酸素親和性を中酸素親和性に制御したヘモグロビン含有リポソーム懸濁液
【課題】出血治療時だけでなく、梗塞部位、ガン部位などの治療時に必要な酸素運搬が、１つの製剤で可能となり、且つ、ヘモグロビン収率が向上したアロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするリポソーム懸濁液を提供する。
【手段】アロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするリポソーム懸濁液において、前記リポソーム懸濁液中の(1)ヘモグロビン濃度(2)アロステリック因子濃度(3)リポソーム膜形成脂質濃度(4)ステアリン酸濃度の最適な数値限定を行なう。
【手段】アロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするリポソーム懸濁液において、前記リポソーム懸濁液中の(1)ヘモグロビン濃度(2)アロステリック因子濃度(3)リポソーム膜形成脂質濃度(4)ステアリン酸濃度の最適な数値限定を行なう。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、出血治療又は梗塞治療などに用いるヘモグロビン含有リポソーム懸濁液に関する。
【背景技術】
【０００２】
出血治療又は梗塞治療などに用いる人工酸素運搬体として、ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液が様々に検討されて来た。ヘモグロビンベースの人工酸素運搬体はアロスリック因子を用いて、酸素親和性を制御する事が可能である。通常の血液循環における肺の酸素分圧100mmHgと組織末端の酸素分圧40mmHgの間の酸素運搬量を多くする為、酸素親和性を制御する方法が検討されて来た（特公平4-66456、特開2008-120760）。出血ショック時又は梗塞時は血流不全の為、組織末端は酸素不足に陥っており、通常の組織末端の酸素分圧40mmHgより更に低くなっている。この場合、酸素分圧100mmHgと酸素分圧40mmHgの間の酸素供給だけでなく、酸素分圧40mmHg以下の部位への酸素供給を十分に考慮する必要がある。特に梗塞部位等への適用では酸素分圧40mmHg以下への酸素供給が重要である。酸素親和性を制御する主な因子はヘモグロビンに対するアロステリック因子添加量である。また、アロステリック因子はヘモグロビン収率（仕込みヘモグロビン量に対するリポソーム化されたヘモグロビン量の割合（％））にも関与する事を、本発明者等は見出しており（特願2008-79396）、この観点からの検討は従来十分ではなかった。酸素親和性を制御する因子はアロステリック因子だけでなく、リポソーム内水相のpHも関与し、リポソーム内水相のpHには、リポソーム化前のヘモグロビンのpHだけでなくリポソーム膜形成脂質組成も影響を与える。そして、リポソーム膜形成脂質組成はリポソーム内のヘモグロビン保持機能等にも関与する。これらの因子を総合的に検討し、アロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするリポソーム懸濁液において、酸素親和性を適切に制御し、且つ、ヘモグロビン収率を向上させる検討は、従来、行なわれていなかった。
【特許文献１】特公平4-66456号公報
【特許文献２】特開2008-120760号公報
【非特許文献１】人工血液2003;11(3)：179-184
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ヘモグロビンベースの人工酸素運搬体において、ヒト血液を原料とする場合、赤血球からヘモグロビンを取り出す工程で、ヒト赤血球に元々存在するアロステリック因子の2,3-DPG（酸素放出能を高める燐酸化合物）が失われる。その結果として、酸素解離曲線（詳細は0010に記述）は左にシフトし、酸素運搬効率（詳細は0010に記述）は低くなってしまう問題があった。この問題を解決する為、ヘモグロビン溶液型の人工酸素運搬体では、ヘモグロビンにアロステリック因子を化学結合させたり、ヘモグロビン含有リポソーム型の人工酸素運搬体では、予めヘモグロビン溶液にアロステリック因子を添加する技術を用いている。これらは何れも通常の血液循環における肺の酸素分圧100mmHgと通常の組織末端の酸素分圧40mmHgの間の酸素運搬量を多くする為に、酸素放出能を制御する方法であった（特公平4-66456、特開2008-120760）。本発明では、このタイプを低酸素親和性〔高酸素親和性（後述）と比較して、通常の血液循環における酸素分圧領域（100mmHg〜40mmHg）において酸素を放し易い〕と呼び、天然赤血球と比較して、酸素解離曲線が右にシフトしている状態を示す。
また、人工酸素運搬体としてのヘモグロビン含有リポソームの平均粒子径は0.2μm前後である。天然赤血球（7〜8μm）と比較すると、非常に小さいので、血栓、栓塞等で血流が阻害されて、虚血により低酸素状態に陥った部位（酸素分圧が、通常の組織末端の酸素分圧40mmHgより更に低い）に対して、狭窄部位（天然赤血球では通過困難な）を通過して、或いは側副血行路や周囲の毛細血管を介して、酸素を供給する事も可能である（Circulation, 2004;100(Suppl-Ｉ)：483、CirculationJ.,2004:68(Suppl-Ｉ)：Ｉ-133）。また、癌組織においては、時として癌細胞の増殖に見合った血管新生を伴わないので、その血管網は無秩序で且つ、脆弱で有り、癌組織の血流は不安定で、一時的な血流遮断を繰り返している。この為、癌組織内部の細胞は低酸素状態にさらされている。この低酸素状態により、癌治療の為の放射線照射に対して抵抗性を示すが、人工酸素運搬体としてのヘモグロビン含有リポソーム懸濁液は、天然赤血球では到達不可能な癌組織内低酸素部位までに、酸素を供給出来る可能性がある（ASAIOJ.,2004:50:164）。この為、ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液を人工酸素運搬体として、梗塞部位、ガン部位など、通常の組織末端（酸素分圧：40mmHg）より、更に低酸素状態の部位に、酸素を供給し易くする事を目的として、酸素分圧40mmHgと0mmHgの間の酸素運搬量を多くする為に、酸素放出能を制御したヘモグロビン含有リポソーム懸濁液を、本発明者等は鋭意検討して来た（特願2006-308816）。本発明では、このタイプを高酸素親和性〔低酸素親和性（前述）と比較して、通常の血液循環における酸素分圧領域（100mmHg〜40mmHg）において酸素を放し難い〕と呼び、天然赤血球と比較して、酸素解離曲線が左にシフトしている状態を示す。
【０００４】
更に、出血ショックにおいては、血液が失われ、血流不全となる為、組織末端は酸素不足に陥っているので、通常の酸素分圧40mmHgより低い状態にある。従って、出血ショック治療初期においては、酸素分圧40mmHg以下の部位への酸素供給が重要であり、人工酸素運搬体が投与され、低酸素分圧領域への酸素供給及び血管内循環量が確保された後は、今度は、通常の血液循環における酸素分圧100mmHg〜40mmHgの間での酸素供給が重要となる。この点に着目し、低酸素親和性の人工酸素運搬体と高酸素親和性の人工酸素運搬体を併用して用いる事を特徴とする人工酸素運搬体も検討して来た。（特願2008-219207）。しかし、この方法は、低酸素親和性と高酸素親和性の２つの製剤が必要となる問題がある。
【０００５】
本発明では、出血治療時だけでなく、梗塞部位、ガン部位などの治療時にも、適切な酸素運搬が可能で有り、しかも、１つの製剤で、その目的を達する為、酸素分圧100mmHg〜40mmHgの酸素運搬と酸素分圧40mmHg〜0mmHgの酸素運搬がバランスよく出来る中酸素親和性の人工酸素運搬体を検討した。本発明では中酸素親和性とは、酸素解離曲線が、低酸素親和性と比較して左にシフトし、且つ、高酸素親和性と比較して右にシフトしている状態を示す。中酸素親和性は低酸素親和性と比較した場合、より低酸素領域（酸素分圧40mmHg〜0mmHg）への酸素供給を増加させ、出血ショック治療初期、梗塞部位、ガン部位への酸素供給に有利となる。高酸素親和性と比較した場合は、より通常の酸素分圧領域（酸素分圧100mmHg〜40mmHg）への酸素供給を増加させる事が出来、高酸素親和性と比較し、酸素分圧100mmHg〜40mmHgにおける酸素供給及び酸素分圧40mmHg~0mmHgにおける酸素供給のバランスが良くなる。また、酸素親和性を制御する主な因子はヘモグロビンに対するアロステリック因子量であるが、アロステリック因子添加量はヘモグロビン収率にも影響を与える事を本発明者等は見出しており、アロステリック因子添加量を減少させると、ヘモグロビン収率が増加する傾向にある。そして、酸素親和性を制御する因子はアロステリック因子だけでなく、リポソーム内水相のpHも関与している。リポソーム内水相のpHはリポソーム化前のヘモグロビンのpHだけでなくリポソーム膜形成脂質組成中のステアリン酸の影響も受ける（特開2008-120760、特願2006-308816）。また、ステアリン酸はヘモグロビン収率、内水相ヘモグロビンの保持機能、ヘモグロビンメト化率へも影響を与える（詳細は0011に記述）。今回の発明においては、これらの因子を総合的に検討し、中酸素親和性に酸素運搬能を制御し、出血治療時だけでなく、梗塞部位、ガン部位などの治療時にも適切な酸素運搬が、１つの製剤で可能であり、且つ、ヘモグロビン収率を向上させたアロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするリポソーム懸濁液を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液において、（１）ヘモグロビン濃度（２）アロステリック因子濃度（３）リポソーム膜構成脂質濃度（４）ステアリン酸濃度を適切に設定する事により、中酸素親和性に酸素親和性を制御し、出血治療時だけでなく、梗塞部位、ガン部位などの治療時にも適切な酸素運搬が、１つの製剤で可能であり、且つ、ヘモグロビン収率を向上させたアロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするリポソーム懸濁液が下記のごとく提供される。
【０００７】
(1)アロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするリポソーム懸濁液であって、前記リポソーム膜形成脂質がステアリン酸を含み、前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度が5.6〜6.7w/v%であり、アロステリック因子濃度が0.033〜0.045w/v%であり、リポソーム膜形成脂質濃度が3.05〜5.10w/v%であり、ステアリン酸濃度が0.41〜0.77w/v%である事を特徴とする前記リポソーム懸濁液。
