食道ガン転移判定用組成物及び方法
【課題】食道ガンの転移診断に有用なポリヌクレオチドを提供する。
【解決手段】転移のない食道ガン細胞と比較して転移のある食道ガン細胞において発現レベルの変化が認められるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片、特定の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、及びそれらのいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド又はその断片、からなる群から選択される２以上のポリヌクレオチドを含む食道ガン診断用組成物、キット又はＤＮＡチップ、或いは、該組成物、キット又はＤＮＡチップを用いて食道ガンの転移を検出又は予測する方法。
【解決手段】転移のない食道ガン細胞と比較して転移のある食道ガン細胞において発現レベルの変化が認められるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片、特定の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、及びそれらのいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド又はその断片、からなる群から選択される２以上のポリヌクレオチドを含む食道ガン診断用組成物、キット又はＤＮＡチップ、或いは、該組成物、キット又はＤＮＡチップを用いて食道ガンの転移を検出又は予測する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食道ガンの転移判定又は検出に有用な判定（診断）用組成物、該組成物を利用した食道ガン転移検出又は判定方法、及び該組成物を利用した食道ガン転移診断又は検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
食道は咽頭と胃の間をつなぐ管腔状の臓器であり、大部分は胸腔、一部は頸部と腹腔に存在する。胸腔の上部では気管と脊椎の間にあり、下部では心臓、大動脈と肺に囲まれている。食道は口から食べた食物を胃に送る働きをする。
【０００３】
日本人の２００１年のガンによる死亡率は１０万人中２３８．８人である。死亡原因の中で食道ガンが占める割合は年々増加しており、２００１年度には男性では全ガン死亡例の５．０％、女性では１．４％が食道ガンであった。食道ガンの発症年齢のピークは６０〜７０歳代にあり、男性に発症が多い。また喫煙、飲酒、熱い嗜好物などの環境要因が発生に密接に関連する。さらに食道壁内部や周辺は血管やリンパ管が豊富であるため、発生したガンの転移が多いことが知られている。
【０００４】
食道ガンの治療は進行度（日本食道疾患研究会編 臨床・病理 食道ガン取り扱い規約 １９９９年）や転移、全身状態を考慮して決定する。食道ガンの標準的な治療法は日本食道疾患研究会編「食道ガン治療ガイドライン」（２００２年）に示されている。現在最も一般的な療法は手術療法であり、ガンを含めた食道とリンパ節を含む周囲の組織を切除（リンパ節郭清）した上で、胃など他の臓器を用いて食道を再建する。ただし手術療法、特に広範囲のリンパ節郭清は患者に大きな負担を与え、手術後のＱＯＬ低下への配慮も必要である。粘膜内にとどまる早期のガンの場合には内視鏡的粘膜切除術が可能である場合がある。また根治療法、対症療法の両面から放射線照射が行われる場合がある。さらに手術療法や放射線療法と組み合わせて化学療法が行われる。化学療法では現在、５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌとｃｉｓｐｌａｔｉｎの併用療法が最も有効と考えられている。
【０００５】
食道ガンは嚥下時の違和感、嚥下困難、胸骨後部痛や胸部違和感といった自覚症状を覚えた患者の受診によって発見されることが多い。しかしながらこれらの症状が発現するのは食道内でガンが成長した結果であり、自己所見による受診時に発見されるガンはすでに食道壁外進展や転移が起こっており予後不良であることが多い。したがって手術時には食道周辺のリンパ節拡清を行うことが多いが、この時転移の有無が予見できていれば、拡清の範囲を術前に正確に決定することや、拡清の範囲を限定し術後の患者のＱＯＬに貢献することが可能である。
【０００６】
食道ガンは食道造影検査及び内視鏡検査と生検組織検査にて診断が確定される。生検標本は内視鏡検査時や手術時に採取され、病理標本を作製した上で病理組織学的分類によって診断される。この時、内視鏡検査で得られた細胞の性質から食道外への転移の有無が予測できる、迅速で簡便な診断法の開発が求められている。
【０００７】
現在までに、食道ガン組織に特異的に含まれるマーカーを用いた分子生物学的診断方法が提案されている。この方法は迅速で客観的な結果をもたらし、迅速な診断の助けとなる。
【０００８】
これまでに食道ガンの臨床検査用マーカーとして血清中のタンパク質マーカーであるＳＣＣ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＥＡなどが活用されているほか、特許文献１、２に記載のタンパク質などが報告されている。しかしこれらのマーカーは感度、特異度が乏しく、もっとも感度が高いとされているＣＹＦＲＡ２１−１についても、その感度は３３．９％（非特許文献１）から４３．９％（非特許文献２）程度である。したがってこれらの血清中マーカー及びその組み合わせの検出によって食道ガン細胞の存在の有無が確定されるという段階には至っていないし、これらを用いて食道ガンの転移を診断することもできていない。
【０００９】
また、被験者より採取された生検試料に食道ガン細胞が含まれているか否かを特異的に判断するための遺伝子を利用したマーカーとしては、染色体異常（例えば特許文献３，４参照）や遺伝子の後成的配列（例えば特許文献５）が開示されているほか、ＤＮＡチップによる網羅的遺伝子発現解析の結果が複数報告されている（例えば非特許文献３〜８参照）。さらに単独の遺伝子発現を指標としたマーカーとしては特許文献６、非特許文献９、１０に示されるＳＰＲＲ３遺伝子（Ｓｍａｌｌ ｐｒｏｌｉｎｅ―ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）、非特許文献１１に示されるｆｇｆ３遺伝子、特許文献６、非特許文献１２に示されるＣＳＴＢ遺伝子（ｃｙｓｔａｔｉｎ Ｂ、ｌｉｖｅｒ ｔｈｉｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、特許文献７に示されるＵＣＰ２遺伝子（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、特許文献６に示されるＵＰＫ１Ａ遺伝子（ｕｒｏｐｌａｋｉｎ １Ａ）、非特許文献１３に示されるＨＳＰＡ１Ｂ遺伝子（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ ７０ｋＤａ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）などが報告されている。しかし、これらによっても食道ガンの転移を診断することは不可能である。
【００１０】
一方で、特許文献８ではＳＨＣ遺伝子の発現／チロシンリン酸化量が、消化器ガンの進展に影響を与えることが示されているが、食道がんにおけるリンパ節転移を判別できる性能については明確にされていない。
【００１１】
さらに特許文献９においてはＤＮＡチップによる網羅的遺伝子発現解析によって、食道ガンの転移を予測するための組成物及び方法が示されている。すなわち特許文献９においては、４７種の遺伝子の発現量を測定し、組み合わせて判別式を作成することにより、８６％の確率で食道ガンのリンパ節転移を予測することができることが示されている。
【００１２】
【特許文献１】特開２００３-２５９８７２号公報
【特許文献２】特表２０００-５１１５３６号公報
【特許文献３】特開２００１-１７２００号公報
【特許文献４】特開２００２-２７２４９７号公報
【特許文献５】特表２００４-５０５６１２号公報
【特許文献６】国際公開第２００３/０４２６６１パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００３/０７６５９４パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００７/０８４１５６パンフレット
【特許文献９】国際公開第２００６/１１８３０８号パンフレット
【００１３】
【非特許文献１】Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．ら、１９９８、Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ、第１１巻、ｐ．３５−３９
【非特許文献２】Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｈら、２０００、Ｃａｎｃｅｒ、第８９巻、ｐ．１４１３−１４１７
【非特許文献３】Ｌｕｏ, Ａ．ら、２００４年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第２３巻、ｐ.１２９１-１２９９
【非特許文献４】Ｚｈｉ, Ｈ．ら、２００３年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、第１０６巻、ｐ.３２７-３３３
【非特許文献５】Ｌｕ, Ｊ．ら、２００１年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、第９１巻、ｐ.２８８-２９４
【非特許文献６】Ｋａｚｅｍｉ-Ｎｏｕｒｅｉｎｉ，Ｓ．ら、２００４年、Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ 、第１０巻、ｐ.１７１６-１７２１
【非特許文献７】Ｘｕ, Ｓ．Ｈ．ら、２００３年、Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ 、第９巻、ｐ.４１７-４２２
【非特許文献８】Ｓｕ, Ｈ．ら、２００３年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第６３巻、ｐ.３８７２-３８７６
【非特許文献９】Ｃｈｅｎ, Ｂ.Ｓ. ら、２０００年、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第２１巻、ｐ.２１４７-２１５０
【非特許文献１０】Ａｂｒａｈａｍ, Ｊ.Ｍ.ら、１９９６年、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、第７巻、ｐ.８５５-８６０.
【非特許文献１１】Ｋｉｔａｇａｗａ, Ｙ．ら、１９９１年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５１巻、p.１５０４-１５０８
【非特許文献１２】Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ,Ｔ．ら、１９９８年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、第７９巻、ｐ.１７５-１７８
【非特許文献１３】Ｋａｗａｎｉｓｈｉ，Ｋ．ら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ、第８５巻、ｐ.１６４９-１６５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、上記の既存の指標は特異性及び／又は感受性に乏しいことや、生体試料からのその効率的な検出方法が確立していないことから一般に臨床上の利用は行われておらず、また患者の予後を決定する大きな要因である、食道ガン転移の有無を診断マーカーを用いて検出することは、現在不可能と考えられる。そこで特異性及び感受性が高い食道ガン転移のマーカーが切望されている。
【００１５】
本発明は、食道ガン転移の診断及び治療に有用な疾患判定用組成物、該組成物を用いた食道ガン転移の判定（又は検出）方法、及び該組成物を利用した食道ガン転移の判定（又は検出又は診断）キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
マーカー探索の方法としては、食道ガン細胞のうち、手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン細胞と手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン細胞における遺伝子発現やタンパク質発現、又は細胞の代謝産物などの量を何らかの手段によって比較する方法や食道ガン患者と非ガン患者の体液中に含まれる遺伝子、タンパク質、代謝産物などの量を測定する方法が挙げられる。
【００１７】
ＤＮＡアレイを用いた発現遺伝子量解析は、近年、このようなマーカー探索の手法として特に汎用されている。ＤＮＡアレイには数百から数万種の遺伝子に対応した塩基配列を利用したプローブが固定されている。被検試料をＤＮＡアレイに添加することによって試料中の遺伝子がプローブと結合し、この結合量を何らかの手段によって測定することにより、被検試料中の遺伝子量を知ることができる。ＤＮＡアレイ上に固定化するプローブに対応した遺伝子の選択は自由であり、また被検試料に手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン細胞と手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン細胞胞を用いて、試料中の発現遺伝子量を比較することによって食道転移ガンマーカーとなりうる遺伝子群を推定することが可能である。
【００１８】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン組織と手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン組織の遺伝子発現をＤＮＡアレイによって解析し、食道ガン転移の検出マーカーに使用可能な遺伝子を見出し、さらにそれらの遺伝子の発現量が、手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン細胞に比較して手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン細胞において有意に減少又は低減していることを見出し、本発明を完成させた。
【００１９】
１．発明の概要
本発明は、以下の特徴を有する。
本発明は第１の態様において、下記の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド、その変異体又はその断片からなる群から選択される２以上のポリヌクレオチドを含む、食道ガン転移診断用組成物である。
（a）配列番号１〜１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片
（b）配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（c）配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片
（d）配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（e）前記（a）〜（d）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片
その実施形態において、前記断片が、６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチドである上記の組成物である。
【００２０】
また別の実施形態において、前記断片が、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列において、それぞれ配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、上記の組成物である。
【００２１】
また別の実施形態において、前記断片が、配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列、又はこれらに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、上記の組成物である。
【００２２】
本発明の第２の態様において、上記のいずれかに記載の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド、その変異体及び/又はその断片の２以上を含む、食道ガン転移診断用キットである。
【００２３】
その実施形態において、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの１５以上の連続した塩基を含む断片である、上記のキットである。
【００２４】
また別の実施形態において、前記断片が、６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチドである、上記のキットである。
【００２５】
また別の実施形態において、前記断片が、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列において、それぞれ配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、上記のキットである。
【００２６】
また別の実施形態において、前記断片が、配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、上記のキットである。
【００２７】
また別の実施形態において、前記ポリヌクレオチドが、別個に又は任意に組み合わせて異なる容器に包装されている、上記のいずれか１項に記載のキットである。
【００２８】
本発明の第３の態様において、上記のいずれかに記載の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド、その変異体及び/又はその断片の２以上を含む、食道ガン転移診断用ＤＮＡチップである。
【００２９】
その実施形態において、配列番号１１〜２０で表される塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチドの２以上〜全部を含む、上記のＤＮＡチップである。
【００３０】
本発明の第４の態様において、上記のいずれかに記載の組成物、上記のいずれかに記載のキット、上記のいずれかに記載のＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、被験者由来の生体試料における標的核酸の発現レベルを測定することによって、被験者由来の検体試料中に転移を伴う食道ガン細胞が含まれるかどうかをｉｎ ｖｉｔｒｏで判定する方法である。
【００３１】
その実施形態において、ＤＮＡチップを用いる上記の方法である。
また別の実施形態において、いずれかに記載の組成物、上記のいずれかに記載のキット、上記のいずれかに記載のＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、転移を伴う食道ガン又は転移を伴わない食道ガン細胞を含む組織であることが既知の複数の生体試料中の標的核酸の発現量をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する第１の工程、前記第１の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を教師とした判別式（サポートベクターマシーン）を作成する第２の工程、被験者の食道由来の検体試料中の該標的核酸の発現量を第１の工程と同様にｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する第３の工程、前記第２の工程で得られた判別式に第３の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を代入し、該判別式から得られた結果に基づいて、検体試料中に転移を伴うガン細胞が含まれないこと及び／又は転移を伴わないガン細胞が含まれることを判定する第４の工程を含む、食道ガン転移を判定する方法である。
【００３２】
また別の実施形態において、上記のいずれかに記載の組成物、上記のいずれかに記載のキット、又は上記のいずれかに記載のＤＮＡチップの、食道ガン患者の転移の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測するための使用である。
【００３３】
本発明の第５の態様において、配列番号１〜１０で表される塩基配列によってコードされるポリペプチドに対する２以上の抗体又はその断片を用いて、被験者由来の食道ガン細胞或いは血液中の該ポリペプチドのレベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することを含む、被験者の食道ガンの転移の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測する方法である。
【００３４】
その実施形態において、前記ポリペプチドが、配列番号２１〜２７で表されるアミノ酸配列を有する、上記の方法である。
【００３５】
また別の実施形態において、前記ポリペプチドの発現レベルが、転移のない患者由来の食道ガンと比較して変化している場合、転移が有る患者由来の食道ガンであると決定する。
【００３６】
また別の実施形態において、前記ポリペプチドの発現レベルが、転移のある患者由来の食道ガンと比較して変化している場合、転移が無い患者由来の食道ガンであると決定する、上記のいずれかに記載の方法である。
【００３７】
２．定義
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
本明細書において「転移を伴う食道ガン」とは、食道ガンが転移性のガンであることを表し、このような食道ガンはリンパ節などの他の組織に転移するか又は転移し易い性質を有している。一方、「転移を伴わない食道ガン」とは、食道ガンが非転移性のガンであることを表す。
【００３８】
本明細書中で使用されるヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質などの略号による表示は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用に従うものとする。
【００３９】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれも包含する核酸として用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。また、本明細書では、ポリヌクレオチドは核酸と互換的に使用される。
【００４０】
本明細書において「ｃＤＮＡ」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡに相補的な配列のＤＮＡ鎖全長、及びその部分配列からなるＤＮＡ断片、を包含する。ｃＤＮＡは、ＲＮＡを鋳型にして、ポリＴプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ(逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応)によって合成されうる。
【００４１】
本明細書において「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成する正鎖（又はセンス鎖）又は相補鎖（又はアンチセンス鎖）などの各１本鎖ＤＮＡを包含することを意図して用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。
【００４２】
従って、本明細書において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片のいずれも含む。また該「遺伝子」は特定の塩基配列（又は配列番号）で示される「遺伝子」だけではなく、これらによってコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、スプライスバリアントなどの変異体、及び誘導体をコードする「遺伝子」が包含される。かかる同族体、変異体又は誘導体をコードする「遺伝子」としては、具体的には、後に記載したストリンジェントな条件下で、上記の配列番号１〜１０で示されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」を挙げることができる。
【００４３】
例えばヒト由来のタンパク質の同族体（すなわち、ホモログ）又はそれをコードする遺伝子としては、当該タンパク質又はそれをコードするヒト遺伝子に対応する他生物種のタンパク質又は遺伝子が例示でき、これらのタンパク質又は遺伝子ホモログは、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ｈｏｍｏｌｏＧｅｎｅ/）により同定することができる。具体的には特定のヒトアミノ酸又は塩基配列をＢＬＡＳＴプログラム（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ.Ｓ.Ａ.、 １９９３年、第９０巻、ｐ.５８７３―５８７７、 ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ＢＬＡＳＴ/）にかけて一致する（Ｓｃｏｒｅが最も高く、Ｅ−ｖａｌｕｅが０でかつＩｄｅｎｔｉｆｙが１００％を示す）配列の登録番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）を取得することができる。ＢＬＡＳＴプログラムとしては、ＢＬＡＳＴＮ（遺伝子）、ＢＬＡＳＴＸ(タンパク質)などが知られている。例えば、遺伝子検索の場合、上記ＢＬＡＳＴ検索からの登録番号をＵｎｉＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ＵｎｉＧｅｎｅ/）に入力して得られたＵｎｉＧｅｎｅＣｌｕｓｔｅｒＩＤ（Ｈｓ．で示す番号）をＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子ホモログとして、他生物種の遺伝子を選抜することができる。またこの方法において、ＢＬＡＳＴプログラムの代わりにＦＡＳＴＡプログラム（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いてもよい。
【００４４】
なお、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンを含むことができる。
【００４５】
本明細書において「転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡ配列を鋳型にして合成されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のことをいう。ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の上流にあるプロモーターと呼ばれる部位に結合し、ＤＮＡの塩基配列に相補的になるように３'末端にリボヌクレオチドを結合させていく形でメッセンジャーＲＮＡが合成される。このメッセンジャーＲＮＡには遺伝子そのもののみならず、発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンをはじめとする転写開始点からポリＡ配列の末端にいたるまでの全配列が含まれる。
【００４６】
本明細書において「翻訳産物」とは、転写によって合成されたメッセンジャーＲＮＡが,スプライシングなどの修飾を受ける/受けないにかかわらず、その情報を元に合成されたタンパク質を示す。メッセンジャーＲＮＡの翻訳過程においては、まずリボソームとメッセンジャーＲＮＡが結合し、次にメッセンジャーＲＮＡの塩基配列に従ってアミノ酸がつながっていき、タンパク質が合成される。
【００４７】
本明細書において「プローブ」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するために使用されるポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。
【００４８】
本明細書において「プライマー」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し、増幅する、連続するポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。
【００４９】
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、配列番号によって定義される塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、又はその部分配列（ここでは便宜上、これを正鎖と呼ぶ）に対してＡ：Ｔ（Ｕ）、Ｇ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味する。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度の相補関係を有するものであってもよい。
【００５０】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、プローブが他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えばバックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、ハイブリダイゼーションが行われる環境によって異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。
【００５１】
本明細書において「変異体」とは、核酸の場合、多型性、突然変異、転写時の選択的スプライシングなどに起因した天然の変異体、或いは遺伝暗号の縮重に基づく変異体、或いは配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその部分配列において１以上、好ましくは１もしくは数個、の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、或いは該塩基配列又はその部分配列と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体、或いは該塩基配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと上記定義のストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を意味し、一方、タンパク質又はペプチドの場合、配列番号２１〜２７で表されるアミノ酸配列又はその部分配列おいて１以上、好ましくは１もしくは数個、のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、或いは該アミノ酸配列又はその部分配列と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体を意味する。
【００５２】
本明細書において「数個」とは、約１０、９、８、７、６、５、４、３又は２個の整数を意味する。
【００５３】
本明細書において「％同一性」は、上記のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質又は遺伝子の検索システムを用いて、ギャップを導入して、又はギャップを導入しないで、決定することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第９０巻、ｐ.５８７３-５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻、ｐ.２４４４-２４４８）。％同一性は、簡単に言えば、２つの塩基配列又はアミノ酸配列を、ギャップを導入してか又はギャップを導入しないで整列したときの、塩基又はアミノ酸の総数に対する同一の塩基又はアミノ酸の数の割合（％）をいう。
【００５４】
本明細書において「誘導体」とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド(例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体など、一方、タンパク質の場合、アセチル化、アシル化、アルキル化、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、ビオチン化などの化学修飾誘導体を意味する。
【００５５】
本明細書において「診断（又は検出又は判定）用組成物」とは、食道ガンの罹患の有無、罹患の程度もしくは改善の有無や改善の程度を診断するために、また食道ガンの予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接又は間接的に利用されるものをいう。これには食道ガンの罹患に関連して生体内、特に食道組織において発現が変動する遺伝子を特異的に認識し、また結合することのできるヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、及び該遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を検出することができる抗体が包含される。これらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、上記性質に基づいて生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子を検出するためのプローブとして、また生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００５６】
本明細書において検出・診断対象となる「生体組織」とは、食道ガンの発生にともない本発明の遺伝子が発現変化する組織を指す。具体的には食道組織及びその周辺のリンパ節、また転移が疑われる他臓器などを指す。
【００５７】
本明細書で使用される「ＳＨＣ１遺伝子」又は「ＳＨＣ１」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号１）で示されるＳＨＣ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号１に記載のＳＨＣ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００３０２９）やその他生物種ホモログなどが包含される。ＳＨＣ１遺伝子はＰｅｌｉｃｃｉ，Ｇら、１９９２年、Ｃｅｌｌ、第７０巻、ｐ.９３―１０４に記載される方法によって得ることができる。
【００５８】
本明細書で使用される「Ｃ１Ｒ遺伝子」又は「Ｃ１Ｒ」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号２）で示されるｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ １， ｒ ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号２に記載のＣ１Ｒ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＭ＿００１７３３）やその他生物種ホモログなどが包含される。Ｃ１Ｒ遺伝子は、Ｃｏｈｅｎ−Ｈａｇｕｅｎａｕｅｒ， Ｏ．ら、１９８６年、（Ａｂｓｔｒａｃｔ）７ｔｈ Ｉｎｔ. ＣＯＮＧ. ＨＵＭ. Ｇｅｎｅｔ. Ｂｅｒｌｉｎ ６１７ ｏｎｌｙに記載される方法によって得ることができる。
【００５９】
