酵母種および真菌種の検出のための核酸プローブ
本発明は、真菌種および酵母種についての診断アッセイにおけるＲＰＳ７遺伝子またはその対応するｍＲＮＡの一部の使用ならびにかかるアッセイおよび方法で用いる配列に関する。本発明は、ＲＰＳ７遺伝子またはその対応するｍＲＮＡの少なくとも一部に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを含む酵母種および／または真菌種の検出および同定のための診断キットを提供する。オリゴヌクレオチドプローブは、ＲＰＳ７遺伝子またはその対応するｍＲＮＡの一部と実質的に相同であるか実質的に相補的である配列を有することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、リボゾームタンパク質遺伝子、対応するｍＲＮＡ、ならびにこれらに関連する特異的プローブ、プライマー、およびオリゴヌクレオチド、酵母種および真菌種を検出および／または識別するための診断アッセイにおけるその使用に関する。特に、本発明は、リボゾームタンパク質ＲＰＳ７に対応する遺伝子およびその対応するｍＲＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
感染の原因としての酵母および真菌の検出および同定は、これまでにないほど重要である。酵母および真菌感染の危険性がある免疫不全患者数は、増加し続けており、疾患を引き起こす真菌因子の範囲も同様である。真菌感染、特に侵襲性真菌感染による死亡率は、一定の危険な状態にある患者群で３０％以上である（“Ｓｔａｋｅｈｏｌｄｅｒ Ｉｎｓｉｇｈｔ：Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”，Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ，Ｊａｎ ２００４）。一連の利用可能な抗真菌薬は増加しているが、抗真菌薬に対する固有および新たな耐性の両方の認識も増加している。これらの要因により、臨床試験の費用を抑制する必要性が増大し、試験手順において実験が統合されている。
【０００３】
侵襲性真菌感染は増加傾向にある。２００３年では、９００万人の危険な状態にある患者のうち１２０万人が感染症を発症したと見積もられた。免疫不全患者（移植患者、手術患者、新生児、癌患者、糖尿病患者、およびＨＩＶ／ＡＩＤ患者が含まれる）は、侵襲性真菌感染を発症する危険性が高い（Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ ｒｅｐｏｒｔ：Ｓｔａｋｅｈｏｌｄｅｒ ｏｐｉｎｉｏｎ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｏｐｔｉｏｎｓ ｏｕｔｗｅｉｇｈ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ２００４）。多数の重症敗血症が年を追って報告されている。その医学的管理が改善されているにもかかわらず、敗血症は、依然として集中治療における最大の課題の１つを構成している。敗血症の発症を担う微生物（細菌、真菌、および酵母）は、伝統的には、微生物学的培養方法を用いて病院検査室で検出され、この方法は、感度が低く（２５〜８２％）、非常に時間がかかり、一般に、完了までに２〜５日間を要し、真菌感染の診断には８日間までを要する。確定診断は、通常、臨床標本からの特定の作用因子（ａｇｅｎｔ）の回収および同定または明確な形態学的特徴を有する真菌の微視的証明のいずれかに基づく。しかし、これらの方法によって感染菌に関する決定的証拠を得ることができない症例が多数存在する。これらの場合、特定の宿主抗体応答の検出を使用することができるが、この場合も患者の免疫状態に影響を受け得る。典型的に細菌および真菌に起因する血流感染の検出および同定で時間は重要である。有効な治療は、感染源の発見および迅速且つ有効な抗生物質または抗真菌剤の適切な決定に依存する。病原体が正確に同定された後のみに、特定の抗生物質を使用した標的療法を開始することができる。多数の医師が酵母および真菌の早期診断のためのより良好なｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅および直接検出診断技術の開発を望んでいる（“Ｓｔａｋｅｈｏｌｄｅｒ Ｉｎｓｉｇｈｔ：Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”，Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ，Ｊａｎ ２００４）。最近、Ｒｏｃｈｅ（商標）は、臨床サンプル中の細菌、真菌、および酵母のＤＮＡの検出のためのリアルタイムＰＣＲベースのアッセイ（Ｓｅｐｔｉｆａｓｔ（商標））を販売した。したがって、臨床領域における生体分析に適用するための臨床的に有意な細菌病原体および真菌病原体の新規の迅速な診断試験の開発が明確に必要とされている。これにより、本発明者らは、核酸診断（ＮＡＤ）試験で適用するための新規の真菌および酵母核酸標的を検索および同定した。
【０００４】
カンジダ菌種およびアスペルギルス菌種は、現在、免疫不全患者に感染する最も重要な病原体に位置づけられている。特に、感染は、尿路、呼吸器系、および血流、ならびにステント、カテーテル、および整形外科的接合部の挿入部位によく認められる。公知のカンジダ菌種のおよそ１０％がヒト感染に関与している。侵襲性カンジダ症は、カンジダが血流に侵入した場合に起こり、米国の人口１００，０００人あたり８人の頻度で生じ、死亡率は４０％と見積もられている。Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓは、血流感染の４番目に最も一般的な原因である。アスペルギルス症は、通常、肺感染症として始まり、患者によっては生命にかかわる侵襲性感染症に進行する可能性があり、死亡率は９０％を超える。新興真菌症の作用因子には、フサリウム属、スケドスポリウム属、接合菌類、およびトリコスポロン菌種が含まれる（“Ｓｔａｋｅｈｏｌｄｅｒ Ｉｎｓｉｇｈｔ：Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”，Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ，Ｊａｎ ２００４）。
【０００５】
真菌および酵母核酸ベースの診断は、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子、ＲＮＡ転写物、およびその関連するＤＮＡ／ＲＮＡ領域を重視する。ｒＲＮＡ遺伝子は、全ての真菌種で高度に保存されており、これらは、異なる特徴的な遺伝子間転写スペーサー領域も含む。リボゾームｒＲＮＡは、以下の３つの遺伝子を含む：大サブユニット遺伝子（２８Ｓ）、小サブユニット遺伝子（１８Ｓ）および５．８Ｓ遺伝子。２８Ｓ遺伝子および１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、５．８Ｓ ｒＲＮＡおよび２つの内部転写スペーサー（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２）によって分断されている。ＩＴＳ領域が多数の配列多型を含むので、多数の研究者は、これらを標的として重視している（Ａｔｋｉｎｓ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，２００４）。ｒＲＮＡ遺伝子はまた、真菌ゲノム内に１０個を超えるコピーを有する多コピー遺伝子である。
【０００６】
多数のグループが、真菌および酵母感染のための新規のアッセイの開発に取り組んでいる。特許文献１は、多数の他の態様のうち、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの転写因子ＣａＴＥＣ１、そのインヒビター、およびカンジダ感染に関与する疾患の診断および治療方法に関し、ヌクレオチド配列、タンパク質、宿主細胞、および／または抗体を含む診断および薬学的組成物にも関する。特許文献２は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよび／またはカンジダ・ドゥブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）由来のリボゾーム核酸を検出するためのハイブリッド形成アッセイプローブおよびアクセサリーオリゴヌクレオチドに関する。特許文献３および特許文献４は、５つの医学的に重要なカンジダ菌種由来のＤＮＡを増幅および種分化するために使用することができるＤＮＡプライマー組に関する。特許文献５は、カンジダ感染の診断に有用な配列を開示している。一定範囲の酵母種および真菌種の診断について、特許文献６および特許文献７は１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づくプローブを開示し、特許文献８は、２８Ｓ ｒＲＮＡに基づくプローブを開示している。特許文献９は、一定範囲のカンジダ菌種の核酸ベースの診断で用いるキチンシンターゼ遺伝子に基づいた配列を記載している。
【０００７】
変異ゲノム配列を有する耐性のある毒性株集団を増加させる現代の抗菌治療によって生じる淘汰圧を特に考慮して、より迅速でより正確な診断方法の開発が必要であることが明確である。感染原因となる微生物の早期診断が可能な方法により、感染を治療するための特定の狭域の抗生物質または抗真菌薬を選択することができる（非特許文献１）。
【０００８】
ＲＰＳ７は、７０を超えるリボゾームタンパク質のうちの１つである。これは、原核生物および真核生物で認められ、ｒＲＮＡの折り畳みにおいてリボゾーム小サブユニット中で機能し、リボゾーム小サブユニットのヘッドを形成する。ｒｐｓ７遺伝子はリボゾーム内に保存された機能を有する必須タンパク質をコードする。酵母では、例えば、出芽酵母ＲＰＳ７は、１４塩基対の位置が異なり、各遺伝子が１つのイントロンを有する２つの遺伝子によってコードされる。Ｓｙｎｅｔｏｓら（１９９２）は、サッカロミセスは１遺伝子コピーで生存することができるが、両方の欠失で死滅することを示した。Ｄｅｌｂｒｒｕｃｋら（１９９７）は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ中のＲＰＳ７遺伝子をクローン化および配列決定し（ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 Ｕ３７００９）、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ中のｒｐｓ７がイントロンを欠き、Ｓ．セレビシエ中のＲＰＳ７タンパク質とアミノ酸レベルで８３％相同であることを割り出した。このグループは、ＲＰＳ７遺伝子がｒＲＮＡの３〜６倍の発現レベルで菌糸形成中に上方制御されることも示した。これにより、酵母形態から菌糸形成への形態形成がカンジダ菌種感染に重要であるので、遺伝子が臨床的に関連することが示唆される。アスペルギルス菌種、特に、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓでは、ＲＰＳ７遺伝子は、３つのエクソンおよび２つのイントロンを含み、それにより、遺伝子構造は酵母で認められるものと異なる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０４４１９３号明細書
【特許文献２】国際公開第０１／８３８２４号パンフレット
【特許文献３】米国特許第６，０１７，６９９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，４２６，０２６号明細書
【特許文献５】米国特許第６，７４７，１３７号明細書
【特許文献６】欧州特許第０，４２２，８７２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，６５８，７２６号明細書
【特許文献８】米国特許第５，９５８，６９３号明細書
【特許文献９】米国特許第６，０１７，３６６号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ ｒｅｐｏｒｔ：Ｓｔａｋｅｈｏｌｄｅｒ ｏｐｉｎｉｏｎ −Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｏｐｔｉｏｎｓ ｏｕｔｗｅｉｇｈ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ２００４；Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ ｒｅｐｏｒｔ：Ｓｔａｋｅｈｏｌｄｅｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ−Ｓｅｐｓｉｓ，ｕｎｄｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ ａｎ ｏｖｅｒｒｅａｃｔｉｏｎ，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、１つ以上の酵母種または真菌種の検出および同定で使用することができる配列および／または診断アッセイを提供することである。本発明者らは、カンジダおよびアスペルギルス遺伝子特異的プライマーを設計するためにｒｐｓ７遺伝子の構造構成（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を活用している。これは、共生生物としてカンジダを含むサンプル中の真菌病原体を同定したい場合にユニバーサルプライマーの使用アプローチがうまく行かないかもしれないという点で先行技術よりも有利である。カンジダが増幅過程において真菌病原体からの調節を脱して優先的に増幅され、それにより、病原体を検出することができない可能性が高い。さらに、Ｄｅｌｂｒｕｃｋら、１９９７によって、１つの種における異なる染色体上のｒｐｓ７遺伝子の異なる対立遺伝子間の配列の相違が異なる関連する無性種における遺伝子間よりもはるかに異なり得ることが示唆されている。これにより、当業者は、分子診断の標的としてのこの遺伝子の選択を回避するであろう。また、いくつかの種（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓなど）で異なる配列型が存在し、このことも分子診断の標的遺伝子としてのこの遺伝子の選択を回避させているであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
定義
本明細書中で使用される場合、以下の用語は、明らかに別の意味で記載されない限り、所与の意味を有する。
【００１３】
「合成オリゴヌクレオチド」は、ゲノムＤＮＡまたは生きている生物に直接由来しない２つ以上のヌクレオチド塩基の核酸ポリマー分子をいう。用語「合成オリゴヌクレオチド」は、化学的に製造されたか、ｉｎ ｖｉｔｒｏで酵素的に合成されたＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子を含むことが意図される。「オリゴヌクレオチド」は、互いに共有結合した２つ以上のヌクレオチドサブユニットを有するヌクレオチドポリマーである。オリゴヌクレオチドは、一般に、約１０〜約１００ヌクレオチドである。ヌクレオチドサブユニットの糖類は、リボース、デオキシリボース、またはＯＭｅなどのその修飾誘導体であり得る。ヌクレオチドサブユニットを、ホスホジエステル結合、修飾結合（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ）などの結合、またはオリゴヌクレオチドのその相補的標的ヌクレオチド配列とのハイブリッド形成を妨害しない非ヌクレオチド部分によって結合することができる。修飾結合には、標準的なホスホジエステル結合をホスホロチオアート結合、メチルホスホナート結合、または中性ペプチド結合などの異なる結合と置換する修飾結合が含まれる。窒素塩基アナログはまた、本発明のオリゴヌクレオチドの成分であり得る。
【００１４】
「標的核酸」は、標的核酸配列を含む核酸である。「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、または「標的配列」は、相補的オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することができる特異的なデオキシリボヌクレオチド配列またはリボヌクレオチド配列である。
【００１５】
「オリゴヌクレオチドプローブ」は、高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件下で検出可能なハイブリッドプローブ：標的二本鎖を形成することができるのに十分にその標的核酸配列と相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドプローブは、単離化学種であり、かかるヌクレオチドが高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件下でのハイブリッド形成を妨害しない限り、標的化領域の外側にさらなるヌクレオチドを含むことができる。プロモーター配列、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、または所望の二次構造また三次構造を付与する配列（触媒活性部位など）などの非相補性配列を使用し、本発明のプローブを使用して検出を促進することができる。オリゴヌクレオチドプローブを、任意選択的に、プローブのその標的配列とのハイブリッド形成を検出または確認することができる放射性同位体、蛍光部分、化学発光物質、ナノ粒子部分、酵素、またはリガンドなどの検出可能な部分で標識することができる。オリゴヌクレオチドプローブは約５００ヌクレオチド長と同程度またはそれを超えるか、１０ヌクレオチド長未満であることが可能であるが、オリゴヌクレオチドプローブは、約１０〜約１００ヌクレオチド長の範囲のサイズであることが望ましい。
【００１６】
「ハイブリッド」または「二本鎖」は、相補塩基間のワトソン−クリック塩基対合または非標準塩基対合によって２つの一本鎖核酸配列の間に形成された複合体である。「ハイブリッド形成」は、核酸の２つの相補鎖が組合わさって二本鎖構造（「ハイブリッド」または「二本鎖」）を形成する過程である。
【００１７】
「真菌」または「酵母」は、真菌界の任意の生物を意味し、好ましくは子嚢菌門の任意の生物に関し、最も好ましくは半子嚢菌綱の任意の生物に関する。
【００１８】
「相補性」は、各鎖におけるワトソン−クリック塩基対間の水素結合によってハイブリッドまたは二本鎖ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、またはＤＮＡ：ＲＮＡを形成することができるＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖の塩基配列によって付与される性質である。アデニン（Ａ）は、通常、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）と相補性を示し、グアニン（Ｇ）は、通常、シトシン（Ｃ）と相補性を示す。
【００１９】
用語「ストリンジェンシー」を、ハイブリッド形成およびその後のプロセシング工程中に存在する温度、イオン強度、および溶媒組成を記載するために使用する。当業者は、「ストリンジェンシー」条件を種々のパラメーターを個別または共に変更することによって変化させることができることを認識するであろう。高ストリンジェンシー条件下では、相補性の高い核酸ハイブリッドのみが形成され、十分な相補性を持たないハイブリッドは形成されないであろう。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成する２つの核酸鎖間に必要な相補性量を決定づける。ストリンジェンシー条件を、標的核酸および非標的核酸と形成されるハイブリッド間の安定性の相違が最大になるように選択する。
【００２０】
「高ストリンジェンシー」条件を使用して、核酸塩基対合は、高頻度の相補性塩基配列を有する核酸フラグメント間のみに起こるであろう（例えば、「高ストリンジェンシー」条件下でのハイブリッド形成は、約８５〜１００％同一、好ましくは約７０〜１００％同一のホモログ間で起こり得る）。中ストリンジェンシー条件を使用して、核酸塩基対合は、中程度の頻度の相補性塩基配列を有する核酸間で起こるであろう（例えば、「中ストリンジェンシー」条件下でのハイブリッド形成は、約５０〜７０％同一のホモログ間で起こり得る）。したがって、「弱」または「低」ストリンジェンシー条件には、しばしば、相補配列の頻度が通常低い遺伝学的に異なる生物由来の核酸が必要である。
【００２１】
「高ストリンジェンシー」条件は、４２℃の５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整する）、０．５％ ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での結合またはハイブリッド形成、およびその後の４２℃の０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液での洗浄と等価な条件（約５００ヌクレオチド長のプローブを使用する場合）である。
【００２２】
「中ストリンジェンシー」条件は、４２℃の５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整する）、０．５％ ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での結合またはハイブリッド形成、およびその後の４２℃の１．０×ＳＳＰＥ、１．０％ ＳＤＳを含む溶液での洗浄と等価な条件（約５００ヌクレオチド長のプローブを使用する場合）である。
【００２３】
「低ストリンジェンシー」条件は、４２℃の５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整する）、０．１％ ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬［５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔは、５００ｍｌあたり以下を含む：５ｇ Ｆｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ４００、Ｐｈａｒａｍｃｉａ）、５ｇ ＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ；Ｓｉｇｍａ）］、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での結合またはハイブリッド形成、およびその後の４２℃の５×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳを含む溶液での洗浄と等価な条件（約５００ヌクレオチド長のプローブを使用する場合）である。
