非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルス、その調製および使用
本発明は、非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルスおよび、特にインビトロ、エクスビボまたはインビボで遺伝子を導入するための組成物を調製するためのその使用に関する。本発明は、任意の哺乳動物器官、例えば肝臓、筋肉、膵臓又は中枢神経系（眼球を含む）組織または細胞において遺伝子を導入するため、ならびに特に、例えば眼球を含む中枢神経系の障害などの障害または病理を処置するために有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルスおよび特にインビトロ、エクスビボまたはインビボで遺伝子を導入するための組成物を調製するためのその使用を説明する。本発明は、任意の哺乳動物器官において、例えば肝臓、筋肉、膵臓又は中枢神経系（眼球を含む）組織もしくは細胞において遺伝子を導入するため、および特に、例えば眼球を含む中枢神経系の障害などの障害または病理を処置するために有用である。
【０００２】
特に実験（例えば研究）および治療分野において神経系における遺伝子の導入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）のための多数の用途がある。従って、この導入は、標識化、毒性、品質の研究、病理学的モデルの構築、欠損の復活、治療産物の発現（例えば、タンパク質、ＲＮＡｓ等）等を行うことを可能とすることができる。
【０００３】
ウイルスベクター（レトロウイルス、ＡＡＶ、アデノウイルス等）の使用、プラスミドの注入、細胞移植、カプセル化された細胞の移植などのこの導入のための種々のアプローチが先行技術で考察された。これらのアプローチの各々は、効率、安全性、工業的使用、選択性、安定性等の点で利点および欠点を有する。従ってウイルスベクターの使用は、ウイルスの自然感染性に関係した導入効率の点で有利である。
【０００４】
これに関して、オンコレトロウイルスに由来する多数のレトロウイルスベクターは、導入遺伝子の標的細胞のゲノムへの組み込みを可能とするが、これらのベクターは分裂細胞に形質導入することができるのみである。この制限は、エクスビボでの遺伝子の導入またはその細胞が有糸分裂的に活性である器官にそれらの使用を制限する。
【０００５】
この障害を克服するために、レンチウイルスに由来するベクターの使用が考慮された。現在開発された他のウイルスベクターに比べて、レンチウイルスベクターは産生の容易さおよびそれらの生物学の増加した知見を含むいくつかの実際の利点を与える。これらのベクターは、実験的遺伝子治療プロトコールの枠内で遺伝子を導入するために広く使用される。それらは、多数の細胞型、特に中枢神経系の休止細胞に有効に形質導入することを可能とする。実際に、レンチウイルスは、有糸分裂的に活性ではない細胞のゲノムに組み込むことができる複雑なレトロウイルスである。これらのレンチウイルスの例は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＶＩＳＮＡ、ＣＡＥＶおよびＥＩＡＶウイルスである。しかしながら、レトロウイルス、特にレンチウイルスの使用に関連した１つの欠点は、特に、それらが挿入突然変異誘発の潜在的危険を有することにある。なぜならば、それらは形質導入された細胞のクロマチンに組み込まれ、そして明らかに優先的にコード配列に組み込まれるからである。今日まで、この欠点は、インビボで遺伝子を導入するためのこの型のベクターの利用を制限してきた。
【０００６】
現時点で臨床的にこれらのベクターの使用に対する主な障害である挿入突然変異誘発の危険を減少させる目的で、本発明者は非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスベクターを開発した。従って、この新規な世代のレンチウイルスベクターの非組み込み型の性質は、特に遺伝子治療のバイオセーフティーに関して相当な進歩である。このベクターは、例えば、分裂しない細胞における導入遺伝子または他の核酸の安定な発現のため、または他のトランスフェクションの他の方法に抵抗性もしくは他のベクターによる形質導入の方法にすら抵抗性の分裂細胞における遺伝子の一過性発現のために使用することができる。
【０００７】
非組み込み型ベクターは先行技術で知られており、それらの最も普及しているのはアデノウイルスベクターおよびヘルペスベクターである。しかしながら、これらのタイプのベクターについて、すべての複製汚染物を含まないバッチを得ることを可能とする産生方法は現時点ではない。組み込み型ベクターの内、ＡＡＶベクターは相対的に低頻度（約１０％）でしか組み込まれないけれども、ＡＡＶベクターは、それにクローニングされうる導入遺伝子のサイズおよびＡＡＶベクターがそれらの挿入部位で引き起こす突然変異により制限される。
【０００８】
従って本発明は、先行技術の問題に対する解決を与え、そして神経系において遺伝子を導入するための新規なツールおよびベクターを与える。
【０００９】
本発明は、特に非複製型且つ非組み込み型組換えレンチウイルスの完成に関する。
【００１０】
一般に、本発明のレンチウイルスは、突然変異したインテグラーゼおよび特定の組換えゲノムを含む。さらに好ましくは、本発明に従うレンチウイルスは、（ｉ）ＬＴＲ５’レンチウイルス配列とＬＴＲ３’レンチウイルス配列との間にレンチウイルス包膜化ｐｓｉ配列（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｐｓｉ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＲＮＡ核外移行エレメント、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはＲＮＡの核内移行を促進する配列を含む組換えゲノム、ならびに（ｉｉ）該組換えゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みを阻止する突然変異したインテグラーゼを含む。本発明の１つの特定の態様では、組換えゲノムは、例えば配列５’ＬＴＲ−ｐｓｉ−ＲＲＥ−ｃＰＰＴ ＣＴＳ−導入遺伝子−ＬＴＲ３’を含む。
【００１１】
本発明の他の目的は、本発明に従うレンチウイルスおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物（ワクチン組成物を含む）に関する。
【００１２】
本発明は、特定の細胞の集団における標的遺伝子のインビトロ、エクスビボおよびインビボ導入のための方法および組成物に関し、そして障害、例えば眼系を含む中枢神経系の障害の処置にも関する。
【００１３】
本発明の他の目的は、哺乳動物細胞（好ましくはヒト）、好ましくは被験体の中枢神経系（眼球を含む）からの細胞にインビトロ、エクスビボまたはインビボで遺伝子を導入するための組成物を調製するための、上記した非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスの使用に関する。
【００１４】
本発明の目的は、適切なトランス相補性機能（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の存在下に、特に上記した修飾されたインテグラーゼをコードするレンチウイルスｐｏｌ領域の存在下に上記したごとき組換えゲノムを含むベクタープラスミドの細胞内への導入を含む、上記した非複製型且つ非組み込み型レンチウイルスを産生する方法でもある。この方法は、異なるトランス相補性およびエンベローププラスミドの一過性トランスフェクションにより行うことができ、または補助ウイルスの存在下におよび／または１以上の相補性タンパク質を発現する細胞系において行うことができる。
【００１５】
本発明は、インテグラーゼの組み込み機能の損失を誘導する突然変異を含む好ましくはレンチウイルスインテグラーゼを安定な方法で発現する細胞の系統にも関する。突然変異は、本発明の意味では、インテグラーゼのいくらかの塩基の点突然変異および／またはミクロ欠失に相当することができる。それは、好ましくは、インテグラーゼの塩基性領域、Ｃ末端領域（例えば、Ｃ末端の塩基性領域）および／または触媒部位に影響を与える１つ以上の点突然変異に相当し、該突然変異したインテグラーゼは組み込み機能を欠いている。
【００１６】
従って、本発明の１つの特定の目的は、
ａ）いかなるｐｓｉ包膜化シグナルも欠いておりそしてレンチウイルスｇａｇ配列および組み込み機能のないインテグラーゼをコードする突然変異したレンチウイルスｐｏｌ配列を含み、場合によりｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｕおよび／またはｖｐｒなどのアクセサリー遺伝子を欠失しているトランス相補性プラスミド、
ｂ）プロモーター−ｅｎｖ−ＰｏｌｙＡ配列を含むエンベローププラスミド、および
ｃ）レンチウイルスＬＴＲ５’配列とＬＴＲ３’配列との間にレンチウイルス包膜化ｐｓｉ配列、ＲＮＡ核外移行エレメント、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはＲＮＡの核内移行を促進する配列を含む組換えゲノム、ならびに該ゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みを阻止する突然変異したインテグラーゼを含み、レンチウイルスのいかなるコード配列も欠いているレンチウイルスベクタープラスミド、
を含む非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスベクター系を使用する細胞のトランスフェクション、および
産生したレンチウイルスの回収、
を含む非複製型且つ非組み込み型組換えレンチウイルスを調製する方法に関する。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、任意の哺乳動物細胞、特にヒト細胞への遺伝子の導入を可能とする非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルスを記載する。これらは、分裂細胞又は休止細胞、肝臓、膵臓、筋肉、心臓等の中枢器官又は末梢器官に属する細胞であることができる。本発明の１つの特定の目的は、神経系（眼球系を含む）におけるおよび特にニューロン、アストロサイト型グリア細胞および網膜細胞におけるならびに癌腫瘍における遺伝子の導入に関する。これらのレンチウイルスベクターは、特に神経系内での核酸配列のインビボ導入および発現のために有用である。
【００１８】
ベクターの一般的構造
他のレトロウイルスと同様に、レンチウイルスは、２つのＬＴＲ（長い末端反復）配列によりフランキングされたｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を有する。これらの遺伝子の各々は、単一の前駆体ポリペプチドの形態で最初に発現される多数のタンパク質をコードする。ｇａｇ遺伝子は内部構造タンパク質（キャプシドおよびヌクレオキャプシド）をコードする。ｐｏｌ遺伝子は、逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼをコードする。ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。さらに、レンチウイルスゲノムは、パッケージされるウイルスゲノムＲＮＡの核外移行の責任を担うシス作用性ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）エレメントを含有する。ＬＴＲ５’およびＬＴＲ３’配列は、ウイルスＲＮＡｓの転写およびポリアデニル化を促進するのに役立つ。ＬＴＲは、ウイルス複製に必要な他のシス作用性配列のすべてを含有する。ゲノムの逆転写のために必要な配列（ＲＮＡｔプライマーの連結部位）および粒子におけるウイルスＲＮＡの包膜化のために必要な配列（Ψ部位）は、ＬＴＲ５’に隣接している。包膜化のため（または感染性ビリオン中にレトロウイルスＲＮＡをパッケージするため）に必要な配列がウイルスゲノムに存在しないならば、ゲノムＲＮＡは能動的にパッケージされないであろう。さらに、レンチウイルスゲノムは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、ＴＡＴ、ＲＥＶなどのアクセサリー遺伝子を含む。
【００１９】
遺伝子導入用途のためのレンチウイルスベクターの構造は、例えば、特許ＵＳ５，６６５，５７７、ＥＰ３８６，８８２、ＵＳ５，９８１，２７６、ＵＳ６，０１３，５１６または特許出願ＷＯ９９／５８７０１およびＷＯ００２／０９７１０４に記載されている。これらのベクターは、欠陥のあるレンチウイルスゲノム、即ち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の少なくとも１つが不活性化されているかまたは欠失している欠陥のあるレンチウイルスゲノムを含む。
【００２０】
本発明に従うレンチウイルスベクターは、非複製型且つ非組み込み型組換えレンチウイルスであり、即ち、それは自己複製できずそして形質導入された細胞への特異的組み込みができない。さらに詳しくは、本発明は、ＬＴＲ５’レンチウイルス配列とＬＴＲ３’レンチウイルス配列との間にレンチウイルス包膜化ｐｓｉ配列およびＲＮＡ核外移行エレメント、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはＲＮＡの核内移行を促進する配列を含む組換えゲノム、ならびに該組換えゲノムの宿主細胞ゲノムへの組み込みを阻止する突然変異したインテグラーゼを含む、非複製型且つ非組み込み型組換えレンチウイルスに関する。本発明に従うレンチウイルスは、例えば、配列５’ＬＴＲ−ｐｓｉ−ＲＲＥ−ｃＰＰＴ ＣＴＳ−導入遺伝子−ＬＴＲ３’を含む。
【００２１】
本発明の１つの特定の目的は、レンチウイルスのゲノムがいかなるコード化レンチウイルス配列も有利に欠いているレンチウイルスに関する。
【００２２】
本発明のレンチウイルスの１つの重要な特徴は、それらが修飾されたインテグラーゼを含むということである。本発明は、導入遺伝子の発現のための有効な条件において、非複製型組換えレンチウイルスであって、その組み込みの性質が変えられている非複製型組換えレンチウイルスを産生することが可能であることを始めて証明する。修飾されたインテグラーゼの存在は、本発明のウイルスを産生するために、組み込み機能のないインテグラーゼを産生するような、しかし細胞形質導入のときベクターサイクルの前の段階に実質的ななんらの効果も及ぼさない（いわゆるクラス１突然変異）修飾されたｐｏｌ配列の使用から生じる。従って、得られるベクターは、有利には、インテグラーゼの突然変異が核に向けてのゲノムの進行を妨害しない限りにおいて、またはその後に環状化することができる（環の形成）線状ＤＮＡゲノムの形態においてそのレトロ転写を妨害しない限りにおいて、エピソーム表現型を有する。本発明の意味において、クラス１突然変異は、好ましくは、インテグラーゼの塩基性領域、Ｃ末端領域（好ましくはＣ末端領域の塩基性領域）および／または触媒部位をコードする核酸部分に影響を与える１つ以上の点突然変異からなる。点突然変異は、好ましくはインテグラーゼのコードされた配列において、アミノ酸の他のアミノ酸による置換に相当する。この突然変異は、好ましくは、それがインテグラーゼを組み込み非機能性にするという意味で非保存性である。このような突然変異は、好ましくは、インテグラーゼの他の機能、例えば核に向けてのベクターの進行に関与する機能を保存しながら、組み込み機能のないインテグラーゼを産生する突然変異体から選ばれる。ＨＩＶ−１に影響を与えそして組み込み機能のないインテグラーゼを得ることを可能とする突然変異の例は下記の突然変異：
Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｉ、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０Ｉ、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ−３５−Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ（Ｃ末端塩基性領域のＬ領域）、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９Ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ（Ｃ末端塩基性領域のＱ領域に属する２１４および２１６）、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ（Ｃ末端塩基性領域のＮ領域）およびＫ２６４Ｈである。
【００２３】
触媒部位に影響を与える突然変異は、好ましくは、ＨＩＶ−１に関して、インテグラーゼのアミノ酸６４、１１６および／または１５２に関する。このレンチウイルスのＣ末端部分に影響を与える突然変異は、有利には、ＡＡＨによる２６２ＲＲＫモチーフの置換、Ｑ領域における置換（Ｑ２１４Ｌおよび／またはＱ２１６Ｌ）、Ｌ領域における置換（Ｋ１８６）および／またはＬ領域における置換から選ばれる。好ましい突然変異は、ＡＡＨによる２６２ＲＲＫモチーフの置換からなる。
【００２４】
本発明のレンチウイルスは、典型的には、配列５’ＬＴＲ−ｐｓｉ−ＲＲＥ−ｃＰＰＴ ＣＴＳ−（プロモーター）−導入遺伝子−ＬＴＲ３’を有する組換えゲノムを含む。導入遺伝子は、典型的にはプロモーターの制御下に置かれる。１つおよび／または他をｃＰＰＴ ＣＴＳエレメントの上流に配置することもできる。
【００２５】
従って、組換えゲノムは、包膜化および形質導入のために有用なシス作用性ウイルス配列を含む。有利には、それは、あるレンチウイルス配列、特に
− ゲノムの包膜化のために必要な配列（レンチウイルス起源のｐｓｉ配列）；
− ＲＮＡ核外移行エレメント、を保存するのみである。後者は、有利には、レンチウイルスゲノム、特にＶＩＨ、例えばＶＩＨ−１のＲＥＶ応答エレメント（「ＲＥＶ応答エレメント」のためのＲＲＥ配列）（ＲＲＥ配列は、ウイルスＲＮＡ上に存在し、ＲＥＶ調節エレメントと相互作用する）、メイソン−ファイザーモンキーウイルスのＣＴＥ［構成的輸送エレメント（“Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｅｌｅｍｅｎｔ”）」、ＳＩＶ、ＨＩＶ−２またはＦＩＶの核外移行システムまたはあらゆる他のレトロウイルスの同等なエレメント（例えばＳＩＶ、ＨＩＶ２またはＦＩＶの核外移行システム）；
ＲＮＡの核内移行を促進する配列、例えば逆転写ベクターゲノムの有効な核内移行を可能とするｆｌａｐ配列［ｃＰＰＴ−ＣＴＳ領域（セントラルポリプリントラクト−セントラルターミネーション配列（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ−ｃｅｎｔｒａｌ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ））；Ｃｈａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｍａｙ １９９２； ＷＯ ０１／２７３０４］；および
− パッケージされたベクターＲＮＡの転写に介在する、場合により修飾されたＬＴＲ５’および３’、
から選ばれる。
【００２６】
組換えゲノムは、好ましくは、レンチウイルスコード配列のすべて、特にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ配列をコードするウイルス遺伝子、ならびにｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆアクセサリー遺伝子を欠失している。トランス相補性プラスミドは、好ましくは、ｔａｔおよびｒｅｖ遺伝子を保存している。ベクタープラスミドは、有利には、導入遺伝子の発現およびベクターの安全性を改良するためにＵ３エンハンサー配列を欠失したＬＴＲ３’（ＷＯ０９９／３１２５１）を含むことができる。
【００２７】
インテグラーゼ突然変異に加えて、他の標的を場合により突然変異させることができる：ＤＮＡ線状ゲノムの端部に位置するａｔｔ配列。これらの配列を突然変異させるならば、ゲノムに対するインテグラーゼの作用は、もはや正しくは起こらず、もはや組み込みは起こりえない。それ自体線状ＤＮＡの形態で存在するゲノムは環状化することができる。
【００２８】
本発明のベクターおよびプラスミドは、異なる種に属するレンチウイルス、特にＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＶＩＳＮＡ、ＣＡＥＶおよびＥＩＡＶから調製することができる。特に好ましい血清型は、ＨＩＶ、特にＨＩＶ−１、ＦＩＶ、ＥＩＡＶおよびＳＩＶである。
【００２９】
