防腐剤耐性を有する生体成分測定方法およびその試薬
【課題】マグネシウムの測定方法およびその試薬を提供する。特に臨床診断に用いられる生体成分中のマグネシウム測定試薬を提供する。
【解決手段】防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に濁りが発生しない等、各種性能低下がないことを特徴とするマグネシウム測定方法。
【解決手段】防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に濁りが発生しない等、各種性能低下がないことを特徴とするマグネシウム測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は中性脂肪またはマグネシウムの測定方法およびその試薬に関する。特に臨床診断に用いられる生体成分中の中性脂肪測定試薬またはマグネシウム測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査分野で用いられる診断薬として酵素反応を利用した生化学的測定試薬がある。本試薬では、酵素が溶液中で不安定なため、酵素および酵素以外の不安定物質を凍結乾燥し、使用前に溶解液で溶解し使用していた。このため、製造側では凍結乾燥を行うことからコスト、製造時間がかかり、また使用者側では溶解の手間がかかるという問題があった。これに対し、近年、生化学検査の分野において調製不要の無調製液状試薬が開発され凍結乾燥に伴う問題点を解決した。本液状試薬は種々の方法により原料酵素、補酵素等の安定化を行うことで、溶液状態で長期間保存可能な試薬として完成され、現在では国内の生化学的測定試薬市場では主流になっている。
【０００３】
無調製液状試薬の開発において、従来の凍結乾燥試薬から新たに加えるべき開発のポイントの１つに流通時の防腐能の向上があった。防腐能の向上のためには、種々の添加剤が検討されており成果が報告されている（例えば、特許文献１参照）。ところが、防腐剤の選択においては、抗菌力および防腐剤自身の長期安定性などの防腐性能への配慮もさることながら、一方で、原料酵素、補酵素の安定性への影響が無視できず、実際には防腐剤と酵素の相性により防腐剤が成分酵素等を劣化させ、精密性、正確性などの試薬性能に少なからず影響を与える場合があることがわかってきている。このように、十分な防腐性能と試薬の安定性を両立させることは非常に困難な課題である。
【特許文献１】特公平７−７８００５
【０００４】
防腐剤により測定試薬の性能が劣化する試薬として、中性脂肪測定試薬、マグネシウム測定試薬がある（例えば、特許文献２および３参照。）。中性脂肪の測定は、一般に中性脂肪にリパーゼおよびグリセロールキナーゼを作用させて生成したグリセロリン酸またはＡＤＰを測定して行なう。なかでも、グリセロリン酸にグリセロリン酸オキシダーゼを作用させることにより生じた過酸化水素を、ペルオキシダーゼの下で色原体に作用させてキノン色素を生成させる方法が汎用されている。また自動分析機などを用いて２試薬系で測定する場合、第一試薬にアスコルビン酸オキシダーゼを添加しておき、測定を妨害する物質であるアスコルビン酸を消去することも当該分野であればよく行なわれる。また、内因性のグリセロールを消去するためにカタラーゼを添加することも当該分野であればよく行なわれる。
マグネシウムの測定試薬は、一般にマグネシウムにより活性化したグリセロールキナーゼ活性を生成するグリセロリン酸またはＡＤＰを測定して行う。
【特許文献２】特公昭５８−５６７７
【特許文献３】特開昭６４−３０５９７
【０００５】
これらの測定試薬においては複数の酵素が用いられるが、ペルオキシダーゼなど相対的に防腐剤からの影響を受けにくいものもあれば、グリセロールキナーゼなど影響を大きく受ける酵素もある。中性脂肪測定試薬のようないわゆる生化学診断薬と呼ばれる試薬群において、ペルオキシダーゼは酵素として単独で用いられることはほとんどなく多段階反応で他の酵素と共役して用いられるため、試薬としての防腐剤耐性は最も耐性のない酵素に依存する。したがって、ペルオキシダーゼのみの防腐剤耐性が高くても試薬としての有用性はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、防腐剤に対して高い耐性を有し、かつその測定試薬の精密性、正確性を長期間維持する中性脂肪測定試薬およびマグネシウム測定試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するために、試薬中の酵素や色素などの成分と防腐剤との相互作用について考察し、鋭意検討した結果、適切な酵素と防腐剤の組み合わせを選択することにより、試薬中の成分酵素が防腐剤により劣化することで中性脂肪測定試薬においては保存中に濁りが発生する、反応中に試薬ブランクが上昇する、内因性の遊離グリセロールの消去能が低下する、高値測定限界が低下することで、マグネシウム測定試薬においては保存中に濁りが発生する、反応中に試薬ブランクが上昇する、感度が低下する、高値測定限界が低下することで測定試薬の精密性、正確性を低下させていることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に濁りが発生しないことを特徴とする中性脂肪測定方法
（２）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に試薬ブランクの上昇がないことを特徴とする中性脂肪測定方法
（３）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的にグリセロール消去能が低下しないことを特徴とする中性脂肪測定方法
（４）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に高値測定限界が低下しないことを特徴とする中性脂肪測定方法
（５）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に濁りが発生しないことを特徴とするマグネシウム測定方法
（６）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に試薬ブランクの上昇がないことを特徴とするマグネシウム測定方法
（７）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に感度が低下しないことを特徴とするマグネシウム測定方法
（８）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に濁りが発生しないことを特徴とする中性脂肪測定試薬
（９）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に試薬ブランクの上昇がないことを特徴とする中性脂肪測定試薬
（１０）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的にグリセロール消去能が低下しないことを特徴とする中性脂肪測定試薬
（１１）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に高値測定限界が低下しないことを特徴とする中性脂肪測定試薬
（１２）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に濁りが発生しないことを特徴とするマグネシウム測定試薬
（１３）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に試薬ブランクの上昇がないことを特徴とするマグネシウム測定試薬
（１４）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に感度が低下しないことを特徴とするマグネシウム測定試薬
【０００８】
別の表現では、本発明は以下のような構成からなる。
［１］
防腐剤の存在下において、保存中に継続して、防腐性能効果と試薬性能低下の抑制が両立していることを特徴とする、中性脂肪測定方法
［２］
試薬性能低下の抑制が、次から選ばれる少なくとも１つである、［１］の方法
（１）実質的に濁りが発生しないこと
（２）実質的に試薬ブランクの上昇がないこと
（３）実質的にグリセロール消去能が低下しないこと
（４）実質的に高値測定限界が低下しないこと
（５）実質的に試薬に含まれる酵素活性が低下しないこと
［３］
防腐剤の存在下において、保存中に継続して、防腐性能効果と試薬性能低下の抑制が両立していることを特徴とする、マグネシウム測定方法
［４］
試薬性能低下の抑制が、次から選ばれる少なくとも１つである、［３］の方法
（１）実質的に試薬ブランクの上昇がないこと
（２）実質的に感度が低下しないこと
（３）実質的に試薬に含まれる酵素活性が低下しないこと
［５］
防腐剤が、蛋白質に直接作用する防腐剤である、［１］〜［４］のいずれか１に記載の方法
［６］
防腐剤の存在下において、保存中に継続して、防腐性能効果と試薬性能低下の抑制が両立していることを特徴とする、中性脂肪測定試薬
［７］
防腐剤の存在下において、保存中に継続して、防腐性能効果と試薬性能低下の抑制が両立していることを特徴とする、マグネシウム測定試薬
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、防腐剤に対して高い耐性を有し、かつその測定試薬の精密性、正確性を長期間維持する中性脂肪測定試薬およびマグネシウム測定試薬を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてリパーゼ、ペルオキシダーゼ等を含有する２試薬系からなる中性脂肪測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ保存中に濁りが発生しない中性脂肪測定方法である。
【００１１】
防腐剤として抗生物質を使用する場合、微生物が比較的容易に、当該物質の膜透過性を抑制したり、当該物質を分解し無毒化する能力を獲得することができるため、耐性菌の発生を招き、実質的に試薬の防腐効果を失うことがよくあると考えられる。一方、蛋白質に直接作用することができる防腐剤は、微生物が耐性を得ることが難しいと考えられる点でより好ましく、今後汎用されていく可能性が高い。しかし、このような蛋白質に直接作用する防腐剤は当然、共存する酵素蛋白質にも作用するため、蛋白質の構造によっては不安定化を招く可能性がある。このように、防腐剤に対する耐性は、その防腐剤の作用機構と蛋白質の構造の両面に起因すると考えられる。
【００１２】
このような防腐剤としては、特に限定されるものではないが、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン−ヒドロクロリド（Ｎ−メチルイソチアゾロン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ）とも称する。略称ＭＩＴ）などのイソチアゾリン系化合物、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（略称ＨＰＯ）、クロルアセトアミド（略称ＣＡＡ）、｛Ｎ，Ｎ−メチレン−ビス［（Ｎ−１−ヒドロキシメチル）−２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル］｝−尿素（略称ＩＺＵ）及び５−ブロム−５−ニトロ−１，３−ジオキサン（略称ＢＮＤ）などが挙げられる。
【００１３】
これらを用いる場合は、できるだけ少ない種類を用いることが好ましい。より好ましくは１種類を用いることが好ましい。理由は、中性脂肪測定試薬やマグネシウム測定試薬のような多段階の反応を追随させる測定系においては多くの酵素や色素などの要素を必要とするが、防腐剤が各要素に与える影響はそれぞれの防腐剤によって異なると考えられるため、影響を受ける要素数をできるだけ少なくするためである。
【００１４】
たとえば中性脂肪測定試薬の場合、ＢＮＤやＭＩＴが共存するとグリセロールキナーゼがダメージを受ける場合がある。また、ＩＺＵが共存するとグリセロリン酸オキシダーゼがダメージを受ける場合がある。また、ＨＰＯが共存するとアスコルビン酸オキシダーゼがダメージを受ける場合がある。また、ＣＡＡが共存すると発色反応のタイムコースに影響が出る場合があるがこれは４−アミノアンチピリンを劣化させるためであると考えられる。したがって、例えば上記ＭＩＴ、ＨＰＯ、ＣＡＡ、ＩＺＵおよびＢＮＤの中から適切な防腐剤を選択する場合、複数の防腐剤を用いるとすると多くの要素に与える影響に対処しなければならないが、１種のみ使用する場合は１つの要素に対処するだけでよい。例えばＭＩＴを使用する場合は、グリセロールキナーゼへの対処だけで済む。他の防腐剤についても同様である。
【００１５】
