【課題】大きな波長を有するレーザー光によって励起可能な、蛍光色素化合物の提供。
【解決手段】キサンテン環構造並びに電子欠乏窒素複素環式置換基を有するフルオレセイン色素化合物。例えば、下式で表される化合物である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（Ｉ．発明の分野）
本発明は、概して、分子プローブを調製するための標識試薬として有用な蛍光色素化合物に関する。より詳細には、本発明は、キサンテン環構造および電子欠乏窒素複素環式置換基を有するフルオレセインに関する。
【背景技術】
【０００２】
（ＩＩ．背景）
蛍光標識を使用する生物学的検体の非放射性検出は、現代の分析バイオテクノロジーにおいて重要な技術である。放射性標識の必要性を除くことによって、安 全性が高められ、そして試薬の処分に伴う環境への影響およびコストは大いに減少する。このような蛍光検出法を使用する例としては、自動ＤＮＡ配列決定法、オリゴヌクレオチドプローブ法、ポリメラーゼ連鎖反応産物の検出、免疫アッセイなどが挙げられる。
【０００３】
多くの重要な用途において、空間的にオーバーラップした複数の検体の独立した検出（すなわち、多重蛍光検出）を達成するために、スペクトル的に識別可能 な多数の蛍光標識を使用することは好都合である。多重蛍光検出を使用する方法の例としては、単一チューブ多重ＤＮＡプローブアッセイ、ＰＣＲ、単一ヌクレオチド多形性、免疫アッセイ、および多色自動ＤＮＡ配列決定法が挙げられる。反応容器の数は、実験プロトコルを単純化することによって、そして用途に特異 的な試薬キットの生成を容易化することによって、減少され得る。多色自動ＤＮＡ配列決定法の場合、多重蛍光検出は、単一の電気泳動レーンにおいて多数のヌクレオチドの分析を可能にし、それによって単色法による処理量を増加し、そしてレーン内での電気泳動度の変化に伴う不確定性を減少する。自動４色 Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定法は、ゲノム全体の分子レベルでの特徴付けを可能にした。
【０００４】
多重蛍光検出に有用でスペクトル的に識別可能な多数の蛍光標識のセットを組み立てることは、問題を含む。多重蛍光検出は、特に、単一励起光源、電気泳動 分離、および／または酵素での処理（例えば、自動ＤＮＡ配列決定）を必要とする用途のための、蛍光色素標識成分の選択に対して少なくとも６つの制約を課す。第１に、発光スペクトルがスペクトル的に分解される、構造的に類似した色素のセットを見出すことは困難である。なぜなら、有機蛍光色素の代表的な発光 バンドの半値幅は４０〜８０ナノメーター（ｎｍ）だからである。第２に、たとえオーバーラップしない発光スペクトルが同定されたとしても、それぞれの蛍光量子効率が低すぎる場合、このセットは、なお適切ではないかもしれない。第３に、いくつかの蛍光色素が同時に使用される場合、同時励起は困難となる。なぜ なら色素の吸収バンドは、通常、広く分離しているからである。第４に、電荷、分子サイズ、および色素の構造は、検体の電気泳動度に悪影響を与えてはならない。第５に、蛍光色素は、検体を作製または操作するために使用される化学物質（例えば、ＤＮＡ合成の溶媒および試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ 酵素など）と的合成でなければならない。第６に、色素は、レーザー励起に耐えるに充分な光安定性を有さなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
４色自動ＤＮＡ配列決定の用途における使用に適切な、現在利用可能な複数の色素セットは、セットを構成する全ての色素からの蛍光発光を十分に励起するた めに、青色または青緑色のレーザー光（例えば、アルゴンイオンレーザー）を必要とする。より低コストな赤色レーザーが入手可能になるにつれて、上記制約を満たし、そして約５００ｎｍより大きな波長を有するレーザー光によって励起可能な、蛍光色素化合物およびそれらの結合体
の必要性が発生する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（項目１） 以下の式を有する化合物であって：
【０００７】
【化１】

【０００８】
ここで：
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、またはＲ⁷の少なくとも１つが、電子欠乏窒素複素環であり；
Ｒ¹は単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）置換アルキル
、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、もしくは複素環であり、またはＲ¹はＲ⁷と一緒になって、ベンゾまたは複素環であり；
Ｒ²は単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）置換アルキル
、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、もしくは複素環であり；
Ｒ³は単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）置換アルキル
、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、もしくは複素環であり；
Ｒ⁴は単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）置換アルキル
、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、もしくは複素環であり、またはＲ⁴はＲ⁵と一緒になって、ベンゾまたは複素環であり；
Ｒ⁵は単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）置換アルキル
、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、もしくは複素環であり、またはＲ⁵はＲ⁴と一緒になって、ベンゾまたは複素環であり；
Ｒ⁷は単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）置換アルキル
、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、もしくは複素環であり、またはＲ⁷はＲ¹と一緒になって、ベンゾまたは複素環であり；そして
Ｒ⁶は、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルケン、（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルキン、シア
ノ、複素環式芳香族、フェニル、および以下：
【０００９】
【化２】

【００１０】
の構造を有する置換フェニルからなる群から選択され、
ここで、Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴およびＸ⁵は、独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アル
キル、（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルケン、（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルキン、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、ＣＨ₂ＯＨ、
または反応性連結基である、化合物。
（項目２） 項目１に記載のフルオレセイン色素であって、前記電子欠乏複素環が、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリル、３−キノリ ル、４−キノリル、２−イミダゾール、４−イミダゾール、３−ピラゾール、４−ピラゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、シンノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、３−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−テトラゾリル、４−（１−Ｏ，３−Ｎ）− オキサゾール、５−（１−Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、４−（１−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、５−（１−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、２−ベンゾキサゾール、２−ベンゾチアゾール、４−（１，２，３−Ｎ）−ベンゾトリアゾール、およびベンズイミダゾールからなる群から選択される、フルオレセイン色素。
（項目３） 項目１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ⁴がＲ⁵と一緒になってベンゾである、フルオレセイン色素。
（項目４） 項目１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ¹がＲ⁷と一緒になってベンゾである、フルオレセイン色素。
（項目５） 項目１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ⁶が以下：
【００１１】
【化３】

【００１２】
の構造を有する置換フェニルである、フルオレセイン色素。
（項目６） 項目５に記載のフルオレセイン色素であって、Ｘ³およびＸ⁴の一方がカルボキシルであり、他方が水素である、フルオレセイン色素。
（項目７） 項目１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴が各々独立して、フェニルまたは置換フェニルである、フルオレセイン色素。
（項目８） 項目１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴が各々独立して、ナフチルまたは置換ナフチルである、フルオレセイン色素。
（項目９） 項目１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ²およびＲ³がそれぞれ独立して、フルオロまたはクロロである、フルオレセイン色素。
（項目１０） 項目１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ²およびＲ³がそれぞれ独立して、２−ピリジルまたは３−ピリジルである、フルオレセイン色素。
（項目１１） 項目１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ²およびＲ³がそれぞれ独立して、２−キノリルまたは３−キノリルである、フルオレセイン色素。
（項目１２） 項目１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ⁵およびＲ⁷が水素である、フルオレセイン色素。
（項目１３） 項目１に記載のフルオレセイン色素であって、前記反応性連結基が、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、塩化スルホニル、２，６ −ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、ホスホルアミダイト、マレイミド、ハロアセチル、およびヨードアセトアミドからなる群から選択される、フルオレセイン色素。
（項目１４） 以下：
【００１３】
【化４】

【００１４】

【００１５】

【００１６】

【００１７】
の構造を有する、フルオレセイン色素。
（項目１５） 項目１に記載のフルオレセイン色素で基質を標識する方法であって、該方法が、該基質を該フルオレセイン色素の反応性連結基と反応させ、基質−色素結合体が形成される工程を包含する、方法。
（項目１６） 前記反応性連結基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである、項目１５に記載の方法。
（項目１７） 前記反応性連結基が、ホスホルアミダイトである、項目１５に記載の方法。
（項目１８） 前記基質が、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチド、タンパク質、炭水化物、リガンド、粒子、および表面からなる群から選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１９） 前記粒子が、ナノ粒子、ミクロスフィア、ビーズ、およびリポソームである、項目１８に記載の方法。
（項目２０） 前記表面が、ガラスである、項目１８に記載の方法。
（項目２１） エネルギー移動色素化合物であって、以下：
第１波長で光を吸収し得、そしてドナー色素によって発せられる励起エネルギーを吸収し得るアクセプター色素にリンカーによって連結され、応答の際に励起エネルギーを発し、そして応答の際に第２波長で蛍光発光する、ドナー色素、
を含み、
ここで、該ドナー色素およびアクセプター色素の少なくとも１つが、項目１に記載のフルオレセイン色素である、エネルギー移動色素化合物。
（項目２２） 前記リンカーが、以下：
【００１８】
【化５】

【００１９】
の構造を有する、項目２１に記載のエネルギー移動色素。
（項目２３） 前記リンカーが、以下：
【００２０】
【化６】

【００２１】
の構造を有する、項目２１に記載のエネルギー移動色素。
（項目２４） 前記リンカーが、以下：
【００２２】
【化７】

【００２３】
の構造を有し、ここで、ｎが１または２である、項目２１に記載のエネルギー移動色素。（項目２５） 以下の式を有する、標識したヌクレオシドまたはヌクレオチドであって：
【００２４】
【化８】

【００２５】
ここで、ＤＹＥが項目１に記載のフルオレセイン色素であるか、または項目２３に記載のエネルギー移動色素であり；
Ｂが核酸塩基であり；
Ｒ⁸がＨ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、チオフォスフェー
ト、またはホスフェートアナログであり；
Ｒ⁹およびＲ¹⁰が単独の場合、各々独立して、Ｈ、ＨＯ、Ｆ、およびポリメラーゼ媒介
標的指向重合を阻止する部分であるか、またはＲ⁹およびＲ¹⁰が一緒になって、２’−３
’−ジデヒドロリボースを形成し；そして
Ｌがリンカーである、標識したヌクレオシドまたはヌクレオチド。
（項目２６） 項目２５に記載の標識したヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、Ｂが、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および８−デアザグアノシンからなる群から選択される、標識したヌクレオシドまたはヌクレオチド。
（項目２７） 項目２５に記載の標識したヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、Ｌが以下：
【００２６】
【化９】

【００２７】
であり、ここで、ｎが０、１、または２である、標識したヌクレオシドまたはヌクレオチド。
（項目２８） 酵素的に組み込み可能である、項目２５に記載の標識したヌクレオシドまたはヌクレオチド。
（項目２９） ターミネーターである、項目２５に記載の標識したヌクレオシドまたはヌクレオチド。
（項目３０） 以下の構造を有する、項目２９に記載のターミネーターヌクレオチドであって：
【００２８】
【化１０】

【００２９】
ここで、ＤＹＥがフルオレセイン色素であり；
Ｂが核酸塩基であり；
Ｒ⁸がトリホスフェート、α−チオトリホスフェート、またはトリホスフェートアナロ
グであり；
Ｒ⁹およびＲ¹⁰が単独の場合、各々独立して、Ｈ、Ｆ、およびポリメラーゼ媒介標的指
向重合を阻止する部分であるか、またはＲ⁹およびＲ¹⁰が一緒になって、２’−３’−ジ
デヒドロリボースを形成し；そして
Ｌがリンカーである、ターミネーターヌクレオチド。
（項目３１） 酵素的に伸長可能である、項目２５に記載の標識したヌクレオシドまたはヌクレオチド。
（項目３２） 以下の式を有する、標識したオリゴヌクレオチドあって：
【００３０】
【化１１】

【００３１】
ここで、該オリゴヌクレオチドが２〜１００個のヌクレオチドを含み；
ＤＹＥが項目１に記載のフルオレセイン色素であるか、または項目２１に記載のエネルギー移動色素であり；
Ｂが核酸塩基であり；
Ｌがリンカーであり；
Ｒ¹⁰がＨ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、アルキルアミン、アルキル（Ｃ₁〜Ｃ₆）、アリル、アルコキシ（Ｃ₁〜Ｃ₆）、ＯＣＨ₃、またはＯＣＨ₂ＣＨ＝ＣＨ₂であり；
Ｒ¹⁵がＨ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログであり；そして
Ｒ¹⁶がＨ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間ア
ナログである、標識したオリゴヌクレオチド。
（項目３３） 以下の式を有する、標識したオリゴヌクレオチドあって：
【００３２】
【化１２】

【００３３】
ここで、該オリゴヌクレオチドが２〜１００個のヌクレオチドを含み；
ＤＹＥが項目１に記載のフルオレセイン色素であり；
ＸがＯ、ＮＨ、またはＳであり；
Ｂが核酸塩基であり；
Ｌがリンカーであり；
Ｒ¹⁰がＨ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、アルキルアミン、アルキル（Ｃ₁〜Ｃ₆）、アリル、アルコキシ（Ｃ₁〜Ｃ₆）、ＯＣＨ₃、またはＯＣＨ₂ＣＨ＝ＣＨ₂であり；そし
て
Ｒ¹⁵がヌクレオチド間ホスホジエステルまたはヌクレオチド間アナログである、標識したオリゴヌクレオチド。
（項目３４） 項目３３に記載の標識したオリゴヌクレオチドであって、Ｌがアルキルジイル（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）である、標識したオリゴヌクレオチド。
（項目３５） 項目３３に記載の標識したオリゴヌクレオチドであって、Ｌが−（ＣＨ₂
ＣＨ₂Ｏ）_n−を含む易動度改変因子であり、ここでｎが１〜１００である、標識したオリゴヌクレオチド。
（項目３６） 以下の式を有する、ホスホルアミダイト化合物であって：
【００３４】
【化１３】

【００３５】
ここで、ＤＹＥが項目１に記載のフルオレセイン色素であるか、または項目２１に記載のエネルギー移動色素であり；
Ｌがリンカーであり；
Ｒ¹¹およびＲ¹²が独立して、アルキル（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）、アルケン、アリール、および１
０個までの炭素原子を含むシクロアルキルからなる群から選択され；またはＲ¹¹およびＲ¹²が窒素原子と一緒になって、飽和した窒素複素環を形成し；そして
Ｒ¹³が亜リン酸エステル保護基である、ホスホルアミダイト化合物。
（項目３７） Ｒ¹³が、メチル、２−シアノエチル、および２−（４−ニトロフェニル）エチルからなる群から選択される、項目３６に記載のホスホルアミダイト化合物。
（項目３８） Ｒ¹¹およびＲ¹²が、それぞれイソプロピルである、項目３６に記載のホス
ホルアミダイト化合物。
（項目３９） Ｒ¹¹およびＲ¹²が、一緒になってモルホリノである、項目３６に記載のホスホルアミダイト化合物。
（項目４０） Ｌが、アルキルジイル（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）である、項目３６に記載のホスホル
アミダイト化合物。
（項目４１） 前記フルオレセイン色素が、Ｒ⁶でリンカーによって結合される、項目３
６に記載のホスホルアミダイト化合物。
（項目４２） 以下の構造のホスホルアミダイト化合物であって：
【００３６】
【化１４】