【００２４】
核酸ｉｎ−ｖｉｔｒｏ増幅ベースのテクノロジーに関しては、「ストリンジェンシー」を、特にｉｎ−ｖｉｔｒｏ増幅テクノロジーに対する温度条件および緩衝液のイオン条件の適用によって達成する。例えば、ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲに関しては、「ストリンジェンシー」を、プローブのリアルタイムＰＣＲハイブリッド形成に関して、標的核酸のｉｎ−ｖｉｔｒｏ増幅のための標的核酸へのオリゴヌクレオチドプライマーのための特定の温度および緩衝液のイオン強度の適用によって得る。
【００２５】
例えば、ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅ベースの検出系に関して使用する場合、「高ストリンジェンシー」は、１．５〜８ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む緩衝液環境における５５℃〜６５℃の範囲のハイブリッド形成（アニーリング）温度条件を含む。
【００２６】
例えば、ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅ベースの検出系に関して使用する場合、「中ストリンジェンシー」は、１．５〜８ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む緩衝液環境における４５℃〜５４℃の範囲のハイブリッド形成（アニーリング）温度条件を含む。
【００２７】
例えば、ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅ベースの検出系に関して使用する場合、「低ストリンジェンシー」は、１．５〜８ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む緩衝液環境における４０℃〜４４℃の範囲のハイブリッド形成（アニーリング）温度条件を含む。
【００２８】
当業者は、本発明の実質的に対応するプローブが言及した配列と異なるが、依然として同一の標的核酸配列とハイブリッド形成することができると理解するであろう。核酸由来のこの変動を、配列内の同一塩基の比率またはプローブとその標的配列との間の完全に相補的な塩基の比率に関して言及することができる。本発明のプローブは、これらの比率が約１００％〜約８０％であるか、約１０ヌクレオチド標的配列中の０塩基ミスマッチから約１０ヌクレオチド標的配列中の２塩基ミスマッチまでである場合に核酸配列に実質的に対応する。好ましい実施形態では、比率は約１００％〜約８５％である。より好ましい実施形態では、この比率は約９０％〜約１００％であり、他の好ましい実施形態では、この比率は約９５％〜約１００％である。
【００２９】
「十分に相補的な」または「実質的に相補的な」は、高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件下で検出に安定なハイブリッドを形成するのに十分な量の連続的相補ヌクレオチドを有する核酸を意味する。
【００３０】
「核酸ハイブリッド」または「プローブ：標的二本鎖」は、好ましくは約１０〜約１００ヌクレオチド長、より好ましくは１４〜５０ヌクレオチド長の二本鎖の水素結合構造である構造を意味するが、この長さはオリゴヌクレオチドプローブの全長に依存するであろう。構造は、化学発光または蛍光の検出、オートラジオグラフィ、電気化学分析、またはゲル電気泳動などの手段による検出に対して十分に安定である。かかるハイブリッドには、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖分子が含まれる。
【００３１】
「ＲＮＡ等価物およびＤＮＡ等価物」は、同一の相補塩基対ハイブリッド形成特性を有するＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子をいう。ＲＮＡ等価物およびＤＮＡ等価物は、異なる糖類（すなわち、リボース対デオキシリボース）を有し、ＲＮＡ中のウラシルの存在およびＤＮＡ中のチミンの存在が異なり得る。等価物が特定の配列と同程度の相補性を有するので、ＲＮＡ等価物とＤＮＡ等価物との間の相違は、実質的に対応する核酸配列の相違に寄与しない。
【００３２】
「優先的にハイブリッド形成する」は、高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件下でオリゴヌクレオチドプローブがその標的核酸とハイブリッド形成して、安定なプローブ：非標的ハイブリッド（他の生物由来の非標的核酸の存在を示すであろう）を形成することなく、安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成する（それにより、標的核酸の存在を示す）ことができることを意味する。したがって、プローブは、当業者が（例えば、カンジダ）の存在を正確に検出し、これらの種を他の生物と区別することができるように非標的核酸よりも十分に広い範囲で核酸を標的化するようにハイブリッド形成する。優先的ハイブリッド形成を、当該分野で公知であり、本明細書中に記載されている技術を使用して測定することができる。
【００３３】
「セラノスティクス（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）」は、疾患を診断し、正確な治療レジメを選択し、治療に対する患者の応答をモニタリングするための診断試験の使用を意味する。本発明のセラノスティクスは、患者から採取したサンプル、スワブ（ｓｗａｂ）、または標本に対する本発明のＮＡＤアッセイの使用に基づき得る。
【００３４】
発明の要旨
本発明は、ＲＰＳ７遺伝子またはその対応するｍＲＮＡの少なくとも一部に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを含む酵母種および／または真菌種の検出および同定のための診断キットを提供する。オリゴヌクレオチドプローブは、ＲＰＳ７遺伝子またはその対応するｍＲＮＡの一部と実質的に相同であるか実質的に相補的である配列を有することができる。したがって、これは、相補的なＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子と結合するかハイブリッド形成することができるであろう。ＲＰＳ７遺伝子は、真菌ＲＰＳ７遺伝子であり得る。ＲＰＳ７遺伝子は、酵母ＲＰＳ７遺伝子であり得る。核酸分子は合成であり得る。キットは、１つを超えるかかるプローブを含むことができる。特に、キットは、複数のかかるプローブを含むことができる。さらに、キットは、例えば、細菌種またはウイルスなどの他の生物のさらなるプローブを含むことができる。
【００３５】
ＲＰＳ７遺伝子は、酵母および真菌中のリボゾーム小サブユニットのタンパク質成分であるリボゾームタンパク質Ｓ７をコードする。これはリボゾーム生合成、すなわち、タンパク質合成に必要である。ＲＰＳ７は、１８Ｓ ｒＲＮＡのアセンブリの開始に関与する。
【００３６】
本発明は、酵母および真菌の診断で使用する高コピー数のｍＲＮＡを同定した。同定された配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ／ＲＮＡ増幅ベースの検出系だけでなく、シグナル増幅ベースの検出系にも適切である。さらに、適切な標的として同定された本発明の配列は、いくつかの領域中に有意な遺伝子内配列多様性（有利であり、本発明の態様が群または種特異的標的に指向することができる）を有し、いくつかの領域中に有意な配列均一性（本発明の態様が酵母および真菌の診断のための直接核酸検出テクノロジー、シグナル増幅核酸検出テクノロジー、および核酸ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅テクノロジーで使用する属特異的酵母および真菌プライマーおよびプローブに指向することができる）も有するという利点を提供する。ＲＰＳ７配列により、診断アッセイで複数の試験および自動化が可能である。
【００３７】
本発明の配列の利点の１つは、密接に関連する酵母種と真菌種との間の遺伝子内ＲＰＳ７ヌクレオチド配列の多様性によって酵母および真菌の検出のための診断アッセイで使用する特異的プライマーおよびプローブを診断することができることである。ＲＰＳ７ヌクレオチド配列（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方）を、診断アッセイにおける直接検出、シグナル増幅検出、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅テクノロジーと共に使用することができる。ＲＰＳ７配列により、診断アッセイで複数の試験および自動化が可能である。
【００３８】
高コピー数のＲＰＳ７ ｍＲＮＡは、シグナル増幅検出テクノロジーと組み合わせた診断アッセイにおけるその使用に有利である。さらに、ＲＰＳ７転写物の不安定性により、この診断標的を生存率診断アッセイで使用することができる。
【００３９】
キットは、ＲＰＳ７遺伝子の少なくとも一部の増幅用プライマーをさらに含むことができる。適切には、キットは、ＲＰＳ７遺伝子の一部の順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。ＲＰＳ７遺伝子の一部は、アスペルギルスＲＰＳ７遺伝子のエクソン３の一部であり得る。あるいは、ＲＰＳ７遺伝子の一部は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓＲＰＳ７遺伝子の塩基対５０８位から塩基対７１１位までの遺伝子領域の一部に等価であり得る。アスペルギルスＲＰＳ７遺伝子のエクソン３の一部のプローブおよびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓＲＰＳ７遺伝子の塩基対５０８位から塩基対７１１までに等価な遺伝子領域の一部のプローブを含むキットが特に好ましい。塩基対５０８位から塩基対７１１位までに等価な領域を、他の生物（サッカロミセス菌種およびクリプトコッカス・ネオフォルマンスなど）で見出すことができるが、必ずしも５０８位〜７１１位ではない。キットは、さらなるプローブも含むことができる。
【００４０】
プローブは、配列番号１〜配列番号７、配列番号１７６〜配列番号１８９、配列番号３７８〜配列番号４１３、および配列番号４１９〜配列番号４４８、またはＲＰＳ７遺伝子のプローブとして作用することもできる配列と実質的に相同であるか実質的に相補的である配列の群から選択される配列を有することができる。
【００４１】
キットは、少なくとも１つの順方向ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーおよび少なくとも１つの逆方向ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマー、配列番号８〜配列番号４０、配列番号４１４、配列番号４１７、配列番号４１８、または順方向増幅プライマーとして作用することもできるこれらと実質的に相同であるか実質的に相補的である配列からなる群から選択される配列を有する順方向増幅プライマー、ならびに配列番号３、配列番号２２〜配列番号４９、配列番号４１５、および配列番号４１６、または逆方向増幅プライマーとして作用することもできるこれらと実質的に相同であるか実質的に相補的である配列からなる群から選択される配列を有する逆方向増幅プライマーを含むことができる。診断キットは、直接核酸検出テクノロジー、シグナル増幅核酸検出テクノロジー、および核酸ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅テクノロジーに基づくことができ、のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）、分岐ＤＮＡテクノロジー（ｂＤＮＡ）、およびローリングサークル増幅テクノロジー（ＲＣＡＴ））、または他のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素増幅テクノロジーの一つ以上から選択される。
【００４２】
本発明はまた、配列番号１〜配列番号４６６およびこれらと実質的に相同であるかこれらの一部と実質的に相同であり、ＲＰＳ７遺伝子に基づいた診断で機能を果たす配列からなる群から選択される核酸分子を提供する。核酸分子は、配列番号ｌ〜配列番号４６６の核酸分子の一部と実質的に相同であるか実質的に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００４３】
本発明はまた、
（ｉ）適切な条件下で試験サンプルを少なくとも１つの上記定義のオリゴヌクレオチドプローブと混合する工程、
（ｉｉ）高ストリンジェンシー条件下で試験サンプル中に存在し得る任意の核酸をオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させてプローブ：標的二本鎖を形成する工程、および
（ｉｉｉ）プローブ：標的二本鎖が存在するかどうかを決定する工程を含み、二本鎖の存在が試験サンプル中の標的生物の存在について陽性と同定する、試験サンプル中の標的生物を検出する方法を提供する。
【００４４】
プローブは、配列番号１〜配列番号４９、配列番号１７６〜配列番号１８９、および配列番号３７８〜配列番号４４８、またはＲＰＳ７遺伝子のプローブとして作用することもできる配列と実質的に相同であるか実質的に相補的である配列からなる群から選択される配列を有することができる。
【００４５】
本発明の核酸分子およびキットを、１つ以上の酵母種および／または真菌種の存在を検出するか、患者中の酵母および／または真菌の力価を測定するための診断アッセイ、または患者中の酵母および／または真菌の力価を減少させるか、環境中の酵母および／または真菌の汚染を測定するために設計された治療レジメンの有効性を評価する方法で使用することができる。環境は、病院であり得るか、食品サンプル、環境サンプル（例えば、水）、産業サンプル（製造過程サンプルなど）、または生物汚染度または質の評価に必要な最終産物であり得る。
【００４６】
本発明のキットおよび核酸分子を、ＲＰＳ７遺伝子機能を破壊するために使用することができる１つ以上の破壊剤（ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）の同定および／または特徴づけで使用することができる。破壊剤を、アンチセンスＲＮＡ、ＰＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＲＰＳ７遺伝子はＥ．ゴシピイ（Ｅ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ）遺伝子である。いくつかのかかる実施形態では、ＲＰＳ７遺伝子を、配列番号５４、配列番号１９４、配列番号２１２、またはその各ｍＲＮＡ等価物、配列番号５５、配列番号１９５、配列番号２１３またはその一部、またはこれらと実質的に相同であるか、１つ以上の配列の一部と実質的に相補的である配列からなる群から選択することができる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ＲＰＳ７遺伝子はＫ．ラクチス遺伝子である。いくつかのかかる実施形態では、ＲＰＳ７遺伝子を、配列番号５６、配列番号１９６、配列番号２１０、またはその各ｍＲＮＡ等価物、配列番号５７、配列番号１９７、配列番号２１１またはその一部、またはこれらと実質的に相同であるか、１つ以上の配列の一部と実質的に相補的である配列からなる群から選択することができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ＲＰＳ７遺伝子は、Ｄ．ハンセニイイ（Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ）遺伝子である。いくつかのかかる実施形態では、ＲＰＳ７遺伝子を、配列番号６０、配列番号２００、配列番号２１４、またはその各ｍＲＮＡ等価物、配列番号６１、配列番号２０１、配列番号２１５またはその一部、またはこれらと実質的に相同であるか、１つ以上の配列の一部と実質的に相補的である配列からなる群から選択することができる。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態では、種特異的プローブを含む核酸分子を使用して、同一属の種を区別することができる。
【００５１】
例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ菌種特異的プローブは、配列番号６、配列番号７、および配列番号３７８〜配列番号３８５またはその一部、またはこれらと実質的に相同であるか、１つ以上の配列の一部と実質的に相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００５２】
酵母および真菌の標的生物の核酸を検出するための組成物中に本発明のオリゴヌクレオチドを提供することができる。かかる組成物はまた、組成物の意図する使用に応じて適切に、緩衝液、酵素、界面活性剤、塩などを含むことができる。本発明の組成物、キット、および方法は、少なくとも１つの合成オリゴヌクレオチドを含むと本明細書中に記載されているが、合成オリゴヌクレオチドの代わりかこれと共に合成ヌクレオチドフラグメントと実質的に同一の配列を有する天然オリゴヌクレオチドを含むこともできることも想定される。
【００５３】
本発明はまた、少なくとも１つの順方向ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーおよび少なくとも１つの逆方向ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーを含み、順方向増幅プライマーが、配列番号８〜４０、配列番号４１４，配列番号４１７、配列番号４１８、または順方向増幅プライマーとして作用することもできるこれらと実質的に相同であるか実質的に相補的である配列の一つ以上からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーが、配列番号３、配列番号２２〜配列番号４９、配列番号４１５、および配列番号４１６、または逆方向増幅プライマーとして作用することもできるこれらと実質的に相同であるか実質的に相補的である配列の一つ以上からなる群から選択される、標的酵母および／または真菌生物のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅診断キットを提供する。
【００５４】
本発明はまた、候補酵母種および／または真菌種のＲＰＳ７遺伝子配列と実質的に相補的であるか実質的に相同である配列を含む１つ以上のＤＮＡプローブを含む、候補酵母種および／または真菌種の存在を検出するための診断キットを提供する。本発明はまた、ＲＰＳ７遺伝子またはそのｍＲＮＡ転写物、酵母および／または真菌のＲＰＳ７遺伝子またはそのｍＲＮＡ転写物、酵母ＲＰＳ７遺伝子またはそのｍＲＮＡ転写物、１つ以上の配列番号１〜配列番号４６６からなる１つ以上の群と実質的に相同であるか、実質的に相補的であるヌクレオチド配列を有する１つ以上の合成オリゴヌクレオチドを提供する。ヌクレオチドは、ＤＮＡを含むことができる。ヌクレオチドは、ＲＮＡを含むことができる。ヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡの混合物を含むことができる。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含むことができる。本発明の配列（ならびに本発明の方法、キット、組成物、およびアッセイに関連する配列）を、ＲＰＳ７遺伝子のコード領域の一部と実質的に相同であるように選択することができる。遺伝子は、標的酵母または真菌生物由来の遺伝子であり得る。本発明の配列は、好ましくは、配列の一部とプローブ：標的二本鎖を形成することができるのに十分である。
【００５５】
本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチド（合成であってよい）と実質的に相同であるか、実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブを含む標的酵母または真菌生物のための診断キットを提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーとしての使用に適切な配列もオリゴヌクレオチドプローブとしての使用に適切であり得る一方で、増幅プライマーが約１５ヌクレオチドと約３０ヌクレオチドとの間（より好ましくは約１５〜約２３、最も好ましくは約２０〜約２３）の相補部分を有することができ、本発明のオリゴヌクレオチドプローブが任意の適切な長さであり得ることが好ましいことを認識するであろう。当業者は、選択したオリゴヌクレオチドプローブの長さ、性質、構造（例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒのハイブリッド形成プローブ対、Ｔａｑｍａｎ５’エキソヌクレアーゼプローブ、ヘアピンループ構造など）、および配列に応じて異なるハイブリッド形成条件および／またはアニーリング条件が必要であることを認識するであろう。オリゴヌクレオチドプローブを表面上に固定した本発明のキットおよびアッセイも提供することができる。かかる表面は、ビーズ、膜、カラム、ディップスティック、ナノ粒子、診断プレートのウェルなどの反応室の内面もしくは反応チューブの内側、毛細管、または容器などであり得る。
【００５６】
標的酵母または真菌生物を、
【００５７】
【数１】
からなる群から選択することができる。
【００５８】
標的酵母生物は、既に実験的に証明された所与のプライマー対のカンジダ菌種であり得、より好ましくは、
【００５９】
【数２】
からなる群から選択される。これらの環境下では、遺伝子特異的領域または属特異的領域に対する本発明の増幅プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブを、１つ以上、または多数、または実質的に全ての標的酵母生物群の所望の生物を同定することができるように設計することができる。適切な順方向増幅プライマーを、Ｃａｎ１Ｆ：５’−ＡＧＣ ＴＧＧ ＴＴＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＴ−３’（配列番号４０）、配列番号３６、および配列番号３７、ならびに／または配列番号３８と３９との混合物からなる群から選択することができる。適切な逆方向増幅プライマーを、Ｃａｎ２Ｒ：５’−ＴＣＴ ＧＧＧ ＴＡＴ ＣＴＧ ＡＴ（Ａ／Ｇ）ＧＴＴ ＣＴ−３’（配列番号３）、配列番号２、および／または配列番号４と５との混合物、実際は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４６、配列番号４７、および／または配列番号４３〜４５の混合物、および／または配列番号４８〜４９の混合物の１つ以上と実質的に相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択することができる。適切な属特異的オリゴヌクレオチドプローブは、ＣＡＳＰ：５’−ＴＡＡ ＣＡＴ ＣＧＴ ＡＧＧ ＣＴＡ ＡＴＣ−３’（配列番号１）、配列番号６、または配列番号７である。カンジダ菌種特異的プローブを、配列番号３７８〜配列番号４１３からなる群から選択することができる。標的真菌生物は、既に実験的に証明された所与のプライマー対のアスペルギルス菌種であり得、より好ましくは、
