麦芽発酵飲料用大麦種の選抜方法及び麦芽発酵飲料
【課題】 作業が容易で、短時間で遺伝子型を判別でき、多検体を処理することが可能で、泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種をより確実に選抜できる選抜方法を提供することを目的とする。
【解決手段】 泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種を選抜する選抜方法であって、被検大麦種について、Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列と、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列とのアラインメントにより特定されるＤＮＡマーカーの少なくとも一つについて遺伝子型を同定し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型に一致する被検大麦種を、泡持ちの優れる大麦種として選抜する選抜方法を提供する。
【解決手段】 泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種を選抜する選抜方法であって、被検大麦種について、Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列と、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列とのアラインメントにより特定されるＤＮＡマーカーの少なくとも一つについて遺伝子型を同定し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型に一致する被検大麦種を、泡持ちの優れる大麦種として選抜する選抜方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麦芽発酵飲料用大麦種の選抜方法及び麦芽発酵飲料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビール等の麦芽発酵飲料の泡は、薄い液体の膜に包まれた炭酸ガスの気泡の集合体であり、気が抜けたり、香味が変化したりするのを防ぐ蓋の役目をするほか、香り立ちを向上させる働きがある。このため、泡持ちはビール等の麦芽発酵飲料の品質を左右する重要な要因の一つである。
【０００３】
泡持ちの良し悪しは様々な要因から成り立っているが、その要因の一つとしてタンパク質の関与が考えられており、プロテインＺ（Ｚ４、Ｚ７）やＬＴＰ−１といったタンパク質が泡持ちに関連するタンパク質としてこれまでに取り上げられてきた（例えば非特許文献１−３を参照）。
【０００４】
プロテインＺ４については、泡持ちに関与するとする報告（非特許文献４）、また直接泡持ちには関与していないと示唆する報告があり（非特許文献５）、プロテインＺ４と泡持ちの関係にはいまだ議論の余地がある。一方、これまでに種子プロテインＺ４含有量に関するＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）マーカーが開発されている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．，５６巻，１４５８−１４６４頁，２００８年
【非特許文献２】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．，５６巻，８６６４−８６７１頁，２００８年
【非特許文献３】Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，６０巻，４７−５７頁，２００２年
【非特許文献４】Ｊ．Ｉｎｓｔ．Ｂｒｅｗ．，１０５巻，１７１−１７７頁，１９９９年
【非特許文献５】Ｐｒｏｃ．Ｃｏｎｇｒ．Ｅｕｒ．Ｂｒｅｗ．Ｃｏｎｖ．，２２巻，５６１−５６８頁，１９８９年
【非特許文献６】Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．，４９巻，６９−７４頁，１９９９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
麦芽発泡飲料用の大麦育種において、泡持ちの優れた大麦種の当該形質を確実に後代へと伝えていくことは必須かつ重要な課題である。近年、作物の育種において、様々な形質に関して、ＤＮＡマーカーを利用した当該形質を有する作物の選抜技術が開発されているが、これまでのところ泡持ちに関して有効なＤＮＡマーカーは報告されていない。
【０００７】
これまでに大麦種子中のプロテインＺ４含有量に関するＲＦＬＰマーカーが非特許文献６に開示されている。しかしながら、ＲＦＬＰ法はゲノムＤＮＡの制限酵素切断とサザンハイブリダイゼーションを基にした方法であって、作業が煩雑なうえ、遺伝子型を判別するのに多大な時間を要し、さらに多検体を処理するのには不向きな選抜方法である。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、作業が容易で、短時間で遺伝子型を判別でき、多検体を処理することが可能で、泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種をより確実に選抜できる選抜方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種を選抜する選抜方法であって、
被検大麦種について、
Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列と、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列とのアラインメントにより特定されるＤＮＡマーカーの少なくとも一つについて遺伝子型を同定し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型に一致する被検大麦種を、泡持ちの優れる大麦種として選抜する選抜方法を提供する。
【００１０】
ここで、「Ｈａｒｕｎａ型」とは、プロテインＺ４遺伝子座周辺領域に存在する前記ＤＮＡマーカーの遺伝子型が、はるな二条種の前記ＤＮＡマーカーの遺伝子型と一致する大麦種を表す。「Ｈａｒｕｎａ型」のプロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列の一例としては、配列番号１で示される塩基配列が挙げられる。
【００１１】
同様に、「Ｃｏｐｅｌａｎｄ型」とは、プロテインＺ４遺伝子座周辺領域に存在する前記ＤＮＡマーカーの遺伝子型が、Ｃｏｐｅｌａｎｄ種の前記ＤＮＡマーカーの遺伝子型と一致する大麦種を表す。「Ｃｏｐｅｌａｎｄ型」のプロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列の一例としては、配列番号２で示される塩基配列が挙げられる。
【００１２】
上記Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列及びＣｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列をアラインメントすることにより、前記両塩基配列が一致しない塩基部位が見出され、ＤＮＡマーカーとして特定することができる。大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域には複数の前記ＤＮＡマーカーがあり、被検大麦種において、前記ＤＮＡマーカーの少なくとも一つについて、遺伝子型を同定し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型に一致する被検大麦種を選抜する。
【００１３】
ここで、被検大麦種において複数同定された遺伝子型のうち、少なくとも１つがＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致すればよい。
【００１４】
上述した本発明における選抜方法では、大麦プロテインＺ４含有量と相関する新規なＤＮＡマーカーを利用し、その遺伝子型に基づいて被検大麦種を選抜することにより、プロテインＺ４含有量の高い被検大麦種をより確実に選抜することができる。
【００１５】
本発明者らは、後段で詳述するように、ビールにおいてプロテインＺ４含有量と泡持ちとの間に有意な相関関係があることを確認し（図１参照）、プロテインＺ４含有量が泡持ちの有効なマーカーになりうることを見出した。したがって、上述した選抜方法により、泡持ちの優れる被検大麦種を選抜することができる。
【００１６】
麦芽発酵飲料の泡持ちは、例えば、２０℃の麦芽発酵飲料を泡注ぎ出し機で標準グラスに注いで生じる泡の高さが３０ｍｍ降下するのに要する時間（秒）（ＮＩＢＥＭ値）を判定基準とすることができる。
【００１７】
上記ＤＮＡマーカーとして、配列番号１及び配列番号２で特定される塩基配列のアラインメントにより特定されるＤＮＡマーカーを例示できる。例えば、配列番号１で示される塩基配列の第１２番目、第１４番目、第４６番目、第２４０番目、第２８６−２８８番目、第８６６番目又は第９５２番目の塩基に相当する塩基部位である（以下順にＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６及びＭ７と呼ぶ）。
【００１８】
本発明は、（１）上記ＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを、被検大麦種のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅し、（２）該ポリヌクレオチドを用いて、該ＤＮＡマーカーのうち少なくとも一つについて塩基種を同定し、（３）同定された遺伝子型がＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致する大麦種を泡持ちの優れる大麦種として選抜する方法を提供する。
【００１９】
上記選抜方法においては、大麦からＤＮＡを抽出する作業工程、ＰＣＲ法によりＤＮＡマーカーを含むポリヌクレオチドを増幅する作業工程、ポリヌクレオチドのシークエンスを解析する作業工程、といった基本的かつ比較的容易な操作のみで短時間でＤＮＡマーカーの遺伝子型を同定することができるため、多検体を処理することが可能となる。
【００２０】
本発明はまた、（１）上記ＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを、被検大麦種のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅し、（２）該ポリヌクレオチドを制限酵素と反応させ、（３）該ＤＮＡマーカー位置にて前記制限酵素によるポリヌクレオチドの切断が生じるか否かで遺伝子型を同定し、（４）同定された遺伝子型がＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致する大麦種を泡持ちの優れる大麦種として選抜する方法を提供する。
【００２１】
上記選抜方法においては、大麦種からＤＮＡを抽出する作業工程、ＰＣＲによりＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを増幅する作業工程、制限酵素と反応させる作業工程及びアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片サイズを検出する作業工程、といった基本的かつ比較的容易な操作のみでＤＮＡマーカーの遺伝子型を同定することができる。また、ＤＮＡ断片サイズを検出する作業工程に要する時間が短く、多検体を処理することが可能である。さらに、塩基配列の解読を必要としないため、遺伝子型の同定にかかるコストを低く抑えることができる。
【００２２】
本発明はまた、上記選抜方法によって選抜された大麦種の交配後代系統に由来する大麦種を提供する。
【００２３】
本発明は、仕込工程及び発酵工程を少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、前記仕込工程で使用される大麦種が、本発明の選抜方法によって選抜された大麦種である、麦芽発酵飲料の製造方法を提供する。
本発明はまた、上記製造方法で得ることのできる麦芽発酵飲料を提供する。
【００２４】
本発明の選抜方法によって選抜された大麦種は、プロテインＺ４含有量が高く、当該大麦種から製造される麦芽発酵飲料は、泡持ちに優れる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種をより確実に選抜することができる。また、泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種を選抜する際、容易な作業によって、短時間で遺伝子型を同定でき、多検体を処理することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ビールにおけるプロテインＺ４含有量とＮＩＢＥＭ値との関係を表すグラフである。
【図２】配列番号１及び配列番号２で特定されるＨａｒｕｎａ型及びＣｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列、並びに配列番号３で特定されるＫｅｎｄａｌｌ種の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列のアラインメント図である。アラインメントによって特定されたＤＮＡマーカーを矢印で示した。四角で囲われた塩基配列は、プロテインＺ４の開始コドン（ＡＴＧ）及び終止コドン（ＴＡＡ）に相当する塩基配列である。
【図３】ＰＣＲ法によりＤＮＡマーカーＭ３を含むポリヌクレオチドを増幅後、制限酵素ＡｃｃＩと反応させ、アガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色により電気泳動パターンを視覚化した写真である。各レーン上部に記載されたＨ又はＣは、被検大麦種の遺伝子型がＨａｒｕｎａ型の遺伝子型又はＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致することを示す。
【図４】既往大麦種を図３に示した方法でＨａｒｕｎａ型とＣｏｐｅｌａｎｄ型に選別し、平均プロテインＺ４含有量を比較したグラフである。
【図５】大麦ミカモゴールデン−Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの倍化半数体系統を図３に示した方法でＨａｒｕｎａ型とＣｏｐｅｌａｎｄ型に選別し、平均プロテインＺ４含有量を比較したグラフである。
【図６】ＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６及びＭ７の塩基種を同定し、Ｈａｒｕｎａ型とＣｏｐｅｌａｎｄ型に選別した大麦種の平均プロテインＺ４含有量を比較したグラフである。
【図７】ＤＮＡマーカーＭ５の塩基種を同定し、Ｈａｒｕｎａ型とＣｏｐｅｌａｎｄ型に選別した大麦種の平均プロテインＺ４含有量を比較したグラフである。
【図８】プロテインＺ４遺伝子が座上する４Ｈ染色体のマーカー地図を示したものである。
