１以上の血漿誘導体を含む、品質保証された薬物
【課題】本発明は、１以上の血漿誘導体を活性物質または不活性成分として含む薬物を記載し、ここで、出発原料、または該血漿誘導体の製造時に生ずる中間体は、１つまたはそれ以上の複製可能な血液原ウイルスにより汚染されていないか、または規定された限界値を越えないウイルス負荷を有する。
【解決手段】最終血漿誘導体を製造するための、このようにして品質の確かめられた出発原料または中間体を、少なくとも１つのさらなる実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかける。本発明はさらに、この薬物を製造するための方法、さらにはまた、品質保証された出発原料または中間体を製造するための方法を記載する。
【解決手段】最終血漿誘導体を製造するための、このようにして品質の確かめられた出発原料または中間体を、少なくとも１つのさらなる実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかける。本発明はさらに、この薬物を製造するための方法、さらにはまた、品質保証された出発原料または中間体を製造するための方法を記載する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１以上の血漿誘導体を活性物質または不活性成分として含む薬物に関し、またそのような薬物の製造のための品質保証された出発原料に関し、さらにはまた、これらの薬物を製造するための方法に関する。本発明はまた、品質保証された出発原料、特に品質保証された血漿プールの製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血漿は、特に先天的または後天的な血漿成分の欠乏の場合における代替療法に対する、医薬品製剤として、または血漿誘導体の製造のための出発原料として特に優れた臨床的重要性を有するものである。しかし、ヒト血漿を使用する場合、医薬品製剤によって、または血漿誘導体によって運搬され得る、感染物質が含まれていないことに注意しなければならない。恐らく血中に存在し得るであろう感染物質には、とりわけ、ＨＩウイルスまたは肝炎ウイルス(Ａ型、Ｂ型、Ｃ型または非Ａ非Ｂ型肝炎)といったような、血液によって運搬され得るウイルス(血液原ウイルス)が含まれるが、血液により伝達され得るパルボウイルスもまた含まれる。
【０００３】
血漿誘導体を含む薬物が非常に必要であることから、これらの薬物の経済的な製造は、工業規模でのみ可能である。
【０００４】
血漿をドナーから得て、医薬品製剤の製造のためにプールする。従来のプールサイズは、約２,０００〜６,０００個の献血漿(plasma donations)である。たった１つの、ウイルスで汚染された献血漿により、血漿プール全体が汚染される危険がある。
【０００５】
２０世紀前半の後期という早い時期に、ヒトアルブミンが加熱により首尾よくウイルス不含有製剤とされた。このことは最初、それらの熱感度から、血漿から得ることができる他の薬物全てに対して不可能であった。今までのところ、適切に製造されたアルブミンが何百万という場合において使用されている；それにもかかわらず、ヒト血液が有するウイルスが原因となる感染はいまだかつてなかった。対照的に、ウイルス感染、特に肝炎ウイルスによるウイルス感染、また１９８０年代以来、ＡＩＤＳウイルスによる大規模なウイルス感染もまた、血漿から製造された多くの他の薬物に関して報告されている。
【０００６】
１９８０年ごろ、ウイルス汚染物質を不活性化する目的で、適切に安定化された第VIII因子濃縮物に対して加熱処理が初めて行われた。しかし、最初に、第VIII因子活性の多大な損失が認めざるを得ず、実際の不活性化の可能性は未知のままであった。
【０００７】
加熱処理方法を改良することにより、また他の新たな不活性化方法によって、最終的には、血漿から薬物を製造することが可能となり、これは大抵の場合、レシピエントにおけるウイルス感染をもたらさなかった。この開発に付随して、ウイルス血症の疑いがあり、従って、血漿がウイルスを含む疑いのあるドナーおよび献物(donations)を排除することを目的とした、ドナーおよび献物の選択における改良もまたあった。
【０００８】
今しばらくの間、陽性の結果を与える献物を排除しようと、また血液製剤の製造のための出発原料として使用すべき、より大きな血漿プールに、それらを取り入れまいと、血中の幾つかのウイルス抗原または抗体の検出が利用されている。疾患の症状またはあらゆる検査での異常検査結果を有していないが、それにもかかわらず、彼らの血中には幾つかのウイルスが長期間にわたり高濃度でも匿われている個々のドナーの場合、ある特定のウイルスによる、そのようなウイルス血症の発生は現在、増幅方法の助けをもって、はっきりと検出することができる。
【０００９】
血漿ユニットをプールした後、ウイルスで汚染された、たった１つの献血漿は、当然ながら希釈される；しかし、増幅反応の助けによるウイルスゲノム配列の検出は非常に鋭敏なので、そのような希釈物中においてすら、ウイルスゲノムまたはそれらの配列をはっきりと検出することができる；また上述のように、それらが一定の検出限界以下に落ち込むなら、感染の可能性という意味では、それらには、もはや臨床的関連はない。
Ｔhe ＥＥＣ Ｒegulatory Ｄocument Ｎote for Ｇuidance，Ｇuidelines for Ｍedicinal Ｐroducts Ｄerived from Ｈuman Ｂlood and Ｐlasma(Ｂiologicals １９９２、２０：１５９−１６４)は、血漿ドナーおよび献血漿を調べるための品質保証システムを提唱している。従って、各々の献血漿を、Ｂ型肝炎抗原またはＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２抗体といったようなウイルスマーカーの不在に関する確認試験で分析しなければならないが、これは、これらが血漿ドナーの対応するウイルス感染を示すからである。Ｃ型肝炎の感染を排除するための試験もまた行うべきである。
【００１０】
欧州薬局方に従って、Ｂ型肝炎表面抗原およびＣ型肝炎ウイルスおよびＨＩＶ抗体を測定するために、特別な試験を各々の献物に対して行うべきである(欧州薬局方、第２版、第II部、１９９４年、８５３〜８５４頁)。
【００１１】
１９９５年３月１４日付のＦＤＡガイドラインは、付加的安全因子としての最終産物(免疫グロブリン産物)のＰＣＲ試験を提供している。
【００１２】
提唱された試験にもかかわらず、これらのウイルスマーカーを単に調べるだけでは、個々の献血漿の安全性は十分に保証されないことがＥＥＣガイドラインにおいて力説されている。血漿試料中での該マーカーの不在が確認されたとしても、ドナーのウイルス血症を排除することはできない。ウイルス抗原および対応する抗体は、感染後すぐには検出することができないので、ウイルス感染の最初のマーカーは、感染源と接触してから数週間または数カ月後にしか発生しないことが多い。感染後および抗体発生前の、この重要な期間は、通例、「ウィンドウ期間(window period)」と呼ばれている。しかし、感染後、最初のウイルスマーカーを検出することができる時間ポイントは、ウイルスによって様々である。
【００１３】
さらに、血漿から製造される幾つかの薬物に関して、ウイルスを製造過程の途中で消失させる、または不活性化すること、またそのような製品自体が非常にウイルスに関して安全であることもまた知られるに至っている。
【００１４】
血漿誘導体のウイルス不活性化は、工業的規模で非常に上手く行われているが、それにもかかわらず、ＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルスといったような血液原ウイルスが稀に伝達されていることから、製造業者は、一定の製造方法を利用しているにもかかわらず、ウイルスで汚染された製品のバッチが幾つか生じたと仮定しなければならなかった(Ｌancet ３４０、３０５〜３０６（１９９２）；ＭＭＷＲ ４３（２８）、５０５〜５０９（１９９４）、Ｔhromb.Ｈaemost. ６８、７８１（１９９２）)。このことは恐らく、幾つかの出発バッチの過度の汚染から起こった。血漿を回収する間に、ウイルスで汚染された献血漿を排除するのには、間接法が利用できるだけであることから、出発原料は非常にひどく汚染されているので、他の上手く利用されるウイルス不活性化およびウイルス消失方法が、もはやウイルスに関して安全な最終産物を製造するには十分でないということが起こり得る。
【００１５】
ＨＩＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶに関するヒト感染用量は知られておらず、また今のところ測定することはできない。従って、組織培養における感染用量(ＴＣＩＤ５０：組織培養感染用量)または動物モデルにおける感染用量(ＣＩＤ５０：チンパンジー感染用量)の測定では、概算のヒト感染用量しか得られない。さらに、幾つかの場合、人々は、それらにさらされているにもかかわらず、ＨＩＶ、ＨＣＶまたはＨＢＶで感染されない。従って、そのようなウイルスのヒト感染用量は、必ずしも感染するとは限らない。
【００１６】
Ｐiatakら(Ｓcience １９９３、２５９：１７４９−１７５４)は、ＨＩＶのＴＣＩＤ５０が、１ ＴＣＩＤ５０／ＨＩＶ ＲＮＡの１０４コピーであることを測定した。Ｓhimizu,Ｙ.Ｋ.ら(ＰＮＡＳ.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ １９９３、９０：６０３７−６０４１)は、ＨＣＶ株のＣＩＤ５０が、１ ＣＩＤ５０／ＲＮＡの１コピーであることを測定した。
【００１７】
Ｅderら(Ｔhe Ｒole of the Ｃhimpanzee in Ｒesearch、Ｓymp.Ｖienna １９９２、１５６〜１６５)は、ＨＢＶ ＤＮＡの２０コピー／血漿のmlがＣＩＤ５０ １に対応することを示すことができた。
【００１８】
血漿プールまたは他の血漿出発原料の場合、ウイルス負荷(ウイルス汚染)は出来るだけ低く、必要ならば、付加的ウイルス不活性化工程により、またはウイルスを消失させる方法により、ウイルス汚染を少なくとも感染用量以下まで低下させることができるように注意することが特に必要である。出発原料のウイルス汚染は、ウイルス核酸のコピー数が既にチンパンジーの感染用量以下程度であるのが望ましいであろう。
【００１９】
【非特許文献１】Ｔhe ＥＥＣ Ｒegulatory Ｄocument Ｎote for Ｇuidance，Ｇuidelines for Ｍedicinal Ｐroducts Ｄerived from Ｈuman Ｂlood and Ｐlasma(Ｂiologicals １９９２、２０：１５９−１６４
【非特許文献２】Ｐiatakら、Ｓcience １９９３、２５９：１７４９−１７５４
【非特許文献３】Ｓhimizu,Ｙ.Ｋ.ら、ＰＮＡＳ.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ １９９３、９０：６０３７−６０４１
【非特許文献４】Ｅderら、Ｔhe Ｒole of the Ｃhimpanzee in Ｒesearch、Ｓymp.Ｖienna １９９２、１５６〜１６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、幾つかの出発バッチの過度の汚染から起こる、複製可能な血液原ウイルスでのウイルス汚染の危険がもはや全くない、１以上の血漿誘導体を含む薬物を提供することである。
【００２１】
さらに具体的な目的は、ウイルス負荷が指定された最大値を越えてはならない、品質保証された出発原料または中間体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明により、この目的は、出発原料または血漿誘導体の製造中に生ずる中間体がウイルスにより汚染されておらず、または１つまたはそれ以上の複製可能な血液原ウイルスの負荷が規定された限界値を越えていない、１以上の血漿誘導体を活性物質または補助成分として含む薬物により成し遂げられ、
− 幾つかの複製可能な血液原ウイルスのウイルス負荷の不在を、出発原料もしくは中間体中の過剰のウイルス中和抗体により、または献血漿時の血漿ドナーの防御免疫により測定し、
