鳥インフルエンザウイルス感染の予防的治療のためのポリＩＣＬＣカプセル化リポソーム
改善された治療効果を有するポリＩＣＬＣ製剤を用いた、鳥インフルエンザウイルス感染の治療方法が開示される。ポリＩＣＬＣは、リポソーム内にカプセル化され、このリポソームはゆっくりとした持続放出特性を有するドラッグデリバリシステムをもたらすとともに、正常な組織に全身的な負荷を引き起こさずに感染の部位を狙って薬剤を用いる能力を有する。これにより、ポリＩＣＬＣの免疫学的活性および生物学的活性が増強される。このポリＩＣＬＣ製剤は、鳥インフルエンザウイルス感染の治療に特に効果的であって、また特に、鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス感染の治療に効果的である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年１１月３日出願の米国仮特許出願番号第６０/８５６,３１０号の利益を享受する優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、改善された治療効果を有するポリＩＣＬＣ製剤を用いた鳥インフルエンザウイルス感染の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
世界保健機関に報告されたヒトの鳥インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）感染症例は、２００３年から毎年増加しており（２００３年には４感染症例であったのが、２００６年には１０９感染症例にまで増加）、現在、世界的に、インフルエンザの地球規模的パンデミックが起こりつつあることが問題となっている。
【０００４】
抗ウイルス剤及びワクチン両方に対する耐性を増すことにより発達してきた季節性インフルエンザウイルス及び鳥インフルエンザウイルス両方が発達してきたこと、また、ウイルス内の一定の構造変化のためにワクチンの設計及び生産が困難であるという観点から、広域スペクトルであるとともに遺伝的構成に左右されない新しい抗ウイルスへの取り組みを発展させるための必然的な理由が存在する。このような取り組みの発展により、薬剤耐性の可能性が減少されるだけでなく、人畜共通由来のインフルエンザウイルスの新種の変異に対する予防も与えられる。
【０００５】
鳥インフルエンザ或いはパンデミックインフルエンザウイルス及び季節性インフルエンザウイルス間の重大な違いとして、前者のウイルスは大規模な炎症を感染者の気道に引き起こすことである。鳥インフルエンザ及びパンデミックインフルエンザウイルスによって引き起こされた気道の炎症は、通常の季節性インフルエンザウイルスにより引き起こされた気道の炎症レベルの約１０倍であると推定される。またこのことは、鳥インフルエンザ及びパンデミックインフルエンザ両方の犠牲者に見られる致死率の増加に寄与する要因である。大規模な炎症を緩和するための新たな方法の発展は重要ではあるが、時として鳥インフルエンザ及びパンデミックインフルエンザに対する包括的戦略の一部を見落とすことになる。
【０００６】
二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、非常に強力な生物学的修飾因子であるとともに、鳥インフルエンザに対する広域スペクトラムの免疫学的予防としての役割を潜在的に果たすことが可能である。ｄｓＲＮＡは、ナノモル濃度の細胞に絶大な影響力を発揮することができる。ｄｓＲＮＡの調節作用は、分子レベル及び細胞レベルにおける作用の広域スペクトラムを含む。分子レベルにおいては、ｄｓＲＮＡは、例えばインターフェロン合成、タンパク質キナーゼの誘発、２−５Ａポリメラーゼの誘発、組織適合光源の増強及び代謝の誘発等といった生物学的活性を引き起こすことが可能である。細胞レベルにおいては、ｄｓＲＮＡは、例えば発熱性、分裂促進性、マクロファージ活性化、細胞性の免疫活性化及び抗ウイルス状態の誘発等の生物学的活性を引き起こすことが可能である。ｄｓＲＮＡのある際立った特徴は、抗菌療法及び抗ガン治療における免疫調節効果である。特に、二重鎖ＲＮＡポリＩＣＬＣ、つまりＰＩＣＬＣは、抗ウイルス剤或いは抗腫瘍薬として非常に効果的であることが発見された。二重鎖ＲＮＡポリＩＣＬＣは、炎症促進性のサイトカイン経路の損傷効果を下方制御する一方、抗ウイルス経路（例：2'-5'オリゴアデニル酸シンターゼ経路）の有益な要素を発揮するため宿主を弱めるのに用いることができると考えられている。
【０００７】
ポリＩＣＬＣは合成ｄｓＲＮＡであって、ポリ−Ｌ−リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリリボイノシン酸及びポリリボシチジル酸のらせん構造（ポリＩ．ポリＣ）から構成される。結果として生じたポリＩＣＬＣは、熱力学的にポリＩ．ポリＣよりさらに安定している。ポリＩＣＬＣは臨床試験において、神経膠腫の腫瘍治療に効果的であることがわかっている（非特許文献１）。またポリＩＣＬＣは、多数の研究において、インフルエンザ（非特許文献２）、狂犬病（非特許文献３）、リフトバレー熱（非特許文献４）、及びベネズエラウマ脳脊髄炎（非特許文献５）を含むウイルス感染の免疫療法に効果的であることがわかっている。
【０００８】
ポリＩＣＬＣは、有望な免疫修飾物質であるとともに、抗菌療法及び抗ガン治療に大いなる潜在力を有するけれども、ヒトに重大な副作用をもたらすことがわかっている。特にこの副作用は、薬剤が複合的に高用量で投与された場合特に起こる。報告された副作用（非特許文献６）の中には、熱、血圧低下、白血球減少、筋肉痛、血小板減少症及び多発性関節痛が含まれる。この固有の毒性問題は、ポリＩＣＬＣをより安全な状態でヒトに使用するために克服される必要がある。さらに、ポリＩＣＬＣの治療効果は、生体内での安定性により制限される。リボ核酸として、ポリＩＣＬＣは血清ＲＮＡ分解酵素による体内での分解の影響を受けやすい。ポリＩＣＬＣのＲＮＡ分解酵素の分解の範囲は、ポリＩ．ポリＣの分解と比較して非常に改善されているが、予防は完璧なものではない。また、ポリ−Ｌ−リジン及びカルボキシメチルセルロース自身は、生体内の酵素分解及び免疫的な除去の影響を受けやすい。したがって、治療効果が改善され、またヒトへの使用がより安全な改善されたポリＩＣＬＣ製剤が必要とされている。また、鳥インフルエンザウイルスに対するポリＩＣＬＣの治療効果も証明される必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Neurosurgery 38:1096-1104,（Salazar A, M.他）
【非特許文献２】Antimicrob. Agents Chemother, 39:574-2576（Wong,J.P.）
【非特許文献３】J.Infect.Dis.136:286-292（Baer,G.M.）
【非特許文献４】J.Biol.Response Modifiers 4:503-511（Kende,M.）
【非特許文献５】J.Infect.Dis.136:267-272（Stephen,E.L.）
【非特許文献６】Cancer Treat. Rep.62:1907-1913（Levine,A.S.）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ヒトにおける毒性効果を減少させるとともに、鳥インフルエンザに対する増強された治療効果を有するポリＩＣＬＣ製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のある態様によれば、哺乳類における鳥インフルエンザウイルス感染の予防的治療のための方法であって、リポソーム内でカプセル化されたポリＩＣＬＣを有する免疫調節薬を前記哺乳類に投与する工程を備える方法がもたらされる。
