間葉系幹細胞を含んでなる根管充填材、及びこれを用いた歯組織再生方法
【課題】 入手しやすく臨床的応用が可能であり、かつ効率的に歯組織再生を促進することができる、抜歯もしくは非抜歯法の根管充填材及びこれを用いた歯組織再生方法を提供することを目的とする。
【解決手段】抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、根管の根尖側に挿入される、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０と、細胞外基質２１０とを含んでなる根管充填材２００、および抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の非抜歯の根管の根尖側に、根管充填材を注入する工程を含む、抜歯もしくは非抜歯法による歯組織再生方法を提供する。
【解決手段】抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、根管の根尖側に挿入される、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０と、細胞外基質２１０とを含んでなる根管充填材２００、および抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の非抜歯の根管の根尖側に、根管充填材を注入する工程を含む、抜歯もしくは非抜歯法による歯組織再生方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞を含んでなる根管充填材及びこれを用いた歯組織再生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、歯を失う原因は、破折を含めると約半分がう蝕によるもので、歯髄を抜くと歯を失う可能性が激増することが知られている。歯の平均寿命は現在５７歳といわれ、一生自分の歯で咬むことを考えると、歯の寿命は２０年以上高める必要がある。８０２０運動（８０歳になっても自分の歯を２０本以上残す運動）にもかかわらず、現在８０歳の人の歯の達成率は２１％で、日本歯科医師会の打ち立てた５０％の目標達成にはう蝕治療の抜本的改革が必要である。
【０００３】
歯髄を除去、すなわち抜髄すると、修復象牙質形成能及び感染防御機構が喪失し、痛みという警告信号の喪失により、う蝕拡大の危険性が増加する。また、抜髄治療に完璧な方法はなく、抜髄・根管充填後、歯冠側からの漏えいにより根尖病巣が生じたり、垂直性破折や審美性の消失、術後疼痛が生じたりする可能性もある。
【０００４】
従って、超高齢社会では、安易に抜髄を行うことを避け、歯の延命化をめざして、歯再生医療技術を組み入れた象牙質・歯髄再生による新しいう蝕・歯髄炎治療法を開発することは非常に重要である。
【０００５】
一方、歯髄再生に関しては、これまで、歯根未完成歯において、抜歯して抜髄・根管治療をした後に再度移植すると歯髄が再生されるといわれている。根尖部に病変を伴う歯根未完成歯でも、抜歯して徹底的な根管拡大・清掃を行い、セメント・象牙境まで血餅を満たし、Mineral trioxide aggregate（ＭＴＡ）で窩洞を完全封鎖することにより、歯髄様組織が再生されるとの報告がある。
【０００６】
また、イヌの健全歯根完成歯においては、抜歯後抜髄し、根尖部を切断するあるいは根尖部を１．１ｍｍ以上拡大し再び移植し、血餅を充填すると歯髄様組織の再生がみられるといわれている（非特許文献１）。
【０００７】
上述の根管内歯髄再生は、歯根未完成歯についての報告が大半であり、根管内に再生された組織が血管や神経を伴う歯髄固有の組織であることの証明もなされていない。また、すべて、一旦抜歯して生体外で根管拡大・清掃を行い、再移植して血餅を充填している。
【０００８】
治療対象となる歯に対して、抜歯、抜髄後、根管の根尖側に、歯髄幹細胞を含む細胞と、前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質とを有する根管充填材を注入する歯組織再生方法も知られている（特許文献１）。
【０００９】
歯髄幹細胞は、患者の大きな負担なく、乳歯あるいは智歯から採取することができる点で有利である。しかし、高齢の患者から十分な量の歯髄幹細胞を採取することは難しく、臨床的応用においては実用化が難しいと考えられる。このため、超高齢化社会において、より利用しやすい供給源を用いて、歯組織の再生を実現することが望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００９／１１３７３３号
【００１１】
【非特許文献１】Laureys et al., Am J Orthod DentofacialOrthop. 2001 Apr;119(4):335.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記従来方法の欠点を克服し、より入手しやすく臨床的応用が可能であり、かつ効率的に歯組織再生を促進することができる、抜歯もしくは非抜歯根管充填材及びこれを用いた歯組織再生方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を達成するため鋭意検討を行った結果、歯髄幹細胞以外の間葉系幹細胞、例えば、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞もしくは臍帯血細胞のいずれかを抜歯もしくは非抜歯根管に移植することによっても、歯髄の再生が可能であることを発見し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
従って、本発明は、一実施の形態によれば、抜髄後もしくは感染根管の根管拡大清掃後、抜歯もしくは非抜歯の根管の根尖側に挿入される根管充填材であって、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞と、細胞外基質とを含んでいる。歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞もしくは臍帯血細胞のいずれか一つであることが好ましい。
【００１５】
前記歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が、ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、ＣＤ９０陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、ＣＤ３１陰性細胞、ＣＤ４５陰性細胞、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陰性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＦＬＫ−１陽性細胞，ＣＤ１６６陽性細胞、もしくはＶＥＧＦＲ２陽性細胞のうち少なくともいずれか一つを含むことが好ましい。
【００１６】
前記根管充填材が、細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくともいずれか一つを含む遊走因子をさらに含むことが好ましい。特には、根管充填材において、前記歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞を根管の根尖側に移植あるいは注入するとともに、根管の歯冠側に細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくともいずれか一つを含む遊走因子を付着させていることが好ましい。
【００１７】
前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ１、ＶＥＧＦ、ＧＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ、ＧＭ−ＣＳＦ及び血清のうち少なくともいずれか一つであることが好ましい。
【００１８】
前記細胞増殖因子が、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ及び血清のうち少なくともいずれか一つであることが好ましい。
【００１９】
前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ３及び血清のうち少なくともいずれか一つであることが好ましい。
【００２０】
前記細胞外基質が、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＣＬ、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくともいずれか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。
【００２１】
前記細胞外基質における前記歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下であることが好ましい。
【００２２】
本発明は、また別の局面によれば、抜歯もしくは非抜歯法による歯組織再生方法であって、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の根管の根尖側に、前述のいずれかに記載の根管充填材を注入する工程を含む。
【００２３】
前記根管充填材を前記根管の根尖側に注入する工程の前に、前記根管を拡大することで根尖部の根管の太さを所定の大きさにする工程をさらに含むことが好ましい。
【００２４】
本発明は、また別の局面によれば、歯組織の異所再生方法であって、第１の個体の歯の抜髄を行う工程と、前記歯の歯根部分を所定の長さに切り出す工程と、抜髄後の根管の一端を封鎖する工程と、前記根管に、間葉系幹細胞と細胞外基質とを含む根管充填材を注入する工程と、充填材を注入した歯根を第２の個体に移植する工程とを含み、さらに好ましくは、歯髄が再生された歯根を歯槽骨内に再植する工程を含む。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る根管充填材及びこれを用いた歯組織再生方法によれば、抜歯もしくは非抜歯法で歯組織再生を促進させることができる。根管充填材及びこれを用いた歯組織再生方法による歯組織再生では、再生組織に内部吸収及び外部吸収が見られず、且つ、破歯細胞も見られずに、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並んだ再生組織を得ることができる。また、本発明に係る歯組織の異所再生方法によれば、例えば免疫拒絶を考慮したヒトの遺伝子をもつブタ（ヒトブタ）などの異種個体において、歯組織を再生することができる点で有用である。これらは、超高齢化社会における歯科治療において非常に有望である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】第１実施形態に係る根管充填材の説明図である。
【図２】第１実施形態に係る根管充填材の製造工程を説明する説明図である。
【図３Ａ】歯髄炎に罹患している歯の説明図である。
【図３Ｂ】抜髄後の根管拡大処置を行ったところを説明する模式図である。
【図３Ｃ】根管充填材を充填するところを説明する模式図である。
【図３Ｄ】スポンゼル（ゼラチン）及びレジンを注入したところを説明する模式図である。
【図３Ｅ】歯髄再生及び血管再生を示す模式図である。
【図３Ｆ】形態形成因子及びレジンを注入したところを説明する模式図である。
【図３Ｇ】象牙質再生を示す模式図である。
【図３Ｈ】細菌が根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に及んでいる根尖性歯周炎の模式図である。
【図３Ｉ】抜歯後に抜髄及び消毒し、根尖部を切断して開口し、根管に、根管充填材を充填するところを説明する模式図である。
【図４】第２実施形態に係る根管充填材の説明図であり、そのうち（ａ）は根管の歯冠側に遊走因子を付着させている構成であり、（ｂ）は歯冠部側に細胞外基質を残す構成である。
【図５】第２実施形態に係る根管充填材の製造工程を説明する説明図である。
【図６】充填材を注入した歯根を免疫不全マウスへ移植する、歯組織の異所再生方法を示す概念図である。
【図７Ａ】イヌ歯髄組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の分離を示す。図７Ａ（ａ）はフローサイトメトリー分析結果であり、図７Ａ（ｂ）は、歯髄組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。図７Ａ（ｃ）は、イヌ歯髄組織由来の初代ＣＤ３１−ＳＰ細胞の３日目、図７Ａ（ｄ）は１０日目の位相差顕微鏡画像を示す。実験はそれぞれ１２回繰り返し、典型的な実験を表示した。
【図７Ｂ】イヌ骨髄組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の分離を示す。図７Ｂ（ｅ）はフローサイトメトリー分析結果であり、図７Ｂ（ｆ）は、骨髄組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。図７Ｂ（ｇ）は、イヌ骨髄組織由来の初代ＣＤ３１−ＳＰ細胞の３日目、図７（ｈ）は１０日目の位相差顕微鏡画像を示す。
【図７Ｃ】イヌ脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の分離を示す。図７Ｃ（ｉ）はフローサイトメトリー分析結果であり、図７Ｃ（ｊ）は、脂肪組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。図７Ｃ（ｋ）は、イヌ骨髄組織由来の初代ＣＤ３１−ＳＰ細胞の３日目、図７Ｃ（ｌ）は１０日目の位相差顕微鏡画像を示す。
【図８】（ａ）、（ｄ）、（ｇ）はイヌ歯髄組織、（ｂ）、（ｅ）、（ｈ）はイヌ骨髄組織、（ｃ）、（ｆ）、（ｉ）はイヌ脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の多系列分化能を示す位相差顕微鏡画像である。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、マトリゲルアッセイを用いた内皮分化能であり、播種１２時間後である。（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）は、ニューロスフェア形成であり、第４継代の細胞集団を誘導後１４日である。（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）は、ニューロスフェアを解離させて神経誘導した後１４日である。（ｊ）は、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、及びｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎのｍＲＮＡの発現を示す。実験は三度繰り返し、典型的な実験を表示した。
【図９】イヌ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰの間質細胞由来因子１の遊走及び増殖効果を示す。データは、平均値±標準偏差で表し、４回の測定を行った。実験は３回繰り返し、典型的な実験結果を示した。（ａ）は、培養後０、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４時間の、ＳＤＦ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いた場合の遊走活性を示す。＊Ｐ＜０．００１ 歯髄ｖｓ骨髄，＃Ｐ＜０．０５ 歯髄ｖｓ脂肪，＊＊Ｐ＜０．００１ 骨髄ｖｓ脂肪。（ｂ）は、培養後２、１８、２６、４４時間の、ＳＤＦ−１（１０ｎｇ／ｍｌを用いた場合の増殖活性を示す。
【図１０Ａ】本願発明に係る充填材を抜髄後のイヌ根管に自家移植した際の歯髄組織の完全な再生を示す。（ａ）、（ｄ）、（ｇ）は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰを移植した場合であり、（ｂ）、（ｅ）、（ｈ）は、イヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰを移植した場合であり、（ｃ）、（ｆ）、（ｉ）、は、イヌ脂肪ＣＤ３１−ＳＰを移植した場合の顕微鏡画像である。（ａ）〜（ｆ）は移植後１４日であり、（ｇ）〜（ｉ）は移植後２８日である。図中、矢印はマトリックスの形成を、ｍは石灰化した組織を示す。（ｊ）は、１４日における、新たに再生された組織の面積の、根管の面積に対する比率を示す。データは、平均値±標準偏差であらわした。
【図１０Ｂ】本願発明に係る充填材を抜髄後のイヌ根管に自家移植した際の歯髄組織の完全な再生を示す。（ｋ）、（ｎ）、（ｑ）は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰを移植した場合であり、（ｌ）、（ｏ）、（ｒ）は、イヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰを移植した場合であり、（ｍ）、（ｐ）、（ｓ）は、イヌ脂肪ＣＤ３１−ＳＰを移植した場合の顕微鏡画像である。（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）はＢＳ−１レクチンで免疫染色した結果を示す共焦点顕微鏡像であり、新たに形成された毛細血管を示す。（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）は、ＰＧＰ９．５で免疫染色した結果である。（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）は、マッソン・トリクロム染色した結果であり、基質形成を示す。
【図１１Ａ】ブタ歯髄組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の分離を示す。（ａ）はフローサイトメトリー分析結果であり、（ｂ）は、歯髄組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。（ｃ）は、ブタ歯髄組織由来の初代ＣＤ３１−ＳＰ細胞の３日目、（ｄ）は７日目の位相差顕微鏡画像を示す。実験はそれぞれ１２回繰り返し、典型的な実験を表示した。
【図１１Ｂ】ブタ骨髄組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の分離を示す。（ｅ）はフローサイトメトリー分析結果であり、（ｆ）は、骨髄組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。（ｇ）は、ブタ骨髄組織由来の初代ＣＤ３１−ＳＰ細胞の３日目、（ｈ）は７日目の位相差顕微鏡画像を示す。
【図１１Ｃ】ブタ脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の分離を示す。（ｉ）はフローサイトメトリー分析結果であり、（ｊ）は、脂肪組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。（ｋ）は、ブタ骨髄組織由来の初代ＣＤ３１−ＳＰ細胞の３日目、（ｌ）は７日目の位相差顕微鏡画像を示す。
【図１２】（ａ）、（ｄ）はブタ歯髄組織、（ｂ）、（ｅ）はブタ骨髄組織、（ｃ）、（ｆ）、はブタ脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の多系列分化能を示す位相査顕微鏡画像である。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、マトリゲルアッセイを用いた内皮分化能であり、播種１２時間後である。（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）は、第４継代の細胞集団を誘導後１４日のニューロスフェアである。実験は三度繰り返し、典型的な実験を表示した。
【図１３】間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）に対する歯髄、骨髄、脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の効果を示す。データはサンプル数４の平均値±標準偏差で表す。実験は三度繰り返し、典型的な実験を表示した。non-paired Student’s t test にて統計解析した。（ａ）０、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４時間後の遊走能。ＳＤＦ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）投与。＊Ｐ＜０．００１ 歯髄ｖｓ骨髄、＃Ｐ＜０．０５ 歯髄ｖｓ脂肪、＊＊Ｐ＜０．００１骨髄ｖｓ脂肪。（ｂ）２、１８、２６、４４時間後の増殖能 ＳＤＦ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）投与。
【図１４】免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス）へのｉｎ ｖｉｖｏ皮下移植後の歯髄再生を示す。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、ブタ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞を移植した場合、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）は、ブタ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞を移植した場合、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）は、ブタ脂肪ＣＤ３１−ＳＰを移植した場合の、いずれも、移植後１４日目の光学顕微鏡画像である。
【図１５】イヌ自己および他者ＰＢＭＣ（末梢血単核球）を用いたイヌ歯髄、骨髄、脂肪培養上清の免疫抑制能の検討。＊Ｐ＜０．００１ 歯髄ｖｓ骨髄、＃Ｐ＜０．００１ 歯髄ｖｓ脂肪、†Ｐ＜０．００１ 骨髄ｖｓ脂肪。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下に、本発明を図面を参照して詳細に説明する。以下の説明は、本発明を限定するものではない。
【００２８】
（第１実施形態）
本発明は、第１実施形態によれば、細胞外基質と、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞とを含んでなる根管充填材である。図１は、本実施形態に係る根管充填材２００の説明図である。根管充填材２００は、細胞外基質２１０に、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０を付着させて形成される。ここで、「付着させて形成される」とは、細胞外基質が液体、流体等の場合には、細胞外基質に、好ましくは均一に、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が混合されていることを意味する。いっぽう、細胞外基質が、後述するスポンジ状の三次元構造体等、一定の形状を有する形態の場合には、細胞外基質が構成する構造体の表面及び内部に、好ましくは均一に、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が取り込まれ、保持されていることをいう。歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０は、根管充填材２００の根管の根尖側に付着される。ここで、「根管充填材２００の根管の根尖側に付着される」とは、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が、根管の根尖側に注入され、移植されるように根管充填材が形成されることをいう。
【００２９】
歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞は、歯髄以外の任意の組織由来のものであってよい。例えば、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞、もしくは臍帯血幹細胞を用いることができる。また、これらの間葉系幹細胞は、歯組織再生の処置を受ける対象の個体自身の組織から抽出した自家細胞でもよいし、また、歯組織再生の処置を受ける対象個体以外の個体の組織から抽出した同種細胞でもよい。歯組織再生の処置を受ける対象は、哺乳動物であってよく、特にはヒトである。
【００３０】
歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞の一例である骨髄幹細胞は、骨髄由来の幹細胞であって、既知の方法により骨髄組織から抽出、分離することが出来る。また、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞もそれぞれ、脂肪組織、羊膜組織、臍帯血組織由来の幹細胞であって、これらも既知の方法により、各組織から抽出、分離することが出来る。
【００３１】
歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞は、ＳＰ細胞、及び／または、特定の細胞マーカーを発現する細胞画分を分取して用いることができる。具体的には、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、ＣＤ９０陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＣＤ３１陰性細胞、ＣＤ４５陰性細胞、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陰性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＦＬＫ−１陽性細胞，ＣＤ１６６陽性細胞、またはＶＥＧＦＲ２陽性細胞のうち少なくともいずれか一つを含むことができる。なお、本明細書において、陽性を「＋」、陰性を「−」と指称することもある。
【００３２】
特には、ＣＤ３１陰性ｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）細胞を含むことが好ましい。なお、本明細書において、ＣＤ３１陰性ｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ細胞は、ＣＤ３１−ＳＰ細胞とも指称する。ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、マウス下肢虚血部に移植すると血流回復・血管新生が促進され、ラット脳梗塞虚血部に移植すると神経細胞の分化促進、運動麻痺が回復する。また、イヌの生活歯髄切断面上に移植すると生活歯髄切断面上の窩洞内に血管新生・神経再生・歯髄再生が見られる。間葉系幹細胞としてＣＤ３１−ＳＰ細胞を用いる場合、歯髄再生能力は高いと考えられる。
【００３３】
ＳＰ細胞は、フローサイトメトリーを利用したセルソーティング法による、当業者には既知の通常の方法を用いて分離することができる。特定の細胞マーカーを発現する細胞画分は、抗体を用いたフローサイトメトリーや磁気ビーズ方法によって得ることが出来る。分取した画分をさらに培養し、培養の第３〜第５継代の間葉系幹細胞を、本実施形態にかかる根幹充填材に用いることが好ましい。