− あるいは、出発原料もしくは中間体中の問題の各々のウイルスのゲノム当量(equivalents)を、核酸の検出または測定のための、定量可能な、制御された、非阻害的方法により測定し、最終血漿誘導体の製造のための、品質保証された出発原料または中間体を、少なくとも１つの実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかけて、得られた品質保証された最終血漿誘導体を既知の方法により後処理して、薬物とする。
【００２３】
該目的の達成は、出発原料中に存在する汚染またはウイルス負荷の程度の測定を含んでなり、このウイルス負荷をもはや、ウイルスを不活性化する、または消失させる方法により排除することができない。従って、出発原料中のウイルス汚染の可能性を測定し、こういった高度の汚染が実在する限り、それらの出発原料をさらに処理しないことにより、すなわち、それらを処理から排除することにより、その問題を解決する。
【００２４】
この目的のために、ウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかけるべきである、各血漿由来の出発原料、およびあるいは血漿誘導体の製造で生ずる中間体を、並びに最終血漿誘導体を、血液血漿から製造された薬物がもはや、時々ですらなくも、複製可能な血液原ウイルスを伝達することができないということを確かな方法で確実なものとする方法で試験して処理すべきである。そのようにする際は、可能なウイルス負荷の上限を測定するために、出発原料を、選択された増幅技術の利用により試験し、血液原ウイルスの伝達を起こさないであろう薬物とするために、この出発原料または中間体をさらに、少なくとも１つの実質的なウイルス不活性化またはウイルス消失工程にかけるであろう。
【００２５】
本発明により、ゲノム当量の測定の間に検出されるべき標的核酸は、血液中、血漿中、血清中、または血漿画分中での様々な増幅方法により増幅することができる。しかし、好ましくは、ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)または特殊型のＰＣＲを、各々、検出または測定方法として使用する。特定のウイルスゲノム配列の検出の場合には、増幅方法が、増幅すべき核酸配列に対して選択的でなければならない。本発明の血漿プール中の核酸の増幅は、文献に記載されている一連の増幅方法により達成することができる。
【００２６】
特定のウイルスゲノム配列の増幅は、それらを複製して、それらを検出可能とするために、個々のゲノム、さらに非常に様々なウイルスのゲノムに関する知識を必要とする。
【００２７】
核酸の様々な増幅方法は、ＰＣＲに基づいている。ＰＣＲ増幅方法は、Ｍullisら(米国特許第４,６８３,１９５号および同第４,６８３,２０２号)に初めて記載された。ウイルスゲノム配列はまた、「ネステッド(nested) ＰＣＲ」(Ｍullisら、Ｍethods Ｅnzymol. １９８７、１５５：３３５−３５０)またはＲＴ−ＰＣＲ(Ｐowell,Ｌ.Ｍ.ら、Ｃell １９８７、５０：８３１−８４０；Ｋawasakiら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ １９８８、８５：５６９８−５７０２)によっても増幅することができる。
【００２８】
ＲＮＡの増幅および検出では、まず最初に、ＲＮＡをＤＮＡに転写しなければならない。この方法は、いわゆるＲＴ−ＰＣＲとして、ＷＯ ９１／０９９４４に記載されており、また逆転写酵素の使用を必要とする。
【００２９】
次いで、伸長工程において、また後のハイブリダイジングまたはその産物のゲル電気泳動による分離において、標識化ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより、その増幅産物を分析することができる。
【００３０】
ＰＣＲに対する他の方法もまた記載されている。
【００３１】
核酸を増幅するための、これらの方法の１つは、欧州特許第０ ３２０ ３０８号、並びに欧州特許第０ ３３６ ７３１号、並びにＷuおよびＷallace(Ｇenomics １９８９、４：５６０〜５９６)による、ＬＣＲ(リガーゼ鎖反応)である。
他の酵素的方法は、欧州特許第０ ３１０ ２２９号、およびＧuatelli,Ｊ.Ｃ.ら(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ １９９０、８７：１８７４〜１８７８)による、ＮＡＳＢＡ(核酸配列に基づく増幅)、３ＳＲ(自己支持配列複製)、または欧州特許第０ ３７３ ９６０号、およびＫwoh,Ｄ.Ｙ.ら(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ １９８９、８６：１１７３〜１１７７)によるＴＡＳ(転写に基づく増幅システム)である。これらの方法では、増幅において、例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼといったような一連の酵素を同時に、または段階的に使用する。
【００３２】
他の増幅方法は、欧州特許第０ ３６１ ９８３号、およびＬizardiら(ＴＩＢＴＥＣＨ １９９１、９：５３〜５８)による、ＲＮＡバクテリオファージ Ｑβのレプリカーゼの使用に基づく。
【００３３】
Ｕrdea,Ｍ.Ｓ.ら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.Ｓymp.Ｓer. ２４ Ｏxford １９９１、Ｐachl,Ｃ.Ａ.ら、XXXII Ｉnterscience Ｃonference on Ａntimicrobial Ａgents and Ｃhemotherapy．Ａnaheim、１９９２年１０月(アブストラクト １２４７)により、さらなる方法は、抽出される核酸に代わって、分枝鎖状ＤＮＡオリゴヌクレオチドによるシグナル増幅(分枝鎖状ＤＮＡシグナル増幅)を記載している。
欧州特許第０ ５９０ ３２７ Ａ２号は、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、またはＢ型肝炎ウイルスのウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの測定を提供する、血液試料の分析方法を開示している。Ｂ型肝炎ウイルスゲノムを測定するための試験に対する検出限界は、その評価を、ゲルを染色した後で電気泳動により行うなら、１,５００コピー(１５０,０００コピー／ml)である。血液試料は一部が、血液の乾燥スポットである。分析後、試料のさらなる処理のための準備はしない。
【００３４】
幾つかのウイルスに対する高度免疫グロブリン製剤を製造するための方法は、能動的に免疫されているドナー、または既に疾患を克服していることから、防御免疫を示すドナーに由来する血液および血漿から出発する。病原性ウイルスに対して予防接種されている血漿ドナーの血液は、対応する抗体タイターを含む。ＨＩＶ抗体のような、ウイルス血症を示す抗体とは対照的に、これらの抗体が望ましい。
【００３５】
従って、本発明の薬物を製造するために使用する、品質保証された出発原料または中間体は、問題のウイルスに対するウイルス中和抗体を過剰に含むか、または存在する可能性のある複製可能な血液原ウイルスのゲノムもしくはゲノムフラグメントを検出不可能な量で、もしくは限界値以下の量で含む。
【００３６】
血漿誘導体は、薬物中、活性物質として、または補助成分としてもまた含まれ得る。活性物質には、例えば、凝固因子、免疫グロブリン、繊維素溶解因子、酵素阻害剤または血漿中に存在する他の酵素もしくはチモーゲンもしくはそれらの混合物が含まれる。補助成分には、アルブミンまたは他の安定剤、様々な阻害剤、補因子等が含まれる。
原則的には、血漿プール、クリオプアー(cryopoor)血漿、またはＣohn II ＋ III ペーストといったような、ある特定の製造方法を開始する物質を全て、出発原料としてみなすべきである。一連の可能な出発原料は、Ｈeideら(「Ｔhe Ｐlasma Ｐroteins」中の「Ｐlasma Ｐrotein Ｆractionation」、Ｆrank Ｗ.Ｐutnam編、Ａcademic Ｐress Ｎew Ｙork、Ｓan Ｆrancisco、Ｌondon １９７７、５４５〜５９７頁）による論文で引用されている。
【００３７】
中間体は、与えられた製造工程により得られている、ある特定の製造方法で出発原料から誘導される産物、例えば、出発原料として血漿またはクリオプアー血漿を用いての第IX因子の製造におけるプロトロンビン複合体である。
【００３８】
慣例の製造方法で薬物に後処理される最終血漿誘導体は、該製品に特異的な製造方法により、場合によっては中間体を経て、出発原料から製造される。勿論、この後処理の間に、２つまたはそれ以上の最終血漿誘導体を一緒に合わせることができる。
【００３９】
好ましくは、ＨＩＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ、また特にＨＩＶおよびＨＣＶよりなる群から選択される、少なくとも２つのウイルスに関して、ウイルス汚染が存在しないか、または規定された限界値を越えないウイルス汚染が存在することが好ましい。
【００４０】
さらに、本発明は、上述のウイルスに限定されない；むしろ、存在しないか、または規定された限界値を越えないウイルス汚染を、血液により、または血液から得られた産物により伝達され得、またヒトにとって危険の高いウイルスであることが判明している、あらゆる血液原ウイルス、例えば、パルボウイルス、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに関して、および新たに発見されたウイルスに関して測定することができる。好ましくは、これらのウイルスの薬物中での存在が患者に危険を示すならば、存在しないか、または規定された限界値を越えないウイルス汚染を、血液原ウイルス全てに関して測定するであろう。
【００４１】
いずれの場合でも、この値を越えてはならないという、複製可能な血液原ウイルスによる許容可能な汚染の限界値は、主として、検出反応の能力に、また出発原料および中間体を評価するのに適当な手段に依存する。例えば、検出限界は、検出反応に使用される試料の体積に依存する。例えば、ウイルスゲノム当量を、たった１つの献物の試料２０μl中で検出することができず、また使用する検出方法が、たった１つのゲノム当量を試料中で検出することが可能なら、個々の献物の最大汚染は、血漿１ml当たり５０ ゲノム当量より少ないと結論することができる。陰性の検出結果を得て、さらに試料２０μlを試験して、再びウイルスゲノム当量が検出されないなら、その単一の献物の最大負荷は、血漿１ml当たり２５ ゲノム当量より少ないと結論することができる。
【００４２】
出発原料または中間体１ml当たり、最大値 ５００ ゲノム当量、特に最大値 ２００ ゲノム当量、好ましくは最大値 １００ ゲノム当量、またとりわけ最大値 ５０ ゲノム当量は、複製可能な血液原ウイルスによる許容可能な汚染に関する実際的な限界値であることが証明されている。
【００４３】
本発明の好ましい保証された出発原料または中間体の場合には、少なくとも４つのリダクション(reduction)因子を与える、少なくとも１つの方法により成し遂げられるウイルス不活性化またはウイルス消失が、品質保証された、この出発原料または中間体起源の薬物の製造において成し遂げられる。
【００４４】
本発明の血漿タンパク質含有薬物は、出発原料となる血漿タンパク質の、１つまたはそれ以上の複製可能な血液原ウイルスによる、確かめられた、限定された汚染を基にして、ウイルスを不活性化する、または消失させるためのタンパク質保存方法が、血漿タンパク質をウイルスに安全な形で得るのに十分であるという利点を有する。好ましくは、存在する可能性のある複製可能な血液原ウイルスのウイルス負荷をいずれも不活性化する、または排除するために、４つ未満のリダクション因子を有するタンパク質保存方法を行う。あるタンパク質保存方法は、血漿タンパク質の活性および完全性を出来る限り最も広い範囲で維持することが可能である。回収されるべきタンパク質の(特異的)活性を５０％またはそれ以上、また好ましくは８０％またはそれ以上維持する、ある方法は、タンパク質保存性と見なされる。本発明の薬物の製造方法中での、たった１つのウイルス活性化またはウイルス消失は、存在する可能性のあるウイルスをいずれも完全に不活性化する、または排除するのに十分である。