【００１２】
好ましくは、用いるリポソームは単層或いは多重層であるとともに、１以上のカチオン性リン脂質を含有する。このカチオン性リン脂質は例えば、ステアリルアミン、１，２−ジアチル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）或いは１，２−トリアチル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＡＰ）等である。最も好ましくは、リポソームは単層或いは多重層であって、フォスファチジルコリン、ステアリルアミンの脂質、及びステロイドコレステロールから調製される。また、それぞれの脂質のモル比は約９：１：１である。表面リポソームは、ポリエチレングリコールで覆われ、リポソームの循環半減期を延長させる。また表面リポソームは体内の特定の部位に目標を定める抗体で覆われる。
【００１３】
中性荷電リポソームはまた、ポリＩＣＬＣのリポソーム封入に用いられることが可能である。このような中性荷電リポソームは、例えばフォスファチジルコリン及びコレステロールを用いて調製される。
【００１４】
本発明に包含される鳥インフルエンザは、鳥に感染するインフルエンザＡウイルスの全ての亜型を含む。周知のＨＡ亜型は１６種類、及びＮＡ亜型は９種類が存在する。鳥及びヒト両方に感染することで知られる鳥インフルエンザＡウイルスの３つの主要な亜型は、インフルエンザＡＨ５型（Ｈ５型の９つの潜在的な亜型が周知である）、インフルエンザＡＨ７型（Ｈ７型の９つの潜在的な亜型が周知である）、及びインフルエンザＡＨ９型（Ｈ９型の９つの潜在的な亜型が周知である）である。これらのうち、鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスが好ましいとされる。
【００１５】
本発明の他の態様によると、リポソームポリＩＣＬＣを調整する方法が提供され、この方法は、リポソーム及びポリＩＣＬＣの混合物を凍結乾燥する工程を有する。好都合なことに、この方法は、リン脂質の混合物から有機溶媒を除去すること、その結果生じた脂質混合物をポリＩＣＬＣを含む水性緩衝液を用いて再水和すること、その結果生じた脂質とポリＩＣＬＣの混合物を凍結乾燥すること、その結果生じた乾燥混合物を水で戻すこと、及びその結果生じたリポソームのペレットを緩衝液を用いて、使用前に所望の薬物濃度にまで再懸濁することを含む。好適な緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、脱イオン水である。緩衝液の調製に際しＲＮＡｓｅを含まない水を用いることが重要であり、これによりポリＩＣＬＣの酵素分解が最小化される。
【００１６】
リポソームの調製の代替方法は、界面活性剤透析、放出、逆相蒸発法（ＲＥＶ）、及び超音波処理を含む。ポリＩＣＬＣのリポソームへのロードは、受動的に捕捉すること及びリモートローディング法等の能動的過程により達成される。非封入のポリＩＣＬＣは、遠心分離、カラム分離或いは透析により除去される。
【００１７】
リポソーム内のポリＩＣＬＣのカプセル化における利点は、ポリＩＣＬＣの毒性が減少すると同時に、ポリＩＣＬＣの治療効果が増加することである。さらに、リポソームポリＩＣＬＣは、体内のＲＮＡｓｅ分解からポリＩＣＬＣを保護する。したがって、ポリＩＣＬＣの免疫学的活性及び生物学的活性が増強される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】リポソームのポリＩＣＬＣの治療効果と対比した遊離ポリＩＣＬＣの治療効果に関する試験結果を示すグラフである。
【図２】リポソームのポリＩＣＬＣの毒性と対比した遊離ポリＩＣＬＣの毒性に関する試験結果を示すグラフである。
【図３】マウスの鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの低ウイルス追加投与量に対する対照と対比したリポソームのポリＩＣＬＣの治療効果に関する試験結果を示すグラフである。
【図４】マウスの鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの高ウイルス追加投与量に対する対照と対比したリポソームのポリＩＣＬＣの治療効果に関する試験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜ポリＩＣＬＣ＞
ポリＩＣＬＣは、アイオワ大学薬学部の薬剤部（アイオワシティ、アイオワ州）により調製され、国立衛生研究所（ベテスダ、メリーランド州）により提供された。０．９％の塩化ナトリウム中、ポリＩＣＬＣ１ミリリットルに対しポリＩ．ポリＣが２ｍｇ、ポリエルリジン１．５ｍｇ、及びカルボキシメチルセルロースが５ｍｇ含まれていた。
【００２０】
＜ポリＩＣＬＣカプセル化リポソーム＞
リポソームは微細な脂質小胞で、１以上の脂質二重層及び水性コンパートメントから構成される。リポソームの主要構成物は、通常はリン脂質とコレステロール等のステロイドの組み合わせである。リン酸脂質は、陽性、中性及び陰性荷電される。陽性及び陰性荷電されたリン酸脂質から作られたリポソームはそれぞれ、カチオン性リポソーム及びアニオン性リポソームと呼ばれる。ＤＮＡ及びＲＮＡは通常陰性荷電されるので、カチオン性リポソームはリポソームポリＩＣＬＣ製剤を作るのに選択されるリポソームである。リポソームのポリＩＣＬＣを作るために用いるカチオン性リン酸脂質は、ステアリルアミン、１，２−ジアチル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）或いは１，２−トリアチル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＡＰ）が好適である。コレステロールは二重層を安定化するために含まれる。リポソーム表面はポリエチレングリコールで覆われてもよく、これによりその循環が延長される。プロテインもまたリポソーム膜と結合してもよく、これにより特定の細胞受容体の結合が促進される。
【００２１】
ポリＩＣＬＣの封入に用いられるリポソームは、大型多重層リポソーム（ＭＬＶ）、小型単層リポソーム（ＳＵＶ）或いは大型単層リポソーム（ＬＵＶ）であってよい。好ましくは、多重層リポソームはリポソームポリＩＣＬＣの調製に用いられる。
【００２２】
ドラッグデリバリシステムとして用いられる場合、リポソームはゆっくりとした持続放出特性を有するとともに、正常な組織に全身的な負荷を引き起こさずに感染の部位及び腫瘍に狙って薬剤を用いる能力を有する。リポソームは多数の治療薬を封入するのにうまく用いられてきた。この治療薬とは、抗生物質、抗ウイルス薬、及び抗ガン剤である。これらの特性のため、リポソームポリＩＣＬＣは、ポリＩＣＬＣの容量依存的毒性を有意に減少させることができる、優れたドラッグデリバリシステムである。さらに、リポソームのカプセル化は、ポリＩＣＬＣを体内のＲＮＡ分解酵素の分解から保護する。したがって、ポリＩＣＬＣの治療効果が増強される。
【００２３】
＜調製＞