【００３７】
ここで、ＤＹＥが項目１に記載のフルオレセイン色素である、ホスホルアミダイト化合物。
（項目４３） 以下の式を有する、ホスホルアミダイト化合物であって：
【００３８】
【化１５】

【００３９】
ここで、ＤＹＥが項目１に記載のフルオレセイン色素であるか、または項目２１に記載のエネルギー移動色素であり；
Ｂが核酸塩基であり；
Ｌがリンカーであり；
Ｒ¹¹およびＲ¹²が独立して、アルキル（Ｃ₁〜Ｃ₆）、アルケン、アリール、および１０個までの炭素原子を含むシクロアルキルからなる群から選択され；またはＲ¹¹およびＲ¹²が窒素原子と一緒になって、飽和した窒素複素環を形成し；
Ｒ¹³が亜リン酸エステル保護基であり；そして
Ｒ¹⁴が酸−切断可能なヒドロキシ保護基である、ホスホルアミダイト化合物。
（項目４４） 項目４３に記載のホスホルアミダイト化合物であって、ここで、Ｒ¹³が、メチル、２−シアノエチル、および２−（４−ニトロフェニル）エチルからなる群から選択される、ホスホルアミダイト化合物。
（項目４５） 項目４３に記載のホスホルアミダイト化合物であって、ここで、Ｒ¹¹およびＲ¹²が、それぞれイソプロピルである、ホスホルアミダイト化合物。
（項目４６） 項目４３に記載のホスホルアミダイト化合物であって、Ｒ¹¹およびＲ¹²が
一緒になって、モルホリノである、ホスホルアミダイト化合物。
（項目４７） 項目４３に記載の化合物であって、ここで、Ｌが以下：
【００４０】
【化１６】

【００４１】
であり、そしてｎが２〜１０の範囲である、化合物。
（項目４８） 項目４３に記載の化合物であって、ここで、Ｌが以下：
【００４２】
【化１７】

【００４３】
であり、そしてｎが０、１、または２である、化合物。
（項目４９） 項目４３に記載の化合物であって、ここで、Ｌが以下：
【００４４】
【化１８】

【００４５】
であり、そしてｎが１〜１０の範囲である、化合物。
（項目５０） 項目４３に記載の化合物であって、Ｂが、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および８−デアザグアノシンからなる群から選択される、化合物。
（項目５１） 標識したオリゴヌクレオチドを合成する方法であって、項目３６のホスホルアミダイト化合物を固体支持体上のオリゴヌクレオチドにカップリングする工程を包含する、方法。
（項目５２） 標識したオリゴヌクレオチドを合成する方法であって、ヌクレオシドホスホルアミダイト試薬を固体支持体にカップリングする工程を包含し、ここで、該固体支持体が、項目１に記載の色素または項目２１に記載のエネルギー移動化合物で標識される、方法。
（項目５３） 標識したプライマー伸長産物を産生する方法であって、連続プライマー伸長を支持し得る酵素的に伸長可能なヌクレオチドおよびターミネーター の混合物の存在下で、プライマー−標的ハイブリッドを酵素的に伸長する工程を包含し、ここで、該プライマーまたは該ターミネーターが、項目１に記載の色素または項目２１に記載のエネルギー移動化合物で標識される、方法。
（項目５４） オリゴヌクレオチド連結の方法であって、該方法は以下：
２つのプローブを標的配列にアニーリングする工程；および
一方のプローブの５’末端と他方のプローブの３’末端との間のホスホジエステル結合を形成する工程；
を包含し、
ここで、１つまたは両方のプローブが、項目１に記載の色素または項目２１に記載のエネルギー移動化合物で標識される、方法。
（項目５５） フラグメント分析の方法であって、該方法は以下：
ポリヌクレオチドフラグメントをサイズ依存分離プロセスに供する工程であって、該フラグメントが項目１に記載のフルオレセイン色素または項目２１に記載のエネルギー移動化合物で標識される、工程；および
該分離プロセスの後に、該標識したポリヌクレオチドフラグメントを検出する工程、
を包含する、方法。
（項目５６） 前記フラグメントが、易動度改変標識で標識される、項目５５に記載の方法。
（項目５７） 前記フラグメントが、連結によって形成される、項目５５に記載の方法。（項目５８） 項目５５に記載の方法であって、前記サイズ依存分離プロセスが電気泳動であり、そして該標識したポリヌクレオチドフラグメントが蛍光によって検出される、方法。
（項目５９） 増幅の方法であって、該方法が以下：
２つ以上のプライマーを標的ＤＮＡ配列にアニーリングする工程；および
ポリメラーゼ、および酵素的に伸長可能なヌクレオチドの混合物によって該プライマーを伸長する工程；
を包含し、ここで、該プライマーまたはヌクレオチドが項目１に記載の色素で標識される、方法。
（項目６０） 増幅の方法であって、該方法が以下：
２つ以上のプライマーおよび蛍光色素−クエンチャープローブを標的ＤＮＡ配列にアニーリングする工程；および
ポリメラーゼ、および酵素的に伸長可能なヌクレオチドの混合物によって該プライマーを伸長する工程；
を包含し、ここで、該プローブが項目１に記載の色素で標識される、方法。
（項目６１） オリゴヌクレオチドを標識するためのキットであって、項目１に記載の反応性連結基を含む色素およびオリゴヌクレオチドを含む、キット。
（項目６２） オリゴヌクレオチドを標識するためのキットであって、項目３６に記載のホスホルアミダイト化合物およびオリゴヌクレオチドを含む、キット。
（項目６３） 標識したプライマー伸長産物を産生するためのキットであって、該キットは、連続プライマー伸長を支持し得る酵素的に伸長可能なヌクレオチ ド、ターミネーターおよびプライマーを含み、ここで、該プライマーまたは該ターミネーターが項目１に記載の色素で標識される、キット。
（項目６４） 標識したプライマー伸長産物を産生するためのキットであって、該キットは、連続プライマー伸長を支持し得る酵素的に伸長可能なヌクレオチ ド、ターミネーターおよびプライマーを含み、ここで、該プライマーまたは該ターミネーターが項目２１に記載のエネルギー移動色素で標識される、キット。
（項目６５） 標識したプライマー伸長産物を産生するためのキットであって、該キットは、連続プライマー伸長を支持し得る酵素的に伸長可能なヌクレオチ ド、ターミネーターおよびプライマーを含み、ここで、該プライマーまたは該ターミネーターが項目１４に記載の色素で標識される、キット。
（項目６６） 項目６５に記載のキットであって、前記ターミネーターが一組の４つの異なるターミネーターであって、該ターミネーターの１つは標的Ａで終結 し、該ターミネーターの１つは標的Ｇで終結し、該ターミネーターの１つは標的Ｃで終結し、そして該ターミネーターの１つは標的ＴまたはＵで終結する、キット。
（項目６７） 項目６６に記載のキットであって、前記一組の４つの異なるターミネーターが、一組の、易動度が一致したターミネーターである、キット。
【００４６】
（ＩＩＩ．要旨）
本発明は、多色蛍光検出に有用なスペクトル的に分解可能な蛍光標識のセットの作製に適切な、色素化合物に関する。
【００４７】
概して本発明の色素は、以下のフルオレセイン型キサンテン環構造Ｉ：
【００４８】
【化１９】

【００４９】
を含み、ここで、この構造は、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵、またはＲ⁷で、フルオレセイン環系
に連結した少なくとも１つの電子欠乏窒素複素環で置換されている。
【００５０】
Ｒ¹は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置換アル
キル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム（ｉｍｍｉｎｉｕｍ）、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはＲ⁷一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
【００５１】
Ｒ²は、単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置換アルキ
ル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリール、または複素環である。
【００５２】
Ｒ³は、単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置換アルキ
ル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリール、または複素環である。
【００５３】
Ｒ⁴は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置換アル
キル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはＲ⁵一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
【００５４】
Ｒ⁵は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置換アル
キル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはＲ⁴一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
【００５５】
Ｒ⁷は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置換アル
キル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはＲ¹一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
【００５６】
Ｒ⁶は、以下の式ＩＩを有する、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケン、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキン、シアノ、複素環式芳香族、フェニル、および置換フェニルであり得：
【００５７】
【化２０】