【００６０】
【数３】
からなる群から選択される。適切な順方向増幅プライマーは配列番号４１４、配列番号４１７、および配列番号４１８であり得、選択される逆方向プライマーは、配列番号４１５または配列番号４１６であり得る。アスペルギルス菌種特異的プローブを、配列番号４１９〜配列番号４４８からなる群から選択することができる。
【００６１】
試験サンプルは、標的酵母および／または真菌生物の細胞を含むことができる。本方法はまた、上記試験サンプル中に存在し得る標的酵母または真菌生物の任意の細胞から核酸を放出させる工程を含むことができる。理想的には、試験サンプルは、患者から得たサンプル（スワブ、または血液、尿、唾液、気管支洗浄物、歯科標本、皮膚標本、頭皮標本、移植臓器生検、糞便、粘液、または排泄物サンプルなど）の溶解物である。試験サンプルは、食品サンプル、水サンプル、環境サンプル、最終産物、および最終産物または製造過程産業サンプルであり得る。
【００６２】
本発明はまた、１つ以上の酵母種または真菌種の存在についての診断アッセイにおける配列番号１〜４６６のいずれか１つの使用を提供する。種は、
【００６３】
【数４】
【００６４】
【数５】
からなる群から選択することができる。
【００６５】
本発明はまた、１つ以上の本発明の合成オリゴヌクレオチドを含むセラノスティクス、食品安全性診断、産業微生物学診断、環境モニタリング、獣医学的診断、バイオテロ診断で使用するキットを提供する。キットはまた、適切なサンプル回収装置、試薬容器、緩衝液、標識部分、溶液、界面活性剤、および補足液（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）からなる群から選択される１つ以上の材料を含むことができる。本発明はまた、セラノスティクス、食品安全性診断、産業微生物学診断、環境モニタリング、獣医学的診断、バイオテロ診断における本発明の配列、組成物、ヌクレオチドフラグメント、アッセイ、およびキットの使用を提供する。
【００６６】
核酸分子、組成物、キット、または方法を、酵母および／または真菌種の検出のための診断核酸ベースのアッセイで使用することができる。
【００６７】
核酸分子、組成物、キット、または方法を、患者中の酵母および／または真菌の力価を測定するための診断アッセイで使用することができる。力価をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することができる。
【００６８】
核酸分子、組成物、キット、または方法を、治療レジメの１つ以上の重要な段階で（ｉｎ ｖｉｖｏ方法またはｉｎ ｖｉｔｒｏ方法によって）患者中の酵母および／または真菌の力価を評価する工程を含む、患者中の酵母および／または真菌の力価を減少させるように設計した治療レジメの有効性を評価する方法で使用することができる。適切な重要な段階には、治療前、治療中、および治療後が含まれ得る。治療レジメは、医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｒｕｇ）などの抗真菌薬を含むことができる。
【００６９】
核酸分子、組成物、キット、または方法を、例えば、病院における潜在的な酵母および／または真菌の汚染を測定するための診断アッセイで使用することができる。
【００７０】
核酸分子、組成物、キット、または方法を、ＲＰＳ７遺伝子機能を破壊するために使用することができる１つ以上の破壊剤の同定および／または特徴づけで使用することができる。適切な破壊剤を、アンチセンスＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｉＲＮＡからなる群から選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ａ：プライマーＣａｎ１ＦおよびＣａｎ２Ｒを使用して増幅したカンジダ菌種ＲＴ−ＰＣＲ部分的ＲＰＳ７配列のゲル電気泳動；ｂ：Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ種特異的プローブＣＡＳＰの特異性を証明するオートラジオグラフ。ＡおよびＢ：レーン１：マーカーＸＩＶ；２：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ部分的ＲＰＳ７ ＲＴ−ＰＣＲ産物；３：Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ部分的ＲＰＳ７ ＲＴ−ＰＣＲ産物；４：Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ部分的ＲＰＳ７ ＲＴ−ＰＣＲ産物；５：Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ部分的ＲＰＳ７ ＲＴ−ＰＣＲ産物；６：Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ部分的ＲＰＳ７ ＲＴ−ＰＣＲ産物。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅産物を、カンジダ属特異的プライマーＣａｎ１Ｆ：５’−ＡＧＣ ＴＧＧ ＴＴＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＴ−３’（配列番号４０）およびＣａｎ２Ｒ：５’−ＴＣＴ ＧＧＧ ＴＡＴ ＣＴＧ ＡＴ（Ａ／Ｇ）ＧＴＴ ＣＴ−３’（配列番号３）を使用して生成した。
【図２】ＲＰＳ７遺伝子、組み込みプライマー配列番号４０および配列番号３、ならびにＴａｑＭａｎプローブ配列番号３８４に基づくＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのリアルタイムＰＣＲアッセイの包括試験（ｉｎｃｌｕｓｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ）−２０種全てのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ株が検出された。
【図３】ＲＰＳ７遺伝子および組み込みプライマー配列番号４０および配列番号３、ならびにＴａｑＭａｎプローブ配列番号３８４に基づくＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのリアルタイムＰＣＲアッセイの特異性。病理学に関連する他のカンジダ菌種（Ｃ．ｈａｅｍｕｌｏｎｉ、Ｃ．ｋｅｆｙｒ、Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｖｉｓｗａｎｔｈｉｉ、Ｃ．ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ、およびヒトＤＮＡが含まれる）の照合−交差反応は認められなかった。
【図４】ＲＰＳ７遺伝子、組み込みプライマー配列番号４０および配列番号３、ならびにＴａｑＭａｎプローブ配列番号３８４に基づき、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓゲノムＤＮＡの連続希釈物（１０６−ｌ細胞等価物）を含むＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのリアルタイムＰＣＲアッセイの検出限度−検出限度は１０細胞であった。
【図５】ＲＰＳ７遺伝子、組み込みプライマー配列番号４１８および配列番号４１５、ならびにＴａｑＭａｎプローブ配列番号４１９に基づき、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓゲノムＤＮＡ ５０６２の連続希釈物（１０６−ｌ細胞等価物）を含むＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのリアルタイムＰＣＲアッセイの検出限度−現出限度は１細胞等価物であった。
【図６】ＲＰＳ７遺伝子、組み込みプライマー配列番号４１８および配列番号４１５、ならびにＴａｑＭａｎプローブ配列番号４１９に基づくＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（２０株のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のリアルタイムＰＣＲアッセイの包括試験−全てのＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ株が検出された。
【図７】ＲＰＳ７遺伝子、組み込みプライマー配列番号４１８および配列番号４１５、ならびにＴａｑＭａｎプローブ配列番号４１９に基づくＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのリアルタイムＰＣＲアッセイの特異性試験。交差反応性試験パネルは、一定範囲のアスペルギルス菌種を含んでいた−交差反応は検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
発明の詳細な説明
材料と方法
生物および成長条件：カンジダ菌種（ＣＢＳ ５６２）を、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ寒天（４％ ｗｔ／ｖｏｌグルコース、１％ ｗｔ／ｖｏｌペプトン、１．５％寒天）上で、１８０ｒｐｍにて３７℃で一晩成長させた。１つのコロニーを使用して、１０ｍｌのＳａｂｏｕｒａｕｄブロス（Ｏｘｏｉｄ（商標））に接種し、３７℃で一晩成長させた。１ｍｌの一晩培養物を使用して、１００ｍｌ Ｓａｂｏｕｒａｕｄブロス（Ｏｘｏｉｄ（商標））に接種し、指数成長期および静止期まで（それぞれ、８時間および１６時間）成長させた。クロコウジカビを、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ寒天上にて３０℃で４８時間成長させた。皮下注射針を使用して、寒天を突き刺し、１００ｍｌ Ｓａｂｏｕｒａｕｄブロスに移し、４８時間成長させた。傾斜培養（ｓｌｏｐｅ）または乾燥ストック（ｄｅｓｓｉｃａｔｅｄ ｓｔｏｃｋ）由来のアスペルギルス菌種も、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ寒天中にて２５℃で１〜７日間成長させた。
【００７３】
総ＲＮＡの単離：Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓからのＲＮＡ抽出を、指数成長期まで成長させた後にＲＮｅａｓｙ（商標）ミニキット（商標）（Ｑｉａｇｅｎ（商標））を使用して行った。１ｍｌの培養物を、１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、ペレットを１００μｌのＹＩ溶解緩衝液（０．１Ｍ ＥＤＴＡ、１Ｍソルビトール、０．１％β−メルカプトエタノール、および１０００Ｕリチカーゼ（ｌｙｔｉｃａｓｅ））中で再懸濁し、３０℃で２０分間インキュベートした。総ＲＮＡの質を、１．２％ＭＯＰＳ変性ゲルでのゲル電気泳動によって評価し、ＴＢＳ−３８０（商標）ミニフルオロメーター（ ｍｉｎｉｆｌｕｒｏｍｅｔｅｒ）（Ｔｕｒｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を使用した蛍光光度法によって定量した。
ＲＰＳ７真菌／酵母遺伝子特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーの設計：総ＲＮＡを、Ａｍｂｉｏｎ（商標）酵母総ＲＮＡ単離キットを使用して５つのカンジダ菌種（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、およびＣ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）から単離し、製造者の説明書に従ってこれを行った。次いで、５つ全ての単離した総ＲＮＡに対してｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＴ−ＰＣＲ増幅を行って、特徴づけていない酵母種（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、およびＣ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）由来の配列の生成のためのＣａｎ １Ｆ（配列番号４０）およびＣａｎ２Ｒ（配列番号３）の使用を証明した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーである配列番号３および配列番号４０を使用し、製造者の説明書に従ってＴｉｔａｎ Ｏｎｅ Ｔｕｂｅ（商標）ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して試験した全カンジダ菌種由来の単離総ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。次いで、得られたＲＴ−ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅産物を、１．２％アガロースゲルで電気泳動して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅の成功を判断し、その後にサザンブロッティングした（図１Ａ）。特徴づけていないカンジダＲＰＳ７配列由来の残りのＲＴ−ＰＣＲｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅産物を、製造者の説明書に従ってＲｏｃｈｅ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ（商標）ＰＣＲ産物精製キットを使用して精製し、その後に配列決定プライマーとして配列番号４０を使用して配列決定し、これらの生物の新規のＲＰＳ７部分配列データを得た（配列番号６４および６５、６６および６７、６８および６９、７０および７１）。
Ｃａｎ１Ｆ：５’−ＡＧＣ ＴＧＧ ＴＴＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＴ−３’：配列番号４０
Ｃａｎ２Ｒ：５’−ＴＣＴ ＧＧＧ ＴＡＴ ＣＴＧ ＡＴ（Ａ／Ｇ）ＧＴＴ ＣＴ−３’：配列番号３
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＣＲ増幅を使用したカンジダ、出芽酵母、およびＣ．ネオフォルマンス種部分ＲＰＳ７配列の決定−プライマーＣａｎＦ１（配列番号４０）およびＣａｎＲ２（配列番号３）：カンジダ菌種部分ＲＰＳ７配列のヌクレオチド配列データベースを決定および拡大するために、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＣＲ増幅プライマーＣａｎＦ１（配列番号４０）およびＣａｎ２Ｒ（配列番号３）の多様な用途をさらに証明するために、一連のＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅を、以下のカンジダ株に対して行った：Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ株１７８、１８０、３２０、３６９、７６５、１６７３３、１５６０、９５５９、４１５４、２７００、５６２、３８２２、３１５６、３３４５、３３２８、Ｃ．ドゥブリニエンシス３９４９、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ株、９０８７、４６９２、２０５４４４、１０２６９、９５５６、５５６３、３９５９、１３８、３６０５、３８９７、８０１８、３８６３、３９０２、６０４、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ株、３９０２、６０４、２１９４、２１９６、１００１、１７１６、９５５７、５５７９、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ株５５７９、９５６０、６０５５、１７５１８、５７３、３１６５、３９２２、３８４７、およびＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株３８９５、９４、４２２５、５５５７、１５９０２、４１３９、３８７３、３８７０、８１５７、２３１１。総ゲノムＤＮＡを、Ｅｄｇｅ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓゲノムＤＮＡ精製キットを使用してこれらの各株から単離し、精製ＤＮＡの完全性を、１．２％アガロースゲルでの各単離ＤＮＡサンプルの電気泳動によって決定した。次いで、各ＤＮＡサンプルを、製造者の説明書に従ってＣａｎＦ１およびＣａｎＲ２と組み合わせてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＣＲ増幅に供した。次いで、各カンジダ株ゲノムＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物を、Ｒｏｃｈｅ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ産物精製キットを使用して精製した。次いで、精製ＰＣＲ産物を、配列プライマーとしてＣａｎＦ１を使用したヌクレオチド配列決定に供した。これにより、試験した全カンジダ株についての新規の部分ＲＰＳ７ヌクレオチド配列が生成された。配列番号６２〜配列番号１７５によって示した配列は、試験した上記のカンジダ株について生成した部分ＲＰＳ７ヌクレオチド配列を示す。さらに、ＰＣＲ増幅プライマーである配列番号４０および配列番号３を使用して、カンジダ菌種（ｎ＝２０種、ｎ＝１２０株）から抽出したＤＮＡを増幅した。これらのプライマーは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＲＰＳ７遺伝子の５０８〜７１１位（受入番号：Ｕ３７００９）と等価なＲＰＳ７遺伝子の２０４ｂｐ領域を増幅する。リチカーゼ酵素でのカンジダ菌種細胞の前処理後にＭａｇＮＡピュア酵母よび細菌単離キットＩＩＩを使用して、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でＤＮＡを抽出した。いくつかのＤＮＡ抽出物を、ＥａｓｙＭａｇシステム（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を使用して得た。表１の概説の試薬および条件を使用してＰＣＲ増幅を行った。ＤＮＡ配列決定のＰＣＲ産物を、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴキット（ＵＳＢ）またはＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ精製キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して浄化した。配列番号４０のプライマーを使用して、外部配列サービスプロバイダーであるＳｅｑｕｉｓｅｒｖｅ（Ｇｅｒｍａｎｙ）がカンジダ菌種のＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定を開始した。さらに、ＰＣＲプライマーである配列番号４０および配列番号３を使用して、Ｃ．ネオフォルマンスおよび出芽酵母種由来のＤＮＡを増幅した。配列番号４０のプライマーを使用して、ＰＣＲ産物も外部配列プロバイダーであるＳｅｑｕｉｓｅｒｖｅ（Ｇｅｒｍａｎｙ）が配列決定した。配列番号２２２〜配列番号３２５は、カンジダ菌種ｒｐｓ７遺伝子（２０４ｂｐ）配列を示す。配列番号４４９は、出芽酵母ｒｐｓ７遺伝子（２０４ ｂｐ）配列を示し、配列番号４５１はＣ．ネオフォルマンスｒｐｓ７遺伝子配列を示す。
表１：カンジダ菌種である出芽酵母およびＣ．ネオフォルマンスにおいてＲＰＳ７遺伝子を増幅するために使用したＰＣＲ試薬および条件。
【００７４】
【表１−１】
【００７５】
【表１−２】
アスペルギルス菌種のＲＰＳ７遺伝子エクソン３配列情報の作成
ＰＣＲプライマーである順方向プライマー配列番号４１４および逆方向プライマー配列番号４１５を、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのＲＰＳ７中の６６４〜９８０位（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：ＸＭ＿７４９４５３（アスペルギルス菌種））由来のエクソン３（３１７ｂｐ）を増幅するように設計した。これらのプライマーを使用して８種由来のＤＮＡ（ｎ＝６７株−表２）をＰＣＲ増幅し、これらの株についてのエクソン３フラグメントの配列情報を連続的に得た。独立したプライマー対である順方向プライマー配列番号４１７および逆方向プライマー配列番号４１６を設計し、適用して、クロコウジカビ株中のＲＰＳ７遺伝子（エクソン３−３１７ｂｐ）を増幅した（ｎ＝１０−表２）。これらのプライマーを使用して、表３に記載の条件を使用して、ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）にてアスペルギルス菌種中のＲＰＳ７エクソン３（３１７ｂｐ）のＰＣＲ増幅を行った。ＤＮＡ配列決定のためのＰＣＲ産物を、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ精製キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して浄化した。外部配列サービスプロバイダーであるＳｅｑｕｉｓｅｒｖｅ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって配列番号４１４および配列番号４１７（順方向）プライマーを使用してＤＮＡ配列決定を行った。
表２：ＲＰＳ７遺伝子のエクソン３を配列決定したアスペルギルス菌種および株。
【００７６】
【表２】
表３：ＤＮＡ配列決定のためのアスペルギルス菌種中のＲＰＳ７遺伝子のエクソン３の３１７ｂｐ領域のＰＣＲ増幅のために使用したＰＣＲ試薬およびＰＣＲ条件。