導入遺伝子の配列は、選ばれたプロモーターおよび／またはエンハンサーならびに該導入遺伝子の良好な発現に必要な転写調節エレメント、転写後調節エレメントおよび翻訳後調節エレメントの制御下に置くことができる。
【００３０】
本発明の意味では、用語「導入遺伝子」は、一般に、いかなるコード核酸又は非コード核酸も示す。これは、例えば酵素認識配列（特異的組み込み部位、タンパク質に対する特定のアフィニティーを示す部位等）の如き非コード配列であることができる。これは、好ましくは、与えられたポリペプチドをコードする配列またはそのように活性であるＲＮＡである。それは、特にＤＮＡｃ、ＤＮＡｇ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、例えば干渉ＲＮＡ、リボザイム等または後者の組合せであることができる。典型的には、導入遺伝子は、所望の発現産物をコードする配列を含むＤＮＡである。さらに、導入遺伝子は、１つ以上の転写終結領域、典型的にはポリアデニル化シグナルを含むことができる。
【００３１】
導入遺伝子は、触媒核酸（干渉、アンチセンス、リボザイム）、自殺核酸（例えば毒素をコードする）または生物学的に活性なペプチド、例えば成長因子、栄養因子、抗血管形成誘導因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、受容体、分化因子、コロニー刺激因子、抗癌剤、酵素、神経伝達物質もしくはその前駆体等をコードする核酸から選ぶことができる。
【００３２】
本発明の１つの特定の態様に従えば、導入遺伝子は、例えば下記の栄養因子：ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＧＤＮＦ等、あるいは抗血管形成誘導因子または欠損した代謝活性を回復するかもしくは特定の代謝機能を与える酵素、例えばＴＨ、ＡＡＤＣ、ＧＴＰＣ、β−グルクロニダーゼ等をコードする。
【００３３】
本発明の他の特定の態様に従えば、導入遺伝子は、例えば、優勢遺伝的疾患に関与するまたは機能獲得（ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇａｉｎ）により誘導される疾患、例えば神経変性疾患に関与する突然変異したタンパク質、例えば突然変異したＳＯＤ（筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ＡＰＰ、ｔａｕ、プレセニリンまたはＢＡＣＥ（アルツハイマー病）タンパク質、α−シヌクレイン（パーキンソン病）またはハンチントン（ハンチントン病）の発現を特異的に阻害することを可能とする干渉性ＲＮＡｓ（ＲＮＡｉ）をコードする。
【００３４】
導入遺伝子は、典型的には、導入遺伝子に対して相同性であるかまたは異種であることができる転写プロモーター、例えば細胞、ウイルス、合成、キメラプロモーター等の制御下に置かれる。使用されるプロモーターは、２または３ＲＮＡポリメラーゼ等に依存して、構成的であるかまたは調節型であり、弱いか又は強い、組織特異的または遍在的であることができる。典型的には、ＣＭＶ、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＴＫなどのウイルスプロモーター、または好ましくはＰＧＫ、Ｒｈｏ、ＥＦ１αなどの細胞プロモーターが使用される。特異的組織プロモーターを使用することができる。これらは、例えば場合により修飾されている、ＥＮＯ、ＧＦＡＰ、ＮＳＥプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＵ６またはＨ１プロモーター等であることができる。導入遺伝子発現を指向するために使用されるプロモーターは、例えばＣＭＶ、ＴＫ、またはＲＳＶ ＬＴＲ遺伝子のプロモーターから選ばれるウイルスプロモーターであることができる。
【００３５】
エンベローププラスミドに存在するプロモーターおよび／またはベクタープラスミドに存在するプロモーターは、同一であるか又は異なっておりそして細胞またはウイルスプロモーターである。
【００３６】
非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスベクターの産生
本発明に従うレンチウイルスベクターは、安定な系統において一過性トランスフェクションによりおよび／またはヘルパーウイルスにより種々の方法で調製することができる。
【００３７】
本発明に従う方法は、特に好ましい態様に従えば、最小３つのプラスミド（図１参照）：
ａ）いかなるｐｓｉ包膜化シグナルも欠いており、レンチウイルスｇａｇ配列および組み込み機能のないインテグラーゼをコードする突然変異したレンチウイルスｐｏｌ配列を含み、場合によりｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｕおよび／またはｖｐｒアクセサリー遺伝子を欠失しているトランス相補性プラスミド、
ｂ）プロモーター−ｅｎｖ−ＰｏｌｙＡ配列を含むエンベローププラスミド、および
ｃ） 場合によりＬＴＲ３’のプロモーター領域又はＬＴＲ３’のＵ３エンハンサー配列を欠失しており、そしてレンチウイルスのＬＴＲ５’配列とＬＴＲ３’配列との間にレンチウイルス包膜化ｐｓｉ配列、ＲＮＡ核外移行エレメント（好ましくは、ＨＩＶ ＲＲＥまたは任意の他のレトロウイルスからの同等なエレメント）、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはＲＮＡの核内移行を促進する配列（例えばｃＰＰＴ ＣＴＳ配列）を含む組換えゲノム、ならびに該ゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みを阻止する突然変異したインテグラーゼ、を含むレンチウイルスベクタープラスミドであって、レンチウイルスのいかなるコード配列も欠いているレンチウイルスベクタープラスミド、
を組合せて組換えビリオンまたは組換えレンチウイルスを産生すること、および
レンチウイルス産物の回収、
を提唱する。
【００３８】
有利には、使用される３つのプラスミドは、組換えを可能とするのに十分ないかなる相同性配列も含まない。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖコード核酸は、有利には先行技術でおよびデータベースで入手可能なウイルス遺伝子の配列から慣用の技術に従って調製されたおよび実施例で説明されたＤＮＡｃであることができる。
【００３９】
トランス相補性プラスミドは、ｇａｇおよびｐｏｌレンチウイルスタンパク質をコードする核酸を提供する。これらのタンパク質は、レンチウイルスに由来しており、好ましくはＶＩＨ−１に由来する。このプラスミドは、いかなる包膜化配列、エンベロープコード配列、アクセサリー遺伝子も欠いており、そして有利にはレンチウイルスＬＴＲｓも欠いている。この理由で、ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする配列は、異種プロモーター、例えば細胞、ウイルスのプロモーター等の制御下に置かれ、これらのプロモーターは、構成型であるか調節型であることができ、弱いか又は強力であることができる。これは、好ましくは、ＣＭＶ−Δｐｓｉ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ＰｏｌｙＡ配列を含むトランス相補性プラスミドである。このプラスミドは、エンビロープ糖タンパク質は別として、空のビリオンの形成のために必要なすべてのタンパク質の発現を可能とする。トランス相補性プラスミドは、有利にはＴＡＴおよびＲＥＶ遺伝子を含むことができる。さらに、トランス相補性プラスミドは、ＷＰＲＥ、ＡＰＰ ５’ＵＴＲ、ＴＡＵ ３’ＵＴＲおよびクロマチンインシュレーション配列、例えばＭＡＲ（マトリックス付着領域（Ｍａｔｒｉｘ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ））、ＳＡＲ（スカフォールド付着領域（Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ））、ｓｃｓおよびｓｃｓ’（特異的クロマチン構造（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）等から選ばれる転写調節エレメントを含むこともできる。有利には、それは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよび／またはｎｅｆアクセサリー遺伝子を欠いている。ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子ならびにＴＡＴおよびＲＥＶ遺伝子は、場合により分離された異なるプラスミドにより担われることもできる。この場合に、いくつかのトランス相補性プラスミドを使用し、各プラスミドは１以上の該タンパク質をコードする。
【００４０】
トランス相補性プラスミドのｐｏｌ配列における突然変異は、いくつかの塩基の１つ以上のミクロ欠失、好ましくは、上記したとおり、コードされたインテグラーゼ配列の塩基性領域、Ｃ末端領域（例えば、Ｃ末端領域の塩基性領域）および／または触媒領域に影響を与える１つ以上の点突然変異からなる。
【００４１】
エンベローププラスミドは、選ばれたエンベロープ（ｅｎｖ）糖タンパク質の産生を可能とする核酸を与える。それは、いかなるｐｓｉ包膜化シグナル、ｇａｇまたはｐｏｌコード配列も欠いており、そしてレンチウイルスＬＴＲｓも欠いている。それはプロモーター−ｅｎｖ−ＰｏｌｙＡ配列を含む。
【００４２】
先行技術に述べられたシュードタイプＶＩＨ−１ベクター（例えば他のウイルスに由来するまたは細胞起源の、従って修飾された向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を有する、野生型エンビロープとは異なるエンビロープを含む）は、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質を含む。このエンベロープは、超遠心に対する抵抗性および非常に広い向性などの有利な特徴を有する。他のエンビロープ、例えば古典的レトロウイルスのエンビロープ（両種指向性および同種指向性ＭＬＶレトロウイルスまたはＶＩＨｇｐ１２０、しかし多くの他のウイルスも）と違って、ＶＳＶ糖タンパク質は、超遠心後に不安定ではない。これは、ウイルス上清を濃縮しそして高い感染レベルを得ることを可能とする。さらに、このエンベロープは、特にインビトロでビリオンに非常に広い向性を与え、非常に多くの細胞型の感染を可能とする。このエンベロープの受容体は、異なるタイプの多数の細胞の表面に存在するホスファチジルセリンモチーフであろう。
【００４３】
水泡性口内炎ウイルスのエンベロープ（ｅｎｖ）糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）は、本発明の枠内で有利に使用されるが、ある細胞集団を最前に標的化するために任意の他のシュードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）を使用することができる。従ってエンベロープタンパク質は、任意のエンベロープされたウイルスからの任意のエンベロープ糖タンパク質、例えばラブドウイルスエンベロープタンパク質、さらに好ましくは狂犬病ウイルス（ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）、およびなおさらに好ましくは、狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）：狂犬病（Ｒａｂｉｅｓ）（ＲＡＢ）、デューベンヘイジ（Ｄｕｖｅｎｈａｇｕｅ）（ＤＵＶ）、ヨーロピアンバット１型（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｂａｔ １）（ＥＢ−１）、ヨーロピアンバット２型（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｂａｔ ２）（ＥＢ−２）、コトンカン（Ｋｏｎｔｏｎ）（ＫＯＴ）、ラゴスバット（Ｌａｇｏｓ ｂａｔ）（ＬＢ）、オボジアング（Ｏｂｏｄｈｉａｎｇ）（ＯＢＤ）、ロシャンボー（Ｒｏｃｈａｍｂｅａｕ）（ＲＢＵ）の血清群のウイルスのエンベロープタンパク質、モコラウイルス（ＭＯＫ）の血清群からのウイルスのエンビロープタンパク質およびこれらのエンビロープの任意のキメラ組成物から選ぶことができる。狂犬病およびモコラウイルスは特に好ましい。実際それらは神経系に対して非常に特異的な、動物における向性を有する（ＷＯ０２／０９７１０４）。さらに、この型のエンベロープは、細胞の標的化、特にアストロサイト型のグリア細胞の標的化を可能とする。
【００４４】
好ましい態様では、本発明は、例えば狂犬病またはモコラウイルスエンビロープを有するシュードタイプのＶＩＨ−１型のレンチウイルスベクターを使用する。
【００４５】
本発明のベクタープラスミドは、ＬＴＲ５’とＬＴＲ３’との間にｐｓｉエレメント、ＰＲＥ（又は他のレトロウイルスの同等のエレメント）、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはｆｌａｐ配列、ｃＰＰＴ ＣＴＳを含む組換え核酸を含む。それは、例えば、配列５’ＬＴＲ−ｐｓｉ−ＲＲＥ−ｃＰＰＴ ＣＴＳ−（プロモーター−）導入遺伝子−ＬＴＲ３’を含むことができる。導入遺伝子の配列は、プロモーターおよび／またはエンハンサーの制御下に、ならびにこの遺伝子の良好な発現のために必要なすべての転写調節エレメント、転写後調節エレメントおよび形質導入後調節エレメントの制御下にベクタープラスミドの範囲内に場合により配置される。このプラスミドは、良好な形質導入プロセスのために必要なシス作用性ウイルス配列を含む。元のウイルスから、それはゲノムの包膜化のために必要なある配列（レンチウイルス起源のｐｓｉ配列）、場合により逆転写ベクターゲノムの有効な核内移行を可能とするｆｌａｐ配列（ｃＰＰＴ−ＣＴＳ領域）およびパッケージされる前にベクターＲＮＡの転写を可能とする内在性ＬＴＲ５’（ｉｎｔｅｇｒａｌ ＬＴＲ５’）を保存するのみである。さらに、このベクターは、場合によりＬＴＲ３’Ｕ３エンハンサー配列を欠失していてもよい（ＷＯ９９／３１２５１）。さらに、それは、元のウイルス遺伝子のすべて、特にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ 配列をコードするウイルス遺伝子を欠失しておりそしてベクターの安全性を改良するためにアクセサリー遺伝子（ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｒおよび／またはｖｐｕ）を欠失している。
【００４６】
本発明の１つの特定の態様では、線状ゲノムの端部に位置しているａｔｔ配列は、さらに有利に突然変異しており、そして場合によりインテグラーゼがゲノムに作用するのをより困難にするように欠失される。
【００４７】
ｇａｇおよびｐｏｌの発現、エンベロープタンパク質の発現、ベクターゲノムｍＲＮＡおよび導入遺伝子の発現をそれぞれ促進するために、トランス相補性プラスミド、エンベローププラスミドおよびベクタープラスミドにおいて使用されるプロモーターは、有利には、遍在性プロモーター又は特異的プロモーター、例えばＣＭＶ、ＴＫ、ＲＳＶ ＬＴＲウイルスプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＵ６又はＨ１プロモーターから選ばれる同一の又は異なるプロモーターである。
【００４８】
本発明に従うレンチウイルスは、ネイティブ感染性ウイルスを構成するある遺伝子が抑制されそして標的細胞に導入されるべき有益な核酸配列により置き換えられるように、遺伝子的に修飾される。細胞膜へのウイルスの融合に続いて、該ウイルスは、その核酸を細胞に注入する。このようにして導入された遺伝子物質は、次いで転写されそして場合により宿主細胞内でタンパク質に翻訳される。
【００４９】
本発明に従う好ましいベクター系は、
ａ）いかなるｐｓｉ包膜化シグナルも欠いており、そしてレンチウイルスのｇａｇ配列および組み込み機能のない、（インテグラーゼのコードされた配列におけるＣ末端領域の塩基性領域における）ＡＡＨによる２６２ＲＲＫモチーフの置換を含むインテグラーゼをコードする突然変異したレンチウイルスｐｏｌ配列を含み、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｕおよび／またはｖｐｒなどのいかなるアクセサリー遺伝子も欠失している、トランス相補性プラスミド、
ｂ）好ましくはウイルスプロモーターを含みそしてＶＳＶ−Ｇエンベロープ、さらに好ましくはＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＰｏｌｙＡ配列をコードする上記したエンベローププラスミド、および
ｃ）場合によりＬＴＲ３’のプロモーター領域またはＬＴＲ３’のＵ３エンハンサー配列を欠いており、ＬＴＲ５’とＬＴＲ３’との間にｐｓｉエレメント、ＰＲＥ、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはｆｌａｐ配列、ｃＰＰＴ ＣＴＳを含み、レンチウイルス（例えばＨＩＶ−１）の遺伝子のすべてを欠いているレンチウイルスベクタープラスミド
を含む。
【００５０】
非組み込み型の且つ複製に欠陥のある組換えウイルスの産生のために、上記したプラスミドをコンピテント細胞に導入することができ、そして産生されたウイルスを回収する。使用される細胞は、任意のコンピテント細胞、特に哺乳動物、例えば動物またはヒトからの特に真核細胞 であることができる。それらは体細胞または胚細胞、幹細胞又は分化した細胞であることができる。例えば、２９３細胞、繊維芽細胞、肝細胞、筋肉（骨格、心臓、平滑、血管等）細胞、神経細胞（ニューロン、グリア、アストロサイト）、上皮、腎、眼細胞等を挙げることができる。それらは植物細胞、酵母または真核細胞であることもできる。それらはＳＶ４０ Ｔ抗原により形質転換された細胞であることもできる。
【００５１】
従って、本発明は、コンピテント細胞の集団を上記したプラスミドの組合せによりトランスフェクションしそして産生されたベクターを回収することを含む、非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルスを調製するための方法に基づいている。
【００５２】
従って、本発明は、
ａ）いかなるｐｓｉ包膜化シグナルも欠いており、そしてｇａｇ配列および／または例えばコードされたインテグラーゼ配列の塩基性領域および／またはＣ末端領域におけるＡＡＨによる２６２ＲＲＫモチーフの置換を可能とするクラス１突然変異を含むｐｏｌ配列を含み、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｕおよび／またはｖｐｒなどのいかなるアクセサリー遺伝子も欠いている、少なくとも１つのトランス相補性プラスミド、
ｂ）（例えばＶＳＶ−Ｇ）−ＰｏｌｙＡ（例えばＣＭＶ−）エンベローププロモーター配列を含むエンベローププラスミド、
ｃ）場合によりＬＴＲ３’のＵ３エンハンサー配列を欠失しており、５’ＬＴＲと３’’ＬＴＲとの間にｐｓｉエレメント、ＰＲＥ、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはｆｌａｐ配列、ｃＰＰＴ ＣＴＳを含み、レンチウイルス（例えばＨＩＶ−１）のコード配列を欠失しているベクタープラスミド、
を含む上記した非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスベクター系によるコンピテント細胞のトランスフェクション、および
レンチウイルス産物の回収、
を含む、導入遺伝子のインビボ発現を可能とする非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスを産生するための特に有利な方法に関する。
【００５３】
本発明のレンチウイルスは、上記したとおり、１つ以上のｇａｇ、ｅｎｖおよびインテグラーゼ上で突然変異したｐｏｌタンパク質を産生する包膜化細胞の系統から調製することもできる。
【００５４】
この理由で、１つの特定の態様では、本発明の方法は、選ばれたｅｎｖタンパク質を発現する細胞の系統におけるちょうど２つのプラスミド（ベクタープラスミドおよびトランス相補性プラスミド）のトランスフェクションを含む。この系統を調製するために使用される細胞は、例えば、上記したコンピテント細胞である。
【００５５】
他の態様に従えば、使用される系統は、ｅｎｖタンパク質、ｇａｇタンパク質および／またはレンチウイルスｐｏｌタンパク質も発現し、後者はクラス１突然変異を含む。この場合に、この方法は、単にベクタープラスミドのトランスフェクションを含む。
【００５６】
上記したとおり、産生されるレンチウイルスは、好ましくは、ＶＩＨ−１、ＶＩＨ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＶＩＳＮＡ、ＣＡＥＶまたはＥＩＡＶウイルスに由来する。
