酵素複合体
【課題】セルロース系バイオマスからバイオエタノールを作製する技術において、非結晶性セルロースを高効率に糖化すること。
【解決手段】非結晶性セルロースを分解する酵素と、タンパク質と吸着または結合する担体と、を備え、前記担体が磁性を有した酵素複合体であり、前記酵素が、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドロラーゼ、βグルコシダーゼまたはそれらに類する酵素であり、また、それらの混合物であることを特徴とし、さらに、前記担体が、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）であることを特徴とする酵素複合体であることで、セルロースからグルコースを産生する糖化効率を向上し、さらに磁石により吸引することで回収することができる。
【解決手段】非結晶性セルロースを分解する酵素と、タンパク質と吸着または結合する担体と、を備え、前記担体が磁性を有した酵素複合体であり、前記酵素が、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドロラーゼ、βグルコシダーゼまたはそれらに類する酵素であり、また、それらの混合物であることを特徴とし、さらに、前記担体が、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）であることを特徴とする酵素複合体であることで、セルロースからグルコースを産生する糖化効率を向上し、さらに磁石により吸引することで回収することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース系バイオマス、特にシュレッダー紙からバイオエタノールを作製する際に使用する酵素であるセルラーゼの複合体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
セルロース系バイオマスをバイオエタノールに変換するためには、セルロースをグルコース単位まで糖化する必要がある。
【０００３】
しかし、セルロースは、グルコースがb-1,4結合していることにより、セルロース繊維間が水素結合で強く結合しており簡単には糖化できない、という問題があった。
【０００４】
この問題に対して、一般的にはトリコデルマ・リーゼイ菌が産生するセルラーゼが存在する。
【０００５】
セルラーゼを多く産生するトリコデルマ・リーゼイ菌を選択し、さらに糖化する活性を向上するために、特定の種類のセルラーゼを補充することで、セルラーゼの糖化活性を向上している。
【０００６】
一方、現状では上記セルラーゼでは実用化できるほどの糖化活性が得られていないという問題があった。
【０００７】
この問題に対して、遺伝子工学技術を利用し、骨格タンパク質によりセルラーゼを連結させた酵素複合体、セルロソーム、というタンパク質の構築により、糖化活性を向上する取組みがある（非特許文献１および２）。
【０００８】
従来の酵素複合体としては、菌体であるサーモビフィダ・フスカやクロストリジウム・サーモセラムが産生するセルロソームがあった。
【０００９】
セルロソームは、セルロースを糖化するための酵素活性部位と酵素活性部位を連結する骨格タンパク質部位から構成されている。
【００１０】
前述の菌から、酵素活性部位および骨格タンパク質部位の遺伝子配列を抽出し、大腸菌等によりタンパク質を発現する。
【００１１】
上記非特許文献１および２では、発現した酵素活性部位を２つまたは３つ、骨格タンパク質部位により連結させることで、糖化活性を向上させるセルロソームを構築していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許第４４６９９５９号公報
【特許文献２】特開平１１−２４３９５１号公報
【特許文献３】特開２００７−３１４３８７号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Syst Synth Biol (2010) 4:193-201
【非特許文献２】Biotechnol Lett (2009) 31:465-476
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、前記従来の酵素複合体では、実用化できる酵素活性を達成することができていない、活性評価するために遺伝子の抽出からタンパク質の作製までにコストおよび数週間以上の時間がかかる、セルロース糖化後、セルロソームを回収できないためバイオエタノール作製にかかる酵素コストが増加する、といった課題を有していた。
【００１５】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、従来のセルラーゼを利用し簡便に糖化活性を向上でき、簡易的にセルラーゼを回収することが可能な酵素複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記従来の課題を解決するために、本発明の酵素複合体は、非結晶性セルロースを分解する酵素と、タンパク質と吸着または結合する担体と、を備え、前記担体が磁性を有し、セルロースの糖化を行う。
【００１７】