【００４５】
血漿誘導体または薬物の製造に使用され、また試験ウイルスが加えられている出発原料または中間体の場合には、与えられたウイルス不活性化工程に先立つウイルス消失により、ウイルス負荷を大いに減少させることができることが示されている(例えば、ＥＰ−Ａ−０ ５０６ ６５１)。該消失は、ナノ(nano)濾過、沈降反応、透析、遠心分離、クロマトグラフ精製工程等といったような、既知の方法により行うことができる。ウイルスを不活性化するために、一連の物理的、化学的、または化学的／物理的方法が知られており、これらは、例えば、ＥＰ−Ａ−１５９ ３１１またはＥＰ−Ａ−０ ６３７ ４５１でのような加熱処理、ＥＰ−Ａ−０ ２４７ ９９８による加水分解酵素処理、例えば、ＥＰ−Ａ−０ １３１ ７４０でのような放射線処理または有機溶媒および／または界面活性剤での処理を含んでなる。血漿画分および薬物を製造する間の、さらに適当なウイルス不活性化工程は、ＥＰ−Ａ−０ ５０６ ６５１またはＷＯ ９４／１３３２９に記載されている。様々な不活性化方法が、Ｅur.Ｊ.Ｅpidermal. ３（１９８７）、１０３−１１８において分析されている；そのリダクション因子は、ＥＣ委員会(Ｃommission)のＥＣIII／８ １１５／８９−ＥＮ ガイドラインにおいて扱われている。
【００４６】
本発明の方法により、プールした出発原料、特に血漿プール、または中間体を各々、群を抜いて安全性の増加した品質とすることが可能である。
【００４７】
好ましくは、例えば、適当な予防接種により、１つまたは幾つかのウイルスに対して、能動的に免疫されているか、または免疫性であることから、防御免疫を示す血漿ドナーを、本発明の品質保証された血漿プールの製造のために選択する。血漿ドナーは、肝炎ウイルスに対して、特にＡ型肝炎ウイルスに対して、対応する血漿の感染の可能性を排除するために予防接種されているのが好ましい。
【００４８】
血漿が出発原料であるなら、本発明による品質保証の好ましい態様は、
− ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、パルボウイルスおよびＨＡＶ群の全てのウイルスのゲノム当量を測定する、
− ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびパルボウイルス群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰のＨＡＶ抗体を測定する、
− ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰のＨＡＶおよびパルボウイルス抗体を測定する、
− ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰のＨＡＶ抗体を測定する、
− ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰のパルボウイルス抗体を測定する、
− ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量を測定する、
− ＨＩＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量を測定する、
− ＨＩＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰のＨＢＶ抗体を測定する
ということにある。
【００４９】
本発明の品質保証された血漿プールは、例えば、Ａ型肝炎およびＢ型肝炎ウイルスに対して予防接種されており、それ故、抗感染免疫性により、血中に抗体タイターを有し得る血漿ドナーを選択することによっても得ることができる。これらの抗体は、能動免疫化により形成されており、それ故、ウイルス血症を示すものではない。対応するウイルス血症を示すマーカーの不在に関して、献血漿を個々に試験する。この目的のために、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス抗体、また場合により、ＨＩＶ抗体を測定するための試験を、有効とされるＥＬＩＳＡ試験システムの助けをもって行う。ＡＬＴおよびＧＰＤ値といったような、幾つかの肝臓値もまた、Ｃ型肝炎ウイルスのマーカーである。ドナー血漿中のウイルスマーカーの不在を確かめるのなら、個々の献血漿の血漿プール中のＡＩＤＳウイルス(ＨＩＶ−１)、また場合により、Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムまたはゲノムフラグメントの不在の証拠を、さらなる選択基準として用意する。この献血漿が、ウイルス感染を示す、ＨＩＶに対する抗体を何ら含まないという確認にもかかわらず、この方法が推奨される。ＨＩＶウイルスで感染させてから、対応する抗体が検出可能となるまでの時間は、とりわけ、これらのウイルスの場合には、数カ月であり得る。従って、ＨＩＶ抗体の不在に関してのみ試験した血漿プールを、複製可能な感染ウイルスを何ら含まない、またはそれらを規定された限界値以下で含む、制御された血漿プールとして利用可能とすることはできない。
【００５０】
複製可能な血液原ウイルスによる限定された汚染を確かめるための本発明の方法の１つは、核酸を検出する、または測定する、定量可能な、制御された、および非阻害的方法は別として、本発明の血漿プール中のウイルス中和抗体の検出を含んでなる。例えば、適当な酵素免疫試験のような、有効とされる試験システムもまた、抗体タイターを測定するのに使用すべきである。該方法に使用される試料は、場合により、凍結乾燥した後、再構築することができる。
【００５１】
血漿プールの他に、低温型沈降物または他の初期の中間体が本発明の出発原料と考えられる。初期の中間体は、薬物の製造においてヒト血漿から得られる中間体であり、これらはさらに、ウイルス消失またはウイルス不活性化にかけられるであろう。血漿プール、特に、同様に保証された少量のものを、より多量なものに合わせる可能性に関して本明細書中で述べられていることはまた、−可能である限り−本発明により、他の出発原料にも適用される。従って、同じ種類の、品質保証された出発原料または中間体を、各々、品質保証された出発原料または中間体の、より大きなプールへと混合することを、本発明により提供する。
【００５２】
出発原料または中間体に対する、そのような高い品質基準は、まだ満たされていない。一方では、ウイルスで汚染された血漿プールにより引き起こされるウイルス血症を完全に排除することが必要であるとは考えられていない。血漿プールは、主として、血漿誘導体の製造、すなわち、血漿タンパク質に基づいた医薬品製剤の製造に使用される。しかし、この製造では、存在する可能性のあるウイルスを不活性化する、および／または消失させるための付加的方法を行わなければならず、このことは、最終生成物による病原性ウイルスの伝達の危険を倍数的に減少させるので、先行技術により指示された通常のアッセイが適しているとみなされる。
【００５３】
本発明により、過剰のウイルス中和抗体、または確かめられた、限定された負荷のウイルスゲノム配列を示す、それらの出発原料または中間体のみを、生成物のさらなる後処理に使用する。それにもかかわらず、核酸増幅方法で測定されるゲノム当量の量は、複製可能なウイルスによる汚染の上限しか与えないことから、本発明の要件を満たさず、また本発明の範囲内の薬物への、さらなる処理には不適な出発原料を、感染性として証明できるように記載することはできない。従って、測定されるゲノム当量の量は、全てのゲノム当量が活性なウイルスに由来する場合にのみ、複製可能なウイルスの負荷の「真の値」を与える。
【００５４】
本発明により保証された幾つかの出発原料から、混合することにより、より多量のものを得ることができるが、これは、同じ安全基準に従う。
【００５５】
血漿プールの場合、後者を、約２〜約２０個の献血漿からなる小さなプールとして与えるのがよい。少なくとも１０の小さなプールを合わせて、約２０〜２００、また好ましくは約２００個の献血漿からなるミニプールとすることができる。大きさの次のオーダーは、約２００〜２,０００、また好ましくは約２,０００個の献血漿からなるマクロプールであり、これは、場合により、少なくとも１０のミニプール単位で混合することにより製造される。幾つかのマクロプールを合わせて、２００,０００個までの献血漿からなるマルチマクロプールとすることができる。
【００５６】
本発明により、ウイルスゲノムまたはゲノムフラグメントに関する証拠を、これらのプールサイズ各々に用意することができる。小さなプールを試験した後、調べた小さなプールを合わせて、より大きなプール、例えば、ミニプールとすることにより、かつて記載されたことのない品質が、より大きなプールでも得られる。
【００５７】
従って、本発明の特別の態様は、好ましくは約２００個の献血漿からなるミニプールを混合して、好ましくは約２,０００個の献血漿からなるマクロプールとすることにより得られる血漿プールにある。
【００５８】
さらに好ましい態様は、マクロプールを、いずれかの所望の数の他のマクロプールと混合することにより合わせて、２００,０００個までの献物からなるマルチマクロプールとすることを特徴とする、血漿プールからなる。
【００５９】
また別の好ましい態様は、そのミニプールが、２〜約２０個の献物からなる小さなプールを混合することにより得られる、血漿プールにある。
【００６０】
血漿画分または最終血漿誘導体を各々製造するための、および薬物を製造するための、血液血漿の分画に対する出発原料を選択する際には、経済的な理由から、比較的多量のものが好まれるべきである。しかし、今までは、ウイルスゲノムまたはゲノムフラグメントの検出により、ウイルスで汚染されていないとみなすことができたマクロプールの、またはマルチマクロプールの大きさの血漿プールを利用することができなかった。２,０００個以上の献血漿を一緒に混合することから生ずる希釈効果が大きすぎ、また検出すべきゲノムの数が試験方法の検出限界より小さいことが非常に多いことから、マルチマクロプールのみに関しての証拠を用意するには十分ではない。小さなサブユニットを試験した後、合わせて、より大きなユニットとすることにより、こういった検出能力の問題を克服し、また経済的に重要な量が得られる。
【００６１】
本発明の品質保証された出発原料は、血漿タンパク質を中間体として含む画分の製造に、または最終薬物の製造に、群を抜いて適当である。
【００６２】
出発原料、特に血漿プールに与えられた方法は、勿論、全ての種類の血漿画分に対して同様に利用することができる。従って、さらなる態様により、本発明はまた、品質保証された最終血漿誘導体にも関し、この血漿誘導体の複製可能な血液原ウイルスによる汚染は、品質保証された出発原料の使用によって安全に限定される。
【００６３】
さらに、本発明は、勿論、本発明により品質保証された出発原料からの、または本発明により品質保証された１つまたは幾つかの中間体からの製造方法により得られる最終的な血漿誘導体にも関する。
【００６４】
本発明により製造される最終血漿誘導体から医薬的調合によって製造される薬物もまた、本発明に含まれる。
【００６５】
さらに、本発明は、品質保証された出発原料からの、または血漿誘導体の製造中に得られる品質保証された中間体からの、１以上の血漿誘導体を含む薬物の製造方法に関し、その品質保証された出発原料または中間体は、１つまたはそれ以上の複製可能な血液原ウイルスで汚染されていないか、または規定された限界値を越えない量で汚染されており、またその規定された限界値は、１つまたはそれ以上の、以下の基準による核酸の検出または測定のための、定量可能な、制御された、および非阻害的方法により、各々のウイルスのゲノム当量を測定する場合において選択される：
【００６６】
− 少なくとも１０,０００コピーの選択された核酸配列の核酸増幅方法の検出限界；
− 出発原料または中間体１ml当り、ある一定数のゲノム当量、特に５００以下のゲノム当量、好ましくは２００以下のゲノム当量、さらに好ましくは１００以下のゲノム当量、またとりわけ好ましくは５０以下のゲノム当量。
