酵素製剤
【課題】酵素製剤を提供する。
【解決手段】本発明は、不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物に、ヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングが備えられることによって得られる酵素製剤、かかる酵素製剤を製造するための方法、および工業用バイオ触媒としての酵素製剤の使用に関する。
【解決手段】本発明は、不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物に、ヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングが備えられることによって得られる酵素製剤、かかる酵素製剤を製造するための方法、および工業用バイオ触媒としての酵素製剤の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオ触媒として使用するための新しい種類の酵素製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物および単離酵素は、化学工業または食品製造における触媒として幅広く使用されている。概要が、例えば、Ａ．リーゼ（Ｌｉｅｓｅ）、Ｋ．ゼールバッハ（Ｓｅｅｌｂａｃｈ）、Ｃ．ワンドレイ（Ｗａｎｄｒｅｙ）、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）−ＶＣＨ：２０００年、ドイツヴァインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）に示されている。
【０００３】
かかるバイオ触媒の経済的使用を保証するために、いくつかの条件が満たされなければならない。すなわち、バイオ触媒は反応条件下に十分に長く活性でなければならず、反応終了後に容易に分離可能であり、かつできるだけ頻繁に再使用可能であるべきである。理想的には、これらの条件は、できるだけ一般の触媒を提供するために、できるだけ広範囲の反応条件（例えば、温度範囲、使用される溶剤の種類、圧力等）に対して満たされるべきである。
【０００４】
これらの条件を満たすために、使用される酵素または酵素を含有する微生物を固定化する通常の方法が必要である。
【０００５】
多くの場合、酵素または酵素を含有する微生物は担体上に非共有結合で固定化され、担体としては多くの場合、適切な粒度分布のイオン交換樹脂またはポリマー粒子が使用される。その例は、ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、デンマークの市販製品ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）４３５、リポザイム（Ｌｉｐｏｚｙｍ）ＲＭ ＩＭ、またはリポザイム（Ｌｉｐｏｚｙｍ）ＴＬ ＩＭ、または天野（Ａｍａｎｏ）エンザイム（株）（日本）の市販製品アマノ（Ａｍａｎｏ）ＰＳである。これらの例は、かかる固定化物が非水性系においても、例えば、「Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．」１９８９年、９３４−９３５頁に記載されているように、溶剤をまったく含有せず、または有機溶剤しか含有しないような、技術的に利用可能な活性を示すため、広範囲に使用されている固定化リパーゼである。ただし、かかる固定化物の使用における欠点は、一方では、使用される反応系に依存して、例えば、界面活性成分の使用に際して、酵素または酵素を含有する微生物の脱着の発生である。かかる脱着に付随する活性損失は比較例１において示される。さらに、かかる製剤は不十分な機械的安定性を示し、それによって簡易な攪拌反応器での使用が不可能であり、または明らかに再使用が制限された場合にだけ可能である。かかる製剤の機械的不安定性は比較例２において示される。
【０００６】
したがって、かかる酵素製剤の反復使用を可能にするためには、別のリアクターコンセプトを使用しなければならない。「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」２００３年、１０５、６０１−６０７頁には、実施例について、リパーゼ触媒エステル化を実施するための固定床反応器の使用が記載されている。ただし、この方法の欠点は、高粘性混合物または懸濁液が固定床によって促進できないため低粘性均一反応混合物に限定されることである。
【０００７】
Ｋ．ファーベル（Ｆａｂｅｒ）「有機化学における生体内変換（Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、シュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）：２０００年、ドイツベルリンには、３８４頁以下にアルギン酸封入酵素の使用が記載されている。ただし、こうして得られる製剤は機械的安定性がきわめて低く、かつ非水性系における活性がきわめて低い。
【０００８】
さらに、例えば、グルタルジアルデヒドなどの反応性物質による固定化酵素の追加の交差架橋が記載されている。ただし、欠点は、修飾前の活性と比べ交差架橋製剤のほとんど明らかに低下した特異的活性である。さらに、この方法は機械的安定性の改善に寄与しない。
【０００９】
同様に、そこには反応性担体への酵素の共有固定化が記載されている。これによる欠点は、担体と反応しうる適切な官能基が酵素の表面に存在しなければならないことであり、さらに、それによってしばしば酵素活性の損失が生じる。
【００１０】
「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１９９９年、１２１、９４８７−９４９６頁にはシロキサン基質、いわゆるゾル・ゲルにおける酵素の含有物が記載されている。ゾル・ゲル製剤の欠点は、効率的にろ過するのが難しい低い粒度分布、機械的安定性の不足、脱着の発生、毒性反応物の使用（ＴＥＯＳの毒性については、例えば、「日本酸素技報（Ｎｉｐｐｏｎ Ｓａｎｓｏ Ｇｉｈｏ）」 １９９０年、９、６８−７２頁およびＡｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １９９４年、６８、２７７−２８３頁を参照、ＴＭＯＳの毒性については、例えば、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ」１９８９年、１３、２８５−２９５頁を参照、非毒性ゾル・ゲルの製造には、例えば、「Ｐｏｌｉｍｅｒｙ ｗ Ｍｅｄｙｃｙｎｉｅ」２０００年、３０、４５−５４頁に記載されているように、６か月以上の貯蔵や３５０℃での熱処理という手間のかかるステップが必要である。さらに、これは使用された溶剤にきわめて強く依存する膨張反応であり、これはさまざまな反応系（水性および非水性）における普遍的な使用を妨げる。「Ｊ．Ｓｏｌ Ｇｅｌ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」２００３年、２６、１１８３−１１８７頁は、例として、観察された酵素活性の溶剤依存性とともに広範囲な使用可能性の要件が満たされないことを示している。
【００１１】
「Ｌａｎｄｂａｕｆｏｒｓｃｈｕｎｇ Ｖｏｅｌｋｅｎｒｏｄｅ」２００２年、特集号２４１、４１−４６頁には、その酵素が最初に「微細な」シリコーン粒子上に固定化され、次いでゾル・ゲルへカプセル化されるゾル・ゲル製剤が記載されている。そこで機械的安定性の問題は部分的に解決されるが、記載されている実験は、十分な活性が選択された溶剤においてのみ達成されることを示し、溶剤非含有系における使用はまったく記載されていない。さらに、製剤は直ちに使用可能な形では存在せず、まず適切な大きさに切断しなければならず、これは技術的基準においてほとんど実現されない。
【００１２】
「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ」２００５年、３５、９３−９９頁には、機械的に安定なシリコーン球への水性酵素溶液の封入、いわゆる固定化エマルションによる酵素の固定化が記載されている。しかし、得られる特異的活性は、１０００Ｕ／ｇ以上のわずかに特異的な活性化が達成されうる上述した不活性担体上の固定化物と比べ、３３Ｕ／ｇまでと、明らかに低すぎる（Ｕ＝単位もしくはμｍｏｌ／分）。
【００１３】
国際公開第０３／１０６６０７号パンフレットにもかかる固定化エマルションが記載されているが、水性系における使用のみが記載されており、用途は洗剤組成物であり、バイオ触媒ではなく、かつ得られる粒径は約１０μｍであり、有機反応混合物から効率的にろ過するには小さすぎる。
【００１４】
したがって、従来技術の欠点を克服し、これまでに実現不可能なバイオ触媒の方法を実現する酵素固定化のための方法がさらに必要とされている。
【特許文献１】国際公開第０３／１０６６０７号パンフレット
【非特許文献１】「Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．」１９８９年、９３４−９３５頁
【非特許文献２】「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」２００３年、１０５、６０１−６０７頁
【非特許文献３】Ｋ．ファーベル（Ｆａｂｅｒ）「有機化学における生体内変換（Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、シュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）：２０００年、ドイツベルリン ３８４頁以下
【非特許文献４】「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１９９９年、１２１、９４８７−９４９６頁
【非特許文献５】「日本酸素技報（Ｎｉｐｐｏｎ Ｓａｎｓｏ Ｇｉｈｏ）」 １９９０年、９、６８−７２頁
【非特許文献６】Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １９９４年、６８、２７７−２８３頁
【非特許文献７】「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ」１９８９年、１３、２８５−２９５頁
【非特許文献８】「Ｐｏｌｉｍｅｒｙ ｗ Ｍｅｄｙｃｙｎｉｅ」２０００年、３０、４５−５４頁
【非特許文献９】「Ｊ．Ｓｏｌ Ｇｅｌ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」２００３年、２６、１１８３−１１８７頁
【非特許文献１０】「Ｌａｎｄｂａｕｆｏｒｓｃｈｕｎｇ Ｖｏｅｌｋｅｎｒｏｄｅ」２００２年、特集号２４１、４１−４６頁
【非特許文献１１】「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ」２００５年、３５、９３−９９頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明の課題は、従来技術の製剤の１つもしくは複数の欠点のない酵素製剤の提供であった。具体的には、機械的な力および脱着に対して高い安定性を有し、かつその際に好ましくは、技術的使用を可能にするために十分に高いさまざまな水性および非水性反応混合物における特異的活性を使用する酵素製剤が提供されるべきである。好ましくは、酵素製剤は、反応系から簡単に分離され、かつ再使用されうる、その粒度分布から適切でなければならない。
【００１６】
明確に挙げられていない別の課題は、以下の明細書、実施例のほか、特許請求の範囲の文脈から生じる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この課題は、不活性担体上の酵素または酵素を含有する微生物の固定化、および次いでヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングの被覆によって得られる酵素製剤によって解決されるという意外な方法が見出された。
【００１８】
したがって、本発明の対象は、不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物に、ヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングが備えられる酵素製剤、ならびに工業用バイオ触媒としてのその使用である。
【００１９】
さらに、本発明の対象は、不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物に、ヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングが備えられることを特徴とする、本発明による酵素製剤の製造方法である。
【００２０】
本発明による酵素製剤には、機械的な力および脱着に対して高い安定性を有するという利点がある。これら改善された特徴にもかかわらず、本発明による酵素製剤には、さまざまな水性（例えば、トリブチリンの加水分解）および非水性反応化合物（例えば、プロピルラウレートの溶剤非含有合成）における、技術的使用を可能にするために十分に高い特異的活性がある。さらに、本発明による酵素製剤には、担体材料および担体材料に付随する粒度分布の選択によって、酵素製剤の反応系からの簡単な分離および酵素製剤の再使用が可能であるように粒径を設定しうる利点がある。
【００２１】
本発明による酵素製剤およびその製造のための方法は以下に例示的に記載されるが、本発明はこれらの例示的な実施形態に限定されることはない。以下に範囲、一般式、または化合物クラスが挙げられている場合、これらは、明確に言及されている化合物の適切な範囲または群だけではなく、個々の値（範囲）または化合物からの取出しによって得られうる化合物のすべての部分範囲および部分群も包含する。本明細書の枠内で文書が引用される場合、その内容は完全に本発明の開示内容に属する。本発明の枠内で、例えば、さまざまな単位を多重に有しうる有機修飾ポリシロキサンなどの化合物が記載される場合、これらはこれらの化合物においてランダムに分布され（ランダムオリゴマー）または規則正しく（ブロックオリゴマー）存在しうる。かかる化合物における単位の数の表示は、すべての対応する化合物を介して得られる平均値として理解される。
【００２２】
本発明による酵素製剤は、不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物に、ヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングが備えられることによって得られることを特徴とする。
【００２３】
