骨再生誘導膜、およびその製造方法
【課題】 骨再建能力を有効に導き出す新しいしくみを組み込んだ生体吸収性骨再生誘導膜、およびその製造方法を提供する。
【解決手段】 本発明に係る骨再生誘導膜は、ケイ素溶出型炭酸カルシウムとポリ乳酸とを主成分とする不織布層と、ポリ乳酸を主成分とする不織布層の２層構造を構成後、ケイ素溶出型炭酸カルシウムとポリ乳酸とを主成分とする不織布層にアパタイトをコーティングすることで骨再建能力を有効に導き出す新しいしくみを組み込む。本発明に係る骨再生誘導膜は、エレクトロスピニング法を用いた不織布製造技術と擬似体液浸漬法を利用することで得られる。
【解決手段】 本発明に係る骨再生誘導膜は、ケイ素溶出型炭酸カルシウムとポリ乳酸とを主成分とする不織布層と、ポリ乳酸を主成分とする不織布層の２層構造を構成後、ケイ素溶出型炭酸カルシウムとポリ乳酸とを主成分とする不織布層にアパタイトをコーティングすることで骨再建能力を有効に導き出す新しいしくみを組み込む。本発明に係る骨再生誘導膜は、エレクトロスピニング法を用いた不織布製造技術と擬似体液浸漬法を利用することで得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に口腔や顎顔面手術の分野において広く利用される骨欠損修復方法のひとつである骨組織誘導再生（Guided Bone Regeneration；GBR）法に用いられる骨再生誘導（GBR）膜およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
GBR膜は骨形成に寄与しない細胞や組織の骨欠損部への侵入を防ぎ、骨の自己再生能力を活かし、骨を再建させるために欠損部を覆う遮蔽膜である。この膜を用いるGBR法は生体が本来もっている治癒力を利用して骨欠損を治癒するもので、手術法も複雑でなく口腔外科では多くの良好な結果が得られている。
【０００３】
GBR膜の種類としては非吸収性膜と吸収性膜に大別される。非吸収性の膜材料としてポリテトラフルオロエチレン（expanded polytetrafluoroetylene；ePTEF）が実用化されており、すでに良好な臨床成績を得ている。しかし、非吸収性であるために欠損部の修復後、膜を取り除くための２次手術が必要となり患者への負担は軽くない。また、生体不活性（非吸収性）であるため大きな欠損部への適用は難しい。そこで、２次手術による外科的侵襲を避けることができる生体吸収性の合成ポリエステルであるポリ乳酸やポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体、生物由来のコラーゲンや筋膜などを用いたGBR膜の研究開発が最近では盛んに実施され、一部製品化されている。例えば、吸収性ポリマーとリン酸三カルシウムやヒドロキシアパタイトとの複合体を含み微細孔を有する骨再生膜（特許文献１）、生体吸収性材料で形成されたフェルトからなる保護膜（特許文献２、３）、コラーゲンからなるスポンジ様マトリックス層と比較的不浸透性のバリヤ層からなる多層膜（特許文献４）、各種生体吸収性ポリマーを組み合わせた高分子ブレンドからなる有孔性シート状構造の歯科用吸収性組織再生膜（特許文献５）、連続的なマクロ多孔性シートの形態の再吸収性の可撓性移植片（特許文献６）、生体分解性樹脂粉末にレーザーを照射して３次元粉体造形する生体適合膜（特許文献７）など、様々なGBR膜とその製造方法が提案されている。
【０００４】
特に超高齢化社会における健康維持において、咀嚼能力の維持確保は極めて重要であり、口腔や顎の骨欠損には一刻も早い治癒が望まれている。骨形成能を向上させるために生体吸収性膜に骨形成伝導剤（特許文献１）、成長因子または骨形態発生因子（特許文献４、７）を含有させる試みもあるが、このような因子を取り扱うことは容易ではない。骨の自己再生をより確実に早くさせる骨再建能力に優れた生体吸収性GBR膜の開発が求められている。
【０００５】
最近の生体関連材料の研究技術動向を見ると、材料と骨とを結合させるという材料設計から、本物の骨を再生させるための材料設計に研究内容がシフトしており、骨形成に及ぼすケイ素の役割が注目され、ケイ素含有を特徴とした材料設計が数多く見られる（非特許文献１）。例えば、ケイ素の徐放により細胞への遺伝子的働きかけが行なわれ、骨生成が促進されることが報告されている（非特許文献２）。また、３種の炭酸カルシウム（カルサイト、アラゴナイト、バテライト）とポリ乳酸の複合体を擬似体液（SBF）に浸漬させると、最も短時間で骨似アパタイトがその表面に生成したものはバテライトとポリ乳酸の複合体であることが示されている（非特許文献３）。これらのことから、ケイ素を徐放するバテライトを用いることが骨再建の速いGBR膜を提供するための重要な手段となる。
【特許文献１】特開平6-319794
【特許文献２】特開平7-265337
【特許文献３】特開2004-105754
【特許文献４】特表2001-519210