【００５７】
細胞系の中でも、特に非常に組換え可能であることで知られているニワトリリンパ腫から樹立されたＤＴ４０系統およびＣｏｓ７系統（ＳＶ４０抗原により不死化されたサル腎臓からの細胞）を優れていると認めることができる。細胞系は、ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ１（結腸癌から採取された細胞から樹立されたヒト系統）、ＬＦ１（ヒト胚肺繊維芽細胞）、ＬＬ１（ヒト胚皮膚繊維芽細胞）、ＴＫ６（ヒトリンパ芽球系統）、ＨａＣａＴ（ヒト角化細胞）、Ｕ９３７（ヒト単球）、ＨＣＴ１５、ＳＷ４８０、Ｃｏｌｏ３２０、Ｃｏ１１５、ＥＢ、Ｈｂ１１００、Ｒａｔ−１、ＰＣ１２（ラットホトクロモサイトーマ（ｒａｔ ｐｈｏｔｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）等の系統であることもできる。この非網羅的リストは例として与えられる。当業者に知られている他の系統を選ぶことができそしてその側としてなんらの特定の努力なしに本発明の枠内で使用することができる。
【００５８】
本発明の方法を実施するために、プラスミドを問題の細胞型に適合した当業者に知られている任意の技術により細胞に導入することができる。一般に、細胞およびベクター系を、細胞へのベクター系またはプラスミドの導入を可能とするのに十分な期間の時間適当な装置（プレート、ボックス、チューブ、ポケット等）中で接触させる。典型的には、ベクター系またはプラスミドは、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーションによりまたは脂質、ポリマー、リポソームおよびペプチド等などのトランスフェクションを促進する１以上の化合物を使用することにより細胞に導入される。リン酸カルシウム沈殿が好ましい。細胞は任意の適合した培地、例えばＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、ウシ胎児血清の不存在下に培養を可能とする特定の培地等の中で培養される。
【００５９】
本発明の１つの特定の目的は、レンチウイルスインテグラーゼであって、塩基性領域、そのＣ末端領域（例えばＣ末端領域の塩基性領域）および／またはその触媒部位に影響を与える１つ以上の突然変異を含み、組み込み機能を欠いているレンチウイルスインテグラーゼを安定な方式で発現する細胞の系統、および非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルスのインビトロ調製のためのこの型の細胞系の使用にも関する。
【００６０】
従って、本発明の１つの目的は、本方法を実施することにより得られる細胞およびヒトまたは動物における治療、ワクチンまたは外科的処置方法を実施するために使用される細胞組成物を調製するための本発明に従う細胞、細胞の系統又は細胞集団の使用に関する。
【００６１】
本発明は、上記した如きベクターを含む、インビトロまたはエクスビボで細胞のゲノムを修飾するための方法を実施するためのキットにも関する。
【００６２】
用途
本発明に従うウイルスおよび系統は、例えば、好ましくは分裂しない細胞における導入遺伝子または他の核酸の発現のため、あるいは他のベクターによる他のトランスフェクションに対してまたは形質導入法に対してすら抵抗性分裂細胞の遺伝子の一過性発現のために使用することができる。
【００６３】
驚くべきことに、本願は、この方法で得られるレンチウイルスベクターは、例えば網膜細胞、アストロサイト、他のグリア細胞又はニューロンなどの異なる細胞型に形質導入することができることを示す。本発明のベクターにより標的化されうる神経細胞の他の亜集団は、例えば、ミクログリア細胞、上皮細胞またはオリゴデンドロサイトである。目における遺伝子の導入に関する１つの特定の用途において、本発明のベクターは、例えば色素上皮細胞への選択的導入を可能とするようにモコラエンベロープでのシュードタイプ化されうる。
【００６４】
この非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスベクターは、遺伝子導入の安全性および有効性を改良するためであり：インテグラーゼを突然変異させることにより、該ベクターは標的細胞のゲノムにもはや組み込まれず、従って挿入突然変異誘発の危険を排除する。さらに、ベクターへのｆｌａｐ配列（ｃＰＰＴ−ＣＴＳ）の可能な挿入はＤＮＡゲノムの核内移行を実質的に改良することができ、分裂終了細胞において安定な、そして繁殖している細胞において一過性の、導入遺伝子の強い発現を可能とする。
【００６５】
本発明の非組み込み型レンチウイルスベクターの可能な用途はいくつかの型がありそして下記の用途を含む：
−遺伝子治療、即ち、任意の哺乳動物細胞、特にヒト細胞における遺伝子導入を含む。これらは、分裂細胞もしくは休止細胞、中枢器官もしくは末梢器官、例えば肝臓、膵臓、筋肉、心臓などに属する細胞であることができる。それは、好ましくは、例えば神経変性病理または網膜の疾患の処置の枠内で、休止細胞（分裂しない）における、特に中枢神経系の細胞における、特に脳、骨髄および眼球の細胞における遺伝子の導入、および一過性発現のための分裂細胞への遺伝子の導入（例えば、抗腫瘍自殺ストラテジー、脊髄の損傷を処置するための軸索拒絶ストラテジー）である。
遺伝子治療は、タンパク質、例えば神経栄養因子、酵素、転写因子、受容体等の発現を可能とすることができる。さらに、それは「オリゴヌクレオチド」ストラテジー（アンチセンスまたは干渉ＲＮＡｓ、リボザイム等）の実施を可能とする。
−細胞治療、即ち、移植前に選ばれた行き先に向けて細胞を方向付けるための前駆細胞における分化因子の発現、または細胞が有利な因子を発現するように細胞のエクスビボ形質導入、それに続く該細胞の移植。
【００６６】
本発明の１つの特定の目的は、例えば、インビトロ、エクスビボまたはインビボで被験体の中枢神経系（眼球を含む）への遺伝子の導入用の組成物を調製するための本発明に従う非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスの使用に関する。
【００６７】
本発明の他の特定の目的は、中枢器官又は末梢器官に影響を与える疾患、例えば神経系（眼球を含む）の疾患の処置のための組成物を調製するためのこの型のレンチウイルスの使用に関する。
【００６８】
本発明に従う非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスは、それらが含有する導入遺伝子に従って、例えば、神経変性疾患、および特にアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ＳＬＡもしくはＳＭＡ、加齢黄斑変性症（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（ＤＭＬＡ）、眼変性（ｏｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）もしくは中枢神経系の損傷（例えば卒中、癲癇、脊髄の病変もしくは損傷等）、中枢神経系に影響を与える疾患（ムコ多糖症等）、グリオブラストーマもしくはアストロサイトーマ、神経系に影響を与える代謝疾患（ムコ多糖症、シャルコ−マリー（Ｃｈａｒｃｏｔ−ｍａｒｉｅ）等）または眼球に影響を与える疾患（ＤＭＬＡ、色素網膜炎（ｐｉｇｍｅｎｔ ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）、緑内障等）を処置するための医薬組成物を製造するために使用することができる。
【００６９】
本発明の１つの特定の態様に従えば、非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルスは、色素網膜炎を処置するための医薬組成物を製造するために使用される。用語「色素網膜炎」は、アポトーシスによる桿体（ｒｏｄｓ）および錐状体（ｃｏｎｅｓ）（網膜の神経細胞）の進行性変性により特徴付けられる眼障害の雑多なグループを示すのに使用される。３０００毎に１個体の発生率で、これは失明の主要な原因である。色素上皮および光受容体の細胞の形質導入は、この型の病理に対して決定的に有益である。遺伝子置換ストラテジーは、光受容体または色素上皮の形質導入を必要とするが、これに対して神経保護ストラテジーは色素上皮の形質導入から利益を得ることができる。実際に、この方法の利点は、それが神経細胞を修飾しないで、色素上皮のみを修飾し、それは次いで拡散性栄養因子、例えばＧＤＮＦを合成しそして保護されるべき光受容体を取り囲んでいる区域においてそれを分泌するということである。
【００７０】
本発明の他の目的は、神経系の細胞におけるいくつかの核酸を導入しそして発現する目的でのいくつかのレンチウイルスの組み合わせた使用である。組み合わせた使用は異なるウイルスの逐次投与または同時投与を含むことができる。
【００７１】
上記したとおり、本発明は、神経細胞における多数の核酸、例えば、触媒核酸（干渉、アンチセンス、リボザイム等）、成長因子、栄養因子、サイトカイン、コロニー刺激因子、抗癌剤、毒素、酵素、神経伝達物質またはそれらの前駆体等をコードする核酸の輸送および発現を可能とすることができる。
【００７２】
本発明に従うレンチウイルスを含有する医薬組成物は、適切なエンビロープ糖タンパク質の助けによりシャュードタイプのレンチウイルスベクターの特定の向性に依存して大脳内にまたは全身的に患者に投与することができる。従って、これは大脳内投与、例えば、線条体内投与、海馬もしくは黒質への投与、静脈内、動脈内、硝子体内（ｉｎｔｒａ−ｖｉｔｒｅａｌ）投与であることができ、又は網膜下空間（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｓｐａｃｅ）等に投与することができる。好ましい注射方法は、大脳内注射および網膜下空間への注射である。
【００７３】
組成物は、１０２〜１０１０、典型的には１０３〜１０８の形質導入のための有効粒子のレベル、（ベクターストック（ｖｅｃｔｏｒ ｓｔｏｃｋ）の逐次希釈による細胞形質導入により決定されたレベル）または約１０５〜１０１３コピーのゲノム当量で［ベクターのＲＮＡゲノムでの定量的逆転写ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）またはベクターのＲＮＡゲノムと会合したＤＮＡ鎖での定量的ＰＣＲにより決定されたレベル］有利に投与される。このレンチウイルスは、場合により同系アルブミンなどの安定剤または任意の他の安定化タンパク質、グリセロール等ならびにポリブレンまたはＤＥＡＥデキストラン等などの補助因子（ａｄｕｖａｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ）と一緒にして、任意の適合した溶液、例えば塩類溶液、等張性溶液、緩衝液中でコンディショニングされうる（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）。
【００７４】
本発明の他の利点は、下記の実施例においてさらに詳細に説明される。これらの実施例は説明のためであり限定するものではないとみなすべきである。
【００７５】
実験の部
最初に、レンチウイルスベクター（ｐ８．９１ ＩＮＷＴおよびｐ８．９１ ＩＮＮプラスミド）を産生するために使用されるトランス相補性プラスミドにおいて突然変異したまたは突然変異していないインテグラーゼ配列（ヘマグルチニンと融合した）を使用した。次いで、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の早発ウイルスプロモーターの制御下にグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現しそして正常な（ＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰベクター）もしくは突然変異した（ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ）インテグラーゼを有するＶＩＨ−１に由来するベクターのストックを産生した。神経細胞内のＧＦＰ導入遺伝子の発現を操作するためのＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターの効率に関する研究を最後に行い、始めインビトロ、次いでインビボで行った。
【００７６】
インビトロベクターの特徴付け
インビトロＧＦＰ導入遺伝子の発現
非組み込み型レンチウイルスベクターの、細胞系に形質導入しそしてそこで導入遺伝子を発現する能力を評価するために、２９３Ｔ、ＨｅＬａおよびＭＴ４細胞を種々の容量のＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰおよびＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターの存在下にインキュベーションした。ＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型ベクターによる形質導入の７２時間後に、ある百分率の細胞がＧＦＰを発現する（ＦＡＣＳによる分析）。同じようにして、ＧＦＰ＋細胞がＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターによる形質導入の７２時間後にＦＡＣＳにより証明された（図２）。この最初の結果は、そのインテグラーゼが不活性化されているベクターの良好な形質導入有効性を示唆する。
【００７７】
偽形質導入（ｐｓｅｕｄｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）の分析
レンチウイルスベクターのストックを、それらの産生期間中、プラスミドＤＮＡ、特にｐＴｒｉｐ ＣＭＶ ＧＦＰベクタープラスミドによりおよびトランスフェクションされた細胞におけるこの同じプラスミドから産生されたＧＦＰタンパク質により汚染させる。これらの２つのエレメントは、ＧＦＰがレトロ転写されたベクターゲノムの発現に由来しない偽のポジティブ細胞を発生させることができる。したがって、これらのＧＦＰ＋細胞は形質導入されていなくて、「偽形質導入されている」。
【００７８】
ＧＦＰ＋細胞が偽形質導入機構から生じていないことを証明するために、２９３Ｔ細胞は、任意のアジド−デオキシチミジン（ＡＺＴ）の存在下又は不存在下に、逆転写酵素（ＲＴ）阻害剤の助けにより形質導入された。実際、ＡＺＴによる処理は、ＧＦＰが細胞の形質導入から生じる場合に、ＧＦＰの発現を阻害する。従って、ＡＺＴの存在下に観察されたＧＦＰ＋細胞の百分率は、偽形質導入の百分率に相当するだけである。２０の感染多重度（ＭＯＩ）で２９３Ｔ細胞を形質導入した後に、ＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型ベクターでＧＦＰ＋細胞４０．７％（±１．５）が観察されそしてＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型ベクターで２８．０％（±１．９）が観察される。１０μＭ ＡＺＴの存在下においては、形質導入された細胞の百分率は、それぞれ５．８％（±０．１）および４．９％（±０．４）に低下する（図３）。従って、ＲＴの阻害は、ＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型ベクターによる形質導入の後であろうと、ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターによる形質導入の後であろうと、ＧＦＰ＋細胞の百分率を減少させることを可能とする。従って、任意の逆転写酵素阻害剤の不存在下に観察されるＧＦＰ＋細胞の大部分は、２つの型のベクターにより有効に形質導入されておりそして偽形質導入機構からは生じない。
【００７９】
分裂細胞における発現の安定性
突然変異したＩＮ−ＨＡＮインテグラーゼを有する粒子のエピソーム性格を証明するために、ＧＦＰの発現を異なるＨｅｌａ、２９３ＴおよびＭＴ４細胞系における形質導入の後の１５日まで分析した。細胞を、５のＭＯＩで、突然変異体ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターにより、組み込み型ＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰ対照によりまたは非組み込み型ＣＭＶ ＧＦＰアデノウイルス対照により形質導入させた。形質導入された細胞の各バッチを１２〜１５日間増幅しそして７２時間毎にＦＡＣＳにより分析した。最後の細胞を回収する２４時間前に、これらのいくらかを５ｍＭ酪酸ナトリウムで処理して、ＧＦＰの発現に対するハイポアセチル化の可能な影響を評価した。得られた結果は、図４に示される。
【００８０】
時間に対して、ＧＦＰを発現する２９３ＴまたはＭＴ４細胞の百分率は、これらがＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型対照ベクターで形質導入されたとき相対的に安定であり、この百分率は２９３Ｔ細胞において評価された最後の点に僅かに下がる（図４）。しかしながら、実験の終わりにおける酪酸ナトリウムによる細胞の処理は、２９３Ｔ ＧＦＰ＋細胞の百分率を最初に測定したレベルに戻すことを可能とし、これは導入遺伝子の発現を支配するプロモーターの再活性化を示唆し、そして分析された細胞の集団に組み込まれたベクターの時間に対する安定性を示す。非組み込み型アデノウイルス対照ベクターで形質導入された細胞では、ポジティブ細胞の百分率は、形質導入の１５日後相殺されるように引き続く分裂期間中有意に低下する。この場合に、形質導入の１５日後の酪酸ナトリウム処理は、ＧＦＰ＋細胞の最初の百分率を再確立することを可能としない（図４Ｂ）。この結果は、細胞分裂期間中アデノウイルスゲノムの漸進的な希釈により説明される。染色体外エレメントとして、ベクターゲノムは、細胞サイクル期間中細胞のゲノムＤＮＡのように複製されない。従って、各有糸分裂と共にベクターゲノムのコピーは、２つの娘細胞の１つにのみ伝達され、これは理論的に各細胞サイクルで導入遺伝子を発現する細胞の百分率を２で割ることになる。
【００８１】
突然変異体インテグラーゼを有するベクターにより形質導入された細胞における発現は、アデノウイルスベクターによるトランスフェクション後に観察されるプロフィルに極めて類似したプロフィルを示す。実際、ＧＦＰ＋細胞の百分率は、時間に対して減少し（図４）そして酪酸ナトリウムで細胞を処理することにより最初のレベルに戻すことができない。この結果は、アデノウイルスベクターによる形質導入の場合におけると同じく、ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターのゲノムは、各細胞分裂によって逐次希釈により最初に形質導入された細胞から排除されることを示唆する。
【００８２】
休止細胞におけるＧＦＰ導入遺伝子の発現の安定性
時間に対するＧＦＰ＋細胞の百分率の減少は、形質導入された細胞の核におけるベクターゲノムの不安定性およびそれらの分解を反映することもできる。この仮定を立証するために、ＧＦＰ導入遺伝子の発現を２つの型のベクターによるニューロン細胞の形質導入後に研究した。実際、初代ニューロン（胚ラット皮質）は培養において分裂しない。ＧＦＰの発現は、ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターによるこれらの細胞の形質導入後の少なくとも１６日間は持続する（図５Ａおよび５Ｂ）。考慮された異なる時間におけるＷＴベクターにより形質導入された免疫反応性細胞の百分率と、Ｎベクターで得られた百分率との間に有意な差は観察できなかった（反復した測定において２因子ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．９３２１）。追加の実験は、導入遺伝子の発現は形質導入後２５日まで持続することを示すことを可能とした（図５Ｃ）。
【００８３】
従って、エピソーム形態は、形質導入された細胞の核において相対的に安定であり、そして休止細胞において少なくとも２５日間導入遺伝子の発現を可能とする。この結果は、分解によるよりはむしろ各有糸分裂によるエピソームベクターゲノムの希釈により分裂細胞における時間に対するＧＦＰの発現の減少の仮定を支持する。
【００８４】
インビボでのＧＦＰ導入遺伝子の発現
マウス線条体における発現