本発明において特に好ましい防腐剤として、蛋白質のＳＨ基やアミノ基に作用すると言われているイソチアゾリン系化合物が挙げられる。例えば２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（または、Ｎ−メチルイソチアゾロン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ、略称ＭＩＴ））、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（ＣＭＩＴ）、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン（ＢＩＴ）等や、その誘導体などが挙げられる。これらは、混合物としてプロクリン１５０（スペルコ製）、プロクリン３００（スペルコ製）、アクチサイドＭＢＳ（ソー・ジャパン製）、単一製品としてアクチサイドＢ２０（Ｎ）（ソー・ジャパン製）、ＭＩＴ（ロシュ製、シグマ製）等が一般に市販されている。なお、既述の理由により試薬中にイソチアゾリン系化合物以外の防腐剤を添加しない態様がさらに好ましい。本発明の中性脂肪測定方法において、イソチアゾリン系化合物は防腐能、試薬の安定性に与える影響のいずれの点においても優れている。
【００１６】
本発明に用いる防腐剤とは、試薬を保存している間の微生物の増殖を抑制することを目的として、試薬に添加される物質をいう。このときの防腐剤の添加濃度は特に限定されるものではないが、十分な防腐性能効果が得られる濃度であることが望ましい。防腐剤の添加濃度は、防腐剤の種類や添加する試薬の組成などによって異なるのは当然であり、適当な添加濃度の決定は当業者が適宜実施できることである。十分な防腐能を有し診断薬用途に用いられる濃度範囲であれば特に限定されないが、例えば溶液中の下限濃度として０．０００１％、好ましくは０．００１％、更に好ましくは０．０１％である。上限濃度として１％、好ましくは０．５％、更に好ましくは０．１％である。
【００１７】
十分な防腐性能効果とは、例えば次の抗菌試験により菌の増殖がないことで効果をみることができる。抗菌試験方法は、被検試薬として防腐剤を添加した測定試薬を用い、これを３５℃、１週間または２週間保存する。本試薬にブレインハートインフュージョン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を終濃度で３９ｇ／Ｌになるように添加混合し被検試薬とする。菌液はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｒｉｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属等の標準菌株または抗生物質に対する耐性を獲得した菌株を生理食塩水に懸濁し目安として６６０ｎｍの吸光度が０．５Ａｂｓになるように調製する。本菌液を被検試薬４ｍＬに対し５０μＬ接種した後、２５または３７℃で３日間振とうする。判定は被検試薬の６６０ｎｍにおける吸光度を保存前後で比較し有意に吸光度の増加がある場合を防腐効果なしと判定し、吸光度の変動に有意差がない場合、菌の増殖がないと判断し防腐効果ありと判定する。
【００１８】
防腐剤に対する高い耐性とは、防腐剤の存在下において、保存中に継続して、防腐性能効果と試薬性能低下の抑制が両立していることを指す。例えば、ある組成物に、耐性を試験したい防腐剤を添加し、保存中に、実質的に正確性、精密性、測定レンジなどの試薬性能低下が抑制され、かつ、実質的に浮遊物や沈殿物の発生が抑制されている状態であれば、その試薬は該防腐剤に対して高い耐性を有すると言える。この定義において、保存温度、保存期間は、当業者の常識の範囲で任意に設定できる。通常、２〜１０℃で０．５年以上、好ましくは１年以上、さらに好ましくは１．５年以上、あるいは室温（２５℃付近）で０．５年以上で行うことが好ましいが、評価を実施する場合は加速試験として、３５〜３７℃で１週間以上で代替することも可能である。その場合、試験の条件、期間は、必要により適宜変更することができる。
【００１９】
防腐剤共存下における試薬性能の低下により、中性脂肪測定試薬においては、保存中に濁りが発生する、反応中に試薬ブランクが上昇する、内因性の遊離グリセロールの消去能が低下する、高値測定限界が低下することなどが、現象としてみられる。マグネシウム測定試薬においては、保存中に濁りが発生する、反応中に試薬ブランクが上昇する、感度が低下する、高値測定限界が低下する、などの現象がみられる。防腐剤に対する耐性のうち試薬性能低下が抑制されているかどうかは、これらの現象の推移を見ることによって評価できる。
【００２０】
これらの現象は酵素や色素など種々の要素の劣化によりもたらされると考えられる。内因性の遊離グリセロールの消去能低下や、高値測定限界の低下は、酵素の失活により多段階の酵素反応の少なくとも１つの反応の速度が遅くなることにより、反応の追随が遅れることが主な原因である。中性脂肪測定試薬では、グリセロール消去に関与する酵素はグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、カタラーゼが例示される。また、測定に関与する酵素は、リパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼが例示される。また、保存中の濁り発生、反応中の試薬ブランク上昇は、酵素蛋白質が失活により変性し不溶化することが主な原因であるが、濁りの場合はさらに界面活性剤や塩類など他の物質が防腐剤の作用を受け不溶化している場合もありうるし、ブランク上昇の場合はさらに色素類が防腐剤の作用を受け自己縮合している場合もありうる。
【００２１】
従来、防腐剤としてイソチアゾリン系化合物を用いた場合は、主として、グリセロールキナーゼが防腐剤により劣化することによりもたらされてきたと考えられる。したがって、例えば本発明において防腐剤としてイソチアゾリン系化合物を用いた場合、防腐剤に対する耐性のうち試薬性能低下が抑制されているかどうかは、濃度が０．１〜２０Ｕ／ｍＬのグリセロールキナーゼの、防腐剤による劣化を見ることによっても評価できる。試薬性能低下が抑制されているかどうかは、「実質的に試薬に含まれる酵素活性が低下しない」かどうかで判断する。防腐剤１００ｍｇ／Ｌの濃度で２５℃、１週間共存させた時のグリセロールキナーゼ活性残存率が７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上である。特定の防腐剤に対する効果を評価したい場合は、評価対象の試薬組成物に上記濃度の防腐剤を添加した後、上記条件で保存した前後の酵素活性を比較すればよい。
【００２２】
上記のように、使用する防腐剤の種類によって、酵素に与える影響がそれぞれ異なることから、防腐剤に対する耐性のうち試薬性能低下が抑制されているかどうかは、当該防腐剤が影響を与える酵素を適宜選択してグリセロールキナーゼと同様に評価することができる。指標となる酵素としては、特に限定されないが、中性脂肪測定試薬においては、リパーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ等が好ましく選択可能である。試薬性能低下が抑制されているかどうかは、防腐剤１００ｍｇ／Ｌの濃度で２５℃、１週間共存させた時の酵素活性残存率が７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上である。以上のことはマグネシウム測定試薬についても同様である。
【００２３】
本発明において、「実質的に濁りが発生しない」とは、全く濁りが生じないか又はほとんど濁りが生じず、一定のレベル以下に抑えられていることを意味する。「一定レベル」は当業者常識により適宜決定されるが、一般には、試薬の規格（製品規格、出荷規格など）を満足するレベルであればよい。保存中の濁りを評価する方法としては、目視、６６０ｎｍの吸光度測定、あるいは、パーティクルカウンター（クラボウ社製）による測定などにより評価することができる。中でも最小検出感度の観点からパーティクルカウンターが好ましい。パーティクルカウンターでの５〜１５０μｍの総カウント数は１０００個／ｍＬ以下、好ましくは５００個／ｍＬ以下、更に好ましくは１００個／ｍＬ以下が良い。測定結果の判定には、定量検査や分析化学の領域で用いられている評価法等、従来用いられている任意の検定方法を適宜採用することができる。
【００２４】
本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてリパーゼ、ペルオキシダーゼ等を含有する２試薬系からなる中性脂肪測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ保存中に試薬ブランクの上昇がない中性脂肪測定方法である。
【００２５】
本発明において、試薬ブランクは、精製水または測定対象を含まない試料を測定した時の測定終了時点の、測定波長により測定された吸光度をいう。「実質的に試薬ブランクの上昇がない」とは、全くブランクの上昇がないか又はほとんど上昇がなく、一定のレベル以下に抑えられていることを意味する。本発明における試薬ブランクの保存前に対する保存後の上昇は０．１Ａｂｓ以下であるが、好ましくは０．０５Ａｂｓ以下、更に好ましくは０．０１Ａｂｓ以下である。測定結果の判定には、定量検査や分析化学の領域で用いられている評価法等、従来用いられている任意の検定方法を適宜採用することができる。
【００２６】
本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてリパーゼ、ペルオキシダーゼ等を含有する２試薬系からなる中性脂肪測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ保存中にグリセロール消去能が低下しない中性脂肪測定方法である。
【００２７】
本発明において、グリセロール消去能は、中性脂肪の測定において試料中に含まれると妨害要因となる遊離のグリセロールを中性脂肪の測定の前に反応に関与しない物質に変換する（消去）する能力のことをいう。「実質的にグリセロール消去能が低下しない」とは、全く消去能が低下しないか又はほとんど低下せず、一定のレベル以上に抑えられていることを意味する。「一定レベル」は当業者常識により適宜決定されるが、一般には、試薬の規格を満足するレベルであればよい。通常トリオレイン換算で１００ｍｇ／ｄＬあれば十分だが、好ましくは２０００ｍｇ／ｄＬ以上であり、更に好ましくは３５００ｍｇ／ｄＬ以上である。この条件下で、本発明におけるグリセロール消去能の保存前に対する保存後の低下は３０％以下であるが、好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下である。
【００２８】
グリセロール消去能は、好ましくは次のように判断する。
（１）グリセロール（ナカライテスク社製）を精製水で濃度が等間隔になるよう希釈し１０水準以上の希釈系列を作製する。
（２）中性脂肪測定試薬を用いて上記の試料を各２回以上ずつ測定し平均値を算出する。測定は日立７１７０形自動分析機を用いる。試料２．１μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とする。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とする。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとり２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定する。吸光度測定結果は、精製水および２００ｍｇ／ｄＬトリオレイン水溶液の測定吸光度より算出し中性脂肪濃度として求める。
（３）完全に消去されていれば測定値はゼロになるはずである。各水準のトリオレインの測定値をプロットして、どこまでゼロを保っているかをみる。測定値が１０ｍｇ／ｄＬを超えた場合（２００ｍｇ／ｄＬトリオレインの５％）はこの濃度水準を含めそれ以上の濃度ではグリセロール消去能がないと判定し、１水準下の濃度をグリセロール消去能とする。
【００２９】
本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてリパーゼ、ペルオキシダーゼ等を含有する２試薬系からなる中性脂肪測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ高値測定限界が低下しない中性脂肪測定方法である。
【００３０】
本発明において、高値測定限界は、中性脂肪高値試料を段階希釈した試料を測定した場合、その測定値が希釈系列に対し比例関係にある濃度の最高値のことをいう。
「実質的に高値測定限界が低下しない」とは、全く測定限界が低下しないか又はほとんど低下せず、一定のレベル以上に抑えられていることを意味する。「一定レベル」は当業者常識により適宜決定されるが、一般には、試薬の規格を満足するレベルであればよい。通常トリオレイン換算で１５００ｍｇ／ｄＬあれば十分だが、好ましくは２０００ｍｇ／ｄＬ以上であり、更に好ましくは２５００ｍｇ／ｄＬ以上である。この条件下で、本発明における高値測定限界の保存前に対する保存後の低下は３０％以下である、好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下である。
【００３１】
高値測定限界は、好ましくは次のように判断する。
（１）トリオレイン（ナカライテスク社製）を精製水で濃度が等間隔になるよう希釈し１０水準以上の希釈系列を作製する。
