酸化ストレスに伴う老化関連疾患を示すトランスジェニック動物
老化および老化関連疾患、特にアルツハイマー病を含む神経変性疾患、糖尿病、眼疾患、白髪、生殖器の異常、筋萎縮および骨粗鬆症、またはミトコンドリア病のモデル動物を提供する。 ＡＬＤＨ２＊２遺伝子を非ヒト動物に導入したトランスジェニック非ヒト動物を作成する。 ＡＬＤＨ２＊２対立遺伝子を導入することにより老化および老化関連疾患モデルとなるトランスジェニック動物が作成された。該トランスジェニック動物は、骨粗鬆症、筋萎縮症、および／または糖尿病様の形質を示した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、老化および老化関連疾患、特にアルツハイマー病を含む神経変性疾患、糖尿病、眼疾患、白髪、生殖器の異常、筋萎縮および骨粗鬆症、またはミトコンドリア病のモデル動物に関する。
【背景技術】
老化とともに、さまざまな老化関連疾患の発症リスクが上昇することがわかっており、これらの疾患の治療および／または予防のための薬剤ならびに方法の開発が急務であるが、この開発には、ヒトにおける症状をできるだけ忠実に表すモデル動物を利用する必要がある。
これらのモデル動物作製における代表的な技術として、その疾患における発症機序のトリガーとなる遺伝子をトランスジェニック動物作製技術を用いて導入するなどの手法がある。
種々の老化関連疾患の中で、アルツハイマー病等を含む神経変性疾患は、その発症および進行の機序が未だ完全には解明されていないことが、神経変性疾患モデル動物の開発に支障となっている。
アルツハイマー病モデルトランスジェニック動物としては、我が国特許出願特開平７−１３２０３３号「アルツハイマー病モデルトランスジェニック動物」が公知である。しかしながら、該トランスジェニック動物は、βアクチンプロモーターを用いて変異βアミロイド前駆体タンパク質を核内に高発現させることにより、細胞内でのβアミロイドの蓄積を促進させたものである。βアミロイドの産生および蓄積は、アルツハイマー病で病理学上認められるが、これが発症機序におけるトリガーとして寄与しているという確証は得られておらず、また、βアミロイドが発症機序に関与しているアルツハイマー病は、アルツハイマー病患者の約１割程度であるとする説もある。したがって、この学説からしても、βアミロイドトランスジェニック動物は、アルツハイマー病のモデル動物としての適用範囲が狭く、該動物をもってアルツハイマー病の治療および／または予防のための薬剤および方法の開発に十分であるとは言えない。
アルツハイマー病以外の老人性神経変性疾患のモデル動物もまた、未だ開発途上であり、その発症機序の解明とともに、モデル動物の開発も待たれている。
また、他の老化関連疾患として、骨粗鬆症を挙げることができるが、骨粗鬆症のモデル動物としては、現在のところ、低カルシウム食モデル、卵巣摘出モデル、プレドニゾロン投与モデル等が公知である。しかしながら、これらの動物が、完全な骨粗鬆症モデルであるという確証はない。したがって、公知のトランスジェニック動物とは異なるアプローチにより作製された骨粗鬆症モデル動物を開発し、かかるモデル動物を利用してその発症機序の解明、ならびに治療および／または予防法等の開発を進めることが必要とされている。
その他には、老化関連疾患として糖尿病を挙げることができる。糖尿病もまた他の老化関連疾患と同じく、その発症機序の解明、ならびに治療および／または予防法等の開発を進めることが必要とされている。糖尿病のモデル動物は、複数種のものが知られているが、これらが完全な糖尿病モデルであるという確証はない。したがって、公知のトランスジェニック動物とは異なるアプローチにより作製された糖尿病モデル動物は、その発症機序の解明等に有用である。
老化関連疾患とは別にミトコンドリアの機能障害によって生じるミトコンドリア病もまた多種の病因からなる疾患である。特に筋と中枢神経系に主症状が現れる疾患はミトコンドリア脳筋症と総称される。ミトコンドリア病の多くは、ミトコンドリアＤＮＡ及びミトコンドリアに関連する核ＤＮＡの異常が原因とされている。しかし、病因から病態へと至るプロセスについては不明な点が多い。特にミトコンドリアは活性酸素を発生し、酸化ストレスの影響を受けやすいオルガネラであり、これが様々な病態と結びついている可能性が高い。こうした観点から、ミトコンドリア病発症機序の解明、ならびに治療および／または予防法等の開発を進める為のモデル動物の作製が試みられている（例えば、特表平９−５１１３９８、および特表２００３−５０９０７１号公報など参照のこと）。
一方、ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）の欠損が、アポリポタンパク質Ｅのε４遺伝子座と相乗的に働いて、老年性アルツハイマー病（ＡＤ）の危険因子となり得ることを本発明者らはすでに報告している（特開２００１−２９９３９７）。
ＡＬＤＨ２は、アルコールから生成するアルデヒドをカルボン酸に代謝する酵素であり、生体内におけるアセトアルデヒドの酸化に重要な役割を有している（Ｂｏｓｒｏｎ Ｗ．Ｆ．ａｎｄ Ｌｉ Ｔ．Ｋ．（１９８６）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ａｌｃｏｈｏｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．６，５０２−５１０．）。ヒトにおいては、その変異対立遺伝子であるＡＬＤＨ２＊２は、ＡＬＤＨ２＊１遺伝子の第１２エキソン内に１つの点突然変異（Ｇ／Ａ）を有するものであり、これはアジア系人種に限られる（Ｙｏｓｈｉｄａ Ａ．，Ｈｕａｎｇ Ｉ．Ｙ．ａｎｄ ｌｋａｗａ Ｍ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｂｎｏｒｌｎａｌｉｔｙ ｏｆ ａｎｉｎａｃｔｉｖｅ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｖａｒｉａｎｔ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｆｏｕｎｄ ｉｎ Ｏｒｉｅｎｔａｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８１，２５８−２６１．）
）。この変異により、４８７位のグルタミン酸がリジンに置換され（Ｅ４８７Ｋ）、ドミナント・ネガティブとして作用する（Ｃｒａｂｂ Ｄ．Ｗ．，Ｅｄｅｎｂｅｒｇ Ｈ．Ｊ．，Ｂｏｓｒｏｎ Ｗ．Ｆ．ａｎｄ Ｌｉ Ｔ．Ｋ．（１９８９）Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｆｏｒ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ａｌｃｏｈｏｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅ ｉｎａｃｔｉｖｅ ＡＬＤＨ２（２）ａｌｌｅｌｅ ｉｓ ｄｏｍｉｎａｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３，３１４−３１６．Ｓｉｎｇｈ Ｓ．，Ｆｒｉｔｚｅ Ｇ．，Ｆａｎｇ Ｂ．Ｌ．，Ｈａｒａｄａ Ｓ．，Ｐａｉｋ Ｙ．Ｋ．，Ｅｃｋｅｙ Ｒ．，Ａｇａｒｗａｌ Ｄ．Ｐ．ａｎｄ Ｇｏｅｄｄｅ Ｈ．Ｗ．（１９８９）Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｎａｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ，Ｊａｐａｎｅｓｅ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ａｌｌｅｌｅ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．８３，１１９−１２１．Ｘｉａｏ Ｑ．，Ｗｅｉｎｅｒ Ｈ．ａｎｄ Ｃｒａｂｂ Ｄ．Ｗ．（１９９６）Ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡＬＤＨ２）ｇｅｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ａｌｃｏｈｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｌｕｓｈｉｎｇ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ ｉｎ ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｆａｓｈｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８，２０２７−２０３２．）
）。ＡＬＤＨ２＊２対立遺伝子を有する個体は、アルコール赤面症候群（Ａｌｃｏｈｏｌ ｆｌｕｓｈｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を示し、血中アセトアルデヒド値が増加する（Ｇｏｅｄｄｅ Ｈ．Ｗ．，Ｈａｒａｄａ Ｓ．ａｎｄ Ａｇａｒｗａｌ Ｄ．Ｐ．（１９７９）Ｒａｃｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ａｌｃｏｈｏｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ：ａ ｎｅｗ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５１，３３１−３３４．Ｃｒａｂｂ Ｄ．Ｗ．（１９９０）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５，３１１−３１５．）
）。また、ＡＬＤＨ２＊２対立遺伝子は、トルエンの代謝産物であるベンズアルデヒドなどの他のアルデヒドおよびビニルクロライドの代謝の際に生成するクロロアセトアルデヒドの代謝にも作用しているとの報告がある（Ｋａｗａｍｏｔｏ Ｔ．，Ｍａｔｓｕｎｏ Ｋ．，Ｋｏｄａｍａ Ｙ．，Ｍｕｒａｔａ Ｋ．ａｎｄ Ｍａｔｓｕｄａ Ｓ．（１９９４）ＡＬＤＨ２ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｔｏｌｕｅｎｅ．Ａｒｃｈ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ．４９，３３２−３３６．Ｆａｒｒｅｓ Ｊ．，Ｗａｎｇ Ｘ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ．，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ｓ．Ｊ．，Ｗａｎｇ Ｔ．Ｔ．ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ Ｈ．（１９９４）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ４８７ ｔｏ ｌｙｓｉｎｅ ｉｎ ｒａｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ａ ｍｏｄｅｌ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｈｕｍａｎ（Ｏｒｉｅｎｔａｌ ｔｙｐｅ）ｃｌａｓｓ ２ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１３８５４−１３８６０．Ｙｏｋｏｙａｍａ Ａ．，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｔ．，Ｏｈｍｏｒｉ Ｔ．，Ｍａｋｕｕｃｈｉ Ｈ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｓ．，Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ Ｓ．，Ｙｏｓｈｉｎｏ Ｋ．，Ｍａｒｕｙａｍａ Ｋ，，Ｎａｋａｎｏ Ｍ．ａｎｄ Ｉｓｈｉｉ Ｈ．（１９９６）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ａｎｄ ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ｕｐｐｅｒ ａｅｒｏｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｔｒａｃｔ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−２ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ａｌｃｏｈｏｌｉｃｓ．Ｃａｎｃｅｒ．７７，１９８６−１９９０．）。
活性酸素種（ＲＯＳ）により生ずる酸化ストレスおよび過酸化反応は、ＡＤ（Ｌｏｖｅｌｌ Ｍ．Ａ．，Ｅｈｍａｎｎ Ｗ．Ｄ．，Ｍａｔｔｓｏｎ Ｍ．Ｐ．ａｎｄ Ｍａｒｋｅｓｂｅｒｙ Ｗ．Ｒ．（１９９７）Ｅｌｅｖａｔｅｄ ４−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ ｉｎ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ．１８，４５７−４６１．Ｍａｒｋ Ｒ．Ｊ．，Ｐａｎｇ Ｚ．，Ｇｅｄｄｅｓ Ｊ．Ｗ．，Ｕｃｈｉｄａ Ｋ．ａｎｄ Ｍａｔｔｓｏｎ Ｍ．Ｐ．（１９９７）Ａｍｙｌｏｉｄ ｂ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｍｐａｉｒｓ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ａｎｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，１０４６−１０５４．）、パーキンソン病（ＰＤ）（Ｄｅｘｔｅｒ Ｄ．Ｔ．，Ｈｏｌｌｅｙ ＡＥ．，Ｆｌｉｔｔｅｒ Ｗ．Ｄ．，Ｓｌａｔｅｒ Ｔ．Ｆ．，Ｗｅｌｌｓ Ｆ．Ｒ．，Ｄａｎｉｅｌ Ｓ．Ｅ．，Ｌｅｅｓ ＡＪ．，Ｊｅｎｎｅｒ Ｐ．ａｎｄ Ｍａｒｓｄｅｎ Ｃ．Ｄ．（１９９４）Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ：ａｎ ＨＰＬＣ ａｎｄ ＥＳＲ ｓｔｕｄｙ．Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ．９，９２−９７．）、筋性側索硬化症（ａｍｙｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）および脳虚血（Ｃｈａｎ Ｐ．Ｈ（２００１）Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ．Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．２１，２−１４．）などの神経変性疾患の原因に深く関与していることが報告されている。主要なＲＯＳは、ミトコンドリアのスーパーオキシドアニオンラディカルに由来し、これが不飽和多価脂肪酸を攻撃することによって膜脂質の過酸化反応が起こり、４−ヒドロキシ−２−ノネナール（４−ＨＮＥ）およびマロンジアルデヒドなどの反応性アルデヒドが生成する。該４−ＨＮＥは求電子試薬であり、細胞内タンパク質に吸着して、該タンパク質内のリジン、ヒスチジン、セリンおよびシスティン残基と相互作用してタンパク質を変性させ得る。ＡＤまたはＰＤ患者の脳組織の免疫染色によると、神経変性に伴う４−ＨＮＥにより修飾されたタンパク質が増加している（Ｍｏｎｔｉｎｅ Ｋ．Ｓ．，Ｏｌｓｏｎ Ｓ．Ｊ．，Ａｍａｒｎａｔｈ Ｖ．，Ｗｈｅｔｓｅｌｌ Ｗ．Ｏ．Ｊｒ．，Ｇｒａｈａｍ Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｏｎｔｉｎｅ Ｔ．Ｊ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎｏｎｅｎａｌ ａｄｄｕｃｔｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ＡＰＯＥ４．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０，４３７−４４３．Ｙｏｒｉｔａｋａ Ａ．，Ｈａｔｔｏｒｉ Ｎ．，Ｕｃｈｉｄａ Ｋ．，Ｔａｎａｋａ Ｍ．，Ｓｔａｄｔｍａｎ Ｅ．Ｒ．ａｎｄ Ｍｉｚｕｎｏ Ｙ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ４−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｄｄｕｃｔｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３，２６９６−２７０１．Ｓａｙｒｅ Ｌ．Ｍ．，Ｚｅｌａｓｋｏ Ｄ．Ａ．，Ｈａｒｒｉｓ Ｐ．Ｌ．，Ｐｅｒｒｙ Ｇ．，Ｓａｌｏｍｏｎ Ｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ Ｍ．Ａ（１９９７）４−Ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｄｖａｎｃｅｄ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６８，２０９２−２０９７．）。
【発明の開示】
本発明は、酸化ストレスによる老化症状を反映する新規な老化関連疾患モデル動物を提供するものであり、特に、アルツハイマー病をはじめとする老化に関連する神経変性疾患および糖尿病、骨粗鬆症、さらにはミトコンドリア病の新規モデル動物を提供する。
上記の知見に基づき、本発明者らは、ＡＬＤＨ２＊２対立遺伝子を導入することによりアルツハイマー病疾患モデルとなるトランスジェニック動物が作成できると考え、本発明を完成させるに至った。また、該トランスジェニック動物は、神経変性疾患、糖尿病、骨粗鬆症、筋萎縮症、眼疾患等、老化関連およびミトコンドリア関連疾患様の形態を示すことが判明した。
また、本発明者らは、神経細胞死におけるＡＬＤＨ２酵素活性の役割を培養細胞を用いて検討したところ、ＡＬＤＨ２活性欠損株は酸化ストレスによって生じる４−ＨＮＥの解毒能が低下し、細胞死が促進されることを見いだした（Ｏｈｓａｗａ Ｉ．，Ｎｉｓｈｉｍａｋｉ，Ｋ．，Ｙａｓｕｄａ Ｃ．，Ｋａｍｉｎｏ Ｋ．ａｎｄ Ｏｈｔａ Ｓ．（２００３）Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ａ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ＰＣ１２ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｎｅｕｃｈｅｍ．８４，１１１０−１１１７．）。この結果から、ＡＬＤＨ２の活性欠損型がアルツハイマー病やパーキンソン病などの老化関連神経変性疾患の危険因子となるのは、この欠損により酸化ストレスに対する抵抗性が低下しているためと考えることができる。
したがって、本発明は、以下の：
１． ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）遺伝子の活性をドミナント・ネガティブに抑制する不活性型ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２＊２）をコードする遺伝子を、非ヒト脊椎動物に導入することによる早期老化、老化関連疾患および／またはミトコンドリア病の症状を示すトランスジェニック動物；
２． 老化関連疾患が神経変性疾患、糖尿病または骨粗鬆症である、上記１記載のトランスジェニック動物；
３． 不活性型ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２＊２）遺伝子がマウスに由来するものである、上記１または２に記載のトランスジェニック動物；
４． 非ヒト脊椎動物がマウスである、上記１〜３のいずれかに記載のトランスジェニック動物：
５． プロモーターを上記ＡＬＤＨ２＊２遺伝子に対して機能し得る形で連結させて用いる、上記１〜４のいずれかに記載のトランスジェニック動物；
６． プロモーターがＥＦプロモーターである、上記５記載のトランスジェニック動物；
７． プロモーターがアクチンプロモーターである、上記５記載のトランスジェニック動物；
８． ＡＬＤＨ２＊２遺伝子を、非ヒト脊椎動物に導入することによる、早期老化、老化関連疾患および／またはミトコンドリア病のモデルとなるトランスジェニック動物の作製方法；
９． 老化関連疾患が神経変性疾患、糖尿病または骨粗鬆症である、上記８記載のトランスジェニック動物の作製方法；
１０． 不活性型ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２＊２）遺伝子がマウスに由来するものである、上記８または９に記載のトランスジェニック動物の作製方法；
１１． 非ヒト脊椎動物がマウスである、上記８〜１０のいずれかに記載のトランスジェニック動物の作製方法；
１２． プロモーターを上記ＡＬＤＨ２＊２遺伝子に対して機能し得る形で連結させて用いる、上記８〜１１のいずれかに記載のトランスジェニック動物の作製方法；
１３． プロモーターがＥＦプロモーターである、上記１２記載のトランスジェニック動物の作製方法；
１４． プロモーターがアクチンプロモーターである、上記１２記載のトランスジェニック動物の作製方法；
１５． 老化関連疾患またはミトコンドリア病を制御する物質を、上記１〜７のいずれかに記載のトランスジェニック動物を用いてスクリーニングする方法であって、
１） 上記動物に試験する物質を投与、または上記動物を試験する物質に曝露すること、
２） 上記動物の老化、老化関連疾患またはミトコンドリア病の症状の促進または抑制を確認すること、
を含む、上記方法；