本構成によって、セルロースを効率よく糖化し、さらに、担体が磁性を有することでセルラーゼの回収を容易にすることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の酵素複合体によれば、セルロースを効率よく糖化することができ、さらにセルラーゼの回収を容易にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施の形態１における酵素複合体の構成図
【図２】本発明の実施の形態２における酵素複合体の構成図
【図３】従来のセルラーゼのセルロース糖化メカニズムを示す図
【図４】従来のセルロソームの構成図
【図５】本発明の実施例における糖化活性の向上を示すグラフ
【図６】本発明の実施例における酵素複合体の磁石への吸引を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００２１】
図３は、３つのセルラーゼが共同しながらセルロースをグルコースへ糖化するメカニズムを示す。
【００２２】
例えば、ａはエンドグルカナーゼであり、ｂはセロビオハイドロラーゼであり、ｃはbグルコシダーゼである。
【００２３】
一般的にセルロースはグルコースが１，４−b結合することで直鎖的な結合を有し、それゆえセルロース鎖同士が水素結合により強固に結合している（結晶構造）。
【００２４】
それゆえ、セルロースは水に不溶で、酵素などで糖化されにくい。
【００２５】
しかし、セルロース鎖の一部は非結晶構造となっており、水分子が入り込める構造が存在する。
【００２６】
エンドグルカナーゼはその非結晶構造へアタックし、セルロース鎖を切断する。
【００２７】
次に、セロビオハイドロラーゼが切断されたセルロース鎖の末端からセルロース鎖をセロビオース単位に分解する。
【００２８】
最後に、グルコシダーゼがセロビオースを分解することにより、グルコースが生成される。
【００２９】
このように、セルロースは主に３種類のセルラーゼによってグルコースに糖化される。
【００３０】
図４は、従来のセルロソームの構成を示した図である。
【００３１】
骨格タンパク質１０５はコヘシンとドックリンというタンパク質から成り、リンカー１０７によりセルラーゼの酵素活性部位１０８、１０９および１１０と結合している。
【００３２】
セルロース結合モジュール１０６は、セルロースの表面に結合するタンパク質である。
【００３３】
セルロソームは、セルロース結合モジュール１０６によりセルロース表面へ結合し、酵素活性部位１０８、１０９および１１０がセルロースをごく近場にてグルコースへ糖化する。
【００３４】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１における酵素複合体の構成図である。
【００３５】
図１において、セルラーゼ１０１、１０２および１０３は、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドロラーゼ、およびβグルコシダーゼまたはそれらに類するセルラーゼのいずれかである。
【００３６】
カーボンナノチューブ１０４は、単層または複層が存在するが、好ましくは単層である。
【００３７】
カーボンナノチューブ１０４は、ＣＮＴと略されることもある。
【００３８】
ＣＮＴ１０４は、単層または複層であるが、好ましくは単層であることがよい。
【００３９】
前記セルラーゼ１０１、１０２および１０３が混在した溶液とＣＮＴ１０４を混合し、物理的に吸着させる。
【００４０】
物理的な吸着により、セルラーゼ１０１、１０２および１０３はランダムにＣＮＴ１０４上に吸着する。
【００４１】
セルラーゼ１０１、１０２および１０３がＣＮＴ１０４上にランダムに吸着することにより、図３に示すごとくセルラーゼが共同してセルロースをグルコースに糖化する作用がＣＮＴ１０４上にて連続的に行われ、糖化効率が向上することになる。
【００４２】
かかる構成によればセルラーゼ１０１、１０２および１０３がランダムにＣＮＴ１０４上に吸着することにより、セルロース鎖と極めて近い反応場にて接触することとなり、セルロース鎖を連続的にグルコースまで糖化することができるため、糖化効率を向上することができる。
【００４３】
なお、本実施の形態において、ＣＮＴ１０４とセルラーゼ１０１、１０２および１０３は物理的吸着としたが、ＣＮＴ１０４へ化学的な修飾を施し、セルラーゼを固定化しても良い。
【００４４】
（実施の形態２）
図２は、本発明の実施の形態１の酵素複合体の別の形態を示す図である。
【００４５】
図２において、図１と同じ構成要素については同じ符号を用い、説明を省略する。
【００４６】
実施の形態１においては、セルラーゼ１０１、１０２および１０３が混在した溶液とＣＮＴ１０４を混合し、複合体を形成したが、図２のように、セルラーゼ１０１、１０２および１０３を各々ＣＮＴ１０４と混合し複合体を形成した後、混在させてもよい。
【００４７】
（実施例）
セルラーゼ１０１，１０２および１０３の混合溶液として、セルラーゼ（シグマアルドリッチ社製、品番C8546）を用いた。
【００４８】
ＣＮＴ１０４として、単層カーボンナノチューブ（ＫＨケミカル社製）およびラテックスビーズ（Ｄｕｋｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた。
【００４９】
反応溶液として、ｐＨ５．０のクエン酸バッファーを用いた。
【００５０】