酵素固定化物の製造のために、適切な酵素を含有する全細胞、休止細胞、精製酵素または細胞抽出物、またはその混合物が使用されうる。好ましく使用されるのは、加水分解酵素、例えば、リパーゼ、エステラーゼ、またはプロテアーゼであり、例えば、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、サーモマイセス・ラヌゴシオサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｇｏｓｉｏｓｕｓ）、ブタ膵臓（Ｓｃｈｗｅｉｎｅｐａｎｋｒｅａｓ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、アルカリギネス属（Ａｌｃａｌｉｇｉｎｅｓ ｓｐ．）由来のリパーゼ、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）由来のコレステロールエステラーゼ、ブタ肝臓由来のエステラーゼなどであり、特に好ましくは、リパーゼが使用される。したがって、酵素固定化物は、好ましくは、加水分解酵素、好ましくは、リパーゼのクラス由来の酵素を有する。
【００２４】
不活性担体としては、不活性有機または無機担体が使用されうる。不活性担体としては、好ましくは粒子の少なくとも９０％において１０〜５０００μｍ、好ましくは、５０μｍ〜２０００μｍの粒径の粒度分布を有するような個々の粒子担体が使用され、もしくは酵素固定化物に存在する。有機担体としては、特に、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニルスチロール、スチロール−ジビニルベンゾル共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンペレフタレート、ＰＴＦＥおよび／または他のポリマーを有する、またはこれらからなるものが使用されうる。担体材料としては、固定化すべき酵素に依存して、特に、酸性または塩基性イオン交換樹脂、例えば、Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ５６８、Ｄｕｏｌｉｔｅ ＸＡＤ ７６１、Ｄｕｏｌｉｔｅ ＸＡＤ １１８０、Ｄｕｏｌｉｔｅ ＸＡＤ ７ＨＰ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ ４００、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＣＧ ５０、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（すべてローム・アンド・ハース（Ｒｏｈｍ ｕｎｄ Ｈａａｓ）社の製品）またはＬｅｗａｔｉｔ ＣＮＰ １０５およびＬｅｗａｔｉｔ ＶＰ ＯＣ １６００（ランクセス（Ｌａｎｘｅｓｓ）社、ドイツレバークーゼン（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ）の製品）が使用されうる。無機担体としては、従来技術から周知の酸化物および／またはセラミック担体が使用されうる。特に、無機担体として、例えば、セライト、ゼオライト、シリカ、細孔性ガラス（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓ（ＣＰＧ））または他の担体が使用されうるが、これらは例えば、Ｌ．カオ（Ｃａｏ）、「担体結合固定化酵素：原理、応用、および設計（Ｃａｒｒｉｅｒ−ｂｏｕｎｄ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ）」、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）−ＶＣＨ：２００５年、ドイツヴァインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）に記載されている。特に好ましくは、酵素固定化物に存在する不活性担体もしくは酵素固定化物の製造に使用される不活性担体は、ポリビニルスチロール、ポリメタクリレートまたはポリアクリレートからなる。
【００２５】
粒子上での固定化は、本発明によれば、共有または非共有、好ましくは、非共有で行われうる。非共有固定化のためには、担体は、例えば、場合により別の成分、例えば、無機塩または界面活性剤を含有する水性酵素溶液でインキュベート、もしくは含浸されうる。このインキュベーション／含浸は、例えば、０℃〜５０℃、好ましくは、０℃〜４０℃の温度で実施されうる。好ましくは、インキュベーション／含浸は数分〜数時間の時間にわたって行われる。インキュベーションの進行は、タンパク質測定のための一般的な方法により溶液中の酵素の濃度を測定することによって行われうる。所望の固定化度の達成後、担体は、好ましくは、水で洗浄され、かつ必要に応じて、乾燥されうる。次いで、こうして得られた酵素固定化物には、本発明によれば、シリコーンコーティングが備えられうる。
【００２６】
しかし、本発明によれば、市販されている酵素固定化物、例えば、（ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、デンマークのノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ） ４３５、リポザイムＲＭ ＩＭ、またはリポザイムＴＬ ＩＭ、または天野（Ａｍａｎｏ）エンザイム（株）（日本）のアマノ（Ａｍａｎｏ）ＰＳも使用されうる。
【００２７】
シリコーンコーティングは、本発明によれば、ヒドロシリル化によって得られる。そのために、好ましくは、触媒、好ましくは、遷移金属触媒の存在下に、Ｓｉ−Ｈ官能性ポリシロキサンが、少なくとも１つの末端、好ましくは、少なくとも２つの炭素−炭素二重結合を有する有機修飾ポリシロキサンで転換される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
Ｓｉ−Ｈ官能性ポリシロキサンとしては、好ましくは、一般式Ｉ
【化１】
［式中、
Ｎは、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋２＝３〜８５０、好ましくは、６〜１６０であり、
ａは、１〜８００、好ましくは、２〜１５０であり、
ｂは、０〜４００、好ましくは、２〜７５であり、
ｃは、０〜１０、好ましくは、０であり、
ｄは、０〜１０、好ましくは、０であり、
Ｒ１は、互いに独立して同一または異なり、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基、好ましくは、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、またはフェニル、特に、メチルを含んで成る群から選択され、
Ｒ２ａは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ２ｂは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ３は、互いに独立して同一または一般式Ｉａ
【化２】
［式中、
Ｎは、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋２＝３〜８５０、好ましくは、６〜１６０であり、
ａは、１〜８００、好ましくは、２〜１５０であり、
ｂは、０〜４００、好ましくは、２〜７５であり、
ｃは、０〜１０、好ましくは、０であり
ｄは、０〜１０、好ましくは、０であり、
Ｒ１は、互いに独立して同一または異なり、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基、好ましくは、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基またはフェニル、特に、メチルを含んで成る群から選択され、
Ｒ２ａは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ２ｂは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ３は、互いに独立して同一、または、一般式Ｉａのさまざまな残基、または残基Ｒ１である］のさまざまな残基である］のＳｉＨポリシロキサンが使用される。
【００２９】
好ましくは、ＳｉＨ官能性ポリシロキサンとして、一般式Ｉ
【化３】
［式中、
Ｎは、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋２＝６〜１６０であり、
ａは、２〜１５０であり、
ｂは、２〜７５であり、
ｃは、０であり、
ｄは、０であり、
Ｒ１は、互いに独立して同一または異なり、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基、好ましくは、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、またはフェニル、特に、メチルを含んで成る群から選択され、
Ｒ２ａは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ２ｂは、互いに独立して水素またはＲ１である］のポリシロキサンが使用される。
【００３０】
これらの化合物が実質的に統計的法則によって規制される分布との混合物の形で存在していること、もしくは存在しうることは当業者には周知である。したがって、指数ａ、ｂ、ｃ、およびｄの値は、通常、平均値を示す。
【００３１】
本発明によれば、オレフィン反応相手として、すなわち末端炭素−炭素二重結合を含有するポリシロキサンとしては、好ましくは、一般式ＩＩ
【化４】
［式中、
Ｎは、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋２＝３〜１０００、好ましくは、１０〜６００であり、
ｍは、１〜８００、好ましくは、２〜６００であり、
ｎは、０〜２０、好ましくは、０〜１０、好ましくは、０であり、
ｏは、０〜１０、好ましくは、０であり、
ｐは、０〜１０、好ましくは、０であり、
Ｒ４は、互いに独立して同一または異なり、かつ次の群、すなわち、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基、好ましくは、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、またはフェニル、特に、メチルからなり、
Ｒ５は、互いに独立して末端不飽和アルキル残基、好ましくは、ビニル、または、好ましくは、３〜２０個の炭素原子を有するアルコキシル残基、またはＲ４であり、
Ｒ６は、互いに独立して同一または一般式ＩＩａ
【化５】
［式中、
Ｎは、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋２＝３〜１０００、好ましくは、１０〜６００であり、
ｍは、１〜８００、好ましくは、２〜６００であり、
ｎは、０〜２０、好ましくは、０〜１０、好ましくは、０であり、
ｏは、０〜１０、好ましくは、０であり、
ｐは、０〜１０、好ましくは、０であり、
Ｒ４は、互いに独立して同一または異なり、かつ次の群、すなわち、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基、好ましくは、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、またはフェニル、特にメチルからなり、
Ｒ５は、互いに独立して末端不飽和アルキル残基、好ましくは、ビニル、または、好ましくは、３〜２０個の炭素原子を有するアルコキシル残基、またはＲ４であり、
Ｒ６は、互いに独立して同一または一般式ＩＩａのさまざまな残基または残基Ｒ４である］のさまざまな残基である］のポリシロキサンが使用される。
【００３２】
末端炭素−炭素二重結合を含有するポリシロキサンとしては、好ましくは、一般式ＩＩ
【化６】
［式中、
Ｎは、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋２＝１０〜６００であり、
ｍは、２〜６００であり、
ｎは、０であり、
ｏは、０であり、
ｐは、０であり、
Ｒ４は、互いに独立して同一または異なり、かつ次の群、すなわち、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基、好ましくは、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、またはフェニル、特にメチルからなり、
Ｒ５は、互いに独立して末端不飽和アルキル残基、好ましくは、ビニル、または、好ましくは、３〜２０個の炭素原子を有するアルコキシル残基である］のポリシロキサンが使用される。
【００３３】
一般式ＩＩの化合物が実質的に統計的法則によって規制される分布との混合物の形で存在していること、もしくは存在しうることは当業者には周知である。したがって、指数ｍ、ｎ、ｏ、およびｐの値は、通常、平均値を示す。
【００３４】
ヒドロシリル化は触媒の存在下に確立された方法に従って実施されうる。この場合、例えば、ヒドロシリル化に通常使用される、例えば、白金、ロジウム、オスミウム、ルテニウム、パラジウム、イリジウム錯体または類似の化合物、もしくは適切な純元素、またはシリカ、アルミニウム酸化物、もしくは活性炭または類似の担体材料上に固定化された誘導体などの触媒が使用されうる。好ましくは、ヒドロシリル化は、Ｃｉｓ白金またはカールシュテット触媒［トリス（ジビニルテトラメチルジシロキサン）ビス−プラチン］などＰｔ触媒の存在下に実施される。
【００３５】
好ましくは、触媒の使用量は、モルオレフィン当たり、もしくは、モル末端炭素−炭素二重結合当たり１０−７〜１０−１モル、好ましくは、１〜１００ｐｐｍである。ヒドロシリル化は、好ましくは、０〜２００℃、好ましくは、２０〜１２０℃の温度で実施される。
【００３６】
ヒドロシリル化は、溶剤の存在下または非存在下に実施されうる。一般に、反応の実施のために溶剤は必要ではない。しかし、反応は、例えば、脂肪族または芳香族炭化水素、環状オリゴシロキサン、アルコールまたはエステルなど適切な溶剤において実施されうる。適切な溶剤は、特にシクロヘキサンまたはトルオールである。
【００３７】
本発明によれば、使用される担体の質量に関して、好ましくは、１〜５００質量％、好ましくは、１０〜２００質量％、特に好ましくは、２０〜１５０質量％のシロキサン成分が使用される。シロキサン成分は、特に式Ｉおよび式ＩＩの化合物の合計から、もしくはその反応産物から構成される。
【００３８】
ヒドロシリル化は、式１の化合物の式ＩＩの化合物とのきわめて種々の比を使用して実施されうる。好ましくは、ヒドロシリル化は、反応基に関して１：１０〜１０：１、好ましくは、１：５〜５：１、特に好ましくは、１：１．１〜１．１：１、かつ完全に特に好ましくは、１：１のモル比で行われる。一般式ＩおよびＩＩの使用される化合物の選択およびその混合比の変化によって、シリコーンコーティングの特徴は、基質の透過性および他の反応特性を考慮して変更される。シリコーン成分の酵素固定化物との重量比の選択によって、シリコーンコーティングのコーティング厚さは変化し、対応する要件要求に一致する。
