〜８．３の間のｐＨレベルで増殖および／または維持される。他の態様では、酵母は６．４〜８．４の間のｐＨレベルで増殖および／または維持される。他の態様では、酵母は５．５〜８．５の間のｐＨレベルで増殖および／または維持される。他の態様では、酵母は６．５〜８．５の間のｐＨレベルで増殖および／または維持される。他の態様では、酵母は約５．６、５．７、５．８または５．９のｐＨレベルで増殖される。別の態様では、酵母は約６のｐＨレベルで増殖される。別の態様では、酵母は約６．５のｐＨレベルで増殖される。他の態様では、酵母は約６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９または７．０のｐＨレベルで増殖される。他の態様では、酵母は約７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０のｐＨレベルで増殖される。他の態様では、酵母は８より上のレベルで増殖される。
【００２９】
１つの態様では、酵母は、培地のｐＨレベルがｐＨ５．５より下に下がらないように培養される。いくつかの場合では、ｐＨ５．５を下回る低下は５分を超えない。他の場合では、ｐＨ５．５を下回る低下は１０分、好ましくは２０、３０、４０、５０または６０分を超えない。他の場合では、ｐＨ５．５を下回る低下は１時間を超えない。別の態様では、酵母は、培地のｐＨレベルが５．０より下に下がらないように培養される。いくつかの場合では、ｐＨ５．０を下回る低下は５分を超えない。他の場合では、ｐＨ５．０を下回る低下は１０分、好ましくは２０、３０、４０、５０または６０分を超えない。他の場合では、ｐＨ５．０を下回る低下は１時間を超えない。このため、酵母が少なくともｐＨ５．５以上の培地で増殖される時間が長いほど、以下に記載された望ましい特徴を有する酵母を得ることに関し、結果は良好となるであろう。
【００３０】
１つの態様では、酵母細胞を増殖させるための中性ｐＨ方法の使用は、酵母培養期間の少なくとも５０％にわたって、酵母細胞が中性ｐＨで増殖されることを意味する。酵母培養期間の少なくとも６０％、より好ましくは酵母培養期間の少なくとも７０％、より好ましくは酵母培養期間の少なくとも８０％、および最も好ましくは酵母培養期間の少なくとも９０％にわたって、酵母が中性ｐＨで増殖されることがより好ましい。
【００３１】
別の態様では、中性ｐＨでの酵母の増殖には、中性ｐＨで少なくとも５分間、好ましくは中性ｐＨで少なくとも１５分間、より好ましくは中性ｐＨで少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも２時間、さらにより好ましくは、少なくとも３時間以上酵母細胞を培養することが含まれる。
【００３２】
先述の通り、酵母は増殖および複製するため、細胞密度が増大し、培地の酸性レベルが上昇する。このため、酵母密度が増加しているときに、酵母は少なくとも５．５のｐＨレベルで培養および／または少なくともｐＨ５．５で維持されることが推奨される。１つの態様では、酵母密度が０．５酵母単位（ＹＵ）／ｍｌ以上であるとき、酵母はｐＨ５．５〜８の間で増殖および／または維持される。他の態様では、酵母密度が少なくとも０．６ＹＵ／ｍｌ以上、好ましくは０．７ＹＵ／ｍｌ以上、０．８ＹＵ／ｍｌ以上、０．９ＹＵ／ｍｌ以上、または１ＹＵ／ｍｌ以上である場合、酵母はｐＨ５．５〜８の間で増殖および／または維持される。別の態様では、酵母密度が０．５ＹＵ／ｍｌ以上である場合、酵母はｐＨ６〜８の間で増殖および／または維持される。他の態様では、酵母密度が少なくとも０．６ＹＵ／ｍｌ以上、好ましくは０．７ＹＵ／ｍｌ以上、０．８ＹＵ／ｍｌ以上、０．９ＹＵ／ｍｌ以上、または１ＹＵ／ｍｌ以上である場合、酵母はｐＨ６〜８の間で増殖および／または維持される。
【００３３】
いくつかの態様では、酵母培養が中性ｐＨレベルにあるのは、回収時であることが好ましい。いくつかの場合では、回収時の酵母培養は６〜８の間のｐＨレベルにあるであろう。他の場合では、回収時の酵母培養は５．５〜８の間のｐＨレベルにあるであろう。
【００３４】
培地は、任意の手段により少なくとも５．５のｐＨレベルにすることができる。１つの態様では、コハク酸（および任意の関連形態、例えば、アニオンコハク酸塩）が培地を緩衝するのに使用される。実施例にさらに詳述されている通り、培地を少なくともｐＨ５．５に緩衝するためのコハク酸塩の使用は、酵母が約２〜２時間半の倍加時間を有することが可能になる。コハク酸塩は、市販の供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）から入手できる。他の態様では、クエン酸塩は、培地を少なくともｐＨ５．５にするのに使用することができる。当業者は、酵母を生存させ続けながら、培地を少なくともｐＨ５．５にするのに使用することができる他の緩衝剤を容易に決定することができるであろう。溶液を安定したｐＨレベルに保つ緩衝剤の概念は、当技術分野でよく知られており、このため、本明細書では詳細に論じない。本発明により増殖された酵母は、医薬製剤（例えば、ワクチン）に使用されるならば、ＧＭＰグレードの材料が使用されることが推奨される。
