鶏大腸菌由来弱毒変異株、鶏大腸菌対策用ワクチン、免疫方法及び鶏用ワクチンベクター
【課題】多大な経済的被害をもたらす鶏大腸菌症に対して、注射以外の簡便な投与方法により、ブロイラーコマーシャル鶏にも適用可能な、安全で有効な弱毒生ワクチン株を提供する。
【解決手段】鶏大腸菌株由来で、最も高頻度に分離される血清型の０７８型菌株で、サイクリックＡＭＰリセプター蛋白質（ｃｒｐ）をコードする遺伝子の機能が不活性化され、復帰変異の可能性がゼロにされた、受託番号:FERM P-20986として寄託された鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331。
【解決手段】鶏大腸菌株由来で、最も高頻度に分離される血清型の０７８型菌株で、サイクリックＡＭＰリセプター蛋白質（ｃｒｐ）をコードする遺伝子の機能が不活性化され、復帰変異の可能性がゼロにされた、受託番号:FERM P-20986として寄託された鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、養鶏産業において重要な疾病である鶏大腸菌症対策用ワクチンに使用した場合、遺伝的に安定でかつ高い有効性と安全性を発揮できる鶏大腸菌弱毒変異株AESN1331(受託番号:FERM P-20986)、鶏大腸菌対策用ワクチン、免疫方法及び鶏用ワクチンベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
鶏における大腸菌症は、孵化から成鶏まで通じて発生し、主として6〜10週齢の肉用鶏に多発する。鶏の場合、大腸菌は主に呼吸器から感染し、血行性に全身へ移行後、敗血症、漿膜炎、肉芽腫症及び皮膚炎等の多様な病型を発現する。大腸菌症が発生した場合、育成率及び増体重の低下を引き起こすだけでなく、屠殺解体検査時の廃棄率を増加させるなど、養鶏産業に多大な経済的損失をもたらす。大腸菌症を発生させる誘因としては、密飼い又は飼育失宜などによる換気不足、不適切な温度管理、他の感染性疾患の罹患に伴う免疫能の低下などがあげられる。これまでは、その対策として鶏舎の徹底した洗浄・消毒、単位面積あたりの飼養羽数の制限、換気方法の改良、鶏舎温度の調整等の飼育管理方法の改善、他の感染性疾患の侵入及び発生を防ぐための他病に対するワクチン接種といった間接的な対応策、および抗生物質の飼料への予防的添加という方策しかなかった。このうち、飼料への抗生物質添加は、薬剤耐性菌の出現といった新たな問題を引き起こすことが示唆されており、消費者側から養鶏産業に対して抗生物質使用の削減もしくは減量が求められている。なお、出荷間近の鶏群に大腸菌症の発生が認められた場合は、肉への抗生物質の残留を防ぐために、抗生物質による治療が不可能となることから、斃死鶏の処分又は発育不良鶏を淘汰する以外に策はなく、その経済的損失は著しいものとなる。
【０００３】
最近、我が国において大腸菌対策用の種鶏用不活化オイルワクチンが輸入され市販されるに至ったが、種鶏に免疫してコマーシャル鶏に移行抗体を付与するものであることから、移行免疫消失後の感染については防御できない。従って、投与方法が簡便でコマーシャル鶏に直接適用可能な生ワクチンの開発が望まれているところである。
【０００４】
また、大腸菌生ワクチン株の別の用途として、ワクチンベクターとしての応用がある。現在鶏には通常10種類を越えるワクチンが注射されており、その接種にかかる労力は多大である。また投与される鶏自体へのストレスも無視できない。そこで、投与方法が容易で、かつ1回の接種で多種類の病原体に対して有効性を示すワクチンの開発が望まれている。このようなワクチンは、遺伝子組換え技術を応用し、様々鶏のウイルス性、細菌性あるいは原虫性の感染防御抗原を複数発現させた組換え体を応用することによって可能となる。その際に重要となるのは、鶏体内で一時的に増殖し、ある程度の抗原刺激を与えた後、自然に消失する性質をもった弱毒病原体に基づくベクターの選択である。鶏用のベクター候補として、基礎研究段階としてポックスウイルス、マレック病ウイルスなどで現在研究が進められているところであるが、我が国においては未だ実用化には至っていない。従って、今後、弱毒多価生ワクチンの実用化に向けて、すぐれた鶏用ワクチンベクターの開発が望まれているところである。
【非特許文献１】Nagai et al., Veterinary Microbiology, 60:227-238, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の第一の目的は、多大な経済的被害をもたらす鶏大腸菌症に対して、注射以外の簡便な投与方法により、ブロイラーコマーシャル鶏にも適用可能な、安全で有効な弱毒生ワクチン株を提供することにある。第二の目的は、鶏大腸菌弱毒生ワクチン株を、鶏用ワクチンベクターとして利用することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的を達成するために、発明者らは以前の研究から、鶏大腸菌株においてサイクリックAMPリセプター蛋白質（CRP）をコード化する遺伝子の機能を不活性化することにより、その病原性が失われることを見出していた（非特許文献1）。そこで、我が国において病原性の鶏大腸菌で最も高頻度に分離される血清型であるO78型の菌株を選択し、この株を元にして復帰変異の可能性をゼロにする目的でcrp遺伝子の削除変異株を作出することに成功し、本発明に至った。