本明細書で使用される「ＬＡＭＡ５遺伝子」又は「ＬＡＭＡ５」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号３）で示されるＬａｍｉｎｉｎ ａｌｐｈａ−５ｃｈａｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号３に記載のＬＡＭＡ５遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００５５６０）やその他生物種ホモログなどが包含される。ＬＡＭＡ５遺伝子はＤｕｒｋｉｎ，Ｍ．Ｅ．ら１９８６年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． 第７０巻、ｐ.２９６−３００に記載される方法によって得ることができる。
【００６０】
本明細書で使用される「ＰＧＡＭ１遺伝子」又は「ＰＧＡＭ１」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号４）で示されるＰｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ １遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号４に記載のＰＧＡＭ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００２６２９）やその他生物種ホモログなどが包含される。ＰＧＡＭ１遺伝子はＳａｋｏｄａ， Ｓ．ら、１９８８年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２６３巻、ｐ.１６８９９−１６９０５に記載される方法によって得ることができる。
【００６１】
本明細書で使用される「ＺＮＦ７０８遺伝子」又は「ＺＮＦ７０８」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号５）で示される７１ ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号５に記載のＺＮＦ７０８遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２１２６９）やその他生物種ホモログなどが包含される。ＺＮＦ７０８遺伝子はＴｈｉｅｓｅｎ，Ｈ．Ｊ．ら、１９９０年、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、第２巻、ｐ.３６３−３７４に記載される方法によって得ることができる。
【００６２】
本明細書で使用される「ＹＷＨＡＱ遺伝子」又は「ＹＷＨＡＱ」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号６）で示される１４−３−３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｕ遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号６に記載のＹＷＨＡＱ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００６８２６）やその他生物種ホモログなどが包含される。ＹＷＨＡＱ遺伝子はＮｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｊ．、１９９１年、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ、第１０８８巻、ｐ. ４２５−４２８に記載される方法によって得ることができる。
【００６３】
本明細書で使用される「ＡＣ００４６０９遺伝子」又は「ＡＣ００４６０９」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号７）で示されるＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １９, ｃｏｓｍｉｄ Ｆ１６９１２と称される遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号７に記載のＡＣ００４６０９遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＣ００４６０９）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００６４】
本明細書で使用される「ＺＮＦ７１４遺伝子」又は「ＺＮＦ７１４遺伝子」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号８）で示されるｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ７１４遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号８に記載のＺＮＦ７１４遺伝子遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿１８２５１５）やその他生物種ホモログなどが包含される。ＺＮＦ７１４遺伝子はＯｈ，Ｊ．Ｈ．ら、２００５年、Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅ、第１６巻、ｐ.９４２−９５４に記載される方法によって得ることができる。
【００６５】
本明細書で使用される「ＬＯＣ１５２６６７遺伝子」又は「ＬＯＣ１５２６６７」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号９）で示されるＬＯＣ１５２６６７ ＮＩＰ３０−ｌｉｋｅ 遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号９に記載のＬＯＣ１５２６６７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＲ＿００２２２８）やその他生物種ホモログなどが包含される。ＬＯＣ１５２６６７遺伝子はＭａｒｑｕｅｓ，Ａ．Ｃ．ら、２００５年、ＰＬｏＳ ｂｉｏｌｏｇｙ、第２３巻、ｐ.Ｅ３５７に記載される方法によって得ることができる。
【００６６】
本明細書で使用される「ＺＮＦ７１６遺伝子」又は「ＺＮＦ７１６」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号１０）で示されるｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ７１６遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号１０に記載のＺＮＦ７１６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＫ１３１５７５）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【発明の効果】
【００６７】
本発明は、食道ガン転移の診断及び治療に有用な疾患判定用組成物及び該組成物を用いた食道転移ガンの判定（又は検出）方法を提供するものであり、これによって、食道ガンの転移に対して特異的かつ高予測率の、及び迅速でかつ簡便な、判定方法を提供するという格別の作用効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
以下に本発明をさらに具体的に説明する
１．食道ガン転移の標的核酸
本発明において、上記定義の食道ガン転移診断用組成物及びキットを使用して食道ガン転移の存在及び/又は不存在、或いは食道ガン転移の可能性の有無、を予測又は判定するための食道ガン転移のマーカーとしての標的核酸には、例えば、配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むヒト遺伝子（すなわち、それぞれ、ＳＨＣ１、Ｃ１Ｒ、ＬＡＭＡ５、ＰＧＡＭ１、ＺＮＦ７０８、ＹＷＨＡＱ、ＡＣ００４６０９、ＺＮＦ７１４、ＬＯＣ１５２６６７、ＺＮＦ７１６）、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体が含まれる。ここで、遺伝子、同族体、転写産物、ｃＤＮＡ、変異体及び誘導体は、上記定義のとおりである。好ましい標的核酸は、配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むヒト遺伝子、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、より好ましくは該転写産物又はｃＤＮＡである。
【００６９】
本発明において食道ガン転移の標的となる上記遺伝子はいずれも、手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン組織に比較して、手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン組織において発現レベルが有意に増加しているか、或いは低下しているものである（後述の実施例の表１参照）。
【００７０】
第１の標的核酸は、ＳＨＣ１遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。ＳＨＣ１遺伝子は国際公開第２００７/０８４１５６パンフレットにおいて消化器ガンの進展に影響を与えることが示されている。
【００７１】
第２の標的核酸は、Ｃ１Ｒ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＣ１Ｒ遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７２】
第３の標的核酸は、ＬＡＭＡ５遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＬＡＭＡ５遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７３】
第４の標的核酸は、ＰＧＡＭ１遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＰＧＡＭ１遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７４】
第５の標的核酸は、ＺＮＦ７０８遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＺＮＦ７０８遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７５】
第６の標的核酸は、ＹＷＨＡＱ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＹＷＨＡＱ遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７６】
第７の標的核酸は、ＡＣ００４６０９遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＡＣ００４６０９遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７７】
第８の標的核酸は、ＺＮＦ７１４遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＺＮＦ７１４遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７８】
第９の標的核酸は、ＬＯＣ１５２６６７遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＬＯＣ１５２６６７遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７９】
第１０の標的核酸は、ＺＮＦ７１６遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＺＮＦ７１６遺伝子及びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００８０】
２．食道ガン転移の標的ポリペプチド
本発明において、上記定義の食道ガン転移診断用組成物及びキットを使用して食道ガン転移の存在及び/又は不存在を判定するための食道ガン転移のマーカーとしての標的ポリペプチドには、例えば、配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むヒト遺伝子（すなわち、それぞれ、ＳＨＣ１、Ｃ１Ｒ、ＬＡＭＡ５、ＰＧＡＭ１、ＺＮＦ７０８、ＹＷＨＡＱ、ＡＣ００４６０９、ＺＮＦ７１４、ＬＯＣ１５２６６７、ＺＮＦ７１６遺伝子）によってコードされるポリペプチド、例えば、配列番号２１〜２７で表されるアミノ酸配列を含むヒトポリペプチド、それらの同族体、或いはそれらの変異体又は誘導体が含まれる。ここで、ポリペプチド、同族体、変異体及び誘導体は、上記定義のとおりである。好ましい標的ポリペプチドは、配列番号２１〜２７で表されるアミノ酸配列を含むヒトポリペプチドである。
【００８１】
本発明において食道ガン転移の標的となる上記ポリペプチドはいずれも、対応する遺伝子及びその転写産物の発現量と同様に、手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン組織に比較して、手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン組織において発現レベルが有意に増加しているか、又は低下しているものであること、或いは血液中の該ポリペプチドのレベルが手術時にリンパ節転移がなかった被験者と比べて手術時にリンパ節転移があった被験者において有意に増加しているか、又は低下することによって特徴付けられる。
【００８２】
３．食道ガン転移診断用組成物
３．１ 核酸
本発明において、食道ガン又は食道ガン転移の存在及び/又は不存在を判定又は検出するための、或いは食道ガン転移（又は転移の可能性）の有無を判定又は予測するために使用可能な核酸組成物は、食道ガン転移の標的核酸としての、ヒト由来のＳＨＣ１、Ｃ１Ｒ、ＬＡＭＡ５、ＰＧＡＭ１、ＺＮＦ７０８、ＹＷＨＡＱ、ＡＣ００４６０９、ＺＮＦ７１４、ＬＯＣ１５２６６７、ＺＮＦ７１６遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体の存在、発現レベル又は存在量を定性的及び/又は定量的に測定することを可能にする。
【００８３】
上記の標的核酸は、手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン組織に比較して、手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン組織においてその発現レベルが有意に増加するか、或いは低下する。それゆえ、本発明の組成物は、手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン組織と手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン組織について標的核酸の発現レベルを測定し、それらを比較するために有効に使用することができる。
【００８４】
本発明で使用可能な組成物は、食道ガンに罹患した患者の生体組織において配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド群、該塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でそれぞれハイブリダイズするポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド群、ならびにそれらのポリヌクレオチド群の塩基配列において１５以上、好ましくは２０〜３０又はそれ以上、より好ましくは４０〜５０又はそれ以上、さらに好ましくは６０以上、の連続した塩基を含むポリヌクレオチド群から選ばれた、２以上、好ましくは３以上、より好ましくは６以上のポリヌクレオチドの組み合わせを含む。ポリヌクレオチドの組み合わせは、互いに異なる遺伝子に由来するポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
【００８５】
具体的には、本発明の組成物は、以下の２以上のポリヌクレオチド又はその断片を含むことができる。
（１）配列番号１〜１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（２）配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
（３）配列番号１〜１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（４）配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
（５）配列番号１〜１０で表される塩基配列の各々と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド群、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
【００８６】
上記（１）〜(５)のポリヌクレオチドの断片は、各ポリヌクレオチドの塩基配列において、例えば、連続する１５〜配列の全塩基数、１５〜５０００塩基、１５〜４５００塩基、１５〜４０００塩基、１５〜３５００塩基、１５〜３０００塩基、１５〜２５００塩基、１５〜２０００塩基、１５〜１５００塩基、１５〜１０００塩基、１５〜９００塩基、１５〜８００塩基、１５〜７００塩基、１５〜６００塩基、１５〜５００塩基、１５〜４００塩基、１５〜３００塩基、１５〜２５０塩基、１５〜２００塩基、１５〜１５０塩基、１５〜１４０塩基、１５〜１３０塩基、１５〜１２０塩基、１５〜１１０塩基、１５〜１００塩基、１５〜９０塩基、１５〜８０塩基、１５〜７０塩基、１５〜６０塩基、１５〜５０塩基、１５〜４０塩基、１５〜３０塩基又は１５〜２５塩基；２５〜配列の全塩基数、２５〜１０００塩基、２５〜９００塩基、２５〜８００塩基、２５〜７００塩基、２５〜６００塩基、２５〜５００塩基、２５〜４００塩基、２５〜３００塩基、２５〜２５０塩基、２５〜２００塩基、２５〜１５０塩基、２５〜１４０塩基、２５〜１３０塩基、２５〜１２０塩基、２５〜１１０塩基、２５〜１００塩基、２５〜９０塩基、２５〜８０塩基、２５〜７０塩基、２５〜６０塩基、２５〜５０塩基又は２５〜４０塩基；５０〜配列の全塩基数、５０〜１０００塩基、５０〜９００塩基、５０〜８００塩基、５０〜７００塩基、５０〜６００塩基、５０〜５００塩基、５０〜４００塩基、５０〜３００塩基、５０〜２５０塩基、５０〜２００塩基、５０〜１５０塩基、５０〜１４０塩基、５０〜１３０塩基、５０〜１２０塩基、５０〜１１０塩基、５０〜１００塩基、５０〜９０塩基、５０〜８０塩基、５０〜７０塩基又は５０〜６０塩基；６０〜配列の全塩基数、６０〜１０００塩基、６０〜９００塩基、６０〜８００塩基、６０〜７００塩基、６０〜６００塩基、６０〜５００塩基、６０〜４００塩基、６０〜３００塩基、６０〜２５０塩基、６０〜２００塩基、６０〜１５０塩基、６０〜１４０塩基、６０〜１３０塩基、６０〜１２０塩基、６０〜１１０塩基、６０〜１００塩基、６０〜９０塩基、６０〜８０塩基又は６０〜７０塩基などの範囲の塩基数を含むことができるが、これらに限定されないものとする。
【００８７】
本発明の実施形態により、配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドの断片はそれぞれ、配列番号１１〜２０で表される塩基配列又はその相補的配列、或いはそれらの連続する１５塩基以上の部分配列、を含むことが好ましい。
【００８８】
本発明の組成物には、例えば以下のポリヌクレオチドが包含される。
(１)配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその相補的配列の各々において、１５以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(２)配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその相補的配列の各々において、６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(３)配列番号１〜１０で表される塩基配列において、それぞれ配列番号１１〜２０で表される塩基配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(４)配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な配列において、それぞれ配列番号１１〜２０で表される塩基配列に相補的な配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
【００８９】
本発明で使用される上記ポリヌクレオチド類又はその断片類はいずれもＤＮＡでもよいしＲＮＡでもよい。
【００９０】
本発明の組成物としてのポリヌクレオチドは、ＤＮＡ組換え技術、ＰＣＲ法、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機による方法などの一般的な技術を用いて作製することができる。
【００９１】
ＤＮＡ組換え技術及びＰＣＲ法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＵＳ （１９９３）； Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＵＳ （１９８９）などに記載される技術を使用することができる。
【００９２】
ヒト由来の、ＳＨＣ１、Ｃ１Ｒ、ＬＡＭＡ５、ＰＧＡＭ１、ＺＮＦ７０８、ＹＷＨＡＱ、ＡＣ００４６０９、ＺＮＦ７１４、ＬＯＣ１５２６６７、ＺＮＦ７１６遺伝子は公知であり、前述のようにその取得方法も知られている。このため、これらの遺伝子をクローニングすることによって、本発明の組成物としてのポリヌクレオチドを作製することができる。
【００９３】
本発明の組成物を構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ自動合成装置を用いて化学的に合成することができる。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この方法によって約１００塩基までの一本鎖ＤＮＡを自動合成することができる。ＤＮＡ自動合成装置は、例えばＰｏｌｙｇｅｎ社、ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社などから市販されている。
【００９４】
或いは、本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡクローニング法によって作製することもできる。本発明において標的である上記遺伝子が発現される食道組織などの生体組織から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラムで処理して得られるポリＡ（＋）ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法によってｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーからハイブリダイゼーションスクリーニング、発現スクリーニング、抗体スクリーニングなどのスクリーニングによって目的のｃＤＮＡクローンを得ることができる。必要に応じて、ｃＤＮＡクローンをＰＣＲ法によって増幅することもできる。プローブ又はプライマーは、配列番号１〜２０に示される塩基配列に基づいて１５〜１００塩基の連続する配列の中から選択し、合成しうる。ｃＤＮＡクローニング技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．& Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ． 著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の 第１巻７．４２〜７．４５、第２巻８．９〜８．１７に記載されている。
【００９５】
３．２ 抗体
本発明はさらに、配列番号１〜１０で表される塩基配列によってコードされるポリペプチド、例えば配列番号２１〜２７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、に対する２以上の抗体、その断片、又はそれらの化学修飾誘導体を含む、食道ガン転移の判定、検出、診断又は予測のための組成物を提供する。
【００９６】
すなわち、本発明により、食道ガン転移マーカーとしての、上記ＳＨＣ１、Ｃ１Ｒ、ＬＡＭＡ５、ＰＧＡＭ１、ＺＮＦ７０８、ＹＷＨＡＱ、ＡＣ００４６０９、ＺＮＦ７１４、ＬＯＣ１５２６６７、ＺＮＦ７１６遺伝子によってコードされるポリペプチド、それらの同族体、或いはそれらの変異体又は誘導体を検出するために、これらのポリペプチドに対する抗体を２以上、好ましくは３以上、より好ましくは６以上組み合わせて用いることができる。
【００９７】
これらのポリペプチドは、ＤＮＡ組換え技術によって得ることができる。例えば、上記のようにして得られたｃＤＮＡクローンを発現ベクターに組み込み、該ベクターによって形質転換又はトランスフェクションされた原核又は真核宿主細胞を培養することによって該細胞又は培養上清から得ることができる。ベクター及び発現系はＮｏｖａｇｅｎ社、宝酒造、第一化学薬品、Ｑｉａｇｅｎ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社などから入手可能である。宿主細胞としては、細菌などの原核細胞（例えば大腸菌、枯草菌）、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシアエ）、昆虫細胞（例えばSf細胞）、哺乳動物細胞（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ）などを用いることができる。ベクターには、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの他に、調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、複製開始点、ターミネーター、選択マーカーなどを含むことができる。またポリペプチドの精製を容易にするために標識ペプチドをポリペプチドのＣ末端又はＮ末端につけた融合ポリペプチドとしてもよい。代表的な標識ペプチドには、６〜１０残基のヒスチジンリピート、ＦＬＡＧ、ｍｙｃぺプチド、ＧＦＰポリペプチドなどが挙げられるが、標識ペプチドはこれらにかぎられるものではない。またＤＮＡ組換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． & Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ．（上記）に記載されている。
【００９８】
標識ペプチドを付けずに本発明に係るポリペプチドを生産した場合には、その精製法として例えばイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。またこれに加えて、ゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法でもよい。一方、当該タンパクにヒスチジンリピート、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ＧＦＰといった標識ペプチドを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれの標識ペプチドに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。単離・精製が容易となるような発現ベクターを構築するとよい。特にポリペプチドと標識ペプチドとの融合ポリペプチドの形態で発現するように発現ベクターを構築し、遺伝子工学的に当該ポリペプチドを調製すれば、単離・精製も容易である。
【００９９】
このようにして得られたポリペプチドを認識する抗体は、抗体の抗原結合部位を介して、該ポリペプチドに特異的に結合し得る。具体的には、配列番号２１〜２７のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその断片、その変異体ポリペプチド又は融合ポリペプチドなどを、それぞれに免疫反応性である抗体を産生するための免疫原として使用することが可能である。
【０１００】
より具体的には、ポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチドなどは、抗体形成を引き出す抗原決定基又はエピトープを含むが、これら抗原決定基又はエピトープは、直鎖でもよいし、より高次構造（断続的）でもよい。なお、該抗原決定基又はエピトープは、当該技術分野に知られるあらゆる方法によって同定できる。
【０１０１】
本発明のポリペプチドによってあらゆる態様の抗体が誘導される。該ポリペプチドの全部若しくは一部又はエピトープが単離されていれば、慣用的技術を用いてポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも調製可能である。方法には例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅ ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０に挙げられた方法がある。
【０１０２】
本発明の抗体としては、本発明の標的ポリペプチド又はその断片と特異的に結合するものであれば特に限定されず、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも使用することができるが、モノクローナル抗体を使用するのが好ましい。また、本発明の抗体のグロブリンタイプは、上記特徴を有するものである限り特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。
【０１０３】
＜モノクローナル抗体の作製＞
（１）免疫及び抗体産生細胞の採取
標的ポリペプチドからなる免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢａｌｂ／ｃ）、ウサギなどに投与する。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０〜２００μｇとされる。免疫は主として皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で、２〜１０回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法などにより繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原を静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２〜５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
【０１０４】
（２）細胞融合
各標的ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を作製する。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生し、そして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を本発明のタンパク質で免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。抗体産生細胞と融合させる骨髄腫細胞株としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。骨髄腫細胞株の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）などが挙げられる。
【０１０５】
次に、上記骨髄腫細胞株と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを約１：１〜 ２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１５００〜４０００ダルトンのポリエチレングリコール等を約１０〜８０％の濃度で使用することができる。また場合によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合させることもできる。
【０１０６】
（３）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に２００万個/ウエル程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、２０〜４０℃ 、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はチミジンキナーゼ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞と骨髄腫細胞株のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【０１０７】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採取し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ、及びＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）等によって行うことができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。本発明のハイブリドーマは、後述するように、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ等の基本培地中での培養において安定であり、標的ポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生、分泌するものである。
【０１０８】
（４）抗体の回収
モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。すなわち樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で２〜１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１０００万個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水又は血清を採取する。
【０１０９】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製されたモノクローナル抗体を得ることができる。
【０１１０】
＜ポリクローナル抗体の作製＞
ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様にウサギ等の動物を免疫し、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＩＡ及びＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。ポリクローナル抗体はさらに、精製ポリペプチドを結合した親和性カラムに結合させることを含む、いわゆる吸収法によって、特異的抗体として調製することができる。
【０１１１】
本発明で使用可能な抗体又は断片は、上記のポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の他に、合成抗体、組換え抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、単鎖抗体（単鎖ダイアボディ、ｓｃＦｖなどを含む）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片などを含むことができる。
【０１１２】
本発明で使用される抗体は、組成物の他にキットの形態をとることができる。キットに含まれる抗体は、個別に又は混合物の形態で存在しうるし、或いは固相担体に結合されていてもよいし又は遊離の形態でもよい。さらに、そのようなキットは、標識二次抗体、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、精製された標準物質としてのマーカー(標的)ポリペプチド、使用説明書、等を含むことができる。