【００３５】
さらに、培地を改善するのに他の補助剤を培地に添加することができる。培地に添加するのに特に役立つ他の補助剤にはソイトンが含まれる。ソイトンは、市販の供給源（例えば、ＢＤ Ｄｉｆｃｏ社）から容易に入手できる。実施例および図面に示される通り、培地へのソイトンの添加は、中性ｐＨでの増殖のため密度の増加を支持する。さらに、ソイトンの添加は、目的とする抗原、インフルエンザウイルスの血球凝集素（ＨＡ）の発現を支持する。
【００３６】
他の添加剤は、異種遺伝子の発現誘導など、他の目的で酵母培養に添加することができる。いくつかの態様では、血球凝集素発現の発現を誘導するのに銅が使用される。しかし、銅の使用は、中性ｐＨで増殖される酵母で発現される誘導性遺伝子の調節には、中性ｐＨでは理想的ではないため、銅以外の添加剤が推奨される。
【００３７】
酵母培養に対する中性ｐＨの効果
酵母の培養における中性ｐＨの使用は、免疫調節および／または免疫応答誘発のためのビヒクルとして酵母を使用するのに望ましい特徴である、いくつかの生物学的効果を促進する。１つの態様では、中性ｐＨでの酵母の培養は、倍加時間に何らのマイナス効果を与えることなく（例えば、倍加時間の減速）、酵母の良好な増殖を可能にする。酵母は、細胞壁の柔軟性を失うことなく高密度まで増殖し続けることができる。
【００３８】
別の態様では、少なくとも５．５のｐＨ、またはｐＨ５．５〜８の間などの中性ｐＨの使用は、柔軟な細胞壁を有する酵母および／またはすべての回収密度で細胞壁消化酵素（例えば、グルカナーゼ）に感受性を有する酵母の産生を可能にする。このため、本発明は、従来のアッセイで測定した細胞壁の柔軟性（例えば、グルカナーゼに対する感受性）を有する酵母の方法および組成物を提供する。事前実験は、酵母が、０．５ＹＵ（酵母単位）／ｍｌの回収密度で、細胞壁消化酵素による消化に対する感受性を喪失することを立証した。このため、１つの利点は、０．５ＹＵ／ｍｌでの標準的な増殖培地で培養された酵母により行われる比較を、任意の密度での中性ｐＨ増殖との比較に使用できることである。柔軟な細胞壁を有する酵母は、酵母を宿す細胞におけるサイトカイン（例えば、ＩＮＦ−ガンマ）分泌を促進するなど、独特の免疫応答を示すことができるため、この特性は望ましい。当業者が中性ｐＨの方法を使用すると考えられる別の理由は、細胞壁に位置する抗原への到達性を高められる点である。これは、フローサイトメトリーなどの標準技術で測定した、発現タンパク質の免疫原性の増大および抗体検出に有用である。
【００３９】
中性ｐＨで培養された酵母で観察されるさらに別の望ましい特徴は、免疫調節の目的で有益な方法での抗原発現である。１つの態様では、酵母は抗原発現のためのビヒクルとして使用される（例えば、米国特許第５，８３０，４６３号および第７，０８３，７８７号を参照されたい）。抗原は、天然酵母抗原、あるいは酵母により発現される異種抗原であってよい。いくつかの態様では、抗原発現のための酵母は、様々な疾患および病気（例えば、感染症または癌）と闘うワクチン、予防薬、および治療薬の開発に役立つ。中性ｐＨの方法を用いて、当業者は、抗原が他の細胞（例えば、免疫共刺激性機能または免疫制御のため）または他の作用物質（例えば、検出用抗体）により到達可能な抗原提示酵母を産生することができる。さらに、インフルエンザＨＡ抗原などのいくつかの抗原に中性ｐＨを使用することは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）による処理により、ジスルフィド結合したＨＡの遊離を可能にする。これは、ＨＡ発現酵母が、ｐＨがｐＨ５より下に低下する培地で培養される場合には不可能なことである。いくつかの場合では、これは、わずかな時間でもｐＨがｐＨ５より下に低下する場合に生じる。他の場合では、これは、１もしくは数分または１もしくは複数時間、ｐＨがｐＨ５より下に低下する場合に生じる。
【００４０】
中性ｐＨの方法に従い培養された酵母が示す別の望ましい特徴は、酵母に曝露した細胞からのＴｈ１型サイトカインの分泌である。Ｔｈ１型サイトカインの例には、インターフェロン−ガンマ、ＩＬ−１２、およびＩＬ−２が含まれるが、これらに限定されない。実施例にさらに詳述されている通り、中性ｐＨプロトコルに従い増殖された酵母で負荷された樹状細胞は、低い（酸性）ｐＨ培地で増殖された酵母に比べて、インターフェロン−ガンマ分泌および発現レベルが上昇する。中性ｐＨ培養方法を用いる場合、ＩＬ−１２分泌レベルの低下はなかった。このため、当業者は、免疫調節の目的、例えば、増大したＴｈ１型応答から恩恵を受けると考えられる、疾患または障害に苦しんでいる個体においてＴｈ１型応答を誘導するために、本明細書に開示された中性ｐＨの方法を使用することができる。
【００４１】
中性ｐＨの方法を用いて増殖された酵母組成物