【０００７】
本発明は以下に関するものである。
（１） 受託番号:FERM P-20986として寄託された鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331。
（２） （１）に記載の鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331を含むことを特徴とする鶏大腸菌対策用弱生ワクチン。
（３） （１）に記載の鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331を含む有効量の生ワクチンを鶏に投与することを特徴とする鶏大腸菌感染の免疫方法。
（４） （１）に記載の鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331からなることを特徴とする鶏用ワクチンベクター。
【発明の効果】
【０００８】
本発明による鶏大腸菌のcrp遺伝子欠損変異株であるAESN1331株は、鶏に対する病原性が著しく低下しており、鶏ヒナや発育鶏卵に投与してもまったく安全である。本株はcrp遺伝子を351bpにわたって欠失させていることから、病原性復帰の危惧がなく、遺伝的に安定である。本株を鶏に噴霧、散霧及び点眼経路において、また発育鶏卵の卵内に投与した時、強毒株の攻撃から防御する免疫能を付与できることが判明した。このような性状から、本株は鶏大腸菌症に対する生ワクチンとして好適な性状を有していることが示された。また、本株は鶏体内に短期間定着した後に消失し、かつ投与鶏に免疫応答を惹起できることから、遺伝子操作等を用いて外来遺伝子を組み込み、他の複数の疾病に対して防御効果を付与するための鶏用ワクチンベクターとして利用することにも、好適であることがあわせて判明した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明について詳細に説明する。本発明の鶏大腸菌弱毒変異株AESN1331株(受託番号:FERM P-20986)の作出は次の手順により行うことができる。
【００１０】
鶏大腸菌の糖分解能に関わるcrp遺伝子の機能が病原性と密接に関連し、crp遺伝子欠損変異株は高度に弱毒化されることが報告されている（非特許文献１）。そこで、以下のようにして、鶏大腸菌血清型O78である J29株から、crp遺伝子欠損変異株AESN1331株を作出した。
【００１１】
プラスミド上にクローニングしたJ29株のCRP遺伝子から、crp遺伝子（配列表１）のオープンリーディングフレーム（ORF）の中心部分にある157番目のアデニン(a)から507番目のシトシン(ｃ)にある351bpの塩基をPCRを用いて常法により欠損させた欠損変異型crp遺伝子（以下Δcrp、配列表２）を作出した。これを遺伝子置き換え用に用いられるpCVD442ベクタープラスミド上にクローニングし、大腸菌SM10λpir株に形質転換した（ESN1324株、図１）。この株と、鶏大腸菌J29株とをフィルターメイティングし、ナリジクス酸、リファンピシリンおよびアンピシリンを含有するLB培地上で培養することにより、鶏大腸菌J29株の染色体上にΔcrp遺伝子を含むpCVD442プラスミドが結合したクローン（ヘテロトランスコンジュガント）を選択した。得られたクローンを液体培養し、5%のシュークロースを含有するDHL寒天培地上に発育させた。形成されたコロニーの中から、CRP（−）の表現型に一致する白色集落（乳糖非分解の性状）を形成し、かつ、5%シュークロースを含むLB寒天培地に発育可能なクローンを選択した。さらに、その中からpCVD442が脱落したことを示す表現型である、アンピシリン感受性のクローンを選択した。
【００１２】
得られたクローンをAESN1331株と名づけ、確認のための解析を行った。本株の染色体をテンプレートとし、pCVD442由来の数種類のプライマーを用いたPCRを行ったところ、増幅DNA断片は観察されなかった。このことは、本株の染色体上には、すでにpCVD442が存在しないことを示している。さらに、crp遺伝子の5’端および3’端に一致するプライマーを用いてcrp遺伝子全体をPCR増幅し、得られたDNA断片の塩基配列を決定した。その結果、Δcrp遺伝子の配列（配列表２）のみが確認されたことから、J29株中のcrp遺伝子は一連の操作によってΔcrp遺伝子に置き換えられ、AESN1331株が作出された。