リポソームは、フォスファチジルコリン２１０ｍｇ（２１０.mu.mole）、ステアリルアミン２３．２ｍｇ（２３．２.mu.mole）及びコレステロール８．１ｍｇ（３０.mu.mole）を用いて調製された。脂質を１００ｍｌの丸底フラスコに加え、脂質を溶解するためにクロロホルム２ｍｌを加えた。丸底フラスコは摂氏４５度の水浴中で、乾燥した脂質薄膜が形成されるまで回転蒸発された。そしてフラスコは真空オーブン（摂氏４５度、マイナス８０キロパスカル）内に１時間配置され、残留有機溶媒を除去した。その後脂質薄膜を、ポリＩＣＬＣ３ｍｌを用いた後、０．９％のＮａＣｌ３ｍｌを用いて元に戻した。その他の好適な緩衝剤は、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水或いは脱イオン水である。緩衝液の調製には、ＲＮＡ分解酵素を含まない水を用いてポリＩＣＬＣの分解を最小化させることが重要である。その後、脂質薬の混合物をスクリューキャップチューブに移し、十分に混合し、液体窒素にチューブを浸し凍結させた。サンプルはその後、全ての液体が除去され白い乾燥した粉が得られるまで、一晩凍結乾燥された。凍結乾燥に続いて、サンプルは１００−１５０.muの１０．９％のＮａＣｌで再水和され、１５分間摂氏４５度で培養され、そして室温で２時間静置された。リポソームポリＩＣＬＣは無菌の０．９％ＮａＣｌで希釈され、超遠心分離法を用い洗浄された。リポソームのペレットはその後、マウスへ投与するための所望の薬物濃度にするため、緩衝液を用いて再懸濁された。
【００２４】
リポソームの表面は、循環を延長させるためにポリエチレングリコールで覆われるとともに、特定の感染部位及び腫瘍へのリポソームの親和性を増加させるために抗体で覆われてもよい。
【００２５】
中性的に荷電されたリポソームは、ポリＩＣＬＣのリポソーム封入に用いられてもよい。例えば、中性的に荷電されたリポソームは、フォスファチジルコリン及びコレステロールを用いて調製されてもよい。
【００２６】
リポソームを生産する他の調整方法は、界面活性剤透析、放出、逆相蒸発法（ＲＥＶ）、及び超音波処理を含む。ポリＩＣＬＣのリポソームへのロードは、受動捕捉（passive trapping）又はリモートローディング法等の能動的過程により達成される。非封入のポリＩＣＬＣは、遠心分離、カラム分離或いは透析により除去されることが可能である。
【００２７】
＜マウス内の卵により増殖されたインフルエンザＡ／ＰＲ／８ウイルスへの適応＞
従来の手順を用い、インフルエンザＡ／ＰＲ／８ウイルスは、肺の気道を通過して４度の盲目継代によりマウスに伝えられる。この盲目継代は、最初の摂取材料として卵により増殖されたウイルス（メリーランド州、パークローン、米国細胞バンク（ＡＴＴＣ）より入手可能）を利用するものである。ウイルスは早くも３度目の盲目継代において、マウス内で病原性になる。インフルエンザの症状としては、毛の逆立ち、体重の急激な減少、集団化、及びケージ内の動物の動きの著しい減少がある。感染したマウスの解剖により、重度の肺の病変が明らかとなり、また、肺の拡大もいくつかのマウスにおいて観察された。
【００２８】
＜試験＞
カプセル化ポリＩＣＬＣリポソームは、経鼻投与、腹腔内投与或いは静脈内投与によりマウスに投与される。用いた摂取材料の量は、経鼻投与には５０.mu.l、及び腹腔内投与或いは静脈内投与には１００.mu.lであった。経鼻投与及び腹腔内投与では、マウスは薬の投与の前にペントバルビタールナトリウムを用いて麻酔された。動物が気絶すると、鼻を上向きの状態で手で注意深く支えられ、抗ウイルス物質がマイクロピペットを用いて徐々に鼻腔に塗布された。塗布量は自然に肺の中へ吸入された。
【００２９】
麻酔されたマウスの群（１グループ５から１０のマウス）に、ポリＩＣＬＣ或いはポリＩＣＬＣカプセル化リポソームが、腹腔内投与或いは静脈内投与により１回又は２回投与された（２０.mu.g／１投与）。ウイルスの追加投与の７日、１４日及び２１日前にリポソームはマウスに投与された。その後、マウスは半数致死量10LD.sub.50のマウス適合インフルエンザＡ／ＰＲ／８ウイルスに鼻腔感染した。ウイルス感染後１４日で、ウイルス追加投与に対し生き残った数のマウスが記録された。
【００３０】
＜結果＞
マウスのインフルエンザＡ感染の致死量の追加投与に対する、マウスの予防的保護のための遊離ポリＩＣＬＣ及びポリＩＣＬＣカプセル化リポソームの効果が図１に示される。相対的に、ウイルス感染前７日以内に遊離ポリＩＣＬＣが投与されたマウスは、ウイルス感染後１４日目に１００％生存していた。しかしながら、ウイルスの追加投与の前の１４日目及び２１日目に、遊離ポリＩＣＬＣの前処置が行われていた場合、感染後１４日目の生存率は減少する。反対に、ポリＩＣＬＣカプセル化リポソーム（ＭＬＶポリＩＣＬＣ）がウイルス感染７から１４日前以内に投与されたマウスは、ウイルス感染後１４日目に１００％生存していた。これらの結果により、リポソームのカプセル化は、ポリＩＣＬＣの抗ウイルス活性及び免疫修飾活性に悪影響を与えないばかりか、むしろこれらの活性を抗ウイルス状態を延長させることにより増強させる。
【００３１】
図２を参照する。マウスの体重で計測した遊離ポリＩＣＬＣ及びリポソームポリＩＣＬＣのマウスへの毒性の影響を示す。ポリＩＣＬＣの中毒量を投与されたマウスは、体重の急速な減少、立毛及び身体運動の低下等の兆候がある。マウスは、遊離ポリＩＣＬＣの一日投与量30.mu.g/匹を２回投与された。図２を参照すると、１回目の投与は投薬後２日目に行われ、２回目の投与は投薬後０日目に行われた。マウスは投与後１から３日目以内で、最大２ｇ（全体重の約１０％近く）体重が減少した。体重の減少に加え、これらのマウスはまた、立毛（逆立てた毛）及び身体運動の低下の異常な症状や兆候を示した。反対に、ポリＩＣＬＣカプセル化リポソームを同一量与えられたマウスは著しい体重低下を示さず、また身体運動の低下の異常な症状や兆候を示さなかった。したがって、遊離した非カプセル化ポリＩＣＬＣは高い毒性を有し、その一方、ポリＩＣＬＣカプセル化リポソームは図２の結果に示されるように低い毒性を有する。リポソームポリＩＣＬＣを投与されたマウスは、体重の著しい減少を示さなかった。
【００３２】
結論として、マウスに直接投与された遊離ポリＩＣＬＣは、インフルエンザＡ型ウイルス感染に対する限定的な予防をもたらすという結果が示された。さらに、ポリＩＣＬＣを繰り返し高用量投与すると、マウスに中毒性服作用を引き起こすことがわかった。反対に、リポソームカプセル化ポリＩＣＬＣは、ウイルス感染に対し、ポリＩＣＬＣの毒性を減少させる一方治療効果を増強させることにより、効果的な治療をもたらす。
【００３３】
＜マウスの鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス感染に対するポリＩＣＬＣカプセル化リポソーム＞
鳥インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスに対するリポソームポリＩＣＬＣの予防効果を明示するため、致命的な呼吸器マウスモデルが、感染したニワトリから分離したＨ５Ｎ１インフルエンザＡウイルスの野生型を用いて作られた。このようなマウス由来の鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの感染モデルを作ることは、リポソームのポリＩＣＬＣの抗ウイルス活性の有効性の判定を可能にするのに極めて重要である。
【００３４】
有効性の研究において、Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０ｇ）の群は、４８時間置きにリポソームのポリＩＣＬＣ２０μｇを２回鼻腔内に前処置された。薬物治療後２４時間でこれらのマウスは、低用量（１ＬＤ５０）或いは高用量（４ＬＤ５０）の鳥インフルエンザＡウイルスのどちらかを鼻腔内に追加投与された。処理動物及びウイルス対照群の両方の生存率はその後毎日監視され、感染後１４日目に測定された。
【００３５】
鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの低用量及び高用量のウイルス追加投与に対する予防的保護のためのカプセル化されたリポソームポリＩＣＬＣの効率性は、図３及び図４にそれぞれ示される。図３に示される通り、低用量のウイルス或いは高用量のウイルスどちらかに感染した対照群のマウスは、感染後５から６日で開始した鳥インフルエンザの感染により死亡した。低用量のウイルス追加投与で感染した対照群のマウスは、感染後９日目までに死亡した。高用量のウイルス追加投与において、全てのマウスは感染後１４日目で死亡した。反対に、図４に示す通り、カプセル化されたリポソームポリＩＣＬＣは、少量のウイルス追加投与に対し完全な予防（１００％生存）をもたらすとともに、多量のウイルス追加投与に対しては６３から７５％の予防をもたらした。リポソームポリＩＣＬＣによりもたらされた増加するこれらの生存の度合いは、統計学的に有意差がある（高用量ウイルス及び低用量ウイルスそれぞれｐ＜０．０４０２対対照、ｐ＜０．００１４対対照）。リポソームポリＩＣＬＣで前処理されたマウスの平均生存時間はまた、対照のマウスと比較して増加していることがわかった。
【００３６】
カプセル化リポソームポリＩＣＬＣは、鳥インフルエンザウイルス感染に対し効果的な予防をもたらすことが、これらの結果により示された。
【００３７】
このＨ５Ｎ１の有効性の研究に用いられたリポソームポリＩＣＬＣの投与量は、１回投与量当たり２０μｇであった。しかしながら、鳥インフルエンザウイルスに対するその他の投与計画において一般的に、及びより具体的には、Ｈ５Ｎ１ウイルスを１から２００μｇの範囲で用いる（１回投与量当たり１から１００μｇが好適とされる）ことも可能である。もちろん、投与計画はまた、従来の理解にしたがって治療する対象の重量に基づきなされることも可能である。
【００３８】
本明細書に示され記述された実施形態及び変化例は、単に本発明の原則の具体例にすぎず、様々な変更形態は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなしに当業者により実施可能なものである。
【００３９】
また、この開示においていかなる値域であっても、各介在価値及び範囲は、或いは文脈が示さない限り、本発明に包含される。さらに、文脈が明らかに示さない限り、各値の下限値の１０分の１までの値を含むものとする。本発明はまた示されない限り、述べられた範囲の上限値及び下限値を含む。より小さな範囲（介在範囲）の上限及び下限は、独立してその小さな範囲に含まれる。述べられた範囲が、限界の１つまたは両方を含む場合には、これら含まれる限界のいずれかまたは両方を除く範囲もまた本発明に含まれる。
【００４０】
要約すれば、リポソームポリＩＣＬＣは、動物の実験研究において、季節性インフルエンザウイルス及び鳥インフルエンザウイルス両方に対し予防をもたらした。リポソームポリＩＣＬＣがインフルエンザＡウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１）の様々な亜型に対し効果的であることが示された観察により、インフルエンザウイルス及び特に、鳥インフルエンザウイルス等の変化し続ける、突然変異するウイルスを処理するのに特に非常に効果的であることが証明された。本明細書に示された実験結果から、リポソームポリＩＣＬＣが、鳥インフルエンザ、パンデミックインフルエンザ及び季節性インフルエンザに対抗する世界的な戦いにおいて、抗インフルエンザ薬及びワクチンの既存の備蓄を補完するため用いられることができる重要な薬であることが一括して証明された。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年１１月３日出願の米国仮特許出願番号第６０/８５６,３１０号の利益を享受する優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、改善された治療効果を有するポリＩＣＬＣ製剤を用いた鳥インフルエンザウイルス感染の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
世界保健機関に報告されたヒトの鳥インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）感染症例は、２００３年から毎年増加しており（２００３年には４感染症例であったのが、２００６年には１０９感染症例にまで増加）、現在、世界的に、インフルエンザの地球規模的パンデミックが起こりつつあることが問題となっている。
【０００４】
抗ウイルス剤及びワクチン両方に対する耐性を増すことにより発達してきた季節性インフルエンザウイルス及び鳥インフルエンザウイルス両方が発達してきたこと、また、ウイルス内の一定の構造変化のためにワクチンの設計及び生産が困難であるという観点から、広域スペクトルであるとともに遺伝的構成に左右されない新しい抗ウイルスへの取り組みを発展させるための必然的な理由が存在する。このような取り組みの発展により、薬剤耐性の可能性が減少されるだけでなく、人畜共通由来のインフルエンザウイルスの新種の変異に対する予防も与えられる。
【０００５】
鳥インフルエンザ或いはパンデミックインフルエンザウイルス及び季節性インフルエンザウイルス間の重大な違いとして、前者のウイルスは大規模な炎症を感染者の気道に引き起こすことである。鳥インフルエンザ及びパンデミックインフルエンザウイルスによって引き起こされた気道の炎症は、通常の季節性インフルエンザウイルスにより引き起こされた気道の炎症レベルの約１０倍であると推定される。またこのことは、鳥インフルエンザ及びパンデミックインフルエンザ両方の犠牲者に見られる致死率の増加に寄与する要因である。大規模な炎症を緩和するための新たな方法の発展は重要ではあるが、時として鳥インフルエンザ及びパンデミックインフルエンザに対する包括的戦略の一部を見落とすことになる。
【０００６】
二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、非常に強力な生物学的修飾因子であるとともに、鳥インフルエンザに対する広域スペクトラムの免疫学的予防としての役割を潜在的に果たすことが可能である。ｄｓＲＮＡは、ナノモル濃度の細胞に絶大な影響力を発揮することができる。ｄｓＲＮＡの調節作用は、分子レベル及び細胞レベルにおける作用の広域スペクトラムを含む。分子レベルにおいては、ｄｓＲＮＡは、例えばインターフェロン合成、タンパク質キナーゼの誘発、２−５Ａポリメラーゼの誘発、組織適合光源の増強及び代謝の誘発等といった生物学的活性を引き起こすことが可能である。細胞レベルにおいては、ｄｓＲＮＡは、例えば発熱性、分裂促進性、マクロファージ活性化、細胞性の免疫活性化及び抗ウイルス状態の誘発等の生物学的活性を引き起こすことが可能である。ｄｓＲＮＡのある際立った特徴は、抗菌療法及び抗ガン治療における免疫調節効果である。特に、二重鎖ＲＮＡポリＩＣＬＣ、つまりＰＩＣＬＣは、抗ウイルス剤或いは抗腫瘍薬として非常に効果的であることが発見された。二重鎖ＲＮＡポリＩＣＬＣは、炎症促進性のサイトカイン経路の損傷効果を下方制御する一方、抗ウイルス経路（例：2'-5'オリゴアデニル酸シンターゼ経路）の有益な要素を発揮するため宿主を弱めるのに用いることができると考えられている。
【０００７】
ポリＩＣＬＣは合成ｄｓＲＮＡであって、ポリ−Ｌ−リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリリボイノシン酸及びポリリボシチジル酸のらせん構造（ポリＩ．ポリＣ）から構成される。結果として生じたポリＩＣＬＣは、熱力学的にポリＩ．ポリＣよりさらに安定している。ポリＩＣＬＣは臨床試験において、神経膠腫の腫瘍治療に効果的であることがわかっている（非特許文献１）。またポリＩＣＬＣは、多数の研究において、インフルエンザ（非特許文献２）、狂犬病（非特許文献３）、リフトバレー熱（非特許文献４）、及びベネズエラウマ脳脊髄炎（非特許文献５）を含むウイルス感染の免疫療法に効果的であることがわかっている。
【０００８】