本発明はまた、本明細書に開示された中性ｐＨの方法を用いて増殖された酵母を含む組成物も企図する。１つの態様では、組成物は、この表面もしくは内部のいずれか、または両方で天然抗原を発現する酵母を含む。この組成物は、アジュバントとしての投与など、様々な目的に有用であり得る。別の態様では、組成物は、この表面もしくは内部のいずれか、または両方で異種抗原を発現する酵母を含む。この組成物は、免疫調節を必要としている個体における免疫調節およびワクチン開発など、様々な目的に有用であり得る。
【００４２】
これらの組成物はまた、医薬的に許容可能な賦形剤および／または担体を含むこともできる。医薬的に許容可能な担体には、滅菌水性または非水性の溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれ得る。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水性溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル油または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補液、電解質補液（リンゲルデキストロースを基にしたものなど）などが含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような防腐剤および他の添加剤も存在することができる。医薬的に許容可能な賦形剤を有する、中性ｐＨ条件下で増殖された酵母を含む組成物製剤は、一般に当業者には日常的である。
【００４３】
本発明のキット
本発明は、中性ｐＨ条件下で酵母を培養するための培地成分を含むキットを企図する。１つの態様では、キットは、培地を少なくとも５．５のｐＨにするのに使用できるコハク酸塩またはコハク酸を含有する培地成分、およびこれを使用するための一連の指示書を含む。別の態様では、キットはさらに追加成分としてソイトンを含む。別の態様では、キットはさらに酵母細胞を含む。酵母細胞は、本明細書に開示されたプロトコルにより培養を開始するため凍結することができる。別の態様では、酵母細胞は、キットの一部として包装するため凍結される前に、本明細書に開示された方法で既に培養されていてよい。別の態様では、酵母細胞は凍結乾燥することができ、場合によりキットに含めることができる。別の態様では、キットは、本明細書に開示された方法により調製された、複製可能である酵母を含む。
【００４４】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を説明するのに提供される。これらは、どんな形であれ本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
酵母培地処方
様々なタイプの培地を、酵母を培養するのに使用およびｐＨレベルが中性になるように調整することができる。使用することができる培地の例を以下に提供するが、本発明は、これらの培地成分または培地プロトコルの使用に限定されないことを理解されたい。
【００４６】
１つの標準的な培地処方は、以下のようなＵＬＤＭ培地である。
【００４７】
【化１】
別の標準的な培地処方は、以下のようなＵＬ２培地である。
【００４８】
【化２】
別の標準的な培地処方は、以下のようなＵＬ３培地である。
【００４９】
【化３】
別の標準的な培地処方は、以下のようなＵＬ４培地である。
【００５０】
【化４】
別の標準的な培地処方は、以下のようなＵＤＭ培地である。
【００５１】
【化５】
【００５２】
【化６】
別の標準的な培地処方は、以下のようなＵ２培地である。
【００５３】
【化７】
別の標準的な培地処方は、以下のようなＵ３培地である。
【００５４】
【化８】
【００５５】
【化９】
別の標準的な培地処方は、以下のようなＵ４培地である。
【００５６】
【化１０】
標準的な培地処方は、追加のアミノ酸を補充することができる。以下のプロトコルは例示的な培地処方である。
【００５７】
ＵＬＤＭａａ培地処方は以下の通りである。
【００５８】
【化１１】
【００５９】
【化１２】
ＵＬ２ａａ培地処方は以下の通りである。
【００６０】
【化１３】
ＵＬ３ａａ培地処方は以下の通りである。
【００６１】
【化１４】
ＵＤＭａａ培地処方は以下の通りである。
【００６２】
【化１５】
【００６３】
【化１６】
Ｕ２ａａ培地処方は以下の通りである。
【００６４】
【化１７】
Ｕ３ａａ培地処方は以下の通りである。
【００６５】
【化１８】
【００６６】
【化１９】
別の態様では、コハク酸塩含有緩衝培地を使用する。コハク酸塩含有酵母培地は以下である。ｐＨ６．９に調整したＵＤＭＳ培地処方は以下の通りである。
【００６７】
【化２０】
ｐＨ６．９に調整したＵ２Ｓ培地処方は以下の通りである。
【００６８】
【化２１】
【００６９】
【化２２】
ｐＨ６．９に調整したＵ３Ｓ培地処方は以下の通りである。
【００７０】
【化２３】
ｐＨ６．９に調整したＵ４Ｓ培地処方は以下の通りである。
【００７１】
【化２４】
（実施例２）
細胞増殖および培養ｐＨに対する培地ｐＨの効果