【００１３】
本発明のワクチンは、有効量の上記AESN1331株を鶏に投与することによって鶏大腸菌症を予防する免疫を付与するものである。
【００１４】
本発明におけるワクチンの免疫方法には、簡便で多数の鶏に同時に投与でき、且つ投与された鶏に与えるストレスの少ない噴霧、散霧あるいは点眼方法が適用できる。さらに自動接種機を用いることで確実に、大量にそして迅速に投与することが可能な卵内投与方法も適用することができる。
【００１５】
本発明におけるワクチンベクターとは、ウイルス性、細菌性あるいは原虫性等に対する防御抗原を発現させたAESN1331株を、上記方法で鶏に投与することによって、それら抗原に対する免疫を惹起し、それらに関連する感染性疾患に対して鶏に防御性を付与することできるものである。
【００１６】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【実施例１】
【００１７】
AESN1331株の性状
AESN1331株及び親株である大腸菌J29株の代表的な性状を第1表に示した。糖分解性試験にはｐH指示薬を含む基礎培地に糖を１％濃度で添加したものを用いて、菌を接種した後に37℃で48時間培養し、培地の色調の変化をみて判定した。コンゴーレッド吸着性は、1%コンゴーレッドを含む平板培地に菌を塗抹し、37℃で24時間培養後、増殖したコロニーの色調により判定した。O血清型は、病原大腸菌免疫血清（デンカ生研）を用い、スライド凝集反応にて型別した。PCRによるcrp遺伝子の増幅には、配列番号３及び配列番号４に示すプライマーを用いた。試料の抽出はInstaGene (BIO-RAD）を用い、キットの説明書に従って実施した。PCR反応はTthポリメラーゼ (TOYOBO)を用い、表２に示す組成及び濃度の反応液中で、88℃で40秒、63℃で1分間及び68℃で2分間の反応を２５サイクル実施した。
【００１８】
【表１】
【００１９】
【表２】
【００２０】
第１表に示すとおり、AESN1331株はグルコース分解能を保持したが、乳糖分解能は失っていた。さらに、AESN1331株ではコンゴーレッド吸着性も喪失していた。血清型は親株と変わらず、O78型を示した。PCRで増幅された遺伝子断片の大きさはAESN1331株で609bp、親株であるJ29株で960bpであった（図２）。配列番号２及びPCR増幅断片の解析結果から、AESN1331株のcrp遺伝子には、351bpの欠損があることが示された。
【実施例２】
【００２１】
AESN1331株の雛に対する免疫原性
SPF鶏群由来の4日齢ヒナ40羽を10羽ずつ４群に分け、そのうち３群を試験群とし、AESN1331株を約108CFUずつ、4週間隔で2回投与（免疫）した。各群への投与は第１群では噴霧、第2群では散霧及び第３群では点眼により行った。残りの１群については非投与対照とした。
【００２２】
AESN1331株を投与した各群の鶏は、いずれも臨床症状を全く示さず、AESN1331株は、鶏に投与しても安全であることが確認された。
【００２３】
次に、AESN1331株投与による免疫効果を調べるため、試験群3群ならびに対照群の鶏に対して第２回投与後２週に、鶏大腸菌の強毒株を1.5×108CFU、静脈内に接種することにより攻撃した。攻撃後1週の時点における生残羽数を調べることにより、AESN1331株のワクチン効果を判定した。結果を第３表に示した。
【００２４】
【表３】
【００２５】
攻撃後、AESN1331株を投与していない対照群の生残数は２羽のみであったのに対して、試験群では噴霧投与区で9羽が、散霧攻撃区で10羽が及び点眼投与区で10羽が生残した。この結果から、AESN1331株をいずれの経路で投与しても、強毒株の攻撃に対して防御効果を発現できることが示された。
【実施例３】
【００２６】
AESN1331株の卵内投与免疫法への応用
孵卵開始19日目のSPF鶏群由来の有精卵20個を使用し、試験群10個及び対照群10個に分けた。試験群は、AESN1331株の103CFUを卵内投与した。対照群は同様にリン酸緩衝食塩液のみを卵内に投与した。
【００２７】
投与後発育鶏卵は、対照群と同様にAESN1331株を投与した群も正常に孵化し、ふ化後の鶏ヒナも臨床症状等を全く示さず正常に発育した。このことから、AESN1331株は、発育鶏卵の卵内に投与した場合でも、安全性であることが確認された。
【００２８】
AESN1331株の卵内投与による免疫効果をみるため、投与卵及び対照卵由来のヒナに対し、４週齢時に鶏大腸菌の強毒株1.5×108CFUを静脈内に接種して攻撃した。攻撃後1週の時点における生残羽数を調べることにより、卵内投与によるAESN1331株のワクチン効果を判定した。結果を第４表に示した。
【００２９】