ポリＩＣＬＣは、有望な免疫修飾物質であるとともに、抗菌療法及び抗ガン治療に大いなる潜在力を有するけれども、ヒトに重大な副作用をもたらすことがわかっている。特にこの副作用は、薬剤が複合的に高用量で投与された場合特に起こる。報告された副作用（非特許文献６）の中には、熱、血圧低下、白血球減少、筋肉痛、血小板減少症及び多発性関節痛が含まれる。この固有の毒性問題は、ポリＩＣＬＣをより安全な状態でヒトに使用するために克服される必要がある。さらに、ポリＩＣＬＣの治療効果は、生体内での安定性により制限される。リボ核酸として、ポリＩＣＬＣは血清ＲＮＡ分解酵素による体内での分解の影響を受けやすい。ポリＩＣＬＣのＲＮＡ分解酵素の分解の範囲は、ポリＩ．ポリＣの分解と比較して非常に改善されているが、予防は完璧なものではない。また、ポリ−Ｌ−リジン及びカルボキシメチルセルロース自身は、生体内の酵素分解及び免疫的な除去の影響を受けやすい。したがって、治療効果が改善され、またヒトへの使用がより安全な改善されたポリＩＣＬＣ製剤が必要とされている。また、鳥インフルエンザウイルスに対するポリＩＣＬＣの治療効果も証明される必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Neurosurgery 38:1096-1104,（Salazar A, M.他）
【非特許文献２】Antimicrob. Agents Chemother, 39:574-2576（Wong,J.P.）
【非特許文献３】J.Infect.Dis.136:286-292（Baer,G.M.）
【非特許文献４】J.Biol.Response Modifiers 4:503-511（Kende,M.）
【非特許文献５】J.Infect.Dis.136:267-272（Stephen,E.L.）
【非特許文献６】Cancer Treat. Rep.62:1907-1913（Levine,A.S.）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ヒトにおける毒性効果を減少させるとともに、鳥インフルエンザに対する増強された治療効果を有するポリＩＣＬＣ製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のある態様によれば、哺乳類における鳥インフルエンザウイルス感染の予防的治療のための方法であって、リポソーム内でカプセル化されたポリＩＣＬＣを有する免疫調節薬を前記哺乳類に投与する工程を備える方法がもたらされる。
【００１２】
好ましくは、用いるリポソームは単層或いは多重層であるとともに、１以上のカチオン性リン脂質を含有する。このカチオン性リン脂質は例えば、ステアリルアミン、１，２−ジアチル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）或いは１，２−トリアチル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＡＰ）等である。最も好ましくは、リポソームは単層或いは多重層であって、フォスファチジルコリン、ステアリルアミンの脂質、及びステロイドコレステロールから調製される。また、それぞれの脂質のモル比は約９：１：１である。表面リポソームは、ポリエチレングリコールで覆われ、リポソームの循環半減期を延長させる。また表面リポソームは体内の特定の部位に目標を定める抗体で覆われる。
【００１３】
中性荷電リポソームはまた、ポリＩＣＬＣのリポソーム封入に用いられることが可能である。このような中性荷電リポソームは、例えばフォスファチジルコリン及びコレステロールを用いて調製される。
【００１４】
本発明に包含される鳥インフルエンザは、鳥に感染するインフルエンザＡウイルスの全ての亜型を含む。周知のＨＡ亜型は１６種類、及びＮＡ亜型は９種類が存在する。鳥及びヒト両方に感染することで知られる鳥インフルエンザＡウイルスの３つの主要な亜型は、インフルエンザＡＨ５型（Ｈ５型の９つの潜在的な亜型が周知である）、インフルエンザＡＨ７型（Ｈ７型の９つの潜在的な亜型が周知である）、及びインフルエンザＡＨ９型（Ｈ９型の９つの潜在的な亜型が周知である）である。これらのうち、鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスが好ましいとされる。
【００１５】
本発明の他の態様によると、リポソームポリＩＣＬＣを調整する方法が提供され、この方法は、リポソーム及びポリＩＣＬＣの混合物を凍結乾燥する工程を有する。好都合なことに、この方法は、リン脂質の混合物から有機溶媒を除去すること、その結果生じた脂質混合物をポリＩＣＬＣを含む水性緩衝液を用いて再水和すること、その結果生じた脂質とポリＩＣＬＣの混合物を凍結乾燥すること、その結果生じた乾燥混合物を水で戻すこと、及びその結果生じたリポソームのペレットを緩衝液を用いて、使用前に所望の薬物濃度にまで再懸濁することを含む。好適な緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、脱イオン水である。緩衝液の調製に際しＲＮＡｓｅを含まない水を用いることが重要であり、これによりポリＩＣＬＣの酵素分解が最小化される。
【００１６】
リポソームの調製の代替方法は、界面活性剤透析、放出、逆相蒸発法（ＲＥＶ）、及び超音波処理を含む。ポリＩＣＬＣのリポソームへのロードは、受動的に捕捉すること及びリモートローディング法等の能動的過程により達成される。非封入のポリＩＣＬＣは、遠心分離、カラム分離或いは透析により除去される。
【００１７】
リポソーム内のポリＩＣＬＣのカプセル化における利点は、ポリＩＣＬＣの毒性が減少すると同時に、ポリＩＣＬＣの治療効果が増加することである。さらに、リポソームポリＩＣＬＣは、体内のＲＮＡｓｅ分解からポリＩＣＬＣを保護する。したがって、ポリＩＣＬＣの免疫学的活性及び生物学的活性が増強される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】リポソームのポリＩＣＬＣの治療効果と対比した遊離ポリＩＣＬＣの治療効果に関する試験結果を示すグラフである。
【図２】リポソームのポリＩＣＬＣの毒性と対比した遊離ポリＩＣＬＣの毒性に関する試験結果を示すグラフである。
【図３】マウスの鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの低ウイルス追加投与量に対する対照と対比したリポソームのポリＩＣＬＣの治療効果に関する試験結果を示すグラフである。
【図４】マウスの鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの高ウイルス追加投与量に対する対照と対比したリポソームのポリＩＣＬＣの治療効果に関する試験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜ポリＩＣＬＣ＞
ポリＩＣＬＣは、アイオワ大学薬学部の薬剤部（アイオワシティ、アイオワ州）により調製され、国立衛生研究所（ベテスダ、メリーランド州）により提供された。０．９％の塩化ナトリウム中、ポリＩＣＬＣ１ミリリットルに対しポリＩ．ポリＣが２ｍｇ、ポリエルリジン１．５ｍｇ、及びカルボキシメチルセルロースが５ｍｇ含まれていた。
【００２０】
＜ポリＩＣＬＣカプセル化リポソーム＞