図１に示した通り、細胞増殖および培養ｐＨに対する培地ｐＨの効果を試験した。細胞は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．２またはリン酸緩衝液、ｐＨ７．２を補充したＵ２培地で増殖させた。対照培養物は、培地に緩衝液を添加せずにＵ２培地で増殖させた。対照として特筆される条件（培地ｐＨ５．５と同じ）または培地ｐＨ７．２としては、これらの対照物の増殖培地は、酵母を摂取する前に塩基（ＮａＯＨ）によりｐＨ５．５またはｐＨ７．２のいずれかに調整した。培養物を３０℃でインキュベートし、細胞数および培養ｐＨを最大１６時間モニターした。結果は、様々なｐＨレベルでの緩衝液が、酵母の増殖速度に影響したことを示す。図１に示した通り、倍加時間は２．８〜４．５時間の範囲であった。非緩衝ｐＨ７培地におけるｐＨは、２．０ＹＵ／ｍＬで約５．５であった。これは、ｐＨを中性レベルに保つためにいくつかの形態の緩衝剤が必要であることを示すものである。
【００７２】
（実施例３）
細胞壁厚に対する培地ｐＨの効果
培地ｐＨの効果を試験して、細胞壁厚に何らかの効果を有するかどうかを判定した。増殖培地および条件は実施例１と同じであった。培養物は、０．５〜２．０ＹＵ／ｍＬの範囲の密度で回収した。図２の凡例では、培養物を回収した密度がダッシュマークの後ろの数字で記されている。例えば、対照−０．６とは、細胞をｐＨ５．５で非緩衝培地で増殖し、次いで、細胞が０．６ＹＵ／ｍＬ密度に達したときに回収したことを意味する。フラスコ１〜３の条件（例えば１〜０．５、２〜２．０または３〜１．０）は、図の下に記載されており、回収時の細胞密度は凡例に記されている。使用した溶解アッセイプロトコルは以下の通りであった：（１）洗浄した細胞１０ＹＵを１ｍＬのＴｒｉｓ−ＢＭＥで再懸濁した；（２）「時間０」の試料を採取し、６００ｎｍでＯＤを測定する；（３）グルカナーゼ２０Ｕを添加する；（４）３０℃で回転させる；（５）１０分ごとに、試料を採取しＯＤを測定する。
【００７３】
図２に観察され得る通り、対照培養（培地ｐＨ約５．５）は、細胞密度が増加するにつれて溶解効率が低下することを示す。フラスコ２は、緩衝剤なしによるｐＨ７．２での培地の効果を示す。フラスコ２は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液によるｐＨ７．２での培地の効果を示す。フラスコ３は、リン酸緩衝液によるｐＨ７．２での培地の効果を示す。
【００７４】
故に、結果は、約ｐＨ５．５以上で緩衝した酵母の増殖が、すべての回収密度で、細胞壁を柔軟に、および細胞壁消化酵素による消化（例えば、リチカーゼ／グルカナーゼによるスフェロプラストの作製）に対し感受性に保つことを示している。反対に、多くの酵母研究所で一般に使用される標準工程では、感受性は回収密度＞０．５ＹＵ／ｍＬで失われた。比較を容易にするため、標準的な増殖培地による０．５ＹＵ／ｍＬが、任意の密度での中性ｐＨ増殖との比較に多く使用される。
【００７５】
（実施例４）
７５−１５細胞の構築
ＴＫ７５−１５で表される融合タンパク質は、ＴＥＦ２プロモーターに誘導されるＡｇａ２配列を用いて細胞壁にインフルエンザＨＡタンパク質を発現するように設計した。このコンストラクトでは、Ａｇａ２配列にＨＡ配列Ｃ末端が対応するタンパク質を構築した。このタンパク質は、Ａｇａ１ｐ（この場合では、ＣＵＰ１プロモーターに誘導される）も発現する細胞で発現した場合、酵母細胞の外側の細胞壁、およびサイトゾルに局在する。インフルエンザＨＡ抗原を含む融合タンパク質は、ＮからＣ末端のフレームで融合される以下の配列要素を有する単一のポリペプチドである（融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書に配列番号１で表される）：１）天然の１８アミノ酸ＥＲ標的シグナル配列（配列番号１の位置１〜１８）を含む、完全長のＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２タンパク質配列（配列番号１の位置１〜８７）；２）ＨＡ本体からＡｇａ２を隔てるスペーサー（位置８８および８９）；３）シグナル配列（配列番号１の位置９０〜６００）を欠く、およびＨＡの３６Ｃ末端残基を欠き、それによってＣ末端膜アンカーおよび細胞質尾部が排除された、インフルエンザＨＡタンパク質；４）ヒスチジンタグからＨＡタンパク質本体を隔てるトリグリシンスペーサー（配列番号１の位置６０１〜６０３）；および５）Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１の位置６０４〜６０９）。配列番号１の融合タンパク質をコードする核酸配列は、本明細書に配列番号２で表される。この融合タンパク質およびこれを発現するタルモゲン（Ｔａｒｍｏｇｅｎ）は、７５−１５と呼ぶことができる。
【００７６】
使用したタンパク質配列は次の通りである（配列番号１）
【００７７】
【化２５】
対応する核酸配列は次の通りである（配列番号２）
【００７８】
【化２６】
【００７９】
【化２７】
（実施例５）
７５−１５細胞増殖および培養ｐＨに対する異なる緩衝剤（ｐＨ６．５培地）の効果