【特許文献５】特開2002-85547
【特許文献６】特表2003-517326
【特許文献７】特開2006-187303
【非特許文献１】都留寛治、小川哲朗、大串始、「生体関連材料の研究技術および標準化の動向」、セラミックス、41, 549-553 (2006）
【非特許文献２】H.Maeda, T.Kasuga, and L.L.Hench, “Preparation of Poly(L-lactic acid)-Polysiloxane-Calcium Carbonate Hybrid Membranes for Guided Bone Regeneration”, Biomaterials, 27, 1216-1222 (2006)
【非特許文献３】H.Maeda, T.Kasuga, M.Nogami, and Y.Ota, “Preparation of Calcium Carbonate Composite and Their Apatite-Forming Ability in Simulated Body Fluid”, J.Ceram.Soc.Japan, 112, S804-808 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
よって本発明の目的は、骨再建能力を有効に導き出す新しいしくみを組み込んだ生体吸収性GBR膜、および工業的に有利な方法で安価に高性能（骨再建の速い）GBR膜を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ケイ素溶出型炭酸カルシウム（Si-CaCO3）と代表的にはポリ乳酸（PLA）のような生分解性樹脂とを主成分とする不織布層（以下「Si-CaCO3/PLA層」と呼ぶ。）と、代表的にはPLAのような生分解性樹脂を主成分とする不織布層（以下「PLA層」と呼ぶ。）の２層構造を有するGBR膜を提供する。また上記のようなGBR膜のSi-CaCO3/PLA層にさらにアパタイトをコーティングしたGBR膜を提供する。PLA層は軟組織の侵入を阻止し、アパタイトがコーティングされたSi-CaCO3/PLA層は細胞親和性・骨形成能を向上させる機能を有する。また、上記のようなGBR膜の製造にエレクトロスピニング法を用いた不織布製造技術を利用することで、細胞への養分供給のための連通孔を確保するとともに、患部とのフィッティング性を向上させた膜を容易に作製することができる。さらに、細胞の初期接着性を向上させる吸収性アパタイトはSBF浸漬法より容易にコーティングされる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係るGBR膜は骨芽細胞様細胞（MC3T3-E1細胞）を用いた細胞親和性評価において細胞増殖性が高いことを示し、骨再建能力に優れた生体吸収性GBR膜と期待される。また、本発明に係るGBR膜製造方法によれば、上記のような可能性を持ったGBR膜を容易かつ効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の好ましい実施の形態によれば、ポリマー溶液にプラス高電圧を印加し、マイナスに帯電したコレクターにスプレーされる過程でファイバー化を起こさせるエレクトロスピニング法とSBF浸漬の工程を経ることにより、GBR膜を製造することができる。
【００１０】
PLAをクロロホルム（CHCl3）もしくは、ジクロロメタン（DCM）に溶解させてPLA層作製用の紡糸溶液を用意する。PLA（分子量：20-30万程度）の濃度は4-12wt%が紡糸しやすい。良好な紡糸状態を維持するためにジメチルホルムアミド（DMF）または、メタノール（CH3OH）をCHCl3やDCMに対して50wt%程度まで適宜加えてもよい。PLA紡糸溶液にSi-CaCO3を加え、Si-CaCO3/PLA層作製用の紡糸溶液を用意する。Si-CaCO3/PLA層のSi-CaCO3含量が40-60wt%になるように混合すると、SBF浸漬工程において効率よくSi-CaCO3/PLAファイバー上にアパタイトを沈積することができる。または、予め所定の割合のPLAとSi-CaCO3を加熱ニーダーで混練して調製した複合体を溶媒に溶かして紡糸溶液としてもよい。Si-CaCO3は、例えば特願2006-285429に記載される方法を用いて調製する。好ましくはPLA層はポリ乳酸（PLA）のみよりなり、あるいはポリ乳酸とポリグリコール酸（PGA）との共重合体のみからなる。その他の使用可能な生分解性樹脂としては、ポリエチレングリコール（PEG)、ポリカプロラクトン（PCL)や、PLA、PGA、PEG及びPCLの共重合体のような合成高分子の他、フィブリン、コラーゲン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、キトサンのような天然高分子が挙げられる。これらはSi-CaCO3/PLA層のPLAとも置換可能である。Si-CaCO3/PLA層及びPLA層には生体用として問題ないリン酸三カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カルシウム、リン酸八カルシウム、リン酸四カルシウム、ピロリン酸カルシウム、塩化カルシウム等の無機物が含まれていてもよい。