【００３９】
ヒドロシリル化によって製造される本発明によるシリコーンコーティングは、ヒドロシリル化が酵素固定化物の存在下に実施されることによって得られうる。しかし、ヒドロシリル化によって得られたシロキサンをその後に酵素固定化物へ配置することよってコーティングを得ることも可能である。これは、例えば、酵素固定化物をシロキサンの溶液、例えば、有機溶剤、特に、シクロヘキサンまたはトリオール中のシロキサンの溶液で処理することによって行われうる。次いで、溶剤は、例えば、蒸発によって除去されうる。かかる溶液中のシロキサンの濃度は、好ましくは、１０〜１００質量％、好ましくは、３０〜１００質量％である。しかし、好ましくは、本発明によるシリコーンコーティングは、ヒドロシリル化が酵素固定化物の存在下に実施されることによって得られる。
【００４０】
本発明による酵素製剤は、好ましくは、以下に述べられる本発明による方法によって製造される。酵素製剤の製造のためのこの方法は、不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物に、ヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングが備えられることによって特徴づけられる。
【００４１】
好ましくは、本発明による方法は、酵素固定化物をＳｉＨ官能性ポリシロキサン、末端炭素−炭素二重結合を含有するポリシロキサン、ならびにヒドロシリル化を触媒する触媒を有する反応混合物とヒドロシリル化条件下に接触させることによってシリコーンコーティングが備えられるように実施される。特に、この方法は、不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物の存在下に、ヒドロシリル化反応が実施されるように実施されうる。ヒドロシリル化に際して生じるシリコーンによって、酵素固定化物にはシリコーンコーティングが備えられうる。
【００４２】
ヒドロシリル化は当業者に周知の方法で実施されうる。好ましくは、ヒドロシリル化は上述したパラメータ／使用素材／触媒を使用して実施される。
【００４３】
本発明による方法の好ましい実施形態において、特定量の酵素固定化物には、例えば、一般式Ｉおよび一般式ＩＩの化合物ならびにカールシュテット（Ｋａｒｓｔｅｄｔ）触媒を含有する混合物の添加によって、シリコーン試薬（式ＩおよびＩＩの化合物＋触媒）の混合物（反応混合物）が添加される。例えば、酵素固定化物１ｇには、１０：１〜１：１０のモル混合比で式ＩおよびＩＩの化合物、ならびにカールシュテット触媒、例えば、シリコーン成分の既存量に対して５０ｐｐｍの混合物が添加されうる。コーティング特徴の最適化のために、シリコーン成分を触媒を含めて添加の前に溶剤、例えば、シクロヘキサン、トリオール、または別の有機溶剤において溶解し、かつその溶液を酵素固定化物に添加することが有利でありうる。例えば、シクロヘキサンが溶剤として使用されると、溶液を酵素固定化物に添加した後、例えば、ボルテクサー（Ｖｏｒｔｅｘｅｒ）（イカ（Ｉｋａ）、ステップ９）によって、シクロヘキサンの大部分が蒸発するまで、この混合物を約１５〜３０分間、強く分散させるのが有利であることが証明された。次いで、得られた酵素製剤を乾燥室において５０℃で、例えば１２時間、乾燥させ、もしくは硬化させる。一般式ＩおよびＩＩの化合物の混合比の変化によって、シリコーンコーティングの特徴は問題なく変化し、対応する要件に一致する。
【００４４】
本発明による方法の別の実施形態が、コーティングすべき酵素固定化物を所望の反応混合物へ浸漬し、次いで反応混合物から除去し、かつ乾燥させることによって前述の実施形態と区別される。除去は、例えば、酸素固定化物粒子を抑制するふるいを使用して行われうる。浸漬時間は、好ましくは、１〜１０分である。乾燥は従来の乾燥室で行われうる。好ましくは、乾燥／硬化は２０℃〜８０℃、好ましくは、４０℃〜６０℃、特に好ましくは、約５０℃の温度で行われる。
【００４５】
特に、技術的基準での実施に適している本発明による方法の別の実施形態において、ヒドロシリル化は（例えば、エアヴェルカ（Ｅｒｗｅｒｋａ）またはアイリッヒ（Ｅｉｒｉｃｈ）社の）ペレット化パンユニットを使用して実施される。この場合、酵素固定化物粒子の規定量がいわゆるパンユニットへ添加され、攪拌される。次いで、式ＩおよびＩＩの化合物のほか、触媒ならびに場合により溶剤を含有する混合物が添加され、または好ましくは、（例えば、シュリック（Ｓｃｈｌｉｃｋ）社または他の）２流体ノズルが使用されて、加圧され（例えば、窒素または合成空気）、混合物もしくは成分が微噴霧の形で塗布され、できるだけ均一の分布を粒子上で保証する。粒子は、長めのコーティング時間後に、上述したように除去され、かつ数時間、２０℃〜８０℃、好ましくは、４０℃〜６０℃、特に好ましくは、５０℃の温度で乾燥室で乾燥され、もしくは硬化され、次いでさらに使用するまで室温で貯蔵される。
【００４６】
別の実施形態において、粒子は流動層反応器（例えば、エアヴェルカ（Ｅｒｗｅｒｋａ）社）において生成されうるが、ここで粒子および反応混合物は適切な混合比で強い分散下に使用される。
【００４７】
本発明による酵素製剤は、例えばバイオ触媒として、特に工業用バイオ触媒として使用されうる。
【００４８】
本発明を図１および２の図面を用いて詳しく説明するが、これらに限定されることはない。
【００４９】
図１および図２は、４ｃｍの底の直径を有する１００ｍＬのビーカー中の攪拌懸濁液の写真を示す。懸濁液は、実施例２に記載されているように製造されている。図面の図１からは、微粒子の未処理ＮＺ４３５に基づく攪拌懸濁液が混濁していることがわかる。それに対して、本発明により処理されたＮＺ４３５に基づく攪拌懸濁液は透明であり、粒子もなく、もしくは少なくとも可視的大きさの粒子もない（図２）。
【００５０】
以下の実施例により、明細書および特許請求の範囲から生じる保護範囲を制限することなく、本発明を詳しく説明することにする。
【実施例】
【００５１】
材料と方法：
ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）４３５（ＮＺ４３５）は、ポリメタクリレート上に吸着によって固定化されたＣ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来のリパーゼＢの、ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ／デンマークの市販の酵素固定化物である。
【００５２】
加水分解活性（水性媒体におけるトリブチリン加水分解）：
加水分解活性をいわゆるｐＨ−Ｓｔａｔ法で測定したが、この場合、加水分解で放出された酸を塩基に対して滴定し、溶液のｐＨ値を一定に維持する。塩基の消費の時間依存性から放出された酸とともに酵素活性が定量化される。実施例：触媒活性粒子１０−２０ｍｇをトリス−ＨＣｌ緩衝液（１ｍＭ、ｐＨ７．５、さらに０．１ｍＭ ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２を含有）２５ｍＬおよびトリブチリン５００μＬに添加した。加水分解活性を自動滴定装置（トリトロリン（Ｔｒｉｔｒｏｌｉｎｅ）アルファ、ショット（Ｓｃｈｏｔｔ）社）において滴定塩基（５０ｍＭ ＮａＯＨ）の量を定量化した。
【００５３】
加水分解活性（水性媒体におけるバレリアン酸エチルエステル）：
トリブチリンの実施例における加水分解活性の測定と同様に、バレリアン酸エチルエステルも使用されうる。実施例：触媒活性粒子１０−２０ｍｇをリン酸緩衝液（１ｍＭ、ｐＨ８．０）２５ｍＬ、およびバレリアン酸エチルエステル５００μＬを添加した。加水分解活性を自動滴定装置（トリトロリン（Ｔｒｉｔｒｏｌｉｎｅ）アルファ、ショット（Ｓｃｈｏｔｔ）社）において滴定塩基（５０ｍＭ ＮａＯＨ）の量を定量化した。
【００５４】
ＰＬＵ単位での合成活性（溶剤非含有系におけるプロピルラウレート合成活性）：
触媒活性粒子１０ｍｇを等モル基質溶液（ラウリン酸および１−プロパノール）５ｍＬに添加し、６０℃で振盪もしくは攪拌してインキュベートした。試料（Ｖ試料：５０μＬ）を２５分にわたって５分ごとに取出し、デカン（内部標準：４ｍＭドデカン）９５０μＬに移した。ＰＬＵの測定は開始生成種を用いて行われる。プロピルラウレートの検出（保持時間：９，７９１分）はガスクロマトグラフィーで行われた（島津製作所（Ｓｈｉｍａｚｕ）２０１０、ＳＧＥ社、ＢＴＸカラム、長さ２５ｍ、内径０．２２μｍ、膜：０．２５μｍ、検出器タイプ：３００℃でのＦＩＤ、注入温度２７５℃および注入量１μＬ、分割比（Ｓｐｌｉｔｒａｔｉｏ）３５，０、担体ガス圧（ヘリウム）１５０ｋｐａ、温度プログラム：開始温度６０℃を１．５分維持、温度上昇２０℃／分、終了温度２５０℃を２．５分維持）。
【００５５】
ラッカーゼ活性の測定：
ラッカーゼ活性の測定のために、触媒活性粒子（天然または固定化ラッカーゼ）をＡＢＴＳ−Ｌｓｇ（Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅの溶液、１．８ｍＭ、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手）１ｍＬを含むリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６、３７℃）１９ｍＬに移し、かつ吸光の増加を４０５ｎｍで分光計により測定する。ラッカーゼ活性は２０分の時間にわたって追跡されなければならない。試料は５分の間隔で取られる。活性は次のように測定される。すなわち、
【数１】
ΔＥｘｔ． ４０５ 時間に依存した吸光の変化
Ｖ総 反応成分における総量［２０ｍＬ］
Ｖ試料 試料の量［２ｍＬ］
Δｔ 時間の変化［分］
ε ４０５ｎｍでのＡＢＴＳの吸光係数［４３．２ｍＬ μｍｏｌ−１ｃｍ−１］
ｄ キュベットのコーティング厚さ［１ｃｍ］
【００５６】
活性は、毎分１μｍｏｌ基質転換として規定される単位（Ｕ／ｍＬもしくはＵ／ｇ）で示される。
【００５７】
ブラッドフォードによるタンパク質測定：
上清におけるタンパク質含量の測定をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の方法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９７６年、７２、２４８−２５４頁）に従って実施したが、これはタンパク質における塩基性および芳香族アミノ酸残基へのトリアリルメタン色素クーマシー・ブリリアント・ブルーＧ−２５０の結合に基づく。この結合は、４６５ｎｍから５９５ｎｍへの吸光最大の変化の原因となる。較正の確立のためにＢＳＡの吸光を５−２０μｇ／Ｌの濃度で測定した。このためにそれぞれの試料にＨ２Ｏを補充して８００μＬとし、ブラッドフォード試薬（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ Ｒａｄ）、ミュンヘン）２００μＬを添加して５９５ｎｍで測定した。
【００５８】
厳しい反応条件下に触媒活性粒子の浸出反応を測定するためにプロトコルを次のステップに拡大した。
【００５９】
ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）４３５（ＮＺ４３５）のタンパク質の割合の測定は次のスキームに従って行われた。ＮＺ４３５粒子を３０分間、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（１：１、ｖ／ｖ）において４５℃で振盪してインキュベートし、次いで上清から試料（例えば、１ｍＬ）を取出し、凍結乾燥させ、Ｈ２Ｏ（同じく１ｍＬ）中に再懸濁した。次いで、タンパク質含量を上述したように測定することができた。結果は表１からわかる。
【００６０】
【表１】
【００６１】
比較例１：従来の酵素固定化物の機械的安定性の測定
粒子の機械的安定性の測定のために、これらをさまざまな高粘性の等モル基質溶液（例えば、ポリエチレングリコール（分子量約２４００）および油酸）において高い性能特性および６０℃より高い温度でインキュベートし、次いで粒子の完全性を検査した。ＮＺ４３５（ポリエチレングリコール（分子量約２４００））および油酸中５重量％）を使用して２４時間後に、例えば明らかに発生する混濁によって、裸眼で微粒子の形成を発見することができた。
【００６２】
比較例２：従来の酵素固定化物の脱着安定性の測定
厳しい反応条件下に粒子の脱着安定性の測定のために、ＮＺ４３５ ５０ｍｇの一部分をＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１、ｖ／ｖ）溶液２０ｍＬにおいて４５℃で３０分間振盪した。上清から特定の試料（例えば、１ｍＬ）を取出し、上清中のタンパク質含量を上述したように測定した。粒子を折畳み型フィルタを介して回収し、Ｈ２Ｏ １００ｍＬで洗浄し、かつ１２時間、５０℃で乾燥させ、次いで上述したスキームに従って加水分解活性および合成活性をＰＬＯで測定した。結果は表２からわかる。
【００６３】
【表２】
【００６４】
実施例１：安定した酵素製剤の製造
製造例：
ＮＺ４３５粒子１ｇを金属シャーレに、一般式ＩおよびＩＩの化合物（組成は表３を参照、一般式およびＩＩの成分は、例えば、米国特許第７，１９６，１５３Ｂ２号明細書に記載されているように、当業者に周知の方法に従って、平衡によって製造された）のさまざまな組成物、ならびにカールシュテット触媒（Ｓｙｌｏｆｆ ４０００、ダウ・コーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）、米国の製品）からなる反応混合物１ｍＬとともに添加した。シリコーン成分を触媒を含めてそれぞれ使用前にシクロヘキサン３ｍＬ中に溶解し、次いで金属シャーレの粒子に添加した。添加後、直ちにボルテクサー（Ｖｏｒｔｅｘｅｒ）（イカ（Ｉｋａ）、ステップ９）を用いて１５−３０分間、シクロヘキサンの大部分が蒸発するまで強く分散させた。次いで、粒子を約１２時間、乾燥室において５０℃で乾燥させた。
【００６５】
【表３】
【００６６】
この方法に従って製造された粒子は、加水分解における未処理固定化物に対して、７３％まで（比較例１に記載されているように、未処理ＮＺ４３５の１．０５Ｕ／ｍｇと比べ、実施例１ ｉおよび１ ｉｉｉ、０．７７Ｕ／ｍｇ ＮＺ４３５）、もしくは６５％まで（実施例１ ｉ、０．６８Ｕ／ｍｇ ＮＺ４３５）の活性収率を有する。合成においては、９４％（実施例１ ｉ）、８４％（実施例１ ｉｉｉ）、または６８％（実施例１ ｉｉ）の活性収率を達成することができた。
【００６７】