【０１１３】
４．食道ガン転移診断用キット
本発明はまた、本発明の組成物に含まれるものと同じポリヌクレオチド、その変異体及び/又はその断片の１つ又は複数を含む食道ガン診断（検出）用キットを提供する。
【０１１４】
本発明のキットは、好ましくは、上記３．１に記載したポリヌクレオチド類から選択される２以上、好ましくは３以上、より好ましくは６以上のポリヌクレオチド又はその断片を含む。
【０１１５】
本発明のキットは、配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、その相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチドの断片を少なくとも２つ含むことができる。
【０１１６】
本発明のキットに含むことができるポリヌクレオチド断片は、例えば下記の（１）〜（５）からなる群より選択される２以上のＤＮＡである：
（１）配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその相補的配列において、１５以上の連続した塩基を含むＤＮＡ。
（２）配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその相補的配列において、６０以上の連続した塩基を含むＤＮＡ。
（３）配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその相補的配列において、それぞれ配列番号１１〜２０で表される塩基配列又はその相補的配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むＤＮＡ。
（４）配列番号１１〜２０で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（５）配列番号１１〜２０で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むＤＮＡ。
【０１１７】
好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの１５以上の連続した塩基を含む断片である。
【０１１８】
好ましい実施形態では、前記断片は、１５以上、好ましくは２０〜３０又はそれ以上、より好ましくは４０〜５０又はそれ以上、さらに好ましくは６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチドであることができる。
【０１１９】
別の好ましい実施形態では、前記断片が、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列において、それぞれ配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【０１２０】
別の好ましい実施形態では、前記断片が、配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【０１２１】
別の好ましい実施形態では、前記断片が、配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【０１２２】
別の好ましい実施形態では、前記断片が、配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【０１２３】
上記の組み合わせの具体例は、配列番号１及び２の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜３の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜４の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜５の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜６の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜７の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜８の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜９の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜１０の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はその断片である。
【０１２４】
また、別の組み合わせの具体例は、配列番号２及び３の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜４の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜５の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜５の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜６の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜７の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜８の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜９の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜１０の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はその断片である。
【０１２５】
別のより好ましい実施形態によれば、本発明のキットは、配列番号１１〜２０で表される塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチドの２以上〜全部を含むことができる。
【０１２６】
例えば、そのような組み合わせの例は、配列番号１２及び１３の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜１４の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜１５の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜１５の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜１６の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜１７の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜１８の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜１９の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜２０の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はその断片である。
【０１２７】
ポリヌクレオチド又はその断片１個での食道ガン判別確率が６０数％に過ぎないが、異なる遺伝子由来のポリヌクレオチド又はその断片２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは６個以上、を組み合わせると８０％超から９０数％まで確率が向上する。
【０１２８】
本発明において、ポリヌクレオチドの断片のサイズは、各ポリヌクレオチドの塩基配列において、例えば、連続する１５〜配列の全塩基数、１５〜５０００塩基、１５〜４５００塩基、１５〜４０００塩基、１５〜３５００塩基、１５〜３０００塩基、１５〜２５００塩基、１５〜２０００塩基、１５〜１５００塩基、１５〜１０００塩基、１５〜９００塩基、１５〜８００塩基、１５〜７００塩基、１５〜６００塩基、１５〜５００塩基、１５〜４００塩基、１５〜３００塩基、１５〜２５０塩基、１５〜２００塩基、１５〜１５０塩基、１５〜１４０塩基、１５〜１３０塩基、１５〜１２０塩基、１５〜１１０塩基、１５〜１００塩基、１５〜９０塩基、１５〜８０塩基、１５〜７０塩基、１５〜６０塩基、１５〜５０塩基、１５〜４０塩基、１５〜３０塩基又は１５〜２５塩基；２５〜配列の全塩基数、２５〜１０００塩基、２５〜９００塩基、２５〜８００塩基、２５〜７００塩基、２５〜６００塩基、２５〜５００塩基、２５〜４００塩基、２５〜３００塩基、２５〜２５０塩基、２５〜２００塩基、２５〜１５０塩基、２５〜１４０塩基、２５〜１３０塩基、２５〜１２０塩基、２５〜１１０塩基、２５〜１００塩基、２５〜９０塩基、２５〜８０塩基、２５〜７０塩基、２５〜６０塩基、２５〜５０塩基又は２５〜４０塩基；５０〜配列の全塩基数、５０〜１０００塩基、５０〜９００塩基、５０〜８００塩基、５０〜７００塩基、５０〜６００塩基、５０〜５００塩基、５０〜４００塩基、５０〜３００塩基、５０〜２５０塩基、５０〜２００塩基、５０〜１５０塩基、５０〜１４０塩基、５０〜１３０塩基、５０〜１２０塩基、５０〜１１０塩基、５０〜１００塩基、５０〜９０塩基、５０〜８０塩基、５０〜７０塩基又は５０〜６０塩基；６０〜配列の全塩基数、６０〜１０００塩基、６０〜９００塩基、６０〜８００塩基、６０〜７００塩基、６０〜６００塩基、６０〜５００塩基、６０〜４００塩基、６０〜３００塩基、６０〜２５０塩基、６０〜２００塩基、６０〜１５０塩基、６０〜１４０塩基、６０〜１３０塩基、６０〜１２０塩基、６０〜１１０塩基、６０〜１００塩基、６０〜９０塩基、６０〜８０塩基又は６０〜７０塩基などの範囲の塩基数である。
【０１２９】
本発明のキットを構成する上記の組み合わせは、あくまでも例示であり、他の種々の可能な組み合わせのすべてが本発明に包含されるものとする。
【０１３０】
本発明のキットには、上で説明した本発明におけるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片に加えて、食道ガンの検出を可能とする既知の又は将来見出されるポリヌクレオチドも包含させることができる。
【０１３１】
本発明のキットに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片は、個別に又は任意に組み合わせて異なる容器に包装される。
【０１３２】
５．ＤＮＡチップ
本発明はさらに、本発明の組成物及び/又はキットに含まれるものと同じポリヌクレオチド(或いは、上記の３．１節の組成物及び/又は４節のキットに記載されたポリヌクレオチド)、変異体、断片及びそれらの組み合わせを含む食道ガン転移診断用ＤＮＡチップを提供する。
【０１３３】
ＤＮＡチップの基板としては、ＤＮＡを固相化できるものであれば特に制限はなく、スライドガラス、シリコン製チップ、ポリマー製チップ及びナイロンメンブレンなどを例示することができる。またこれらの基板にはポリＬ−リジンコートやアミノ基、カルボキシル基などの官能基導入などの表面処理がされていてもよい。
【０１３４】
また固相化法については一般に用いられる方法であれば特に制限はなく、スポッター又はアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いてＤＮＡをスポットする方法や、ノズルより微少な液滴を圧電素子などにより噴射する装置（インクジェット）を用いてＤＮＡを基板に吹き付ける方法、又は基板上で順次ヌクレオチド合成を行う方法を例示することができる。高密度分注機を用いる場合には、例えば多数のウエルを持つプレートのおのおののウエルに異なった遺伝子溶液を入れておき、この溶液をピン（針）で取り上げて基板上に順番にスポットすることによる。インクジェット法では、ノズルより遺伝子を噴射し、基板上に高速度で遺伝子を整列配置することによる。基板上でのＤＮＡ合成は、基板上に結合した塩基を光によって脱離する官能基で保護し、マスクを用いることにより特定部位の塩基だけに光を当て、官能基を脱離させる。その後、塩基を反応液に加えて、基板上の塩基とカップリングさせる工程を繰り返すことによって行われる。
【０１３５】
固相化されるポリヌクレオチドは、上記で説明した本発明の全てのポリヌクレオチドである。
【０１３６】
例えば、そのようなポリヌクレオチドは、以下の（１）〜（１２）のポリヌクレオチド及びその断片のうち異なる遺伝子由来の２以上、好ましくは３以上、より好ましくは６以上のポリヌクレオチド又はその断片を含むことができる。
（１）配列番号１〜１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（２）配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
（３）配列番号１〜１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（４）配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（５）配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（６）配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
（７）配列番号１〜１０で表される塩基配列の各々と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド群、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（８）配列番号１〜１０で表される塩基配列の各々からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド群、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
(９)配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその相補的配列の各々において、１５以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(１０)配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその相補的配列の各々において、６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(１１)配列番号１〜１０で表される塩基配列において、それぞれ配列番号１１〜２０で表される塩基配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(１２)配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な配列において、それぞれ配列番号１１〜２０で表される塩基配列に相補的な配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
【０１３７】
好ましい実施形態によれば、本発明のＤＮＡチップは、配列番号１１〜２０で表される塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチドの２以上から全部を含むことができる。
【０１３８】
本発明において、固相化されるポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡのいずれでもよいし、或いは１本鎖でもよいし又は２本鎖でもよい。
【０１３９】
標的遺伝子、ＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現レベルを検出、測定することができるＤＮＡチップの例としては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＷｈｏｌｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｏｌｉｇｏ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ、タカラバイオ社のＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ（登録商標）ＨＳ Ｈｕｍａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＣＨＩＰなどを挙げることができる。
【０１４０】
ＤＮＡマイクロアレイの作製について、例えば予め調製したプローブを固相表面に固定化する方法を使用することができる。予め調製したポリヌクレオチドプローブを固相表面に固定化する方法では、官能基を導入したポリヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Ｊ．Ｂ．Ｌａｍｔｕｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第２２巻、ｐ．２１２１−２１２５、Ｚ．Ｇｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第２２巻、ｐ．５４５６−５４６５）。ポリヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサ-やクロスリンカーを介して共有結合される。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成ポリヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Ｇ．Ｙｅｒｓｈｏｖら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９６年、第９４巻、ｐ．４９１３）。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化ポリクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Ｒ．Ｇ．Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９７年、第９４巻、ｐ．１１１９−１１２３）。
【０１４１】
６．食道ガン転移の検出法
６．１ 核酸
本発明は、本発明の組成物、キット、ＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、被験者由来の検体試料中にすでに転移を起こした食道ガン細胞が含まれるかどうかをｉｎ ｖｉｔｒｏで判定する方法であって、手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン組織に比較して、該検体試料中の細胞の標的核酸の発現量が増加しているか又は低下している場合、該検体試料中にすでに転移がある食道ガン細胞が存在すると判定することを含み、ここで、該標的核酸が該組成物、キット又はＤＮＡチップに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片によって検出可能なものである、方法を提供する。
【０１４２】
本発明はまた、本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップの、被験者由来の検体試料中の食道ガン転移のｉｎ ｖｉｖｏ検出のための使用を提供する。
【０１４３】
本発明の上記方法において、組成物、キット又はＤＮＡチップは、上で説明したような、本発明のポリヌクレオチド、その変異体又はその断片を単一で或いはあらゆる可能な組み合わせで含むものが使用される。
【０１４４】
本発明の食道ガン転移の検出、判定又は（遺伝子）診断において、本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片は、プライマーとして又はプローブとして用いることができる。プライマーとして用いる場合には、通常１５〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基の塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、例えば１５塩基〜全配列の塩基数、好ましくは２５〜１０００塩基、より好ましくは２５〜１００塩基の塩基長を有するものが例示できるが、この範囲に限定されない。
【０１４５】
本発明の組成物又はキットに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片は、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法などの、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、定法に従ってプライマー又はプローブとして利用することができる。測定対象試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験者の食道組織又は食道ガン細胞の存在が疑われる生体組織の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって摘出した生体組織から回収する。さらにそこから常法に従って調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてもよいし、さらに該ＲＮＡをもとにして調製される、ｃＤＮＡ、ポリＡ（＋）ＲＮＡを含む各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【０１４６】
或いは、生体組織における本発明の遺伝子、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどの核酸の発現量は、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマクロアレイを含む）を用いて検出或いは定量することができる。この場合、本発明の組成物又はキットはＤＮＡアレイのプローブとして使用することができる（例えば、アフィメトリックス社のＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙでは２５塩基の長さのポリヌクレオチドプローブが用いられる。また、東レ株式会社の３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標） Ｈｕｍａｎ Ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ ２５ｋでは６９〜７０塩基の長さのポリヌクレオチドプローブが用いられる。）。かかるＤＮＡアレイを生体組織から採取したＲＮＡをもとに調製される標識ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズによって形成された上記プローブと標識ＤＮＡ又はＲＮＡとの複合体を、該標識ＤＮＡ又はＲＮＡの標識を指標として検出することにより、生体組織中での本発明食道ガン転移関連遺伝子の発現の有無又は発現レベル（発現量）を評価することができる。本発明の方法では、ＤＮＡチップを好ましく使用できるが、これは、ひとつの生体試料について同時に複数遺伝子の発現の有無又は発現レベルの評価が可能である。
【０１４７】
本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップは、食道ガン転移の診断、判定又は検出（罹患の有無や罹患の程度の診断）のために有用である。具体的には、該組成物、キット又はＤＮＡチップを使用した食道ガン転移の診断は、被験者の食道ガン細胞の存在する生体組織と、手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン組織及び／又は手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン組織との比較、或いは、手術時にリンパ節転移がなかった患者及び／又は手術時にリンパ節転移があった患者の同等の生体組織との比較を行い、該診断用組成物で検出される遺伝子の発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。この場合、遺伝子発現レベルの違いには、発現の有無だけではなく、転移がある食道ガン細胞の存在する生体組織と転移がない食道ガン細胞の存在する生体組織の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発現量を比較した時の差が検定上有意（ｐ値＜０．０５）である場合が含まれる。例えばＳＨＣ１遺伝子は転移のある食道ガンで発現誘導を示すので、被験者の食道ガン組織では発現しており、該発現量と転移がない食道ガン細胞の存在する生体組織の発現量と比べて検定を行った時に、その差が有意であれば、被験者について食道ガンの転移が疑われる。
【０１４８】
本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップを利用した転移がある食道ガン（細胞）の検出方法は、被験者の生体組織の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって摘出した生体組織から回収し、そこに含まれる遺伝子を、本発明のポリヌクレオチド群から選ばれた単数又は複数のポリヌクレオチド、その変異体又はその断片を用いて検出し、その遺伝子発現量を測定することにより、食道ガンの転移の有無又はその程度を診断することを含む。また本発明の食道ガン転移の検出方法は、例えば食道ガン患者において、該疾患の改善のために治療薬を投与した場合における該疾患の改善の有無又はその程度を検出、判定又は診断することもできる。
【０１４９】
本発明の方法は、例えば以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程：
（ａ）被験者由来の検体試料を、本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップのポリヌクレオチドと接触させる工程、
（ｂ）生体試料中の標的核酸の発現レベルを、上記ポリヌクレオチドをプローブとして用いて測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の結果をもとに、該検体試料中の食道ガン（細胞）転移の存在又は不存在を判定する工程、
を含むことができる。
【０１５０】
本発明方法で用いられる検体試料としては、被験者の生体組織、例えば食道組織及びその周辺組織、食道ガンの転移が疑われる組織など、から調製される試料を挙げることができる。具体的には該組織から調製されるＲＮＡ含有試料、或いはそれからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料は、被験者の生体組織の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって摘出した生体組織から回収し、そこから常法に従って調製することができる。
【０１５１】
ここで被験者とは、哺乳動物、例えば非限定的にヒト、サル、マウス、ラットなどを指し、好ましくはヒトである。
【０１５２】
本発明の方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて工程を変更することができる。
【０１５３】
測定対象物としてＲＮＡを利用する場合、食道ガン（細胞）の検出は、例えば下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡ又はそれから転写された相補的ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）を、本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップのポリヌクレオチドと結合させる工程、
（ｂ） 該ポリヌクレオチドに結合した生体試料由来のＲＮＡ又は該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記ポリヌクレオチドをプローブとして用いて測定する工程、
（ｃ） 上記（ｂ）の測定結果に基づいて、食道ガン（細胞）の存在又は不存在を判定する工程、
を含むことができる。
【０１５４】
本発明によって食道ガン（細胞）を検出、判定又は診断するために、例えば種々のハイブリダイゼーション法を使用することができる。かようなハイブリダイゼーション法には、例えばノーザンブロット法、サザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法などを使用することができる。
【０１５５】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の診断用組成物をプローブとして用いることによって、ＲＮＡ中の各遺伝子発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の診断用組成物（相補鎖）を放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓなど）や蛍光物質などで標識し、それを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーした被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせたのち、形成された診断用組成物（ＤＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖を診断用組成物の標識物（放射性同位元素又は蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（ＢＡＳ-１８００ＩＩ、富士写真フィルム株式会社、などを例示できる）又は蛍光検出器（ＳＴＯＲＭ８６０、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、などを例示できる）で検出、測定する方法を例示することができる。
【０１５６】
本明細書で使用する「被験者」なる用語は、哺乳動物（例えばヒト、ペット動物、家畜類など）を指し、好ましくはヒトである。
【０１５７】
定量ＲＴ―ＰＣＲ法を利用する場合には、本発明の上記診断用組成物をプライマーとして用いることによって、ＲＮＡ中の遺伝子発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法にしたがってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的の各遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の診断用組成物から調製した１対のプライマー（上記ｃＤＮＡに結合する正鎖と逆鎖からなる）をｃＤＮＡとハイブリダイズさせて常法によりＰＣＲ法を行い、得られた二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、二本鎖ＤＮＡの検出法としては、上記ＰＣＲをあらかじめ放射性同位元素や蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行う方法、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドなどで二本鎖ＤＮＡを染色して検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーさせて標識した診断用組成物をプローブとしてこれとハイブリダイズさせて検出する方法をとることができる。
【０１５８】
ＤＮＡアレイ解析を利用する場合は、本発明の上記診断用組成物をＤＮＡプローブ（一本鎖又は二本鎖）として基板に貼り付けたＤＮＡチップを用いる。遺伝子群を基板に固相化したものには、一般にＤＮＡチップ及びＤＮＡアレイという名称があり、ＤＮＡアレイにはＤＮＡマクロアレイとＤＮＡマイクロアレイが包含されるが、本明細書ではＤＮＡチップといった場合、該ＤＮＡアレイを含むものとする。
【０１５９】
ハイブリダイゼーション条件は、限定されないが、例えば３０℃〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ、０．１〜０．５％ ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは４０℃〜４５℃で、３．４×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び１×ＳＳＣ溶液、０．２×ＳＳＣ溶液による室温での連続した洗浄などの条件を挙げることができる。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）である。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが望ましい。具体的にはこのような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【０１６０】
本発明の組成物又はキットのポリヌクレオチド断片をプライマーとしてＰＣＲを実施する際のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、例えば１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣＬ、１〜２ｍＭ ＭｇＣｌ２などの組成のＰＣＲバッファーを用い、当該プライマーの配列から計算されたＴｍ＋５〜１０℃において１５秒から１分程度処理することなどが挙げられる。かかるＴｍの計算方法としてＴｍ＝２×(アデニン残基数+チミン残基数)＋４×(グアニン残基数+シトシン残基数)などが挙げられる。
【０１６１】
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． & Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ． 著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の 第１巻７．４２〜７．４５、第２巻８．９〜８．１７などに記載されており、本発明において利用できる。
【０１６２】
本発明はまた、本発明の組成物、キット、ＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、被験者由来の検体試料中の標的核酸又は遺伝子の発現量を測定し、食道ガン組織と正常組織の遺伝子発現量を教師（訓練サンプル）としたサポートベクターマシーン（ＳＶＭ）を判別式として、検体試料中に転移がある食道ガン細胞が含まれないこと及び／又は含まれることを判定する方法を提供する。
【０１６３】
すなわち、本発明はさらに、本発明の組成物、キット、ＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、転移がある患者由来の食道ガン細胞を含む組織又は転移がない患者由来の食道ガン細胞であることが既知の複数の生体試料中の標的核酸の発現量をin ｖｉｔｒｏで測定する第１の工程、前記第１の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を教師とした判別式（サポートベクターマシーン）を作成する第２の工程、被験者の食道由来の検体試料中の該標的核酸の発現量を第１の工程と同様にｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する第３の工程、前記第２の工程で得られた判別式に第３の工程で得られた該標的酢酸の発現量の測定値を代入し、該判別式から得られた結果に基づいて、検体試料中に転移がある食道ガン細胞が含まれないこと及び／又は転移がない食道ガン細胞が含まれることを判定する第４の工程を含む、ここで、該標的核酸が該組成物、キット又はＤＮＡチップに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片によって検出可能なものである、前記方法を提供する。