１６． 上記動物の老化または老化関連疾患の症状を確認することが、上記物質を投与、または上記物質に曝露した上記動物が、投与または曝露を受けていない対照の動物に比べて、筋萎縮、背骨の湾曲、骨密度の低下、体毛の脱色、糖負荷試験により検出される高血糖値の持続、または神経伝導速度低下のうちの少なくともいずれか１つを促進または抑制されていることを確認することである、上記１５記載の方法；
１７． 上記筋萎縮を促進または抑制されていることを確認することが、筋組織の断面積測定、筋組織の筋密度測定、または筋組織の免疫染色のいずれかにより実施される、上記１６記載の方法；
１８． 上記酸化ストレスに対する抵抗性の低下を促進または抑制されていることを確認することが、上記動物から単離した組織由来の細胞が４−ＨＮＥに対する抵抗性が減少または増大していることにより実施される、上記１６記載の方法；
１９． 上記動物から単離した組織由来の細胞が中枢神経系由来のニューロンである、上記１８記載の方法；
２０． 老化関連疾患またはミトコンドリア病を制御する物質を、上記１〜７のいずれかに記載のトランスジェニック動物より単離した組織由来の細胞を用いてスクリーニングする方法であって、
１） 上記細胞を試験する物質に曝露すること、
２） 上記動物の老化、老化関連疾患またはミトコンドリア病の症状の促進または抑制を確認すること、
を含む、上記方法；
に関する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−３０７４９０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、アクチンプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック・マウスの各組織におけるＡＬＤＨ２＊２の発現を確認したウェスタンブロットの結果である。
図２は、アクチンプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの３系統（Ｃ２，６２９および６３５）について、ＡＬＤＨ２活性の測定結果を示す。
図３は、アクチンプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスＣ２および６２９の２系統について、生後から１５週目までの体重を測定した結果を示す（右図）。左図は皮を除去したマウスの画像である。Ｃ２マウスでは全身の筋肉が減少している。
図４は、１０週齢メスのヘテロＣ２マウスと野生型Ｃ５７ＢＬ／６について、脳、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、大腿筋の重量を比較した結果を示す。
図５は、Ｃ２マウスとＣ５７ＢＬ／６の１２週齢メスの下肢切片のヘマトキシリン・エオジン染色結果を示す。
図６は、Ｃ２マウスとＣ５７ＢＬ／６の１２週齢メスの下肢切片のヒラメ筋断面積測定結果を示す。
図７は、Ｃ２マウスとＣ５７ＢＬ／６の１２週齢メスの下肢切片の単位面積あたりのヒラメ筋細胞数をカウントした結果を示す。
図８は、Ｃ２マウスとＣ５７ＢＬ／６の１２週齢メスの下肢切片のヒラメ筋細胞総数をカウントした結果を示す。
図９は、Ｃ２とＣ５７ＢＬ／６マウスの下肢切片をレーザー顕微鏡で観察した結果を示す。
図１０は、Ｃ２とＣ５７ＢＬ／６マウスの下肢切片のＧｏｍｏｒｉトリクローム変法による組織化学的染色像を示す。
図１１は、Ｃ２とＣ５７ＢＬ／６マウスの下肢切片の蛍光色素ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ染色による染色像を示す。
図１２は、大腿筋の過酸化脂質量を、ＢＩＯＸＹＴＥＣＨ ＬＰＯ−５８６キットによるＭＤＡ量及びＭＤＡ＋４−ＨＡＥの測定結果を示す。
図１３は、３ヶ月齢のホモの１０３３−７マウスの写真である。
図１４は、Ｃ２とＣ５７ＢＬ／６マウスの神経伝導速度測定結果を示す。
図１５は、Ｃ２とＣ５７ＢＬ／６マウスの糖負荷試験結果を示す。
図１６は、Ｃ２マウスの背骨湾曲を示すレントゲン写真（Ａ）と骨密度の低下（Ｂ）を示す。
図１７は、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウス大脳皮質初代培養神経細胞に４−ＨＮＥを添加したときの生存細胞数を示す。
図１８は、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウス大脳皮質初代培養神経細胞に４−ＨＮＥを添加後、抗ＴＵＪ−１抗体陽性となる神経細胞の写真である。
図１９は、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウス大脳皮質初代培養神経細胞に４−ＨＮＥを添加後、抗４−ＨＮＥ抗体で染色することで、４−ＨＮＥの蓄積を測定した結果である。
図２０は、Ｃ２ヘテロの雄にビタミンＥ添加食を与えたときの体重増加を経時的に示す。
図２１は、Ｃ２ヘテロの雄にビタミンＥ添加食を与えたときの筋断面積増加を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
本明細書中、「不活性型ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２」とは、ＡＬＤＨ２遺伝子内に１つ以上の点突然変異（Ｇ／Ａ）を有し、この変異によりミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２の活性をドミナント・ネガティブに抑制することのできる変異タンパク質のことを指す。ヒトにおいてはＡＬＤＨ２遺伝子の第１２エキソン内に１つ以上の点突然変異（Ｇ／Ａ）を有し４８７位のグルタミン酸がリジンに置換（Ｅ４８７Ｋ）されているＡＬＤＨ２＊２を指す。本発明のトランスジェニック動物は、該不活性型酵素遺伝子が高レベルで発現することにより、ドミナント・ネガティブとしてミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２活性を抑制し、酸化ストレスが蓄積する。
動物の用意、微量注入法、注入された受精卵の再移植、仮親の維持、及びトランスジェニック・マウス系統の回収と維持に関する詳細な方法は、Ｇｏｒｄｏｎ，ＪとＲｕｄｄｌｅ，Ｆ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１，４１１−４３３（１９８３）、ＢｒｉｎｓｔｅｒらＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，４４３８−４４４２（１９８５）、及びＢｒｉｎｓｔｅｒらＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５，８３６−８４０（１９８８）に従えばよい。
ＡＬＤＨ２＊２遺伝子は、天然に存在する遺伝子を、その個体に由来する組織から単離することもでき、またＡＬＤＨ２遺伝子を常法にしたがって適当な動物種からクローニングし、アミノ酸残基を置換する変異を導入することで得ることもできる。たとえば、ヒトＡＬＤＨ２の４８７位のグルタミン酸に相当するマウスＡＬＤＨ２遺伝子（マウスＡＬＤＨ２ｃＤＮＡを配列番号１に示している）の５０６番目のアミノ酸残基グルタミン酸をコードするコドンＧＡＡを点突然変異誘発法、二段階ＰＣＲ法等を用いて、リジンをコードするコドン（例えば、ＡＡＡ）に変異させることにより得ることができる。さらに他には、ＤＮＡ合成により得ることも可能である。この変異導入は、適切なベクター（プラスミド、ウイルスＤＮＡなど）を用いて行われる。例えば、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等を用いることができる。こうして得られた変異遺伝子（すなわち、ＡＬＤＨ２＊２遺伝子）と、適切な発現プロモーターおよび／またはエンハンサーとを、プロモーターおよび／またはエンハンサーが該遺伝子に対して機能し得る形で連結するように挿入する。本発明の適切な発現プロモーターは、通常の遺伝子組換技術で使用される発現プロモーターであり、特に限定されるものではないが、例えば、恒常型プロモーターの例として、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、Ｌｃｋキナーゼの遠位プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）などが挙げられる。また、誘導型のプロモーターの例としては、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターなどが挙げられる。以上のようなプロモーターを有する発現ベクターは、いずれも市販されているか、または公的な機関から入手できる。市販されている場合は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社などから購入することができる。また、部位特異的発現プロモーター、例えば、筋組織で高発現するプロモーターであるアクチンプロモーター、神経特異的プロモーターであるＴα１遺伝子プロモーター（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１６：１９６−２０１，１９９８）など、対象とする遺伝子を発現させたい部位に応じて、その部位に特異的な発現プロモーターを使用することは、当業者には容易に達成でき得る。
あるいはまた、エンハンサー配列を、機能し得る形で対象とする遺伝子と連結させることもできる。本発明において適切なエンハンサー配列とは、特に限定されるものではないが、例えば、ＳＶ４０エンハンサー、ポリオーマウイルスエンハンサー、ＭｏＭｕＬＶエンハンサー、ＭｏＭｕＳＶエンハンサー、ＡＫＶエンハンサー、ＳＬ３−３エンハンサー、ＨＰＶのＩＥ２またはＩＥ６エンハンサー、ＨＢＶエンハンサー、ＨＣＭＶエンハンサー等のウイルスエンハンサー、例えば、ＩｇＨエンハンサー、ＩｇＬエンハンサー、Ｔ細胞レセプターα鎖エンハンサー、ＨＬＡＤＱαおよびβ遺伝子エンハンサー、β−ＩＦＮエンハンサー、ＩＬ−２エンハンサー、ＩＬ−２Ｒエンハンサー等の免疫系遺伝子のエンハンサー、例えば、β−アクチンエンハンサー、ＭＣＫエンハンサー、プレアルブミン遺伝子エンハンサー、エラスターゼＩ遺伝子エンハンサー、メタロチオネイン遺伝子エンハンサー等の細胞エンハンサー等が挙げられる。当業者であれば、目的に応じて、適切なものを選択して用いることができる。
上述にしたがって、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列に連結されたＡＬＤＨ２＊２遺伝子を、非ヒト脊椎動物に導入するためのトランスジェニック技術は、公知である。非ヒト脊椎動物としては、技術的には全ての動物種を対象とすることが可能である。したがって、本発明のトランスジェニック動物は、あらゆる脊椎動物であり得る。脊椎動物のなかでも、特にニワトリ等の鳥類、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウサギ等の哺乳類が好ましく、マウスの他、ラット、モルモットをはじめとするあらゆる囓歯動物がさらに好ましい。特に近交系が多数作出されており、しかも受精卵の培養、体外受精等の技術が整っている点で、マウスが特に好ましい。全能性細胞（マウスの場合、受精卵や初期胚が好ましい）に公知の遺伝子導入法により目的とする遺伝子を導入する。該遺伝子導入法は、例えば、マイクロインジェクション法（Ｇｏｒｄｏｎ Ｊ．およびＲｕｄｄｌｅ Ｆ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８３など参照のこと）あるいはウイルスを介して感染させる方法を用いることができる。遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管または子宮に移植され、出生された動物を飼育した後、体の一部（尾部先端等）からＤＮＡを抽出し、サザン解析やＰＣＲ法等により、導入した遺伝子の存在を確認する。導入した遺伝子の存在が確認された個体（ヘテロ接合体）を初代（Ｆｏｕｎｄｅｒ：ＦＯ）とすれば、導入遺伝子はその子（Ｆ１）の５０％に伝達される。さらに、このＦ１個体の雌雄を交配させることにより、２倍体染色体の両方に導入遺伝子を有する個体（Ｆ２）を作成することができる。
このようにして得られたＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物は、１種または複数の老化関連疾患およびミトコンドリア病形質を示し得る。
本明細書中、「老化関連疾患」とは、老年性神経変性疾患（アルツハイマー病、老人性痴呆症、パーキンソン氏病、網膜変性疾患など）、糖尿病、筋萎縮症、骨粗鬆症、視聴覚障害など、加齢とともに発症するという傾向のある疾患の総称として用いる。例えば、ＥＦプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物の場合、老年性神経変性疾患またはアルツハイマー病の形質を示す。これらは、外界からの刺激に対する応答が著しく低下している。あるいは、アクチンプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物の場合、骨粗鬆症の形質を示す。これは背骨の湾曲と骨密度の低下により確認することができる。また、アクチンプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物の場合、糖尿病の形質を示す。これはグルコース負荷試験で高血糖値を示し、また糖尿病に付随する神経伝達速度の低下により確認することができる。
また、ＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物は、早期老化モデル動物として利用し得る。早期老化モデル動物とは、老化関連疾患の発症期が通常の個体より若い、ヒトの老化現象に認められる、例えば眼疾患、白髪、生殖器の異常、および筋萎縮等の現象が、通常の個体より若くして認められる、および／または寿命が通常の個体より短い等の特徴を有する動物を指す。例えば、本発明のＥＦプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物では、老化関連疾患の発症期が通常の個体より若いことの他に、通常の個体より早期に体毛の退色が認められる。
かかる早期老化モデル動物は、人類の老化関連疾患および老化現象に認められる症状についての予防および／または治療のための研究が、短期間に行えるという点で、これらの研究における利用価値が高い。早期老化モデル動物の開発は従来から行われていたが、本発明のトランスジェニック動物の老化促進は、酸化ストレスを機序とするため、酸化ストレスに対する老化現象等の解明および解決等に有用である。
また、ＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物は、ミトコンドリア病モデル動物として利用し得る。ミトコンドリアの機能障害によって生じるミトコンドリア病もまた多種の病因からなる疾患である。特に筋と中枢神経系に主症状が現れる疾患はミトコンドリア脳筋症と総称される。例えば、本発明のアクチンプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物では顕著な筋萎縮が認められ、ミトコンドリアの異常な蓄積が認められる等、ミトコンドリア脳筋症の形質を示す。かかるモデル動物は、ミトコンドリア病発症機序の解明、ならびに治療および／または予防法等の開発を進める上で有用である。
さらに、本発明のトランスジェニック動物を、他の早期老化モデル動物または老化関連疾患モデル動物と交配することにより、新規の早期老化モデル動物、または老化関連疾患モデル動物を作製することもできる。例えば、他のアルツハイマー病関連遺伝子を操作した動物と本発明のトランスジェニック動物を交配して得られる動物は、該アルツハイマー病関連遺伝子と酸化ストレスとの関連性についての研究に用いることができる。
本発明はさらに、上記トランスジェニック動物を用いて、老化関連疾患またはミトコンドリア病を制御する物質をスクリーニングする方法にも関する。該方法は、試験する物質（あらゆる化学物質、動物体内でタンパク質発現の可能な核酸分子を含む）を上記動物に適切な方法で投与するか、または適切な方法で該物質に上記動物を曝露することにより、該動物の老化関連疾患またはミトコンドリア病の症状における変化を確認することにより、達成することができる。例えば、該動物の筋萎縮、背骨の湾曲、骨密度の低下、体毛の脱色、糖負荷試験により検出される高血糖値の持続、神経伝導速度低下、または酸化ストレスに対する抵抗性の低下のうち、少なくとも１つが、上記物質の投与または曝露を受けていない対照の動物に比較して、抑制されている場合、該物質は老化関連疾患を抑制（すなわち、予防／治療）する方向に制御する物質であると特定することができる。また同様に比較して、促進されている場合、該物質は老化関連疾患を促進する方向に制御する物質であると特定することができる。該方法において、例えば筋萎縮の促進または抑制を調べる場合、例えば、上記物質の投与または曝露後の動物から特定の筋組織を摘出し、その断面積測定、筋密度測定、免疫染色の少なくとも１種の方法で確認することができる。
また、酸化ストレスに対する抵抗性の低下について検出するには、上記物質の投与または曝露を受けた上記動物に酸化ストレスを与える（例えば、４−ＨＮＥを投与する）か、該動物から特定の組織中の細胞（例えば、神経細胞）を採取し、該細胞が生存可能な条件下で酸化ストレスを与え、その細胞毒性（例えば、細胞死の誘導、細胞の生存活性の低下など）を検出することによっても実施可能である。老化関連疾患またはミトコンドリア病を制御する物質を投与または暴露されていない動物由来の細胞に比べて、該物質を投与または暴露された細胞では酸化ストレスによる細胞毒性が増強されている場合（例えば、低濃度の活性酸素で細胞毒性が検出される等）は、該物質は老化関連疾患を促進する方向に制御する物質であると特定することができる。また、逆に細胞毒性が低減されている場合は、該物質は老化関連疾患を抑制（すなわち、予防／治療）する方向に制御する物質であると特定することができる。
あるいはまた、該動物から特定の組織を摘出し、該組織中の細胞を単離して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで老化関連疾患またはミトコンドリア病を制御する物質をスクリーニングすることもできる。単離した細胞（例えば、中枢神経系由来のニューロンなど）を生存可能な条件下で、試験する物質に暴露し、該細胞に対する影響（例えば、細胞の生存活性の変化など）を評価することにより達成できる。
上記スクリーニングにおける適切な条件等は、当業者であれば、必要に応じて日常的な作業により容易に設定することができる。
さらに、後述の実施例により、本発明にかかるトランスジェニック動物が、アルツハイマー病の疾患モデル動物として有用であること、および抗老化物質（例えば、抗酸化物質）などの効果を評価するのに有用な動物であることを含めて、本発明を具体的に説明する。しかし、本発明は実施例に限定して解釈されるべきではない。
実施例１：マウスＡＬＤＨ２ ｃＤＮＡのクローニング
マウスのアルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）をコードするｃＤＮＡは、配列番号２と３のプライマーを用いて、マウス脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）からＰＣＲ法を用いてクローニングした。ＰＣＲ法の条件は標準の方法を用いた。各１μＭのプライマー、鋳型ＤＮＡとして３μｇ ｃＤＮＡライブラリー、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、２単位のＡｍｐｌｉｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２からなる反応液を増幅サイクル数２５で、９４℃に３０秒、５７℃に３０秒、７２℃に３０秒にて反応した。得られた１．７ｋｂのＡＬＤＨ２ｃＤＮＡ断片を各１２単位の制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで３７℃にて１時間消化し、０．５μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を各６単位の制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで３７℃にて１時間消化することで開裂したＤＮＡ断片と混和して、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ存在下で１６℃にて１時間反応した。この反応液１０μｌを大腸菌ＤＨ５αのコンピテント・セル１００μｌに添加、氷上に１時間静置、３０秒間４２℃で熱処理、再び氷上で２分間静置した後に、ＬＢ液体培地を９００μｌ加えて３７℃にて１時間培養後、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗沫した。３７℃にて一晩培養した寒天培地から生育したコロニーを選択し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地１リットルにて一晩培養した後、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＡＬＤＨ２を精製した。
実施例２：不活性型マウスＡＬＤＨ２であるＡＬＤＨ２＊２の構築
ＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡ（配列番号１）がコードする５０６番目のコドンＧＡＡ（アミノ酸残基Ｇｌｕをコード）をコドンＡＡＡ（アミノ酸残基Ｌｙｓをコード）に置換するために二段階ＰＣＲ法により ＤＮＡ配列を変更した。一段階目のＰＣＲは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＡＬＤＨ２を鋳型ＤＮＡとして用い、反応液（１）では配列番号２と４に記載のプライマーを用いて、反応液（２）では配列番号３と５に記載のプライマーを用いて、前述の反応条件と同一のＰＣＲ条件で反応した。その結果、反応液（１）では１５６８ｂｐ、反応液（２）では１３５ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。この反応液（１）と（２）のＤＮＡ断片を鋳型に、配列番号２と３のプライマーを用いて二段階めのＰＣＲを前述の反応条件と同一の条件で反応した。得られた１．７ｋｂ ＡＬＤＨ２＊２ｃＤＮＡ断片を各１２単位の制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで３７℃にて１時間消化し、０．５μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）を各６単位の制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで３７℃にて１時間消化することで開裂したＤＮＡ断片と混和して、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ存在下で１６℃にて１時間反応した。この反応液１０μｌを大腸菌ＤＨ５αのコンピテント・セル１００μｌに添加、氷上に１時間静置、３０秒間４２℃で熱処理、再び氷上で２分間静置した後に、ＬＢ液体培地を９００μｌ加えて３７℃にて１時間培養後、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗沫した。３７℃にて一晩培養した寒天培地から生育したコロニーを選択し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地１リットルにて一晩培養した後、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを用いて、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＡＬＤＨ２＊２を精製した。
実施例３：トランスジェニック・マウス作製用プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＡＬＤＨ２＊２及びｐＥＦ１−ＢＯＳ−ＡＬＤＨ２＊２の構築
ｐＣＡＧＧＳ−ＡＬＤＨ２＊２の作製には、１μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＡＬＤＨ２＊２を各１２単位の制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで３７℃にて１時間消化し、０．５μｇのプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ，Ｈ．他、Ｇｅｎｅ １０８，１９３−１９９（１９９１）に記載、熊本大学 山村研一先生より入手）を各６単位の制限酵素ＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで３７℃にて１時間消化することで開裂したＤＮＡ断片と混和し、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ存在下で１６℃にて１時間反応した。この反応液１０μｌを大腸菌ＤＨ５αのコンピテント・セル１００μｌに添加、氷上に１時間静置、３０秒間４２℃で熱処理、再び氷上で２分間静置した後に、ＬＢ液体培地を９００μｌ加えて３７℃にて１時間培養後、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗沫した。３７℃にて一晩培養した寒天培地から生育したコロニーを選択し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地１リットルにて一晩培養した後、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを用いて、プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＡＬＤＨ２＊２を精製した。
ｐＥＦ１−ＢＯＳ−ＡＬＤＨ２＊２の作製には、１μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＡＬＤＨ２＊２を１２単位の制限酵素ＸｂａＩで３７℃にて１時間消化し、０．５μｇのプラスミドｐＥＦ１−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．とＮａｇａｔａ，Ｓ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１８，５３２２（１９９０）に記載、大阪大学 長田重一先生より入手）を６単位の制限酵素ＸｂａＩで３７℃にて１時間消化することで開裂したＤＮＡ断片と混和し、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ存在下で１６℃にて１時間反応した。この反応液１０μｌを大腸菌ＤＨ５αのコンピテント・セル１００μｌに添加、氷上に１時間静置、３０秒間４２℃で熱処理、再び氷上で２分間静置した後に、ＬＢ液体培地を９００μｌ加えて３７℃にて１時間培養後、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗沫した。３７℃にて一晩培養した寒天培地から生育したコロニーを選択し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地１リットルにて一晩培養した後、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを用いて、プラスミドｐＥＦ１−ＢＯＳ−ＡＬＤＨ２＊２を精製した。
実施例４：マウス受精卵への微量注入の為の線状ＤＮＡ断片Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２及びＰｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２の調製
３０μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＡＬＤＨ２ ＊２を、２００μｌの全反応量において各５０単位の制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで３７℃において１６時間消化した。次いで、この反応液をエチジウムブロマイド含有アガロースゲル電気泳動に供し、ＵＶ照射にて可視化し、３．９ｋｂのアクチンプロモーターとＡＬＤＨ２＊２ｃＤＮＡをコードする線状ＤＮＡ断片Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２を含むゲル切片を回収した。同様に３０μｇのｐＥＦ１−ＢＯＳ−ＡＬＤＨ２＊２を、２００μｌの全反応量において各５０単位の制限酵素ＡｐａＬＩとＰｖｕＩで３７℃において１６時間消化した。次いで、この反応液をエチジウムブロマイド含有アガロースゲル電気泳動に供し、ＵＶ照射にて可視化し、４．２ｋｂのＥＦ１プロモーターとＡＬＤＨ２＊２ｃＤＮＡをコードする線状ＤＮＡ断片Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２を含むゲル切片を回収した。それぞれのＤＮＡ断片のゲル切片からの精製には、ＰｒｅｐＡ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、製造者のマニュアルに従って実施した。
実施例５：マウス受精卵への微量注入とトランスジェニック・マウスの作製
マウス受精卵への微量注入とトランスジェニック・マウスの作製は発表されている方法によっておこなった。受精卵はＣ５７ＢＬ／６マウスから単離し、線状ＤＮＡ断片Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２及び線状ＤＮＡ断片Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２をそれぞれ８００個の受精卵に注入した。注入済み卵はただちに仮親マウスの卵管内に移植して出産させた。Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入については８３匹、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入については９５匹のマウスを得た。なお、本発明のトランスジェニック・マウスの系統は、胚を凍結保存することにより維持する。
次いで、得られたマウス個体のゲノムＤＮＡ中の導入遺伝子について、その存在の有無を試験した。マウスの各個体からのＤＮＡの抽出には、まず、プロテナーゼＫを添加した組織溶解液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ラウリル硫酸塩）２００μｌの入ったチューブにバイオプシーによって得たマウス尾１〜２ｍｍを加え、５５℃で一晩インキュベーションした。ＲＮａｓｅＡを添加し３７℃にて１時間インキュベーションし溶液中の不要なＲＮＡを分解せしめた後、フェノールを加えて５分間震盪し上清を回収、新しいチューブに移して、さらにフェノール・クロロホルムを加えて５分間震盪し上清を回収、新しいチューブに移す工程を２回繰り返した後にクロロホルムを加えて５分間震盪し上清を回収、新しいチューブに移してエタノールでＤＮＡを沈澱させ、乾燥後にＴＥ緩衝液で溶解した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型に実施例１で述べたＰＣＲ条件に準じて、増幅サイクル数３５回としてＰＣＲを行った。Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの検出には配列番号６と７に記載のプライマーの組み合わせと、配列番号８と９に記載のプライマーの組み合わせの二通りのＰＣＲ反応を、また、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの検出には配列番号１０と７に記載のプライマーの組み合わせによるＰＣＲ反応を行った。以上の反応では、遺伝子導入されていないマウスではＰＣＲによるＤＮＡの増幅は認められない。ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡをエチジウムブロマイド含有アガロースゲルにて電気泳動せしめ、ＵＶ照射にて増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した結果、Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスについては２１匹、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスについては１６匹のマウスについて遺伝子の導入を確認できた。
実施例６：トランスジェニック系統の確立
導入遺伝子の存在を確認できたマウスについて、その子孫であるトランスジェニック系統を確立するために、遺伝子導入が確認できたマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと検定交配（ｂａｃｋｃｒｏｓｓ）した。生まれたマウスについて実施例５に記載の方法を用いて尾よりＤＮＡを抽出、ＰＣＲを行うことで遺伝子導入の有無を検定した。その結果、Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスについては３系統（Ｃ２，６２９および６３５）、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスについては３系統（１０３３−７，１０３９−２および１０３０−１２）、それぞれ子孫に導入遺伝子を移すことができ、トランスジェニック系統を確立することができた。
実施例７：ホモとヘテロの判別
実施例６で得られた各系統のマウスについて、それぞれの子孫がホモであるかヘテロであるかサザン・ブロティング法を用いて決定した。マウスからのＤＮＡの抽出は、実施例５に記載の方法を用いた。標識プローブの調製は、配列番号８と配列番号１１に記載の合成ＤＮＡをプライマーにプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＡＬＤＨ２を鋳型として実施例１に記載の方法に準じてＰＣＲを行い、ＤＮＡを回収した。このＤＮＡ ５０ｎｇにそれぞれ１０μＭの配列番号８と配列番号１１の合成ＤＮＡ ２μｌづつを加えて計５μｌとし、９４℃で３分間加熱処理後、液体窒素にて凍結した。次いで、これに１０倍濃度のＫｌｅｎｏｗバッファー１μｌ、２．５ｍＭ ｄＡＧＴ ｍｉｘ ０．６μｌ、α３２Ｐ−ｄＣＴＰ ６μｌとＫｌｅｎｏｗ Ｆｌａｇｍｅｎｔ １μｌを加えて、３７℃で１０分間反応せしめ、これを標識プローブとした。マウスから抽出したＤＮＡ５μｇを５０単位の制限酵素ＢｇｌＩＩで３７℃にて一晩消化し、１％アガロースゲルにて電気泳動せしめ、次いで、ゲルを０．５Ｍ ＮａＯＨと１．５Ｍ ＮａＣｌからなる変性液に浸して３０分間浸透することでＤＮＡを変性処理した。このＤＮＡをＰＶＤＦ膜に移行せしめ、ＵＶでＤＮＡをクロスリンクした後に膜を２×ＳＳＣで洗浄した。次いで、膜をＲａｐｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）に浸し、これに標識プローブを加えて６５℃にて１００分間加温処理した。膜を０．１％ ＳＤＳ含有２×ＳＳＣで室温にて２０分間洗浄し、次いで０．１％ ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣで６５℃にて１５分間、２回洗浄した後、ＦＬＡ２０００（富士フイルム株式会社、東京、日本）を用いて遺伝子導入したＡＬＤＨ２ ＤＮＡを含む１．２ｋｂのバンドを検出した。バンドの濃度が、非トランスジェニック、ヘテロ、ホモの間で０対１対２となることから、それぞれのマウス子孫がホモであるかヘテロであるかを判別した。
実施例８：抗ＡＬＤＨ２抗血清の作製
抗ＡＬＤＨ２抗血清を作製するために大腸菌でグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＡＬＤＨ２の融合タンパク質を作製した。融合タンパク質の作製のため１μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＡＬＤＨ２＊２を各１２単位の制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで３７℃にて１時間消化し、０．５μｇのプラスミドｐＰｒｏＥｘ３ ＧＳＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を６単位の制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃にて１時間消化することで開裂したＤＮＡ断片と混和し、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ存在下で１６℃にて１時間反応した。この反応液１０μｌを大腸菌ＤＨ５αのコンピテント・セル１００μｌに添加、氷上に１時間静置、３０秒間４２℃で熱処理、再び氷上で２分間静置した後に、ＬＢ液体培地を９００μｌ加えて３７℃にて１時間培養後、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗沫した。３７℃にて一晩培養した寒天培地から生育したコロニーを選択し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地１リットルにて一晩培養した後、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを用いて、ＧＳＴ−ＡＬＤＨ２融合タンパク質発現プラスミドｐＧＳＴ−ＡＬＤＨ２を精製した。次いで、このプラスミドを保持する大腸菌ＢＬ２１をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で培養せしめ、６００ｎＭにおける吸光度が０．５に達したときにＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加して、さらに４時間培養した。この培養液を遠心にて集菌し、集菌した大腸菌を１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳに懸濁し、氷上で超音波破砕した。これを遠心後に上清を新しいチューブに移し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を加えて１晩、４℃にて混和した。このＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂの沈殿をＰＢＳで洗浄した後に５ｍＭの還元型グルタチオンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて、４℃にて１０分間緩やかに混和することでＧＳＴ−ＡＬＤＨ２融合タンパク質を溶出させしめた。次いで、この融合タンパク質をフロイントアジュバント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）と混和し、ウサギに免疫した。抗体価が上昇したことを確認した後に全採血し、さらに血清として−８０℃にて保存し以降の実験に用いた。
実施例９：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法によるＡＬＤＨ２＊２タンパク質発現の確認
トランスジェニック・マウスから各臓器を取り出し、即座に液体窒素で凍結後、−８０℃で保存した。凍結した臓器は、ハンマーを用いて細断した後に臓器１００ｍｇに対してＴＮバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，７．５Ｍ尿素、ＥＤＴＡ不含（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ）プロテアーゼ・インヒビター（Ｒｏｃｈｅ社、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を１ｍｌとなるように添加した。これをＰＯＬＹＴＲＯＮ（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社、Ｌｉｔｔａｕ−Ｌｕｃｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で破砕し、さらに１／４量の１０％ ＳＤＳを加えてから超音波処理した。遠心後に上清をとり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動用サンプルとした。次いで、各臓器のサンプル量が２０μｇとなるように調製し、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルを用いて電気泳動を行った。泳動後にタンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングし、膜をＢｌｏｃｋ Ａｃｅ（雪印乳業、日本）で１５分間ブロッキングした後、１／１０濃度のＢｌｏｃｋ Ａｃｅで２０００倍に希釈した抗ＡＬＤＨ２抗ウサギ血清と置き換え、３７℃で１時間反応させた。０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１／１０濃度のＢｌｏｃｋ Ａｃｅで３回洗浄した後、１／１０濃度のＢｌｏｃｋ Ａｃｅで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼが結合されている抗ウサギＩｇＧ抗体と置き換え、３７℃で１時間反応した。０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１／１０濃度のＢｌｏｃｋ Ａｃｅで３回洗浄した後、膜にＡｔｔｏＰｈｏｓ（Ｒｏｃｈｅ社製）を塗布し、ＦＬＡ２０００でＡＬＤＨ２のバンドを検出した。結果の一例を図１に示す。Ｃ２系統においては、心臓と大腿筋においてＡＬＤＨ２の発現量が増加しており、増加分はＡＬＤＨ２＊２が過剰発現していることを示している。
実施例１０：ＡＬＤＨ２活性の測定
Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスについては３系統（Ｃ２，６２９および６３５）について、大腿筋のＡＬＤＨ２活性を測定した。生後１２週のヘテロのＣ２マウス、ホモの６２９および６３５マウスとコントロールのＣ５７ＢＬ／６マウスから大腿筋を取り、筋１ｇあたり７ｍｌのＡバッファー（０．１Ｍ ＫＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＡＴＰ）を加えて細断した。これに筋１ｇあたり５ｍｇのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加し、５分間室温にて反応した後に、さらに２０ｍｌのＡバッファーを加えて１５秒間ホモジナイズ、６００ｇで１０分間遠心した。上清をさらに１４０００ｇで１０分間遠心した後に１％ＢＳＡを含む５ｍｌのＢバッファー（０．１Ｍ ＫＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．２ｍＭ ＡＴＰ，プロテアーゼ・インヒビターＥＤＴＡ不含（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ））で懸濁し、７０００ｇで１０分間遠心し、再び沈殿を１ｍｌのＢバッファーで懸濁した。これを３５００ｇで１０分間遠心して、ミトコンドリアの沈殿を２５０ｍＭショ糖を含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）５００μｌで懸濁後に３０秒間３回超音波で破砕、再び１０００００ｇで３０分間遠心して、その上清１０μｌを用いてＡＬＤＨ２活性を測定した。反応は上清を加えて１００μｌとした反応液（２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＮＡＤ，５ｍＭアセトアルデヒドまたはプロピオンアルデヒド）の３４０ｎｍの吸光度を５〜１０分間測定し、その吸光度の経時変化から上清中のＡＬＤＨ２活性を求めた。また、上清中のタンパク量をＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（ＰＩＥＲＣＥ社製、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて製造者のプロトコールに従って測定し、この値を元にタンパク質量あたりのＡＬＤＨ２活性を計算した。結果を図２に示す。Ｃ５７ＢＬ／６の大腿筋に比して、いずれのＰａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの大腿筋でもＡＬＤＨ２活性が大幅に低下しており、特にＣ２マウスについてはほとんど活性が検出できなかった。
