関節リウマチの患者の末梢血白血球におけるＦＣ受容体媒介性腫瘍壊死因子スーパーファミリ及びケモカインのｍＲＮＡ発現の増大
ＴＮＦＳＦ−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１又はＴＮＦＳＦ−１４の発現を変化させることを伴う関節リウマチの治療に対する患者の応答性を予測する方法を開示する。このような治療の有効性をモニタリングする方法も開示する。さらに、関節リウマチの治療に用いる化合物のスクリーニング方法を開示する。関節リウマチ患者の疾患状態を経時的にモニタリングする方法も開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、腫瘍壊死因子スーパーファミリメンバー又はサイトカインを伴う関節リウマチ治療に対する患者の応答性を予測する方法、このような療法の有効性をモニタリングする方法、及び関節リウマチの治療に用いる化合物をスクリーニングする方法に関する。本開示は、関節リウマチの患者の疾患状態をモニタリングする方法にも関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、「関節リウマチ及び膠原病の患者の末梢血白血球におけるＦＣ受容体媒介性ＴＮＦＳＦのｍＲＮＡ発現の増大（ENHANCED FC RECEPTOR-MEDIATED TNFSF MRNA EXPRESSION IN PERIPHERAL BLOOD LEUKOCYTES IN PATIENTS WITH REHEUMATOID ARTHRITIS AND COLLAGEN DISEASES）と題され、２００６年４月７日に提出された米国特許仮出願第６０／７９０，５１１号（その全体が参照により本明細書中に援用され、本明細書の一部となる）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患は、宿主細胞と反応する抗体、又は自己反応性である免疫エフェクタＴ細胞のいずれかの生成を特徴とする。自己抗体は、重症筋無力症における抗アセチルコリン受容体抗体及び全身性エリテマトーデスにおける抗ＤＮＡ抗体のように或る特定の種類の自己免疫疾患で頻繁に同定される。しかし、このような自己抗体は、多くの種類の自己免疫疾患では見られない。さらに、自己抗体は健常な個体では検出されることが多いが、このような抗体は自己免疫疾患を誘導しない。したがって、自己抗体の他に、未だに同定されていないさらなる機構が自己免疫疾患の病因に明らかに関与している。
【０００４】
自己抗体が標的となる宿主細胞と結合すると、補体カスケードが活性化し、標的となる細胞膜上にＣ５〜９膜攻撃複合体（membrane attack complex）を形成し、これが宿主細胞の破壊に繋がると考えられる（Esser, Toxicology 87, 229（1994）を参照されたい）。副生成物である、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、又はＣ５ａ等の走化性因子は、より多くの白血球を病巣へと補充する（Hugli, Crit. Rev. Immunol. 1, 321（1981）を参照されたい）。病巣に補充された白血球又は自然状態で存在する白血球は、Ｆｃ受容体（「ＦｃＲ」）を介した抗体結合細胞（免疫複合体）を認識する。ＦｃＲが免疫複合体と架橋すると、白血球は、宿主細胞の表面上に存在する特異的な受容体と結合し、アポトーシス又は細胞損傷を誘導する（Micheau et al., Cell 114, 181（2003）を参照されたい）ＴＮＦ−αを放出する（Debets et al., J Immunol. 141, 1197（1988）を参照されたい）。活性化ＦｃＲによって、走化性サイトカインの放出も始まり、様々なサブセットの白血球を病巣に補充する（Chantry et al., Eur. J. Immunol. 19, 189（1989）を参照されたい）。以上が、ＦｃＲ関連自己免疫疾患の分子機構の全般的な仮説である。
【０００５】
関節リウマチ（「ＲＡ」）は、胃腸管の炎症を伴う免疫疾患である。臨床的には十分に特徴付けられているが、その病因は余り理解されていない。ＲＡは、通常、末梢関節に対称的に分布して生じる慢性的炎症性滑膜炎を特徴とする。このことによって、軟骨破壊、骨侵食及び関節の完全性の変化が引き起こされ得る。ＲＡの病因は未だに知られていないが、滑膜におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の優勢、ＲＡ患者の血液及び血清における可溶性ＩＬ−２受容体（活性化Ｔ細胞によって産生される）の増大、並びにＴ細胞除去による疾患の顕著な改善のために、ＣＤ４＋Ｔ細胞がこの疾患に関与する疑いが強い。治療は、鎮痛、炎症の低減、関節構造の保護、機能維持及び全身症候の制御に焦点を当てている。選択肢としては、アスピリン及び他の非ステロイド系抗炎症薬、メトトレキサート、金化合物、Ｄ
−ペニシラミン、抗マラリア薬、及びスルファサラジン等の抗リウマチ薬、グルココルチコイド、インフリキシマブ及びエタネルセプト等のＴＮＦ−α中和剤、並びにアザチオプリン、レフルノミド、シクロスポリン及びシクロホスファミド等の免疫抑制薬が挙げられる。療法の選択肢の選択がＲＡ患者の疾患状態の評価に依存しているので、疾患状態を評価し、疾患の進行をモニタリングする新規の方法を開発することが望まれる。
【０００６】
ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤＦ２５４、及びＲＡＮＫリガンドとしても知られている）は、活性化Ｔ細胞によって発現された場合に抗原提示樹状細胞の生存を高め、骨芽細胞によって発現及び分泌された場合に細胞表面受容体ＴＮＦＲＳＦ１１（ＲＡＮＫとしても知られている）を介した破骨細胞の分化及び活性化を促進する、最近記載された腫瘍壊死因子スーパーファミリのメンバーである。破骨細胞は活性化すると骨吸収に関与し、何人かのＲＡ患者で観察された骨侵食に一部関与し得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施の形態において、関節リウマチのヒトが療法に反応する可能性があるか否かを判定する方法であって、ヒト由来の白血球を含む第１のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、刺激後、第１のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、ヒト由来の白血球を含む第２のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、第２のサンプルにおいてｍＲＮＡの量を測定すること、並びに第１のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との比を求めることを含み、この比が約１．５：１以上である場合にこのヒトが療法に反応する可能性があると判定する方法が提供される。
【０００８】
さらなる態様において、第１のサンプルにおいて白血球を刺激することは、熱凝集ヒトＩｇＧを第１のサンプルと混合することを含む。
【０００９】
さらなる態様において、第１のサンプルにおいて白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を第１のサンプルと混合することを含む。
【００１０】
さらなる態様において、第１のサンプル及び第２のサンプルの少なくとも１つは全血を含む。
【００１１】
別の態様において、対照の刺激物質はリン酸緩衝生理食塩水である。
【００１２】
さらなる態様において、療法はシクロスポリンＡ及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む。
【００１３】
一実施の形態において、関節リウマチ療法の有効性を評価する方法であって、ヒト由来の白血球を含む第１のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、ヒト由来の白血球を含む第２のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第１のサンプル及び第２のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、第１のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との第１の比
を算出すること、療法をヒトで行うこと、療法の実施後に得られるヒト由来の白血球を含む第３のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、療法の実施後に得られるヒト由来の白血球を含む第４のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第３のサンプル及び第４のサンプルにおいて、ｍＲＮＡのレベルを測定すること、第３のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第４のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との第２の比を算出すること、並びに第１の比と第２の比とを比較することを含み、これらの比の有意な差が効果的な療法の指標となる、関節リウマチ療法の有効性を評価する方法が提供される。
【００１４】
さらなる態様において、第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することは、熱凝集ヒトＩｇＧをサンプルと混合させることを包含する。
【００１５】
さらなる態様において、第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質をサンプルと混合させることを包含する。
【００１６】
さらなる態様において、対照の刺激物質はリン酸緩衝生理食塩水である。
【００１７】
さらなる態様において、第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルの少なくとも１つが全血からなる。
【００１８】
さらなる態様において、これらの比の有意な差は、第１の比が第２の比よりも大きいことである。
【００１９】
さらなる態様において、療法がシクロスポリンＡ及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む。
【００２０】
一実施の形態において、関節リウマチを治療すると推定される作用物質を同定する方法であって、熱凝集ヒトＩｇＧに曝される場合、白血球が、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの転写において少なくとも１．５の倍数増加を示すヒト由来の白血球を含む第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルを得ること、第１のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、第２のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第１のサンプル及び第２のサンプルにおいて、ｍＲＮＡの量を測定すること、第１のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との第１の比を算出すること、第３のサンプル及び第４のサンプルを作用物質に曝すこと、曝露後、第３のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、曝露後、第４のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第３のサンプル及び第４のサンプルにおいて、ｍＲＮＡのレベルを測定すること、第３のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第４のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との第２の比を算出すること、並びに第１の比と第２の比とを比較することを含み、これらの比の有意な差が推定の作用物質の指標となる、関節リウマチを治療すると推定される作用物質を同定する方法が提供される。
【００２１】
さらなる態様において、第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することは、熱凝集ヒトＩｇＧをサンプルと混合させることを包含する。
【００２２】
さらなる態様において、第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質をサンプルと混合させることを包含する。
【００２３】
さらなる態様において、対照の刺激物質はリン酸緩衝生理食塩水である。
【００２４】
さらなる態様において、第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルの少なくとも１つが全血を包含する。
【００２５】
さらなる態様において、これらの比の有意な差は、第１の比が第２の比よりも大きいことである。
【００２６】