（２）中性脂肪測定試薬を用いて上記の試料を各２回以上ずつ測定し平均値を算出する。測定は日立７１７０形自動分析機を用いる。試料２．１μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とする。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とする。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとり２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定する。吸光度測定結果は、精製水および２００ｍｇ／ｄＬトリオレイン水溶液の測定吸光度より算出し中性脂肪濃度として求める。
（３）各水準のトリオレインの測定値を第一水準の測定値で割った値をプロットして、どこまで比例関係を保っているかをみる。理論値の±５％を外れたときはこの濃度水準を含めそれ以上の濃度では直線性がないと判定し、１水準下の濃度を高値測定限界とする。
【００３２】
また、本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロール等を含有する２試薬系からなるマグネシウム測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ保存中に濁りが発生しないマグネシウム測定試薬である。
【００３３】
また、本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロール等を含有する２試薬系からなるマグネシウム測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ保存中に試薬ブランクの上昇がないマグネシウム測定試薬である。
【００３４】
本発明における試薬ブランクの保存前に対する保存後の上昇は０．１Ａｂｓ以下であるが、好ましくは０．０５Ａｂｓ以下、更に好ましくは０．０１Ａｂｓ以下である。
【００３５】
また、本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロール等を含有する２試薬系からなるマグネシウム測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ保存中に感度が低下しないマグネシウム測定試薬である。
【００３６】
本発明において、感度とは、定量性が保証される範囲の既知濃度の試料を測定した場合の吸光度から試薬ブランク吸光度を差し引いた吸光度のことをいう。
「実質的に感度が低下しない」とは、全く感度が低下しないか又はほとんど低下せず、一定のレベル以上に抑えられていることを意味する。「一定レベル」は当業者常識により適宜決定されるが、一般には、試薬の規格を満足するレベルであればよい。この条件下で、本発明における感度の保存前に対する保存後の低下は３０％以下であるが、好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下である。
【００３７】
さらに、本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてリパーゼ、ペルオキシダーゼ等を含有する２試薬系からなる中性脂肪測定方法であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ、さらに次の［１］〜［４］のうち２つ以上を満たす中性脂肪測定方法である。［１］保存中に実質的に濁りが発生しない、［２］保存中に実質的に試薬ブランクの上昇がない、［３］保存中に実質的にグリセロール消去能が低下しない、［４］保存中に実質的に高値測定限界が低下しない。
【００３８】
また、本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロール等を含有する２試薬系からなるマグネシウム測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ、さらに次の［１］〜［３］のうち２つ以上を満たすマグネシウム測定方法である。［１］保存中に実質的に濁りが発生しない、［２］保存中に実質的に試薬ブランクの上昇がない、［３］保存中に実質的に感度が低下しない。
【００３９】
本発明に用いるグリセロールキナーゼとは、ＥＣ２．７．１．３０に分類される以下の反応を触媒する酵素が含まれる。
グリセロール＋ＡＴＰ＋Ｍｇ→グリセロール−３−ホスフェート＋ＡＤＰ＋Ｍｇ
本発明に用いるグリセロールキナーゼとして好ましいのは、防腐剤に対する耐性が防腐剤１００ｍｇ／Ｌの濃度で２５℃、１週間共存させた時のグリセロールキナーゼ活性残存率が７０％以上１００％以下、好ましくは８０％以上１００％以下、更に好ましくは９０％以上１００％以下のものである。
【００４０】
このような酵素は、その起源は特に限定されない。動物起源であれば、ヒト、ラット肝、ハト肝などが例示される。また、酵母・微生物などの微生物であれば、サッカロマイセス属（例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、キャンディダ属（例えばキャンディダ・ミコデルマ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｙｃｏｄｅｒｍａ））、バチルス属（例えばバチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、サーマス属（例えばサーマス・フラーバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ））、セルロモナス属（例えばセルロモナス・フラビゲナ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖｉｇｅｎａ）、セルロモナス・エスピー（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．））、エシェリヒア属（例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、アースロバクター属（例えばアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．））、フラボバクテリウム属（例えばフラボバクテリウム・メニンゴセプティクム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ））、ストレプトマイセス属（例えばストレプトマイセス・カヌス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｃａｎｕｓ））、ジオトリカム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）などが挙げられる。これらはいずれも市販のものなどを使用することができる。
【００４１】
これらのうち、防腐剤、特に蛋白質に直接作用する防腐剤と共存していても試薬の安定性を維持すると言う点で好ましく用いられるのは、セルロモナス属、フラボバクテリウム属（フラボバクテリウム・メニンゴセプティクム）、アースロバクター属（アースロバクター・エスピー）、サーマス属、バチルス属（バチルス・ステアロサーモフィラス）のものである。さらに好ましくは、セルロモナス属、サーマス属、バチルス属（バチルス・ステアロサーモフィラス）のものである。最も好ましくは、セルロモナス・エスピーから抽出されたものが用いられる。上記の酵素は、これらの遺伝子を他の微生物に組み込まれた遺伝子組換え微生物より製造されたものを含む。
【００４２】
上記のような差が生じる理由の１つとしては、反応を受けやすい部分、例えば酵素タンパク質がもつシステインやメチオニンなどの含硫アミノ酸残基の、個数とその位置に起因することが考えられる（例えばサーマス・フラバス由来のグリセロールキナーゼのアミノ酸配列については、特許文献４を参照）。このことを示唆するものとして、ザルコシンオキシダーゼにおいて、システイン残基を他のアミノ酸に置換することにより種々の物質に対する安定化を達成している事例が挙げられる（たとえば、特許文献５参照）。したがって、含硫アミノ酸を含む酵素、とくに酵素表面に含硫アミノ酸が存在する場合、とりわけ活性中心や補酵素や基質結合部位近傍に含硫アミノ酸が存在する場合、防腐剤などの化学物質の影響をより受けやすいことが示唆される。また、含硫アミノ酸の個数についてはその他の条件に大きな差がなければ原則として少ない方が防腐剤耐性があると考えられる。
【特許文献４】特開平１１−９２７９号公報
【特許文献５】特許第３１３２６１８号公報
【００４３】
該グリセロールキナーゼの濃度下限は、通常０．０５Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１Ｕ／ｍＬである。一方上限は、通常２０Ｕ／ｍＬ、好ましくは５Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは２Ｕ／ｍＬである。
【００４４】
本発明に用いる緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。なかでも、トリス緩衝液、リン酸緩衝液は濃度、温度によってｐＨが変動しやすいが、安価であるという利点がある。一方、ｐＨの変動等が小さいＧＯＯＤ緩衝液はＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示される。これらはいずれも市販のものなどを使用することができる。
【００４５】
本発明のｐＨとしては、酵素を不安定化する範囲でなければ特に限定されない。該緩衝液のｐＨ下限は好ましくは５であるが、さらに好ましくは５．５である。ｐＨ上限は好ましくは９であるが、さらに好ましくは８である。中性脂肪測定試薬の場合、ｐＨ６〜７．５、さらには６〜７の弱酸性域が、グリセロリン酸オキシダーゼおよびアスコルビン酸オキシダ−ゼの反応至適ｐＨであることからさらに好ましい。
【００４６】
本発明の測定試薬には、さらに界面活性剤、糖類、キレート剤、補酵素などを添加してもよい。界面活性剤としては非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤などが挙げられる。糖類としては、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンおよびその誘導体等が挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。補酵素としては、フラビンアデニンジヌクレオチド等が挙げられる。これらはいずれも市販のものなどを使用することができる。これらの添加目的は特に限定されないが、酵素や試薬の安定化効果を有する種類、濃度であることが好ましい。また、添加物自身が防腐剤による劣化を受けない種類、濃度であることが好ましい。
【００４７】
本発明の測定試薬には測定上必要な他の試薬が含まれていてもよい。中性脂肪測定試薬としては、例えばリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ＡＴＰ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色源体が含有されうる。また、例えばリパーゼ、グリセロールキナーゼ、ＡＴＰ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが含有されうる。また、マグネシウム測定試薬としては、一般にグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ＡＴＰ、キレート剤、ペルオキシダーゼ、色源体が含有されうる。
【００４８】
上記種々の成分の中で、特にリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ＡＴＰ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色源体を用いる中性脂肪測定試薬、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ＡＴＰ、キレート剤、ペルオキシダーゼ、色源体を用いるマグネシウム測定試薬については、本発明により特に好ましい効果が得られる。
【００４９】
さらに、本願発明においては糖類を添加してもよい。糖類としては、単糖、二糖、オリゴ糖、環状オリゴ糖などの中から適宜選択され、特に限定されるものではない。例えばキシロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、メリビオース、リビトース、イノシトール、ズルシトール、グルシトール、グルコノ−１，５−ラクトン、Ｇ２−β−サイクロデキストリン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノコレート等が挙げられる。中でもシュークロースを骨格とする化合物、例えばシュークロース、ラクトシュークロース、ラフィノース、イヌロオリゴ糖類、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノコレート等が好適に用いられる。中でもシュークロースが好ましい。いずれも、市販のものなどを使用することができる。糖類の添加濃度には特に制限はないが、好ましくは、防腐剤に対して、０．０１倍量（Ｗ／Ｗ）以上であり、好ましい下限は０．０５倍量（Ｗ／Ｗ）、好ましい上限は５００倍量（Ｗ／Ｗ）である。とくにイソチアゾリン系化合物を防腐剤として用いる場合に耐性（安定化効果）が高まり、好ましい。
【００５０】