【００５８】
ここで、Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴、またはＸ⁵は、別々に、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、（Ｃ₁−Ｃ₆）ア
ルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケン、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキン、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、ＣＨ₂ＯＨ
、または反応性連結基である。
【００５９】
１つの局面において、本発明は、構造Ｉのフルオレセイン色素を有する基質を標識する方法を提供し、ここでこの基質は、色素の反応性連結基と反応し、そし て基質−色素結合体が形成する。適切な色素標識化結合体は、Ｉに従った電子欠乏窒素複素環で置換されたフルオレセイン色素、および基質（すなわち、別の分子または基質）を含む。この基質は、本発明の１つ以上の色素（同じであっても良いし、異なっていても良い）で標識され得る。色素からの蛍光は、スペクトル 範囲にわたって検出可能なシグナルを提供し、これは、単一のサンプルまたは混合物において別々に標識された基質の識別を可能にする。
【００６０】
１つの実施形態において、電子欠乏窒素複素環で置換されたフルオレセイン色素は、別の色素化合物に共有結合されて、エネルギー移動色素化合物を形成する。
【００６１】
別の実施形態において、電子欠乏窒素複素環で置換されたフルオレセイン色素は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオシドおよびヌクレオチドのアナログ、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのアナログに共有結合されて、それらとの標識化結合体を形成する。
【００６２】
さらに別の実施形態において、本発明は、本発明の電子欠乏窒素複素環で置換されたフルオレセイン色素を含む、ホスホラミダイト試薬を提供する。
【００６３】
別の局面において、本発明は、電子欠乏窒素複素環で置換されたフルオレセイン色素で標識されたオリゴヌクレオチドを合成する種々の方法、および蛍光標識化ポリヌクレオチドの検出のために色素を使用する種々の方法を提供する。
【００６４】
別の局面において、本発明は、電子欠乏窒素複素環で置換されたフルオレセイン色素、および分子を標識するために有用かつ／またはＤＮＡ配列決定およびＤＮＡ増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）のようなアッセイを行うために有用な試薬を含むキットを提供する。
【００６５】
本発明の、電子欠乏窒素複素環で置換されたフルオレセイン色素は、現在公知なフルオレセイン色素全般に対して有意な利点を提供する。
【００６６】
（Ｖ．好ましい実施形態の詳細な説明）
ここで、本発明の好ましい実施形態への言及が詳細になされ、これらの例は、付随する図面に示される。本発明は好ましい実施形態と組み合わせて記載されるが、本発明をこれ
らの実施形態に限定することは意図されないことが理解される。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれ得る、あらゆる変更、改変、および等価物を包含することを意図する。
【００６７】
（Ｖ．１ 定義）
他で述べられない限り、以下の用語および語句は、本明細書中で使用される場合、以下の意味を有することが意図される：
「核酸塩基」は、相補的な核酸塩基または核酸塩基アナログとワトソンクリック水素結合を形成し得る、窒素含有複素環部分（例えば、プリン、７−デアザプ リン、またはピリミジン）を意味する。代表的な核酸塩基は、天然に存在する拡散塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、およびこれらの天然に存在する核酸塩基のアナログ（例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、イノシン、ネブラリン、ニトロピロール、ニトロインドール、２− アミノ−プリン、２，６−ジアミノ−プリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシチジン、プソイドイソシチジン、５−プロピニル−シチジン、イソシチジン、イソグアニン、７−デアザ−グアニン、２−チオ−ピリミジン、
６−チオ−グアニン、４−チオ−チミン、４−チオ−ウラシル、Ｏ⁶−メチル−グアニン
、Ｎ⁶−メチル−アデニン、Ｏ⁴− メチル−チミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチル−インドール、およびエテノアデニン（Ｆａｓｍａｎ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３８５〜３９４頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌ（１９８９）））である。
【００６８】
「ヌクレオシド」は、リボース糖のＣ−１’炭素に連結した核酸塩基を含む化合物を意味する。リボースは、置換されていても置換されていなくても良い。置 換リボース糖は、１つ以上の炭素原子、好ましくは３’炭素が１つ以上の同じかまたは異なる−Ｒ基、−ＯＲ基、−ＮＲＲ基、またはハロゲン基（ここで各Ｒは、独立して、−Ｈ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、または（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリールである）で置換された、リボースを含むがこれら
に限定されない。特定の好ましいリボースは、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−デオキシリボース、３’−ハロリボース、３’−フルオロリ ボース、３’−クロロリボース、および３’−アルキルリボースである。核酸塩基がＡまたはＧである場合、リボース糖は核酸塩基のＮ⁹位置に結合している。核酸塩基がＣ、Ｔ、またはＵである場
合、ペントース糖は、核酸塩基のＮ¹位置に結合している（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａ
ｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版、Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、（１９９２））。
【００６９】
「ヌクレオチド」は、モノマー単位としてか、またはポリヌクレオチド内の、ヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。ヌクレオチドは、時々、リボース糖 の構造上の特徴を特に示すために「ＮＴＰ」、または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」と記される。「ヌクレオチド５’−トリホスフェート」とは、５’位置に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドをいう。三リン酸エステル基は、種々の酸素の硫黄置換（例えば、α−チオヌクレオチド５’−トリホスフェート） を含み得る。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシドまたはそのアナログを含む、任意のポリマー化合物を包 含する。交換可能に使用される「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む、ヌクレオチドモノマーの単鎖ポリマーおよび二重鎖ポリマーを意味する。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合また はヌクレオチド間アナログおよび関連する対イオン（例えば、Ｈ⁺、ＮＨ₄⁺、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ²⁺、Ｎａ⁺など）によって連結され
た、デオキシリボヌクレオチドのみからなるか、リボヌクレオチドのみからなるか、またはそのキメラ混合物からなり得る。オリゴヌクレオチドは、核酸塩基アナログおよび糖アナログからなり得る。ポリヌクレオチドの大きさの範囲は、代表的に２〜３個のモノマー単位からであり、それらが一般にオリゴヌクレオチド といわれる場合は、例えば５〜４０個から数千個のモノマーヌクレオチド単位である。他に示されない限りオリゴヌクレオチド配列が示されるときはいつでもヌクレオチドは左から右へ５’〜３’の順序であること、および他に示されない限り「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、 「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。
【００７１】
用語「ワトソン／クリック塩基対」とは、一般に二重鎖ＤＮＡに見られる水素結合した塩基対をいう。
【００７２】
「結合部位」とは、リンカーが共有結合する部分（例えば、フルオレセイン色素、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド）での部位をいう。
【００７３】
「リンカー」とは、色素を基質（例えば、オリゴヌクレオチド）に連結するか、または例えばエネルギー移動色素対において一方の色素を他方の色素に連結する、部分をいう。
【００７４】
「アルキル」とは、親であるアルカン、アルケン、またはアルキンの１つの炭素原子から１つの水素原子を除去することによって誘導される、飽和もしくは不 飽和な、直鎖状、分枝状、または環状の炭化水素ラジカルをいう。代表的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチルなどを含むがこれらに限定されない。代表的なアルキル基は、以下を含むがこれらに限定されない：メチル（−ＣＨ₃）；エタニル（−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、エテ
ニル（−ＣＨ＝ＣＨ₂）、エチニル（−Ｃ≡ＣＨ）のようなエチル；プロパン−１−イル
（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、プロパン−２−イル、シクロプロパン−１−イル、プロパ
−１−エン−１−イル（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ₂）、プロパ−１−エン−２−イル、プロパ
−２−エン−１−イル（−ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ₂）、プロパ−２−エン−２−イル、シクロプロパ−１−エン−１−イル；シクロプロパ−２−エン−１−イル、プロパ−１−イン−１−イル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）、プロパ−２−イン−１−イル（−ＣＨ₂−Ｃ≡ＣＨ）な
どのようなプロピル；ブタン−１−イル（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、ブタン−２−イル、シクロブタン−１−イル、ブタ−１−エン−１−イル（−ＣＨ＝ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、ブタ−１−エン−２−イル、ブタ−２−エン−１−イル（−ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ₂−ＣＨ₃）、ブタ−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ₂）、ブタ−１，３−ジエン−２−イル、シクロブタ−１−エン−１−イ
ル、シクロブタ−１−エン−３−イル、シクロブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１−イン−１−イル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、ブタ−１−イン−３−イル、ブタ−３−イン−１−イル（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｃ≡ＣＨ）などのようなブチル；など。好ましい実施形態において、アルキル基は（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、（Ｃ₁−Ｃ₃）が特に好ましい。
【００７５】
「アルコキシ」は、−ＯＲを意味し、ここでＲは（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルである。
【００７６】
「アルキルジイル」とは、１〜１２個の炭素原子の飽和もしくは不飽和な、分枝状、直鎖状、または環状の炭化水素ラジカルをいい、そして親であるアルカ ン、アルケン、またはアルキンの２つの同じかまたは異なる炭素原子の除去によって誘導される、２つの一価ラジカル中心を有する。代表的なアルキルジイルラジカルとしては、メタノ（−ＣＨ₂−
）；１，２−エチルジイル；１，３−プロピルジイル；１，４−ブチルジイル；などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７７】
「アリール」とは、親である芳香環系の１つの炭素原子から１つの水素原子を除去することによって誘導される、６〜２０個の炭素原子の一価芳香族炭化水素ラジカルをいう。代表的なアリール基としては、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから誘導されるラジカルが挙げられる が、これらに限定されない。
【００７８】
「アリールジイル」とは、６〜２０個の炭素原子の不飽和な環式または多環式の炭化水素ラジカルをいい、共役共鳴電子系、および親であるアリール化合物の２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除去することによって誘導される少なくとも２つの一価ラジカル中心を有する。
【００７９】
「置換アルキル」、「置換アルキルジイル」、「置換アリール」、および「置換アリールジイル」とは、それぞれ、１つ以上の水素原子が各々独立して別の置 換基で置換されている、アルキルラジカル、アルキルジイルラジカル、アリール、およびアリールジイルをいう。代表的な置換基としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ^-、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ^-、−ＮＲＲ、＝ＮＲ、−ＣＸ₃、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−
ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ₂＝Ｎ₂、−Ｎ₃、−Ｓ（Ｏ）₂Ｏ^-、−Ｓ（
Ｏ）₂ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ^-）₂、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）₂、−Ｃ（Ｏ）Ｒ
、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ^-、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−
Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、および−Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲ、ここで、各Ｘは、独立してハロゲンであり、そして各Ｒは、独立して−Ｈ、アルキル、アリール、または複素環である。特に好ましい置換基は、以下である：ハロゲン、−ＯＳ（Ｏ）₂ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）₂ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ、−Ｓ（Ｏ）₂ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（Ｏ）Ｏ₂ＲＲ、−Ｐ（Ｏ）Ｏ₂ＲＲ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＮＲＲ、−ＮＲＲＲ、−ＮＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−ＣＮ、−Ｏ、および−ＯＲ、ここでＲは、−Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、および連結基からなる群より独立して選択される。
【００８０】
「反応性連結基」とは、別の分子と反応して共有結合または連結（ｌｉｎｋａｇｅ）を形成し得る、化学的に反応性な部分（例えば、求核剤または求電子剤）をいう。
【００８１】
「複素環」とは、１つ以上の環原子がヘテロ原子（例えば、窒素、酸素、および硫黄）で置換されている、環系を有する分子をいう。
【００８２】
「電子欠乏窒素複素環式置換基」とは、環系の１つの原子から１つの水素原子を除去して、複素環を本発明のフルオレセイン色素に結合させることによって誘 導される、一価の電子欠乏窒素複素環をいう（Ｊｏｕｌｅら、Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔｈｏｒｎｅｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、Ｌｔｄ．、Ｃｈｅｌｔｅｎｈａｍ、Ｕ．Ｋ．（１９９８）；Ａｃｈｅｓｏｎ、Ｒ．、Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、第２版。Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓの部、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６７））。いくつかの例示的な電子欠乏窒素複素環が図１１に示される。
【００８３】
「基質」は、本発明の色素化合物が結合される実体である。基質としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（ｉ）ポリヌクレオチド、（ｉｉ）ヌ クレオシドおよびヌクレオチド、（ｉｉｉ）ペプチドおよびタンパク質、（ｉｖ）炭水化物、（ｖ）リガンド、および（ｖｉ）上記（ｉ）〜（ｖ）の任意のアナログ。
【００８４】
「酵素的に組み込み可能な」とは、新生ポリヌクレオチド鎖の末端（例えば、３’）上
にポリメラーゼ酵素の作用を介して酵素的に組み込まれ得る、ヌクレオチドの性質をいう。
【００８５】
「ターミネーター」は、得られたポリヌクレオチド鎖に対するヌクレオチドの引き続く組み込みを妨げ、それによってポリメラーゼ伸長を停止する、酵素的に 組み込み可能なヌクレオチドを意味する。代表的なターミネーターには、３’ヒドロキシル置換基がなく、そして２’，３’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジヒドロキシリボース、および２’，３’−ジデオキシ，３’−ハロリボース（例えば、３’−フルオロ）が挙げられる。あるいは、リボフラノースアナログ （例えば、アラリボース）が使用され得る。例示的なヌクレオチドターミネーターとしては、２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、β−Ｄ−アラビノフラノシル、３’−デオキシ−β−Ｄ−アラビノフラノシル、３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、および２’，３’−ジデ オキシ− ３’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル（Ｃｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅら（１
９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２：１６７１−１６８６；およびＣｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅら、（１９８５）ＦＥＢ．Ｌｅｔｔ．、 １８３：２７５−２７８）。ヌクレオチドターミネーターはまた、可逆ヌクレオチドターミネーターを含む（Ｍｅｔｚｋｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２（２０）：４２５９）。
【００８６】
「酵素的に伸長可能な」は、ヌクレオチドがポリヌクレオチドの末端で酵素的に組み込み可能であり、そして得られた伸長ポリヌクレオチドが、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの引き続く組み込みを行い得る、ヌクレオチドの性質を意味する。
【００８７】
「ヌクレオチド間アナログ」は、オリゴヌクレオチドのリン酸エステルアナログを意味し、これには以下が挙げられるがこれらに限定されない：アルキルホス ホネート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート。ヌクレオチド間アナログはまた、糖／リン酸基が、アミド結合（例えば、２−アミノエチルグリシン単位）によって置換されている非リン酸アナログ（ＰＮＡといわれる）を 含む（Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９１）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ
ｐｏｌｙａｍｉｄｅ”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００）。
【００８８】
「標的配列」は、プライマーもしくはプローブとのハイブリダイゼーション、酵素的活性、または検出の対象である、一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）を意味する。
【００８９】
「スペクトル的に分解可能」は、蛍光色素のセットに関して、それぞれの色素の蛍光発光バンドが十分に明瞭であり（すなわち、十分に非オーバーラップであ り）、色素が、単独かまたは他の化合物に結合体化された（標識された）場合のいずれかで、一連の帯域通過フィルターおよび光電子倍増管、荷電結合デバイス（ＣＣＤ）、分光写真器などを用いる標準的な光検出システム（例えば、光検出器）を使用して、蛍光シグナルに基づいて、互いに識別可能であることを意味す る（Ｗｈｅｅｌｅｓｓら、（１９８５）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ、２１−７６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。おそらく、スペクトル的に分解可能な色素のセットを含む全ての色素は、単一光源によって励起可能 である。
【００９０】
「易動度一致」とは、等しい長さのポリヌクレオチドを標識するために使用される場合
に、実質的に類似の電気泳動易動度を有する、別個に標識されたポリヌクレオチドを生じる、蛍光色素のセットをいう。代表的に、易動度一致色素のセットで標識されたポリヌクレオチドの相対的な電気泳動易動度は、ヌクレオチドの約１／２未満だけ異なる。好ましくは、易動度一致色素は、上記で定義されたようにス ペクトル的に分解可能である。
【００９１】
「相対的光安定性」は、吸収極大における残存色素のサンプリング測定を用いて、強度の白色光への曝露によって測定される場合の、標準（５−カルボキシフ ルオレセイン）に対する蛍光色素の化学的安定性を意味する。自動ＤＮＡ配列決定およびフラグメント分析用途に共通のレーザー誘導性蛍光の下での安定性の相関性試験として、等しい光密度単位の試験色素および基準が同時に光に供される。
【００９２】
（Ｖ．２ 色素）
第１の局面において、本発明は、以下の構造Ｉに従う新しいクラスのフルオレセイン型キサンテン環化合物：
【００９３】
【化２１】

【００９４】
を含み、ここで、この構造は、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、またはＲ⁷で、フルオレセイン環系に連結した少なくとも１つの電子欠乏窒素複素環で置換されている。電子欠乏窒素複素環は、炭素−炭素結合または炭素−窒素結合を介して フルオレセイン環系に結合され得る。本開示の全体にわたって提供される全ての分子構造は、提示されるそのままの電子構造を含むだけでなく、その共鳴構造、互変異体、鏡像異性体、ジアステレオマー、およびプロトン化状態の全てを含むことが意図される。
【００９５】
Ｒ¹は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置換アル
キル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはＲ⁷と一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
【００９６】
Ｒ²は、単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置換アルキ
ル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、または複素環である。
【００９７】
Ｒ³は、単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置換アルキ
ル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、または複素環である。
【００９８】
Ｒ⁴は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置換アル
キル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド
、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはＲ⁵と一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
【００９９】
Ｒ⁵は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置換アル
キル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはＲ⁴と一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
【０１００】
Ｒ⁷は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置換アル
キル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはＲ¹と一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
【０１０１】
Ｒ⁶は、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケン、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキン、シア
ノ、複素環式芳香族、フェニル、および以下の式ＩＩを有する置換フェニルからなる群より選択され：
【０１０２】
【化２２】

【０１０３】
ここで、Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴、およびＸ⁵は、別々に、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、（Ｃ₁−Ｃ₆）ア
ルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケン、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキン、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、ＣＨ₂ＯＨ
、または反応性連結基である。
【０１０４】
Ｉに従った特に好ましい色素は、Ｒ⁴がＲ⁵と一緒に融合環（例えば、ベンゾ）を形成する色素を含む。Ｒ¹がＲ⁷と一緒に融合環（例えば、ベンゾ）を形成する色素も同様に好ましい。
【０１０５】
好ましい色素は、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、およびＲ⁴が、各々別々に、フェニルおよび置換フェニル、ナフチル、置換ナフチル、フルオロ、クロロ、２−ピリジル、３−ピリジル、２−キノリル、または３−キノリルである、色素を含む。Ｒ⁵およびＲ⁷は、好ましくは水素である。
【０１０６】
ＩＩに従った特に好ましい色素の別のクラスは、置換フェニルが以下の構造ＩＩａ：
【０１０７】
【化２３】