インビボで細胞に形質導入することにおけるインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの有効性を決定するためおよびＧＦＰ導入遺伝子の発現を可能とするために、ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターを、マウス線条体に注射した。この注射の１０日後に、ＧＦＰ発現を証明することができた。この発現は、注射に続く少なくとも１ヶ月の期間持続する。この結果は、ＳＮＣ細胞における導入遺伝子の発現を可能としそして維持することにおける非組み込み型ベクターの有効性を確認する（図６）。形質導入された細胞の表現型を同定するために、一方ではＧＦＰ／ＧＦＡＰ免疫組織蛍光（グリア細胞繊維性酸性タンパク質、アストロサイトマーカー）および他方ではＧＦＰ／ＮｅｕＮ（ニューロンマーカー）による共標識化を隣接切片で実施した。共焦点顕微鏡によるスライドの分析の後に、ＧＦＰ のＧＦＡＰマーカーとの大部分の共局在（ｃｏｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ）（図７Ａ）およびＧＦＰ のＮｅｕＮマーカーとの非常に僅かな共局在（図７Ｂ）を観察することができた。これらの結果は、ＶＳＶエンベロープでシュードタイプ化されたインビボでのＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターは、好ましくはアストロサイト細胞に形質導入することを示唆する。
【００８５】
網膜における発現
非組み込み型レンチウイルスベクターの網膜の色素上皮細胞に形質導入する能力を評価した。このために、ベクターの網膜下注射をラットおよびイヌにおいて実施した。予備的結果は、ラットにおいて少なくとも９週間そしてイヌにおいて３ヶ月間ＧＦＰの発現を示す（図８）。これらの２つのシステムにおける発現の安定性の評価は続行されている。本発明者により以前に得られた結果は、レンチウイルスベクターは、ラットにおける網膜下注射後に、本質的に色素上皮細胞に形質導入することを示す。
【００８６】
目を綿密に検査することによりあるイヌでは低いレベルの毒性が観察された。この毒性は、注射された用量とは無関係であり、そしてベクター自体についてもそうであり、そして注射の時点で外科的行為により誘導されると思われる。より広範な組織学的分析は、この刺激をより明白に理解することを可能とするであろう。
【００８７】
動物モデルにおける治療導入遺伝子の発現
臨床的適用のための非組み込み型レンチウイルスベクターの使用、治療導入遺伝子を発現することにおける該ベクターの有効性を立証する目的で、グリア由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を、色素網膜炎により特徴付けられたモデル、ＲＤ１０ラットにおける網膜下注射後に試験した。表現「色素網膜炎（ＲＰ）」は、桿体および錐状体（網膜の神経細胞）のアポトーシスによる、進行性変性により特徴付けられる眼障害の雑多なグループを示す。３０００に１つの個体の発生率で、これは失明の主要な原因である。色素上皮細胞および光受容体の形質導入は、この型の病理においてきわめて有益である。遺伝子置換ストラテジーは、光受容体又は色素上皮の形質導入を必要とするが、これに対して神経保護のストラテジーは、色素上皮の形質導入から利益を得ることができる。実際、この方法は、それが神経細胞を修飾しないで、色素上皮のみを修飾し、これは次いで拡散性栄養因子、例えばＧＤＮＦを合成し、そしてそれを保護されるべき光受容体を取り囲んでいる区域に分泌するであろうという利益を有する。
【００８８】
実験室で行われた実験は、組み込み型レンチウイルスベクターが正常なマウスにおける網膜下注射によって色素上皮の細胞に形質導入するのに有効であることを示す。
【００８９】
上記した結果は、げっ歯類および大きな動物において中枢神経系（脳および網膜）においてインビトロ、エクスビボおよびインビボで導入遺伝子の発現を可能とすることができる本発明に従う非組み込み型レンチウイルスベクターの有効性および治療的潜在力を示す。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】３つのプラスミド：ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターの制御下のＧＦＰ導入遺伝子およびセントラルｆｌａｐ配列［核内輸送に介入するセントラルポリプリントラクト−セントラルターミネーション配列（ｃＰＰＴ−ＣＴＳ）］、ＲＥＶ調節エレメントと相互作用するＲＲＥ（ＲＥＶ応答配列）およびｐｓｉ包膜化配列（Ψ）、プロモーター配列を欠失した（ΔＵ３）ＬＴＲ３’のＵ３領域を有するベクタープラスミド；ＣＭＶプロモーターの制御下にＶＩＨ−１の複製サイクルの早発フェイズ（ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ ｐｈａｓｅｓ）のために必要なタンパク質（ＧＡＧおよびＰＯＬ）、調節エレメント（ＴＡＴ、ＲＥＶ）を発現しそしてΨ配列を欠失したトランス相補性プラスミド；ＣＭＶプロモーターの制御下に水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のエンベロープ糖タンパク質を発現するエンベローププラスミド、のトランスフェクションによりレンチウイルスベクターを産生するためのシステム。
【図２】非組み込み型レンチウイルスベクターによる細胞系（２９３ＴおよびＨｅｌａ）の形質導入後に得られたＧＦＰの発現。百分率形質導入は、種々の用量（ウエル当たりマイクロリットルの容積）のＩＮｗｔ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型およびＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターの存在下に細胞のインキュベーションの７２時間後にＦＡＣＳにより決定される。
【図３】ＡＺＴによる細胞の処理後のＩＮｗｔ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型およびＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターによる形質導入の抑制。百分率形質導入は、ベクター単独およびベクターとＡＺＴ１０μＭの存在下に２９３Ｔ細胞の７２時間のインキュベーションの後にＦＡＣＳにより決定される。
【図４Ａ】ＩＮｗｔ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型およびＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターによる細胞系（２９３ＴおよびＭＴ４）の形質導入後の時間の期間中のＧＦＰの発現。ＧＦＰ＋細胞の百分率は、形質導入（ＭＯＩ ５）の３日、６日、９日および１２もしくは１５日後にＦＡＣＳにより決定された（Ａ：２９３Ｔ、Ｂ：ＭＴ４）。「ｂｕｔ」と記載された点については、細胞は分析の２４時間前に５ｍＭ酪酸ナトリウム処理を受けた。
【図４Ｂ】ＩＮｗｔ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型およびＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターによる細胞系（２９３ＴおよびＭＴ４）の形質導入後の時間の期間中のＧＦＰの発現。ＧＦＰ＋細胞の百分率は、形質導入（ＭＯＩ ５）の３日、６日、９日および１２もしくは１５日後にＦＡＣＳにより決定された（Ａ：２９３Ｔ、Ｂ：ＭＴ４）。「ｂｕｔ」と記載された点については、細胞は分析の２４時間前に５ｍＭ酪酸ナトリウム処理を受けた。
【図５Ａ】ＩＮｗｔ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型またはＩＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターによる形質導入後にラット皮質から採取された初代胚ニューロン（ｐｒｉｍａｒｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）におけるＧＦＰの発現。 Ａ：対照（形質導入されていない）ニューロン、組み込み型（ＩＮｗｔ）ベクターにより形質導入されたニューロン、または非組み込み型（ＩＮＮ）ベクターにより形質導入されたニューロンにおける発現の、形質導入の３、９および１６日後における免疫細胞化学分析（２０倍拡大）。
【図５Ｂ】ＩＮｗｔ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型またはＩＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターによる形質導入後にラット皮質から採取された初代胚ニューロン（ｐｒｉｍａｒｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）におけるＧＦＰの発現。 Ｂ：ＩＮＷＴおよび ＩＮＮグループにおける皮質ニューロンの百分率形質導入。測定は、三重に（ｉｎ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）行われそして平均±標準誤差（ＥＳＭ）として表された。
【図５Ｃ】ＩＮｗｔ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型またはＩＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターによる形質導入後にラット皮質から採取された初代胚ニューロン（ｐｒｉｍａｒｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）におけるＧＦＰの発現。 Ｃ：対照（形質導入されていない）ニューロン、組み込み型（ＩＮｗｔ）ベクターにより形質導入されたニューロンまたは非組み込み型（ＩＮＮ）ベクターにより形質導入されたニューロンにおける発現の、形質導入の３、１５よび２５日後における免疫細胞蛍光分析（１０倍拡大）。
【図６】マウス線条体への注射後のインビボでのＧＦＰの発現。マウス線条体におけるＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ（Ａ）またはＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰ（Ｂ）ベクターの定位的注射（ｓｔｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）の１０日後に脳を取り出し、クライオスタットを使用して２０μｍ厚さの切り方で切断しそして免疫組織化学に従って分析してＧＦＰ． ｃｃ：ベンチ体（ｃａｌｌｏｕｓ ｂｏｄｙ）、ｓｔｒ：線条体、の存在を示した。拡大率（２．５倍、５倍又は２０倍）は各写真上に示される。
【図７Ａ】マウス線条体への注射後のインビボでのＧＦＰの発現。マウス線条体へのＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターの定位的注射の１０日後に脳を取り出し、クライオスタットを使用して２０μｍ厚さの切り方で切断しそして共焦点顕微鏡による免疫組織蛍光に従って分析した。 Ａ：ＣＦＰ／ＧＦＡＰ 共標識：ＧＦＰを発現するアストロサイト（拡大率４０倍）
【図７Ｂ】マウス線条体への注射後のインビボでのＧＦＰの発現。マウス線条体へのＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターの定位的注射の１０日後に脳を取り出し、クライオスタットを使用して２０μｍ厚さの切り方で切断しそして共焦点顕微鏡による免疫組織蛍光に従って分析した。 Ｂ：ＧＦＰ／ＮｅｕＮ共標識：ＧＦＰを発現するニューロン（拡大率１６倍）
【図８】ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターのｐ２４、６６ｎｇの網膜下注射の後にラットにおけるインビボでのＧＦＰの発現。網膜上の蛍光顕微鏡法による写真（２．５倍）は、注射の２週間後に平坦になった。 Ｂ：ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターのｐ２４、２．５μｇの網膜下注射の後にイヌにおけるインビボでのＧＦＰの発現。注射の１月後のｖｉｇｉｌ犬における蛍光における血管造影法。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルスおよび特にインビトロ、エクスビボまたはインビボで遺伝子を導入するための組成物を調製するためのその使用を説明する。本発明は、任意の哺乳動物器官において、例えば肝臓、筋肉、膵臓又は中枢神経系（眼球を含む）組織もしくは細胞において遺伝子を導入するため、および特に、例えば眼球を含む中枢神経系の障害などの障害または病理を処置するために有用である。
【０００２】
特に実験（例えば研究）および治療分野において神経系における遺伝子の導入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）のための多数の用途がある。従って、この導入は、標識化、毒性、品質の研究、病理学的モデルの構築、欠損の復活、治療産物の発現（例えば、タンパク質、ＲＮＡｓ等）等を行うことを可能とすることができる。
【０００３】
ウイルスベクター（レトロウイルス、ＡＡＶ、アデノウイルス等）の使用、プラスミドの注入、細胞移植、カプセル化された細胞の移植などのこの導入のための種々のアプローチが先行技術で考察された。これらのアプローチの各々は、効率、安全性、工業的使用、選択性、安定性等の点で利点および欠点を有する。従ってウイルスベクターの使用は、ウイルスの自然感染性に関係した導入効率の点で有利である。
【０００４】
これに関して、オンコレトロウイルスに由来する多数のレトロウイルスベクターは、導入遺伝子の標的細胞のゲノムへの組み込みを可能とするが、これらのベクターは分裂細胞に形質導入することができるのみである。この制限は、エクスビボでの遺伝子の導入またはその細胞が有糸分裂的に活性である器官にそれらの使用を制限する。
【０００５】
この障害を克服するために、レンチウイルスに由来するベクターの使用が考慮された。現在開発された他のウイルスベクターに比べて、レンチウイルスベクターは産生の容易さおよびそれらの生物学の増加した知見を含むいくつかの実際の利点を与える。これらのベクターは、実験的遺伝子治療プロトコールの枠内で遺伝子を導入するために広く使用される。それらは、多数の細胞型、特に中枢神経系の休止細胞に有効に形質導入することを可能とする。実際に、レンチウイルスは、有糸分裂的に活性ではない細胞のゲノムに組み込むことができる複雑なレトロウイルスである。これらのレンチウイルスの例は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＶＩＳＮＡ、ＣＡＥＶおよびＥＩＡＶウイルスである。しかしながら、レトロウイルス、特にレンチウイルスの使用に関連した１つの欠点は、特に、それらが挿入突然変異誘発の潜在的危険を有することにある。なぜならば、それらは形質導入された細胞のクロマチンに組み込まれ、そして明らかに優先的にコード配列に組み込まれるからである。今日まで、この欠点は、インビボで遺伝子を導入するためのこの型のベクターの利用を制限してきた。
【０００６】
現時点で臨床的にこれらのベクターの使用に対する主な障害である挿入突然変異誘発の危険を減少させる目的で、本発明者は非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスベクターを開発した。従って、この新規な世代のレンチウイルスベクターの非組み込み型の性質は、特に遺伝子治療のバイオセーフティーに関して相当な進歩である。このベクターは、例えば、分裂しない細胞における導入遺伝子または他の核酸の安定な発現のため、または他のトランスフェクションの他の方法に抵抗性もしくは他のベクターによる形質導入の方法にすら抵抗性の分裂細胞における遺伝子の一過性発現のために使用することができる。
【０００７】
非組み込み型ベクターは先行技術で知られており、それらの最も普及しているのはアデノウイルスベクターおよびヘルペスベクターである。しかしながら、これらのタイプのベクターについて、すべての複製汚染物を含まないバッチを得ることを可能とする産生方法は現時点ではない。組み込み型ベクターの内、ＡＡＶベクターは相対的に低頻度（約１０％）でしか組み込まれないけれども、ＡＡＶベクターは、それにクローニングされうる導入遺伝子のサイズおよびＡＡＶベクターがそれらの挿入部位で引き起こす突然変異により制限される。
【０００８】
従って本発明は、先行技術の問題に対する解決を与え、そして神経系において遺伝子を導入するための新規なツールおよびベクターを与える。
【０００９】
本発明は、特に非複製型且つ非組み込み型組換えレンチウイルスの完成に関する。
【００１０】
一般に、本発明のレンチウイルスは、突然変異したインテグラーゼおよび特定の組換えゲノムを含む。さらに好ましくは、本発明に従うレンチウイルスは、（ｉ）ＬＴＲ５’レンチウイルス配列とＬＴＲ３’レンチウイルス配列との間にレンチウイルス包膜化ｐｓｉ配列（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｐｓｉ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＲＮＡ核外移行エレメント、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはＲＮＡの核内移行を促進する配列を含む組換えゲノム、ならびに（ｉｉ）該組換えゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みを阻止する突然変異したインテグラーゼを含む。本発明の１つの特定の態様では、組換えゲノムは、例えば配列５’ＬＴＲ−ｐｓｉ−ＲＲＥ−ｃＰＰＴ ＣＴＳ−導入遺伝子−ＬＴＲ３’を含む。
【００１１】
本発明の他の目的は、本発明に従うレンチウイルスおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物（ワクチン組成物を含む）に関する。
【００１２】
本発明は、特定の細胞の集団における標的遺伝子のインビトロ、エクスビボおよびインビボ導入のための方法および組成物に関し、そして障害、例えば眼系を含む中枢神経系の障害の処置にも関する。
【００１３】
本発明の他の目的は、哺乳動物細胞（好ましくはヒト）、好ましくは被験体の中枢神経系（眼球を含む）からの細胞にインビトロ、エクスビボまたはインビボで遺伝子を導入するための組成物を調製するための、上記した非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスの使用に関する。
【００１４】
本発明の目的は、適切なトランス相補性機能（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の存在下に、特に上記した修飾されたインテグラーゼをコードするレンチウイルスｐｏｌ領域の存在下に上記したごとき組換えゲノムを含むベクタープラスミドの細胞内への導入を含む、上記した非複製型且つ非組み込み型レンチウイルスを産生する方法でもある。この方法は、異なるトランス相補性およびエンベローププラスミドの一過性トランスフェクションにより行うことができ、または補助ウイルスの存在下におよび／または１以上の相補性タンパク質を発現する細胞系において行うことができる。
【００１５】
本発明は、インテグラーゼの組み込み機能の損失を誘導する突然変異を含む好ましくはレンチウイルスインテグラーゼを安定な方法で発現する細胞の系統にも関する。突然変異は、本発明の意味では、インテグラーゼのいくらかの塩基の点突然変異および／またはミクロ欠失に相当することができる。それは、好ましくは、インテグラーゼの塩基性領域、Ｃ末端領域（例えば、Ｃ末端の塩基性領域）および／または触媒部位に影響を与える１つ以上の点突然変異に相当し、該突然変異したインテグラーゼは組み込み機能を欠いている。
【００１６】
従って、本発明の１つの特定の目的は、
ａ）いかなるｐｓｉ包膜化シグナルも欠いておりそしてレンチウイルスｇａｇ配列および組み込み機能のないインテグラーゼをコードする突然変異したレンチウイルスｐｏｌ配列を含み、場合によりｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｕおよび／またはｖｐｒなどのアクセサリー遺伝子を欠失しているトランス相補性プラスミド、
ｂ）プロモーター−ｅｎｖ−ＰｏｌｙＡ配列を含むエンベローププラスミド、および
ｃ）レンチウイルスＬＴＲ５’配列とＬＴＲ３’配列との間にレンチウイルス包膜化ｐｓｉ配列、ＲＮＡ核外移行エレメント、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはＲＮＡの核内移行を促進する配列を含む組換えゲノム、ならびに該ゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みを阻止する突然変異したインテグラーゼを含み、レンチウイルスのいかなるコード配列も欠いているレンチウイルスベクタープラスミド、