【図９】大麦ミカモゴールデン−Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの倍化半数体系統をＲＦＬＰマーカーＭＷＧ２０３３ＤｒａでＨａｒｕｎａ型とＣｏｐｅｌａｎｄ型に選別し，平均プロテインＺ４含有量を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を実施するための形態について、さらに詳細に説明する。
【００２８】
本発明は、泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種を選抜する選抜方法であって、
被検大麦種について、Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列と、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列のアラインメントにより特定されるＤＮＡマーカーの少なくとも一つについて遺伝子型を同定し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型に一致する被検大麦種を、泡持ちの優れる大麦種として選抜する選抜方法を提供する。
【００２９】
本発明において、大麦プロテインＺ４の遺伝子座周辺領域とは、大麦プロテインＺ４のエキソン、イントロンのみならず、転写制御に関わるＤＮＡ領域及びその周辺領域をも含むものである。ここで、大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域としては、開始コドンに相当するＡＴＧ配列の上流２５ｃＭ以内の範囲とすることができ、５ｃＭ以内の範囲とすることが好ましく、１ｃＭの範囲とすることがより好ましい。また、終止コドンに相当するＴＡＡ配列の下流２５ｃＭ以内の範囲とすることができ、５ｃＭの範囲とすることが好ましく、更に１ｃＭの範囲とすることがより好ましい。
【００３０】
ここで、ｃＭ（センチモルガン）とは、遺伝学的方法によって定まる染色体上での遺伝子間の距離を表す単位であって、減数分裂１回当たり、相同染色体間に平均１回の交叉が起こる距離を１Ｍとし、その１／１００の距離を１ｃＭという。
【００３１】
すなわち、プロテインＺ４遺伝子座から５ｃＭ以内であれば、組換えが生じる確率が５％以内となり、さらに１ｃＭ以内であればその確率が１％以内となるため、上記ＤＮＡマーカーとプロテインＺ４含有量との相関関係が、高い確率で保たれることになる。したがって、この範囲内とすることでプロテインＺ４含有量の高い被検大麦種をより確実に、統計上有意に選抜することができる。
【００３２】
大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列は、例えば、大麦種から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法により大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域からＤＮＡ断片を増幅し、必要に応じて該ＤＮＡ断片を精製し、該ＤＮＡ断片を鋳型としたシークエンス解析によって塩基配列を決定することにより入手できる。
【００３３】
ここで、ゲノムＤＮＡは大麦のどの部位から抽出されてもよく、大麦の葉、茎、根、種子等をゲノムＤＮＡソースとして利用可能である。ゲノムＤＮＡの抽出方法は、特に限定されるものではなく、常用される方法を一般に適用可能である。また、市販されているキット類も好適に使用可能である。
【００３４】
ＰＣＲのプライマーは、ＮＣＢＩ、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ等のデータベースを利用し、大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域に相当するゲノムの塩基配列を入手し、その塩基配列情報に基づいて設計することができる。プライマーの長さ、塩基配列、ＧＣ含有量等のパラメーターの決定については、当業者の通常の試行錯誤の範囲内であり、適宜決定されうる。また、ＰＣＲ法、増幅ＤＮＡ精製、シークエンスについては、当該技術分野で汎用されている手法を適用することができる。
【００３５】
本発明では、上記Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列及びＣｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列をアラインメントすることにより、前記両塩基配列が一致しない塩基部位が見出され、ＤＮＡマーカーとして特定することができる。
【００３６】
ここで、Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列は、代表的には大麦はるな二条種からゲノムＤＮＡを抽出し、上述した方法により決定できる。また、はるな二条種以外の大麦種から抽出したゲノムＤＮＡを用いることも可能であり、そのような大麦種の例として、これらに限定されるものではないが、ミカモゴールデン、りょうふう、りょううん、北育４１号、Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｆｌａｎｋｌｉｎ、Ｂａｒｋｅ種などが例示できる。
【００３７】
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列は、代表的には大麦Ｃｏｐｅｌａｎｄ種からゲノムＤＮＡを抽出し、上述した方法により決定できる。また、Ｃｏｐｅｌａｎｄ種以外の大麦種から抽出したゲノムＤＮＡを用いることも可能であり、そのような大麦種の例として、これらに限定されるものではないが、ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｆｌａｇｓｈｉｐ、Ｇａｉｒｄｎｅｒ種などが例示できる。
【００３８】
本発明においてアラインメントとは、対応する塩基配列部分が並ぶよう、適宜空白（ギャップ）を入れて塩基配列を整列したものをいう。また、３つ以上の塩基配列における多重整列についても、アラインメントと呼ぶ。整列を最適化するために導入されるギャップ部分については、本発明においては塩基配列が一致しない塩基部位、すなわちＤＮＡマーカーとして特定する。
【００３９】
アラインメントにあたっては、公知のアラインメント作成プログラムを利用することができる。例えばＣｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘなどが好適に利用可能である。
【００４０】
本発明におけるＤＮＡマーカーの一例として、配列番号１で特定される塩基配列の第１２番目、第１４番目、第４６番目、第２４０番目、第２８６−２８８番目、第８６６番目又は第９５２番目の塩基に相当する塩基部位を例示できる（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６及びＭ７）。
【００４１】
本発明は、（１）上記ＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを、被検大麦種のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅し、（２）該ポリヌクレオチドを用いて、該ＤＮＡマーカーのうち少なくとも一つについて塩基種を同定し、（３）同定された遺伝子型がＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致する大麦種を泡持ちの優れる大麦種として選抜する方法を提供する。
【００４２】
被検大麦種からのゲノムＤＮＡの抽出方法は、特に限定されるものではなく、常用される方法を一般に適用可能である。また、市販されているキット類も好適に使用可能である。一方、ゲノムＤＮＡは被検大麦種の葉、茎、根、種子等の部位から抽出されてもよいが、育種段階での選抜を考慮すれば、葉から抽出するのが好ましい。葉から抽出することにより、早い段階で望ましい形質を有する大麦を選抜することができる。
【００４３】
上記ゲノムＤＮＡから、少なくとも一つの上記ＤＮＡマーカーを含むポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅する場合においては、ＤＮＡマーカーを特定する際に決定した大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列を基にＰＣＲ用プライマーを設計することができる。該プライマーにより増幅されるポリヌクレオチドの長さとしては、２０〜３００００ｂｐとすることができる。ＰＣＲ法での増幅効率、増幅されたポリヌクレオチドを解析する際の取り扱いの容易さ等を勘案すれば、上限値は１００００ｂｐとするのが好ましく、より好ましくは３０００ｂｐであり、さらに好ましくは２０００ｂｐである。同様に下限値は１００ｂｐとするのが好ましく、より好ましくは３００ｂｐ、さらに好ましくは５００ｂｐである。ＰＣＲ法に用いるポリメラーゼの種類を当業者に良く知られたものの中から適宜選択することにより、上述した長さを有するポリヌクレオチドを増幅することができる。
【００４４】
上記ポリヌクレオチドを用いてＤＮＡマーカーの塩基種を同定する方法としては、シークエンス解析により塩基配列を解読する方法などが好適に利用可能である。
【００４５】
該ＤＮＡマーカーの同定された塩基種と、Ｈａｒｕｎａ型及びＣｏｐｅｌａｎｄ型の当該ＤＮＡマーカーの塩基種とを比較し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の塩基種と一致する被検大麦種を選抜する。これにより、泡持ちの優れた大麦種の選抜が可能となる。
【００４６】
上述した塩基種の比較は、一つのＤＮＡマーカーについて実施することもできるし、又は二つ以上のＤＮＡマーカーについて実施することもできる。二つ以上のＤＮＡマーカーについて比較を行なった場合は、当該ＤＮＡマーカーのうち少なくとも一つがＣｏｐｅｌａｎｄ型と一致する大麦種を選抜する。この場合も、泡持ちの優れた大麦種を選抜できる。
【００４７】
本発明はまた、（１）上記ＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを、被検大麦種のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅し、（２）該ポリヌクレオチドを制限酵素と反応させ、（３）該ＤＮＡマーカー位置にて前記制限酵素によるポリヌクレオチドの切断が生じるか否かを同定し、（４）同定された遺伝子型がＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致する大麦種を泡持ちの優れる大麦種として選抜する方法を提供する。
【００４８】
上記ＤＮＡマーカーの遺伝子型によっては、Ｈａｒｕｎａ型又はＣｏｐｅｌａｎｄ型のいずれかのみにおいて、該ＤＮＡマーカー位置に制限酵素が認識できる塩基配列が形成されうる。この場合においては、ＰＣＲ法により該ＤＮＡマーカーを含むポリヌクレオチドを増幅した後、当該制限酵素により切断が生じるか否かで遺伝子型を同定できる。
【００４９】
被検大麦種からのゲノムＤＮＡの抽出方法、及びゲノムＤＮＡを抽出する部位については上述した通りである。
【００５０】
ＰＣＲ法により上記ＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを増幅する工程において、ＰＣＲ用プライマーの設計は上述した通りである。該プライマーにより増幅されるポリヌクレオチドの長さとしては、特に限定はないが、後の工程で制限酵素切断断片をフラグメントのサイズで検出することを考慮すれば、上限値を５０００ｂｐとするのが好ましく、より好ましくは３０００ｂｐであり、さらに好ましくは２０００ｂｐである。同様に下限値は、２００ｂｐが好ましく、より好ましくは３００ｂｐであり、さらに好ましくは５００ｂｐである。ＰＣＲ法に用いるポリメラーゼの種類を当業者に良く知られたものの中から適宜選択することにより、上述した長さを有するポリヌクレオチドを増幅することができる。
【００５１】
制限酵素による反応は、公知の至適緩衝液、至適反応温度により実施することができる。また、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片サイズを検出する工程も、当業者に常用される方法で実施することができる。
【００５２】
アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡ断片サイズの検出の結果、ＤＮＡ断片の数、ＤＮＡ断片のサイズから、当該ＤＮＡマーカー位置にて制限酵素による切断が生じたか否かを判定できる。これを遺伝子型とし、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致する被検大麦種を選抜すればよい。
【００５３】
本発明はまた、上記選抜方法によって選抜された大麦種の交配後代系統に由来する大麦種を提供する。
【００５４】
上記選抜方法によって選抜された大麦種は、ゲノムＤＮＡの塩基配列がＣｏｐｅｌａｎｄ型と一致しており、該大麦種間で交配した場合、後代系統の大麦種もほぼ確実にＣｏｐｅｌａｎｄ型となり、プロテインＺ４含量が高い。したがって、泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種として有用である。
【００５５】
本発明はまた、仕込工程及び発酵工程を少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、前記仕込工程で使用される大麦種が、本発明の選抜方法によって選抜された大麦種又は本発明の選抜方法によって選抜された大麦種の交配後代系統に由来する大麦種である、麦芽発酵飲料の製造方法を提供する。
本発明はまた、上記製造方法で得ることのできる麦芽発酵飲料を提供する。
【００５６】
本発明により選抜された大麦種又は本発明の選抜方法によって選抜された大麦種の交配後代系統に由来する大麦種を製麦することにより麦芽を得ることができる。製麦の方法としては特に制限されず公知の方法で行えば良い。具体的には、例えば、浸麦度が４０％〜４５％に達するまで浸麦後、１０〜２０℃で３〜６日間発芽させ、焙燥して麦芽を得ることができる。
【００５７】
上記仕込工程は、麦芽や大麦を含む原料と仕込用水とを混合し、得られた混合物を加温することにより麦芽や大麦を糖化させ、前記糖化された麦芽や大麦から麦汁を採取する工程である。この仕込工程には、本発明により選抜された大麦種又は本発明の選抜方法によって選抜された大麦種の交配後代系統に由来する大麦種から得られた麦芽のみならず、本発明により選抜された大麦種又は本発明の選抜方法によって選抜された大麦種の交配後代系統に由来する大麦種そのものも使用することができる。また、さらに原料として、上記麦芽や大麦以外に、コーンスターチ、コーングリッツ、米、糖類等の副原料を添加しても良い。
【００５８】
上記発酵工程は、前記麦汁にホップを添加し、煮沸、冷却した冷麦汁に酵母を添加して発酵させ麦芽発酵飲料（中間）品を得る工程である。ここで用いられる酵母は、例えば、サッカロミセス・セレビシェ、サッカロミセス・ウバルム等が挙げられる。
【００５９】