【００６７】
本発明により、限界値に関する他の許容可能な選択基準は：
− 細胞培養試験によって測定される限界値、好ましくは、１ml当りのあるＴＣＩＤ５０(ａ ＴＣＩＤ５０)、またはこの量で含まれるゲノム当量、
− 動物モデルによって測定される限界値、好ましくは、１ml当りのあるＣＩＤ５０(ａ ＣＩＤ５０)、またはこの量で含まれるゲノム当量
である。
【００６８】
これらの限界値は、それらの実用的関連(試験方法の検出能力に依存する)、およびそれらの生物学的関連(特に、ＴＣＩＤおよびＣＩＤ値)から好ましい。
【００６９】
非常に鋭敏なＰＣＲ法は、試験物質中に混入し得る非常に僅かな量の幾つかの不純物でさえもまた増幅されて、誤った陽性の結果を生じ得るという不利な点を有する。
【００７０】
本発明の方法の好ましい態様は、１つ以上の検出システムの使用により特徴付けられ、または測定を核酸に対して利用する場合、１つのシステムが誤った陽性の結果を排除して、他のシステムが誤った陰性の結果を排除するよう、その検出または測定システムを選択するのが好ましい。
【００７１】
好ましくは、少なくとも２つの異なったＰＣＲ法を利用し、少なくとも１つの方法をスクリーニングに使用して、少なくとも１つの方法を確認に使用する。
【００７２】
ＤＴＳ−ＰＣＲ(二重標的化(Ｄual Ｔargeting)サザンブロットＰＣＲ)の場合、抽出された核酸の増幅に続いて、合成された核酸をアガロースゲル電気泳動により分離した後、ジゴキシゲニン(ＤＩＧ)標識化プローブとハイブリダイゼーションさせた後、サザンブロットにかける。その評価は、バンド強度のデンシトメーター測定によって行う。配列の不均一性から、ＰＣＲプライマーとテンプレートとの間のミスプライミングにより引き起こされ得る誤った陰性の結果を排除するために、核酸抽出物を増幅して、最初のプライマー対とは異なる、さらなるプライマーを用いての第２のＰＣＲにおいて再度分析する。合成核酸を内部標準として加えることにより、ＤＴＳ−ＰＣＲを調べて、誤った陰性の結果を排除する。
【００７３】
例えば、ＤＴＳ−ＰＣＲにおいて得られた結果をさらに確かめるために、ＬＩＦ−ＰＣＲ(レーザー誘起蛍光ＰＣＲ)をさらなる方法として使用するのが好ましい。
【００７４】
非放射能標識化プライマー(好ましくは、蛍光染料で標識化されたプライマー)を使用することにより、ＰＣＲ産物をＬＩＦ−ＰＣＲにより検出することができる。しかし、増幅産物の検出はまた、伸長反応の間に、非放射能標識化ヌクレオチドアナログを、新しく合成された核酸に組み込むことにより簡易化することもできる。ＬＩＦ−ＰＣＲでは、核酸を蛍光標識化プライマーの存在下に増幅した後、その増幅産物をＰＡＧＥにより分離する。ＬＩＦ−ＰＣＲの各々の試料に関して、さらなる陰性および陽性の対照を行う。ＰＣＲ産物の検出および定量は、遺伝子スキャナーによって達成される。特に、誤った陰性の結果を排除して、陽性の結果をＬＩＦ−ＰＣＲの内部二重標準化法により確認する。
【００７５】
本発明により、陽性および陰性の対照を使用することによって、誤った陽性の結果または誤った陰性の結果を排除することができる。記載した、２つの異なったＰＣＲ法の組み合わせ、特にＤＴＳ−ＰＣＲとレーザー誘起蛍光ＰＣＲ(ＬＩＦ−ＰＣＲ)との組合せは、多数の試料を慣例の対照で試験することを可能とすることから、主として、誤った陰性の結果を排除することができ、また誤った陽性の結果を回避することができる。
【００７６】
本発明のさらなる態様は、試験試料を濃縮することに存し、それによって、より低い負荷のウイルスゲノム配列でさえも検出することができる。本発明の方法の感度は、血漿試料またはその中に含まれるゲノム当量を濃縮することによる、さらなる方法により、増大させることができ、感度を１０倍〜１００倍増大させるのが好ましい。
【００７７】
従って、本発明の方法の好ましい態様では、出発原料(例えば、個々の献血漿または試料プール)もしくは中間体起源の試料、またはその中に含まれるゲノム当量を、好ましくは凍結乾燥、吸着、または遠心分離により濃縮する。
【００７８】
本発明により、ゲノム配列を検出する、または測定するための、定量可能な、制御された、および非阻害的方法を与える方法を利用する。しかし、血漿プール中の限定された負荷の複製可能なウイルスをウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出により測定する場合、検出方法の幾つかの阻害物質が試料中に存在することが起こり得るので、非阻害増幅は、直ちには不可能である。
【００７９】
ＰＣＲ法により測定される血漿プールのウイルス汚染は、過小評価され得ることが証明されている。ＰＣＲ測定法の感度にかなり影響を与え得る因子が血漿プール中に存在することがある(Ｎucleic Ａcids Ｒesearch １６（２１）、１０３５５（１９８８）)。これらの、いわゆるＰＣＲ反応の阻害物質は、検出反応の前に、本発明の方法により除去するか、またはゲノム標準を使用することにより、検出反応の間に排除する。プール中、内部標準が適当な割合で増幅可能であり、また検出可能であるなら、そのような阻害物質の存在は排除される。
【００８０】
ヘパリンのような血漿中に存在する物質、高塩濃縮物およびポリエチレングリコールが、ＰＣＲ反応を阻害し得ることは周知である(ＢioＴechniques ９（２）、１６６（１９９０）、およびＪournal of Ｃlinical Ｍicrobiology ２９（４）、６７６−６７９（１９９１）)。
【００８１】
従って、本発明の方法の好ましい態様は、存在する可能性のある増幅の阻害物質を、個々の献血漿中、または試料プール中から除去する、または消失させることを特徴とする。
【００８２】
血液、血漿または血清中の増幅阻害物質を除去する、または中和するための、これらのさらなる方法は、例えば、試料の超遠心分離、およびその中に含まれる阻害物質を含む上清をデカントすること、および核酸の抽出、さらにはまたヘパリナーゼ、ポリアミンを用いての試料の処理、またはＨＰＬＣによる核酸の予備精製を含んでなる。核酸の無制限増幅を、より高い純度の核酸により確実なものとする。
【００８３】
該方法の好ましい変更態様により、幾つかのウイルスに特異的なプライマー対を増幅試験に使用し、その結果、幾つかの種類のウイルスの存在を同時にアッセイすることができる。特に好ましい試験では、ＨＩＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶの群から選択される、２つまたはそれ以上のウイルスがアッセイされる。
【００８４】
特に、ＲＮＡウイルスは、この変異体または既知の株のサブタイプが大変迅速に発生し得、そのゲノム配列が野生型配列のものとは幾分異なる結果として、高い変異率を受けやすい。しかし、例えば、ＰＣＲのような、鋭敏な増幅方法の場合には、試料中に実在するコピーを測定するために、特に高い増幅効率が、非常に少ないコピー数のウイルスゲノム配列の検出および定量測定に欠くことができない。プライマーのテンプレートとの不十分なアニーリングは、それらの効率を減少させる。従って、プライマーを選択する際の適当な注意を確実なものとしなければならない。
【００８５】
好ましいプライマー対は、それらがアッセイすべき個々の血液原ウイルスの保存されたゲノム配列をコードするよう選択され、そのプライマーの適合性は、調査すべきウイルスの典型的な試料横断切片(cross section)の適当な試料において確立される。
【００８６】
以前同定された、ＨＩＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶの既知のゲノム配列の他に、それらのサブタイプもまた、増幅反応のためのプライマーを選択することにより検出することができる。本発明により、このことは、使用するプライマーを各々のウイルスの高度に保存されたゲノム領域から選択することで達成される。従って、全ての関連あるサブタイプに対する特異性が確認されているプライマーのみが、ＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによる本発明の出発原料または中間体の選択に使用されるであろう。
【００８７】
疫学モニターの範囲内では、標的ウイルスの、新たに発生したウイルス株をアッセイして、それらが対応するテンプレートを含むかどうかを調べ、使用するプライマーを、これに対して配向する。次いで、既知のウイルス株群内で見出される変化を基に、新規ウイルス性株に関して実在するコピーの定量的な検出に適当な新規プライマーを合成することが可能であろう。そこで、新たに合成されたプライマーが有するアッセイの感度は、既に試験されているプライマーの感度と少なくとも同等でなければならない。
【００８８】
保存された核酸配列のための新規プライマーを、新たに発生する標的ウイルスのために開発しなければならない。
【００８９】
試料中の核酸を検出する、または測定する方法を調べるために、好ましくは、該方法を行う前または間に、１つまたはそれ以上の内部標準または標準品を試料に加え、その標準物質は、全く同じアッセイ容器中、存在し得る全てのウイルスゲノムまたはゲノム配列と同時に検出され、または測定される。
【００９０】
この方法は、特に、内部標準を各々の増幅反応の検出限界に近い量で使用するならば、ウイルス核酸の含量の一層正確な定量または増幅方法の検出限界の一層良好な評価の可能性を提供する。
【００９１】
本発明により合わせて、品質保証された血漿プールとした個々の献物を、さらなる同様に品質保証された血漿プールと合わせることができるので、品質保証されたミニプール、マクロプールまたはマルチマクロプールが提供される。品質保証された、より小さなプールから製造される、より大きなプールの利点は、既に十分記載した。
【００９２】
さらなる態様により、本発明は、血漿プールを、２つまたはそれ以上の個々の献物から、複製可能なウイルスによる、確かめられた、限定された汚染を伴う、品質保証された出発原料として製造する方法であって、以下の工程：
− 試料をｎ個の献物から採取し、
− 個々の献物試料を合わせて、ｍの試料プールとし、
− この試料プール中に存在するウイルスゲノムまたはゲノム配列の量を、核酸の検出または測定のための、定量可能な、制御された、および非阻害的方法によって検出する
により特徴付けられる方法に関し、
その方法においては、試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出量が、ある一定の限界値以下にある、個々の献物(ｎｇ)を合わせて、品質保証された血漿プールとして、試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出量が、限界値より大きいか、または限界値に等しい、個々の献物(ｎａ)を、さらなる処理にかけるか、または排除する(ｎおよびｍは正の整数である)。例えば、ウイルスゲノム当量を消失させることにより、またはウイルス中和抗体含有画分を混合することにより、個々の献物のさらなる処理を行うことができる。
【００９３】
さらなる方法の工程では、排除されるｎａ個の献物のさらなる処理に関してもまた、試料を再び採取するのがよく、またこれらの個々の献物試料を合わせて、ｍａの試料プールとするのがよい(ｎａおよびｍａは、ｍａ＞２の正の整数であって、ｍａ：ｎａの割合は、ｍ：ｎの割合より大きい)。この試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の量を、核酸の検出または測定のための、定量可能な、制御された、および非阻害的方法によって再び検出することができ、ここで、試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出量が、ある一定の限界値以下にある、個々の献物を合わせて、品質保証された血漿プールとして、ウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出量が、限界値に等しいか、限界値より大きい、個々の献物を、さらなる処理にかけるか、または排除する。さらに処理すべき、または排除すべき個々の献物の数が、ある一定数に達するか、または一定数以下となるまで、この方法を繰り返すことができる。
【００９４】