セルロースとして、ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１（シグマアルドリッチ社製）を用いた。
【００５１】
濃度が２ｍｇ/ｍＬおよび体積パーセントで２０％となるように、セルラーゼおよびＣＮＴを調製し、室温において一晩揺動混合しながら、セルラーゼとＣＮＴを吸着させた。
【００５２】
セルロースを２ｇ/ｍＬとなるように調整し、セルラーゼ・ＣＮＴ混合溶液を等量ずつ（５００ｕＬ：５００ｕＬ）混合し、３７度において１時間糖化反応した。
【００５３】
反応溶液に含まれるセルラーゼを失活するため、９８度にて１５分間、反応溶液を熱処理した。
【００５４】
反応溶液の上澄みを回収するため、反応溶液を１．５ｍＬチューブに入れ、12,500rpmで１０分間遠心した。
【００５５】
さらに、上澄みを０．２ｕｍフィルターへ通し、通った上澄みを用いて含まれるグルコース量を測定した。
【００５６】
グルコース量の測定には、グルコースアッセイキット（フナコシ社）を用い、プロトコールに従って行った。
【００５７】
図５に、測定結果を示した。
【００５８】
ラテックスビーズでは、コントロール（cont.）と同程度のグルコース生産量であるのに対し、ＣＮＴでは最大で２．４倍量のグルコースが産生されていることがわかった。
【００５９】
図６に、ＣＮＴとセルラーゼの複合体と磁石（ネオジウム）の相互作用を示した。
【００６０】
セルラーゼが吸着したＣＮＴが、ネオジウム磁石へ吸引されている様子が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明にかかる酵素複合体は、担体にランダムに結合した３つ、もしくはそれ以上のセルラーゼを有し、さらに担体が磁性を有することで磁石による回収を可能とし、セルロース系バイオマスからバイオエタノールを生産する等においてコスト削減の手段として有用である。セルロースを含むゴミの削減等の用途にも応用できる。
【符号の説明】
【００６２】
１０１ セルラーゼの１種
１０２ セルラーゼの１種
１０３ セルラーゼの１種
１０４ カーボンナノチューブ
１０５ 骨格タンパク質
１０６ セルロースバインディングモジュール
１０７ リンカー
１０８ ある種のセルラーゼの触媒活性部位
１０９ ある種のセルラーゼの触媒活性部位
１１０ ある種のセルラーゼの触媒活性部位
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース系バイオマス、特にシュレッダー紙からバイオエタノールを作製する際に使用する酵素であるセルラーゼの複合体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
セルロース系バイオマスをバイオエタノールに変換するためには、セルロースをグルコース単位まで糖化する必要がある。
【０００３】
しかし、セルロースは、グルコースがb-1,4結合していることにより、セルロース繊維間が水素結合で強く結合しており簡単には糖化できない、という問題があった。
【０００４】
この問題に対して、一般的にはトリコデルマ・リーゼイ菌が産生するセルラーゼが存在する。
【０００５】
セルラーゼを多く産生するトリコデルマ・リーゼイ菌を選択し、さらに糖化する活性を向上するために、特定の種類のセルラーゼを補充することで、セルラーゼの糖化活性を向上している。
【０００６】
一方、現状では上記セルラーゼでは実用化できるほどの糖化活性が得られていないという問題があった。
【０００７】
この問題に対して、遺伝子工学技術を利用し、骨格タンパク質によりセルラーゼを連結させた酵素複合体、セルロソーム、というタンパク質の構築により、糖化活性を向上する取組みがある（非特許文献１および２）。
【０００８】
従来の酵素複合体としては、菌体であるサーモビフィダ・フスカやクロストリジウム・サーモセラムが産生するセルロソームがあった。
【０００９】
セルロソームは、セルロースを糖化するための酵素活性部位と酵素活性部位を連結する骨格タンパク質部位から構成されている。
【００１０】
前述の菌から、酵素活性部位および骨格タンパク質部位の遺伝子配列を抽出し、大腸菌等によりタンパク質を発現する。
【００１１】
上記非特許文献１および２では、発現した酵素活性部位を２つまたは３つ、骨格タンパク質部位により連結させることで、糖化活性を向上させるセルロソームを構築していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許第４４６９９５９号公報
【特許文献２】特開平１１−２４３９５１号公報
【特許文献３】特開２００７−３１４３８７号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Syst Synth Biol (2010) 4:193-201
【非特許文献２】Biotechnol Lett (2009) 31:465-476
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、前記従来の酵素複合体では、実用化できる酵素活性を達成することができていない、活性評価するために遺伝子の抽出からタンパク質の作製までにコストおよび数週間以上の時間がかかる、セルロース糖化後、セルロソームを回収できないためバイオエタノール作製にかかる酵素コストが増加する、といった課題を有していた。