【表４】
【００３０】
攻撃後、対照群の生残羽数は0羽であったのに対し、試験群では10羽全てが生残した。この結果から、AESN1331株を卵内に投与することにより、強毒株の攻撃からヒナを防御する免疫を付与できることが確認された。
【実施例４】
【００３１】
AESN1331株の鶏体内における生残性
ワクチンベクターとして重要な性状は、菌が生体内に一定期間定着し、免疫刺激を付与後、体内から消失することである。そこで、AESN1331株がベクターとして適切な性状を有しているか判断するため、本菌株投与後の鶏体内での生残性について経時的に調べた。
【００３２】
SPF鶏群由来の4日齢ヒナ12羽に、AESN1331株108CFUを噴霧投与した。投与後1日、7日、14日及び21日に各3羽を剖検し、鼻腔、眼窩下洞、気管、気嚢、肺、心臓、肝臓、脾臓、盲腸、ファブリキウス嚢及び脚部関節について菌検索を実施した。結果を第５表に示した。
【００３３】
【表５】
【００３４】
AESN1331株は噴霧投与後1日目の鼻腔において3羽中3羽、眼窩下洞において3羽中2羽、肺においては3羽中3羽から分離され、上部気道及び肺に本菌株が定着することが判明した。実質臓器他の検索部位から、菌は分離されなかった。投与後7日目以降については、1日目に菌が分離された鼻腔、眼窩下洞及び肺を含め、検索した全ての部位において本菌株は分離されなかった。この結果より、AESN1331株は噴霧投与後、呼吸器道の表面にごく短期間定着後、消失することが判明した。このことは、AESN1331株が、鶏用ベクターとして適した性状を有していることを示している。
【実施例５】
【００３５】
AESN1331株の抗体産生誘導能
実施例４によって、AESN1331株は鶏体内に極短期間定着した後、消失することが判明した。そこで、次にベクターとして重要な性状である菌定着期間に充分な免疫誘導を行えるかどうかについて調べることとした。そこで、本菌株を噴霧投与後、O78抗原に対する抗体応答を調査した。
SPF鶏群由来の4日齢ヒナ20羽を、試験群10羽及び対照群10羽に分けた。試験群にはAESN1331株約108CFUを4週間隔で2回噴霧投与し、対照群は非投与とした。第２回投与後10日に試験群及び対照群から採血し、得られた血清について大腸菌血清型O78抗原に対する抗体をELISAにより測定した。結果を第６表に示す。
【００３６】
【表６】
【００３７】
対照群の平均ELISA値が0.001±0.003であったのに対して、AESN1331株を投与された鶏群では、平均ELISA値は0.305±0.446となり、明らかな抗体応答が認められた。また、ELISA値0.1以上を陽性と判定した場合、個体別にみた抗体陽性率は、試験群で６０％、対照群で0%であった。この成績から、AESN1331株を2回噴霧投与することにより、免疫応答が惹起され、その結果としてO78抗原に対する抗体が産生されたものと考えられた。
【００３８】
本成績より、AESN1331株は鶏の体内に極短期間定着し、その結果として免疫応答が惹起され、AESN1331株由来のO78型抗原に対する抗体が産生されたものと判断された。このことより、本株は、ワクチンベクターとして好適な性状を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明による鶏大腸菌のcrp遺伝子欠損変異株であるAESN1331株は、鶏に対する病原性が著しく低下しており、鶏ヒナや発育鶏卵に投与してもまったく安全であり、鶏大腸菌対策用ワクチン、鶏用ワクチンベクターとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】AESN1331株の作出過程を示したものである。矢印で示す方向に手順が進む。
【図２】J29株及びAESN1331株のcrp遺伝子を増幅させたPCRの結果を示す電気泳動写真である。上部の数字はレーンを示し、Mはマーカー、１はJ29株、２はAESN1331株を示す。左部位にある数字は、それぞれ矢印で指したバンドの大きさを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、養鶏産業において重要な疾病である鶏大腸菌症対策用ワクチンに使用した場合、遺伝的に安定でかつ高い有効性と安全性を発揮できる鶏大腸菌弱毒変異株AESN1331(受託番号:FERM P-20986)、鶏大腸菌対策用ワクチン、免疫方法及び鶏用ワクチンベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