実施例１１：Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの体重および各臓器の重量測定
Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの各系統とＣ５７ＢＬ／６の雌５匹について生後から１５週目までの体重を測定した。Ｃ２マウスはヘテロ、６２９と６３５についてはホモのマウスについて解析した。その結果、Ｃ２および６２９の２系統について、Ｃ５７ＢＬ／６よりも有意に体重が減少していた（図３）。さらに１０週齢メスのヘテロＣ２マウスとＣ５７ＢＬ／６について、脳、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、大腿筋の重量を比較した（図４）。その結果、心臓と大腿筋の重量がＣ２マウスでは減少していた。
実施例１２：Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの筋萎縮
ヘテロまたはホモのＣ２マウスとＣ５７ＢＬ／６の１２週齢メスの下肢を液体窒素で凍結し、ｃｒｙｏｓｔａｔ（ＣＭ１９００，ＬＥＩＣＡ社製、Ｎｕｓｓｌｏｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で８μｍの厚さからなる横断面の新鮮凍結切片を作製した。作製した切片はヘマトキシリン・エオジン染色し（図５）、腓腹筋とヒラメ筋についてその断面積を測定したところ、Ｃ２マウスの筋断面積はＣ５７ＢＬ／６の筋断面積よりも減少していた。図６には、ヒラメ筋断面積の測定結果を示す。一方、単位面積あたりの筋細胞数をカウントすることで筋密度を測定したところ、Ｃ２マウスの筋密度が増加していた（図７）。しかし、ヒラメ筋細胞の総数には変化がない（図８）ことから、Ｃ２マウスでは筋が萎縮していることが明らかとなった。
実施例１３：免疫染色と組織化学的染色による萎縮した筋の観察
ヘテロのＣ２マウスとホモの６２９と６３５マウス、及びＣ５７ＢＬ／６マウスの１２週齢メスの下肢を液体窒素で凍結し、ｃｒｙｏｓｔａｔで８μｍの厚さからなる横断面の新鮮凍結切片を作製した。免疫染色のためには、まず、切片を７０％のメタノールで−２０℃にて１０分間膜透過処理をし、ＰＢＳで洗浄後、ブロッキング・バッファー（ＰＢＳ中に３％ヤギ血清、３％牛アルブミンを含有）に１５分間浸した。次いで、抗ＡＬＤＨ２抗ウサギ血清（１／１００容量）とミトコンドリアに局在するＨＳＰ６０に特異的な抗ＨＳＰ６０抗体（１／１００容量；医学生物研究所製、名古屋）を含むブロッキング・バッファーに切片を３７℃に１時間浸した。これをＰＢＳで３回洗浄した後に、抗マウスＩｇＧ ＢＯＤＩＰＹ（１／１００容量；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）と抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（１／１００容量；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を含むブロッキング・バッファーに切片を室温にて１時間浸した。次いで、ＰＢＳにて３回洗浄した後に５μＭのヨウ化プロピジウムに５分間漬けることで核を染色し、ＰＢＳで洗浄後ＰＥＲＭＡＦＬＯＵＲで一晩固定して観察用スライドとした。Ｃ２とＣ５７ＢＬ／６マウスの切片を共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社製、東京）で観察した結果を図９に示す。Ｃ５７ＢＬ／６の切片では、抗ＨＳＰ６０抗体陽性のミトコンドリアで抗ＡＬＤＨ２抗体陽性像が得られ、ＡＬＤＨ２がミトコンドリアに局在していた。これに対しＣ２の切片では、抗ＡＬＤＨ２抗体陽性像は筋細胞全体に認められ、顆粒状となっていることがわかる。
組織化学的染色ではＧｏｍｏｒｉトリクローム変法を行った。新鮮凍結切片をＨａｒｒｉｓヘマトキシリン液に１０分間漬けた後に水洗を１０分間行い、次いでＧｏｍｏｒｉ液に２０分間浸した。０．２％酢酸で少し洗浄した後、脱水、透徹、カナダバルサムにて封入した。染色像を図１０に示す。Ｃ５７ＢＬ／６と６３５マウスの切片では正常な染色像が見られたが、６２９マウスの切片では一部、Ｃ２マウスの切片では半分以上の筋細胞で、ミトコンドリアが増殖し集積したときに見られる赤色ボロ繊維が認められた。また、新鮮凍結切片をＰＢＳ中にミトコンドリアを特異的に染色する蛍光色素ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（１μＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を含む溶液で１０分間染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（図１１）。その結果、６２９及びＣ２マウスでは筋細胞内に顆粒状に染色像が見られ、Ｇｏｍｏｒｉトリクローム変法で見られたミトコンドリアの異常集積を確認することができた。
実施例１４：大腿筋の過酸化脂質量測定
Ｃ２およびＣ５７ＢＬ／６マウスから大腿筋を取り出し、即座に液体窒素で凍結後、−８０℃で保存した。凍結した臓器は、ハンマーを用いて細断した後に臓器１００ｍｇに対してＴＮバッファーを１ｍｌとなるように添加した。これをＰＯＬＹＴＲＯＮで破砕し、さらに１／４量の１０％ ＳＤＳを加えてから超音波処理し、遠心、その上清をとり、抽出タンパク量が１０ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。この抽出液２００μｌを用いて、ＢＩＯＸＹＴＥＣＨ ＬＰＯ−５８６キット（Ｏｘｉｓ Ｒｅｓｅａｃｈ社製、）にてｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ（ＭＤＡ）量とＭＤＡと４−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋｅｎａｌｓ（４−ＨＡＥ）の総量の２種類をキット製造者のマニュアルに記載の方法で測定した。その結果、Ｃ２マウス大腿筋ではＣ５７ＢＬ／６と比較して、ＭＤＡ量及びＭＤＡ＋４−ＨＡＥ総量のいずれも増加しており、また、ＭＤＡ＋４−ＨＡＥ総量からＭＤＡ量を差し引いて求めた４−ＨＡＥ量も増加していた（図１２）。この結果は、大腿筋で発現させたＡＬＤＨ２＊２によりＡＬＤＨ２活性が低下し、酸化ストレスが増加したことを示している。また、Ｃ２マウスで見られる筋の萎縮は、この酸化ストレスの増加がもたらしたものと考えられる。
実施例１５：Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの解析
ホモの１０３３−７マウスについて解析を行ったところ、以下の所見を得た。まず、雄については生後３ヶ月で体毛の脱色が見られた（図１３）。また、雄および雌のいずれにおいても運動量低下、ふるえ、視覚異常、筋力低下がみとめられた。すなわち、このマウスでは老化が促進され、また中枢神経系に異常が生じている。
実施例１６：神経伝導速度の低下
雌のヘテロＣ２マウスとＣ５７ＢＬ／６マウスについて、後肢の運動神経について伝達速度を測定した。測定した結果を図１４に示す。この結果から、トランスジェニック・マウスでは、糖尿病に特徴的な神経伝導速度の低下が認められた。
実施例１７：糖負荷後の血糖値の上昇
２５週齢のヘテロＣ２マウスとＣ５７ＢＬ／６マウスについて２ｇ／ｋｇのグルコースを腹腔投与した。投与０、１５、３０、６０、９０、および１２０分後に目から採血し、血糖値を市販のキット（ニプロフリースタイルセンサー、ニプロ社、大阪）を用いて測定した。その結果を図１５に示す。Ｃ２マウスは、雄および雌のいずれについてもコントロールのＣ５７ＢＬ／６マウスを上回る高い血糖値を示し、このマウスが糖尿病となっている所見を得た。
実施例１８：背骨の湾曲と骨密度の低下
ホモおよびヘテロのＣ２マウスとＣ５７ＢＬ／６マウスについて、３８ｋＶｐにて０．０３秒間レントゲン照射することで骨の解析を行った。その結果、１２週齢においてヘテロ及びホモのＣ２マウスは背骨が湾曲しており、ヘテロマウスは年齢の進行とともにその湾曲が増大している（図１６Ａ）。また、Ｘ線フィルムに投影された骨の画像について、その濃淡を測定することで相対的な骨密度を求めた。その結果、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに比してホモのＣ２マウスは有意に骨密度が低下していた（図１６Ｂ）。
実施例１９：Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウス脳神経細胞の酸化ストレスに対する抵抗性の低下
大脳皮質神経細胞を培養するために、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウスである１０３３−７系統のホモで維持されている雌雄を掛け合わせて妊娠１８日目の胎児を取り出した。胎児は氷冷したＰＢＳ入りシャーレに移し、脳を取り出した後に実体顕微鏡下で大脳皮質を切り出し、髄膜を剥がした。これをカミソリの刃で細断して、一腹分の胎児より取り出した大脳皮質片につき、５ｍｌの０．２５％トリプシンで懸濁し、３７℃で時々揺すりながら１０分間消化して０．２５ｍｌの０．０１％ ＤＮａｓｅＩを加え、転倒混和してＤＮＡを切断後にトリプシン阻害剤として馬血清５ｍｌを添加し、ピペットで軽く混和した。遠心して上清を除去後、沈殿した細胞を５ｍｌの培地（ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）にＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（２９２ｍｇ／ｌ）、ペニシリン、ストレプトマイシン、ＩＴＳ ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、プトレシン（Ｓｉｇｍａ社製）を含む）で懸濁した。細胞は、ポリ−Ｌ−リジンでコートした培養皿に２ｘ１０５個／ｃｍ２となるように撒き、１日間培養した。この細胞に酸化ストレスに対する抵抗性を調べる目的として各濃度の４−ＨＮＥを含む培地を添加し、さらに１日間培養した後に生細胞数をカウントした。この時、生着しており多角形の細胞体と神経突起を有する細胞を生細胞と判定した。Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウスから調製した大脳皮質初代培養細胞は、同じ方法でＣ５７ＢＬ／６マウスから調製した細胞に比べて、より低濃度の４−ＨＮＥで細胞死が促進された（図１７）。また、これらの細胞を４％パラフォルムアルデヒドで室温３０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄後０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理、再度ＰＢＳで３回洗浄後、ブロッキング・バッファー（ＰＢＳ中に３％ヤギ血清、３％牛アルブミンを含有）に１５分間浸した。次いで、神経細胞特異的な抗ＴＵＪ−１抗体（１／５００容量；Ｓｉｇｍａ社製）または、抗４−ＨＮＥ抗体（１／１００容量；日本老化制御研究所製、静岡）を含むブロッキング・バッファーに３７℃１時間浸し、ＰＢＳで３回洗浄後に抗マウスＩｇＧ ＢＯＤＩＰＹ（１／５００容量；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）を含むブロッキング・バッファーに室温１時間浸し、ＰＢＳで３回洗浄後に共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社製）で観察した。抗ＴＵＪ−１抗体による染色（図１８）から、図１７で観察した細胞は成熟神経細胞であり、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウスの神経細胞はＣ５７ＢＬ／６マウスの神経細胞に比べて、より低濃度の４−ＨＮＥで細胞死が促進されることが示された。さらに抗４−ＨＮＥ抗体による染色像をＮＩＨ Ｉｍａｇｅソフトウエア（ＮＩＨ製、ＭＤ，ＵＳＡ）で解析することで、染色強度をグラフ化した（図１９）。その結果、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウスの神経細胞では、４−ＨＮＥがより蓄積しやすいことが明らかとなった。このことは、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウスの脳由来の神経細胞でＡＬＤＨ２活性が低下した結果、脂質の過酸化により生じる反応性アルデヒドである４−ＨＮＥを解毒する能力が低下して、酸化ストレスによる神経細胞死が促進されたことを示している。酸化ストレスは加齢に伴って増大することから、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウス脳は加齢に伴う傷害をより受けやすく、アルツハイマー病などのモデル動物としての活用が期待できる。
実施例２０：Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウス筋萎縮にたいするビタミンＥ添加食投与の効果
ビタミンＥは広範に使用されている抗酸化物質であり、アルツハイマー病においてもその予防効果があることが良く知られている。そこで、本発明のＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスが、抗酸化剤などの薬効を調べるためのモデル動物となりうるか、ビタミンＥ添加食を投与することで調べた。ビタミンＥ添加食は、粉末飼料（ＭＦマウス・ラット・ハムスター飼育用実験動物飼料；オリエンタル酵母工業製、東京）に１００ｇあたり３ｇの（±）−α−トコフェノール（Ｗａｋｏ製、東京）を添加し、よく混和することで作製した。これを生後７週のヘテロＣ２マウス雄５匹に与え、以降６ヶ月間にわたって週１回体重を測定した。その結果、ビタミンＥ添加食群のマウスは、未添加の飼料（普通食）を与えた群に比較して体重の増加が認められた（図２０）。また、そのときの各マウスの実施例１２と同様に下肢筋断面積を測定し比較したところ、ビタミンＥ添加食群のマウスでは筋断面の増加しており（図２１）、ビタミンＥの筋萎縮阻害効果が認められた。この結果は、ＡＬＤＨ２活性低下に伴う筋での酸化ストレス増加をビタミンＥが抑制したことを示しており、ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスが抗酸化物質などの薬効を調べるうえで有効なモデルであることが示された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明によるトランスジェニック動物は、老化および老化関連疾患、特にアルツハイマー病、骨粗鬆症、筋萎縮症、眼疾患、白髪、生殖器異常などのモデル動物として利用できる。本発明による老化関連疾患モデル動物は、酸化ストレスに起因する老化関連疾患の治療および／もしくは予防のための薬剤または方法の開発に貢献し得るものである。また、本発明のトランスジェニック動物は、あらゆる加齢とともに認められる症状の改善するための方法および薬剤の開発にも有用である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【技術分野】
本発明は、老化および老化関連疾患、特にアルツハイマー病を含む神経変性疾患、糖尿病、眼疾患、白髪、生殖器の異常、筋萎縮および骨粗鬆症、またはミトコンドリア病のモデル動物に関する。
【背景技術】
老化とともに、さまざまな老化関連疾患の発症リスクが上昇することがわかっており、これらの疾患の治療および／または予防のための薬剤ならびに方法の開発が急務であるが、この開発には、ヒトにおける症状をできるだけ忠実に表すモデル動物を利用する必要がある。
これらのモデル動物作製における代表的な技術として、その疾患における発症機序のトリガーとなる遺伝子をトランスジェニック動物作製技術を用いて導入するなどの手法がある。
種々の老化関連疾患の中で、アルツハイマー病等を含む神経変性疾患は、その発症および進行の機序が未だ完全には解明されていないことが、神経変性疾患モデル動物の開発に支障となっている。
アルツハイマー病モデルトランスジェニック動物としては、我が国特許出願特開平７−１３２０３３号「アルツハイマー病モデルトランスジェニック動物」が公知である。しかしながら、該トランスジェニック動物は、βアクチンプロモーターを用いて変異βアミロイド前駆体タンパク質を核内に高発現させることにより、細胞内でのβアミロイドの蓄積を促進させたものである。βアミロイドの産生および蓄積は、アルツハイマー病で病理学上認められるが、これが発症機序におけるトリガーとして寄与しているという確証は得られておらず、また、βアミロイドが発症機序に関与しているアルツハイマー病は、アルツハイマー病患者の約１割程度であるとする説もある。したがって、この学説からしても、βアミロイドトランスジェニック動物は、アルツハイマー病のモデル動物としての適用範囲が狭く、該動物をもってアルツハイマー病の治療および／または予防のための薬剤および方法の開発に十分であるとは言えない。
アルツハイマー病以外の老人性神経変性疾患のモデル動物もまた、未だ開発途上であり、その発症機序の解明とともに、モデル動物の開発も待たれている。
また、他の老化関連疾患として、骨粗鬆症を挙げることができるが、骨粗鬆症のモデル動物としては、現在のところ、低カルシウム食モデル、卵巣摘出モデル、プレドニゾロン投与モデル等が公知である。しかしながら、これらの動物が、完全な骨粗鬆症モデルであるという確証はない。したがって、公知のトランスジェニック動物とは異なるアプローチにより作製された骨粗鬆症モデル動物を開発し、かかるモデル動物を利用してその発症機序の解明、ならびに治療および／または予防法等の開発を進めることが必要とされている。
その他には、老化関連疾患として糖尿病を挙げることができる。糖尿病もまた他の老化関連疾患と同じく、その発症機序の解明、ならびに治療および／または予防法等の開発を進めることが必要とされている。糖尿病のモデル動物は、複数種のものが知られているが、これらが完全な糖尿病モデルであるという確証はない。したがって、公知のトランスジェニック動物とは異なるアプローチにより作製された糖尿病モデル動物は、その発症機序の解明等に有用である。
老化関連疾患とは別にミトコンドリアの機能障害によって生じるミトコンドリア病もまた多種の病因からなる疾患である。特に筋と中枢神経系に主症状が現れる疾患はミトコンドリア脳筋症と総称される。ミトコンドリア病の多くは、ミトコンドリアＤＮＡ及びミトコンドリアに関連する核ＤＮＡの異常が原因とされている。しかし、病因から病態へと至るプロセスについては不明な点が多い。特にミトコンドリアは活性酸素を発生し、酸化ストレスの影響を受けやすいオルガネラであり、これが様々な病態と結びついている可能性が高い。こうした観点から、ミトコンドリア病発症機序の解明、ならびに治療および／または予防法等の開発を進める為のモデル動物の作製が試みられている（例えば、特表平９−５１１３９８、および特表２００３−５０９０７１号公報など参照のこと）。
一方、ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）の欠損が、アポリポタンパク質Ｅのε４遺伝子座と相乗的に働いて、老年性アルツハイマー病（ＡＤ）の危険因子となり得ることを本発明者らはすでに報告している（特開２００１−２９９３９７）。
ＡＬＤＨ２は、アルコールから生成するアルデヒドをカルボン酸に代謝する酵素であり、生体内におけるアセトアルデヒドの酸化に重要な役割を有している（Ｂｏｓｒｏｎ Ｗ．Ｆ．ａｎｄ Ｌｉ Ｔ．Ｋ．（１９８６）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ａｌｃｏｈｏｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．６，５０２−５１０．）。ヒトにおいては、その変異対立遺伝子であるＡＬＤＨ２＊２は、ＡＬＤＨ２＊１遺伝子の第１２エキソン内に１つの点突然変異（Ｇ／Ａ）を有するものであり、これはアジア系人種に限られる（Ｙｏｓｈｉｄａ Ａ．，Ｈｕａｎｇ Ｉ．Ｙ．ａｎｄ ｌｋａｗａ Ｍ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｂｎｏｒｌｎａｌｉｔｙ ｏｆ ａｎｉｎａｃｔｉｖｅ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｖａｒｉａｎｔ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｆｏｕｎｄ ｉｎ Ｏｒｉｅｎｔａｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８１，２５８−２６１．）