麦芽発酵飲料は、その製造に用いられる麦芽の使用比率の多少は特に制限されず、麦芽を原料の一部として発酵により製造される飲料であればよい。具体的には例えば、ビールや発泡酒が挙げられる。また、いわゆるノンアルコールビールやノンアルコール発泡酒も、ビール等と同様の製法を用いることから、麦芽発酵飲料である。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００６１】
（予備試験；ビール中のプロテインＺ４含有量とＮＩＢＥＭ値の関係）
４００Ｌパイロットプラントで１１品種（はるな二条、あまぎ二条、ミカモゴールデン、新田二条２３号、りょうふう、りょううん、北育４１号、ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、ＣＤＣ Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ）の麦芽それぞれから醸造された試験ビール合計４２点をサンプルとして用いた。
【００６２】
［試験ビール中のプロテインＺ４濃度の測定］
ビール中のプロテインＺ４濃度の測定はサンドイッチＥＬＩＳＡ法で行った。精製した大麦プロテインＺ４を抗原としたウサギ抗プロテインＺ４抗体を一次抗体に、またペルオキシダーゼ標識抗プロテインＺ４−Ｆａｂ’を二次抗体とした。一次抗体１００μＬを９６穴プレートにアプライし４℃で一晩放置した。カゼイン溶液でブロッキングした後、適宜希釈したビールサンプル１００μＬをそれぞれ添加し室温で２時間反応後、ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０， ｐＨ７．５）で３回洗浄した。その後、二次抗体を添加し、２時間反応後、ＴＢＳで３回洗浄した。検出はＰＯＤ発色キット（住友ベークライト社）にて発色させた後、４９２ｎｍの吸光度を測定した。既知の濃度の精製した大麦プロテインＺ４標準液の吸光度で検量線を作成し、これに対するサンプルの吸光度でサンプルのプロテインＺ４濃度を算出した。大麦プロテインＺ４標準液としては、大麦からプロテインＺ４を精製し、凍結乾燥後秤量し、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に溶解させたものを用いた。
【００６３】
［試験ビールのＮＩＢＥＭ値の測定］
ＮＩＢＥＭ値の測定は、ＨＡＦＦＭＡＮＳ社のＮＩＢＥＭ−Ｔ装置、ＩＮＰＡＣＫ２０００及びＮＩＢＥＭ値測定用の標準グラスを用いて行った。具体的には、上記の試験ビールをそれぞれ２０℃の状態にし、泡注ぎ出し機により炭酸ガスを用いて標準グラスに注ぎ出し、生じた泡の高さの降下をＮＩＢＥＭ−Ｔ装置で追尾することにより測定した。
【００６４】
［プロテインＺ４濃度とＮＩＢＥＭ値の関係］
プロテインＺ４濃度とＮＩＢＥＭ値の間には有意な相関関係があった（図１）。一方、製麦工程中に蛋白質がどの程度分解されたかを示す指標の一つであるコールバッハ値（ＫＩ）及び、苦味の程度を表す指標で、ホップ中のイソα酸が関与しているとされるＢＵは泡持ちと深い関係があるとされている（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，６０巻，４７−５７頁，２００２年）。本解析に用いたサンプルはサンプル数が４２、用いた麦芽品種が１１、また表１のように麦芽ＫＩやビールＢＵのばらつきも大きい。このようにＫＩやＢＵのばらつきの大きい母集団でプロテインＺ４とＮＩＢＥＭ値が有意な相関関係を示したことから、プロテインＺ４はＮＩＢＥＭ値の有効なマーカーになることが示された。
【００６５】
【表１】
【００６６】
（実施例１；ＤＮＡマーカーの特定）
［塩基配列解析］
大麦はるな二条種、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ種及びＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ種の葉から、以下の方法でゲノムＤＮＡを抽出した。葉に抽出バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）とジルコニアボールを添加し、振とうした後、６０℃で３０分間保持した。遠心分離後の上清に等量のイソプロパノールを添加しＤＮＡを析出させ、遠心分離後、沈殿に７０％エタノールを添加し再び遠心分離した。生じたＤＮＡの沈殿を滅菌水に溶解させたものをＰＣＲの鋳型に用いた。ＮＣＢＩのデータベースよりプロテインＺ４の塩基配列情報を入手し、遺伝領域、及び翻訳開始位置より上流域を含むようにセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを設計し、タカラバイオ社のＰｒｅｍｉｘ Ｔａｑ（Ｅｘ Ｔａｑ Ｖｅｒｓｉｏｎ）を用いてＰＣＲ反応を行いＤＮＡ断片を増幅した。なお、ＰＣＲ反応は、センスプライマー１とアンチセンスプライマー１の組み合わせ、および、センスプライマー２とアンチセンスプライマー２の組み合わせ、により標的配列を２断片に分けて増幅した。増幅産物のサイズはそれぞれ約２．０及び１．７ｋｂｐである。プライマーの配列は以下の通りである。
センスプライマー１（配列番号４）；
５’−ＧＧＡＧＴＡＴＡＴＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＧ−３’
アンチセンスプライマー１（配列番号５）；
５’−ＣＣＣＴＴＣＧＣＧＴＡＡＧＧＡＡＧＣＴＴ−３’
センスプライマー２（配列番号６）；
５’−ＧＧＴＧＧＴＧＣＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＣＧＣ−３’
アンチセンスプライマー２（配列番号７）；
５’−ＣＴＴＴＧＡＡＡＣＣＧＣＧＧＴＣＴＧＴＡＣ−３’
【００６７】
増幅産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、目的サイズのＤＮＡ断片をゲルごと切り取りＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔでＤＮＡ断片を精製した。このＤＮＡ断片のシークエンスを決定した。シークエンス解析はＳｉｇｍａ社への委託解析により行った。決定した大麦はるな二条種、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ種及びＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ種の塩基配列をそれぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３とした。
【００６８】
［塩基配列のアラインメント解析］
配列番号１、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を用い、ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．８（ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）により塩基配列のアラインメント解析を行なった。図２に示すように、プロテインＺ４遺伝子の開始コドンより上流３１８ｂｐの位置からプロテインＺ４遺伝子終止コドンの位置までの１８５３ｂｐ長の領域において、７ヶ所（９塩基）を塩基配列が一致しない塩基部位として特定した。
【００６９】
上記塩基部位７ヶ所は、それぞれ配列番号１で特定される塩基配列の第１２番目、第１４番目、第４６番目、第２４０番目、第２８６−２８８番目、第８６６番目及び第９５２番目の塩基に相当する塩基部位であった。これらをそれぞれＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６及びＭ７と名づけた。
【００７０】
（実施例２；ＤＮＡマーカーＭ３を用いた既往大麦種の選抜効果の検証）
大麦ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、りょううん、りょうふう、北育４１号、はるな二条、Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｆｌａｇｓｈｉｐ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｇａｉｒｄｎｅｒ、Ｂａｒｋｅ、Ｂｒａｅｍｅｒ、Ｓｃａｒｌｅｔｔの１６品種を解析対象とし、上述したＤＮＡマーカーＭ３を用いて遺伝子型を同定し、同定した遺伝子型に基づいてプロテインＺ４含有量の高い大麦種を選抜できるか検証した。
【００７１】
［ＤＮＡマーカーＭ３の遺伝子型の同定］
前記１６品種からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、前記ＤＮＡマーカーＭ３を含む、約２０００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を得た。プライマーは配列番号４及び配列番号５に記載されたものを用いた。
【００７２】
得られたＰＣＲ産物に制限酵素ＡｃｃＩ（タカラバイオ株式会社）を添加し、３７℃で、一晩反応を行った。反応産物を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色により電気泳動パターンを視覚化した（図３）。
図３のアガロースゲル電気泳動結果図では、各レーンには、左から右に向けて、ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ，ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ，Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ，りょうふう，りょううん，北育４１号，はるな二条，Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ，Ｓｃｈｏｏｎｅｒ，Ｆｌａｇｓｈｉｐ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｇａｉｒｄｎｅｒ，Ｂａｒｋｅ，Ｂｒａｅｍｅｒ，Ｓｃａｒｌｅｔｔ大麦種に由来するサンプルがロードされている。
ＤＮＡマーカーＭ３は、制限酵素ＡｃｃＩの認識サイト（ＧＴＡＧＡＣ）内に存在し、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄはこの領域の塩基配列が「ＡＴＡＧＡＣ」のため、ＡｃｃＩで切断されないが、はるな二条は「ＧＴＡＧＡＣ」のためＡｃｃＩで切断され、約１２００ｂｐと８００ｂｐのＤＮＡ断片が生じる。解析の結果、１６種のうち、８種がはるな二条と同一のパターン、８種がＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄと同一の電気泳動パターンを示した。これらをＨａｒｕｎａ型及びＣｏｐｅｌａｎｄ型と分類した。
【００７３】
［ＥＬＩＳＡによるプロテインＺ４含有量の定量］
前記１６種の大麦種子中のプロテインＺ４をＥＬＩＳＡ法により定量した。ＥＬＩＳＡは、精製した大麦プロテインＺ４を抗原としたウサギ抗プロテインＺ４抗体を用いた以下の直接吸着法で行った。ミルで粉砕した大麦種子５０ｍｇを２ｍＬスクリューキャップ付きチューブにとり、０．２８％ＤＴＴ（和光純薬工業）を含むＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）１ｍＬを添加し、一晩振とうした。この液の遠心上清を大麦種子タンパク質抽出液とした。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量した後、適宜希釈した大麦種子タンパク質抽出液１００μＬをそれぞれ４反復９６穴プレートにアプライし、４℃で一晩放置した。カゼイン溶液でブロッキングした後、プロテインＡカラムで精製した抗プロテインＺ４抗体をアプライし、室温で２時間反応後、ＴＢＳで３回洗浄した。その後、１０００倍希釈した二次抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−ＡＰ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を添加し、室温で２時間反応後、ＴＢＳで３回洗浄した。発色は１ｍｇ／ｍＬ ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物（１０％ジエタノールアミン）（和光純薬工業）溶液１５０μＬを入れ行い、適度な発色が見られた段階で３Ｎ ＮａＯＨを５０μＬ添加し反応を停止後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。既知の濃度の精製した大麦プロテインＺ４標準液の吸光度で検量線を作成し、これに対するサンプルの吸光度でサンプルのプロテインＺ４濃度を算出した。大麦プロテインＺ４標準液としては、大麦からプロテインＺ４を精製し、凍結乾燥後秤量し、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に溶解させたものを用いた。
【００７４】
［Ｈａｒｕｎａ型およびＣｏｐｅｌａｎｄ型のプロテインＺ４含有量の比較］
ＤＮＡマーカーＭ３の遺伝子型によりグループ分けしたＣｏｐｅｌａｎｄ型とＨａｒｕｎａ型、それぞれのプロテインＺ４含量の平均値を算出し、比較した（図４）。その結果、
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型；２３．５±４．３７ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
Ｈａｒｕｎａ型；１６．５±２．８３ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
であった。ｔ検定により検定したところ、危険率１％で有意にＣｏｐｅｌａｎｄ型の方がＨａｒｕｎａ型と比較してプロテインＺ４含有量が高かった。
【００７５】
（実施例３；ＤＮＡマーカーＭ３を用いた倍化半数体系統の大麦種の選抜効果の検証）
別の母集団で本マーカーの効果を検証するため大麦ミカモゴールデン−Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの倍化半数体系統について、実施例２と同様の手順によって、プロテインＺ４含量の定量及びＤＮＡマーカーＭ３の遺伝子型を同定した。同定した遺伝子型に従ってＣｏｐｅｌａｎｄ型とＨａｒｕｎａ型に分類し、それぞれのプロテインＺ４含量の平均値を算出し、比較した（図５）。
【００７６】
その結果、
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型；２９．４±１９．８５ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
Ｈａｒｕｎａ型；１１．６±４．６４ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
であり、ｔ検定により検定したところ、危険率１％で有意にＣｏｐｅｌａｎｄ型の方がＨａｒｕｎａ型よりもプロテインＺ４含量が高かった。以上、実施例２及び実施例３の結果より、本ＤＮＡマーカーＭ３はプロテインＺ４含有量の高い大麦種を選抜するためのＤＮＡマーカーとして有効に利用できることが示された。
【００７７】