【００７７】
【表３−１】
【００７８】
【表３−２】
ＲＰＳ７遺伝子配列に基づいたプロトタイプ種特異的Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ核酸診断（ＮＡＤ）アッセイの開発：次いで、新規および既に存在するＲＰＳ７配列データ（配列番号６２〜配列番号１７５）を試験し、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ種特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＣＡＳＰ、配列番号１）を同定し、上記のようにサザンブロットへのハイブリッド形成での使用するために合成した。ＣＡＳＰ（配列番号１）オリゴヌクレオチドプローブの５’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してγＰ３２で放射性標識し、サザンブロットと５５℃で２時間ハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成溶液を取り出し、ブロットに６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて室温で１０分間の洗浄を２回行い、その後に６ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにて５５℃で１分間の高ストリンジェンシー洗浄を行った。ブロットをＸ線フィルムに曝露し、−７０℃で２時間オートラジオグラフィを行った。図１Ｂは、ＣＡＳＰ種特異的オリゴヌクレオチドプローブのみがＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのＲＴ−ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅産物とハイブリッド形成した。したがって、目的の酵母種の検出のための標的としてのＲＰＳ７核酸配列の使用および潜在性が証明された。
ＣＡＳＰ：５’−ＴＡＡ ＣＡＴ ＣＧＴ ＡＧＧ ＣＴＡ ＡＴＣ−３’：配列番号１
カンジダ菌種のオリゴヌクレオチドプローブの設計
各種（配列番号２２２〜配列番号３２５）について得た異なる配列型を示すカンジダ菌種中のＲＰＳ７遺伝子２０４ｂｐ標的領域について得た配列情報をアラインメントし、生物情報学ツール（ＣｌｕｓｔａｌＷおよびＢＬＡＳＴプログラムが含まれる）を使用して分析し、異なるカンジダ菌種の同定のためのオリゴヌクレオチドプローブを設計した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号３７８〜配列番号３８５を設計した。Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号３８６〜配列番号３８９を設計した。Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号３９０〜配列番号３９３を設計した。Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号３９４〜配列番号４０５を設計した。Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４０６〜配列番号４１３を設計した。
【００７９】
プライマー配列番号４０および配列番号３ならびにオリゴヌクレオチドプローブ配列番号３７８〜配列番号４１３を使用して、カンジダ菌種のための核酸診断アッセイを設計した。開発したアッセイの例には、５つのカンジダ菌種（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、およびＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓが含まれる）のためのリアルタイムＰＣＲ ＴａｑＭａｎアッセイが含まれる。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓアッセイの例は、プライマー配列番号４０および配列番号３ならびにオリゴヌクレオチドプローブ配列番号３８４を含む（図２）。Ｃ．ｋｒｕｓｅｉのアッセイの例は、プライマー配列番号４０および配列番号３ならびにプローブ配列番号３８６を含む。Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａのアッセイの例は、プライマー配列番号４０および配列番号３ならびにプローブ配列番号４１２を含む。Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのアッセイの例は、プライマー配列番号４０および配列番号３ならびにプローブ配列番号４００を含む。Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓのアッセイの例は、プライマー配列番号４０および配列番号３ならびにプローブ配列番号３９２を含む。これらの種特異的アッセイをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ装置で設定し、表４に記載の条件および試薬を使用して行う。各種アッセイを、種の２０種の株の包括性（ｉｎｃｌｕｓｉｖｉｔｙ）について試験し、各種アッセイについて、関連株（ｎ＝２０）を検出した。各種アッセイを、種のパネル（１９種のカンジダ、２４種の他の酵母および皮膚糸状菌、９種のアスペルギルス、１５種の細菌種、およびヒトＤＮＡが含まれる）に対する交差反応性について試験した（表５）。各種アッセイにより、検出するように設計した種の株のみが検出され、他のカンジダ菌種、アスペルギルス菌種、他の酵母、皮膚糸状菌、細菌、またはヒトＤＮＡ由来のＤＮＡと交差反応しなかった。図３は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ種特異的アッセイを使用した特異性研究の例を示す。アッセイの検出限度（ＬＯＤ）または感度を、関連種由来のゲノムＤＮＡの１０回連続希釈（１０６−ｌ細胞等価物）を使用して決定した。各種アッセイについて１０種の細胞等価物の検出限度を確立した。図４は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓアッセイについて得た検出限度を示す。
表４：ＰＣＲ試薬およびサーモサイクリング条件：
【００８０】
【表４−１】
【００８１】
【表４−２】
カンジダ菌種およびＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓアッセイでの交差反応性試験のために含まれる種のパネル
【００８２】
【化１−１】
オリゴヌクレオチドプライマーおよびアスペルギルス菌種のためのプローブの設計
ＤＮＡ配列決定後（エクソン３ ＲＰＳ７（３１７ｂｐ））、各種（配列番号３２６〜配列番号３７７）について得た異なる配列型を示すアスペルギルス菌種から増幅したＰＣＲ産物のために生成した配列情報をアラインメントし、生物情報学ツール（ＣｌｕｓｔａｌＷおよびＢＬＡＳＴプログラムが含まれる）を使用して分析した。ＰＣＲプライマー配列番号４１８を、ＰＣＲプライマー配列番号４１５と組み合わせて、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよび他のアスペルギルス菌種中のＲＰＳ７遺伝子の１２５ｂｐ領域の増幅のために設計した。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの同定ために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４１９〜配列番号４２４を設計した。Ａ．カンジダスの同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４２５〜配列番号４２８を設計した。Ａ．テレウスの同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４２９〜配列番号４３２を設計した。Ａ．ベルシカラの同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４３３〜配列番号４３６を設計した。Ａ．ニデュランスの同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４３７〜配列番号４４０を設計した。Ａ．フラバスの同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４４１および配列番号４４２を設計した。Ａ．クラバタスの同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４４３〜配列番号４４８を設計した。
アスペルギルス菌種（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のための核酸ベースの診断アッセイ：
アスペルギルス菌種のための核酸診断アッセイを、プライマー配列番号４１４〜配列番号４１８およびオリゴヌクレオチドプローブ配列番号４１９〜配列番号４４８を使用して設計した。開発したアッセイの一例は、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのためのリアルタイムＰＣＲ ＴａｑＭａｎアッセイ（プライマー配列である配列番号４１８および配列番号４１５ならびにＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブ配列番号４１９を含む）である。このアッセイを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ装置で設定し、表４に記載の条件および試薬を使用して行う。アッセイの検出限度（ＬＯＤ）または感度を、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ株番号５０６２由来のゲノムＤＮＡの１０回連続希釈（１０６−ｌ細胞等価物）を使用して決定した。図５は、１ゲノム等価物としてのＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓアッセイのＬＯＤを示す。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓアッセイの特異性を、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの２０株を使用した包括性についてのＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓアッセイの試験によって確認した。アッセイで全２０株が検出された（図６）。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓアッセイを、パネル（２０種のカンジダ、２４種の皮膚糸状菌、８種のアスペルギルス菌種、１５の細菌種、およびヒトＤＮＡが含まれる）に対する交差反応性についてチェックした。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓアッセイにおいてこれらの株／種またはヒトＤＮＡの交差反応は存在しなかった（表５）。図７は、アスペルギルス菌種ＤＮＡのパネルを使用して行った交差反応研究の例を示す。
【００８３】
本明細書中に開示の任意の配列がＰａｔｅｎｔＩｎ３．３ソフトウェア中の添付の配列表中のその対応物と異なる限りにおいて、テキスト本文内の配列は、正確なバージョンとして認識すべきである。
【００８４】
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ／ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」および用語「ｈａｖｉｎｇ／ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は、本発明に関連して本明細書中で使用される場合、記載の特徴、整数、工程、または成分の存在を特定するために使用するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、成分、またはその群の存在または付加を排除しない。
【００８５】
明確にするために個別の実施形態の文脈で記載される本発明の一定の特徴を、１つの実施形態と組み合わせて提供することもできると認識される。逆に、簡潔にするために１つの実施形態の文脈で記載される本発明の種々の特徴を、個別または任意の適切なサブコンビネーション（ｓｕｂｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）で提供することもできる。配列番号、プローブの部位、オリゴヌクレオチドなどを太字および下線で示す。
Ｎまたはｘ＝任意のヌクレオチド；ｗ＝ａ／ｔ、ｍ＝ａ／ｃ、ｒ＝ａ／ｇ、ｋ＝ｇ／ｔ、ｓ＝ｃ／ｇ、ｙ＝ｃ／ｔ、ｈ＝ａ／ｔ／ｃ、ｖ＝ａ／ｇ／ｃ、ｄ＝ａ／ｇ／ｔ、ｂ＝ｇ／ｔ／ｃ。
【００８６】
一部の例では、特異的縮重オプションを、括弧内に示す：例えば、（ａ／ｇ）はＡまたはＧのいずれかである。
【００８７】
【化１−２】
【００８８】
【化２】
【００８９】
【化３】
【００９０】
【化４】
【００９１】
【化５】
【００９２】
【化６】
【００９３】
【化７】
【００９４】
【化８】
【００９５】
【化９】
【００９６】
【化１０】
【００９７】
【化１１】
【００９８】
【化１２】
【００９９】
【化１３】
【０１００】
【化１４】
【０１０１】
【化１５】
【０１０２】
【化１６】
【０１０３】
【化１７】
【０１０４】
【化１８】
【０１０５】
【化１９】
【０１０６】
【化２０】
【０１０７】
【化２１】
【０１０８】
【化２２】
【０１０９】
【化２３】
【０１１０】
【化２４】
【０１１１】
【化２５】
【０１１２】
【化２６】
【０１１３】
【化２７】
【０１１４】
【化２８】
【０１１５】
【化２９】
【０１１６】
【化３０】
【０１１７】
【化３１】
【０１１８】
【化３２】
【０１１９】
【化３３】
【０１２０】
【化３４】
【０１２１】
【化３５】
【０１２２】
【化３６】
【０１２３】
【化３７】
【０１２４】
【化３８】
【０１２５】
【化３９】
【０１２６】
【化４０】
【０１２７】
【化４１】
【０１２８】
【化４２】
【０１２９】
【化４３】
【０１３０】
【化４４】
【０１３１】
【化４５】
【０１３２】
【化４６】
【０１３３】
【化４７】
【０１３４】
【化４８】
【０１３５】
【化４９】
【０１３６】
【化５０】
【０１３７】
【化５１】
【図１ＡａｎｄＢ】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、リボゾームタンパク質遺伝子、対応するｍＲＮＡ、ならびにこれらに関連する特異的プローブ、プライマー、およびオリゴヌクレオチド、酵母種および真菌種を検出および／または識別するための診断アッセイにおけるその使用に関する。特に、本発明は、リボゾームタンパク質ＲＰＳ７に対応する遺伝子およびその対応するｍＲＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
感染の原因としての酵母および真菌の検出および同定は、これまでにないほど重要である。酵母および真菌感染の危険性がある免疫不全患者数は、増加し続けており、疾患を引き起こす真菌因子の範囲も同様である。真菌感染、特に侵襲性真菌感染による死亡率は、一定の危険な状態にある患者群で３０％以上である（“Ｓｔａｋｅｈｏｌｄｅｒ Ｉｎｓｉｇｈｔ：Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”，Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ，Ｊａｎ ２００４）。一連の利用可能な抗真菌薬は増加しているが、抗真菌薬に対する固有および新たな耐性の両方の認識も増加している。これらの要因により、臨床試験の費用を抑制する必要性が増大し、試験手順において実験が統合されている。
【０００３】
侵襲性真菌感染は増加傾向にある。２００３年では、９００万人の危険な状態にある患者のうち１２０万人が感染症を発症したと見積もられた。免疫不全患者（移植患者、手術患者、新生児、癌患者、糖尿病患者、およびＨＩＶ／ＡＩＤ患者が含まれる）は、侵襲性真菌感染を発症する危険性が高い（Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ ｒｅｐｏｒｔ：Ｓｔａｋｅｈｏｌｄｅｒ ｏｐｉｎｉｏｎ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｏｐｔｉｏｎｓ ｏｕｔｗｅｉｇｈ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ２００４）。多数の重症敗血症が年を追って報告されている。その医学的管理が改善されているにもかかわらず、敗血症は、依然として集中治療における最大の課題の１つを構成している。敗血症の発症を担う微生物（細菌、真菌、および酵母）は、伝統的には、微生物学的培養方法を用いて病院検査室で検出され、この方法は、感度が低く（２５〜８２％）、非常に時間がかかり、一般に、完了までに２〜５日間を要し、真菌感染の診断には８日間までを要する。確定診断は、通常、臨床標本からの特定の作用因子（ａｇｅｎｔ）の回収および同定または明確な形態学的特徴を有する真菌の微視的証明のいずれかに基づく。しかし、これらの方法によって感染菌に関する決定的証拠を得ることができない症例が多数存在する。これらの場合、特定の宿主抗体応答の検出を使用することができるが、この場合も患者の免疫状態に影響を受け得る。典型的に細菌および真菌に起因する血流感染の検出および同定で時間は重要である。有効な治療は、感染源の発見および迅速且つ有効な抗生物質または抗真菌剤の適切な決定に依存する。病原体が正確に同定された後のみに、特定の抗生物質を使用した標的療法を開始することができる。多数の医師が酵母および真菌の早期診断のためのより良好なｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅および直接検出診断技術の開発を望んでいる（“Ｓｔａｋｅｈｏｌｄｅｒ Ｉｎｓｉｇｈｔ：Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”，Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ，Ｊａｎ ２００４）。最近、Ｒｏｃｈｅ（商標）は、臨床サンプル中の細菌、真菌、および酵母のＤＮＡの検出のためのリアルタイムＰＣＲベースのアッセイ（Ｓｅｐｔｉｆａｓｔ（商標））を販売した。したがって、臨床領域における生体分析に適用するための臨床的に有意な細菌病原体および真菌病原体の新規の迅速な診断試験の開発が明確に必要とされている。これにより、本発明者らは、核酸診断（ＮＡＤ）試験で適用するための新規の真菌および酵母核酸標的を検索および同定した。
【０００４】
カンジダ菌種およびアスペルギルス菌種は、現在、免疫不全患者に感染する最も重要な病原体に位置づけられている。特に、感染は、尿路、呼吸器系、および血流、ならびにステント、カテーテル、および整形外科的接合部の挿入部位によく認められる。公知のカンジダ菌種のおよそ１０％がヒト感染に関与している。侵襲性カンジダ症は、カンジダが血流に侵入した場合に起こり、米国の人口１００，０００人あたり８人の頻度で生じ、死亡率は４０％と見積もられている。Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓは、血流感染の４番目に最も一般的な原因である。アスペルギルス症は、通常、肺感染症として始まり、患者によっては生命にかかわる侵襲性感染症に進行する可能性があり、死亡率は９０％を超える。新興真菌症の作用因子には、フサリウム属、スケドスポリウム属、接合菌類、およびトリコスポロン菌種が含まれる（“Ｓｔａｋｅｈｏｌｄｅｒ Ｉｎｓｉｇｈｔ：Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”，Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ，Ｊａｎ ２００４）。
【０００５】
真菌および酵母核酸ベースの診断は、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子、ＲＮＡ転写物、およびその関連するＤＮＡ／ＲＮＡ領域を重視する。ｒＲＮＡ遺伝子は、全ての真菌種で高度に保存されており、これらは、異なる特徴的な遺伝子間転写スペーサー領域も含む。リボゾームｒＲＮＡは、以下の３つの遺伝子を含む：大サブユニット遺伝子（２８Ｓ）、小サブユニット遺伝子（１８Ｓ）および５．８Ｓ遺伝子。２８Ｓ遺伝子および１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、５．８Ｓ ｒＲＮＡおよび２つの内部転写スペーサー（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２）によって分断されている。ＩＴＳ領域が多数の配列多型を含むので、多数の研究者は、これらを標的として重視している（Ａｔｋｉｎｓ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，２００４）。ｒＲＮＡ遺伝子はまた、真菌ゲノム内に１０個を超えるコピーを有する多コピー遺伝子である。
【０００６】
多数のグループが、真菌および酵母感染のための新規のアッセイの開発に取り組んでいる。特許文献１は、多数の他の態様のうち、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの転写因子ＣａＴＥＣ１、そのインヒビター、およびカンジダ感染に関与する疾患の診断および治療方法に関し、ヌクレオチド配列、タンパク質、宿主細胞、および／または抗体を含む診断および薬学的組成物にも関する。特許文献２は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよび／またはカンジダ・ドゥブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）由来のリボゾーム核酸を検出するためのハイブリッド形成アッセイプローブおよびアクセサリーオリゴヌクレオチドに関する。特許文献３および特許文献４は、５つの医学的に重要なカンジダ菌種由来のＤＮＡを増幅および種分化するために使用することができるＤＮＡプライマー組に関する。特許文献５は、カンジダ感染の診断に有用な配列を開示している。一定範囲の酵母種および真菌種の診断について、特許文献６および特許文献７は１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づくプローブを開示し、特許文献８は、２８Ｓ ｒＲＮＡに基づくプローブを開示している。特許文献９は、一定範囲のカンジダ菌種の核酸ベースの診断で用いるキチンシンターゼ遺伝子に基づいた配列を記載している。