【００３４】
根管充填材２００における間葉系幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下とすることが好ましい。間葉系幹細胞の含有率が、１×１０３セル／μｌよりも少ないと、根管内の歯組織の再生が不十分なものとなる可能性があるからである。一方、間葉系幹細胞の含有率が、１×１０６セル／μｌよりも多いと、対象の歯に対して予期せぬ副作用が生じる可能性があるからである。
【００３５】
細胞外基質（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）２１０は、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＬＧＡ（乳酸グリコール酸共重合体）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＤＬＬＡ（ポリ−ＤＬ−乳酸）、ＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくともいずれか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。なお、プロテオグリカンは、タンパク質と糖鎖（グリコサミノグリカン）が共有結合した複合糖質の一種である。また、細胞外基質は、熱可塑性高分子等の高分子体で作製された数平均直径が１ｎｍ〜１０００ｎｍのナノファイバーからなるスポンジ状の三次元構造体も使用できる。そのような三次元構造体の空隙率は８０％〜９９．９９％とすることが好ましい。
【００３６】
細胞外基質として使用されるコラーゲンは、Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとの混合であるＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲンを用いることが好ましい。Ｉ型コラーゲンとは、基本的コラーゲンであり、線維性コラーゲンである。ＩＩＩ型コラーゲンは、コラーゲン線維とは別の、細網線維と呼ばれる細い網目状の構造を形成し、細胞等の足場を作ることができる。
【００３７】
上述の混合コラーゲンを用いる場合には、ＩＩＩ型コラーゲンの割合は１０重量％以上５０重量％以下とすることが好ましい。ＩＩＩ型コラーゲンの割合が５０重量％よりも多くなると、混合コラーゲンが固化できないおそれがあるからである。一方、ＩＩＩ型コラーゲンの割合が１０重量％よりも少なくなると、Ｉ型コラーゲンの割合が多くなり、後述するような血管新生が起こるのではなく、象牙質が再生される可能性があるからである。
【００３８】
次に、図２を用いて、本実施形態に係る根管充填材２００の製造方法を説明する。
【００３９】
根管充填材２００は、細胞外基質２１０の根尖側に歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０を付着させて形成される。間葉系幹細胞２２０は根管充填材２００の根尖部の１／４〜２／３に付着されているのが望ましく、より望ましくは根尖部の１／３である。根管充填材は、流体状の細胞外基質を用いる場合には、細胞外基質と間葉系幹細胞とを含む第１の組成物と、細胞外基質を含む第２の組成物とを調製し、これらがそれぞれ、根尖部、歯冠部に位置するように形成することができる。製造方法の一具体例としては、まず、トータルで２０μリットルとし、ピペットマンのチップ等に１０μリットル〜１３μリットルのＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲンを吸い込み、次に、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞を混合させたＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲン（例えばコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン））を７μリットル〜１０μリットル吸い込むことができる。ピペットマンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好ましい。根管充填材内部に気泡が発生すると、発生した気泡が細胞の遊走を妨げて歯組織再生の促進が損なわれるからである。ピペットマンのチップの内径は細いものが好ましく、例えばチップの下内径が０．５〜０．７ｍｍのものが使用でき、例えばＱＳＰ社のＨ−０１０−９６ＲＳマイクロキャピラリーチップを使用できる。根管充填材の形状は、特に限定されるものではなく、例えば円錐、円錐台、円柱等である。あるいは、根管充填材は、スポンジ状の三次元構造体の細胞外基質を用いる場合には、歯根に適合するサイズに形成された、細胞外基質を含む構造体の根尖部に歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞を吸収させて調製することができる。なお、本実施形態の説明における上記細胞外基質の使用容量は、一例であって、充填材は特定の容量には限定されず、歯髄を再生させる歯の根管の容量に応じて、適宜決定することができる。
【００４０】
次に、図３Ａ〜図３Ｆを用いて、根管充填材２００を使用する非抜歯法による歯組織再生方法を、歯組織再生方法の一例として説明する。
【００４１】
本実施形態に係る歯髄組織再生方法は、図３Ａに示すように、例えば歯髄炎が発生している対象となる歯１００について、非抜歯にて歯組織再生を行う。対象となる歯とは、う蝕、歯髄炎等により、細菌感染が冠部歯髄又は根部歯髄まで波及している歯をいう。
【００４２】
対象となる歯１００について、図３Ｂに示すように、抜髄又は感染根管の根管拡大清掃が行われる。抜髄とは、歯牙の内部に存在する歯髄を除去することである。抜髄は当業者には既知の通常の方法、たとえば、手用あるいは電気エンジンのリーマー・ファイルあるいはロータリーエンジンで器械的に拡大形成後、次亜塩素酸ソーダとオキシドールで交互洗浄する方法によって行うことができる。また、感染根管とは、細菌が歯髄に到達後、根管壁の象牙質に及んでいる場合の根管をいい、根管拡大清掃後とは、感染根管における細菌を除去した後をいう。細菌の除去は、たとえば、交互洗浄後、根管内薬剤塗布によって行うことができる。
【００４３】
抜髄後は、対象となる歯の根管を拡大し、根尖部の根管の大きさを所定の太さにすることが望ましい。抜髄あるいは感染根管治療した根管内に根管充填材２００を充填する際に、根管を拡大しておくほうが根管充填材２００を充填しやすいためである。また、根尖歯周組織から血管及び神経が進入しやすいためである。ここで、根尖とは、対象となる歯の歯槽骨に結合される端部（歯根の先端部分）をいう。歯の根管の拡大は、手用あるいは電気エンジンのリーマー・ファイルあるいはロータリーエンジンで器械的にという方法によって行うことができる。
【００４４】
例えば、図３Ｂにおいて、根尖部の根管の太さｄは、根管の直径において０．６ｍｍ以上、１．５ｍｍ以下とすることが望ましい。根管の太さｄが０．６ｍｍよりも小さいと、血管及び神経が根尖歯周組織から進入しにくく、また根管充填材２００の充填が難しいおそれがあるからである。一方、根管の太さが１．５ｍｍよりも大きいと、対象となる歯に対して必要以上の負担を与えて割れやすくなるおそれがあるからである。
【００４５】
次に、図３Ｃに示されるように、根管の根尖側にピンセット等により根管充填材２００を充填する。根管充填材２００は、生物学的材質を含有するので、生物学的根管充填材とすることもできる。根管充填材２００は、根管内の歯髄が存在した場所である歯髄相当部位に充填することが望ましい。なお、細胞外基質２１０がゲル状の場合はピンセット等でつまむことができないので、ピペットマン、注射等により注入することができる。
【００４６】
根管の根尖側に根管充填材２００を注入した後は、図３Ｄに示されるように、根管充填材２００の上部にゼラチン６１０を注入し、レジン６２０により蓋をすることができる。ゼラチン、及びレジンは、特に限定されることなく、歯科治療で通常使用されるものを用いることができる。
【００４７】
これにより、根管内の歯組織が再生される。再生される歯組織は、図３Ｅに示されるように、例えば根管内の歯髄固有組織、血管４００、神経等である。また、ＢＭＰｓ等の形態形成因子を用いることにより、再生される歯組織としては象牙質がある。更に、感染根管に対して根管充填材２００を充填する場合は、再生される歯組織として歯根膜（歯槽骨に歯を植立する歯周組織）やセメント質等の歯周組織がある。
【００４８】
その後は、レジン６２０を一度除去して、図３Ｆに示すように、ＢＭＰｓ等の形態形成因子６３０又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布し、レジン６２０により蓋をする。形態形成因子６３０又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布したことにより、図３Ｇに示されるように象牙質５００も再生することができる。
【００４９】
更に、本実施形態に係る根管充填材２００を用いる歯組織再生では、再生組織に内部吸収及び外部吸収が見られず、且つ、破歯細胞も見られずに、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並んでいる。また、出血による血餅が多量に存在すると歯髄組織再生の障害になると考えられるところ、非抜歯の方法では、血餅の発生を低く抑えられ、効率的に歯組織再生を促進させることができるという利点がある。また、根管拡大後の出血や症状が消失するまで根管貼薬して根管充填を待つことができ、実際の臨床治療に近接させることができるという利点もある。
【００５０】
なお、上述したように、対象となる歯１００は、う蝕、歯髄炎等により、細菌感染が冠部歯髄又は根部歯髄まで波及している歯であってよいが、これに限定されない。すなわち、対象となる歯１００には神経機能が低下して咬合感覚が弱くなっている歯も含まれる。このような場合は、抜髄後に、根管に根管充填材２００を充填することにより、歯髄を再生させることで咬合感覚を向上させることができる。また、図３Ｈに示すように、対象となる歯１００には、細菌感染が根尖歯周組織まで波及している歯（細菌が歯髄に到達後、根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に及んでいる歯）も含まれる。このような歯は根尖性歯周炎１１０を伴うことが多い。感染根管の根管拡大清掃後に、根管充填材２００を注入することが好ましい。
【００５１】
本実施形態による根管充填材は、非抜歯のみならず、抜歯の形態でも同様に用いることができる。抜歯の形態で用いる場合には、ます、歯組織再生が所望される対象を、抜歯する。抜歯後、感染根管の根管拡大清掃後、抜髄及び消毒する。抜髄及び消毒は、上記非抜歯の方法で説明したのと同様にして行うことが出来る。次に、根尖部を切断して開口して根管充填材を移植する。根尖部の切断箇所は、下端から１ｍｍ〜２ｍｍが好ましい。根尖部の切断方法は、歯科的な通常の方法、例えば、エアタービンや電気エンジンによることができる。根管充填材の注入は、上記非抜歯の方法で説明したのと同様にして行うことが出来る。図３Ｉは、抜歯の形態における、根管の根尖側への根管充填材２００の充填を示す根管充填材を注入した後は、根管充填材の上部にゼラチンを注入し、レジンにより蓋をする。その後は抜歯をした歯を抜歯窩に再移植することができる。抜歯の形態は、特に直視で患歯を処置できることおよび根尖部歯周組織に傷害が少ないという利点がある。
【００５２】
（第２実施形態）
第２実施形態に係る根管充填材は、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞と、遊走因子とを含む。遊走因子は、細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくともいずれか一つを含む。
【００５３】
図４（ａ）及び（ｂ）は、本発明の第２実施形態に係る根管充填材２００の説明図である。図４（ａ）に示すように、根管充填材２００は、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側（例えば根管の上部１／２〜２／３）に細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくともいずれか一つを含む遊走因子２３０を付着させている。
【００５４】
間葉系幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させ、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させる理由は、間葉系幹細胞２２０を根管の歯冠側にまで付着させても組織からの栄養が供給されずに壊死する可能性があるからであり、また、根管の根尖側に付着している間葉系幹細胞２２０が根管の歯冠側に付着している遊走因子に引っぱられて歯組織再生が促進されやすいからである。なお、図４（ｂ）に示すように、根管充填材２００の根管の歯冠側に細胞外基質２１０を残しておくことも可能である。
【００５５】
遊走因子は、細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち一つを含むものであってもよく、二以上を組み合わせて含むものであってもよい。
【００５６】
細胞遊走因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の遊走に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。また、細胞増殖因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の増殖に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。そして、神経栄養因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の生存に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。
【００５７】
細胞遊走因子は、ＳＤＦ１、ＶＥＧＦ、ＧＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ、ＧＭ−ＣＳＦ、及び血清のうち少なくともいずれか一つを用いることが好ましい。特に、ＭＭＰ３は、細胞遊走能が高く好適に使用することができる。
【００５８】
細胞増殖因子は、ＩＧＦ，ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ及び血清の少なくともいずれか一つを用いることが好ましい。
【００５９】
神経栄養因子は、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ３及び血清のうち少なくともいずれか一つを用いることが好ましい。血清は、自己血清が好ましい。自己血清とは、歯組織再生を受ける個体の血清であって、新鮮な血液を３０分静置させた後、遠心させて上清を集めることにより得ることができる。
【００６０】
遊走因子を付着させた細胞外基質における、遊走因子の含有率は、０．１ｎｇ／μｌ以上５００ｎｇ／μｌ以下とすることが好ましい。遊走因子の含有率が０．１ｎｇ／μｌよりも少ないと、遊走の程度が少なくなる可能性がありうるからである。一方、遊走因子の含有率が５００ｎｇ／μｌよりも多いと、対象となる歯１００に対して予期せぬ副作用が生じる可能性があり得るからである。
【００６１】
次に、図５を用いて、本実施形態に係る根管充填材２００の製造方法を説明する。図５は、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させる根管充填材２００の製造方法を説明する説明図である。
【００６２】
実施形態２に係る根管充填材２００は、流体状の細胞外基質を用いる場合には、細胞外基質と歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞とを含む第１の組成物と、細胞外基質と遊走因子とを含む第２の組成物とを調製し、これらがそれぞれ、根尖部、歯冠部に位置するように注入、移植することができる。製造方法の一具体例としては、まず、トータルで２０μリットルとし、ピペットマンのチップ等に遊走因子を混合させたＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲン（Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとの混合割合は１：１）を１０μリットル〜１３μリットル吸い込む。次に、間葉系幹細胞を混合させたＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲンを７μリットル〜１０μリットル吸い込む。実施形態２においても、ピペットマンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好ましい。また、ピペットマンのチップの内径は細いものが好ましい。このようにして、図４（ａ）に示す根管充填材２００が製造される。
【００６３】
実施形態２に係る根管充填材２００の使用形態は、実施形態１と同様に、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の非抜歯の根管の根尖側、あるいは、抜歯後、根尖部を切断して開口した根管の根尖側に充填することができる。
【００６４】
本実施形態に係る根管充填材２００によれば、遊走因子を有しているため更に効率的に、歯組織再生を行うことができ、再生組織には、内部吸収は無く、破歯細胞も見られずに、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並んでいる。
【００６５】
（第３実施形態）
上述の第１実施形態では、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０が根管充填材２００の根管の根尖側に付着されて根管充填材２００は構成されていた。しかし、そのような実施形態に限定されることはなく、間葉系幹細胞２２０は、根管充填材２００の全体に均一に混合されていても良い。このような根管充填材２００も、抜歯もしくは非抜歯の両方の形態で同様に使用することができ、これを使用することにより、歯根完成歯に対して、内部吸収を発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並ぶ歯組織再生を図ることができる。このような根管充填材２００は、例えば、間葉系幹細胞２２０と、細胞外基質の一例であるＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲンとを気泡を発生させないように均一に混合させることにより製造される。
【００６６】
また、上述の第２実施形態では、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させて、根管充填材２００は構成されていた。しかし、そのような実施形態に限定されることはなく、間葉系幹細胞２２０及び遊走因子２３０は共に、根管充填材２００の全体に均一に混合されていても良い。このような根管充填材２００も、抜歯もしくは非抜歯の両方の形態で同様に使用することができ、これを使用することにより、歯根完成歯に対して、内部吸収を発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並ぶ歯組織再生を図ることができる。この根管充填材２００は、例えば、間葉系幹細胞と、遊走因子と、細胞外基質の一例であるＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲンとを気泡を発生させないように均一に混合させることにより製造される。
【００６７】
（第４実施形態）
本願発明は、第４実施形態によれば、上記第１〜第３の実施形態において説明した根管充填材を用いた歯組織の異所再生方法である。歯組織の異所再生方法は、第１の個体の歯の抜髄を行う工程と、前記歯の歯根部分を所定の長さに切り出す工程と、前記根管に、前述の根管充填材を注入する工程と、充填材を注入した歯根を第２の個体に移植する工程とを含む。
【００６８】
根管充填材は、上記第１〜第３の実施形態において説明したものを用いることができる。しかし、上記第１〜第３の実施形態における根管充填材を構成する間葉系幹細胞に替えて、歯髄幹細胞を用いることもできる。この場合、歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＳＳＥＡ−４陽性細胞、ＦＬＫ−１陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、歯髄ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞及びＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１６６陽性細胞のうち少なくともいずれか一つを含むことが好ましく、前記歯髄ＳＰ細胞が、ＣＸＣＲ４陽性、ＳＳＥＡ−４陽性、ＦＬＫ−１陽性、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１５０陽性、ＣＤ７３陽性、又は、ＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１６６陽性細胞のうち少なくともいずれか一つを含むことが好ましい。
【００６９】
上記第１の個体は、歯を再生することを所望する個体であって、哺乳動物が好ましく、典型的にはヒトである。上記第２の個体は、第１の個体と異なり、ヒトを除く哺乳動物である。たとえば、マウスやブタであってよく、免疫不全化したマウスやブタを用いることができる。
【００７０】
第４実施形態にかかる方法を、図６を用いて説明する。図６（ａ）は、第１の個体の歯１００である。本実施形態に用いる第１の個体の歯は、第１の個体から抜歯することによって得ることができる。第１の個体の歯の抜髄を行う工程では、第１実施形態で説明したのと同様に、抜髄を行う。図６（ｂ）は、抜歯され、歯髄が除去された歯１００である。前記歯の歯根部分を所定の長さに切り出す工程では、再生させる組織の大きさに応じて、歯の歯根部分を切り出す。例えば、１〜３０ｍｍとすることができるが、これらには限定されない。図６（ｃ）は、切り出される歯根部分１２０を模式的に示したものである。抜髄後の根管の一端を封鎖する工程では、切り出した歯根部分１２０の根管の一端を、セメント等を用いて封鎖する。前記根管に、前述の根管充填材を注入する工程では、第１〜第３実施形態で説明した方法に従って充填材を調製し、注入する。図６（ｄ）は、根管充填材２００を歯根部分１２０の根管に注入した状態を示す。根管充填材２００は、間葉系幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させる。図６（ｅ）は、根管充填材が注入された歯根部分７００を示す。根管充填材２００を注入した歯根を第２の個体に移植する工程では、図６（ｆ）に示すように、根管充填材２００を注入された歯根部分７００を、第２の個体の、好ましくは皮下に移植する。
【００７１】
その後、第２の個体を所定の期間にわたって飼育し、前記根管充填材が充填された歯根部分７００を取り出すことで、再生された歯組織を得ることが出来る。再生された歯組織は、さらに、第１の個体の歯槽骨内に再移植して用いることができる。第４実施形態にかかる方法は、ある個体の歯組織を、別の個体で再生することができる点で非常に有利でありうる。
【００７２】
以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００７３】
［イヌ由来幹細胞による歯髄の再生］
［細胞分離］
イヌ上歯から抽出したイヌ歯髄組織より、Iohara et al., 2006（STEM CELLS, Volume 24, Issue 11, pages 2493-2503, November 2006）に記載の方法により、イヌ歯髄幹細胞を分取した。初代脂肪細胞及び初代骨髄細胞は、それぞれ、同一のイヌの腹部皮下脂肪及び肋骨の骨髄から分離した。これらの細胞は、Iohara et al., 2006に記載されているように、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，http://www.sigmaaldrich.com）でラベルした。そして、この細胞を、マウスＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，http://www.bdbioscience.com）で３０分間、４℃でプレインキュベートし、非特異的結合を除去した。これらの細胞を、さらに、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ＭＣＡ９２８）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，http://www.serotec.com）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ，ＰＥ）（ＭＣＡ９２８ＰＥ）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、および、２０％ウシ胎児血清を添加した、ＰＢＳ中の、マウス抗ブタＣＤ３１（ＰＥ）（ＬＣＩ−４）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，http://www.invitrogen.com）で６０分間、４℃でインキュベートした。そして、これらを、２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＨＥＰＥＳバッファー中で再懸濁させた。細胞の分析及びソーティングは、フローサイトメータ（ＦＡＣＳ−ＡＲＩＡ ＩＩ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。
【００７４】
イヌ歯髄、骨髄及び脂肪細胞由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞を、Ｉ型コラーゲンでコートした３５ｍｍ皿（Ａｓａｈｉ Ｔｅｃｈｎｏｇｌａｓｓ ｃｏｒｐ．，Ｆｕｎａｂａｓｈｉ，Ｊａｐａｎ，http://www.atgc.co.jp）中の、１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）にそれぞれ播種し、細胞を維持した。培地は、４〜５日に一度交換した。細胞が、５０〜６０％コンフルエントに達したら、０．０２％のＥＤＴＡで３７℃、１０分間インキュベートすることにより分離し、１：４に希釈して、継代培養した。
【００７５】
［細胞表面マーカーの発現］