鶏における大腸菌症は、孵化から成鶏まで通じて発生し、主として6〜10週齢の肉用鶏に多発する。鶏の場合、大腸菌は主に呼吸器から感染し、血行性に全身へ移行後、敗血症、漿膜炎、肉芽腫症及び皮膚炎等の多様な病型を発現する。大腸菌症が発生した場合、育成率及び増体重の低下を引き起こすだけでなく、屠殺解体検査時の廃棄率を増加させるなど、養鶏産業に多大な経済的損失をもたらす。大腸菌症を発生させる誘因としては、密飼い又は飼育失宜などによる換気不足、不適切な温度管理、他の感染性疾患の罹患に伴う免疫能の低下などがあげられる。これまでは、その対策として鶏舎の徹底した洗浄・消毒、単位面積あたりの飼養羽数の制限、換気方法の改良、鶏舎温度の調整等の飼育管理方法の改善、他の感染性疾患の侵入及び発生を防ぐための他病に対するワクチン接種といった間接的な対応策、および抗生物質の飼料への予防的添加という方策しかなかった。このうち、飼料への抗生物質添加は、薬剤耐性菌の出現といった新たな問題を引き起こすことが示唆されており、消費者側から養鶏産業に対して抗生物質使用の削減もしくは減量が求められている。なお、出荷間近の鶏群に大腸菌症の発生が認められた場合は、肉への抗生物質の残留を防ぐために、抗生物質による治療が不可能となることから、斃死鶏の処分又は発育不良鶏を淘汰する以外に策はなく、その経済的損失は著しいものとなる。
【０００３】
最近、我が国において大腸菌対策用の種鶏用不活化オイルワクチンが輸入され市販されるに至ったが、種鶏に免疫してコマーシャル鶏に移行抗体を付与するものであることから、移行免疫消失後の感染については防御できない。従って、投与方法が簡便でコマーシャル鶏に直接適用可能な生ワクチンの開発が望まれているところである。
【０００４】
また、大腸菌生ワクチン株の別の用途として、ワクチンベクターとしての応用がある。現在鶏には通常10種類を越えるワクチンが注射されており、その接種にかかる労力は多大である。また投与される鶏自体へのストレスも無視できない。そこで、投与方法が容易で、かつ1回の接種で多種類の病原体に対して有効性を示すワクチンの開発が望まれている。このようなワクチンは、遺伝子組換え技術を応用し、様々鶏のウイルス性、細菌性あるいは原虫性の感染防御抗原を複数発現させた組換え体を応用することによって可能となる。その際に重要となるのは、鶏体内で一時的に増殖し、ある程度の抗原刺激を与えた後、自然に消失する性質をもった弱毒病原体に基づくベクターの選択である。鶏用のベクター候補として、基礎研究段階としてポックスウイルス、マレック病ウイルスなどで現在研究が進められているところであるが、我が国においては未だ実用化には至っていない。従って、今後、弱毒多価生ワクチンの実用化に向けて、すぐれた鶏用ワクチンベクターの開発が望まれているところである。
【非特許文献１】Nagai et al., Veterinary Microbiology, 60:227-238, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の第一の目的は、多大な経済的被害をもたらす鶏大腸菌症に対して、注射以外の簡便な投与方法により、ブロイラーコマーシャル鶏にも適用可能な、安全で有効な弱毒生ワクチン株を提供することにある。第二の目的は、鶏大腸菌弱毒生ワクチン株を、鶏用ワクチンベクターとして利用することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的を達成するために、発明者らは以前の研究から、鶏大腸菌株においてサイクリックAMPリセプター蛋白質（CRP）をコード化する遺伝子の機能を不活性化することにより、その病原性が失われることを見出していた（非特許文献1）。そこで、我が国において病原性の鶏大腸菌で最も高頻度に分離される血清型であるO78型の菌株を選択し、この株を元にして復帰変異の可能性をゼロにする目的でcrp遺伝子の削除変異株を作出することに成功し、本発明に至った。
【０００７】
本発明は以下に関するものである。
（１） 受託番号:FERM P-20986として寄託された鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331。
（２） （１）に記載の鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331を含むことを特徴とする鶏大腸菌対策用弱生ワクチン。
（３） （１）に記載の鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331を含む有効量の生ワクチンを鶏に投与することを特徴とする鶏大腸菌感染の免疫方法。
（４） （１）に記載の鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331からなることを特徴とする鶏用ワクチンベクター。
【発明の効果】
【０００８】