実施例２：本発明による酵素製剤の機械的安定性の測定
粒子（未処理、天然ＮＺ４３５、もしくは表３のｉｉｉに従ってコーティングされたＮＺ４３５）３００ｍｇをそれぞれ９０分間、５ｍＬラウリン酸中で６０℃下に強く攪拌した（イカ（Ｉｋａ）社の磁気攪拌プレート、モデルＲＴパワー、ステップ５、磁気攪拌子、長さ３．１ｃｍ、幅０．６ｃｍ）。撹拌器の除去後、攪拌懸濁液の写真を作成した（図１および２）。
【００６８】
図面の図１により、微粒子の未処理ＮＺ４３５に基づく攪拌懸濁液が混濁していることが明らかにわかる。本発明による処理ＮＺ４３５に基づく攪拌懸濁液は、それに対して透明であり、粒子もなく、もしくは少なくとも可視的大きさの粒子もない（図２）。
【００６９】
次いで、懸濁液からの粒子を折畳み型フィルタで分離し、約１０ｍＬのアセトンで洗浄し、１２時間、５０℃で乾燥させた。
【００７０】
粒子の機械的安定性の測定のために粒度分布の測定を実施した。これにより使用されるふるい比は次の排除サイズを有した。すなわち、８００μｍ、５００μｍ、３００μｍ、１５０μｍ、および７５μｍ。
【００７１】
ふるい分けごとに攪拌前後に粒度分布を測定した。結果は表４からわかる。
【００７２】
【表４】
【００７３】
実施例３：安定な酵素製剤の脱着安定性の測定
比較例２と同様に、実施例１から得られた粒子を水／アセトニトリルで処理し、次いで加水分解活性、合成活性、および放出タンパク質の量を測定した。この測定の結果は表５からわかる。
【００７４】
【表５】
【００７５】
未処理天然酵素固定化物はインキュベーション後に決して加水分解活性を示さず、５６μｇ／ｍｇ固定化物が遊離タンパク質として検出されうるが、シリコーンコート粒子は初期活性の７５％までの加水分解活性（試料ｉｉ、０．５１Ｕ／ｍｇ ＮＺ４３５対浸出前の０．７７Ｕ／ｍｇ ＮＺ４３５）、初期活性の５５％までの合成活性（試料ｉｉ、２９８０Ｕ／ｇ ＮＺ４３５対浸出前の５４００Ｕ／ｇ ＮＺ４３５）、および約８６％（試料ｉｉ）まで削減された酵素脱着を示す。
【００７６】
実施例４：酵素固定化物の製造
Ｌｅｗａｔｉｔ ＶＰＯＣ １６００（ランクセス（Ｌａｎｘｅｓｓ）社）１ｇを約１８時間、室温でＣＡＬＢ溶液（リポザイムＣＡＬＢ Ｌ、ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、デンマークバウスヴェア（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ）加水分解活性：２７００Ｕ／ｍＬ）５ｍＬ中で攪拌し、折畳み型フィルタで分離し、かつ水２５０ｍＬで蒸留洗浄し、次いで３時間、風乾し、イソプロパノール１ｍＬで洗浄し、かつもう１回、１時間、風乾した。こうして製造された固定化物をロック可能な反応容器において４℃下でさらに使用するまで貯蔵した。
【００７７】
上述した方法の後、酵素固定化物の活性を測定した（１．０４Ｕ／ｍｇの加水分解活性および６０００ＰＬＵ／ｇの合成活性）。負荷密度はブラッドフォード試験によって約３０μｇタンパク質／ｍｇＶＰＯＣ１６００で測定された。
【００７８】
こうして生成された酵素固定化物を上述した方法後の第２のステップにおいてシリコーンでコーティングした（表３の実験ｉにおけるような組成）。製剤中の酵素固定化物の質量の割合は６３％に相当する。コート製剤の加水分解活性は０．４３Ｕ／ｍｇであり、合成活性は２９２７ ＰＬＵ／ｇである。
【００７９】
比較例２と同様に、非コートおよびシリコーンでコーティングされた粒子を水／アセトニトリルで処理し、次いで加水分解活性、合成活性、および放出タンパク質の量を測定した。結果は表６からわかる。
【００８０】
【表６】
【００８１】
表６からわかるように、未処理固定化物において９倍の量のタンパク質が脱着される。同時に、５４％（加水分解活性）、もしくは６０％（合成活性）の活性収率が達成されうる。ＮＺ４３５によってすでに市販の完成製剤で示されたシリコーンでの酵素固定化物のコーティングのための上述した方法の適合性は、したがって、自己負荷酵素固定化物でも証明することができた。
【００８２】
実施例５：有機溶剤中の酵素活性の測定
実施例１および４の酵素製剤、ならびに対応する天然固定化物の活性を、プロピルラウレート合成がメチルシクロヘキサン（基質の初期濃度＝１０ｍＭ、温度＝２５℃）中で実施されることによって測定する。
【００８３】
【表７】
【００８４】
表７は、酵素製剤の活性収率が有機溶剤における使用に際して顕著であり、かつ脱着安定性も明らかになることを明らかに示している。
【００８５】
実施例６：別のリパーゼ製剤の製造
実施例１と同様に、リポザイムＲＭ ＩＭ（ランクセス（Ｌａｎｘｅｓｓ）社のＤｕｏｌｉｔｅ Ａ５６８上に固定化されたムコール・ミエヘイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼ、ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）から入手）にシロキサンコーティングを備え、かつ活性収率を実施例５と同様に有機溶剤中で測定する。
【００８６】
【表８】
【００８７】
表８は、リポザイムＲＭ ＩＭの使用量に関して、測定精度の枠内で定量的活性収率が達成されることを明らかに示している。
【００８８】
実施例７：別のリパーゼ製剤の製造
実施例４と同様に、サーモマイセス・ラヌギノーサ（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）由来のリパーゼ（アザ・スペツィアルエンザイム（Ａｓａ Ｓｐｅｚｉａｌｅｎｚｙｍｅ）社の「エステラーゼ（Ｅｓｔｅｒａｓｅ）ＴＬ０１として入手、これは追加のエステラーゼ機能を有するリパーゼであることが重要である）をＬｅｗａｔｉｔ ＶＰＯＣ１６００上に固定化し、かつシロキサンコーティングを備える。活性測定には加水分解バレリアン酸エチルエステルを測定する。
【００８９】
【表９】
【００９０】
表９は、天然製剤は２６１Ｕ／ｇの活性を有するが、コーティングされた製剤は１５７Ｕ／ｇの活性を示すことを示している。天然固定化物の含量に関して、これは２８５Ｕ／ｇの活性を意味し、すなわち、誤差精度の枠内で定量的活性収率が達成されうる。
【００９１】
実施例８：エステラーゼ製剤の製造
実施例７と同様に、リゾプス・オリザエ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）由来のエステラーゼをＬｅｗａｉｔ ＶＰＯＣ１６００上に固定化し、コーティングし、かつバレリアン酸エチルエステルの加水分解における活性を測定する。
【００９２】
【表１０】
【００９３】
ここでも測定精度の枠内で量的活性収率が示される。
【００９４】
実施例９：ラッカーゼ製剤の製造
実施例４と同様に、ミセリオフトーラ・サーモフィリア（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉａ）（ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）におけるＦｌａｖｏｒｓｔａｒとして入手）由来のラッカーゼ（ＥＣ １.１０.３.２）をＬｅｗａｔｉｔ ＶＰ ＯＣ １６００上に固定化し（１ｇＬｅｗａｔｉｔ ＶＰＯＣ １６００におけるタンパク質４．５ｍｇ）、シロキサンコーティングを備え、かつＡＢＴＳアッセイにおける活性を測定した。
【００９５】
【表１１】
【００９６】
表１１は、ラッカーゼも本発明による方法でコーティングされることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】微粒子の未処理ＮＺ４３５に基づく攪拌懸濁液の写真である。
【図２】処理されたＮＺ４３５に基づく攪拌懸濁液の写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオ触媒として使用するための新しい種類の酵素製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物および単離酵素は、化学工業または食品製造における触媒として幅広く使用されている。概要が、例えば、Ａ．リーゼ（Ｌｉｅｓｅ）、Ｋ．ゼールバッハ（Ｓｅｅｌｂａｃｈ）、Ｃ．ワンドレイ（Ｗａｎｄｒｅｙ）、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）−ＶＣＨ：２０００年、ドイツヴァインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）に示されている。
【０００３】
かかるバイオ触媒の経済的使用を保証するために、いくつかの条件が満たされなければならない。すなわち、バイオ触媒は反応条件下に十分に長く活性でなければならず、反応終了後に容易に分離可能であり、かつできるだけ頻繁に再使用可能であるべきである。理想的には、これらの条件は、できるだけ一般の触媒を提供するために、できるだけ広範囲の反応条件（例えば、温度範囲、使用される溶剤の種類、圧力等）に対して満たされるべきである。
【０００４】
これらの条件を満たすために、使用される酵素または酵素を含有する微生物を固定化する通常の方法が必要である。
【０００５】
多くの場合、酵素または酵素を含有する微生物は担体上に非共有結合で固定化され、担体としては多くの場合、適切な粒度分布のイオン交換樹脂またはポリマー粒子が使用される。その例は、ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、デンマークの市販製品ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）４３５、リポザイム（Ｌｉｐｏｚｙｍ）ＲＭ ＩＭ、またはリポザイム（Ｌｉｐｏｚｙｍ）ＴＬ ＩＭ、または天野（Ａｍａｎｏ）エンザイム（株）（日本）の市販製品アマノ（Ａｍａｎｏ）ＰＳである。これらの例は、かかる固定化物が非水性系においても、例えば、「Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．」１９８９年、９３４−９３５頁に記載されているように、溶剤をまったく含有せず、または有機溶剤しか含有しないような、技術的に利用可能な活性を示すため、広範囲に使用されている固定化リパーゼである。ただし、かかる固定化物の使用における欠点は、一方では、使用される反応系に依存して、例えば、界面活性成分の使用に際して、酵素または酵素を含有する微生物の脱着の発生である。かかる脱着に付随する活性損失は比較例１において示される。さらに、かかる製剤は不十分な機械的安定性を示し、それによって簡易な攪拌反応器での使用が不可能であり、または明らかに再使用が制限された場合にだけ可能である。かかる製剤の機械的不安定性は比較例２において示される。
【０００６】
したがって、かかる酵素製剤の反復使用を可能にするためには、別のリアクターコンセプトを使用しなければならない。「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」２００３年、１０５、６０１−６０７頁には、実施例について、リパーゼ触媒エステル化を実施するための固定床反応器の使用が記載されている。ただし、この方法の欠点は、高粘性混合物または懸濁液が固定床によって促進できないため低粘性均一反応混合物に限定されることである。
【０００７】
Ｋ．ファーベル（Ｆａｂｅｒ）「有機化学における生体内変換（Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、シュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）：２０００年、ドイツベルリンには、３８４頁以下にアルギン酸封入酵素の使用が記載されている。ただし、こうして得られる製剤は機械的安定性がきわめて低く、かつ非水性系における活性がきわめて低い。
【０００８】
さらに、例えば、グルタルジアルデヒドなどの反応性物質による固定化酵素の追加の交差架橋が記載されている。ただし、欠点は、修飾前の活性と比べ交差架橋製剤のほとんど明らかに低下した特異的活性である。さらに、この方法は機械的安定性の改善に寄与しない。
【０００９】
同様に、そこには反応性担体への酵素の共有固定化が記載されている。これによる欠点は、担体と反応しうる適切な官能基が酵素の表面に存在しなければならないことであり、さらに、それによってしばしば酵素活性の損失が生じる。
【００１０】
「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１９９９年、１２１、９４８７−９４９６頁にはシロキサン基質、いわゆるゾル・ゲルにおける酵素の含有物が記載されている。ゾル・ゲル製剤の欠点は、効率的にろ過するのが難しい低い粒度分布、機械的安定性の不足、脱着の発生、毒性反応物の使用（ＴＥＯＳの毒性については、例えば、「日本酸素技報（Ｎｉｐｐｏｎ Ｓａｎｓｏ Ｇｉｈｏ）」 １９９０年、９、６８−７２頁およびＡｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １９９４年、６８、２７７−２８３頁を参照、ＴＭＯＳの毒性については、例えば、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ」１９８９年、１３、２８５−２９５頁を参照、非毒性ゾル・ゲルの製造には、例えば、「Ｐｏｌｉｍｅｒｙ ｗ Ｍｅｄｙｃｙｎｉｅ」２０００年、３０、４５−５４頁に記載されているように、６か月以上の貯蔵や３５０℃での熱処理という手間のかかるステップが必要である。さらに、これは使用された溶剤にきわめて強く依存する膨張反応であり、これはさまざまな反応系（水性および非水性）における普遍的な使用を妨げる。「Ｊ．Ｓｏｌ Ｇｅｌ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」２００３年、２６、１１８３−１１８７頁は、例として、観察された酵素活性の溶剤依存性とともに広範囲な使用可能性の要件が満たされないことを示している。
【００１１】
「Ｌａｎｄｂａｕｆｏｒｓｃｈｕｎｇ Ｖｏｅｌｋｅｎｒｏｄｅ」２００２年、特集号２４１、４１−４６頁には、その酵素が最初に「微細な」シリコーン粒子上に固定化され、次いでゾル・ゲルへカプセル化されるゾル・ゲル製剤が記載されている。そこで機械的安定性の問題は部分的に解決されるが、記載されている実験は、十分な活性が選択された溶剤においてのみ達成されることを示し、溶剤非含有系における使用はまったく記載されていない。さらに、製剤は直ちに使用可能な形では存在せず、まず適切な大きさに切断しなければならず、これは技術的基準においてほとんど実現されない。
【００１２】
