母体試料から胎児核酸を分離、単離または富化するために、母親とその胎児との間で示差的にメチル化されているゲノム領域を利用する組成物およびプロセスが提供される。本明細書に記載の組成物およびプロセスは、染色体の異数性を検出することを含めた、非侵襲的な出生前診断のために特に有用である。本発明は、とりわけ、これらに限定されないが、胎児核酸の存在または非存在、胎児核酸の絶対量または相対量、胎児の性別、および異数性などの胎児の染色体異常を含めた胎児の遺伝形質を非侵襲的に検出するために有用なヒトの後成的なバイオマーカーを提供する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児核酸を調製するための方法であって、
ａ）妊婦に由来する試料を提供する工程と；
ｂ）該妊婦の該試料に由来する胎児核酸を母体核酸から、該胎児核酸と該母体核酸の等価物との間のメチル化状態の違いによって分離する工程であって、該胎児核酸が、配列番号９０〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む工程と；
ｃ）パート（ｂ）において分離された胎児核酸を鋳型として利用するプロセスによって胎児核酸を含む核酸を調製する工程と
を含む方法。
【請求項２】
メチル化されたヌクレオチドに特異的に結合する作用剤によって前記胎児核酸を前記母体核酸から分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
メチル化されたヌクレオチドに結合する前記作用剤がメチル−ＣｐＧ結合性タンパク質（ＭＢＤ）またはその断片である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
メチル化されたヌクレオチドに結合する前記作用剤が、メチル化された胎児核酸に結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
メチル化されたヌクレオチドに結合する前記作用剤が、メチル化された母体核酸に結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
メチル化されていないヌクレオチドに特異的に結合する作用剤によって前記胎児核酸を前記母体核酸から分離する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
メチル化されていない母体核酸を特異的に消化する作用剤によって前記胎児核酸を前記母体核酸から分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
メチル化されていない母体核酸を特異的に消化する前記作用剤が、メチル化感受性制限酵素である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
２種以上のメチル化感受性制限酵素を同じ反応において使用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｃ）の前記プロセスが増幅反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｃ）の前記プロセスが、胎児核酸の絶対量を決定するための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号９０〜２６１のポリヌクレオチド配列の３つ以上を調製する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
示差的にメチル化された母体核酸および胎児核酸を含む母体試料中の胎児核酸の絶対量を決定するための方法であって、
ａ）１種以上のメチル化感受性制限酵素を使用して母体試料中の該母体核酸を消化し、それによって、配列番号９０〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む該胎児核酸を富化する工程と；
ｂ）多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を使用して、工程ａ）からの胎児核酸の絶対量を決定する工程と
を含む方法。
【請求項１４】
胎児核酸の所与の絶対量または濃度が特定の臨床的感度要件または臨床的特異性要件を満たす必要がある、胎児の形質を決定するための診断方法と併せて、胎児核酸の絶対量または濃度を使用する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
示差的にメチル化された母体核酸および胎児核酸を含む母体試料中の胎児核酸の濃度を決定するための方法であって、
ａ）該母体試料中に存在する核酸の総量を決定する工程と；
ｂ）メチル化感受性制限酵素を使用して母体試料中の該母体核酸を消化し、それによって該胎児核酸を富化する工程と；
ｃ）配列番号９０〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む、工程ｂ）からの胎児核酸の量を、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を使用して決定する工程と；
ｄ）工程ａ）からの核酸の総量を、工程ｃ）からの胎児核酸の量と比較し、それによって該母体試料中の胎児核酸の濃度を決定する工程と
を含む方法。
【請求項１６】
胎児核酸の所与の絶対量または濃度が特定の臨床的感度要件または臨床的特異性要件を満たす必要がある、胎児の形質を決定するための診断方法と併せて、胎児核酸の絶対量または濃度を使用する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
示差的にメチル化された母体核酸および胎児核酸を含む母体試料に由来する胎児核酸を使用して胎児の異数性の存在または非存在を決定するための方法であって、
ａ）メチル化感受性制限酵素を使用して母体試料中の該母体核酸を消化し、それによって該胎児核酸を富化する工程と；
ｂ）配列番号１６４〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む、標的染色体に由来する胎児核酸の量を、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を使用して決定する工程と；
ｃ）配列番号９０〜１６３のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む、参照染色体に由来する胎児核酸の量を、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を使用して決定する工程と；
ｄ）工程ｂ）からの胎児核酸の量を、工程ｃ）からの胎児核酸の量に対して比較する工程であって、標的胎児核酸の量と参照胎児核酸の量との間の統計的有意差により、胎児の異数性の存在が示される工程と
を含む方法。
【請求項１８】
前記標的染色体および参照染色体のそれぞれの３〜１５個の遺伝子座における胎児核酸の量を決定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記メチル化感受性制限酵素の消化効率を決定する、請求項１３、１５または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記定量化を実施するための、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない方法が、胎児核酸の量を決定するための競合剤ベースの方法を使用する、請求項１３、１５または１７に記載の方法。
【請求項２１】
母体試料中に存在するＹ染色体核酸の存在または非存在を決定する工程をさらに含む、請求項１３、１５または１７に記載の方法。
【請求項２２】
男の胎児について、母体試料中に存在するＹ染色体核酸の量を決定する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
胎児核酸の量を、Ｙ染色体核酸の量と比較する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、または５０個超の遺伝子座における胎児核酸の量を決定する、請求項１３または１５に記載の方法。
【請求項２５】
母体試料中に存在する核酸の総量を決定する、請求項１３または１７に記載の方法。
【請求項２６】
核酸の総量と、男の胎児についてＹ染色体核酸の量とを決定する、請求項１３、１５または１７に記載の方法。
【請求項２７】
核酸の総量と、男の胎児についてＹ染色体核酸の量と、前記メチル化感受性制限酵素の消化効率とを全て決定する、請求項１３、１５または１７に記載の方法。
【請求項２８】
核酸の総量を決定するために２種以上のアッセイを使用し、男の胎児についてＹ染色体核酸の量を決定するために１種以上のアッセイを使用し、前記メチル化感受性制限酵素の消化効率を決定するために１種以上のアッセイを使用する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
３つ以上の遺伝子座における胎児核酸の量を決定する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
消化された母体核酸の平均長よりも大きなアンプリコンを生成する増幅反応によって前記胎児核酸の量を決定し、それによって該胎児核酸をさらに富化する、請求項１３、１５または１７に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図９Ｄ】

【図９Ｅ】

【図９Ｆ】

【図９Ｇ】

【図９Ｈ】

【図９Ｉ】

【図９Ｊ】

【図９Ｋ】

【図９Ｌ】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図４】

【公表番号】特表２０１３−５０５０１９（Ｐ２０１３−５０５０１９Ａ）
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２９７５６（Ｐ２０１２−５２９７５６）
【出願日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２７８７９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３４６３１
【国際公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（５０４１５９５３４）セクエノム，　インコーポレイテッド (5)
【出願人】（５１１０６６９０８）
【Ｆターム（参考）】