これらの方法により、許容不可能なほど高い負荷の複製可能なウイルスを含む可能性のある全ての個々の献血漿を、ほぼ無限に大きな血漿プールから幾つかの試験で排除することを可能とするための、簡単な方法を提供する。他方では、ウイルスで汚染された個々の献物と一緒に、今までに利用した方法により排除されてきた適当な個々の献物は、合わせて分析するなら、簡単な方法の工程により認識され、また最終血漿誘導体へと処理することができる。
【００９５】
従って、本発明のさらなる目的、すなわち、大きな血漿プール中でさえも、たった１人の感染したドナーを、さらなる献物から排除して、直ちに医療処置に付すために、簡単かつ低コストの方法で発見することを達成することができる。そのことで、ドナー集団の安全性が増大する。
【００９６】
本発明の方法を受ける血漿プールにより含まれてなる個々の献物の数は、通常、２〜２００,０００(ｎ＝２〜２００,０００)、また好ましくは２０〜２０,０００、さらに好ましくは２００〜２,０００、またとりわけ２００に達する。数字ｍは、特に、１〜１００,０００の間、また好ましくは２〜１,０００の間にある。さらに処理すべき、または事実上、排除すべき個々の献物に対して決められた数は、１００、好ましくは１０、また特に好ましくは１に達する。従って、最後の場合、ウイルスで汚染された個々の献物は、それ相当に同定される。しかし、実際、このことは、血漿ドナーを同定するという理由でのみ示される；従って、その数は、通常、１０〜１００の間で決められる。
【００９７】
必要ならば、核酸の検出または測定に加えて、アッセイすべきウイルスに対するウイルス中和抗体に関して、血漿プールをアッセイすることができる。
【００９８】
概して、ウイルスに対する抗体が見出された試料プールを用いて、各々の個々の献物を合わせて、さらに使用する。次いで、試料プール中、抗体が全く検出されていない個々の献物をさらなる処理に回すか、または排除する。
【００９９】
さらに、本発明は、本発明の方法の範囲内で製造される、品質保証された出発原料または中間体、特に血漿プールに関し、さらにはまた、好ましくは、ウイルスゲノム当量に関して、またはウイルス中和抗体の存在に関して、各々、一度以上アッセイされている、品質保証された最終血漿誘導体に関する。
【０１００】
本発明はまた、医薬品製剤化工程により、ヒト血漿起源の品質保証された最終血漿誘導体から得ることができる薬物をも含んでなる。
【０１０１】
さらなる態様により、本発明は、複製可能な様々な血液原ウイルスを含まない、１以上の血漿誘導体を含む薬物の製造方法に関し、この方法は、以下の方法の工程により特徴付けられる：
− 血漿誘導体の製造中に生じ、またヒト血漿から誘導される出発原料または中間体を与え、
− 複製可能な血液原ウイルスによるウイルス汚染の不在を実証することにより、またはそのような汚染が、ある特定の限界値を越えない量で存在することを測定することにより、出発原料または中間体の品質を保証し、
− 出発原料または中間体各々の中の過剰のウイルス中和抗体により、または献血漿時の血漿ドナーの防御免疫により、幾つかの複製可能な血液原ウイルスによる汚染の不在を検出し、
− あるいは、問題の各々のウイルスのゲノム当量を、出発原料中、または中間体中、各々、測定し、
− このようにして品質保証された出発原料または中間体を各々、少なくとも１つのさらなる実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかけて、血漿誘導体を完成し、
− このようにして得られた品質保証された最終血漿誘導体を、公知の方法により後処理して、薬物とする。
【０１０２】
ヒト血漿から薬物を製造するための好ましい方法では、その製造方法中、品質保証工程を少なくとも１つの中間体に用いる。
【０１０３】
好ましい態様により、該品質保証工程は、実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかける中間体に対して行う。最も好ましくは、実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかけるべき、各々の中間体の品質保証である。
本発明を以下の実施例により記載するが、これは、本発明を限定しようとするものではない。
【実施例】
【０１０４】
実施例１
１. ＰＣＲの通則
１.１. ＤＴＳ−ＰＣＲ(二重標的化サザンブロット)の通則
第１の特異的プライマー対によって、核酸をＰＣＲで増幅した後、そのＰＣＲ産物をアガロースゲルでの電気泳動により分離して、フィルターにブロットさせる。フィルターに結合させたＰＣＲ産物をジゴキシゲニン(ＤＩＧ)標識化プローブとハイブリダイズさせると、これが増幅されたゲノム配列内に結合し、発生反応後に検出する。デンシトメーターによって、バンド強度を定量的に測定する。第１のプライマーとは異なる第２のプライマー対を使用する、さらなるＰＣＲでは、核酸を増幅して、サザンブロット分析によってもまた検出する。ゲノム配列の２つの異なる領域のＰＣＲ、およびハイブリダイゼーションによる、それらの視覚化により、誤った陰性の結果を減らすことができ、また陽性の結果を確かめることができる。
【０１０５】
１.２. ＬＩＦ−ＰＣＲ(レーザー誘起蛍光標識化)の通則
蛍光基を有するプライマーを使用するＰＣＲによって、様々な起源の核酸を増幅した。レーザー誘起蛍光測定装置を備えた自動ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂiosystems製のＧene Ｓcan(商標) ソフトウェアを備えたＤＮＡ Ｓequencer ３７３Ａ)の助けをもって、得られた増幅産物の分析および定量を行った。この装置により、変性条件下、ポリアクリルアミドゲル中でのゲル電気泳動によって、蛍光標識化ＰＣＲ産物をサイズにより分離して、それらの量を定量的に測定することができる。試料中の幾つかの配列のコピー数を、定量すべき核酸、および少なくとも２つの内部標準に関して得られた強度に基づいて測定する。
【０１０６】
１.２.１. ウイルス粒子のＤＮＡの抽出
超遠心分離機中、試料５００μlを７０,０００rpmで２０分間遠心分離した。ペレットを、１０mＭ トリス／ＨＣl(pＨ ８.０)５００μl、およびプロテイナーゼ Ｋ(Ｂoehringer Ｍannheim、２０mg／ml)１０μl、さらにはまた２０％ ＳＤＳ１０μlに溶解する。３７℃で一晩インキュベーションするか、または５６℃で４時間インキュベーションした後、既知量の標準核酸を加え、試料をフェノールおよびクロロホルムで順次抽出した後、グリコゲン(Ｂoehringer Ｍannheim、２０mg／ml)１０μlを加える。続いて、生成物をエタノールで沈殿させ、遠心分離して、ペレットを洗浄して、最終的には、水に溶解する。
【０１０７】
１.２.２. 残留ウイルスＤＮＡの抽出
試料５００μlを、１０mＭ トリス／ＨＣl(pＨ ８.０)５μl、およびプロテイナーゼ Ｋ(２０mg／ml)１０μlに溶解する。３７℃で一晩インキュベーションするか、または５６℃で４時間インキュベーションした後、既知量の標準核酸を加え、試料をフェノールおよびクロロホルムで順次抽出して、グリコゲン(２０mg／ml)１０μlを加える。続いて、生成物をエタノールで沈殿させ、遠心分離して、ペレットを洗浄して、最終的には、水に再び溶解する。
【０１０８】
１.２.３. ＰＣＲのためのＲＮＡの抽出
血漿またはＰＢＳで希釈した血漿１mlを７０,０００rpmで２０分間遠心分離する。上清を吸引により取り除いた。ペレットを、イソチオシアン酸グアニジウム溶液(ＢiotexのＲＮＡzol)１ml、および酵母由来の１mg／ml tＲＮＡ５μlにとって、２０μlのような、予め決められた量の標準ＲＮＡを加えた。４００および１,２００コピーといったような、指定された数の(−)ＲＮＡ標準および(＋)ＲＮＡ標準を加えて、渦流する(vortexed)。その溶液を７０℃で１０分間加熱し、１／１０体積のクロロホルムを加えた後、その混合物を氷上で１０分間インキュベートする。次いで、卓上遠心分離機中、これを５分間遠心分離して、上清を新しい管に移す。イソプロパノール５００μlを加えて、温度を−８０℃で１５分間維持する。次いで、これを１０分間遠心分離し、７０％ エタノールで２回洗浄して、ペレットを水５０μlにとる。ＲＴ−ＰＣＲの場合には、５μlを使用した。
【０１０９】
１.２.４. ＤＮＡの検出のためのＰＣＲ
ＰＣＲ製剤は、抽出された核酸のアリコート、ＰＣＲ緩衝液(Ｂoehringer Ｍannheim)、ＭgＣl２、dＮＴＰs、プライマー、Ｔaq ポリメラーゼ(Ｂoehringer Ｍannheim、５.０ユニット／μl)および水を既知の方法で含む。緩衝液および酵素の製造業者の指示に従って、また従来の方法に従って、ＰＣＲを行う(Ｍullisら、Ｍethods in Ｅnzymology １５５：３３５、１９８７)。
【０１１０】
１.２.５. ＨＩＶ ＲＮＡの検出のためのＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲ製剤は、Ｐerkin−Ｅlmer製のＲＴ緩衝液中の抽出された核酸のアリコート、ＭgＣl２、dＮＴＰs、ＲＴ プライマー、およびrＴ.th. ポリメラーゼ(Ｐerkin−Ｅlmer、２.５ユニット／μl)および水を通常の方法で含む。緩衝液および酵素の製造業者の指示に従って、また従来の方法に従って、ＲＴをＰＣＲ装置(Ｐerkin−ＥlmerのＧeneＡmp ＰＣＲ Ｓystem ９６００)で行う(Ｍullisら、Ｍethods in Ｅnzymology １５５：３３５、１９８７)。
ＰＣＲの場合には、ＭgＣl２、キレート緩衝剤、および第２のプライマーをさらに加える。次いで、ＰＣＲを上記のように行う。
【０１１１】
１.２.６. 生成物の分析
ＰＣＲ産物の測定および定量のために、０.５〜１.０μlをＰＣＲ溶液から採取して、製造業者の指示に従って、Ａpplied Ｂiosystems ３７３Ａ装置で分析する。
【０１１２】
１.３. サザンブロットおよびＤＴＳ−ＰＣＲ産物の検出
各々の生成物に意図された濃度でのＰＣＲ産物のゲル電気泳動分離のために、アガロースゲルを調製した。ゲル操作は、電気泳動用の１×操作用(running)緩衝液中で行った。ＰＣＲ産物試料を、０.５×操作用緩衝液中のフィコール／ブロモフェノールブルーと混合して、調製したゲルスロットを変えた。ゲル操作後、そのゲルを０.５Ｍ ＮaＯＨ／１.５Ｍ ＮaＣl中で１時間インキュベーションすることにより、ＰＣＲ産物を変性させた後、中和した。ＤＮＡをフィルター(ＤuralonＴＭ、Ｓtratagene、Ｌa Ｊolla、Ｃalifornia)に移して、核酸をＵＶ架橋(cross linking)より膜に結合させた。プレハイブリダイゼーション緩衝液(６×ＳＳＣ、０.５％ ＳＤＳ、５×Ｄenhardt's、１００μg／ml 変性ＤＮＡ)中、その膜を６８℃で１時間インキュベートした。ハイブリダイゼーションでジゴキシゲニン標識化ＤＮＡプローブで起こした後、アルカリ性ホスファターゼがコンジュゲートした抗体、ニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)、および５−ブロモ−１−クロロ−３−インドールホスフェート(ＢＣＩＰ)によって、免疫染色によるバンドの視覚化を成し遂げた。ブロットをデンシトメトリーにより評価した。
【０１１３】
１.４. 使用したプライマー
ＬＩＦ−ＰＣＲに使用したプライマーを表１.１.および表１.２.に要約する。
ＤＴＳ−ＰＣＲに使用したプライマーは、ＨＩＶの場合には、ＳＫ３８、ＳＫ３９、ＳＫ１４５およびＳＫ４３１(Ｒatnerら、１９８５)；ＨＣＶの場合には、３２、Ｒ３、ＣＨＡＡ、Ｒ１、ＣonＡ１、ＣonaＡ２およびＣonＡ(Ｃhironから入手可能)；およびＨＢＶの場合には、ＨＢＶ１ａおよびＨＢＶ１ｂ(Ｋanekoら、１９８９)、さらにはまたＨＢＶ４ａおよびＨＢＶ４ｂ(Ｃarmanら、１９８９)である。
【表１−１】
【表１−２】
【０１１４】
実施例 ２：
２.１. ＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによる、ドナー由来の血漿試料中のＨＩＶ ＲＮＡの定量