「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ」２００５年、３５、９３−９９頁には、機械的に安定なシリコーン球への水性酵素溶液の封入、いわゆる固定化エマルションによる酵素の固定化が記載されている。しかし、得られる特異的活性は、１０００Ｕ／ｇ以上のわずかに特異的な活性化が達成されうる上述した不活性担体上の固定化物と比べ、３３Ｕ／ｇまでと、明らかに低すぎる（Ｕ＝単位もしくはμｍｏｌ／分）。
【００１３】
国際公開第０３／１０６６０７号パンフレットにもかかる固定化エマルションが記載されているが、水性系における使用のみが記載されており、用途は洗剤組成物であり、バイオ触媒ではなく、かつ得られる粒径は約１０μｍであり、有機反応混合物から効率的にろ過するには小さすぎる。
【００１４】
したがって、従来技術の欠点を克服し、これまでに実現不可能なバイオ触媒の方法を実現する酵素固定化のための方法がさらに必要とされている。
【特許文献１】国際公開第０３／１０６６０７号パンフレット
【非特許文献１】「Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．」１９８９年、９３４−９３５頁
【非特許文献２】「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」２００３年、１０５、６０１−６０７頁
【非特許文献３】Ｋ．ファーベル（Ｆａｂｅｒ）「有機化学における生体内変換（Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、シュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）：２０００年、ドイツベルリン ３８４頁以下
【非特許文献４】「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１９９９年、１２１、９４８７−９４９６頁
【非特許文献５】「日本酸素技報（Ｎｉｐｐｏｎ Ｓａｎｓｏ Ｇｉｈｏ）」 １９９０年、９、６８−７２頁
【非特許文献６】Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １９９４年、６８、２７７−２８３頁
【非特許文献７】「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ」１９８９年、１３、２８５−２９５頁
【非特許文献８】「Ｐｏｌｉｍｅｒｙ ｗ Ｍｅｄｙｃｙｎｉｅ」２０００年、３０、４５−５４頁
【非特許文献９】「Ｊ．Ｓｏｌ Ｇｅｌ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」２００３年、２６、１１８３−１１８７頁
【非特許文献１０】「Ｌａｎｄｂａｕｆｏｒｓｃｈｕｎｇ Ｖｏｅｌｋｅｎｒｏｄｅ」２００２年、特集号２４１、４１−４６頁
【非特許文献１１】「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ」２００５年、３５、９３−９９頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明の課題は、従来技術の製剤の１つもしくは複数の欠点のない酵素製剤の提供であった。具体的には、機械的な力および脱着に対して高い安定性を有し、かつその際に好ましくは、技術的使用を可能にするために十分に高いさまざまな水性および非水性反応混合物における特異的活性を使用する酵素製剤が提供されるべきである。好ましくは、酵素製剤は、反応系から簡単に分離され、かつ再使用されうる、その粒度分布から適切でなければならない。
【００１６】
明確に挙げられていない別の課題は、以下の明細書、実施例のほか、特許請求の範囲の文脈から生じる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この課題は、不活性担体上の酵素または酵素を含有する微生物の固定化、および次いでヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングの被覆によって得られる酵素製剤によって解決されるという意外な方法が見出された。
【００１８】
したがって、本発明の対象は、不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物に、ヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングが備えられる酵素製剤、ならびに工業用バイオ触媒としてのその使用である。
【００１９】
さらに、本発明の対象は、不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物に、ヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングが備えられることを特徴とする、本発明による酵素製剤の製造方法である。
【００２０】
本発明による酵素製剤には、機械的な力および脱着に対して高い安定性を有するという利点がある。これら改善された特徴にもかかわらず、本発明による酵素製剤には、さまざまな水性（例えば、トリブチリンの加水分解）および非水性反応化合物（例えば、プロピルラウレートの溶剤非含有合成）における、技術的使用を可能にするために十分に高い特異的活性がある。さらに、本発明による酵素製剤には、担体材料および担体材料に付随する粒度分布の選択によって、酵素製剤の反応系からの簡単な分離および酵素製剤の再使用が可能であるように粒径を設定しうる利点がある。
【００２１】
本発明による酵素製剤およびその製造のための方法は以下に例示的に記載されるが、本発明はこれらの例示的な実施形態に限定されることはない。以下に範囲、一般式、または化合物クラスが挙げられている場合、これらは、明確に言及されている化合物の適切な範囲または群だけではなく、個々の値（範囲）または化合物からの取出しによって得られうる化合物のすべての部分範囲および部分群も包含する。本明細書の枠内で文書が引用される場合、その内容は完全に本発明の開示内容に属する。本発明の枠内で、例えば、さまざまな単位を多重に有しうる有機修飾ポリシロキサンなどの化合物が記載される場合、これらはこれらの化合物においてランダムに分布され（ランダムオリゴマー）または規則正しく（ブロックオリゴマー）存在しうる。かかる化合物における単位の数の表示は、すべての対応する化合物を介して得られる平均値として理解される。
【００２２】
本発明による酵素製剤は、不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物に、ヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングが備えられることによって得られることを特徴とする。
【００２３】
酵素固定化物の製造のために、適切な酵素を含有する全細胞、休止細胞、精製酵素または細胞抽出物、またはその混合物が使用されうる。好ましく使用されるのは、加水分解酵素、例えば、リパーゼ、エステラーゼ、またはプロテアーゼであり、例えば、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、サーモマイセス・ラヌゴシオサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｇｏｓｉｏｓｕｓ）、ブタ膵臓（Ｓｃｈｗｅｉｎｅｐａｎｋｒｅａｓ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、アルカリギネス属（Ａｌｃａｌｉｇｉｎｅｓ ｓｐ．）由来のリパーゼ、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）由来のコレステロールエステラーゼ、ブタ肝臓由来のエステラーゼなどであり、特に好ましくは、リパーゼが使用される。したがって、酵素固定化物は、好ましくは、加水分解酵素、好ましくは、リパーゼのクラス由来の酵素を有する。
【００２４】
不活性担体としては、不活性有機または無機担体が使用されうる。不活性担体としては、好ましくは粒子の少なくとも９０％において１０〜５０００μｍ、好ましくは、５０μｍ〜２０００μｍの粒径の粒度分布を有するような個々の粒子担体が使用され、もしくは酵素固定化物に存在する。有機担体としては、特に、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニルスチロール、スチロール−ジビニルベンゾル共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンペレフタレート、ＰＴＦＥおよび／または他のポリマーを有する、またはこれらからなるものが使用されうる。担体材料としては、固定化すべき酵素に依存して、特に、酸性または塩基性イオン交換樹脂、例えば、Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ５６８、Ｄｕｏｌｉｔｅ ＸＡＤ ７６１、Ｄｕｏｌｉｔｅ ＸＡＤ １１８０、Ｄｕｏｌｉｔｅ ＸＡＤ ７ＨＰ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ ４００、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＣＧ ５０、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（すべてローム・アンド・ハース（Ｒｏｈｍ ｕｎｄ Ｈａａｓ）社の製品）またはＬｅｗａｔｉｔ ＣＮＰ １０５およびＬｅｗａｔｉｔ ＶＰ ＯＣ １６００（ランクセス（Ｌａｎｘｅｓｓ）社、ドイツレバークーゼン（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ）の製品）が使用されうる。無機担体としては、従来技術から周知の酸化物および／またはセラミック担体が使用されうる。特に、無機担体として、例えば、セライト、ゼオライト、シリカ、細孔性ガラス（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓ（ＣＰＧ））または他の担体が使用されうるが、これらは例えば、Ｌ．カオ（Ｃａｏ）、「担体結合固定化酵素：原理、応用、および設計（Ｃａｒｒｉｅｒ−ｂｏｕｎｄ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ）」、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）−ＶＣＨ：２００５年、ドイツヴァインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）に記載されている。特に好ましくは、酵素固定化物に存在する不活性担体もしくは酵素固定化物の製造に使用される不活性担体は、ポリビニルスチロール、ポリメタクリレートまたはポリアクリレートからなる。
【００２５】
粒子上での固定化は、本発明によれば、共有または非共有、好ましくは、非共有で行われうる。非共有固定化のためには、担体は、例えば、場合により別の成分、例えば、無機塩または界面活性剤を含有する水性酵素溶液でインキュベート、もしくは含浸されうる。このインキュベーション／含浸は、例えば、０℃〜５０℃、好ましくは、０℃〜４０℃の温度で実施されうる。好ましくは、インキュベーション／含浸は数分〜数時間の時間にわたって行われる。インキュベーションの進行は、タンパク質測定のための一般的な方法により溶液中の酵素の濃度を測定することによって行われうる。所望の固定化度の達成後、担体は、好ましくは、水で洗浄され、かつ必要に応じて、乾燥されうる。次いで、こうして得られた酵素固定化物には、本発明によれば、シリコーンコーティングが備えられうる。
【００２６】
しかし、本発明によれば、市販されている酵素固定化物、例えば、（ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、デンマークのノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ） ４３５、リポザイムＲＭ ＩＭ、またはリポザイムＴＬ ＩＭ、または天野（Ａｍａｎｏ）エンザイム（株）（日本）のアマノ（Ａｍａｎｏ）ＰＳも使用されうる。
【００２７】
シリコーンコーティングは、本発明によれば、ヒドロシリル化によって得られる。そのために、好ましくは、触媒、好ましくは、遷移金属触媒の存在下に、Ｓｉ−Ｈ官能性ポリシロキサンが、少なくとも１つの末端、好ましくは、少なくとも２つの炭素−炭素二重結合を有する有機修飾ポリシロキサンで転換される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
Ｓｉ−Ｈ官能性ポリシロキサンとしては、好ましくは、一般式Ｉ
【化１】
［式中、
Ｎは、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋２＝３〜８５０、好ましくは、６〜１６０であり、
ａは、１〜８００、好ましくは、２〜１５０であり、
ｂは、０〜４００、好ましくは、２〜７５であり、
ｃは、０〜１０、好ましくは、０であり、
ｄは、０〜１０、好ましくは、０であり、
Ｒ１は、互いに独立して同一または異なり、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基、好ましくは、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、またはフェニル、特に、メチルを含んで成る群から選択され、
Ｒ２ａは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ２ｂは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ３は、互いに独立して同一または一般式Ｉａ
【化２】
［式中、
Ｎは、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋２＝３〜８５０、好ましくは、６〜１６０であり、
ａは、１〜８００、好ましくは、２〜１５０であり、
ｂは、０〜４００、好ましくは、２〜７５であり、
ｃは、０〜１０、好ましくは、０であり
ｄは、０〜１０、好ましくは、０であり、
Ｒ１は、互いに独立して同一または異なり、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基、好ましくは、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基またはフェニル、特に、メチルを含んで成る群から選択され、
Ｒ２ａは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ２ｂは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ３は、互いに独立して同一、または、一般式Ｉａのさまざまな残基、または残基Ｒ１である］のさまざまな残基である］のＳｉＨポリシロキサンが使用される。