を含む非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスベクター系を使用する細胞のトランスフェクション、および
産生したレンチウイルスの回収、
を含む非複製型且つ非組み込み型組換えレンチウイルスを調製する方法に関する。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、任意の哺乳動物細胞、特にヒト細胞への遺伝子の導入を可能とする非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルスを記載する。これらは、分裂細胞又は休止細胞、肝臓、膵臓、筋肉、心臓等の中枢器官又は末梢器官に属する細胞であることができる。本発明の１つの特定の目的は、神経系（眼球系を含む）におけるおよび特にニューロン、アストロサイト型グリア細胞および網膜細胞におけるならびに癌腫瘍における遺伝子の導入に関する。これらのレンチウイルスベクターは、特に神経系内での核酸配列のインビボ導入および発現のために有用である。
【００１８】
ベクターの一般的構造
他のレトロウイルスと同様に、レンチウイルスは、２つのＬＴＲ（長い末端反復）配列によりフランキングされたｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を有する。これらの遺伝子の各々は、単一の前駆体ポリペプチドの形態で最初に発現される多数のタンパク質をコードする。ｇａｇ遺伝子は内部構造タンパク質（キャプシドおよびヌクレオキャプシド）をコードする。ｐｏｌ遺伝子は、逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼをコードする。ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。さらに、レンチウイルスゲノムは、パッケージされるウイルスゲノムＲＮＡの核外移行の責任を担うシス作用性ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）エレメントを含有する。ＬＴＲ５’およびＬＴＲ３’配列は、ウイルスＲＮＡｓの転写およびポリアデニル化を促進するのに役立つ。ＬＴＲは、ウイルス複製に必要な他のシス作用性配列のすべてを含有する。ゲノムの逆転写のために必要な配列（ＲＮＡｔプライマーの連結部位）および粒子におけるウイルスＲＮＡの包膜化のために必要な配列（Ψ部位）は、ＬＴＲ５’に隣接している。包膜化のため（または感染性ビリオン中にレトロウイルスＲＮＡをパッケージするため）に必要な配列がウイルスゲノムに存在しないならば、ゲノムＲＮＡは能動的にパッケージされないであろう。さらに、レンチウイルスゲノムは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、ＴＡＴ、ＲＥＶなどのアクセサリー遺伝子を含む。
【００１９】
遺伝子導入用途のためのレンチウイルスベクターの構造は、例えば、特許ＵＳ５，６６５，５７７、ＥＰ３８６，８８２、ＵＳ５，９８１，２７６、ＵＳ６，０１３，５１６または特許出願ＷＯ９９／５８７０１およびＷＯ００２／０９７１０４に記載されている。これらのベクターは、欠陥のあるレンチウイルスゲノム、即ち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の少なくとも１つが不活性化されているかまたは欠失している欠陥のあるレンチウイルスゲノムを含む。
【００２０】
本発明に従うレンチウイルスベクターは、非複製型且つ非組み込み型組換えレンチウイルスであり、即ち、それは自己複製できずそして形質導入された細胞への特異的組み込みができない。さらに詳しくは、本発明は、ＬＴＲ５’レンチウイルス配列とＬＴＲ３’レンチウイルス配列との間にレンチウイルス包膜化ｐｓｉ配列およびＲＮＡ核外移行エレメント、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはＲＮＡの核内移行を促進する配列を含む組換えゲノム、ならびに該組換えゲノムの宿主細胞ゲノムへの組み込みを阻止する突然変異したインテグラーゼを含む、非複製型且つ非組み込み型組換えレンチウイルスに関する。本発明に従うレンチウイルスは、例えば、配列５’ＬＴＲ−ｐｓｉ−ＲＲＥ−ｃＰＰＴ ＣＴＳ−導入遺伝子−ＬＴＲ３’を含む。
【００２１】
本発明の１つの特定の目的は、レンチウイルスのゲノムがいかなるコード化レンチウイルス配列も有利に欠いているレンチウイルスに関する。
【００２２】
本発明のレンチウイルスの１つの重要な特徴は、それらが修飾されたインテグラーゼを含むということである。本発明は、導入遺伝子の発現のための有効な条件において、非複製型組換えレンチウイルスであって、その組み込みの性質が変えられている非複製型組換えレンチウイルスを産生することが可能であることを始めて証明する。修飾されたインテグラーゼの存在は、本発明のウイルスを産生するために、組み込み機能のないインテグラーゼを産生するような、しかし細胞形質導入のときベクターサイクルの前の段階に実質的ななんらの効果も及ぼさない（いわゆるクラス１突然変異）修飾されたｐｏｌ配列の使用から生じる。従って、得られるベクターは、有利には、インテグラーゼの突然変異が核に向けてのゲノムの進行を妨害しない限りにおいて、またはその後に環状化することができる（環の形成）線状ＤＮＡゲノムの形態においてそのレトロ転写を妨害しない限りにおいて、エピソーム表現型を有する。本発明の意味において、クラス１突然変異は、好ましくは、インテグラーゼの塩基性領域、Ｃ末端領域（好ましくはＣ末端領域の塩基性領域）および／または触媒部位をコードする核酸部分に影響を与える１つ以上の点突然変異からなる。点突然変異は、好ましくはインテグラーゼのコードされた配列において、アミノ酸の他のアミノ酸による置換に相当する。この突然変異は、好ましくは、それがインテグラーゼを組み込み非機能性にするという意味で非保存性である。このような突然変異は、好ましくは、インテグラーゼの他の機能、例えば核に向けてのベクターの進行に関与する機能を保存しながら、組み込み機能のないインテグラーゼを産生する突然変異体から選ばれる。ＨＩＶ−１に影響を与えそして組み込み機能のないインテグラーゼを得ることを可能とする突然変異の例は下記の突然変異：
Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｉ、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０Ｉ、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ−３５−Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ（Ｃ末端塩基性領域のＬ領域）、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９Ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ（Ｃ末端塩基性領域のＱ領域に属する２１４および２１６）、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ（Ｃ末端塩基性領域のＮ領域）およびＫ２６４Ｈである。
【００２３】
触媒部位に影響を与える突然変異は、好ましくは、ＨＩＶ−１に関して、インテグラーゼのアミノ酸６４、１１６および／または１５２に関する。このレンチウイルスのＣ末端部分に影響を与える突然変異は、有利には、ＡＡＨによる２６２ＲＲＫモチーフの置換、Ｑ領域における置換（Ｑ２１４Ｌおよび／またはＱ２１６Ｌ）、Ｌ領域における置換（Ｋ１８６）および／またはＬ領域における置換から選ばれる。好ましい突然変異は、ＡＡＨによる２６２ＲＲＫモチーフの置換からなる。
【００２４】
本発明のレンチウイルスは、典型的には、配列５’ＬＴＲ−ｐｓｉ−ＲＲＥ−ｃＰＰＴ ＣＴＳ−（プロモーター）−導入遺伝子−ＬＴＲ３’を有する組換えゲノムを含む。導入遺伝子は、典型的にはプロモーターの制御下に置かれる。１つおよび／または他をｃＰＰＴ ＣＴＳエレメントの上流に配置することもできる。
【００２５】
従って、組換えゲノムは、包膜化および形質導入のために有用なシス作用性ウイルス配列を含む。有利には、それは、あるレンチウイルス配列、特に
− ゲノムの包膜化のために必要な配列（レンチウイルス起源のｐｓｉ配列）；
− ＲＮＡ核外移行エレメント、を保存するのみである。後者は、有利には、レンチウイルスゲノム、特にＶＩＨ、例えばＶＩＨ−１のＲＥＶ応答エレメント（「ＲＥＶ応答エレメント」のためのＲＲＥ配列）（ＲＲＥ配列は、ウイルスＲＮＡ上に存在し、ＲＥＶ調節エレメントと相互作用する）、メイソン−ファイザーモンキーウイルスのＣＴＥ［構成的輸送エレメント（“Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｅｌｅｍｅｎｔ”）」、ＳＩＶ、ＨＩＶ−２またはＦＩＶの核外移行システムまたはあらゆる他のレトロウイルスの同等なエレメント（例えばＳＩＶ、ＨＩＶ２またはＦＩＶの核外移行システム）；
ＲＮＡの核内移行を促進する配列、例えば逆転写ベクターゲノムの有効な核内移行を可能とするｆｌａｐ配列［ｃＰＰＴ−ＣＴＳ領域（セントラルポリプリントラクト−セントラルターミネーション配列（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ−ｃｅｎｔｒａｌ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ））；Ｃｈａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｍａｙ １９９２； ＷＯ ０１／２７３０４］；および
− パッケージされたベクターＲＮＡの転写に介在する、場合により修飾されたＬＴＲ５’および３’、
から選ばれる。
【００２６】
組換えゲノムは、好ましくは、レンチウイルスコード配列のすべて、特にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ配列をコードするウイルス遺伝子、ならびにｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆアクセサリー遺伝子を欠失している。トランス相補性プラスミドは、好ましくは、ｔａｔおよびｒｅｖ遺伝子を保存している。ベクタープラスミドは、有利には、導入遺伝子の発現およびベクターの安全性を改良するためにＵ３エンハンサー配列を欠失したＬＴＲ３’（ＷＯ０９９／３１２５１）を含むことができる。
【００２７】
インテグラーゼ突然変異に加えて、他の標的を場合により突然変異させることができる：ＤＮＡ線状ゲノムの端部に位置するａｔｔ配列。これらの配列を突然変異させるならば、ゲノムに対するインテグラーゼの作用は、もはや正しくは起こらず、もはや組み込みは起こりえない。それ自体線状ＤＮＡの形態で存在するゲノムは環状化することができる。
【００２８】
本発明のベクターおよびプラスミドは、異なる種に属するレンチウイルス、特にＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＶＩＳＮＡ、ＣＡＥＶおよびＥＩＡＶから調製することができる。特に好ましい血清型は、ＨＩＶ、特にＨＩＶ−１、ＦＩＶ、ＥＩＡＶおよびＳＩＶである。
【００２９】
導入遺伝子の配列は、選ばれたプロモーターおよび／またはエンハンサーならびに該導入遺伝子の良好な発現に必要な転写調節エレメント、転写後調節エレメントおよび翻訳後調節エレメントの制御下に置くことができる。
【００３０】
本発明の意味では、用語「導入遺伝子」は、一般に、いかなるコード核酸又は非コード核酸も示す。これは、例えば酵素認識配列（特異的組み込み部位、タンパク質に対する特定のアフィニティーを示す部位等）の如き非コード配列であることができる。これは、好ましくは、与えられたポリペプチドをコードする配列またはそのように活性であるＲＮＡである。それは、特にＤＮＡｃ、ＤＮＡｇ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、例えば干渉ＲＮＡ、リボザイム等または後者の組合せであることができる。典型的には、導入遺伝子は、所望の発現産物をコードする配列を含むＤＮＡである。さらに、導入遺伝子は、１つ以上の転写終結領域、典型的にはポリアデニル化シグナルを含むことができる。
【００３１】
導入遺伝子は、触媒核酸（干渉、アンチセンス、リボザイム）、自殺核酸（例えば毒素をコードする）または生物学的に活性なペプチド、例えば成長因子、栄養因子、抗血管形成誘導因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、受容体、分化因子、コロニー刺激因子、抗癌剤、酵素、神経伝達物質もしくはその前駆体等をコードする核酸から選ぶことができる。
【００３２】
本発明の１つの特定の態様に従えば、導入遺伝子は、例えば下記の栄養因子：ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＧＤＮＦ等、あるいは抗血管形成誘導因子または欠損した代謝活性を回復するかもしくは特定の代謝機能を与える酵素、例えばＴＨ、ＡＡＤＣ、ＧＴＰＣ、β−グルクロニダーゼ等をコードする。
【００３３】
本発明の他の特定の態様に従えば、導入遺伝子は、例えば、優勢遺伝的疾患に関与するまたは機能獲得（ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇａｉｎ）により誘導される疾患、例えば神経変性疾患に関与する突然変異したタンパク質、例えば突然変異したＳＯＤ（筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ＡＰＰ、ｔａｕ、プレセニリンまたはＢＡＣＥ（アルツハイマー病）タンパク質、α−シヌクレイン（パーキンソン病）またはハンチントン（ハンチントン病）の発現を特異的に阻害することを可能とする干渉性ＲＮＡｓ（ＲＮＡｉ）をコードする。
【００３４】
導入遺伝子は、典型的には、導入遺伝子に対して相同性であるかまたは異種であることができる転写プロモーター、例えば細胞、ウイルス、合成、キメラプロモーター等の制御下に置かれる。使用されるプロモーターは、２または３ＲＮＡポリメラーゼ等に依存して、構成的であるかまたは調節型であり、弱いか又は強い、組織特異的または遍在的であることができる。典型的には、ＣＭＶ、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＴＫなどのウイルスプロモーター、または好ましくはＰＧＫ、Ｒｈｏ、ＥＦ１αなどの細胞プロモーターが使用される。特異的組織プロモーターを使用することができる。これらは、例えば場合により修飾されている、ＥＮＯ、ＧＦＡＰ、ＮＳＥプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＵ６またはＨ１プロモーター等であることができる。導入遺伝子発現を指向するために使用されるプロモーターは、例えばＣＭＶ、ＴＫ、またはＲＳＶ ＬＴＲ遺伝子のプロモーターから選ばれるウイルスプロモーターであることができる。
【００３５】
エンベローププラスミドに存在するプロモーターおよび／またはベクタープラスミドに存在するプロモーターは、同一であるか又は異なっておりそして細胞またはウイルスプロモーターである。
【００３６】
非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスベクターの産生
本発明に従うレンチウイルスベクターは、安定な系統において一過性トランスフェクションによりおよび／またはヘルパーウイルスにより種々の方法で調製することができる。
【００３７】
本発明に従う方法は、特に好ましい態様に従えば、最小３つのプラスミド（図１参照）：
ａ）いかなるｐｓｉ包膜化シグナルも欠いており、レンチウイルスｇａｇ配列および組み込み機能のないインテグラーゼをコードする突然変異したレンチウイルスｐｏｌ配列を含み、場合によりｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｕおよび／またはｖｐｒアクセサリー遺伝子を欠失しているトランス相補性プラスミド、
ｂ）プロモーター−ｅｎｖ−ＰｏｌｙＡ配列を含むエンベローププラスミド、および
ｃ） 場合によりＬＴＲ３’のプロモーター領域又はＬＴＲ３’のＵ３エンハンサー配列を欠失しており、そしてレンチウイルスのＬＴＲ５’配列とＬＴＲ３’配列との間にレンチウイルス包膜化ｐｓｉ配列、ＲＮＡ核外移行エレメント（好ましくは、ＨＩＶ ＲＲＥまたは任意の他のレトロウイルスからの同等なエレメント）、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはＲＮＡの核内移行を促進する配列（例えばｃＰＰＴ ＣＴＳ配列）を含む組換えゲノム、ならびに該ゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みを阻止する突然変異したインテグラーゼ、を含むレンチウイルスベクタープラスミドであって、レンチウイルスのいかなるコード配列も欠いているレンチウイルスベクタープラスミド、
を組合せて組換えビリオンまたは組換えレンチウイルスを産生すること、および
レンチウイルス産物の回収、
を提唱する。
【００３８】
有利には、使用される３つのプラスミドは、組換えを可能とするのに十分ないかなる相同性配列も含まない。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖコード核酸は、有利には先行技術でおよびデータベースで入手可能なウイルス遺伝子の配列から慣用の技術に従って調製されたおよび実施例で説明されたＤＮＡｃであることができる。
【００３９】
トランス相補性プラスミドは、ｇａｇおよびｐｏｌレンチウイルスタンパク質をコードする核酸を提供する。これらのタンパク質は、レンチウイルスに由来しており、好ましくはＶＩＨ−１に由来する。このプラスミドは、いかなる包膜化配列、エンベロープコード配列、アクセサリー遺伝子も欠いており、そして有利にはレンチウイルスＬＴＲｓも欠いている。この理由で、ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする配列は、異種プロモーター、例えば細胞、ウイルスのプロモーター等の制御下に置かれ、これらのプロモーターは、構成型であるか調節型であることができ、弱いか又は強力であることができる。これは、好ましくは、ＣＭＶ−Δｐｓｉ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ＰｏｌｙＡ配列を含むトランス相補性プラスミドである。このプラスミドは、エンビロープ糖タンパク質は別として、空のビリオンの形成のために必要なすべてのタンパク質の発現を可能とする。トランス相補性プラスミドは、有利にはＴＡＴおよびＲＥＶ遺伝子を含むことができる。さらに、トランス相補性プラスミドは、ＷＰＲＥ、ＡＰＰ ５’ＵＴＲ、ＴＡＵ ３’ＵＴＲおよびクロマチンインシュレーション配列、例えばＭＡＲ（マトリックス付着領域（Ｍａｔｒｉｘ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ））、ＳＡＲ（スカフォールド付着領域（Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ））、ｓｃｓおよびｓｃｓ’（特異的クロマチン構造（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）等から選ばれる転写調節エレメントを含むこともできる。有利には、それは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよび／またはｎｅｆアクセサリー遺伝子を欠いている。ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子ならびにＴＡＴおよびＲＥＶ遺伝子は、場合により分離された異なるプラスミドにより担われることもできる。この場合に、いくつかのトランス相補性プラスミドを使用し、各プラスミドは１以上の該タンパク質をコードする。
【００４０】
トランス相補性プラスミドのｐｏｌ配列における突然変異は、いくつかの塩基の１つ以上のミクロ欠失、好ましくは、上記したとおり、コードされたインテグラーゼ配列の塩基性領域、Ｃ末端領域（例えば、Ｃ末端領域の塩基性領域）および／または触媒領域に影響を与える１つ以上の点突然変異からなる。
【００４１】
エンベローププラスミドは、選ばれたエンベロープ（ｅｎｖ）糖タンパク質の産生を可能とする核酸を与える。それは、いかなるｐｓｉ包膜化シグナル、ｇａｇまたはｐｏｌコード配列も欠いており、そしてレンチウイルスＬＴＲｓも欠いている。それはプロモーター−ｅｎｖ−ＰｏｌｙＡ配列を含む。