【０００７】
変異ゲノム配列を有する耐性のある毒性株集団を増加させる現代の抗菌治療によって生じる淘汰圧を特に考慮して、より迅速でより正確な診断方法の開発が必要であることが明確である。感染原因となる微生物の早期診断が可能な方法により、感染を治療するための特定の狭域の抗生物質または抗真菌薬を選択することができる（非特許文献１）。
【０００８】
ＲＰＳ７は、７０を超えるリボゾームタンパク質のうちの１つである。これは、原核生物および真核生物で認められ、ｒＲＮＡの折り畳みにおいてリボゾーム小サブユニット中で機能し、リボゾーム小サブユニットのヘッドを形成する。ｒｐｓ７遺伝子はリボゾーム内に保存された機能を有する必須タンパク質をコードする。酵母では、例えば、出芽酵母ＲＰＳ７は、１４塩基対の位置が異なり、各遺伝子が１つのイントロンを有する２つの遺伝子によってコードされる。Ｓｙｎｅｔｏｓら（１９９２）は、サッカロミセスは１遺伝子コピーで生存することができるが、両方の欠失で死滅することを示した。Ｄｅｌｂｒｒｕｃｋら（１９９７）は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ中のＲＰＳ７遺伝子をクローン化および配列決定し（ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 Ｕ３７００９）、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ中のｒｐｓ７がイントロンを欠き、Ｓ．セレビシエ中のＲＰＳ７タンパク質とアミノ酸レベルで８３％相同であることを割り出した。このグループは、ＲＰＳ７遺伝子がｒＲＮＡの３〜６倍の発現レベルで菌糸形成中に上方制御されることも示した。これにより、酵母形態から菌糸形成への形態形成がカンジダ菌種感染に重要であるので、遺伝子が臨床的に関連することが示唆される。アスペルギルス菌種、特に、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓでは、ＲＰＳ７遺伝子は、３つのエクソンおよび２つのイントロンを含み、それにより、遺伝子構造は酵母で認められるものと異なる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０４４１９３号明細書
【特許文献２】国際公開第０１／８３８２４号パンフレット
【特許文献３】米国特許第６，０１７，６９９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，４２６，０２６号明細書
【特許文献５】米国特許第６，７４７，１３７号明細書
【特許文献６】欧州特許第０，４２２，８７２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，６５８，７２６号明細書
【特許文献８】米国特許第５，９５８，６９３号明細書
【特許文献９】米国特許第６，０１７，３６６号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ ｒｅｐｏｒｔ：Ｓｔａｋｅｈｏｌｄｅｒ ｏｐｉｎｉｏｎ −Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｏｐｔｉｏｎｓ ｏｕｔｗｅｉｇｈ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ２００４；Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ ｒｅｐｏｒｔ：Ｓｔａｋｅｈｏｌｄｅｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ−Ｓｅｐｓｉｓ，ｕｎｄｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ ａｎ ｏｖｅｒｒｅａｃｔｉｏｎ，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、１つ以上の酵母種または真菌種の検出および同定で使用することができる配列および／または診断アッセイを提供することである。本発明者らは、カンジダおよびアスペルギルス遺伝子特異的プライマーを設計するためにｒｐｓ７遺伝子の構造構成（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を活用している。これは、共生生物としてカンジダを含むサンプル中の真菌病原体を同定したい場合にユニバーサルプライマーの使用アプローチがうまく行かないかもしれないという点で先行技術よりも有利である。カンジダが増幅過程において真菌病原体からの調節を脱して優先的に増幅され、それにより、病原体を検出することができない可能性が高い。さらに、Ｄｅｌｂｒｕｃｋら、１９９７によって、１つの種における異なる染色体上のｒｐｓ７遺伝子の異なる対立遺伝子間の配列の相違が異なる関連する無性種における遺伝子間よりもはるかに異なり得ることが示唆されている。これにより、当業者は、分子診断の標的としてのこの遺伝子の選択を回避するであろう。また、いくつかの種（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓなど）で異なる配列型が存在し、このことも分子診断の標的遺伝子としてのこの遺伝子の選択を回避させているであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
定義
本明細書中で使用される場合、以下の用語は、明らかに別の意味で記載されない限り、所与の意味を有する。
【００１３】
「合成オリゴヌクレオチド」は、ゲノムＤＮＡまたは生きている生物に直接由来しない２つ以上のヌクレオチド塩基の核酸ポリマー分子をいう。用語「合成オリゴヌクレオチド」は、化学的に製造されたか、ｉｎ ｖｉｔｒｏで酵素的に合成されたＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子を含むことが意図される。「オリゴヌクレオチド」は、互いに共有結合した２つ以上のヌクレオチドサブユニットを有するヌクレオチドポリマーである。オリゴヌクレオチドは、一般に、約１０〜約１００ヌクレオチドである。ヌクレオチドサブユニットの糖類は、リボース、デオキシリボース、またはＯＭｅなどのその修飾誘導体であり得る。ヌクレオチドサブユニットを、ホスホジエステル結合、修飾結合（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ）などの結合、またはオリゴヌクレオチドのその相補的標的ヌクレオチド配列とのハイブリッド形成を妨害しない非ヌクレオチド部分によって結合することができる。修飾結合には、標準的なホスホジエステル結合をホスホロチオアート結合、メチルホスホナート結合、または中性ペプチド結合などの異なる結合と置換する修飾結合が含まれる。窒素塩基アナログはまた、本発明のオリゴヌクレオチドの成分であり得る。
【００１４】
「標的核酸」は、標的核酸配列を含む核酸である。「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、または「標的配列」は、相補的オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することができる特異的なデオキシリボヌクレオチド配列またはリボヌクレオチド配列である。
【００１５】
「オリゴヌクレオチドプローブ」は、高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件下で検出可能なハイブリッドプローブ：標的二本鎖を形成することができるのに十分にその標的核酸配列と相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドプローブは、単離化学種であり、かかるヌクレオチドが高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件下でのハイブリッド形成を妨害しない限り、標的化領域の外側にさらなるヌクレオチドを含むことができる。プロモーター配列、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、または所望の二次構造また三次構造を付与する配列（触媒活性部位など）などの非相補性配列を使用し、本発明のプローブを使用して検出を促進することができる。オリゴヌクレオチドプローブを、任意選択的に、プローブのその標的配列とのハイブリッド形成を検出または確認することができる放射性同位体、蛍光部分、化学発光物質、ナノ粒子部分、酵素、またはリガンドなどの検出可能な部分で標識することができる。オリゴヌクレオチドプローブは約５００ヌクレオチド長と同程度またはそれを超えるか、１０ヌクレオチド長未満であることが可能であるが、オリゴヌクレオチドプローブは、約１０〜約１００ヌクレオチド長の範囲のサイズであることが望ましい。
【００１６】
「ハイブリッド」または「二本鎖」は、相補塩基間のワトソン−クリック塩基対合または非標準塩基対合によって２つの一本鎖核酸配列の間に形成された複合体である。「ハイブリッド形成」は、核酸の２つの相補鎖が組合わさって二本鎖構造（「ハイブリッド」または「二本鎖」）を形成する過程である。
【００１７】
「真菌」または「酵母」は、真菌界の任意の生物を意味し、好ましくは子嚢菌門の任意の生物に関し、最も好ましくは半子嚢菌綱の任意の生物に関する。
【００１８】
「相補性」は、各鎖におけるワトソン−クリック塩基対間の水素結合によってハイブリッドまたは二本鎖ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、またはＤＮＡ：ＲＮＡを形成することができるＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖の塩基配列によって付与される性質である。アデニン（Ａ）は、通常、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）と相補性を示し、グアニン（Ｇ）は、通常、シトシン（Ｃ）と相補性を示す。
【００１９】
用語「ストリンジェンシー」を、ハイブリッド形成およびその後のプロセシング工程中に存在する温度、イオン強度、および溶媒組成を記載するために使用する。当業者は、「ストリンジェンシー」条件を種々のパラメーターを個別または共に変更することによって変化させることができることを認識するであろう。高ストリンジェンシー条件下では、相補性の高い核酸ハイブリッドのみが形成され、十分な相補性を持たないハイブリッドは形成されないであろう。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成する２つの核酸鎖間に必要な相補性量を決定づける。ストリンジェンシー条件を、標的核酸および非標的核酸と形成されるハイブリッド間の安定性の相違が最大になるように選択する。
【００２０】
「高ストリンジェンシー」条件を使用して、核酸塩基対合は、高頻度の相補性塩基配列を有する核酸フラグメント間のみに起こるであろう（例えば、「高ストリンジェンシー」条件下でのハイブリッド形成は、約８５〜１００％同一、好ましくは約７０〜１００％同一のホモログ間で起こり得る）。中ストリンジェンシー条件を使用して、核酸塩基対合は、中程度の頻度の相補性塩基配列を有する核酸間で起こるであろう（例えば、「中ストリンジェンシー」条件下でのハイブリッド形成は、約５０〜７０％同一のホモログ間で起こり得る）。したがって、「弱」または「低」ストリンジェンシー条件には、しばしば、相補配列の頻度が通常低い遺伝学的に異なる生物由来の核酸が必要である。
【００２１】
「高ストリンジェンシー」条件は、４２℃の５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整する）、０．５％ ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での結合またはハイブリッド形成、およびその後の４２℃の０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液での洗浄と等価な条件（約５００ヌクレオチド長のプローブを使用する場合）である。
【００２２】
「中ストリンジェンシー」条件は、４２℃の５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整する）、０．５％ ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での結合またはハイブリッド形成、およびその後の４２℃の１．０×ＳＳＰＥ、１．０％ ＳＤＳを含む溶液での洗浄と等価な条件（約５００ヌクレオチド長のプローブを使用する場合）である。
【００２３】
「低ストリンジェンシー」条件は、４２℃の５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整する）、０．１％ ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬［５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔは、５００ｍｌあたり以下を含む：５ｇ Ｆｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ４００、Ｐｈａｒａｍｃｉａ）、５ｇ ＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ；Ｓｉｇｍａ）］、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での結合またはハイブリッド形成、およびその後の４２℃の５×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳを含む溶液での洗浄と等価な条件（約５００ヌクレオチド長のプローブを使用する場合）である。
【００２４】
核酸ｉｎ−ｖｉｔｒｏ増幅ベースのテクノロジーに関しては、「ストリンジェンシー」を、特にｉｎ−ｖｉｔｒｏ増幅テクノロジーに対する温度条件および緩衝液のイオン条件の適用によって達成する。例えば、ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲに関しては、「ストリンジェンシー」を、プローブのリアルタイムＰＣＲハイブリッド形成に関して、標的核酸のｉｎ−ｖｉｔｒｏ増幅のための標的核酸へのオリゴヌクレオチドプライマーのための特定の温度および緩衝液のイオン強度の適用によって得る。
【００２５】
例えば、ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅ベースの検出系に関して使用する場合、「高ストリンジェンシー」は、１．５〜８ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む緩衝液環境における５５℃〜６５℃の範囲のハイブリッド形成（アニーリング）温度条件を含む。
【００２６】
例えば、ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅ベースの検出系に関して使用する場合、「中ストリンジェンシー」は、１．５〜８ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む緩衝液環境における４５℃〜５４℃の範囲のハイブリッド形成（アニーリング）温度条件を含む。
【００２７】
例えば、ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅ベースの検出系に関して使用する場合、「低ストリンジェンシー」は、１．５〜８ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む緩衝液環境における４０℃〜４４℃の範囲のハイブリッド形成（アニーリング）温度条件を含む。
【００２８】
当業者は、本発明の実質的に対応するプローブが言及した配列と異なるが、依然として同一の標的核酸配列とハイブリッド形成することができると理解するであろう。核酸由来のこの変動を、配列内の同一塩基の比率またはプローブとその標的配列との間の完全に相補的な塩基の比率に関して言及することができる。本発明のプローブは、これらの比率が約１００％〜約８０％であるか、約１０ヌクレオチド標的配列中の０塩基ミスマッチから約１０ヌクレオチド標的配列中の２塩基ミスマッチまでである場合に核酸配列に実質的に対応する。好ましい実施形態では、比率は約１００％〜約８５％である。より好ましい実施形態では、この比率は約９０％〜約１００％であり、他の好ましい実施形態では、この比率は約９５％〜約１００％である。
【００２９】
「十分に相補的な」または「実質的に相補的な」は、高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件下で検出に安定なハイブリッドを形成するのに十分な量の連続的相補ヌクレオチドを有する核酸を意味する。
【００３０】
「核酸ハイブリッド」または「プローブ：標的二本鎖」は、好ましくは約１０〜約１００ヌクレオチド長、より好ましくは１４〜５０ヌクレオチド長の二本鎖の水素結合構造である構造を意味するが、この長さはオリゴヌクレオチドプローブの全長に依存するであろう。構造は、化学発光または蛍光の検出、オートラジオグラフィ、電気化学分析、またはゲル電気泳動などの手段による検出に対して十分に安定である。かかるハイブリッドには、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖分子が含まれる。
【００３１】
「ＲＮＡ等価物およびＤＮＡ等価物」は、同一の相補塩基対ハイブリッド形成特性を有するＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子をいう。ＲＮＡ等価物およびＤＮＡ等価物は、異なる糖類（すなわち、リボース対デオキシリボース）を有し、ＲＮＡ中のウラシルの存在およびＤＮＡ中のチミンの存在が異なり得る。等価物が特定の配列と同程度の相補性を有するので、ＲＮＡ等価物とＤＮＡ等価物との間の相違は、実質的に対応する核酸配列の相違に寄与しない。
【００３２】
「優先的にハイブリッド形成する」は、高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件下でオリゴヌクレオチドプローブがその標的核酸とハイブリッド形成して、安定なプローブ：非標的ハイブリッド（他の生物由来の非標的核酸の存在を示すであろう）を形成することなく、安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成する（それにより、標的核酸の存在を示す）ことができることを意味する。したがって、プローブは、当業者が（例えば、カンジダ）の存在を正確に検出し、これらの種を他の生物と区別することができるように非標的核酸よりも十分に広い範囲で核酸を標的化するようにハイブリッド形成する。優先的ハイブリッド形成を、当該分野で公知であり、本明細書中に記載されている技術を使用して測定することができる。
【００３３】
「セラノスティクス（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）」は、疾患を診断し、正確な治療レジメを選択し、治療に対する患者の応答をモニタリングするための診断試験の使用を意味する。本発明のセラノスティクスは、患者から採取したサンプル、スワブ（ｓｗａｂ）、または標本に対する本発明のＮＡＤアッセイの使用に基づき得る。
【００３４】
発明の要旨
本発明は、ＲＰＳ７遺伝子またはその対応するｍＲＮＡの少なくとも一部に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを含む酵母種および／または真菌種の検出および同定のための診断キットを提供する。オリゴヌクレオチドプローブは、ＲＰＳ７遺伝子またはその対応するｍＲＮＡの一部と実質的に相同であるか実質的に相補的である配列を有することができる。したがって、これは、相補的なＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子と結合するかハイブリッド形成することができるであろう。ＲＰＳ７遺伝子は、真菌ＲＰＳ７遺伝子であり得る。ＲＰＳ７遺伝子は、酵母ＲＰＳ７遺伝子であり得る。核酸分子は合成であり得る。キットは、１つを超えるかかるプローブを含むことができる。特に、キットは、複数のかかるプローブを含むことができる。さらに、キットは、例えば、細菌種またはウイルスなどの他の生物のさらなるプローブを含むことができる。
【００３５】
ＲＰＳ７遺伝子は、酵母および真菌中のリボゾーム小サブユニットのタンパク質成分であるリボゾームタンパク質Ｓ７をコードする。これはリボゾーム生合成、すなわち、タンパク質合成に必要である。ＲＰＳ７は、１８Ｓ ｒＲＮＡのアセンブリの開始に関与する。
【００３６】
本発明は、酵母および真菌の診断で使用する高コピー数のｍＲＮＡを同定した。同定された配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ／ＲＮＡ増幅ベースの検出系だけでなく、シグナル増幅ベースの検出系にも適切である。さらに、適切な標的として同定された本発明の配列は、いくつかの領域中に有意な遺伝子内配列多様性（有利であり、本発明の態様が群または種特異的標的に指向することができる）を有し、いくつかの領域中に有意な配列均一性（本発明の態様が酵母および真菌の診断のための直接核酸検出テクノロジー、シグナル増幅核酸検出テクノロジー、および核酸ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅テクノロジーで使用する属特異的酵母および真菌プライマーおよびプローブに指向することができる）も有するという利点を提供する。ＲＰＳ７配列により、診断アッセイで複数の試験および自動化が可能である。
【００３７】
本発明の配列の利点の１つは、密接に関連する酵母種と真菌種との間の遺伝子内ＲＰＳ７ヌクレオチド配列の多様性によって酵母および真菌の検出のための診断アッセイで使用する特異的プライマーおよびプローブを診断することができることである。ＲＰＳ７ヌクレオチド配列（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方）を、診断アッセイにおける直接検出、シグナル増幅検出、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅テクノロジーと共に使用することができる。ＲＰＳ７配列により、診断アッセイで複数の試験および自動化が可能である。