【００２９】
好ましくは、ＳｉＨ官能性ポリシロキサンとして、一般式Ｉ
【化３】
［式中、
Ｎは、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋２＝６〜１６０であり、
ａは、２〜１５０であり、
ｂは、２〜７５であり、
ｃは、０であり、
ｄは、０であり、
Ｒ１は、互いに独立して同一または異なり、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基、好ましくは、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、またはフェニル、特に、メチルを含んで成る群から選択され、
Ｒ２ａは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ２ｂは、互いに独立して水素またはＲ１である］のポリシロキサンが使用される。
【００３０】
これらの化合物が実質的に統計的法則によって規制される分布との混合物の形で存在していること、もしくは存在しうることは当業者には周知である。したがって、指数ａ、ｂ、ｃ、およびｄの値は、通常、平均値を示す。
【００３１】
本発明によれば、オレフィン反応相手として、すなわち末端炭素−炭素二重結合を含有するポリシロキサンとしては、好ましくは、一般式ＩＩ
【化４】
［式中、
Ｎは、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋２＝３〜１０００、好ましくは、１０〜６００であり、
ｍは、１〜８００、好ましくは、２〜６００であり、
ｎは、０〜２０、好ましくは、０〜１０、好ましくは、０であり、
ｏは、０〜１０、好ましくは、０であり、
ｐは、０〜１０、好ましくは、０であり、
Ｒ４は、互いに独立して同一または異なり、かつ次の群、すなわち、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基、好ましくは、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、またはフェニル、特に、メチルからなり、
Ｒ５は、互いに独立して末端不飽和アルキル残基、好ましくは、ビニル、または、好ましくは、３〜２０個の炭素原子を有するアルコキシル残基、またはＲ４であり、
Ｒ６は、互いに独立して同一または一般式ＩＩａ
【化５】
［式中、
Ｎは、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋２＝３〜１０００、好ましくは、１０〜６００であり、
ｍは、１〜８００、好ましくは、２〜６００であり、
ｎは、０〜２０、好ましくは、０〜１０、好ましくは、０であり、
ｏは、０〜１０、好ましくは、０であり、
ｐは、０〜１０、好ましくは、０であり、
Ｒ４は、互いに独立して同一または異なり、かつ次の群、すなわち、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基、好ましくは、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、またはフェニル、特にメチルからなり、
Ｒ５は、互いに独立して末端不飽和アルキル残基、好ましくは、ビニル、または、好ましくは、３〜２０個の炭素原子を有するアルコキシル残基、またはＲ４であり、
Ｒ６は、互いに独立して同一または一般式ＩＩａのさまざまな残基または残基Ｒ４である］のさまざまな残基である］のポリシロキサンが使用される。
【００３２】
末端炭素−炭素二重結合を含有するポリシロキサンとしては、好ましくは、一般式ＩＩ
【化６】
［式中、
Ｎは、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋２＝１０〜６００であり、
ｍは、２〜６００であり、
ｎは、０であり、
ｏは、０であり、
ｐは、０であり、
Ｒ４は、互いに独立して同一または異なり、かつ次の群、すなわち、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基、好ましくは、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、またはフェニル、特にメチルからなり、
Ｒ５は、互いに独立して末端不飽和アルキル残基、好ましくは、ビニル、または、好ましくは、３〜２０個の炭素原子を有するアルコキシル残基である］のポリシロキサンが使用される。
【００３３】
一般式ＩＩの化合物が実質的に統計的法則によって規制される分布との混合物の形で存在していること、もしくは存在しうることは当業者には周知である。したがって、指数ｍ、ｎ、ｏ、およびｐの値は、通常、平均値を示す。
【００３４】
ヒドロシリル化は触媒の存在下に確立された方法に従って実施されうる。この場合、例えば、ヒドロシリル化に通常使用される、例えば、白金、ロジウム、オスミウム、ルテニウム、パラジウム、イリジウム錯体または類似の化合物、もしくは適切な純元素、またはシリカ、アルミニウム酸化物、もしくは活性炭または類似の担体材料上に固定化された誘導体などの触媒が使用されうる。好ましくは、ヒドロシリル化は、Ｃｉｓ白金またはカールシュテット触媒［トリス（ジビニルテトラメチルジシロキサン）ビス−プラチン］などＰｔ触媒の存在下に実施される。
【００３５】
好ましくは、触媒の使用量は、モルオレフィン当たり、もしくは、モル末端炭素−炭素二重結合当たり１０−７〜１０−１モル、好ましくは、１〜１００ｐｐｍである。ヒドロシリル化は、好ましくは、０〜２００℃、好ましくは、２０〜１２０℃の温度で実施される。
【００３６】
ヒドロシリル化は、溶剤の存在下または非存在下に実施されうる。一般に、反応の実施のために溶剤は必要ではない。しかし、反応は、例えば、脂肪族または芳香族炭化水素、環状オリゴシロキサン、アルコールまたはエステルなど適切な溶剤において実施されうる。適切な溶剤は、特にシクロヘキサンまたはトルオールである。
【００３７】
本発明によれば、使用される担体の質量に関して、好ましくは、１〜５００質量％、好ましくは、１０〜２００質量％、特に好ましくは、２０〜１５０質量％のシロキサン成分が使用される。シロキサン成分は、特に式Ｉおよび式ＩＩの化合物の合計から、もしくはその反応産物から構成される。
【００３８】
ヒドロシリル化は、式１の化合物の式ＩＩの化合物とのきわめて種々の比を使用して実施されうる。好ましくは、ヒドロシリル化は、反応基に関して１：１０〜１０：１、好ましくは、１：５〜５：１、特に好ましくは、１：１．１〜１．１：１、かつ完全に特に好ましくは、１：１のモル比で行われる。一般式ＩおよびＩＩの使用される化合物の選択およびその混合比の変化によって、シリコーンコーティングの特徴は、基質の透過性および他の反応特性を考慮して変更される。シリコーン成分の酵素固定化物との重量比の選択によって、シリコーンコーティングのコーティング厚さは変化し、対応する要件要求に一致する。
【００３９】
ヒドロシリル化によって製造される本発明によるシリコーンコーティングは、ヒドロシリル化が酵素固定化物の存在下に実施されることによって得られうる。しかし、ヒドロシリル化によって得られたシロキサンをその後に酵素固定化物へ配置することよってコーティングを得ることも可能である。これは、例えば、酵素固定化物をシロキサンの溶液、例えば、有機溶剤、特に、シクロヘキサンまたはトリオール中のシロキサンの溶液で処理することによって行われうる。次いで、溶剤は、例えば、蒸発によって除去されうる。かかる溶液中のシロキサンの濃度は、好ましくは、１０〜１００質量％、好ましくは、３０〜１００質量％である。しかし、好ましくは、本発明によるシリコーンコーティングは、ヒドロシリル化が酵素固定化物の存在下に実施されることによって得られる。
【００４０】
本発明による酵素製剤は、好ましくは、以下に述べられる本発明による方法によって製造される。酵素製剤の製造のためのこの方法は、不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物に、ヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングが備えられることによって特徴づけられる。
【００４１】
好ましくは、本発明による方法は、酵素固定化物をＳｉＨ官能性ポリシロキサン、末端炭素−炭素二重結合を含有するポリシロキサン、ならびにヒドロシリル化を触媒する触媒を有する反応混合物とヒドロシリル化条件下に接触させることによってシリコーンコーティングが備えられるように実施される。特に、この方法は、不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物の存在下に、ヒドロシリル化反応が実施されるように実施されうる。ヒドロシリル化に際して生じるシリコーンによって、酵素固定化物にはシリコーンコーティングが備えられうる。
【００４２】
ヒドロシリル化は当業者に周知の方法で実施されうる。好ましくは、ヒドロシリル化は上述したパラメータ／使用素材／触媒を使用して実施される。
【００４３】
本発明による方法の好ましい実施形態において、特定量の酵素固定化物には、例えば、一般式Ｉおよび一般式ＩＩの化合物ならびにカールシュテット（Ｋａｒｓｔｅｄｔ）触媒を含有する混合物の添加によって、シリコーン試薬（式ＩおよびＩＩの化合物＋触媒）の混合物（反応混合物）が添加される。例えば、酵素固定化物１ｇには、１０：１〜１：１０のモル混合比で式ＩおよびＩＩの化合物、ならびにカールシュテット触媒、例えば、シリコーン成分の既存量に対して５０ｐｐｍの混合物が添加されうる。コーティング特徴の最適化のために、シリコーン成分を触媒を含めて添加の前に溶剤、例えば、シクロヘキサン、トリオール、または別の有機溶剤において溶解し、かつその溶液を酵素固定化物に添加することが有利でありうる。例えば、シクロヘキサンが溶剤として使用されると、溶液を酵素固定化物に添加した後、例えば、ボルテクサー（Ｖｏｒｔｅｘｅｒ）（イカ（Ｉｋａ）、ステップ９）によって、シクロヘキサンの大部分が蒸発するまで、この混合物を約１５〜３０分間、強く分散させるのが有利であることが証明された。次いで、得られた酵素製剤を乾燥室において５０℃で、例えば１２時間、乾燥させ、もしくは硬化させる。一般式ＩおよびＩＩの化合物の混合比の変化によって、シリコーンコーティングの特徴は問題なく変化し、対応する要件に一致する。
【００４４】
本発明による方法の別の実施形態が、コーティングすべき酵素固定化物を所望の反応混合物へ浸漬し、次いで反応混合物から除去し、かつ乾燥させることによって前述の実施形態と区別される。除去は、例えば、酸素固定化物粒子を抑制するふるいを使用して行われうる。浸漬時間は、好ましくは、１〜１０分である。乾燥は従来の乾燥室で行われうる。好ましくは、乾燥／硬化は２０℃〜８０℃、好ましくは、４０℃〜６０℃、特に好ましくは、約５０℃の温度で行われる。
【００４５】
特に、技術的基準での実施に適している本発明による方法の別の実施形態において、ヒドロシリル化は（例えば、エアヴェルカ（Ｅｒｗｅｒｋａ）またはアイリッヒ（Ｅｉｒｉｃｈ）社の）ペレット化パンユニットを使用して実施される。この場合、酵素固定化物粒子の規定量がいわゆるパンユニットへ添加され、攪拌される。次いで、式ＩおよびＩＩの化合物のほか、触媒ならびに場合により溶剤を含有する混合物が添加され、または好ましくは、（例えば、シュリック（Ｓｃｈｌｉｃｋ）社または他の）２流体ノズルが使用されて、加圧され（例えば、窒素または合成空気）、混合物もしくは成分が微噴霧の形で塗布され、できるだけ均一の分布を粒子上で保証する。粒子は、長めのコーティング時間後に、上述したように除去され、かつ数時間、２０℃〜８０℃、好ましくは、４０℃〜６０℃、特に好ましくは、５０℃の温度で乾燥室で乾燥され、もしくは硬化され、次いでさらに使用するまで室温で貯蔵される。
【００４６】
別の実施形態において、粒子は流動層反応器（例えば、エアヴェルカ（Ｅｒｗｅｒｋａ）社）において生成されうるが、ここで粒子および反応混合物は適切な混合比で強い分散下に使用される。
【００４７】
本発明による酵素製剤は、例えばバイオ触媒として、特に工業用バイオ触媒として使用されうる。
【００４８】
本発明を図１および２の図面を用いて詳しく説明するが、これらに限定されることはない。
【００４９】
図１および図２は、４ｃｍの底の直径を有する１００ｍＬのビーカー中の攪拌懸濁液の写真を示す。懸濁液は、実施例２に記載されているように製造されている。図面の図１からは、微粒子の未処理ＮＺ４３５に基づく攪拌懸濁液が混濁していることがわかる。それに対して、本発明により処理されたＮＺ４３５に基づく攪拌懸濁液は透明であり、粒子もなく、もしくは少なくとも可視的大きさの粒子もない（図２）。
【００５０】
以下の実施例により、明細書および特許請求の範囲から生じる保護範囲を制限することなく、本発明を詳しく説明することにする。
【実施例】
【００５１】
材料と方法：
ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）４３５（ＮＺ４３５）は、ポリメタクリレート上に吸着によって固定化されたＣ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来のリパーゼＢの、ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ／デンマークの市販の酵素固定化物である。
【００５２】
加水分解活性（水性媒体におけるトリブチリン加水分解）：
加水分解活性をいわゆるｐＨ−Ｓｔａｔ法で測定したが、この場合、加水分解で放出された酸を塩基に対して滴定し、溶液のｐＨ値を一定に維持する。塩基の消費の時間依存性から放出された酸とともに酵素活性が定量化される。実施例：触媒活性粒子１０−２０ｍｇをトリス−ＨＣｌ緩衝液（１ｍＭ、ｐＨ７．５、さらに０．１ｍＭ ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２を含有）２５ｍＬおよびトリブチリン５００μＬに添加した。加水分解活性を自動滴定装置（トリトロリン（Ｔｒｉｔｒｏｌｉｎｅ）アルファ、ショット（Ｓｃｈｏｔｔ）社）において滴定塩基（５０ｍＭ ＮａＯＨ）の量を定量化した。
【００５３】
加水分解活性（水性媒体におけるバレリアン酸エチルエステル）：
トリブチリンの実施例における加水分解活性の測定と同様に、バレリアン酸エチルエステルも使用されうる。実施例：触媒活性粒子１０−２０ｍｇをリン酸緩衝液（１ｍＭ、ｐＨ８．０）２５ｍＬ、およびバレリアン酸エチルエステル５００μＬを添加した。加水分解活性を自動滴定装置（トリトロリン（Ｔｒｉｔｒｏｌｉｎｅ）アルファ、ショット（Ｓｃｈｏｔｔ）社）において滴定塩基（５０ｍＭ ＮａＯＨ）の量を定量化した。