【０１０８】
を有する色素を含む。
【０１０９】
ＩＩａの好ましい実施形態では、Ｘ³およびＸ⁴の１つが反応性連結基であり、そしてその他が水素である。ＩＩａの特に好ましい実施形態では、Ｘ³およびＸ⁴の１つがカルボキシルであり、そしてその他が水素である。
【０１１０】
上記発明の種々の局面は、多重蛍光検出に有用な公知の蛍光色素化合物についての以下の重要な利点のうち１つ以上を可能にする：（１）対象色素化合物の発 光スペクトルは、電子欠乏窒素複素環および／またはアリール置換基の型およびに位置における小さな変化によって調節され得、このことは、類似の吸収特性であるがスペクトル的に分解可能な蛍光発光スペクトルを有する色素セットの作製を可能にする；（２）対象色素化合物は、その好ましい蛍光特性を損なうことな く、容易に基質に結合し得る；（３）対象色素化合物は、狭い発光バンド幅を有する、すなわち発光バンド幅は、約４５ｎｍより低い半値全幅（ＦＷＨＭ）発光強度を有する；（４）対象色素化合物は、高い量子収量を維持しながら緩衝水溶液に非常に溶解性である；（５）対象色素化合物は、比較的光安定性である；そ して（６）対象色素化合物は、比較的大きな（すなわち、約５０，０００より大きい）吸光率を有する（Ｂｅｎｓｏｎら“Ａｒｏｍａｔｉｃ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｘａｎｔｈｅｎｅ ｄｙｅｓ”、１９９９年１２月２８日発行の米国特許第６，００８，３７９号）。ＦＷＨＭによって例示されるよ うな狭い発光バンド幅は、１つ（１セット）以上の蛍光色素で標識された基質の混合物中でのスペクトル分解を容易にするものとして望ましい。光安定性は、本発明の色素で標識された基質（例えば、ポリヌクレオチド）が強いレーザー光に供されて検出のための蛍光を誘導し得るという点で、重要な特性である。光退色 または他の化学的分解機構は、最適より低い光安定性の色素で標識された基質の検出を減少または阻害する。
【０１１１】
図１１は、本発明のフルオレセイン色素上の置換基として使用され得る電子欠乏窒素複素環の代表的なサンプルを示す。これらの複素環置換基は、蛍光色素の 重要なスペクトル特性に対して直接的な影響を有する。これらの影響は、以下のような本発明のフルオレセイン色素のスペクトル特性によって例示される：（ｉ）励起、発光、ならびに吸収極大および吸収スペクトル、（ｉｉ）光安定性、（ｉｉｉ）量子効率、ならびに（ｉｖ）エネルギー移動効率。
【０１１２】
電子欠乏窒素複素環は、環に１つ以上の窒素原子を保持する５員環または６員環を有し得る（図１１）。５員環または６員環は、第２の芳香族環（例えば、ベ ンゾ環、または置換ベンゾ環）または飽和環（例えば、シクロペンチルまたはシクロヘキシル）に融合され得る。複素環は、環系に他のヘテロ原子（例えば、酸素または硫黄）を有し得る。
【０１１３】
好ましい電子欠乏窒素複素環としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：図１１中の複素環、ならびに２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリル、
３−キノリル、４−キノリル、２−イミダゾール、４−イミダゾール、３−ピラゾール、４−ピラゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、シノリン、フタラジン（ｐｔｈａｌａｚｉｎｅ）、キナゾリン、キノキサリン、３−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−テトラ ゾリル、４−（１−Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、５−（１−Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、４−（１−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、５−（１−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、２−ベンゾキサゾール、２−ベンゾチアゾール、ベンゾトリアゾール、４−（１，２，３−Ｎ）−ベンゾトリアゾール、およびベンズイミダゾー ル。複素環は、複素環式環の炭素原子との結合によって直接的に、キサンテン環系に結合され得る。あるいは複素環は、複素環とキサンテン環系との間の芳香族性の非局在化を広げる不飽和リンカーを介して、キサンテン環系に結合され得る。広範な電子の非局在化を可能にするリンカーとしては、以下が挙げられるがこ れらに限定されない：（ｉ）オレフィン型；−ＣＲ＝ＣＲ−、（ｉｉ）ポリオレフィン型；−（ＣＲ＝ＣＲ）_n−、ここで、ｎは２〜１０である（ｉｉｉ）アセチレン型；−Ｃ≡Ｃ−、（ｉｖ）ポリ
アセチレン型；−（Ｃ≡Ｃ）_n−、ここで、ｎは２〜１０である（ｖ）スクアリン（ｓｑ
ｕａｒｉｎｅ）および（ｖｉ）他の結合体型リンカー。Ｒは、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロゲン、フッ素、塩素、ＣＮ、ＣＦ₃、アリール、および置換アリールからなる群
より選択される。オレフィン結合の形状は、シスまたはトランス、ＥまたはＺであり得る。
【０１１４】
（Ｖ．２Ａ エネルギー移動色素）
別の局面において本発明は、電子欠乏窒素複素環で置換された構造Ｉのフルオレセイン色素化合物を組み込んでいるエネルギー移動色素化合物を含む。一般 に、本発明のエネルギー移動色素は、ドナー色素（第１波長で光を吸収し、そしてそれに応じて励起エネルギーを発する）、アクセプター色素（ドナー色素によって発せられた励起エネルギーを吸収し得、そしてそれに応じて第２波長で蛍光を発し得る）およびリンカー（ドナー色素をアクセプター色素に結合する。こ のリンカーは、ドナー色素とアクセプター色素との間の効果的なエネルギー移動を容易にするために有効であり、そしてアクセプター色素の高い発光量子収量を維持する）を含む。（Ｌｅｅら“Ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｙｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”、１９９８年９月１ 日発行の米国特許第５，８００，９９６号；Ｌｅｅら“Ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｙｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”、１９９９年８月３１日発行の米国特許第５，９４５，５２６号；Ｍａｔｈｉｅｓら“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ”１９９７年８月５日発行の米国特許第５，６５４，４１９号）。本発明のエネルギー移動色素において、少なくとも１つのドナーアクセプター色素は、電子欠乏窒素複素環で置換されたフルオレセイン色素である。
【０１１５】
エネルギー移動色素は、混合物中の多重標識された基質の同時検出（例えば、ＤＮＡ配列決定）での使用のための利点を有する。１つのドナー色素が、エネル ギー移動色素のセットにおいて使用され得、その結果、各色素対は共通の波長での強い吸収を有する。次いで、エネルギー移動セット中のアクセプター色素を変化させることによって、アクセプター色素は、それぞれの発光極大によってスペクトル的に分解され得る。エネルギー移動色素はまた、非エネルギー移動色素よ りも大きな有効ストークスシフトを与える。ストークスシフトは、励起極大（ドナー色素が最大に光を吸収する波長）と発光極大（アクセプターが最大に光を発光する波長）との間の差異である。
【０１１６】
好ましい実施形態において、ドナー色素とアクセプター色素との間のリンカーは、リンカーに、ある程度の構造的剛性を与える官能基（例えば、アルケン、ジ エン、アルキン、少なくとも１つの不飽和結合または融合環構造を有する５員環および６員環）を含む。エネルギー移動色素のドナー色素およびアクセプター色素は、以下の構造を有するリンカー
によって結合され得：
【０１１７】
【化２４】

【０１１８】
ここで、ｎは１または２である。
【０１１９】
エネルギー移動色素のドナー色素とアクセプター色素との間のリンカーの結合部位は、任意の位置Ｒ¹−Ｒ⁷であり得、ここでドナー色素およびアクセプター色素の１つまたは両方は本発明の色素である。好ましい結合部位としては、Ｒ²、Ｒ³、Ｘ³、およびＸ⁴が挙げられる。
【０１２０】
エネルギー移動色素化合物は、リンカーを介して基質に共有結合される。このリンカーは、アルキルジイル（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）またはアリールジイル（Ｃ₆〜Ｃ₂₀）であり得、そして受容官能基としては、アミド、カルバメート、尿素、チオ尿素、ホスフェート、ホスホロチオエートなどが挙げられる。好ましいリンカーとし ては、１，２−エチルジイルおよび１，６−ヘキシルジイルが挙げられる。ドナー色素およびアクセプター色素の片方または両方が、本発明の色素である場合、エネルギー移動色素と基質との間のリンカーの結合部位は、そのエネルギー移動色素における任意のＲ¹〜Ｒ⁷位で有り得る。好ましい結合部位としては、Ｒ²、Ｒ³、Ｘ³およびＸ⁴が挙げられる。この基質が、ヌクレオシドまたはヌクレオチドである場合、好ましい結合部位は、核酸塩基上にある。基質がオリゴヌクレオチドである場合、好ま しい結合部位としては、３’および５’末端が挙げられる。基質が、ペプチドまたはタンパク質である場合、好ましい結合部位としては、アミノ末端またはカルボキシ末端が挙げられる。
【０１２１】
（Ｖ．３ 合成方法）
いくつかの合成方法が、本発明の蛍光色素の合成のために利用可能である。中間体の合成の好ましい方法は、白金触媒Ｓｕｚｕｋｉボロネートカップリング反 応を介し、これにより、アリールボロン酸がハロゲン化アリールとカップリングされ、位置選択性を伴ってビアリール生成物が得られる（Ｚｈａｎｇら（１９９８）「Ｂａｓｅ ａｎｄ ｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｕｚｕｋｉ ｃｒｏｓｓ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｂｕｌｋｙ ａｒｔｌｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｗｉｔｈ ｈａｌｏｐｙｒｉｄｉｎｅｓ：ｓｙｓｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｙｒｉｄｙｌｐｈｅｎｏｌｓ」，Ｌ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：６８８６−９０；Ｍａｒｔｉｎら（１９９３）「Ｐａｌｌａｄｉｕｍ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｃｒｏｓｓ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｏｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｏｒｇａｎｉｃ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅｓ」，Ａｃｔａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃａｎ．４７：２２１−３０；Ａｌｉｐｒａ
ｎｔｉｓら（１９９４）「Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｕｚｕｋｉ
ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：６９８５−８６； Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９８４）「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ５−ａｒｙｌｎｉｃｏｔｉｎａｔｅｓ」，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４９：５２３７−４３）。
【０１２２】
環化基質５は、図１において合成される。Ｓｕｚｕｋｉ反応は、繰り返され、初めに、テトラキス（トリフェニルホスフィン）白金触媒を用いて１，３−ジメ トキシフェン−２−イルボロン酸と２−臭化トルエンをカップリングすることによりビフェニル化合物１が得られる。１の位置選択的な臭素化により、２が得られ、続く白金触媒下のピリジン−３−ボロン酸とのＳｕｚｕｋｉ反応は、３を生成した。臭化水素および酢酸での３の脱メチルにより、４が得られ、続く無水 ２，５−ジクロロトリメリト酸とフリーデル‐クラフツアシル化は５を生成した。
【０１２３】
臭素化したナフチル化合物８は、図２に例示すように、環化中間体１１および１２の合成のための共通の中間体として機能する。ピリジン−３−ボロン酸およ びトル−２−イルボロン酸のＳｕｚｕｋｉカップリングにより、各々９および１０が得られ、これらを、脱メチルし、１１および１２にした。
【０１２４】
１００℃でのメタンスルホン酸中での中間体５および１１の等モル混合物の環化により、クロマトグラフィー後に、色素１３（図３）の３０％収率を得た（実 施例１３）。同様に、１４を１２との５の環化により形成した（実施例１４）。色素１５（図４）を、５および２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレンの環化により形成した（１９９８年１１月２４日に発行された、Ｂｅｎｓｏｎら「Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｂｅｎｚｏｘａｎｔｈｅｎｅ ｄｙｅｓ」、米国特許 第５，８４０，９９９号）。対称色素１６（図４）を、２モル等量の４および１モル等量の無水２，５−ジクロロトリメリト酸の二重環化により合成した（実施例１６）。
【０１２５】
同じ方法により、電子欠乏窒素複素環式置換フルオレセイン色素１９、２２（図５）、２５（図６）、２８（図７）、３３（図８）、３６（図９）および４１（図１０）を合成した（実施例１７〜４１）。
【０１２６】
（Ｖ．４ 本色素の標識試薬）
本発明は、標識試薬を含み、ここで、電子欠乏窒素複素環置換フルオレセイン色素は、基質と反応するための反応性形態である。別の局面において、本発明 は、本発明（すなわち、構造Ｉ）のフルオレセイン色素で標識または結合体化された基質を含む。基質は、実質的に、本発明の色素が結合体化され得る任意の分子または物質であり得、例えば、タンパク質、ポリペプチド、多糖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、固体支持体、有機および無機ポリ マー、ならびにその組み合わせおよびアセンブリ（例えば、染色体、核、生細胞（例えば、細菌または他の微生物、哺乳動物細胞、組織など）などが挙げられるがこれらに限定されない。この色素は、種々の手段によって任意のリンカー（疎水性引力、イオン性引力、および共有結合が挙げられる）を介して基質と結合体 化される。好ましくは、この色素は、共有結合を介して基質に結合体化される。
【０１２７】
標識化は、代表的に、当該分野で周知の方法（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．４０〜５５頁、６４３〜７１頁、（１９９６））を用いて、両方が可溶である適切な溶媒中で結合される適切な反応性フルオレセイン色素と基質とを混合し、続いて、任意の結合体化されてない出発物質または不要な副生成物からこの結合体を分離することに
よって得られる。この色素結合体は、後の使用のために乾燥保存され得るかまたは溶液中で保存され得る。
【０１２８】
本発明のフルオレセイン色素は、置換基の位置（Ｒ¹〜Ｒ⁵、Ｒ⁷、Ｘ¹〜Ｘ⁵）の１つに
おいて反応性結合基を含むか、または別の分子（すなわち、基質）への色素の共有結合を含み得る。反応性結合基は、色素および共有結合を形成し得る基質上の 部分である。代表的に、この色素は、基質上の求核性官能基と反応し得る求電子性官能基を有する。基質求核試薬の例としては、アルコール、アルコキシド、アミン、ヒドロキシルアミン、およびチオールが挙げられる。色素を基質に結合体化させるために使用される反応性結合基の選択は、代表的に、結合される基質上 の相補的な官能性に依存する。求電子反応性結合基の例としては、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、塩化スルホニル、スルホネートエステル、ハロゲン化シリル、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、ホスホルアミダイト、マレイミド、ハロアセチル、エポキシド、アルキ ルハライド、ハロゲン化アリル、アルデヒド、ケトン、アシルアジド、無水物およびヨウ化アセトアミドが挙げられる。単一の型の反応性結合基は、基質（代表的に多糖）に関して利用可能であり得、または、種々の基（例えば、アミン、チオール、アルコール、フェノール）は、タンパク質について代表的であるよう に、利用可能であり得る。結合される基質は、１より多い色素（この色素は、同一であっても異なってもよい）、またはハプテンによってさらに修飾される基質に結合化され得る。いくらかの選択性は、反応条件の注意深い制御によって得られるが、標識の選択性は、適切な反応色素の選択によって最も良好に得られる。
【０１２９】
好ましい反応性結合基は、フルオレセイン色素のカルボキシル基置換基のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）である。この色素のＮＨＳエス テル形態は、好ましい標識試薬である。この色素のＮＨＳエステルは、予め形成され、単離され、精製され、そして/または特徴付けされ得るか、あるいはインサイチュで形成され得、そして基質
の求核性基（例えば、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ペプチド、など）と反応し得る。代表的に、本発明の色素のカルボキシル形態（例えば、表１の色素 化合物）は、カルボジイミド試薬（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド）、またはウロニウム試薬（例えば、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）またはＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾ トリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、および活性化剤（例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ならびにＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応して、この色素のＮＨＳエステルが生じる。
【０１３０】
本発明のフルオレセイン色素上のＮＨＳエステルについての好ましい置換基の位置は、Ｘ³およびＸ⁴（Ｉａ）である。ＮＨＳエステルの代表的な例は、構造Ｉｂ：
【０１３１】
【化２５】

【０１３２】
である。
【０１３３】
別の好ましい反応性結合基は、本発明の色素のホスホルアミダイト形態である。ホスホルアミダイト色素試薬は、本発明の色素で標識されたオリゴヌクレオチ ドの自動合成のために特に有用である。オリゴヌクレオチドは、通常ホスホルアミダイトヌクレオシド試薬を用いるホスホルアミダイト方法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．およびＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．「Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」、米国特 許第４，４１５，７３２号、１９８３年、１１月１５日発行；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、米国特許第４，４５８，０６６号、１９８４年、７月３日発行；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．および Ｉｙｅｒ，Ｒ．（１９９２）「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：２２２３−２３１１）によって固体支持体上でに合成される。このホ スホルアミダイト色素試薬は、ヌクレオシドまたは非ヌクレオシドであり得、そしてそれらの３’末端、５’末端および／または１以上の内部位置で合成的ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログを標識するために都合よく使用され得る。ホスホルアミダイト色素試薬の非ヌクレオシド形態は、一般構造 ＩＩＩ：
【０１３４】
【化２６】