本発明による鶏大腸菌のcrp遺伝子欠損変異株であるAESN1331株は、鶏に対する病原性が著しく低下しており、鶏ヒナや発育鶏卵に投与してもまったく安全である。本株はcrp遺伝子を351bpにわたって欠失させていることから、病原性復帰の危惧がなく、遺伝的に安定である。本株を鶏に噴霧、散霧及び点眼経路において、また発育鶏卵の卵内に投与した時、強毒株の攻撃から防御する免疫能を付与できることが判明した。このような性状から、本株は鶏大腸菌症に対する生ワクチンとして好適な性状を有していることが示された。また、本株は鶏体内に短期間定着した後に消失し、かつ投与鶏に免疫応答を惹起できることから、遺伝子操作等を用いて外来遺伝子を組み込み、他の複数の疾病に対して防御効果を付与するための鶏用ワクチンベクターとして利用することにも、好適であることがあわせて判明した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明について詳細に説明する。本発明の鶏大腸菌弱毒変異株AESN1331株(受託番号:FERM P-20986)の作出は次の手順により行うことができる。
【００１０】
鶏大腸菌の糖分解能に関わるcrp遺伝子の機能が病原性と密接に関連し、crp遺伝子欠損変異株は高度に弱毒化されることが報告されている（非特許文献１）。そこで、以下のようにして、鶏大腸菌血清型O78である J29株から、crp遺伝子欠損変異株AESN1331株を作出した。
【００１１】
プラスミド上にクローニングしたJ29株のCRP遺伝子から、crp遺伝子（配列表１）のオープンリーディングフレーム（ORF）の中心部分にある157番目のアデニン(a)から507番目のシトシン(ｃ)にある351bpの塩基をPCRを用いて常法により欠損させた欠損変異型crp遺伝子（以下Δcrp、配列表２）を作出した。これを遺伝子置き換え用に用いられるpCVD442ベクタープラスミド上にクローニングし、大腸菌SM10λpir株に形質転換した（ESN1324株、図１）。この株と、鶏大腸菌J29株とをフィルターメイティングし、ナリジクス酸、リファンピシリンおよびアンピシリンを含有するLB培地上で培養することにより、鶏大腸菌J29株の染色体上にΔcrp遺伝子を含むpCVD442プラスミドが結合したクローン（ヘテロトランスコンジュガント）を選択した。得られたクローンを液体培養し、5%のシュークロースを含有するDHL寒天培地上に発育させた。形成されたコロニーの中から、CRP（−）の表現型に一致する白色集落（乳糖非分解の性状）を形成し、かつ、5%シュークロースを含むLB寒天培地に発育可能なクローンを選択した。さらに、その中からpCVD442が脱落したことを示す表現型である、アンピシリン感受性のクローンを選択した。
【００１２】
得られたクローンをAESN1331株と名づけ、確認のための解析を行った。本株の染色体をテンプレートとし、pCVD442由来の数種類のプライマーを用いたPCRを行ったところ、増幅DNA断片は観察されなかった。このことは、本株の染色体上には、すでにpCVD442が存在しないことを示している。さらに、crp遺伝子の5’端および3’端に一致するプライマーを用いてcrp遺伝子全体をPCR増幅し、得られたDNA断片の塩基配列を決定した。その結果、Δcrp遺伝子の配列（配列表２）のみが確認されたことから、J29株中のcrp遺伝子は一連の操作によってΔcrp遺伝子に置き換えられ、AESN1331株が作出された。
【００１３】
本発明のワクチンは、有効量の上記AESN1331株を鶏に投与することによって鶏大腸菌症を予防する免疫を付与するものである。
【００１４】
本発明におけるワクチンの免疫方法には、簡便で多数の鶏に同時に投与でき、且つ投与された鶏に与えるストレスの少ない噴霧、散霧あるいは点眼方法が適用できる。さらに自動接種機を用いることで確実に、大量にそして迅速に投与することが可能な卵内投与方法も適用することができる。
【００１５】
本発明におけるワクチンベクターとは、ウイルス性、細菌性あるいは原虫性等に対する防御抗原を発現させたAESN1331株を、上記方法で鶏に投与することによって、それら抗原に対する免疫を惹起し、それらに関連する感染性疾患に対して鶏に防御性を付与することできるものである。
【００１６】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【実施例１】
【００１７】
AESN1331株の性状
AESN1331株及び親株である大腸菌J29株の代表的な性状を第1表に示した。糖分解性試験にはｐH指示薬を含む基礎培地に糖を１％濃度で添加したものを用いて、菌を接種した後に37℃で48時間培養し、培地の色調の変化をみて判定した。コンゴーレッド吸着性は、1%コンゴーレッドを含む平板培地に菌を塗抹し、37℃で24時間培養後、増殖したコロニーの色調により判定した。O血清型は、病原大腸菌免疫血清（デンカ生研）を用い、スライド凝集反応にて型別した。PCRによるcrp遺伝子の増幅には、配列番号３及び配列番号４に示すプライマーを用いた。試料の抽出はInstaGene (BIO-RAD）を用い、キットの説明書に従って実施した。PCR反応はTthポリメラーゼ (TOYOBO)を用い、表２に示す組成及び濃度の反応液中で、88℃で40秒、63℃で1分間及び68℃で2分間の反応を２５サイクル実施した。