献血漿を、ＨＩＶ 血清(−)の健康な被験者、およびＨＩＶ 血清(−)、p２４抗原(＋)の一次感染した被験者から採取した。ドナーの血漿試料をＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによって試験した。ＤＴＳ−ＰＣＲによる試料試験を、プライマー対 ＳＫ１４５／４３１(プライマー対 １)およびＳＫ３８／３９(プライマー対 ２)(表１.１.)で行った；正のハイブリダイゼーションシグナルを有する試料をＬＩＦ−ＰＣＲによってさらに試験した。ＬＩＦ−ＰＣＲによって定量する場合には、ＨＩＶ−１のcＤＮＡ配列に結合し、野生型ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって１１５bpのＰＣＲ産物を与える、プライマー ＳＫ３８およびＳＫ３９(表 １.１)を使用した。標準プラスミド、pgag１、pgag−１５およびpgag＋１２(表１.２.)を使用した結果、１１５bp(pgag１)、１００bp(pgag−１５)および１２７bp(pgag＋１２)のＲＴ−ＰＣＲ産物が生じた。標準プラスミドを共増幅し(coamplified)、Ｇene Ｓcan(商標)で共分析して(coanalyzed)、コピー数／mlを測定した。定量的評価の結果を表２に要約する。
【表２】
ＨＩＶ 血清(−)、p２４抗原(＋)の血漿ドナーでは、最小汚染は２.８×１０５、最大汚染は２.３×１０７コピー／mlであることが測定された。
【０１１５】
２.２. ＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによる、ドナー由来の血漿試料中のＨＣＶ ＲＮＡの定量
献血漿を、ＨＣＶ 血清(−)の健康な被験者、およびＨＣＶの一次感染した被験者から採取した。ドナー由来の血漿試料をＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによって試験した。試料のＤＴＳ−ＰＣＲ試験を、プライマー対 ３２／Ｒ３(プライマー対 １)およびＣＨＡＡ／Ｒ１(プライマー対 ２)(Ｃhiron)で行った；正のハイブリダイゼーションシグナルを有する試料を、ＬＩＦ−ＰＣＲによってさらに試験した。ＬＩＦ−ＰＣＲにより定量する場合には、ＨＣＶのcＤＮＡ配列に結合して、ＲＴ−ＰＣＲにより野生型ＲＮＡから誘導される１１４bpの産物を与える、プライマー ＨＣＶ３２およびＨＣＶＰＴ４(表 １.１)を使用した。標準プラスミドとして、pＨＣＶwt、pＨＣＶ−７およびpＨＣＶ＋８(表１.２.)を使用した結果、長さ １１４bp(pＨＣＶwt)、１０７bp(pＨＣＶ−７)および１２２bp(pＨＣＶ＋８)のＲＴ−ＰＣＲ産物が生じた。標準プラスミドを試料で共増幅し、Ｇene Ｓcan(商標)で共分析して、コピー数／mlを測定した。定量的測定の結果を表３に要約する。
【表３】
ＨＣＶ 血清(−)の一次感染した血漿ドナーでは、最小汚染は２.２×１０４コピー／ml、最大汚染は１.６×１０６コピー／mlであることが測定された。
【０１１６】
２.３. ＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによる、ドナー由来の血漿試料中のＨＢＶ ＤＮＡの定量
献血漿を、ＨＢＶ 血清(−)の健康な被験者、並びに一次感染した、ＨＢsＡg(＋)、抗ＨＢsＡg 血清(−)、およびＨＢsＡg(＋)、抗ＨＢsＡg 血清(＋)の被験者から採取した。ドナーの血漿試料をＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによってアッセイした。ＤＴＳ−ＰＣＲによる試料試験を、プライマー対 ＨＢＶ１ａ／ＨＢＶ１ｂ(プライマー対 １)およびＨＢＶ４ａ／ＨＢＶ４ｂ(プライマー対 ２)で行った(Ｃarmanら、１９８９)；正のハイブリダイゼーションシグナルを有する試料をＬＩＦ−ＰＣＲによってさらに試験した。ＬＩＦ−ＰＣＲにより定量する場合には、ＨＢＶゲノムのcＤＮＡ配列に結合して、ＲＴ−ＰＣＲにより野生型ＲＮＡから誘導される１８２bpのＰＣＲ産物を与える、プライマー ＨＢＶ＋１７８０ＢおよびＨＢＶ−１９５０Ｂ(表１.１.)を使用した。標準プラスミド、pＨＢＶwt、pＨＢＶ−９およびpＨＢＶ＋１２(表１.２.)を使用したが、これらは、１８２bp(pＨＢＶwt)、１７３bp(pＨＢＶ−９)および１９４bp(pＨＢＶ＋１２)のＲＴ−ＰＣＲ産物を与える。標準プラスミドを試料で共増幅し、Ｇene Ｓcan(商標)で共分析して、コピー数／mlを測定した。定量的評価の結果を表４に要約する。
【表４】
【０１１７】
ＨＢＶ 血清(−)の一次感染した血漿ドナーでは、最小汚染は１.４×１０５コピー／ml、また最大汚染は１.３×１０８コピー／mlであることが各々測定された。
【０１１８】
実施例 ３：
３.１. ＨＩＶ−１ ＲＮＡに関する様々なサイズの血漿プールのアッセイ
１０、５０、１００、５００、１,０００および２,０００のＨＩＶ 血清(−)、p２４抗原(−)の健康な個々のドナー由来の血漿試料を、試料プール中に混合した。各々の個々のプールサイズを、実施例１でのように測定された２.３×１０７コピー／ml(試料)という高いウイルス負荷で一次ＨＩＶ感染したドナー由来の１つの血漿試料と、実施例１でのように測定された２.８×１０５コピー／ml(試料 ２)という最小汚染で一次ＨＩＶ感染したドナー由来の１つの血漿試料と、また対照として、１×１０４コピー／ml(試料 ３)、および１×１０３コピー／ml(試料 ４)であるＨＩＶ ＲＮＡの規定された製剤と混合した。各々のプールサイズに関する定量可能なウイルスのコピー数／mlを、ＬＩＦ−ＰＣＲによって測定した。ＰＣＲ評価の結果を表５.１.に要約する。
【０１１９】
結果：
表５.１.は、高い負荷(２.３×１０７コピー／ml)を有する、さらにはまた最小汚染(３.８×１０５コピー／ml)を有する、一次感染した、抗−ＨＩＶ 血清(−)、p２４抗原(＋)の個々の献物でのウイルス汚染を、１０、５０、１００および５００の個々の献物の血漿プール中、ＰＣＲによって検出することができることを示す。ＨＩＶ−ＲＮＡで高度に汚染された献物はまた、１,０００および２,０００の個々のドナー由来の血漿プール中でも検出することができた；他方、最小汚染を伴う献物はもはや、このサイズのプールでは検出することができなかった。個々の献物中、１×１０４コピー／mlでの汚染により引き起こされるＨＩＶ−ＲＮＡ負荷は、１０個までの献物のプール中で検出することができた。試験したプールサイズではいずれも、個々の献物中、１×１０３コピー／mlの汚染レベルでウイルスゲノム配列を検出することは不可能であった。
【表５−１】
【０１２０】
３.２. 試料を濃縮することによる感度の増大
ＨＩＶ−ＲＮＡのコピーを検出することができなかったプールサイズでの検出感度を増大させるために、プールした血漿の１０倍濃縮した試料をＰＣＲに使用した。この目的のために、実施例３.１.で使用した、試料２、３および４の個々の血漿プールの各々の場合における試料体積の１０倍体積を遠心分離により濃縮し、１／１０の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲに使用した。ＰＣＲ評価の結果を表５.２.に要約する。
【０１２１】
ＰＣＲの初期試料体積を１０倍濃縮することにより、１つの一次ＨＩＶ感染した献物を含む２,０００の個々のドナー由来のプールの最小汚染を検出することが可能であった(２.８×１０５コピー／ml)。同様に、たった１つの献物中に１×１０４コピー／mlのウイルス汚染を伴う、５０および１００の個々のドナー由来の血漿プール中での検出の感度を増大させることが可能であった。たった１つの献物中の１×１０３コピー／mlでのウイルス汚染は、１０の個々のドナー由来の最も小さなプールサイズでしか検出することができなかった。
【０１２２】
次に大きいプールサイズでのウイルスゲノムの検出を改良するために、１００倍の初期体積の、実施例３.１.で使用した試料３および４を、さらなる実験において濃縮し、１／１００の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲに使用した。ＰＣＲ評価の結果を表５.３.に要約する。
【０１２３】
血漿試料を１００倍濃縮することにより、たった１つの献物中の１×１０４コピー／mlのウイルスＨＩＶゲノム汚染をさらに、５００、１,０００および２,０００の個々のドナー由来の血漿プール中で検出することができた。
【表５−２】
【表５−３】
【０１２４】
実施例 ４
４.１. ＨＣＶ−ＲＮＡに関する様々なサイズの血漿プールの試験
１０、５０、１００、５００および１,０００のＨＣＶ 血清(−)の健康な個々のドナー由来の血漿試料を混合して、試料プールとした。各々の個々のプールサイズを、実施例１でのように測定された１.６×１０６コピー／ml(試料 １)という高い汚染を有する、一次ＨＣＶ感染したドナーの献血漿に由来する１つの血漿試料と、実施例１でのように測定された２.２×１０４コピー／ml(試料 ２)という最小汚染で一次感染したドナー由来の１つの血漿試料と、また対象として、１×１０３コピー／ml(試料 ３)、および５×１０２コピー／ml(試料 ４)であるＨＣＶの規定された製剤と混合した。各々のプールサイズに関する、定量可能なコピー数／mlを、ＰＣＲによって測定した。ＰＣＲ評価の結果を表６.１.に要約する。
【０１２５】
結果：
表６.１.は、１.６×１０６コピー／mlという高い汚染を有する、一次感染した献物でのウイルス汚染を、１０、５０、１００、５００、および１,０００個の献物からなる血漿プール中で検出することができることを示す。１００、５００および１,０００の個々のドナー由来のプールでは、たった１つの、最小限度に汚染された献物(２.２×１０４コピー／ml)により引き起こされるＨＣＶ−ＲＮＡはもはや、検出することができなかった。ＨＣＶゲノム当量の検出は、１０および５０までのドナー由来のプール中、たった１つの献物における２.２×１０４コピー／mlの汚染で可能である。たった１つの献物における約１×１０３または５×１０２コピー／mlという、より少ない数のＨＣＶコピーでのウイルスゲノム当量汚染は、試験したプールサイズではいずれも検出することができなかった。
【表６−１】
【０１２６】
４.２. 試料を濃縮することによる感度の増大
ＨＣＶ−ＲＮＡのコピーを検出することができなかったプールサイズでの感度を増大させるために、プールした血漿の１０倍濃縮した試料をＰＣＲに使用した。この目的のために、実施例４．１．で使用した、試料２、３および４の個々の血漿プールの各々の場合における試料体積の１０倍体積を遠心分離により濃縮し、１／１０の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲに使用した。ＰＣＲ評価の結果を表６.２.に要約する。
ＰＣＲの初期試料体積を１０倍濃縮することにより、１つの一次ＨＣＶ感染した献物を含む１０、５０および５００の個々のドナー由来のプールの最小負荷を検出することが可能であった(２.２×１０４コピー／ml)。同様に、１０の個々のドナー由来の血漿プール中、たった１つの献物における１×１０３または５×１０２コピー／mlという、各々のウイルス汚染の検出の感度を増大させることが可能であった。
【０１２７】
次に大きいプールサイズでのウイルスゲノムの検出を改良するために、１００倍の初期体積の、実施例４.１.で使用した試料３および４を、さらなる実験において濃縮し、１／１００の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲに使用した。ＰＣＲ評価の結果を表６.３.に要約する。
【０１２８】
血漿試料を１００倍濃縮することにより、たった１つの献物中の１×１０３および５×１０２コピー／mlのウイルスＨＣＶゲノム汚染をさらに、１００の個々のドナー由来の血漿プール中で検出することができた。
【表６−２】
【表６−３】
【０１２９】
実施例 ５：
５.１. ＨＢＶ−ＤＮＡに関する様々なサイズの血漿プールの試験