【０１３５】
を有し、ここで、ＤＹＥは、色素Ｉの保護形態または非保護形態であり、エネルギー移動色素を含む。Ｌは、リンカーである。別々であるＲ¹¹およびＲ¹²は、アルキル（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）、アルケン、アリール、および１０炭素原子までを含むシクロアルキルであるか、ま
たはＲ¹¹およびＲ¹²は、窒素原子形態と共に一緒になって飽和窒素複素環を形成する。Ｒ
¹³は、亜リン酸エステル保護基であり、オリゴヌクレオチドの不要な伸長を妨げる。一般的に、Ｒ¹³は、オ リゴヌクレオチド合成条件に対して安定であるが、このオリゴヌクレオチドまたは色素の完全性に不利に影響を与えない試薬を用いて合成的オリゴヌクレオチド生成物から取り除かれ得る。これらの特徴を有する種々の亜リン酸エステル基は、当該分野で周知である。好ましくは、Ｒ¹³は、メチル；２−シアノエチル、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ；および２−（４−ニトロフェニル）エチル、−ＣＨ₂ＣＨ₂（ｐ−ＮＯ₂Ｐｈ）である。ホ
スホルアミダイト色素試薬の好ましい実施形態は、以下である：（ｉ）Ｒ¹¹およびＲ¹²が各々イソプロピルであり、（ｉｉ）一緒になったＲ¹¹およびＲ¹²がモルホリノであり、（ｉｉｉ）Ｌが、アルキル（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）であり、（ｉｖ）Ｒ¹³が、２−シアノエチルであ
り、そして（ｖ）ＤＹＥがリンカーによってＲ⁶で結合される。ホスホルアミダイト色素
試薬ＩＩＩは、本発明の単一のフルオレセイン色素による基質の標識を行う。基質がオリゴヌクレオチドである場合、この色素は、オリゴヌクレオチドの５’末 端で結合され、結果として、３’から５’の方向で合成される。他のホスホルアミダイト色素試薬（ヌクレシドおよび非ヌクレオシド）は、オリゴヌクレオチドの他の部位（例えば、３’末端、核酸塩基、ヌクレオチド間結合、糖）で標識可能にする。核酸塩基、ヌクレオチド間結合、および糖部位での標識は、フルオレ セイン色素を用いて内部標識および複数の標識を可能にする。
【０１３６】
ヒドロキシル基（例えば、固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドの５’末端ＯＨ）と穏やかな酸活性化で反応する場合、ホスホルアミダイト色素試薬 ＩＩＩは、反応してヌクレオチド間ホスファイト基を形成し、次いでこのホスファイトは、ヌクレオチド間ホスフェート基に酸化される。幾らかの例において、この色素は、官能基（例えば、構造Ｉにおけるようなフェノール酸素）を含み得、これは、ホスホルアミダイト色素試薬の合成の間かまたはオリゴヌクレオチド のような分子を標識するためのその後の使用の間のいずれかの間で、保護を必要とする。使用される保護基（単数または複数）は、官能基の性質に依存し、そして当業者に明らかである（Ｇｒｅｅｎ，ＴおよびＷｕｔｓ，Ｐ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版、 Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。一般的に、使用される保護基は、５’−ヒドロキシル保護基（例えば、ジメトキシトリチル）を取り除くために、オリゴヌクレオチド合成において通常使用される酸性条件下（例えば、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸）で安定であるべきであり、そ して固体支持体から合成的オリゴヌクレオチドを脱保護および／または切断するために使用される塩基性条件下（水酸化アンモニウム、メチルアミン水溶液）で不安定であるべきである。
【０１３７】
安定なホスホルアミダイト色素試薬は、構造Ｉのキサンテン環酸素の最初の保護（代表的に、エステル化（例えば、ピバレート（Ｒ＝ｔＢｕ）またはベンゾ エート（Ｒ＝Ｐｈ）エステルのようなアシル化））によって形成され得る。エステル化は、構造Ｉａのラクトン化を引き起こし、ラクトン化は、非蛍光性の保護状態（例えば、以下：
【０１３８】
【化２７】

【０１３９】
構造Ｉｃ）の試薬を所与し、ここで、Ｘ³およびＸ⁴の １つは、水素であり、そしてその他は、カルボキシルであり、この色素は、公知の反応（例えば、カルボキシルの活性化、６−アミノ、１−ヘキサノールを用いるアミド化およびビス（ジイソプロピルアミノ）シアノエチルホスファイトを用いるヒドロキシルのホスファイト化（Ｔｈｅｉｓｅｎ，ｅｔａｌ（１９９２）） 「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
ｄｙｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．２７，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，９９〜１００頁）により、非ヌクレオシドのホスホルアミダイト色素標識試薬（例えば、以下：
【０１４０】
【化２８】

【０１４１】
Ｉｄ）に転換される。
【０１４２】
本発明の色素はまた、オリゴヌクレオチドの自動合成のために、固体支持体に共有結合され得る（Ｍｕｌｌａｈ，Ｂ．およびＡｎｄｒｕｓ，Ａ．「Ｓｏｌｉｄ
ｓｕｐｐｏｒｔ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ３’−ｌａｂｅｌｌｅｄ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、米国特許第５，７３６，６２６号（１９９８年４月７日発行）；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｐｏｌｙｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、米国特許第４，４５８，０６６号（１９８４年７月３日発行）。１つの実施形態において、この色素は、固体支持体（例えば、制御された細孔ガラス（Ｎｅｌｓｏｎ，ｅｔａｌ（１９９２）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ３． Ｄｉｒｅｃｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ，ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ，２−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ｂａｃｋｂｏｎｅ」，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２０：６２５３−５９；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｐ． 「Ｍｕｉｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ
ｇｌａｓｓ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、米国特許第５，１４１，８１３ 号（１９９２年８月２５日発行））またはポリスチレン（Ａｎｄｒｕｓ，ｅｔａｌ「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、米国特許第５，０４７，５２４（１９９１年９月１０日発行）お よび米国特許第５，２６２，５３０号（１９９３年１１月１６日発行））への結合、およびホスホルアミダイトヌクレオシド試薬を用いる伸長について酸に不安定な官能性を有するリンカーに結合される。切断および脱保護の後、標識されたオリゴヌクレオチドは、３’末端において本発明の色素を有し得る。
【０１４３】
（Ｖ．４Ａ ヌクレオチド標識）
好ましいクラスの標識された基質は、本発明のフルオレセイン色素を用いて標識されるヌクレオシドおよびヌクレオチドの結合体を含む。このような標識され たヌクレオシドおよびヌクレオチドは、酵素合成（例えば、ＰＣＲ増幅の状況において使用される標識されたヌクレオチド５’−トリホスフェート、Ｓａｎｇｅｒ型ポリヌクレオチド配列決定、およびｎｉｃｋ翻訳反応）によって形成されるポリヌクレオチドを標識するために特に有用である。
【０１４４】
この色素は、糖または核酸塩基のいずれかに結合体化され得る。好ましい実施形態において、この化合物は、末端リボヌクレオシド−５’−トリホスフェート （「ターミネーター」）であり、ここで、この色素は、核酸塩基部分に共有結合される。２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−トリホスフェート（「ｄＮＴＰ」）またはリボヌクレオシド−５’−トリホスフェート（「ＮＴＰ」）、適切なポリメラーゼ酵素および初回刺激をうけた標的ポリヌクレオチドと の結合において使用される場合、このようなターミネーターは、ＤＮＡ配列決定のような適用のために標的媒介酵素合成を介して、一連の末端化電子欠乏窒素複素環置換フルオレセイン色素を標識したポリヌクレオチドフラグメントを生成するために使用され得る。ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖または核酸塩基 部分上の部位で標識され得る。好ましい核酸塩基標識部位は、プリン核酸塩基の８−Ｃ、７−デアザプリン核酸塩基の７−Ｃまたは８−Ｃ、およびピリミジン核酸塩基の５位置を含む。ヌクレオシドまたはヌクレオチドと色素との間でリンカーは位置Ｒ¹〜Ｒ⁷の任意の１つで色素に結合し得る。
【０１４５】
標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、酵素的に組み込み可能でありかつ酵素的に伸長可能であり得る。本発明の色素で標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、構造ＩＶ：
【０１４６】
【化２９】

【０１４７】
を有し得、ここで、ＤＹＥは、色素Ｉ（エネルギー移動色素を含む）の保護形態または脱保護形態である。Ｂは、核酸塩基（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および８−デアザグアノシン）である。Ｒ⁸は、Ｈ、モノ
ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、チオホスフェート、またはホスフェートアナログである。Ｒ⁹およびＲ¹⁰は、単独の場合、各々の独立してＨ、ＨＯ、Ｆであ
る。標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドが、ターミネーターである場合、Ｒ⁹お
よびＲ¹⁰は、ポリメラーゼ媒介標的指向重合をブロックするように選択される。ターミネーターのヌクレオチドにおいて、Ｒ⁹およびＲ¹⁰は、単独の場合、各々独立してＨ、Ｆお
よびポリメラーゼ媒介標的指向重合をブロックする部分であるか、または一緒になる場合、２’−３’−ジデヒドロリボースを形成する。
【０１４８】
リンカーＬは、
【０１４９】
【化３０】

【０１５０】
であり得、ここで、ｎは、０、１、または２である。
【０１５１】
（Ｖ．４Ｂ オリゴヌクレオチド標識）
別の好ましいクラスの標識された基質は、本発明のフルオレセイン色素で標識されるオリゴヌクレオチドの結合体を含む。このような標識されたポリヌクレオ チドまたはアナログは、多くの重要な状況において有用であり、ＤＮＡ配列決定プライマーとして、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ、オリゴヌクレオチド連結プローブ、二重標識された５’−エキソヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ^TM） プローブなどを含む（Ｆｕｎｇ，ｅｔａｌ．「Ａｍｉｎｏ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｌｉｎｋｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ，ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，ａｎｄ ｕｓｅｆｕｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」，米国特許第 ４，７５７，１４１号（１９９８年７月１２日発行）；Ａｎｄｒｕｓ，Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ５’ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）ＰＣＲ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，３９〜５４頁；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．４０〜５５頁、６４３〜７１頁）。標識されたオリゴヌクレオチドは、構 造Ｖ：
【０１５２】
【化３１】

【０１５３】
を有し得、ここで、このオリゴヌクレオチドは、２〜１００個のヌクレオチドを含む。ＤＹＥは、フルオレセイン色素Ｉであり、エネルギー移動色素を含む。Ｂ は、核酸塩基（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および８−デアザグアノシン）である。Ｌは、リンカーである。Ｒ¹⁰は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン化物、アジド、アミン、アルキルアミン、アルキル（Ｃ₁〜Ｃ₆）、アリル、アルコキシ（Ｃ₁〜Ｃ₆）、ＯＣＨ₃、またはＯＣＨ₂ＣＨ＝ＣＨ₂である。Ｒ¹⁵は、Ｈ、ホスフェート、ヌ
クレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログである。Ｒ¹⁶は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステルまたはヌクレオチド間アナログである。本実施形態において、構造Ｖの核酸塩基標識オリゴヌクレオチドは、核酸塩基を通して結合された本発明の複数の色素を有し得る。
【０１５４】
核酸塩基標識オリゴヌクレオチドＶは、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼによる酵素的に組み込み可能なヌクレオチド試薬ＩＶ（Ｒ⁸は、トリホスフェートである）の
酵素学的組み込み、および（ｉｉ）自動合成によるホスホルアミダイト色素ヌクレオシド試薬ＶＩのカップリング、によって形成され得る。
【０１５５】
一般的に、標識されたヌクレオチドが、酵素的合成によって作製される場合、以下の手順が使用され得る。標的ＤＮＡは、変性され、そしてオリゴヌクレオチ ドプライマーは、標的ＤＮＡにアニールされる。初回刺激を受けた標的の連続した標的指向酵素的伸長を支持し得る、酵素的に組み込み可能なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの混合物（例えば、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰまたはｄＵＴＰを含む混合物）は、初回刺激を受けた標的に添加さ れる。少なくともヌクレオチドのフラクションは、色素Ｉで標識されるか、または上記のように標識されたターミネーターである。次に、ポリメラーゼ酵素は、ポリメラーゼ酵素が活性である条件下で混合物に添加される。標識されたオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ媒介鎖合成の間に標識されたヌクレオチドまたは ターミネーターの組み込みによって形成される。
【０１５６】
代替の酵素的合成方法において、２つのプライマー：標的配列の（＋）鎖に相補的な１つのプライマーおよび標的配列の（−）鎖に相補的な別のプライマー は、１つの代わりに使用され、ポリメラーゼは、熱安定性のポリメラーゼであり、そして反応温度は、変性温度と伸長温度との間で循環され、それによってＰＣＲによって標的配列に対する標識された相補体を急激に増幅する（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔａｌ（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）。１つまたは両方のプライマーは、本発明の色素で標識され得る。あるいは、１以上のヌクレオチドの５’−トリホスフェートは、本発明の色素で標識され得る。各標識スキームは、本発明の１以上の色素を有するＤＮＡ増幅産物を生じる。
【０１５７】
本発明のフルオレセイン色素でのオリゴヌクレオチドの内部標識は、一般構造ＶＩ：
【０１５８】
【化３２】

【０１５９】
のヌクレオシドホスホルアミダイト色素試薬で実施され得、ここで、ＤＹＥは、色素Ｉの保護形態または非保護形態である。環外のアミンおよび核酸塩基Ｂの他 の官能性は、ヌクレオシドホスホルアミダイト色素試薬の合成の間および／または標識されたオリゴヌクレオチドを合成するためのその後の使用の間、保護を必要とし得る。選択される特定の保護基は、核酸塩基または核酸塩基アナログの同一性に依存し、そして当業者に明らかである。例えば、アデニンおよびシトシン の環外アミンは、ベンゾイル（ｂｚ）で保護され得、そしてグアニンの環外アミンは、従来の手順を用いてジメチルホルムアミド（ｄｍｆ）またはイソブチリル（ｉｂｕ）で保護され得る。好ましくは、核酸塩基は、穏やかな塩基性条件下で容易に取り除かれる基で保護される。例えば、ｄＡ^bz、ｄＣ^bz、ｄＧ^dmfおよび
Ｔホスホルアミダイトヌクレオシドを用いて合成されたオリゴヌクレオチド（ならびにそれらの対応する３’ヌクレオシド固体支持体）は、６５℃にて濃縮され た水酸化アンモニウム中で６０分にわたって切断および脱保護され得る（Ｂａｕｃａｇｅ，Ｓ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．（１９９２）「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ
ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ
ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：２２２３−２３１１）。
【０１６０】
別々にとられるＲ¹¹およびＲ¹²は、アルキル（Ｃ₁〜Ｃ₆）、アルケン、アリール、およびシクロアルキル（１０個までの炭素原子を含む）、からなる群から選択される（例えば、イソプロピル）か、または、窒素原子と一緒になってＲ¹¹およびＲ¹²が、飽和窒素複素環（例えば、モルホリノ）を形成する。Ｒ¹³は、亜リン酸エステル保護基（例えば、メチル、２−シアノメチル、および２−（４−ニトロフェニル）エチル）である。Ｒ¹⁴は、酸切断可能ヒドロキシル保護基（例えば、ジメトキシトリチル）であり、これは、引き続くモノマーカップリングを可能にする。
【０１６１】
ＶＩのリンカーＬは、
【０１６２】
【化３３】

【０１６３】
（ここで、ｎは、２〜１０の範囲である）；
【０１６４】
【化３４】

【０１６５】
（ここで、ｎは、０、１または２である）；および
【０１６６】
【化３５】

【０１６７】
（ここで、ｎは、１〜１０の範囲である）であり得る。
【０１６８】
試薬ＩＶおよびＶＩは、本発明Ｉの色素を用いて標識されるオリゴヌクレオチドＶを調製する際に効果的である。標識されたオリゴヌクレオチドの別の実施形態は、構造ＶＩＩ
【０１６９】
【化３６】