（実施例４；ＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６及びＭ７を用いた既往大麦種の選抜効果の検証）
ビール醸造用大麦として使用されている主要１４品種について、その他のＤＮＡマーカーの有効性を評価した。検証に用いた１４品種は、はるな二条、りょうふう、りょううん、北育４１号、Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｆｌａｎｋｌｉｎ、Ｂａｒｋｅ、ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｆｌａｇｓｈｉｐ、Ｇａｉｒｄｎｅｒである。
【００７８】
［塩基配列の解析］
実施例１と同様の方法により、上記１４品種からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、上記ＤＮＡマーカーＭ１〜Ｍ７をすべて含むＤＮＡ断片を増幅し、シークエンス解析により前記ＤＮＡマーカーの塩基種を同定した。
【００７９】
［塩基配列の比較］
１４品種の各ＤＮＡマーカーの遺伝子型と、Ｈａｒｕｎａ型及びＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型とを比較した。その結果、ＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６及びＭ７の遺伝子型により、はるな二条、りょうふう、りょううん、北育４１号、Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｆｌａｎｋｌｉｎ、Ｂａｒｋｅの８品種がＨａｒｕｎａ型に分類され、ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｆｌａｇｓｈｉｐ、Ｇａｉｒｄｎｅｒの６品種がＣｏｐｅｌａｎｄ型に分類された（表２）。
【００８０】
【表２】
【００８１】
［ＥＬＩＳＡによるプロテインＺ４含有量の定量］
実施例２に記載したのと同様の方法により、１４品種の種子中のプロテインＺ４含有量を定量した。
【００８２】
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型とＨａｒｕｎａ型、それぞれのプロテインＺ４含量の平均値を算出し、比較した（図６）。その結果、
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型；２５．２±３．５７ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
Ｈａｒｕｎａ型；１６．５±２．８３ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
であり、ｔ検定により検定したところ、危険率１％で有意にＣｏｐｅｌａｎｄ型の方がＨａｒｕｎａ型よりもプロテインＺ４含有量が高かった。以上の結果から、本ＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６及びＭ７はプロテインＺ４含有量の高い大麦種を選抜するためのＤＮＡマーカーとして有効に利用できることが示された。
【００８３】
また、以上の結果より、本実施例に記載されていない大麦プロテインＺ４遺伝子近傍において、Ｈａｒｕｎａ型及びＣｏｐｅｌａｎｄ型の塩基配列のアラインメント解析を行なった場合に、本ＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６及びＭ７と同様に特定されうるＤＮＡマーカーについても、泡持ちの優れる大麦種を選抜するＤＮＡマーカーとして有効に利用できることは当業者にとって自明なことである。
【００８４】
（実施例５；ＤＮＡマーカーＭ５を用いた既往大麦種の選抜効果の検証）
ビール醸造用大麦として使用されている主要１４品種について、その他のＤＮＡマーカーの有効性を評価した。検証に用いた１４品種は、はるな二条、りょうふう、りょううん、北育４１号、Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｆｌａｎｋｌｉｎ、Ｂａｒｋｅ、ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｆｌａｇｓｈｉｐ、Ｇａｉｒｄｎｅｒである。
【００８５】
［塩基配列の解析］
実施例４と同様に、上記１４品種からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、上記ＤＮＡマーカーＭ１〜Ｍ７をすべて含むＤＮＡ断片を増幅し、シークエンス解析により前記ＤＮＡマーカーの塩基種を同定した。
【００８６】
［塩基配列の比較］
１４品種の各ＤＮＡマーカーの遺伝子型と、Ｈａｒｕｎａ型及びＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型とを比較した。その結果、ＤＮＡマーカーＭ５の遺伝子型により、はるな二条、りょうふう、りょううん、北育４１号、Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｆｌａｎｋｌｉｎ、Ｂａｒｋｅ、ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌの９品種がＨａｒｕｎａ型に分類され、ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｆｌａｇｓｈｉｐ、Ｇａｉｒｄｎｅｒの５品種がＣｏｐｅｌａｎｄ型に分類された（表２）。
【００８７】
［ＥＬＩＳＡによるプロテインＺ４含有量の定量］
実施例２に記載したのと同様の方法により、１４品種の種子中のプロテインＺ４含有量を定量した。
【００８８】
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型とＨａｒｕｎａ型、それぞれのプロテインＺ４含量の平均値を算出し、比較した（図７）。その結果、
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型；２４．９±３．９４ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
Ｈａｒｕｎａ型；１７．６±４．１９ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
であり、ｔ検定により検定したところ、危険率１％で有意にＣｏｐｅｌａｎｄ型の方がＨａｒｕｎａ型よりもプロテインＺ４含有量が高かった。以上の結果より、本ＤＮＡマーカーＭ５はプロテインＺ４含有量の高い大麦種を選抜するためのＤＮＡマーカーとして有効に利用できることが示された。
【００８９】
実施例４において、ＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６及びＭ７によって遺伝子型を同定し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致する大麦種を選抜した結果、６品種が選抜された。一方、実施例５において、ＤＮＡマーカーＭ５の遺伝子型を同定し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致する大麦種を選抜した結果、前記６品種のうちＫｅｎｄａｌｌ種が選抜されなかった。本実施例からは、ＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６及びＭ７によってＣｏｐｅｌａｎｄ型に選別された大麦６品種のうち５品種で遺伝子型が一致するＤＮＡマーカーＭ５によっても、プロテインＺ４含有量の高い品種の選抜ができることが示された。
【００９０】
（参考例；ＲＦＬＰマーカーＭＷＧ２０３３Ｄｒａによる既往大麦種の選抜）
プロテインＺ４遺伝子周辺領域において、本発明におけるＤＮＡマーカーとして利用可能なＤＮＡマーカーが存在する範囲を検証した。
【００９１】
図８は、ＲＦＬＰマーカーに基づいて作成された、大麦ゲノム４Ｈ染色体のマーカー地図を示したものである。ＲＦＬＰマーカーＢａｍｙＸｂａの位置を基点として、プロテインＺ４遺伝子は７７．６ｃＭの位置にある。本参考例では、９９．２ｃＭの位置にあるＲＦＬＰマーカーＭＷＧ２０３３Ｄｒａを利用して、大麦ミカモゴールデン−Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの倍化半数体系統を分類し、Ｈａｒｕｎａ型とＣｏｐｅｌａｎｄ型のプロテインＺ４含有量を比較した。なお、ミカモゴールデン種は、遺伝子型の判定の結果、ＤＮＡマーカーＭ１〜Ｍ７のすべてで、Ｈａｒｕｎａ型に分類された（データ示さず）。
【００９２】
［遺伝子型の判別］
大麦ミカモゴールデン−Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの倍化半数体系統の葉を試料として、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ，Ｍ．Ｇ． ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，１９８０年，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８巻，４３２１−４３２５頁）によって、ゲノムＤＮＡを抽出した。各ゲノムＤＮＡ５μｇに制限酵素ＤｒａＩ（タカラバイオ株式会社）を添加し、３７℃で、一晩反応を行った。反応産物を０．７％アガロースゲル電気泳動により分離し、アルカリトランスファー法（Ｒｅｅｄ，Ｋ．Ｃ． ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｍａｎｎ，１９８５年，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３巻，７２０７−７２２１頁）により、ナイロンメンブレンに転写した。ｐ-ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたプローブとなるＤＮＡ断片をＭ１３プライマーで、ＰＣＲ法により増幅した後、ＤＩＧ−ｈｉｇｈ ｐｒｉｍｅキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用い、ＰＣＲ産物を鋳型としてラベル化反応を行い、ＤＩＧラベル化プローブを得た。ハイブリダイゼーションおよびシグナルの検出は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＤＩＧ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅに従って実施した。
【００９３】
［遺伝子型の分類］
検出されたバンドパターンに基づいて大麦種を２種に分類し、ミカモゴールデン種が分類された大麦種群をＨａｒｕｎａ型と、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ種が分類された大麦種群をＣｏｐｅｌａｎｄ型とした。
【００９４】
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型とＨａｒｕｎａ型、それぞれのプロテインＺ４含量の平均値を算出し、比較した（図９）。その結果、
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型；２７．１±２０．００ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
Ｈａｒｕｎａ型；１９．２± １５．６５ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
であり、ｔ検定により検定したところ、危険率５％で有意にＣｏｐｅｌａｎｄ型の方がＨａｒｕｎａ型よりもプロテインＺ４含有量が高かった。
【００９５】
参考例及び実施例２〜５における、プロテインＺ４含量の平均値及びばらつきを比較すると、ＤＮＡマーカーとプロテインＺ４遺伝子との距離が離れるほど、大麦種の選抜精度は低下する傾向がみられる。しかしながら、本参考例において、ＲＦＬＰマーカーＭＷＧ２０３３Ｄｒａは、プロテインＺ４遺伝子から２１．６ｃＭ距離が離れているものの、本発明のＤＮＡマーカーとして利用可能なことが示された。したがって、プロテインＺ４遺伝子からの距離がこの範囲内であれば、本発明におけるＤＮＡマーカーとして好適に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列番号４〜７；合成プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麦芽発酵飲料用大麦種の選抜方法及び麦芽発酵飲料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビール等の麦芽発酵飲料の泡は、薄い液体の膜に包まれた炭酸ガスの気泡の集合体であり、気が抜けたり、香味が変化したりするのを防ぐ蓋の役目をするほか、香り立ちを向上させる働きがある。このため、泡持ちはビール等の麦芽発酵飲料の品質を左右する重要な要因の一つである。
【０００３】
泡持ちの良し悪しは様々な要因から成り立っているが、その要因の一つとしてタンパク質の関与が考えられており、プロテインＺ（Ｚ４、Ｚ７）やＬＴＰ−１といったタンパク質が泡持ちに関連するタンパク質としてこれまでに取り上げられてきた（例えば非特許文献１−３を参照）。
【０００４】
プロテインＺ４については、泡持ちに関与するとする報告（非特許文献４）、また直接泡持ちには関与していないと示唆する報告があり（非特許文献５）、プロテインＺ４と泡持ちの関係にはいまだ議論の余地がある。一方、これまでに種子プロテインＺ４含有量に関するＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）マーカーが開発されている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．，５６巻，１４５８−１４６４頁，２００８年
【非特許文献２】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．，５６巻，８６６４−８６７１頁，２００８年
【非特許文献３】Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，６０巻，４７−５７頁，２００２年
【非特許文献４】Ｊ．Ｉｎｓｔ．Ｂｒｅｗ．，１０５巻，１７１−１７７頁，１９９９年
【非特許文献５】Ｐｒｏｃ．Ｃｏｎｇｒ．Ｅｕｒ．Ｂｒｅｗ．Ｃｏｎｖ．，２２巻，５６１−５６８頁，１９８９年
【非特許文献６】Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．，４９巻，６９−７４頁，１９９９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
麦芽発泡飲料用の大麦育種において、泡持ちの優れた大麦種の当該形質を確実に後代へと伝えていくことは必須かつ重要な課題である。近年、作物の育種において、様々な形質に関して、ＤＮＡマーカーを利用した当該形質を有する作物の選抜技術が開発されているが、これまでのところ泡持ちに関して有効なＤＮＡマーカーは報告されていない。