一実施の形態において、ヒトにおいて関節リウマチの状態を評価する方法であって、白血球を含み、ヒトから１回目に得られる第１のサンプルにおいて白血球をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すること、刺激後、第１のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、１回目にヒトから得られる白血球を含む第２のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第２のサンプルにおいてｍＲＮＡの量を測定すること、第１のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との第１の比を求めること、白血球を含み、１回目に続く２回目でヒトから得られる第３のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、刺激後、第３のサンプルにおいてｍＲＮＡの量を測定すること、２回目でヒトから得られる白血球を含む第４のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第４のサンプルにおいてｍＲＮＡの量を測定すること、第３のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第４のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との第２の比を求めること、並びに第１の比と第２の比とを比較することを含み、第１の比と第２の比との有意な差が疾患状態の変化の指標となる、ヒトにおいて関節リウマチの状態を評価する方法が提供される。
【００２７】
さらなる態様において、第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することは、ヒト熱凝集ＩｇＧをサンプルと混合させることを包含する。
【００２８】
さらなる態様において、第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質をサンプルと混合させることを包含する。
【００２９】
さらなる態様において、対照の刺激物質はリン酸緩衝生理食塩水である。
【００３０】
さらなる態様において、第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルの少なくとも１つが全血から成る。
【００３１】
さらなる態様において、これらの比の有意な差は、第２の比が第１の比よりも大きく、疾患状態の変化が疾患の進行である。
【００３２】
さらなる態様において、これらの比の有意な差は、第１の比が第２の比よりも大きく、疾患状態の変化が疾患の回復である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本開示は、ＲＡ患者が特異的療法に良好な候補者であるか否かを判定する際の特異的な細胞刺激物質に応じた白血球における差次的なｍＲＮＡ転写パターンの使用に関する。本開示は、ＲＡ患者に実施する療法が有効であるか否かを判定する際のこのような差次的な転写パターンの使用にも関する。本開示は、ＲＡの治療に用いる候補物質をスクリーニングする際のこのような差次的な転写パターンの使用にも関する。本開示は、経時的に患者におけるＲＡの状態を評価し、疾患の進行をモニタリングする際のこのような差次的な転写パターンの使用にも関する。
【００３４】
上記のように、ＲＡの病因は、ＲＡ患者の免疫細胞におけるＦｃＲの機能化に関連し得る。疾患におけるＦｃＲの潜在的な役割をさらに評価するために、自己免疫疾患の患者の病的部位へと遊走する前の末梢血の循環白血球におけるＦｃＲの機能が正常であるか、又はこの遊走の前に既に高められているかを判定することが有用である。Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）の機能が関節リウマチ（ＲＡ）の患者の末梢血の白血球において正常であるか、又は高められたかを分析するために、熱凝集ヒトＩｇＧ（ＨＡＧ）をヘパリン化全血に直接添加し、腫瘍壊死因子スーパーファミリ（ＴＮＦＳＦ）の様々なメンバーのｍＲＮＡレベルの変化を評価した。ＩｇＧに対して複数のＦｃＲ（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＵｎｉＧｅｎｅデータベース）が存在するが、ＨＡＧは全てのＦｃＲサブタイプと反応することができる普遍の刺激物質として作用する。ＨＡＧを有する刺激物質によって生じる、ＴＮＦスーパーファミリ（ＴＮＦＳＦ）のｍＲＮＡ（例えばＧｅｎｅＢａｎｋ ＵｎｉＧｅｎｅデータベースを参照されたい）のメンバーのｍＲＮＡレベルの変化を定量化した。
【００３５】
利用した方法は以下のようなものであった。様々なＴＮＦＳＦ遺伝子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋのＵｎｉＧｅｎｅデータベースから検索した。それぞれの遺伝子のＰＣＲプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Applied Biosystem, Foster City, CA）及びＨＹＢｓｉｍｕｌａｔｏｒ（RNAture, Irvine, CA）によって設計された（Mitsuhashi et al., Nature 367:759（1994）、及びHyndman et al., BioTechniques, 20:1090（1996）を参照されたい）。この配列は以下の表１で要約される。オリゴヌクレオチドはIDT（Coralville, IA）で合成された。
【００３６】
【表１−１】
【表１−２】
【００３７】
熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）は、ＰＢＳ中で６３℃で１５分間、２０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（Sigma, St. Louis）を加熱することによって調製した（Ostreiko et al., Immunol Lett. 15, 311（1987）を参照されたい）。８ウェルストリップマイクロチューブに、１．２μｌのＨＡＧ又は対照（リン酸緩衝生理食塩水）（BioLegend, San Diego）を添加し、使用まで−２０℃で保存した。新鮮ヘパリン化全血６０μｌをそれぞれのウェルに三重で添加し、蓋をして３７℃で２〜８時間インキュベートした。それぞれの処理後、以下に記載されるように全血５０μｌをフィルタプレートに移した。それぞれの血液サンプルを使用まで−８０℃で凍結保存した。
【００３８】
ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡは、Mitsuhashi et al., Clin. Chem. 52:4（doi: 10.1373/clinchem.2005.048983で公開された）に記載された方法に従って全血から調製した。米国特許出願第１０／７９６，２９８号（参照より本明細書中に援用される）で開示された方法を利用してもよい。要するに、９６ウェルフィルタプレートを回収プレート上に置き、５ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）１５０μｌを加えた。４℃で１分間、１２０×ｇで遠心分離した後、血液サンプル５０μｌをそれぞれのウェルに加え、すぐに４℃で２分間、１２０×ｇで遠心分離した後、４℃で５分間、２０００×ｇで遠心分離しながらＰＢＳ ３００μｌで１回、それぞれのウェルを洗浄した。それから、１％の２−メルカプトエタノール（Bio Rad, Hercules, CA, USA）、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Pierce, Rockford, IL, USA）、０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（5 Prime Eppendorf/Brinkmann, Westbury, NY, USA）、０．１ｍｇ／ｍｌの大腸菌ｔＲＮＡ（Sigma）、それぞれ１０ｍＭの特異的なリバースプライマーと、標準的なＲＮＡ３４オリゴヌクレオチドとのカクテルを添加した、ストック溶解緩衝液６０μｌをフィルタプレートに加えた後、３７℃で１０分間インキュベートした。それから、フィルタプレートをオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、RNAture）上に置き（Mitsuhashi et al., Nature 357:519（1992）、及びHamaguchi et al., Clin. Chem. 44, 2256（1998）（両方とも参照により本明細書中に援用される）を参照されたい）、４℃で５分間、２０００×ｇで遠心分離した。４℃で一晩保存した後、４℃でマイクロプレートをプレーン溶解緩衝液１００μｌで３回、その後洗浄緩衝液（０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ）１５０μｌで３回洗浄した。１×ＲＴ緩衝液、それぞれ１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、４単位のｒＲＮａｓｉｎ、及び８０単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（Promega）（プライマーなし）を含有する緩衝液３０μｌを添加し、３７℃で２時間、インキュベートすることによって、それぞれのウェルでｃＤＮＡを直接合成した。特異的なプライマーでプライミングした（primer-primed）ｃＤＮＡが溶液中に存在し、オリゴ（ｄＴ）でプライミングしたｃＤＮＡはマイクロプレートに固定されたままであった（Hugli, Crit. Rev. Immunol. 1, 321（1981）を参照されたい）。ＳＹＢＲグリーンＰＣＲ（Morrison et al., Biotechniques 24, 954（1998）（参照により本明細書中に援用される））のために、ｃＤＮＡを水で４倍に希釈し、ｃＤＮＡ溶液４μｌを３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、これにｉＴａｑ ＳＹＢＲマスターミックス（BioRad, Hercules, CA）５μｌ及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー）１μｌを加え、９５℃で１０分間を１サイクル、その後９５℃で３０秒間及び６０℃で１分間を４５サイクルのＰＣＲをＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ（ABI）において行った。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲも利用することができ、このような場合、ｃＤＮＡ溶液を３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、これにＴａｑＭａｎ汎用マスターミックス（ABI）５μｌ及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに３〜６μＭのＴａｑＭａｎプローブ）１μｌを加え、９５℃で１０分間を１サイクル、その後９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び６０〜６５℃で１分間を４５サイクルのＰＣＲをＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ（ABI）において行った。
【００３９】
１×ＲＴ緩衝液を陰性対照として用い、プライマーダイマーがＳＹＢＲグリーンＰＣＲ条件下で生成しなかったことを確認した。Ｃｔは、解析用ソフトウェア（ＳＤＳ, ABI）によって求められた。ΔＣｔは、適切な対照サンプルのＣｔ値を差し引くことによって算出され、倍数増加は、それぞれのＰＣＲサイクルの有効性を１００％と仮定することによって、２＾（−ΔＣｔ）と算出された。
【００４０】
図１は、末梢全血のヒト白血球におけるＴＮＦＳＦのｍＲＮＡのＦｃＲ媒介性の遺伝子発現の分析結果を示す。ＲＡ患者で示される結果は、ＨＡＧ刺激に応じて１．５倍を超える倍数増加を示す被験者と定義された、「応答」被験者の割合として表される。
【００４１】
ＲＡ患者及び健常な対照被験者に対する個々の結果は、対照値を超える倍数増加として図２で表される。各データ（健常な成人では○、及びＲＡ患者では●）は、三重の一定分量の全血の平均であった。図１で示される統計的有意性（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）は、上記のように応答者及び非応答者の集団を用いたχ2検定によって算出された。ＨＡＧで刺激し、サイクル閾値（Ｃｔ）（以下を参照されたい）に対して発現された健常個体の全血を用いて得られたさらなるデータは図１１に示される。
【００４２】