【０１６４】
或いは、本発明の方法は、例えば下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）転移がある患者由来の食道ガン細胞を含む組織又は転移がない患者由来の食道ガン細胞組織であることが既知の生体試料中の標的遺伝子の発現量を、本発明による診断（検出）用組成物、キット又はＤＮＡチップを用いて測定する工程、
（ｂ）（ａ）で測定された発現量の測定値を、下記の数１〜数５の式に代入して、ＳＶＭと呼ばれる判別式を作成する工程、
（ｃ）被験者由来の検体試料中の該標的遺伝子の発現量を、本発明による診断（検出）用組成物、キット又はＤＮＡチップを用いて測定し、（ｂ）で作成した判別式にそれらを代入して、得られた結果に基づいて該検体試料中に転移がある食道ガン細胞が含まれるかどうかを判定する工程、
を含むことができる。
【０１６５】
ＳＶＭとは２クラスの分類問題を解くためにつくられた１９９５年にＡＴ＆ＴのＶ．Ｖａｐｎｉｋ（Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｎｉｎｇ Ｔｈｅｏｒｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９５年発行）によって統計的学習理論の枠組みで提案された学習機械である。ＳＶＭは線形の識別器であるが、後述するカーネルを組み合わせることによって非線形問題を扱うことができる。異なるクラスの訓練サンプルについて、それらを識別する多数の超平面のうち、その超平面と訓練サンプルとの最小距離が最大となる超平面を識別面とすることにより、新たに与えられるテストサンプルがどのクラスに属するかを最も正確に識別することができる。
【０１６６】
ＳＶＭでは線形問題のみしか扱うことができないが、本質的に非線形な問題に対応するための方法として、特徴ベクトルを高次元へ非線形変換し、その空間で線形の識別を行う方法が知られている。こうすれば、元の空間で非線形モデルを用いているのと等価となる。しかし高次元への写像を行うと膨大な計算量が必要となり、汎化能力も減少する。ＳＶＭでは識別関数が入力パターンの内積のみに依存した形になっており、内積が計算できれば最適な識別関数を構成することが可能である。非線形に写像した空間での二つの要素の内積がそれぞれのもとの空間での入力のみで表現されるような式のことをカーネルと呼び、高次元に写像しながら、実際には写像された空間での特徴の計算を避けてカーネルの計算のみで最適な識別関数、すなわち判別式を構成することができる。
【０１６７】
本発明の方法で使用可能な判別式の算出例を以下に示す。
ＳＶＭを決めるためには食道ガン細胞を含む組織又は正常組織であることが既知の生体試料中の標的遺伝子の発現量を教師（訓練サンプル）として用意し、以下の手順によって識別関数の定数を決定することができる。
【０１６８】
訓練サンプルxiは（＋１、−１）でクラス分けされる、食道ガン細胞を含む組織群、又は正常組織群のいずれかに属しているとする。これらの訓練サンプルが超平面によって線形分離できるとき、識別関数は例えば次式となる。
【０１６９】
【数１】
（ここで、wは重み係数、bはバイアス定数、xはサンプルの変数を表す。）
ただし、この関数には制約条件：
【０１７０】
【数２】
（ここで、Tは内積、yはサンプルのクラス、ζはスラック変数を表す。）
があるため、Ｌａｇｕｒａｎｇｅの未定乗数法を用いることによりＬａｇｕｒａｎｇｅ乗数αを用いた以下の最適化問題に帰着する。
【０１７１】
【数３】
ここで、
【０１７２】
【数４】
（ここで、Cは実験により決定される制限条件パラメーターを表す。）
この問題を解くと最終的に、
【０１７３】
【数５】
が得られ、識別関数を一義的に得ることができる。この関数に新たに与えられる検体試料（食道ガン細胞を含むかどうか未知の組織の発現遺伝子量）についてのｘを代入することによって、ｆ（ｘ）をクラス分け（すなわち、＋１又は−１）することができ、検体試料がどちらのクラス（すなわち、転移がある患者由来の食道ガン細胞を含む組織群又は転移がない患者由来の食道ガン細胞）に属するかを識別する。
【０１７４】
以上に示すように、未知試料のクラス分けを行うためのＳＶＭによる判定式の作成には２群の教師（訓練サンプル）が必要となる。この訓練サンプルは例えば今回の発明の場合、「転移のある食道ガン患者の食道ガン組織から得られた発現遺伝子（遺伝子ｘ１，ｘ２，．．ｘｉ，．．．ｘｎ）」の各患者に対応したセット、及び「転移のない食道ガン患者の食道ガン組織から得られた発現遺伝子（遺伝子ｘ１，ｘ２，．．ｘｉ，．．．ｘｎ）」の各患者に対応したセット、の２群である。これらのセットについてそれぞれ測定される発現遺伝子数（ｎ）は実験のデザインによって様々ではあるが、個々の遺伝子については、どのような実験においても２群間で大きく差がある場合と、比較的差が少ない、或いは差がない場合が観察される。ＳＶＭによる判別式の精度を上げるためには、訓練サンプルとなる２群に、明確な差があることが条件となるため、遺伝子セットの中から２群間で発現量に差がある遺伝子のみを抽出して利用することが必要である。
【０１７５】
このように、２群間で差がある遺伝子を抽出する方法としては、平均値の差を検出するパラメトリック解析であるｔ−検定、ノンパラメトリック解析であるＭａｎｎ―ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定などを利用できる。
【０１７６】
本発明の方法において、例えば、上に記載したような配列番号１〜１０に基づく２〜全部、好ましくは３〜全部、さらに好ましくは６〜全部の上記ポリヌクレオチド、並びに/或いは、上に記載したような配列番号１１〜２０（又は配列番号１２〜２０）に基づく２〜全部、好ましくは３〜全部、さらに好ましくは６〜全部のポリヌクレオチド、からの任意の組み合わせを用いて、かつ上記の１０種の標的遺伝子の発現量がすべて有意に転移がある患者由来の食道ガン組織と転移がない患者由来の食道ガン組織との間で異なり、転移がある患者由来の食道ガン組織において発現が増加しているか、或いは減少していることを指標にして、これら１０種の遺伝子について発現量を測定することにより、食道ガンの転移を７０％以上、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の確率で見分けることができる（図１）。
【０１７７】
６．２ 抗体
本発明はさらに、本発明の上記抗体を用いて、被験者由来の食道ガン細胞、血液等の生体試料中の上記ポリペプチドのレベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することを含む、被験者の食道ガンの転移の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測する方法、或いは食道ガンの転移をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出する方法が提供される。
【０１７８】
具体的には、本発明は、上記１０種の遺伝子（例えば、配列番号１〜１０に相当する）又はその断片（例えば、配列番号１１〜２０に相当する）によってコードされるポリペプチド、例えば配列番号２１〜２７、２２〜２７などで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、に対する２〜全部、好ましくは３〜全部、さらに好ましくは６〜全部、の抗体又はその断片を用いて、転移がある患者由来の食道ガン細胞もしくは組織と転移がない患者由来の食道ガン細胞もしくは組織間での該ポリペプチドの発現量、或いは血液中の該ポリペプチドのレベル(又は存在量)、をiｎ vｉｔｒｏで測定することを含む、食道ガン転移の検出方法、或いは食道ガン転移（又は転移の可能性）の有無の予測方法を提供する。
【０１７９】
測定は、慣用の酵素又は蛍光団で標識した抗体又は断片と、組織切片又はホモゲナイズした組織とを接触させる工程、抗原−抗体複合体を定性的に又は定量的に測定する工程を含むことができる。検出は、例えば免疫電顕により標的ポリペプチドの存在とレベルを測定する方法、ELISAや蛍光抗体法などの慣用法によって標的ポリペプチドのレベルを測定する方法などによって行い、転移がない患者由来の食道ガン細胞もしくは組織と比べて転移がある患者由来の食道ガン細胞もしくは組織において標的ポリペプチドの発現レベル（発現量）が増加しているか又は減少している場合、或いは血液中の該ポリペプチドのレベルが、転移がない食道ガン患者と比べて転移がある食道ガン患者において有意に増加しているか又は低下している場合、食道ガンの転移があると決定する。言い換えれば、前記ポリペプチドの発現量又はレベルが、転移のない患者由来の値と比較して有意に増加又は低下している場合、食道ガンの転移があると決定する。ここで、「有意に」とは、統計学的に有意（ｐ≦０．０５）であることを意味する。
【０１８０】
ポリペプチドの発現レベルは、免疫学的方法によって測定しうる。免疫学的測定法として例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応又はウェスタンブロット法が挙げられる。
【０１８１】
上記の方法において、標識を用いた免疫測定法により実施する場合には、本発明の抗体を固相化するか、又は試料中の成分を固相化して、それらの免疫学的反応を行うことができる。
【０１８２】
固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。
【０１８３】
固相化は、固相担体と本発明の抗体又は試料成分とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法に従って結合させることにより行うことができる。
【０１８４】
さらにまた、本発明においては、本発明の抗体と、試料中の標的ポリペプチドとの反応を容易に検出するために、本発明の抗体を標識することにより該反応を直接検出するか、又は標識二次抗体を用いることにより間接的に検出する。本発明の検出方法においては、感度の点で、後者の間接的検出（ 例えばサンドイッチ法など）を利用することが好ましい。
【０１８５】
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼ又はビオチン− アビジン複合体等を、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ等を、そして放射免疫測定法の場合にはトリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。また、発光免疫測定法は、ＮＡＤＨ−、ＦＭＮＨ２−、ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
【０１８６】
標識物質と抗体との結合法は、酵素免疫測定法の場合にはグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方法を、放射免疫測定法の場合にはクロラミンＴ法、ボルトンハンター法等の公知の方法を用いることができる。測定の操作法は、公知の方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９５年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００１年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．）により行うことができる。例えば、本発明の抗体を直接標識する場合には、試料中の成分を固相化し、標識した本発明の抗体と接触させて、マーカーポリペプチドと本発明の抗体との複合体を形成させる。そして未結合の標識抗体を洗浄分離して、結合標識抗体量又は未結合標識抗体量より試料中の標的ポリペプチドの量を測定することができる。
【０１８７】
また、例えば標識二次抗体を用いる場合には、本発明の抗体と試料とを反応させ（一次反応）、さらに標識二次抗体を反応させる（二次反応）。一次反応と二次反応は逆の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいし、又は時間をずらして行ってもよい。一次反応及び二次反応により、固相化した標的ポリペプチド−本発明の抗体−標識二次抗体の複合体、又は固相化した本発明の抗体−標的ポリペプチド−標識二次抗体の複合体が形成する。そして未結合の標識二次抗体を洗浄分離して、結合標識二次抗体量又は未結合標識二次抗体量より試料中の標的ポリペプチドの量を測定することができる。
【０１８８】
具体的には、酵素免疫測定法の場合は標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を光学的方法等により測定する。蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫定法の場合には放射性物質標識による放射能量を測定する。発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。
【０１８９】
本発明の方法では、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応又は粒子凝集反応等における免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目視的に測る測定法により実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を反応系に含ませてもよい。
【０１９０】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、この実施例によって制限されないものとする。
【実施例】
【０１９１】
１．実験者の臨床病理学的所見
インフォームドコンセントを得た３１名の食道ガン患者から、食道ガン摘出手術時又は食道生検実施時に食道の摘出組織を得た。摘出された組織片について肉眼的及び／又は病理組織学的に食道ガン組織を判断し、食道ガン病変部と正常組織部を分けてただちに凍結し、液体窒素中で保存した。別途、周辺の所属リンパ節の採取を行い、食道ガン細胞の転移の有無を病理学的に診断した。
【０１９２】
２．ｔｏｔａｌＲＮＡ抽出とｃＤＮＡの調製
試料として食道ガン患者の食道組織における食道ガン病変部の組織を用いた。おのおのの組織から、Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、同社推奨のプロトコールによりｔｏｔａｌＲＮＡを調製した。
【０１９３】
上述の方法で得られたｔｏｔａｌＲＮＡ １μgについて、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー及びランダムノナマーを併用し、ＣｙＳｃｒｉｂｅ Ｆｉｒｓｔ-Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）を用いてメーカー推奨のプロトコールで逆転写反応を行った。食道ガン組織由来のｔｏｔａｌＲＮＡにはＣｙ３−ｄＵＴＰ（ＧＥヘルスケア社）を、リファレンスｔｏｔａｌＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にはＣｙ５−ｄＵＴＰ（ＧＥヘルスケア社）を添加して、メーカー推奨のプロトコールで逆転写反応時にｃＤＮＡの標識を行った。標識されたｃＤＮＡはＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製してからハイブリダイズに用いた。
【０１９４】
３．遺伝子絞込みのためのオリゴＤＮＡマイクロアレイ
オリゴＤＮＡマイクロアレイとしてはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社ＧｅｎｅＣｈｉｐTM（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ａ）と本明細書中で述べる方法に従って作製したガラス製ＤＮＡチップ、及び東レ株式会社３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ ２５ｋを用いて候補遺伝子の一次絞込みを行い、さらに本明細書中に述べる方法で作製した一次絞込み済みの遺伝子を搭載した３Ｄ−Ｇｅｎｅ基板を利用したオリゴＤＮＡマイクロアレイを用いた。
【０１９５】
４．遺伝子の一次絞込み
遺伝子の一次絞込みには、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社ＧｅｎｅＣｈｉｐTM／ガラス製オリゴＤＮＡマイクロアレイの組合せを用いる方法と、東レ株式会社３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ ２５ｋを用いる方法の二通りを利用した。
【０１９６】
ガラス製オリゴＤＮＡマイクロアレイの作製方法を以下に示す。最初に搭載するオリゴＤＮＡの種類を決定するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社ＧｅｎｅＣｈｉｐTMを用いて遺伝子の絞込みを行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐTMの操作については、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＧｅｎｅＣｈｉｐTM Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍなどの同社の定める手順に基づいて実施した。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＧｅｎｅＣｈｉｐTMを用いた解析の結果、食道ガンによって発現変動が起こる可能性がある遺伝子及び実験対照となりうる遺伝子を計８９６１種抽出した。
【０１９７】
抽出した８９６１種の遺伝子について、配列の重複をおこさないように配列特異性が高い部位の配列６０−７０残基をそれぞれ選択して合成した。４倍に希釈したＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（タカラバイオ社）に３０μＭとなるように溶解した、８９６１種の６０又は７０ｍｅｒからなる合成オリゴＤＮＡを、ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ・ＤＮＡマイクロアレイ用コートグラスＤＭＳＯ対応 ＴｙｐｅＩアミノ修飾オリゴＤＮＡ固定コート（松浪硝子工業株式会社）上にスポッター（ＧＭＳ４１７ａｒｒａｙｅｒ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて湿度環境５０−６０％でスポットした。
【０１９８】
標識したｃＤＮＡ １μｇをアンチセンスオリゴカクテル（ＱＩＡＧＥＮ）に溶解し、Ｇａｐカバーグラス（松浪硝子工業）を載せたガラス製オリゴＤＮＡマイクロアレイにアプライし、４２℃で１６時間ハイブリダイズを行った。ハイブリダイズ終了後、ＤＮＡチップを２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、１ｘＳＳＣ、０．２ｘＳＳＣで順次洗浄した。
【０１９９】
上述の方法によりハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップをＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いてスキャンし、画像を取得して蛍光強度を数値化した。統計学的処理はＳｐｅｅｄ Ｔ．著「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ」Ｃｈａｐｍａｎ & Ｈａｌｌ/ＣＲＣ，及びＣａｕｓｔｏｎ Ｈ．Ｃ．ら著「Ａ ｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ ｇｕｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参考にして行った。すなわちハイブリダイズ後の画像解析から得られたデータについて、それぞれの対数値をとり、ｇｌｏｂａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎをとＬＯＷＥＳＳ（ｌｏｃａｌｌｙ ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ ｓｍｏｏｔｈｅｒ）による平滑化を行い、ＭＡＤによるスケーリング処理によってノーマライゼーション補正を行った。その結果、転移がある食道ガン病変部における発現量が、転移がない食道ガン病変部よりも多いか又は少ない遺伝子を見出すことができた。これらの遺伝子を食道ガン転移検出用遺伝子として利用することができると考えられる。この結果、２５５種の遺伝子を絞り込んだ。
【０２００】
一方、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標） Ｈｕｍａｎ Ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ ２５ｋによる遺伝子の一次絞込みについては、６名の食道ガン患者（転移あり３名、転移なし３名）から採取した検体由来の発現遺伝子解析を実施した。それぞれの患者からトータルＲＮＡを採取し、逆転写して標識したｃＤＮＡ ５００ｎｇを東レ株式会社製ハイブリバッファーに溶解し、３Ｄ−ＧｅｎｅTM Ｈｕｍａｎ ２５Ｋにアプライした後、４２℃で１６時間ハイブリダイズを行った。ハイブリ終了後にＤＮＡチップを洗浄してＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ株式会社製ＰｒｏＳｃａｎＡｒｒａｙ（登録商標）を用いてスキャンし、画像を取得して蛍光強度を数値化した。この数値化データについてそれぞれの対数値をとり、ｇｌｏｂａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行った上で、転移がある食道ガン病変部における発現量が、転移がない食道ガン病変部よりも多い／少ない遺伝子を見出すためにＳｔｕｄｅｎｔ’ｔ−ｔｅｓｔ、判別分析、変動倍率のランキングを行って８４９種の遺伝子を絞り込んだ。
【０２０１】
５．診断用遺伝子絞込みのためのＤＮＡチップ実験
４．で絞り込んだ診断用遺伝子候補、及び対照遺伝子検出用のプローブとして、それぞれの遺伝子配列から配列６０−７０残基をそれぞれ選択して、１１１９種のオリゴヌクレオチドを合成した（配列番号１１〜２０の配列であるオリゴヌクレオチドをそれぞれ含む）。これらのプローブを東レ株式会社製３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）１３３２柱基板にそれぞれ１プローブにつき１点ずつスポットし、食道ガン転移判別用ＤＮＡチップとして作製した。
【０２０２】
この食道ガン転移判別用ＤＮＡチップに、食道ガン患者の手術検体又は生検検体由来の食道ガン組織から採取したＲＮＡを逆転写・Ｃｙ３標識して、同様に逆転写・Ｃｙ５標識を行った対照となるＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）と、それぞれ３００ｎｇを同時にアプライした。４２℃で１６時間ハイブリダイズを行い、ハイブリ終了後にＤＮＡチップを洗浄してＰｅｒｋｉｎ―Ｅｌｍｅｒ株式会社製ＰｒｏＳｃａｎＡｒｒａｙ（登録商標）を用いてＤＮＡチップをスキャンし、画像を取得してそれぞれのスポットの蛍光強度を数値化した。この数値化データについてＣｙ３蛍光値とＣｙ５蛍光値のブランク補正（プローブをスポットしていない柱領域の蛍光値の平均をそれぞれの蛍光から減算する）、ｇｌｏｂａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行った上でＭ値に変換した（Ｍ値：検体由来Ｃｙ３蛍光／対照由来Ｃｙ５蛍光の底２の対数変換値）。
【０２０３】
６．予測スコアリングシステム
３１例の患者から得た食道がん検体（転移あり１０例、転移なし２１例）のデータをもとに、テストデータに転移ありの検体が必ず３例含まれる条件下で、無作為に学習データ２６例、テストデータ５例を分けた。学習データ群において、Ｌｅａｖｅ ｏｎｅ ｏｕｔ法によって診断用遺伝子の選択と判別用アルゴリズム構築を行った。抜いた１例の学習データとテストデータを予測し、学習データのすべて必ず１回予測対照となるように、２６回の試行を行った。サンプリングを変えて、同様の試行を１０回繰り返し、そのテストデータを予測する精度の平均によって、判別アルゴリズムの精度を評価したところ、遺伝子５種を用いた場合に最大（７６％）の予測精度を得ることが示された。この結果が偶然出ないことを確かめるために、３１例の患者について転移あり、なしの情報を無作為に振り分け、データを完全にランダム化して同様の試行を３００回実施したところ、判別精度は遺伝子５種で５２．３％にとどまり、判別アルゴリズムの精度が偶然でないことが示された。
【０２０４】
そこで次に、この５種の遺伝子に相当する遺伝子を１０回のランダムサンプリング法の試行結果から抽出し、出現頻度順に順位付けした（表１）。この順位を順に遺伝子数を増やしながら、全３１検体についてＬｅａｖｅ ｏｎｅ ｏｕｔ法によるＳＶＭ判別を行ったところ、上位１０遺伝子で、食道ガンのリンパ節転移予測について、精度９６．３％を示した。なお、表１に示した遺伝子は、転移がある食道ガン病変部と転移がない食道ガン病変部での遺伝子転写産物の発現量差が上位の遺伝子である。
【０２０５】
【表１】
【０２０６】
この一覧から上位から順に遺伝子を選び、食道ガン組織を識別するためのＳＶＭによる判別マシーンを作成したところ、プローブとして配列番号１１〜２０のポリヌクレオチドを用いて測定した遺伝子発現を検討することにより、転移がある食道ガン病変部と転移がない食道ガン病変部の判別式を作成したところ、用いる遺伝子の数に依存して確率が変動し、９３．６％以上の確率で転移がある食道ガン病変部と転移がない食道ガン病変部を判別することができた（図1）。
【０２０７】
また、任意のプローブによって測定した遺伝子発現を検討することにより、転移がある食道ガン病変部と転移がない食道ガン病変部の判別式を作成したところ、表２のような判別確率を得ることができた（表２）。
【０２０８】
【表２】
【０２０９】
図１及び表２に示したような結果は、食道ガン患者からのサンプルでの結果と本質的に一致する。
【産業上の利用可能性】
【０２１０】
本発明により、特異性、感受性に優れた食道ガン転移判定用組成物を提供することができるため、少なくともリンパ節への食道ガン転移の検出のために非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】表１に記載の遺伝子に対応する配列番号１１〜２０のポリヌクレオチドを組み合わせて用いた場合の食道ガンのリンパ節転移判別確率（％）を示す。縦軸は、食道ガンのリンパ節転移判別確率（％）、すなわち検体中の転移がある食道ガン組織の存在を検出できる確率、横軸は、表１に記載の遺伝子に対応する配列番号１１〜２０において、配列番号１１から２０まで１つずつ順番に増やした、転移がある食道ガン検出に必要な遺伝子の合計数をそれぞれ示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食道ガンの転移判定又は検出に有用な判定（診断）用組成物、該組成物を利用した食道ガン転移検出又は判定方法、及び該組成物を利用した食道ガン転移診断又は検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
食道は咽頭と胃の間をつなぐ管腔状の臓器であり、大部分は胸腔、一部は頸部と腹腔に存在する。胸腔の上部では気管と脊椎の間にあり、下部では心臓、大動脈と肺に囲まれている。食道は口から食べた食物を胃に送る働きをする。
【０００３】
日本人の２００１年のガンによる死亡率は１０万人中２３８．８人である。死亡原因の中で食道ガンが占める割合は年々増加しており、２００１年度には男性では全ガン死亡例の５．０％、女性では１．４％が食道ガンであった。食道ガンの発症年齢のピークは６０〜７０歳代にあり、男性に発症が多い。また喫煙、飲酒、熱い嗜好物などの環境要因が発生に密接に関連する。さらに食道壁内部や周辺は血管やリンパ管が豊富であるため、発生したガンの転移が多いことが知られている。
【０００４】
食道ガンの治療は進行度（日本食道疾患研究会編 臨床・病理 食道ガン取り扱い規約 １９９９年）や転移、全身状態を考慮して決定する。食道ガンの標準的な治療法は日本食道疾患研究会編「食道ガン治療ガイドライン」（２００２年）に示されている。現在最も一般的な療法は手術療法であり、ガンを含めた食道とリンパ節を含む周囲の組織を切除（リンパ節郭清）した上で、胃など他の臓器を用いて食道を再建する。ただし手術療法、特に広範囲のリンパ節郭清は患者に大きな負担を与え、手術後のＱＯＬ低下への配慮も必要である。粘膜内にとどまる早期のガンの場合には内視鏡的粘膜切除術が可能である場合がある。また根治療法、対症療法の両面から放射線照射が行われる場合がある。さらに手術療法や放射線療法と組み合わせて化学療法が行われる。化学療法では現在、５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌとｃｉｓｐｌａｔｉｎの併用療法が最も有効と考えられている。
【０００５】
食道ガンは嚥下時の違和感、嚥下困難、胸骨後部痛や胸部違和感といった自覚症状を覚えた患者の受診によって発見されることが多い。しかしながらこれらの症状が発現するのは食道内でガンが成長した結果であり、自己所見による受診時に発見されるガンはすでに食道壁外進展や転移が起こっており予後不良であることが多い。したがって手術時には食道周辺のリンパ節拡清を行うことが多いが、この時転移の有無が予見できていれば、拡清の範囲を術前に正確に決定することや、拡清の範囲を限定し術後の患者のＱＯＬに貢献することが可能である。
【０００６】
食道ガンは食道造影検査及び内視鏡検査と生検組織検査にて診断が確定される。生検標本は内視鏡検査時や手術時に採取され、病理標本を作製した上で病理組織学的分類によって診断される。この時、内視鏡検査で得られた細胞の性質から食道外への転移の有無が予測できる、迅速で簡便な診断法の開発が求められている。
【０００７】
現在までに、食道ガン組織に特異的に含まれるマーカーを用いた分子生物学的診断方法が提案されている。この方法は迅速で客観的な結果をもたらし、迅速な診断の助けとなる。
【０００８】
これまでに食道ガンの臨床検査用マーカーとして血清中のタンパク質マーカーであるＳＣＣ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＥＡなどが活用されているほか、特許文献１、２に記載のタンパク質などが報告されている。しかしこれらのマーカーは感度、特異度が乏しく、もっとも感度が高いとされているＣＹＦＲＡ２１−１についても、その感度は３３．９％（非特許文献１）から４３．９％（非特許文献２）程度である。したがってこれらの血清中マーカー及びその組み合わせの検出によって食道ガン細胞の存在の有無が確定されるという段階には至っていないし、これらを用いて食道ガンの転移を診断することもできていない。
【０００９】
また、被験者より採取された生検試料に食道ガン細胞が含まれているか否かを特異的に判断するための遺伝子を利用したマーカーとしては、染色体異常（例えば特許文献３，４参照）や遺伝子の後成的配列（例えば特許文献５）が開示されているほか、ＤＮＡチップによる網羅的遺伝子発現解析の結果が複数報告されている（例えば非特許文献３〜８参照）。さらに単独の遺伝子発現を指標としたマーカーとしては特許文献６、非特許文献９、１０に示されるＳＰＲＲ３遺伝子（Ｓｍａｌｌ ｐｒｏｌｉｎｅ―ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）、非特許文献１１に示されるｆｇｆ３遺伝子、特許文献６、非特許文献１２に示されるＣＳＴＢ遺伝子（ｃｙｓｔａｔｉｎ Ｂ、ｌｉｖｅｒ ｔｈｉｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、特許文献７に示されるＵＣＰ２遺伝子（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、特許文献６に示されるＵＰＫ１Ａ遺伝子（ｕｒｏｐｌａｋｉｎ １Ａ）、非特許文献１３に示されるＨＳＰＡ１Ｂ遺伝子（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ ７０ｋＤａ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）などが報告されている。しかし、これらによっても食道ガンの転移を診断することは不可能である。
【００１０】
一方で、特許文献８ではＳＨＣ遺伝子の発現／チロシンリン酸化量が、消化器ガンの進展に影響を与えることが示されているが、食道がんにおけるリンパ節転移を判別できる性能については明確にされていない。
【００１１】
さらに特許文献９においてはＤＮＡチップによる網羅的遺伝子発現解析によって、食道ガンの転移を予測するための組成物及び方法が示されている。すなわち特許文献９においては、４７種の遺伝子の発現量を測定し、組み合わせて判別式を作成することにより、８６％の確率で食道ガンのリンパ節転移を予測することができることが示されている。
【００１２】
【特許文献１】特開２００３-２５９８７２号公報
【特許文献２】特表２０００-５１１５３６号公報
【特許文献３】特開２００１-１７２００号公報
【特許文献４】特開２００２-２７２４９７号公報
【特許文献５】特表２００４-５０５６１２号公報
【特許文献６】国際公開第２００３/０４２６６１パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００３/０７６５９４パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００７/０８４１５６パンフレット
【特許文献９】国際公開第２００６/１１８３０８号パンフレット
【００１３】
【非特許文献１】Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．ら、１９９８、Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ、第１１巻、ｐ．３５−３９
【非特許文献２】Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｈら、２０００、Ｃａｎｃｅｒ、第８９巻、ｐ．１４１３−１４１７
【非特許文献３】Ｌｕｏ, Ａ．ら、２００４年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第２３巻、ｐ.１２９１-１２９９
【非特許文献４】Ｚｈｉ, Ｈ．ら、２００３年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、第１０６巻、ｐ.３２７-３３３
【非特許文献５】Ｌｕ, Ｊ．ら、２００１年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、第９１巻、ｐ.２８８-２９４
【非特許文献６】Ｋａｚｅｍｉ-Ｎｏｕｒｅｉｎｉ，Ｓ．ら、２００４年、Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ 、第１０巻、ｐ.１７１６-１７２１
【非特許文献７】Ｘｕ, Ｓ．Ｈ．ら、２００３年、Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ 、第９巻、ｐ.４１７-４２２
【非特許文献８】Ｓｕ, Ｈ．ら、２００３年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第６３巻、ｐ.３８７２-３８７６
【非特許文献９】Ｃｈｅｎ, Ｂ.Ｓ. ら、２０００年、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第２１巻、ｐ.２１４７-２１５０
【非特許文献１０】Ａｂｒａｈａｍ, Ｊ.Ｍ.ら、１９９６年、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、第７巻、ｐ.８５５-８６０.