(2)前記アロステリック因子がフィチン酸12ナトリウムである事を特徴とする(1)に記載のリポソーム懸濁液。
(3)前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率が10%以下である事を特徴とする(1)に記載のリポソーム懸濁液。
【発明の効果】
【０００８】
以上、詳述した様に、本発明はアロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするリポソーム懸濁液において、(1)ヘモグロビン濃度(2)アロステリック因子濃度(3)リポソーム膜構成脂質濃度(4)ステアリン酸濃度について、特に酸素親和性に直接的に影響するアロステリック因子濃度及び間接的に影響を与えるステアリン酸濃度を適切に設定し、出血治療時だけでなく、梗塞部位、ガン部位などの治療時にも適切な酸素運搬が、１つの製剤で可能であり、且つ、ヘモグロビン収率を向上させたアロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするヘモグロビン含有リポソーム懸濁液が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を具体的に説明する。
＜リポソーム膜構成脂質＞
本発明におけるリポソーム膜形成脂質は天然又は合成の脂質が使用可能である。特にリン脂質が好適に使用される。これらを常法に従って水素添加したものがあげられる。更にリポソーム膜形成脂質には所望によりステロール等の膜強化剤や荷電物質として高級飽和脂肪酸を添加しても良い。リン脂質としては水素添加大豆リン脂質、膜強化剤としてコレステロール、荷電物質としてステアリン酸等が好適に使用される。
【００１０】
＜リポソーム内水相に含有されるヘモグロビン＞
本発明のリポソーム内水相に含有されるヘモグロビンは、公知の方法によりヒト期限切れ濃厚赤血球製剤より白血球、血小板、血漿及び赤血球膜を除去した後、濃縮したヒト由来濃厚ヘモグロビンが用いられる。
【００１１】
＜リポソーム凝集抑制剤＞
リポソーム表面への蛋白吸着抑制剤又はリポソーム凝集抑制剤として、公知の方法 ( 特開2008-024646など ) により、一端に疎水性を有し、且つ、他端に親水性高分子を有する化合物が用いられる。ポリエチレングリコールとリン脂質が共有結合したポリエチリングリコール結合リン脂質が好適に用いられる。
【００１２】
＜アロステリック因子による酸素解離曲線の制御＞
本発明に記載されるアロステリック因子とは、酸素解離曲線（ヘモグロビンの酸素飽和度と酸素分圧との関係を示す曲線。ヒト天然赤血球の酸素解離曲線は図1参照）に影響を与える因子である。アロステリック因子としては、特開昭57-26621号に記載のものも使用出来るが、安全性、保存安定性、価格、入手のし易さ、効果の点でフィチン酸が好ましく、フィチン酸12ナトリウムがより好ましい。アロステリック因子は酸素解離曲線を右にシフトさせ、その結果として酸素運搬効率を高くする。一般的には、天然赤血球の酸素運搬効率とは、通常の血液循環における肺の酸素分圧である100mmHgと酸素供給先である組織末端の酸素分圧40mmHgとの間のヘモグロビンの酸素飽和度の差を示す。図1が示す様に、ヒト天然赤血球では肺（酸素分圧100mmHg）で、酸素飽和度は約100%であり、組織末端（酸素分圧40mmHg）では酸素飽和度は約75%なので、通常の血液循環において、肺と組織末端との間で、酸素飽和量の約25%を組織に供給する。人工酸素運搬体としてのヘモグロビン含有リポソーム懸濁液において、ヒト血液を原料とする場合、赤血球からヘモグロビンを取り出す工程において、ヒト赤血球に元々存在するアロステリック因子の2,3-DPG（酸素放出能を高める燐酸化合物）が失われる。その結果として、酸素解離曲線は左にシフトし、天然赤血球で得られた100mmHgと40mmHgの間での酸素運搬効率が低下してしまう問題が有った。本発明者らは、予めヘモグロビン溶液にアロステリック因子を添加し、これをリポソーム化する事により、この問題を解決する方法を鋭意検討して来た（特公平4-66456、特開2008-120760）。このタイプを本発明では低酸素親和性と呼んでいる（0003に既述）。
しかし、梗塞部位、ガン部位などの治療時における酸素供給では（特願2008-79396）、末梢循環不全となり、組織末端では酸素不足に陥っており、組織末端の酸素分圧は通常の組織末端の酸素分圧40mmHgよりも更に低くなっている。酸素分圧40mmHgよりも更に低い酸素分圧の部位に酸素を供給する為には、酸素分圧40mmHgと酸素分圧0mmHgとの間での酸素運搬効率が重要であり、酸素解離曲線を適切な範囲で左にシフトさせれば、天然赤血球と比較して、酸素分圧100mmHg〜40mmHgの間では、酸素を離し難く、酸素分圧40mmHg以下の部位で酸素を離し易くなる。梗塞部位又はガン部位などの低酸素領域に運搬可能な酸素運搬量を増加させる為には、酸素解離曲線を右にシフトさせる作用のあるアロステリック因子については添加量を少なくするか、或いは添加しない技術を用いる高酸素親和性の人工酸素運搬体が有利である（特願2008-79396）。
【００１３】
出血ショック時の治療初期においては、血液が失われ、血流不全となる為、組織末端は酸素不足に陥っているので、高酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液（アロステリック因子の添加量が少ないか或いは添加しない）を投与し、酸素分圧40mmHg以下の低酸素部位への効率の良い酸素供給を行なう。その後では、今度は通常の肺の酸素分圧100mmHgと組織末端の酸素分圧40mmHgとの間での酸素供給が必要となるので、低酸素親和性の人工酸素運搬体が有利となる。そこで、高酸素親和性の人工酸素運搬体投与の後で、低酸素親和性の人工酸素運搬体を投与する事を特徴とする人工酸素運搬体も考えられる（特願2008-219207）。しかし、この方法の短所としては、低酸素親和性と高酸素親和性の２つ
の製剤を必要とする事がある。
【００１４】
本発明においては、出血治療、梗塞治療、ガン治療において、１つの製剤で、適切な酸素運搬が可能となる様に、低酸素親和性と比較した場合は、より低酸素領域（酸素分圧40mmHg〜0mmHg）への酸素供給を増加させ、且つ、高酸素親和性と比較した場合は、より通常の酸素分圧領域（酸素分圧100mmHg〜40mmHg）への酸素供給を増加させた中酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液を鋭意検討した。中酸素親和性では、低酸素親和性と比較して、酸素解離曲線が左にシフトしており、ヘモグロビンに対するアロステリック因子添加量は少なくて済み、その結果、ヘモグロビン収率は向上する。ヘモグロビン収率が向上するだけでなく、低酸素親和性と比較して、低酸素領域（酸素分圧40mmHg〜0mmHg）への酸素供給が増加するので、出血ショック治療初期又は梗塞部位、ガン部位などの治療に有利となる。以上により、本発明において、適切に設定した前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度（詳細は0013に記述）、及びステアリン酸濃度（詳細は0011に記述）に対する、前記リポソーム懸濁液中のアロステリック因子であるフィチン酸12ナトリウム濃度は0.033〜0.045w/v%であり、より好ましくは0.035〜0.043w/v%である。
【００１５】
＜ステアリン酸組成比が内水相pH及びヘモグロビン保持機能などに及ぼす影響＞
酸素解離曲線に影響を与える因子はアロステリック因子だけでなく、内水相ヘモグロビンのpHも影響を与える。内水相ヘモグロビンのpHには、リポソーム化前の赤血球膜除去濃厚ヘモグロビンのpHだけでなく、リポソーム膜構成脂質中のステアリン酸組成比も影響を与える。つまり、ステアリン酸組成比が高いと内水相pHは低下する傾向に有り、酸素解離曲線は右にシフトし、ステアリン酸組成比が低いと、ステアリン酸組成比が高い場合と比較し、内水相pHは上昇する傾向に有り、酸素解離曲線は左にシフトする。
ステアリン酸組成比は内水相pHを介して、酸素解離曲線に影響を与えるばかりでなく、内水相ヘモグロビンの保持機能にも関与する。つまり、ステアリン酸組成比が高いとヘモグロビン保持機能が低くなり、ステアリン酸組成比が低いとヘモグロビン保持機能が向上する傾向に有る。ヘモグロビン保持機能が低い場合、ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液が生体に投与された時、血漿中にリポソーム内部のヘモグロビンが漏れ出す懸念がある。血漿中に漏れ出したヘモグロビンは、血漿中に存在するハプトグロビンにより、肝臓に運ばれ、分解、再利用されるが、一定量を越えると、ハプトグロビンによる処理能力を超えるので、可能な限り、ヘモグロビン保持機能を向上させておく必要が有る。他方、ステアリン酸組成比はヘモグロビン収率にも影響を与え、ステアリン酸組成比が高いとヘモグロビン収率が高くなり、ステアリン酸組成比が低いとヘモグロビン収率が低くなる。これらを総合的に検討する必要が有り、今回、これらの因子を総合的に考慮し、本発明におけるヘモグロビン含有リポソーム懸濁液中のステアリン酸濃度を0.41〜0.77w/v%、より好ましくは0.47〜0.71w/v%に設定した。
【００１６】
＜ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液の酸素運搬量設定＞
本発明における、ヘモグロビンを内水相とするリポソーム懸濁液1mLが酸素分圧100mmHgと酸素分圧40mmHgの間で運搬可能な酸素運搬量（通常の血液循環における酸素供給を想定）又は、酸素分圧40mmHgと0mmHgの間で運搬可能な酸素運搬量（梗塞部位、ガン部位への酸素供給を想定）は、本発明において、以下の3項目により理論的に算出する。（１）前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度（ヘモグロビンが酸素運搬の主役である）（２）前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率（ヘモグロビンが酸化されて、メトヘモグロビンとなると酸素運搬能を失う）（３）前記リポソーム懸濁液の酸素運搬効率。本発明の酸素運搬効率は通常の血液循環における酸素供給の為には、酸素分圧10mmHgと40mmHgの間で設定される（酸素解離曲線において酸素分圧100mmHgと40mmHgの間の酸素飽和度の差）。また、梗塞部位又はガン部位への酸素供給の為には、酸素分圧40mmHgと0mmHgの間で設定される（酸素解離曲線において酸素分圧40mmHgと0mmHgの間の酸素飽和度の差）。