）。この変異により、４８７位のグルタミン酸がリジンに置換され（Ｅ４８７Ｋ）、ドミナント・ネガティブとして作用する（Ｃｒａｂｂ Ｄ．Ｗ．，Ｅｄｅｎｂｅｒｇ Ｈ．Ｊ．，Ｂｏｓｒｏｎ Ｗ．Ｆ．ａｎｄ Ｌｉ Ｔ．Ｋ．（１９８９）Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｆｏｒ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ａｌｃｏｈｏｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅ ｉｎａｃｔｉｖｅ ＡＬＤＨ２（２）ａｌｌｅｌｅ ｉｓ ｄｏｍｉｎａｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３，３１４−３１６．Ｓｉｎｇｈ Ｓ．，Ｆｒｉｔｚｅ Ｇ．，Ｆａｎｇ Ｂ．Ｌ．，Ｈａｒａｄａ Ｓ．，Ｐａｉｋ Ｙ．Ｋ．，Ｅｃｋｅｙ Ｒ．，Ａｇａｒｗａｌ Ｄ．Ｐ．ａｎｄ Ｇｏｅｄｄｅ Ｈ．Ｗ．（１９８９）Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｎａｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ，Ｊａｐａｎｅｓｅ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ａｌｌｅｌｅ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．８３，１１９−１２１．Ｘｉａｏ Ｑ．，Ｗｅｉｎｅｒ Ｈ．ａｎｄ Ｃｒａｂｂ Ｄ．Ｗ．（１９９６）Ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡＬＤＨ２）ｇｅｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ａｌｃｏｈｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｌｕｓｈｉｎｇ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ ｉｎ ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｆａｓｈｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８，２０２７−２０３２．）
）。ＡＬＤＨ２＊２対立遺伝子を有する個体は、アルコール赤面症候群（Ａｌｃｏｈｏｌ ｆｌｕｓｈｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を示し、血中アセトアルデヒド値が増加する（Ｇｏｅｄｄｅ Ｈ．Ｗ．，Ｈａｒａｄａ Ｓ．ａｎｄ Ａｇａｒｗａｌ Ｄ．Ｐ．（１９７９）Ｒａｃｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ａｌｃｏｈｏｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ：ａ ｎｅｗ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５１，３３１−３３４．Ｃｒａｂｂ Ｄ．Ｗ．（１９９０）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５，３１１−３１５．）
）。また、ＡＬＤＨ２＊２対立遺伝子は、トルエンの代謝産物であるベンズアルデヒドなどの他のアルデヒドおよびビニルクロライドの代謝の際に生成するクロロアセトアルデヒドの代謝にも作用しているとの報告がある（Ｋａｗａｍｏｔｏ Ｔ．，Ｍａｔｓｕｎｏ Ｋ．，Ｋｏｄａｍａ Ｙ．，Ｍｕｒａｔａ Ｋ．ａｎｄ Ｍａｔｓｕｄａ Ｓ．（１９９４）ＡＬＤＨ２ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｔｏｌｕｅｎｅ．Ａｒｃｈ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ．４９，３３２−３３６．Ｆａｒｒｅｓ Ｊ．，Ｗａｎｇ Ｘ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ．，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ｓ．Ｊ．，Ｗａｎｇ Ｔ．Ｔ．ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ Ｈ．（１９９４）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ４８７ ｔｏ ｌｙｓｉｎｅ ｉｎ ｒａｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ａ ｍｏｄｅｌ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｈｕｍａｎ（Ｏｒｉｅｎｔａｌ ｔｙｐｅ）ｃｌａｓｓ ２ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１３８５４−１３８６０．Ｙｏｋｏｙａｍａ Ａ．，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｔ．，Ｏｈｍｏｒｉ Ｔ．，Ｍａｋｕｕｃｈｉ Ｈ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｓ．，Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ Ｓ．，Ｙｏｓｈｉｎｏ Ｋ．，Ｍａｒｕｙａｍａ Ｋ，，Ｎａｋａｎｏ Ｍ．ａｎｄ Ｉｓｈｉｉ Ｈ．（１９９６）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ａｎｄ ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ｕｐｐｅｒ ａｅｒｏｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｔｒａｃｔ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−２ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ａｌｃｏｈｏｌｉｃｓ．Ｃａｎｃｅｒ．７７，１９８６−１９９０．）。
活性酸素種（ＲＯＳ）により生ずる酸化ストレスおよび過酸化反応は、ＡＤ（Ｌｏｖｅｌｌ Ｍ．Ａ．，Ｅｈｍａｎｎ Ｗ．Ｄ．，Ｍａｔｔｓｏｎ Ｍ．Ｐ．ａｎｄ Ｍａｒｋｅｓｂｅｒｙ Ｗ．Ｒ．（１９９７）Ｅｌｅｖａｔｅｄ ４−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ ｉｎ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ．１８，４５７−４６１．Ｍａｒｋ Ｒ．Ｊ．，Ｐａｎｇ Ｚ．，Ｇｅｄｄｅｓ Ｊ．Ｗ．，Ｕｃｈｉｄａ Ｋ．ａｎｄ Ｍａｔｔｓｏｎ Ｍ．Ｐ．（１９９７）Ａｍｙｌｏｉｄ ｂ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｍｐａｉｒｓ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ａｎｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，１０４６−１０５４．）、パーキンソン病（ＰＤ）（Ｄｅｘｔｅｒ Ｄ．Ｔ．，Ｈｏｌｌｅｙ ＡＥ．，Ｆｌｉｔｔｅｒ Ｗ．Ｄ．，Ｓｌａｔｅｒ Ｔ．Ｆ．，Ｗｅｌｌｓ Ｆ．Ｒ．，Ｄａｎｉｅｌ Ｓ．Ｅ．，Ｌｅｅｓ ＡＪ．，Ｊｅｎｎｅｒ Ｐ．ａｎｄ Ｍａｒｓｄｅｎ Ｃ．Ｄ．（１９９４）Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ：ａｎ ＨＰＬＣ ａｎｄ ＥＳＲ ｓｔｕｄｙ．Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ．９，９２−９７．）、筋性側索硬化症（ａｍｙｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）および脳虚血（Ｃｈａｎ Ｐ．Ｈ（２００１）Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ．Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．２１，２−１４．）などの神経変性疾患の原因に深く関与していることが報告されている。主要なＲＯＳは、ミトコンドリアのスーパーオキシドアニオンラディカルに由来し、これが不飽和多価脂肪酸を攻撃することによって膜脂質の過酸化反応が起こり、４−ヒドロキシ−２−ノネナール（４−ＨＮＥ）およびマロンジアルデヒドなどの反応性アルデヒドが生成する。該４−ＨＮＥは求電子試薬であり、細胞内タンパク質に吸着して、該タンパク質内のリジン、ヒスチジン、セリンおよびシスティン残基と相互作用してタンパク質を変性させ得る。ＡＤまたはＰＤ患者の脳組織の免疫染色によると、神経変性に伴う４−ＨＮＥにより修飾されたタンパク質が増加している（Ｍｏｎｔｉｎｅ Ｋ．Ｓ．，Ｏｌｓｏｎ Ｓ．Ｊ．，Ａｍａｒｎａｔｈ Ｖ．，Ｗｈｅｔｓｅｌｌ Ｗ．Ｏ．Ｊｒ．，Ｇｒａｈａｍ Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｏｎｔｉｎｅ Ｔ．Ｊ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎｏｎｅｎａｌ ａｄｄｕｃｔｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ＡＰＯＥ４．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０，４３７−４４３．Ｙｏｒｉｔａｋａ Ａ．，Ｈａｔｔｏｒｉ Ｎ．，Ｕｃｈｉｄａ Ｋ．，Ｔａｎａｋａ Ｍ．，Ｓｔａｄｔｍａｎ Ｅ．Ｒ．ａｎｄ Ｍｉｚｕｎｏ Ｙ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ４−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｄｄｕｃｔｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３，２６９６−２７０１．Ｓａｙｒｅ Ｌ．Ｍ．，Ｚｅｌａｓｋｏ Ｄ．Ａ．，Ｈａｒｒｉｓ Ｐ．Ｌ．，Ｐｅｒｒｙ Ｇ．，Ｓａｌｏｍｏｎ Ｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ Ｍ．Ａ（１９９７）４−Ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｄｖａｎｃｅｄ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６８，２０９２−２０９７．）。
【発明の開示】
本発明は、酸化ストレスによる老化症状を反映する新規な老化関連疾患モデル動物を提供するものであり、特に、アルツハイマー病をはじめとする老化に関連する神経変性疾患および糖尿病、骨粗鬆症、さらにはミトコンドリア病の新規モデル動物を提供する。
上記の知見に基づき、本発明者らは、ＡＬＤＨ２＊２対立遺伝子を導入することによりアルツハイマー病疾患モデルとなるトランスジェニック動物が作成できると考え、本発明を完成させるに至った。また、該トランスジェニック動物は、神経変性疾患、糖尿病、骨粗鬆症、筋萎縮症、眼疾患等、老化関連およびミトコンドリア関連疾患様の形態を示すことが判明した。
また、本発明者らは、神経細胞死におけるＡＬＤＨ２酵素活性の役割を培養細胞を用いて検討したところ、ＡＬＤＨ２活性欠損株は酸化ストレスによって生じる４−ＨＮＥの解毒能が低下し、細胞死が促進されることを見いだした（Ｏｈｓａｗａ Ｉ．，Ｎｉｓｈｉｍａｋｉ，Ｋ．，Ｙａｓｕｄａ Ｃ．，Ｋａｍｉｎｏ Ｋ．ａｎｄ Ｏｈｔａ Ｓ．（２００３）Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ａ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ＰＣ１２ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｎｅｕｃｈｅｍ．８４，１１１０−１１１７．）。この結果から、ＡＬＤＨ２の活性欠損型がアルツハイマー病やパーキンソン病などの老化関連神経変性疾患の危険因子となるのは、この欠損により酸化ストレスに対する抵抗性が低下しているためと考えることができる。
したがって、本発明は、以下の：
１． ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）遺伝子の活性をドミナント・ネガティブに抑制する不活性型ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２＊２）をコードする遺伝子を、非ヒト脊椎動物に導入することによる早期老化、老化関連疾患および／またはミトコンドリア病の症状を示すトランスジェニック動物；
２． 老化関連疾患が神経変性疾患、糖尿病または骨粗鬆症である、上記１記載のトランスジェニック動物；
３． 不活性型ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２＊２）遺伝子がマウスに由来するものである、上記１または２に記載のトランスジェニック動物；
４． 非ヒト脊椎動物がマウスである、上記１〜３のいずれかに記載のトランスジェニック動物：
５． プロモーターを上記ＡＬＤＨ２＊２遺伝子に対して機能し得る形で連結させて用いる、上記１〜４のいずれかに記載のトランスジェニック動物；
６． プロモーターがＥＦプロモーターである、上記５記載のトランスジェニック動物；
７． プロモーターがアクチンプロモーターである、上記５記載のトランスジェニック動物；
８． ＡＬＤＨ２＊２遺伝子を、非ヒト脊椎動物に導入することによる、早期老化、老化関連疾患および／またはミトコンドリア病のモデルとなるトランスジェニック動物の作製方法；
９． 老化関連疾患が神経変性疾患、糖尿病または骨粗鬆症である、上記８記載のトランスジェニック動物の作製方法；
１０． 不活性型ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２＊２）遺伝子がマウスに由来するものである、上記８または９に記載のトランスジェニック動物の作製方法；
１１． 非ヒト脊椎動物がマウスである、上記８〜１０のいずれかに記載のトランスジェニック動物の作製方法；
１２． プロモーターを上記ＡＬＤＨ２＊２遺伝子に対して機能し得る形で連結させて用いる、上記８〜１１のいずれかに記載のトランスジェニック動物の作製方法；
１３． プロモーターがＥＦプロモーターである、上記１２記載のトランスジェニック動物の作製方法；
１４． プロモーターがアクチンプロモーターである、上記１２記載のトランスジェニック動物の作製方法；
１５． 老化関連疾患またはミトコンドリア病を制御する物質を、上記１〜７のいずれかに記載のトランスジェニック動物を用いてスクリーニングする方法であって、
１） 上記動物に試験する物質を投与、または上記動物を試験する物質に曝露すること、
２） 上記動物の老化、老化関連疾患またはミトコンドリア病の症状の促進または抑制を確認すること、
を含む、上記方法；
１６． 上記動物の老化または老化関連疾患の症状を確認することが、上記物質を投与、または上記物質に曝露した上記動物が、投与または曝露を受けていない対照の動物に比べて、筋萎縮、背骨の湾曲、骨密度の低下、体毛の脱色、糖負荷試験により検出される高血糖値の持続、または神経伝導速度低下のうちの少なくともいずれか１つを促進または抑制されていることを確認することである、上記１５記載の方法；
１７． 上記筋萎縮を促進または抑制されていることを確認することが、筋組織の断面積測定、筋組織の筋密度測定、または筋組織の免疫染色のいずれかにより実施される、上記１６記載の方法；
１８． 上記酸化ストレスに対する抵抗性の低下を促進または抑制されていることを確認することが、上記動物から単離した組織由来の細胞が４−ＨＮＥに対する抵抗性が減少または増大していることにより実施される、上記１６記載の方法；
１９． 上記動物から単離した組織由来の細胞が中枢神経系由来のニューロンである、上記１８記載の方法；
２０． 老化関連疾患またはミトコンドリア病を制御する物質を、上記１〜７のいずれかに記載のトランスジェニック動物より単離した組織由来の細胞を用いてスクリーニングする方法であって、
１） 上記細胞を試験する物質に曝露すること、
２） 上記動物の老化、老化関連疾患またはミトコンドリア病の症状の促進または抑制を確認すること、
を含む、上記方法；
に関する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−３０７４９０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、アクチンプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック・マウスの各組織におけるＡＬＤＨ２＊２の発現を確認したウェスタンブロットの結果である。
図２は、アクチンプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの３系統（Ｃ２，６２９および６３５）について、ＡＬＤＨ２活性の測定結果を示す。
図３は、アクチンプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスＣ２および６２９の２系統について、生後から１５週目までの体重を測定した結果を示す（右図）。左図は皮を除去したマウスの画像である。Ｃ２マウスでは全身の筋肉が減少している。
図４は、１０週齢メスのヘテロＣ２マウスと野生型Ｃ５７ＢＬ／６について、脳、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、大腿筋の重量を比較した結果を示す。
図５は、Ｃ２マウスとＣ５７ＢＬ／６の１２週齢メスの下肢切片のヘマトキシリン・エオジン染色結果を示す。
図６は、Ｃ２マウスとＣ５７ＢＬ／６の１２週齢メスの下肢切片のヒラメ筋断面積測定結果を示す。
図７は、Ｃ２マウスとＣ５７ＢＬ／６の１２週齢メスの下肢切片の単位面積あたりのヒラメ筋細胞数をカウントした結果を示す。
図８は、Ｃ２マウスとＣ５７ＢＬ／６の１２週齢メスの下肢切片のヒラメ筋細胞総数をカウントした結果を示す。
図９は、Ｃ２とＣ５７ＢＬ／６マウスの下肢切片をレーザー顕微鏡で観察した結果を示す。
図１０は、Ｃ２とＣ５７ＢＬ／６マウスの下肢切片のＧｏｍｏｒｉトリクローム変法による組織化学的染色像を示す。
図１１は、Ｃ２とＣ５７ＢＬ／６マウスの下肢切片の蛍光色素ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ染色による染色像を示す。
図１２は、大腿筋の過酸化脂質量を、ＢＩＯＸＹＴＥＣＨ ＬＰＯ−５８６キットによるＭＤＡ量及びＭＤＡ＋４−ＨＡＥの測定結果を示す。
図１３は、３ヶ月齢のホモの１０３３−７マウスの写真である。
図１４は、Ｃ２とＣ５７ＢＬ／６マウスの神経伝導速度測定結果を示す。
図１５は、Ｃ２とＣ５７ＢＬ／６マウスの糖負荷試験結果を示す。
図１６は、Ｃ２マウスの背骨湾曲を示すレントゲン写真（Ａ）と骨密度の低下（Ｂ）を示す。
図１７は、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウス大脳皮質初代培養神経細胞に４−ＨＮＥを添加したときの生存細胞数を示す。
図１８は、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウス大脳皮質初代培養神経細胞に４−ＨＮＥを添加後、抗ＴＵＪ−１抗体陽性となる神経細胞の写真である。
図１９は、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウス大脳皮質初代培養神経細胞に４−ＨＮＥを添加後、抗４−ＨＮＥ抗体で染色することで、４−ＨＮＥの蓄積を測定した結果である。
図２０は、Ｃ２ヘテロの雄にビタミンＥ添加食を与えたときの体重増加を経時的に示す。
図２１は、Ｃ２ヘテロの雄にビタミンＥ添加食を与えたときの筋断面積増加を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
本明細書中、「不活性型ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２」とは、ＡＬＤＨ２遺伝子内に１つ以上の点突然変異（Ｇ／Ａ）を有し、この変異によりミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２の活性をドミナント・ネガティブに抑制することのできる変異タンパク質のことを指す。ヒトにおいてはＡＬＤＨ２遺伝子の第１２エキソン内に１つ以上の点突然変異（Ｇ／Ａ）を有し４８７位のグルタミン酸がリジンに置換（Ｅ４８７Ｋ）されているＡＬＤＨ２＊２を指す。本発明のトランスジェニック動物は、該不活性型酵素遺伝子が高レベルで発現することにより、ドミナント・ネガティブとしてミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２活性を抑制し、酸化ストレスが蓄積する。
動物の用意、微量注入法、注入された受精卵の再移植、仮親の維持、及びトランスジェニック・マウス系統の回収と維持に関する詳細な方法は、Ｇｏｒｄｏｎ，ＪとＲｕｄｄｌｅ，Ｆ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１，４１１−４３３（１９８３）、ＢｒｉｎｓｔｅｒらＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，４４３８−４４４２（１９８５）、及びＢｒｉｎｓｔｅｒらＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５，８３６−８４０（１９８８）に従えばよい。