【０００７】
これまでに大麦種子中のプロテインＺ４含有量に関するＲＦＬＰマーカーが非特許文献６に開示されている。しかしながら、ＲＦＬＰ法はゲノムＤＮＡの制限酵素切断とサザンハイブリダイゼーションを基にした方法であって、作業が煩雑なうえ、遺伝子型を判別するのに多大な時間を要し、さらに多検体を処理するのには不向きな選抜方法である。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、作業が容易で、短時間で遺伝子型を判別でき、多検体を処理することが可能で、泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種をより確実に選抜できる選抜方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種を選抜する選抜方法であって、
被検大麦種について、
Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列と、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列とのアラインメントにより特定されるＤＮＡマーカーの少なくとも一つについて遺伝子型を同定し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型に一致する被検大麦種を、泡持ちの優れる大麦種として選抜する選抜方法を提供する。
【００１０】
ここで、「Ｈａｒｕｎａ型」とは、プロテインＺ４遺伝子座周辺領域に存在する前記ＤＮＡマーカーの遺伝子型が、はるな二条種の前記ＤＮＡマーカーの遺伝子型と一致する大麦種を表す。「Ｈａｒｕｎａ型」のプロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列の一例としては、配列番号１で示される塩基配列が挙げられる。
【００１１】
同様に、「Ｃｏｐｅｌａｎｄ型」とは、プロテインＺ４遺伝子座周辺領域に存在する前記ＤＮＡマーカーの遺伝子型が、Ｃｏｐｅｌａｎｄ種の前記ＤＮＡマーカーの遺伝子型と一致する大麦種を表す。「Ｃｏｐｅｌａｎｄ型」のプロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列の一例としては、配列番号２で示される塩基配列が挙げられる。
【００１２】
上記Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列及びＣｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列をアラインメントすることにより、前記両塩基配列が一致しない塩基部位が見出され、ＤＮＡマーカーとして特定することができる。大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域には複数の前記ＤＮＡマーカーがあり、被検大麦種において、前記ＤＮＡマーカーの少なくとも一つについて、遺伝子型を同定し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型に一致する被検大麦種を選抜する。
【００１３】
ここで、被検大麦種において複数同定された遺伝子型のうち、少なくとも１つがＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致すればよい。
【００１４】
上述した本発明における選抜方法では、大麦プロテインＺ４含有量と相関する新規なＤＮＡマーカーを利用し、その遺伝子型に基づいて被検大麦種を選抜することにより、プロテインＺ４含有量の高い被検大麦種をより確実に選抜することができる。
【００１５】
本発明者らは、後段で詳述するように、ビールにおいてプロテインＺ４含有量と泡持ちとの間に有意な相関関係があることを確認し（図１参照）、プロテインＺ４含有量が泡持ちの有効なマーカーになりうることを見出した。したがって、上述した選抜方法により、泡持ちの優れる被検大麦種を選抜することができる。
【００１６】
麦芽発酵飲料の泡持ちは、例えば、２０℃の麦芽発酵飲料を泡注ぎ出し機で標準グラスに注いで生じる泡の高さが３０ｍｍ降下するのに要する時間（秒）（ＮＩＢＥＭ値）を判定基準とすることができる。
【００１７】
上記ＤＮＡマーカーとして、配列番号１及び配列番号２で特定される塩基配列のアラインメントにより特定されるＤＮＡマーカーを例示できる。例えば、配列番号１で示される塩基配列の第１２番目、第１４番目、第４６番目、第２４０番目、第２８６−２８８番目、第８６６番目又は第９５２番目の塩基に相当する塩基部位である（以下順にＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６及びＭ７と呼ぶ）。
【００１８】
本発明は、（１）上記ＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを、被検大麦種のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅し、（２）該ポリヌクレオチドを用いて、該ＤＮＡマーカーのうち少なくとも一つについて塩基種を同定し、（３）同定された遺伝子型がＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致する大麦種を泡持ちの優れる大麦種として選抜する方法を提供する。
【００１９】
上記選抜方法においては、大麦からＤＮＡを抽出する作業工程、ＰＣＲ法によりＤＮＡマーカーを含むポリヌクレオチドを増幅する作業工程、ポリヌクレオチドのシークエンスを解析する作業工程、といった基本的かつ比較的容易な操作のみで短時間でＤＮＡマーカーの遺伝子型を同定することができるため、多検体を処理することが可能となる。
【００２０】
本発明はまた、（１）上記ＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを、被検大麦種のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅し、（２）該ポリヌクレオチドを制限酵素と反応させ、（３）該ＤＮＡマーカー位置にて前記制限酵素によるポリヌクレオチドの切断が生じるか否かで遺伝子型を同定し、（４）同定された遺伝子型がＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致する大麦種を泡持ちの優れる大麦種として選抜する方法を提供する。
【００２１】
上記選抜方法においては、大麦種からＤＮＡを抽出する作業工程、ＰＣＲによりＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを増幅する作業工程、制限酵素と反応させる作業工程及びアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片サイズを検出する作業工程、といった基本的かつ比較的容易な操作のみでＤＮＡマーカーの遺伝子型を同定することができる。また、ＤＮＡ断片サイズを検出する作業工程に要する時間が短く、多検体を処理することが可能である。さらに、塩基配列の解読を必要としないため、遺伝子型の同定にかかるコストを低く抑えることができる。
【００２２】
本発明はまた、上記選抜方法によって選抜された大麦種の交配後代系統に由来する大麦種を提供する。
【００２３】
本発明は、仕込工程及び発酵工程を少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、前記仕込工程で使用される大麦種が、本発明の選抜方法によって選抜された大麦種である、麦芽発酵飲料の製造方法を提供する。
本発明はまた、上記製造方法で得ることのできる麦芽発酵飲料を提供する。
【００２４】
本発明の選抜方法によって選抜された大麦種は、プロテインＺ４含有量が高く、当該大麦種から製造される麦芽発酵飲料は、泡持ちに優れる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種をより確実に選抜することができる。また、泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種を選抜する際、容易な作業によって、短時間で遺伝子型を同定でき、多検体を処理することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ビールにおけるプロテインＺ４含有量とＮＩＢＥＭ値との関係を表すグラフである。
【図２】配列番号１及び配列番号２で特定されるＨａｒｕｎａ型及びＣｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列、並びに配列番号３で特定されるＫｅｎｄａｌｌ種の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列のアラインメント図である。アラインメントによって特定されたＤＮＡマーカーを矢印で示した。四角で囲われた塩基配列は、プロテインＺ４の開始コドン（ＡＴＧ）及び終止コドン（ＴＡＡ）に相当する塩基配列である。
【図３】ＰＣＲ法によりＤＮＡマーカーＭ３を含むポリヌクレオチドを増幅後、制限酵素ＡｃｃＩと反応させ、アガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色により電気泳動パターンを視覚化した写真である。各レーン上部に記載されたＨ又はＣは、被検大麦種の遺伝子型がＨａｒｕｎａ型の遺伝子型又はＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致することを示す。
【図４】既往大麦種を図３に示した方法でＨａｒｕｎａ型とＣｏｐｅｌａｎｄ型に選別し、平均プロテインＺ４含有量を比較したグラフである。
【図５】大麦ミカモゴールデン−Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの倍化半数体系統を図３に示した方法でＨａｒｕｎａ型とＣｏｐｅｌａｎｄ型に選別し、平均プロテインＺ４含有量を比較したグラフである。
【図６】ＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６及びＭ７の塩基種を同定し、Ｈａｒｕｎａ型とＣｏｐｅｌａｎｄ型に選別した大麦種の平均プロテインＺ４含有量を比較したグラフである。
【図７】ＤＮＡマーカーＭ５の塩基種を同定し、Ｈａｒｕｎａ型とＣｏｐｅｌａｎｄ型に選別した大麦種の平均プロテインＺ４含有量を比較したグラフである。
【図８】プロテインＺ４遺伝子が座上する４Ｈ染色体のマーカー地図を示したものである。
【図９】大麦ミカモゴールデン−Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの倍化半数体系統をＲＦＬＰマーカーＭＷＧ２０３３ＤｒａでＨａｒｕｎａ型とＣｏｐｅｌａｎｄ型に選別し，平均プロテインＺ４含有量を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を実施するための形態について、さらに詳細に説明する。
【００２８】
本発明は、泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種を選抜する選抜方法であって、
被検大麦種について、Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列と、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列のアラインメントにより特定されるＤＮＡマーカーの少なくとも一つについて遺伝子型を同定し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型に一致する被検大麦種を、泡持ちの優れる大麦種として選抜する選抜方法を提供する。
【００２９】
本発明において、大麦プロテインＺ４の遺伝子座周辺領域とは、大麦プロテインＺ４のエキソン、イントロンのみならず、転写制御に関わるＤＮＡ領域及びその周辺領域をも含むものである。ここで、大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域としては、開始コドンに相当するＡＴＧ配列の上流２５ｃＭ以内の範囲とすることができ、５ｃＭ以内の範囲とすることが好ましく、１ｃＭの範囲とすることがより好ましい。また、終止コドンに相当するＴＡＡ配列の下流２５ｃＭ以内の範囲とすることができ、５ｃＭの範囲とすることが好ましく、更に１ｃＭの範囲とすることがより好ましい。
【００３０】
ここで、ｃＭ（センチモルガン）とは、遺伝学的方法によって定まる染色体上での遺伝子間の距離を表す単位であって、減数分裂１回当たり、相同染色体間に平均１回の交叉が起こる距離を１Ｍとし、その１／１００の距離を１ｃＭという。
【００３１】
すなわち、プロテインＺ４遺伝子座から５ｃＭ以内であれば、組換えが生じる確率が５％以内となり、さらに１ｃＭ以内であればその確率が１％以内となるため、上記ＤＮＡマーカーとプロテインＺ４含有量との相関関係が、高い確率で保たれることになる。したがって、この範囲内とすることでプロテインＺ４含有量の高い被検大麦種をより確実に、統計上有意に選抜することができる。
【００３２】
大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列は、例えば、大麦種から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法により大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域からＤＮＡ断片を増幅し、必要に応じて該ＤＮＡ断片を精製し、該ＤＮＡ断片を鋳型としたシークエンス解析によって塩基配列を決定することにより入手できる。
【００３３】
ここで、ゲノムＤＮＡは大麦のどの部位から抽出されてもよく、大麦の葉、茎、根、種子等をゲノムＤＮＡソースとして利用可能である。ゲノムＤＮＡの抽出方法は、特に限定されるものではなく、常用される方法を一般に適用可能である。また、市販されているキット類も好適に使用可能である。
【００３４】
ＰＣＲのプライマーは、ＮＣＢＩ、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ等のデータベースを利用し、大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域に相当するゲノムの塩基配列を入手し、その塩基配列情報に基づいて設計することができる。プライマーの長さ、塩基配列、ＧＣ含有量等のパラメーターの決定については、当業者の通常の試行錯誤の範囲内であり、適宜決定されうる。また、ＰＣＲ法、増幅ＤＮＡ精製、シークエンスについては、当該技術分野で汎用されている手法を適用することができる。
【００３５】
本発明では、上記Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列及びＣｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列をアラインメントすることにより、前記両塩基配列が一致しない塩基部位が見出され、ＤＮＡマーカーとして特定することができる。