前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度：Aw/v%、前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率：Ｂ％、前記リポソーム懸濁液の酸素運搬効率（「通常の血液循環における酸素供給を想定」又は「梗塞部位又はガン部位への酸素供給を想定」）：C%とすると、前記リポソーム懸濁液1mLが、酸素分圧100mmHgと40mmHgの間で、又は、酸素分圧40mmHgと0mmHgの間で運搬可能な酸素量DmL（37℃、1気圧）は、以下の様に理論的に計算される。
リポソーム懸濁液1mL中のヘモグロビンに結合可能な酸素分子数（moL）は、ヘモグロビンに結合可能な酸素分子が4つである事から、
｛A (1−B / 100) × 4 / 64500｝/ 100．．．．．(1)となる。
更に、酸素運搬効率がC%である事から、リポソーム懸濁液1mLが放出する酸素分子数(moL)は、
（１）×（C / 100）．．．．(2)となる。
また、気体の状態方程式PV＝nRT、R(atm・1 / K・moL)＝0.082より、
D(mL)＝（2）×0.082×（37＋273）×1000．．．．(3)となる。
以上により、前記ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液において、（1）前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度(2)前記リポソーム懸濁液中の酸素運搬効率(3)前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率を適切に制御し、設定する事により、適切な酸素運搬量の設定が可能となる。
【００１７】
＜リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度＞
本発明における人工酸素運搬体としてのヘモグロビン含有リポソーム懸濁液の酸素運搬効率の主役はヘモグロビンである。前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度が高過ぎると、ヘモグロビンをリポソーム化する為のリポソーム膜形成脂質の濃度が必然的に高くなり、生体に投与される総脂質濃度が高くなって、安全性の面で懸念がある。また、前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度が低過ぎると、酸素運搬の主役であるヘモグロビンの絶対量が不足して、酸素運搬量設定に不利となる。従って、前記リポソーム懸濁液中の適切なヘモグロビン濃度は5.6〜6.7w/v%であり、より好ましくは5.7〜6.6w/v%である。
【００１８】
＜リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率＞
ヘモグロビンは酸化されて、メトヘモグロビンとなると、酸素運搬能を失うので、人工酸素運搬体としてのヘモグロビン含有リポソームにおいては、ヘモグロビンの酸化防止（ヘモグロビンメト化防止）は、重要課題の１つである。ヘモグロビンのpHが過度に低下すると、ヘモグロビンの酸化が促進するので、製造工程を低温に保つと同時に、製造工程ではヘモグロビンのpH制御を行い、公知の方法（特開2006-104069）により、還元剤使用による脱酸素化及び脱酸素化状態のまま、製造バッグに無菌充填した後、脱酸素化状態を維持出来る様に外包装を行う。前記リポソーム懸濁液製造直後及び有効期間中のヘモグロビンメト化率は10%以下である。ヘモグロビンメト化率がこれより高くなると、前記リポソーム懸濁液の酸素運搬量が低下し、酸素運搬体として不利となる。
【実施例１】
【００１９】
次に本発明の実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。なお、前記リポソーム懸濁液の製造工程は無菌環境下での操作とした。
【００２０】
＜中酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液の製造＞
アロステリック因子添加量により、酸素解離曲線を低酸素親和性より左に且つ、高酸素親和性より右にシフトさせる。
水素添加ホスファチジルコリン192g、コレステロール94g、ステアリン酸49gからなる均一混合脂質に水335gを加えて、85℃で30分間加熱して水和膨潤均一混合資質を調整した。期限切れ濃厚赤血球製剤からヘモグロビンを精製、濃縮し、アロステリック因子として、フィチン酸12ナトリウムをヘモグロビンに対して、0.5モル添加したヘモグロビン濃度42.6w/v%の濃厚ヘモグロビン溶液を調製した。前記水和膨潤均一混合脂質670gに前記濃厚ヘモグロビン溶液2393gを添加し、均一に攪拌し前乳化を行なった。前記前乳化後に更に強力な攪拌により、本乳化を行なった。前記本乳化後の混合液を生理食塩水により希釈して、0.45μｍ膜を用いて、循環濾過により粒子径の制御を行なった。次に10mg/mL濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水を使用し、亜硫酸ナトリウムによる脱酸素化を行なった後、分画分子量30万の限外濾過膜を用いて、0.5mg/mL濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水による加水濃縮で、リポソーム化されなかったヘモグロビン及びフィチン酸12ナトリウムを除去し、ヒト由来濃厚ヘモグロビン及びアロステリック因子含有リポソーム懸濁液を作成した。前記リポソーム懸濁液に、PEG結合リン脂質として、DSPE-PE5000（日本油脂製）を生理食塩水に溶解させたPEG結合リン脂質水溶液を添加した。前記リポソーム及びPEG結合リン脂質を含有した前記リポソーム懸濁液中のリポソーム膜構成脂質濃度が4.48w/v%であり、PEG結合リン脂質が0.41w/v％である様に調製した後、37℃、24時間処理し、PEG結合リン脂質をリポソーム表面に固定化した前記リポソーム懸濁液を5181mL得た。
前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度は6.1w/v%であり、アロステリック因子であるフィチン酸12ナトリウム濃度は0.0360w/v%であり、ステアリン酸濃度は0.59w/v%であり、ヘモグロビン収率は31%であった。製造直後の前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率は4.3％であった。
【００２１】
＜酸素運搬量の算出＞
前記リポソーム懸濁液の酸素解離曲線（37℃）から求めた通常の酸素分圧（通常の血液循環における）である酸素分圧100mmHgと酸素分圧40mmHgの間の酸素運搬効率は25％であり、低酸素領域（出血ショック治療初期又は梗塞部位、ガン部位など）である酸素分圧40mmHgと酸素分圧0mmHgの間の酸素運搬効率は61％であった。前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度6.1w/v%、ヘモグロビンメト化率4.3w/v%、前記リポソーム懸濁液の酸素運搬効率（通常の酸素分圧設定又は低酸素領域酸素分圧設定）を前述0011に記載の（３）式に当てはめると、前記リポソーム懸濁液1mLが、通常の酸素分圧（通常の血液循環における）である酸素分圧100mmHgと酸素分圧40mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）は0.023mLと算出された。一方、低酸素領域（出血ショック治療初期又は梗塞部位、ガン部位など）の酸素分圧40mmHgと酸素分圧0mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）は0.056ｍＬと算出された。
【実施例２】
【００２２】
＜中酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液の製造＞
アロステリック因子添加量により、酸素解離曲線を低酸素親和性より左に且つ、高酸素親和性より右にシフトさせる。
水素添加ホスファチジルコリン3149g、コレステロール1543g、ステアリン酸809gから成る均一混合脂質に水5501gを加えて、85℃で30分間加熱して水和膨潤均一混合脂質を調整した。期限切れ濃厚赤血球製剤からヘモグロビンを精製、濃縮し、アロステリック因子として、フィチン酸12ナトリウムをヘモグロビンに対して、0.5モル添加したヘモグロビン濃度42.6w/v%の濃厚ヘモグロビン溶液を調整した。前記水和膨潤均一混合脂質11002gに前記濃厚ヘモグロビン溶液39295gを添加し、均一に攪拌し前乳化を行なった。前記前乳化後に更に強力な攪拌により、本乳化を行なった。前記本乳化後の混合液を生理食塩水により希釈して、0.45μm膜を用いて、循環濾過により粒子径の制御を行なった。次に10mg / mL濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水を使用し、亜硫酸ナトリウムによる脱酸素化を行なった後、分画分子量30万の限外濾過膜を用いて、0.5mg mL濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水による加水濃縮で、リポソーム化されなかったヘモグロビン及びフィチン酸12ナトリウムを除去し、ヒト由来濃厚ヘモグロビン及びアロステリック因子含有リポソーム懸濁液を作成した。前記リポソーム懸濁液にPEG結合リン脂質として、DSPE-PE5000（日本油脂製）を生理食塩水に溶解させたPEG結合リン脂質水溶液を添加した。前記リポソーム及びPEG結合リン脂質を含有した前記リポソーム懸濁液中のリポソーム膜構成脂質濃度が4.09w/v%であり、PEG結合リン脂質が0.43w/v%である様に調整した後、37℃、24時間処理し、PEG結合リン脂質をリポソーム表面に固定化した前記リポソーム懸濁液を87683mL得た。
前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度は6.3w/v%であり、アロステリック因子であるフィチン12ナトリウム濃度は0.040w/v%であり、ステアリン酸濃度は0.62w/v%であり、ヘモグロビン収率は33%であった。製造直後の前記リポソーム懸濁液のヘモグロビンメト化率は5.0%であった。
【００２３】
＜酸素運搬量の算出＞
前記リポソーム懸濁液の酸素解離曲線（37℃）から求めた通常の酸素分圧（通常の血液循環における）である酸素分圧100mmHgと酸素分圧40mmHgの間の酸素運搬効率は23%であり、低酸素領域（出血ショック治療初期又は梗塞部位、ガン部位など）である酸素分圧40mmHgと酸素分圧0mmHgの間の酸素運搬効率は63%であった。前記リポソーム懸濁液のヘモグロビン濃度6.3w/v%、ヘモグロビンメト化率5.0%、前記リポソーム懸濁液の酸素運搬効率（通常の酸素分圧設定又は低酸素領域酸素分圧設定）を前述0012に記載の（３）式に当てはめると、前記リポソーム懸濁液1mLが、通常の酸素分圧（通常の血液循環における）である酸素分圧100mmHgと酸素分圧40mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）は0.022mLと算出された。一方、低酸素領域（出血ショック治療初期又は梗塞部位、ガン部位など）の酸素分圧40mmHgと酸素分圧0mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）は0.059mLと算出された。