グリセロールキナーゼの活性測定は以下の測定条件で行うのが好ましい。
グリセロールを基質とし、グリセロール−３−リン酸の生成量によって酵素活性を測定した。０．５％４―アミノアンチピリン水溶液０．２ｍｌ、１．５％フェノール水溶液０．２ｍｌ、グリセロールー３―リン酸酸化酵素２００Ｕ、ペルオキシダーゼ８０Ｕ、ＡＴＰ４８．４ｍｇに０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．９）を加え、総量２１ｍｌとし、これを以下の測定のための原液とした。各反応は、この測定原液を３ｍｌ取り、０．３Ｍグリセロール水溶液５０μｌ、酵素溶液１００μｌを添加し、混和後、３７℃に制御された分光光度計で５００ｎｍの吸光度を３分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化を求めた（ΔＯＤｔｅｓｔ）。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液（０．２％牛血清アルブミンを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７．５）を１００μｌ加え上記同様に操作を行って１分間当りの吸光度変化量を求めた（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。
得られた吸光度変化量より下記計算式に基づきグリセロールキナーゼの酵素活性を算出した。なお上記条件下で１分間に１マイクロモルのグリセロールをリン酸化する酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
計算式
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×３．１５（ｍｌ）×希釈倍率｝／｛１３．３×１／２×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍｌ）｝
３．１５ｍｌ＝反応混液液量
１３．３＝キノン色素の上記測定条件下でのミリモル吸光係数
１／２＝酵素反応で生成した過酸化水素の１分子から形成するキノン色素が１／２分子であることによる係数
１．０ｃｍ＝セルの光路長
０．１ｍｌ＝酵素サンプル液量
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１）
Ｎ−メチルイソチアゾロン（ロッシュ社製）、グリセロールキナーゼ（セルロモナス・エスピー由来 東洋紡績社製ＧＹＫ−３０１）を添加した下記の中性脂肪測定試薬 第一試液を２５℃で１週間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。比較例ではグリセロールキナーゼをセルロモナス・エスピー由来にかえてサーマス・フラーバス由来（東洋紡績社製）を用いた。
【００５２】
（試薬の調製）
下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬を調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ６．６
ＭｇＣｌ２ ０．２ｇ／Ｌ
アデノシン３リン酸２Ｎａ塩 ０．９ｇ／Ｌ
エマルゲンＡ６０ ２ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
グリセロールキナーゼ ３Ｕ／ｍＬ
グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製） ２００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−メチルイソチアゾロン １００ｍｇ／Ｌ
【００５３】
【表１】
【００５４】
結果 表１に示す。比較例では約４０％まで活性が低下するのに対し、実施例では保存後も９０％以上の良好な安定性を示した。
【００５５】
（実施例２）
Ｎ−メチルイソチアゾロン（ロッシュ社製）、グリセロールキナーゼ（セルロモナス・エスピー由来 東洋紡績社製ＧＹＫ−３０１）を添加した下記のマグネシウム測定試薬 第二試液を２５℃で１週間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。比較例ではグリセロールキナーゼをセルロモナス・エスピー由来にかえてサーマス・フラーバス由来（東洋紡績社製）を用いた。
【００５６】
（試薬の調製）
下記組成からなるマグネシウム測定試薬の第二試薬を調製した。
第ニ試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ６．８
エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム ３ｇ／Ｌ
アデノシン２リン酸２Ｎａ塩 ０．５ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
グリセロールキナーゼ ６Ｕ／ｍＬ
グリセリン ０．４ｇ／Ｌ
Ｎ−メチルイソチアゾロン １００ｍｇ／Ｌ
【００５７】
【表２】
【００５８】
結果 表２に示す。比較例では約６０％まで活性が低下するのに対し、実施例では保存後も９０％以上の良好な安定性を示した。
【００５９】
（実施例３）
実施例１の中性脂肪測定試薬の第一試液に対し、第二試薬として下記試薬を組み合わせて下記測定法にて各々の試薬にてグリセロール５０００ｍｇ／ｄＬ（トリオレイン換算値）の希釈１０水準、および中性脂肪３０００ｍｇ／ｄＬの希釈１０水準を測定し、グリセロール消去能および高値測定限界を算出し、２５℃、１週間保存前に対する保存後の性能を相対値（％）で示した。尚、グリセロール消去能の判定は測定値として３ｍｇ／ｄＬ以下となるグリセロール希釈水準の最高濃度を消去能範囲と判定し、高値測定限界は測定値が真値に対し９５〜１０５％の回収率の範囲となる濃度とした。
【００６０】
（試薬の調製）
下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第二試薬をそれぞれ調製した。
第ニ試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
塩化マグネシウム・６水和物 ０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｇ／Ｌ
ＡＤＰＳ ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ２．９Ｕ／ｍＬ
リパーゼ（東洋紡社製ＬＰＬ−３１４） ２Ｕ／ｍＬ
【００６１】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料２．１μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および２００ｍｇ／ｄＬトリオレイン水溶液の測定吸光度より算出し中性脂肪濃度として求めた。
【００６２】
【表３】
【００６３】
結果 表３に示す。比較例ではグリセロール消去能が４０％、高値測定限界は３５％の低下を示したのに対し、実施例ではグリセロール消去能が、高値測定限界とも９０％以上でほぼ低下はみられなかった。
【００６４】
（実施例４）
実施例２のマグネシウム測定試薬の第一試液に対し、第二試薬として下記試薬を組み合わせて下記測定法にて各々の試薬にてマグネシウム ５ｍｇ／ｄＬ水溶液を測定し、測定感度を算出し、２５℃、１週間保存前に対する保存後の感度を相対値（％）で示した。
【００６５】
（試薬の調製）
下記組成からなるマグネシウム測定試薬の第一試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ６．８
エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム ３ｇ／Ｌ
アデノシン３リン酸２Ｎａ塩 １．５ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
ＴＯＤＢ ０．２ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ５μｍｏｌ／Ｌ
グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３１１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
【００６６】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料５．８μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および５ｍｇ／ｄＬマグネシウム水溶液の測定吸光度より算出しコレステロール濃度として求めた。
【００６７】
【表４】
【００６８】
結果 表４に示す。比較例では感度が３２％低下を示したのに対し、実施例ではほぼ低下はみられなかった。
【００６９】
（実施例５）
実施例３の中性脂肪測定試薬の第一試液、第二試薬を組み合わせて、調製直後、１０℃、１２ヶ月保存後の管理血清値（ＬコンセーラＮおよびＬコンセーラＡＮ）を測定し、保存後の血清値を調製直後の血清値に対する相対値（％）として求めた。
【００７０】
【表５】
【００７１】
結果 表５に示す。比較例では感度がなくなり血清値の算出は不能であった。実施例ではＬコンセーラＮで１０３％、ＬコンセーラＡＮで９９．３％と保存前後の血清値の変動はほぼみられなかった。
【００７２】
（実施例６）
Ｎ−メチルイソチアゾロン（ロッシュ社製）、グリセロールキナーゼ（サーマス・フラバス由来 東洋紡績社製ＧＹＫ−３１１、ストレプトマイセス・カヌス由来 Ｇｅｎｚｙｍｅ社、ジオトリカム・キャンディダム由来 Ｒｏｃｈｅ社、バチルス・ステアロサーモフィラス由来 Ｒｏｃｈｅ社）を添加した実施例１の中性脂肪測定試薬 第一試液を９℃および３５℃で２週間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。試薬に５ｇ／Ｌのシュークロースを添加した場合と、そうでない場合の２通りで検討し、防腐剤無添加の場合と比較した。
【００７３】
（試薬の調製）
下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬を調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ６．６
ＭｇＣｌ２ ０．２ｇ／Ｌ
アデノシン３リン酸２Ｎａ塩 ０．９ｇ／Ｌ
エマルゲンＡ６０ ２ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
グリセロールキナーゼ ３Ｕ／ｍＬ
グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製） ２００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−メチルイソチアゾロン １００ｍｇ／Ｌ
【００７４】
【表６】
【００７５】
【表７】
【００７６】
結果 表６および表７に示す。防腐剤を添加した場合、ジオトリカム・キャンディダム由来の酵素は調製直後にすでに酵素活性を失っていた。９℃保存においては、ストレプトマイセス・カヌス由来の酵素がこの中では比較的安定であった。一方３５℃保存においては、サーマス・フラバス由来の酵素とバチルス・ステアロサーモフィラス由来の酵素が比較的安定であった。シュークロースを添加した場合は、とくに３５℃におけるサーマス・フラバス由来の酵素とバチルス・ステアロサーモフィラス由来の酵素をさらに安定化する働きが見られた。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の生体成分測定方法および試薬は、防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に濁りが発生しない等、各種性能低下がないこと等の特性を持つため、臨床検査分野で用いられる診断薬として優れており、産業界に寄与することが大である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は中性脂肪またはマグネシウムの測定方法およびその試薬に関する。特に臨床診断に用いられる生体成分中の中性脂肪測定試薬またはマグネシウム測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査分野で用いられる診断薬として酵素反応を利用した生化学的測定試薬がある。本試薬では、酵素が溶液中で不安定なため、酵素および酵素以外の不安定物質を凍結乾燥し、使用前に溶解液で溶解し使用していた。このため、製造側では凍結乾燥を行うことからコスト、製造時間がかかり、また使用者側では溶解の手間がかかるという問題があった。これに対し、近年、生化学検査の分野において調製不要の無調製液状試薬が開発され凍結乾燥に伴う問題点を解決した。本液状試薬は種々の方法により原料酵素、補酵素等の安定化を行うことで、溶液状態で長期間保存可能な試薬として完成され、現在では国内の生化学的測定試薬市場では主流になっている。
【０００３】