イヌ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の表現型を第３継代において評価した。細胞は、以下のもので免疫標識した。マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ．）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）（ＭＣＡ９２８Ｆ）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−Ｃｙ５，ＰＥ−Ｃｙ５）（ＭＣＡ９２８Ｃ）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ａｌｅｘａ ６４７）（ＭＲＣ ＯＸ−３４）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ２４（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）（ＭＬ５）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２９（ＰＥ−Ｃｙ５）（ＭＥＭ−１０１Ａ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３１（ＦＩＴＣ）（Ｑｂｅｎｄ１０）（Ｄａｋｏ）、ＣＤ３３（ＦＩＴＣ）（ＨＩＭ３−４）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３４（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ，ＡＰＣ）（１Ｈ６）（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）、ＣＤ４４（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ｃｙ７）（ＩＭ７）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ７３（ＡＰＣ）（ＡＤ２）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ９０（ＦＩＴＣ）（ＹＫＩＸ３３７．２１７）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ１４６（ＦＩＴＣ）（ｓｃ−１８８３７）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ１５０（ＦＩＴＣ）（Ａ１２）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＭＨＣクラスＩ（Ｒ−ＰＥ）（３Ｆ１０）（Ａｎｃｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ，ＵＳＡ）、ＭＨＣ ｃｌａｓｓＩＩ（ＡＰＣ）（ＴＤＲ３１．１）（Ａｎｃｅｌｌ）、ＣＸＣＲ４（ＦＩＴＣ）（１２Ｇ５）（Ｒ＆Ｄ）に対する抗体。
【００７６】
［リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析］
細胞集団のさらなる表現型を評価するために、第３継代において歯髄および脂肪ＣＤ１０５＋細胞、及びｔｏｔａｌ歯髄細胞から、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。細胞数は、各実験とも、５×１０４にノーマライズした。Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成は、ｔｏｔａｌＲＮＡから、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ−α（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて逆転写することによって行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増殖は、ライトサイクラーＦａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）で標識した幹細胞マーカーである、ｃａｎｉｎｅ ＣＸＣＲ４、Ｓｏｘ２、Ｓｔａｔ３、Ｂｍｉ１、Ｔｅｒｔ、Ｏｃｔ４を用いて、９５℃で１０秒，６２℃で１５秒、７２℃で８秒、ライトサイクラー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。用いたプライマーを以下に示す。
【００７７】
【表１】
【００７８】
【表２】
【００７９】
血管新生因子及び神経栄養因子のｍＲＮＡの発現を調べるために、イヌマトリックスメタロプロテアーゼ−３（ＭＭＰ−３）、ＶＥＧＦ−Ａ、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＳＤＦ−１、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ３のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増殖もまた行った（Iohara et al.,submitted）。骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の発現は、ベータアクチンで正規化した後、歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞の発現と比較した。
【００８０】
［分化誘導］
第３継代から第５継代のイヌ骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の血管新生細胞及び神経栄養細胞への分化は、Iohara et al., 2006に記載した歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞の分化と比較した。神経分化については、ニューロフィラメント、ニューロモジュリン、及びｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ，ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ，ｔｙｐｅＩα（Ｓｃｎ１α）の発現を調べた。
【００８１】
［増殖及び遊走アッセイ］
間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）（Ａｃｒｉｓ，Ｈｅｒｆｏｒｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に応答した細胞増殖を決定するために、第４継代のイヌ骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞と歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞を、０．２％のウシ胎児アルブミン（Ｓｉｇｍａ）及びＳＤＦ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、９６ウェルあたり、１０３ｃｅｌｌｓの条件で比較した。１０μｌのＴｅｔｒａ−ｃｏｌｏｒ ｏｎｅ（登録商標）（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ｋｏｇｙｏ，Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，ＪＡＰＡＮ）を９６ウェルプレートに添加し、培養開始後、２、１２、２４、３６時間において、分光光度計を用いて波長４５０ｎｍの吸光度を測定し、細胞数を得た。細胞を入れないウェルをネガティブコントロールとして用いた。
【００８２】
歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞と比較した骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の遊走活性を調べるために、ＳＤＦ−１、ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓアッセイを行った。ＴＡＸＩＳｃａｎ−ＦＬ（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔｏｋｙｏ，ＪＡＰＡＮ）を用いて、細胞のリアルタイムｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓを検出した。ＴＡＸＩＳｃａｎ−ＦＬは、エッチングしたシリコン基板と、平坦なガラスプレートから構成され、両者は、６μｍの深さのマイクロチャネルを有する二つのコンパートメントを形成する。各細胞フラクション（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌを、１μｌ）は、ステンレススチールホルダを備えたデバイスが結合した単一の孔に注入した。１０ｎｇ／μｌのＳＤＦ−１、１μｌは、反対側の孔に注入した。細胞遊走のビデオ画像を６時間にわたって撮影した。
【００８３】
［インビボ移植］
歯髄の除去及び細胞集団の移植の実験モデルは、歯根が完全に完成しており根管が閉鎖しているイヌ永久歯（Ｎａｒｃ，Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ）において確立した。両側の上顎第二門歯及び下顎第三門歯において、静脈内にペントバルビタールナトリウム（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を注入して全歯髄を除去した後、＃７０Ｋ−ｆｉｌｅ（ＭＡＮＩ．ＩＮＣ，Ｔｏｃｈｉｇｉ，Ｊａｐａｎ）を用いて、根尖部の根管の太さを０．７ｍｍ以上にした。第３継代から第４継代におけるイヌ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の、それぞれ５ｘ１０５ｃｅｌｌｓをコラーゲンＴＥ（新田ゼラチン）１０μｌでＤｉＩラベルした第１の組成物と、コラーゲンＴＥ１０μｌと最終濃度が１５ｎｇ／μｌのＳＤＦ−１を含む第２の組成物とから構成される、根管充填材を調製した。この充填材を、第１の組成物が下部根管に自家移植され、かつ第２の組成物が上部根管にあるように、根管に充填した。充填後、上部の孔はリン酸亜鉛セメント（Ｅｌｉｔｅ Ｃｅｍｅｎｔ，ＧＣ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）及び複合レジン（Ｃｌｅａｒｆｉｌ Ｍｅｇａ Ｂｏｎｄ，Ｋｕｒａｒａｙ）で封鎖し、接着剤(Ｃｌｅａｒｆｉｌ Ｍｅｇａ Ｂｏｎｄ，Ｋｕｒａｒａｙ)で処理した。１５匹のイヌからの６０の歯を使用した。各１０の歯に、歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１を移植し、１４日後及び２８日後に採取した。
【００８４】
形態学的分析のために、これらを４％のパラホルムアルデヒドＰＦＡ）（Ｎａｋａｒａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で、４℃において一晩固定し、１０％のギ酸で脱塩した後、パラフィンワックス（Ｓｉｇｍａ）に埋め込んだ。パラフィンのセクション（５μｍ厚さ）は、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色した後、形態学的分析を行った。血管の染色のため、５μｍ厚さのパラフィンのセクションは、脱パラフィンし、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ Ｌｅｃｔｉｎ１／ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ（ｓｎｏｗｄｒｏｐ）ｌｅｃｔｉｎ（２０μｇ／ｍｌ，Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｙｏｕｎｇｓｔｏｗｎ，Ｏｈｉｏ）で１５分間染色し、移植した細胞の存在及び局在化を新しく形成された血管との関連でモニターした。モニターには、蛍光顕微鏡ＢＩＯＲＥＶＯ，ＢＺ−９０００（ＫＥＹＥＮＣＥ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いた。
【００８５】
次に、神経染色のために、５μｍ厚さのパラフィンのセクションは、脱パラフィンし、０．３％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともに、１５分間インキュベートした。２．０％のｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍとともにインキュベーションして、非特異的結合をブロックした後、ヤギ抗ヒトＰＧＰ９．５（Ｕｌｔｒａ Ｃｌｏｎｅ Ｌｔｄ．）（１：１００００）とともに、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、結合した抗体は、ビオチン化ヤギ抗ウザギＩｇＧ二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）（１：２００）と、室温にて１時間反応させた。このセクションはまた、ＤＡＢ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎを用いて、ＡＢＣ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とともに、１０分間展開した。
【００８６】
移植１４日後の各サンプルにおける再生歯髄の相対量は、実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｍ２０５ＦＡ）での歯の全体画像を得ることにより測定した。イヌ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞及びＳＤＦ−１を移植したそれぞれ５本ずつの各歯について、１５０μｍの間隔をおいた３つのセクションを調べた。新たに再生された歯髄組織及び象牙質のスクリーンの映像の輪郭を追跡し、根管におけるこの輪郭の表面積を、Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて決定した。根管面積に対する再生面積の比率は、各歯の３つのセクションにおいて計算し、平均値を決定した。統計的分析は、ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。データは、５回の測定の平均±標準偏差であらわした。
【００８７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増殖は、３つの異なる細胞移植における再生組織の比較のために、歯根膜については、前述のマーカー、すなわちイヌａｘｉｎ２、ペリオスチン、アスポリン／ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １ （ＰＬＡＰ−１）、シンデカン３、テネイシンＣ、ＴＲＨ−ＤＥ、ビメンチン、アルカリホスファターゼもまた用いて行った。
【００８８】
［統計的分析］
平均値±標準偏差であらわされたデータは、ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔを用いて計算した。各実験は３回行い、典型的結果を図表に記した。
【００８９】
［結果］
［イヌ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の単離及び評価］
フローサイトメトリーによる分析の結果、同一個体からのイヌ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＳＰ細胞は、それぞれ全細胞の、１．５％、０．３％、０．１％で存在することがわかった（図７（ａ）、（ｅ）、（ｉ））。また、イヌ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞は、それぞれ全細胞の、０．９％、０．３％、０．１％で存在することがわかった（図７（ｂ）、（ｆ）、（ｊ））。これら３種類のＣＤ３１−ＳＰ細胞集団は、同様の細胞表現型、すなわち複数の長い突起を有する星状細胞および紡錘状細胞を含むものであった。星状細胞は顆粒に囲まれた大きな核を含有するものであった。紡錘状細胞は、細長い突起とわずかな細胞質を有するニューロン様の細胞であった。図７（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｋ）、（ｌ）に示す。３５ｍｍ皿に播種した、単一のイヌ歯髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、１０日間でコロニーを形成し、単一のイヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、１４日間でコロニーを形成した。この結果は、これらの細胞に、コロニー形成活性があることを示す。イヌ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の付着および増殖の効率はそれぞれ、８％、６％、７％であると推定された。第３継代における限界希釈法アッセイの結果、歯髄ＣＦＵの頻度は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては８０％と推定され、イヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては７５％と推定され、イヌ脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては８０％と推定された。
【００９０】
細胞表面抗体マーカーのフローサイトメトリー分析により、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞の「幹細胞としての形質」を、イヌ骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞と比較した。これら三種のＣＤ３１−ＳＰ細胞集団は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、およびＣＤ９０について陽性であった。ＣＤ３４＋細胞の割合は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞では、４．４％であり、これはイヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞の９．８％、イヌ脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の７．１％と比較して低いものであった。ＣＤ１０５＋細胞の割合は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞では、６０．２％であり、イヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞では６４．９％であり、イヌ脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の８５．５％と比較して低いものであった。これらは第４継代において、ＣＤ１４６についてはおおむね陰性であった。ＣＸＣＲ４は、イヌ歯髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、イヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞よりも多く発現していた。結果を表３に示す。
【００９１】
【表３】
【００９２】
幹細胞マーカーであるＳｔａｔ３、Ｂｍｉ１、Ｓｏｘ２、Ｔｅｒｔ、ＣＸＣＲ４は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、イヌ骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞と同程度に発現していた。この結果は、これら３種の細胞集団が、同程度の幹細胞としての性質を有していることを示唆する。血管新生因子および／または神経栄養因子である、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＭＭＰ−３の発現量は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては、イヌ骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞におけるよりも、多かった。ＢＤＮＦは、イヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、イヌ歯髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞におけるよりも多く発現した。ＧＤＮＦは三種の細胞集団でいずれも同様に発現した。結果を表４に示す。
【００９３】
【表４】
【００９４】
ＣＤ３１−ＳＰ細胞の血管内皮細胞への分化能（図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ））、ニューロスフェアへの分化能（図８（ｄ）、（ｅ）、（ｆ））、神経細胞への分化能（図８（ｇ）、（ｈ）、（ｉ））を、イヌ歯髄、骨髄、及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の三種の細胞集団において比較した。索状および管状の広範囲のネットワークが、すべての細胞集団において、培養１２時間までにはマトリゲル上で観察された（図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ））。クラスターおよび増殖性のニューロスフェアが培養開始後１４日において検出された。三種の細胞集団においては、ニューロスフェアの頻度および量においては、大きな相違は見られなかった。そして、これらのニューロスフェアからのさらなる神経誘導にも成功した。これら三種の細胞集団におけるほとんどの細胞は、免疫染色によりニューロモジュリン陽性であった。神経マーカー、ニューロフィラメント、ニューロモジュリン、Ｓｃｎ１α ｍＲＮＡは三種の細胞集団のすべてにおいて発現していた（図８（ｊ））。
【００９５】
［遊走と増殖］
ＴＡＸＩＳｃａｎ−ＦＬにより示されるＳＤＦ−１を加えた場合の遊走活性は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞において比較的高く、イヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては、これら二つよりも低いものであった（図９（ａ））。また、ＳＤＦ−１を加えた場合の増殖活性も、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞と、イヌ骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、いずれも同様であった（図９（ｂ））。
【００９６】
［根管への移植後の歯髄再生］
次に、イヌ歯髄、骨髄、および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１との、歯根が完全に完成しており根管が閉鎖しているイヌ永久歯の抜髄後の根管への、ｉｎ ｖｉｖｏでの自家移植を評価した（図１０）。歯髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の移植の結果、ＳＤＦ−１とともに移植した場合には、移植後１４日目には、歯髄様組織の形成が生じた（図１０（ａ）、（ｃ））。しかし、骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１とを移植した場合には、再生した歯髄の量は、歯髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１を移植した場合よりも少なかった（図１０（ｂ））。統計解析の結果、再生された領域は、歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞をＳＤＦ−１とともに移植した場合に、骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞をＳＤＦ−１とともに移植した場合と比較して、それぞれ、２．０倍、及び１．５倍であり、有意に大きいことがわかった（図１０（ｊ））。三種類のすべての移植において、再生された組織中の細胞は星状、あるいは紡錘状であった（図１０（ｄ）、（ｅ）、（ｆ））。しかし、線維性の基質形成が、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞移植の一部においてみられた（図１０（ｅ）、（ｆ））。さらに、脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１移植の９０日目には、歯髄内に強い石灰化が見られた（図１０（ｉ））が、歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１移植ではほとんど石灰化がみられず、骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１移植ではやや石灰化がみられた。凍結切片をＢＳ−１ ｌｅｃｔｉｎで染色した後に共焦点レーザー顕微鏡分析を行ったところ、再生組織において血管新生が生じていることがわかった（図１０（ｋ）（ｌ）（ｍ））。抗体で染色された神経突起は、根尖孔から新たに再生された歯髄内に延びていた（図１０（ｎ）（ｏ）（ｐ）。マッソン染色の結果、脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１移植の９０日目では強い基質形成がみられた。
【００９７】
ペリオスチンｍＲＮＡの発現は、イヌ歯髄、骨髄、及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞移植の再生組織において、正常な歯根膜組織における発現量よりも、ずっと少なかった。歯髄で多く発現することが知られている、シンデカン３、テナスチンＣ、ビメンチンは、すべての再生組織においても、正常な歯髄組織と比較して、同様に発現していることがわかった。脂肪、骨、象牙質、ａＰ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、Ｄｓｐｐの分化マーカーは、それぞれ、いずれの再生組織においても発現していなかった。結果を表５に示す。
【００９８】
【表５】
【実施例２】
【００９９】
［ブタ由来幹細胞による歯髄の再生］
［細胞分離］
初代歯髄細胞は、ブタ歯胚から分離した。ブタ初代脂肪細胞及び初代骨髄細胞は、それぞれ、同一のブタの下顎から分離した。これらの細胞は、Iohara et al., 2006に記載されている方法にしたがい、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，http://www.sigmaaldrich.com）でラベルした。そして、この細胞を、マウスＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，http://www.bdbioscience.com）で３０分間、４℃でプレインキュベートし、非特異的結合を除去した。これらの細胞を、さらに、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ＭＣＡ９２８）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，http://www.serotec.com）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ，ＰＥ）（ＭＣＡ９２８ＰＥ）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、および、２０％ウシ胎児血清を添加した、ＰＢＳ中の、マウス抗ブタＣＤ３１（ＰＥ）（ＬＣＩ−４）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，http://www.invitrogen.com）で６０分間、４℃でインキュベートした。そして、これらを、２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＨＥＰＥＳバッファー中で再懸濁させた。細胞の分析及びソーティングは、フローサイトメータ（ＦＡＣＳ−ＡＲＩＡＩＩ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を用いて行った。