【００１５】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、従来のセルラーゼを利用し簡便に糖化活性を向上でき、簡易的にセルラーゼを回収することが可能な酵素複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記従来の課題を解決するために、本発明の酵素複合体は、非結晶性セルロースを分解する酵素と、タンパク質と吸着または結合する担体と、を備え、前記担体が磁性を有し、セルロースの糖化を行う。
【００１７】
本構成によって、セルロースを効率よく糖化し、さらに、担体が磁性を有することでセルラーゼの回収を容易にすることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の酵素複合体によれば、セルロースを効率よく糖化することができ、さらにセルラーゼの回収を容易にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施の形態１における酵素複合体の構成図
【図２】本発明の実施の形態２における酵素複合体の構成図
【図３】従来のセルラーゼのセルロース糖化メカニズムを示す図
【図４】従来のセルロソームの構成図
【図５】本発明の実施例における糖化活性の向上を示すグラフ
【図６】本発明の実施例における酵素複合体の磁石への吸引を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００２１】
図３は、３つのセルラーゼが共同しながらセルロースをグルコースへ糖化するメカニズムを示す。
【００２２】
例えば、ａはエンドグルカナーゼであり、ｂはセロビオハイドロラーゼであり、ｃはbグルコシダーゼである。
【００２３】
一般的にセルロースはグルコースが１，４−b結合することで直鎖的な結合を有し、それゆえセルロース鎖同士が水素結合により強固に結合している（結晶構造）。
【００２４】
それゆえ、セルロースは水に不溶で、酵素などで糖化されにくい。
【００２５】
しかし、セルロース鎖の一部は非結晶構造となっており、水分子が入り込める構造が存在する。
【００２６】
エンドグルカナーゼはその非結晶構造へアタックし、セルロース鎖を切断する。
【００２７】
次に、セロビオハイドロラーゼが切断されたセルロース鎖の末端からセルロース鎖をセロビオース単位に分解する。
【００２８】
最後に、グルコシダーゼがセロビオースを分解することにより、グルコースが生成される。
【００２９】
このように、セルロースは主に３種類のセルラーゼによってグルコースに糖化される。
【００３０】
図４は、従来のセルロソームの構成を示した図である。
【００３１】
骨格タンパク質１０５はコヘシンとドックリンというタンパク質から成り、リンカー１０７によりセルラーゼの酵素活性部位１０８、１０９および１１０と結合している。
【００３２】
セルロース結合モジュール１０６は、セルロースの表面に結合するタンパク質である。
【００３３】
セルロソームは、セルロース結合モジュール１０６によりセルロース表面へ結合し、酵素活性部位１０８、１０９および１１０がセルロースをごく近場にてグルコースへ糖化する。
【００３４】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１における酵素複合体の構成図である。
【００３５】
図１において、セルラーゼ１０１、１０２および１０３は、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドロラーゼ、およびβグルコシダーゼまたはそれらに類するセルラーゼのいずれかである。
【００３６】
カーボンナノチューブ１０４は、単層または複層が存在するが、好ましくは単層である。
【００３７】
カーボンナノチューブ１０４は、ＣＮＴと略されることもある。
【００３８】
ＣＮＴ１０４は、単層または複層であるが、好ましくは単層であることがよい。
【００３９】
前記セルラーゼ１０１、１０２および１０３が混在した溶液とＣＮＴ１０４を混合し、物理的に吸着させる。
【００４０】
物理的な吸着により、セルラーゼ１０１、１０２および１０３はランダムにＣＮＴ１０４上に吸着する。
【００４１】
セルラーゼ１０１、１０２および１０３がＣＮＴ１０４上にランダムに吸着することにより、図３に示すごとくセルラーゼが共同してセルロースをグルコースに糖化する作用がＣＮＴ１０４上にて連続的に行われ、糖化効率が向上することになる。
【００４２】
かかる構成によればセルラーゼ１０１、１０２および１０３がランダムにＣＮＴ１０４上に吸着することにより、セルロース鎖と極めて近い反応場にて接触することとなり、セルロース鎖を連続的にグルコースまで糖化することができるため、糖化効率を向上することができる。
【００４３】
なお、本実施の形態において、ＣＮＴ１０４とセルラーゼ１０１、１０２および１０３は物理的吸着としたが、ＣＮＴ１０４へ化学的な修飾を施し、セルラーゼを固定化しても良い。
【００４４】
（実施の形態２）
図２は、本発明の実施の形態１の酵素複合体の別の形態を示す図である。
【００４５】
図２において、図１と同じ構成要素については同じ符号を用い、説明を省略する。
【００４６】