細胞増殖に対する効果および培養ｐＨに対する効果を判定するため、異なる緩衝剤を７５−１５細胞で試験した。これらの緩衝剤を図３に示す。これらの緩衝剤には、コハク酸塩、クエン酸塩、および炭酸塩が含まれる。いずれの緩衝剤も沈殿形成をもたらすことはなかった。使用した緩衝剤のすべてのが、標準的な増殖培地に十分に溶解した。すべての試験培養物のｐＨを、酵母培養物の摂取前にｐＨ６．５に調整した。培養物を、次いで、振盪フラスコで３０℃で最大１５時間増殖させた。細胞を炭酸塩緩衝剤で増殖させた場合には、最少の増殖が見られた、または増殖は見られなかった。図３に見られる通り、異なる緩衝剤の使用は、増殖速度に影響した。増殖は、中性ｐＨ（少なくともｐＨ５．５）で速かった。特に、コハク酸塩緩衝剤を有する培地は、倍加時間に関して最良であった（約２．５時間の倍加時間）。反対に、酵母細胞をｐＨ５．５未満（より酸性条件）で増殖させた場合、倍加時間は約３．５時間で減速した。クエン酸塩は同様の倍加時間であった（約３．５時間）。０．０５Ｍでのクエン酸塩は、０．０２Ｍでのコハク酸塩より緩衝能力が増大した。これらの実験では、発現誘導のため培養物すべてに０．３５ｍＭの銅を入れた。
【００８０】
（実施例６）
細胞溶解に対する様々な緩衝剤の効果
図４は、コハク酸塩およびクエン酸塩など、様々な緩衝剤で行った実験結果を示す。培養物は、実施例１に記載された通りに増殖させた。グルカナーゼにより溶解される酵母の能力を、上記の溶解アッセイプロトコルを用いて測定した。対照培養（培地ｐＨ約５．２）での酵母は、細胞密度が増加するにつれ（図２に関する上述の通り、ダッシュの後ろの数字で示される細胞密度）、グルカナーゼによる溶解効率の低下を示した。しかし、コハク酸塩およびクエン酸塩緩衝培地のいずれについても、回収時の細胞密度は、上述した溶解アッセイにおいて細胞壁消化酵素により溶解される酵母の能力に何ら効果を与えなかった。コハク酸塩およびクエン酸塩緩衝培地での酵母は、増加する細胞密度（例えば、０．５ＹＵ／ｍｌ、０．９ＹＵ／ｍｌおよび２．１または２．２ＹＵ／ｍｌ）での溶解に依然として感受性であった。
【００８１】
（実施例７）
培地処方試験
酵母培地に添加される他の剤の寄与を試験し、結果を５に示す。Ｕ２またはＵ４は、基本的な培地組成物を指す。タンパク質発現は、銅誘導性ＣＵＰＩプロモーターの調節下にあるため、ＨＡタンパク質を発現するのに誘導される酵母細胞用の培地に、０．３５ｍＭの銅を添加する。ソイトン（図５のＳｏｙ）は、大豆のペプシン消化により得られる栄養素の市販の複合体混合物である。ソイトンの添加は、最速の増殖および最高収量（３０ＹＵ／ｍＬ）をもたらした。０．０８Ｍのコハク酸の使用は、より良好な緩衝能力を示した。細胞は、３０℃で、ｘ軸に示した時間の間増殖させた。
【００８２】
図６は、細胞の生存の判定にＧｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを使用した培地処方試験の結果を示す。銅誘導性Ａｇａ２−ＨＡを発現する酵母株７５−１５を、振盪フラスコで３０℃で増殖させた。銅を培養物に添加した場合、Ａｇａ２−ＨＡタンパク質が発現され、細胞表面に現れる。該タンパク質は、表面にＨＡを示す酵母細胞の数を表している（％陽性シグナル）。細胞の生存は、他の方法（例えば、血球計またはトリパンブルー）を用いて判定することもできる。最も高いシグナルは、（細胞が増殖速度を減速する傾向にある細胞密度を超える）細胞密度８ＹＵ／ｍＬですら、Ｕ２で観察された。ソイトンを用いた培養物は、高密度がタンパク質の減少を示し、細胞密度の明らかな効果を示した。Ｕ４の使用は、全般に低いシグナルをもたらした。細胞壁、および表面発現タンパク質を検出するＨＡ特異的抗体の能力にｐＨが与える効果から、これらの結果も検出の容易性を証明するものである。
【００８３】
異なるソイトン濃度を用いて、追加の実験を行った。図７はこの結果を示す。０．５ｇ／ｌおよび１ｇ／ｌソイトンの間に、増殖またはｐＨの差は観察されなかった。Ｕ４−ＹＮＢ培地ではＵ２培地よりも速い増殖が観察された。
【００８４】
（実施例８）
酵母が中性ｐＨ条件で増殖される場合のＨＡ到達性の差
検出用抗体などの他の作用物質からの相互作用に対する特定抗原の到達性を、様々な培地ｐＨレベルにより評価した。図８は、酵母細胞をｐＨ５未満で増殖させた場合、および同様に酵母を６を超えるｐＨで増殖させた場合に、インタクトな酵母から遊離可能なインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）の免疫ブロットアッセイを示す。中性ｐＨで増殖させた酵母は、表面に提示されたＨＡを、ＨＡを発現する細胞数および細胞あたりのＨＡ量のいずれにおいても、フローサイトメトリー染色で判定される抗体検出によりずっと利用しやすいものにする。さらに、中性ｐＨで増殖させた酵母は、ジチオスレイトール（ジスルフィド還元剤）による処理により、ジスルフィド結合したＨＡを遊離する操作がより簡単であった。
【００８５】
（実施例９）
サイトカイン産生に対する中性ｐＨの効果