無調製液状試薬の開発において、従来の凍結乾燥試薬から新たに加えるべき開発のポイントの１つに流通時の防腐能の向上があった。防腐能の向上のためには、種々の添加剤が検討されており成果が報告されている（例えば、特許文献１参照）。ところが、防腐剤の選択においては、抗菌力および防腐剤自身の長期安定性などの防腐性能への配慮もさることながら、一方で、原料酵素、補酵素の安定性への影響が無視できず、実際には防腐剤と酵素の相性により防腐剤が成分酵素等を劣化させ、精密性、正確性などの試薬性能に少なからず影響を与える場合があることがわかってきている。このように、十分な防腐性能と試薬の安定性を両立させることは非常に困難な課題である。
【特許文献１】特公平７−７８００５
【０００４】
防腐剤により測定試薬の性能が劣化する試薬として、中性脂肪測定試薬、マグネシウム測定試薬がある（例えば、特許文献２および３参照。）。中性脂肪の測定は、一般に中性脂肪にリパーゼおよびグリセロールキナーゼを作用させて生成したグリセロリン酸またはＡＤＰを測定して行なう。なかでも、グリセロリン酸にグリセロリン酸オキシダーゼを作用させることにより生じた過酸化水素を、ペルオキシダーゼの下で色原体に作用させてキノン色素を生成させる方法が汎用されている。また自動分析機などを用いて２試薬系で測定する場合、第一試薬にアスコルビン酸オキシダーゼを添加しておき、測定を妨害する物質であるアスコルビン酸を消去することも当該分野であればよく行なわれる。また、内因性のグリセロールを消去するためにカタラーゼを添加することも当該分野であればよく行なわれる。
マグネシウムの測定試薬は、一般にマグネシウムにより活性化したグリセロールキナーゼ活性を生成するグリセロリン酸またはＡＤＰを測定して行う。
【特許文献２】特公昭５８−５６７７
【特許文献３】特開昭６４−３０５９７
【０００５】
これらの測定試薬においては複数の酵素が用いられるが、ペルオキシダーゼなど相対的に防腐剤からの影響を受けにくいものもあれば、グリセロールキナーゼなど影響を大きく受ける酵素もある。中性脂肪測定試薬のようないわゆる生化学診断薬と呼ばれる試薬群において、ペルオキシダーゼは酵素として単独で用いられることはほとんどなく多段階反応で他の酵素と共役して用いられるため、試薬としての防腐剤耐性は最も耐性のない酵素に依存する。したがって、ペルオキシダーゼのみの防腐剤耐性が高くても試薬としての有用性はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、防腐剤に対して高い耐性を有し、かつその測定試薬の精密性、正確性を長期間維持する中性脂肪測定試薬およびマグネシウム測定試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するために、試薬中の酵素や色素などの成分と防腐剤との相互作用について考察し、鋭意検討した結果、適切な酵素と防腐剤の組み合わせを選択することにより、試薬中の成分酵素が防腐剤により劣化することで中性脂肪測定試薬においては保存中に濁りが発生する、反応中に試薬ブランクが上昇する、内因性の遊離グリセロールの消去能が低下する、高値測定限界が低下することで、マグネシウム測定試薬においては保存中に濁りが発生する、反応中に試薬ブランクが上昇する、感度が低下する、高値測定限界が低下することで測定試薬の精密性、正確性を低下させていることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に濁りが発生しないことを特徴とする中性脂肪測定方法
（２）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に試薬ブランクの上昇がないことを特徴とする中性脂肪測定方法
（３）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的にグリセロール消去能が低下しないことを特徴とする中性脂肪測定方法
（４）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に高値測定限界が低下しないことを特徴とする中性脂肪測定方法
（５）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に濁りが発生しないことを特徴とするマグネシウム測定方法
（６）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に試薬ブランクの上昇がないことを特徴とするマグネシウム測定方法
（７）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に感度が低下しないことを特徴とするマグネシウム測定方法
（８）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に濁りが発生しないことを特徴とする中性脂肪測定試薬
（９）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に試薬ブランクの上昇がないことを特徴とする中性脂肪測定試薬
（１０）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的にグリセロール消去能が低下しないことを特徴とする中性脂肪測定試薬
（１１）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に高値測定限界が低下しないことを特徴とする中性脂肪測定試薬
（１２）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に濁りが発生しないことを特徴とするマグネシウム測定試薬
（１３）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に試薬ブランクの上昇がないことを特徴とするマグネシウム測定試薬
（１４）防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に感度が低下しないことを特徴とするマグネシウム測定試薬
【０００８】
別の表現では、本発明は以下のような構成からなる。
［１］
防腐剤の存在下において、保存中に継続して、防腐性能効果と試薬性能低下の抑制が両立していることを特徴とする、中性脂肪測定方法
［２］
試薬性能低下の抑制が、次から選ばれる少なくとも１つである、［１］の方法
（１）実質的に濁りが発生しないこと
（２）実質的に試薬ブランクの上昇がないこと
（３）実質的にグリセロール消去能が低下しないこと
（４）実質的に高値測定限界が低下しないこと
（５）実質的に試薬に含まれる酵素活性が低下しないこと
［３］
防腐剤の存在下において、保存中に継続して、防腐性能効果と試薬性能低下の抑制が両立していることを特徴とする、マグネシウム測定方法
［４］
試薬性能低下の抑制が、次から選ばれる少なくとも１つである、［３］の方法
（１）実質的に試薬ブランクの上昇がないこと
（２）実質的に感度が低下しないこと
（３）実質的に試薬に含まれる酵素活性が低下しないこと
［５］
防腐剤が、蛋白質に直接作用する防腐剤である、［１］〜［４］のいずれか１に記載の方法
［６］
防腐剤の存在下において、保存中に継続して、防腐性能効果と試薬性能低下の抑制が両立していることを特徴とする、中性脂肪測定試薬
［７］
防腐剤の存在下において、保存中に継続して、防腐性能効果と試薬性能低下の抑制が両立していることを特徴とする、マグネシウム測定試薬
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、防腐剤に対して高い耐性を有し、かつその測定試薬の精密性、正確性を長期間維持する中性脂肪測定試薬およびマグネシウム測定試薬を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてリパーゼ、ペルオキシダーゼ等を含有する２試薬系からなる中性脂肪測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ保存中に濁りが発生しない中性脂肪測定方法である。
【００１１】
防腐剤として抗生物質を使用する場合、微生物が比較的容易に、当該物質の膜透過性を抑制したり、当該物質を分解し無毒化する能力を獲得することができるため、耐性菌の発生を招き、実質的に試薬の防腐効果を失うことがよくあると考えられる。一方、蛋白質に直接作用することができる防腐剤は、微生物が耐性を得ることが難しいと考えられる点でより好ましく、今後汎用されていく可能性が高い。しかし、このような蛋白質に直接作用する防腐剤は当然、共存する酵素蛋白質にも作用するため、蛋白質の構造によっては不安定化を招く可能性がある。このように、防腐剤に対する耐性は、その防腐剤の作用機構と蛋白質の構造の両面に起因すると考えられる。
【００１２】
このような防腐剤としては、特に限定されるものではないが、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン−ヒドロクロリド（Ｎ−メチルイソチアゾロン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ）とも称する。略称ＭＩＴ）などのイソチアゾリン系化合物、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（略称ＨＰＯ）、クロルアセトアミド（略称ＣＡＡ）、｛Ｎ，Ｎ−メチレン−ビス［（Ｎ−１−ヒドロキシメチル）−２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル］｝−尿素（略称ＩＺＵ）及び５−ブロム−５−ニトロ−１，３−ジオキサン（略称ＢＮＤ）などが挙げられる。
【００１３】
これらを用いる場合は、できるだけ少ない種類を用いることが好ましい。より好ましくは１種類を用いることが好ましい。理由は、中性脂肪測定試薬やマグネシウム測定試薬のような多段階の反応を追随させる測定系においては多くの酵素や色素などの要素を必要とするが、防腐剤が各要素に与える影響はそれぞれの防腐剤によって異なると考えられるため、影響を受ける要素数をできるだけ少なくするためである。
【００１４】
たとえば中性脂肪測定試薬の場合、ＢＮＤやＭＩＴが共存するとグリセロールキナーゼがダメージを受ける場合がある。また、ＩＺＵが共存するとグリセロリン酸オキシダーゼがダメージを受ける場合がある。また、ＨＰＯが共存するとアスコルビン酸オキシダーゼがダメージを受ける場合がある。また、ＣＡＡが共存すると発色反応のタイムコースに影響が出る場合があるがこれは４−アミノアンチピリンを劣化させるためであると考えられる。したがって、例えば上記ＭＩＴ、ＨＰＯ、ＣＡＡ、ＩＺＵおよびＢＮＤの中から適切な防腐剤を選択する場合、複数の防腐剤を用いるとすると多くの要素に与える影響に対処しなければならないが、１種のみ使用する場合は１つの要素に対処するだけでよい。例えばＭＩＴを使用する場合は、グリセロールキナーゼへの対処だけで済む。他の防腐剤についても同様である。
【００１５】
本発明において特に好ましい防腐剤として、蛋白質のＳＨ基やアミノ基に作用すると言われているイソチアゾリン系化合物が挙げられる。例えば２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（または、Ｎ−メチルイソチアゾロン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ、略称ＭＩＴ））、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（ＣＭＩＴ）、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン（ＢＩＴ）等や、その誘導体などが挙げられる。これらは、混合物としてプロクリン１５０（スペルコ製）、プロクリン３００（スペルコ製）、アクチサイドＭＢＳ（ソー・ジャパン製）、単一製品としてアクチサイドＢ２０（Ｎ）（ソー・ジャパン製）、ＭＩＴ（ロシュ製、シグマ製）等が一般に市販されている。なお、既述の理由により試薬中にイソチアゾリン系化合物以外の防腐剤を添加しない態様がさらに好ましい。本発明の中性脂肪測定方法において、イソチアゾリン系化合物は防腐能、試薬の安定性に与える影響のいずれの点においても優れている。
【００１６】
本発明に用いる防腐剤とは、試薬を保存している間の微生物の増殖を抑制することを目的として、試薬に添加される物質をいう。このときの防腐剤の添加濃度は特に限定されるものではないが、十分な防腐性能効果が得られる濃度であることが望ましい。防腐剤の添加濃度は、防腐剤の種類や添加する試薬の組成などによって異なるのは当然であり、適当な添加濃度の決定は当業者が適宜実施できることである。十分な防腐能を有し診断薬用途に用いられる濃度範囲であれば特に限定されないが、例えば溶液中の下限濃度として０．０００１％、好ましくは０．００１％、更に好ましくは０．０１％である。上限濃度として１％、好ましくは０．５％、更に好ましくは０．１％である。
【００１７】