【００１１】
エレクトロスピニング装置を用いることで、ノズルから出た電荷を帯びたPLA層、およびSi-CaCO3/PLA層作製用の紡糸溶液は、電界中、溶媒を揮発させながらファイバーとなってマイナス電極のコレクターに向かい、コレクター上で薄いファイバーの層を形成する。紡糸条件（紡糸溶液の濃度や溶媒の種類や供給速度、紡糸時間、印加電圧、ノズルとコレクターの距離など）を変えることによって所望のGBR膜にすることが可能である。また、得られた不織布をプレスすることで緻密化や膜厚を調整することもできる。PLA紡糸溶液を噴霧してPLA層を形成させ、引き続きSi-CaCO3/PLA紡糸溶液を噴霧してSi-CaCO3/PLA層を積層させ、あるいは各々の不織布を作製後、合着させることにより２層構造のGBR膜を構成する。２層構造を有するGBR膜を必要なサイズに切り取り、さらに約37℃のSBFもしくはSBFの1.5倍の無機イオン濃度の液（1.5SBF）に所定時間浸漬してSi-CaCO3/PLA層にアパタイトを析出させることで、骨再建能力を有効に導き出す新しいしくみを組み込んだ生体吸収性GBR膜が得られる。なお２層を合着後にSBF浸漬を行っても、Si-CaCO3/PLA層に含まれるケイ素がアパタイトの核形成を誘起し、かつカルシウム成分が溶出することでアパタイトの過飽和度を急激に上昇させるため、Si-CaCO3/PLA層表面にアパタイトが選択的に生成し、一方PLA層の表面は疎水性であるから実質的にアパタイトが生成することはない。
【実施例】
【００１２】
以下、本発明に係るGBR膜の製造方法の実施例について説明する。以下の実施例についての説明は本発明をより深く理解するためのものであって、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
【００１３】
各実施例では以下に示す原料を使用した。
・ケイ素溶出型炭酸カルシウム（Si-CaCO3）：消石灰（ミクロスターT 純度96%以上 矢橋工業株式会社）、メタノール（特級試薬 純度99.8%以上 キシダ化学株式会社）、γ‐アミノプロピルトリエトキシシラン（TSL8331 純度98%以上 GE東芝シリコーン株式会社）、炭酸ガス（高純度液化炭酸ガス 純度99.9% 大洋化学工業株式会社）を用いて調製されたSi含量：2.9wt%のバテライト
・ポリ乳酸（PLA）：PURASORB PL Poly(L-lactide) 分子量20-30万 PURAC biochem
・クロロホルム（CHCl3）：特級試薬 純度99.0%以上 キシダ化学株式会社
・N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）：特級試薬 純度99.5%以上 キシダ化学株式会社
【００１４】
（実施例１）
PLA:10g、CHCl3:110g、DMF:27.5gを混合した紡糸溶液（PLA:6.8wt%）、Si-CaCO3:15g、PLA:10g、CHCl3:140g、DMF:35gを混合した紡糸溶液（Si-CaCO3:7.5wt%、PLA:5.0wt%）を準備した。これらの紡糸溶液を用いて、エレクトロスピング法により不織布２層構造を有するGBR膜を作製した。
【００１５】
[PLA層作製条件]
紡糸溶液供給速度：約0.1ml/min、印加電圧：15kV、ノズルとコレクターの距離：10cm、ノズル：15cm/minで左右（3-4cm幅）に移動、コンベア式コレクター（コンベア速度：5-6m/min）、紡糸時間：約170分
【００１６】
[Si-CaCO3/PLA層作製条件]
紡糸溶液供給速度：約0.16ml/min、印加電圧：20kV、ノズルとコレクターの距離：10cm、ノズル：15cm/minで左右（3-4cm幅）に移動、コンベア式コレクター（コンベア速度：5-6m/min）、紡糸時間：約130分
【００１７】
図１の走査型電子顕微鏡（SEM）写真に得られたPLA層（軟組織侵入防止面）の微構造を示す。図２のSEM写真にSi-CaCO3/PLA層（骨再生面）の微構造を示す。PLAファイバーに粒状のSi-CaCO3が含有されていることが確認できる。
【００１８】
（実施例２）
PLA:9g、CHCl3:91gを混合した紡糸溶液（PLA:9.0wt%）を用いてエレクトロスピニング法によりPLA層を作製した。
【００１９】
[PLA層作製条件]
紡糸溶液供給速度：0.05ml/min、印加電圧：20kV、ノズルとコレクターの距離：15cm、ノズル：固定、プレートコレクター：固定、紡糸時間：60分