【００３６】
ここで、Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列は、代表的には大麦はるな二条種からゲノムＤＮＡを抽出し、上述した方法により決定できる。また、はるな二条種以外の大麦種から抽出したゲノムＤＮＡを用いることも可能であり、そのような大麦種の例として、これらに限定されるものではないが、ミカモゴールデン、りょうふう、りょううん、北育４１号、Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｆｌａｎｋｌｉｎ、Ｂａｒｋｅ種などが例示できる。
【００３７】
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列は、代表的には大麦Ｃｏｐｅｌａｎｄ種からゲノムＤＮＡを抽出し、上述した方法により決定できる。また、Ｃｏｐｅｌａｎｄ種以外の大麦種から抽出したゲノムＤＮＡを用いることも可能であり、そのような大麦種の例として、これらに限定されるものではないが、ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｆｌａｇｓｈｉｐ、Ｇａｉｒｄｎｅｒ種などが例示できる。
【００３８】
本発明においてアラインメントとは、対応する塩基配列部分が並ぶよう、適宜空白（ギャップ）を入れて塩基配列を整列したものをいう。また、３つ以上の塩基配列における多重整列についても、アラインメントと呼ぶ。整列を最適化するために導入されるギャップ部分については、本発明においては塩基配列が一致しない塩基部位、すなわちＤＮＡマーカーとして特定する。
【００３９】
アラインメントにあたっては、公知のアラインメント作成プログラムを利用することができる。例えばＣｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘなどが好適に利用可能である。
【００４０】
本発明におけるＤＮＡマーカーの一例として、配列番号１で特定される塩基配列の第１２番目、第１４番目、第４６番目、第２４０番目、第２８６−２８８番目、第８６６番目又は第９５２番目の塩基に相当する塩基部位を例示できる（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６及びＭ７）。
【００４１】
本発明は、（１）上記ＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを、被検大麦種のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅し、（２）該ポリヌクレオチドを用いて、該ＤＮＡマーカーのうち少なくとも一つについて塩基種を同定し、（３）同定された遺伝子型がＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致する大麦種を泡持ちの優れる大麦種として選抜する方法を提供する。
【００４２】
被検大麦種からのゲノムＤＮＡの抽出方法は、特に限定されるものではなく、常用される方法を一般に適用可能である。また、市販されているキット類も好適に使用可能である。一方、ゲノムＤＮＡは被検大麦種の葉、茎、根、種子等の部位から抽出されてもよいが、育種段階での選抜を考慮すれば、葉から抽出するのが好ましい。葉から抽出することにより、早い段階で望ましい形質を有する大麦を選抜することができる。
【００４３】
上記ゲノムＤＮＡから、少なくとも一つの上記ＤＮＡマーカーを含むポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅する場合においては、ＤＮＡマーカーを特定する際に決定した大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列を基にＰＣＲ用プライマーを設計することができる。該プライマーにより増幅されるポリヌクレオチドの長さとしては、２０〜３００００ｂｐとすることができる。ＰＣＲ法での増幅効率、増幅されたポリヌクレオチドを解析する際の取り扱いの容易さ等を勘案すれば、上限値は１００００ｂｐとするのが好ましく、より好ましくは３０００ｂｐであり、さらに好ましくは２０００ｂｐである。同様に下限値は１００ｂｐとするのが好ましく、より好ましくは３００ｂｐ、さらに好ましくは５００ｂｐである。ＰＣＲ法に用いるポリメラーゼの種類を当業者に良く知られたものの中から適宜選択することにより、上述した長さを有するポリヌクレオチドを増幅することができる。
【００４４】
上記ポリヌクレオチドを用いてＤＮＡマーカーの塩基種を同定する方法としては、シークエンス解析により塩基配列を解読する方法などが好適に利用可能である。
【００４５】
該ＤＮＡマーカーの同定された塩基種と、Ｈａｒｕｎａ型及びＣｏｐｅｌａｎｄ型の当該ＤＮＡマーカーの塩基種とを比較し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の塩基種と一致する被検大麦種を選抜する。これにより、泡持ちの優れた大麦種の選抜が可能となる。
【００４６】
上述した塩基種の比較は、一つのＤＮＡマーカーについて実施することもできるし、又は二つ以上のＤＮＡマーカーについて実施することもできる。二つ以上のＤＮＡマーカーについて比較を行なった場合は、当該ＤＮＡマーカーのうち少なくとも一つがＣｏｐｅｌａｎｄ型と一致する大麦種を選抜する。この場合も、泡持ちの優れた大麦種を選抜できる。
【００４７】
本発明はまた、（１）上記ＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを、被検大麦種のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅し、（２）該ポリヌクレオチドを制限酵素と反応させ、（３）該ＤＮＡマーカー位置にて前記制限酵素によるポリヌクレオチドの切断が生じるか否かを同定し、（４）同定された遺伝子型がＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致する大麦種を泡持ちの優れる大麦種として選抜する方法を提供する。
【００４８】
上記ＤＮＡマーカーの遺伝子型によっては、Ｈａｒｕｎａ型又はＣｏｐｅｌａｎｄ型のいずれかのみにおいて、該ＤＮＡマーカー位置に制限酵素が認識できる塩基配列が形成されうる。この場合においては、ＰＣＲ法により該ＤＮＡマーカーを含むポリヌクレオチドを増幅した後、当該制限酵素により切断が生じるか否かで遺伝子型を同定できる。
【００４９】
被検大麦種からのゲノムＤＮＡの抽出方法、及びゲノムＤＮＡを抽出する部位については上述した通りである。
【００５０】
ＰＣＲ法により上記ＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを増幅する工程において、ＰＣＲ用プライマーの設計は上述した通りである。該プライマーにより増幅されるポリヌクレオチドの長さとしては、特に限定はないが、後の工程で制限酵素切断断片をフラグメントのサイズで検出することを考慮すれば、上限値を５０００ｂｐとするのが好ましく、より好ましくは３０００ｂｐであり、さらに好ましくは２０００ｂｐである。同様に下限値は、２００ｂｐが好ましく、より好ましくは３００ｂｐであり、さらに好ましくは５００ｂｐである。ＰＣＲ法に用いるポリメラーゼの種類を当業者に良く知られたものの中から適宜選択することにより、上述した長さを有するポリヌクレオチドを増幅することができる。
【００５１】
制限酵素による反応は、公知の至適緩衝液、至適反応温度により実施することができる。また、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片サイズを検出する工程も、当業者に常用される方法で実施することができる。
【００５２】
アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡ断片サイズの検出の結果、ＤＮＡ断片の数、ＤＮＡ断片のサイズから、当該ＤＮＡマーカー位置にて制限酵素による切断が生じたか否かを判定できる。これを遺伝子型とし、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致する被検大麦種を選抜すればよい。
【００５３】
本発明はまた、上記選抜方法によって選抜された大麦種の交配後代系統に由来する大麦種を提供する。
【００５４】
上記選抜方法によって選抜された大麦種は、ゲノムＤＮＡの塩基配列がＣｏｐｅｌａｎｄ型と一致しており、該大麦種間で交配した場合、後代系統の大麦種もほぼ確実にＣｏｐｅｌａｎｄ型となり、プロテインＺ４含量が高い。したがって、泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種として有用である。
【００５５】
本発明はまた、仕込工程及び発酵工程を少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、前記仕込工程で使用される大麦種が、本発明の選抜方法によって選抜された大麦種又は本発明の選抜方法によって選抜された大麦種の交配後代系統に由来する大麦種である、麦芽発酵飲料の製造方法を提供する。
本発明はまた、上記製造方法で得ることのできる麦芽発酵飲料を提供する。
【００５６】
本発明により選抜された大麦種又は本発明の選抜方法によって選抜された大麦種の交配後代系統に由来する大麦種を製麦することにより麦芽を得ることができる。製麦の方法としては特に制限されず公知の方法で行えば良い。具体的には、例えば、浸麦度が４０％〜４５％に達するまで浸麦後、１０〜２０℃で３〜６日間発芽させ、焙燥して麦芽を得ることができる。
【００５７】
上記仕込工程は、麦芽や大麦を含む原料と仕込用水とを混合し、得られた混合物を加温することにより麦芽や大麦を糖化させ、前記糖化された麦芽や大麦から麦汁を採取する工程である。この仕込工程には、本発明により選抜された大麦種又は本発明の選抜方法によって選抜された大麦種の交配後代系統に由来する大麦種から得られた麦芽のみならず、本発明により選抜された大麦種又は本発明の選抜方法によって選抜された大麦種の交配後代系統に由来する大麦種そのものも使用することができる。また、さらに原料として、上記麦芽や大麦以外に、コーンスターチ、コーングリッツ、米、糖類等の副原料を添加しても良い。
【００５８】
上記発酵工程は、前記麦汁にホップを添加し、煮沸、冷却した冷麦汁に酵母を添加して発酵させ麦芽発酵飲料（中間）品を得る工程である。ここで用いられる酵母は、例えば、サッカロミセス・セレビシェ、サッカロミセス・ウバルム等が挙げられる。
【００５９】
麦芽発酵飲料は、その製造に用いられる麦芽の使用比率の多少は特に制限されず、麦芽を原料の一部として発酵により製造される飲料であればよい。具体的には例えば、ビールや発泡酒が挙げられる。また、いわゆるノンアルコールビールやノンアルコール発泡酒も、ビール等と同様の製法を用いることから、麦芽発酵飲料である。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００６１】
（予備試験；ビール中のプロテインＺ４含有量とＮＩＢＥＭ値の関係）
４００Ｌパイロットプラントで１１品種（はるな二条、あまぎ二条、ミカモゴールデン、新田二条２３号、りょうふう、りょううん、北育４１号、ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、ＣＤＣ Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ）の麦芽それぞれから醸造された試験ビール合計４２点をサンプルとして用いた。
【００６２】
［試験ビール中のプロテインＺ４濃度の測定］
ビール中のプロテインＺ４濃度の測定はサンドイッチＥＬＩＳＡ法で行った。精製した大麦プロテインＺ４を抗原としたウサギ抗プロテインＺ４抗体を一次抗体に、またペルオキシダーゼ標識抗プロテインＺ４−Ｆａｂ’を二次抗体とした。一次抗体１００μＬを９６穴プレートにアプライし４℃で一晩放置した。カゼイン溶液でブロッキングした後、適宜希釈したビールサンプル１００μＬをそれぞれ添加し室温で２時間反応後、ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０， ｐＨ７．５）で３回洗浄した。その後、二次抗体を添加し、２時間反応後、ＴＢＳで３回洗浄した。検出はＰＯＤ発色キット（住友ベークライト社）にて発色させた後、４９２ｎｍの吸光度を測定した。既知の濃度の精製した大麦プロテインＺ４標準液の吸光度で検量線を作成し、これに対するサンプルの吸光度でサンプルのプロテインＺ４濃度を算出した。大麦プロテインＺ４標準液としては、大麦からプロテインＺ４を精製し、凍結乾燥後秤量し、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に溶解させたものを用いた。
【００６３】
［試験ビールのＮＩＢＥＭ値の測定］
ＮＩＢＥＭ値の測定は、ＨＡＦＦＭＡＮＳ社のＮＩＢＥＭ−Ｔ装置、ＩＮＰＡＣＫ２０００及びＮＩＢＥＭ値測定用の標準グラスを用いて行った。具体的には、上記の試験ビールをそれぞれ２０℃の状態にし、泡注ぎ出し機により炭酸ガスを用いて標準グラスに注ぎ出し、生じた泡の高さの降下をＮＩＢＥＭ−Ｔ装置で追尾することにより測定した。
【００６４】
［プロテインＺ４濃度とＮＩＢＥＭ値の関係］
プロテインＺ４濃度とＮＩＢＥＭ値の間には有意な相関関係があった（図１）。一方、製麦工程中に蛋白質がどの程度分解されたかを示す指標の一つであるコールバッハ値（ＫＩ）及び、苦味の程度を表す指標で、ホップ中のイソα酸が関与しているとされるＢＵは泡持ちと深い関係があるとされている（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，６０巻，４７−５７頁，２００２年）。本解析に用いたサンプルはサンプル数が４２、用いた麦芽品種が１１、また表１のように麦芽ＫＩやビールＢＵのばらつきも大きい。このようにＫＩやＢＵのばらつきの大きい母集団でプロテインＺ４とＮＩＢＥＭ値が有意な相関関係を示したことから、プロテインＺ４はＮＩＢＥＭ値の有効なマーカーになることが示された。
【００６５】
【表１】
【００６６】
（実施例１；ＤＮＡマーカーの特定）
［塩基配列解析］
大麦はるな二条種、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ種及びＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ種の葉から、以下の方法でゲノムＤＮＡを抽出した。葉に抽出バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）とジルコニアボールを添加し、振とうした後、６０℃で３０分間保持した。遠心分離後の上清に等量のイソプロパノールを添加しＤＮＡを析出させ、遠心分離後、沈殿に７０％エタノールを添加し再び遠心分離した。生じたＤＮＡの沈殿を滅菌水に溶解させたものをＰＣＲの鋳型に用いた。ＮＣＢＩのデータベースよりプロテインＺ４の塩基配列情報を入手し、遺伝領域、及び翻訳開始位置より上流域を含むようにセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを設計し、タカラバイオ社のＰｒｅｍｉｘ Ｔａｑ（Ｅｘ Ｔａｑ Ｖｅｒｓｉｏｎ）を用いてＰＣＲ反応を行いＤＮＡ断片を増幅した。なお、ＰＣＲ反応は、センスプライマー１とアンチセンスプライマー１の組み合わせ、および、センスプライマー２とアンチセンスプライマー２の組み合わせ、により標的配列を２断片に分けて増幅した。増幅産物のサイズはそれぞれ約２．０及び１．７ｋｂｐである。プライマーの配列は以下の通りである。