【００３８】
高コピー数のＲＰＳ７ ｍＲＮＡは、シグナル増幅検出テクノロジーと組み合わせた診断アッセイにおけるその使用に有利である。さらに、ＲＰＳ７転写物の不安定性により、この診断標的を生存率診断アッセイで使用することができる。
【００３９】
キットは、ＲＰＳ７遺伝子の少なくとも一部の増幅用プライマーをさらに含むことができる。適切には、キットは、ＲＰＳ７遺伝子の一部の順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。ＲＰＳ７遺伝子の一部は、アスペルギルスＲＰＳ７遺伝子のエクソン３の一部であり得る。あるいは、ＲＰＳ７遺伝子の一部は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓＲＰＳ７遺伝子の塩基対５０８位から塩基対７１１位までの遺伝子領域の一部に等価であり得る。アスペルギルスＲＰＳ７遺伝子のエクソン３の一部のプローブおよびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓＲＰＳ７遺伝子の塩基対５０８位から塩基対７１１までに等価な遺伝子領域の一部のプローブを含むキットが特に好ましい。塩基対５０８位から塩基対７１１位までに等価な領域を、他の生物（サッカロミセス菌種およびクリプトコッカス・ネオフォルマンスなど）で見出すことができるが、必ずしも５０８位〜７１１位ではない。キットは、さらなるプローブも含むことができる。
【００４０】
プローブは、配列番号１〜配列番号７、配列番号１７６〜配列番号１８９、配列番号３７８〜配列番号４１３、および配列番号４１９〜配列番号４４８、またはＲＰＳ７遺伝子のプローブとして作用することもできる配列と実質的に相同であるか実質的に相補的である配列の群から選択される配列を有することができる。
【００４１】
キットは、少なくとも１つの順方向ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーおよび少なくとも１つの逆方向ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマー、配列番号８〜配列番号４０、配列番号４１４、配列番号４１７、配列番号４１８、または順方向増幅プライマーとして作用することもできるこれらと実質的に相同であるか実質的に相補的である配列からなる群から選択される配列を有する順方向増幅プライマー、ならびに配列番号３、配列番号２２〜配列番号４９、配列番号４１５、および配列番号４１６、または逆方向増幅プライマーとして作用することもできるこれらと実質的に相同であるか実質的に相補的である配列からなる群から選択される配列を有する逆方向増幅プライマーを含むことができる。診断キットは、直接核酸検出テクノロジー、シグナル増幅核酸検出テクノロジー、および核酸ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅テクノロジーに基づくことができ、のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）、分岐ＤＮＡテクノロジー（ｂＤＮＡ）、およびローリングサークル増幅テクノロジー（ＲＣＡＴ））、または他のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素増幅テクノロジーの一つ以上から選択される。
【００４２】
本発明はまた、配列番号１〜配列番号４６６およびこれらと実質的に相同であるかこれらの一部と実質的に相同であり、ＲＰＳ７遺伝子に基づいた診断で機能を果たす配列からなる群から選択される核酸分子を提供する。核酸分子は、配列番号ｌ〜配列番号４６６の核酸分子の一部と実質的に相同であるか実質的に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００４３】
本発明はまた、
（ｉ）適切な条件下で試験サンプルを少なくとも１つの上記定義のオリゴヌクレオチドプローブと混合する工程、
（ｉｉ）高ストリンジェンシー条件下で試験サンプル中に存在し得る任意の核酸をオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させてプローブ：標的二本鎖を形成する工程、および
（ｉｉｉ）プローブ：標的二本鎖が存在するかどうかを決定する工程を含み、二本鎖の存在が試験サンプル中の標的生物の存在について陽性と同定する、試験サンプル中の標的生物を検出する方法を提供する。
【００４４】
プローブは、配列番号１〜配列番号４９、配列番号１７６〜配列番号１８９、および配列番号３７８〜配列番号４４８、またはＲＰＳ７遺伝子のプローブとして作用することもできる配列と実質的に相同であるか実質的に相補的である配列からなる群から選択される配列を有することができる。
【００４５】
本発明の核酸分子およびキットを、１つ以上の酵母種および／または真菌種の存在を検出するか、患者中の酵母および／または真菌の力価を測定するための診断アッセイ、または患者中の酵母および／または真菌の力価を減少させるか、環境中の酵母および／または真菌の汚染を測定するために設計された治療レジメンの有効性を評価する方法で使用することができる。環境は、病院であり得るか、食品サンプル、環境サンプル（例えば、水）、産業サンプル（製造過程サンプルなど）、または生物汚染度または質の評価に必要な最終産物であり得る。
【００４６】
本発明のキットおよび核酸分子を、ＲＰＳ７遺伝子機能を破壊するために使用することができる１つ以上の破壊剤（ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）の同定および／または特徴づけで使用することができる。破壊剤を、アンチセンスＲＮＡ、ＰＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＲＰＳ７遺伝子はＥ．ゴシピイ（Ｅ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ）遺伝子である。いくつかのかかる実施形態では、ＲＰＳ７遺伝子を、配列番号５４、配列番号１９４、配列番号２１２、またはその各ｍＲＮＡ等価物、配列番号５５、配列番号１９５、配列番号２１３またはその一部、またはこれらと実質的に相同であるか、１つ以上の配列の一部と実質的に相補的である配列からなる群から選択することができる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ＲＰＳ７遺伝子はＫ．ラクチス遺伝子である。いくつかのかかる実施形態では、ＲＰＳ７遺伝子を、配列番号５６、配列番号１９６、配列番号２１０、またはその各ｍＲＮＡ等価物、配列番号５７、配列番号１９７、配列番号２１１またはその一部、またはこれらと実質的に相同であるか、１つ以上の配列の一部と実質的に相補的である配列からなる群から選択することができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ＲＰＳ７遺伝子は、Ｄ．ハンセニイイ（Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ）遺伝子である。いくつかのかかる実施形態では、ＲＰＳ７遺伝子を、配列番号６０、配列番号２００、配列番号２１４、またはその各ｍＲＮＡ等価物、配列番号６１、配列番号２０１、配列番号２１５またはその一部、またはこれらと実質的に相同であるか、１つ以上の配列の一部と実質的に相補的である配列からなる群から選択することができる。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態では、種特異的プローブを含む核酸分子を使用して、同一属の種を区別することができる。
【００５１】
例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ菌種特異的プローブは、配列番号６、配列番号７、および配列番号３７８〜配列番号３８５またはその一部、またはこれらと実質的に相同であるか、１つ以上の配列の一部と実質的に相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００５２】
酵母および真菌の標的生物の核酸を検出するための組成物中に本発明のオリゴヌクレオチドを提供することができる。かかる組成物はまた、組成物の意図する使用に応じて適切に、緩衝液、酵素、界面活性剤、塩などを含むことができる。本発明の組成物、キット、および方法は、少なくとも１つの合成オリゴヌクレオチドを含むと本明細書中に記載されているが、合成オリゴヌクレオチドの代わりかこれと共に合成ヌクレオチドフラグメントと実質的に同一の配列を有する天然オリゴヌクレオチドを含むこともできることも想定される。
【００５３】
本発明はまた、少なくとも１つの順方向ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーおよび少なくとも１つの逆方向ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーを含み、順方向増幅プライマーが、配列番号８〜４０、配列番号４１４，配列番号４１７、配列番号４１８、または順方向増幅プライマーとして作用することもできるこれらと実質的に相同であるか実質的に相補的である配列の一つ以上からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーが、配列番号３、配列番号２２〜配列番号４９、配列番号４１５、および配列番号４１６、または逆方向増幅プライマーとして作用することもできるこれらと実質的に相同であるか実質的に相補的である配列の一つ以上からなる群から選択される、標的酵母および／または真菌生物のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅診断キットを提供する。
【００５４】
本発明はまた、候補酵母種および／または真菌種のＲＰＳ７遺伝子配列と実質的に相補的であるか実質的に相同である配列を含む１つ以上のＤＮＡプローブを含む、候補酵母種および／または真菌種の存在を検出するための診断キットを提供する。本発明はまた、ＲＰＳ７遺伝子またはそのｍＲＮＡ転写物、酵母および／または真菌のＲＰＳ７遺伝子またはそのｍＲＮＡ転写物、酵母ＲＰＳ７遺伝子またはそのｍＲＮＡ転写物、１つ以上の配列番号１〜配列番号４６６からなる１つ以上の群と実質的に相同であるか、実質的に相補的であるヌクレオチド配列を有する１つ以上の合成オリゴヌクレオチドを提供する。ヌクレオチドは、ＤＮＡを含むことができる。ヌクレオチドは、ＲＮＡを含むことができる。ヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡの混合物を含むことができる。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含むことができる。本発明の配列（ならびに本発明の方法、キット、組成物、およびアッセイに関連する配列）を、ＲＰＳ７遺伝子のコード領域の一部と実質的に相同であるように選択することができる。遺伝子は、標的酵母または真菌生物由来の遺伝子であり得る。本発明の配列は、好ましくは、配列の一部とプローブ：標的二本鎖を形成することができるのに十分である。
【００５５】
本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチド（合成であってよい）と実質的に相同であるか、実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブを含む標的酵母または真菌生物のための診断キットを提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーとしての使用に適切な配列もオリゴヌクレオチドプローブとしての使用に適切であり得る一方で、増幅プライマーが約１５ヌクレオチドと約３０ヌクレオチドとの間（より好ましくは約１５〜約２３、最も好ましくは約２０〜約２３）の相補部分を有することができ、本発明のオリゴヌクレオチドプローブが任意の適切な長さであり得ることが好ましいことを認識するであろう。当業者は、選択したオリゴヌクレオチドプローブの長さ、性質、構造（例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒのハイブリッド形成プローブ対、Ｔａｑｍａｎ５’エキソヌクレアーゼプローブ、ヘアピンループ構造など）、および配列に応じて異なるハイブリッド形成条件および／またはアニーリング条件が必要であることを認識するであろう。オリゴヌクレオチドプローブを表面上に固定した本発明のキットおよびアッセイも提供することができる。かかる表面は、ビーズ、膜、カラム、ディップスティック、ナノ粒子、診断プレートのウェルなどの反応室の内面もしくは反応チューブの内側、毛細管、または容器などであり得る。
【００５６】
標的酵母または真菌生物を、
【００５７】
【数１】
からなる群から選択することができる。
【００５８】
標的酵母生物は、既に実験的に証明された所与のプライマー対のカンジダ菌種であり得、より好ましくは、
【００５９】
【数２】
からなる群から選択される。これらの環境下では、遺伝子特異的領域または属特異的領域に対する本発明の増幅プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブを、１つ以上、または多数、または実質的に全ての標的酵母生物群の所望の生物を同定することができるように設計することができる。適切な順方向増幅プライマーを、Ｃａｎ１Ｆ：５’−ＡＧＣ ＴＧＧ ＴＴＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＴ−３’（配列番号４０）、配列番号３６、および配列番号３７、ならびに／または配列番号３８と３９との混合物からなる群から選択することができる。適切な逆方向増幅プライマーを、Ｃａｎ２Ｒ：５’−ＴＣＴ ＧＧＧ ＴＡＴ ＣＴＧ ＡＴ（Ａ／Ｇ）ＧＴＴ ＣＴ−３’（配列番号３）、配列番号２、および／または配列番号４と５との混合物、実際は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４６、配列番号４７、および／または配列番号４３〜４５の混合物、および／または配列番号４８〜４９の混合物の１つ以上と実質的に相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択することができる。適切な属特異的オリゴヌクレオチドプローブは、ＣＡＳＰ：５’−ＴＡＡ ＣＡＴ ＣＧＴ ＡＧＧ ＣＴＡ ＡＴＣ−３’（配列番号１）、配列番号６、または配列番号７である。カンジダ菌種特異的プローブを、配列番号３７８〜配列番号４１３からなる群から選択することができる。標的真菌生物は、既に実験的に証明された所与のプライマー対のアスペルギルス菌種であり得、より好ましくは、
【００６０】
【数３】
からなる群から選択される。適切な順方向増幅プライマーは配列番号４１４、配列番号４１７、および配列番号４１８であり得、選択される逆方向プライマーは、配列番号４１５または配列番号４１６であり得る。アスペルギルス菌種特異的プローブを、配列番号４１９〜配列番号４４８からなる群から選択することができる。
【００６１】
試験サンプルは、標的酵母および／または真菌生物の細胞を含むことができる。本方法はまた、上記試験サンプル中に存在し得る標的酵母または真菌生物の任意の細胞から核酸を放出させる工程を含むことができる。理想的には、試験サンプルは、患者から得たサンプル（スワブ、または血液、尿、唾液、気管支洗浄物、歯科標本、皮膚標本、頭皮標本、移植臓器生検、糞便、粘液、または排泄物サンプルなど）の溶解物である。試験サンプルは、食品サンプル、水サンプル、環境サンプル、最終産物、および最終産物または製造過程産業サンプルであり得る。
【００６２】
本発明はまた、１つ以上の酵母種または真菌種の存在についての診断アッセイにおける配列番号１〜４６６のいずれか１つの使用を提供する。種は、
【００６３】
【数４】
【００６４】
【数５】
からなる群から選択することができる。
【００６５】
本発明はまた、１つ以上の本発明の合成オリゴヌクレオチドを含むセラノスティクス、食品安全性診断、産業微生物学診断、環境モニタリング、獣医学的診断、バイオテロ診断で使用するキットを提供する。キットはまた、適切なサンプル回収装置、試薬容器、緩衝液、標識部分、溶液、界面活性剤、および補足液（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）からなる群から選択される１つ以上の材料を含むことができる。本発明はまた、セラノスティクス、食品安全性診断、産業微生物学診断、環境モニタリング、獣医学的診断、バイオテロ診断における本発明の配列、組成物、ヌクレオチドフラグメント、アッセイ、およびキットの使用を提供する。
【００６６】
核酸分子、組成物、キット、または方法を、酵母および／または真菌種の検出のための診断核酸ベースのアッセイで使用することができる。
【００６７】
核酸分子、組成物、キット、または方法を、患者中の酵母および／または真菌の力価を測定するための診断アッセイで使用することができる。力価をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することができる。
【００６８】
核酸分子、組成物、キット、または方法を、治療レジメの１つ以上の重要な段階で（ｉｎ ｖｉｖｏ方法またはｉｎ ｖｉｔｒｏ方法によって）患者中の酵母および／または真菌の力価を評価する工程を含む、患者中の酵母および／または真菌の力価を減少させるように設計した治療レジメの有効性を評価する方法で使用することができる。適切な重要な段階には、治療前、治療中、および治療後が含まれ得る。治療レジメは、医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｒｕｇ）などの抗真菌薬を含むことができる。
【００６９】
核酸分子、組成物、キット、または方法を、例えば、病院における潜在的な酵母および／または真菌の汚染を測定するための診断アッセイで使用することができる。
【００７０】
核酸分子、組成物、キット、または方法を、ＲＰＳ７遺伝子機能を破壊するために使用することができる１つ以上の破壊剤の同定および／または特徴づけで使用することができる。適切な破壊剤を、アンチセンスＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｉＲＮＡからなる群から選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ａ：プライマーＣａｎ１ＦおよびＣａｎ２Ｒを使用して増幅したカンジダ菌種ＲＴ−ＰＣＲ部分的ＲＰＳ７配列のゲル電気泳動；ｂ：Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ種特異的プローブＣＡＳＰの特異性を証明するオートラジオグラフ。ＡおよびＢ：レーン１：マーカーＸＩＶ；２：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ部分的ＲＰＳ７ ＲＴ−ＰＣＲ産物；３：Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ部分的ＲＰＳ７ ＲＴ−ＰＣＲ産物；４：Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ部分的ＲＰＳ７ ＲＴ−ＰＣＲ産物；５：Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ部分的ＲＰＳ７ ＲＴ−ＰＣＲ産物；６：Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ部分的ＲＰＳ７ ＲＴ−ＰＣＲ産物。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅産物を、カンジダ属特異的プライマーＣａｎ１Ｆ：５’−ＡＧＣ ＴＧＧ ＴＴＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＴ−３’（配列番号４０）およびＣａｎ２Ｒ：５’−ＴＣＴ ＧＧＧ ＴＡＴ ＣＴＧ ＡＴ（Ａ／Ｇ）ＧＴＴ ＣＴ−３’（配列番号３）を使用して生成した。
【図２】ＲＰＳ７遺伝子、組み込みプライマー配列番号４０および配列番号３、ならびにＴａｑＭａｎプローブ配列番号３８４に基づくＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのリアルタイムＰＣＲアッセイの包括試験（ｉｎｃｌｕｓｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ）−２０種全てのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ株が検出された。
【図３】ＲＰＳ７遺伝子および組み込みプライマー配列番号４０および配列番号３、ならびにＴａｑＭａｎプローブ配列番号３８４に基づくＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのリアルタイムＰＣＲアッセイの特異性。病理学に関連する他のカンジダ菌種（Ｃ．ｈａｅｍｕｌｏｎｉ、Ｃ．ｋｅｆｙｒ、Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｖｉｓｗａｎｔｈｉｉ、Ｃ．ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ、およびヒトＤＮＡが含まれる）の照合−交差反応は認められなかった。
【図４】ＲＰＳ７遺伝子、組み込みプライマー配列番号４０および配列番号３、ならびにＴａｑＭａｎプローブ配列番号３８４に基づき、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓゲノムＤＮＡの連続希釈物（１０６−ｌ細胞等価物）を含むＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのリアルタイムＰＣＲアッセイの検出限度−検出限度は１０細胞であった。
【図５】ＲＰＳ７遺伝子、組み込みプライマー配列番号４１８および配列番号４１５、ならびにＴａｑＭａｎプローブ配列番号４１９に基づき、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓゲノムＤＮＡ ５０６２の連続希釈物（１０６−ｌ細胞等価物）を含むＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのリアルタイムＰＣＲアッセイの検出限度−現出限度は１細胞等価物であった。