PLAとSi-CaCO3を加熱ニーダーで200℃、15分間混練してSi-CaCO3を60wt%含有するSi-CaCO3/PLA複合体を調製した。Si-CaCO3/PLA複合体：25g、CHCl3:90gを混合した紡糸溶液（Si-CaCO3:13.0wt%、PLA:8.7wt%）を用いて、エレクトロスピング法によりSi-CaCO3/PLA層を作製した。
【００２０】
[Si-CaCO3/PLA層作製条件]
紡糸溶液供給速度：0.05ml/min、印加電圧：20kV、ノズルとコレクターの距離：15cm、ノズル：固定、プレートコレクター：固定、紡糸時間：30分
【００２１】
以上の手順で作製された２種の不織布を必要なサイズに切り取り、合着させて１枚の膜とする。Si-CaCO3/PLA層の上にPLA層、その上にステンレスメッシュ（40メッシュ）を重ね合わせた。この上に150-160℃に加熱した板を載せ、10秒程、適当に押さえつけることで合着した膜が得られた。図３にPLA層面のSEM写真を示す。図４にSi-CaCO3/PLA層面のSEM写真、図５にSi-CaCO3/PLA層を構成するファイバーのSEM写真を示す。PLAファイバーに粒状のSi-CaCO3が含有されていることが確認できる。
【００２２】
得られた合着膜のSi-CaCO3/PLA層面を37℃の1.5SBFに１日接液させた。図６に接液面のファイバーのSEM写真を示す。図５と比較すると明らかにSi-CaCO3とは異なる物質がファイバー表面を覆っている状態が観察される。図７に1.5SBF浸漬前後のX線回折パターンを示す。浸漬後にはアパタイトのピークが認められる。これらのことからSi-CaCO3/PLA層面がアパタイトでコーティングされていることが確認できる。
【００２３】
図８にアパタイトがコーティングされたSi-CaCO3/PLA層面（Si-composite）とPLA層面（PLA）、コントロール（Thermanox：細胞培養用に表面処理されたプラスチックスディスク）に骨芽細胞様細胞を播種した後の細胞数（1cm2あたりの細胞数に換算）の変化を示す。PLAに新機構を組み込んだ面は骨芽細胞増殖性が高いことを示し、骨再建能力に優れた生体吸収性GBR膜と期待される。
【００２４】
実験条件
・培養
24wellプレート使用
細胞種；マウス骨芽細胞様細胞（MC3T3-E1細胞：理研）
細胞播種数；1X104cell/well
培地；α-MEM（10%ウシ胎仔血清含有）
培地交換；播種翌日、その後は１日おき
・細胞カウント方法
Cell Counting Kit-8（細胞増殖/細胞毒性測定試薬、株式会社同仁化学研究所）を使用。試薬添付のプロトコルに沿って処理。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、実施例１で作製したGBR膜のPLA層面のSEM写真である。
【図２】図２は、実施例１で作製したGBR膜のSi-CaCO3/PLA層面のSEM写真である。
【図３】図３は、実施例２で作製したPLA層面のSEM写真である。
【図４】図４は、実施例２で作製したSi-CaCO3/PLA層面のSEM写真である。
【図５】図５は、実施例２で作製したSi-CaCO3/PLA層を構成するファイバーのSEM写真である。
【図６】図６は、実施例２で作製した合着膜を1.5SBFに浸漬した後のSi-CaCO3/PLA層を構成するファイバーのSEM写真である。
【図７】図７は、実施例２で作製した合着膜の1.5SBF浸漬前後のX線回折パターンを示した図である。
【図８】図８は、実施例２で作製したSi-CaCO3/PLA層とPLA層の細胞親和性評価を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に口腔や顎顔面手術の分野において広く利用される骨欠損修復方法のひとつである骨組織誘導再生（Guided Bone Regeneration；GBR）法に用いられる骨再生誘導（GBR）膜およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
GBR膜は骨形成に寄与しない細胞や組織の骨欠損部への侵入を防ぎ、骨の自己再生能力を活かし、骨を再建させるために欠損部を覆う遮蔽膜である。この膜を用いるGBR法は生体が本来もっている治癒力を利用して骨欠損を治癒するもので、手術法も複雑でなく口腔外科では多くの良好な結果が得られている。
【０００３】