リポソームは微細な脂質小胞で、１以上の脂質二重層及び水性コンパートメントから構成される。リポソームの主要構成物は、通常はリン脂質とコレステロール等のステロイドの組み合わせである。リン酸脂質は、陽性、中性及び陰性荷電される。陽性及び陰性荷電されたリン酸脂質から作られたリポソームはそれぞれ、カチオン性リポソーム及びアニオン性リポソームと呼ばれる。ＤＮＡ及びＲＮＡは通常陰性荷電されるので、カチオン性リポソームはリポソームポリＩＣＬＣ製剤を作るのに選択されるリポソームである。リポソームのポリＩＣＬＣを作るために用いるカチオン性リン酸脂質は、ステアリルアミン、１，２−ジアチル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）或いは１，２−トリアチル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＡＰ）が好適である。コレステロールは二重層を安定化するために含まれる。リポソーム表面はポリエチレングリコールで覆われてもよく、これによりその循環が延長される。プロテインもまたリポソーム膜と結合してもよく、これにより特定の細胞受容体の結合が促進される。
【００２１】
ポリＩＣＬＣの封入に用いられるリポソームは、大型多重層リポソーム（ＭＬＶ）、小型単層リポソーム（ＳＵＶ）或いは大型単層リポソーム（ＬＵＶ）であってよい。好ましくは、多重層リポソームはリポソームポリＩＣＬＣの調製に用いられる。
【００２２】
ドラッグデリバリシステムとして用いられる場合、リポソームはゆっくりとした持続放出特性を有するとともに、正常な組織に全身的な負荷を引き起こさずに感染の部位及び腫瘍に狙って薬剤を用いる能力を有する。リポソームは多数の治療薬を封入するのにうまく用いられてきた。この治療薬とは、抗生物質、抗ウイルス薬、及び抗ガン剤である。これらの特性のため、リポソームポリＩＣＬＣは、ポリＩＣＬＣの容量依存的毒性を有意に減少させることができる、優れたドラッグデリバリシステムである。さらに、リポソームのカプセル化は、ポリＩＣＬＣを体内のＲＮＡ分解酵素の分解から保護する。したがって、ポリＩＣＬＣの治療効果が増強される。
【００２３】
＜調製＞
リポソームは、フォスファチジルコリン２１０ｍｇ（２１０.mu.mole）、ステアリルアミン２３．２ｍｇ（２３．２.mu.mole）及びコレステロール８．１ｍｇ（３０.mu.mole）を用いて調製された。脂質を１００ｍｌの丸底フラスコに加え、脂質を溶解するためにクロロホルム２ｍｌを加えた。丸底フラスコは摂氏４５度の水浴中で、乾燥した脂質薄膜が形成されるまで回転蒸発された。そしてフラスコは真空オーブン（摂氏４５度、マイナス８０キロパスカル）内に１時間配置され、残留有機溶媒を除去した。その後脂質薄膜を、ポリＩＣＬＣ３ｍｌを用いた後、０．９％のＮａＣｌ３ｍｌを用いて元に戻した。その他の好適な緩衝剤は、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水或いは脱イオン水である。緩衝液の調製には、ＲＮＡ分解酵素を含まない水を用いてポリＩＣＬＣの分解を最小化させることが重要である。その後、脂質薬の混合物をスクリューキャップチューブに移し、十分に混合し、液体窒素にチューブを浸し凍結させた。サンプルはその後、全ての液体が除去され白い乾燥した粉が得られるまで、一晩凍結乾燥された。凍結乾燥に続いて、サンプルは１００−１５０.muの１０．９％のＮａＣｌで再水和され、１５分間摂氏４５度で培養され、そして室温で２時間静置された。リポソームポリＩＣＬＣは無菌の０．９％ＮａＣｌで希釈され、超遠心分離法を用い洗浄された。リポソームのペレットはその後、マウスへ投与するための所望の薬物濃度にするため、緩衝液を用いて再懸濁された。
【００２４】
リポソームの表面は、循環を延長させるためにポリエチレングリコールで覆われるとともに、特定の感染部位及び腫瘍へのリポソームの親和性を増加させるために抗体で覆われてもよい。
【００２５】
中性的に荷電されたリポソームは、ポリＩＣＬＣのリポソーム封入に用いられてもよい。例えば、中性的に荷電されたリポソームは、フォスファチジルコリン及びコレステロールを用いて調製されてもよい。
【００２６】
リポソームを生産する他の調整方法は、界面活性剤透析、放出、逆相蒸発法（ＲＥＶ）、及び超音波処理を含む。ポリＩＣＬＣのリポソームへのロードは、受動捕捉（passive trapping）又はリモートローディング法等の能動的過程により達成される。非封入のポリＩＣＬＣは、遠心分離、カラム分離或いは透析により除去されることが可能である。
【００２７】
＜マウス内の卵により増殖されたインフルエンザＡ／ＰＲ／８ウイルスへの適応＞
従来の手順を用い、インフルエンザＡ／ＰＲ／８ウイルスは、肺の気道を通過して４度の盲目継代によりマウスに伝えられる。この盲目継代は、最初の摂取材料として卵により増殖されたウイルス（メリーランド州、パークローン、米国細胞バンク（ＡＴＴＣ）より入手可能）を利用するものである。ウイルスは早くも３度目の盲目継代において、マウス内で病原性になる。インフルエンザの症状としては、毛の逆立ち、体重の急激な減少、集団化、及びケージ内の動物の動きの著しい減少がある。感染したマウスの解剖により、重度の肺の病変が明らかとなり、また、肺の拡大もいくつかのマウスにおいて観察された。
【００２８】
＜試験＞
カプセル化ポリＩＣＬＣリポソームは、経鼻投与、腹腔内投与或いは静脈内投与によりマウスに投与される。用いた摂取材料の量は、経鼻投与には５０.mu.l、及び腹腔内投与或いは静脈内投与には１００.mu.lであった。経鼻投与及び腹腔内投与では、マウスは薬の投与の前にペントバルビタールナトリウムを用いて麻酔された。動物が気絶すると、鼻を上向きの状態で手で注意深く支えられ、抗ウイルス物質がマイクロピペットを用いて徐々に鼻腔に塗布された。塗布量は自然に肺の中へ吸入された。
【００２９】
麻酔されたマウスの群（１グループ５から１０のマウス）に、ポリＩＣＬＣ或いはポリＩＣＬＣカプセル化リポソームが、腹腔内投与或いは静脈内投与により１回又は２回投与された（２０.mu.g／１投与）。ウイルスの追加投与の７日、１４日及び２１日前にリポソームはマウスに投与された。その後、マウスは半数致死量10LD.sub.50のマウス適合インフルエンザＡ／ＰＲ／８ウイルスに鼻腔感染した。ウイルス感染後１４日で、ウイルス追加投与に対し生き残った数のマウスが記録された。
【００３０】
＜結果＞
マウスのインフルエンザＡ感染の致死量の追加投与に対する、マウスの予防的保護のための遊離ポリＩＣＬＣ及びポリＩＣＬＣカプセル化リポソームの効果が図１に示される。相対的に、ウイルス感染前７日以内に遊離ポリＩＣＬＣが投与されたマウスは、ウイルス感染後１４日目に１００％生存していた。しかしながら、ウイルスの追加投与の前の１４日目及び２１日目に、遊離ポリＩＣＬＣの前処置が行われていた場合、感染後１４日目の生存率は減少する。反対に、ポリＩＣＬＣカプセル化リポソーム（ＭＬＶポリＩＣＬＣ）がウイルス感染７から１４日前以内に投与されたマウスは、ウイルス感染後１４日目に１００％生存していた。これらの結果により、リポソームのカプセル化は、ポリＩＣＬＣの抗ウイルス活性及び免疫修飾活性に悪影響を与えないばかりか、むしろこれらの活性を抗ウイルス状態を延長させることにより増強させる。
【００３１】
図２を参照する。マウスの体重で計測した遊離ポリＩＣＬＣ及びリポソームポリＩＣＬＣのマウスへの毒性の影響を示す。ポリＩＣＬＣの中毒量を投与されたマウスは、体重の急速な減少、立毛及び身体運動の低下等の兆候がある。マウスは、遊離ポリＩＣＬＣの一日投与量30.mu.g/匹を２回投与された。図２を参照すると、１回目の投与は投薬後２日目に行われ、２回目の投与は投薬後０日目に行われた。マウスは投与後１から３日目以内で、最大２ｇ（全体重の約１０％近く）体重が減少した。体重の減少に加え、これらのマウスはまた、立毛（逆立てた毛）及び身体運動の低下の異常な症状や兆候を示した。反対に、ポリＩＣＬＣカプセル化リポソームを同一量与えられたマウスは著しい体重低下を示さず、また身体運動の低下の異常な症状や兆候を示さなかった。したがって、遊離した非カプセル化ポリＩＣＬＣは高い毒性を有し、その一方、ポリＩＣＬＣカプセル化リポソームは図２の結果に示されるように低い毒性を有する。リポソームポリＩＣＬＣを投与されたマウスは、体重の著しい減少を示さなかった。