【０１００】
ブタ歯髄、骨髄及び脂肪細胞由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞を、Ｉ型コラーゲンでコートした３５ｍｍ皿（Ａｓａｈｉ Ｔｅｃｈｎｏｇｌａｓｓ ｃｏｒｐ．，Ｆｕｎａｂａｓｈｉ，Ｊａｐａｎ，http://www.atgc.co.jp）中の、１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）及び５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を添加したＥＢＭ２にそれぞれ播種し、細胞を維持した。培地は、４〜５日に一度交換した。細胞が、５０〜６０％コンフルエントに達したら、０．０２％のＥＤＴＡで、３７℃、１０分間インキュベートすることにより分離し、１：４に希釈して、継代培養した。
【０１０１】
［細胞表面マーカーの発現］
ブタ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の表現型を第３継代において評価した。細胞は、下記の抗体で免疫標識し、フローサイトメトリーで分析した。マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ．）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）（ＭＣＡ９２８Ｆ）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−Ｃｙ５，ＰＥ−Ｃｙ５）（ＭＣＡ９２８Ｃ）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ａｌｅｘａ ６４７）（ＭＲＣ ＯＸ−３４）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、及び、ＣＤ１４（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７）（ＴｕＫ４）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ２９（ＰＥ−Ｃｙ５）（ＭＥＭ−１０１Ａ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３１（ＰＥ）（ＬＣＩ−４）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ３４（ＰＥ）（５８１）（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ４４（ＰＥ−Ｃｙ５）（ＩＭ７）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ７３（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７）（ＡＤ２）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ９０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７）（Ｆ１５−４２−１）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ１０５（ＦＩＴＣ）（ＭＥＭ−２２９）（ａｂｃａｍ）、ＣＤ１１７／ｃ−ｋｉｔ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ，ＡＰＣ）（Ａ３Ｃ６Ｅ２）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，http://www.miltenyibiotec.com）、ＣＤ１３３（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７）（２９３Ｃ３）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ１４６（ＦＩＴＣ）（ＯＪ７９ｃ）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ），ＣＤ１５０（ＦＩＴＣ）（Ａ１２）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ），ＣＤ２７１（ＡＰＣ）（ＭＥ２０．４−１Ｈ４）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．）、ＣＸＣＲ４（ＦＩＴＣ）（１２Ｇ５）（Ｒ＆Ｄ）に対する抗体。
【０１０２】
［幹細胞マーカー、血管新生因子及び神経栄養因子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析］
ブタ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞集団の幹細胞特性、血管新生能、神経原生能を調べるために、各ＣＤ３１−ＳＰ細胞から、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。細胞数は、各実験とも、５×１０４にノーマライズした。Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成は、ｔｏｔａｌ ＲＮＡから、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ−α（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて逆転写することによって行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増殖は、ライトサイクラーＦａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）で標識した幹細胞マーカー、ブタＣ Ｓｏｘ２、Ｔｅｒｔ，Ｂｍｉ１，ＣＸＣＲ４、Ｓｔａｔ３、及び血管新生因子及び神経栄養因子、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マトリックスメタロプロテアーゼ−３（ＭＭＰ−３）、血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ（Iohara et al., 2008（STEM CELLS, Volume 26, Issue 9, pages 2408-2418, September 2008）; Sugiyama et al., 2011（Tissue Engineering Part A. Jan 2011））を用いて、９５℃で１０秒、６２℃で１５秒、７２℃で８秒、ライトサイクラー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った．骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の発現は、ベータアクチンで正規化した後、歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞の発現と比較した。用いたプライマーを以下に示す。
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
［歯根モデルへの移植］
異所性の歯髄再生のために、ブタ歯根モデルの皮下移植を行った。ブタ第三切歯を抜歯し、その歯根を６ｍｍの長さにスライスした。根管を１ｍｍ幅にまで拡大した後、ＭＴＡセメントで一端を封鎖した。ブタ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞集団の第３から第４継代、それぞれ、１ｘ１０６ｃｅｌｌｓと、コラーゲンＴＥ（新田ゼラチン、Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）１０μｌから構成される根管充填材を調製した。この充填材を一端を封鎖した歯根に注入した。この歯根を、５週齢のＳＣＩＤマウス（ＣＢ１７，ＣＬＥＡ，Ｔｏｋｙｏ，ＪＡＰＡＮ，http://www.clea-japan.com）に皮下移植した。異なる４個体のブタ由来の歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞が、各２つの歯根に移植された。１４日後、組織学的研究のために、計２４本の歯根を採取した。
【０１０５】
形態学的分析のために、これらを４％のパラホルムアルデヒドＰＦＡ（Ｎａｋａｒａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で、４℃において一晩固定し、１０％のギ酸で脱塩した後、パラフィンワックス（Ｓｉｇｍａ）に埋め込んだ。パラフィンのセクション（５μｍ厚さ）は、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色した後、形態学的分析を行った。血管の染色のため、５μｍ厚さのパラフィンのセクションは、脱パラフィンし、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ Ｌｅｃｔｉｎ １／ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ（ｓｎｏｗｄｒｏｐ）ｌｅｃｔｉｎ（２０μｇ／ｍｌ，Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｙｏｕｎｇｓｔｏｗｎ，Ｏｈｉｏ）で１５分間染色し、移植した細胞の存在及び局在化を新しく形成された血管との関連でモニターした。モニターには、蛍光顕微鏡ＢＩＯＲＥＶＯ，ＢＺ−９０００（ＫＥＹＥＮＣＥ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いた。
【０１０６】
［ブタ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の単離及び評価］
フローサイトメトリーによる分析の結果、同一個体からの歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＳＰ細胞は、それぞれ全細胞の、１．６％、０．３％、０．１％で存在することがわかった（図１１Ａ（ａ）、１１Ｂ（ｅ）、１１Ｃ（ｉ））。また、歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞は、それぞれ全細胞の、０．９％、０．３％、０．１％で存在することがわかった（図１１Ａ（ｂ）、１１Ｂ（ｆ）、１１Ｃ（ｊ））。これら３種類のＣＤ３１−ＳＰ細胞集団は、同様の細胞表現型、すなわち複数の長い突起を有する星状細胞および紡錘状細胞を含むものであった。星状細胞は顆粒に囲まれた大きな核を含有するものであった。紡錘状細胞は、細長い突起とわずかな細胞質を有するニューロン様の細胞であった。図１１Ａ（ｃ）、Ａ（ｄ）、Ｂ（ｇ）、Ｂ（ｈ）、Ｃ（ｋ）、Ｃ（ｌ）に示す。ＩＧＦ１、ＥＧＦ、及び１０％のウシ胎児血清を添加したＥＢＭ２は、ＣＤ３１−ＳＰ細胞の表現型を保持していた。これは、第１２継代において、ＣＤ３１−及びＡＢＣＧ２／ＢＣＲＰ１＋が９９．８％より多いことを示す。コラーゲンタイプＩでコートされた３５ｍｍ皿に播種した、単一の歯髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、１０日でコロニーを形成し、単一の骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、１４日でコロニーを形成した。この結果は、これらの細胞にコロニー形成活性があることを示す。ブタ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の付着および増殖の効率はそれぞれ、８％，６％，７％であると推定された。第３継代における限界希釈法圧制の結果、歯髄ＣＦＵの頻度は、ブタ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては８０％と推定され、ブタ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては７５％と推定され、ブタ脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては８０％と推定された。
【０１０７】
細胞表面抗体マーカーのフローサイトメトリー分析により、ブタ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞の「幹細胞としての形質」を、ブタ骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞と比較した。これら三種のＣＤ３１−ＳＰ細胞集団は、第３継代において、ＣＤ２９、ＣＤ４４、およびＣＤ９０、ＣＤ１０５について陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ１４６については陰性であった。ブタ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、ブタ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞、ブタ脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞と比較して、はるかに多くのＣＤ３４を発現していた。ＣＸＣＲ４は、ブタ歯髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、ブタ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞よりも多く発現していた。結果を表７に示す。
【０１０８】
【表７】
【０１０９】
幹細胞マーカーであるＳｏｘ２、Ｔｅｒｔ、Ｂｍｉ１、ＣＸＣＲ４、Ｓｔａｔ３ ｍＲＮＡは、歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞と同程度に発現していた。この結果は、これら３種の細胞集団が、同程度に幹細胞としての性質を有していることを示唆する。血管新生因子および／または神経栄養因子である、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−３、ＶＥＧＦ−Ａ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙは、三種の細胞集団でいずれも同様に発現した。結果を表８に示す。
【０１１０】
【表８】
【０１１１】
ＣＤ３１−ＳＰ細胞の内皮細胞への分化能（図１２（ａ）、（ｂ）、（ｃ））、ニューロスフェアへの分化能（図１２（ｄ）、（ｅ）、（ｆ））を、三種のＣＤ３１−ＳＰ細胞集団において比較した。索状および管状の広範囲のネットワークが、すべての細胞集団において、培養１２時間目にはマトリゲル上で観察された（図１２（ａ）、（ｂ）、（ｃ））。クラスターおよび増殖性のニューロスフェアが培養開始後１４日において検出された。ニューロスフェアの頻度および量においては、三種の細胞集団間で、大きな相違は見られなかった。そして、これらのニューロスフェアからのさらなる神経誘導にも成功した。これらの結果は、三種の細胞集団のすべてが、同様の血管誘導及び神経誘導能を有することを示す。
【０１１２】
ＳＤＦ−１を加えた場合の増殖活性は、ブタ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞と、ブタ骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、いずれも同様であった（図１３（ａ））。ＴＡＸＩＳｃａｎ−ＦＬにより示されるＳＤＦ−１を加えた場合の遊走活性もまた、歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞と、骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、いずれも同様であった（図１３（ｂ））。
【０１１３】
［歯根に充填したＣＤ３１−ＳＰ細胞の皮下移植後の歯髄再生］
次に、歯根に充填したＣＤ３１−ＳＰ細胞の、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスへのｉｎ ｖｉｖｏ皮下移植を評価した。ブタ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞移植後１４日には、十分に組織化された血管系を有する歯髄様組織が、根管に充填されていた（図１４（ａ）、（ｂ）、（ｃ））。ブタ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞移植によってもまた、毛細血管を有する歯髄様組織が誘導されていた（図１４（ｄ）、（ｅ）、（ｆ））。ブタ脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞移植の結果、石灰化が見られた（図１４（ｇ）、（ｈ）、（ｉ））。
【実施例３】
【０１１４】
［歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３1−ＳＰ細胞の免疫原性］
イヌ血液は、採血後直ちにベノジェクト真空採血管（ＴＥＲＵＭＯ）に移し同量の生理食塩水（大塚製薬）を加え転倒混和後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ Ｔｕｂｅ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）を用いて比重遠心法（比重１．００７）にて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。一方のＰＢＭＣを、抗原性を保持したまま増殖を抑制するため、マイトマイシンＣ （ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）１０ｍｇ／ｍｌにて３時間３７℃にて処理しｓｔｉｍｕｌａｔｏｒとして使用した。
【０１１５】
イヌ歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の免疫調節能を比較するため、各細胞を１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭにて３日間培養後、それぞれの培養上清を採取し、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ（ＭＩＬＬＩ ＰＯＲＥ）を用いて１０倍に濃縮し、使用した。それぞれのＰＢＭＣを１×１０５ｃｅｌｌｓに調整後、ＰＢＭＣとｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ＰＢＭＣを１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ１６４０で９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ上で４８時間共培養した。さらに、歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の培養上清をそれぞれ加えて、ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒＯＮＥ（ＳＥＩＫＡＧＡＫＵ ＢＩＯＢＵＳＩＮＥＳＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）（ＭＴＴ法）を用い、増殖活性を経時的に測定し、培養上清添加によるＰＢＭＣ増殖抑制効果を比較した。
【０１１６】
ブタ歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３1−ＳＰ細胞の免疫原性に関与するｍＲＮＡをＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲにて検討した結果、ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｐｉｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）ｃｌａｓｓ ＩＩＤＲＢ、ＣＤ８０、ＣＤ４０の発現は３種すべてで見られなかった。また、ブタ未分取のｔｏｔａｌ歯髄細胞と比べて、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＡ発現は歯髄０．０７、骨髄０．２５、脂肪０．０８で非常に低い発現だった。また、フローサイトメトリーの結果では、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩが３種とも陰性であり、ＭＨＣ ｃｌａｓｓＩは歯髄３６．０％、骨髄７３．８％．脂肪は８０．０％であった。よって、３種ともに免疫原性が低いことが示唆された。
【０１１７】
［歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３1−ＳＰ細胞の免疫調整能］
イヌ歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３1−ＳＰ細胞の免疫調節能をｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ（ＭＬＲ）法にて、自己のイヌの末梢血単球の、他家の末梢血単球添加（これ自身増殖能なし）による増加を、３種の培養上清がそれぞれ抑制することにより検討した。その結果、歯髄・骨髄・脂肪ともにＣＤ３1−ＳＰ細胞は、自己の末梢血単球の増加を有意に抑制し、３種の間に有意差は認められなかった（図１５）。よって、３種とも同様の免疫調整能を有することが示唆された。
【符号の説明】
【０１１８】
１００ 対象となる歯
１１０ 根尖性歯周炎
１２０ 歯根部分
２００ 根管充填材
２１０ 細胞外基質
２２０ 間葉系幹細胞
２３０ 遊走因子
４００ 血管
５００ 象牙質
６１０ ゼラチン
６２０ レジン
６３０ 形態形成因子
６４０ セメント
７００ 根管充填材が充填された歯根部分
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞を含んでなる根管充填材及びこれを用いた歯組織再生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、歯を失う原因は、破折を含めると約半分がう蝕によるもので、歯髄を抜くと歯を失う可能性が激増することが知られている。歯の平均寿命は現在５７歳といわれ、一生自分の歯で咬むことを考えると、歯の寿命は２０年以上高める必要がある。８０２０運動（８０歳になっても自分の歯を２０本以上残す運動）にもかかわらず、現在８０歳の人の歯の達成率は２１％で、日本歯科医師会の打ち立てた５０％の目標達成にはう蝕治療の抜本的改革が必要である。
【０００３】
歯髄を除去、すなわち抜髄すると、修復象牙質形成能及び感染防御機構が喪失し、痛みという警告信号の喪失により、う蝕拡大の危険性が増加する。また、抜髄治療に完璧な方法はなく、抜髄・根管充填後、歯冠側からの漏えいにより根尖病巣が生じたり、垂直性破折や審美性の消失、術後疼痛が生じたりする可能性もある。
【０００４】
従って、超高齢社会では、安易に抜髄を行うことを避け、歯の延命化をめざして、歯再生医療技術を組み入れた象牙質・歯髄再生による新しいう蝕・歯髄炎治療法を開発することは非常に重要である。
【０００５】
一方、歯髄再生に関しては、これまで、歯根未完成歯において、抜歯して抜髄・根管治療をした後に再度移植すると歯髄が再生されるといわれている。根尖部に病変を伴う歯根未完成歯でも、抜歯して徹底的な根管拡大・清掃を行い、セメント・象牙境まで血餅を満たし、Mineral trioxide aggregate（ＭＴＡ）で窩洞を完全封鎖することにより、歯髄様組織が再生されるとの報告がある。
【０００６】
また、イヌの健全歯根完成歯においては、抜歯後抜髄し、根尖部を切断するあるいは根尖部を１．１ｍｍ以上拡大し再び移植し、血餅を充填すると歯髄様組織の再生がみられるといわれている（非特許文献１）。
【０００７】
上述の根管内歯髄再生は、歯根未完成歯についての報告が大半であり、根管内に再生された組織が血管や神経を伴う歯髄固有の組織であることの証明もなされていない。また、すべて、一旦抜歯して生体外で根管拡大・清掃を行い、再移植して血餅を充填している。
【０００８】
治療対象となる歯に対して、抜歯、抜髄後、根管の根尖側に、歯髄幹細胞を含む細胞と、前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質とを有する根管充填材を注入する歯組織再生方法も知られている（特許文献１）。
【０００９】
歯髄幹細胞は、患者の大きな負担なく、乳歯あるいは智歯から採取することができる点で有利である。しかし、高齢の患者から十分な量の歯髄幹細胞を採取することは難しく、臨床的応用においては実用化が難しいと考えられる。このため、超高齢化社会において、より利用しやすい供給源を用いて、歯組織の再生を実現することが望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００９／１１３７３３号
【００１１】
【非特許文献１】Laureys et al., Am J Orthod DentofacialOrthop. 2001 Apr;119(4):335.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記従来方法の欠点を克服し、より入手しやすく臨床的応用が可能であり、かつ効率的に歯組織再生を促進することができる、抜歯もしくは非抜歯根管充填材及びこれを用いた歯組織再生方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を達成するため鋭意検討を行った結果、歯髄幹細胞以外の間葉系幹細胞、例えば、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞もしくは臍帯血細胞のいずれかを抜歯もしくは非抜歯根管に移植することによっても、歯髄の再生が可能であることを発見し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
従って、本発明は、一実施の形態によれば、抜髄後もしくは感染根管の根管拡大清掃後、抜歯もしくは非抜歯の根管の根尖側に挿入される根管充填材であって、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞と、細胞外基質とを含んでいる。歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞もしくは臍帯血細胞のいずれか一つであることが好ましい。