十分な防腐性能効果とは、例えば次の抗菌試験により菌の増殖がないことで効果をみることができる。抗菌試験方法は、被検試薬として防腐剤を添加した測定試薬を用い、これを３５℃、１週間または２週間保存する。本試薬にブレインハートインフュージョン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を終濃度で３９ｇ／Ｌになるように添加混合し被検試薬とする。菌液はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｒｉｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属等の標準菌株または抗生物質に対する耐性を獲得した菌株を生理食塩水に懸濁し目安として６６０ｎｍの吸光度が０．５Ａｂｓになるように調製する。本菌液を被検試薬４ｍＬに対し５０μＬ接種した後、２５または３７℃で３日間振とうする。判定は被検試薬の６６０ｎｍにおける吸光度を保存前後で比較し有意に吸光度の増加がある場合を防腐効果なしと判定し、吸光度の変動に有意差がない場合、菌の増殖がないと判断し防腐効果ありと判定する。
【００１８】
防腐剤に対する高い耐性とは、防腐剤の存在下において、保存中に継続して、防腐性能効果と試薬性能低下の抑制が両立していることを指す。例えば、ある組成物に、耐性を試験したい防腐剤を添加し、保存中に、実質的に正確性、精密性、測定レンジなどの試薬性能低下が抑制され、かつ、実質的に浮遊物や沈殿物の発生が抑制されている状態であれば、その試薬は該防腐剤に対して高い耐性を有すると言える。この定義において、保存温度、保存期間は、当業者の常識の範囲で任意に設定できる。通常、２〜１０℃で０．５年以上、好ましくは１年以上、さらに好ましくは１．５年以上、あるいは室温（２５℃付近）で０．５年以上で行うことが好ましいが、評価を実施する場合は加速試験として、３５〜３７℃で１週間以上で代替することも可能である。その場合、試験の条件、期間は、必要により適宜変更することができる。
【００１９】
防腐剤共存下における試薬性能の低下により、中性脂肪測定試薬においては、保存中に濁りが発生する、反応中に試薬ブランクが上昇する、内因性の遊離グリセロールの消去能が低下する、高値測定限界が低下することなどが、現象としてみられる。マグネシウム測定試薬においては、保存中に濁りが発生する、反応中に試薬ブランクが上昇する、感度が低下する、高値測定限界が低下する、などの現象がみられる。防腐剤に対する耐性のうち試薬性能低下が抑制されているかどうかは、これらの現象の推移を見ることによって評価できる。
【００２０】
これらの現象は酵素や色素など種々の要素の劣化によりもたらされると考えられる。内因性の遊離グリセロールの消去能低下や、高値測定限界の低下は、酵素の失活により多段階の酵素反応の少なくとも１つの反応の速度が遅くなることにより、反応の追随が遅れることが主な原因である。中性脂肪測定試薬では、グリセロール消去に関与する酵素はグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、カタラーゼが例示される。また、測定に関与する酵素は、リパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼが例示される。また、保存中の濁り発生、反応中の試薬ブランク上昇は、酵素蛋白質が失活により変性し不溶化することが主な原因であるが、濁りの場合はさらに界面活性剤や塩類など他の物質が防腐剤の作用を受け不溶化している場合もありうるし、ブランク上昇の場合はさらに色素類が防腐剤の作用を受け自己縮合している場合もありうる。
【００２１】
従来、防腐剤としてイソチアゾリン系化合物を用いた場合は、主として、グリセロールキナーゼが防腐剤により劣化することによりもたらされてきたと考えられる。したがって、例えば本発明において防腐剤としてイソチアゾリン系化合物を用いた場合、防腐剤に対する耐性のうち試薬性能低下が抑制されているかどうかは、濃度が０．１〜２０Ｕ／ｍＬのグリセロールキナーゼの、防腐剤による劣化を見ることによっても評価できる。試薬性能低下が抑制されているかどうかは、「実質的に試薬に含まれる酵素活性が低下しない」かどうかで判断する。防腐剤１００ｍｇ／Ｌの濃度で２５℃、１週間共存させた時のグリセロールキナーゼ活性残存率が７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上である。特定の防腐剤に対する効果を評価したい場合は、評価対象の試薬組成物に上記濃度の防腐剤を添加した後、上記条件で保存した前後の酵素活性を比較すればよい。
【００２２】
上記のように、使用する防腐剤の種類によって、酵素に与える影響がそれぞれ異なることから、防腐剤に対する耐性のうち試薬性能低下が抑制されているかどうかは、当該防腐剤が影響を与える酵素を適宜選択してグリセロールキナーゼと同様に評価することができる。指標となる酵素としては、特に限定されないが、中性脂肪測定試薬においては、リパーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ等が好ましく選択可能である。試薬性能低下が抑制されているかどうかは、防腐剤１００ｍｇ／Ｌの濃度で２５℃、１週間共存させた時の酵素活性残存率が７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上である。以上のことはマグネシウム測定試薬についても同様である。
【００２３】
本発明において、「実質的に濁りが発生しない」とは、全く濁りが生じないか又はほとんど濁りが生じず、一定のレベル以下に抑えられていることを意味する。「一定レベル」は当業者常識により適宜決定されるが、一般には、試薬の規格（製品規格、出荷規格など）を満足するレベルであればよい。保存中の濁りを評価する方法としては、目視、６６０ｎｍの吸光度測定、あるいは、パーティクルカウンター（クラボウ社製）による測定などにより評価することができる。中でも最小検出感度の観点からパーティクルカウンターが好ましい。パーティクルカウンターでの５〜１５０μｍの総カウント数は１０００個／ｍＬ以下、好ましくは５００個／ｍＬ以下、更に好ましくは１００個／ｍＬ以下が良い。測定結果の判定には、定量検査や分析化学の領域で用いられている評価法等、従来用いられている任意の検定方法を適宜採用することができる。
【００２４】
本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてリパーゼ、ペルオキシダーゼ等を含有する２試薬系からなる中性脂肪測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ保存中に試薬ブランクの上昇がない中性脂肪測定方法である。
【００２５】
本発明において、試薬ブランクは、精製水または測定対象を含まない試料を測定した時の測定終了時点の、測定波長により測定された吸光度をいう。「実質的に試薬ブランクの上昇がない」とは、全くブランクの上昇がないか又はほとんど上昇がなく、一定のレベル以下に抑えられていることを意味する。本発明における試薬ブランクの保存前に対する保存後の上昇は０．１Ａｂｓ以下であるが、好ましくは０．０５Ａｂｓ以下、更に好ましくは０．０１Ａｂｓ以下である。測定結果の判定には、定量検査や分析化学の領域で用いられている評価法等、従来用いられている任意の検定方法を適宜採用することができる。
【００２６】
本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてリパーゼ、ペルオキシダーゼ等を含有する２試薬系からなる中性脂肪測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ保存中にグリセロール消去能が低下しない中性脂肪測定方法である。
【００２７】
本発明において、グリセロール消去能は、中性脂肪の測定において試料中に含まれると妨害要因となる遊離のグリセロールを中性脂肪の測定の前に反応に関与しない物質に変換する（消去）する能力のことをいう。「実質的にグリセロール消去能が低下しない」とは、全く消去能が低下しないか又はほとんど低下せず、一定のレベル以上に抑えられていることを意味する。「一定レベル」は当業者常識により適宜決定されるが、一般には、試薬の規格を満足するレベルであればよい。通常トリオレイン換算で１００ｍｇ／ｄＬあれば十分だが、好ましくは２０００ｍｇ／ｄＬ以上であり、更に好ましくは３５００ｍｇ／ｄＬ以上である。この条件下で、本発明におけるグリセロール消去能の保存前に対する保存後の低下は３０％以下であるが、好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下である。
【００２８】
グリセロール消去能は、好ましくは次のように判断する。
（１）グリセロール（ナカライテスク社製）を精製水で濃度が等間隔になるよう希釈し１０水準以上の希釈系列を作製する。
（２）中性脂肪測定試薬を用いて上記の試料を各２回以上ずつ測定し平均値を算出する。測定は日立７１７０形自動分析機を用いる。試料２．１μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とする。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とする。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとり２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定する。吸光度測定結果は、精製水および２００ｍｇ／ｄＬトリオレイン水溶液の測定吸光度より算出し中性脂肪濃度として求める。
（３）完全に消去されていれば測定値はゼロになるはずである。各水準のトリオレインの測定値をプロットして、どこまでゼロを保っているかをみる。測定値が１０ｍｇ／ｄＬを超えた場合（２００ｍｇ／ｄＬトリオレインの５％）はこの濃度水準を含めそれ以上の濃度ではグリセロール消去能がないと判定し、１水準下の濃度をグリセロール消去能とする。
【００２９】
本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてリパーゼ、ペルオキシダーゼ等を含有する２試薬系からなる中性脂肪測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ高値測定限界が低下しない中性脂肪測定方法である。
【００３０】
本発明において、高値測定限界は、中性脂肪高値試料を段階希釈した試料を測定した場合、その測定値が希釈系列に対し比例関係にある濃度の最高値のことをいう。
「実質的に高値測定限界が低下しない」とは、全く測定限界が低下しないか又はほとんど低下せず、一定のレベル以上に抑えられていることを意味する。「一定レベル」は当業者常識により適宜決定されるが、一般には、試薬の規格を満足するレベルであればよい。通常トリオレイン換算で１５００ｍｇ／ｄＬあれば十分だが、好ましくは２０００ｍｇ／ｄＬ以上であり、更に好ましくは２５００ｍｇ／ｄＬ以上である。この条件下で、本発明における高値測定限界の保存前に対する保存後の低下は３０％以下である、好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下である。
【００３１】
高値測定限界は、好ましくは次のように判断する。
（１）トリオレイン（ナカライテスク社製）を精製水で濃度が等間隔になるよう希釈し１０水準以上の希釈系列を作製する。
（２）中性脂肪測定試薬を用いて上記の試料を各２回以上ずつ測定し平均値を算出する。測定は日立７１７０形自動分析機を用いる。試料２．１μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とする。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とする。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとり２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定する。吸光度測定結果は、精製水および２００ｍｇ／ｄＬトリオレイン水溶液の測定吸光度より算出し中性脂肪濃度として求める。
（３）各水準のトリオレインの測定値を第一水準の測定値で割った値をプロットして、どこまで比例関係を保っているかをみる。理論値の±５％を外れたときはこの濃度水準を含めそれ以上の濃度では直線性がないと判定し、１水準下の濃度を高値測定限界とする。
【００３２】
また、本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロール等を含有する２試薬系からなるマグネシウム測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ保存中に濁りが発生しないマグネシウム測定試薬である。
【００３３】
また、本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロール等を含有する２試薬系からなるマグネシウム測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ保存中に試薬ブランクの上昇がないマグネシウム測定試薬である。
【００３４】
本発明における試薬ブランクの保存前に対する保存後の上昇は０．１Ａｂｓ以下であるが、好ましくは０．０５Ａｂｓ以下、更に好ましくは０．０１Ａｂｓ以下である。
【００３５】
また、本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロール等を含有する２試薬系からなるマグネシウム測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ保存中に感度が低下しないマグネシウム測定試薬である。