ｐＨが、ｐＨ５．５より上であった、またはｐＨ５．５より上で維持されなかった培地で増殖させたＹＶＥＣ酵母（異種抗原を発現していない）を添加した、樹状細胞（ＤＣ）を用いて、中性ｐＨで酵母を培養することがサイトカイン産生に与える効果を実験した。マウス骨髄由来樹状細胞に、ＤＣあたり１０酵母を、ＲＰＭ１培地で４８時間、３７℃で一緒にインキュベートして添加した。次いで、上清を、分泌されたサイトカインについて分析した。図９はこれらの実験結果を示す。下のパネルは、中性ｐＨ（すなわち、少なくとも５．５以上）で増殖される酵母で負荷された樹状細胞からのＩＦＮ−ガンマ分泌は著しく増加すること、酵母がｐＨを５．５未満に低下させた培地で培養される場合には、著しい増加は見られないことを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母を増殖させるための方法であって、培地で該酵母を培養することを含み、該培地が、該酵母が培養中にある時間の少なくとも５０％にわたって５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される、方法。
【請求項２】
酵母を増殖させるための方法であって、培地で該酵母を培養することを含み、前記培地が５．５〜８の間のｐＨレベルで維持され、該酵母の密度が少なくとも０．５酵母単位／ｍＬである、方法。
【請求項３】
酵母が培養中にある時間の少なくとも５０％にわたって、少なくとも５．５のｐＨレベルを有する培地で該酵母を培養することによる、酵母を増殖させるための方法。
【請求項４】
前記培地が５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記培地がさらにソイトンを含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
個体に投与された場合に前記酵母が免疫応答を誘発する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記酵母が異種抗原を発現する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記異種抗原が前記酵母の表面で発現される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１、２、または３に記載の方法のいずれか１つにより培養された酵母を含む組成物。
【請求項１２】
抗原を発現する発現系を含有する酵母を培地で培養することにより抗原発現酵母を産生するための方法であって、該培地のｐＨが少なくとも５．５である、方法。
【請求項１３】
抗原を発現する発現系を含有する酵母を培養することにより抗原発現酵母を産生するための方法であって、該培地が５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される、方法。
【請求項１４】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記培地がさらにソイトンを含有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
個体に投与された場合に前記酵母が免疫応答を誘発する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵母が異種抗原を発現する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記異種抗原が前記酵母の表面で発現される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵母が５．５未満のｐＨで増殖する場合より容易に前記異種抗原が他の細胞または作用物質との相互作用に到達可能である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１２または１３に記載の方法のいずれか１つにより培養された酵母を含む組成物。
【請求項２２】
抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより該個体におけるＴｈ１型応答を誘導する方法であって、該酵母が、少なくとも５．５のｐＨレベルを有する培地で培養されている、方法。
【請求項２３】
抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより該個体におけるＴｈ１型応答を誘導する方法であって、該酵母が、５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地で培養されている、方法。
【請求項２４】
前記組成物が、中性ｐＨで培養、維持または回収された酵母で負荷された樹状細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記培地がさらにソイトンを含有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