図１及び図２で示されるように、ＨＡＧが主にＴＮＦＳＦ−３、４、７、８、１１、１４、１５及び１８のｍＲＮＡを誘導した。ＨＡＧ誘導性のＴＮＦＳＦ−３、４、７及び１４に対する応答者集団（１．５を超える倍数増加）が、健常な対照よりもＲＡ患者において有意に大きく、ＨＡＧ誘導性のＴＮＦＳＦ−１１に対する応答者集団は対照よりもＨＡＧにおいて大きかったが、この場合では統計的有意性は確立することができなかった。これらのデータによって、ＴＮＦＳＦ−３、４、７、１１及び１４に対して白血球の機能亢進が付随した末梢血白血球におけるＨｃＲ機能の障害が示唆されている。このシステムは、下記のように、ＲＡにおける免疫細胞の細胞傷害機能の分析に有用である。
【００４３】
用量応答及び動力学的研究が図３で示される。図３は、末梢血白血球におけるＴＮＦＳＦのｍＲＮＡ発現に対する熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）の効果を示す。図３Ａは反応速度を示す。三重の一定分量のヘパリン化全血６０μｌをそれぞれＰＢＳ（○、△）、又は２００μｇ／ｍＬのＨＡＧ（●、▲）と混合し、３７℃で０〜１２時間インキュベートした。それから、ＴＮＦＳＦ−１５（○、●）及びＩＬ−８（△、▲）のｍＲＮＡを上記のように定量した。対照として時間が０での値を用いて倍数増加を算出した。図３Ｂは用量応答を示す。三重の一定分量のヘパリン化全血６０μｌをそれぞれ様々な濃度のＨＡＧと混合し、３７℃で２時間インキュベートした。それから、ＴＮＦＳＦ−２（●）、ＴＮＦＳＦ−１５（▲）、ＩＬ−８（○）、ＩＬ−１Ｂ（◇）、及びＣＸＣＬ−２（△）のｍＲＮＡを上記のように定量した。対照として溶媒（ＰＢＳ）に対する値を用いて倍数増加を算出した。それぞれのデータ点は、三重の一定分量の全血の平均±標準偏差（Ａ）又は平均（Ｂ）であった。外部対照ＲＮＡ３４は全ての場合で変化せず、このことによってアッセイが適切に行われたことが示唆された。
【００４４】
上記のＨＡＧの他に、他の刺激物質、例えばホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（Ｃｏｎ−Ａ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＡ、熱凝集ＩｇＥ、及び熱凝集ＩｇＭも、図４〜図１０及び図１２〜図１４で示されるように、健常な個体から採取された全血において様々なサブタイプのＴＮＦＳＦ及びケモカインを誘導する。これらのアッセイで進められたプロトコルは、それぞれの場合で利用された刺激物質が異なることを除いて上記で与えられたものと同じであった。図４〜図１４では、データは、或る特定量のＰＣＲ産物を生成するのに必要とされるＰＣＲのサイクル数であるサイクル閾値（Ｃｔ）に関して表される。刺激したサンプルのＣｔ値から刺激していないサンプルのＣｔ値を差し引くことによって、ΔＣｔ値を得た。Ｃｔは対数スケールで
あるので、１ΔＣｔ単位は、量が２倍変化することを示す。発現レベルが高くなると、標準量の産物を生成するのに必要とされるＰＣＲのサイクル数が減少するので、負のΔＣｔ値は発現の増大を示す。
【００４５】
これらの刺激物質の幾つかがＨＡＧのものと同様の刺激パターンを示す。特に、図４及び図５で示されるように、ＰＭＡ及びＰＨＡは、ＲＡ患者においてＨＡＧによっても刺激されるＴＮＦＳＦ−１４を刺激する。これらの刺激物質は、ＲＡ患者に対する療法の選択肢を評価し、ＲＡを治療する新規の薬剤をスクリーニングするのにも有用である。
【００４６】
免疫系の活性によって生じる実際の細胞死（ＲＡで起こると考えられるようなもの）を研究するのに、細胞傷害アッセイが一般的に用いられている。一般的に、51Ｃｒ充填した標的細胞をエフェクタ細胞と様々な比でインキュベートし、死細胞又は損傷細胞から放出された51Ｃｒ放射活性の量を定量することによって、細胞傷害アッセイが行われる（Dunkley et al., J Immunol Methods 6, 39（1974）を参照されたい）。幾つかの場合、放射性物質を非放射性物質、例えば蛍光物質に置き換えているが（Kruger-Krasagakes et al., J Immunol Methods 156, 1（1992）を参照されたい）、基本原理は変わらない。このように、細胞傷害アッセイの結果は実際の細胞死を反映する。
【００４７】
しかし、非生理的な実験条件下で細胞傷害アッセイを行い、複雑な細胞間相互作用及び細胞−血漿間相互作用をこのような研究の中で評価するのは難しい。さらに、細胞傷害アッセイは、どのＴＮＦＳＦメンバーが細胞死に関与するかを示していない。エフェクタ細胞が標的細胞を認識すると、単一のエフェクタ細胞では多くの標的細胞を破壊するのに十分ではないので、エフェクタ細胞は標的細胞を破壊するだけでなく、他のエフェクタ細胞を補充するようにも機能する。この補充機能は、走化性因子の放出によって表されると考えられる。エフェクタ細胞によって放出されるこのような走化性因子の同一性は、従来の細胞傷害アッセイでは示されない。しかし、本開示に記載のアッセイシステムによって、エフェクタ細胞において多くの種類の遺伝子発現を同時に同定することができる。
【００４８】
関与するＴＮＦＳＦサブタイプの同定は、これらの分子が標的細胞又は白血球上の特異的な受容体と反応するので非常に重要である。例えば、ＵｎｉＧｅｎｅの発現配列タグ（ＥＳＴ）プロファイルデータベースによれば、ＴＮＦＳＦ−１１に対する受容体（ＴＮＦＲＳＦ１１、ＲＡＮＫとしても知られる）は破骨細胞に存在し、この経路の刺激によって骨吸収が引き起こされる。したがって、ＲＡ患者におけるＴＮＦＳＦ−１１活性の増大（図１、図２）はＲＡの主な影響である骨侵食に関連し得る。
【００４９】
全血の使用が培養培地において単離白血球を使用することよりも好ましく、これは前者が後者よりも生理学的であり、白血球の全集団をスクリーニングすることができるためである。全血のより長期的なインキュベートによって、さらなる人工産物を生成することができる。したがって、理想的な方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏからｅｘ ｖｉｖｏに切り替えることによって、短期間のインキュベート中に全血における初期の致死シグナル及び補充シグナルを同定することである。ｍＲＮＡの転写は、タンパク質合成又は最終的な生物学的転帰のいずれよりも早い事象である。したがって、ｍＲＮＡは標的にふさわしい。
【００５０】
本開示は、初めて末梢血の循環白血球におけるＦｃＲ由来のＴＮＦＳＦ−１１誘導性の基礎機能亢進を示唆している。本方法は、腸組織ではなく全血を用いるので、ＴＮＦＳＦ不活性化療法に対して見込まれる応答性を評価するため、及び治療反応をモニタリングするためのＲＡに対する診断試験として用いることができる。具体的には、ＲＡのヒトがＴ細胞刺激に応じて転写されたｍＲＮＡを標的とする療法に対して反応する可能性があるか否かを判定する方法の好ましい実施形態では、ＲＡ患者から全血を得て、上記のように、血液サンプルにＨＡＧ刺激、及び任意で対照刺激（ＰＢＳ）を与える。上記のようにサン
プルでＴＮＦＳＦ−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１又はＴＮＦＳＦ−１４のｍＲＮＡのｍＲＮＡレベルの量を測定することができる。ＨＡＧで刺激後に１つ又は複数のこれらのｍＲＮＡのレベルが有意に上昇したＲＡ患者（例えば、１．５を超える倍数変化によって示されるように）は、これらのｍＲＮＡを標的とする療法に良好な候補者である。
【００５１】
さらに、患者においてＴＮＦＳＦ−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１又はＴＮＦＳＦ−１４のｍＲＮＡの１つ又は複数を標的とするＲＡ治療の有効性を評価する方法の好ましい実施形態において、ＨＡＧ刺激後の全血におけるｍＲＮＡの量と、対照刺激後の量との第１の比を治療の開始前に得る。ＨＡＧ抗体刺激後の全血におけるｍＲＮＡの量と、対照刺激後の量との第２の比を治療の開始後に得る。これらの比の有意差（第１の比が第２の比より大きいような場合）が療法の有効性を示し得る。例えば、このような療法には、シクロスポリンＡ又はタクロリムスの投与が含まれ得る。
【００５２】
重要なことに、このｅｘ ｖｉｖｏ方法は、破骨細胞の活性化に関与することが知られている１つ又は複数のＴＮＦＳＦ−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１又はＴＮＦＳＦ−１４、及び特にＴＮＦＳＦ−１１の抗ＦｃＲ媒介性のｍＲＮＡ発現を阻害する化合物のスクリーニングにも用いることができる。これらの新規の薬剤候補が転写レベルで白血球のｍＲＮＡ生成を阻害するので、このような化合物は興味深い薬剤標的である。このことがＲＡに対する薬剤開発の新たな戦略を与える。
【００５３】
開示のシステムを用いて薬剤化合物をスクリーニングし、それによってＲＡを治療すると推定される作用物質を同定する方法の実施形態において、ＨＡＧ等のＴ細胞刺激に曝された場合、白血球が、ＲＡ関連ｍＲＮＡレベルにおいて少なくとも１．５の倍数増加を示すという点で応答者であるＲＡ患者から全血を得る。ＨＡＧ刺激後の被験者の全血におけるｍＲＮＡの量と、対照刺激後の量との第１の比を算出する。さらに、被験者からの全血サンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏで薬剤化合物に曝した後、上記のように差次的に刺激する。それから、ＨＡＧ刺激後の全血におけるｍＲＮＡの量と、これらの曝露サンプルの対照刺激後の量との第２の比を算出する。２つの比の有意差（第１の比が第２の比より大きいような場合）によって、薬剤化合物がＲＡに対する潜在的な治療法として、さらなる研究候補であることが示され得る。
【００５４】
さらに、患者から得られた白血球を含むサンプルにおいて、ＴＮＦＳＦ−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１又はＴＮＦＳＦ−１４の１つ又は複数のｍＲＮＡレベルを測定することによってＲＡ患者の疾患状態をモニタリングする方法の好ましい実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで熱凝集ＩｇＧ抗体又は他の刺激物質を用いたＴ細胞刺激後の全血におけるｍＲＮＡの量と、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの対照刺激後の量との第１の比を１回目に得る。１回目に続く２回目で、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞刺激後の全血におけるｍＲＮＡの量と、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの対照刺激後の量との第２の比を得る。これらの比の有意差は疾患状態の変化を示し得る。例えば、第２の比が第１の比より大きい場合、このことが疾患の進行を示し得る一方で、第１の比の方が大きいことが疾患の退行を示し得る。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】関節リウマチ患者群及び対照群における、末梢全血中のヒト白血球中の様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡによるＦｃＲ媒介性遺伝子発現の定量結果を示す図である。
【図２】関節リウマチ患者群及び対照患者群の全血において熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）刺激によって誘導された様々なＴＮＦＳＦのｍＲＮＡレベルの倍数増加を示す図である。
【図３】末梢血の白血球におけるＴＮＦＳＦ及びケモカインのｍＲＮＡ発現に対するＨＡＧの効果を示す図である。