【００２４】
＜低酸素親和性及び高酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液との比較＞
低酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液（後述、比較例1）、中酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液（前述、実施例1、実施例2）、高酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液（後述、比較例2）の各々が、通常の血液循環における酸素分圧100mmHg〜40mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）及び低酸素分圧領域（出血ショック治療初期又は梗塞部位、ガン部位など）40mmHg〜0mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）を表1に纏める。実施例1の中酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液は比較例1の低酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液と比較すると、低酸素分圧領域（40mmHg〜0mmHg）へ運び得る酸素量が1.47倍に増加し、出血ショック治療初期、梗塞部位、ガン部位への酸素供給に有利となる。比較例2の高酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液と比較すると、通常の血液循環における酸素分圧領域（100mmHg〜40mmHg）へ運び得る酸素量が8.21倍に増加している事が確認された。高酸素親和性では低酸素領域での酸素運搬に極端に特化しており、これに対して中酸素親和性では高酸素親和性と比較して、低酸素領域への酸素運搬と、通常の血液循環における酸素分圧での酸素運搬のバランスが取れており、且つ、低酸素親和性と比較し、低酸素領域への酸素運搬量が増加している事が分かる。実施例2も比較例1及び比較例2と比較して同様の傾向が認められた。また、実施例1、実施例2と同じくアロステリックエフェクターを用いて酸素運搬を制御する比較例1を比較すると、実施例1、実施例2の中酸素親和性ではヘモグロビン収率が各々2.52倍、2.58倍に増加した。
【００２５】
【表１】
（比較例1）
【００２６】
＜低酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液の製造＞
アロステリック因子を添加して、酸素解離曲線を天然赤血球と比較して、より右にシフトさせる。
水素添加大豆ホスファチジルコリン182g、コレステロール89g、ステアリン酸46gからなる均一混合脂質に水317gを加えて、85℃で30分加熱して水和膨潤均一混合脂質を調整した。期限切れ濃厚赤血球製剤からヘモグロビンを精製、濃縮し、アロステリック因子として、フィチン酸12ナトリウムをヘモグロビンに対して等モル添加したヘモグロビン濃度42.6w/v%の濃厚ヘモグロビンを調整した。前記水和膨潤均一混合脂質634gに前記フィチン酸12ナトリウム添加濃厚ヘモグロビン溶液2264gを添加し、水和膨潤均一混合脂質中のステアリン酸を中和する量の水酸化ナトリウムを添加しつつ、均一に攪拌し、前乳化を行なった。前記前乳化後に更に強力な攪拌により、本乳化を行なった。前記本乳化後の混合液を生理食塩水により希釈して、0.45μm膜を用いて、循環濾過により粒子径の制御を行なった。次に10mg/ml濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水を使用し、亜硫酸ナトリウムによる脱酸素化を行なった後、分画分子量30万の限外濾過膜を用いて、0.5mg/ml濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水による加水濾過濃縮で、リポソーム化されなかったヘモグロビン及びフィチン酸12ナトリウムを除去し、ヒト由来濃厚ヘモグロビン及びアロステリック因子含有リポソーム懸濁液を作成した。前記リポソーム懸濁液に、PEG結合リン脂質として、DSPE-PEG5000（日本油脂製）を生理食塩水に溶解させたPEG結合リン脂質水溶液を添加した。前記リポソーム及びPEG結合リン脂質を含有した前記リポソーム懸濁液中のリポソーム膜構成脂質濃度が4.04w/v%であり、PEG結合リン脂質濃度が0.33w/v%である様に調整した後、37℃、24時間処理し、PEG結合リン脂質をリポソーム表面に固定化した前記リポソーム懸濁液1991mLを得た。
前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度は6.2w/v%であり、アロステリック因子であるフィチン酸12ナトリウム濃度は0.077w/v%であり、ステアリン酸濃度は0.60w/v%であり、ヘモグロビン収率は12.8%であった。製造直後の前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率は4.5%であつた。
【００２７】
＜酸素運搬量の算出＞
前記リポソーム懸濁液の酸素解離曲線（37℃）から求めた酸素運搬効率（高酸素親和性設定：酸素分圧40mmHgと酸素分圧0mmHgの間の酸素飽和度の差）は41%であった。前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度6.2%、ヘモグロビンメト化率4.5%、前記リポソーム懸濁液の酸素運搬効率（高酸素親和性設定）41%を前述0013に記載の(3)式に当てはめると、前記リポソーム懸濁液1mLが酸素分圧40mmHg〜0mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）は0.038mLと算出された。一方、酸素分圧100mmHgと40mmHgの間の運搬可能な酸素量（37℃、1気圧）は、酸素解離曲線が右にシフトしており、この場合の酸素運搬効率（低酸素親和性設定）が37%となるので、同じく前述0012に記載の(3)式に当てはめると0.035mLとなる。
（比較例2）
【００２８】
＜高酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液の製造＞
アロステリック因子を添加せず、酸素解離曲線を天然赤血球と比較して、より左にシフトさせる。
水素添加大豆ホスファチジルコリン182g、コレステロール89g、ステアリン酸46gからなる均一混合脂質に水317gを加えて、85℃で30分間加熱して水和膨潤均一混合脂質を調整した。期限切れ濃厚赤血球際剤からヘモグロビンを精製、濃縮し、ヘモグロビン濃度42.0w/v%の濃厚ヘモグロビンを調整した。前記水和膨潤均一混合脂質634gに前記濃厚ヘモグロビン溶液2264gを添加し、均一に攪拌し前乳化を行なった。前記前乳化後に更に強力な攪拌により、本乳化を行なった。前記本乳化後の混合液を生理食塩水により希釈して、0.45μm膜を用いて、循環濾過により粒子径の制御を行なった。次に10mg/mL濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水溶液を使用し、亜硫酸ナトリウムによる脱酸素化を行なった後、分画分子量30万の限外濾過膜を用いて、0.5mg/mL濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水溶液による加水濃縮で、リポソーム化されなかったヘモグロビンを除去し、ヒト由来濃厚ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液を作成した。前記リポソーム懸濁液に、PEG結合リン脂質として、DSPE-PEG5000（日本油脂製）を生理食塩水に溶解させたPEG結合リン脂質生理食塩水溶液を添加した。前記リポソーム及びPEG結合リン脂質を含有した前記リポソーム懸濁液中のリポソーム膜形成脂質濃度が4.05w/v%であり、PEG結合リン脂質濃度が0.31w/v%である様に調整した後、37℃、24時間処理し、PEG結合リン脂質をリポソーム表面に固定化した前記リポソーム懸濁液8000mLを得た。
前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度は6.3w/v%であり、ステアリン酸濃度は0.58w/v%であり、ヘモグロビン収率は53.0%であった。製造直後の前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率は4.0%であった。
【００２９】
＜酸素運搬量の算出＞
前記リポソーム懸濁液の酸素解離曲線（37℃）から求めた酸素運搬効率（高酸素親和性設定。酸素分圧40mmHgと酸素分圧0mmHgの間の酸素飽和度の差）は97%であった。前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度：6.3w/v%、ヘモグロビンメト化率：4.0%、前記リポソーム懸濁液の酸素運搬効率（高酸素親和性設定）：97%を前述0015に記載の（３）式に当てはめると、前記リポソーム懸濁液1mLが酸素分圧40mmHg〜0mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）は0.092mLと算出された。一方、酸素解離曲線が天然赤血球より左にシフトしているので、100mmHgと40mmHgの間の酸素運搬効率は僅か3%となり、100mmHgと40mmHgの間で運搬可能な酸素量は、前述0012に記載の（３）式に当てはめると0.0028mLとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ヒト天然血液の酸素解離曲線を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、出血治療又は梗塞治療などに用いるヘモグロビン含有リポソーム懸濁液に関する。
【背景技術】
【０００２】