１０、５０、１００、５００、１,０００および２,０００のＨＢＶ 血清(−)の健康な個々のドナーの血漿試料を混合して、試料プールとした。そのプールを、実施例１でのように測定された１.３×１０８コピー／ml(試料 １)という高い汚染を有する、一次ＨＢＶ感染したドナー由来の血漿試料と、実施例１でのように測定された１.４×１０４コピー／ml(試料 ２)という最小汚染で一次感染したドナー由来の血漿と、また対象として、５×１０３コピー／ml(試料 ３)、および１×１０３コピー／ml(試料 ４)であるＨＢＶの規定された製剤と混合した。各々のプールサイズに関する、定量可能なコピー数／mlを、ＰＣＲによって測定した。ＰＣＲ評価の結果を表７.１.に要約する。
表７.１.は、高いゲノム汚染を有する、一次ＨＢＶ感染した献物でのウイルス汚染を、１０、５０、１００、５００、１,０００および２,０００個の献物からなる血漿試料プール中で検出することができることを示す。５００、１,０００および２,０００の個々のドナー由来のプールでは、たった１つの、最小限度に汚染された献物(１.４×１０４コピー／ml)により引き起こされるＨＢＶ−ＤＮＡはもはや、検出することができなかった。ＨＢＶゲノム当量の検出は、１０および５０までのドナー由来のプール中、たった１つの献物における５×１０３コピー／mlの汚染で、また１０までのドナー由来のプール中、たった１つの献物における１×１０３コピー／mlの汚染で可能であった。
【表７−１】
【０１３０】
５.２. 試料を濃縮することによる感度の増大
ＨＢＶ−ＤＮＡのコピーを検出することができなかったプールサイズでの感度を増大させるために、プールした血漿の１０倍濃縮した試料をＰＣＲに使用した。この目的のために、実施例５.１.で使用した、試料２、３および４の個々の血漿プールの各々の場合における試料体積の１０倍体積を遠心分離により濃縮し、１／１０の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲに使用した。ＰＣＲ評価の結果を表７.２.に要約する。
ＰＣＲの初期試料体積を１０倍濃縮することにより、１.４×１０４コピー／mlという、１つの一次ＨＢＶ感染した献物を含む５００の個々のドナー由来のプールの最小負荷を検出することが可能であった。同様に、１００および５００の個々のドナー由来の血漿プール中、たった１つの献物に由来する５×１０３コピー／mlのウイルス汚染を、また５０および１００の個々のドナー由来の血漿プール中、たった１つの献物に由来する１×１０３コピー／mlの汚染を検出する感度を増大させることが可能であった。
次に大きいプールサイズでのウイルスゲノムの検出を改良するために、１００倍の初期体積の、実施例５.１.で使用した試料３および４を、さらなる実験において濃縮し、１／１００の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲに使用した(表７.３.)。
【０１３１】
結果：
血漿試料を１００倍濃縮することにより、たった１つの献物中の１×１０３コピー／mlのウイルスＨＩＶゲノム汚染をさらに、５００および１,０００の個々のドナー由来の血漿プール中で検出することができた。
【表７−２】
【表７−３】
【０１３２】
実施例 ６：
ＨＩＶおよびＨＣＶ ＲＮＡに関する様々なサイズの血漿プールの試験
１０、５０、１００、５００、１,０００および２,０００のＨＩＶ 血清(−)およびＨＣＶ 血清(−)の健康な個々のドナー由来の血漿試料を混合して、血漿試料プールとした。各々の個々のプールサイズを、実施例２.１.および２.２.でのように測定された２.３×１０７コピー／mlという高いＨＩＶ負荷、および１.６×１０６コピー／ml(試料 １)というＨＣＶ負荷、並びに実施例２.１.および２.２.でのように測定された２.８×１０５コピー／mlという最小ＨＩＶ負荷、および２.２×１０４コピー／ml(試料 ２)というＨＣＶ負荷を有する、一次ＨＩＶ感染したドナー由来の血漿試料、および一次ＨＣＶ感染したドナー由来の血漿試料、また対照として、１×１０４コピー／mlであるＨＩＶ、および１×１０３コピー／ml(試料 ３)であるＨＣＶの規定された製剤、並びに１×１０３コピー／mlであるＨＩＶ、および２×１０２コピー／ml(試料 ４)であるＨＣＶの製剤と混合した。ＨＩＶおよびＨＣＶに特異的な核酸の存在に関して、各々のプールサイズを、ＨＩＶおよびＨＣＶに特異的なプライマーを用いてのＬＩＦ−ＰＣＲによって試験した。１,０００の個々のドナー由来のプールサイズまでの、たった１つの献物による２.３×１０７ ＨＩＶコピー／mlおよび１.６×１０６ ＨＣＶコピー／mlという最大汚染を伴う汚染で、ＨＩＶに特異的なゲノム配列およびＨＣＶに特異的なゲノム配列を検出することが可能であった。ＨＩＶゲノム当量はさらに、僅かに汚染された献物で汚染された５００個の献物のプール中で見出されたが、ＨＣＶゲノム当量は、５０の個々のドナー由来のプール中でしか見出すことはできなかった。従って、試験したプール中でのＨＣＶゲノム配列の検出に対する感度は、ＨＩＶゲノム配列に対する感度より対数減衰的に(log step)低い。
【０１３３】
７．プール中のＨＡＶウイルス汚染に対する、ＨＡＶ免疫化献物の中和効果の検出
ＨＡＶ免疫化ドナー由来の献血漿の中和能力は、インビトロにおける中和試験により示すことができる。
血漿中に存在するＡ型肝炎ウイルスに対するＨＡＶ抗体の中和効果を検出するために、防御免疫を有する１００の予め免疫化されたＨＡＶドナー由来の血漿プールを試験して、そのプールをＨＡＶ(タイター １０６．４ＴＣＩＤ５０／ml)と混合した。３７℃で１時間インキュベーションした後、ＨＡＶタイターを測定した。血漿プール中に存在するＨＡＶ抗体により、ＨＡＶ感染力を対数減衰的に＞４.６まで減少させることができた。このことは、免疫されたドナー由来の血漿中に存在する防御抗体が、より大きな血漿プール中でのウイルス汚染を中和することができることを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１以上の血漿誘導体を活性物質または不活性成分として含む薬物に関し、またそのような薬物の製造のための品質保証された出発原料に関し、さらにはまた、これらの薬物を製造するための方法に関する。本発明はまた、品質保証された出発原料、特に品質保証された血漿プールの製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血漿は、特に先天的または後天的な血漿成分の欠乏の場合における代替療法に対する、医薬品製剤として、または血漿誘導体の製造のための出発原料として特に優れた臨床的重要性を有するものである。しかし、ヒト血漿を使用する場合、医薬品製剤によって、または血漿誘導体によって運搬され得る、感染物質が含まれていないことに注意しなければならない。恐らく血中に存在し得るであろう感染物質には、とりわけ、ＨＩウイルスまたは肝炎ウイルス(Ａ型、Ｂ型、Ｃ型または非Ａ非Ｂ型肝炎)といったような、血液によって運搬され得るウイルス(血液原ウイルス)が含まれるが、血液により伝達され得るパルボウイルスもまた含まれる。
【０００３】
血漿誘導体を含む薬物が非常に必要であることから、これらの薬物の経済的な製造は、工業規模でのみ可能である。
【０００４】
血漿をドナーから得て、医薬品製剤の製造のためにプールする。従来のプールサイズは、約２,０００〜６,０００個の献血漿(plasma donations)である。たった１つの、ウイルスで汚染された献血漿により、血漿プール全体が汚染される危険がある。
【０００５】
２０世紀前半の後期という早い時期に、ヒトアルブミンが加熱により首尾よくウイルス不含有製剤とされた。このことは最初、それらの熱感度から、血漿から得ることができる他の薬物全てに対して不可能であった。今までのところ、適切に製造されたアルブミンが何百万という場合において使用されている；それにもかかわらず、ヒト血液が有するウイルスが原因となる感染はいまだかつてなかった。対照的に、ウイルス感染、特に肝炎ウイルスによるウイルス感染、また１９８０年代以来、ＡＩＤＳウイルスによる大規模なウイルス感染もまた、血漿から製造された多くの他の薬物に関して報告されている。
【０００６】
１９８０年ごろ、ウイルス汚染物質を不活性化する目的で、適切に安定化された第VIII因子濃縮物に対して加熱処理が初めて行われた。しかし、最初に、第VIII因子活性の多大な損失が認めざるを得ず、実際の不活性化の可能性は未知のままであった。
【０００７】
加熱処理方法を改良することにより、また他の新たな不活性化方法によって、最終的には、血漿から薬物を製造することが可能となり、これは大抵の場合、レシピエントにおけるウイルス感染をもたらさなかった。この開発に付随して、ウイルス血症の疑いがあり、従って、血漿がウイルスを含む疑いのあるドナーおよび献物(donations)を排除することを目的とした、ドナーおよび献物の選択における改良もまたあった。
【０００８】
今しばらくの間、陽性の結果を与える献物を排除しようと、また血液製剤の製造のための出発原料として使用すべき、より大きな血漿プールに、それらを取り入れまいと、血中の幾つかのウイルス抗原または抗体の検出が利用されている。疾患の症状またはあらゆる検査での異常検査結果を有していないが、それにもかかわらず、彼らの血中には幾つかのウイルスが長期間にわたり高濃度でも匿われている個々のドナーの場合、ある特定のウイルスによる、そのようなウイルス血症の発生は現在、増幅方法の助けをもって、はっきりと検出することができる。
【０００９】
血漿ユニットをプールした後、ウイルスで汚染された、たった１つの献血漿は、当然ながら希釈される；しかし、増幅反応の助けによるウイルスゲノム配列の検出は非常に鋭敏なので、そのような希釈物中においてすら、ウイルスゲノムまたはそれらの配列をはっきりと検出することができる；また上述のように、それらが一定の検出限界以下に落ち込むなら、感染の可能性という意味では、それらには、もはや臨床的関連はない。
Ｔhe ＥＥＣ Ｒegulatory Ｄocument Ｎote for Ｇuidance，Ｇuidelines for Ｍedicinal Ｐroducts Ｄerived from Ｈuman Ｂlood and Ｐlasma(Ｂiologicals １９９２、２０：１５９−１６４)は、血漿ドナーおよび献血漿を調べるための品質保証システムを提唱している。従って、各々の献血漿を、Ｂ型肝炎抗原またはＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２抗体といったようなウイルスマーカーの不在に関する確認試験で分析しなければならないが、これは、これらが血漿ドナーの対応するウイルス感染を示すからである。Ｃ型肝炎の感染を排除するための試験もまた行うべきである。
【００１０】
欧州薬局方に従って、Ｂ型肝炎表面抗原およびＣ型肝炎ウイルスおよびＨＩＶ抗体を測定するために、特別な試験を各々の献物に対して行うべきである(欧州薬局方、第２版、第II部、１９９４年、８５３〜８５４頁)。
【００１１】
１９９５年３月１４日付のＦＤＡガイドラインは、付加的安全因子としての最終産物(免疫グロブリン産物)のＰＣＲ試験を提供している。
【００１２】
提唱された試験にもかかわらず、これらのウイルスマーカーを単に調べるだけでは、個々の献血漿の安全性は十分に保証されないことがＥＥＣガイドラインにおいて力説されている。血漿試料中での該マーカーの不在が確認されたとしても、ドナーのウイルス血症を排除することはできない。ウイルス抗原および対応する抗体は、感染後すぐには検出することができないので、ウイルス感染の最初のマーカーは、感染源と接触してから数週間または数カ月後にしか発生しないことが多い。感染後および抗体発生前の、この重要な期間は、通例、「ウィンドウ期間(window period)」と呼ばれている。しかし、感染後、最初のウイルスマーカーを検出することができる時間ポイントは、ウイルスによって様々である。
【００１３】
さらに、血漿から製造される幾つかの薬物に関して、ウイルスを製造過程の途中で消失させる、または不活性化すること、またそのような製品自体が非常にウイルスに関して安全であることもまた知られるに至っている。
【００１４】