【０１７０】
に従って標識された５’末端であり、ここで、Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはＳであり、Ｌは、アルキルジイル（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）または易動度改変因子であり、そして標識されたオリゴヌ
クレオチドは、１つのＤＹＥのみを保有する。易動度改変因子リンカーは、オリゴヌクレオチドの電気泳動易動度または疎水的性質に影響する。易動度改変因子リンカーの例としては、エチレンオキシユニット、−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−が挙げられ、ここで、ｎは、１
〜１００であり得る（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ａ ｍｉｘｅｄ ＤＮＡ− ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｈａｉｎ ｐｒｏｂｅ」、米国特許第５，６２４，８００号、１９９７年４月２９日発行）。好ましくは、ｎは、２〜２０である。標識されたオリゴヌクレオチドＶＩＩは、ホスホラミダイト試薬ＩＩＩ（特に例えばＩｄ）を用いて自動化合成によって形成され得る。あるいは、標識されたオリゴヌク レオチドＶＩＩは、本発明の色素の反応性連結基形態（例えば、Ｉｂ）を、５’−アミノアルキルオリゴヌクレオチドと反応させることによって形成され得る。
【０１７１】
１つの好ましい合成後化学標識方法において、オリゴヌクレオチドは、以下のように標識される。構造Ｉｂに従う色素は、ＤＭＳＯ中に溶解されるかまたは懸 濁され、約ｐＨ９の０．２５Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液中の５’−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドに、過剰（１０〜２０倍）で加えられ、６時間反応させられる（例えば、米国特許第４，７５７，１４１号）。色素標識オリゴヌクレオチドＶＩＩは、緩衝液（例えば、０．１モル濃
度のトリエチルアミンアセテート（ＴＥＡＡ））を用いて溶出するサイズ排除クロマトグラフィーカラムを通過させることによって未反応の色素から分離され得る。粗製の標識オリゴヌクレオチドＶＩＩを含む画分（ここで、Ｌは、−（ＣＨ₂）₆−である）は、勾配溶出を使用する逆相ＨＰＬＣによってさらに精製される。
【０１７２】
（Ｖ．５ キット）
本発明は、本発明の電子欠乏性窒素複素環置換蛍光色素および／またはそれらの標識された結合体を含むキットを包含する。１つの実施形態において、キット は、本発明の色素を他の分子（すなわち基質）に結合するのに有用である。このようなキットは、一般的に最適な連結部分を含む本発明の色素および別の分子または基質に対して色素を結合するのに適切な試薬、酵素、緩衝液、溶媒などを含む。
【０１７３】
１つの実施形態において、キットは、酵素的に合成されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを、本発明の色素を用いて標識するのに有用である。こ のようなキットは、一般的に、連続プライマー伸長およびポリメラーゼ酵素を支持し得る、本発明に従う標識された酵素的に組み込み可能なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、酵素的に組込み可能なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの混合物を含む。好ましくは、標識された酵素的に組込み可能なヌクレ オチドまたはヌクレオチドアナログは、構造ＩＶに記載の化合物、最も好ましくは、標識されたターミネーターである。好ましいポリメラーゼは、ＡＭＰＬＩＴＡＱ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＡ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のように、熱安定である。
【０１７４】
別の実施形態において、キットは、本発明のホスホラミダイト試薬を用いて合成オリゴヌクレオチドを標識するのに有用である。このようなキットは、一般的 に、オリゴヌクレオチド合成を行うために任意にホスホラミダイト色素試薬、他の合成試薬、および／または支持体を含む（Ａｎｄｒｕｓら、「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」米国特許第５， ２６２，５３０号、１９９３年１１月１６日発行）。
【０１７５】
（Ｖ．６ 標識された試薬を用いる方法）
本発明の色素および試薬は、蛍光検出を利用する任意の方法、特に、複数の空間的に重なる分析物の同時検出を必要とする方法によく適する（Ｍｅｎｃｈｅｎ ら、「４，７−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｙｅｓ ａｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ」、米国特許第５，１８８，９３４号、１９９３年２月２３日発行）。本発明の色素および試薬は、生化学分離手順（例えば、電気泳動）に供されるポリヌクレオチドのクラス、または空間的にアドレ ス可能なハイブリダイゼーションアレイにおける位置の中に分布しているポリヌクレオチドのクラスを同定するために特によく適する。
【０１７６】
これらの用途には、５’標識配列決定プライマー、５’標識ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー、ハイブリダイゼーションプローブ、およびライゲー ションアッセイプローブのような標識オリゴヌクレオチドの使用が挙げられる。ＰＣＲ用途には、可変数（ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒ）タンデムリピート（ＶＮＴＲ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）および特定の配列の隣接複数コピーを含む二重鎖ＤＮＡの反復領域の増幅のマイクロサテライト方法による 遺伝型決定のための標識されたオリゴヌクレオチドの使用が挙げられ、繰り返しユニットの数が可変である。好ましくは、このようなＰＣＲ遺伝型決定方法において、ＰＣＲプライマーは、本発明の色素を用いて標識される。
【０１７７】
特に好ましい実施形態において、本発明のフルオレセイン色素は、ＰＣＲの間の増幅産物のリアルタイムまたは終点測定を提供する定量的方法および試薬において使用され得る（Ｇｅｌｆａｎｄら、「Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ
ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ
ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」、米国特許第５，２１０，０１５号、１９９３年５月９日発行）；Ｌｉｖａｋら、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｌｆ−Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｂｅ」、米国特許第５，５３８，８４８号、１９９６年７月２３日発行）。蛍光色素−クエンチャープローブを使用するエキ ソヌクレアーゼアッセイ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標））（Ｌｉｖａｋら、「Ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅ」、米国特許第５，７２３，５９１号、１９９８年３月３日発行；Ｍｕｌｌａｈら、（１９９８）「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｓｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：１０２６〜１０３１）は、閉鎖 チューブシステムにおけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物の直接検出を与え、これには、ＰＣＲを行うために必要とされるサンプルプロセシングを超えるサンプルプロセシングはない。Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて、プライマー伸長を行いそしてポリヌクレオチドを増幅するポリメラーゼはまた、５’〜３’エ キソヌクレアーゼ活性によって標的配列にアニールされるプローブを置換および切断する。Ｔａｑｍａｎ型アッセイにおいて、プローブは、自己クエンチし、蛍光色素およびクエンチャー部分（これらのいずれもが本発明の色素であり得る）を用いて標識される。スペクトルの重なりは、プローブがインタクトである場 合、効率的なエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を可能にする（Ｃｌｅｇｇ，Ｒ（１９９２）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ
ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１１：３５３〜３８８）。標的配列にハイブリダイズされる場合、プローブは、ＰＣＲの間 に、標的−プローブハイブリッドの存在する量に比例した蛍光シグナルを放出するために切断される（Ｌｉｖａｋら、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｌｆ−Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｂｅ」、米国特許第５，５３８，８４８号、１９９６年７月２３日発行；Ｌｉｖａｋら、「Ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅ」、米国特許第５，７２３，５９１号、１９９８年３月３日発行）。
【０１７８】
なお別の局面において、本発明は、標的ポリヌクレオチドを配列決定するために、本発明の電子欠乏性窒素複素環置換フルオレセイン色素を使用する方法を提 供する。この方法は、一般的に、本発明の色素を用いて標識された一連の異なるサイズのポリヌクレオチドを形成する工程、サイズに基づいて一連の異なるサイズの標識されたポリヌクレオチドを分離する工程、および色素の蛍光に基づいて分離された標識されたポリヌクレオチドを検出する工程を包含する。
【０１７９】
一連の異なるサイズの標識されたポリヌクレオチドは、周知の方法（Ｓａｎｇｅｒら、（１９７７）「ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｈａｉｎ −ｔｅｍｉｎａｔｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３〜５４６７；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、「Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｓｃａｎｎｉｎｉｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｐｐａｒａｔａｔｕｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」米国 特許第４，８１１，２１８号、１９８９年３月７日発行；ＰＥ Ｃｏｒｐ．、Ｊａｎｕａｒｙ １９９５、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^TM ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ、Ｒｅｖ．Ａ、Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｐ／Ｎ ９０３４３３、ＰＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に従って、プライムされた標的配列を酵素的に伸長することによって、便利に生成され得る。例えば、一連の標識されたポリヌクレオチドは、標識されたプライマーを使用し、そしてポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および少なくとも１つのターミネーター（例え ば、
２’，３’−ジデオキシリボヌクレオシド−５’−トリホスフェート）の存在下において標識された標的を用いてプライムされた標的配列を酵素的に伸長して得られ得る。あるいは、一連の標識されたポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および少なくとも１つの標識されたターミネーターの存在下で標識され ていないプライムされた標的を酵素的に伸長することによって得られ得る（Ｂｅｒｇｏｔら、「Ｓｐｅｃｔｒａｌｌｙ ｒｅｓｏｌｖａｂｌｅ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｄｙｅｓ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ」、米国特許第５，３６６，８６０号、１９９４年１１月２２日発行）。いずれの実施形態においても、この ポリメラーゼは、ターミネーターが組み込まれる（これは、伸長反応を終了させる）までｄＮＴＰを用いてプライマーを伸長するのに役立つ。いったん終結すると、一連の標識されたポリヌクレオチドは、サイズに基づいて分離され、そして分離されたポリヌクレオチドが色素標識の蛍光に基づいて検出される。
【０１８０】
この方法の特に有利な実施形態において、４つの異なる蛍光的に標識されたターミネーターが使用され、ここで、それぞれのヌクレオシドが異なるスペクトル 的に分解され得るフルオロホアを用いて標識され、そして少なくとも１つのフルオロホアが本発明に従う電子欠乏性窒素複素環置換フルオレセイン色素であり、その結果、フルオロホアのセットが「易動度一致」される。この実施形態に従って、プライムされた標的配列が、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび４つの異なる蛍 光的に標識されたターミネーターの存在下で酵素的に伸長される。サイズに基づいた分離に続いて、一連の分離され標識されたポリヌクレオチドが得られ、ここで、蛍光色素の発光性質は、３’−末端ヌクレオチドの同一性を明らかにする。特に好ましい実施形態において、易動度一致されたセットの蛍光色素のすべて が、単一光源を使用して励起され得る。
【０１８１】
本明細書中において、「フラグメント分析」または「遺伝子分析」方法として呼ばれる方法の好ましいカテゴリーにおいて、標識されるポリヌクレオチド配 列、または「フラグメント」は、例えば、ライゲーションまたはポリメラーゼ指向プライマー伸長によって、標識されたプライマーまたはヌクレオチドを使用して標的指向酵素合成によって生成され；フラグメントが、サイズ依存分離プロセス（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィー）に供され；そして分離された フラグメントは、例えば、レーザー誘導蛍光によって分離に続いて検出される（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、「Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、米国特許第４，８１１，２１８号、１９８９年３月７日発 行）。特に好ましい実施形態において、複数のクラスのポリヌクレオチドが、同時に分離され、異なるクラスがスペクトル分解され得る標識によって区別される。
【０１８２】
特に好ましいフラグメント分析方法において、本発明の色素を用いて標識されるフラグメントが、相対的サイズによって同定される。フラグメントサイズと配 列との間の対応は、４つの可能な終結塩基（「ターミネーター」）およびスペクトル的に分解され得る色素のセットのメンバーの組み込みによって確立される。このようなセットは、市販の分光光度計を用いて発光および吸収バンド幅を測定することによって本発明の色素から容易に組み立てられる。好ましくは、ＤＮＡ 配列決定（すなわち、ジデオキシＤＮＡ配列決定またはＳａｎｇｅｒ型配列決定）の連鎖終結方法およびフラグメント分析が使用される。ターミネーターのそれぞれが異なる蛍光色素を有し、そして集合的に実験のターミネーターが、本発明の色素から１つ以上を含む色素のセットを有する。
【０１８３】
本発明のスペクトル的に分解可能な蛍光色素はまた、標的のＰＣＲ増幅の後に、遺伝子型決定実験に有用である。詳細には、それぞれ異なる色素で５’末端で 標識されるプライマーのオリゴヌクレオチドのセットが、複数の座を増幅し得、そして単一ヌクレオチド多形成（ＳＮＰ）を識別する。サイズ基準での、色素標識増幅生成物の電気泳動分離は、プ
ライマー配列のセットに依存する特定の遺伝型を示すプロフィールまたは特徴的データセットを確立する。
【０１８４】
リガーゼ酵素によるポリヌクレオチドプローブの共有結合は、分子生物学者に利用可能な最も有用なツールの１つである。２つのプローブが標的配列にアニー ルされ、ここで、２つのプローブが、隣接しそして介在するギャップなしである場合、ホスホジエステル結合が１つのプローブの５’末端と他のプローブの３’末端との間に、リガーゼ酵素によって形成され得る（Ｗｈｉｔｅｌｅｙら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」、米国特許第４，８８３，７５０号、１９８９年発行；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、（１９８８）「Ａ ｌｉｇａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｇｅｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７〜８０；Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら（１９９０）「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ
ＤＮＡ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ＥＬＩＳＡ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｓｓａｙ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ８７：８９２３〜２７）。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイは、標的サンプル中の特定の配列の存在を検出する。１つまたは両方のプローブが、本発明の色素を用いて標識される場合、ライゲーション産物は、蛍光によって検出され得る（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、（１９９４） 「Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ａｎｄ ｓｅｑｅｎｃｅ−ｃｏｄｅｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４５２７〜３４）。
【０１８５】
Ｓａｎｇｅｒ型配列決定は、配列が決定されるべき一本鎖ＤＮＡ標的または二本鎖ＤＮＡ標的を使用して、インビトロでのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖 の合成を含む。合成は、オリゴヌクレオチドプライマーが標的にアニールする場所に基づいて規定された部位において開始される。合成反応は、継続したＤＮＡ伸長を支持しないヌクレオチドアナログの組み込みによって終結される。例示的な連鎖終結ヌクレオチドアナログには、３’〜５’ＤＮＡ連鎖伸長に必要な３’ −ＯＨ基を欠く２’，３’−ジデオキシヌクレオシド
５’トリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）を含む。適切な比率のｄＮＴＰ（２’−デオキシヌクレオシド ５’−トリホスフェート）および４つのｄｄＮＴＰの１ つが使用される場合、酵素触媒重合が、ｄｄＮＴＰが組み込まれる各部位において連鎖の集団の画分において終結される。蛍光色素標識プライマーまたは標識ｄｄＮＴＰが各反応に使用される場合、配列情報が高分解能電気泳動による分離の後に蛍光によって検出され得る。連鎖終結方法において、本発明の色素が、配 列決定プライマーまたはジデオキシヌクレオチドのいずれかに接続し得る。色素は、プライマーの核酸塩基上の、プライマーの５’末端上の相補的な官能性に連結され得る（Ｆｕｎｇら、「Ａｍｉｎｏ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｌｉｎｋｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ、 ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ、ａｎｄ ｕｓｅｆｕｌ ｃｏｎｊｇｕａｔｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」、米国特許第４，７５７，１４１号、１９８８年７月１２日発行） か；あるいは、例えば、アルキニルアミノ連結基を介してジデオキシヌクレオチドの核酸塩基上に連結され得る（Ｋｈａｎら、「Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｐｒｏｐａｒｇｙｌｅｔｈｏｘｙａｍｉｄｏ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｕｓｉｎｇ ｓａｍｅ」米国特許第５，７７０，７１６号、１９９８年６月２３日発行、および米国特許第５，８２１，３５６号、１９９８年１０月１３日発行；Ｈｏｂｂｓ，ＦおよびＴｒａｉｎｏｒ，Ｇ．「Ａｌｋｙｎｙｌａｍｉｎｏ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」、米国特許第５，１５１，５０７号、１９９２年９月２９日 発行）。
【０１８６】
代表的な配列決定試験は、図１６に示され、ここで、３’−フルオロターミネーターは
、色素化合物１３を用いて、プロパルギルエトキシアミドリンカー（ＥＯ）：３’ＦｄｄＧＴＰ−ＥＯ−１３を介して標識される：
【０１８７】
【化３７】