ＡＬＤＨ２＊２遺伝子は、天然に存在する遺伝子を、その個体に由来する組織から単離することもでき、またＡＬＤＨ２遺伝子を常法にしたがって適当な動物種からクローニングし、アミノ酸残基を置換する変異を導入することで得ることもできる。たとえば、ヒトＡＬＤＨ２の４８７位のグルタミン酸に相当するマウスＡＬＤＨ２遺伝子（マウスＡＬＤＨ２ｃＤＮＡを配列番号１に示している）の５０６番目のアミノ酸残基グルタミン酸をコードするコドンＧＡＡを点突然変異誘発法、二段階ＰＣＲ法等を用いて、リジンをコードするコドン（例えば、ＡＡＡ）に変異させることにより得ることができる。さらに他には、ＤＮＡ合成により得ることも可能である。この変異導入は、適切なベクター（プラスミド、ウイルスＤＮＡなど）を用いて行われる。例えば、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等を用いることができる。こうして得られた変異遺伝子（すなわち、ＡＬＤＨ２＊２遺伝子）と、適切な発現プロモーターおよび／またはエンハンサーとを、プロモーターおよび／またはエンハンサーが該遺伝子に対して機能し得る形で連結するように挿入する。本発明の適切な発現プロモーターは、通常の遺伝子組換技術で使用される発現プロモーターであり、特に限定されるものではないが、例えば、恒常型プロモーターの例として、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、Ｌｃｋキナーゼの遠位プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）などが挙げられる。また、誘導型のプロモーターの例としては、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターなどが挙げられる。以上のようなプロモーターを有する発現ベクターは、いずれも市販されているか、または公的な機関から入手できる。市販されている場合は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社などから購入することができる。また、部位特異的発現プロモーター、例えば、筋組織で高発現するプロモーターであるアクチンプロモーター、神経特異的プロモーターであるＴα１遺伝子プロモーター（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１６：１９６−２０１，１９９８）など、対象とする遺伝子を発現させたい部位に応じて、その部位に特異的な発現プロモーターを使用することは、当業者には容易に達成でき得る。
あるいはまた、エンハンサー配列を、機能し得る形で対象とする遺伝子と連結させることもできる。本発明において適切なエンハンサー配列とは、特に限定されるものではないが、例えば、ＳＶ４０エンハンサー、ポリオーマウイルスエンハンサー、ＭｏＭｕＬＶエンハンサー、ＭｏＭｕＳＶエンハンサー、ＡＫＶエンハンサー、ＳＬ３−３エンハンサー、ＨＰＶのＩＥ２またはＩＥ６エンハンサー、ＨＢＶエンハンサー、ＨＣＭＶエンハンサー等のウイルスエンハンサー、例えば、ＩｇＨエンハンサー、ＩｇＬエンハンサー、Ｔ細胞レセプターα鎖エンハンサー、ＨＬＡＤＱαおよびβ遺伝子エンハンサー、β−ＩＦＮエンハンサー、ＩＬ−２エンハンサー、ＩＬ−２Ｒエンハンサー等の免疫系遺伝子のエンハンサー、例えば、β−アクチンエンハンサー、ＭＣＫエンハンサー、プレアルブミン遺伝子エンハンサー、エラスターゼＩ遺伝子エンハンサー、メタロチオネイン遺伝子エンハンサー等の細胞エンハンサー等が挙げられる。当業者であれば、目的に応じて、適切なものを選択して用いることができる。
上述にしたがって、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列に連結されたＡＬＤＨ２＊２遺伝子を、非ヒト脊椎動物に導入するためのトランスジェニック技術は、公知である。非ヒト脊椎動物としては、技術的には全ての動物種を対象とすることが可能である。したがって、本発明のトランスジェニック動物は、あらゆる脊椎動物であり得る。脊椎動物のなかでも、特にニワトリ等の鳥類、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウサギ等の哺乳類が好ましく、マウスの他、ラット、モルモットをはじめとするあらゆる囓歯動物がさらに好ましい。特に近交系が多数作出されており、しかも受精卵の培養、体外受精等の技術が整っている点で、マウスが特に好ましい。全能性細胞（マウスの場合、受精卵や初期胚が好ましい）に公知の遺伝子導入法により目的とする遺伝子を導入する。該遺伝子導入法は、例えば、マイクロインジェクション法（Ｇｏｒｄｏｎ Ｊ．およびＲｕｄｄｌｅ Ｆ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８３など参照のこと）あるいはウイルスを介して感染させる方法を用いることができる。遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管または子宮に移植され、出生された動物を飼育した後、体の一部（尾部先端等）からＤＮＡを抽出し、サザン解析やＰＣＲ法等により、導入した遺伝子の存在を確認する。導入した遺伝子の存在が確認された個体（ヘテロ接合体）を初代（Ｆｏｕｎｄｅｒ：ＦＯ）とすれば、導入遺伝子はその子（Ｆ１）の５０％に伝達される。さらに、このＦ１個体の雌雄を交配させることにより、２倍体染色体の両方に導入遺伝子を有する個体（Ｆ２）を作成することができる。
このようにして得られたＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物は、１種または複数の老化関連疾患およびミトコンドリア病形質を示し得る。
本明細書中、「老化関連疾患」とは、老年性神経変性疾患（アルツハイマー病、老人性痴呆症、パーキンソン氏病、網膜変性疾患など）、糖尿病、筋萎縮症、骨粗鬆症、視聴覚障害など、加齢とともに発症するという傾向のある疾患の総称として用いる。例えば、ＥＦプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物の場合、老年性神経変性疾患またはアルツハイマー病の形質を示す。これらは、外界からの刺激に対する応答が著しく低下している。あるいは、アクチンプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物の場合、骨粗鬆症の形質を示す。これは背骨の湾曲と骨密度の低下により確認することができる。また、アクチンプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物の場合、糖尿病の形質を示す。これはグルコース負荷試験で高血糖値を示し、また糖尿病に付随する神経伝達速度の低下により確認することができる。
また、ＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物は、早期老化モデル動物として利用し得る。早期老化モデル動物とは、老化関連疾患の発症期が通常の個体より若い、ヒトの老化現象に認められる、例えば眼疾患、白髪、生殖器の異常、および筋萎縮等の現象が、通常の個体より若くして認められる、および／または寿命が通常の個体より短い等の特徴を有する動物を指す。例えば、本発明のＥＦプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物では、老化関連疾患の発症期が通常の個体より若いことの他に、通常の個体より早期に体毛の退色が認められる。
かかる早期老化モデル動物は、人類の老化関連疾患および老化現象に認められる症状についての予防および／または治療のための研究が、短期間に行えるという点で、これらの研究における利用価値が高い。早期老化モデル動物の開発は従来から行われていたが、本発明のトランスジェニック動物の老化促進は、酸化ストレスを機序とするため、酸化ストレスに対する老化現象等の解明および解決等に有用である。
また、ＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物は、ミトコンドリア病モデル動物として利用し得る。ミトコンドリアの機能障害によって生じるミトコンドリア病もまた多種の病因からなる疾患である。特に筋と中枢神経系に主症状が現れる疾患はミトコンドリア脳筋症と総称される。例えば、本発明のアクチンプロモーターを用いたＡＬＤＨ２＊２トランスジェニック動物では顕著な筋萎縮が認められ、ミトコンドリアの異常な蓄積が認められる等、ミトコンドリア脳筋症の形質を示す。かかるモデル動物は、ミトコンドリア病発症機序の解明、ならびに治療および／または予防法等の開発を進める上で有用である。
さらに、本発明のトランスジェニック動物を、他の早期老化モデル動物または老化関連疾患モデル動物と交配することにより、新規の早期老化モデル動物、または老化関連疾患モデル動物を作製することもできる。例えば、他のアルツハイマー病関連遺伝子を操作した動物と本発明のトランスジェニック動物を交配して得られる動物は、該アルツハイマー病関連遺伝子と酸化ストレスとの関連性についての研究に用いることができる。
本発明はさらに、上記トランスジェニック動物を用いて、老化関連疾患またはミトコンドリア病を制御する物質をスクリーニングする方法にも関する。該方法は、試験する物質（あらゆる化学物質、動物体内でタンパク質発現の可能な核酸分子を含む）を上記動物に適切な方法で投与するか、または適切な方法で該物質に上記動物を曝露することにより、該動物の老化関連疾患またはミトコンドリア病の症状における変化を確認することにより、達成することができる。例えば、該動物の筋萎縮、背骨の湾曲、骨密度の低下、体毛の脱色、糖負荷試験により検出される高血糖値の持続、神経伝導速度低下、または酸化ストレスに対する抵抗性の低下のうち、少なくとも１つが、上記物質の投与または曝露を受けていない対照の動物に比較して、抑制されている場合、該物質は老化関連疾患を抑制（すなわち、予防／治療）する方向に制御する物質であると特定することができる。また同様に比較して、促進されている場合、該物質は老化関連疾患を促進する方向に制御する物質であると特定することができる。該方法において、例えば筋萎縮の促進または抑制を調べる場合、例えば、上記物質の投与または曝露後の動物から特定の筋組織を摘出し、その断面積測定、筋密度測定、免疫染色の少なくとも１種の方法で確認することができる。
また、酸化ストレスに対する抵抗性の低下について検出するには、上記物質の投与または曝露を受けた上記動物に酸化ストレスを与える（例えば、４−ＨＮＥを投与する）か、該動物から特定の組織中の細胞（例えば、神経細胞）を採取し、該細胞が生存可能な条件下で酸化ストレスを与え、その細胞毒性（例えば、細胞死の誘導、細胞の生存活性の低下など）を検出することによっても実施可能である。老化関連疾患またはミトコンドリア病を制御する物質を投与または暴露されていない動物由来の細胞に比べて、該物質を投与または暴露された細胞では酸化ストレスによる細胞毒性が増強されている場合（例えば、低濃度の活性酸素で細胞毒性が検出される等）は、該物質は老化関連疾患を促進する方向に制御する物質であると特定することができる。また、逆に細胞毒性が低減されている場合は、該物質は老化関連疾患を抑制（すなわち、予防／治療）する方向に制御する物質であると特定することができる。
あるいはまた、該動物から特定の組織を摘出し、該組織中の細胞を単離して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで老化関連疾患またはミトコンドリア病を制御する物質をスクリーニングすることもできる。単離した細胞（例えば、中枢神経系由来のニューロンなど）を生存可能な条件下で、試験する物質に暴露し、該細胞に対する影響（例えば、細胞の生存活性の変化など）を評価することにより達成できる。
上記スクリーニングにおける適切な条件等は、当業者であれば、必要に応じて日常的な作業により容易に設定することができる。
さらに、後述の実施例により、本発明にかかるトランスジェニック動物が、アルツハイマー病の疾患モデル動物として有用であること、および抗老化物質（例えば、抗酸化物質）などの効果を評価するのに有用な動物であることを含めて、本発明を具体的に説明する。しかし、本発明は実施例に限定して解釈されるべきではない。
実施例１：マウスＡＬＤＨ２ ｃＤＮＡのクローニング
マウスのアルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）をコードするｃＤＮＡは、配列番号２と３のプライマーを用いて、マウス脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）からＰＣＲ法を用いてクローニングした。ＰＣＲ法の条件は標準の方法を用いた。各１μＭのプライマー、鋳型ＤＮＡとして３μｇ ｃＤＮＡライブラリー、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、２単位のＡｍｐｌｉｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２からなる反応液を増幅サイクル数２５で、９４℃に３０秒、５７℃に３０秒、７２℃に３０秒にて反応した。得られた１．７ｋｂのＡＬＤＨ２ｃＤＮＡ断片を各１２単位の制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで３７℃にて１時間消化し、０．５μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を各６単位の制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで３７℃にて１時間消化することで開裂したＤＮＡ断片と混和して、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ存在下で１６℃にて１時間反応した。この反応液１０μｌを大腸菌ＤＨ５αのコンピテント・セル１００μｌに添加、氷上に１時間静置、３０秒間４２℃で熱処理、再び氷上で２分間静置した後に、ＬＢ液体培地を９００μｌ加えて３７℃にて１時間培養後、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗沫した。３７℃にて一晩培養した寒天培地から生育したコロニーを選択し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地１リットルにて一晩培養した後、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＡＬＤＨ２を精製した。
実施例２：不活性型マウスＡＬＤＨ２であるＡＬＤＨ２＊２の構築
ＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡ（配列番号１）がコードする５０６番目のコドンＧＡＡ（アミノ酸残基Ｇｌｕをコード）をコドンＡＡＡ（アミノ酸残基Ｌｙｓをコード）に置換するために二段階ＰＣＲ法により ＤＮＡ配列を変更した。一段階目のＰＣＲは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＡＬＤＨ２を鋳型ＤＮＡとして用い、反応液（１）では配列番号２と４に記載のプライマーを用いて、反応液（２）では配列番号３と５に記載のプライマーを用いて、前述の反応条件と同一のＰＣＲ条件で反応した。その結果、反応液（１）では１５６８ｂｐ、反応液（２）では１３５ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。この反応液（１）と（２）のＤＮＡ断片を鋳型に、配列番号２と３のプライマーを用いて二段階めのＰＣＲを前述の反応条件と同一の条件で反応した。得られた１．７ｋｂ ＡＬＤＨ２＊２ｃＤＮＡ断片を各１２単位の制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで３７℃にて１時間消化し、０．５μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）を各６単位の制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで３７℃にて１時間消化することで開裂したＤＮＡ断片と混和して、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ存在下で１６℃にて１時間反応した。この反応液１０μｌを大腸菌ＤＨ５αのコンピテント・セル１００μｌに添加、氷上に１時間静置、３０秒間４２℃で熱処理、再び氷上で２分間静置した後に、ＬＢ液体培地を９００μｌ加えて３７℃にて１時間培養後、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗沫した。３７℃にて一晩培養した寒天培地から生育したコロニーを選択し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地１リットルにて一晩培養した後、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを用いて、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＡＬＤＨ２＊２を精製した。
実施例３：トランスジェニック・マウス作製用プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＡＬＤＨ２＊２及びｐＥＦ１−ＢＯＳ−ＡＬＤＨ２＊２の構築
ｐＣＡＧＧＳ−ＡＬＤＨ２＊２の作製には、１μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＡＬＤＨ２＊２を各１２単位の制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで３７℃にて１時間消化し、０．５μｇのプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ，Ｈ．他、Ｇｅｎｅ １０８，１９３−１９９（１９９１）に記載、熊本大学 山村研一先生より入手）を各６単位の制限酵素ＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで３７℃にて１時間消化することで開裂したＤＮＡ断片と混和し、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ存在下で１６℃にて１時間反応した。この反応液１０μｌを大腸菌ＤＨ５αのコンピテント・セル１００μｌに添加、氷上に１時間静置、３０秒間４２℃で熱処理、再び氷上で２分間静置した後に、ＬＢ液体培地を９００μｌ加えて３７℃にて１時間培養後、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗沫した。３７℃にて一晩培養した寒天培地から生育したコロニーを選択し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地１リットルにて一晩培養した後、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを用いて、プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＡＬＤＨ２＊２を精製した。
ｐＥＦ１−ＢＯＳ−ＡＬＤＨ２＊２の作製には、１μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＡＬＤＨ２＊２を１２単位の制限酵素ＸｂａＩで３７℃にて１時間消化し、０．５μｇのプラスミドｐＥＦ１−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．とＮａｇａｔａ，Ｓ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１８，５３２２（１９９０）に記載、大阪大学 長田重一先生より入手）を６単位の制限酵素ＸｂａＩで３７℃にて１時間消化することで開裂したＤＮＡ断片と混和し、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ存在下で１６℃にて１時間反応した。この反応液１０μｌを大腸菌ＤＨ５αのコンピテント・セル１００μｌに添加、氷上に１時間静置、３０秒間４２℃で熱処理、再び氷上で２分間静置した後に、ＬＢ液体培地を９００μｌ加えて３７℃にて１時間培養後、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗沫した。３７℃にて一晩培養した寒天培地から生育したコロニーを選択し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地１リットルにて一晩培養した後、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを用いて、プラスミドｐＥＦ１−ＢＯＳ−ＡＬＤＨ２＊２を精製した。
実施例４：マウス受精卵への微量注入の為の線状ＤＮＡ断片Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２及びＰｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２の調製