センスプライマー１（配列番号４）；
５’−ＧＧＡＧＴＡＴＡＴＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＧ−３’
アンチセンスプライマー１（配列番号５）；
５’−ＣＣＣＴＴＣＧＣＧＴＡＡＧＧＡＡＧＣＴＴ−３’
センスプライマー２（配列番号６）；
５’−ＧＧＴＧＧＴＧＣＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＣＧＣ−３’
アンチセンスプライマー２（配列番号７）；
５’−ＣＴＴＴＧＡＡＡＣＣＧＣＧＧＴＣＴＧＴＡＣ−３’
【００６７】
増幅産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、目的サイズのＤＮＡ断片をゲルごと切り取りＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔでＤＮＡ断片を精製した。このＤＮＡ断片のシークエンスを決定した。シークエンス解析はＳｉｇｍａ社への委託解析により行った。決定した大麦はるな二条種、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ種及びＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ種の塩基配列をそれぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３とした。
【００６８】
［塩基配列のアラインメント解析］
配列番号１、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を用い、ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．８（ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）により塩基配列のアラインメント解析を行なった。図２に示すように、プロテインＺ４遺伝子の開始コドンより上流３１８ｂｐの位置からプロテインＺ４遺伝子終止コドンの位置までの１８５３ｂｐ長の領域において、７ヶ所（９塩基）を塩基配列が一致しない塩基部位として特定した。
【００６９】
上記塩基部位７ヶ所は、それぞれ配列番号１で特定される塩基配列の第１２番目、第１４番目、第４６番目、第２４０番目、第２８６−２８８番目、第８６６番目及び第９５２番目の塩基に相当する塩基部位であった。これらをそれぞれＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６及びＭ７と名づけた。
【００７０】
（実施例２；ＤＮＡマーカーＭ３を用いた既往大麦種の選抜効果の検証）
大麦ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、りょううん、りょうふう、北育４１号、はるな二条、Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｆｌａｇｓｈｉｐ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｇａｉｒｄｎｅｒ、Ｂａｒｋｅ、Ｂｒａｅｍｅｒ、Ｓｃａｒｌｅｔｔの１６品種を解析対象とし、上述したＤＮＡマーカーＭ３を用いて遺伝子型を同定し、同定した遺伝子型に基づいてプロテインＺ４含有量の高い大麦種を選抜できるか検証した。
【００７１】
［ＤＮＡマーカーＭ３の遺伝子型の同定］
前記１６品種からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、前記ＤＮＡマーカーＭ３を含む、約２０００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を得た。プライマーは配列番号４及び配列番号５に記載されたものを用いた。
【００７２】
得られたＰＣＲ産物に制限酵素ＡｃｃＩ（タカラバイオ株式会社）を添加し、３７℃で、一晩反応を行った。反応産物を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色により電気泳動パターンを視覚化した（図３）。
図３のアガロースゲル電気泳動結果図では、各レーンには、左から右に向けて、ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ，ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ，Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ，りょうふう，りょううん，北育４１号，はるな二条，Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ，Ｓｃｈｏｏｎｅｒ，Ｆｌａｇｓｈｉｐ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｇａｉｒｄｎｅｒ，Ｂａｒｋｅ，Ｂｒａｅｍｅｒ，Ｓｃａｒｌｅｔｔ大麦種に由来するサンプルがロードされている。
ＤＮＡマーカーＭ３は、制限酵素ＡｃｃＩの認識サイト（ＧＴＡＧＡＣ）内に存在し、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄはこの領域の塩基配列が「ＡＴＡＧＡＣ」のため、ＡｃｃＩで切断されないが、はるな二条は「ＧＴＡＧＡＣ」のためＡｃｃＩで切断され、約１２００ｂｐと８００ｂｐのＤＮＡ断片が生じる。解析の結果、１６種のうち、８種がはるな二条と同一のパターン、８種がＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄと同一の電気泳動パターンを示した。これらをＨａｒｕｎａ型及びＣｏｐｅｌａｎｄ型と分類した。
【００７３】
［ＥＬＩＳＡによるプロテインＺ４含有量の定量］
前記１６種の大麦種子中のプロテインＺ４をＥＬＩＳＡ法により定量した。ＥＬＩＳＡは、精製した大麦プロテインＺ４を抗原としたウサギ抗プロテインＺ４抗体を用いた以下の直接吸着法で行った。ミルで粉砕した大麦種子５０ｍｇを２ｍＬスクリューキャップ付きチューブにとり、０．２８％ＤＴＴ（和光純薬工業）を含むＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）１ｍＬを添加し、一晩振とうした。この液の遠心上清を大麦種子タンパク質抽出液とした。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量した後、適宜希釈した大麦種子タンパク質抽出液１００μＬをそれぞれ４反復９６穴プレートにアプライし、４℃で一晩放置した。カゼイン溶液でブロッキングした後、プロテインＡカラムで精製した抗プロテインＺ４抗体をアプライし、室温で２時間反応後、ＴＢＳで３回洗浄した。その後、１０００倍希釈した二次抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−ＡＰ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を添加し、室温で２時間反応後、ＴＢＳで３回洗浄した。発色は１ｍｇ／ｍＬ ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物（１０％ジエタノールアミン）（和光純薬工業）溶液１５０μＬを入れ行い、適度な発色が見られた段階で３Ｎ ＮａＯＨを５０μＬ添加し反応を停止後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。既知の濃度の精製した大麦プロテインＺ４標準液の吸光度で検量線を作成し、これに対するサンプルの吸光度でサンプルのプロテインＺ４濃度を算出した。大麦プロテインＺ４標準液としては、大麦からプロテインＺ４を精製し、凍結乾燥後秤量し、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に溶解させたものを用いた。
【００７４】
［Ｈａｒｕｎａ型およびＣｏｐｅｌａｎｄ型のプロテインＺ４含有量の比較］
ＤＮＡマーカーＭ３の遺伝子型によりグループ分けしたＣｏｐｅｌａｎｄ型とＨａｒｕｎａ型、それぞれのプロテインＺ４含量の平均値を算出し、比較した（図４）。その結果、
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型；２３．５±４．３７ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
Ｈａｒｕｎａ型；１６．５±２．８３ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
であった。ｔ検定により検定したところ、危険率１％で有意にＣｏｐｅｌａｎｄ型の方がＨａｒｕｎａ型と比較してプロテインＺ４含有量が高かった。
【００７５】
（実施例３；ＤＮＡマーカーＭ３を用いた倍化半数体系統の大麦種の選抜効果の検証）
別の母集団で本マーカーの効果を検証するため大麦ミカモゴールデン−Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの倍化半数体系統について、実施例２と同様の手順によって、プロテインＺ４含量の定量及びＤＮＡマーカーＭ３の遺伝子型を同定した。同定した遺伝子型に従ってＣｏｐｅｌａｎｄ型とＨａｒｕｎａ型に分類し、それぞれのプロテインＺ４含量の平均値を算出し、比較した（図５）。
【００７６】
その結果、
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型；２９．４±１９．８５ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
Ｈａｒｕｎａ型；１１．６±４．６４ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
であり、ｔ検定により検定したところ、危険率１％で有意にＣｏｐｅｌａｎｄ型の方がＨａｒｕｎａ型よりもプロテインＺ４含量が高かった。以上、実施例２及び実施例３の結果より、本ＤＮＡマーカーＭ３はプロテインＺ４含有量の高い大麦種を選抜するためのＤＮＡマーカーとして有効に利用できることが示された。
【００７７】
（実施例４；ＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６及びＭ７を用いた既往大麦種の選抜効果の検証）
ビール醸造用大麦として使用されている主要１４品種について、その他のＤＮＡマーカーの有効性を評価した。検証に用いた１４品種は、はるな二条、りょうふう、りょううん、北育４１号、Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｆｌａｎｋｌｉｎ、Ｂａｒｋｅ、ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｆｌａｇｓｈｉｐ、Ｇａｉｒｄｎｅｒである。
【００７８】
［塩基配列の解析］
実施例１と同様の方法により、上記１４品種からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、上記ＤＮＡマーカーＭ１〜Ｍ７をすべて含むＤＮＡ断片を増幅し、シークエンス解析により前記ＤＮＡマーカーの塩基種を同定した。
【００７９】
［塩基配列の比較］
１４品種の各ＤＮＡマーカーの遺伝子型と、Ｈａｒｕｎａ型及びＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型とを比較した。その結果、ＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６及びＭ７の遺伝子型により、はるな二条、りょうふう、りょううん、北育４１号、Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｆｌａｎｋｌｉｎ、Ｂａｒｋｅの８品種がＨａｒｕｎａ型に分類され、ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｆｌａｇｓｈｉｐ、Ｇａｉｒｄｎｅｒの６品種がＣｏｐｅｌａｎｄ型に分類された（表２）。
【００８０】
【表２】
【００８１】
［ＥＬＩＳＡによるプロテインＺ４含有量の定量］
実施例２に記載したのと同様の方法により、１４品種の種子中のプロテインＺ４含有量を定量した。
【００８２】
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型とＨａｒｕｎａ型、それぞれのプロテインＺ４含量の平均値を算出し、比較した（図６）。その結果、
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型；２５．２±３．５７ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
Ｈａｒｕｎａ型；１６．５±２．８３ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
であり、ｔ検定により検定したところ、危険率１％で有意にＣｏｐｅｌａｎｄ型の方がＨａｒｕｎａ型よりもプロテインＺ４含有量が高かった。以上の結果から、本ＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６及びＭ７はプロテインＺ４含有量の高い大麦種を選抜するためのＤＮＡマーカーとして有効に利用できることが示された。
【００８３】
また、以上の結果より、本実施例に記載されていない大麦プロテインＺ４遺伝子近傍において、Ｈａｒｕｎａ型及びＣｏｐｅｌａｎｄ型の塩基配列のアラインメント解析を行なった場合に、本ＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６及びＭ７と同様に特定されうるＤＮＡマーカーについても、泡持ちの優れる大麦種を選抜するＤＮＡマーカーとして有効に利用できることは当業者にとって自明なことである。
【００８４】
（実施例５；ＤＮＡマーカーＭ５を用いた既往大麦種の選抜効果の検証）
ビール醸造用大麦として使用されている主要１４品種について、その他のＤＮＡマーカーの有効性を評価した。検証に用いた１４品種は、はるな二条、りょうふう、りょううん、北育４１号、Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｆｌａｎｋｌｉｎ、Ｂａｒｋｅ、ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｆｌａｇｓｈｉｐ、Ｇａｉｒｄｎｅｒである。
【００８５】
［塩基配列の解析］
実施例４と同様に、上記１４品種からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、上記ＤＮＡマーカーＭ１〜Ｍ７をすべて含むＤＮＡ断片を増幅し、シークエンス解析により前記ＤＮＡマーカーの塩基種を同定した。