【図６】ＲＰＳ７遺伝子、組み込みプライマー配列番号４１８および配列番号４１５、ならびにＴａｑＭａｎプローブ配列番号４１９に基づくＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（２０株のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のリアルタイムＰＣＲアッセイの包括試験−全てのＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ株が検出された。
【図７】ＲＰＳ７遺伝子、組み込みプライマー配列番号４１８および配列番号４１５、ならびにＴａｑＭａｎプローブ配列番号４１９に基づくＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのリアルタイムＰＣＲアッセイの特異性試験。交差反応性試験パネルは、一定範囲のアスペルギルス菌種を含んでいた−交差反応は検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
発明の詳細な説明
材料と方法
生物および成長条件：カンジダ菌種（ＣＢＳ ５６２）を、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ寒天（４％ ｗｔ／ｖｏｌグルコース、１％ ｗｔ／ｖｏｌペプトン、１．５％寒天）上で、１８０ｒｐｍにて３７℃で一晩成長させた。１つのコロニーを使用して、１０ｍｌのＳａｂｏｕｒａｕｄブロス（Ｏｘｏｉｄ（商標））に接種し、３７℃で一晩成長させた。１ｍｌの一晩培養物を使用して、１００ｍｌ Ｓａｂｏｕｒａｕｄブロス（Ｏｘｏｉｄ（商標））に接種し、指数成長期および静止期まで（それぞれ、８時間および１６時間）成長させた。クロコウジカビを、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ寒天上にて３０℃で４８時間成長させた。皮下注射針を使用して、寒天を突き刺し、１００ｍｌ Ｓａｂｏｕｒａｕｄブロスに移し、４８時間成長させた。傾斜培養（ｓｌｏｐｅ）または乾燥ストック（ｄｅｓｓｉｃａｔｅｄ ｓｔｏｃｋ）由来のアスペルギルス菌種も、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ寒天中にて２５℃で１〜７日間成長させた。
【００７３】
総ＲＮＡの単離：Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓからのＲＮＡ抽出を、指数成長期まで成長させた後にＲＮｅａｓｙ（商標）ミニキット（商標）（Ｑｉａｇｅｎ（商標））を使用して行った。１ｍｌの培養物を、１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、ペレットを１００μｌのＹＩ溶解緩衝液（０．１Ｍ ＥＤＴＡ、１Ｍソルビトール、０．１％β−メルカプトエタノール、および１０００Ｕリチカーゼ（ｌｙｔｉｃａｓｅ））中で再懸濁し、３０℃で２０分間インキュベートした。総ＲＮＡの質を、１．２％ＭＯＰＳ変性ゲルでのゲル電気泳動によって評価し、ＴＢＳ−３８０（商標）ミニフルオロメーター（ ｍｉｎｉｆｌｕｒｏｍｅｔｅｒ）（Ｔｕｒｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を使用した蛍光光度法によって定量した。
ＲＰＳ７真菌／酵母遺伝子特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーの設計：総ＲＮＡを、Ａｍｂｉｏｎ（商標）酵母総ＲＮＡ単離キットを使用して５つのカンジダ菌種（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、およびＣ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）から単離し、製造者の説明書に従ってこれを行った。次いで、５つ全ての単離した総ＲＮＡに対してｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＴ−ＰＣＲ増幅を行って、特徴づけていない酵母種（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、およびＣ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）由来の配列の生成のためのＣａｎ １Ｆ（配列番号４０）およびＣａｎ２Ｒ（配列番号３）の使用を証明した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーである配列番号３および配列番号４０を使用し、製造者の説明書に従ってＴｉｔａｎ Ｏｎｅ Ｔｕｂｅ（商標）ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して試験した全カンジダ菌種由来の単離総ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。次いで、得られたＲＴ−ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅産物を、１．２％アガロースゲルで電気泳動して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅の成功を判断し、その後にサザンブロッティングした（図１Ａ）。特徴づけていないカンジダＲＰＳ７配列由来の残りのＲＴ−ＰＣＲｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅産物を、製造者の説明書に従ってＲｏｃｈｅ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ（商標）ＰＣＲ産物精製キットを使用して精製し、その後に配列決定プライマーとして配列番号４０を使用して配列決定し、これらの生物の新規のＲＰＳ７部分配列データを得た（配列番号６４および６５、６６および６７、６８および６９、７０および７１）。
Ｃａｎ１Ｆ：５’−ＡＧＣ ＴＧＧ ＴＴＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＴ−３’：配列番号４０
Ｃａｎ２Ｒ：５’−ＴＣＴ ＧＧＧ ＴＡＴ ＣＴＧ ＡＴ（Ａ／Ｇ）ＧＴＴ ＣＴ−３’：配列番号３
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＣＲ増幅を使用したカンジダ、出芽酵母、およびＣ．ネオフォルマンス種部分ＲＰＳ７配列の決定−プライマーＣａｎＦ１（配列番号４０）およびＣａｎＲ２（配列番号３）：カンジダ菌種部分ＲＰＳ７配列のヌクレオチド配列データベースを決定および拡大するために、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＣＲ増幅プライマーＣａｎＦ１（配列番号４０）およびＣａｎ２Ｒ（配列番号３）の多様な用途をさらに証明するために、一連のＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅を、以下のカンジダ株に対して行った：Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ株１７８、１８０、３２０、３６９、７６５、１６７３３、１５６０、９５５９、４１５４、２７００、５６２、３８２２、３１５６、３３４５、３３２８、Ｃ．ドゥブリニエンシス３９４９、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ株、９０８７、４６９２、２０５４４４、１０２６９、９５５６、５５６３、３９５９、１３８、３６０５、３８９７、８０１８、３８６３、３９０２、６０４、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ株、３９０２、６０４、２１９４、２１９６、１００１、１７１６、９５５７、５５７９、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ株５５７９、９５６０、６０５５、１７５１８、５７３、３１６５、３９２２、３８４７、およびＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株３８９５、９４、４２２５、５５５７、１５９０２、４１３９、３８７３、３８７０、８１５７、２３１１。総ゲノムＤＮＡを、Ｅｄｇｅ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓゲノムＤＮＡ精製キットを使用してこれらの各株から単離し、精製ＤＮＡの完全性を、１．２％アガロースゲルでの各単離ＤＮＡサンプルの電気泳動によって決定した。次いで、各ＤＮＡサンプルを、製造者の説明書に従ってＣａｎＦ１およびＣａｎＲ２と組み合わせてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＣＲ増幅に供した。次いで、各カンジダ株ゲノムＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物を、Ｒｏｃｈｅ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ産物精製キットを使用して精製した。次いで、精製ＰＣＲ産物を、配列プライマーとしてＣａｎＦ１を使用したヌクレオチド配列決定に供した。これにより、試験した全カンジダ株についての新規の部分ＲＰＳ７ヌクレオチド配列が生成された。配列番号６２〜配列番号１７５によって示した配列は、試験した上記のカンジダ株について生成した部分ＲＰＳ７ヌクレオチド配列を示す。さらに、ＰＣＲ増幅プライマーである配列番号４０および配列番号３を使用して、カンジダ菌種（ｎ＝２０種、ｎ＝１２０株）から抽出したＤＮＡを増幅した。これらのプライマーは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＲＰＳ７遺伝子の５０８〜７１１位（受入番号：Ｕ３７００９）と等価なＲＰＳ７遺伝子の２０４ｂｐ領域を増幅する。リチカーゼ酵素でのカンジダ菌種細胞の前処理後にＭａｇＮＡピュア酵母よび細菌単離キットＩＩＩを使用して、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でＤＮＡを抽出した。いくつかのＤＮＡ抽出物を、ＥａｓｙＭａｇシステム（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を使用して得た。表１の概説の試薬および条件を使用してＰＣＲ増幅を行った。ＤＮＡ配列決定のＰＣＲ産物を、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴキット（ＵＳＢ）またはＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ精製キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して浄化した。配列番号４０のプライマーを使用して、外部配列サービスプロバイダーであるＳｅｑｕｉｓｅｒｖｅ（Ｇｅｒｍａｎｙ）がカンジダ菌種のＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定を開始した。さらに、ＰＣＲプライマーである配列番号４０および配列番号３を使用して、Ｃ．ネオフォルマンスおよび出芽酵母種由来のＤＮＡを増幅した。配列番号４０のプライマーを使用して、ＰＣＲ産物も外部配列プロバイダーであるＳｅｑｕｉｓｅｒｖｅ（Ｇｅｒｍａｎｙ）が配列決定した。配列番号２２２〜配列番号３２５は、カンジダ菌種ｒｐｓ７遺伝子（２０４ｂｐ）配列を示す。配列番号４４９は、出芽酵母ｒｐｓ７遺伝子（２０４ ｂｐ）配列を示し、配列番号４５１はＣ．ネオフォルマンスｒｐｓ７遺伝子配列を示す。
表１：カンジダ菌種である出芽酵母およびＣ．ネオフォルマンスにおいてＲＰＳ７遺伝子を増幅するために使用したＰＣＲ試薬および条件。
【００７４】
【表１−１】
【００７５】
【表１−２】
アスペルギルス菌種のＲＰＳ７遺伝子エクソン３配列情報の作成
ＰＣＲプライマーである順方向プライマー配列番号４１４および逆方向プライマー配列番号４１５を、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのＲＰＳ７中の６６４〜９８０位（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：ＸＭ＿７４９４５３（アスペルギルス菌種））由来のエクソン３（３１７ｂｐ）を増幅するように設計した。これらのプライマーを使用して８種由来のＤＮＡ（ｎ＝６７株−表２）をＰＣＲ増幅し、これらの株についてのエクソン３フラグメントの配列情報を連続的に得た。独立したプライマー対である順方向プライマー配列番号４１７および逆方向プライマー配列番号４１６を設計し、適用して、クロコウジカビ株中のＲＰＳ７遺伝子（エクソン３−３１７ｂｐ）を増幅した（ｎ＝１０−表２）。これらのプライマーを使用して、表３に記載の条件を使用して、ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）にてアスペルギルス菌種中のＲＰＳ７エクソン３（３１７ｂｐ）のＰＣＲ増幅を行った。ＤＮＡ配列決定のためのＰＣＲ産物を、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ精製キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して浄化した。外部配列サービスプロバイダーであるＳｅｑｕｉｓｅｒｖｅ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって配列番号４１４および配列番号４１７（順方向）プライマーを使用してＤＮＡ配列決定を行った。
表２：ＲＰＳ７遺伝子のエクソン３を配列決定したアスペルギルス菌種および株。
【００７６】
【表２】
表３：ＤＮＡ配列決定のためのアスペルギルス菌種中のＲＰＳ７遺伝子のエクソン３の３１７ｂｐ領域のＰＣＲ増幅のために使用したＰＣＲ試薬およびＰＣＲ条件。
【００７７】
【表３−１】
【００７８】
【表３−２】
ＲＰＳ７遺伝子配列に基づいたプロトタイプ種特異的Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ核酸診断（ＮＡＤ）アッセイの開発：次いで、新規および既に存在するＲＰＳ７配列データ（配列番号６２〜配列番号１７５）を試験し、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ種特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＣＡＳＰ、配列番号１）を同定し、上記のようにサザンブロットへのハイブリッド形成での使用するために合成した。ＣＡＳＰ（配列番号１）オリゴヌクレオチドプローブの５’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してγＰ３２で放射性標識し、サザンブロットと５５℃で２時間ハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成溶液を取り出し、ブロットに６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて室温で１０分間の洗浄を２回行い、その後に６ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにて５５℃で１分間の高ストリンジェンシー洗浄を行った。ブロットをＸ線フィルムに曝露し、−７０℃で２時間オートラジオグラフィを行った。図１Ｂは、ＣＡＳＰ種特異的オリゴヌクレオチドプローブのみがＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのＲＴ−ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅産物とハイブリッド形成した。したがって、目的の酵母種の検出のための標的としてのＲＰＳ７核酸配列の使用および潜在性が証明された。
ＣＡＳＰ：５’−ＴＡＡ ＣＡＴ ＣＧＴ ＡＧＧ ＣＴＡ ＡＴＣ−３’：配列番号１
カンジダ菌種のオリゴヌクレオチドプローブの設計
各種（配列番号２２２〜配列番号３２５）について得た異なる配列型を示すカンジダ菌種中のＲＰＳ７遺伝子２０４ｂｐ標的領域について得た配列情報をアラインメントし、生物情報学ツール（ＣｌｕｓｔａｌＷおよびＢＬＡＳＴプログラムが含まれる）を使用して分析し、異なるカンジダ菌種の同定のためのオリゴヌクレオチドプローブを設計した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号３７８〜配列番号３８５を設計した。Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号３８６〜配列番号３８９を設計した。Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号３９０〜配列番号３９３を設計した。Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号３９４〜配列番号４０５を設計した。Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４０６〜配列番号４１３を設計した。
【００７９】
プライマー配列番号４０および配列番号３ならびにオリゴヌクレオチドプローブ配列番号３７８〜配列番号４１３を使用して、カンジダ菌種のための核酸診断アッセイを設計した。開発したアッセイの例には、５つのカンジダ菌種（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、およびＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓが含まれる）のためのリアルタイムＰＣＲ ＴａｑＭａｎアッセイが含まれる。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓアッセイの例は、プライマー配列番号４０および配列番号３ならびにオリゴヌクレオチドプローブ配列番号３８４を含む（図２）。Ｃ．ｋｒｕｓｅｉのアッセイの例は、プライマー配列番号４０および配列番号３ならびにプローブ配列番号３８６を含む。Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａのアッセイの例は、プライマー配列番号４０および配列番号３ならびにプローブ配列番号４１２を含む。Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのアッセイの例は、プライマー配列番号４０および配列番号３ならびにプローブ配列番号４００を含む。Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓのアッセイの例は、プライマー配列番号４０および配列番号３ならびにプローブ配列番号３９２を含む。これらの種特異的アッセイをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ装置で設定し、表４に記載の条件および試薬を使用して行う。各種アッセイを、種の２０種の株の包括性（ｉｎｃｌｕｓｉｖｉｔｙ）について試験し、各種アッセイについて、関連株（ｎ＝２０）を検出した。各種アッセイを、種のパネル（１９種のカンジダ、２４種の他の酵母および皮膚糸状菌、９種のアスペルギルス、１５種の細菌種、およびヒトＤＮＡが含まれる）に対する交差反応性について試験した（表５）。各種アッセイにより、検出するように設計した種の株のみが検出され、他のカンジダ菌種、アスペルギルス菌種、他の酵母、皮膚糸状菌、細菌、またはヒトＤＮＡ由来のＤＮＡと交差反応しなかった。図３は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ種特異的アッセイを使用した特異性研究の例を示す。アッセイの検出限度（ＬＯＤ）または感度を、関連種由来のゲノムＤＮＡの１０回連続希釈（１０６−ｌ細胞等価物）を使用して決定した。各種アッセイについて１０種の細胞等価物の検出限度を確立した。図４は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓアッセイについて得た検出限度を示す。
表４：ＰＣＲ試薬およびサーモサイクリング条件：
【００８０】
【表４−１】
【００８１】
【表４−２】
カンジダ菌種およびＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓアッセイでの交差反応性試験のために含まれる種のパネル
【００８２】
【化１−１】
オリゴヌクレオチドプライマーおよびアスペルギルス菌種のためのプローブの設計
ＤＮＡ配列決定後（エクソン３ ＲＰＳ７（３１７ｂｐ））、各種（配列番号３２６〜配列番号３７７）について得た異なる配列型を示すアスペルギルス菌種から増幅したＰＣＲ産物のために生成した配列情報をアラインメントし、生物情報学ツール（ＣｌｕｓｔａｌＷおよびＢＬＡＳＴプログラムが含まれる）を使用して分析した。ＰＣＲプライマー配列番号４１８を、ＰＣＲプライマー配列番号４１５と組み合わせて、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよび他のアスペルギルス菌種中のＲＰＳ７遺伝子の１２５ｂｐ領域の増幅のために設計した。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの同定ために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４１９〜配列番号４２４を設計した。Ａ．カンジダスの同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４２５〜配列番号４２８を設計した。Ａ．テレウスの同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４２９〜配列番号４３２を設計した。Ａ．ベルシカラの同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４３３〜配列番号４３６を設計した。Ａ．ニデュランスの同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４３７〜配列番号４４０を設計した。Ａ．フラバスの同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４４１および配列番号４４２を設計した。Ａ．クラバタスの同定のために、オリゴヌクレオチドプローブ配列番号４４３〜配列番号４４８を設計した。
アスペルギルス菌種（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のための核酸ベースの診断アッセイ：