３０μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＡＬＤＨ２ ＊２を、２００μｌの全反応量において各５０単位の制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで３７℃において１６時間消化した。次いで、この反応液をエチジウムブロマイド含有アガロースゲル電気泳動に供し、ＵＶ照射にて可視化し、３．９ｋｂのアクチンプロモーターとＡＬＤＨ２＊２ｃＤＮＡをコードする線状ＤＮＡ断片Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２を含むゲル切片を回収した。同様に３０μｇのｐＥＦ１−ＢＯＳ−ＡＬＤＨ２＊２を、２００μｌの全反応量において各５０単位の制限酵素ＡｐａＬＩとＰｖｕＩで３７℃において１６時間消化した。次いで、この反応液をエチジウムブロマイド含有アガロースゲル電気泳動に供し、ＵＶ照射にて可視化し、４．２ｋｂのＥＦ１プロモーターとＡＬＤＨ２＊２ｃＤＮＡをコードする線状ＤＮＡ断片Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２を含むゲル切片を回収した。それぞれのＤＮＡ断片のゲル切片からの精製には、ＰｒｅｐＡ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、製造者のマニュアルに従って実施した。
実施例５：マウス受精卵への微量注入とトランスジェニック・マウスの作製
マウス受精卵への微量注入とトランスジェニック・マウスの作製は発表されている方法によっておこなった。受精卵はＣ５７ＢＬ／６マウスから単離し、線状ＤＮＡ断片Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２及び線状ＤＮＡ断片Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２をそれぞれ８００個の受精卵に注入した。注入済み卵はただちに仮親マウスの卵管内に移植して出産させた。Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入については８３匹、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入については９５匹のマウスを得た。なお、本発明のトランスジェニック・マウスの系統は、胚を凍結保存することにより維持する。
次いで、得られたマウス個体のゲノムＤＮＡ中の導入遺伝子について、その存在の有無を試験した。マウスの各個体からのＤＮＡの抽出には、まず、プロテナーゼＫを添加した組織溶解液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ラウリル硫酸塩）２００μｌの入ったチューブにバイオプシーによって得たマウス尾１〜２ｍｍを加え、５５℃で一晩インキュベーションした。ＲＮａｓｅＡを添加し３７℃にて１時間インキュベーションし溶液中の不要なＲＮＡを分解せしめた後、フェノールを加えて５分間震盪し上清を回収、新しいチューブに移して、さらにフェノール・クロロホルムを加えて５分間震盪し上清を回収、新しいチューブに移す工程を２回繰り返した後にクロロホルムを加えて５分間震盪し上清を回収、新しいチューブに移してエタノールでＤＮＡを沈澱させ、乾燥後にＴＥ緩衝液で溶解した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型に実施例１で述べたＰＣＲ条件に準じて、増幅サイクル数３５回としてＰＣＲを行った。Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの検出には配列番号６と７に記載のプライマーの組み合わせと、配列番号８と９に記載のプライマーの組み合わせの二通りのＰＣＲ反応を、また、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの検出には配列番号１０と７に記載のプライマーの組み合わせによるＰＣＲ反応を行った。以上の反応では、遺伝子導入されていないマウスではＰＣＲによるＤＮＡの増幅は認められない。ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡをエチジウムブロマイド含有アガロースゲルにて電気泳動せしめ、ＵＶ照射にて増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した結果、Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスについては２１匹、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスについては１６匹のマウスについて遺伝子の導入を確認できた。
実施例６：トランスジェニック系統の確立
導入遺伝子の存在を確認できたマウスについて、その子孫であるトランスジェニック系統を確立するために、遺伝子導入が確認できたマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと検定交配（ｂａｃｋｃｒｏｓｓ）した。生まれたマウスについて実施例５に記載の方法を用いて尾よりＤＮＡを抽出、ＰＣＲを行うことで遺伝子導入の有無を検定した。その結果、Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスについては３系統（Ｃ２，６２９および６３５）、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスについては３系統（１０３３−７，１０３９−２および１０３０−１２）、それぞれ子孫に導入遺伝子を移すことができ、トランスジェニック系統を確立することができた。
実施例７：ホモとヘテロの判別
実施例６で得られた各系統のマウスについて、それぞれの子孫がホモであるかヘテロであるかサザン・ブロティング法を用いて決定した。マウスからのＤＮＡの抽出は、実施例５に記載の方法を用いた。標識プローブの調製は、配列番号８と配列番号１１に記載の合成ＤＮＡをプライマーにプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＡＬＤＨ２を鋳型として実施例１に記載の方法に準じてＰＣＲを行い、ＤＮＡを回収した。このＤＮＡ ５０ｎｇにそれぞれ１０μＭの配列番号８と配列番号１１の合成ＤＮＡ ２μｌづつを加えて計５μｌとし、９４℃で３分間加熱処理後、液体窒素にて凍結した。次いで、これに１０倍濃度のＫｌｅｎｏｗバッファー１μｌ、２．５ｍＭ ｄＡＧＴ ｍｉｘ ０．６μｌ、α３２Ｐ−ｄＣＴＰ ６μｌとＫｌｅｎｏｗ Ｆｌａｇｍｅｎｔ １μｌを加えて、３７℃で１０分間反応せしめ、これを標識プローブとした。マウスから抽出したＤＮＡ５μｇを５０単位の制限酵素ＢｇｌＩＩで３７℃にて一晩消化し、１％アガロースゲルにて電気泳動せしめ、次いで、ゲルを０．５Ｍ ＮａＯＨと１．５Ｍ ＮａＣｌからなる変性液に浸して３０分間浸透することでＤＮＡを変性処理した。このＤＮＡをＰＶＤＦ膜に移行せしめ、ＵＶでＤＮＡをクロスリンクした後に膜を２×ＳＳＣで洗浄した。次いで、膜をＲａｐｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）に浸し、これに標識プローブを加えて６５℃にて１００分間加温処理した。膜を０．１％ ＳＤＳ含有２×ＳＳＣで室温にて２０分間洗浄し、次いで０．１％ ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣで６５℃にて１５分間、２回洗浄した後、ＦＬＡ２０００（富士フイルム株式会社、東京、日本）を用いて遺伝子導入したＡＬＤＨ２ ＤＮＡを含む１．２ｋｂのバンドを検出した。バンドの濃度が、非トランスジェニック、ヘテロ、ホモの間で０対１対２となることから、それぞれのマウス子孫がホモであるかヘテロであるかを判別した。
実施例８：抗ＡＬＤＨ２抗血清の作製
抗ＡＬＤＨ２抗血清を作製するために大腸菌でグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＡＬＤＨ２の融合タンパク質を作製した。融合タンパク質の作製のため１μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＡＬＤＨ２＊２を各１２単位の制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで３７℃にて１時間消化し、０．５μｇのプラスミドｐＰｒｏＥｘ３ ＧＳＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を６単位の制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃にて１時間消化することで開裂したＤＮＡ断片と混和し、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ存在下で１６℃にて１時間反応した。この反応液１０μｌを大腸菌ＤＨ５αのコンピテント・セル１００μｌに添加、氷上に１時間静置、３０秒間４２℃で熱処理、再び氷上で２分間静置した後に、ＬＢ液体培地を９００μｌ加えて３７℃にて１時間培養後、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗沫した。３７℃にて一晩培養した寒天培地から生育したコロニーを選択し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地１リットルにて一晩培養した後、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを用いて、ＧＳＴ−ＡＬＤＨ２融合タンパク質発現プラスミドｐＧＳＴ−ＡＬＤＨ２を精製した。次いで、このプラスミドを保持する大腸菌ＢＬ２１をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で培養せしめ、６００ｎＭにおける吸光度が０．５に達したときにＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加して、さらに４時間培養した。この培養液を遠心にて集菌し、集菌した大腸菌を１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳに懸濁し、氷上で超音波破砕した。これを遠心後に上清を新しいチューブに移し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を加えて１晩、４℃にて混和した。このＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂの沈殿をＰＢＳで洗浄した後に５ｍＭの還元型グルタチオンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて、４℃にて１０分間緩やかに混和することでＧＳＴ−ＡＬＤＨ２融合タンパク質を溶出させしめた。次いで、この融合タンパク質をフロイントアジュバント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）と混和し、ウサギに免疫した。抗体価が上昇したことを確認した後に全採血し、さらに血清として−８０℃にて保存し以降の実験に用いた。
実施例９：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法によるＡＬＤＨ２＊２タンパク質発現の確認
トランスジェニック・マウスから各臓器を取り出し、即座に液体窒素で凍結後、−８０℃で保存した。凍結した臓器は、ハンマーを用いて細断した後に臓器１００ｍｇに対してＴＮバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，７．５Ｍ尿素、ＥＤＴＡ不含（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ）プロテアーゼ・インヒビター（Ｒｏｃｈｅ社、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を１ｍｌとなるように添加した。これをＰＯＬＹＴＲＯＮ（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社、Ｌｉｔｔａｕ−Ｌｕｃｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で破砕し、さらに１／４量の１０％ ＳＤＳを加えてから超音波処理した。遠心後に上清をとり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動用サンプルとした。次いで、各臓器のサンプル量が２０μｇとなるように調製し、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルを用いて電気泳動を行った。泳動後にタンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングし、膜をＢｌｏｃｋ Ａｃｅ（雪印乳業、日本）で１５分間ブロッキングした後、１／１０濃度のＢｌｏｃｋ Ａｃｅで２０００倍に希釈した抗ＡＬＤＨ２抗ウサギ血清と置き換え、３７℃で１時間反応させた。０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１／１０濃度のＢｌｏｃｋ Ａｃｅで３回洗浄した後、１／１０濃度のＢｌｏｃｋ Ａｃｅで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼが結合されている抗ウサギＩｇＧ抗体と置き換え、３７℃で１時間反応した。０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１／１０濃度のＢｌｏｃｋ Ａｃｅで３回洗浄した後、膜にＡｔｔｏＰｈｏｓ（Ｒｏｃｈｅ社製）を塗布し、ＦＬＡ２０００でＡＬＤＨ２のバンドを検出した。結果の一例を図１に示す。Ｃ２系統においては、心臓と大腿筋においてＡＬＤＨ２の発現量が増加しており、増加分はＡＬＤＨ２＊２が過剰発現していることを示している。
実施例１０：ＡＬＤＨ２活性の測定
Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスについては３系統（Ｃ２，６２９および６３５）について、大腿筋のＡＬＤＨ２活性を測定した。生後１２週のヘテロのＣ２マウス、ホモの６２９および６３５マウスとコントロールのＣ５７ＢＬ／６マウスから大腿筋を取り、筋１ｇあたり７ｍｌのＡバッファー（０．１Ｍ ＫＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＡＴＰ）を加えて細断した。これに筋１ｇあたり５ｍｇのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加し、５分間室温にて反応した後に、さらに２０ｍｌのＡバッファーを加えて１５秒間ホモジナイズ、６００ｇで１０分間遠心した。上清をさらに１４０００ｇで１０分間遠心した後に１％ＢＳＡを含む５ｍｌのＢバッファー（０．１Ｍ ＫＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．２ｍＭ ＡＴＰ，プロテアーゼ・インヒビターＥＤＴＡ不含（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ））で懸濁し、７０００ｇで１０分間遠心し、再び沈殿を１ｍｌのＢバッファーで懸濁した。これを３５００ｇで１０分間遠心して、ミトコンドリアの沈殿を２５０ｍＭショ糖を含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）５００μｌで懸濁後に３０秒間３回超音波で破砕、再び１０００００ｇで３０分間遠心して、その上清１０μｌを用いてＡＬＤＨ２活性を測定した。反応は上清を加えて１００μｌとした反応液（２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＮＡＤ，５ｍＭアセトアルデヒドまたはプロピオンアルデヒド）の３４０ｎｍの吸光度を５〜１０分間測定し、その吸光度の経時変化から上清中のＡＬＤＨ２活性を求めた。また、上清中のタンパク量をＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（ＰＩＥＲＣＥ社製、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて製造者のプロトコールに従って測定し、この値を元にタンパク質量あたりのＡＬＤＨ２活性を計算した。結果を図２に示す。Ｃ５７ＢＬ／６の大腿筋に比して、いずれのＰａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの大腿筋でもＡＬＤＨ２活性が大幅に低下しており、特にＣ２マウスについてはほとんど活性が検出できなかった。
実施例１１：Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの体重および各臓器の重量測定
Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの各系統とＣ５７ＢＬ／６の雌５匹について生後から１５週目までの体重を測定した。Ｃ２マウスはヘテロ、６２９と６３５についてはホモのマウスについて解析した。その結果、Ｃ２および６２９の２系統について、Ｃ５７ＢＬ／６よりも有意に体重が減少していた（図３）。さらに１０週齢メスのヘテロＣ２マウスとＣ５７ＢＬ／６について、脳、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、大腿筋の重量を比較した（図４）。その結果、心臓と大腿筋の重量がＣ２マウスでは減少していた。
実施例１２：Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの筋萎縮
ヘテロまたはホモのＣ２マウスとＣ５７ＢＬ／６の１２週齢メスの下肢を液体窒素で凍結し、ｃｒｙｏｓｔａｔ（ＣＭ１９００，ＬＥＩＣＡ社製、Ｎｕｓｓｌｏｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で８μｍの厚さからなる横断面の新鮮凍結切片を作製した。作製した切片はヘマトキシリン・エオジン染色し（図５）、腓腹筋とヒラメ筋についてその断面積を測定したところ、Ｃ２マウスの筋断面積はＣ５７ＢＬ／６の筋断面積よりも減少していた。図６には、ヒラメ筋断面積の測定結果を示す。一方、単位面積あたりの筋細胞数をカウントすることで筋密度を測定したところ、Ｃ２マウスの筋密度が増加していた（図７）。しかし、ヒラメ筋細胞の総数には変化がない（図８）ことから、Ｃ２マウスでは筋が萎縮していることが明らかとなった。
実施例１３：免疫染色と組織化学的染色による萎縮した筋の観察
ヘテロのＣ２マウスとホモの６２９と６３５マウス、及びＣ５７ＢＬ／６マウスの１２週齢メスの下肢を液体窒素で凍結し、ｃｒｙｏｓｔａｔで８μｍの厚さからなる横断面の新鮮凍結切片を作製した。免疫染色のためには、まず、切片を７０％のメタノールで−２０℃にて１０分間膜透過処理をし、ＰＢＳで洗浄後、ブロッキング・バッファー（ＰＢＳ中に３％ヤギ血清、３％牛アルブミンを含有）に１５分間浸した。次いで、抗ＡＬＤＨ２抗ウサギ血清（１／１００容量）とミトコンドリアに局在するＨＳＰ６０に特異的な抗ＨＳＰ６０抗体（１／１００容量；医学生物研究所製、名古屋）を含むブロッキング・バッファーに切片を３７℃に１時間浸した。これをＰＢＳで３回洗浄した後に、抗マウスＩｇＧ ＢＯＤＩＰＹ（１／１００容量；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）と抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（１／１００容量；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を含むブロッキング・バッファーに切片を室温にて１時間浸した。次いで、ＰＢＳにて３回洗浄した後に５μＭのヨウ化プロピジウムに５分間漬けることで核を染色し、ＰＢＳで洗浄後ＰＥＲＭＡＦＬＯＵＲで一晩固定して観察用スライドとした。Ｃ２とＣ５７ＢＬ／６マウスの切片を共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社製、東京）で観察した結果を図９に示す。Ｃ５７ＢＬ／６の切片では、抗ＨＳＰ６０抗体陽性のミトコンドリアで抗ＡＬＤＨ２抗体陽性像が得られ、ＡＬＤＨ２がミトコンドリアに局在していた。これに対しＣ２の切片では、抗ＡＬＤＨ２抗体陽性像は筋細胞全体に認められ、顆粒状となっていることがわかる。
組織化学的染色ではＧｏｍｏｒｉトリクローム変法を行った。新鮮凍結切片をＨａｒｒｉｓヘマトキシリン液に１０分間漬けた後に水洗を１０分間行い、次いでＧｏｍｏｒｉ液に２０分間浸した。０．２％酢酸で少し洗浄した後、脱水、透徹、カナダバルサムにて封入した。染色像を図１０に示す。Ｃ５７ＢＬ／６と６３５マウスの切片では正常な染色像が見られたが、６２９マウスの切片では一部、Ｃ２マウスの切片では半分以上の筋細胞で、ミトコンドリアが増殖し集積したときに見られる赤色ボロ繊維が認められた。また、新鮮凍結切片をＰＢＳ中にミトコンドリアを特異的に染色する蛍光色素ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（１μＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を含む溶液で１０分間染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（図１１）。その結果、６２９及びＣ２マウスでは筋細胞内に顆粒状に染色像が見られ、Ｇｏｍｏｒｉトリクローム変法で見られたミトコンドリアの異常集積を確認することができた。
実施例１４：大腿筋の過酸化脂質量測定