【００８６】
［塩基配列の比較］
１４品種の各ＤＮＡマーカーの遺伝子型と、Ｈａｒｕｎａ型及びＣｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型とを比較した。その結果、ＤＮＡマーカーＭ５の遺伝子型により、はるな二条、りょうふう、りょううん、北育４１号、Ｌｏｆｔｙ Ｎｉｊｏ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｆｌａｎｋｌｉｎ、Ｂａｒｋｅ、ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌの９品種がＨａｒｕｎａ型に分類され、ＡＣ Ｍｅｔｃａｌｆｅ、ＣＤＣ Ｃｏｐｅｌａｎｄ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｆｌａｇｓｈｉｐ、Ｇａｉｒｄｎｅｒの５品種がＣｏｐｅｌａｎｄ型に分類された（表２）。
【００８７】
［ＥＬＩＳＡによるプロテインＺ４含有量の定量］
実施例２に記載したのと同様の方法により、１４品種の種子中のプロテインＺ４含有量を定量した。
【００８８】
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型とＨａｒｕｎａ型、それぞれのプロテインＺ４含量の平均値を算出し、比較した（図７）。その結果、
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型；２４．９±３．９４ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
Ｈａｒｕｎａ型；１７．６±４．１９ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
であり、ｔ検定により検定したところ、危険率１％で有意にＣｏｐｅｌａｎｄ型の方がＨａｒｕｎａ型よりもプロテインＺ４含有量が高かった。以上の結果より、本ＤＮＡマーカーＭ５はプロテインＺ４含有量の高い大麦種を選抜するためのＤＮＡマーカーとして有効に利用できることが示された。
【００８９】
実施例４において、ＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６及びＭ７によって遺伝子型を同定し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致する大麦種を選抜した結果、６品種が選抜された。一方、実施例５において、ＤＮＡマーカーＭ５の遺伝子型を同定し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型と一致する大麦種を選抜した結果、前記６品種のうちＫｅｎｄａｌｌ種が選抜されなかった。本実施例からは、ＤＮＡマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６及びＭ７によってＣｏｐｅｌａｎｄ型に選別された大麦６品種のうち５品種で遺伝子型が一致するＤＮＡマーカーＭ５によっても、プロテインＺ４含有量の高い品種の選抜ができることが示された。
【００９０】
（参考例；ＲＦＬＰマーカーＭＷＧ２０３３Ｄｒａによる既往大麦種の選抜）
プロテインＺ４遺伝子周辺領域において、本発明におけるＤＮＡマーカーとして利用可能なＤＮＡマーカーが存在する範囲を検証した。
【００９１】
図８は、ＲＦＬＰマーカーに基づいて作成された、大麦ゲノム４Ｈ染色体のマーカー地図を示したものである。ＲＦＬＰマーカーＢａｍｙＸｂａの位置を基点として、プロテインＺ４遺伝子は７７．６ｃＭの位置にある。本参考例では、９９．２ｃＭの位置にあるＲＦＬＰマーカーＭＷＧ２０３３Ｄｒａを利用して、大麦ミカモゴールデン−Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの倍化半数体系統を分類し、Ｈａｒｕｎａ型とＣｏｐｅｌａｎｄ型のプロテインＺ４含有量を比較した。なお、ミカモゴールデン種は、遺伝子型の判定の結果、ＤＮＡマーカーＭ１〜Ｍ７のすべてで、Ｈａｒｕｎａ型に分類された（データ示さず）。
【００９２】
［遺伝子型の判別］
大麦ミカモゴールデン−Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの倍化半数体系統の葉を試料として、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ，Ｍ．Ｇ． ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，１９８０年，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８巻，４３２１−４３２５頁）によって、ゲノムＤＮＡを抽出した。各ゲノムＤＮＡ５μｇに制限酵素ＤｒａＩ（タカラバイオ株式会社）を添加し、３７℃で、一晩反応を行った。反応産物を０．７％アガロースゲル電気泳動により分離し、アルカリトランスファー法（Ｒｅｅｄ，Ｋ．Ｃ． ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｍａｎｎ，１９８５年，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３巻，７２０７−７２２１頁）により、ナイロンメンブレンに転写した。ｐ-ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたプローブとなるＤＮＡ断片をＭ１３プライマーで、ＰＣＲ法により増幅した後、ＤＩＧ−ｈｉｇｈ ｐｒｉｍｅキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用い、ＰＣＲ産物を鋳型としてラベル化反応を行い、ＤＩＧラベル化プローブを得た。ハイブリダイゼーションおよびシグナルの検出は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＤＩＧ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅに従って実施した。
【００９３】
［遺伝子型の分類］
検出されたバンドパターンに基づいて大麦種を２種に分類し、ミカモゴールデン種が分類された大麦種群をＨａｒｕｎａ型と、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ種が分類された大麦種群をＣｏｐｅｌａｎｄ型とした。
【００９４】
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型とＨａｒｕｎａ型、それぞれのプロテインＺ４含量の平均値を算出し、比較した（図９）。その結果、
Ｃｏｐｅｌａｎｄ型；２７．１±２０．００ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
Ｈａｒｕｎａ型；１９．２± １５．６５ｎｇ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、
であり、ｔ検定により検定したところ、危険率５％で有意にＣｏｐｅｌａｎｄ型の方がＨａｒｕｎａ型よりもプロテインＺ４含有量が高かった。
【００９５】
参考例及び実施例２〜５における、プロテインＺ４含量の平均値及びばらつきを比較すると、ＤＮＡマーカーとプロテインＺ４遺伝子との距離が離れるほど、大麦種の選抜精度は低下する傾向がみられる。しかしながら、本参考例において、ＲＦＬＰマーカーＭＷＧ２０３３Ｄｒａは、プロテインＺ４遺伝子から２１．６ｃＭ距離が離れているものの、本発明のＤＮＡマーカーとして利用可能なことが示された。したがって、プロテインＺ４遺伝子からの距離がこの範囲内であれば、本発明におけるＤＮＡマーカーとして好適に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列番号４〜７；合成プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種を選抜する選抜方法であって、
被検大麦種について、
（ａ）Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列と、（ｂ）Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列とのアラインメントにより特定されるＤＮＡマーカーの少なくとも一つについて遺伝子型を同定し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型に一致する被検大麦種を、泡持ちの優れる大麦種として選抜する選抜方法。
【請求項２】
前記（ａ）及び（ｂ）の塩基配列が、それぞれ配列番号１及び配列番号２で特定される塩基配列である、請求項１に記載の選抜方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡマーカーが、配列番号１で特定される塩基配列の第１２番目、第１４番目、第４６番目、第２４０番目、第２８６−２８８番目、第８６６番目又は第９５２番目の塩基に相当する塩基部位である、請求項１又は２に記載の選抜方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡマーカーが、配列番号１で特定される塩基配列の第４６番目の塩基に相当する塩基部位である、請求項１又は２に記載の選抜方法。
【請求項５】
前記遺伝子型の同定が、
前記ＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを、被検大麦種のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅し、
該ポリヌクレオチドを用いて、該ＤＮＡマーカーのうち少なくとも一つについて塩基種を同定するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の選抜方法。
【請求項６】
前記遺伝子型の同定が、
前記ＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを、被検大麦種のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅し、
該ポリヌクレオチドを制限酵素と反応させ、
該ＤＮＡマーカー位置にて前記制限酵素によるポリヌクレオチドの切断が生じるか否かで同定するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の選抜方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の選抜方法によって選抜された大麦種の交配後代系統に由来する大麦種。
【請求項８】
仕込工程及び発酵工程を少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、
前記仕込工程で使用される大麦種が、請求項１〜６のいずれか一項に記載された選抜方法により選抜された大麦種又は請求項７に記載された大麦種である、製造方法。
【請求項９】
請求項８記載の製造方法で得ることのできる麦芽発酵飲料。
【請求項１】
泡持ちの優れる麦芽発酵飲料用の大麦種を選抜する選抜方法であって、
被検大麦種について、
（ａ）Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列と、（ｂ）Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の大麦プロテインＺ４遺伝子座周辺領域の塩基配列とのアラインメントにより特定されるＤＮＡマーカーの少なくとも一つについて遺伝子型を同定し、Ｃｏｐｅｌａｎｄ型の遺伝子型に一致する被検大麦種を、泡持ちの優れる大麦種として選抜する選抜方法。
【請求項２】
前記（ａ）及び（ｂ）の塩基配列が、それぞれ配列番号１及び配列番号２で特定される塩基配列である、請求項１に記載の選抜方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡマーカーが、配列番号１で特定される塩基配列の第１２番目、第１４番目、第４６番目、第２４０番目、第２８６−２８８番目、第８６６番目又は第９５２番目の塩基に相当する塩基部位である、請求項１又は２に記載の選抜方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡマーカーが、配列番号１で特定される塩基配列の第４６番目の塩基に相当する塩基部位である、請求項１又は２に記載の選抜方法。
【請求項５】
前記遺伝子型の同定が、
前記ＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを、被検大麦種のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅し、
該ポリヌクレオチドを用いて、該ＤＮＡマーカーのうち少なくとも一つについて塩基種を同定するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の選抜方法。
【請求項６】
前記遺伝子型の同定が、
前記ＤＮＡマーカーを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを、被検大麦種のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅し、
該ポリヌクレオチドを制限酵素と反応させ、
該ＤＮＡマーカー位置にて前記制限酵素によるポリヌクレオチドの切断が生じるか否かで同定するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の選抜方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の選抜方法によって選抜された大麦種の交配後代系統に由来する大麦種。
【請求項８】
仕込工程及び発酵工程を少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、
前記仕込工程で使用される大麦種が、請求項１〜６のいずれか一項に記載された選抜方法により選抜された大麦種又は請求項７に記載された大麦種である、製造方法。
【請求項９】
請求項８記載の製造方法で得ることのできる麦芽発酵飲料。
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−２７９２６０（Ｐ２０１０−２７９２６０Ａ）
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１３３０８４（Ｐ２００９−１３３０８４）
【出願日】平成２１年６月２日（２００９．６．２）
【出願人】（３０３０４０１８３）サッポロビール株式会社 (150)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２日（２００９．６．２）
【出願人】（３０３０４０１８３）サッポロビール株式会社 (150)
【Ｆターム（参考）】
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