【００１５】
前記歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が、ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、ＣＤ９０陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、ＣＤ３１陰性細胞、ＣＤ４５陰性細胞、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陰性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＦＬＫ−１陽性細胞，ＣＤ１６６陽性細胞、もしくはＶＥＧＦＲ２陽性細胞のうち少なくともいずれか一つを含むことが好ましい。
【００１６】
前記根管充填材が、細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくともいずれか一つを含む遊走因子をさらに含むことが好ましい。特には、根管充填材において、前記歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞を根管の根尖側に移植あるいは注入するとともに、根管の歯冠側に細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくともいずれか一つを含む遊走因子を付着させていることが好ましい。
【００１７】
前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ１、ＶＥＧＦ、ＧＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ、ＧＭ−ＣＳＦ及び血清のうち少なくともいずれか一つであることが好ましい。
【００１８】
前記細胞増殖因子が、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ及び血清のうち少なくともいずれか一つであることが好ましい。
【００１９】
前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ３及び血清のうち少なくともいずれか一つであることが好ましい。
【００２０】
前記細胞外基質が、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＣＬ、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくともいずれか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。
【００２１】
前記細胞外基質における前記歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下であることが好ましい。
【００２２】
本発明は、また別の局面によれば、抜歯もしくは非抜歯法による歯組織再生方法であって、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の根管の根尖側に、前述のいずれかに記載の根管充填材を注入する工程を含む。
【００２３】
前記根管充填材を前記根管の根尖側に注入する工程の前に、前記根管を拡大することで根尖部の根管の太さを所定の大きさにする工程をさらに含むことが好ましい。
【００２４】
本発明は、また別の局面によれば、歯組織の異所再生方法であって、第１の個体の歯の抜髄を行う工程と、前記歯の歯根部分を所定の長さに切り出す工程と、抜髄後の根管の一端を封鎖する工程と、前記根管に、間葉系幹細胞と細胞外基質とを含む根管充填材を注入する工程と、充填材を注入した歯根を第２の個体に移植する工程とを含み、さらに好ましくは、歯髄が再生された歯根を歯槽骨内に再植する工程を含む。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る根管充填材及びこれを用いた歯組織再生方法によれば、抜歯もしくは非抜歯法で歯組織再生を促進させることができる。根管充填材及びこれを用いた歯組織再生方法による歯組織再生では、再生組織に内部吸収及び外部吸収が見られず、且つ、破歯細胞も見られずに、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並んだ再生組織を得ることができる。また、本発明に係る歯組織の異所再生方法によれば、例えば免疫拒絶を考慮したヒトの遺伝子をもつブタ（ヒトブタ）などの異種個体において、歯組織を再生することができる点で有用である。これらは、超高齢化社会における歯科治療において非常に有望である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】第１実施形態に係る根管充填材の説明図である。
【図２】第１実施形態に係る根管充填材の製造工程を説明する説明図である。
【図３Ａ】歯髄炎に罹患している歯の説明図である。
【図３Ｂ】抜髄後の根管拡大処置を行ったところを説明する模式図である。
【図３Ｃ】根管充填材を充填するところを説明する模式図である。
【図３Ｄ】スポンゼル（ゼラチン）及びレジンを注入したところを説明する模式図である。
【図３Ｅ】歯髄再生及び血管再生を示す模式図である。
【図３Ｆ】形態形成因子及びレジンを注入したところを説明する模式図である。
【図３Ｇ】象牙質再生を示す模式図である。
【図３Ｈ】細菌が根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に及んでいる根尖性歯周炎の模式図である。
【図３Ｉ】抜歯後に抜髄及び消毒し、根尖部を切断して開口し、根管に、根管充填材を充填するところを説明する模式図である。
【図４】第２実施形態に係る根管充填材の説明図であり、そのうち（ａ）は根管の歯冠側に遊走因子を付着させている構成であり、（ｂ）は歯冠部側に細胞外基質を残す構成である。
【図５】第２実施形態に係る根管充填材の製造工程を説明する説明図である。
【図６】充填材を注入した歯根を免疫不全マウスへ移植する、歯組織の異所再生方法を示す概念図である。
【図７Ａ】イヌ歯髄組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の分離を示す。図７Ａ（ａ）はフローサイトメトリー分析結果であり、図７Ａ（ｂ）は、歯髄組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。図７Ａ（ｃ）は、イヌ歯髄組織由来の初代ＣＤ３１−ＳＰ細胞の３日目、図７Ａ（ｄ）は１０日目の位相差顕微鏡画像を示す。実験はそれぞれ１２回繰り返し、典型的な実験を表示した。
【図７Ｂ】イヌ骨髄組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の分離を示す。図７Ｂ（ｅ）はフローサイトメトリー分析結果であり、図７Ｂ（ｆ）は、骨髄組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。図７Ｂ（ｇ）は、イヌ骨髄組織由来の初代ＣＤ３１−ＳＰ細胞の３日目、図７（ｈ）は１０日目の位相差顕微鏡画像を示す。
【図７Ｃ】イヌ脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の分離を示す。図７Ｃ（ｉ）はフローサイトメトリー分析結果であり、図７Ｃ（ｊ）は、脂肪組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。図７Ｃ（ｋ）は、イヌ骨髄組織由来の初代ＣＤ３１−ＳＰ細胞の３日目、図７Ｃ（ｌ）は１０日目の位相差顕微鏡画像を示す。
【図８】（ａ）、（ｄ）、（ｇ）はイヌ歯髄組織、（ｂ）、（ｅ）、（ｈ）はイヌ骨髄組織、（ｃ）、（ｆ）、（ｉ）はイヌ脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の多系列分化能を示す位相差顕微鏡画像である。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、マトリゲルアッセイを用いた内皮分化能であり、播種１２時間後である。（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）は、ニューロスフェア形成であり、第４継代の細胞集団を誘導後１４日である。（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）は、ニューロスフェアを解離させて神経誘導した後１４日である。（ｊ）は、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、及びｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎのｍＲＮＡの発現を示す。実験は三度繰り返し、典型的な実験を表示した。
【図９】イヌ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰの間質細胞由来因子１の遊走及び増殖効果を示す。データは、平均値±標準偏差で表し、４回の測定を行った。実験は３回繰り返し、典型的な実験結果を示した。（ａ）は、培養後０、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４時間の、ＳＤＦ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いた場合の遊走活性を示す。＊Ｐ＜０．００１ 歯髄ｖｓ骨髄，＃Ｐ＜０．０５ 歯髄ｖｓ脂肪，＊＊Ｐ＜０．００１ 骨髄ｖｓ脂肪。（ｂ）は、培養後２、１８、２６、４４時間の、ＳＤＦ−１（１０ｎｇ／ｍｌを用いた場合の増殖活性を示す。
【図１０Ａ】本願発明に係る充填材を抜髄後のイヌ根管に自家移植した際の歯髄組織の完全な再生を示す。（ａ）、（ｄ）、（ｇ）は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰを移植した場合であり、（ｂ）、（ｅ）、（ｈ）は、イヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰを移植した場合であり、（ｃ）、（ｆ）、（ｉ）、は、イヌ脂肪ＣＤ３１−ＳＰを移植した場合の顕微鏡画像である。（ａ）〜（ｆ）は移植後１４日であり、（ｇ）〜（ｉ）は移植後２８日である。図中、矢印はマトリックスの形成を、ｍは石灰化した組織を示す。（ｊ）は、１４日における、新たに再生された組織の面積の、根管の面積に対する比率を示す。データは、平均値±標準偏差であらわした。
【図１０Ｂ】本願発明に係る充填材を抜髄後のイヌ根管に自家移植した際の歯髄組織の完全な再生を示す。（ｋ）、（ｎ）、（ｑ）は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰを移植した場合であり、（ｌ）、（ｏ）、（ｒ）は、イヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰを移植した場合であり、（ｍ）、（ｐ）、（ｓ）は、イヌ脂肪ＣＤ３１−ＳＰを移植した場合の顕微鏡画像である。（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）はＢＳ−１レクチンで免疫染色した結果を示す共焦点顕微鏡像であり、新たに形成された毛細血管を示す。（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）は、ＰＧＰ９．５で免疫染色した結果である。（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）は、マッソン・トリクロム染色した結果であり、基質形成を示す。
【図１１Ａ】ブタ歯髄組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の分離を示す。（ａ）はフローサイトメトリー分析結果であり、（ｂ）は、歯髄組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。（ｃ）は、ブタ歯髄組織由来の初代ＣＤ３１−ＳＰ細胞の３日目、（ｄ）は７日目の位相差顕微鏡画像を示す。実験はそれぞれ１２回繰り返し、典型的な実験を表示した。
【図１１Ｂ】ブタ骨髄組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の分離を示す。（ｅ）はフローサイトメトリー分析結果であり、（ｆ）は、骨髄組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。（ｇ）は、ブタ骨髄組織由来の初代ＣＤ３１−ＳＰ細胞の３日目、（ｈ）は７日目の位相差顕微鏡画像を示す。
【図１１Ｃ】ブタ脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の分離を示す。（ｉ）はフローサイトメトリー分析結果であり、（ｊ）は、脂肪組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。（ｋ）は、ブタ骨髄組織由来の初代ＣＤ３１−ＳＰ細胞の３日目、（ｌ）は７日目の位相差顕微鏡画像を示す。
【図１２】（ａ）、（ｄ）はブタ歯髄組織、（ｂ）、（ｅ）はブタ骨髄組織、（ｃ）、（ｆ）、はブタ脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の多系列分化能を示す位相査顕微鏡画像である。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、マトリゲルアッセイを用いた内皮分化能であり、播種１２時間後である。（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）は、第４継代の細胞集団を誘導後１４日のニューロスフェアである。実験は三度繰り返し、典型的な実験を表示した。
【図１３】間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）に対する歯髄、骨髄、脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の効果を示す。データはサンプル数４の平均値±標準偏差で表す。実験は三度繰り返し、典型的な実験を表示した。non-paired Student’s t test にて統計解析した。（ａ）０、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４時間後の遊走能。ＳＤＦ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）投与。＊Ｐ＜０．００１ 歯髄ｖｓ骨髄、＃Ｐ＜０．０５ 歯髄ｖｓ脂肪、＊＊Ｐ＜０．００１骨髄ｖｓ脂肪。（ｂ）２、１８、２６、４４時間後の増殖能 ＳＤＦ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）投与。
【図１４】免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス）へのｉｎ ｖｉｖｏ皮下移植後の歯髄再生を示す。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、ブタ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞を移植した場合、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）は、ブタ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞を移植した場合、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）は、ブタ脂肪ＣＤ３１−ＳＰを移植した場合の、いずれも、移植後１４日目の光学顕微鏡画像である。
【図１５】イヌ自己および他者ＰＢＭＣ（末梢血単核球）を用いたイヌ歯髄、骨髄、脂肪培養上清の免疫抑制能の検討。＊Ｐ＜０．００１ 歯髄ｖｓ骨髄、＃Ｐ＜０．００１ 歯髄ｖｓ脂肪、†Ｐ＜０．００１ 骨髄ｖｓ脂肪。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下に、本発明を図面を参照して詳細に説明する。以下の説明は、本発明を限定するものではない。
【００２８】
（第１実施形態）
本発明は、第１実施形態によれば、細胞外基質と、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞とを含んでなる根管充填材である。図１は、本実施形態に係る根管充填材２００の説明図である。根管充填材２００は、細胞外基質２１０に、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０を付着させて形成される。ここで、「付着させて形成される」とは、細胞外基質が液体、流体等の場合には、細胞外基質に、好ましくは均一に、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が混合されていることを意味する。いっぽう、細胞外基質が、後述するスポンジ状の三次元構造体等、一定の形状を有する形態の場合には、細胞外基質が構成する構造体の表面及び内部に、好ましくは均一に、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が取り込まれ、保持されていることをいう。歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０は、根管充填材２００の根管の根尖側に付着される。ここで、「根管充填材２００の根管の根尖側に付着される」とは、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が、根管の根尖側に注入され、移植されるように根管充填材が形成されることをいう。
【００２９】
歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞は、歯髄以外の任意の組織由来のものであってよい。例えば、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞、もしくは臍帯血幹細胞を用いることができる。また、これらの間葉系幹細胞は、歯組織再生の処置を受ける対象の個体自身の組織から抽出した自家細胞でもよいし、また、歯組織再生の処置を受ける対象個体以外の個体の組織から抽出した同種細胞でもよい。歯組織再生の処置を受ける対象は、哺乳動物であってよく、特にはヒトである。
【００３０】
歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞の一例である骨髄幹細胞は、骨髄由来の幹細胞であって、既知の方法により骨髄組織から抽出、分離することが出来る。また、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞もそれぞれ、脂肪組織、羊膜組織、臍帯血組織由来の幹細胞であって、これらも既知の方法により、各組織から抽出、分離することが出来る。
【００３１】
歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞は、ＳＰ細胞、及び／または、特定の細胞マーカーを発現する細胞画分を分取して用いることができる。具体的には、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、ＣＤ９０陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＣＤ３１陰性細胞、ＣＤ４５陰性細胞、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陰性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＦＬＫ−１陽性細胞，ＣＤ１６６陽性細胞、またはＶＥＧＦＲ２陽性細胞のうち少なくともいずれか一つを含むことができる。なお、本明細書において、陽性を「＋」、陰性を「−」と指称することもある。
【００３２】
特には、ＣＤ３１陰性ｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）細胞を含むことが好ましい。なお、本明細書において、ＣＤ３１陰性ｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ細胞は、ＣＤ３１−ＳＰ細胞とも指称する。ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、マウス下肢虚血部に移植すると血流回復・血管新生が促進され、ラット脳梗塞虚血部に移植すると神経細胞の分化促進、運動麻痺が回復する。また、イヌの生活歯髄切断面上に移植すると生活歯髄切断面上の窩洞内に血管新生・神経再生・歯髄再生が見られる。間葉系幹細胞としてＣＤ３１−ＳＰ細胞を用いる場合、歯髄再生能力は高いと考えられる。
【００３３】
ＳＰ細胞は、フローサイトメトリーを利用したセルソーティング法による、当業者には既知の通常の方法を用いて分離することができる。特定の細胞マーカーを発現する細胞画分は、抗体を用いたフローサイトメトリーや磁気ビーズ方法によって得ることが出来る。分取した画分をさらに培養し、培養の第３〜第５継代の間葉系幹細胞を、本実施形態にかかる根幹充填材に用いることが好ましい。
【００３４】
根管充填材２００における間葉系幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下とすることが好ましい。間葉系幹細胞の含有率が、１×１０３セル／μｌよりも少ないと、根管内の歯組織の再生が不十分なものとなる可能性があるからである。一方、間葉系幹細胞の含有率が、１×１０６セル／μｌよりも多いと、対象の歯に対して予期せぬ副作用が生じる可能性があるからである。
【００３５】
細胞外基質（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）２１０は、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＬＧＡ（乳酸グリコール酸共重合体）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＤＬＬＡ（ポリ−ＤＬ−乳酸）、ＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくともいずれか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。なお、プロテオグリカンは、タンパク質と糖鎖（グリコサミノグリカン）が共有結合した複合糖質の一種である。また、細胞外基質は、熱可塑性高分子等の高分子体で作製された数平均直径が１ｎｍ〜１０００ｎｍのナノファイバーからなるスポンジ状の三次元構造体も使用できる。そのような三次元構造体の空隙率は８０％〜９９．９９％とすることが好ましい。
【００３６】
細胞外基質として使用されるコラーゲンは、Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとの混合であるＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲンを用いることが好ましい。Ｉ型コラーゲンとは、基本的コラーゲンであり、線維性コラーゲンである。ＩＩＩ型コラーゲンは、コラーゲン線維とは別の、細網線維と呼ばれる細い網目状の構造を形成し、細胞等の足場を作ることができる。
【００３７】
上述の混合コラーゲンを用いる場合には、ＩＩＩ型コラーゲンの割合は１０重量％以上５０重量％以下とすることが好ましい。ＩＩＩ型コラーゲンの割合が５０重量％よりも多くなると、混合コラーゲンが固化できないおそれがあるからである。一方、ＩＩＩ型コラーゲンの割合が１０重量％よりも少なくなると、Ｉ型コラーゲンの割合が多くなり、後述するような血管新生が起こるのではなく、象牙質が再生される可能性があるからである。
【００３８】
次に、図２を用いて、本実施形態に係る根管充填材２００の製造方法を説明する。
【００３９】
根管充填材２００は、細胞外基質２１０の根尖側に歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０を付着させて形成される。間葉系幹細胞２２０は根管充填材２００の根尖部の１／４〜２／３に付着されているのが望ましく、より望ましくは根尖部の１／３である。根管充填材は、流体状の細胞外基質を用いる場合には、細胞外基質と間葉系幹細胞とを含む第１の組成物と、細胞外基質を含む第２の組成物とを調製し、これらがそれぞれ、根尖部、歯冠部に位置するように形成することができる。製造方法の一具体例としては、まず、トータルで２０μリットルとし、ピペットマンのチップ等に１０μリットル〜１３μリットルのＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲンを吸い込み、次に、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞を混合させたＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲン（例えばコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン））を７μリットル〜１０μリットル吸い込むことができる。ピペットマンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好ましい。根管充填材内部に気泡が発生すると、発生した気泡が細胞の遊走を妨げて歯組織再生の促進が損なわれるからである。ピペットマンのチップの内径は細いものが好ましく、例えばチップの下内径が０．５〜０．７ｍｍのものが使用でき、例えばＱＳＰ社のＨ−０１０−９６ＲＳマイクロキャピラリーチップを使用できる。根管充填材の形状は、特に限定されるものではなく、例えば円錐、円錐台、円柱等である。あるいは、根管充填材は、スポンジ状の三次元構造体の細胞外基質を用いる場合には、歯根に適合するサイズに形成された、細胞外基質を含む構造体の根尖部に歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞を吸収させて調製することができる。なお、本実施形態の説明における上記細胞外基質の使用容量は、一例であって、充填材は特定の容量には限定されず、歯髄を再生させる歯の根管の容量に応じて、適宜決定することができる。
【００４０】
次に、図３Ａ〜図３Ｆを用いて、根管充填材２００を使用する非抜歯法による歯組織再生方法を、歯組織再生方法の一例として説明する。
【００４１】
本実施形態に係る歯髄組織再生方法は、図３Ａに示すように、例えば歯髄炎が発生している対象となる歯１００について、非抜歯にて歯組織再生を行う。対象となる歯とは、う蝕、歯髄炎等により、細菌感染が冠部歯髄又は根部歯髄まで波及している歯をいう。
【００４２】
対象となる歯１００について、図３Ｂに示すように、抜髄又は感染根管の根管拡大清掃が行われる。抜髄とは、歯牙の内部に存在する歯髄を除去することである。抜髄は当業者には既知の通常の方法、たとえば、手用あるいは電気エンジンのリーマー・ファイルあるいはロータリーエンジンで器械的に拡大形成後、次亜塩素酸ソーダとオキシドールで交互洗浄する方法によって行うことができる。また、感染根管とは、細菌が歯髄に到達後、根管壁の象牙質に及んでいる場合の根管をいい、根管拡大清掃後とは、感染根管における細菌を除去した後をいう。細菌の除去は、たとえば、交互洗浄後、根管内薬剤塗布によって行うことができる。