【００３６】
本発明において、感度とは、定量性が保証される範囲の既知濃度の試料を測定した場合の吸光度から試薬ブランク吸光度を差し引いた吸光度のことをいう。
「実質的に感度が低下しない」とは、全く感度が低下しないか又はほとんど低下せず、一定のレベル以上に抑えられていることを意味する。「一定レベル」は当業者常識により適宜決定されるが、一般には、試薬の規格を満足するレベルであればよい。この条件下で、本発明における感度の保存前に対する保存後の低下は３０％以下であるが、好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下である。
【００３７】
さらに、本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてリパーゼ、ペルオキシダーゼ等を含有する２試薬系からなる中性脂肪測定方法であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ、さらに次の［１］〜［４］のうち２つ以上を満たす中性脂肪測定方法である。［１］保存中に実質的に濁りが発生しない、［２］保存中に実質的に試薬ブランクの上昇がない、［３］保存中に実質的にグリセロール消去能が低下しない、［４］保存中に実質的に高値測定限界が低下しない。
【００３８】
また、本発明の一実施態様は、第一試薬としてグリセロリン酸オキシダーゼ等を含有し、第二試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロール等を含有する２試薬系からなるマグネシウム測定試薬であって、防腐剤に対する高い耐性があり、かつ、さらに次の［１］〜［３］のうち２つ以上を満たすマグネシウム測定方法である。［１］保存中に実質的に濁りが発生しない、［２］保存中に実質的に試薬ブランクの上昇がない、［３］保存中に実質的に感度が低下しない。
【００３９】
本発明に用いるグリセロールキナーゼとは、ＥＣ２．７．１．３０に分類される以下の反応を触媒する酵素が含まれる。
グリセロール＋ＡＴＰ＋Ｍｇ→グリセロール−３−ホスフェート＋ＡＤＰ＋Ｍｇ
本発明に用いるグリセロールキナーゼとして好ましいのは、防腐剤に対する耐性が防腐剤１００ｍｇ／Ｌの濃度で２５℃、１週間共存させた時のグリセロールキナーゼ活性残存率が７０％以上１００％以下、好ましくは８０％以上１００％以下、更に好ましくは９０％以上１００％以下のものである。
【００４０】
このような酵素は、その起源は特に限定されない。動物起源であれば、ヒト、ラット肝、ハト肝などが例示される。また、酵母・微生物などの微生物であれば、サッカロマイセス属（例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、キャンディダ属（例えばキャンディダ・ミコデルマ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｙｃｏｄｅｒｍａ））、バチルス属（例えばバチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、サーマス属（例えばサーマス・フラーバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ））、セルロモナス属（例えばセルロモナス・フラビゲナ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖｉｇｅｎａ）、セルロモナス・エスピー（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．））、エシェリヒア属（例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、アースロバクター属（例えばアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．））、フラボバクテリウム属（例えばフラボバクテリウム・メニンゴセプティクム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ））、ストレプトマイセス属（例えばストレプトマイセス・カヌス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｃａｎｕｓ））、ジオトリカム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）などが挙げられる。これらはいずれも市販のものなどを使用することができる。
【００４１】
これらのうち、防腐剤、特に蛋白質に直接作用する防腐剤と共存していても試薬の安定性を維持すると言う点で好ましく用いられるのは、セルロモナス属、フラボバクテリウム属（フラボバクテリウム・メニンゴセプティクム）、アースロバクター属（アースロバクター・エスピー）、サーマス属、バチルス属（バチルス・ステアロサーモフィラス）のものである。さらに好ましくは、セルロモナス属、サーマス属、バチルス属（バチルス・ステアロサーモフィラス）のものである。最も好ましくは、セルロモナス・エスピーから抽出されたものが用いられる。上記の酵素は、これらの遺伝子を他の微生物に組み込まれた遺伝子組換え微生物より製造されたものを含む。
【００４２】
上記のような差が生じる理由の１つとしては、反応を受けやすい部分、例えば酵素タンパク質がもつシステインやメチオニンなどの含硫アミノ酸残基の、個数とその位置に起因することが考えられる（例えばサーマス・フラバス由来のグリセロールキナーゼのアミノ酸配列については、特許文献４を参照）。このことを示唆するものとして、ザルコシンオキシダーゼにおいて、システイン残基を他のアミノ酸に置換することにより種々の物質に対する安定化を達成している事例が挙げられる（たとえば、特許文献５参照）。したがって、含硫アミノ酸を含む酵素、とくに酵素表面に含硫アミノ酸が存在する場合、とりわけ活性中心や補酵素や基質結合部位近傍に含硫アミノ酸が存在する場合、防腐剤などの化学物質の影響をより受けやすいことが示唆される。また、含硫アミノ酸の個数についてはその他の条件に大きな差がなければ原則として少ない方が防腐剤耐性があると考えられる。
【特許文献４】特開平１１−９２７９号公報
【特許文献５】特許第３１３２６１８号公報
【００４３】
該グリセロールキナーゼの濃度下限は、通常０．０５Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１Ｕ／ｍＬである。一方上限は、通常２０Ｕ／ｍＬ、好ましくは５Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは２Ｕ／ｍＬである。
【００４４】
本発明に用いる緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。なかでも、トリス緩衝液、リン酸緩衝液は濃度、温度によってｐＨが変動しやすいが、安価であるという利点がある。一方、ｐＨの変動等が小さいＧＯＯＤ緩衝液はＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示される。これらはいずれも市販のものなどを使用することができる。
【００４５】
本発明のｐＨとしては、酵素を不安定化する範囲でなければ特に限定されない。該緩衝液のｐＨ下限は好ましくは５であるが、さらに好ましくは５．５である。ｐＨ上限は好ましくは９であるが、さらに好ましくは８である。中性脂肪測定試薬の場合、ｐＨ６〜７．５、さらには６〜７の弱酸性域が、グリセロリン酸オキシダーゼおよびアスコルビン酸オキシダ−ゼの反応至適ｐＨであることからさらに好ましい。
【００４６】
本発明の測定試薬には、さらに界面活性剤、糖類、キレート剤、補酵素などを添加してもよい。界面活性剤としては非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤などが挙げられる。糖類としては、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンおよびその誘導体等が挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。補酵素としては、フラビンアデニンジヌクレオチド等が挙げられる。これらはいずれも市販のものなどを使用することができる。これらの添加目的は特に限定されないが、酵素や試薬の安定化効果を有する種類、濃度であることが好ましい。また、添加物自身が防腐剤による劣化を受けない種類、濃度であることが好ましい。
【００４７】
本発明の測定試薬には測定上必要な他の試薬が含まれていてもよい。中性脂肪測定試薬としては、例えばリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ＡＴＰ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色源体が含有されうる。また、例えばリパーゼ、グリセロールキナーゼ、ＡＴＰ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが含有されうる。また、マグネシウム測定試薬としては、一般にグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ＡＴＰ、キレート剤、ペルオキシダーゼ、色源体が含有されうる。
【００４８】
上記種々の成分の中で、特にリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ＡＴＰ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色源体を用いる中性脂肪測定試薬、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ＡＴＰ、キレート剤、ペルオキシダーゼ、色源体を用いるマグネシウム測定試薬については、本発明により特に好ましい効果が得られる。
【００４９】
さらに、本願発明においては糖類を添加してもよい。糖類としては、単糖、二糖、オリゴ糖、環状オリゴ糖などの中から適宜選択され、特に限定されるものではない。例えばキシロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、メリビオース、リビトース、イノシトール、ズルシトール、グルシトール、グルコノ−１，５−ラクトン、Ｇ２−β−サイクロデキストリン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノコレート等が挙げられる。中でもシュークロースを骨格とする化合物、例えばシュークロース、ラクトシュークロース、ラフィノース、イヌロオリゴ糖類、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノコレート等が好適に用いられる。中でもシュークロースが好ましい。いずれも、市販のものなどを使用することができる。糖類の添加濃度には特に制限はないが、好ましくは、防腐剤に対して、０．０１倍量（Ｗ／Ｗ）以上であり、好ましい下限は０．０５倍量（Ｗ／Ｗ）、好ましい上限は５００倍量（Ｗ／Ｗ）である。とくにイソチアゾリン系化合物を防腐剤として用いる場合に耐性（安定化効果）が高まり、好ましい。
【００５０】
グリセロールキナーゼの活性測定は以下の測定条件で行うのが好ましい。
グリセロールを基質とし、グリセロール−３−リン酸の生成量によって酵素活性を測定した。０．５％４―アミノアンチピリン水溶液０．２ｍｌ、１．５％フェノール水溶液０．２ｍｌ、グリセロールー３―リン酸酸化酵素２００Ｕ、ペルオキシダーゼ８０Ｕ、ＡＴＰ４８．４ｍｇに０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．９）を加え、総量２１ｍｌとし、これを以下の測定のための原液とした。各反応は、この測定原液を３ｍｌ取り、０．３Ｍグリセロール水溶液５０μｌ、酵素溶液１００μｌを添加し、混和後、３７℃に制御された分光光度計で５００ｎｍの吸光度を３分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化を求めた（ΔＯＤｔｅｓｔ）。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液（０．２％牛血清アルブミンを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７．５）を１００μｌ加え上記同様に操作を行って１分間当りの吸光度変化量を求めた（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。
得られた吸光度変化量より下記計算式に基づきグリセロールキナーゼの酵素活性を算出した。なお上記条件下で１分間に１マイクロモルのグリセロールをリン酸化する酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
計算式
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×３．１５（ｍｌ）×希釈倍率｝／｛１３．３×１／２×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍｌ）｝