GBR膜の種類としては非吸収性膜と吸収性膜に大別される。非吸収性の膜材料としてポリテトラフルオロエチレン（expanded polytetrafluoroetylene；ePTEF）が実用化されており、すでに良好な臨床成績を得ている。しかし、非吸収性であるために欠損部の修復後、膜を取り除くための２次手術が必要となり患者への負担は軽くない。また、生体不活性（非吸収性）であるため大きな欠損部への適用は難しい。そこで、２次手術による外科的侵襲を避けることができる生体吸収性の合成ポリエステルであるポリ乳酸やポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体、生物由来のコラーゲンや筋膜などを用いたGBR膜の研究開発が最近では盛んに実施され、一部製品化されている。例えば、吸収性ポリマーとリン酸三カルシウムやヒドロキシアパタイトとの複合体を含み微細孔を有する骨再生膜（特許文献１）、生体吸収性材料で形成されたフェルトからなる保護膜（特許文献２、３）、コラーゲンからなるスポンジ様マトリックス層と比較的不浸透性のバリヤ層からなる多層膜（特許文献４）、各種生体吸収性ポリマーを組み合わせた高分子ブレンドからなる有孔性シート状構造の歯科用吸収性組織再生膜（特許文献５）、連続的なマクロ多孔性シートの形態の再吸収性の可撓性移植片（特許文献６）、生体分解性樹脂粉末にレーザーを照射して３次元粉体造形する生体適合膜（特許文献７）など、様々なGBR膜とその製造方法が提案されている。
【０００４】
特に超高齢化社会における健康維持において、咀嚼能力の維持確保は極めて重要であり、口腔や顎の骨欠損には一刻も早い治癒が望まれている。骨形成能を向上させるために生体吸収性膜に骨形成伝導剤（特許文献１）、成長因子または骨形態発生因子（特許文献４、７）を含有させる試みもあるが、このような因子を取り扱うことは容易ではない。骨の自己再生をより確実に早くさせる骨再建能力に優れた生体吸収性GBR膜の開発が求められている。
【０００５】
最近の生体関連材料の研究技術動向を見ると、材料と骨とを結合させるという材料設計から、本物の骨を再生させるための材料設計に研究内容がシフトしており、骨形成に及ぼすケイ素の役割が注目され、ケイ素含有を特徴とした材料設計が数多く見られる（非特許文献１）。例えば、ケイ素の徐放により細胞への遺伝子的働きかけが行なわれ、骨生成が促進されることが報告されている（非特許文献２）。また、３種の炭酸カルシウム（カルサイト、アラゴナイト、バテライト）とポリ乳酸の複合体を擬似体液（SBF）に浸漬させると、最も短時間で骨似アパタイトがその表面に生成したものはバテライトとポリ乳酸の複合体であることが示されている（非特許文献３）。これらのことから、ケイ素を徐放するバテライトを用いることが骨再建の速いGBR膜を提供するための重要な手段となる。
【特許文献１】特開平6-319794
【特許文献２】特開平7-265337
【特許文献３】特開2004-105754
【特許文献４】特表2001-519210
【特許文献５】特開2002-85547
【特許文献６】特表2003-517326
【特許文献７】特開2006-187303
【非特許文献１】都留寛治、小川哲朗、大串始、「生体関連材料の研究技術および標準化の動向」、セラミックス、41, 549-553 (2006）
【非特許文献２】H.Maeda, T.Kasuga, and L.L.Hench, “Preparation of Poly(L-lactic acid)-Polysiloxane-Calcium Carbonate Hybrid Membranes for Guided Bone Regeneration”, Biomaterials, 27, 1216-1222 (2006)
【非特許文献３】H.Maeda, T.Kasuga, M.Nogami, and Y.Ota, “Preparation of Calcium Carbonate Composite and Their Apatite-Forming Ability in Simulated Body Fluid”, J.Ceram.Soc.Japan, 112, S804-808 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
よって本発明の目的は、骨再建能力を有効に導き出す新しいしくみを組み込んだ生体吸収性GBR膜、および工業的に有利な方法で安価に高性能（骨再建の速い）GBR膜を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ケイ素溶出型炭酸カルシウム（Si-CaCO3）と代表的にはポリ乳酸（PLA）のような生分解性樹脂とを主成分とする不織布層（以下「Si-CaCO3/PLA層」と呼ぶ。）と、代表的にはPLAのような生分解性樹脂を主成分とする不織布層（以下「PLA層」と呼ぶ。）の２層構造を有するGBR膜を提供する。また上記のようなGBR膜のSi-CaCO3/PLA層にさらにアパタイトをコーティングしたGBR膜を提供する。PLA層は軟組織の侵入を阻止し、アパタイトがコーティングされたSi-CaCO3/PLA層は細胞親和性・骨形成能を向上させる機能を有する。また、上記のようなGBR膜の製造にエレクトロスピニング法を用いた不織布製造技術を利用することで、細胞への養分供給のための連通孔を確保するとともに、患部とのフィッティング性を向上させた膜を容易に作製することができる。