【０１８８】
上記フラグメント分析方法において、標識されたポリヌクレオチドは、クロマトグラフィー、アフィニティー、または電気泳動手順によって分離される。好ま しくは、この分離は、電気泳動である（ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＨａｍｅｓ編、Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８１）。好ましいタイプの電気泳動マト リクスは、架橋ポリアクリルアミドまたは非架橋ポリアクリルアミド、あるいは他のアミド含有ポリマーであり、これは、約２〜２０重量パーセントの濃度（体積に対する重量）を有する（Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉら、「Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｅｓｉｓ」米国特許第５，５５２，０２８号、１９９６年９月３日発行）。電気泳動マトリクスは、スラブ（ｓｌａｂ）ゲルまたはキャピラリー形式で構成され得る（Ｍａｔｈｉｅｓら、「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ａｒｒａｙ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｃａｎｎｅｒ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ」、米国特許第５，２７４，２４０号、１９９３年１２月２８日発行）。より好ましくは、ポリアクリルアミドの濃度は、約４〜８％の間である。好ましくは、特にＤＮＡ配列決定において、電気泳動マトリクスは、変性剤（例えば、尿素、ホルムアミ ドなど）を含む（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７９〜１８５頁（１９８２）；ＰＥ Ｃｏｒｐ．、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^TM ３７７ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ、Ｒｅｖ．Ａ，Ｃｈａｐｔｅｒ
２（Ｐ／Ｎ ９０３４３３、ＰＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）Ｊａｎｕａｒｙ １９９５）。最適電気泳動条件（例えば、特定の分離に使用さ
れる、ポリマー、ポリマー濃度、ｐＨ、温度、変性剤の濃度）は、分離されるべきポリヌクレオチドのサイズ範囲、それらの塩基組成（それらは一本鎖または二本鎖であるか否かにかかわらない）、および情報が電気泳動によって探索される分類の性質を含む多くの因子に依存する（Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｐ．「Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｌｏｗ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ｍｅｄｉｕｍ」、米国特許第５，３７４，５２７号、１９９４年１２月２０日発行）。従って、本発明の用途は、特定の分離のために条件を最適化するために標準的な予備的試験を必要とし得る。
【０１８９】
本発明の色素を用いて標識されるポリヌクレオチドはまた、電気泳動易動の割合を影響する部分（すなわち、易動度改変標識）を用いて標識され得る。易動度改変標識には、エチレンオキシ単位、−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−のポリマー（ここで、ｎは、１〜１００であ
り得る）が挙げられる（Ｇｒｏｓｓｍａｎｎら、「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ａ ｍｉｘｅｄ ＤＮＡ− ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｈａｉｎ ｐｒｏｂｅ」、米国特許第５，６２４，８００号、１９９７年４月２９日発行）。好ましくは、ｎは、２〜２０である。具体的には、フルオレセイン色素標識ポリヌクレオチドを、別個の既知のサイズのポリエチレンオキシのさらなる標識を用いて標識することによって、ポリヌクレオチド におけるヌクレオチドの数に独立して、電気泳動および検出による別次元の分離を可能にする。すなわち、同じ長さのポリヌクレオチドが、スペクトル的に分解可能な色素標識および易動度改変標識に基づいて識別され得る。色素標識と易動度改変標識の両方を有するポリヌクレオチドは、単一標識ポリヌクレオチドまた はヌクレオチド組成のライゲーションまたはポリメラーゼ伸長によって酵素的に形成され得る。あるいは、合成オリゴヌクレオチドは、本発明の色素の標識および易動度改変因子を有し得、これらは、自動化合成の間に（例えば、ホスホラミダイト試薬）、またはアミノ−またはチオール−オリゴヌクレオチドに合成後 カップリング（例えば、ＮＨＳ標識カップリング）によって組み込まれる。
【０１９０】
電気泳動分離に続いて、色素ポリヌクレオチド結合体は、色素標識ポリヌクレオチドからの蛍光発光を測定することによって検出される。このような検出を実 施するために、標識ポリヌクレオチドは、標準的手段（例えば、高強度水銀蒸気ランプ、レーザーなど）によって照射される。好ましくは、照射手段は、約４５０ｎｍより上の波長での照射ビームを有するレーザーである。より好ましくは、色素−ポリヌクレオチドは、アルゴンイオンまたはＨｅ−Ｎｅガスレーザー あるいは固体状態ダイオードレーザーによって生成されるレーザー光によって照射される。次いで、蛍光は、光感受性検出器（例えば、光電子増倍管、電荷結合デバイスなど）によって検出される。例示的な電気泳動検出システムは、別に記載される（Ｈｏｆｆら、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」、米国特許第５，５４３，０２６号、１９９６年８月６日発行；Ｍａｔｈｉｅｓら、 「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ａｒｒａｙ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｃａｎｎｅｒ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ」、米国特許第５，２７４，２４０号、１９９３年１２月２８日発行；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、「Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、米国特許第４，８１１，２１８号、１９８９年３月７日発行）。
【０１９１】
（ＶＩ．７ 実施例）
本発明は、以下の実施例によってさらに実施され得る。これは、本発明の純粋な例示であり、いずれの方法においても本発明の範囲を限定しないことを意図する。
【０１９２】
（実施例１）
（１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−ベンゼン１の合成）
１，３−ジメトキシフェン−２−イルボロン酸：
【０１９３】
【化３８】

【０１９４】
（１０ｇ、５４．９５ｍｍｏｌ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）、２−ブロモトルエン（１８．８１ｇ、１１０ｍｍｏｌ）、グリム（ｇｌｙｍｅ）（２００ｍｌ）、およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｈ₃Ｐ）₄Ｐｄ⁰
（４ｇ、３．４６ｍｍｏｌ）を、１５分間攪拌し、次いで、８ｇの炭酸カリウム（３５ｍｌ、水（ｒｅｆ）中）を添加した。６時間還流後、この反応混合物を、 水と酢酸エチルの１：１混合物８００ｍｌ中に注いだ。有機層を水（３００ｍｌ×２）、およびブライン（２００×１）によって洗浄し、溶媒を除去し、そして粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン、酢酸エチル０％〜１０％）によって精製し、１を１０．５ｇ（８４％）で得た（図１）。
【０１９５】
（実施例２）
（１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−４−ブロモベンゼン２の合成）
１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−ベンゼン１（１０ｇ、４３．８６ｍｍｏｌ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（８．２６ｇ、４６． ４ｍｍｏｌ）、および過塩素酸（７０％、０．５ｍｌ）を、ジクロロメタン（２００ｍｌ）中で混合し、そして室温で４時間攪拌させた。この反応混合物を、重炭酸ナトリウム溶液（５％、１００ｍｌ）でクエンチし、ジクロロメタン層を、水（１００ｍｌ）、ブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、そしてこの溶媒を除去し た。この粗生成物を、ヘキサンおよび酢酸エチル（０％〜１０％の酢酸エチル）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、２を１０．８ｇ（８０％）で得た。
【０１９６】
（実施例３）
（１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−４−（ピリド−３−イル）−ベンゼン３の合成）
ピリジン−３−ボロン酸（５．８１ｇ、４７．２７ｍｍｏｌ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）、１，３−ジメトキシ−２−（トール− ２−イル）−４−ブロモベンゼン（２）（１０．７ｇ、３４．８ｍｍｏｌ）、グリム（２００ｍｌ）、およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｈ₃Ｐ）₄Ｐｄ⁰（４ｇ、３．４
６ｍｍｏｌ）を、１５分間攪拌し、次いで、炭酸カリウム（１６ｇ、７０ｍｌの水中）を添加した。１０時間還流後、この反応混合物を、水と酢酸エチルの１： １混合物８００ｍｌ中に注いだ。有機層を水（３００ｍｌ×２）、およびブライン（２００ｍｌ）によって洗浄し、溶媒を除去し、そして粗生成物を、ヘキサンおよび酢酸エチル（１０％〜２５％の酢酸エチル）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、３を８．８ｇ（８３％）で得た。
【０１９７】
（実施例４）
（２−（トール−２−イル）−４−（ピリド−３−イル）−１，３−ジヒドロキシベン
ゼン４の合成）
１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−４−（ピリド−３−イル）−ベンゼン３（３．５ｇ、１１．４６ｍｍｏｌ）、酢酸（３０ｍｌ）、および臭 化水素酸（４８％）（１５ｍｌ）を、２４時間還流した。この反応混合物を冷却後、この試薬のほとんどを減圧下で除去し、この残留の酸を、重炭酸ナトリウム溶液（５％）（１００ｍｌ）とこの濃縮物を混合することによって除去した。この生成物を、酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出し、水（１００ｍｌ×２）および ブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、そしてこの酢酸エチルをエバポレートした。この粗生成物を、ジクロロメタンおよびアセトン（０％〜１０％のアセトン）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、４を２．８ｇ（９０％）で得た。
【０１９８】
（実施例５）
（ケトン５の合成）
（２−（トール−２−イル）−４−（ピリド−３−イル）−１，３−ジヒドロキシベンゼン４（６３０ｍｇ、２．２５ｍｍｏｌ）、２，５−ジクロロトリメリト酸無水物：
【０１９９】
【化３９】