【００４３】
抜髄後は、対象となる歯の根管を拡大し、根尖部の根管の大きさを所定の太さにすることが望ましい。抜髄あるいは感染根管治療した根管内に根管充填材２００を充填する際に、根管を拡大しておくほうが根管充填材２００を充填しやすいためである。また、根尖歯周組織から血管及び神経が進入しやすいためである。ここで、根尖とは、対象となる歯の歯槽骨に結合される端部（歯根の先端部分）をいう。歯の根管の拡大は、手用あるいは電気エンジンのリーマー・ファイルあるいはロータリーエンジンで器械的にという方法によって行うことができる。
【００４４】
例えば、図３Ｂにおいて、根尖部の根管の太さｄは、根管の直径において０．６ｍｍ以上、１．５ｍｍ以下とすることが望ましい。根管の太さｄが０．６ｍｍよりも小さいと、血管及び神経が根尖歯周組織から進入しにくく、また根管充填材２００の充填が難しいおそれがあるからである。一方、根管の太さが１．５ｍｍよりも大きいと、対象となる歯に対して必要以上の負担を与えて割れやすくなるおそれがあるからである。
【００４５】
次に、図３Ｃに示されるように、根管の根尖側にピンセット等により根管充填材２００を充填する。根管充填材２００は、生物学的材質を含有するので、生物学的根管充填材とすることもできる。根管充填材２００は、根管内の歯髄が存在した場所である歯髄相当部位に充填することが望ましい。なお、細胞外基質２１０がゲル状の場合はピンセット等でつまむことができないので、ピペットマン、注射等により注入することができる。
【００４６】
根管の根尖側に根管充填材２００を注入した後は、図３Ｄに示されるように、根管充填材２００の上部にゼラチン６１０を注入し、レジン６２０により蓋をすることができる。ゼラチン、及びレジンは、特に限定されることなく、歯科治療で通常使用されるものを用いることができる。
【００４７】
これにより、根管内の歯組織が再生される。再生される歯組織は、図３Ｅに示されるように、例えば根管内の歯髄固有組織、血管４００、神経等である。また、ＢＭＰｓ等の形態形成因子を用いることにより、再生される歯組織としては象牙質がある。更に、感染根管に対して根管充填材２００を充填する場合は、再生される歯組織として歯根膜（歯槽骨に歯を植立する歯周組織）やセメント質等の歯周組織がある。
【００４８】
その後は、レジン６２０を一度除去して、図３Ｆに示すように、ＢＭＰｓ等の形態形成因子６３０又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布し、レジン６２０により蓋をする。形態形成因子６３０又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布したことにより、図３Ｇに示されるように象牙質５００も再生することができる。
【００４９】
更に、本実施形態に係る根管充填材２００を用いる歯組織再生では、再生組織に内部吸収及び外部吸収が見られず、且つ、破歯細胞も見られずに、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並んでいる。また、出血による血餅が多量に存在すると歯髄組織再生の障害になると考えられるところ、非抜歯の方法では、血餅の発生を低く抑えられ、効率的に歯組織再生を促進させることができるという利点がある。また、根管拡大後の出血や症状が消失するまで根管貼薬して根管充填を待つことができ、実際の臨床治療に近接させることができるという利点もある。
【００５０】
なお、上述したように、対象となる歯１００は、う蝕、歯髄炎等により、細菌感染が冠部歯髄又は根部歯髄まで波及している歯であってよいが、これに限定されない。すなわち、対象となる歯１００には神経機能が低下して咬合感覚が弱くなっている歯も含まれる。このような場合は、抜髄後に、根管に根管充填材２００を充填することにより、歯髄を再生させることで咬合感覚を向上させることができる。また、図３Ｈに示すように、対象となる歯１００には、細菌感染が根尖歯周組織まで波及している歯（細菌が歯髄に到達後、根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に及んでいる歯）も含まれる。このような歯は根尖性歯周炎１１０を伴うことが多い。感染根管の根管拡大清掃後に、根管充填材２００を注入することが好ましい。
【００５１】
本実施形態による根管充填材は、非抜歯のみならず、抜歯の形態でも同様に用いることができる。抜歯の形態で用いる場合には、ます、歯組織再生が所望される対象を、抜歯する。抜歯後、感染根管の根管拡大清掃後、抜髄及び消毒する。抜髄及び消毒は、上記非抜歯の方法で説明したのと同様にして行うことが出来る。次に、根尖部を切断して開口して根管充填材を移植する。根尖部の切断箇所は、下端から１ｍｍ〜２ｍｍが好ましい。根尖部の切断方法は、歯科的な通常の方法、例えば、エアタービンや電気エンジンによることができる。根管充填材の注入は、上記非抜歯の方法で説明したのと同様にして行うことが出来る。図３Ｉは、抜歯の形態における、根管の根尖側への根管充填材２００の充填を示す根管充填材を注入した後は、根管充填材の上部にゼラチンを注入し、レジンにより蓋をする。その後は抜歯をした歯を抜歯窩に再移植することができる。抜歯の形態は、特に直視で患歯を処置できることおよび根尖部歯周組織に傷害が少ないという利点がある。
【００５２】
（第２実施形態）
第２実施形態に係る根管充填材は、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞と、遊走因子とを含む。遊走因子は、細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくともいずれか一つを含む。
【００５３】
図４（ａ）及び（ｂ）は、本発明の第２実施形態に係る根管充填材２００の説明図である。図４（ａ）に示すように、根管充填材２００は、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側（例えば根管の上部１／２〜２／３）に細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくともいずれか一つを含む遊走因子２３０を付着させている。
【００５４】
間葉系幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させ、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させる理由は、間葉系幹細胞２２０を根管の歯冠側にまで付着させても組織からの栄養が供給されずに壊死する可能性があるからであり、また、根管の根尖側に付着している間葉系幹細胞２２０が根管の歯冠側に付着している遊走因子に引っぱられて歯組織再生が促進されやすいからである。なお、図４（ｂ）に示すように、根管充填材２００の根管の歯冠側に細胞外基質２１０を残しておくことも可能である。
【００５５】
遊走因子は、細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち一つを含むものであってもよく、二以上を組み合わせて含むものであってもよい。
【００５６】
細胞遊走因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の遊走に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。また、細胞増殖因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の増殖に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。そして、神経栄養因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の生存に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。
【００５７】
細胞遊走因子は、ＳＤＦ１、ＶＥＧＦ、ＧＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ、ＧＭ−ＣＳＦ、及び血清のうち少なくともいずれか一つを用いることが好ましい。特に、ＭＭＰ３は、細胞遊走能が高く好適に使用することができる。
【００５８】
細胞増殖因子は、ＩＧＦ，ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ及び血清の少なくともいずれか一つを用いることが好ましい。
【００５９】
神経栄養因子は、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ３及び血清のうち少なくともいずれか一つを用いることが好ましい。血清は、自己血清が好ましい。自己血清とは、歯組織再生を受ける個体の血清であって、新鮮な血液を３０分静置させた後、遠心させて上清を集めることにより得ることができる。
【００６０】
遊走因子を付着させた細胞外基質における、遊走因子の含有率は、０．１ｎｇ／μｌ以上５００ｎｇ／μｌ以下とすることが好ましい。遊走因子の含有率が０．１ｎｇ／μｌよりも少ないと、遊走の程度が少なくなる可能性がありうるからである。一方、遊走因子の含有率が５００ｎｇ／μｌよりも多いと、対象となる歯１００に対して予期せぬ副作用が生じる可能性があり得るからである。
【００６１】
次に、図５を用いて、本実施形態に係る根管充填材２００の製造方法を説明する。図５は、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させる根管充填材２００の製造方法を説明する説明図である。
【００６２】
実施形態２に係る根管充填材２００は、流体状の細胞外基質を用いる場合には、細胞外基質と歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞とを含む第１の組成物と、細胞外基質と遊走因子とを含む第２の組成物とを調製し、これらがそれぞれ、根尖部、歯冠部に位置するように注入、移植することができる。製造方法の一具体例としては、まず、トータルで２０μリットルとし、ピペットマンのチップ等に遊走因子を混合させたＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲン（Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとの混合割合は１：１）を１０μリットル〜１３μリットル吸い込む。次に、間葉系幹細胞を混合させたＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲンを７μリットル〜１０μリットル吸い込む。実施形態２においても、ピペットマンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好ましい。また、ピペットマンのチップの内径は細いものが好ましい。このようにして、図４（ａ）に示す根管充填材２００が製造される。
【００６３】
実施形態２に係る根管充填材２００の使用形態は、実施形態１と同様に、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の非抜歯の根管の根尖側、あるいは、抜歯後、根尖部を切断して開口した根管の根尖側に充填することができる。
【００６４】
本実施形態に係る根管充填材２００によれば、遊走因子を有しているため更に効率的に、歯組織再生を行うことができ、再生組織には、内部吸収は無く、破歯細胞も見られずに、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並んでいる。
【００６５】
（第３実施形態）
上述の第１実施形態では、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０が根管充填材２００の根管の根尖側に付着されて根管充填材２００は構成されていた。しかし、そのような実施形態に限定されることはなく、間葉系幹細胞２２０は、根管充填材２００の全体に均一に混合されていても良い。このような根管充填材２００も、抜歯もしくは非抜歯の両方の形態で同様に使用することができ、これを使用することにより、歯根完成歯に対して、内部吸収を発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並ぶ歯組織再生を図ることができる。このような根管充填材２００は、例えば、間葉系幹細胞２２０と、細胞外基質の一例であるＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲンとを気泡を発生させないように均一に混合させることにより製造される。
【００６６】
また、上述の第２実施形態では、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させて、根管充填材２００は構成されていた。しかし、そのような実施形態に限定されることはなく、間葉系幹細胞２２０及び遊走因子２３０は共に、根管充填材２００の全体に均一に混合されていても良い。このような根管充填材２００も、抜歯もしくは非抜歯の両方の形態で同様に使用することができ、これを使用することにより、歯根完成歯に対して、内部吸収を発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並ぶ歯組織再生を図ることができる。この根管充填材２００は、例えば、間葉系幹細胞と、遊走因子と、細胞外基質の一例であるＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲンとを気泡を発生させないように均一に混合させることにより製造される。
【００６７】
（第４実施形態）
本願発明は、第４実施形態によれば、上記第１〜第３の実施形態において説明した根管充填材を用いた歯組織の異所再生方法である。歯組織の異所再生方法は、第１の個体の歯の抜髄を行う工程と、前記歯の歯根部分を所定の長さに切り出す工程と、前記根管に、前述の根管充填材を注入する工程と、充填材を注入した歯根を第２の個体に移植する工程とを含む。
【００６８】
根管充填材は、上記第１〜第３の実施形態において説明したものを用いることができる。しかし、上記第１〜第３の実施形態における根管充填材を構成する間葉系幹細胞に替えて、歯髄幹細胞を用いることもできる。この場合、歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＳＳＥＡ−４陽性細胞、ＦＬＫ−１陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、歯髄ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞及びＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１６６陽性細胞のうち少なくともいずれか一つを含むことが好ましく、前記歯髄ＳＰ細胞が、ＣＸＣＲ４陽性、ＳＳＥＡ−４陽性、ＦＬＫ−１陽性、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１５０陽性、ＣＤ７３陽性、又は、ＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１６６陽性細胞のうち少なくともいずれか一つを含むことが好ましい。
【００６９】
上記第１の個体は、歯を再生することを所望する個体であって、哺乳動物が好ましく、典型的にはヒトである。上記第２の個体は、第１の個体と異なり、ヒトを除く哺乳動物である。たとえば、マウスやブタであってよく、免疫不全化したマウスやブタを用いることができる。
【００７０】
第４実施形態にかかる方法を、図６を用いて説明する。図６（ａ）は、第１の個体の歯１００である。本実施形態に用いる第１の個体の歯は、第１の個体から抜歯することによって得ることができる。第１の個体の歯の抜髄を行う工程では、第１実施形態で説明したのと同様に、抜髄を行う。図６（ｂ）は、抜歯され、歯髄が除去された歯１００である。前記歯の歯根部分を所定の長さに切り出す工程では、再生させる組織の大きさに応じて、歯の歯根部分を切り出す。例えば、１〜３０ｍｍとすることができるが、これらには限定されない。図６（ｃ）は、切り出される歯根部分１２０を模式的に示したものである。抜髄後の根管の一端を封鎖する工程では、切り出した歯根部分１２０の根管の一端を、セメント等を用いて封鎖する。前記根管に、前述の根管充填材を注入する工程では、第１〜第３実施形態で説明した方法に従って充填材を調製し、注入する。図６（ｄ）は、根管充填材２００を歯根部分１２０の根管に注入した状態を示す。根管充填材２００は、間葉系幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させる。図６（ｅ）は、根管充填材が注入された歯根部分７００を示す。根管充填材２００を注入した歯根を第２の個体に移植する工程では、図６（ｆ）に示すように、根管充填材２００を注入された歯根部分７００を、第２の個体の、好ましくは皮下に移植する。
【００７１】
その後、第２の個体を所定の期間にわたって飼育し、前記根管充填材が充填された歯根部分７００を取り出すことで、再生された歯組織を得ることが出来る。再生された歯組織は、さらに、第１の個体の歯槽骨内に再移植して用いることができる。第４実施形態にかかる方法は、ある個体の歯組織を、別の個体で再生することができる点で非常に有利でありうる。
【００７２】
以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００７３】
［イヌ由来幹細胞による歯髄の再生］
［細胞分離］
イヌ上歯から抽出したイヌ歯髄組織より、Iohara et al., 2006（STEM CELLS, Volume 24, Issue 11, pages 2493-2503, November 2006）に記載の方法により、イヌ歯髄幹細胞を分取した。初代脂肪細胞及び初代骨髄細胞は、それぞれ、同一のイヌの腹部皮下脂肪及び肋骨の骨髄から分離した。これらの細胞は、Iohara et al., 2006に記載されているように、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，http://www.sigmaaldrich.com）でラベルした。そして、この細胞を、マウスＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，http://www.bdbioscience.com）で３０分間、４℃でプレインキュベートし、非特異的結合を除去した。これらの細胞を、さらに、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ＭＣＡ９２８）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，http://www.serotec.com）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ，ＰＥ）（ＭＣＡ９２８ＰＥ）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、および、２０％ウシ胎児血清を添加した、ＰＢＳ中の、マウス抗ブタＣＤ３１（ＰＥ）（ＬＣＩ−４）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，http://www.invitrogen.com）で６０分間、４℃でインキュベートした。そして、これらを、２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＨＥＰＥＳバッファー中で再懸濁させた。細胞の分析及びソーティングは、フローサイトメータ（ＦＡＣＳ−ＡＲＩＡ ＩＩ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。
【００７４】
イヌ歯髄、骨髄及び脂肪細胞由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞を、Ｉ型コラーゲンでコートした３５ｍｍ皿（Ａｓａｈｉ Ｔｅｃｈｎｏｇｌａｓｓ ｃｏｒｐ．，Ｆｕｎａｂａｓｈｉ，Ｊａｐａｎ，http://www.atgc.co.jp）中の、１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）にそれぞれ播種し、細胞を維持した。培地は、４〜５日に一度交換した。細胞が、５０〜６０％コンフルエントに達したら、０．０２％のＥＤＴＡで３７℃、１０分間インキュベートすることにより分離し、１：４に希釈して、継代培養した。
【００７５】
［細胞表面マーカーの発現］
イヌ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の表現型を第３継代において評価した。細胞は、以下のもので免疫標識した。マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ．）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）（ＭＣＡ９２８Ｆ）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−Ｃｙ５，ＰＥ−Ｃｙ５）（ＭＣＡ９２８Ｃ）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ａｌｅｘａ ６４７）（ＭＲＣ ＯＸ−３４）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ２４（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）（ＭＬ５）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２９（ＰＥ−Ｃｙ５）（ＭＥＭ−１０１Ａ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３１（ＦＩＴＣ）（Ｑｂｅｎｄ１０）（Ｄａｋｏ）、ＣＤ３３（ＦＩＴＣ）（ＨＩＭ３−４）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３４（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ，ＡＰＣ）（１Ｈ６）（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）、ＣＤ４４（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ｃｙ７）（ＩＭ７）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ７３（ＡＰＣ）（ＡＤ２）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ９０（ＦＩＴＣ）（ＹＫＩＸ３３７．２１７）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ１４６（ＦＩＴＣ）（ｓｃ−１８８３７）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ１５０（ＦＩＴＣ）（Ａ１２）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＭＨＣクラスＩ（Ｒ−ＰＥ）（３Ｆ１０）（Ａｎｃｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ，ＵＳＡ）、ＭＨＣ ｃｌａｓｓＩＩ（ＡＰＣ）（ＴＤＲ３１．１）（Ａｎｃｅｌｌ）、ＣＸＣＲ４（ＦＩＴＣ）（１２Ｇ５）（Ｒ＆Ｄ）に対する抗体。
【００７６】
［リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析］
細胞集団のさらなる表現型を評価するために、第３継代において歯髄および脂肪ＣＤ１０５＋細胞、及びｔｏｔａｌ歯髄細胞から、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。細胞数は、各実験とも、５×１０４にノーマライズした。Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成は、ｔｏｔａｌＲＮＡから、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ−α（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて逆転写することによって行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増殖は、ライトサイクラーＦａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）で標識した幹細胞マーカーである、ｃａｎｉｎｅ ＣＸＣＲ４、Ｓｏｘ２、Ｓｔａｔ３、Ｂｍｉ１、Ｔｅｒｔ、Ｏｃｔ４を用いて、９５℃で１０秒，６２℃で１５秒、７２℃で８秒、ライトサイクラー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。用いたプライマーを以下に示す。
【００７７】
【表１】
【００７８】
【表２】
【００７９】
血管新生因子及び神経栄養因子のｍＲＮＡの発現を調べるために、イヌマトリックスメタロプロテアーゼ−３（ＭＭＰ−３）、ＶＥＧＦ−Ａ、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＳＤＦ−１、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ３のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増殖もまた行った（Iohara et al.,submitted）。骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の発現は、ベータアクチンで正規化した後、歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞の発現と比較した。
【００８０】
［分化誘導］
第３継代から第５継代のイヌ骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の血管新生細胞及び神経栄養細胞への分化は、Iohara et al., 2006に記載した歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞の分化と比較した。神経分化については、ニューロフィラメント、ニューロモジュリン、及びｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ，ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ，ｔｙｐｅＩα（Ｓｃｎ１α）の発現を調べた。
【００８１】
［増殖及び遊走アッセイ］