【００３２】
結論として、マウスに直接投与された遊離ポリＩＣＬＣは、インフルエンザＡ型ウイルス感染に対する限定的な予防をもたらすという結果が示された。さらに、ポリＩＣＬＣを繰り返し高用量投与すると、マウスに中毒性服作用を引き起こすことがわかった。反対に、リポソームカプセル化ポリＩＣＬＣは、ウイルス感染に対し、ポリＩＣＬＣの毒性を減少させる一方治療効果を増強させることにより、効果的な治療をもたらす。
【００３３】
＜マウスの鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス感染に対するポリＩＣＬＣカプセル化リポソーム＞
鳥インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスに対するリポソームポリＩＣＬＣの予防効果を明示するため、致命的な呼吸器マウスモデルが、感染したニワトリから分離したＨ５Ｎ１インフルエンザＡウイルスの野生型を用いて作られた。このようなマウス由来の鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの感染モデルを作ることは、リポソームのポリＩＣＬＣの抗ウイルス活性の有効性の判定を可能にするのに極めて重要である。
【００３４】
有効性の研究において、Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０ｇ）の群は、４８時間置きにリポソームのポリＩＣＬＣ２０μｇを２回鼻腔内に前処置された。薬物治療後２４時間でこれらのマウスは、低用量（１ＬＤ５０）或いは高用量（４ＬＤ５０）の鳥インフルエンザＡウイルスのどちらかを鼻腔内に追加投与された。処理動物及びウイルス対照群の両方の生存率はその後毎日監視され、感染後１４日目に測定された。
【００３５】
鳥Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの低用量及び高用量のウイルス追加投与に対する予防的保護のためのカプセル化されたリポソームポリＩＣＬＣの効率性は、図３及び図４にそれぞれ示される。図３に示される通り、低用量のウイルス或いは高用量のウイルスどちらかに感染した対照群のマウスは、感染後５から６日で開始した鳥インフルエンザの感染により死亡した。低用量のウイルス追加投与で感染した対照群のマウスは、感染後９日目までに死亡した。高用量のウイルス追加投与において、全てのマウスは感染後１４日目で死亡した。反対に、図４に示す通り、カプセル化されたリポソームポリＩＣＬＣは、少量のウイルス追加投与に対し完全な予防（１００％生存）をもたらすとともに、多量のウイルス追加投与に対しては６３から７５％の予防をもたらした。リポソームポリＩＣＬＣによりもたらされた増加するこれらの生存の度合いは、統計学的に有意差がある（高用量ウイルス及び低用量ウイルスそれぞれｐ＜０．０４０２対対照、ｐ＜０．００１４対対照）。リポソームポリＩＣＬＣで前処理されたマウスの平均生存時間はまた、対照のマウスと比較して増加していることがわかった。
【００３６】
カプセル化リポソームポリＩＣＬＣは、鳥インフルエンザウイルス感染に対し効果的な予防をもたらすことが、これらの結果により示された。
【００３７】
このＨ５Ｎ１の有効性の研究に用いられたリポソームポリＩＣＬＣの投与量は、１回投与量当たり２０μｇであった。しかしながら、鳥インフルエンザウイルスに対するその他の投与計画において一般的に、及びより具体的には、Ｈ５Ｎ１ウイルスを１から２００μｇの範囲で用いる（１回投与量当たり１から１００μｇが好適とされる）ことも可能である。もちろん、投与計画はまた、従来の理解にしたがって治療する対象の重量に基づきなされることも可能である。
【００３８】
本明細書に示され記述された実施形態及び変化例は、単に本発明の原則の具体例にすぎず、様々な変更形態は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなしに当業者により実施可能なものである。
【００３９】
また、この開示においていかなる値域であっても、各介在価値及び範囲は、或いは文脈が示さない限り、本発明に包含される。さらに、文脈が明らかに示さない限り、各値の下限値の１０分の１までの値を含むものとする。本発明はまた示されない限り、述べられた範囲の上限値及び下限値を含む。より小さな範囲（介在範囲）の上限及び下限は、独立してその小さな範囲に含まれる。述べられた範囲が、限界の１つまたは両方を含む場合には、これら含まれる限界のいずれかまたは両方を除く範囲もまた本発明に含まれる。
【００４０】
要約すれば、リポソームポリＩＣＬＣは、動物の実験研究において、季節性インフルエンザウイルス及び鳥インフルエンザウイルス両方に対し予防をもたらした。リポソームポリＩＣＬＣがインフルエンザＡウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１）の様々な亜型に対し効果的であることが示された観察により、インフルエンザウイルス及び特に、鳥インフルエンザウイルス等の変化し続ける、突然変異するウイルスを処理するのに特に非常に効果的であることが証明された。本明細書に示された実験結果から、リポソームポリＩＣＬＣが、鳥インフルエンザ、パンデミックインフルエンザ及び季節性インフルエンザに対抗する世界的な戦いにおいて、抗インフルエンザ薬及びワクチンの既存の備蓄を補完するため用いられることができる重要な薬であることが一括して証明された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における鳥インフルエンザウイルス感染の予防的治療のための方法であって、
リポソーム内でカプセル化されたポリ−Ｌ−リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリリボイノシン酸及びポリリボシチジル酸を有する組成物を前記哺乳類に投与する工程を備える方法。
【請求項２】
前記鳥インフルエンザウイルス感染がＨ５Ｎ１亜型のものであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リポソームがホスファチジルコリン、カチオン性脂質及びコレステロールを含むカチオン性リポソームであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記リポソームがホスファチジルコリン、カチオン性脂質及びコレステロールを含むカチオン性リポソームであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記カチオン性脂質がステアリルアミンであることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記カチオン性脂質がステアリルアミンであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記ホスファチジルコリン、カチオン性脂質及びコレステロールが、それぞれモル比９：１：１で存在することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項８】
前記ホスファチジルコリン、カチオン性脂質及びコレステロールが、それぞれモル比９：１：１で存在することを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項９】