【０２００】
（Ｍｅｎｃｈｅｎら、Ｓ．”４，７−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
ｄｙｅｓ ａｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ”、米国特許第５，８８５，７７８号、１９９９年３月２３日発行）（５９０ｍｇ、２． ２５ｍｍｏｌ）、ニトロベンゼン（２０ｍｌ）、および塩化アルミニウム（ニトロベンゼン中）（１２ｍｌ、１Ｍ）を、室温で２４時間攪拌した。この反応混合物を、氷水（５０ｍｌ）、酢酸エチル（１００ｍｌ）、およびｎ−ブタノール（２０ｍｌ）の混合物中に注ぎ、次いで、１０％のＨＣｌ（５０ｍｌ）を添加し て、このアルミニウム塩を溶解させた。有機層を、水（５０ｍｌ×２）およびブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、そしてこの溶媒をエバポレートして、異性体５ａおよび５ｂの混合物として生成物を得た。ジクロロメタン中のメタノール（１０％〜３０％のメタノール）、および酢酸（１％）を用いるシリカゲルカラムクロ マトグラフィーによる分離によって、所望の遅く移動する異性体５ｂ（３８０ｍｇ、３１％）を得た。これは、図１に示される構造を有すると考えられる。
【０２０１】
（実施例６）
（１，３−ジメトキシナフタレン６）
１，３−ジヒドロキシナフタレン（１５ｇ、９３．６ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（２０ｇ、１４４．７ｍｍｏｌ）（アセトン（２００ｍｌ）中）に、ジメ チルスルフェート（２１ｍｌ、２２２ｍｍｏｌ）を添加した。一晩攪拌後、この反応混合物を、１０％の水酸化ナトリウム（１００ｍｌ）と混合し、酢酸エチル（２００ｍｌ×２）で抽出した。有機層を、水（１００ｍｌ×２）で洗浄し、エバポレートし、そして任意の未反応ジメチルスルフェートをクエンチするため に、この残渣を、水酸化アンモニウム（５０ｍｌ）で２時間攪拌させた。生成物を、酢酸エチル（２００ｍｌ）で抽出し、そして水（１００ｍｌ×２）およびブライン（１００ｍｌ）で洗浄した。この溶媒をエバポレートして、６を１５ｇ（８５％）で得た。
【０２０２】
（実施例７）
（Ｂｉｓ−（１，３−ジメトキシナフト−２−イル）−ジメチルスズ７）
１，３−ジメトキシナフタレン（６）（７．１ｇ、３７．７３ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（６０ｍｌ）に溶解させ、−７０℃まで冷却させ、テトラメチルエチ レンジアミン（０．２ｍｌ）を添加し、次いで、ｎ−ブチルリチウム（２６ｍｌ、１．６Ｍ（ヘキサン中））を添加した。この溶液を、冷却状態で３０分間、そして周囲温度で１時間攪拌した後、この溶液を再び−２０℃まで冷却させ、そして２塩化ジメチルスズ、ＳｎＭｅ₂Ｃｌ₂（５．０５ｇ（２０ｍｌ ＴＨＦ中））を添加した。この反応混合物を、周囲温度で２時間攪拌させ、水（１００ｍｌ）に注ぎ、そして酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽 出させた。有機層を、水（５０ｍｌ）、ブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、そしてエバポレートした。残渣を、ヘキサン（５０ｍｌ）より再結晶し、７を６．８ｇ（６９％）で得た。
【０２０３】
（実施例８）
（１，３−ジメトキシ−２−ブロモナフタレン８）
Ｂｉｓ−（１，３−ジメトキシナフト−２−イル）−ジメチルスズ７（１１ｇ、２１ｍｍｏｌ）（ＴＨＦ（５００ｍｌ）中）を、−３０℃まで冷却し、そして Ｎ−ブロモスクシンイミド（８ｇ、４５ｍｍｏｌ）を添加した。−３０℃で２時間攪拌させた後、この反応混合物を、水（２００ｍｌ）および酢酸エチル（２００ｍｌ）でクエンチした。有機層を、１０％塩化水素酸（１００ｍｌ）、水（１００ｍｌ×２）、ブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、そしてエバポレート した。この粗生成物を、ヘキサン−酢酸エチル（０％〜１０％の酢酸エチル）で溶出させるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、８を９ｇ（８０％）で得た。
【０２０４】
（実施例９）
（２−（ピリド−３−イル）−１，３−ジメトキシナフタレン９）
ピリジン−３−ボロン酸（３．９４ｇ、３２ｍｍｏｌ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）、１，３−ジメトキシ−２−ブロモナフタレン
８（６．６ｇ、２４．７ｍｍｏｌ）、グリム（２００ｍｌ）、およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｈ₃Ｐ）₄Ｐｄ（３ｇ、２．７ｍｍｏｌ）を、１５分間攪拌し、次いで、炭酸カリウム（１１．４ｇ、水（５０ｍＬ）中）を添加した。一晩還流後、この反応混合物を、水と酢 酸エチルの１：１（８００ｍｌ）中に注いだ。有機層を水（３００ｍｌ×２）、およびブライン（２００ｍｌ）によって洗浄し、溶媒を除去し、そして粗生成物を、ジクロロメタンおよびアセトン（０％〜５％のアセトン）を用いて溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、９を５．１ｇ（８４％）で得 た。
【０２０５】
（実施例１０）
（２−（トール−２−イル）−１，３−ジメトキシナフタレン１０）
この化合物を、８およびトール−２−イルボロン酸（Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用して、本質的に実施例９と同じ手順によって調製した。
【０２０６】
（実施例１１）
（２−（ピリド−３−イル）−１，３−ジヒドロキシナフタレン１１の合成）
この化合物を、２−（ピリド−３−イル）−１，３−ジメトキシナフタレン９を使用して、実施例４に使用したのと同じ手順によって調製し、１１を得た。
【０２０７】
（実施例１２）
（２−（トール−２−イル）−１，３−ジヒドロキシナフタレン１２の合成）
この化合物を、２−（トール−２−イル）−１，３−ジメトキシナフタレン１０を使用して、実施例４に使用したのと同じ手順によって調製し、１２を得た。
【０２０８】
（実施例１３）
（色素１３の合成）
ケトン５ｂ（２５０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）および２−（ピリド−３−イル）−１，３−ジヒドロキシナフタレン１１（１０９ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ） を、メタンスルホン酸（７ｍｌ）と混合し、そして１００℃で１時間攪拌した。この溶液を、室温まで冷却し、次いで氷水（５０ｍｌ）に注いだ。色素を、ｎ−ブタノール（５０ｍｌ×２）で抽出し、そして水（２０ｍｌ×２）で洗浄した。この溶媒を、減圧下でエバポレートし、そして色素を逆相シリカゲルクロマトグ ラフィー（５０％のメタノール）により精製し、１３を１０３ｍｇ（３０％）で得た（図３）。
【０２０９】
（実施例１４）
（色素１４の合成）
この色素を、２−（トール−２−イル）−１，３−ジヒドロキシナフタレン １２および５を使用して、実施例１３に使用したのと同じ手順によって調製した。
【０２１０】
（実施例１５）
（色素１５の合成）
この色素を、２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン（Ｂｅｎｓｏｎら、”Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｂｅｎｚｏｘａｎｔｈｅｎｅ ｄｙｅｓ”、米国 特許第５，８４０，９９９号（１９９８年１１月２４日発行））および５を使用して、実施例１３に使用したのと同じ手順によって調製した。
【０２１１】
（実施例１６）
（色素１６の合成）
２−（トール−２−イル）−４−（ピリド−３−イル）−１，３−ジヒドロベンゼン４（５２ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、２，５−ジクロロトリメリト酸無水 物（Ｍｅｎｃｈｅｎら、”４，７−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｙｅｓ ａｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ”、米国特許第５，８８５，７７８号、１９９９年３月２３日発行））（３６．５ｍｇ、１４ｍｍｏｌ）、およびメタンスルホン酸（１ｍｌ）を加熱し、そして１３０〜１３５℃で ２時間攪拌した。この溶液を室温まで冷却し、次いで氷水（５０ｍｌ）に注いだ。この粗色素を、ｎ−ブタノール（５０ｍｇ×２）で抽出し、そいてこの抽出物を水（２０ｍｌ×２）で洗浄した。溶媒を、減圧下でエバポレートし、２つの異性体の混合物として粗色素を得た。この異性体を、分取薄層クロマトグラフィー （シリカゲル；ジクロロメタン：メタノール；酢酸／１００：１０：２（ｖ：ｖ：ｖ）移動相）によって分離し、所望の遅く移動する異性体１６を２４ｍｇ（３０％）で得た。
【０２１２】
（実施例１７）
（２，３−ジメトキシ−４−（ピリド−３−イル）ベンジル１７の合成）
２，４−ジメトキシフェニル−４−イルボロン酸（０．９ｇ、４．９７ｍｍｏｌ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）、３−ブロモピリジン（０．８２ｇ、５ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｈ₃Ｐ）₄Ｐｄ⁰（
０．６５ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）、およびトリエチルアミン（２．１ｍｌ）を混合し、１１０〜１２０℃で１６時 間攪拌した。この反応混合物を、水および酢酸エチルの混合物１：１（１００ｍｌ）に注ぎ、そして有機層を、水（５０ｍｌ×２）およびブライン（５０ｍｌ）で洗浄した。溶媒を取り除いた後、粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー（０％〜１０％のアセトン（ジクロロメタン中））によって精製し、１７を０． ４５ｇ（４２．５％）で得た。
【０２１３】
（実施例１８）
（４−（ピリド−３−イル）−１，３−ジヒドロキシベンゼン１８の合成）
この化合物を、２，３−ジメトキシ−４−（ピリド−３−イル）ベンジル１７を使用して、実施例４で使用されるのと同じ手順によって調製し、１８を得た。
【０２１４】
（実施例１９）
（色素１９の合成）
この色素を、４−（ピリド−３−イル）−１，３−ジヒドロキシベンゼン１８および２，５−ジクロロトリメリト酸無水物を使用して、実施例１６で使用されるのと同じ手順によって調製した。
【０２１５】
（実施例２０）
（２，３−ジメトキシ−４−（ピリド−２−イル）ベンゼン２０の合成）
この化合物を、２，４−ジメトキシフェニル−４−イルボロン酸および２−ブロモピリジンを使用して、実施例１７で使用されるのと同じ手順によって調製し、２０を得た。
【０２１６】
（実施例２１）
（２，３−ジヒドロキシ−４−（ピリド−２−イル）ベンゼン２１の合成）
この化合物を、２，３−ジメトキシ−４−（ピリド−２−イル）ベンゼン２０を使用して、実施例４で使用されるのと同じ手順によって調製し、２１を得た。
【０２１７】
（実施例２２）
（色素２２の合成）
この化合物を、４−（ピリド−３−イル）−１，３−ジヒドロベンゼン２１および２，５−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例１６で使用されるのと同じ手順によって調製した。
【０２１８】
（実施例２３）
（１，３−ジメトキシ−４−（キノン−３−イル）ベンゼン２３の合成）
この化合物を、１，３−ジメトキシフェン−４−イルボロン酸および３−ブロモキノリンを使用して、実施例１７で使用されるのと同じ手順を使用して調製し、２３を得た。
【０２１９】
（実施例２４）
（１，３−ジヒドロキシ−４−（キノン−３−イル）ベンゼン２４の合成）
この化合物を、１，３−ジメトキシ−４−（キノン−３−イル）ベンゼン２３を使用して、実施例４で使用されるのと同じ手順によって調製し、２４を得た。
【０２２０】
（実施例２５）
（色素２５の合成）
この色素を、１，３−ジヒドロキシ−４−（キノン−３−イル）ベンゼン２４および２，５−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例１６で使用されるのと同じ手順によって調製した。
【０２２１】
（実施例２６）
（１，３−ジメトキシ−４−（キノン−２−イル）ベンゼン２６の合成）
この化合物を、１，３−ジヒドロキシフェン−４−ボロン酸および２−ブロモキノリンを使用して、実施例１７で使用されるのと同じ手順を使用して調製し、２６を得た。
【０２２２】
（実施例２７）
（１，３−ジヒドロキシ−４−（キノン−２−イル）ベンゼン２７の合成）
この化合物を、１，３−ジメトキシ−４−（キノン−２−イル）ベンゼン２６を使用して、実施例４で使用されるのと同じ手順によって調製し、２７を得た。
【０２２３】
（実施例２８）
（色素２８の合成）
この色素を、１，３−ジヒドロキシ−４−（キノン−２−イル）ベンゼン２７および２，５−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例１６で使用されるのと同じ手順によって調製した。
【０２２４】
（実施例２９）
（１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）ベンゼン２９の合成）
この化合物を、１，３−ジメトキシフェン−２−イルボロン酸および３−ブロモピリジンを使用して、実施例１で使用されるのと同じ手順によって調製し、２９を得た。
【０２２５】
（実施例３０）
（１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）−４−ブロモベンゼン３０の合成）
この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）ベンゼン２９およびＮ−ブロモスクシンイミドを使用して、実施例２で使用されるのと同じ手順によって調製し、３０を得た。
【０２２６】
（実施例３１）
（１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）−４−フェニルベンゼン ３１の合成）
この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）−４−ブロモベンゼン３０およびフェニルボロン酸を使用して、実施例３で使用されるのと同じ手順によって調製し、３１を得た。
【０２２７】
（実施例３２）
（１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）−４−フェニルベンゼン３２の合成）
この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）−４−フェニルベンゼン３１を使用して、実施例４で使用されるのと同じ手順によって調製し、３２を得た。
【０２２８】
（実施例３３）
（色素３３の合成）
この色素を、１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）−４−フェニルベンゼン３２および２，５−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例１６で使用されるのと同じ手順によって調製した。
【０２２９】
（実施例３４）
（１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−４−フェニルベンゼン３４の合成）
この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−４−ブロモベンゼン２およびフェニルボロン酸を使用して、実施例３で使用されるのと同じ手順によって調製し、３４を得た。
【０２３０】
（実施例３５）
（１，３−ジヒドロキシ−２−（トール−２−イル）−４−フェニルベンゼン３５の合成）
この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−４−フェニルベンゼン３４を使用して、実施例４で使用されるのと同じ手順によって調製して、３５を得た。
【０２３１】
（実施例３６）
（色素３６の合成）
この色素を、１，３−ジヒドロキシ−２−（トール−２−イル）−４−フェニルベンゼン３５および２，５−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例１６で使用されるのと同じ手順によって調製した。
【０２３２】
（実施例３７）
（１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−２−イル）ベンゼン３７の合成）
この化合物を、１，３−ジメトキシフェン−２−イルボロン酸および２−ブロモピリジンを使用して、実施例１で使用されるのと同じ手順によって調製し、３７を得た。
【０２３３】
（実施例３８）
（１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−２−イル）−４−ブロモベンゼン３８の合成）
この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−２−イル）ベンゼン３７およびＮ−ブロモスクシンイミドを使用して、実施例２で使用されるのと同じ手順によって調製し、３８を得た。
【０２３４】
（実施例３９）
（１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−２−イル）−４−（ナフト−２−イル）ベンゼン３９の合成）
この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−２−イル）−４−ブロモベンゼン３８およびナフト−２−イルボロン酸を使用して、実施例３で使用されるのと同じ手順によって調製し、３９を得た。
【０２３５】
（実施例４０）
（１，３−ジヒドロキシ−２−（ピリド−２−イル）−４−（ナフト−２−イル）ベンゼン４０の合成）
この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−２−イル）−４−（ナフト−２−イル）ベンゼン３９を脱メチル化して、実施例４で使用されるのと同じ手順によって調製し、４０を得た。
【０２３６】
（実施例４１）
（色素４１の合成）
この色素を、１，３−ジヒドロキシ−２−（ピリド−２−イル）−４−（ナフト−２−イル）ベンゼン４０および２，５−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例１６で使用されるのと同じ手順によって調製した。
【０２３７】
（実施例４２）
（色素の性質）
本発明のフルオレセイン色素のいくつかの特定の性質を、測定した（表１）。
【０２３８】
【表１】

【０２３９】
表１．色素の性質
^a色素の酸形態の発光最大
^b半波高全幅値
^c５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）との比較
各個々の刊行物または特許出願が、特異的および個々に参考として援用されると示される場合と同程度まで、全刊行物および特許出願は、本明細書中において参考として援用される。
【０２４０】
特定の実施形態が上に詳細に記載されるが、当業者は、多くの改変がその技術から逸脱することなく好ましい実施形態において可能であることを明瞭に理解する。このような改変の全ては、以下の発明の詳細な説明内に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１】図１は、化合物１〜５の構造を示す。
【図２】図２は、化合物６〜１２の構造を示す。
【図３】図３は、化合物１３および１４の構造を示す。
【図４】図４は、化合物１５および１６の構造を示す。
【図５】図５は、化合物１７〜２２の構造を示す。
【図６】図６は、化合物２３〜２５の構造を示す。
【図７】図７は、化合物２６〜２８の構造を示す。
【図８】図８は、化合物２９〜３３の構造を示す。
【図９】図９は、化合物３４〜３６の構造を示す。
【図１０】図１０は、化合物３７〜４１の構造を示す。
【図１１】図１１は、電子欠乏窒素複素環の代表的な収集を示す。
【図１２】図１２は、化合物１９の蛍光定量走査を示す；１Ｘ ＴＢＥ中、室温で、励起最大値５３０ｎｍ、発光最大値５５４ｎｍ。
【図１３】図１３は、化合物２２の蛍光定量走査を示す；１Ｘ ＴＢＥ中、室温で、励起最大値５３１．５ｎｍ、発光最大値５５６ｎｍ。
【図１４】図１４は、化合物２５の蛍光定量走査を示す；１Ｘ ＴＢＥ中、室温で、発光最大値５６２．５ｎｍ。
【図１５】図１５は、化合物３３の蛍光定量走査を示す；１Ｘ ＴＢＥ中、室温で、励起最大値５４５．５ｎｍ、発光最大値５７１．５ｎｍ。
【図１６】図１６は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０由来の標識化連鎖フラグメントの蛍光検出を示す。ｐＧＥＭ標的のＧ末端配列からの塩基１８３〜塩基 １７６の領域、−２１Ｍ１３前方プライマーを使用。試薬：ＰＯＰ６電気泳動培地、Ｔａｑ ＦＳポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物 各２５ｐｍｏｌのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＴＴＰ。トップパネル：ｄＮＴＰ混合物およびターミネーター３’ＦｄｄＧＴＰ−ＥＯ−１３。ボトムパネル：ｄＮＴＰ混合物およびエ ネルギー移動色素ターミネーター３’ＦｄｄＧＴＰ−ＥＯ−６ＦＡＭ−Ｂｎ−ｄＲ１１０。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の化合物。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【公開番号】特開２００７−２７７５６５（Ｐ２００７−２７７５６５Ａ）
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１２４００５（Ｐ２００７−１２４００５）
【出願日】平成１９年５月８日（２００７．５．８）
【分割の表示】特願２００５−２５５７７０（Ｐ２００５−２５５７７０）の分割
【原出願日】平成１３年２月５日（２００１．２．５）
【出願人】（５０００６９０５７）アプレラ　コーポレイション (120)
【住所又は居所原語表記】８５０　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｃｅｎｔｒｅ　Ｄｒｉｖｅ　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ　ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ　９４４０４　Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】