【図４】ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図５】フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図６】コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図７】コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図８】リポ多糖（ＬＰＳ）による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図９】ジャカリンによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１０】フコイダンによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１１Ａ】熱凝集ＩｇＧによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１１Ｂ】熱凝集ＩｇＧによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１１Ｃ】熱凝集ＩｇＧによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１１Ｄ】熱凝集ＩｇＧによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１２Ａ】熱凝集ＩｇＡによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１２Ｂ】熱凝集ＩｇＡによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１２Ｃ】熱凝集ＩｇＡによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１３Ａ】熱凝集ＩｇＭによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１３Ｂ】熱凝集ＩｇＭによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１３Ｃ】熱凝集ＩｇＭによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１４Ａ】熱凝集ＩｇＥによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１４Ｂ】熱凝集ＩｇＥによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１４Ｃ】熱凝集ＩｇＥによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本開示は、腫瘍壊死因子スーパーファミリメンバー又はサイトカインを伴う関節リウマチ治療に対する患者の応答性を予測する方法、このような療法の有効性をモニタリングする方法、及び関節リウマチの治療に用いる化合物をスクリーニングする方法に関する。本開示は、関節リウマチの患者の疾患状態をモニタリングする方法にも関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、「関節リウマチ及び膠原病の患者の末梢血白血球におけるＦＣ受容体媒介性ＴＮＦＳＦのｍＲＮＡ発現の増大（ENHANCED FC RECEPTOR-MEDIATED TNFSF MRNA EXPRESSION IN PERIPHERAL BLOOD LEUKOCYTES IN PATIENTS WITH REHEUMATOID ARTHRITIS AND COLLAGEN DISEASES）と題され、２００６年４月７日に提出された米国特許仮出願第６０／７９０，５１１号（その全体が参照により本明細書中に援用され、本明細書の一部となる）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患は、宿主細胞と反応する抗体、又は自己反応性である免疫エフェクタＴ細胞のいずれかの生成を特徴とする。自己抗体は、重症筋無力症における抗アセチルコリン受容体抗体及び全身性エリテマトーデスにおける抗ＤＮＡ抗体のように或る特定の種類の自己免疫疾患で頻繁に同定される。しかし、このような自己抗体は、多くの種類の自己免疫疾患では見られない。さらに、自己抗体は健常な個体では検出されることが多いが、このような抗体は自己免疫疾患を誘導しない。したがって、自己抗体の他に、未だに同定されていないさらなる機構が自己免疫疾患の病因に明らかに関与している。
【０００４】
自己抗体が標的となる宿主細胞と結合すると、補体カスケードが活性化し、標的となる細胞膜上にＣ５〜９膜攻撃複合体（membrane attack complex）を形成し、これが宿主細胞の破壊に繋がると考えられる（Esser, Toxicology 87, 229（1994）を参照されたい）。副生成物である、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、又はＣ５ａ等の走化性因子は、より多くの白血球を病巣へと補充する（Hugli, Crit. Rev. Immunol. 1, 321（1981）を参照されたい）。病巣に補充された白血球又は自然状態で存在する白血球は、Ｆｃ受容体（「ＦｃＲ」）を介した抗体結合細胞（免疫複合体）を認識する。ＦｃＲが免疫複合体と架橋すると、白血球は、宿主細胞の表面上に存在する特異的な受容体と結合し、アポトーシス又は細胞損傷を誘導する（Micheau et al., Cell 114, 181（2003）を参照されたい）ＴＮＦ−αを放出する（Debets et al., J Immunol. 141, 1197（1988）を参照されたい）。活性化ＦｃＲによって、走化性サイトカインの放出も始まり、様々なサブセットの白血球を病巣に補充する（Chantry et al., Eur. J. Immunol. 19, 189（1989）を参照されたい）。以上が、ＦｃＲ関連自己免疫疾患の分子機構の全般的な仮説である。
【０００５】
関節リウマチ（「ＲＡ」）は、胃腸管の炎症を伴う免疫疾患である。臨床的には十分に特徴付けられているが、その病因は余り理解されていない。ＲＡは、通常、末梢関節に対称的に分布して生じる慢性的炎症性滑膜炎を特徴とする。このことによって、軟骨破壊、骨侵食及び関節の完全性の変化が引き起こされ得る。ＲＡの病因は未だに知られていないが、滑膜におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の優勢、ＲＡ患者の血液及び血清における可溶性ＩＬ−２受容体（活性化Ｔ細胞によって産生される）の増大、並びにＴ細胞除去による疾患の顕著な改善のために、ＣＤ４＋Ｔ細胞がこの疾患に関与する疑いが強い。治療は、鎮痛、炎症の低減、関節構造の保護、機能維持及び全身症候の制御に焦点を当てている。選択肢としては、アスピリン及び他の非ステロイド系抗炎症薬、メトトレキサート、金化合物、Ｄ
−ペニシラミン、抗マラリア薬、及びスルファサラジン等の抗リウマチ薬、グルココルチコイド、インフリキシマブ及びエタネルセプト等のＴＮＦ−α中和剤、並びにアザチオプリン、レフルノミド、シクロスポリン及びシクロホスファミド等の免疫抑制薬が挙げられる。療法の選択肢の選択がＲＡ患者の疾患状態の評価に依存しているので、疾患状態を評価し、疾患の進行をモニタリングする新規の方法を開発することが望まれる。
【０００６】
ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤＦ２５４、及びＲＡＮＫリガンドとしても知られている）は、活性化Ｔ細胞によって発現された場合に抗原提示樹状細胞の生存を高め、骨芽細胞によって発現及び分泌された場合に細胞表面受容体ＴＮＦＲＳＦ１１（ＲＡＮＫとしても知られている）を介した破骨細胞の分化及び活性化を促進する、最近記載された腫瘍壊死因子スーパーファミリのメンバーである。破骨細胞は活性化すると骨吸収に関与し、何人かのＲＡ患者で観察された骨侵食に一部関与し得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施の形態において、関節リウマチのヒトが療法に反応する可能性があるか否かを判定する方法であって、ヒト由来の白血球を含む第１のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、刺激後、第１のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、ヒト由来の白血球を含む第２のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、第２のサンプルにおいてｍＲＮＡの量を測定すること、並びに第１のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との比を求めることを含み、この比が約１．５：１以上である場合にこのヒトが療法に反応する可能性があると判定する方法が提供される。
【０００８】
さらなる態様において、第１のサンプルにおいて白血球を刺激することは、熱凝集ヒトＩｇＧを第１のサンプルと混合することを含む。
【０００９】
さらなる態様において、第１のサンプルにおいて白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を第１のサンプルと混合することを含む。
【００１０】
さらなる態様において、第１のサンプル及び第２のサンプルの少なくとも１つは全血を含む。
【００１１】
別の態様において、対照の刺激物質はリン酸緩衝生理食塩水である。
【００１２】
さらなる態様において、療法はシクロスポリンＡ及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む。
【００１３】
一実施の形態において、関節リウマチ療法の有効性を評価する方法であって、ヒト由来の白血球を含む第１のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、ヒト由来の白血球を含む第２のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第１のサンプル及び第２のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、第１のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との第１の比
を算出すること、療法をヒトで行うこと、療法の実施後に得られるヒト由来の白血球を含む第３のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、療法の実施後に得られるヒト由来の白血球を含む第４のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第３のサンプル及び第４のサンプルにおいて、ｍＲＮＡのレベルを測定すること、第３のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第４のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との第２の比を算出すること、並びに第１の比と第２の比とを比較することを含み、これらの比の有意な差が効果的な療法の指標となる、関節リウマチ療法の有効性を評価する方法が提供される。
【００１４】
さらなる態様において、第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することは、熱凝集ヒトＩｇＧをサンプルと混合させることを包含する。
【００１５】
さらなる態様において、第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質をサンプルと混合させることを包含する。
【００１６】
さらなる態様において、対照の刺激物質はリン酸緩衝生理食塩水である。
【００１７】
さらなる態様において、第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルの少なくとも１つが全血からなる。
【００１８】
さらなる態様において、これらの比の有意な差は、第１の比が第２の比よりも大きいことである。
【００１９】
さらなる態様において、療法がシクロスポリンＡ及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む。
【００２０】
一実施の形態において、関節リウマチを治療すると推定される作用物質を同定する方法であって、熱凝集ヒトＩｇＧに曝される場合、白血球が、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの転写において少なくとも１．５の倍数増加を示すヒト由来の白血球を含む第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルを得ること、第１のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、第２のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第１のサンプル及び第２のサンプルにおいて、ｍＲＮＡの量を測定すること、第１のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との第１の比を算出すること、第３のサンプル及び第４のサンプルを作用物質に曝すこと、曝露後、第３のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、曝露後、第４のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第３のサンプル及び第４のサンプルにおいて、ｍＲＮＡのレベルを測定すること、第３のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第４のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との第２の比を算出すること、並びに第１の比と第２の比とを比較することを含み、これらの比の有意な差が推定の作用物質の指標となる、関節リウマチを治療すると推定される作用物質を同定する方法が提供される。
【００２１】
さらなる態様において、第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することは、熱凝集ヒトＩｇＧをサンプルと混合させることを包含する。