さらに、細胞の初期接着性を向上させる吸収性アパタイトはSBF浸漬法より容易にコーティングされる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係るGBR膜は骨芽細胞様細胞（MC3T3-E1細胞）を用いた細胞親和性評価において細胞増殖性が高いことを示し、骨再建能力に優れた生体吸収性GBR膜と期待される。また、本発明に係るGBR膜製造方法によれば、上記のような可能性を持ったGBR膜を容易かつ効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の好ましい実施の形態によれば、ポリマー溶液にプラス高電圧を印加し、マイナスに帯電したコレクターにスプレーされる過程でファイバー化を起こさせるエレクトロスピニング法とSBF浸漬の工程を経ることにより、GBR膜を製造することができる。
【００１０】
PLAをクロロホルム（CHCl3）もしくは、ジクロロメタン（DCM）に溶解させてPLA層作製用の紡糸溶液を用意する。PLA（分子量：20-30万程度）の濃度は4-12wt%が紡糸しやすい。良好な紡糸状態を維持するためにジメチルホルムアミド（DMF）または、メタノール（CH3OH）をCHCl3やDCMに対して50wt%程度まで適宜加えてもよい。PLA紡糸溶液にSi-CaCO3を加え、Si-CaCO3/PLA層作製用の紡糸溶液を用意する。Si-CaCO3/PLA層のSi-CaCO3含量が40-60wt%になるように混合すると、SBF浸漬工程において効率よくSi-CaCO3/PLAファイバー上にアパタイトを沈積することができる。または、予め所定の割合のPLAとSi-CaCO3を加熱ニーダーで混練して調製した複合体を溶媒に溶かして紡糸溶液としてもよい。Si-CaCO3は、例えば特願2006-285429に記載される方法を用いて調製する。好ましくはPLA層はポリ乳酸（PLA）のみよりなり、あるいはポリ乳酸とポリグリコール酸（PGA）との共重合体のみからなる。その他の使用可能な生分解性樹脂としては、ポリエチレングリコール（PEG)、ポリカプロラクトン（PCL)や、PLA、PGA、PEG及びPCLの共重合体のような合成高分子の他、フィブリン、コラーゲン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、キトサンのような天然高分子が挙げられる。これらはSi-CaCO3/PLA層のPLAとも置換可能である。Si-CaCO3/PLA層及びPLA層には生体用として問題ないリン酸三カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カルシウム、リン酸八カルシウム、リン酸四カルシウム、ピロリン酸カルシウム、塩化カルシウム等の無機物が含まれていてもよい。
【００１１】
エレクトロスピニング装置を用いることで、ノズルから出た電荷を帯びたPLA層、およびSi-CaCO3/PLA層作製用の紡糸溶液は、電界中、溶媒を揮発させながらファイバーとなってマイナス電極のコレクターに向かい、コレクター上で薄いファイバーの層を形成する。紡糸条件（紡糸溶液の濃度や溶媒の種類や供給速度、紡糸時間、印加電圧、ノズルとコレクターの距離など）を変えることによって所望のGBR膜にすることが可能である。また、得られた不織布をプレスすることで緻密化や膜厚を調整することもできる。PLA紡糸溶液を噴霧してPLA層を形成させ、引き続きSi-CaCO3/PLA紡糸溶液を噴霧してSi-CaCO3/PLA層を積層させ、あるいは各々の不織布を作製後、合着させることにより２層構造のGBR膜を構成する。２層構造を有するGBR膜を必要なサイズに切り取り、さらに約37℃のSBFもしくはSBFの1.5倍の無機イオン濃度の液（1.5SBF）に所定時間浸漬してSi-CaCO3/PLA層にアパタイトを析出させることで、骨再建能力を有効に導き出す新しいしくみを組み込んだ生体吸収性GBR膜が得られる。なお２層を合着後にSBF浸漬を行っても、Si-CaCO3/PLA層に含まれるケイ素がアパタイトの核形成を誘起し、かつカルシウム成分が溶出することでアパタイトの過飽和度を急激に上昇させるため、Si-CaCO3/PLA層表面にアパタイトが選択的に生成し、一方PLA層の表面は疎水性であるから実質的にアパタイトが生成することはない。
【実施例】
【００１２】
以下、本発明に係るGBR膜の製造方法の実施例について説明する。以下の実施例についての説明は本発明をより深く理解するためのものであって、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
【００１３】
各実施例では以下に示す原料を使用した。
・ケイ素溶出型炭酸カルシウム（Si-CaCO3）：消石灰（ミクロスターT 純度96%以上 矢橋工業株式会社）、メタノール（特級試薬 純度99.8%以上 キシダ化学株式会社）、γ‐アミノプロピルトリエトキシシラン（TSL8331 純度98%以上 GE東芝シリコーン株式会社）、炭酸ガス（高純度液化炭酸ガス 純度99.9% 大洋化学工業株式会社）を用いて調製されたSi含量：2.9wt%のバテライト