【非特許文献１１】Ｋｉｔａｇａｗａ, Ｙ．ら、１９９１年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５１巻、p.１５０４-１５０８
【非特許文献１２】Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ,Ｔ．ら、１９９８年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、第７９巻、ｐ.１７５-１７８
【非特許文献１３】Ｋａｗａｎｉｓｈｉ，Ｋ．ら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ、第８５巻、ｐ.１６４９-１６５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、上記の既存の指標は特異性及び／又は感受性に乏しいことや、生体試料からのその効率的な検出方法が確立していないことから一般に臨床上の利用は行われておらず、また患者の予後を決定する大きな要因である、食道ガン転移の有無を診断マーカーを用いて検出することは、現在不可能と考えられる。そこで特異性及び感受性が高い食道ガン転移のマーカーが切望されている。
【００１５】
本発明は、食道ガン転移の診断及び治療に有用な疾患判定用組成物、該組成物を用いた食道ガン転移の判定（又は検出）方法、及び該組成物を利用した食道ガン転移の判定（又は検出又は診断）キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
マーカー探索の方法としては、食道ガン細胞のうち、手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン細胞と手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン細胞における遺伝子発現やタンパク質発現、又は細胞の代謝産物などの量を何らかの手段によって比較する方法や食道ガン患者と非ガン患者の体液中に含まれる遺伝子、タンパク質、代謝産物などの量を測定する方法が挙げられる。
【００１７】
ＤＮＡアレイを用いた発現遺伝子量解析は、近年、このようなマーカー探索の手法として特に汎用されている。ＤＮＡアレイには数百から数万種の遺伝子に対応した塩基配列を利用したプローブが固定されている。被検試料をＤＮＡアレイに添加することによって試料中の遺伝子がプローブと結合し、この結合量を何らかの手段によって測定することにより、被検試料中の遺伝子量を知ることができる。ＤＮＡアレイ上に固定化するプローブに対応した遺伝子の選択は自由であり、また被検試料に手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン細胞と手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン細胞胞を用いて、試料中の発現遺伝子量を比較することによって食道転移ガンマーカーとなりうる遺伝子群を推定することが可能である。
【００１８】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン組織と手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン組織の遺伝子発現をＤＮＡアレイによって解析し、食道ガン転移の検出マーカーに使用可能な遺伝子を見出し、さらにそれらの遺伝子の発現量が、手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン細胞に比較して手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン細胞において有意に減少又は低減していることを見出し、本発明を完成させた。
【００１９】
１．発明の概要
本発明は、以下の特徴を有する。
本発明は第１の態様において、下記の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド、その変異体又はその断片からなる群から選択される２以上のポリヌクレオチドを含む、食道ガン転移診断用組成物である。
（a）配列番号１〜１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片
（b）配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（c）配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片
（d）配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（e）前記（a）〜（d）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片
その実施形態において、前記断片が、６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチドである上記の組成物である。
【００２０】
また別の実施形態において、前記断片が、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列において、それぞれ配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、上記の組成物である。
【００２１】
また別の実施形態において、前記断片が、配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列、又はこれらに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、上記の組成物である。
【００２２】
本発明の第２の態様において、上記のいずれかに記載の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド、その変異体及び/又はその断片の２以上を含む、食道ガン転移診断用キットである。
【００２３】
その実施形態において、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの１５以上の連続した塩基を含む断片である、上記のキットである。
【００２４】
また別の実施形態において、前記断片が、６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチドである、上記のキットである。
【００２５】
また別の実施形態において、前記断片が、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列において、それぞれ配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、上記のキットである。
【００２６】
また別の実施形態において、前記断片が、配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、上記のキットである。
【００２７】
また別の実施形態において、前記ポリヌクレオチドが、別個に又は任意に組み合わせて異なる容器に包装されている、上記のいずれか１項に記載のキットである。
【００２８】
本発明の第３の態様において、上記のいずれかに記載の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド、その変異体及び/又はその断片の２以上を含む、食道ガン転移診断用ＤＮＡチップである。
【００２９】
その実施形態において、配列番号１１〜２０で表される塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチドの２以上〜全部を含む、上記のＤＮＡチップである。
【００３０】
本発明の第４の態様において、上記のいずれかに記載の組成物、上記のいずれかに記載のキット、上記のいずれかに記載のＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、被験者由来の生体試料における標的核酸の発現レベルを測定することによって、被験者由来の検体試料中に転移を伴う食道ガン細胞が含まれるかどうかをｉｎ ｖｉｔｒｏで判定する方法である。
【００３１】
その実施形態において、ＤＮＡチップを用いる上記の方法である。
また別の実施形態において、いずれかに記載の組成物、上記のいずれかに記載のキット、上記のいずれかに記載のＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、転移を伴う食道ガン又は転移を伴わない食道ガン細胞を含む組織であることが既知の複数の生体試料中の標的核酸の発現量をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する第１の工程、前記第１の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を教師とした判別式（サポートベクターマシーン）を作成する第２の工程、被験者の食道由来の検体試料中の該標的核酸の発現量を第１の工程と同様にｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する第３の工程、前記第２の工程で得られた判別式に第３の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を代入し、該判別式から得られた結果に基づいて、検体試料中に転移を伴うガン細胞が含まれないこと及び／又は転移を伴わないガン細胞が含まれることを判定する第４の工程を含む、食道ガン転移を判定する方法である。
【００３２】
また別の実施形態において、上記のいずれかに記載の組成物、上記のいずれかに記載のキット、又は上記のいずれかに記載のＤＮＡチップの、食道ガン患者の転移の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測するための使用である。
【００３３】
本発明の第５の態様において、配列番号１〜１０で表される塩基配列によってコードされるポリペプチドに対する２以上の抗体又はその断片を用いて、被験者由来の食道ガン細胞或いは血液中の該ポリペプチドのレベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することを含む、被験者の食道ガンの転移の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測する方法である。
【００３４】
その実施形態において、前記ポリペプチドが、配列番号２１〜２７で表されるアミノ酸配列を有する、上記の方法である。
【００３５】
また別の実施形態において、前記ポリペプチドの発現レベルが、転移のない患者由来の食道ガンと比較して変化している場合、転移が有る患者由来の食道ガンであると決定する。
【００３６】
また別の実施形態において、前記ポリペプチドの発現レベルが、転移のある患者由来の食道ガンと比較して変化している場合、転移が無い患者由来の食道ガンであると決定する、上記のいずれかに記載の方法である。
【００３７】
２．定義
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
本明細書において「転移を伴う食道ガン」とは、食道ガンが転移性のガンであることを表し、このような食道ガンはリンパ節などの他の組織に転移するか又は転移し易い性質を有している。一方、「転移を伴わない食道ガン」とは、食道ガンが非転移性のガンであることを表す。
【００３８】
本明細書中で使用されるヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質などの略号による表示は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用に従うものとする。
【００３９】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれも包含する核酸として用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。また、本明細書では、ポリヌクレオチドは核酸と互換的に使用される。
【００４０】
本明細書において「ｃＤＮＡ」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡに相補的な配列のＤＮＡ鎖全長、及びその部分配列からなるＤＮＡ断片、を包含する。ｃＤＮＡは、ＲＮＡを鋳型にして、ポリＴプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ(逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応)によって合成されうる。
【００４１】
本明細書において「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成する正鎖（又はセンス鎖）又は相補鎖（又はアンチセンス鎖）などの各１本鎖ＤＮＡを包含することを意図して用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。
【００４２】
従って、本明細書において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片のいずれも含む。また該「遺伝子」は特定の塩基配列（又は配列番号）で示される「遺伝子」だけではなく、これらによってコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、スプライスバリアントなどの変異体、及び誘導体をコードする「遺伝子」が包含される。かかる同族体、変異体又は誘導体をコードする「遺伝子」としては、具体的には、後に記載したストリンジェントな条件下で、上記の配列番号１〜１０で示されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」を挙げることができる。
【００４３】
例えばヒト由来のタンパク質の同族体（すなわち、ホモログ）又はそれをコードする遺伝子としては、当該タンパク質又はそれをコードするヒト遺伝子に対応する他生物種のタンパク質又は遺伝子が例示でき、これらのタンパク質又は遺伝子ホモログは、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ｈｏｍｏｌｏＧｅｎｅ/）により同定することができる。具体的には特定のヒトアミノ酸又は塩基配列をＢＬＡＳＴプログラム（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ.Ｓ.Ａ.、 １９９３年、第９０巻、ｐ.５８７３―５８７７、 ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ＢＬＡＳＴ/）にかけて一致する（Ｓｃｏｒｅが最も高く、Ｅ−ｖａｌｕｅが０でかつＩｄｅｎｔｉｆｙが１００％を示す）配列の登録番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）を取得することができる。ＢＬＡＳＴプログラムとしては、ＢＬＡＳＴＮ（遺伝子）、ＢＬＡＳＴＸ(タンパク質)などが知られている。例えば、遺伝子検索の場合、上記ＢＬＡＳＴ検索からの登録番号をＵｎｉＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ＵｎｉＧｅｎｅ/）に入力して得られたＵｎｉＧｅｎｅＣｌｕｓｔｅｒＩＤ（Ｈｓ．で示す番号）をＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子ホモログとして、他生物種の遺伝子を選抜することができる。またこの方法において、ＢＬＡＳＴプログラムの代わりにＦＡＳＴＡプログラム（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いてもよい。
【００４４】
なお、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンを含むことができる。
【００４５】
本明細書において「転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡ配列を鋳型にして合成されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のことをいう。ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の上流にあるプロモーターと呼ばれる部位に結合し、ＤＮＡの塩基配列に相補的になるように３'末端にリボヌクレオチドを結合させていく形でメッセンジャーＲＮＡが合成される。このメッセンジャーＲＮＡには遺伝子そのもののみならず、発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンをはじめとする転写開始点からポリＡ配列の末端にいたるまでの全配列が含まれる。
【００４６】
本明細書において「翻訳産物」とは、転写によって合成されたメッセンジャーＲＮＡが,スプライシングなどの修飾を受ける/受けないにかかわらず、その情報を元に合成されたタンパク質を示す。メッセンジャーＲＮＡの翻訳過程においては、まずリボソームとメッセンジャーＲＮＡが結合し、次にメッセンジャーＲＮＡの塩基配列に従ってアミノ酸がつながっていき、タンパク質が合成される。
【００４７】
本明細書において「プローブ」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するために使用されるポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。
【００４８】
本明細書において「プライマー」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し、増幅する、連続するポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。
【００４９】
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、配列番号によって定義される塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、又はその部分配列（ここでは便宜上、これを正鎖と呼ぶ）に対してＡ：Ｔ（Ｕ）、Ｇ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味する。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度の相補関係を有するものであってもよい。
【００５０】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、プローブが他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えばバックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、ハイブリダイゼーションが行われる環境によって異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。
【００５１】
本明細書において「変異体」とは、核酸の場合、多型性、突然変異、転写時の選択的スプライシングなどに起因した天然の変異体、或いは遺伝暗号の縮重に基づく変異体、或いは配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその部分配列において１以上、好ましくは１もしくは数個、の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、或いは該塩基配列又はその部分配列と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体、或いは該塩基配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと上記定義のストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を意味し、一方、タンパク質又はペプチドの場合、配列番号２１〜２７で表されるアミノ酸配列又はその部分配列おいて１以上、好ましくは１もしくは数個、のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、或いは該アミノ酸配列又はその部分配列と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体を意味する。
【００５２】
本明細書において「数個」とは、約１０、９、８、７、６、５、４、３又は２個の整数を意味する。
【００５３】
本明細書において「％同一性」は、上記のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質又は遺伝子の検索システムを用いて、ギャップを導入して、又はギャップを導入しないで、決定することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第９０巻、ｐ.５８７３-５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻、ｐ.２４４４-２４４８）。％同一性は、簡単に言えば、２つの塩基配列又はアミノ酸配列を、ギャップを導入してか又はギャップを導入しないで整列したときの、塩基又はアミノ酸の総数に対する同一の塩基又はアミノ酸の数の割合（％）をいう。
【００５４】
本明細書において「誘導体」とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド(例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体など、一方、タンパク質の場合、アセチル化、アシル化、アルキル化、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、ビオチン化などの化学修飾誘導体を意味する。
【００５５】
本明細書において「診断（又は検出又は判定）用組成物」とは、食道ガンの罹患の有無、罹患の程度もしくは改善の有無や改善の程度を診断するために、また食道ガンの予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接又は間接的に利用されるものをいう。これには食道ガンの罹患に関連して生体内、特に食道組織において発現が変動する遺伝子を特異的に認識し、また結合することのできるヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、及び該遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を検出することができる抗体が包含される。これらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、上記性質に基づいて生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子を検出するためのプローブとして、また生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００５６】
本明細書において検出・診断対象となる「生体組織」とは、食道ガンの発生にともない本発明の遺伝子が発現変化する組織を指す。具体的には食道組織及びその周辺のリンパ節、また転移が疑われる他臓器などを指す。
【００５７】
本明細書で使用される「ＳＨＣ１遺伝子」又は「ＳＨＣ１」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号１）で示されるＳＨＣ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号１に記載のＳＨＣ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００３０２９）やその他生物種ホモログなどが包含される。ＳＨＣ１遺伝子はＰｅｌｉｃｃｉ，Ｇら、１９９２年、Ｃｅｌｌ、第７０巻、ｐ.９３―１０４に記載される方法によって得ることができる。
【００５８】
本明細書で使用される「Ｃ１Ｒ遺伝子」又は「Ｃ１Ｒ」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号２）で示されるｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ １， ｒ ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号２に記載のＣ１Ｒ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＭ＿００１７３３）やその他生物種ホモログなどが包含される。Ｃ１Ｒ遺伝子は、Ｃｏｈｅｎ−Ｈａｇｕｅｎａｕｅｒ， Ｏ．ら、１９８６年、（Ａｂｓｔｒａｃｔ）７ｔｈ Ｉｎｔ. ＣＯＮＧ. ＨＵＭ. Ｇｅｎｅｔ. Ｂｅｒｌｉｎ ６１７ ｏｎｌｙに記載される方法によって得ることができる。
【００５９】
本明細書で使用される「ＬＡＭＡ５遺伝子」又は「ＬＡＭＡ５」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号３）で示されるＬａｍｉｎｉｎ ａｌｐｈａ−５ｃｈａｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号３に記載のＬＡＭＡ５遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００５５６０）やその他生物種ホモログなどが包含される。ＬＡＭＡ５遺伝子はＤｕｒｋｉｎ，Ｍ．Ｅ．ら１９８６年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． 第７０巻、ｐ.２９６−３００に記載される方法によって得ることができる。
【００６０】
本明細書で使用される「ＰＧＡＭ１遺伝子」又は「ＰＧＡＭ１」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号４）で示されるＰｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ １遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号４に記載のＰＧＡＭ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００２６２９）やその他生物種ホモログなどが包含される。ＰＧＡＭ１遺伝子はＳａｋｏｄａ， Ｓ．ら、１９８８年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２６３巻、ｐ.１６８９９−１６９０５に記載される方法によって得ることができる。
【００６１】
本明細書で使用される「ＺＮＦ７０８遺伝子」又は「ＺＮＦ７０８」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号５）で示される７１ ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号５に記載のＺＮＦ７０８遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２１２６９）やその他生物種ホモログなどが包含される。ＺＮＦ７０８遺伝子はＴｈｉｅｓｅｎ，Ｈ．Ｊ．ら、１９９０年、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、第２巻、ｐ.３６３−３７４に記載される方法によって得ることができる。
【００６２】
本明細書で使用される「ＹＷＨＡＱ遺伝子」又は「ＹＷＨＡＱ」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号６）で示される１４−３−３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｕ遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号６に記載のＹＷＨＡＱ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００６８２６）やその他生物種ホモログなどが包含される。ＹＷＨＡＱ遺伝子はＮｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｊ．、１９９１年、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ、第１０８８巻、ｐ. ４２５−４２８に記載される方法によって得ることができる。
【００６３】
本明細書で使用される「ＡＣ００４６０９遺伝子」又は「ＡＣ００４６０９」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号７）で示されるＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １９, ｃｏｓｍｉｄ Ｆ１６９１２と称される遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号７に記載のＡＣ００４６０９遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＣ００４６０９）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【００６４】
本明細書で使用される「ＺＮＦ７１４遺伝子」又は「ＺＮＦ７１４遺伝子」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号８）で示されるｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ７１４遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号８に記載のＺＮＦ７１４遺伝子遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿１８２５１５）やその他生物種ホモログなどが包含される。ＺＮＦ７１４遺伝子はＯｈ，Ｊ．Ｈ．ら、２００５年、Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅ、第１６巻、ｐ.９４２−９５４に記載される方法によって得ることができる。
【００６５】
本明細書で使用される「ＬＯＣ１５２６６７遺伝子」又は「ＬＯＣ１５２６６７」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号９）で示されるＬＯＣ１５２６６７ ＮＩＰ３０−ｌｉｋｅ 遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号９に記載のＬＯＣ１５２６６７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＲ＿００２２２８）やその他生物種ホモログなどが包含される。ＬＯＣ１５２６６７遺伝子はＭａｒｑｕｅｓ，Ａ．Ｃ．ら、２００５年、ＰＬｏＳ ｂｉｏｌｏｇｙ、第２３巻、ｐ.Ｅ３５７に記載される方法によって得ることができる。
【００６６】
本明細書で使用される「ＺＮＦ７１６遺伝子」又は「ＺＮＦ７１６」という用語は、配列番号で指定しない限り、特定塩基配列（配列番号１０）で示されるｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ７１６遺伝子（ＤＮＡ）、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する。具体的には、配列番号１０に記載のＺＮＦ７１６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＫ１３１５７５）やその他生物種ホモログなどが包含される。
【発明の効果】
【００６７】
本発明は、食道ガン転移の診断及び治療に有用な疾患判定用組成物及び該組成物を用いた食道転移ガンの判定（又は検出）方法を提供するものであり、これによって、食道ガンの転移に対して特異的かつ高予測率の、及び迅速でかつ簡便な、判定方法を提供するという格別の作用効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
以下に本発明をさらに具体的に説明する
１．食道ガン転移の標的核酸
本発明において、上記定義の食道ガン転移診断用組成物及びキットを使用して食道ガン転移の存在及び/又は不存在、或いは食道ガン転移の可能性の有無、を予測又は判定するための食道ガン転移のマーカーとしての標的核酸には、例えば、配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むヒト遺伝子（すなわち、それぞれ、ＳＨＣ１、Ｃ１Ｒ、ＬＡＭＡ５、ＰＧＡＭ１、ＺＮＦ７０８、ＹＷＨＡＱ、ＡＣ００４６０９、ＺＮＦ７１４、ＬＯＣ１５２６６７、ＺＮＦ７１６）、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体が含まれる。ここで、遺伝子、同族体、転写産物、ｃＤＮＡ、変異体及び誘導体は、上記定義のとおりである。好ましい標的核酸は、配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むヒト遺伝子、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、より好ましくは該転写産物又はｃＤＮＡである。
【００６９】
本発明において食道ガン転移の標的となる上記遺伝子はいずれも、手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン組織に比較して、手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン組織において発現レベルが有意に増加しているか、或いは低下しているものである（後述の実施例の表１参照）。
【００７０】
第１の標的核酸は、ＳＨＣ１遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。ＳＨＣ１遺伝子は国際公開第２００７/０８４１５６パンフレットにおいて消化器ガンの進展に影響を与えることが示されている。
【００７１】
第２の標的核酸は、Ｃ１Ｒ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＣ１Ｒ遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７２】
第３の標的核酸は、ＬＡＭＡ５遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＬＡＭＡ５遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７３】