【００４２】
先行技術に述べられたシュードタイプＶＩＨ−１ベクター（例えば他のウイルスに由来するまたは細胞起源の、従って修飾された向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を有する、野生型エンビロープとは異なるエンビロープを含む）は、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質を含む。このエンベロープは、超遠心に対する抵抗性および非常に広い向性などの有利な特徴を有する。他のエンビロープ、例えば古典的レトロウイルスのエンビロープ（両種指向性および同種指向性ＭＬＶレトロウイルスまたはＶＩＨｇｐ１２０、しかし多くの他のウイルスも）と違って、ＶＳＶ糖タンパク質は、超遠心後に不安定ではない。これは、ウイルス上清を濃縮しそして高い感染レベルを得ることを可能とする。さらに、このエンベロープは、特にインビトロでビリオンに非常に広い向性を与え、非常に多くの細胞型の感染を可能とする。このエンベロープの受容体は、異なるタイプの多数の細胞の表面に存在するホスファチジルセリンモチーフであろう。
【００４３】
水泡性口内炎ウイルスのエンベロープ（ｅｎｖ）糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）は、本発明の枠内で有利に使用されるが、ある細胞集団を最前に標的化するために任意の他のシュードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）を使用することができる。従ってエンベロープタンパク質は、任意のエンベロープされたウイルスからの任意のエンベロープ糖タンパク質、例えばラブドウイルスエンベロープタンパク質、さらに好ましくは狂犬病ウイルス（ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）、およびなおさらに好ましくは、狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）：狂犬病（Ｒａｂｉｅｓ）（ＲＡＢ）、デューベンヘイジ（Ｄｕｖｅｎｈａｇｕｅ）（ＤＵＶ）、ヨーロピアンバット１型（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｂａｔ １）（ＥＢ−１）、ヨーロピアンバット２型（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｂａｔ ２）（ＥＢ−２）、コトンカン（Ｋｏｎｔｏｎ）（ＫＯＴ）、ラゴスバット（Ｌａｇｏｓ ｂａｔ）（ＬＢ）、オボジアング（Ｏｂｏｄｈｉａｎｇ）（ＯＢＤ）、ロシャンボー（Ｒｏｃｈａｍｂｅａｕ）（ＲＢＵ）の血清群のウイルスのエンベロープタンパク質、モコラウイルス（ＭＯＫ）の血清群からのウイルスのエンビロープタンパク質およびこれらのエンビロープの任意のキメラ組成物から選ぶことができる。狂犬病およびモコラウイルスは特に好ましい。実際それらは神経系に対して非常に特異的な、動物における向性を有する（ＷＯ０２／０９７１０４）。さらに、この型のエンベロープは、細胞の標的化、特にアストロサイト型のグリア細胞の標的化を可能とする。
【００４４】
好ましい態様では、本発明は、例えば狂犬病またはモコラウイルスエンビロープを有するシュードタイプのＶＩＨ−１型のレンチウイルスベクターを使用する。
【００４５】
本発明のベクタープラスミドは、ＬＴＲ５’とＬＴＲ３’との間にｐｓｉエレメント、ＰＲＥ（又は他のレトロウイルスの同等のエレメント）、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはｆｌａｐ配列、ｃＰＰＴ ＣＴＳを含む組換え核酸を含む。それは、例えば、配列５’ＬＴＲ−ｐｓｉ−ＲＲＥ−ｃＰＰＴ ＣＴＳ−（プロモーター−）導入遺伝子−ＬＴＲ３’を含むことができる。導入遺伝子の配列は、プロモーターおよび／またはエンハンサーの制御下に、ならびにこの遺伝子の良好な発現のために必要なすべての転写調節エレメント、転写後調節エレメントおよび形質導入後調節エレメントの制御下にベクタープラスミドの範囲内に場合により配置される。このプラスミドは、良好な形質導入プロセスのために必要なシス作用性ウイルス配列を含む。元のウイルスから、それはゲノムの包膜化のために必要なある配列（レンチウイルス起源のｐｓｉ配列）、場合により逆転写ベクターゲノムの有効な核内移行を可能とするｆｌａｐ配列（ｃＰＰＴ−ＣＴＳ領域）およびパッケージされる前にベクターＲＮＡの転写を可能とする内在性ＬＴＲ５’（ｉｎｔｅｇｒａｌ ＬＴＲ５’）を保存するのみである。さらに、このベクターは、場合によりＬＴＲ３’Ｕ３エンハンサー配列を欠失していてもよい（ＷＯ９９／３１２５１）。さらに、それは、元のウイルス遺伝子のすべて、特にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ 配列をコードするウイルス遺伝子を欠失しておりそしてベクターの安全性を改良するためにアクセサリー遺伝子（ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｒおよび／またはｖｐｕ）を欠失している。
【００４６】
本発明の１つの特定の態様では、線状ゲノムの端部に位置しているａｔｔ配列は、さらに有利に突然変異しており、そして場合によりインテグラーゼがゲノムに作用するのをより困難にするように欠失される。
【００４７】
ｇａｇおよびｐｏｌの発現、エンベロープタンパク質の発現、ベクターゲノムｍＲＮＡおよび導入遺伝子の発現をそれぞれ促進するために、トランス相補性プラスミド、エンベローププラスミドおよびベクタープラスミドにおいて使用されるプロモーターは、有利には、遍在性プロモーター又は特異的プロモーター、例えばＣＭＶ、ＴＫ、ＲＳＶ ＬＴＲウイルスプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＵ６又はＨ１プロモーターから選ばれる同一の又は異なるプロモーターである。
【００４８】
本発明に従うレンチウイルスは、ネイティブ感染性ウイルスを構成するある遺伝子が抑制されそして標的細胞に導入されるべき有益な核酸配列により置き換えられるように、遺伝子的に修飾される。細胞膜へのウイルスの融合に続いて、該ウイルスは、その核酸を細胞に注入する。このようにして導入された遺伝子物質は、次いで転写されそして場合により宿主細胞内でタンパク質に翻訳される。
【００４９】
本発明に従う好ましいベクター系は、
ａ）いかなるｐｓｉ包膜化シグナルも欠いており、そしてレンチウイルスのｇａｇ配列および組み込み機能のない、（インテグラーゼのコードされた配列におけるＣ末端領域の塩基性領域における）ＡＡＨによる２６２ＲＲＫモチーフの置換を含むインテグラーゼをコードする突然変異したレンチウイルスｐｏｌ配列を含み、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｕおよび／またはｖｐｒなどのいかなるアクセサリー遺伝子も欠失している、トランス相補性プラスミド、
ｂ）好ましくはウイルスプロモーターを含みそしてＶＳＶ−Ｇエンベロープ、さらに好ましくはＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＰｏｌｙＡ配列をコードする上記したエンベローププラスミド、および
ｃ）場合によりＬＴＲ３’のプロモーター領域またはＬＴＲ３’のＵ３エンハンサー配列を欠いており、ＬＴＲ５’とＬＴＲ３’との間にｐｓｉエレメント、ＰＲＥ、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはｆｌａｐ配列、ｃＰＰＴ ＣＴＳを含み、レンチウイルス（例えばＨＩＶ−１）の遺伝子のすべてを欠いているレンチウイルスベクタープラスミド
を含む。
【００５０】
非組み込み型の且つ複製に欠陥のある組換えウイルスの産生のために、上記したプラスミドをコンピテント細胞に導入することができ、そして産生されたウイルスを回収する。使用される細胞は、任意のコンピテント細胞、特に哺乳動物、例えば動物またはヒトからの特に真核細胞 であることができる。それらは体細胞または胚細胞、幹細胞又は分化した細胞であることができる。例えば、２９３細胞、繊維芽細胞、肝細胞、筋肉（骨格、心臓、平滑、血管等）細胞、神経細胞（ニューロン、グリア、アストロサイト）、上皮、腎、眼細胞等を挙げることができる。それらは植物細胞、酵母または真核細胞であることもできる。それらはＳＶ４０ Ｔ抗原により形質転換された細胞であることもできる。
【００５１】
従って、本発明は、コンピテント細胞の集団を上記したプラスミドの組合せによりトランスフェクションしそして産生されたベクターを回収することを含む、非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルスを調製するための方法に基づいている。
【００５２】
従って、本発明は、
ａ）いかなるｐｓｉ包膜化シグナルも欠いており、そしてｇａｇ配列および／または例えばコードされたインテグラーゼ配列の塩基性領域および／またはＣ末端領域におけるＡＡＨによる２６２ＲＲＫモチーフの置換を可能とするクラス１突然変異を含むｐｏｌ配列を含み、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｕおよび／またはｖｐｒなどのいかなるアクセサリー遺伝子も欠いている、少なくとも１つのトランス相補性プラスミド、
ｂ）（例えばＶＳＶ−Ｇ）−ＰｏｌｙＡ（例えばＣＭＶ−）エンベローププロモーター配列を含むエンベローププラスミド、
ｃ）場合によりＬＴＲ３’のＵ３エンハンサー配列を欠失しており、５’ＬＴＲと３’’ＬＴＲとの間にｐｓｉエレメント、ＰＲＥ、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはｆｌａｐ配列、ｃＰＰＴ ＣＴＳを含み、レンチウイルス（例えばＨＩＶ−１）のコード配列を欠失しているベクタープラスミド、
を含む上記した非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスベクター系によるコンピテント細胞のトランスフェクション、および
レンチウイルス産物の回収、
を含む、導入遺伝子のインビボ発現を可能とする非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスを産生するための特に有利な方法に関する。
【００５３】
本発明のレンチウイルスは、上記したとおり、１つ以上のｇａｇ、ｅｎｖおよびインテグラーゼ上で突然変異したｐｏｌタンパク質を産生する包膜化細胞の系統から調製することもできる。
【００５４】
この理由で、１つの特定の態様では、本発明の方法は、選ばれたｅｎｖタンパク質を発現する細胞の系統におけるちょうど２つのプラスミド（ベクタープラスミドおよびトランス相補性プラスミド）のトランスフェクションを含む。この系統を調製するために使用される細胞は、例えば、上記したコンピテント細胞である。
【００５５】
他の態様に従えば、使用される系統は、ｅｎｖタンパク質、ｇａｇタンパク質および／またはレンチウイルスｐｏｌタンパク質も発現し、後者はクラス１突然変異を含む。この場合に、この方法は、単にベクタープラスミドのトランスフェクションを含む。
【００５６】
上記したとおり、産生されるレンチウイルスは、好ましくは、ＶＩＨ−１、ＶＩＨ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＶＩＳＮＡ、ＣＡＥＶまたはＥＩＡＶウイルスに由来する。
【００５７】
細胞系の中でも、特に非常に組換え可能であることで知られているニワトリリンパ腫から樹立されたＤＴ４０系統およびＣｏｓ７系統（ＳＶ４０抗原により不死化されたサル腎臓からの細胞）を優れていると認めることができる。細胞系は、ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ１（結腸癌から採取された細胞から樹立されたヒト系統）、ＬＦ１（ヒト胚肺繊維芽細胞）、ＬＬ１（ヒト胚皮膚繊維芽細胞）、ＴＫ６（ヒトリンパ芽球系統）、ＨａＣａＴ（ヒト角化細胞）、Ｕ９３７（ヒト単球）、ＨＣＴ１５、ＳＷ４８０、Ｃｏｌｏ３２０、Ｃｏ１１５、ＥＢ、Ｈｂ１１００、Ｒａｔ−１、ＰＣ１２（ラットホトクロモサイトーマ（ｒａｔ ｐｈｏｔｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）等の系統であることもできる。この非網羅的リストは例として与えられる。当業者に知られている他の系統を選ぶことができそしてその側としてなんらの特定の努力なしに本発明の枠内で使用することができる。
【００５８】
本発明の方法を実施するために、プラスミドを問題の細胞型に適合した当業者に知られている任意の技術により細胞に導入することができる。一般に、細胞およびベクター系を、細胞へのベクター系またはプラスミドの導入を可能とするのに十分な期間の時間適当な装置（プレート、ボックス、チューブ、ポケット等）中で接触させる。典型的には、ベクター系またはプラスミドは、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーションによりまたは脂質、ポリマー、リポソームおよびペプチド等などのトランスフェクションを促進する１以上の化合物を使用することにより細胞に導入される。リン酸カルシウム沈殿が好ましい。細胞は任意の適合した培地、例えばＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、ウシ胎児血清の不存在下に培養を可能とする特定の培地等の中で培養される。
【００５９】
本発明の１つの特定の目的は、レンチウイルスインテグラーゼであって、塩基性領域、そのＣ末端領域（例えばＣ末端領域の塩基性領域）および／またはその触媒部位に影響を与える１つ以上の突然変異を含み、組み込み機能を欠いているレンチウイルスインテグラーゼを安定な方式で発現する細胞の系統、および非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルスのインビトロ調製のためのこの型の細胞系の使用にも関する。
【００６０】
従って、本発明の１つの目的は、本方法を実施することにより得られる細胞およびヒトまたは動物における治療、ワクチンまたは外科的処置方法を実施するために使用される細胞組成物を調製するための本発明に従う細胞、細胞の系統又は細胞集団の使用に関する。
【００６１】
本発明は、上記した如きベクターを含む、インビトロまたはエクスビボで細胞のゲノムを修飾するための方法を実施するためのキットにも関する。
【００６２】
用途
本発明に従うウイルスおよび系統は、例えば、好ましくは分裂しない細胞における導入遺伝子または他の核酸の発現のため、あるいは他のベクターによる他のトランスフェクションに対してまたは形質導入法に対してすら抵抗性分裂細胞の遺伝子の一過性発現のために使用することができる。
【００６３】
驚くべきことに、本願は、この方法で得られるレンチウイルスベクターは、例えば網膜細胞、アストロサイト、他のグリア細胞又はニューロンなどの異なる細胞型に形質導入することができることを示す。本発明のベクターにより標的化されうる神経細胞の他の亜集団は、例えば、ミクログリア細胞、上皮細胞またはオリゴデンドロサイトである。目における遺伝子の導入に関する１つの特定の用途において、本発明のベクターは、例えば色素上皮細胞への選択的導入を可能とするようにモコラエンベロープでのシュードタイプ化されうる。
【００６４】
この非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスベクターは、遺伝子導入の安全性および有効性を改良するためであり：インテグラーゼを突然変異させることにより、該ベクターは標的細胞のゲノムにもはや組み込まれず、従って挿入突然変異誘発の危険を排除する。さらに、ベクターへのｆｌａｐ配列（ｃＰＰＴ−ＣＴＳ）の可能な挿入はＤＮＡゲノムの核内移行を実質的に改良することができ、分裂終了細胞において安定な、そして繁殖している細胞において一過性の、導入遺伝子の強い発現を可能とする。
【００６５】
本発明の非組み込み型レンチウイルスベクターの可能な用途はいくつかの型がありそして下記の用途を含む：
−遺伝子治療、即ち、任意の哺乳動物細胞、特にヒト細胞における遺伝子導入を含む。これらは、分裂細胞もしくは休止細胞、中枢器官もしくは末梢器官、例えば肝臓、膵臓、筋肉、心臓などに属する細胞であることができる。それは、好ましくは、例えば神経変性病理または網膜の疾患の処置の枠内で、休止細胞（分裂しない）における、特に中枢神経系の細胞における、特に脳、骨髄および眼球の細胞における遺伝子の導入、および一過性発現のための分裂細胞への遺伝子の導入（例えば、抗腫瘍自殺ストラテジー、脊髄の損傷を処置するための軸索拒絶ストラテジー）である。
遺伝子治療は、タンパク質、例えば神経栄養因子、酵素、転写因子、受容体等の発現を可能とすることができる。さらに、それは「オリゴヌクレオチド」ストラテジー（アンチセンスまたは干渉ＲＮＡｓ、リボザイム等）の実施を可能とする。
−細胞治療、即ち、移植前に選ばれた行き先に向けて細胞を方向付けるための前駆細胞における分化因子の発現、または細胞が有利な因子を発現するように細胞のエクスビボ形質導入、それに続く該細胞の移植。
【００６６】
本発明の１つの特定の目的は、例えば、インビトロ、エクスビボまたはインビボで被験体の中枢神経系（眼球を含む）への遺伝子の導入用の組成物を調製するための本発明に従う非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスの使用に関する。
【００６７】
本発明の他の特定の目的は、中枢器官又は末梢器官に影響を与える疾患、例えば神経系（眼球を含む）の疾患の処置のための組成物を調製するためのこの型のレンチウイルスの使用に関する。
【００６８】
本発明に従う非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスは、それらが含有する導入遺伝子に従って、例えば、神経変性疾患、および特にアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ＳＬＡもしくはＳＭＡ、加齢黄斑変性症（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（ＤＭＬＡ）、眼変性（ｏｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）もしくは中枢神経系の損傷（例えば卒中、癲癇、脊髄の病変もしくは損傷等）、中枢神経系に影響を与える疾患（ムコ多糖症等）、グリオブラストーマもしくはアストロサイトーマ、神経系に影響を与える代謝疾患（ムコ多糖症、シャルコ−マリー（Ｃｈａｒｃｏｔ−ｍａｒｉｅ）等）または眼球に影響を与える疾患（ＤＭＬＡ、色素網膜炎（ｐｉｇｍｅｎｔ ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）、緑内障等）を処置するための医薬組成物を製造するために使用することができる。
【００６９】
本発明の１つの特定の態様に従えば、非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルスは、色素網膜炎を処置するための医薬組成物を製造するために使用される。用語「色素網膜炎」は、アポトーシスによる桿体（ｒｏｄｓ）および錐状体（ｃｏｎｅｓ）（網膜の神経細胞）の進行性変性により特徴付けられる眼障害の雑多なグループを示すのに使用される。３０００毎に１個体の発生率で、これは失明の主要な原因である。色素上皮および光受容体の細胞の形質導入は、この型の病理に対して決定的に有益である。遺伝子置換ストラテジーは、光受容体または色素上皮の形質導入を必要とするが、これに対して神経保護ストラテジーは色素上皮の形質導入から利益を得ることができる。実際に、この方法の利点は、それが神経細胞を修飾しないで、色素上皮のみを修飾し、それは次いで拡散性栄養因子、例えばＧＤＮＦを合成しそして保護されるべき光受容体を取り囲んでいる区域においてそれを分泌するということである。
【００７０】
本発明の他の目的は、神経系の細胞におけるいくつかの核酸を導入しそして発現する目的でのいくつかのレンチウイルスの組み合わせた使用である。組み合わせた使用は異なるウイルスの逐次投与または同時投与を含むことができる。
【００７１】
上記したとおり、本発明は、神経細胞における多数の核酸、例えば、触媒核酸（干渉、アンチセンス、リボザイム等）、成長因子、栄養因子、サイトカイン、コロニー刺激因子、抗癌剤、毒素、酵素、神経伝達物質またはそれらの前駆体等をコードする核酸の輸送および発現を可能とすることができる。
【００７２】