【００５４】
ＰＬＵ単位での合成活性（溶剤非含有系におけるプロピルラウレート合成活性）：
触媒活性粒子１０ｍｇを等モル基質溶液（ラウリン酸および１−プロパノール）５ｍＬに添加し、６０℃で振盪もしくは攪拌してインキュベートした。試料（Ｖ試料：５０μＬ）を２５分にわたって５分ごとに取出し、デカン（内部標準：４ｍＭドデカン）９５０μＬに移した。ＰＬＵの測定は開始生成種を用いて行われる。プロピルラウレートの検出（保持時間：９，７９１分）はガスクロマトグラフィーで行われた（島津製作所（Ｓｈｉｍａｚｕ）２０１０、ＳＧＥ社、ＢＴＸカラム、長さ２５ｍ、内径０．２２μｍ、膜：０．２５μｍ、検出器タイプ：３００℃でのＦＩＤ、注入温度２７５℃および注入量１μＬ、分割比（Ｓｐｌｉｔｒａｔｉｏ）３５，０、担体ガス圧（ヘリウム）１５０ｋｐａ、温度プログラム：開始温度６０℃を１．５分維持、温度上昇２０℃／分、終了温度２５０℃を２．５分維持）。
【００５５】
ラッカーゼ活性の測定：
ラッカーゼ活性の測定のために、触媒活性粒子（天然または固定化ラッカーゼ）をＡＢＴＳ−Ｌｓｇ（Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅの溶液、１．８ｍＭ、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手）１ｍＬを含むリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６、３７℃）１９ｍＬに移し、かつ吸光の増加を４０５ｎｍで分光計により測定する。ラッカーゼ活性は２０分の時間にわたって追跡されなければならない。試料は５分の間隔で取られる。活性は次のように測定される。すなわち、
【数１】
ΔＥｘｔ． ４０５ 時間に依存した吸光の変化
Ｖ総 反応成分における総量［２０ｍＬ］
Ｖ試料 試料の量［２ｍＬ］
Δｔ 時間の変化［分］
ε ４０５ｎｍでのＡＢＴＳの吸光係数［４３．２ｍＬ μｍｏｌ−１ｃｍ−１］
ｄ キュベットのコーティング厚さ［１ｃｍ］
【００５６】
活性は、毎分１μｍｏｌ基質転換として規定される単位（Ｕ／ｍＬもしくはＵ／ｇ）で示される。
【００５７】
ブラッドフォードによるタンパク質測定：
上清におけるタンパク質含量の測定をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の方法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９７６年、７２、２４８−２５４頁）に従って実施したが、これはタンパク質における塩基性および芳香族アミノ酸残基へのトリアリルメタン色素クーマシー・ブリリアント・ブルーＧ−２５０の結合に基づく。この結合は、４６５ｎｍから５９５ｎｍへの吸光最大の変化の原因となる。較正の確立のためにＢＳＡの吸光を５−２０μｇ／Ｌの濃度で測定した。このためにそれぞれの試料にＨ２Ｏを補充して８００μＬとし、ブラッドフォード試薬（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ Ｒａｄ）、ミュンヘン）２００μＬを添加して５９５ｎｍで測定した。
【００５８】
厳しい反応条件下に触媒活性粒子の浸出反応を測定するためにプロトコルを次のステップに拡大した。
【００５９】
ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）４３５（ＮＺ４３５）のタンパク質の割合の測定は次のスキームに従って行われた。ＮＺ４３５粒子を３０分間、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（１：１、ｖ／ｖ）において４５℃で振盪してインキュベートし、次いで上清から試料（例えば、１ｍＬ）を取出し、凍結乾燥させ、Ｈ２Ｏ（同じく１ｍＬ）中に再懸濁した。次いで、タンパク質含量を上述したように測定することができた。結果は表１からわかる。
【００６０】
【表１】
【００６１】
比較例１：従来の酵素固定化物の機械的安定性の測定
粒子の機械的安定性の測定のために、これらをさまざまな高粘性の等モル基質溶液（例えば、ポリエチレングリコール（分子量約２４００）および油酸）において高い性能特性および６０℃より高い温度でインキュベートし、次いで粒子の完全性を検査した。ＮＺ４３５（ポリエチレングリコール（分子量約２４００））および油酸中５重量％）を使用して２４時間後に、例えば明らかに発生する混濁によって、裸眼で微粒子の形成を発見することができた。
【００６２】
比較例２：従来の酵素固定化物の脱着安定性の測定
厳しい反応条件下に粒子の脱着安定性の測定のために、ＮＺ４３５ ５０ｍｇの一部分をＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１、ｖ／ｖ）溶液２０ｍＬにおいて４５℃で３０分間振盪した。上清から特定の試料（例えば、１ｍＬ）を取出し、上清中のタンパク質含量を上述したように測定した。粒子を折畳み型フィルタを介して回収し、Ｈ２Ｏ １００ｍＬで洗浄し、かつ１２時間、５０℃で乾燥させ、次いで上述したスキームに従って加水分解活性および合成活性をＰＬＯで測定した。結果は表２からわかる。
【００６３】
【表２】
【００６４】
実施例１：安定した酵素製剤の製造
製造例：
ＮＺ４３５粒子１ｇを金属シャーレに、一般式ＩおよびＩＩの化合物（組成は表３を参照、一般式およびＩＩの成分は、例えば、米国特許第７，１９６，１５３Ｂ２号明細書に記載されているように、当業者に周知の方法に従って、平衡によって製造された）のさまざまな組成物、ならびにカールシュテット触媒（Ｓｙｌｏｆｆ ４０００、ダウ・コーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）、米国の製品）からなる反応混合物１ｍＬとともに添加した。シリコーン成分を触媒を含めてそれぞれ使用前にシクロヘキサン３ｍＬ中に溶解し、次いで金属シャーレの粒子に添加した。添加後、直ちにボルテクサー（Ｖｏｒｔｅｘｅｒ）（イカ（Ｉｋａ）、ステップ９）を用いて１５−３０分間、シクロヘキサンの大部分が蒸発するまで強く分散させた。次いで、粒子を約１２時間、乾燥室において５０℃で乾燥させた。
【００６５】
【表３】
【００６６】
この方法に従って製造された粒子は、加水分解における未処理固定化物に対して、７３％まで（比較例１に記載されているように、未処理ＮＺ４３５の１．０５Ｕ／ｍｇと比べ、実施例１ ｉおよび１ ｉｉｉ、０．７７Ｕ／ｍｇ ＮＺ４３５）、もしくは６５％まで（実施例１ ｉ、０．６８Ｕ／ｍｇ ＮＺ４３５）の活性収率を有する。合成においては、９４％（実施例１ ｉ）、８４％（実施例１ ｉｉｉ）、または６８％（実施例１ ｉｉ）の活性収率を達成することができた。
【００６７】
実施例２：本発明による酵素製剤の機械的安定性の測定
粒子（未処理、天然ＮＺ４３５、もしくは表３のｉｉｉに従ってコーティングされたＮＺ４３５）３００ｍｇをそれぞれ９０分間、５ｍＬラウリン酸中で６０℃下に強く攪拌した（イカ（Ｉｋａ）社の磁気攪拌プレート、モデルＲＴパワー、ステップ５、磁気攪拌子、長さ３．１ｃｍ、幅０．６ｃｍ）。撹拌器の除去後、攪拌懸濁液の写真を作成した（図１および２）。
【００６８】
図面の図１により、微粒子の未処理ＮＺ４３５に基づく攪拌懸濁液が混濁していることが明らかにわかる。本発明による処理ＮＺ４３５に基づく攪拌懸濁液は、それに対して透明であり、粒子もなく、もしくは少なくとも可視的大きさの粒子もない（図２）。
【００６９】
次いで、懸濁液からの粒子を折畳み型フィルタで分離し、約１０ｍＬのアセトンで洗浄し、１２時間、５０℃で乾燥させた。
【００７０】
粒子の機械的安定性の測定のために粒度分布の測定を実施した。これにより使用されるふるい比は次の排除サイズを有した。すなわち、８００μｍ、５００μｍ、３００μｍ、１５０μｍ、および７５μｍ。
【００７１】
ふるい分けごとに攪拌前後に粒度分布を測定した。結果は表４からわかる。
【００７２】
【表４】
【００７３】
実施例３：安定な酵素製剤の脱着安定性の測定
比較例２と同様に、実施例１から得られた粒子を水／アセトニトリルで処理し、次いで加水分解活性、合成活性、および放出タンパク質の量を測定した。この測定の結果は表５からわかる。
【００７４】
【表５】
【００７５】
未処理天然酵素固定化物はインキュベーション後に決して加水分解活性を示さず、５６μｇ／ｍｇ固定化物が遊離タンパク質として検出されうるが、シリコーンコート粒子は初期活性の７５％までの加水分解活性（試料ｉｉ、０．５１Ｕ／ｍｇ ＮＺ４３５対浸出前の０．７７Ｕ／ｍｇ ＮＺ４３５）、初期活性の５５％までの合成活性（試料ｉｉ、２９８０Ｕ／ｇ ＮＺ４３５対浸出前の５４００Ｕ／ｇ ＮＺ４３５）、および約８６％（試料ｉｉ）まで削減された酵素脱着を示す。
【００７６】
実施例４：酵素固定化物の製造
Ｌｅｗａｔｉｔ ＶＰＯＣ １６００（ランクセス（Ｌａｎｘｅｓｓ）社）１ｇを約１８時間、室温でＣＡＬＢ溶液（リポザイムＣＡＬＢ Ｌ、ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、デンマークバウスヴェア（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ）加水分解活性：２７００Ｕ／ｍＬ）５ｍＬ中で攪拌し、折畳み型フィルタで分離し、かつ水２５０ｍＬで蒸留洗浄し、次いで３時間、風乾し、イソプロパノール１ｍＬで洗浄し、かつもう１回、１時間、風乾した。こうして製造された固定化物をロック可能な反応容器において４℃下でさらに使用するまで貯蔵した。
【００７７】
上述した方法の後、酵素固定化物の活性を測定した（１．０４Ｕ／ｍｇの加水分解活性および６０００ＰＬＵ／ｇの合成活性）。負荷密度はブラッドフォード試験によって約３０μｇタンパク質／ｍｇＶＰＯＣ１６００で測定された。
【００７８】
こうして生成された酵素固定化物を上述した方法後の第２のステップにおいてシリコーンでコーティングした（表３の実験ｉにおけるような組成）。製剤中の酵素固定化物の質量の割合は６３％に相当する。コート製剤の加水分解活性は０．４３Ｕ／ｍｇであり、合成活性は２９２７ ＰＬＵ／ｇである。
【００７９】
比較例２と同様に、非コートおよびシリコーンでコーティングされた粒子を水／アセトニトリルで処理し、次いで加水分解活性、合成活性、および放出タンパク質の量を測定した。結果は表６からわかる。
【００８０】
【表６】
【００８１】
表６からわかるように、未処理固定化物において９倍の量のタンパク質が脱着される。同時に、５４％（加水分解活性）、もしくは６０％（合成活性）の活性収率が達成されうる。ＮＺ４３５によってすでに市販の完成製剤で示されたシリコーンでの酵素固定化物のコーティングのための上述した方法の適合性は、したがって、自己負荷酵素固定化物でも証明することができた。
【００８２】
実施例５：有機溶剤中の酵素活性の測定
実施例１および４の酵素製剤、ならびに対応する天然固定化物の活性を、プロピルラウレート合成がメチルシクロヘキサン（基質の初期濃度＝１０ｍＭ、温度＝２５℃）中で実施されることによって測定する。
【００８３】
【表７】
【００８４】
表７は、酵素製剤の活性収率が有機溶剤における使用に際して顕著であり、かつ脱着安定性も明らかになることを明らかに示している。
【００８５】
実施例６：別のリパーゼ製剤の製造
実施例１と同様に、リポザイムＲＭ ＩＭ（ランクセス（Ｌａｎｘｅｓｓ）社のＤｕｏｌｉｔｅ Ａ５６８上に固定化されたムコール・ミエヘイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼ、ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）から入手）にシロキサンコーティングを備え、かつ活性収率を実施例５と同様に有機溶剤中で測定する。
【００８６】
【表８】
【００８７】
表８は、リポザイムＲＭ ＩＭの使用量に関して、測定精度の枠内で定量的活性収率が達成されることを明らかに示している。
【００８８】
実施例７：別のリパーゼ製剤の製造
実施例４と同様に、サーモマイセス・ラヌギノーサ（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）由来のリパーゼ（アザ・スペツィアルエンザイム（Ａｓａ Ｓｐｅｚｉａｌｅｎｚｙｍｅ）社の「エステラーゼ（Ｅｓｔｅｒａｓｅ）ＴＬ０１として入手、これは追加のエステラーゼ機能を有するリパーゼであることが重要である）をＬｅｗａｔｉｔ ＶＰＯＣ１６００上に固定化し、かつシロキサンコーティングを備える。活性測定には加水分解バレリアン酸エチルエステルを測定する。
【００８９】
【表９】
【００９０】
表９は、天然製剤は２６１Ｕ／ｇの活性を有するが、コーティングされた製剤は１５７Ｕ／ｇの活性を示すことを示している。天然固定化物の含量に関して、これは２８５Ｕ／ｇの活性を意味し、すなわち、誤差精度の枠内で定量的活性収率が達成されうる。
【００９１】
実施例８：エステラーゼ製剤の製造
実施例７と同様に、リゾプス・オリザエ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）由来のエステラーゼをＬｅｗａｉｔ ＶＰＯＣ１６００上に固定化し、コーティングし、かつバレリアン酸エチルエステルの加水分解における活性を測定する。
【００９２】
【表１０】
【００９３】
ここでも測定精度の枠内で量的活性収率が示される。
【００９４】
実施例９：ラッカーゼ製剤の製造
実施例４と同様に、ミセリオフトーラ・サーモフィリア（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉａ）（ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）におけるＦｌａｖｏｒｓｔａｒとして入手）由来のラッカーゼ（ＥＣ １.１０.３.２）をＬｅｗａｔｉｔ ＶＰ ＯＣ １６００上に固定化し（１ｇＬｅｗａｔｉｔ ＶＰＯＣ １６００におけるタンパク質４．５ｍｇ）、シロキサンコーティングを備え、かつＡＢＴＳアッセイにおける活性を測定した。
【００９５】
【表１１】
【００９６】
表１１は、ラッカーゼも本発明による方法でコーティングされることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】微粒子の未処理ＮＺ４３５に基づく攪拌懸濁液の写真である。
【図２】処理されたＮＺ４３５に基づく攪拌懸濁液の写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物に、ヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングが備えられることによって得られる酵素製剤。
【請求項２】