【００２２】
さらなる態様において、第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質をサンプルと混合させることを包含する。
【００２３】
さらなる態様において、対照の刺激物質はリン酸緩衝生理食塩水である。
【００２４】
さらなる態様において、第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルの少なくとも１つが全血を包含する。
【００２５】
さらなる態様において、これらの比の有意な差は、第１の比が第２の比よりも大きいことである。
【００２６】
一実施の形態において、ヒトにおいて関節リウマチの状態を評価する方法であって、白血球を含み、ヒトから１回目に得られる第１のサンプルにおいて白血球をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すること、刺激後、第１のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、１回目にヒトから得られる白血球を含む第２のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第２のサンプルにおいてｍＲＮＡの量を測定すること、第１のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との第１の比を求めること、白血球を含み、１回目に続く２回目でヒトから得られる第３のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、刺激後、第３のサンプルにおいてｍＲＮＡの量を測定すること、２回目でヒトから得られる白血球を含む第４のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、刺激後、第４のサンプルにおいてｍＲＮＡの量を測定すること、第３のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第４のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との第２の比を求めること、並びに第１の比と第２の比とを比較することを含み、第１の比と第２の比との有意な差が疾患状態の変化の指標となる、ヒトにおいて関節リウマチの状態を評価する方法が提供される。
【００２７】
さらなる態様において、第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することは、ヒト熱凝集ＩｇＧをサンプルと混合させることを包含する。
【００２８】
さらなる態様において、第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質をサンプルと混合させることを包含する。
【００２９】
さらなる態様において、対照の刺激物質はリン酸緩衝生理食塩水である。
【００３０】
さらなる態様において、第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルの少なくとも１つが全血から成る。
【００３１】
さらなる態様において、これらの比の有意な差は、第２の比が第１の比よりも大きく、疾患状態の変化が疾患の進行である。
【００３２】
さらなる態様において、これらの比の有意な差は、第１の比が第２の比よりも大きく、疾患状態の変化が疾患の回復である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本開示は、ＲＡ患者が特異的療法に良好な候補者であるか否かを判定する際の特異的な細胞刺激物質に応じた白血球における差次的なｍＲＮＡ転写パターンの使用に関する。本開示は、ＲＡ患者に実施する療法が有効であるか否かを判定する際のこのような差次的な転写パターンの使用にも関する。本開示は、ＲＡの治療に用いる候補物質をスクリーニングする際のこのような差次的な転写パターンの使用にも関する。本開示は、経時的に患者におけるＲＡの状態を評価し、疾患の進行をモニタリングする際のこのような差次的な転写パターンの使用にも関する。
【００３４】
上記のように、ＲＡの病因は、ＲＡ患者の免疫細胞におけるＦｃＲの機能化に関連し得る。疾患におけるＦｃＲの潜在的な役割をさらに評価するために、自己免疫疾患の患者の病的部位へと遊走する前の末梢血の循環白血球におけるＦｃＲの機能が正常であるか、又はこの遊走の前に既に高められているかを判定することが有用である。Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）の機能が関節リウマチ（ＲＡ）の患者の末梢血の白血球において正常であるか、又は高められたかを分析するために、熱凝集ヒトＩｇＧ（ＨＡＧ）をヘパリン化全血に直接添加し、腫瘍壊死因子スーパーファミリ（ＴＮＦＳＦ）の様々なメンバーのｍＲＮＡレベルの変化を評価した。ＩｇＧに対して複数のＦｃＲ（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＵｎｉＧｅｎｅデータベース）が存在するが、ＨＡＧは全てのＦｃＲサブタイプと反応することができる普遍の刺激物質として作用する。ＨＡＧを有する刺激物質によって生じる、ＴＮＦスーパーファミリ（ＴＮＦＳＦ）のｍＲＮＡ（例えばＧｅｎｅＢａｎｋ ＵｎｉＧｅｎｅデータベースを参照されたい）のメンバーのｍＲＮＡレベルの変化を定量化した。
【００３５】
利用した方法は以下のようなものであった。様々なＴＮＦＳＦ遺伝子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋのＵｎｉＧｅｎｅデータベースから検索した。それぞれの遺伝子のＰＣＲプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Applied Biosystem, Foster City, CA）及びＨＹＢｓｉｍｕｌａｔｏｒ（RNAture, Irvine, CA）によって設計された（Mitsuhashi et al., Nature 367:759（1994）、及びHyndman et al., BioTechniques, 20:1090（1996）を参照されたい）。この配列は以下の表１で要約される。オリゴヌクレオチドはIDT（Coralville, IA）で合成された。
【００３６】
【表１−１】
【表１−２】
【００３７】
熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）は、ＰＢＳ中で６３℃で１５分間、２０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（Sigma, St. Louis）を加熱することによって調製した（Ostreiko et al., Immunol Lett. 15, 311（1987）を参照されたい）。８ウェルストリップマイクロチューブに、１．２μｌのＨＡＧ又は対照（リン酸緩衝生理食塩水）（BioLegend, San Diego）を添加し、使用まで−２０℃で保存した。新鮮ヘパリン化全血６０μｌをそれぞれのウェルに三重で添加し、蓋をして３７℃で２〜８時間インキュベートした。それぞれの処理後、以下に記載されるように全血５０μｌをフィルタプレートに移した。それぞれの血液サンプルを使用まで−８０℃で凍結保存した。
【００３８】
ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡは、Mitsuhashi et al., Clin. Chem. 52:4（doi: 10.1373/clinchem.2005.048983で公開された）に記載された方法に従って全血から調製した。米国特許出願第１０／７９６，２９８号（参照より本明細書中に援用される）で開示された方法を利用してもよい。要するに、９６ウェルフィルタプレートを回収プレート上に置き、５ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）１５０μｌを加えた。４℃で１分間、１２０×ｇで遠心分離した後、血液サンプル５０μｌをそれぞれのウェルに加え、すぐに４℃で２分間、１２０×ｇで遠心分離した後、４℃で５分間、２０００×ｇで遠心分離しながらＰＢＳ ３００μｌで１回、それぞれのウェルを洗浄した。それから、１％の２−メルカプトエタノール（Bio Rad, Hercules, CA, USA）、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Pierce, Rockford, IL, USA）、０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（5 Prime Eppendorf/Brinkmann, Westbury, NY, USA）、０．１ｍｇ／ｍｌの大腸菌ｔＲＮＡ（Sigma）、それぞれ１０ｍＭの特異的なリバースプライマーと、標準的なＲＮＡ３４オリゴヌクレオチドとのカクテルを添加した、ストック溶解緩衝液６０μｌをフィルタプレートに加えた後、３７℃で１０分間インキュベートした。それから、フィルタプレートをオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、RNAture）上に置き（Mitsuhashi et al., Nature 357:519（1992）、及びHamaguchi et al., Clin. Chem. 44, 2256（1998）（両方とも参照により本明細書中に援用される）を参照されたい）、４℃で５分間、２０００×ｇで遠心分離した。４℃で一晩保存した後、４℃でマイクロプレートをプレーン溶解緩衝液１００μｌで３回、その後洗浄緩衝液（０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ）１５０μｌで３回洗浄した。１×ＲＴ緩衝液、それぞれ１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、４単位のｒＲＮａｓｉｎ、及び８０単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（Promega）（プライマーなし）を含有する緩衝液３０μｌを添加し、３７℃で２時間、インキュベートすることによって、それぞれのウェルでｃＤＮＡを直接合成した。特異的なプライマーでプライミングした（primer-primed）ｃＤＮＡが溶液中に存在し、オリゴ（ｄＴ）でプライミングしたｃＤＮＡはマイクロプレートに固定されたままであった（Hugli, Crit. Rev. Immunol. 1, 321（1981）を参照されたい）。ＳＹＢＲグリーンＰＣＲ（Morrison et al., Biotechniques 24, 954（1998）（参照により本明細書中に援用される））のために、ｃＤＮＡを水で４倍に希釈し、ｃＤＮＡ溶液４μｌを３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、これにｉＴａｑ ＳＹＢＲマスターミックス（BioRad, Hercules, CA）５μｌ及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー）１μｌを加え、９５℃で１０分間を１サイクル、その後９５℃で３０秒間及び６０℃で１分間を４５サイクルのＰＣＲをＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ（ABI）において行った。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲも利用することができ、このような場合、ｃＤＮＡ溶液を３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、これにＴａｑＭａｎ汎用マスターミックス（ABI）５μｌ及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに３〜６μＭのＴａｑＭａｎプローブ）１μｌを加え、９５℃で１０分間を１サイクル、その後９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び６０〜６５℃で１分間を４５サイクルのＰＣＲをＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ（ABI）において行った。
【００３９】
１×ＲＴ緩衝液を陰性対照として用い、プライマーダイマーがＳＹＢＲグリーンＰＣＲ条件下で生成しなかったことを確認した。Ｃｔは、解析用ソフトウェア（ＳＤＳ, ABI）によって求められた。ΔＣｔは、適切な対照サンプルのＣｔ値を差し引くことによって算出され、倍数増加は、それぞれのＰＣＲサイクルの有効性を１００％と仮定することによって、２＾（−ΔＣｔ）と算出された。
【００４０】
図１は、末梢全血のヒト白血球におけるＴＮＦＳＦのｍＲＮＡのＦｃＲ媒介性の遺伝子発現の分析結果を示す。ＲＡ患者で示される結果は、ＨＡＧ刺激に応じて１．５倍を超える倍数増加を示す被験者と定義された、「応答」被験者の割合として表される。
【００４１】