本発明に従うレンチウイルスを含有する医薬組成物は、適切なエンビロープ糖タンパク質の助けによりシャュードタイプのレンチウイルスベクターの特定の向性に依存して大脳内にまたは全身的に患者に投与することができる。従って、これは大脳内投与、例えば、線条体内投与、海馬もしくは黒質への投与、静脈内、動脈内、硝子体内（ｉｎｔｒａ−ｖｉｔｒｅａｌ）投与であることができ、又は網膜下空間（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｓｐａｃｅ）等に投与することができる。好ましい注射方法は、大脳内注射および網膜下空間への注射である。
【００７３】
組成物は、１０２〜１０１０、典型的には１０３〜１０８の形質導入のための有効粒子のレベル、（ベクターストック（ｖｅｃｔｏｒ ｓｔｏｃｋ）の逐次希釈による細胞形質導入により決定されたレベル）または約１０５〜１０１３コピーのゲノム当量で［ベクターのＲＮＡゲノムでの定量的逆転写ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）またはベクターのＲＮＡゲノムと会合したＤＮＡ鎖での定量的ＰＣＲにより決定されたレベル］有利に投与される。このレンチウイルスは、場合により同系アルブミンなどの安定剤または任意の他の安定化タンパク質、グリセロール等ならびにポリブレンまたはＤＥＡＥデキストラン等などの補助因子（ａｄｕｖａｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ）と一緒にして、任意の適合した溶液、例えば塩類溶液、等張性溶液、緩衝液中でコンディショニングされうる（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）。
【００７４】
本発明の他の利点は、下記の実施例においてさらに詳細に説明される。これらの実施例は説明のためであり限定するものではないとみなすべきである。
【００７５】
実験の部
最初に、レンチウイルスベクター（ｐ８．９１ ＩＮＷＴおよびｐ８．９１ ＩＮＮプラスミド）を産生するために使用されるトランス相補性プラスミドにおいて突然変異したまたは突然変異していないインテグラーゼ配列（ヘマグルチニンと融合した）を使用した。次いで、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の早発ウイルスプロモーターの制御下にグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現しそして正常な（ＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰベクター）もしくは突然変異した（ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ）インテグラーゼを有するＶＩＨ−１に由来するベクターのストックを産生した。神経細胞内のＧＦＰ導入遺伝子の発現を操作するためのＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターの効率に関する研究を最後に行い、始めインビトロ、次いでインビボで行った。
【００７６】
インビトロベクターの特徴付け
インビトロＧＦＰ導入遺伝子の発現
非組み込み型レンチウイルスベクターの、細胞系に形質導入しそしてそこで導入遺伝子を発現する能力を評価するために、２９３Ｔ、ＨｅＬａおよびＭＴ４細胞を種々の容量のＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰおよびＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターの存在下にインキュベーションした。ＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型ベクターによる形質導入の７２時間後に、ある百分率の細胞がＧＦＰを発現する（ＦＡＣＳによる分析）。同じようにして、ＧＦＰ＋細胞がＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターによる形質導入の７２時間後にＦＡＣＳにより証明された（図２）。この最初の結果は、そのインテグラーゼが不活性化されているベクターの良好な形質導入有効性を示唆する。
【００７７】
偽形質導入（ｐｓｅｕｄｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）の分析
レンチウイルスベクターのストックを、それらの産生期間中、プラスミドＤＮＡ、特にｐＴｒｉｐ ＣＭＶ ＧＦＰベクタープラスミドによりおよびトランスフェクションされた細胞におけるこの同じプラスミドから産生されたＧＦＰタンパク質により汚染させる。これらの２つのエレメントは、ＧＦＰがレトロ転写されたベクターゲノムの発現に由来しない偽のポジティブ細胞を発生させることができる。したがって、これらのＧＦＰ＋細胞は形質導入されていなくて、「偽形質導入されている」。
【００７８】
ＧＦＰ＋細胞が偽形質導入機構から生じていないことを証明するために、２９３Ｔ細胞は、任意のアジド−デオキシチミジン（ＡＺＴ）の存在下又は不存在下に、逆転写酵素（ＲＴ）阻害剤の助けにより形質導入された。実際、ＡＺＴによる処理は、ＧＦＰが細胞の形質導入から生じる場合に、ＧＦＰの発現を阻害する。従って、ＡＺＴの存在下に観察されたＧＦＰ＋細胞の百分率は、偽形質導入の百分率に相当するだけである。２０の感染多重度（ＭＯＩ）で２９３Ｔ細胞を形質導入した後に、ＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型ベクターでＧＦＰ＋細胞４０．７％（±１．５）が観察されそしてＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型ベクターで２８．０％（±１．９）が観察される。１０μＭ ＡＺＴの存在下においては、形質導入された細胞の百分率は、それぞれ５．８％（±０．１）および４．９％（±０．４）に低下する（図３）。従って、ＲＴの阻害は、ＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型ベクターによる形質導入の後であろうと、ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターによる形質導入の後であろうと、ＧＦＰ＋細胞の百分率を減少させることを可能とする。従って、任意の逆転写酵素阻害剤の不存在下に観察されるＧＦＰ＋細胞の大部分は、２つの型のベクターにより有効に形質導入されておりそして偽形質導入機構からは生じない。
【００７９】
分裂細胞における発現の安定性
突然変異したＩＮ−ＨＡＮインテグラーゼを有する粒子のエピソーム性格を証明するために、ＧＦＰの発現を異なるＨｅｌａ、２９３ＴおよびＭＴ４細胞系における形質導入の後の１５日まで分析した。細胞を、５のＭＯＩで、突然変異体ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターにより、組み込み型ＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰ対照によりまたは非組み込み型ＣＭＶ ＧＦＰアデノウイルス対照により形質導入させた。形質導入された細胞の各バッチを１２〜１５日間増幅しそして７２時間毎にＦＡＣＳにより分析した。最後の細胞を回収する２４時間前に、これらのいくらかを５ｍＭ酪酸ナトリウムで処理して、ＧＦＰの発現に対するハイポアセチル化の可能な影響を評価した。得られた結果は、図４に示される。
【００８０】
時間に対して、ＧＦＰを発現する２９３ＴまたはＭＴ４細胞の百分率は、これらがＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型対照ベクターで形質導入されたとき相対的に安定であり、この百分率は２９３Ｔ細胞において評価された最後の点に僅かに下がる（図４）。しかしながら、実験の終わりにおける酪酸ナトリウムによる細胞の処理は、２９３Ｔ ＧＦＰ＋細胞の百分率を最初に測定したレベルに戻すことを可能とし、これは導入遺伝子の発現を支配するプロモーターの再活性化を示唆し、そして分析された細胞の集団に組み込まれたベクターの時間に対する安定性を示す。非組み込み型アデノウイルス対照ベクターで形質導入された細胞では、ポジティブ細胞の百分率は、形質導入の１５日後相殺されるように引き続く分裂期間中有意に低下する。この場合に、形質導入の１５日後の酪酸ナトリウム処理は、ＧＦＰ＋細胞の最初の百分率を再確立することを可能としない（図４Ｂ）。この結果は、細胞分裂期間中アデノウイルスゲノムの漸進的な希釈により説明される。染色体外エレメントとして、ベクターゲノムは、細胞サイクル期間中細胞のゲノムＤＮＡのように複製されない。従って、各有糸分裂と共にベクターゲノムのコピーは、２つの娘細胞の１つにのみ伝達され、これは理論的に各細胞サイクルで導入遺伝子を発現する細胞の百分率を２で割ることになる。
【００８１】
突然変異体インテグラーゼを有するベクターにより形質導入された細胞における発現は、アデノウイルスベクターによるトランスフェクション後に観察されるプロフィルに極めて類似したプロフィルを示す。実際、ＧＦＰ＋細胞の百分率は、時間に対して減少し（図４）そして酪酸ナトリウムで細胞を処理することにより最初のレベルに戻すことができない。この結果は、アデノウイルスベクターによる形質導入の場合におけると同じく、ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターのゲノムは、各細胞分裂によって逐次希釈により最初に形質導入された細胞から排除されることを示唆する。
【００８２】
休止細胞におけるＧＦＰ導入遺伝子の発現の安定性
時間に対するＧＦＰ＋細胞の百分率の減少は、形質導入された細胞の核におけるベクターゲノムの不安定性およびそれらの分解を反映することもできる。この仮定を立証するために、ＧＦＰ導入遺伝子の発現を２つの型のベクターによるニューロン細胞の形質導入後に研究した。実際、初代ニューロン（胚ラット皮質）は培養において分裂しない。ＧＦＰの発現は、ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターによるこれらの細胞の形質導入後の少なくとも１６日間は持続する（図５Ａおよび５Ｂ）。考慮された異なる時間におけるＷＴベクターにより形質導入された免疫反応性細胞の百分率と、Ｎベクターで得られた百分率との間に有意な差は観察できなかった（反復した測定において２因子ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．９３２１）。追加の実験は、導入遺伝子の発現は形質導入後２５日まで持続することを示すことを可能とした（図５Ｃ）。
【００８３】
従って、エピソーム形態は、形質導入された細胞の核において相対的に安定であり、そして休止細胞において少なくとも２５日間導入遺伝子の発現を可能とする。この結果は、分解によるよりはむしろ各有糸分裂によるエピソームベクターゲノムの希釈により分裂細胞における時間に対するＧＦＰの発現の減少の仮定を支持する。
【００８４】
インビボでのＧＦＰ導入遺伝子の発現
マウス線条体における発現
インビボで細胞に形質導入することにおけるインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの有効性を決定するためおよびＧＦＰ導入遺伝子の発現を可能とするために、ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターを、マウス線条体に注射した。この注射の１０日後に、ＧＦＰ発現を証明することができた。この発現は、注射に続く少なくとも１ヶ月の期間持続する。この結果は、ＳＮＣ細胞における導入遺伝子の発現を可能としそして維持することにおける非組み込み型ベクターの有効性を確認する（図６）。形質導入された細胞の表現型を同定するために、一方ではＧＦＰ／ＧＦＡＰ免疫組織蛍光（グリア細胞繊維性酸性タンパク質、アストロサイトマーカー）および他方ではＧＦＰ／ＮｅｕＮ（ニューロンマーカー）による共標識化を隣接切片で実施した。共焦点顕微鏡によるスライドの分析の後に、ＧＦＰ のＧＦＡＰマーカーとの大部分の共局在（ｃｏｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ）（図７Ａ）およびＧＦＰ のＮｅｕＮマーカーとの非常に僅かな共局在（図７Ｂ）を観察することができた。これらの結果は、ＶＳＶエンベロープでシュードタイプ化されたインビボでのＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターは、好ましくはアストロサイト細胞に形質導入することを示唆する。
【００８５】
網膜における発現
非組み込み型レンチウイルスベクターの網膜の色素上皮細胞に形質導入する能力を評価した。このために、ベクターの網膜下注射をラットおよびイヌにおいて実施した。予備的結果は、ラットにおいて少なくとも９週間そしてイヌにおいて３ヶ月間ＧＦＰの発現を示す（図８）。これらの２つのシステムにおける発現の安定性の評価は続行されている。本発明者により以前に得られた結果は、レンチウイルスベクターは、ラットにおける網膜下注射後に、本質的に色素上皮細胞に形質導入することを示す。
【００８６】
目を綿密に検査することによりあるイヌでは低いレベルの毒性が観察された。この毒性は、注射された用量とは無関係であり、そしてベクター自体についてもそうであり、そして注射の時点で外科的行為により誘導されると思われる。より広範な組織学的分析は、この刺激をより明白に理解することを可能とするであろう。
【００８７】
動物モデルにおける治療導入遺伝子の発現
臨床的適用のための非組み込み型レンチウイルスベクターの使用、治療導入遺伝子を発現することにおける該ベクターの有効性を立証する目的で、グリア由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を、色素網膜炎により特徴付けられたモデル、ＲＤ１０ラットにおける網膜下注射後に試験した。表現「色素網膜炎（ＲＰ）」は、桿体および錐状体（網膜の神経細胞）のアポトーシスによる、進行性変性により特徴付けられる眼障害の雑多なグループを示す。３０００に１つの個体の発生率で、これは失明の主要な原因である。色素上皮細胞および光受容体の形質導入は、この型の病理においてきわめて有益である。遺伝子置換ストラテジーは、光受容体又は色素上皮の形質導入を必要とするが、これに対して神経保護のストラテジーは、色素上皮の形質導入から利益を得ることができる。実際、この方法は、それが神経細胞を修飾しないで、色素上皮のみを修飾し、これは次いで拡散性栄養因子、例えばＧＤＮＦを合成し、そしてそれを保護されるべき光受容体を取り囲んでいる区域に分泌するであろうという利益を有する。
【００８８】
実験室で行われた実験は、組み込み型レンチウイルスベクターが正常なマウスにおける網膜下注射によって色素上皮の細胞に形質導入するのに有効であることを示す。
【００８９】
上記した結果は、げっ歯類および大きな動物において中枢神経系（脳および網膜）においてインビトロ、エクスビボおよびインビボで導入遺伝子の発現を可能とすることができる本発明に従う非組み込み型レンチウイルスベクターの有効性および治療的潜在力を示す。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】３つのプラスミド：ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターの制御下のＧＦＰ導入遺伝子およびセントラルｆｌａｐ配列［核内輸送に介入するセントラルポリプリントラクト−セントラルターミネーション配列（ｃＰＰＴ−ＣＴＳ）］、ＲＥＶ調節エレメントと相互作用するＲＲＥ（ＲＥＶ応答配列）およびｐｓｉ包膜化配列（Ψ）、プロモーター配列を欠失した（ΔＵ３）ＬＴＲ３’のＵ３領域を有するベクタープラスミド；ＣＭＶプロモーターの制御下にＶＩＨ−１の複製サイクルの早発フェイズ（ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ ｐｈａｓｅｓ）のために必要なタンパク質（ＧＡＧおよびＰＯＬ）、調節エレメント（ＴＡＴ、ＲＥＶ）を発現しそしてΨ配列を欠失したトランス相補性プラスミド；ＣＭＶプロモーターの制御下に水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のエンベロープ糖タンパク質を発現するエンベローププラスミド、のトランスフェクションによりレンチウイルスベクターを産生するためのシステム。
【図２】非組み込み型レンチウイルスベクターによる細胞系（２９３ＴおよびＨｅｌａ）の形質導入後に得られたＧＦＰの発現。百分率形質導入は、種々の用量（ウエル当たりマイクロリットルの容積）のＩＮｗｔ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型およびＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターの存在下に細胞のインキュベーションの７２時間後にＦＡＣＳにより決定される。
【図３】ＡＺＴによる細胞の処理後のＩＮｗｔ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型およびＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターによる形質導入の抑制。百分率形質導入は、ベクター単独およびベクターとＡＺＴ１０μＭの存在下に２９３Ｔ細胞の７２時間のインキュベーションの後にＦＡＣＳにより決定される。
【図４Ａ】ＩＮｗｔ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型およびＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターによる細胞系（２９３ＴおよびＭＴ４）の形質導入後の時間の期間中のＧＦＰの発現。ＧＦＰ＋細胞の百分率は、形質導入（ＭＯＩ ５）の３日、６日、９日および１２もしくは１５日後にＦＡＣＳにより決定された（Ａ：２９３Ｔ、Ｂ：ＭＴ４）。「ｂｕｔ」と記載された点については、細胞は分析の２４時間前に５ｍＭ酪酸ナトリウム処理を受けた。
【図４Ｂ】ＩＮｗｔ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型およびＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターによる細胞系（２９３ＴおよびＭＴ４）の形質導入後の時間の期間中のＧＦＰの発現。ＧＦＰ＋細胞の百分率は、形質導入（ＭＯＩ ５）の３日、６日、９日および１２もしくは１５日後にＦＡＣＳにより決定された（Ａ：２９３Ｔ、Ｂ：ＭＴ４）。「ｂｕｔ」と記載された点については、細胞は分析の２４時間前に５ｍＭ酪酸ナトリウム処理を受けた。
【図５Ａ】ＩＮｗｔ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型またはＩＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターによる形質導入後にラット皮質から採取された初代胚ニューロン（ｐｒｉｍａｒｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）におけるＧＦＰの発現。 Ａ：対照（形質導入されていない）ニューロン、組み込み型（ＩＮｗｔ）ベクターにより形質導入されたニューロン、または非組み込み型（ＩＮＮ）ベクターにより形質導入されたニューロンにおける発現の、形質導入の３、９および１６日後における免疫細胞化学分析（２０倍拡大）。
【図５Ｂ】ＩＮｗｔ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型またはＩＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターによる形質導入後にラット皮質から採取された初代胚ニューロン（ｐｒｉｍａｒｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）におけるＧＦＰの発現。 Ｂ：ＩＮＷＴおよび ＩＮＮグループにおける皮質ニューロンの百分率形質導入。測定は、三重に（ｉｎ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）行われそして平均±標準誤差（ＥＳＭ）として表された。
【図５Ｃ】ＩＮｗｔ ＣＭＶ ＧＦＰ組み込み型またはＩＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターによる形質導入後にラット皮質から採取された初代胚ニューロン（ｐｒｉｍａｒｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）におけるＧＦＰの発現。 Ｃ：対照（形質導入されていない）ニューロン、組み込み型（ＩＮｗｔ）ベクターにより形質導入されたニューロンまたは非組み込み型（ＩＮＮ）ベクターにより形質導入されたニューロンにおける発現の、形質導入の３、１５よび２５日後における免疫細胞蛍光分析（１０倍拡大）。