・ポリ乳酸（PLA）：PURASORB PL Poly(L-lactide) 分子量20-30万 PURAC biochem
・クロロホルム（CHCl3）：特級試薬 純度99.0%以上 キシダ化学株式会社
・N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）：特級試薬 純度99.5%以上 キシダ化学株式会社
【００１４】
（実施例１）
PLA:10g、CHCl3:110g、DMF:27.5gを混合した紡糸溶液（PLA:6.8wt%）、Si-CaCO3:15g、PLA:10g、CHCl3:140g、DMF:35gを混合した紡糸溶液（Si-CaCO3:7.5wt%、PLA:5.0wt%）を準備した。これらの紡糸溶液を用いて、エレクトロスピング法により不織布２層構造を有するGBR膜を作製した。
【００１５】
[PLA層作製条件]
紡糸溶液供給速度：約0.1ml/min、印加電圧：15kV、ノズルとコレクターの距離：10cm、ノズル：15cm/minで左右（3-4cm幅）に移動、コンベア式コレクター（コンベア速度：5-6m/min）、紡糸時間：約170分
【００１６】
[Si-CaCO3/PLA層作製条件]
紡糸溶液供給速度：約0.16ml/min、印加電圧：20kV、ノズルとコレクターの距離：10cm、ノズル：15cm/minで左右（3-4cm幅）に移動、コンベア式コレクター（コンベア速度：5-6m/min）、紡糸時間：約130分
【００１７】
図１の走査型電子顕微鏡（SEM）写真に得られたPLA層（軟組織侵入防止面）の微構造を示す。図２のSEM写真にSi-CaCO3/PLA層（骨再生面）の微構造を示す。PLAファイバーに粒状のSi-CaCO3が含有されていることが確認できる。
【００１８】
（実施例２）
PLA:9g、CHCl3:91gを混合した紡糸溶液（PLA:9.0wt%）を用いてエレクトロスピニング法によりPLA層を作製した。
【００１９】
[PLA層作製条件]
紡糸溶液供給速度：0.05ml/min、印加電圧：20kV、ノズルとコレクターの距離：15cm、ノズル：固定、プレートコレクター：固定、紡糸時間：60分
PLAとSi-CaCO3を加熱ニーダーで200℃、15分間混練してSi-CaCO3を60wt%含有するSi-CaCO3/PLA複合体を調製した。Si-CaCO3/PLA複合体：25g、CHCl3:90gを混合した紡糸溶液（Si-CaCO3:13.0wt%、PLA:8.7wt%）を用いて、エレクトロスピング法によりSi-CaCO3/PLA層を作製した。
【００２０】
[Si-CaCO3/PLA層作製条件]
紡糸溶液供給速度：0.05ml/min、印加電圧：20kV、ノズルとコレクターの距離：15cm、ノズル：固定、プレートコレクター：固定、紡糸時間：30分
【００２１】
以上の手順で作製された２種の不織布を必要なサイズに切り取り、合着させて１枚の膜とする。Si-CaCO3/PLA層の上にPLA層、その上にステンレスメッシュ（40メッシュ）を重ね合わせた。この上に150-160℃に加熱した板を載せ、10秒程、適当に押さえつけることで合着した膜が得られた。図３にPLA層面のSEM写真を示す。図４にSi-CaCO3/PLA層面のSEM写真、図５にSi-CaCO3/PLA層を構成するファイバーのSEM写真を示す。PLAファイバーに粒状のSi-CaCO3が含有されていることが確認できる。
【００２２】
得られた合着膜のSi-CaCO3/PLA層面を37℃の1.5SBFに１日接液させた。図６に接液面のファイバーのSEM写真を示す。図５と比較すると明らかにSi-CaCO3とは異なる物質がファイバー表面を覆っている状態が観察される。図７に1.5SBF浸漬前後のX線回折パターンを示す。浸漬後にはアパタイトのピークが認められる。これらのことからSi-CaCO3/PLA層面がアパタイトでコーティングされていることが確認できる。
【００２３】
図８にアパタイトがコーティングされたSi-CaCO3/PLA層面（Si-composite）とPLA層面（PLA）、コントロール（Thermanox：細胞培養用に表面処理されたプラスチックスディスク）に骨芽細胞様細胞を播種した後の細胞数（1cm2あたりの細胞数に換算）の変化を示す。PLAに新機構を組み込んだ面は骨芽細胞増殖性が高いことを示し、骨再建能力に優れた生体吸収性GBR膜と期待される。
【００２４】
実験条件
・培養
24wellプレート使用
細胞種；マウス骨芽細胞様細胞（MC3T3-E1細胞：理研）
細胞播種数；1X104cell/well
培地；α-MEM（10%ウシ胎仔血清含有）
培地交換；播種翌日、その後は１日おき
・細胞カウント方法