ＲＡ患者及び健常な対照被験者に対する個々の結果は、対照値を超える倍数増加として図２で表される。各データ（健常な成人では○、及びＲＡ患者では●）は、三重の一定分量の全血の平均であった。図１で示される統計的有意性（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）は、上記のように応答者及び非応答者の集団を用いたχ2検定によって算出された。ＨＡＧで刺激し、サイクル閾値（Ｃｔ）（以下を参照されたい）に対して発現された健常個体の全血を用いて得られたさらなるデータは図１１に示される。
【００４２】
図１及び図２で示されるように、ＨＡＧが主にＴＮＦＳＦ−３、４、７、８、１１、１４、１５及び１８のｍＲＮＡを誘導した。ＨＡＧ誘導性のＴＮＦＳＦ−３、４、７及び１４に対する応答者集団（１．５を超える倍数増加）が、健常な対照よりもＲＡ患者において有意に大きく、ＨＡＧ誘導性のＴＮＦＳＦ−１１に対する応答者集団は対照よりもＨＡＧにおいて大きかったが、この場合では統計的有意性は確立することができなかった。これらのデータによって、ＴＮＦＳＦ−３、４、７、１１及び１４に対して白血球の機能亢進が付随した末梢血白血球におけるＨｃＲ機能の障害が示唆されている。このシステムは、下記のように、ＲＡにおける免疫細胞の細胞傷害機能の分析に有用である。
【００４３】
用量応答及び動力学的研究が図３で示される。図３は、末梢血白血球におけるＴＮＦＳＦのｍＲＮＡ発現に対する熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）の効果を示す。図３Ａは反応速度を示す。三重の一定分量のヘパリン化全血６０μｌをそれぞれＰＢＳ（○、△）、又は２００μｇ／ｍＬのＨＡＧ（●、▲）と混合し、３７℃で０〜１２時間インキュベートした。それから、ＴＮＦＳＦ−１５（○、●）及びＩＬ−８（△、▲）のｍＲＮＡを上記のように定量した。対照として時間が０での値を用いて倍数増加を算出した。図３Ｂは用量応答を示す。三重の一定分量のヘパリン化全血６０μｌをそれぞれ様々な濃度のＨＡＧと混合し、３７℃で２時間インキュベートした。それから、ＴＮＦＳＦ−２（●）、ＴＮＦＳＦ−１５（▲）、ＩＬ−８（○）、ＩＬ−１Ｂ（◇）、及びＣＸＣＬ−２（△）のｍＲＮＡを上記のように定量した。対照として溶媒（ＰＢＳ）に対する値を用いて倍数増加を算出した。それぞれのデータ点は、三重の一定分量の全血の平均±標準偏差（Ａ）又は平均（Ｂ）であった。外部対照ＲＮＡ３４は全ての場合で変化せず、このことによってアッセイが適切に行われたことが示唆された。
【００４４】
上記のＨＡＧの他に、他の刺激物質、例えばホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（Ｃｏｎ−Ａ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＡ、熱凝集ＩｇＥ、及び熱凝集ＩｇＭも、図４〜図１０及び図１２〜図１４で示されるように、健常な個体から採取された全血において様々なサブタイプのＴＮＦＳＦ及びケモカインを誘導する。これらのアッセイで進められたプロトコルは、それぞれの場合で利用された刺激物質が異なることを除いて上記で与えられたものと同じであった。図４〜図１４では、データは、或る特定量のＰＣＲ産物を生成するのに必要とされるＰＣＲのサイクル数であるサイクル閾値（Ｃｔ）に関して表される。刺激したサンプルのＣｔ値から刺激していないサンプルのＣｔ値を差し引くことによって、ΔＣｔ値を得た。Ｃｔは対数スケールで
あるので、１ΔＣｔ単位は、量が２倍変化することを示す。発現レベルが高くなると、標準量の産物を生成するのに必要とされるＰＣＲのサイクル数が減少するので、負のΔＣｔ値は発現の増大を示す。
【００４５】
これらの刺激物質の幾つかがＨＡＧのものと同様の刺激パターンを示す。特に、図４及び図５で示されるように、ＰＭＡ及びＰＨＡは、ＲＡ患者においてＨＡＧによっても刺激されるＴＮＦＳＦ−１４を刺激する。これらの刺激物質は、ＲＡ患者に対する療法の選択肢を評価し、ＲＡを治療する新規の薬剤をスクリーニングするのにも有用である。
【００４６】
免疫系の活性によって生じる実際の細胞死（ＲＡで起こると考えられるようなもの）を研究するのに、細胞傷害アッセイが一般的に用いられている。一般的に、51Ｃｒ充填した標的細胞をエフェクタ細胞と様々な比でインキュベートし、死細胞又は損傷細胞から放出された51Ｃｒ放射活性の量を定量することによって、細胞傷害アッセイが行われる（Dunkley et al., J Immunol Methods 6, 39（1974）を参照されたい）。幾つかの場合、放射性物質を非放射性物質、例えば蛍光物質に置き換えているが（Kruger-Krasagakes et al., J Immunol Methods 156, 1（1992）を参照されたい）、基本原理は変わらない。このように、細胞傷害アッセイの結果は実際の細胞死を反映する。
【００４７】
しかし、非生理的な実験条件下で細胞傷害アッセイを行い、複雑な細胞間相互作用及び細胞−血漿間相互作用をこのような研究の中で評価するのは難しい。さらに、細胞傷害アッセイは、どのＴＮＦＳＦメンバーが細胞死に関与するかを示していない。エフェクタ細胞が標的細胞を認識すると、単一のエフェクタ細胞では多くの標的細胞を破壊するのに十分ではないので、エフェクタ細胞は標的細胞を破壊するだけでなく、他のエフェクタ細胞を補充するようにも機能する。この補充機能は、走化性因子の放出によって表されると考えられる。エフェクタ細胞によって放出されるこのような走化性因子の同一性は、従来の細胞傷害アッセイでは示されない。しかし、本開示に記載のアッセイシステムによって、エフェクタ細胞において多くの種類の遺伝子発現を同時に同定することができる。
【００４８】
関与するＴＮＦＳＦサブタイプの同定は、これらの分子が標的細胞又は白血球上の特異的な受容体と反応するので非常に重要である。例えば、ＵｎｉＧｅｎｅの発現配列タグ（ＥＳＴ）プロファイルデータベースによれば、ＴＮＦＳＦ−１１に対する受容体（ＴＮＦＲＳＦ１１、ＲＡＮＫとしても知られる）は破骨細胞に存在し、この経路の刺激によって骨吸収が引き起こされる。したがって、ＲＡ患者におけるＴＮＦＳＦ−１１活性の増大（図１、図２）はＲＡの主な影響である骨侵食に関連し得る。
【００４９】
全血の使用が培養培地において単離白血球を使用することよりも好ましく、これは前者が後者よりも生理学的であり、白血球の全集団をスクリーニングすることができるためである。全血のより長期的なインキュベートによって、さらなる人工産物を生成することができる。したがって、理想的な方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏからｅｘ ｖｉｖｏに切り替えることによって、短期間のインキュベート中に全血における初期の致死シグナル及び補充シグナルを同定することである。ｍＲＮＡの転写は、タンパク質合成又は最終的な生物学的転帰のいずれよりも早い事象である。したがって、ｍＲＮＡは標的にふさわしい。
【００５０】
本開示は、初めて末梢血の循環白血球におけるＦｃＲ由来のＴＮＦＳＦ−１１誘導性の基礎機能亢進を示唆している。本方法は、腸組織ではなく全血を用いるので、ＴＮＦＳＦ不活性化療法に対して見込まれる応答性を評価するため、及び治療反応をモニタリングするためのＲＡに対する診断試験として用いることができる。具体的には、ＲＡのヒトがＴ細胞刺激に応じて転写されたｍＲＮＡを標的とする療法に対して反応する可能性があるか否かを判定する方法の好ましい実施形態では、ＲＡ患者から全血を得て、上記のように、血液サンプルにＨＡＧ刺激、及び任意で対照刺激（ＰＢＳ）を与える。上記のようにサン
プルでＴＮＦＳＦ−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１又はＴＮＦＳＦ−１４のｍＲＮＡのｍＲＮＡレベルの量を測定することができる。ＨＡＧで刺激後に１つ又は複数のこれらのｍＲＮＡのレベルが有意に上昇したＲＡ患者（例えば、１．５を超える倍数変化によって示されるように）は、これらのｍＲＮＡを標的とする療法に良好な候補者である。
【００５１】
さらに、患者においてＴＮＦＳＦ−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１又はＴＮＦＳＦ−１４のｍＲＮＡの１つ又は複数を標的とするＲＡ治療の有効性を評価する方法の好ましい実施形態において、ＨＡＧ刺激後の全血におけるｍＲＮＡの量と、対照刺激後の量との第１の比を治療の開始前に得る。ＨＡＧ抗体刺激後の全血におけるｍＲＮＡの量と、対照刺激後の量との第２の比を治療の開始後に得る。これらの比の有意差（第１の比が第２の比より大きいような場合）が療法の有効性を示し得る。例えば、このような療法には、シクロスポリンＡ又はタクロリムスの投与が含まれ得る。
【００５２】
重要なことに、このｅｘ ｖｉｖｏ方法は、破骨細胞の活性化に関与することが知られている１つ又は複数のＴＮＦＳＦ−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１又はＴＮＦＳＦ−１４、及び特にＴＮＦＳＦ−１１の抗ＦｃＲ媒介性のｍＲＮＡ発現を阻害する化合物のスクリーニングにも用いることができる。これらの新規の薬剤候補が転写レベルで白血球のｍＲＮＡ生成を阻害するので、このような化合物は興味深い薬剤標的である。このことがＲＡに対する薬剤開発の新たな戦略を与える。
【００５３】
開示のシステムを用いて薬剤化合物をスクリーニングし、それによってＲＡを治療すると推定される作用物質を同定する方法の実施形態において、ＨＡＧ等のＴ細胞刺激に曝された場合、白血球が、ＲＡ関連ｍＲＮＡレベルにおいて少なくとも１．５の倍数増加を示すという点で応答者であるＲＡ患者から全血を得る。ＨＡＧ刺激後の被験者の全血におけるｍＲＮＡの量と、対照刺激後の量との第１の比を算出する。さらに、被験者からの全血サンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏで薬剤化合物に曝した後、上記のように差次的に刺激する。それから、ＨＡＧ刺激後の全血におけるｍＲＮＡの量と、これらの曝露サンプルの対照刺激後の量との第２の比を算出する。２つの比の有意差（第１の比が第２の比より大きいような場合）によって、薬剤化合物がＲＡに対する潜在的な治療法として、さらなる研究候補であることが示され得る。
【００５４】
さらに、患者から得られた白血球を含むサンプルにおいて、ＴＮＦＳＦ−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１又はＴＮＦＳＦ−１４の１つ又は複数のｍＲＮＡレベルを測定することによってＲＡ患者の疾患状態をモニタリングする方法の好ましい実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで熱凝集ＩｇＧ抗体又は他の刺激物質を用いたＴ細胞刺激後の全血におけるｍＲＮＡの量と、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの対照刺激後の量との第１の比を１回目に得る。１回目に続く２回目で、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞刺激後の全血におけるｍＲＮＡの量と、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの対照刺激後の量との第２の比を得る。これらの比の有意差は疾患状態の変化を示し得る。例えば、第２の比が第１の比より大きい場合、このことが疾患の進行を示し得る一方で、第１の比の方が大きいことが疾患の退行を示し得る。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】関節リウマチ患者群及び対照群における、末梢全血中のヒト白血球中の様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡによるＦｃＲ媒介性遺伝子発現の定量結果を示す図である。
【図２】関節リウマチ患者群及び対照患者群の全血において熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）刺激によって誘導された様々なＴＮＦＳＦのｍＲＮＡレベルの倍数増加を示す図である。
【図３】末梢血の白血球におけるＴＮＦＳＦ及びケモカインのｍＲＮＡ発現に対するＨＡＧの効果を示す図である。