第４の標的核酸は、ＰＧＡＭ１遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＰＧＡＭ１遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７４】
第５の標的核酸は、ＺＮＦ７０８遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＺＮＦ７０８遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７５】
第６の標的核酸は、ＹＷＨＡＱ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＹＷＨＡＱ遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７６】
第７の標的核酸は、ＡＣ００４６０９遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＡＣ００４６０９遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７７】
第８の標的核酸は、ＺＮＦ７１４遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＺＮＦ７１４遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７８】
第９の標的核酸は、ＬＯＣ１５２６６７遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＬＯＣ１５２６６７遺伝子又はその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７９】
第１０の標的核酸は、ＺＮＦ７１６遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにＺＮＦ７１６遺伝子及びその転写産物の発現の減少が食道ガンのマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００８０】
２．食道ガン転移の標的ポリペプチド
本発明において、上記定義の食道ガン転移診断用組成物及びキットを使用して食道ガン転移の存在及び/又は不存在を判定するための食道ガン転移のマーカーとしての標的ポリペプチドには、例えば、配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むヒト遺伝子（すなわち、それぞれ、ＳＨＣ１、Ｃ１Ｒ、ＬＡＭＡ５、ＰＧＡＭ１、ＺＮＦ７０８、ＹＷＨＡＱ、ＡＣ００４６０９、ＺＮＦ７１４、ＬＯＣ１５２６６７、ＺＮＦ７１６遺伝子）によってコードされるポリペプチド、例えば、配列番号２１〜２７で表されるアミノ酸配列を含むヒトポリペプチド、それらの同族体、或いはそれらの変異体又は誘導体が含まれる。ここで、ポリペプチド、同族体、変異体及び誘導体は、上記定義のとおりである。好ましい標的ポリペプチドは、配列番号２１〜２７で表されるアミノ酸配列を含むヒトポリペプチドである。
【００８１】
本発明において食道ガン転移の標的となる上記ポリペプチドはいずれも、対応する遺伝子及びその転写産物の発現量と同様に、手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン組織に比較して、手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン組織において発現レベルが有意に増加しているか、又は低下しているものであること、或いは血液中の該ポリペプチドのレベルが手術時にリンパ節転移がなかった被験者と比べて手術時にリンパ節転移があった被験者において有意に増加しているか、又は低下することによって特徴付けられる。
【００８２】
３．食道ガン転移診断用組成物
３．１ 核酸
本発明において、食道ガン又は食道ガン転移の存在及び/又は不存在を判定又は検出するための、或いは食道ガン転移（又は転移の可能性）の有無を判定又は予測するために使用可能な核酸組成物は、食道ガン転移の標的核酸としての、ヒト由来のＳＨＣ１、Ｃ１Ｒ、ＬＡＭＡ５、ＰＧＡＭ１、ＺＮＦ７０８、ＹＷＨＡＱ、ＡＣ００４６０９、ＺＮＦ７１４、ＬＯＣ１５２６６７、ＺＮＦ７１６遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物又はｃＤＮＡ、或いはそれらの変異体又は誘導体の存在、発現レベル又は存在量を定性的及び/又は定量的に測定することを可能にする。
【００８３】
上記の標的核酸は、手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン組織に比較して、手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン組織においてその発現レベルが有意に増加するか、或いは低下する。それゆえ、本発明の組成物は、手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン組織と手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン組織について標的核酸の発現レベルを測定し、それらを比較するために有効に使用することができる。
【００８４】
本発明で使用可能な組成物は、食道ガンに罹患した患者の生体組織において配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド群、該塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でそれぞれハイブリダイズするポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド群、ならびにそれらのポリヌクレオチド群の塩基配列において１５以上、好ましくは２０〜３０又はそれ以上、より好ましくは４０〜５０又はそれ以上、さらに好ましくは６０以上、の連続した塩基を含むポリヌクレオチド群から選ばれた、２以上、好ましくは３以上、より好ましくは６以上のポリヌクレオチドの組み合わせを含む。ポリヌクレオチドの組み合わせは、互いに異なる遺伝子に由来するポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
【００８５】
具体的には、本発明の組成物は、以下の２以上のポリヌクレオチド又はその断片を含むことができる。
（１）配列番号１〜１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（２）配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
（３）配列番号１〜１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（４）配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
（５）配列番号１〜１０で表される塩基配列の各々と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド群、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
【００８６】
上記（１）〜(５)のポリヌクレオチドの断片は、各ポリヌクレオチドの塩基配列において、例えば、連続する１５〜配列の全塩基数、１５〜５０００塩基、１５〜４５００塩基、１５〜４０００塩基、１５〜３５００塩基、１５〜３０００塩基、１５〜２５００塩基、１５〜２０００塩基、１５〜１５００塩基、１５〜１０００塩基、１５〜９００塩基、１５〜８００塩基、１５〜７００塩基、１５〜６００塩基、１５〜５００塩基、１５〜４００塩基、１５〜３００塩基、１５〜２５０塩基、１５〜２００塩基、１５〜１５０塩基、１５〜１４０塩基、１５〜１３０塩基、１５〜１２０塩基、１５〜１１０塩基、１５〜１００塩基、１５〜９０塩基、１５〜８０塩基、１５〜７０塩基、１５〜６０塩基、１５〜５０塩基、１５〜４０塩基、１５〜３０塩基又は１５〜２５塩基；２５〜配列の全塩基数、２５〜１０００塩基、２５〜９００塩基、２５〜８００塩基、２５〜７００塩基、２５〜６００塩基、２５〜５００塩基、２５〜４００塩基、２５〜３００塩基、２５〜２５０塩基、２５〜２００塩基、２５〜１５０塩基、２５〜１４０塩基、２５〜１３０塩基、２５〜１２０塩基、２５〜１１０塩基、２５〜１００塩基、２５〜９０塩基、２５〜８０塩基、２５〜７０塩基、２５〜６０塩基、２５〜５０塩基又は２５〜４０塩基；５０〜配列の全塩基数、５０〜１０００塩基、５０〜９００塩基、５０〜８００塩基、５０〜７００塩基、５０〜６００塩基、５０〜５００塩基、５０〜４００塩基、５０〜３００塩基、５０〜２５０塩基、５０〜２００塩基、５０〜１５０塩基、５０〜１４０塩基、５０〜１３０塩基、５０〜１２０塩基、５０〜１１０塩基、５０〜１００塩基、５０〜９０塩基、５０〜８０塩基、５０〜７０塩基又は５０〜６０塩基；６０〜配列の全塩基数、６０〜１０００塩基、６０〜９００塩基、６０〜８００塩基、６０〜７００塩基、６０〜６００塩基、６０〜５００塩基、６０〜４００塩基、６０〜３００塩基、６０〜２５０塩基、６０〜２００塩基、６０〜１５０塩基、６０〜１４０塩基、６０〜１３０塩基、６０〜１２０塩基、６０〜１１０塩基、６０〜１００塩基、６０〜９０塩基、６０〜８０塩基又は６０〜７０塩基などの範囲の塩基数を含むことができるが、これらに限定されないものとする。
【００８７】
本発明の実施形態により、配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドの断片はそれぞれ、配列番号１１〜２０で表される塩基配列又はその相補的配列、或いはそれらの連続する１５塩基以上の部分配列、を含むことが好ましい。
【００８８】
本発明の組成物には、例えば以下のポリヌクレオチドが包含される。
(１)配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその相補的配列の各々において、１５以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(２)配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその相補的配列の各々において、６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(３)配列番号１〜１０で表される塩基配列において、それぞれ配列番号１１〜２０で表される塩基配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(４)配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な配列において、それぞれ配列番号１１〜２０で表される塩基配列に相補的な配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
【００８９】
本発明で使用される上記ポリヌクレオチド類又はその断片類はいずれもＤＮＡでもよいしＲＮＡでもよい。
【００９０】
本発明の組成物としてのポリヌクレオチドは、ＤＮＡ組換え技術、ＰＣＲ法、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機による方法などの一般的な技術を用いて作製することができる。
【００９１】
ＤＮＡ組換え技術及びＰＣＲ法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＵＳ （１９９３）； Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＵＳ （１９８９）などに記載される技術を使用することができる。
【００９２】
ヒト由来の、ＳＨＣ１、Ｃ１Ｒ、ＬＡＭＡ５、ＰＧＡＭ１、ＺＮＦ７０８、ＹＷＨＡＱ、ＡＣ００４６０９、ＺＮＦ７１４、ＬＯＣ１５２６６７、ＺＮＦ７１６遺伝子は公知であり、前述のようにその取得方法も知られている。このため、これらの遺伝子をクローニングすることによって、本発明の組成物としてのポリヌクレオチドを作製することができる。
【００９３】
本発明の組成物を構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ自動合成装置を用いて化学的に合成することができる。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この方法によって約１００塩基までの一本鎖ＤＮＡを自動合成することができる。ＤＮＡ自動合成装置は、例えばＰｏｌｙｇｅｎ社、ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社などから市販されている。
【００９４】
或いは、本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡクローニング法によって作製することもできる。本発明において標的である上記遺伝子が発現される食道組織などの生体組織から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラムで処理して得られるポリＡ（＋）ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法によってｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーからハイブリダイゼーションスクリーニング、発現スクリーニング、抗体スクリーニングなどのスクリーニングによって目的のｃＤＮＡクローンを得ることができる。必要に応じて、ｃＤＮＡクローンをＰＣＲ法によって増幅することもできる。プローブ又はプライマーは、配列番号１〜２０に示される塩基配列に基づいて１５〜１００塩基の連続する配列の中から選択し、合成しうる。ｃＤＮＡクローニング技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．& Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ． 著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の 第１巻７．４２〜７．４５、第２巻８．９〜８．１７に記載されている。
【００９５】
３．２ 抗体
本発明はさらに、配列番号１〜１０で表される塩基配列によってコードされるポリペプチド、例えば配列番号２１〜２７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、に対する２以上の抗体、その断片、又はそれらの化学修飾誘導体を含む、食道ガン転移の判定、検出、診断又は予測のための組成物を提供する。
【００９６】
すなわち、本発明により、食道ガン転移マーカーとしての、上記ＳＨＣ１、Ｃ１Ｒ、ＬＡＭＡ５、ＰＧＡＭ１、ＺＮＦ７０８、ＹＷＨＡＱ、ＡＣ００４６０９、ＺＮＦ７１４、ＬＯＣ１５２６６７、ＺＮＦ７１６遺伝子によってコードされるポリペプチド、それらの同族体、或いはそれらの変異体又は誘導体を検出するために、これらのポリペプチドに対する抗体を２以上、好ましくは３以上、より好ましくは６以上組み合わせて用いることができる。
【００９７】
これらのポリペプチドは、ＤＮＡ組換え技術によって得ることができる。例えば、上記のようにして得られたｃＤＮＡクローンを発現ベクターに組み込み、該ベクターによって形質転換又はトランスフェクションされた原核又は真核宿主細胞を培養することによって該細胞又は培養上清から得ることができる。ベクター及び発現系はＮｏｖａｇｅｎ社、宝酒造、第一化学薬品、Ｑｉａｇｅｎ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社などから入手可能である。宿主細胞としては、細菌などの原核細胞（例えば大腸菌、枯草菌）、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシアエ）、昆虫細胞（例えばSf細胞）、哺乳動物細胞（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ）などを用いることができる。ベクターには、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの他に、調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、複製開始点、ターミネーター、選択マーカーなどを含むことができる。またポリペプチドの精製を容易にするために標識ペプチドをポリペプチドのＣ末端又はＮ末端につけた融合ポリペプチドとしてもよい。代表的な標識ペプチドには、６〜１０残基のヒスチジンリピート、ＦＬＡＧ、ｍｙｃぺプチド、ＧＦＰポリペプチドなどが挙げられるが、標識ペプチドはこれらにかぎられるものではない。またＤＮＡ組換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． & Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ．（上記）に記載されている。
【００９８】
標識ペプチドを付けずに本発明に係るポリペプチドを生産した場合には、その精製法として例えばイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。またこれに加えて、ゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法でもよい。一方、当該タンパクにヒスチジンリピート、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ＧＦＰといった標識ペプチドを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれの標識ペプチドに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。単離・精製が容易となるような発現ベクターを構築するとよい。特にポリペプチドと標識ペプチドとの融合ポリペプチドの形態で発現するように発現ベクターを構築し、遺伝子工学的に当該ポリペプチドを調製すれば、単離・精製も容易である。
【００９９】
このようにして得られたポリペプチドを認識する抗体は、抗体の抗原結合部位を介して、該ポリペプチドに特異的に結合し得る。具体的には、配列番号２１〜２７のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその断片、その変異体ポリペプチド又は融合ポリペプチドなどを、それぞれに免疫反応性である抗体を産生するための免疫原として使用することが可能である。
【０１００】
より具体的には、ポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチドなどは、抗体形成を引き出す抗原決定基又はエピトープを含むが、これら抗原決定基又はエピトープは、直鎖でもよいし、より高次構造（断続的）でもよい。なお、該抗原決定基又はエピトープは、当該技術分野に知られるあらゆる方法によって同定できる。
【０１０１】
本発明のポリペプチドによってあらゆる態様の抗体が誘導される。該ポリペプチドの全部若しくは一部又はエピトープが単離されていれば、慣用的技術を用いてポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも調製可能である。方法には例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅ ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０に挙げられた方法がある。
【０１０２】
本発明の抗体としては、本発明の標的ポリペプチド又はその断片と特異的に結合するものであれば特に限定されず、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも使用することができるが、モノクローナル抗体を使用するのが好ましい。また、本発明の抗体のグロブリンタイプは、上記特徴を有するものである限り特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。
【０１０３】
＜モノクローナル抗体の作製＞
（１）免疫及び抗体産生細胞の採取
標的ポリペプチドからなる免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢａｌｂ／ｃ）、ウサギなどに投与する。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０〜２００μｇとされる。免疫は主として皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で、２〜１０回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法などにより繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原を静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２〜５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
【０１０４】
（２）細胞融合
各標的ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を作製する。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生し、そして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を本発明のタンパク質で免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。抗体産生細胞と融合させる骨髄腫細胞株としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。骨髄腫細胞株の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）などが挙げられる。
【０１０５】
次に、上記骨髄腫細胞株と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを約１：１〜 ２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１５００〜４０００ダルトンのポリエチレングリコール等を約１０〜８０％の濃度で使用することができる。また場合によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合させることもできる。
【０１０６】
（３）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に２００万個/ウエル程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、２０〜４０℃ 、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はチミジンキナーゼ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞と骨髄腫細胞株のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【０１０７】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採取し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ、及びＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）等によって行うことができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。本発明のハイブリドーマは、後述するように、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ等の基本培地中での培養において安定であり、標的ポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生、分泌するものである。
【０１０８】
（４）抗体の回収
モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。すなわち樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で２〜１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１０００万個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水又は血清を採取する。
【０１０９】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製されたモノクローナル抗体を得ることができる。
【０１１０】
＜ポリクローナル抗体の作製＞
ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様にウサギ等の動物を免疫し、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＩＡ及びＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。ポリクローナル抗体はさらに、精製ポリペプチドを結合した親和性カラムに結合させることを含む、いわゆる吸収法によって、特異的抗体として調製することができる。
【０１１１】
本発明で使用可能な抗体又は断片は、上記のポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の他に、合成抗体、組換え抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、単鎖抗体（単鎖ダイアボディ、ｓｃＦｖなどを含む）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片などを含むことができる。
【０１１２】
本発明で使用される抗体は、組成物の他にキットの形態をとることができる。キットに含まれる抗体は、個別に又は混合物の形態で存在しうるし、或いは固相担体に結合されていてもよいし又は遊離の形態でもよい。さらに、そのようなキットは、標識二次抗体、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、精製された標準物質としてのマーカー(標的)ポリペプチド、使用説明書、等を含むことができる。
【０１１３】
４．食道ガン転移診断用キット
本発明はまた、本発明の組成物に含まれるものと同じポリヌクレオチド、その変異体及び/又はその断片の１つ又は複数を含む食道ガン診断（検出）用キットを提供する。
【０１１４】
本発明のキットは、好ましくは、上記３．１に記載したポリヌクレオチド類から選択される２以上、好ましくは３以上、より好ましくは６以上のポリヌクレオチド又はその断片を含む。
【０１１５】
本発明のキットは、配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、その相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチドの断片を少なくとも２つ含むことができる。
【０１１６】
本発明のキットに含むことができるポリヌクレオチド断片は、例えば下記の（１）〜（５）からなる群より選択される２以上のＤＮＡである：
（１）配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその相補的配列において、１５以上の連続した塩基を含むＤＮＡ。
（２）配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその相補的配列において、６０以上の連続した塩基を含むＤＮＡ。
（３）配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその相補的配列において、それぞれ配列番号１１〜２０で表される塩基配列又はその相補的配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むＤＮＡ。
（４）配列番号１１〜２０で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（５）配列番号１１〜２０で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むＤＮＡ。
【０１１７】
好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの１５以上の連続した塩基を含む断片である。
【０１１８】
好ましい実施形態では、前記断片は、１５以上、好ましくは２０〜３０又はそれ以上、より好ましくは４０〜５０又はそれ以上、さらに好ましくは６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチドであることができる。
【０１１９】
別の好ましい実施形態では、前記断片が、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列において、それぞれ配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【０１２０】
別の好ましい実施形態では、前記断片が、配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【０１２１】
別の好ましい実施形態では、前記断片が、配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【０１２２】
別の好ましい実施形態では、前記断片が、配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【０１２３】
上記の組み合わせの具体例は、配列番号１及び２の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜３の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜４の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜５の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜６の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜７の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜８の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜９の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１〜１０の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はその断片である。
【０１２４】
また、別の組み合わせの具体例は、配列番号２及び３の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜４の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜５の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜５の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜６の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜７の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜８の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜９の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号２〜１０の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はその断片である。
【０１２５】
別のより好ましい実施形態によれば、本発明のキットは、配列番号１１〜２０で表される塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチドの２以上〜全部を含むことができる。
【０１２６】
例えば、そのような組み合わせの例は、配列番号１２及び１３の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜１４の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜１５の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜１５の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜１６の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜１７の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜１８の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜１９の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片、配列番号１２〜２０の塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はその断片である。
【０１２７】
ポリヌクレオチド又はその断片１個での食道ガン判別確率が６０数％に過ぎないが、異なる遺伝子由来のポリヌクレオチド又はその断片２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは６個以上、を組み合わせると８０％超から９０数％まで確率が向上する。
【０１２８】