出血治療又は梗塞治療などに用いる人工酸素運搬体として、ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液が様々に検討されて来た。ヘモグロビンベースの人工酸素運搬体はアロスリック因子を用いて、酸素親和性を制御する事が可能である。通常の血液循環における肺の酸素分圧100mmHgと組織末端の酸素分圧40mmHgの間の酸素運搬量を多くする為、酸素親和性を制御する方法が検討されて来た（特公平4-66456、特開2008-120760）。出血ショック時又は梗塞時は血流不全の為、組織末端は酸素不足に陥っており、通常の組織末端の酸素分圧40mmHgより更に低くなっている。この場合、酸素分圧100mmHgと酸素分圧40mmHgの間の酸素供給だけでなく、酸素分圧40mmHg以下の部位への酸素供給を十分に考慮する必要がある。特に梗塞部位等への適用では酸素分圧40mmHg以下への酸素供給が重要である。酸素親和性を制御する主な因子はヘモグロビンに対するアロステリック因子添加量である。また、アロステリック因子はヘモグロビン収率（仕込みヘモグロビン量に対するリポソーム化されたヘモグロビン量の割合（％））にも関与する事を、本発明者等は見出しており（特願2008-79396）、この観点からの検討は従来十分ではなかった。酸素親和性を制御する因子はアロステリック因子だけでなく、リポソーム内水相のpHも関与し、リポソーム内水相のpHには、リポソーム化前のヘモグロビンのpHだけでなくリポソーム膜形成脂質組成も影響を与える。そして、リポソーム膜形成脂質組成はリポソーム内のヘモグロビン保持機能等にも関与する。これらの因子を総合的に検討し、アロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするリポソーム懸濁液において、酸素親和性を適切に制御し、且つ、ヘモグロビン収率を向上させる検討は、従来、行なわれていなかった。
【特許文献１】特公平4-66456号公報
【特許文献２】特開2008-120760号公報
【非特許文献１】人工血液2003;11(3)：179-184
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ヘモグロビンベースの人工酸素運搬体において、ヒト血液を原料とする場合、赤血球からヘモグロビンを取り出す工程で、ヒト赤血球に元々存在するアロステリック因子の2,3-DPG（酸素放出能を高める燐酸化合物）が失われる。その結果として、酸素解離曲線（詳細は0010に記述）は左にシフトし、酸素運搬効率（詳細は0010に記述）は低くなってしまう問題があった。この問題を解決する為、ヘモグロビン溶液型の人工酸素運搬体では、ヘモグロビンにアロステリック因子を化学結合させたり、ヘモグロビン含有リポソーム型の人工酸素運搬体では、予めヘモグロビン溶液にアロステリック因子を添加する技術を用いている。これらは何れも通常の血液循環における肺の酸素分圧100mmHgと通常の組織末端の酸素分圧40mmHgの間の酸素運搬量を多くする為に、酸素放出能を制御する方法であった（特公平4-66456、特開2008-120760）。本発明では、このタイプを低酸素親和性〔高酸素親和性（後述）と比較して、通常の血液循環における酸素分圧領域（100mmHg〜40mmHg）において酸素を放し易い〕と呼び、天然赤血球と比較して、酸素解離曲線が右にシフトしている状態を示す。
また、人工酸素運搬体としてのヘモグロビン含有リポソームの平均粒子径は0.2μm前後である。天然赤血球（7〜8μm）と比較すると、非常に小さいので、血栓、栓塞等で血流が阻害されて、虚血により低酸素状態に陥った部位（酸素分圧が、通常の組織末端の酸素分圧40mmHgより更に低い）に対して、狭窄部位（天然赤血球では通過困難な）を通過して、或いは側副血行路や周囲の毛細血管を介して、酸素を供給する事も可能である（Circulation, 2004;100(Suppl-Ｉ)：483、CirculationJ.,2004:68(Suppl-Ｉ)：Ｉ-133）。また、癌組織においては、時として癌細胞の増殖に見合った血管新生を伴わないので、その血管網は無秩序で且つ、脆弱で有り、癌組織の血流は不安定で、一時的な血流遮断を繰り返している。この為、癌組織内部の細胞は低酸素状態にさらされている。この低酸素状態により、癌治療の為の放射線照射に対して抵抗性を示すが、人工酸素運搬体としてのヘモグロビン含有リポソーム懸濁液は、天然赤血球では到達不可能な癌組織内低酸素部位までに、酸素を供給出来る可能性がある（ASAIOJ.,2004:50:164）。この為、ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液を人工酸素運搬体として、梗塞部位、ガン部位など、通常の組織末端（酸素分圧：40mmHg）より、更に低酸素状態の部位に、酸素を供給し易くする事を目的として、酸素分圧40mmHgと0mmHgの間の酸素運搬量を多くする為に、酸素放出能を制御したヘモグロビン含有リポソーム懸濁液を、本発明者等は鋭意検討して来た（特願2006-308816）。本発明では、このタイプを高酸素親和性〔低酸素親和性（前述）と比較して、通常の血液循環における酸素分圧領域（100mmHg〜40mmHg）において酸素を放し難い〕と呼び、天然赤血球と比較して、酸素解離曲線が左にシフトしている状態を示す。
【０００４】
更に、出血ショックにおいては、血液が失われ、血流不全となる為、組織末端は酸素不足に陥っているので、通常の酸素分圧40mmHgより低い状態にある。従って、出血ショック治療初期においては、酸素分圧40mmHg以下の部位への酸素供給が重要であり、人工酸素運搬体が投与され、低酸素分圧領域への酸素供給及び血管内循環量が確保された後は、今度は、通常の血液循環における酸素分圧100mmHg〜40mmHgの間での酸素供給が重要となる。この点に着目し、低酸素親和性の人工酸素運搬体と高酸素親和性の人工酸素運搬体を併用して用いる事を特徴とする人工酸素運搬体も検討して来た。（特願2008-219207）。しかし、この方法は、低酸素親和性と高酸素親和性の２つの製剤が必要となる問題がある。
【０００５】
本発明では、出血治療時だけでなく、梗塞部位、ガン部位などの治療時にも、適切な酸素運搬が可能で有り、しかも、１つの製剤で、その目的を達する為、酸素分圧100mmHg〜40mmHgの酸素運搬と酸素分圧40mmHg〜0mmHgの酸素運搬がバランスよく出来る中酸素親和性の人工酸素運搬体を検討した。本発明では中酸素親和性とは、酸素解離曲線が、低酸素親和性と比較して左にシフトし、且つ、高酸素親和性と比較して右にシフトしている状態を示す。中酸素親和性は低酸素親和性と比較した場合、より低酸素領域（酸素分圧40mmHg〜0mmHg）への酸素供給を増加させ、出血ショック治療初期、梗塞部位、ガン部位への酸素供給に有利となる。高酸素親和性と比較した場合は、より通常の酸素分圧領域（酸素分圧100mmHg〜40mmHg）への酸素供給を増加させる事が出来、高酸素親和性と比較し、酸素分圧100mmHg〜40mmHgにおける酸素供給及び酸素分圧40mmHg~0mmHgにおける酸素供給のバランスが良くなる。また、酸素親和性を制御する主な因子はヘモグロビンに対するアロステリック因子量であるが、アロステリック因子添加量はヘモグロビン収率にも影響を与える事を本発明者等は見出しており、アロステリック因子添加量を減少させると、ヘモグロビン収率が増加する傾向にある。そして、酸素親和性を制御する因子はアロステリック因子だけでなく、リポソーム内水相のpHも関与している。リポソーム内水相のpHはリポソーム化前のヘモグロビンのpHだけでなくリポソーム膜形成脂質組成中のステアリン酸の影響も受ける（特開2008-120760、特願2006-308816）。また、ステアリン酸はヘモグロビン収率、内水相ヘモグロビンの保持機能、ヘモグロビンメト化率へも影響を与える（詳細は0011に記述）。今回の発明においては、これらの因子を総合的に検討し、中酸素親和性に酸素運搬能を制御し、出血治療時だけでなく、梗塞部位、ガン部位などの治療時にも適切な酸素運搬が、１つの製剤で可能であり、且つ、ヘモグロビン収率を向上させたアロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするリポソーム懸濁液を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液において、（１）ヘモグロビン濃度（２）アロステリック因子濃度（３）リポソーム膜構成脂質濃度（４）ステアリン酸濃度を適切に設定する事により、中酸素親和性に酸素親和性を制御し、出血治療時だけでなく、梗塞部位、ガン部位などの治療時にも適切な酸素運搬が、１つの製剤で可能であり、且つ、ヘモグロビン収率を向上させたアロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするリポソーム懸濁液が下記のごとく提供される。
【０００７】
(1)アロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするリポソーム懸濁液であって、前記リポソーム膜形成脂質がステアリン酸を含み、前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度が5.6〜6.7w/v%であり、アロステリック因子濃度が0.033〜0.045w/v%であり、リポソーム膜形成脂質濃度が3.05〜5.10w/v%であり、ステアリン酸濃度が0.41〜0.77w/v%である事を特徴とする前記リポソーム懸濁液。
(2)前記アロステリック因子がフィチン酸12ナトリウムである事を特徴とする(1)に記載のリポソーム懸濁液。
(3)前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率が10%以下である事を特徴とする(1)に記載のリポソーム懸濁液。
【発明の効果】
【０００８】
以上、詳述した様に、本発明はアロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするリポソーム懸濁液において、(1)ヘモグロビン濃度(2)アロステリック因子濃度(3)リポソーム膜構成脂質濃度(4)ステアリン酸濃度について、特に酸素親和性に直接的に影響するアロステリック因子濃度及び間接的に影響を与えるステアリン酸濃度を適切に設定し、出血治療時だけでなく、梗塞部位、ガン部位などの治療時にも適切な酸素運搬が、１つの製剤で可能であり、且つ、ヘモグロビン収率を向上させたアロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするヘモグロビン含有リポソーム懸濁液が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を具体的に説明する。
＜リポソーム膜構成脂質＞
本発明におけるリポソーム膜形成脂質は天然又は合成の脂質が使用可能である。特にリン脂質が好適に使用される。これらを常法に従って水素添加したものがあげられる。更にリポソーム膜形成脂質には所望によりステロール等の膜強化剤や荷電物質として高級飽和脂肪酸を添加しても良い。リン脂質としては水素添加大豆リン脂質、膜強化剤としてコレステロール、荷電物質としてステアリン酸等が好適に使用される。
【００１０】
＜リポソーム内水相に含有されるヘモグロビン＞