アスペルギルス菌種のための核酸診断アッセイを、プライマー配列番号４１４〜配列番号４１８およびオリゴヌクレオチドプローブ配列番号４１９〜配列番号４４８を使用して設計した。開発したアッセイの一例は、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのためのリアルタイムＰＣＲ ＴａｑＭａｎアッセイ（プライマー配列である配列番号４１８および配列番号４１５ならびにＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブ配列番号４１９を含む）である。このアッセイを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ装置で設定し、表４に記載の条件および試薬を使用して行う。アッセイの検出限度（ＬＯＤ）または感度を、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ株番号５０６２由来のゲノムＤＮＡの１０回連続希釈（１０６−ｌ細胞等価物）を使用して決定した。図５は、１ゲノム等価物としてのＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓアッセイのＬＯＤを示す。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓアッセイの特異性を、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの２０株を使用した包括性についてのＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓアッセイの試験によって確認した。アッセイで全２０株が検出された（図６）。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓアッセイを、パネル（２０種のカンジダ、２４種の皮膚糸状菌、８種のアスペルギルス菌種、１５の細菌種、およびヒトＤＮＡが含まれる）に対する交差反応性についてチェックした。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓアッセイにおいてこれらの株／種またはヒトＤＮＡの交差反応は存在しなかった（表５）。図７は、アスペルギルス菌種ＤＮＡのパネルを使用して行った交差反応研究の例を示す。
【００８３】
本明細書中に開示の任意の配列がＰａｔｅｎｔＩｎ３．３ソフトウェア中の添付の配列表中のその対応物と異なる限りにおいて、テキスト本文内の配列は、正確なバージョンとして認識すべきである。
【００８４】
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ／ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」および用語「ｈａｖｉｎｇ／ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は、本発明に関連して本明細書中で使用される場合、記載の特徴、整数、工程、または成分の存在を特定するために使用するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、成分、またはその群の存在または付加を排除しない。
【００８５】
明確にするために個別の実施形態の文脈で記載される本発明の一定の特徴を、１つの実施形態と組み合わせて提供することもできると認識される。逆に、簡潔にするために１つの実施形態の文脈で記載される本発明の種々の特徴を、個別または任意の適切なサブコンビネーション（ｓｕｂｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）で提供することもできる。配列番号、プローブの部位、オリゴヌクレオチドなどを太字および下線で示す。
Ｎまたはｘ＝任意のヌクレオチド；ｗ＝ａ／ｔ、ｍ＝ａ／ｃ、ｒ＝ａ／ｇ、ｋ＝ｇ／ｔ、ｓ＝ｃ／ｇ、ｙ＝ｃ／ｔ、ｈ＝ａ／ｔ／ｃ、ｖ＝ａ／ｇ／ｃ、ｄ＝ａ／ｇ／ｔ、ｂ＝ｇ／ｔ／ｃ。
【００８６】
一部の例では、特異的縮重オプションを、括弧内に示す：例えば、（ａ／ｇ）はＡまたはＧのいずれかである。
【００８７】
【化１−２】
【００８８】
【化２】
【００８９】
【化３】
【００９０】
【化４】
【００９１】
【化５】
【００９２】
【化６】
【００９３】
【化７】
【００９４】
【化８】
【００９５】
【化９】
【００９６】
【化１０】
【００９７】
【化１１】
【００９８】
【化１２】
【００９９】
【化１３】
【０１００】
【化１４】
【０１０１】
【化１５】
【０１０２】
【化１６】
【０１０３】
【化１７】
【０１０４】
【化１８】
【０１０５】
【化１９】
【０１０６】
【化２０】
【０１０７】
【化２１】
【０１０８】
【化２２】
【０１０９】
【化２３】
【０１１０】
【化２４】
【０１１１】
【化２５】
【０１１２】
【化２６】
【０１１３】
【化２７】
【０１１４】
【化２８】
【０１１５】
【化２９】
【０１１６】
【化３０】
【０１１７】
【化３１】
【０１１８】
【化３２】
【０１１９】
【化３３】
【０１２０】
【化３４】
【０１２１】
【化３５】
【０１２２】
【化３６】
【０１２３】
【化３７】
【０１２４】
【化３８】
【０１２５】
【化３９】
【０１２６】
【化４０】
【０１２７】
【化４１】
【０１２８】
【化４２】
【０１２９】
【化４３】
【０１３０】
【化４４】
【０１３１】
【化４５】
【０１３２】
【化４６】
【０１３３】
【化４７】
【０１３４】
【化４８】
【０１３５】
【化４９】
【０１３６】
【化５０】
【０１３７】
【化５１】
【図１ＡａｎｄＢ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＰＳ７遺伝子またはその対応するｍＲＮＡの少なくとも一部に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを含む酵母種または真菌種のための診断用キット。
【請求項２】
ＲＰＳ７遺伝子の少なくとも一部の増幅のためのプライマーをさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
ＲＰＳ７遺伝子の一部の順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記ＲＰＳ７遺伝子の一部がアスペルギルスＲＰＳ７遺伝子のエクソン３の一部である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５】
前記ＲＰＳ７遺伝子の一部が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＲＰＳ７遺伝子の塩基対５０８位〜塩基対７１１位の一部に等価である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６】
アスペルギルスＲＰＳ７遺伝子のエクソン３の一部のプローブおよびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＲＰＳ７遺伝子の５０８位〜７１１位に等価物の一部のプローブを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７】
前記プローブが、配列番号１〜配列番号７、配列番号１７６〜配列番号１８９、配列番号３７８〜配列番号４１３、および配列番号４１９〜配列番号４４８、またはプローブとして作用することもできるこれらと実質的に類似するか相補的である配列から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の診断用キット。
【請求項８】
少なくとも１つの順方向ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーおよび少なくとも１つの逆方向ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーを含み、前記順方向増幅プライマーが、配列番号８〜配列番号４０、配列番号４１４、配列番号４１７、配列番号４１８、または順方向増幅プライマーとして作用することもできるこれらと実質的に類似するか相補的である配列からなる群から選択され、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号３、配列番号２２〜配列番号４９、配列番号４１５、および配列番号４１６、または逆方向増幅プライマーとして作用することもできるこれらと実質的に類似するか相補的である配列からなる群から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９】
直接核酸検出テクノロジー、シグナル増幅核酸検出テクノロジー、および核酸ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅テクノロジーに基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）、分岐ＤＮＡテクノロジー（ｂＤＮＡ）、およびローリングサークル増幅テクノロジー（ＲＣＡＴ）、または他の酵素ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅ベースのテクノロジーの一つ以上から選択される、請求項８に記載の診断用キット。
【請求項１０】
配列番号１〜配列番号４６６およびこれらとまたはこれらの一部と実質的に相同であるか実質的に相補的である配列からなる群から選択され、ＲＰＳ７遺伝子に基づいた診断において機能を有する、核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子の一部に実質的に相同であるか実質的に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドを含む核酸分子。
【請求項１２】
試験サンプル中の標的生物を検出する方法であって、
（ｉｉ）適切な条件下で試験サンプルをＲＰＳ７遺伝子またはその対応するｍＲＮＡの少なくとも一部に結合することができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと混合する工程、
（ｉｉ）高ストリンジェンシー条件下で試験サンプル中に存在し得る任意の核酸をオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させてプローブ：標的二本鎖を形成する工程、および
（ｉｉｉ）プローブ：標的二本鎖が存在するかどうかを決定する工程を含み、前記二本鎖の存在が試験サンプル中の標的生物の存在について陽性と同定する、方法。
【請求項１３】
前記プローブが、配列番号１〜配列番号４９、配列番号１７６〜配列番号１８９、および配列番号３７８〜配列番号４４８、またはＲＰＳ７遺伝子のプローブとして作用することもできるこれらと実質的に相同であるか実質的に相補的である配列からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１つ以上の酵母種および／または真菌種の存在を検出するための診断アッセイにおける請求項１０または請求項１１のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項１５】
患者における酵母および／または真菌の力価を測定するための診断アッセイにおける請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のキットまたは請求項１０または請求項１１のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項１６】
患者における酵母および／または真菌の力価を減少させるように設計された治療レジメの有効性を評価する方法であって、前記治療レジメの１つ以上の重要な段階での請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のキットまたは請求項１０または請求項１１のいずれか１項に記載の核酸分子の使用を含む、方法。
【請求項１７】
環境における酵母および／または真菌の汚染を測定するための診断アッセイにおける請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のキットまたは請求項１０または請求項１１のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項１８】
前記環境が、病院、食品サンプル、環境サンプル（例えば、水）、産業サンプル（製造過程サンプルなど）、または生物汚染度または品質の評価に必要な最終産物である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
ＲＰＳ７遺伝子機能を破壊するために使用することができる１つ以上の破壊剤の同定および／または特徴づけにおける請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のキットまたは請求項１０または請求項１１のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項２０】
前記破壊剤が、アンチセンスＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。
【請求項１】
ＲＰＳ７遺伝子またはその対応するｍＲＮＡの少なくとも一部に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを含む酵母種または真菌種のための診断用キット。
【請求項２】
ＲＰＳ７遺伝子の少なくとも一部の増幅のためのプライマーをさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
ＲＰＳ７遺伝子の一部の順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記ＲＰＳ７遺伝子の一部がアスペルギルスＲＰＳ７遺伝子のエクソン３の一部である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５】
前記ＲＰＳ７遺伝子の一部が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＲＰＳ７遺伝子の塩基対５０８位〜塩基対７１１位の一部に等価である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６】
アスペルギルスＲＰＳ７遺伝子のエクソン３の一部のプローブおよびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＲＰＳ７遺伝子の５０８位〜７１１位に等価物の一部のプローブを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７】
前記プローブが、配列番号１〜配列番号７、配列番号１７６〜配列番号１８９、配列番号３７８〜配列番号４１３、および配列番号４１９〜配列番号４４８、またはプローブとして作用することもできるこれらと実質的に類似するか相補的である配列から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の診断用キット。
【請求項８】
少なくとも１つの順方向ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーおよび少なくとも１つの逆方向ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅プライマーを含み、前記順方向増幅プライマーが、配列番号８〜配列番号４０、配列番号４１４、配列番号４１７、配列番号４１８、または順方向増幅プライマーとして作用することもできるこれらと実質的に類似するか相補的である配列からなる群から選択され、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号３、配列番号２２〜配列番号４９、配列番号４１５、および配列番号４１６、または逆方向増幅プライマーとして作用することもできるこれらと実質的に類似するか相補的である配列からなる群から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９】
直接核酸検出テクノロジー、シグナル増幅核酸検出テクノロジー、および核酸ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅テクノロジーに基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）、分岐ＤＮＡテクノロジー（ｂＤＮＡ）、およびローリングサークル増幅テクノロジー（ＲＣＡＴ）、または他の酵素ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅ベースのテクノロジーの一つ以上から選択される、請求項８に記載の診断用キット。
【請求項１０】
配列番号１〜配列番号４６６およびこれらとまたはこれらの一部と実質的に相同であるか実質的に相補的である配列からなる群から選択され、ＲＰＳ７遺伝子に基づいた診断において機能を有する、核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子の一部に実質的に相同であるか実質的に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドを含む核酸分子。
【請求項１２】
試験サンプル中の標的生物を検出する方法であって、
（ｉｉ）適切な条件下で試験サンプルをＲＰＳ７遺伝子またはその対応するｍＲＮＡの少なくとも一部に結合することができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと混合する工程、
（ｉｉ）高ストリンジェンシー条件下で試験サンプル中に存在し得る任意の核酸をオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させてプローブ：標的二本鎖を形成する工程、および
（ｉｉｉ）プローブ：標的二本鎖が存在するかどうかを決定する工程を含み、前記二本鎖の存在が試験サンプル中の標的生物の存在について陽性と同定する、方法。
【請求項１３】
前記プローブが、配列番号１〜配列番号４９、配列番号１７６〜配列番号１８９、および配列番号３７８〜配列番号４４８、またはＲＰＳ７遺伝子のプローブとして作用することもできるこれらと実質的に相同であるか実質的に相補的である配列からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１つ以上の酵母種および／または真菌種の存在を検出するための診断アッセイにおける請求項１０または請求項１１のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項１５】
患者における酵母および／または真菌の力価を測定するための診断アッセイにおける請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のキットまたは請求項１０または請求項１１のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項１６】
患者における酵母および／または真菌の力価を減少させるように設計された治療レジメの有効性を評価する方法であって、前記治療レジメの１つ以上の重要な段階での請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のキットまたは請求項１０または請求項１１のいずれか１項に記載の核酸分子の使用を含む、方法。
【請求項１７】
環境における酵母および／または真菌の汚染を測定するための診断アッセイにおける請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のキットまたは請求項１０または請求項１１のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項１８】
前記環境が、病院、食品サンプル、環境サンプル（例えば、水）、産業サンプル（製造過程サンプルなど）、または生物汚染度または品質の評価に必要な最終産物である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
ＲＰＳ７遺伝子機能を破壊するために使用することができる１つ以上の破壊剤の同定および／または特徴づけにおける請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のキットまたは請求項１０または請求項１１のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項２０】
前記破壊剤が、アンチセンスＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５１２７４０（Ｐ２０１０−５１２７４０Ａ）
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４０９６４（Ｐ２００９−５４０９６４）
【出願日】平成１９年１２月１４日（２００７．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＥ２００７／０００１２３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７２２１７
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（５０６３３３９２３）ナショナル・ユニバーシティ・オブ・アイルランド・ゴルウェイ (5)
【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｇａｌｗａｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１４日（２００７．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＥ２００７／０００１２３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７２２１７
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（５０６３３３９２３）ナショナル・ユニバーシティ・オブ・アイルランド・ゴルウェイ (5)
【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｇａｌｗａｙ
【Ｆターム（参考）】
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