本発明において、ポリヌクレオチドの断片のサイズは、各ポリヌクレオチドの塩基配列において、例えば、連続する１５〜配列の全塩基数、１５〜５０００塩基、１５〜４５００塩基、１５〜４０００塩基、１５〜３５００塩基、１５〜３０００塩基、１５〜２５００塩基、１５〜２０００塩基、１５〜１５００塩基、１５〜１０００塩基、１５〜９００塩基、１５〜８００塩基、１５〜７００塩基、１５〜６００塩基、１５〜５００塩基、１５〜４００塩基、１５〜３００塩基、１５〜２５０塩基、１５〜２００塩基、１５〜１５０塩基、１５〜１４０塩基、１５〜１３０塩基、１５〜１２０塩基、１５〜１１０塩基、１５〜１００塩基、１５〜９０塩基、１５〜８０塩基、１５〜７０塩基、１５〜６０塩基、１５〜５０塩基、１５〜４０塩基、１５〜３０塩基又は１５〜２５塩基；２５〜配列の全塩基数、２５〜１０００塩基、２５〜９００塩基、２５〜８００塩基、２５〜７００塩基、２５〜６００塩基、２５〜５００塩基、２５〜４００塩基、２５〜３００塩基、２５〜２５０塩基、２５〜２００塩基、２５〜１５０塩基、２５〜１４０塩基、２５〜１３０塩基、２５〜１２０塩基、２５〜１１０塩基、２５〜１００塩基、２５〜９０塩基、２５〜８０塩基、２５〜７０塩基、２５〜６０塩基、２５〜５０塩基又は２５〜４０塩基；５０〜配列の全塩基数、５０〜１０００塩基、５０〜９００塩基、５０〜８００塩基、５０〜７００塩基、５０〜６００塩基、５０〜５００塩基、５０〜４００塩基、５０〜３００塩基、５０〜２５０塩基、５０〜２００塩基、５０〜１５０塩基、５０〜１４０塩基、５０〜１３０塩基、５０〜１２０塩基、５０〜１１０塩基、５０〜１００塩基、５０〜９０塩基、５０〜８０塩基、５０〜７０塩基又は５０〜６０塩基；６０〜配列の全塩基数、６０〜１０００塩基、６０〜９００塩基、６０〜８００塩基、６０〜７００塩基、６０〜６００塩基、６０〜５００塩基、６０〜４００塩基、６０〜３００塩基、６０〜２５０塩基、６０〜２００塩基、６０〜１５０塩基、６０〜１４０塩基、６０〜１３０塩基、６０〜１２０塩基、６０〜１１０塩基、６０〜１００塩基、６０〜９０塩基、６０〜８０塩基又は６０〜７０塩基などの範囲の塩基数である。
【０１２９】
本発明のキットを構成する上記の組み合わせは、あくまでも例示であり、他の種々の可能な組み合わせのすべてが本発明に包含されるものとする。
【０１３０】
本発明のキットには、上で説明した本発明におけるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片に加えて、食道ガンの検出を可能とする既知の又は将来見出されるポリヌクレオチドも包含させることができる。
【０１３１】
本発明のキットに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片は、個別に又は任意に組み合わせて異なる容器に包装される。
【０１３２】
５．ＤＮＡチップ
本発明はさらに、本発明の組成物及び/又はキットに含まれるものと同じポリヌクレオチド(或いは、上記の３．１節の組成物及び/又は４節のキットに記載されたポリヌクレオチド)、変異体、断片及びそれらの組み合わせを含む食道ガン転移診断用ＤＮＡチップを提供する。
【０１３３】
ＤＮＡチップの基板としては、ＤＮＡを固相化できるものであれば特に制限はなく、スライドガラス、シリコン製チップ、ポリマー製チップ及びナイロンメンブレンなどを例示することができる。またこれらの基板にはポリＬ−リジンコートやアミノ基、カルボキシル基などの官能基導入などの表面処理がされていてもよい。
【０１３４】
また固相化法については一般に用いられる方法であれば特に制限はなく、スポッター又はアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いてＤＮＡをスポットする方法や、ノズルより微少な液滴を圧電素子などにより噴射する装置（インクジェット）を用いてＤＮＡを基板に吹き付ける方法、又は基板上で順次ヌクレオチド合成を行う方法を例示することができる。高密度分注機を用いる場合には、例えば多数のウエルを持つプレートのおのおののウエルに異なった遺伝子溶液を入れておき、この溶液をピン（針）で取り上げて基板上に順番にスポットすることによる。インクジェット法では、ノズルより遺伝子を噴射し、基板上に高速度で遺伝子を整列配置することによる。基板上でのＤＮＡ合成は、基板上に結合した塩基を光によって脱離する官能基で保護し、マスクを用いることにより特定部位の塩基だけに光を当て、官能基を脱離させる。その後、塩基を反応液に加えて、基板上の塩基とカップリングさせる工程を繰り返すことによって行われる。
【０１３５】
固相化されるポリヌクレオチドは、上記で説明した本発明の全てのポリヌクレオチドである。
【０１３６】
例えば、そのようなポリヌクレオチドは、以下の（１）〜（１２）のポリヌクレオチド及びその断片のうち異なる遺伝子由来の２以上、好ましくは３以上、より好ましくは６以上のポリヌクレオチド又はその断片を含むことができる。
（１）配列番号１〜１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（２）配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
（３）配列番号１〜１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（４）配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド群、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（５）配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（６）配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
（７）配列番号１〜１０で表される塩基配列の各々と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド群、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（８）配列番号１〜１０で表される塩基配列の各々からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド群、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
(９)配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその相補的配列の各々において、１５以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(１０)配列番号１〜１０で表される塩基配列又はその相補的配列の各々において、６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(１１)配列番号１〜１０で表される塩基配列において、それぞれ配列番号１１〜２０で表される塩基配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(１２)配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な配列において、それぞれ配列番号１１〜２０で表される塩基配列に相補的な配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
【０１３７】
好ましい実施形態によれば、本発明のＤＮＡチップは、配列番号１１〜２０で表される塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチドの２以上から全部を含むことができる。
【０１３８】
本発明において、固相化されるポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡのいずれでもよいし、或いは１本鎖でもよいし又は２本鎖でもよい。
【０１３９】
標的遺伝子、ＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現レベルを検出、測定することができるＤＮＡチップの例としては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＷｈｏｌｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｏｌｉｇｏ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ、タカラバイオ社のＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ（登録商標）ＨＳ Ｈｕｍａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＣＨＩＰなどを挙げることができる。
【０１４０】
ＤＮＡマイクロアレイの作製について、例えば予め調製したプローブを固相表面に固定化する方法を使用することができる。予め調製したポリヌクレオチドプローブを固相表面に固定化する方法では、官能基を導入したポリヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Ｊ．Ｂ．Ｌａｍｔｕｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第２２巻、ｐ．２１２１−２１２５、Ｚ．Ｇｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第２２巻、ｐ．５４５６−５４６５）。ポリヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサ-やクロスリンカーを介して共有結合される。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成ポリヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Ｇ．Ｙｅｒｓｈｏｖら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９６年、第９４巻、ｐ．４９１３）。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化ポリクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Ｒ．Ｇ．Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９７年、第９４巻、ｐ．１１１９−１１２３）。
【０１４１】
６．食道ガン転移の検出法
６．１ 核酸
本発明は、本発明の組成物、キット、ＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、被験者由来の検体試料中にすでに転移を起こした食道ガン細胞が含まれるかどうかをｉｎ ｖｉｔｒｏで判定する方法であって、手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン組織に比較して、該検体試料中の細胞の標的核酸の発現量が増加しているか又は低下している場合、該検体試料中にすでに転移がある食道ガン細胞が存在すると判定することを含み、ここで、該標的核酸が該組成物、キット又はＤＮＡチップに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片によって検出可能なものである、方法を提供する。
【０１４２】
本発明はまた、本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップの、被験者由来の検体試料中の食道ガン転移のｉｎ ｖｉｖｏ検出のための使用を提供する。
【０１４３】
本発明の上記方法において、組成物、キット又はＤＮＡチップは、上で説明したような、本発明のポリヌクレオチド、その変異体又はその断片を単一で或いはあらゆる可能な組み合わせで含むものが使用される。
【０１４４】
本発明の食道ガン転移の検出、判定又は（遺伝子）診断において、本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片は、プライマーとして又はプローブとして用いることができる。プライマーとして用いる場合には、通常１５〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基の塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、例えば１５塩基〜全配列の塩基数、好ましくは２５〜１０００塩基、より好ましくは２５〜１００塩基の塩基長を有するものが例示できるが、この範囲に限定されない。
【０１４５】
本発明の組成物又はキットに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片は、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法などの、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、定法に従ってプライマー又はプローブとして利用することができる。測定対象試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験者の食道組織又は食道ガン細胞の存在が疑われる生体組織の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって摘出した生体組織から回収する。さらにそこから常法に従って調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてもよいし、さらに該ＲＮＡをもとにして調製される、ｃＤＮＡ、ポリＡ（＋）ＲＮＡを含む各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【０１４６】
或いは、生体組織における本発明の遺伝子、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどの核酸の発現量は、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマクロアレイを含む）を用いて検出或いは定量することができる。この場合、本発明の組成物又はキットはＤＮＡアレイのプローブとして使用することができる（例えば、アフィメトリックス社のＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙでは２５塩基の長さのポリヌクレオチドプローブが用いられる。また、東レ株式会社の３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標） Ｈｕｍａｎ Ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ ２５ｋでは６９〜７０塩基の長さのポリヌクレオチドプローブが用いられる。）。かかるＤＮＡアレイを生体組織から採取したＲＮＡをもとに調製される標識ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズによって形成された上記プローブと標識ＤＮＡ又はＲＮＡとの複合体を、該標識ＤＮＡ又はＲＮＡの標識を指標として検出することにより、生体組織中での本発明食道ガン転移関連遺伝子の発現の有無又は発現レベル（発現量）を評価することができる。本発明の方法では、ＤＮＡチップを好ましく使用できるが、これは、ひとつの生体試料について同時に複数遺伝子の発現の有無又は発現レベルの評価が可能である。
【０１４７】
本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップは、食道ガン転移の診断、判定又は検出（罹患の有無や罹患の程度の診断）のために有用である。具体的には、該組成物、キット又はＤＮＡチップを使用した食道ガン転移の診断は、被験者の食道ガン細胞の存在する生体組織と、手術時にリンパ節転移がなかった患者由来の食道ガン組織及び／又は手術時にリンパ節転移があった患者由来の食道ガン組織との比較、或いは、手術時にリンパ節転移がなかった患者及び／又は手術時にリンパ節転移があった患者の同等の生体組織との比較を行い、該診断用組成物で検出される遺伝子の発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。この場合、遺伝子発現レベルの違いには、発現の有無だけではなく、転移がある食道ガン細胞の存在する生体組織と転移がない食道ガン細胞の存在する生体組織の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発現量を比較した時の差が検定上有意（ｐ値＜０．０５）である場合が含まれる。例えばＳＨＣ１遺伝子は転移のある食道ガンで発現誘導を示すので、被験者の食道ガン組織では発現しており、該発現量と転移がない食道ガン細胞の存在する生体組織の発現量と比べて検定を行った時に、その差が有意であれば、被験者について食道ガンの転移が疑われる。
【０１４８】
本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップを利用した転移がある食道ガン（細胞）の検出方法は、被験者の生体組織の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって摘出した生体組織から回収し、そこに含まれる遺伝子を、本発明のポリヌクレオチド群から選ばれた単数又は複数のポリヌクレオチド、その変異体又はその断片を用いて検出し、その遺伝子発現量を測定することにより、食道ガンの転移の有無又はその程度を診断することを含む。また本発明の食道ガン転移の検出方法は、例えば食道ガン患者において、該疾患の改善のために治療薬を投与した場合における該疾患の改善の有無又はその程度を検出、判定又は診断することもできる。
【０１４９】
本発明の方法は、例えば以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程：
（ａ）被験者由来の検体試料を、本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップのポリヌクレオチドと接触させる工程、
（ｂ）生体試料中の標的核酸の発現レベルを、上記ポリヌクレオチドをプローブとして用いて測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の結果をもとに、該検体試料中の食道ガン（細胞）転移の存在又は不存在を判定する工程、
を含むことができる。
【０１５０】
本発明方法で用いられる検体試料としては、被験者の生体組織、例えば食道組織及びその周辺組織、食道ガンの転移が疑われる組織など、から調製される試料を挙げることができる。具体的には該組織から調製されるＲＮＡ含有試料、或いはそれからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料は、被験者の生体組織の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって摘出した生体組織から回収し、そこから常法に従って調製することができる。
【０１５１】
ここで被験者とは、哺乳動物、例えば非限定的にヒト、サル、マウス、ラットなどを指し、好ましくはヒトである。
【０１５２】
本発明の方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて工程を変更することができる。
【０１５３】
測定対象物としてＲＮＡを利用する場合、食道ガン（細胞）の検出は、例えば下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡ又はそれから転写された相補的ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）を、本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップのポリヌクレオチドと結合させる工程、
（ｂ） 該ポリヌクレオチドに結合した生体試料由来のＲＮＡ又は該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記ポリヌクレオチドをプローブとして用いて測定する工程、
（ｃ） 上記（ｂ）の測定結果に基づいて、食道ガン（細胞）の存在又は不存在を判定する工程、
を含むことができる。
【０１５４】
本発明によって食道ガン（細胞）を検出、判定又は診断するために、例えば種々のハイブリダイゼーション法を使用することができる。かようなハイブリダイゼーション法には、例えばノーザンブロット法、サザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法などを使用することができる。
【０１５５】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の診断用組成物をプローブとして用いることによって、ＲＮＡ中の各遺伝子発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の診断用組成物（相補鎖）を放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓなど）や蛍光物質などで標識し、それを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーした被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせたのち、形成された診断用組成物（ＤＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖を診断用組成物の標識物（放射性同位元素又は蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（ＢＡＳ-１８００ＩＩ、富士写真フィルム株式会社、などを例示できる）又は蛍光検出器（ＳＴＯＲＭ８６０、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、などを例示できる）で検出、測定する方法を例示することができる。
【０１５６】
本明細書で使用する「被験者」なる用語は、哺乳動物（例えばヒト、ペット動物、家畜類など）を指し、好ましくはヒトである。
【０１５７】
定量ＲＴ―ＰＣＲ法を利用する場合には、本発明の上記診断用組成物をプライマーとして用いることによって、ＲＮＡ中の遺伝子発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法にしたがってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的の各遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の診断用組成物から調製した１対のプライマー（上記ｃＤＮＡに結合する正鎖と逆鎖からなる）をｃＤＮＡとハイブリダイズさせて常法によりＰＣＲ法を行い、得られた二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、二本鎖ＤＮＡの検出法としては、上記ＰＣＲをあらかじめ放射性同位元素や蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行う方法、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドなどで二本鎖ＤＮＡを染色して検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーさせて標識した診断用組成物をプローブとしてこれとハイブリダイズさせて検出する方法をとることができる。
【０１５８】
ＤＮＡアレイ解析を利用する場合は、本発明の上記診断用組成物をＤＮＡプローブ（一本鎖又は二本鎖）として基板に貼り付けたＤＮＡチップを用いる。遺伝子群を基板に固相化したものには、一般にＤＮＡチップ及びＤＮＡアレイという名称があり、ＤＮＡアレイにはＤＮＡマクロアレイとＤＮＡマイクロアレイが包含されるが、本明細書ではＤＮＡチップといった場合、該ＤＮＡアレイを含むものとする。
【０１５９】
ハイブリダイゼーション条件は、限定されないが、例えば３０℃〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ、０．１〜０．５％ ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは４０℃〜４５℃で、３．４×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び１×ＳＳＣ溶液、０．２×ＳＳＣ溶液による室温での連続した洗浄などの条件を挙げることができる。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）である。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが望ましい。具体的にはこのような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【０１６０】
本発明の組成物又はキットのポリヌクレオチド断片をプライマーとしてＰＣＲを実施する際のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、例えば１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣＬ、１〜２ｍＭ ＭｇＣｌ２などの組成のＰＣＲバッファーを用い、当該プライマーの配列から計算されたＴｍ＋５〜１０℃において１５秒から１分程度処理することなどが挙げられる。かかるＴｍの計算方法としてＴｍ＝２×(アデニン残基数+チミン残基数)＋４×(グアニン残基数+シトシン残基数)などが挙げられる。
【０１６１】
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． & Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ． 著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の 第１巻７．４２〜７．４５、第２巻８．９〜８．１７などに記載されており、本発明において利用できる。
【０１６２】
本発明はまた、本発明の組成物、キット、ＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、被験者由来の検体試料中の標的核酸又は遺伝子の発現量を測定し、食道ガン組織と正常組織の遺伝子発現量を教師（訓練サンプル）としたサポートベクターマシーン（ＳＶＭ）を判別式として、検体試料中に転移がある食道ガン細胞が含まれないこと及び／又は含まれることを判定する方法を提供する。
【０１６３】
すなわち、本発明はさらに、本発明の組成物、キット、ＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、転移がある患者由来の食道ガン細胞を含む組織又は転移がない患者由来の食道ガン細胞であることが既知の複数の生体試料中の標的核酸の発現量をin ｖｉｔｒｏで測定する第１の工程、前記第１の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を教師とした判別式（サポートベクターマシーン）を作成する第２の工程、被験者の食道由来の検体試料中の該標的核酸の発現量を第１の工程と同様にｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する第３の工程、前記第２の工程で得られた判別式に第３の工程で得られた該標的酢酸の発現量の測定値を代入し、該判別式から得られた結果に基づいて、検体試料中に転移がある食道ガン細胞が含まれないこと及び／又は転移がない食道ガン細胞が含まれることを判定する第４の工程を含む、ここで、該標的核酸が該組成物、キット又はＤＮＡチップに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片によって検出可能なものである、前記方法を提供する。
【０１６４】
或いは、本発明の方法は、例えば下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）転移がある患者由来の食道ガン細胞を含む組織又は転移がない患者由来の食道ガン細胞組織であることが既知の生体試料中の標的遺伝子の発現量を、本発明による診断（検出）用組成物、キット又はＤＮＡチップを用いて測定する工程、
（ｂ）（ａ）で測定された発現量の測定値を、下記の数１〜数５の式に代入して、ＳＶＭと呼ばれる判別式を作成する工程、
（ｃ）被験者由来の検体試料中の該標的遺伝子の発現量を、本発明による診断（検出）用組成物、キット又はＤＮＡチップを用いて測定し、（ｂ）で作成した判別式にそれらを代入して、得られた結果に基づいて該検体試料中に転移がある食道ガン細胞が含まれるかどうかを判定する工程、
を含むことができる。
【０１６５】
ＳＶＭとは２クラスの分類問題を解くためにつくられた１９９５年にＡＴ＆ＴのＶ．Ｖａｐｎｉｋ（Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｎｉｎｇ Ｔｈｅｏｒｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９５年発行）によって統計的学習理論の枠組みで提案された学習機械である。ＳＶＭは線形の識別器であるが、後述するカーネルを組み合わせることによって非線形問題を扱うことができる。異なるクラスの訓練サンプルについて、それらを識別する多数の超平面のうち、その超平面と訓練サンプルとの最小距離が最大となる超平面を識別面とすることにより、新たに与えられるテストサンプルがどのクラスに属するかを最も正確に識別することができる。
【０１６６】
ＳＶＭでは線形問題のみしか扱うことができないが、本質的に非線形な問題に対応するための方法として、特徴ベクトルを高次元へ非線形変換し、その空間で線形の識別を行う方法が知られている。こうすれば、元の空間で非線形モデルを用いているのと等価となる。しかし高次元への写像を行うと膨大な計算量が必要となり、汎化能力も減少する。ＳＶＭでは識別関数が入力パターンの内積のみに依存した形になっており、内積が計算できれば最適な識別関数を構成することが可能である。非線形に写像した空間での二つの要素の内積がそれぞれのもとの空間での入力のみで表現されるような式のことをカーネルと呼び、高次元に写像しながら、実際には写像された空間での特徴の計算を避けてカーネルの計算のみで最適な識別関数、すなわち判別式を構成することができる。
【０１６７】
本発明の方法で使用可能な判別式の算出例を以下に示す。
ＳＶＭを決めるためには食道ガン細胞を含む組織又は正常組織であることが既知の生体試料中の標的遺伝子の発現量を教師（訓練サンプル）として用意し、以下の手順によって識別関数の定数を決定することができる。
【０１６８】
訓練サンプルxiは（＋１、−１）でクラス分けされる、食道ガン細胞を含む組織群、又は正常組織群のいずれかに属しているとする。これらの訓練サンプルが超平面によって線形分離できるとき、識別関数は例えば次式となる。
【０１６９】
【数１】
（ここで、wは重み係数、bはバイアス定数、xはサンプルの変数を表す。）
ただし、この関数には制約条件：
【０１７０】
【数２】
（ここで、Tは内積、yはサンプルのクラス、ζはスラック変数を表す。）
があるため、Ｌａｇｕｒａｎｇｅの未定乗数法を用いることによりＬａｇｕｒａｎｇｅ乗数αを用いた以下の最適化問題に帰着する。
【０１７１】
【数３】
ここで、
【０１７２】
【数４】
（ここで、Cは実験により決定される制限条件パラメーターを表す。）
この問題を解くと最終的に、
【０１７３】
【数５】
が得られ、識別関数を一義的に得ることができる。この関数に新たに与えられる検体試料（食道ガン細胞を含むかどうか未知の組織の発現遺伝子量）についてのｘを代入することによって、ｆ（ｘ）をクラス分け（すなわち、＋１又は−１）することができ、検体試料がどちらのクラス（すなわち、転移がある患者由来の食道ガン細胞を含む組織群又は転移がない患者由来の食道ガン細胞）に属するかを識別する。
【０１７４】
以上に示すように、未知試料のクラス分けを行うためのＳＶＭによる判定式の作成には２群の教師（訓練サンプル）が必要となる。この訓練サンプルは例えば今回の発明の場合、「転移のある食道ガン患者の食道ガン組織から得られた発現遺伝子（遺伝子ｘ１，ｘ２，．．ｘｉ，．．．ｘｎ）」の各患者に対応したセット、及び「転移のない食道ガン患者の食道ガン組織から得られた発現遺伝子（遺伝子ｘ１，ｘ２，．．ｘｉ，．．．ｘｎ）」の各患者に対応したセット、の２群である。これらのセットについてそれぞれ測定される発現遺伝子数（ｎ）は実験のデザインによって様々ではあるが、個々の遺伝子については、どのような実験においても２群間で大きく差がある場合と、比較的差が少ない、或いは差がない場合が観察される。ＳＶＭによる判別式の精度を上げるためには、訓練サンプルとなる２群に、明確な差があることが条件となるため、遺伝子セットの中から２群間で発現量に差がある遺伝子のみを抽出して利用することが必要である。
【０１７５】
このように、２群間で差がある遺伝子を抽出する方法としては、平均値の差を検出するパラメトリック解析であるｔ−検定、ノンパラメトリック解析であるＭａｎｎ―ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定などを利用できる。
【０１７６】
本発明の方法において、例えば、上に記載したような配列番号１〜１０に基づく２〜全部、好ましくは３〜全部、さらに好ましくは６〜全部の上記ポリヌクレオチド、並びに/或いは、上に記載したような配列番号１１〜２０（又は配列番号１２〜２０）に基づく２〜全部、好ましくは３〜全部、さらに好ましくは６〜全部のポリヌクレオチド、からの任意の組み合わせを用いて、かつ上記の１０種の標的遺伝子の発現量がすべて有意に転移がある患者由来の食道ガン組織と転移がない患者由来の食道ガン組織との間で異なり、転移がある患者由来の食道ガン組織において発現が増加しているか、或いは減少していることを指標にして、これら１０種の遺伝子について発現量を測定することにより、食道ガンの転移を７０％以上、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の確率で見分けることができる（図１）。
【０１７７】
６．２ 抗体
本発明はさらに、本発明の上記抗体を用いて、被験者由来の食道ガン細胞、血液等の生体試料中の上記ポリペプチドのレベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することを含む、被験者の食道ガンの転移の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測する方法、或いは食道ガンの転移をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出する方法が提供される。
【０１７８】