３．１５ｍｌ＝反応混液液量
１３．３＝キノン色素の上記測定条件下でのミリモル吸光係数
１／２＝酵素反応で生成した過酸化水素の１分子から形成するキノン色素が１／２分子であることによる係数
１．０ｃｍ＝セルの光路長
０．１ｍｌ＝酵素サンプル液量
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１）
Ｎ−メチルイソチアゾロン（ロッシュ社製）、グリセロールキナーゼ（セルロモナス・エスピー由来 東洋紡績社製ＧＹＫ−３０１）を添加した下記の中性脂肪測定試薬 第一試液を２５℃で１週間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。比較例ではグリセロールキナーゼをセルロモナス・エスピー由来にかえてサーマス・フラーバス由来（東洋紡績社製）を用いた。
【００５２】
（試薬の調製）
下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬を調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ６．６
ＭｇＣｌ２ ０．２ｇ／Ｌ
アデノシン３リン酸２Ｎａ塩 ０．９ｇ／Ｌ
エマルゲンＡ６０ ２ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
グリセロールキナーゼ ３Ｕ／ｍＬ
グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製） ２００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−メチルイソチアゾロン １００ｍｇ／Ｌ
【００５３】
【表１】
【００５４】
結果 表１に示す。比較例では約４０％まで活性が低下するのに対し、実施例では保存後も９０％以上の良好な安定性を示した。
【００５５】
（実施例２）
Ｎ−メチルイソチアゾロン（ロッシュ社製）、グリセロールキナーゼ（セルロモナス・エスピー由来 東洋紡績社製ＧＹＫ−３０１）を添加した下記のマグネシウム測定試薬 第二試液を２５℃で１週間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。比較例ではグリセロールキナーゼをセルロモナス・エスピー由来にかえてサーマス・フラーバス由来（東洋紡績社製）を用いた。
【００５６】
（試薬の調製）
下記組成からなるマグネシウム測定試薬の第二試薬を調製した。
第ニ試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ６．８
エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム ３ｇ／Ｌ
アデノシン２リン酸２Ｎａ塩 ０．５ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
グリセロールキナーゼ ６Ｕ／ｍＬ
グリセリン ０．４ｇ／Ｌ
Ｎ−メチルイソチアゾロン １００ｍｇ／Ｌ
【００５７】
【表２】
【００５８】
結果 表２に示す。比較例では約６０％まで活性が低下するのに対し、実施例では保存後も９０％以上の良好な安定性を示した。
【００５９】
（実施例３）
実施例１の中性脂肪測定試薬の第一試液に対し、第二試薬として下記試薬を組み合わせて下記測定法にて各々の試薬にてグリセロール５０００ｍｇ／ｄＬ（トリオレイン換算値）の希釈１０水準、および中性脂肪３０００ｍｇ／ｄＬの希釈１０水準を測定し、グリセロール消去能および高値測定限界を算出し、２５℃、１週間保存前に対する保存後の性能を相対値（％）で示した。尚、グリセロール消去能の判定は測定値として３ｍｇ／ｄＬ以下となるグリセロール希釈水準の最高濃度を消去能範囲と判定し、高値測定限界は測定値が真値に対し９５〜１０５％の回収率の範囲となる濃度とした。
【００６０】
（試薬の調製）
下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第二試薬をそれぞれ調製した。
第ニ試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
塩化マグネシウム・６水和物 ０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｇ／Ｌ
ＡＤＰＳ ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ２．９Ｕ／ｍＬ
リパーゼ（東洋紡社製ＬＰＬ−３１４） ２Ｕ／ｍＬ
【００６１】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料２．１μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および２００ｍｇ／ｄＬトリオレイン水溶液の測定吸光度より算出し中性脂肪濃度として求めた。
【００６２】
【表３】
【００６３】
結果 表３に示す。比較例ではグリセロール消去能が４０％、高値測定限界は３５％の低下を示したのに対し、実施例ではグリセロール消去能が、高値測定限界とも９０％以上でほぼ低下はみられなかった。
【００６４】
（実施例４）
実施例２のマグネシウム測定試薬の第一試液に対し、第二試薬として下記試薬を組み合わせて下記測定法にて各々の試薬にてマグネシウム ５ｍｇ／ｄＬ水溶液を測定し、測定感度を算出し、２５℃、１週間保存前に対する保存後の感度を相対値（％）で示した。
【００６５】
（試薬の調製）
下記組成からなるマグネシウム測定試薬の第一試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ６．８
エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム ３ｇ／Ｌ
アデノシン３リン酸２Ｎａ塩 １．５ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
ＴＯＤＢ ０．２ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ５μｍｏｌ／Ｌ
グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３１１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
【００６６】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料５．８μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および５ｍｇ／ｄＬマグネシウム水溶液の測定吸光度より算出しコレステロール濃度として求めた。
【００６７】
【表４】
【００６８】
結果 表４に示す。比較例では感度が３２％低下を示したのに対し、実施例ではほぼ低下はみられなかった。
【００６９】
（実施例５）
実施例３の中性脂肪測定試薬の第一試液、第二試薬を組み合わせて、調製直後、１０℃、１２ヶ月保存後の管理血清値（ＬコンセーラＮおよびＬコンセーラＡＮ）を測定し、保存後の血清値を調製直後の血清値に対する相対値（％）として求めた。
【００７０】
【表５】
【００７１】
結果 表５に示す。比較例では感度がなくなり血清値の算出は不能であった。実施例ではＬコンセーラＮで１０３％、ＬコンセーラＡＮで９９．３％と保存前後の血清値の変動はほぼみられなかった。
【００７２】
（実施例６）
Ｎ−メチルイソチアゾロン（ロッシュ社製）、グリセロールキナーゼ（サーマス・フラバス由来 東洋紡績社製ＧＹＫ−３１１、ストレプトマイセス・カヌス由来 Ｇｅｎｚｙｍｅ社、ジオトリカム・キャンディダム由来 Ｒｏｃｈｅ社、バチルス・ステアロサーモフィラス由来 Ｒｏｃｈｅ社）を添加した実施例１の中性脂肪測定試薬 第一試液を９℃および３５℃で２週間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。試薬に５ｇ／Ｌのシュークロースを添加した場合と、そうでない場合の２通りで検討し、防腐剤無添加の場合と比較した。
【００７３】
（試薬の調製）
下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬を調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ６．６
ＭｇＣｌ２ ０．２ｇ／Ｌ
アデノシン３リン酸２Ｎａ塩 ０．９ｇ／Ｌ
エマルゲンＡ６０ ２ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
グリセロールキナーゼ ３Ｕ／ｍＬ
グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製） ２００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−メチルイソチアゾロン １００ｍｇ／Ｌ
【００７４】
【表６】
【００７５】
【表７】
【００７６】
結果 表６および表７に示す。防腐剤を添加した場合、ジオトリカム・キャンディダム由来の酵素は調製直後にすでに酵素活性を失っていた。９℃保存においては、ストレプトマイセス・カヌス由来の酵素がこの中では比較的安定であった。一方３５℃保存においては、サーマス・フラバス由来の酵素とバチルス・ステアロサーモフィラス由来の酵素が比較的安定であった。シュークロースを添加した場合は、とくに３５℃におけるサーマス・フラバス由来の酵素とバチルス・ステアロサーモフィラス由来の酵素をさらに安定化する働きが見られた。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の生体成分測定方法および試薬は、防腐剤に対して高い耐性を有し、かつ保存中に実質的に濁りが発生しない等、各種性能低下がないこと等の特性を持つため、臨床検査分野で用いられる診断薬として優れており、産業界に寄与することが大である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−メチルイソチアゾロンの存在下において、保存中に継続して、防腐性能効果と試薬性能低下の抑制が両立しているマグネシウム測定試薬を用いるマグネシウム測定方法であって、
該マグネシウム測定試薬が、第二試薬に、Ｎ−メチルイソチアゾロン、セルロモナス属由来のグリセロールキナーゼを含む、２試薬系からなり、ならびに、
試薬性能低下の抑制が、次から選ばれる少なくとも１つである、マグネシウム測定方法。
（１）試薬ブランクの上昇が０．１Ａｂｓ以下であること。
（２）感度の低下が３０％以下であること。
（３）試薬に含まれる酵素活性の低下が、濃度が０．１〜２０Ｕ／ｍＬのグリセロールキナーゼを、Ｎ−メチルイソチアゾロン１００ｍｇ／Ｌの濃度で２５℃、１週間共存させた時のグリセロールキナーゼ活性残存率が７０％以上であること。
【請求項２】
Ｎ−メチルイソチアゾロンの存在下において、保存中に継続して、防腐性能効果と試薬性能低下の抑制が両立しているマグネシウム測定試薬であって、第二試薬に、Ｎ−メチルイソチアゾロン、セルロモナス属由来のグリセロールキナーゼを含む、２試薬系からなるマグネシウム測定試薬。
【請求項１】
Ｎ−メチルイソチアゾロンの存在下において、保存中に継続して、防腐性能効果と試薬性能低下の抑制が両立しているマグネシウム測定試薬を用いるマグネシウム測定方法であって、
該マグネシウム測定試薬が、第二試薬に、Ｎ−メチルイソチアゾロン、セルロモナス属由来のグリセロールキナーゼを含む、２試薬系からなり、ならびに、
試薬性能低下の抑制が、次から選ばれる少なくとも１つである、マグネシウム測定方法。
（１）試薬ブランクの上昇が０．１Ａｂｓ以下であること。
（２）感度の低下が３０％以下であること。
（３）試薬に含まれる酵素活性の低下が、濃度が０．１〜２０Ｕ／ｍＬのグリセロールキナーゼを、Ｎ−メチルイソチアゾロン１００ｍｇ／Ｌの濃度で２５℃、１週間共存させた時のグリセロールキナーゼ活性残存率が７０％以上であること。
【請求項２】
Ｎ−メチルイソチアゾロンの存在下において、保存中に継続して、防腐性能効果と試薬性能低下の抑制が両立しているマグネシウム測定試薬であって、第二試薬に、Ｎ−メチルイソチアゾロン、セルロモナス属由来のグリセロールキナーゼを含む、２試薬系からなるマグネシウム測定試薬。
【公開番号】特開２００７−１８５１９６（Ｐ２００７−１８５１９６Ａ）
【公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−９９０２９（Ｐ２００７−９９０２９）
【出願日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【分割の表示】特願２００３−３２４４９４（Ｐ２００３−３２４４９４）の分割
【原出願日】平成１５年９月１７日（２００３．９．１７）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【分割の表示】特願２００３−３２４４９４（Ｐ２００３−３２４４９４）の分割
【原出願日】平成１５年９月１７日（２００３．９．１７）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]