Ｃ２およびＣ５７ＢＬ／６マウスから大腿筋を取り出し、即座に液体窒素で凍結後、−８０℃で保存した。凍結した臓器は、ハンマーを用いて細断した後に臓器１００ｍｇに対してＴＮバッファーを１ｍｌとなるように添加した。これをＰＯＬＹＴＲＯＮで破砕し、さらに１／４量の１０％ ＳＤＳを加えてから超音波処理し、遠心、その上清をとり、抽出タンパク量が１０ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。この抽出液２００μｌを用いて、ＢＩＯＸＹＴＥＣＨ ＬＰＯ−５８６キット（Ｏｘｉｓ Ｒｅｓｅａｃｈ社製、）にてｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ（ＭＤＡ）量とＭＤＡと４−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋｅｎａｌｓ（４−ＨＡＥ）の総量の２種類をキット製造者のマニュアルに記載の方法で測定した。その結果、Ｃ２マウス大腿筋ではＣ５７ＢＬ／６と比較して、ＭＤＡ量及びＭＤＡ＋４−ＨＡＥ総量のいずれも増加しており、また、ＭＤＡ＋４−ＨＡＥ総量からＭＤＡ量を差し引いて求めた４−ＨＡＥ量も増加していた（図１２）。この結果は、大腿筋で発現させたＡＬＤＨ２＊２によりＡＬＤＨ２活性が低下し、酸化ストレスが増加したことを示している。また、Ｃ２マウスで見られる筋の萎縮は、この酸化ストレスの増加がもたらしたものと考えられる。
実施例１５：Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスの解析
ホモの１０３３−７マウスについて解析を行ったところ、以下の所見を得た。まず、雄については生後３ヶ月で体毛の脱色が見られた（図１３）。また、雄および雌のいずれにおいても運動量低下、ふるえ、視覚異常、筋力低下がみとめられた。すなわち、このマウスでは老化が促進され、また中枢神経系に異常が生じている。
実施例１６：神経伝導速度の低下
雌のヘテロＣ２マウスとＣ５７ＢＬ／６マウスについて、後肢の運動神経について伝達速度を測定した。測定した結果を図１４に示す。この結果から、トランスジェニック・マウスでは、糖尿病に特徴的な神経伝導速度の低下が認められた。
実施例１７：糖負荷後の血糖値の上昇
２５週齢のヘテロＣ２マウスとＣ５７ＢＬ／６マウスについて２ｇ／ｋｇのグルコースを腹腔投与した。投与０、１５、３０、６０、９０、および１２０分後に目から採血し、血糖値を市販のキット（ニプロフリースタイルセンサー、ニプロ社、大阪）を用いて測定した。その結果を図１５に示す。Ｃ２マウスは、雄および雌のいずれについてもコントロールのＣ５７ＢＬ／６マウスを上回る高い血糖値を示し、このマウスが糖尿病となっている所見を得た。
実施例１８：背骨の湾曲と骨密度の低下
ホモおよびヘテロのＣ２マウスとＣ５７ＢＬ／６マウスについて、３８ｋＶｐにて０．０３秒間レントゲン照射することで骨の解析を行った。その結果、１２週齢においてヘテロ及びホモのＣ２マウスは背骨が湾曲しており、ヘテロマウスは年齢の進行とともにその湾曲が増大している（図１６Ａ）。また、Ｘ線フィルムに投影された骨の画像について、その濃淡を測定することで相対的な骨密度を求めた。その結果、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに比してホモのＣ２マウスは有意に骨密度が低下していた（図１６Ｂ）。
実施例１９：Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウス脳神経細胞の酸化ストレスに対する抵抗性の低下
大脳皮質神経細胞を培養するために、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウスである１０３３−７系統のホモで維持されている雌雄を掛け合わせて妊娠１８日目の胎児を取り出した。胎児は氷冷したＰＢＳ入りシャーレに移し、脳を取り出した後に実体顕微鏡下で大脳皮質を切り出し、髄膜を剥がした。これをカミソリの刃で細断して、一腹分の胎児より取り出した大脳皮質片につき、５ｍｌの０．２５％トリプシンで懸濁し、３７℃で時々揺すりながら１０分間消化して０．２５ｍｌの０．０１％ ＤＮａｓｅＩを加え、転倒混和してＤＮＡを切断後にトリプシン阻害剤として馬血清５ｍｌを添加し、ピペットで軽く混和した。遠心して上清を除去後、沈殿した細胞を５ｍｌの培地（ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）にＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（２９２ｍｇ／ｌ）、ペニシリン、ストレプトマイシン、ＩＴＳ ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、プトレシン（Ｓｉｇｍａ社製）を含む）で懸濁した。細胞は、ポリ−Ｌ−リジンでコートした培養皿に２ｘ１０５個／ｃｍ２となるように撒き、１日間培養した。この細胞に酸化ストレスに対する抵抗性を調べる目的として各濃度の４−ＨＮＥを含む培地を添加し、さらに１日間培養した後に生細胞数をカウントした。この時、生着しており多角形の細胞体と神経突起を有する細胞を生細胞と判定した。Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウスから調製した大脳皮質初代培養細胞は、同じ方法でＣ５７ＢＬ／６マウスから調製した細胞に比べて、より低濃度の４−ＨＮＥで細胞死が促進された（図１７）。また、これらの細胞を４％パラフォルムアルデヒドで室温３０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄後０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理、再度ＰＢＳで３回洗浄後、ブロッキング・バッファー（ＰＢＳ中に３％ヤギ血清、３％牛アルブミンを含有）に１５分間浸した。次いで、神経細胞特異的な抗ＴＵＪ−１抗体（１／５００容量；Ｓｉｇｍａ社製）または、抗４−ＨＮＥ抗体（１／１００容量；日本老化制御研究所製、静岡）を含むブロッキング・バッファーに３７℃１時間浸し、ＰＢＳで３回洗浄後に抗マウスＩｇＧ ＢＯＤＩＰＹ（１／５００容量；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）を含むブロッキング・バッファーに室温１時間浸し、ＰＢＳで３回洗浄後に共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社製）で観察した。抗ＴＵＪ−１抗体による染色（図１８）から、図１７で観察した細胞は成熟神経細胞であり、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウスの神経細胞はＣ５７ＢＬ／６マウスの神経細胞に比べて、より低濃度の４−ＨＮＥで細胞死が促進されることが示された。さらに抗４−ＨＮＥ抗体による染色像をＮＩＨ Ｉｍａｇｅソフトウエア（ＮＩＨ製、ＭＤ，ＵＳＡ）で解析することで、染色強度をグラフ化した（図１９）。その結果、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウスの神経細胞では、４−ＨＮＥがより蓄積しやすいことが明らかとなった。このことは、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウスの脳由来の神経細胞でＡＬＤＨ２活性が低下した結果、脂質の過酸化により生じる反応性アルデヒドである４−ＨＮＥを解毒する能力が低下して、酸化ストレスによる神経細胞死が促進されたことを示している。酸化ストレスは加齢に伴って増大することから、Ｐｅｆ−ＡＬＤＨ２＊２導入マウス脳は加齢に伴う傷害をより受けやすく、アルツハイマー病などのモデル動物としての活用が期待できる。
実施例２０：Ｐａｃｔｉｎ−ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウス筋萎縮にたいするビタミンＥ添加食投与の効果
ビタミンＥは広範に使用されている抗酸化物質であり、アルツハイマー病においてもその予防効果があることが良く知られている。そこで、本発明のＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスが、抗酸化剤などの薬効を調べるためのモデル動物となりうるか、ビタミンＥ添加食を投与することで調べた。ビタミンＥ添加食は、粉末飼料（ＭＦマウス・ラット・ハムスター飼育用実験動物飼料；オリエンタル酵母工業製、東京）に１００ｇあたり３ｇの（±）−α−トコフェノール（Ｗａｋｏ製、東京）を添加し、よく混和することで作製した。これを生後７週のヘテロＣ２マウス雄５匹に与え、以降６ヶ月間にわたって週１回体重を測定した。その結果、ビタミンＥ添加食群のマウスは、未添加の飼料（普通食）を与えた群に比較して体重の増加が認められた（図２０）。また、そのときの各マウスの実施例１２と同様に下肢筋断面積を測定し比較したところ、ビタミンＥ添加食群のマウスでは筋断面の増加しており（図２１）、ビタミンＥの筋萎縮阻害効果が認められた。この結果は、ＡＬＤＨ２活性低下に伴う筋での酸化ストレス増加をビタミンＥが抑制したことを示しており、ＡＬＤＨ２＊２ＤＮＡ導入マウスが抗酸化物質などの薬効を調べるうえで有効なモデルであることが示された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明によるトランスジェニック動物は、老化および老化関連疾患、特にアルツハイマー病、骨粗鬆症、筋萎縮症、眼疾患、白髪、生殖器異常などのモデル動物として利用できる。本発明による老化関連疾患モデル動物は、酸化ストレスに起因する老化関連疾患の治療および／もしくは予防のための薬剤または方法の開発に貢献し得るものである。また、本発明のトランスジェニック動物は、あらゆる加齢とともに認められる症状の改善するための方法および薬剤の開発にも有用である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）遺伝子の活性をドミナント・ネガティブに抑制する不活性型ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２＊２）をコードする遺伝子を、非ヒト脊椎動物に導入することによる早期老化、老化関連疾患および／またはミトコンドリア病の症状を示すトランスジェニック動物。
【請求項２】
老化関連疾患が神経変性疾患、糖尿病または骨粗鬆症である、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
不活性型ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２＊２）遺伝子がマウスに由来するものである、請求項１または２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
非ヒト脊椎動物がマウスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
プロモーターを上記ＡＬＤＨ２＊２遺伝子に対して機能し得る形で連結させて用いる、請求項１〜４のいずれか１項記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
プロモーターがＥＦプロモーターである、請求項５記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
プロモーターがアクチンプロモーターである、請求項５記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
ＡＬＤＨ２＊２遺伝子を、非ヒト脊椎動物に導入することによる、早期老化、老化関連疾患および／またはミトコンドリア病のモデルとなるトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項９】
老化関連疾患が神経変性疾患、糖尿病または骨粗鬆症である、請求項８記載のトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項１０】
不活性型ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２＊２）遺伝子がマウスに由来するものである、請求項８または９に記載のトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項１１】
非ヒト脊椎動物がマウスである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項１２】
プロモーターを上記ＡＬＤＨ２＊２遺伝子に対して機能し得る形で連結させて用いる、請求項８〜１１のいずれか１項記載のトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項１３】
プロモーターがＥＦプロモーターである、請求項１２記載のトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項１４】
プロモーターがアクチンプロモーターである、請求項１２記載のトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項１５】
老化関連疾患またはミトコンドリア病を制御する物質を、請求項１〜７のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物を用いてスクリーニングする方法であって、
１） 上記動物に試験する物質を投与、または上記動物を試験する物質に曝露すること、
２） 上記動物の老化、老化関連疾患またはミトコンドリア病の症状の促進または抑制を確認すること、
を含む、上記方法。
【請求項１６】
上記動物の老化または老化関連疾患の症状を確認することが、上記物質を投与、または上記物質に曝露した上記動物が、投与または曝露を受けていない対照の動物に比べて、筋萎縮、背骨の湾曲、骨密度の低下、体毛の脱色、糖負荷試験により検出される高血糖値の持続、神経伝導速度低下、または酸化ストレスに対する抵抗性の低下のうちの少なくともいずれか１つを促進または抑制されていることを確認することである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
上記筋萎縮を促進または抑制されていることを確認することが、筋組織の断面積測定、筋組織の筋密度測定、または筋組織の免疫染色のいずれかにより実施される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
上記酸化ストレスに対する抵抗性の低下を促進または抑制されていることを確認することが、上記動物から単離した組織由来の細胞が４−ＨＮＥに対する抵抗性が減少または増大していることにより実施される、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
上記動物から単離した組織由来の細胞が中枢神経系由来のニューロンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
老化関連疾患またはミトコンドリア病を制御する物質を、請求項１〜７のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物より単離した組織由来の細胞を用いてスクリーニングする方法であって、
１） 上記細胞を試験する物質に曝露すること、
２） 上記動物の老化、老化関連疾患またはミトコンドリア病の症状の促進または抑制を確認すること、
を含む、上記方法。
【請求項１】
ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）遺伝子の活性をドミナント・ネガティブに抑制する不活性型ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２＊２）をコードする遺伝子を、非ヒト脊椎動物に導入することによる早期老化、老化関連疾患および／またはミトコンドリア病の症状を示すトランスジェニック動物。
【請求項２】
老化関連疾患が神経変性疾患、糖尿病または骨粗鬆症である、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
不活性型ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２＊２）遺伝子がマウスに由来するものである、請求項１または２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
非ヒト脊椎動物がマウスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
プロモーターを上記ＡＬＤＨ２＊２遺伝子に対して機能し得る形で連結させて用いる、請求項１〜４のいずれか１項記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
プロモーターがＥＦプロモーターである、請求項５記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
プロモーターがアクチンプロモーターである、請求項５記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
ＡＬＤＨ２＊２遺伝子を、非ヒト脊椎動物に導入することによる、早期老化、老化関連疾患および／またはミトコンドリア病のモデルとなるトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項９】
老化関連疾患が神経変性疾患、糖尿病または骨粗鬆症である、請求項８記載のトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項１０】
不活性型ミトコンドリア型アルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２＊２）遺伝子がマウスに由来するものである、請求項８または９に記載のトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項１１】
非ヒト脊椎動物がマウスである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項１２】
プロモーターを上記ＡＬＤＨ２＊２遺伝子に対して機能し得る形で連結させて用いる、請求項８〜１１のいずれか１項記載のトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項１３】
プロモーターがＥＦプロモーターである、請求項１２記載のトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項１４】
プロモーターがアクチンプロモーターである、請求項１２記載のトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項１５】
老化関連疾患またはミトコンドリア病を制御する物質を、請求項１〜７のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物を用いてスクリーニングする方法であって、
１） 上記動物に試験する物質を投与、または上記動物を試験する物質に曝露すること、
２） 上記動物の老化、老化関連疾患またはミトコンドリア病の症状の促進または抑制を確認すること、
を含む、上記方法。
【請求項１６】
上記動物の老化または老化関連疾患の症状を確認することが、上記物質を投与、または上記物質に曝露した上記動物が、投与または曝露を受けていない対照の動物に比べて、筋萎縮、背骨の湾曲、骨密度の低下、体毛の脱色、糖負荷試験により検出される高血糖値の持続、神経伝導速度低下、または酸化ストレスに対する抵抗性の低下のうちの少なくともいずれか１つを促進または抑制されていることを確認することである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
上記筋萎縮を促進または抑制されていることを確認することが、筋組織の断面積測定、筋組織の筋密度測定、または筋組織の免疫染色のいずれかにより実施される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
上記酸化ストレスに対する抵抗性の低下を促進または抑制されていることを確認することが、上記動物から単離した組織由来の細胞が４−ＨＮＥに対する抵抗性が減少または増大していることにより実施される、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
上記動物から単離した組織由来の細胞が中枢神経系由来のニューロンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
老化関連疾患またはミトコンドリア病を制御する物質を、請求項１〜７のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物より単離した組織由来の細胞を用いてスクリーニングする方法であって、
１） 上記細胞を試験する物質に曝露すること、
２） 上記動物の老化、老化関連疾患またはミトコンドリア病の症状の促進または抑制を確認すること、
を含む、上記方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２０６８１
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【発行日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１３５５２（Ｐ２００５−５１３５５２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２７９７
【国際出願日】平成１６年８月２７日（２００４．８．２７）
【出願人】（８０３００００３４）学校法人日本医科大学 (37)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【発行日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２７９７
【国際出願日】平成１６年８月２７日（２００４．８．２７）
【出願人】（８０３００００３４）学校法人日本医科大学 (37)
【Ｆターム（参考）】
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