具体的には、本発明は、上記１０種の遺伝子（例えば、配列番号１〜１０に相当する）又はその断片（例えば、配列番号１１〜２０に相当する）によってコードされるポリペプチド、例えば配列番号２１〜２７、２２〜２７などで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、に対する２〜全部、好ましくは３〜全部、さらに好ましくは６〜全部、の抗体又はその断片を用いて、転移がある患者由来の食道ガン細胞もしくは組織と転移がない患者由来の食道ガン細胞もしくは組織間での該ポリペプチドの発現量、或いは血液中の該ポリペプチドのレベル(又は存在量)、をiｎ vｉｔｒｏで測定することを含む、食道ガン転移の検出方法、或いは食道ガン転移（又は転移の可能性）の有無の予測方法を提供する。
【０１７９】
測定は、慣用の酵素又は蛍光団で標識した抗体又は断片と、組織切片又はホモゲナイズした組織とを接触させる工程、抗原−抗体複合体を定性的に又は定量的に測定する工程を含むことができる。検出は、例えば免疫電顕により標的ポリペプチドの存在とレベルを測定する方法、ELISAや蛍光抗体法などの慣用法によって標的ポリペプチドのレベルを測定する方法などによって行い、転移がない患者由来の食道ガン細胞もしくは組織と比べて転移がある患者由来の食道ガン細胞もしくは組織において標的ポリペプチドの発現レベル（発現量）が増加しているか又は減少している場合、或いは血液中の該ポリペプチドのレベルが、転移がない食道ガン患者と比べて転移がある食道ガン患者において有意に増加しているか又は低下している場合、食道ガンの転移があると決定する。言い換えれば、前記ポリペプチドの発現量又はレベルが、転移のない患者由来の値と比較して有意に増加又は低下している場合、食道ガンの転移があると決定する。ここで、「有意に」とは、統計学的に有意（ｐ≦０．０５）であることを意味する。
【０１８０】
ポリペプチドの発現レベルは、免疫学的方法によって測定しうる。免疫学的測定法として例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応又はウェスタンブロット法が挙げられる。
【０１８１】
上記の方法において、標識を用いた免疫測定法により実施する場合には、本発明の抗体を固相化するか、又は試料中の成分を固相化して、それらの免疫学的反応を行うことができる。
【０１８２】
固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。
【０１８３】
固相化は、固相担体と本発明の抗体又は試料成分とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法に従って結合させることにより行うことができる。
【０１８４】
さらにまた、本発明においては、本発明の抗体と、試料中の標的ポリペプチドとの反応を容易に検出するために、本発明の抗体を標識することにより該反応を直接検出するか、又は標識二次抗体を用いることにより間接的に検出する。本発明の検出方法においては、感度の点で、後者の間接的検出（ 例えばサンドイッチ法など）を利用することが好ましい。
【０１８５】
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼ又はビオチン− アビジン複合体等を、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ等を、そして放射免疫測定法の場合にはトリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。また、発光免疫測定法は、ＮＡＤＨ−、ＦＭＮＨ２−、ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
【０１８６】
標識物質と抗体との結合法は、酵素免疫測定法の場合にはグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方法を、放射免疫測定法の場合にはクロラミンＴ法、ボルトンハンター法等の公知の方法を用いることができる。測定の操作法は、公知の方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９５年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００１年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．）により行うことができる。例えば、本発明の抗体を直接標識する場合には、試料中の成分を固相化し、標識した本発明の抗体と接触させて、マーカーポリペプチドと本発明の抗体との複合体を形成させる。そして未結合の標識抗体を洗浄分離して、結合標識抗体量又は未結合標識抗体量より試料中の標的ポリペプチドの量を測定することができる。
【０１８７】
また、例えば標識二次抗体を用いる場合には、本発明の抗体と試料とを反応させ（一次反応）、さらに標識二次抗体を反応させる（二次反応）。一次反応と二次反応は逆の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいし、又は時間をずらして行ってもよい。一次反応及び二次反応により、固相化した標的ポリペプチド−本発明の抗体−標識二次抗体の複合体、又は固相化した本発明の抗体−標的ポリペプチド−標識二次抗体の複合体が形成する。そして未結合の標識二次抗体を洗浄分離して、結合標識二次抗体量又は未結合標識二次抗体量より試料中の標的ポリペプチドの量を測定することができる。
【０１８８】
具体的には、酵素免疫測定法の場合は標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を光学的方法等により測定する。蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫定法の場合には放射性物質標識による放射能量を測定する。発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。
【０１８９】
本発明の方法では、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応又は粒子凝集反応等における免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目視的に測る測定法により実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を反応系に含ませてもよい。
【０１９０】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、この実施例によって制限されないものとする。
【実施例】
【０１９１】
１．実験者の臨床病理学的所見
インフォームドコンセントを得た３１名の食道ガン患者から、食道ガン摘出手術時又は食道生検実施時に食道の摘出組織を得た。摘出された組織片について肉眼的及び／又は病理組織学的に食道ガン組織を判断し、食道ガン病変部と正常組織部を分けてただちに凍結し、液体窒素中で保存した。別途、周辺の所属リンパ節の採取を行い、食道ガン細胞の転移の有無を病理学的に診断した。
【０１９２】
２．ｔｏｔａｌＲＮＡ抽出とｃＤＮＡの調製
試料として食道ガン患者の食道組織における食道ガン病変部の組織を用いた。おのおのの組織から、Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、同社推奨のプロトコールによりｔｏｔａｌＲＮＡを調製した。
【０１９３】
上述の方法で得られたｔｏｔａｌＲＮＡ １μgについて、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー及びランダムノナマーを併用し、ＣｙＳｃｒｉｂｅ Ｆｉｒｓｔ-Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）を用いてメーカー推奨のプロトコールで逆転写反応を行った。食道ガン組織由来のｔｏｔａｌＲＮＡにはＣｙ３−ｄＵＴＰ（ＧＥヘルスケア社）を、リファレンスｔｏｔａｌＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にはＣｙ５−ｄＵＴＰ（ＧＥヘルスケア社）を添加して、メーカー推奨のプロトコールで逆転写反応時にｃＤＮＡの標識を行った。標識されたｃＤＮＡはＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製してからハイブリダイズに用いた。
【０１９４】
３．遺伝子絞込みのためのオリゴＤＮＡマイクロアレイ
オリゴＤＮＡマイクロアレイとしてはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社ＧｅｎｅＣｈｉｐTM（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ａ）と本明細書中で述べる方法に従って作製したガラス製ＤＮＡチップ、及び東レ株式会社３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ ２５ｋを用いて候補遺伝子の一次絞込みを行い、さらに本明細書中に述べる方法で作製した一次絞込み済みの遺伝子を搭載した３Ｄ−Ｇｅｎｅ基板を利用したオリゴＤＮＡマイクロアレイを用いた。
【０１９５】
４．遺伝子の一次絞込み
遺伝子の一次絞込みには、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社ＧｅｎｅＣｈｉｐTM／ガラス製オリゴＤＮＡマイクロアレイの組合せを用いる方法と、東レ株式会社３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ ２５ｋを用いる方法の二通りを利用した。
【０１９６】
ガラス製オリゴＤＮＡマイクロアレイの作製方法を以下に示す。最初に搭載するオリゴＤＮＡの種類を決定するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社ＧｅｎｅＣｈｉｐTMを用いて遺伝子の絞込みを行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐTMの操作については、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＧｅｎｅＣｈｉｐTM Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍなどの同社の定める手順に基づいて実施した。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＧｅｎｅＣｈｉｐTMを用いた解析の結果、食道ガンによって発現変動が起こる可能性がある遺伝子及び実験対照となりうる遺伝子を計８９６１種抽出した。
【０１９７】
抽出した８９６１種の遺伝子について、配列の重複をおこさないように配列特異性が高い部位の配列６０−７０残基をそれぞれ選択して合成した。４倍に希釈したＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（タカラバイオ社）に３０μＭとなるように溶解した、８９６１種の６０又は７０ｍｅｒからなる合成オリゴＤＮＡを、ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ・ＤＮＡマイクロアレイ用コートグラスＤＭＳＯ対応 ＴｙｐｅＩアミノ修飾オリゴＤＮＡ固定コート（松浪硝子工業株式会社）上にスポッター（ＧＭＳ４１７ａｒｒａｙｅｒ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて湿度環境５０−６０％でスポットした。
【０１９８】
標識したｃＤＮＡ １μｇをアンチセンスオリゴカクテル（ＱＩＡＧＥＮ）に溶解し、Ｇａｐカバーグラス（松浪硝子工業）を載せたガラス製オリゴＤＮＡマイクロアレイにアプライし、４２℃で１６時間ハイブリダイズを行った。ハイブリダイズ終了後、ＤＮＡチップを２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、１ｘＳＳＣ、０．２ｘＳＳＣで順次洗浄した。
【０１９９】
上述の方法によりハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップをＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いてスキャンし、画像を取得して蛍光強度を数値化した。統計学的処理はＳｐｅｅｄ Ｔ．著「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ」Ｃｈａｐｍａｎ & Ｈａｌｌ/ＣＲＣ，及びＣａｕｓｔｏｎ Ｈ．Ｃ．ら著「Ａ ｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ ｇｕｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参考にして行った。すなわちハイブリダイズ後の画像解析から得られたデータについて、それぞれの対数値をとり、ｇｌｏｂａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎをとＬＯＷＥＳＳ（ｌｏｃａｌｌｙ ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ ｓｍｏｏｔｈｅｒ）による平滑化を行い、ＭＡＤによるスケーリング処理によってノーマライゼーション補正を行った。その結果、転移がある食道ガン病変部における発現量が、転移がない食道ガン病変部よりも多いか又は少ない遺伝子を見出すことができた。これらの遺伝子を食道ガン転移検出用遺伝子として利用することができると考えられる。この結果、２５５種の遺伝子を絞り込んだ。
【０２００】
一方、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標） Ｈｕｍａｎ Ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ ２５ｋによる遺伝子の一次絞込みについては、６名の食道ガン患者（転移あり３名、転移なし３名）から採取した検体由来の発現遺伝子解析を実施した。それぞれの患者からトータルＲＮＡを採取し、逆転写して標識したｃＤＮＡ ５００ｎｇを東レ株式会社製ハイブリバッファーに溶解し、３Ｄ−ＧｅｎｅTM Ｈｕｍａｎ ２５Ｋにアプライした後、４２℃で１６時間ハイブリダイズを行った。ハイブリ終了後にＤＮＡチップを洗浄してＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ株式会社製ＰｒｏＳｃａｎＡｒｒａｙ（登録商標）を用いてスキャンし、画像を取得して蛍光強度を数値化した。この数値化データについてそれぞれの対数値をとり、ｇｌｏｂａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行った上で、転移がある食道ガン病変部における発現量が、転移がない食道ガン病変部よりも多い／少ない遺伝子を見出すためにＳｔｕｄｅｎｔ’ｔ−ｔｅｓｔ、判別分析、変動倍率のランキングを行って８４９種の遺伝子を絞り込んだ。
【０２０１】
５．診断用遺伝子絞込みのためのＤＮＡチップ実験
４．で絞り込んだ診断用遺伝子候補、及び対照遺伝子検出用のプローブとして、それぞれの遺伝子配列から配列６０−７０残基をそれぞれ選択して、１１１９種のオリゴヌクレオチドを合成した（配列番号１１〜２０の配列であるオリゴヌクレオチドをそれぞれ含む）。これらのプローブを東レ株式会社製３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）１３３２柱基板にそれぞれ１プローブにつき１点ずつスポットし、食道ガン転移判別用ＤＮＡチップとして作製した。
【０２０２】
この食道ガン転移判別用ＤＮＡチップに、食道ガン患者の手術検体又は生検検体由来の食道ガン組織から採取したＲＮＡを逆転写・Ｃｙ３標識して、同様に逆転写・Ｃｙ５標識を行った対照となるＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）と、それぞれ３００ｎｇを同時にアプライした。４２℃で１６時間ハイブリダイズを行い、ハイブリ終了後にＤＮＡチップを洗浄してＰｅｒｋｉｎ―Ｅｌｍｅｒ株式会社製ＰｒｏＳｃａｎＡｒｒａｙ（登録商標）を用いてＤＮＡチップをスキャンし、画像を取得してそれぞれのスポットの蛍光強度を数値化した。この数値化データについてＣｙ３蛍光値とＣｙ５蛍光値のブランク補正（プローブをスポットしていない柱領域の蛍光値の平均をそれぞれの蛍光から減算する）、ｇｌｏｂａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行った上でＭ値に変換した（Ｍ値：検体由来Ｃｙ３蛍光／対照由来Ｃｙ５蛍光の底２の対数変換値）。
【０２０３】
６．予測スコアリングシステム
３１例の患者から得た食道がん検体（転移あり１０例、転移なし２１例）のデータをもとに、テストデータに転移ありの検体が必ず３例含まれる条件下で、無作為に学習データ２６例、テストデータ５例を分けた。学習データ群において、Ｌｅａｖｅ ｏｎｅ ｏｕｔ法によって診断用遺伝子の選択と判別用アルゴリズム構築を行った。抜いた１例の学習データとテストデータを予測し、学習データのすべて必ず１回予測対照となるように、２６回の試行を行った。サンプリングを変えて、同様の試行を１０回繰り返し、そのテストデータを予測する精度の平均によって、判別アルゴリズムの精度を評価したところ、遺伝子５種を用いた場合に最大（７６％）の予測精度を得ることが示された。この結果が偶然出ないことを確かめるために、３１例の患者について転移あり、なしの情報を無作為に振り分け、データを完全にランダム化して同様の試行を３００回実施したところ、判別精度は遺伝子５種で５２．３％にとどまり、判別アルゴリズムの精度が偶然でないことが示された。
【０２０４】
そこで次に、この５種の遺伝子に相当する遺伝子を１０回のランダムサンプリング法の試行結果から抽出し、出現頻度順に順位付けした（表１）。この順位を順に遺伝子数を増やしながら、全３１検体についてＬｅａｖｅ ｏｎｅ ｏｕｔ法によるＳＶＭ判別を行ったところ、上位１０遺伝子で、食道ガンのリンパ節転移予測について、精度９６．３％を示した。なお、表１に示した遺伝子は、転移がある食道ガン病変部と転移がない食道ガン病変部での遺伝子転写産物の発現量差が上位の遺伝子である。
【０２０５】
【表１】
【０２０６】
この一覧から上位から順に遺伝子を選び、食道ガン組織を識別するためのＳＶＭによる判別マシーンを作成したところ、プローブとして配列番号１１〜２０のポリヌクレオチドを用いて測定した遺伝子発現を検討することにより、転移がある食道ガン病変部と転移がない食道ガン病変部の判別式を作成したところ、用いる遺伝子の数に依存して確率が変動し、９３．６％以上の確率で転移がある食道ガン病変部と転移がない食道ガン病変部を判別することができた（図1）。
【０２０７】
また、任意のプローブによって測定した遺伝子発現を検討することにより、転移がある食道ガン病変部と転移がない食道ガン病変部の判別式を作成したところ、表２のような判別確率を得ることができた（表２）。
【０２０８】
【表２】
【０２０９】
図１及び表２に示したような結果は、食道ガン患者からのサンプルでの結果と本質的に一致する。
【産業上の利用可能性】
【０２１０】
本発明により、特異性、感受性に優れた食道ガン転移判定用組成物を提供することができるため、少なくともリンパ節への食道ガン転移の検出のために非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】表１に記載の遺伝子に対応する配列番号１１〜２０のポリヌクレオチドを組み合わせて用いた場合の食道ガンのリンパ節転移判別確率（％）を示す。縦軸は、食道ガンのリンパ節転移判別確率（％）、すなわち検体中の転移がある食道ガン組織の存在を検出できる確率、横軸は、表１に記載の遺伝子に対応する配列番号１１〜２０において、配列番号１１から２０まで１つずつ順番に増やした、転移がある食道ガン検出に必要な遺伝子の合計数をそれぞれ示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド、その変異体又はその断片からなる群から選択される２以上のポリヌクレオチドを含む、食道ガン転移診断用組成物。
（a）配列番号１〜１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片
（b）配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（c）配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片
（d）配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（e）前記（a）〜（d）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片
【請求項２】
前記断片が、６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記断片が、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列において、それぞれ配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記断片が、配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列、又はこれらに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド、その変異体及び/又はその断片の２以上を含む、食道ガン転移診断用キット。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの１５以上の連続した塩基を含む断片である、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記断片が、６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチドである、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記断片が、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列において、それぞれ配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記断片が、配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列、又はこれらに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが、別個に又は任意に組み合わせて異なる容器に包装されている、請求項５〜９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド、その変異体及び/又はその断片の２以上を含む、食道ガン転移診断用ＤＮＡチップ。
【請求項１２】
配列番号１１〜２０で表される塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチドの２以上〜全部を含む、請求項１１に記載のＤＮＡチップ。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載の組成物、請求項５〜１０のいずれかに記載のキット、請求項１１〜１２のいずれかに記載のＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、被験者由来の生体試料における標的核酸の発現レベルを測定することによって、被験者由来の検体試料中に転移を伴う食道ガン細胞が含まれるかどうかをｉｎ ｖｉｔｒｏで判定する方法。
【請求項１４】
ＤＮＡチップを用いる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれかに記載の組成物、請求項５〜１０のいずれかに記載のキット、請求項１１〜１２のいずれかに記載のＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、転移を伴う食道ガン又は転移を伴わない食道ガン細胞を含む組織であることが既知の複数の生体試料中の標的核酸の発現量をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する第１の工程、前記第１の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を教師とした判別式（サポートベクターマシーン）を作成する第２の工程、被験者の食道由来の検体試料中の該標的核酸の発現量を第１の工程と同様にｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する第３の工程、前記第２の工程で得られた判別式に第３の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を代入し、該判別式から得られた結果に基づいて、検体試料中に転移を伴うガン細胞が含まれないこと及び／又は転移を伴わないガン細胞が含まれることを判定する第４の工程を含む、食道ガン転移を判定する方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれかに記載の組成物、請求項５〜１０のいずれかに記載のキット、請求項１１〜１２のいずれかに記載のＤＮＡチップの、食道ガン患者の転移の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測するための使用。
【請求項１７】
配列番号１〜１０で表される塩基配列によってコードされるポリペプチドに対する２以上の抗体又はその断片を用いて、被験者由来の食道ガン細胞或いは血液中の該ポリペプチドのレベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することを含む、被験者の食道ガンの転移の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測する方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、配列番号２１〜２７で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチドの発現レベルが、転移のない患者由来の食道ガンと比較して変化している場合、転移が有る患者由来の食道ガンであると決定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリペプチドの発現レベルが、転移のある患者由来の食道ガンと比較して変化している場合、転移が無い患者由来の食道ガンであると決定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１】
下記の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド、その変異体又はその断片からなる群から選択される２以上のポリヌクレオチドを含む、食道ガン転移診断用組成物。
（a）配列番号１〜１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片
（b）配列番号１〜１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（c）配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片
（d）配列番号１〜１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（e）前記（a）〜（d）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片
【請求項２】
前記断片が、６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記断片が、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列において、それぞれ配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記断片が、配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列、又はこれらに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド、その変異体及び/又はその断片の２以上を含む、食道ガン転移診断用キット。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの１５以上の連続した塩基を含む断片である、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記断片が、６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチドである、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記断片が、配列番号１〜１０のいずれかで表される塩基配列において、それぞれ配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列を含み、かつ６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記断片が、配列番号１１〜２０のいずれかで表される塩基配列、又はこれらに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが、別個に又は任意に組み合わせて異なる容器に包装されている、請求項５〜９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド、その変異体及び/又はその断片の２以上を含む、食道ガン転移診断用ＤＮＡチップ。
【請求項１２】
配列番号１１〜２０で表される塩基配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチドの２以上〜全部を含む、請求項１１に記載のＤＮＡチップ。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載の組成物、請求項５〜１０のいずれかに記載のキット、請求項１１〜１２のいずれかに記載のＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、被験者由来の生体試料における標的核酸の発現レベルを測定することによって、被験者由来の検体試料中に転移を伴う食道ガン細胞が含まれるかどうかをｉｎ ｖｉｔｒｏで判定する方法。
【請求項１４】
ＤＮＡチップを用いる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれかに記載の組成物、請求項５〜１０のいずれかに記載のキット、請求項１１〜１２のいずれかに記載のＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、転移を伴う食道ガン又は転移を伴わない食道ガン細胞を含む組織であることが既知の複数の生体試料中の標的核酸の発現量をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する第１の工程、前記第１の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を教師とした判別式（サポートベクターマシーン）を作成する第２の工程、被験者の食道由来の検体試料中の該標的核酸の発現量を第１の工程と同様にｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する第３の工程、前記第２の工程で得られた判別式に第３の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を代入し、該判別式から得られた結果に基づいて、検体試料中に転移を伴うガン細胞が含まれないこと及び／又は転移を伴わないガン細胞が含まれることを判定する第４の工程を含む、食道ガン転移を判定する方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれかに記載の組成物、請求項５〜１０のいずれかに記載のキット、請求項１１〜１２のいずれかに記載のＤＮＡチップの、食道ガン患者の転移の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測するための使用。
【請求項１７】
配列番号１〜１０で表される塩基配列によってコードされるポリペプチドに対する２以上の抗体又はその断片を用いて、被験者由来の食道ガン細胞或いは血液中の該ポリペプチドのレベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することを含む、被験者の食道ガンの転移の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測する方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、配列番号２１〜２７で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチドの発現レベルが、転移のない患者由来の食道ガンと比較して変化している場合、転移が有る患者由来の食道ガンであると決定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリペプチドの発現レベルが、転移のある患者由来の食道ガンと比較して変化している場合、転移が無い患者由来の食道ガンであると決定する、請求項１７に記載の方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−４１（Ｐ２０１０−４１Ａ）
【公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１６１９４２（Ｐ２００８−１６１９４２）
【出願日】平成２０年６月２０日（２００８．６．２０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「食道がん及び腎臓がん診断用ＤＮＡチップの評価・検証及び成果普及事業」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２０日（２００８．６．２０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「食道がん及び腎臓がん診断用ＤＮＡチップの評価・検証及び成果普及事業」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
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