前記ホスファチジルコリン、ステアリルアミン及びコレステロールが、それぞれモル比９：１：１で存在することを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項１０】
前記ホスファチジルコリン、ステアリルアミン及びコレステロールが、それぞれモル比９：１：１で存在することを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記投与する工程が鼻腔内投与を含むことを特徴とする請求項１、３、５、７又は９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記投与する工程が腹腔内投与を含むことを特徴とする請求項１、３、５、７又は９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記投与する工程が静脈内投与を含むことを特徴とする請求項１、３、５、７又は９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与する工程が鼻腔内投与を含むことを特徴とする請求項２、４、６、８又は１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与する工程が腹腔内投与を含むことを特徴とする請求項２、４、６、８又は１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与する工程が静脈内投与を含むことを特徴とする請求項２、４、６、８又は１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記投与する工程が吸入による投与を含むことを特徴とする請求項１、３、５、７又は９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与する工程が吸入による投与を含むことを特徴とする請求項２、４、６、８又は１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
哺乳類における鳥インフルエンザウイルス感染の予防的治療のための方法であって、
リポソーム内でカプセル化されたポリ−Ｌ−リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリリボイノシン酸及びポリリボシチジル酸を有する組成物を前記哺乳類に投与する工程を備える方法。
【請求項２】
前記鳥インフルエンザウイルス感染がＨ５Ｎ１亜型のものであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リポソームがホスファチジルコリン、カチオン性脂質及びコレステロールを含むカチオン性リポソームであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記リポソームがホスファチジルコリン、カチオン性脂質及びコレステロールを含むカチオン性リポソームであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記カチオン性脂質がステアリルアミンであることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記カチオン性脂質がステアリルアミンであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記ホスファチジルコリン、カチオン性脂質及びコレステロールが、それぞれモル比９：１：１で存在することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項８】
前記ホスファチジルコリン、カチオン性脂質及びコレステロールが、それぞれモル比９：１：１で存在することを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項９】
前記ホスファチジルコリン、ステアリルアミン及びコレステロールが、それぞれモル比９：１：１で存在することを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項１０】
前記ホスファチジルコリン、ステアリルアミン及びコレステロールが、それぞれモル比９：１：１で存在することを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記投与する工程が鼻腔内投与を含むことを特徴とする請求項１、３、５、７又は９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記投与する工程が腹腔内投与を含むことを特徴とする請求項１、３、５、７又は９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記投与する工程が静脈内投与を含むことを特徴とする請求項１、３、５、７又は９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与する工程が鼻腔内投与を含むことを特徴とする請求項２、４、６、８又は１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与する工程が腹腔内投与を含むことを特徴とする請求項２、４、６、８又は１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与する工程が静脈内投与を含むことを特徴とする請求項２、４、６、８又は１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記投与する工程が吸入による投与を含むことを特徴とする請求項１、３、５、７又は９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与する工程が吸入による投与を含むことを特徴とする請求項２、４、６、８又は１０のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１０−５０８３０８（Ｐ２０１０−５０８３０８Ａ）
【公表日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３４９６６（Ｐ２００９−５３４９６６）
【出願日】平成１９年１０月３０日（２００７．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１９２８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５２３２３
【国際公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【出願人】（５０９１２２３９３）ハー マジェスティー ザ クイーン， イン ライト オブ カナダ， アズ リプレゼンティッド バイ ザ ミニスター オブ ナショナル ディフェンス (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月３０日（２００７．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１９２８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５２３２３
【国際公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【出願人】（５０９１２２３９３）ハー マジェスティー ザ クイーン， イン ライト オブ カナダ， アズ リプレゼンティッド バイ ザ ミニスター オブ ナショナル ディフェンス (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]