前記酵素が、加水分解酵素、好ましくは、リパーゼのクラスからのものであることを特徴とする請求項１に記載の酵素製剤。
【請求項３】
前記不活性担体が、粒子の９０％において１０〜５０００μｍの粒径の粒度分布を有することを特徴とする請求項１または２に記載の酵素製剤。
【請求項４】
前記使用される不活性担体がポリビニルスチロール、ポリメタクリレートまたはポリアクリレートからなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素製剤。
【請求項５】
前記シリコーンコーティングが、ＳｉＨ官能性ポリシロキサンの末端炭素−炭素二重結合を含有するポリシロキサンとのヒドロシリル化によって得られることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素製剤。
【請求項６】
ＳｉＨ成分として、一般式
【化１】
［式中、
Ｎは、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋２＝３〜８５０であり、
ａは、１〜８００であり、
ｂは、０〜４００であり、
ｃは、０〜１０であり、
ｄは、０〜１０であり、
Ｒ１は、互いに独立して同一または異なり、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基を含んで成る群から選択され、
Ｒ２ａは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ２ｂは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ３は、互いに独立して同一、または、一般式Ｉａ
【化２】
［式中、
Ｎは、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋２＝３〜８５０、好ましくは、６〜１６０であり、
ａは、１〜８００であり、
ｂは、０〜４００であり、
ｃは、０〜１０であり、
ｄは、０〜１０であり、
Ｒ１は、互いに独立して同一または異なり、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基を含んで成る群から選択され、
Ｒ２ａは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ２ｂは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ３は、互いに独立して同一、または、一般式Ｉａのさまざまな残基、または残基Ｒ１である］のさまざまな残基である］のポリシロキサンが使用されることを特徴とする請求項５に記載の酵素製剤。
【請求項７】
ＳｉＨ成分として、一般式Ｉ
【化３】
［式中、
Ｎは、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋２＝６〜１６０であり、
ａは、２〜１５０であり、
ｂは、２〜７５であり、
ｃは、０であり、
ｄは、０であり、
Ｒ１は、互いに独立して同一または異なり、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基を含んで成る群から選択され、
Ｒ２ａは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ２ｂは、互いに独立して水素またはＲ１である］のポリシロキサンが使用されることを特徴とする請求項６に記載の酵素製剤。
【請求項８】
末端炭素−炭素二重結合を含有するポリシロキサンとして、一般式ＩＩ
【化４】
［式中、
Ｎは、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋２＝３〜１０００であり、
ｍは、１〜８００であり、
ｎは、０〜２０であり、
ｏは、０〜１０であり、
ｐは、０〜１０であり、
Ｒ４は、互いに独立して同一または異なり、かつ次の群、すなわち、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基からなり、
Ｒ５は、互いに独立して末端不飽和アルキル残基、またはアルコキシル残基、またはＲ４であり、
Ｒ６は、互いに独立して同一または一般式ＩＩａ
【化５】
［式中、
Ｎは、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋２＝３〜１０００であり、
ｍは、１〜８００であり、
ｎは、０〜２０であり、
ｏは、０〜１０であり、
ｐは、０〜１０であり、
Ｒ４は、互いに独立して同一または異なり、かつ次の群、すなわち、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基からなり、
Ｒ５は、互いに独立して末端不飽和アルキル残基、またはアルコキシル残基、またはＲ４であり、
Ｒ６は、互いに独立して同一または一般式ＩＩａのさまざまな残基または残基Ｒ４である］のさまざまな残基である］のポリシロキサンが使用されることを特徴とする請求項５〜７の少なくとも一項に記載の酵素製剤。
【請求項９】
末端炭素−炭素二重結合を含有するポリシロキサンとして、一般式ＩＩ
【化６】
［式中、
Ｎは、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋２＝１０〜６００であり、
ｍは、２〜６００であり、
ｎは、０〜１０であり、
ｏは、０であり、
ｐは、０であり、
Ｒ４は、互いに独立して同一または異なり、かつ次の群、すなわち、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基からなり、
Ｒ５は、互いに独立して末端不飽和アルキル残基、またはアルコキシル残基である］のポリシロキサンが使用されることを特徴とする請求項５〜８のいずれか一項に記載の酵素製剤。
【請求項１０】
不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物に、ヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングが備えられることによって得られることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素製剤を製造するための方法。
【請求項１１】
前記酵素固定化物が、前記酵素固定化物を、ＳｉＨ官能性ポリシロキサン、末端炭素−炭素二重結合を含有するポリシロキサン、ならびに前記ヒドロシリル化を触媒する触媒を有する反応混合物と、ヒドロシリル化条件下に接触させることによって、シリコーンコーティングが備えられることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工業用バイオ触媒としての請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素製剤の使用。
【請求項１】
不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物に、ヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングが備えられることによって得られる酵素製剤。
【請求項２】
前記酵素が、加水分解酵素、好ましくは、リパーゼのクラスからのものであることを特徴とする請求項１に記載の酵素製剤。
【請求項３】
前記不活性担体が、粒子の９０％において１０〜５０００μｍの粒径の粒度分布を有することを特徴とする請求項１または２に記載の酵素製剤。
【請求項４】
前記使用される不活性担体がポリビニルスチロール、ポリメタクリレートまたはポリアクリレートからなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素製剤。
【請求項５】
前記シリコーンコーティングが、ＳｉＨ官能性ポリシロキサンの末端炭素−炭素二重結合を含有するポリシロキサンとのヒドロシリル化によって得られることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素製剤。
【請求項６】
ＳｉＨ成分として、一般式
【化１】
［式中、
Ｎは、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋２＝３〜８５０であり、
ａは、１〜８００であり、
ｂは、０〜４００であり、
ｃは、０〜１０であり、
ｄは、０〜１０であり、
Ｒ１は、互いに独立して同一または異なり、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基を含んで成る群から選択され、
Ｒ２ａは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ２ｂは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ３は、互いに独立して同一、または、一般式Ｉａ
【化２】
［式中、
Ｎは、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋２＝３〜８５０、好ましくは、６〜１６０であり、
ａは、１〜８００であり、
ｂは、０〜４００であり、
ｃは、０〜１０であり、
ｄは、０〜１０であり、
Ｒ１は、互いに独立して同一または異なり、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基を含んで成る群から選択され、
Ｒ２ａは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ２ｂは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ３は、互いに独立して同一、または、一般式Ｉａのさまざまな残基、または残基Ｒ１である］のさまざまな残基である］のポリシロキサンが使用されることを特徴とする請求項５に記載の酵素製剤。
【請求項７】
ＳｉＨ成分として、一般式Ｉ
【化３】
［式中、
Ｎは、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋２＝６〜１６０であり、
ａは、２〜１５０であり、
ｂは、２〜７５であり、
ｃは、０であり、
ｄは、０であり、
Ｒ１は、互いに独立して同一または異なり、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基を含んで成る群から選択され、
Ｒ２ａは、互いに独立して水素またはＲ１であり、
Ｒ２ｂは、互いに独立して水素またはＲ１である］のポリシロキサンが使用されることを特徴とする請求項６に記載の酵素製剤。
【請求項８】
末端炭素−炭素二重結合を含有するポリシロキサンとして、一般式ＩＩ
【化４】
［式中、
Ｎは、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋２＝３〜１０００であり、
ｍは、１〜８００であり、
ｎは、０〜２０であり、
ｏは、０〜１０であり、
ｐは、０〜１０であり、
Ｒ４は、互いに独立して同一または異なり、かつ次の群、すなわち、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基からなり、
Ｒ５は、互いに独立して末端不飽和アルキル残基、またはアルコキシル残基、またはＲ４であり、
Ｒ６は、互いに独立して同一または一般式ＩＩａ
【化５】
［式中、
Ｎは、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋２＝３〜１０００であり、
ｍは、１〜８００であり、
ｎは、０〜２０であり、
ｏは、０〜１０であり、
ｐは、０〜１０であり、
Ｒ４は、互いに独立して同一または異なり、かつ次の群、すなわち、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基からなり、
Ｒ５は、互いに独立して末端不飽和アルキル残基、またはアルコキシル残基、またはＲ４であり、
Ｒ６は、互いに独立して同一または一般式ＩＩａのさまざまな残基または残基Ｒ４である］のさまざまな残基である］のポリシロキサンが使用されることを特徴とする請求項５〜７の少なくとも一項に記載の酵素製剤。
【請求項９】
末端炭素−炭素二重結合を含有するポリシロキサンとして、一般式ＩＩ
【化６】
［式中、
Ｎは、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋２＝１０〜６００であり、
ｍは、２〜６００であり、
ｎは、０〜１０であり、
ｏは、０であり、
ｐは、０であり、
Ｒ４は、互いに独立して同一または異なり、かつ次の群、すなわち、飽和または不飽和、場合により、１〜３０個の炭素原子を有する分岐アルキル基、７〜３０個の炭素原子を有するアルカリール残基、６〜３０個の炭素原子を有するアリール残基からなり、
Ｒ５は、互いに独立して末端不飽和アルキル残基、またはアルコキシル残基である］のポリシロキサンが使用されることを特徴とする請求項５〜８のいずれか一項に記載の酵素製剤。
【請求項１０】
不活性担体上に固定化された酵素または酵素を含有する微生物を有する酵素固定化物に、ヒドロシリル化によって得られるシリコーンコーティングが備えられることによって得られることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素製剤を製造するための方法。
【請求項１１】
前記酵素固定化物が、前記酵素固定化物を、ＳｉＨ官能性ポリシロキサン、末端炭素−炭素二重結合を含有するポリシロキサン、ならびに前記ヒドロシリル化を触媒する触媒を有する反応混合物と、ヒドロシリル化条件下に接触させることによって、シリコーンコーティングが備えられることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工業用バイオ触媒としての請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素製剤の使用。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−１１３２１（Ｐ２００９−１１３２１Ａ）
【公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１７２２０４（Ｐ２００８−１７２２０４）
【出願日】平成２０年７月１日（２００８．７．１）
【出願人】（５０７３７５４６５）エヴォニク ゴールドシュミット ゲーエムベーハー (100)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１日（２００８．７．１）
【出願人】（５０７３７５４６５）エヴォニク ゴールドシュミット ゲーエムベーハー (100)
【Ｆターム（参考）】
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