【図４】ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図５】フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図６】コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図７】コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図８】リポ多糖（ＬＰＳ）による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図９】ジャカリンによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１０】フコイダンによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１１Ａ】熱凝集ＩｇＧによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１１Ｂ】熱凝集ＩｇＧによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１１Ｃ】熱凝集ＩｇＧによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１１Ｄ】熱凝集ＩｇＧによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１２Ａ】熱凝集ＩｇＡによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１２Ｂ】熱凝集ＩｇＡによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１２Ｃ】熱凝集ＩｇＡによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１３Ａ】熱凝集ＩｇＭによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１３Ｂ】熱凝集ＩｇＭによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１３Ｃ】熱凝集ＩｇＭによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１４Ａ】熱凝集ＩｇＥによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１４Ｂ】熱凝集ＩｇＥによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１４Ｃ】熱凝集ＩｇＥによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節リウマチのヒトが療法に反応する可能性が有るか否かを判定する方法であって、
ヒト由来の白血球を含む第１のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
刺激後、前記第１のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、
ヒト由来の白血球を含む第２のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
第２のサンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、並びに
第１のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との比を求めることを含み、該比が約１．５：１以上である場合にヒトが前記療法に反応する可能性が有ると判定する方法。
【請求項２】
第１のサンプルにおいて白血球を刺激することが、熱凝集ヒトＩｇＧを第１のサンプルと混合することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のサンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン（jacalin）、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を第１のサンプルと混合することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１のサンプル及び第２のサンプルの少なくとも１つが全血を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
対照の刺激物質がリン酸緩衝生理食塩水である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記療法がシクロスポリンＡ及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
関節リウマチ療法の有効性を評価する方法であって、
ヒト由来の白血球を含む第１のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
ヒト由来の白血球を含む第２のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
刺激後、第１のサンプル及び第２のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、
第１のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第１の比を算出すること、
前記療法をヒトで行うこと、
療法の実施後に得られるヒト由来の白血球を含む第３のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
療法の実施後に得られるヒト由来の白血球を含む第４のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで前記対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
刺激後、第３のサンプル及び前記第４のサンプルにおいて、前記ｍＲＮＡのレベルを測定すること、
第３のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、前記第４のサンプルにおける前記ｍＲＮ
Ａの量との第２の比を算出すること、並びに
第１の比と第２の比とを比較することを含み、該比の有意な差が効果的な療法の指標となる、療法の有効性を評価する方法。
【請求項８】
第１のサンプル及び前記第３のサンプルにおいて白血球を刺激することが、熱凝集ヒトＩｇＧを該サンプルと混合することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を該サンプルと混合することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
対照の刺激物質がリン酸緩衝生理食塩水である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルの少なくとも１つが全血を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記比の有意な差は、前記第１の比が前記第２の比よりも大きいことである、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記療法がシクロスポリンＡ及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
関節リウマチを治療すると推定される作用物質を同定する方法であって、
熱凝集ヒトＩｇＧに曝される場合、白血球が、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの転写において少なくとも１．５の倍数増加を示すヒト由来の白血球を含む第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルを得ること、
第１のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
第２のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
刺激後、前記第１のサンプル及び前記第２のサンプルにおいて、前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
第１のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第１の比を算出すること、
第３のサンプル及び第４のサンプルを前記作用物質に曝すこと、
曝露後、第３のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
曝露後、第４のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで前記対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
刺激後、第３のサンプル及び第４のサンプルにおいて、前記ｍＲＮＡのレベルを測定すること、
第３のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第４のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第２の比を算出すること、並びに
前記第１の比と前記第２の比とを比較することを含み、前記比の有意な差が推定の作用物質の指標となる、関節リウマチを治療すると推定される作用物質を同定する方法。
【請求項１５】
第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することが、熱凝集ヒトＩｇＧを前記サンプルと混合することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を該サンプルと混合することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
対照の刺激物質がリン酸緩衝生理食塩水である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルの少なくとも１つが全血を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記比の有意な差は、前記第１の比が前記第２の比よりも大きいことである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ヒトにおいて関節リウマチの状態を評価する方法であって、
白血球を含み、前記ヒトから１回目に得られる第１のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
刺激後、前記第１のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、
前記１回目に前記ヒトから得られる白血球を含む第２のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
刺激後、第２のサンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
第１のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第１の比を求めること、
白血球を含み、前記１回目に続く２回目で前記ヒトから得られる第３のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
刺激後、前記第３のサンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
前記２回目で前記ヒトから得られる白血球を含む第４のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
刺激後、第４のサンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
第３のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第４のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第２の比を求めること、並びに
前記第１の比と前記第２の比とを比較することを含み、該第１の比と該第２の比との有意な差は、前記疾患状態の変化の指標となる、ヒトにおいて関節リウマチの状態を評価する方法。
【請求項２１】
第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することが、ヒト熱凝集ＩｇＧを前記サンプルと混合することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を該サンプルと混合することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
対照の刺激物質がリン酸緩衝生理食塩水である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルの少なくとも１つが全血を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記比の有意な差は、前記第２の比が前記第１の比よりも大きく、疾患状態の前記変化が該疾患の進行である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記比の有意な差は、前記第１の比が前記第２の比よりも大きく、疾患状態の前記変化が該疾患の退行である、請求項２０に記載の方法。
【請求項１】
関節リウマチのヒトが療法に反応する可能性が有るか否かを判定する方法であって、