間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）（Ａｃｒｉｓ，Ｈｅｒｆｏｒｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に応答した細胞増殖を決定するために、第４継代のイヌ骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞と歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞を、０．２％のウシ胎児アルブミン（Ｓｉｇｍａ）及びＳＤＦ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、９６ウェルあたり、１０３ｃｅｌｌｓの条件で比較した。１０μｌのＴｅｔｒａ−ｃｏｌｏｒ ｏｎｅ（登録商標）（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ｋｏｇｙｏ，Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，ＪＡＰＡＮ）を９６ウェルプレートに添加し、培養開始後、２、１２、２４、３６時間において、分光光度計を用いて波長４５０ｎｍの吸光度を測定し、細胞数を得た。細胞を入れないウェルをネガティブコントロールとして用いた。
【００８２】
歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞と比較した骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の遊走活性を調べるために、ＳＤＦ−１、ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓアッセイを行った。ＴＡＸＩＳｃａｎ−ＦＬ（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔｏｋｙｏ，ＪＡＰＡＮ）を用いて、細胞のリアルタイムｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓを検出した。ＴＡＸＩＳｃａｎ−ＦＬは、エッチングしたシリコン基板と、平坦なガラスプレートから構成され、両者は、６μｍの深さのマイクロチャネルを有する二つのコンパートメントを形成する。各細胞フラクション（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌを、１μｌ）は、ステンレススチールホルダを備えたデバイスが結合した単一の孔に注入した。１０ｎｇ／μｌのＳＤＦ−１、１μｌは、反対側の孔に注入した。細胞遊走のビデオ画像を６時間にわたって撮影した。
【００８３】
［インビボ移植］
歯髄の除去及び細胞集団の移植の実験モデルは、歯根が完全に完成しており根管が閉鎖しているイヌ永久歯（Ｎａｒｃ，Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ）において確立した。両側の上顎第二門歯及び下顎第三門歯において、静脈内にペントバルビタールナトリウム（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を注入して全歯髄を除去した後、＃７０Ｋ−ｆｉｌｅ（ＭＡＮＩ．ＩＮＣ，Ｔｏｃｈｉｇｉ，Ｊａｐａｎ）を用いて、根尖部の根管の太さを０．７ｍｍ以上にした。第３継代から第４継代におけるイヌ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の、それぞれ５ｘ１０５ｃｅｌｌｓをコラーゲンＴＥ（新田ゼラチン）１０μｌでＤｉＩラベルした第１の組成物と、コラーゲンＴＥ１０μｌと最終濃度が１５ｎｇ／μｌのＳＤＦ−１を含む第２の組成物とから構成される、根管充填材を調製した。この充填材を、第１の組成物が下部根管に自家移植され、かつ第２の組成物が上部根管にあるように、根管に充填した。充填後、上部の孔はリン酸亜鉛セメント（Ｅｌｉｔｅ Ｃｅｍｅｎｔ，ＧＣ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）及び複合レジン（Ｃｌｅａｒｆｉｌ Ｍｅｇａ Ｂｏｎｄ，Ｋｕｒａｒａｙ）で封鎖し、接着剤(Ｃｌｅａｒｆｉｌ Ｍｅｇａ Ｂｏｎｄ，Ｋｕｒａｒａｙ)で処理した。１５匹のイヌからの６０の歯を使用した。各１０の歯に、歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１を移植し、１４日後及び２８日後に採取した。
【００８４】
形態学的分析のために、これらを４％のパラホルムアルデヒドＰＦＡ）（Ｎａｋａｒａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で、４℃において一晩固定し、１０％のギ酸で脱塩した後、パラフィンワックス（Ｓｉｇｍａ）に埋め込んだ。パラフィンのセクション（５μｍ厚さ）は、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色した後、形態学的分析を行った。血管の染色のため、５μｍ厚さのパラフィンのセクションは、脱パラフィンし、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ Ｌｅｃｔｉｎ１／ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ（ｓｎｏｗｄｒｏｐ）ｌｅｃｔｉｎ（２０μｇ／ｍｌ，Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｙｏｕｎｇｓｔｏｗｎ，Ｏｈｉｏ）で１５分間染色し、移植した細胞の存在及び局在化を新しく形成された血管との関連でモニターした。モニターには、蛍光顕微鏡ＢＩＯＲＥＶＯ，ＢＺ−９０００（ＫＥＹＥＮＣＥ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いた。
【００８５】
次に、神経染色のために、５μｍ厚さのパラフィンのセクションは、脱パラフィンし、０．３％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともに、１５分間インキュベートした。２．０％のｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍとともにインキュベーションして、非特異的結合をブロックした後、ヤギ抗ヒトＰＧＰ９．５（Ｕｌｔｒａ Ｃｌｏｎｅ Ｌｔｄ．）（１：１００００）とともに、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、結合した抗体は、ビオチン化ヤギ抗ウザギＩｇＧ二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）（１：２００）と、室温にて１時間反応させた。このセクションはまた、ＤＡＢ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎを用いて、ＡＢＣ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とともに、１０分間展開した。
【００８６】
移植１４日後の各サンプルにおける再生歯髄の相対量は、実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｍ２０５ＦＡ）での歯の全体画像を得ることにより測定した。イヌ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞及びＳＤＦ−１を移植したそれぞれ５本ずつの各歯について、１５０μｍの間隔をおいた３つのセクションを調べた。新たに再生された歯髄組織及び象牙質のスクリーンの映像の輪郭を追跡し、根管におけるこの輪郭の表面積を、Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて決定した。根管面積に対する再生面積の比率は、各歯の３つのセクションにおいて計算し、平均値を決定した。統計的分析は、ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。データは、５回の測定の平均±標準偏差であらわした。
【００８７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増殖は、３つの異なる細胞移植における再生組織の比較のために、歯根膜については、前述のマーカー、すなわちイヌａｘｉｎ２、ペリオスチン、アスポリン／ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １ （ＰＬＡＰ−１）、シンデカン３、テネイシンＣ、ＴＲＨ−ＤＥ、ビメンチン、アルカリホスファターゼもまた用いて行った。
【００８８】
［統計的分析］
平均値±標準偏差であらわされたデータは、ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔを用いて計算した。各実験は３回行い、典型的結果を図表に記した。
【００８９】
［結果］
［イヌ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の単離及び評価］
フローサイトメトリーによる分析の結果、同一個体からのイヌ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＳＰ細胞は、それぞれ全細胞の、１．５％、０．３％、０．１％で存在することがわかった（図７（ａ）、（ｅ）、（ｉ））。また、イヌ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞は、それぞれ全細胞の、０．９％、０．３％、０．１％で存在することがわかった（図７（ｂ）、（ｆ）、（ｊ））。これら３種類のＣＤ３１−ＳＰ細胞集団は、同様の細胞表現型、すなわち複数の長い突起を有する星状細胞および紡錘状細胞を含むものであった。星状細胞は顆粒に囲まれた大きな核を含有するものであった。紡錘状細胞は、細長い突起とわずかな細胞質を有するニューロン様の細胞であった。図７（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｋ）、（ｌ）に示す。３５ｍｍ皿に播種した、単一のイヌ歯髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、１０日間でコロニーを形成し、単一のイヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、１４日間でコロニーを形成した。この結果は、これらの細胞に、コロニー形成活性があることを示す。イヌ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の付着および増殖の効率はそれぞれ、８％、６％、７％であると推定された。第３継代における限界希釈法アッセイの結果、歯髄ＣＦＵの頻度は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては８０％と推定され、イヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては７５％と推定され、イヌ脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては８０％と推定された。
【００９０】
細胞表面抗体マーカーのフローサイトメトリー分析により、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞の「幹細胞としての形質」を、イヌ骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞と比較した。これら三種のＣＤ３１−ＳＰ細胞集団は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、およびＣＤ９０について陽性であった。ＣＤ３４＋細胞の割合は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞では、４．４％であり、これはイヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞の９．８％、イヌ脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の７．１％と比較して低いものであった。ＣＤ１０５＋細胞の割合は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞では、６０．２％であり、イヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞では６４．９％であり、イヌ脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の８５．５％と比較して低いものであった。これらは第４継代において、ＣＤ１４６についてはおおむね陰性であった。ＣＸＣＲ４は、イヌ歯髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、イヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞よりも多く発現していた。結果を表３に示す。
【００９１】
【表３】
【００９２】
幹細胞マーカーであるＳｔａｔ３、Ｂｍｉ１、Ｓｏｘ２、Ｔｅｒｔ、ＣＸＣＲ４は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、イヌ骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞と同程度に発現していた。この結果は、これら３種の細胞集団が、同程度の幹細胞としての性質を有していることを示唆する。血管新生因子および／または神経栄養因子である、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＭＭＰ−３の発現量は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては、イヌ骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞におけるよりも、多かった。ＢＤＮＦは、イヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、イヌ歯髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞におけるよりも多く発現した。ＧＤＮＦは三種の細胞集団でいずれも同様に発現した。結果を表４に示す。
【００９３】
【表４】
【００９４】
ＣＤ３１−ＳＰ細胞の血管内皮細胞への分化能（図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ））、ニューロスフェアへの分化能（図８（ｄ）、（ｅ）、（ｆ））、神経細胞への分化能（図８（ｇ）、（ｈ）、（ｉ））を、イヌ歯髄、骨髄、及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の三種の細胞集団において比較した。索状および管状の広範囲のネットワークが、すべての細胞集団において、培養１２時間までにはマトリゲル上で観察された（図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ））。クラスターおよび増殖性のニューロスフェアが培養開始後１４日において検出された。三種の細胞集団においては、ニューロスフェアの頻度および量においては、大きな相違は見られなかった。そして、これらのニューロスフェアからのさらなる神経誘導にも成功した。これら三種の細胞集団におけるほとんどの細胞は、免疫染色によりニューロモジュリン陽性であった。神経マーカー、ニューロフィラメント、ニューロモジュリン、Ｓｃｎ１α ｍＲＮＡは三種の細胞集団のすべてにおいて発現していた（図８（ｊ））。
【００９５】
［遊走と増殖］
ＴＡＸＩＳｃａｎ−ＦＬにより示されるＳＤＦ−１を加えた場合の遊走活性は、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞において比較的高く、イヌ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては、これら二つよりも低いものであった（図９（ａ））。また、ＳＤＦ−１を加えた場合の増殖活性も、イヌ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞と、イヌ骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、いずれも同様であった（図９（ｂ））。
【００９６】
［根管への移植後の歯髄再生］
次に、イヌ歯髄、骨髄、および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１との、歯根が完全に完成しており根管が閉鎖しているイヌ永久歯の抜髄後の根管への、ｉｎ ｖｉｖｏでの自家移植を評価した（図１０）。歯髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の移植の結果、ＳＤＦ−１とともに移植した場合には、移植後１４日目には、歯髄様組織の形成が生じた（図１０（ａ）、（ｃ））。しかし、骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１とを移植した場合には、再生した歯髄の量は、歯髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１を移植した場合よりも少なかった（図１０（ｂ））。統計解析の結果、再生された領域は、歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞をＳＤＦ−１とともに移植した場合に、骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞をＳＤＦ−１とともに移植した場合と比較して、それぞれ、２．０倍、及び１．５倍であり、有意に大きいことがわかった（図１０（ｊ））。三種類のすべての移植において、再生された組織中の細胞は星状、あるいは紡錘状であった（図１０（ｄ）、（ｅ）、（ｆ））。しかし、線維性の基質形成が、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞移植の一部においてみられた（図１０（ｅ）、（ｆ））。さらに、脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１移植の９０日目には、歯髄内に強い石灰化が見られた（図１０（ｉ））が、歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１移植ではほとんど石灰化がみられず、骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１移植ではやや石灰化がみられた。凍結切片をＢＳ−１ ｌｅｃｔｉｎで染色した後に共焦点レーザー顕微鏡分析を行ったところ、再生組織において血管新生が生じていることがわかった（図１０（ｋ）（ｌ）（ｍ））。抗体で染色された神経突起は、根尖孔から新たに再生された歯髄内に延びていた（図１０（ｎ）（ｏ）（ｐ）。マッソン染色の結果、脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞とＳＤＦ−１移植の９０日目では強い基質形成がみられた。
【００９７】
ペリオスチンｍＲＮＡの発現は、イヌ歯髄、骨髄、及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞移植の再生組織において、正常な歯根膜組織における発現量よりも、ずっと少なかった。歯髄で多く発現することが知られている、シンデカン３、テナスチンＣ、ビメンチンは、すべての再生組織においても、正常な歯髄組織と比較して、同様に発現していることがわかった。脂肪、骨、象牙質、ａＰ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、Ｄｓｐｐの分化マーカーは、それぞれ、いずれの再生組織においても発現していなかった。結果を表５に示す。
【００９８】
【表５】
【実施例２】
【００９９】
［ブタ由来幹細胞による歯髄の再生］
［細胞分離］
初代歯髄細胞は、ブタ歯胚から分離した。ブタ初代脂肪細胞及び初代骨髄細胞は、それぞれ、同一のブタの下顎から分離した。これらの細胞は、Iohara et al., 2006に記載されている方法にしたがい、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，http://www.sigmaaldrich.com）でラベルした。そして、この細胞を、マウスＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，http://www.bdbioscience.com）で３０分間、４℃でプレインキュベートし、非特異的結合を除去した。これらの細胞を、さらに、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ＭＣＡ９２８）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，http://www.serotec.com）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ，ＰＥ）（ＭＣＡ９２８ＰＥ）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、および、２０％ウシ胎児血清を添加した、ＰＢＳ中の、マウス抗ブタＣＤ３１（ＰＥ）（ＬＣＩ−４）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，http://www.invitrogen.com）で６０分間、４℃でインキュベートした。そして、これらを、２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＨＥＰＥＳバッファー中で再懸濁させた。細胞の分析及びソーティングは、フローサイトメータ（ＦＡＣＳ−ＡＲＩＡＩＩ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を用いて行った。
【０１００】
ブタ歯髄、骨髄及び脂肪細胞由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞を、Ｉ型コラーゲンでコートした３５ｍｍ皿（Ａｓａｈｉ Ｔｅｃｈｎｏｇｌａｓｓ ｃｏｒｐ．，Ｆｕｎａｂａｓｈｉ，Ｊａｐａｎ，http://www.atgc.co.jp）中の、１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）及び５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を添加したＥＢＭ２にそれぞれ播種し、細胞を維持した。培地は、４〜５日に一度交換した。細胞が、５０〜６０％コンフルエントに達したら、０．０２％のＥＤＴＡで、３７℃、１０分間インキュベートすることにより分離し、１：４に希釈して、継代培養した。
【０１０１】
［細胞表面マーカーの発現］
ブタ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の表現型を第３継代において評価した。細胞は、下記の抗体で免疫標識し、フローサイトメトリーで分析した。マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ．）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）（ＭＣＡ９２８Ｆ）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−Ｃｙ５，ＰＥ−Ｃｙ５）（ＭＣＡ９２８Ｃ）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ａｌｅｘａ ６４７）（ＭＲＣ ＯＸ−３４）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、及び、ＣＤ１４（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７）（ＴｕＫ４）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ２９（ＰＥ−Ｃｙ５）（ＭＥＭ−１０１Ａ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３１（ＰＥ）（ＬＣＩ−４）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ３４（ＰＥ）（５８１）（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ４４（ＰＥ−Ｃｙ５）（ＩＭ７）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ７３（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７）（ＡＤ２）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ９０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７）（Ｆ１５−４２−１）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ１０５（ＦＩＴＣ）（ＭＥＭ−２２９）（ａｂｃａｍ）、ＣＤ１１７／ｃ−ｋｉｔ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ，ＡＰＣ）（Ａ３Ｃ６Ｅ２）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，http://www.miltenyibiotec.com）、ＣＤ１３３（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７）（２９３Ｃ３）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ１４６（ＦＩＴＣ）（ＯＪ７９ｃ）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ），ＣＤ１５０（ＦＩＴＣ）（Ａ１２）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ），ＣＤ２７１（ＡＰＣ）（ＭＥ２０．４−１Ｈ４）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．）、ＣＸＣＲ４（ＦＩＴＣ）（１２Ｇ５）（Ｒ＆Ｄ）に対する抗体。
【０１０２】
［幹細胞マーカー、血管新生因子及び神経栄養因子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析］