個体に投与された場合に前記酵母が免疫応答を誘発する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記酵母が異種抗原を発現する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記異種抗原が前記酵母の表面で発現される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｔｈ１型応答がインターフェロン−ガンマ産生である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｔｈ１型応答がＩＬ−１２産生である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
ｐＨが少なくとも５．５である培地、および酵母を培養するための該培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキット。
【請求項３４】
５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地、および酵母を培養するための該培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキット。
【請求項３５】
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記培地がさらにソイトンを含有する、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
さらに酵母を含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
前記酵母が凍結または凍結乾燥されている、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記酵母が、少なくともｐＨ５．５の培地で培養されるか、または５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地で培養されている、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
前記酵母が複製可能である、請求項３７に記載のキット。
【請求項１】
酵母を増殖させるための方法であって、培地で該酵母を培養することを含み、該培地が、該酵母が培養中にある時間の少なくとも５０％にわたって５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される、方法。
【請求項２】
酵母を増殖させるための方法であって、培地で該酵母を培養することを含み、前記培地が５．５〜８の間のｐＨレベルで維持され、該酵母の密度が少なくとも０．５酵母単位／ｍＬである、方法。
【請求項３】
酵母が培養中にある時間の少なくとも５０％にわたって、少なくとも５．５のｐＨレベルを有する培地で該酵母を培養することによる、酵母を増殖させるための方法。
【請求項４】
前記培地が５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記培地がさらにソイトンを含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
個体に投与された場合に前記酵母が免疫応答を誘発する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記酵母が異種抗原を発現する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記異種抗原が前記酵母の表面で発現される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１、２、または３に記載の方法のいずれか１つにより培養された酵母を含む組成物。
【請求項１２】
抗原を発現する発現系を含有する酵母を培地で培養することにより抗原発現酵母を産生するための方法であって、該培地のｐＨが少なくとも５．５である、方法。
【請求項１３】
抗原を発現する発現系を含有する酵母を培養することにより抗原発現酵母を産生するための方法であって、該培地が５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される、方法。
【請求項１４】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記培地がさらにソイトンを含有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
個体に投与された場合に前記酵母が免疫応答を誘発する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵母が異種抗原を発現する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記異種抗原が前記酵母の表面で発現される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵母が５．５未満のｐＨで増殖する場合より容易に前記異種抗原が他の細胞または作用物質との相互作用に到達可能である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１２または１３に記載の方法のいずれか１つにより培養された酵母を含む組成物。