【００１８】
【表１】
【００１９】
【表２】
【００２０】
第１表に示すとおり、AESN1331株はグルコース分解能を保持したが、乳糖分解能は失っていた。さらに、AESN1331株ではコンゴーレッド吸着性も喪失していた。血清型は親株と変わらず、O78型を示した。PCRで増幅された遺伝子断片の大きさはAESN1331株で609bp、親株であるJ29株で960bpであった（図２）。配列番号２及びPCR増幅断片の解析結果から、AESN1331株のcrp遺伝子には、351bpの欠損があることが示された。
【実施例２】
【００２１】
AESN1331株の雛に対する免疫原性
SPF鶏群由来の4日齢ヒナ40羽を10羽ずつ４群に分け、そのうち３群を試験群とし、AESN1331株を約108CFUずつ、4週間隔で2回投与（免疫）した。各群への投与は第１群では噴霧、第2群では散霧及び第３群では点眼により行った。残りの１群については非投与対照とした。
【００２２】
AESN1331株を投与した各群の鶏は、いずれも臨床症状を全く示さず、AESN1331株は、鶏に投与しても安全であることが確認された。
【００２３】
次に、AESN1331株投与による免疫効果を調べるため、試験群3群ならびに対照群の鶏に対して第２回投与後２週に、鶏大腸菌の強毒株を1.5×108CFU、静脈内に接種することにより攻撃した。攻撃後1週の時点における生残羽数を調べることにより、AESN1331株のワクチン効果を判定した。結果を第３表に示した。
【００２４】
【表３】
【００２５】
攻撃後、AESN1331株を投与していない対照群の生残数は２羽のみであったのに対して、試験群では噴霧投与区で9羽が、散霧攻撃区で10羽が及び点眼投与区で10羽が生残した。この結果から、AESN1331株をいずれの経路で投与しても、強毒株の攻撃に対して防御効果を発現できることが示された。
【実施例３】
【００２６】
AESN1331株の卵内投与免疫法への応用
孵卵開始19日目のSPF鶏群由来の有精卵20個を使用し、試験群10個及び対照群10個に分けた。試験群は、AESN1331株の103CFUを卵内投与した。対照群は同様にリン酸緩衝食塩液のみを卵内に投与した。
【００２７】
投与後発育鶏卵は、対照群と同様にAESN1331株を投与した群も正常に孵化し、ふ化後の鶏ヒナも臨床症状等を全く示さず正常に発育した。このことから、AESN1331株は、発育鶏卵の卵内に投与した場合でも、安全性であることが確認された。
【００２８】
AESN1331株の卵内投与による免疫効果をみるため、投与卵及び対照卵由来のヒナに対し、４週齢時に鶏大腸菌の強毒株1.5×108CFUを静脈内に接種して攻撃した。攻撃後1週の時点における生残羽数を調べることにより、卵内投与によるAESN1331株のワクチン効果を判定した。結果を第４表に示した。
【００２９】
【表４】
【００３０】
攻撃後、対照群の生残羽数は0羽であったのに対し、試験群では10羽全てが生残した。この結果から、AESN1331株を卵内に投与することにより、強毒株の攻撃からヒナを防御する免疫を付与できることが確認された。
【実施例４】
【００３１】
AESN1331株の鶏体内における生残性
ワクチンベクターとして重要な性状は、菌が生体内に一定期間定着し、免疫刺激を付与後、体内から消失することである。そこで、AESN1331株がベクターとして適切な性状を有しているか判断するため、本菌株投与後の鶏体内での生残性について経時的に調べた。
【００３２】
SPF鶏群由来の4日齢ヒナ12羽に、AESN1331株108CFUを噴霧投与した。投与後1日、7日、14日及び21日に各3羽を剖検し、鼻腔、眼窩下洞、気管、気嚢、肺、心臓、肝臓、脾臓、盲腸、ファブリキウス嚢及び脚部関節について菌検索を実施した。結果を第５表に示した。
【００３３】
【表５】
【００３４】
AESN1331株は噴霧投与後1日目の鼻腔において3羽中3羽、眼窩下洞において3羽中2羽、肺においては3羽中3羽から分離され、上部気道及び肺に本菌株が定着することが判明した。実質臓器他の検索部位から、菌は分離されなかった。投与後7日目以降については、1日目に菌が分離された鼻腔、眼窩下洞及び肺を含め、検索した全ての部位において本菌株は分離されなかった。この結果より、AESN1331株は噴霧投与後、呼吸器道の表面にごく短期間定着後、消失することが判明した。このことは、AESN1331株が、鶏用ベクターとして適した性状を有していることを示している。
【実施例５】
【００３５】
AESN1331株の抗体産生誘導能