実施の形態１においては、セルラーゼ１０１、１０２および１０３が混在した溶液とＣＮＴ１０４を混合し、複合体を形成したが、図２のように、セルラーゼ１０１、１０２および１０３を各々ＣＮＴ１０４と混合し複合体を形成した後、混在させてもよい。
【００４７】
（実施例）
セルラーゼ１０１，１０２および１０３の混合溶液として、セルラーゼ（シグマアルドリッチ社製、品番C8546）を用いた。
【００４８】
ＣＮＴ１０４として、単層カーボンナノチューブ（ＫＨケミカル社製）およびラテックスビーズ（Ｄｕｋｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた。
【００４９】
反応溶液として、ｐＨ５．０のクエン酸バッファーを用いた。
【００５０】
セルロースとして、ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１（シグマアルドリッチ社製）を用いた。
【００５１】
濃度が２ｍｇ/ｍＬおよび体積パーセントで２０％となるように、セルラーゼおよびＣＮＴを調製し、室温において一晩揺動混合しながら、セルラーゼとＣＮＴを吸着させた。
【００５２】
セルロースを２ｇ/ｍＬとなるように調整し、セルラーゼ・ＣＮＴ混合溶液を等量ずつ（５００ｕＬ：５００ｕＬ）混合し、３７度において１時間糖化反応した。
【００５３】
反応溶液に含まれるセルラーゼを失活するため、９８度にて１５分間、反応溶液を熱処理した。
【００５４】
反応溶液の上澄みを回収するため、反応溶液を１．５ｍＬチューブに入れ、12,500rpmで１０分間遠心した。
【００５５】
さらに、上澄みを０．２ｕｍフィルターへ通し、通った上澄みを用いて含まれるグルコース量を測定した。
【００５６】
グルコース量の測定には、グルコースアッセイキット（フナコシ社）を用い、プロトコールに従って行った。
【００５７】
図５に、測定結果を示した。
【００５８】
ラテックスビーズでは、コントロール（cont.）と同程度のグルコース生産量であるのに対し、ＣＮＴでは最大で２．４倍量のグルコースが産生されていることがわかった。
【００５９】
図６に、ＣＮＴとセルラーゼの複合体と磁石（ネオジウム）の相互作用を示した。
【００６０】
セルラーゼが吸着したＣＮＴが、ネオジウム磁石へ吸引されている様子が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明にかかる酵素複合体は、担体にランダムに結合した３つ、もしくはそれ以上のセルラーゼを有し、さらに担体が磁性を有することで磁石による回収を可能とし、セルロース系バイオマスからバイオエタノールを生産する等においてコスト削減の手段として有用である。セルロースを含むゴミの削減等の用途にも応用できる。
【符号の説明】
【００６２】
１０１ セルラーゼの１種
１０２ セルラーゼの１種
１０３ セルラーゼの１種
１０４ カーボンナノチューブ
１０５ 骨格タンパク質
１０６ セルロースバインディングモジュール
１０７ リンカー
１０８ ある種のセルラーゼの触媒活性部位
１０９ ある種のセルラーゼの触媒活性部位
１１０ ある種のセルラーゼの触媒活性部位
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非結晶性セルロースを分解する酵素と、
タンパク質と吸着または結合する担体と、
を備え、
前記担体が磁性を有した酵素複合体。
【請求項２】
前記酵素が、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドロラーゼ、βグルコシダーゼまたはそれらに類する酵素であり、また、それらの混合物であることを特徴とする請求項１の酵素複合体。
【請求項３】
前記担体が、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）であることを特徴とする請求項１の酵素複合体。
【請求項１】
非結晶性セルロースを分解する酵素と、
タンパク質と吸着または結合する担体と、
を備え、
前記担体が磁性を有した酵素複合体。
【請求項２】
前記酵素が、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドロラーゼ、βグルコシダーゼまたはそれらに類する酵素であり、また、それらの混合物であることを特徴とする請求項１の酵素複合体。
【請求項３】
前記担体が、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）であることを特徴とする請求項１の酵素複合体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１３−８５５０１（Ｐ２０１３−８５５０１Ａ）
【公開日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２２７５２８（Ｐ２０１１−２２７５２８）
【出願日】平成２３年１０月１７日（２０１１．１０．１７）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月１７日（２０１１．１０．１７）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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