【請求項２２】
抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより該個体におけるＴｈ１型応答を誘導する方法であって、該酵母が、少なくとも５．５のｐＨレベルを有する培地で培養されている、方法。
【請求項２３】
抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより該個体におけるＴｈ１型応答を誘導する方法であって、該酵母が、５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地で培養されている、方法。
【請求項２４】
前記組成物が、中性ｐＨで培養、維持または回収された酵母で負荷された樹状細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記培地がさらにソイトンを含有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
個体に投与された場合に前記酵母が免疫応答を誘発する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記酵母が異種抗原を発現する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記異種抗原が前記酵母の表面で発現される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｔｈ１型応答がインターフェロン−ガンマ産生である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｔｈ１型応答がＩＬ−１２産生である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
ｐＨが少なくとも５．５である培地、および酵母を培養するための該培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキット。
【請求項３４】
５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地、および酵母を培養するための該培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキット。
【請求項３５】
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記培地がさらにソイトンを含有する、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
さらに酵母を含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
前記酵母が凍結または凍結乾燥されている、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記酵母が、少なくともｐＨ５．５の培地で培養されるか、または５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地で培養されている、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
前記酵母が複製可能である、請求項３７に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５１７５３７（Ｐ２０１０−５１７５３７Ａ）
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４８４７８（Ｐ２００９−５４８４７８）
【出願日】平成２０年２月１日（２００８．２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５２８４３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９７８６３
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（５０８０１０９０５）グローブイミューン， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１日（２００８．２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５２８４３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９７８６３
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（５０８０１０９０５）グローブイミューン， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]