実施例４によって、AESN1331株は鶏体内に極短期間定着した後、消失することが判明した。そこで、次にベクターとして重要な性状である菌定着期間に充分な免疫誘導を行えるかどうかについて調べることとした。そこで、本菌株を噴霧投与後、O78抗原に対する抗体応答を調査した。
SPF鶏群由来の4日齢ヒナ20羽を、試験群10羽及び対照群10羽に分けた。試験群にはAESN1331株約108CFUを4週間隔で2回噴霧投与し、対照群は非投与とした。第２回投与後10日に試験群及び対照群から採血し、得られた血清について大腸菌血清型O78抗原に対する抗体をELISAにより測定した。結果を第６表に示す。
【００３６】
【表６】
【００３７】
対照群の平均ELISA値が0.001±0.003であったのに対して、AESN1331株を投与された鶏群では、平均ELISA値は0.305±0.446となり、明らかな抗体応答が認められた。また、ELISA値0.1以上を陽性と判定した場合、個体別にみた抗体陽性率は、試験群で６０％、対照群で0%であった。この成績から、AESN1331株を2回噴霧投与することにより、免疫応答が惹起され、その結果としてO78抗原に対する抗体が産生されたものと考えられた。
【００３８】
本成績より、AESN1331株は鶏の体内に極短期間定着し、その結果として免疫応答が惹起され、AESN1331株由来のO78型抗原に対する抗体が産生されたものと判断された。このことより、本株は、ワクチンベクターとして好適な性状を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明による鶏大腸菌のcrp遺伝子欠損変異株であるAESN1331株は、鶏に対する病原性が著しく低下しており、鶏ヒナや発育鶏卵に投与してもまったく安全であり、鶏大腸菌対策用ワクチン、鶏用ワクチンベクターとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】AESN1331株の作出過程を示したものである。矢印で示す方向に手順が進む。
【図２】J29株及びAESN1331株のcrp遺伝子を増幅させたPCRの結果を示す電気泳動写真である。上部の数字はレーンを示し、Mはマーカー、１はJ29株、２はAESN1331株を示す。左部位にある数字は、それぞれ矢印で指したバンドの大きさを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号:FERM P-20986として寄託された鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331。
【請求項２】
請求項１に記載の鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331を含むことを特徴とする鶏大腸菌対策用生ワクチン。
【請求項３】
請求項１に記載の鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331を含む有効量の生ワクチンを鶏に投与することを特徴とする鶏大腸菌感染の免疫方法。
【請求項４】
請求項１に記載の鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331からなることを特徴とする鶏用ワクチンベクター。
【請求項１】
受託番号:FERM P-20986として寄託された鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331。
【請求項２】
請求項１に記載の鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331を含むことを特徴とする鶏大腸菌対策用生ワクチン。
【請求項３】
請求項１に記載の鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331を含む有効量の生ワクチンを鶏に投与することを特徴とする鶏大腸菌感染の免疫方法。
【請求項４】
請求項１に記載の鶏大腸菌由来弱毒変異株AESN1331からなることを特徴とする鶏用ワクチンベクター。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−５４６１４（Ｐ２００８−５４６１４Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３７３２９（Ｐ２００６−２３７３２９）
【出願日】平成１８年９月１日（２００６．９．１）
【出願人】（０００１７３８６５）財団法人日本生物科学研究所 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１日（２００６．９．１）
【出願人】（０００１７３８６５）財団法人日本生物科学研究所 (6)
【Ｆターム（参考）】
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