本発明のリポソーム内水相に含有されるヘモグロビンは、公知の方法によりヒト期限切れ濃厚赤血球製剤より白血球、血小板、血漿及び赤血球膜を除去した後、濃縮したヒト由来濃厚ヘモグロビンが用いられる。
【００１１】
＜リポソーム凝集抑制剤＞
リポソーム表面への蛋白吸着抑制剤又はリポソーム凝集抑制剤として、公知の方法 ( 特開2008-024646など ) により、一端に疎水性を有し、且つ、他端に親水性高分子を有する化合物が用いられる。ポリエチレングリコールとリン脂質が共有結合したポリエチリングリコール結合リン脂質が好適に用いられる。
【００１２】
＜アロステリック因子による酸素解離曲線の制御＞
本発明に記載されるアロステリック因子とは、酸素解離曲線（ヘモグロビンの酸素飽和度と酸素分圧との関係を示す曲線。ヒト天然赤血球の酸素解離曲線は図1参照）に影響を与える因子である。アロステリック因子としては、特開昭57-26621号に記載のものも使用出来るが、安全性、保存安定性、価格、入手のし易さ、効果の点でフィチン酸が好ましく、フィチン酸12ナトリウムがより好ましい。アロステリック因子は酸素解離曲線を右にシフトさせ、その結果として酸素運搬効率を高くする。一般的には、天然赤血球の酸素運搬効率とは、通常の血液循環における肺の酸素分圧である100mmHgと酸素供給先である組織末端の酸素分圧40mmHgとの間のヘモグロビンの酸素飽和度の差を示す。図1が示す様に、ヒト天然赤血球では肺（酸素分圧100mmHg）で、酸素飽和度は約100%であり、組織末端（酸素分圧40mmHg）では酸素飽和度は約75%なので、通常の血液循環において、肺と組織末端との間で、酸素飽和量の約25%を組織に供給する。人工酸素運搬体としてのヘモグロビン含有リポソーム懸濁液において、ヒト血液を原料とする場合、赤血球からヘモグロビンを取り出す工程において、ヒト赤血球に元々存在するアロステリック因子の2,3-DPG（酸素放出能を高める燐酸化合物）が失われる。その結果として、酸素解離曲線は左にシフトし、天然赤血球で得られた100mmHgと40mmHgの間での酸素運搬効率が低下してしまう問題が有った。本発明者らは、予めヘモグロビン溶液にアロステリック因子を添加し、これをリポソーム化する事により、この問題を解決する方法を鋭意検討して来た（特公平4-66456、特開2008-120760）。このタイプを本発明では低酸素親和性と呼んでいる（0003に既述）。
しかし、梗塞部位、ガン部位などの治療時における酸素供給では（特願2008-79396）、末梢循環不全となり、組織末端では酸素不足に陥っており、組織末端の酸素分圧は通常の組織末端の酸素分圧40mmHgよりも更に低くなっている。酸素分圧40mmHgよりも更に低い酸素分圧の部位に酸素を供給する為には、酸素分圧40mmHgと酸素分圧0mmHgとの間での酸素運搬効率が重要であり、酸素解離曲線を適切な範囲で左にシフトさせれば、天然赤血球と比較して、酸素分圧100mmHg〜40mmHgの間では、酸素を離し難く、酸素分圧40mmHg以下の部位で酸素を離し易くなる。梗塞部位又はガン部位などの低酸素領域に運搬可能な酸素運搬量を増加させる為には、酸素解離曲線を右にシフトさせる作用のあるアロステリック因子については添加量を少なくするか、或いは添加しない技術を用いる高酸素親和性の人工酸素運搬体が有利である（特願2008-79396）。
【００１３】
出血ショック時の治療初期においては、血液が失われ、血流不全となる為、組織末端は酸素不足に陥っているので、高酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液（アロステリック因子の添加量が少ないか或いは添加しない）を投与し、酸素分圧40mmHg以下の低酸素部位への効率の良い酸素供給を行なう。その後では、今度は通常の肺の酸素分圧100mmHgと組織末端の酸素分圧40mmHgとの間での酸素供給が必要となるので、低酸素親和性の人工酸素運搬体が有利となる。そこで、高酸素親和性の人工酸素運搬体投与の後で、低酸素親和性の人工酸素運搬体を投与する事を特徴とする人工酸素運搬体も考えられる（特願2008-219207）。しかし、この方法の短所としては、低酸素親和性と高酸素親和性の２つ
の製剤を必要とする事がある。
【００１４】
本発明においては、出血治療、梗塞治療、ガン治療において、１つの製剤で、適切な酸素運搬が可能となる様に、低酸素親和性と比較した場合は、より低酸素領域（酸素分圧40mmHg〜0mmHg）への酸素供給を増加させ、且つ、高酸素親和性と比較した場合は、より通常の酸素分圧領域（酸素分圧100mmHg〜40mmHg）への酸素供給を増加させた中酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液を鋭意検討した。中酸素親和性では、低酸素親和性と比較して、酸素解離曲線が左にシフトしており、ヘモグロビンに対するアロステリック因子添加量は少なくて済み、その結果、ヘモグロビン収率は向上する。ヘモグロビン収率が向上するだけでなく、低酸素親和性と比較して、低酸素領域（酸素分圧40mmHg〜0mmHg）への酸素供給が増加するので、出血ショック治療初期又は梗塞部位、ガン部位などの治療に有利となる。以上により、本発明において、適切に設定した前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度（詳細は0013に記述）、及びステアリン酸濃度（詳細は0011に記述）に対する、前記リポソーム懸濁液中のアロステリック因子であるフィチン酸12ナトリウム濃度は0.033〜0.045w/v%であり、より好ましくは0.035〜0.043w/v%である。
【００１５】
＜ステアリン酸組成比が内水相pH及びヘモグロビン保持機能などに及ぼす影響＞
酸素解離曲線に影響を与える因子はアロステリック因子だけでなく、内水相ヘモグロビンのpHも影響を与える。内水相ヘモグロビンのpHには、リポソーム化前の赤血球膜除去濃厚ヘモグロビンのpHだけでなく、リポソーム膜構成脂質中のステアリン酸組成比も影響を与える。つまり、ステアリン酸組成比が高いと内水相pHは低下する傾向に有り、酸素解離曲線は右にシフトし、ステアリン酸組成比が低いと、ステアリン酸組成比が高い場合と比較し、内水相pHは上昇する傾向に有り、酸素解離曲線は左にシフトする。
ステアリン酸組成比は内水相pHを介して、酸素解離曲線に影響を与えるばかりでなく、内水相ヘモグロビンの保持機能にも関与する。つまり、ステアリン酸組成比が高いとヘモグロビン保持機能が低くなり、ステアリン酸組成比が低いとヘモグロビン保持機能が向上する傾向に有る。ヘモグロビン保持機能が低い場合、ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液が生体に投与された時、血漿中にリポソーム内部のヘモグロビンが漏れ出す懸念がある。血漿中に漏れ出したヘモグロビンは、血漿中に存在するハプトグロビンにより、肝臓に運ばれ、分解、再利用されるが、一定量を越えると、ハプトグロビンによる処理能力を超えるので、可能な限り、ヘモグロビン保持機能を向上させておく必要が有る。他方、ステアリン酸組成比はヘモグロビン収率にも影響を与え、ステアリン酸組成比が高いとヘモグロビン収率が高くなり、ステアリン酸組成比が低いとヘモグロビン収率が低くなる。これらを総合的に検討する必要が有り、今回、これらの因子を総合的に考慮し、本発明におけるヘモグロビン含有リポソーム懸濁液中のステアリン酸濃度を0.41〜0.77w/v%、より好ましくは0.47〜0.71w/v%に設定した。
【００１６】
＜ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液の酸素運搬量設定＞
本発明における、ヘモグロビンを内水相とするリポソーム懸濁液1mLが酸素分圧100mmHgと酸素分圧40mmHgの間で運搬可能な酸素運搬量（通常の血液循環における酸素供給を想定）又は、酸素分圧40mmHgと0mmHgの間で運搬可能な酸素運搬量（梗塞部位、ガン部位への酸素供給を想定）は、本発明において、以下の3項目により理論的に算出する。（１）前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度（ヘモグロビンが酸素運搬の主役である）（２）前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率（ヘモグロビンが酸化されて、メトヘモグロビンとなると酸素運搬能を失う）（３）前記リポソーム懸濁液の酸素運搬効率。本発明の酸素運搬効率は通常の血液循環における酸素供給の為には、酸素分圧10mmHgと40mmHgの間で設定される（酸素解離曲線において酸素分圧100mmHgと40mmHgの間の酸素飽和度の差）。また、梗塞部位又はガン部位への酸素供給の為には、酸素分圧40mmHgと0mmHgの間で設定される（酸素解離曲線において酸素分圧40mmHgと0mmHgの間の酸素飽和度の差）。
前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度：Aw/v%、前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率：Ｂ％、前記リポソーム懸濁液の酸素運搬効率（「通常の血液循環における酸素供給を想定」又は「梗塞部位又はガン部位への酸素供給を想定」）：C%とすると、前記リポソーム懸濁液1mLが、酸素分圧100mmHgと40mmHgの間で、又は、酸素分圧40mmHgと0mmHgの間で運搬可能な酸素量DmL（37℃、1気圧）は、以下の様に理論的に計算される。
リポソーム懸濁液1mL中のヘモグロビンに結合可能な酸素分子数（moL）は、ヘモグロビンに結合可能な酸素分子が4つである事から、
｛A (1−B / 100) × 4 / 64500｝/ 100．．．．．(1)となる。
更に、酸素運搬効率がC%である事から、リポソーム懸濁液1mLが放出する酸素分子数(moL)は、
（１）×（C / 100）．．．．(2)となる。
また、気体の状態方程式PV＝nRT、R(atm・1 / K・moL)＝0.082より、
D(mL)＝（2）×0.082×（37＋273）×1000．．．．(3)となる。
以上により、前記ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液において、（1）前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度(2)前記リポソーム懸濁液中の酸素運搬効率(3)前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率を適切に制御し、設定する事により、適切な酸素運搬量の設定が可能となる。
【００１７】
＜リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度＞