ブタ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞集団の幹細胞特性、血管新生能、神経原生能を調べるために、各ＣＤ３１−ＳＰ細胞から、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。細胞数は、各実験とも、５×１０４にノーマライズした。Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成は、ｔｏｔａｌ ＲＮＡから、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ−α（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて逆転写することによって行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増殖は、ライトサイクラーＦａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）で標識した幹細胞マーカー、ブタＣ Ｓｏｘ２、Ｔｅｒｔ，Ｂｍｉ１，ＣＸＣＲ４、Ｓｔａｔ３、及び血管新生因子及び神経栄養因子、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マトリックスメタロプロテアーゼ−３（ＭＭＰ−３）、血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ（Iohara et al., 2008（STEM CELLS, Volume 26, Issue 9, pages 2408-2418, September 2008）; Sugiyama et al., 2011（Tissue Engineering Part A. Jan 2011））を用いて、９５℃で１０秒、６２℃で１５秒、７２℃で８秒、ライトサイクラー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った．骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の発現は、ベータアクチンで正規化した後、歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞の発現と比較した。用いたプライマーを以下に示す。
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
［歯根モデルへの移植］
異所性の歯髄再生のために、ブタ歯根モデルの皮下移植を行った。ブタ第三切歯を抜歯し、その歯根を６ｍｍの長さにスライスした。根管を１ｍｍ幅にまで拡大した後、ＭＴＡセメントで一端を封鎖した。ブタ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞集団の第３から第４継代、それぞれ、１ｘ１０６ｃｅｌｌｓと、コラーゲンＴＥ（新田ゼラチン、Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）１０μｌから構成される根管充填材を調製した。この充填材を一端を封鎖した歯根に注入した。この歯根を、５週齢のＳＣＩＤマウス（ＣＢ１７，ＣＬＥＡ，Ｔｏｋｙｏ，ＪＡＰＡＮ，http://www.clea-japan.com）に皮下移植した。異なる４個体のブタ由来の歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞が、各２つの歯根に移植された。１４日後、組織学的研究のために、計２４本の歯根を採取した。
【０１０５】
形態学的分析のために、これらを４％のパラホルムアルデヒドＰＦＡ（Ｎａｋａｒａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で、４℃において一晩固定し、１０％のギ酸で脱塩した後、パラフィンワックス（Ｓｉｇｍａ）に埋め込んだ。パラフィンのセクション（５μｍ厚さ）は、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色した後、形態学的分析を行った。血管の染色のため、５μｍ厚さのパラフィンのセクションは、脱パラフィンし、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ Ｌｅｃｔｉｎ １／ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ（ｓｎｏｗｄｒｏｐ）ｌｅｃｔｉｎ（２０μｇ／ｍｌ，Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｙｏｕｎｇｓｔｏｗｎ，Ｏｈｉｏ）で１５分間染色し、移植した細胞の存在及び局在化を新しく形成された血管との関連でモニターした。モニターには、蛍光顕微鏡ＢＩＯＲＥＶＯ，ＢＺ−９０００（ＫＥＹＥＮＣＥ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いた。
【０１０６】
［ブタ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞の単離及び評価］
フローサイトメトリーによる分析の結果、同一個体からの歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＳＰ細胞は、それぞれ全細胞の、１．６％、０．３％、０．１％で存在することがわかった（図１１Ａ（ａ）、１１Ｂ（ｅ）、１１Ｃ（ｉ））。また、歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１−ＳＰ細胞は、それぞれ全細胞の、０．９％、０．３％、０．１％で存在することがわかった（図１１Ａ（ｂ）、１１Ｂ（ｆ）、１１Ｃ（ｊ））。これら３種類のＣＤ３１−ＳＰ細胞集団は、同様の細胞表現型、すなわち複数の長い突起を有する星状細胞および紡錘状細胞を含むものであった。星状細胞は顆粒に囲まれた大きな核を含有するものであった。紡錘状細胞は、細長い突起とわずかな細胞質を有するニューロン様の細胞であった。図１１Ａ（ｃ）、Ａ（ｄ）、Ｂ（ｇ）、Ｂ（ｈ）、Ｃ（ｋ）、Ｃ（ｌ）に示す。ＩＧＦ１、ＥＧＦ、及び１０％のウシ胎児血清を添加したＥＢＭ２は、ＣＤ３１−ＳＰ細胞の表現型を保持していた。これは、第１２継代において、ＣＤ３１−及びＡＢＣＧ２／ＢＣＲＰ１＋が９９．８％より多いことを示す。コラーゲンタイプＩでコートされた３５ｍｍ皿に播種した、単一の歯髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、１０日でコロニーを形成し、単一の骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、１４日でコロニーを形成した。この結果は、これらの細胞にコロニー形成活性があることを示す。ブタ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の付着および増殖の効率はそれぞれ、８％，６％，７％であると推定された。第３継代における限界希釈法圧制の結果、歯髄ＣＦＵの頻度は、ブタ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては８０％と推定され、ブタ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては７５％と推定され、ブタ脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞においては８０％と推定された。
【０１０７】
細胞表面抗体マーカーのフローサイトメトリー分析により、ブタ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞の「幹細胞としての形質」を、ブタ骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞と比較した。これら三種のＣＤ３１−ＳＰ細胞集団は、第３継代において、ＣＤ２９、ＣＤ４４、およびＣＤ９０、ＣＤ１０５について陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ１４６については陰性であった。ブタ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、ブタ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞、ブタ脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞と比較して、はるかに多くのＣＤ３４を発現していた。ＣＸＣＲ４は、ブタ歯髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、ブタ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞よりも多く発現していた。結果を表７に示す。
【０１０８】
【表７】
【０１０９】
幹細胞マーカーであるＳｏｘ２、Ｔｅｒｔ、Ｂｍｉ１、ＣＸＣＲ４、Ｓｔａｔ３ ｍＲＮＡは、歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞と同程度に発現していた。この結果は、これら３種の細胞集団が、同程度に幹細胞としての性質を有していることを示唆する。血管新生因子および／または神経栄養因子である、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−３、ＶＥＧＦ−Ａ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙは、三種の細胞集団でいずれも同様に発現した。結果を表８に示す。
【０１１０】
【表８】
【０１１１】
ＣＤ３１−ＳＰ細胞の内皮細胞への分化能（図１２（ａ）、（ｂ）、（ｃ））、ニューロスフェアへの分化能（図１２（ｄ）、（ｅ）、（ｆ））を、三種のＣＤ３１−ＳＰ細胞集団において比較した。索状および管状の広範囲のネットワークが、すべての細胞集団において、培養１２時間目にはマトリゲル上で観察された（図１２（ａ）、（ｂ）、（ｃ））。クラスターおよび増殖性のニューロスフェアが培養開始後１４日において検出された。ニューロスフェアの頻度および量においては、三種の細胞集団間で、大きな相違は見られなかった。そして、これらのニューロスフェアからのさらなる神経誘導にも成功した。これらの結果は、三種の細胞集団のすべてが、同様の血管誘導及び神経誘導能を有することを示す。
【０１１２】
ＳＤＦ−１を加えた場合の増殖活性は、ブタ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞と、ブタ骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、いずれも同様であった（図１３（ａ））。ＴＡＸＩＳｃａｎ−ＦＬにより示されるＳＤＦ−１を加えた場合の遊走活性もまた、歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞と、骨髄および脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞において、いずれも同様であった（図１３（ｂ））。
【０１１３】
［歯根に充填したＣＤ３１−ＳＰ細胞の皮下移植後の歯髄再生］
次に、歯根に充填したＣＤ３１−ＳＰ細胞の、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスへのｉｎ ｖｉｖｏ皮下移植を評価した。ブタ歯髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞移植後１４日には、十分に組織化された血管系を有する歯髄様組織が、根管に充填されていた（図１４（ａ）、（ｂ）、（ｃ））。ブタ骨髄ＣＤ３１−ＳＰ細胞移植によってもまた、毛細血管を有する歯髄様組織が誘導されていた（図１４（ｄ）、（ｅ）、（ｆ））。ブタ脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞移植の結果、石灰化が見られた（図１４（ｇ）、（ｈ）、（ｉ））。
【実施例３】
【０１１４】
［歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３1−ＳＰ細胞の免疫原性］
イヌ血液は、採血後直ちにベノジェクト真空採血管（ＴＥＲＵＭＯ）に移し同量の生理食塩水（大塚製薬）を加え転倒混和後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ Ｔｕｂｅ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）を用いて比重遠心法（比重１．００７）にて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。一方のＰＢＭＣを、抗原性を保持したまま増殖を抑制するため、マイトマイシンＣ （ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）１０ｍｇ／ｍｌにて３時間３７℃にて処理しｓｔｉｍｕｌａｔｏｒとして使用した。
【０１１５】
イヌ歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の免疫調節能を比較するため、各細胞を１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭにて３日間培養後、それぞれの培養上清を採取し、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ（ＭＩＬＬＩ ＰＯＲＥ）を用いて１０倍に濃縮し、使用した。それぞれのＰＢＭＣを１×１０５ｃｅｌｌｓに調整後、ＰＢＭＣとｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ＰＢＭＣを１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ１６４０で９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ上で４８時間共培養した。さらに、歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３１−ＳＰ細胞の培養上清をそれぞれ加えて、ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒＯＮＥ（ＳＥＩＫＡＧＡＫＵ ＢＩＯＢＵＳＩＮＥＳＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）（ＭＴＴ法）を用い、増殖活性を経時的に測定し、培養上清添加によるＰＢＭＣ増殖抑制効果を比較した。
【０１１６】
ブタ歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３1−ＳＰ細胞の免疫原性に関与するｍＲＮＡをＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲにて検討した結果、ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｐｉｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）ｃｌａｓｓ ＩＩＤＲＢ、ＣＤ８０、ＣＤ４０の発現は３種すべてで見られなかった。また、ブタ未分取のｔｏｔａｌ歯髄細胞と比べて、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＡ発現は歯髄０．０７、骨髄０．２５、脂肪０．０８で非常に低い発現だった。また、フローサイトメトリーの結果では、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩが３種とも陰性であり、ＭＨＣ ｃｌａｓｓＩは歯髄３６．０％、骨髄７３．８％．脂肪は８０．０％であった。よって、３種ともに免疫原性が低いことが示唆された。
【０１１７】
［歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３1−ＳＰ細胞の免疫調整能］
イヌ歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３1−ＳＰ細胞の免疫調節能をｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ（ＭＬＲ）法にて、自己のイヌの末梢血単球の、他家の末梢血単球添加（これ自身増殖能なし）による増加を、３種の培養上清がそれぞれ抑制することにより検討した。その結果、歯髄・骨髄・脂肪ともにＣＤ３1−ＳＰ細胞は、自己の末梢血単球の増加を有意に抑制し、３種の間に有意差は認められなかった（図１５）。よって、３種とも同様の免疫調整能を有することが示唆された。
【符号の説明】
【０１１８】
１００ 対象となる歯
１１０ 根尖性歯周炎
１２０ 歯根部分
２００ 根管充填材
２１０ 細胞外基質
２２０ 間葉系幹細胞
２３０ 遊走因子
４００ 血管
５００ 象牙質
６１０ ゼラチン
６２０ レジン
６３０ 形態形成因子
６４０ セメント
７００ 根管充填材が充填された歯根部分
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、根管の根尖側に挿入される、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞と、細胞外基質とを含んでなる根管充填材。
【請求項２】
前記間葉系幹細胞が、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞もしくは臍帯血細胞のいずれかである、請求項１に記載の根管充填材。
【請求項３】
前記骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞もしくは臍帯血細胞が、ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、ＣＤ９０陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、ＣＤ３１陰性細胞、ＣＤ４５陰性細胞、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陰性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＦＬＫ−１陽性細胞，ＣＤ１６６陽性細胞あるいはＶＥＧＦＲ２陽性細胞のうち少なくともいずれか一つを含む、請求項１記載の根管充填材。
【請求項４】
前記根管充填材が、細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくともいずれか一つを含む遊走因子をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の歯根管充填材。
【請求項５】
前記歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が根管の根尖側に位置し、前記遊走因子が根管の歯冠側に位置する、請求項４に記載の歯根管充填材。
【請求項６】
前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ１、ＶＥＧＦ、ＧＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ、ＧＭ−ＣＳＦ及び血清のうち少なくともいずれか一つである、請求項４または５に記載の根管充填材。
【請求項７】
前記細胞増殖因子が、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ及び血清のうち少なくともいずれか一つである、請求項４または５に記載の根管充填材。
【請求項８】
前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ３及び血清のうち少なくともいずれか一つである、請求項４または５に記載の根管充填材。
【請求項９】
前記細胞外基質が、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＣＬ、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくともいずれか一つを含む生体親和性材料から構成されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の根管充填材。
【請求項１０】
前記細胞外基質における前記歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下である、請求項１〜９のいずれか1項に記載の根管充填材。
【請求項１１】
抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の根管の根尖側に、請求項１〜１０のいずれかに記載の根管充填材を注入する工程を含む、歯組織再生方法。
【請求項１２】
前記根管充填材を前記根管の根尖側に注入する工程の前に、前記根管を拡大することで根尖部の根管の太さを所定の大きさにする工程をさらに含む、請求項１１に記載の歯組織再生方法。
【請求項１３】
第１の個体の歯の抜髄を行う工程と、
前記歯の歯根部分を所定の長さに切り出す工程と、
抜髄後の根管の一端を封鎖する工程と、
前記根管に、間葉系幹細胞と、細胞外基質とを含んでなる根管充填材を注入する工程と、
充填材を注入した歯根を第２の個体に移植する工程と
を含む歯組織の異所再生方法。
【請求項１】
抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、根管の根尖側に挿入される、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞と、細胞外基質とを含んでなる根管充填材。
【請求項２】
前記間葉系幹細胞が、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞もしくは臍帯血細胞のいずれかである、請求項１に記載の根管充填材。
【請求項３】
前記骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞もしくは臍帯血細胞が、ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、ＣＤ９０陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、ＣＤ３１陰性細胞、ＣＤ４５陰性細胞、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陰性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＦＬＫ−１陽性細胞，ＣＤ１６６陽性細胞あるいはＶＥＧＦＲ２陽性細胞のうち少なくともいずれか一つを含む、請求項１記載の根管充填材。
【請求項４】
前記根管充填材が、細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくともいずれか一つを含む遊走因子をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の歯根管充填材。
【請求項５】
前記歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が根管の根尖側に位置し、前記遊走因子が根管の歯冠側に位置する、請求項４に記載の歯根管充填材。
【請求項６】
前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ１、ＶＥＧＦ、ＧＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ、ＧＭ−ＣＳＦ及び血清のうち少なくともいずれか一つである、請求項４または５に記載の根管充填材。
【請求項７】
前記細胞増殖因子が、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ及び血清のうち少なくともいずれか一つである、請求項４または５に記載の根管充填材。
【請求項８】
前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ３及び血清のうち少なくともいずれか一つである、請求項４または５に記載の根管充填材。
【請求項９】
前記細胞外基質が、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＣＬ、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくともいずれか一つを含む生体親和性材料から構成されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の根管充填材。
【請求項１０】
前記細胞外基質における前記歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下である、請求項１〜９のいずれか1項に記載の根管充填材。
【請求項１１】
抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の根管の根尖側に、請求項１〜１０のいずれかに記載の根管充填材を注入する工程を含む、歯組織再生方法。
【請求項１２】
前記根管充填材を前記根管の根尖側に注入する工程の前に、前記根管を拡大することで根尖部の根管の太さを所定の大きさにする工程をさらに含む、請求項１１に記載の歯組織再生方法。
【請求項１３】
第１の個体の歯の抜髄を行う工程と、
前記歯の歯根部分を所定の長さに切り出す工程と、
抜髄後の根管の一端を封鎖する工程と、
前記根管に、間葉系幹細胞と、細胞外基質とを含んでなる根管充填材を注入する工程と、
充填材を注入した歯根を第２の個体に移植する工程と
を含む歯組織の異所再生方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図９】
【図１３】
【図１５】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１４】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図９】
【図１３】
【図１５】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１４】
【公開番号】特開２０１２−１７９１２３（Ｐ２０１２−１７９１２３Ａ）
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４２８６２（Ｐ２０１１−４２８６２）
【出願日】平成２３年２月２８日（２０１１．２．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 〔発行者名〕 日本再生医療学会 〔刊行物名〕 日本再生医療学会雑誌 再生医療 増刊号 ２０１１ Ｖｏｌ．１０ Ｓｕｐｐｌ 第１０回日本再生医療学会総会プログラム・抄録 〔発行年月日〕 平成２３年２月１日
【出願人】（５１０１０８８５８）独立行政法人国立長寿医療研究センター (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２８日（２０１１．２．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 〔発行者名〕 日本再生医療学会 〔刊行物名〕 日本再生医療学会雑誌 再生医療 増刊号 ２０１１ Ｖｏｌ．１０ Ｓｕｐｐｌ 第１０回日本再生医療学会総会プログラム・抄録 〔発行年月日〕 平成２３年２月１日
【出願人】（５１０１０８８５８）独立行政法人国立長寿医療研究センター (2)
【Ｆターム（参考）】
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