Cell Counting Kit-8（細胞増殖/細胞毒性測定試薬、株式会社同仁化学研究所）を使用。試薬添付のプロトコルに沿って処理。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、実施例１で作製したGBR膜のPLA層面のSEM写真である。
【図２】図２は、実施例１で作製したGBR膜のSi-CaCO3/PLA層面のSEM写真である。
【図３】図３は、実施例２で作製したPLA層面のSEM写真である。
【図４】図４は、実施例２で作製したSi-CaCO3/PLA層面のSEM写真である。
【図５】図５は、実施例２で作製したSi-CaCO3/PLA層を構成するファイバーのSEM写真である。
【図６】図６は、実施例２で作製した合着膜を1.5SBFに浸漬した後のSi-CaCO3/PLA層を構成するファイバーのSEM写真である。
【図７】図７は、実施例２で作製した合着膜の1.5SBF浸漬前後のX線回折パターンを示した図である。
【図８】図８は、実施例２で作製したSi-CaCO3/PLA層とPLA層の細胞親和性評価を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケイ素溶出型炭酸カルシウムと生分解性樹脂とを主成分とする不織布層と、生分解性樹脂を主成分とする不織布層との２層構造を有する骨再生誘導膜。
【請求項２】
ケイ素溶出型炭酸カルシウムと生分解性樹脂とを主成分とする不織布層の表面が擬似体液浸漬法により析出させたアパタイトでコートされていることを特徴とする請求項１に記載の骨再生誘導膜。
【請求項３】
生分解性樹脂がポリ乳酸である請求項１又は２に記載の骨再生誘導膜。
【請求項４】
ケイ素溶出型炭酸カルシウムがバテライト相である請求項１乃至３のいずれかに記載の骨再生誘導膜。
【請求項５】
エレクトロスピニング法を用いてケイ素溶出型炭酸カルシウムと生分解性樹脂とを主成分とする不織布を形成する工程と、エレクトロスピニング法を用いて生分解性樹脂を主成分とする不織布を形成する工程を包含する骨再生誘導膜の製造方法。
【請求項６】
生分解性樹脂がポリ乳酸である請求項５に記載の骨再生誘導膜の製造方法。
【請求項７】
ケイ素溶出型炭酸カルシウムがバテライト相である請求項５又は６に記載の骨再生誘導膜の製造方法。
【請求項１】
ケイ素溶出型炭酸カルシウムと生分解性樹脂とを主成分とする不織布層と、生分解性樹脂を主成分とする不織布層との２層構造を有する骨再生誘導膜。
【請求項２】
ケイ素溶出型炭酸カルシウムと生分解性樹脂とを主成分とする不織布層の表面が擬似体液浸漬法により析出させたアパタイトでコートされていることを特徴とする請求項１に記載の骨再生誘導膜。
【請求項３】
生分解性樹脂がポリ乳酸である請求項１又は２に記載の骨再生誘導膜。
【請求項４】
ケイ素溶出型炭酸カルシウムがバテライト相である請求項１乃至３のいずれかに記載の骨再生誘導膜。
【請求項５】
エレクトロスピニング法を用いてケイ素溶出型炭酸カルシウムと生分解性樹脂とを主成分とする不織布を形成する工程と、エレクトロスピニング法を用いて生分解性樹脂を主成分とする不織布を形成する工程を包含する骨再生誘導膜の製造方法。
【請求項６】
生分解性樹脂がポリ乳酸である請求項５に記載の骨再生誘導膜の製造方法。
【請求項７】
ケイ素溶出型炭酸カルシウムがバテライト相である請求項５又は６に記載の骨再生誘導膜の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−６１１０９（Ｐ２００９−６１１０９Ａ）
【公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３１６２１（Ｐ２００７−２３１６２１）
【出願日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、経済産業省中部経済産業局、中小企業地域新生コンソーシアム研究開発事業（機能性炭酸カルシウム微粒子を用いた骨再生誘導膜製造技術の開発）委託研究、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９１０３９６４３）矢橋工業株式会社 (10)
【出願人】（３０４０２１２７７）国立大学法人 名古屋工業大学 (784)
【出願人】（５９２０８１６４５）山八歯材工業株式会社 (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、経済産業省中部経済産業局、中小企業地域新生コンソーシアム研究開発事業（機能性炭酸カルシウム微粒子を用いた骨再生誘導膜製造技術の開発）委託研究、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９１０３９６４３）矢橋工業株式会社 (10)
【出願人】（３０４０２１２７７）国立大学法人 名古屋工業大学 (784)
【出願人】（５９２０８１６４５）山八歯材工業株式会社 (5)
【Ｆターム（参考）】
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