本発明における人工酸素運搬体としてのヘモグロビン含有リポソーム懸濁液の酸素運搬効率の主役はヘモグロビンである。前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度が高過ぎると、ヘモグロビンをリポソーム化する為のリポソーム膜形成脂質の濃度が必然的に高くなり、生体に投与される総脂質濃度が高くなって、安全性の面で懸念がある。また、前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度が低過ぎると、酸素運搬の主役であるヘモグロビンの絶対量が不足して、酸素運搬量設定に不利となる。従って、前記リポソーム懸濁液中の適切なヘモグロビン濃度は5.6〜6.7w/v%であり、より好ましくは5.7〜6.6w/v%である。
【００１８】
＜リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率＞
ヘモグロビンは酸化されて、メトヘモグロビンとなると、酸素運搬能を失うので、人工酸素運搬体としてのヘモグロビン含有リポソームにおいては、ヘモグロビンの酸化防止（ヘモグロビンメト化防止）は、重要課題の１つである。ヘモグロビンのpHが過度に低下すると、ヘモグロビンの酸化が促進するので、製造工程を低温に保つと同時に、製造工程ではヘモグロビンのpH制御を行い、公知の方法（特開2006-104069）により、還元剤使用による脱酸素化及び脱酸素化状態のまま、製造バッグに無菌充填した後、脱酸素化状態を維持出来る様に外包装を行う。前記リポソーム懸濁液製造直後及び有効期間中のヘモグロビンメト化率は10%以下である。ヘモグロビンメト化率がこれより高くなると、前記リポソーム懸濁液の酸素運搬量が低下し、酸素運搬体として不利となる。
【実施例１】
【００１９】
次に本発明の実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。なお、前記リポソーム懸濁液の製造工程は無菌環境下での操作とした。
【００２０】
＜中酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液の製造＞
アロステリック因子添加量により、酸素解離曲線を低酸素親和性より左に且つ、高酸素親和性より右にシフトさせる。
水素添加ホスファチジルコリン192g、コレステロール94g、ステアリン酸49gからなる均一混合脂質に水335gを加えて、85℃で30分間加熱して水和膨潤均一混合資質を調整した。期限切れ濃厚赤血球製剤からヘモグロビンを精製、濃縮し、アロステリック因子として、フィチン酸12ナトリウムをヘモグロビンに対して、0.5モル添加したヘモグロビン濃度42.6w/v%の濃厚ヘモグロビン溶液を調製した。前記水和膨潤均一混合脂質670gに前記濃厚ヘモグロビン溶液2393gを添加し、均一に攪拌し前乳化を行なった。前記前乳化後に更に強力な攪拌により、本乳化を行なった。前記本乳化後の混合液を生理食塩水により希釈して、0.45μｍ膜を用いて、循環濾過により粒子径の制御を行なった。次に10mg/mL濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水を使用し、亜硫酸ナトリウムによる脱酸素化を行なった後、分画分子量30万の限外濾過膜を用いて、0.5mg/mL濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水による加水濃縮で、リポソーム化されなかったヘモグロビン及びフィチン酸12ナトリウムを除去し、ヒト由来濃厚ヘモグロビン及びアロステリック因子含有リポソーム懸濁液を作成した。前記リポソーム懸濁液に、PEG結合リン脂質として、DSPE-PE5000（日本油脂製）を生理食塩水に溶解させたPEG結合リン脂質水溶液を添加した。前記リポソーム及びPEG結合リン脂質を含有した前記リポソーム懸濁液中のリポソーム膜構成脂質濃度が4.48w/v%であり、PEG結合リン脂質が0.41w/v％である様に調製した後、37℃、24時間処理し、PEG結合リン脂質をリポソーム表面に固定化した前記リポソーム懸濁液を5181mL得た。
前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度は6.1w/v%であり、アロステリック因子であるフィチン酸12ナトリウム濃度は0.0360w/v%であり、ステアリン酸濃度は0.59w/v%であり、ヘモグロビン収率は31%であった。製造直後の前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率は4.3％であった。
【００２１】
＜酸素運搬量の算出＞
前記リポソーム懸濁液の酸素解離曲線（37℃）から求めた通常の酸素分圧（通常の血液循環における）である酸素分圧100mmHgと酸素分圧40mmHgの間の酸素運搬効率は25％であり、低酸素領域（出血ショック治療初期又は梗塞部位、ガン部位など）である酸素分圧40mmHgと酸素分圧0mmHgの間の酸素運搬効率は61％であった。前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度6.1w/v%、ヘモグロビンメト化率4.3w/v%、前記リポソーム懸濁液の酸素運搬効率（通常の酸素分圧設定又は低酸素領域酸素分圧設定）を前述0011に記載の（３）式に当てはめると、前記リポソーム懸濁液1mLが、通常の酸素分圧（通常の血液循環における）である酸素分圧100mmHgと酸素分圧40mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）は0.023mLと算出された。一方、低酸素領域（出血ショック治療初期又は梗塞部位、ガン部位など）の酸素分圧40mmHgと酸素分圧0mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）は0.056ｍＬと算出された。
【実施例２】
【００２２】
＜中酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液の製造＞
アロステリック因子添加量により、酸素解離曲線を低酸素親和性より左に且つ、高酸素親和性より右にシフトさせる。
水素添加ホスファチジルコリン3149g、コレステロール1543g、ステアリン酸809gから成る均一混合脂質に水5501gを加えて、85℃で30分間加熱して水和膨潤均一混合脂質を調整した。期限切れ濃厚赤血球製剤からヘモグロビンを精製、濃縮し、アロステリック因子として、フィチン酸12ナトリウムをヘモグロビンに対して、0.5モル添加したヘモグロビン濃度42.6w/v%の濃厚ヘモグロビン溶液を調整した。前記水和膨潤均一混合脂質11002gに前記濃厚ヘモグロビン溶液39295gを添加し、均一に攪拌し前乳化を行なった。前記前乳化後に更に強力な攪拌により、本乳化を行なった。前記本乳化後の混合液を生理食塩水により希釈して、0.45μm膜を用いて、循環濾過により粒子径の制御を行なった。次に10mg / mL濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水を使用し、亜硫酸ナトリウムによる脱酸素化を行なった後、分画分子量30万の限外濾過膜を用いて、0.5mg mL濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水による加水濃縮で、リポソーム化されなかったヘモグロビン及びフィチン酸12ナトリウムを除去し、ヒト由来濃厚ヘモグロビン及びアロステリック因子含有リポソーム懸濁液を作成した。前記リポソーム懸濁液にPEG結合リン脂質として、DSPE-PE5000（日本油脂製）を生理食塩水に溶解させたPEG結合リン脂質水溶液を添加した。前記リポソーム及びPEG結合リン脂質を含有した前記リポソーム懸濁液中のリポソーム膜構成脂質濃度が4.09w/v%であり、PEG結合リン脂質が0.43w/v%である様に調整した後、37℃、24時間処理し、PEG結合リン脂質をリポソーム表面に固定化した前記リポソーム懸濁液を87683mL得た。
前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度は6.3w/v%であり、アロステリック因子であるフィチン12ナトリウム濃度は0.040w/v%であり、ステアリン酸濃度は0.62w/v%であり、ヘモグロビン収率は33%であった。製造直後の前記リポソーム懸濁液のヘモグロビンメト化率は5.0%であった。
【００２３】
＜酸素運搬量の算出＞
前記リポソーム懸濁液の酸素解離曲線（37℃）から求めた通常の酸素分圧（通常の血液循環における）である酸素分圧100mmHgと酸素分圧40mmHgの間の酸素運搬効率は23%であり、低酸素領域（出血ショック治療初期又は梗塞部位、ガン部位など）である酸素分圧40mmHgと酸素分圧0mmHgの間の酸素運搬効率は63%であった。前記リポソーム懸濁液のヘモグロビン濃度6.3w/v%、ヘモグロビンメト化率5.0%、前記リポソーム懸濁液の酸素運搬効率（通常の酸素分圧設定又は低酸素領域酸素分圧設定）を前述0012に記載の（３）式に当てはめると、前記リポソーム懸濁液1mLが、通常の酸素分圧（通常の血液循環における）である酸素分圧100mmHgと酸素分圧40mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）は0.022mLと算出された。一方、低酸素領域（出血ショック治療初期又は梗塞部位、ガン部位など）の酸素分圧40mmHgと酸素分圧0mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）は0.059mLと算出された。
【００２４】
＜低酸素親和性及び高酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液との比較＞
低酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液（後述、比較例1）、中酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液（前述、実施例1、実施例2）、高酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液（後述、比較例2）の各々が、通常の血液循環における酸素分圧100mmHg〜40mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）及び低酸素分圧領域（出血ショック治療初期又は梗塞部位、ガン部位など）40mmHg〜0mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）を表1に纏める。実施例1の中酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液は比較例1の低酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液と比較すると、低酸素分圧領域（40mmHg〜0mmHg）へ運び得る酸素量が1.47倍に増加し、出血ショック治療初期、梗塞部位、ガン部位への酸素供給に有利となる。比較例2の高酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液と比較すると、通常の血液循環における酸素分圧領域（100mmHg〜40mmHg）へ運び得る酸素量が8.21倍に増加している事が確認された。高酸素親和性では低酸素領域での酸素運搬に極端に特化しており、これに対して中酸素親和性では高酸素親和性と比較して、低酸素領域への酸素運搬と、通常の血液循環における酸素分圧での酸素運搬のバランスが取れており、且つ、低酸素親和性と比較し、低酸素領域への酸素運搬量が増加している事が分かる。実施例2も比較例1及び比較例2と比較して同様の傾向が認められた。また、実施例1、実施例2と同じくアロステリックエフェクターを用いて酸素運搬を制御する比較例1を比較すると、実施例1、実施例2の中酸素親和性ではヘモグロビン収率が各々2.52倍、2.58倍に増加した。