ヒト由来の白血球を含む第１のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
刺激後、前記第１のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、
ヒト由来の白血球を含む第２のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
第２のサンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、並びに
第１のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との比を求めることを含み、該比が約１．５：１以上である場合にヒトが前記療法に反応する可能性が有ると判定する方法。
【請求項２】
第１のサンプルにおいて白血球を刺激することが、熱凝集ヒトＩｇＧを第１のサンプルと混合することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のサンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン（jacalin）、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を第１のサンプルと混合することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１のサンプル及び第２のサンプルの少なくとも１つが全血を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
対照の刺激物質がリン酸緩衝生理食塩水である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記療法がシクロスポリンＡ及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
関節リウマチ療法の有効性を評価する方法であって、
ヒト由来の白血球を含む第１のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
ヒト由来の白血球を含む第２のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
刺激後、第１のサンプル及び第２のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、
第１のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第１の比を算出すること、
前記療法をヒトで行うこと、
療法の実施後に得られるヒト由来の白血球を含む第３のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
療法の実施後に得られるヒト由来の白血球を含む第４のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで前記対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
刺激後、第３のサンプル及び前記第４のサンプルにおいて、前記ｍＲＮＡのレベルを測定すること、
第３のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、前記第４のサンプルにおける前記ｍＲＮ
Ａの量との第２の比を算出すること、並びに
第１の比と第２の比とを比較することを含み、該比の有意な差が効果的な療法の指標となる、療法の有効性を評価する方法。
【請求項８】
第１のサンプル及び前記第３のサンプルにおいて白血球を刺激することが、熱凝集ヒトＩｇＧを該サンプルと混合することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を該サンプルと混合することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
対照の刺激物質がリン酸緩衝生理食塩水である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルの少なくとも１つが全血を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記比の有意な差は、前記第１の比が前記第２の比よりも大きいことである、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記療法がシクロスポリンＡ及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
関節リウマチを治療すると推定される作用物質を同定する方法であって、
熱凝集ヒトＩｇＧに曝される場合、白血球が、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの転写において少なくとも１．５の倍数増加を示すヒト由来の白血球を含む第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルを得ること、
第１のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
第２のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
刺激後、前記第１のサンプル及び前記第２のサンプルにおいて、前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
第１のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第１の比を算出すること、
第３のサンプル及び第４のサンプルを前記作用物質に曝すこと、
曝露後、第３のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
曝露後、第４のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで前記対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
刺激後、第３のサンプル及び第４のサンプルにおいて、前記ｍＲＮＡのレベルを測定すること、
第３のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第４のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第２の比を算出すること、並びに
前記第１の比と前記第２の比とを比較することを含み、前記比の有意な差が推定の作用物質の指標となる、関節リウマチを治療すると推定される作用物質を同定する方法。
【請求項１５】
第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することが、熱凝集ヒトＩｇＧを前記サンプルと混合することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を該サンプルと混合することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
対照の刺激物質がリン酸緩衝生理食塩水である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルの少なくとも１つが全血を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記比の有意な差は、前記第１の比が前記第２の比よりも大きいことである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ヒトにおいて関節リウマチの状態を評価する方法であって、
白血球を含み、前記ヒトから１回目に得られる第１のサンプルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
刺激後、前記第１のサンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリ（「ＴＮＦＳＦ」）−３、ＴＮＦＳＦ−４、ＴＮＦＳＦ−７、ＴＮＦＳＦ−１１、及びＴＮＦＳＦ−１４から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、
前記１回目に前記ヒトから得られる白血球を含む第２のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
刺激後、第２のサンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
第１のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第１の比を求めること、
白血球を含み、前記１回目に続く２回目で前記ヒトから得られる第３のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
刺激後、前記第３のサンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
前記２回目で前記ヒトから得られる白血球を含む第４のサンプルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで対照の刺激物質で白血球を刺激すること、
刺激後、第４のサンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
第３のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第４のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第２の比を求めること、並びに
前記第１の比と前記第２の比とを比較することを含み、該第１の比と該第２の比との有意な差は、前記疾患状態の変化の指標となる、ヒトにおいて関節リウマチの状態を評価する方法。
【請求項２１】
第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することが、ヒト熱凝集ＩｇＧを前記サンプルと混合することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第１のサンプル及び第３のサンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を該サンプルと混合することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
対照の刺激物質がリン酸緩衝生理食塩水である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
第１のサンプル、第２のサンプル、第３のサンプル、及び第４のサンプルの少なくとも１つが全血を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記比の有意な差は、前記第２の比が前記第１の比よりも大きく、疾患状態の前記変化が該疾患の進行である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記比の有意な差は、前記第１の比が前記第２の比よりも大きく、疾患状態の前記変化が該疾患の退行である、請求項２０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【公表番号】特表２００９−５３６０２１（Ｐ２００９−５３６０２１Ａ）
【公表日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０４３１０（Ｐ２００９−５０４３１０）
【出願日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８５５９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１７５８９
【国際公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【出願人】（０００００４４５５）日立化成工業株式会社 (4,649)
【出願人】（５００２９４９５８）ヒタチ ケミカル リサーチ センター インコーポレイテッド (27)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８５５９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１７５８９
【国際公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【出願人】（０００００４４５５）日立化成工業株式会社 (4,649)
【出願人】（５００２９４９５８）ヒタチ ケミカル リサーチ センター インコーポレイテッド (27)
【Ｆターム（参考）】
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