【図６】マウス線条体への注射後のインビボでのＧＦＰの発現。マウス線条体におけるＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ（Ａ）またはＩＮＷＴ ＣＭＶ ＧＦＰ（Ｂ）ベクターの定位的注射（ｓｔｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）の１０日後に脳を取り出し、クライオスタットを使用して２０μｍ厚さの切り方で切断しそして免疫組織化学に従って分析してＧＦＰ． ｃｃ：ベンチ体（ｃａｌｌｏｕｓ ｂｏｄｙ）、ｓｔｒ：線条体、の存在を示した。拡大率（２．５倍、５倍又は２０倍）は各写真上に示される。
【図７Ａ】マウス線条体への注射後のインビボでのＧＦＰの発現。マウス線条体へのＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターの定位的注射の１０日後に脳を取り出し、クライオスタットを使用して２０μｍ厚さの切り方で切断しそして共焦点顕微鏡による免疫組織蛍光に従って分析した。 Ａ：ＣＦＰ／ＧＦＡＰ 共標識：ＧＦＰを発現するアストロサイト（拡大率４０倍）
【図７Ｂ】マウス線条体への注射後のインビボでのＧＦＰの発現。マウス線条体へのＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰベクターの定位的注射の１０日後に脳を取り出し、クライオスタットを使用して２０μｍ厚さの切り方で切断しそして共焦点顕微鏡による免疫組織蛍光に従って分析した。 Ｂ：ＧＦＰ／ＮｅｕＮ共標識：ＧＦＰを発現するニューロン（拡大率１６倍）
【図８】ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターのｐ２４、６６ｎｇの網膜下注射の後にラットにおけるインビボでのＧＦＰの発現。網膜上の蛍光顕微鏡法による写真（２．５倍）は、注射の２週間後に平坦になった。 Ｂ：ＩＮＮ ＣＭＶ ＧＦＰ非組み込み型レンチウイルスベクターのｐ２４、２．５μｇの網膜下注射の後にイヌにおけるインビボでのＧＦＰの発現。注射の１月後のｖｉｇｉｌ犬における蛍光における血管造影法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＴＲ５’レンチウイルス配列とＬＴＲ３’レンチウイルス配列との間にレンチウイルス包膜化ｐｓｉ配列、ＲＮＡ核外移行エレメント、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはＲＮＡの核内移行を促進する配列を含む組換えゲノム、ならびに該組換えゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みを阻止する突然変異したインテグラーゼを含む、非複製型且つ非組み込み型組換えレンチウイルス。
【請求項２】
該レンチウイルスがＶＩＨ−１、ＶＩＨ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ、ＢＩＶ、ＶＩＳＮＡおよびＣＡＥＶから選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のレンチウイルス。
【請求項３】
インテグラーゼの突然変異が１つ以上の点突然変異からなることを特徴とする、請求項１または２に記載のレンチウイルス。
【請求項４】
点突然変異が、インテグラーゼの塩基性領域、Ｃ末端領域および／または触媒部位に影響を与えることを特徴とする、請求項３に記載のレンチウイルス。
【請求項５】
塩基性領域および／またはＣ末端領域に影響を与える点突然変異が、ＡＡＨモチーフによる２６２ＲＲＫモチーフの置換であることを特徴とする、請求項４に記載のＶＩＨ−１レンチウイルス。
【請求項６】
触媒部位に影響を与える点突然変異が、６４、１１６および／または１５２アミノ酸突然変異からに選ばれることを特徴とする、請求項４に記載のＶＩＨ−１レンチウイルス。
【請求項７】
前記ゲノムがいかなるコード化レンチウイルス配列も欠いていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のレンチウイルス。
【請求項８】
ＲＮＡ核外移行エレメントが、ＶＩＨ−１のＲＥＶ応答エレメント（ＲＲＥ配列）を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のレンチウイルス。
【請求項９】
ＲＮＡの核内移行を促進する配列がｃＰＰＴ ＣＴＳであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載のレンチウイルス。
【請求項１０】
導入遺伝子が、触媒核酸（干渉、アンチセンス、リボザイム）、自殺核酸または、生物学的に活性なポリペプチド、例えば、成長因子、栄養因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、受容体、分化因子、コロニー刺激因子、抗癌剤、毒素、酵素、神経伝達物質またはその前駆体をコードする核酸であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のレンチウイルス。
【請求項１１】
レンチウイルスインテグラーゼであって、そのＣ末端領域および／またはその触媒部位に影響を与える１つ以上の点突然変異を含み、いかなる組み込み機能も欠いているレンチウイルスインテグラーゼを安定な方式で発現する細胞系。
【請求項１２】
非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルスをインビトロで調製するための、請求項１１に記載の細胞系の使用。
【請求項１３】
ａ．いかなるｐｓｉ包膜化シグナルも欠いており、そしてレンチウイルスｇａｇ配列および組み込み機能のないインテグラーゼをコードする突然変異したレンチウイルスｐｏｌ配列を含み、場合によりｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｕおよび／またはｖｐｒアクセサリー遺伝子を欠失しているトランス相補性プラスミド、
ｂ．プロモーター−ｅｎｖ−ＰｏｌｙＡ配列を含むエンベローププラスミド、および
ｃ．ＬＴＲ５’配列とＬＴＲ３’配列との間にレンチウイルス包膜化ｐｓｉ配列、ＲＮＡ核外移行エレメント、導入遺伝子、および場合によりプロモーターおよび／またはＲＮＡの核内移行を促進する配列を含む組換えゲノム、ならびに該ゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みを阻止する突然変異したインテグラーゼを含み、レンチウイルスのいかなるコード配列も欠いているレンチウイルスベクタープラスミド、
を含む非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスを得ることを可能とするベクター系による細胞のトランスフェクション、および
産生したレンチウイルスの回収、
を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のレンチウイルスを調製する方法。
【請求項１４】
トランス相補性プラスミドにおけるｐｏｌ配列における突然変異が、コードされたインテグラーゼの配列の塩基性領域、Ｃ末端領域および／または触媒部位に影響を与える１つ以上の点突然変異からなることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
トランス相補性プラスミドが、ＷＰＲＥ、ＡＰＰ５’ＵＴＲ、ＴＡＵ３’ＵＴＲ、インシュレーティング配列から選ばれる転写調節エレメントをさらに含むことを特徴とする、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
エンベローププラスミドのエンベロープタンパク質が、ＶＳＶ−Ｇ、狂犬病ウイルス：狂犬病（ＲＡＢ）、デューベンヘージ（ＤＵＶ）、ヨーロピアンバット１型（ＥＢ−１）、ヨーロピアンバット２型（ＥＢ−２）、コトンカン（ＫＯＴ）、ラゴスバット（ＬＢ）、オボジアング（ＯＢＤ）、ロシャンボー（ＲＢＵ）の血清群のウイルスのエンベロープタンパク質、モコラウイルス（ＭＯＫ）の血清群のウイルスのエンベロープタンパク質およびこれらのエンベロープの任意のキメラ組成物から選ばれることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
エンベローププラスミドに存在するプロモーターおよび／またはベクタープラスミドに存在するプロモーターが、同一であるかまたは異なっており、そして細胞またはウイルスプロモーターであることを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
使用されるプロモーターが、ＰＧＫ、ＲｈｏおよびＥＦ１αプロモーターから選ばれる細胞プロモーターであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
使用されるプロモーターが、ＣＭＶ、ＴＫ、ＲＳＶ ＬＴＲ遺伝子のプロモーターから選ばれるウイルスプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのＵ６またはＨ１プロモーターであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
レンチウイルスベクタープラスミドが、プロモーター領域又はＬＴＲ３’Ｕ３エンハンサー配列を欠いていることを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
インビトロ、エクスビボまたはインビボで被験体の中枢神経系に遺伝子を導入するための組成物を調製するための請求項１〜１０のいずれか１項に記載の非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスの使用。
【請求項２２】
神経系（眼球を含む）の疾患の処置のための組成物を調製するための請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
神経変性疾患（パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ＳＬＡ、ＳＭＡ、ＤＭＬＡ等）、中枢神経系の損傷（脊髄の損傷、卒中等）、神経系に影響を与える代謝疾患（ムコ多糖症、シャルコ−マリー、等）、または眼球に影響を与える疾患（色素網膜炎、緑内障等）の処置のための請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
請求項１〜１０のいずれかに記載のレンチウイルスおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１】
ＬＴＲ５’レンチウイルス配列とＬＴＲ３’レンチウイルス配列との間にレンチウイルス包膜化ｐｓｉ配列、ＲＮＡ核外移行エレメント、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび／またはＲＮＡの核内移行を促進する配列を含む組換えゲノム、ならびに該組換えゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みを阻止する突然変異したインテグラーゼを含む、非複製型且つ非組み込み型組換えレンチウイルス。
【請求項２】
該レンチウイルスがＶＩＨ−１、ＶＩＨ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ、ＢＩＶ、ＶＩＳＮＡおよびＣＡＥＶから選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のレンチウイルス。
【請求項３】
インテグラーゼの突然変異が１つ以上の点突然変異からなることを特徴とする、請求項１または２に記載のレンチウイルス。
【請求項４】
点突然変異が、インテグラーゼの塩基性領域、Ｃ末端領域および／または触媒部位に影響を与えることを特徴とする、請求項３に記載のレンチウイルス。
【請求項５】
塩基性領域および／またはＣ末端領域に影響を与える点突然変異が、ＡＡＨモチーフによる２６２ＲＲＫモチーフの置換であることを特徴とする、請求項４に記載のＶＩＨ−１レンチウイルス。
【請求項６】
触媒部位に影響を与える点突然変異が、６４、１１６および／または１５２アミノ酸突然変異からに選ばれることを特徴とする、請求項４に記載のＶＩＨ−１レンチウイルス。
【請求項７】
前記ゲノムがいかなるコード化レンチウイルス配列も欠いていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のレンチウイルス。
【請求項８】
ＲＮＡ核外移行エレメントが、ＶＩＨ−１のＲＥＶ応答エレメント（ＲＲＥ配列）を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のレンチウイルス。
【請求項９】
ＲＮＡの核内移行を促進する配列がｃＰＰＴ ＣＴＳであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載のレンチウイルス。
【請求項１０】
導入遺伝子が、触媒核酸（干渉、アンチセンス、リボザイム）、自殺核酸または、生物学的に活性なポリペプチド、例えば、成長因子、栄養因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、受容体、分化因子、コロニー刺激因子、抗癌剤、毒素、酵素、神経伝達物質またはその前駆体をコードする核酸であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のレンチウイルス。
【請求項１１】
レンチウイルスインテグラーゼであって、そのＣ末端領域および／またはその触媒部位に影響を与える１つ以上の点突然変異を含み、いかなる組み込み機能も欠いているレンチウイルスインテグラーゼを安定な方式で発現する細胞系。
【請求項１２】
非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルスをインビトロで調製するための、請求項１１に記載の細胞系の使用。
【請求項１３】
ａ．いかなるｐｓｉ包膜化シグナルも欠いており、そしてレンチウイルスｇａｇ配列および組み込み機能のないインテグラーゼをコードする突然変異したレンチウイルスｐｏｌ配列を含み、場合によりｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｕおよび／またはｖｐｒアクセサリー遺伝子を欠失しているトランス相補性プラスミド、
ｂ．プロモーター−ｅｎｖ−ＰｏｌｙＡ配列を含むエンベローププラスミド、および
ｃ．ＬＴＲ５’配列とＬＴＲ３’配列との間にレンチウイルス包膜化ｐｓｉ配列、ＲＮＡ核外移行エレメント、導入遺伝子、および場合によりプロモーターおよび／またはＲＮＡの核内移行を促進する配列を含む組換えゲノム、ならびに該ゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みを阻止する突然変異したインテグラーゼを含み、レンチウイルスのいかなるコード配列も欠いているレンチウイルスベクタープラスミド、
を含む非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスを得ることを可能とするベクター系による細胞のトランスフェクション、および
産生したレンチウイルスの回収、
を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のレンチウイルスを調製する方法。
【請求項１４】
トランス相補性プラスミドにおけるｐｏｌ配列における突然変異が、コードされたインテグラーゼの配列の塩基性領域、Ｃ末端領域および／または触媒部位に影響を与える１つ以上の点突然変異からなることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
トランス相補性プラスミドが、ＷＰＲＥ、ＡＰＰ５’ＵＴＲ、ＴＡＵ３’ＵＴＲ、インシュレーティング配列から選ばれる転写調節エレメントをさらに含むことを特徴とする、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
エンベローププラスミドのエンベロープタンパク質が、ＶＳＶ−Ｇ、狂犬病ウイルス：狂犬病（ＲＡＢ）、デューベンヘージ（ＤＵＶ）、ヨーロピアンバット１型（ＥＢ−１）、ヨーロピアンバット２型（ＥＢ−２）、コトンカン（ＫＯＴ）、ラゴスバット（ＬＢ）、オボジアング（ＯＢＤ）、ロシャンボー（ＲＢＵ）の血清群のウイルスのエンベロープタンパク質、モコラウイルス（ＭＯＫ）の血清群のウイルスのエンベロープタンパク質およびこれらのエンベロープの任意のキメラ組成物から選ばれることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
エンベローププラスミドに存在するプロモーターおよび／またはベクタープラスミドに存在するプロモーターが、同一であるかまたは異なっており、そして細胞またはウイルスプロモーターであることを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
使用されるプロモーターが、ＰＧＫ、ＲｈｏおよびＥＦ１αプロモーターから選ばれる細胞プロモーターであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
使用されるプロモーターが、ＣＭＶ、ＴＫ、ＲＳＶ ＬＴＲ遺伝子のプロモーターから選ばれるウイルスプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのＵ６またはＨ１プロモーターであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
レンチウイルスベクタープラスミドが、プロモーター領域又はＬＴＲ３’Ｕ３エンハンサー配列を欠いていることを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
インビトロ、エクスビボまたはインビボで被験体の中枢神経系に遺伝子を導入するための組成物を調製するための請求項１〜１０のいずれか１項に記載の非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスの使用。
【請求項２２】
神経系（眼球を含む）の疾患の処置のための組成物を調製するための請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
神経変性疾患（パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ＳＬＡ、ＳＭＡ、ＤＭＬＡ等）、中枢神経系の損傷（脊髄の損傷、卒中等）、神経系に影響を与える代謝疾患（ムコ多糖症、シャルコ−マリー、等）、または眼球に影響を与える疾患（色素網膜炎、緑内障等）の処置のための請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
請求項１〜１０のいずれかに記載のレンチウイルスおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図６】
【図８】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図６】
【図８】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【公表番号】特表２００８−５０３２３０（Ｐ２００８−５０３２３０Ａ）
【公表日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１７３６５（Ｐ２００７−５１７３６５）
【出願日】平成１７年６月２４日（２００５．６．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００１６０４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１０８３４
【国際公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２４日（２００５．６．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００１６０４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１０８３４
【国際公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
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