【００２５】
【表１】
（比較例1）
【００２６】
＜低酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液の製造＞
アロステリック因子を添加して、酸素解離曲線を天然赤血球と比較して、より右にシフトさせる。
水素添加大豆ホスファチジルコリン182g、コレステロール89g、ステアリン酸46gからなる均一混合脂質に水317gを加えて、85℃で30分加熱して水和膨潤均一混合脂質を調整した。期限切れ濃厚赤血球製剤からヘモグロビンを精製、濃縮し、アロステリック因子として、フィチン酸12ナトリウムをヘモグロビンに対して等モル添加したヘモグロビン濃度42.6w/v%の濃厚ヘモグロビンを調整した。前記水和膨潤均一混合脂質634gに前記フィチン酸12ナトリウム添加濃厚ヘモグロビン溶液2264gを添加し、水和膨潤均一混合脂質中のステアリン酸を中和する量の水酸化ナトリウムを添加しつつ、均一に攪拌し、前乳化を行なった。前記前乳化後に更に強力な攪拌により、本乳化を行なった。前記本乳化後の混合液を生理食塩水により希釈して、0.45μm膜を用いて、循環濾過により粒子径の制御を行なった。次に10mg/ml濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水を使用し、亜硫酸ナトリウムによる脱酸素化を行なった後、分画分子量30万の限外濾過膜を用いて、0.5mg/ml濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水による加水濾過濃縮で、リポソーム化されなかったヘモグロビン及びフィチン酸12ナトリウムを除去し、ヒト由来濃厚ヘモグロビン及びアロステリック因子含有リポソーム懸濁液を作成した。前記リポソーム懸濁液に、PEG結合リン脂質として、DSPE-PEG5000（日本油脂製）を生理食塩水に溶解させたPEG結合リン脂質水溶液を添加した。前記リポソーム及びPEG結合リン脂質を含有した前記リポソーム懸濁液中のリポソーム膜構成脂質濃度が4.04w/v%であり、PEG結合リン脂質濃度が0.33w/v%である様に調整した後、37℃、24時間処理し、PEG結合リン脂質をリポソーム表面に固定化した前記リポソーム懸濁液1991mLを得た。
前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度は6.2w/v%であり、アロステリック因子であるフィチン酸12ナトリウム濃度は0.077w/v%であり、ステアリン酸濃度は0.60w/v%であり、ヘモグロビン収率は12.8%であった。製造直後の前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率は4.5%であつた。
【００２７】
＜酸素運搬量の算出＞
前記リポソーム懸濁液の酸素解離曲線（37℃）から求めた酸素運搬効率（高酸素親和性設定：酸素分圧40mmHgと酸素分圧0mmHgの間の酸素飽和度の差）は41%であった。前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度6.2%、ヘモグロビンメト化率4.5%、前記リポソーム懸濁液の酸素運搬効率（高酸素親和性設定）41%を前述0013に記載の(3)式に当てはめると、前記リポソーム懸濁液1mLが酸素分圧40mmHg〜0mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）は0.038mLと算出された。一方、酸素分圧100mmHgと40mmHgの間の運搬可能な酸素量（37℃、1気圧）は、酸素解離曲線が右にシフトしており、この場合の酸素運搬効率（低酸素親和性設定）が37%となるので、同じく前述0012に記載の(3)式に当てはめると0.035mLとなる。
（比較例2）
【００２８】
＜高酸素親和性のヘモグロビン含有リポソーム懸濁液の製造＞
アロステリック因子を添加せず、酸素解離曲線を天然赤血球と比較して、より左にシフトさせる。
水素添加大豆ホスファチジルコリン182g、コレステロール89g、ステアリン酸46gからなる均一混合脂質に水317gを加えて、85℃で30分間加熱して水和膨潤均一混合脂質を調整した。期限切れ濃厚赤血球際剤からヘモグロビンを精製、濃縮し、ヘモグロビン濃度42.0w/v%の濃厚ヘモグロビンを調整した。前記水和膨潤均一混合脂質634gに前記濃厚ヘモグロビン溶液2264gを添加し、均一に攪拌し前乳化を行なった。前記前乳化後に更に強力な攪拌により、本乳化を行なった。前記本乳化後の混合液を生理食塩水により希釈して、0.45μm膜を用いて、循環濾過により粒子径の制御を行なった。次に10mg/mL濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水溶液を使用し、亜硫酸ナトリウムによる脱酸素化を行なった後、分画分子量30万の限外濾過膜を用いて、0.5mg/mL濃度の亜硫酸ナトリウム生理食塩水溶液による加水濃縮で、リポソーム化されなかったヘモグロビンを除去し、ヒト由来濃厚ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液を作成した。前記リポソーム懸濁液に、PEG結合リン脂質として、DSPE-PEG5000（日本油脂製）を生理食塩水に溶解させたPEG結合リン脂質生理食塩水溶液を添加した。前記リポソーム及びPEG結合リン脂質を含有した前記リポソーム懸濁液中のリポソーム膜形成脂質濃度が4.05w/v%であり、PEG結合リン脂質濃度が0.31w/v%である様に調整した後、37℃、24時間処理し、PEG結合リン脂質をリポソーム表面に固定化した前記リポソーム懸濁液8000mLを得た。
前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度は6.3w/v%であり、ステアリン酸濃度は0.58w/v%であり、ヘモグロビン収率は53.0%であった。製造直後の前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率は4.0%であった。
【００２９】
＜酸素運搬量の算出＞
前記リポソーム懸濁液の酸素解離曲線（37℃）から求めた酸素運搬効率（高酸素親和性設定。酸素分圧40mmHgと酸素分圧0mmHgの間の酸素飽和度の差）は97%であった。前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度：6.3w/v%、ヘモグロビンメト化率：4.0%、前記リポソーム懸濁液の酸素運搬効率（高酸素親和性設定）：97%を前述0015に記載の（３）式に当てはめると、前記リポソーム懸濁液1mLが酸素分圧40mmHg〜0mmHgの間で運び得る酸素運搬量（37℃、1気圧）は0.092mLと算出された。一方、酸素解離曲線が天然赤血球より左にシフトしているので、100mmHgと40mmHgの間の酸素運搬効率は僅か3%となり、100mmHgと40mmHgの間で運搬可能な酸素量は、前述0012に記載の（３）式に当てはめると0.0028mLとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ヒト天然血液の酸素解離曲線を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするリポソーム懸濁液であって、前記リポソーム膜形成脂質がステアリン酸を含み、前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度が5.6〜6.7w/v%であり、アロステリック因子濃度が0.033〜0.045w/v%であり、リポソーム膜形成脂質濃度が3.05〜5.10w/v%であり、ステアリン酸濃度が0.41〜0.77w/v%である事を特徴とする前記リポソーム懸濁液。
【請求項２】
前記アロステリック因子がフィチン酸12ナトリウムである事を特徴とする請求項1に記載のリポソーム懸濁液。
【請求項３】
前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率が10%以下である事を特徴とする請求項1に記載のリポソーム懸濁液。
【請求項１】
アロステリック因子を含有したヘモグロビン溶液を内水相とするリポソーム懸濁液であって、前記リポソーム膜形成脂質がステアリン酸を含み、前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビン濃度が5.6〜6.7w/v%であり、アロステリック因子濃度が0.033〜0.045w/v%であり、リポソーム膜形成脂質濃度が3.05〜5.10w/v%であり、ステアリン酸濃度が0.41〜0.77w/v%である事を特徴とする前記リポソーム懸濁液。
【請求項２】
前記アロステリック因子がフィチン酸12ナトリウムである事を特徴とする請求項1に記載のリポソーム懸濁液。
【請求項３】
前記リポソーム懸濁液中のヘモグロビンメト化率が10%以下である事を特徴とする請求項1に記載のリポソーム懸濁液。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−２１５５１７（Ｐ２０１０−２１５５１７Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−６０３９５（Ｐ２００９−６０３９５）
【出願日】平成２１年３月１３日（２００９．３．１３）
【出願人】（０００１０９５４３）テルモ株式会社 (2,232)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１３日（２００９．３．１３）
【出願人】（０００１０９５４３）テルモ株式会社 (2,232)
【Ｆターム（参考）】
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