血漿誘導体のウイルス不活性化は、工業的規模で非常に上手く行われているが、それにもかかわらず、ＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルスといったような血液原ウイルスが稀に伝達されていることから、製造業者は、一定の製造方法を利用しているにもかかわらず、ウイルスで汚染された製品のバッチが幾つか生じたと仮定しなければならなかった(Ｌancet ３４０、３０５〜３０６（１９９２）；ＭＭＷＲ ４３（２８）、５０５〜５０９（１９９４）、Ｔhromb.Ｈaemost. ６８、７８１（１９９２）)。このことは恐らく、幾つかの出発バッチの過度の汚染から起こった。血漿を回収する間に、ウイルスで汚染された献血漿を排除するのには、間接法が利用できるだけであることから、出発原料は非常にひどく汚染されているので、他の上手く利用されるウイルス不活性化およびウイルス消失方法が、もはやウイルスに関して安全な最終産物を製造するには十分でないということが起こり得る。
【００１５】
ＨＩＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶに関するヒト感染用量は知られておらず、また今のところ測定することはできない。従って、組織培養における感染用量(ＴＣＩＤ５０：組織培養感染用量)または動物モデルにおける感染用量(ＣＩＤ５０：チンパンジー感染用量)の測定では、概算のヒト感染用量しか得られない。さらに、幾つかの場合、人々は、それらにさらされているにもかかわらず、ＨＩＶ、ＨＣＶまたはＨＢＶで感染されない。従って、そのようなウイルスのヒト感染用量は、必ずしも感染するとは限らない。
【００１６】
Ｐiatakら(Ｓcience １９９３、２５９：１７４９−１７５４)は、ＨＩＶのＴＣＩＤ５０が、１ ＴＣＩＤ５０／ＨＩＶ ＲＮＡの１０４コピーであることを測定した。Ｓhimizu,Ｙ.Ｋ.ら(ＰＮＡＳ.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ １９９３、９０：６０３７−６０４１)は、ＨＣＶ株のＣＩＤ５０が、１ ＣＩＤ５０／ＲＮＡの１コピーであることを測定した。
【００１７】
Ｅderら(Ｔhe Ｒole of the Ｃhimpanzee in Ｒesearch、Ｓymp.Ｖienna １９９２、１５６〜１６５)は、ＨＢＶ ＤＮＡの２０コピー／血漿のmlがＣＩＤ５０ １に対応することを示すことができた。
【００１８】
血漿プールまたは他の血漿出発原料の場合、ウイルス負荷(ウイルス汚染)は出来るだけ低く、必要ならば、付加的ウイルス不活性化工程により、またはウイルスを消失させる方法により、ウイルス汚染を少なくとも感染用量以下まで低下させることができるように注意することが特に必要である。出発原料のウイルス汚染は、ウイルス核酸のコピー数が既にチンパンジーの感染用量以下程度であるのが望ましいであろう。
【００１９】
【非特許文献１】Ｔhe ＥＥＣ Ｒegulatory Ｄocument Ｎote for Ｇuidance，Ｇuidelines for Ｍedicinal Ｐroducts Ｄerived from Ｈuman Ｂlood and Ｐlasma(Ｂiologicals １９９２、２０：１５９−１６４
【非特許文献２】Ｐiatakら、Ｓcience １９９３、２５９：１７４９−１７５４
【非特許文献３】Ｓhimizu,Ｙ.Ｋ.ら、ＰＮＡＳ.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ １９９３、９０：６０３７−６０４１
【非特許文献４】Ｅderら、Ｔhe Ｒole of the Ｃhimpanzee in Ｒesearch、Ｓymp.Ｖienna １９９２、１５６〜１６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、幾つかの出発バッチの過度の汚染から起こる、複製可能な血液原ウイルスでのウイルス汚染の危険がもはや全くない、１以上の血漿誘導体を含む薬物を提供することである。
【００２１】
さらに具体的な目的は、ウイルス負荷が指定された最大値を越えてはならない、品質保証された出発原料または中間体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明により、この目的は、出発原料または血漿誘導体の製造中に生ずる中間体がウイルスにより汚染されておらず、または１つまたはそれ以上の複製可能な血液原ウイルスの負荷が規定された限界値を越えていない、１以上の血漿誘導体を活性物質または補助成分として含む薬物により成し遂げられ、
− 幾つかの複製可能な血液原ウイルスのウイルス負荷の不在を、出発原料もしくは中間体中の過剰のウイルス中和抗体により、または献血漿時の血漿ドナーの防御免疫により測定し、
− あるいは、出発原料もしくは中間体中の問題の各々のウイルスのゲノム当量(equivalents)を、核酸の検出または測定のための、定量可能な、制御された、非阻害的方法により測定し、最終血漿誘導体の製造のための、品質保証された出発原料または中間体を、少なくとも１つの実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかけて、得られた品質保証された最終血漿誘導体を既知の方法により後処理して、薬物とする。
【００２３】
該目的の達成は、出発原料中に存在する汚染またはウイルス負荷の程度の測定を含んでなり、このウイルス負荷をもはや、ウイルスを不活性化する、または消失させる方法により排除することができない。従って、出発原料中のウイルス汚染の可能性を測定し、こういった高度の汚染が実在する限り、それらの出発原料をさらに処理しないことにより、すなわち、それらを処理から排除することにより、その問題を解決する。
【００２４】
この目的のために、ウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかけるべきである、各血漿由来の出発原料、およびあるいは血漿誘導体の製造で生ずる中間体を、並びに最終血漿誘導体を、血液血漿から製造された薬物がもはや、時々ですらなくも、複製可能な血液原ウイルスを伝達することができないということを確かな方法で確実なものとする方法で試験して処理すべきである。そのようにする際は、可能なウイルス負荷の上限を測定するために、出発原料を、選択された増幅技術の利用により試験し、血液原ウイルスの伝達を起こさないであろう薬物とするために、この出発原料または中間体をさらに、少なくとも１つの実質的なウイルス不活性化またはウイルス消失工程にかけるであろう。
【００２５】
本発明により、ゲノム当量の測定の間に検出されるべき標的核酸は、血液中、血漿中、血清中、または血漿画分中での様々な増幅方法により増幅することができる。しかし、好ましくは、ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)または特殊型のＰＣＲを、各々、検出または測定方法として使用する。特定のウイルスゲノム配列の検出の場合には、増幅方法が、増幅すべき核酸配列に対して選択的でなければならない。本発明の血漿プール中の核酸の増幅は、文献に記載されている一連の増幅方法により達成することができる。
【００２６】
特定のウイルスゲノム配列の増幅は、それらを複製して、それらを検出可能とするために、個々のゲノム、さらに非常に様々なウイルスのゲノムに関する知識を必要とする。
【００２７】
核酸の様々な増幅方法は、ＰＣＲに基づいている。ＰＣＲ増幅方法は、Ｍullisら(米国特許第４,６８３,１９５号および同第４,６８３,２０２号)に初めて記載された。ウイルスゲノム配列はまた、「ネステッド(nested) ＰＣＲ」(Ｍullisら、Ｍethods Ｅnzymol. １９８７、１５５：３３５−３５０)またはＲＴ−ＰＣＲ(Ｐowell,Ｌ.Ｍ.ら、Ｃell １９８７、５０：８３１−８４０；Ｋawasakiら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ １９８８、８５：５６９８−５７０２)によっても増幅することができる。
【００２８】
ＲＮＡの増幅および検出では、まず最初に、ＲＮＡをＤＮＡに転写しなければならない。この方法は、いわゆるＲＴ−ＰＣＲとして、ＷＯ ９１／０９９４４に記載されており、また逆転写酵素の使用を必要とする。
【００２９】
次いで、伸長工程において、また後のハイブリダイジングまたはその産物のゲル電気泳動による分離において、標識化ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより、その増幅産物を分析することができる。
【００３０】
ＰＣＲに対する他の方法もまた記載されている。
【００３１】
核酸を増幅するための、これらの方法の１つは、欧州特許第０ ３２０ ３０８号、並びに欧州特許第０ ３３６ ７３１号、並びにＷuおよびＷallace(Ｇenomics １９８９、４：５６０〜５９６)による、ＬＣＲ(リガーゼ鎖反応)である。
他の酵素的方法は、欧州特許第０ ３１０ ２２９号、およびＧuatelli,Ｊ.Ｃ.ら(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ １９９０、８７：１８７４〜１８７８)による、ＮＡＳＢＡ(核酸配列に基づく増幅)、３ＳＲ(自己支持配列複製)、または欧州特許第０ ３７３ ９６０号、およびＫwoh,Ｄ.Ｙ.ら(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ １９８９、８６：１１７３〜１１７７)によるＴＡＳ(転写に基づく増幅システム)である。これらの方法では、増幅において、例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼといったような一連の酵素を同時に、または段階的に使用する。
【００３２】
他の増幅方法は、欧州特許第０ ３６１ ９８３号、およびＬizardiら(ＴＩＢＴＥＣＨ １９９１、９：５３〜５８)による、ＲＮＡバクテリオファージ Ｑβのレプリカーゼの使用に基づく。
【００３３】
Ｕrdea,Ｍ.Ｓ.ら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.Ｓymp.Ｓer. ２４ Ｏxford １９９１、Ｐachl,Ｃ.Ａ.ら、XXXII Ｉnterscience Ｃonference on Ａntimicrobial Ａgents and Ｃhemotherapy．Ａnaheim、１９９２年１０月(アブストラクト １２４７)により、さらなる方法は、抽出される核酸に代わって、分枝鎖状ＤＮＡオリゴヌクレオチドによるシグナル増幅(分枝鎖状ＤＮＡシグナル増幅)を記載している。
欧州特許第０ ５９０ ３２７ Ａ２号は、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、またはＢ型肝炎ウイルスのウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの測定を提供する、血液試料の分析方法を開示している。Ｂ型肝炎ウイルスゲノムを測定するための試験に対する検出限界は、その評価を、ゲルを染色した後で電気泳動により行うなら、１,５００コピー(１５０,０００コピー／ml)である。血液試料は一部が、血液の乾燥スポットである。分析後、試料のさらなる処理のための準備はしない。
【００３４】
幾つかのウイルスに対する高度免疫グロブリン製剤を製造するための方法は、能動的に免疫されているドナー、または既に疾患を克服していることから、防御免疫を示すドナーに由来する血液および血漿から出発する。病原性ウイルスに対して予防接種されている血漿ドナーの血液は、対応する抗体タイターを含む。ＨＩＶ抗体のような、ウイルス血症を示す抗体とは対照的に、これらの抗体が望ましい。
【００３５】
従って、本発明の薬物を製造するために使用する、品質保証された出発原料または中間体は、問題のウイルスに対するウイルス中和抗体を過剰に含むか、または存在する可能性のある複製可能な血液原ウイルスのゲノムもしくはゲノムフラグメントを検出不可能な量で、もしくは限界値以下の量で含む。
【００３６】
血漿誘導体は、薬物中、活性物質として、または補助成分としてもまた含まれ得る。活性物質には、例えば、凝固因子、免疫グロブリン、繊維素溶解因子、酵素阻害剤または血漿中に存在する他の酵素もしくはチモーゲンもしくはそれらの混合物が含まれる。補助成分には、アルブミンまたは他の安定剤、様々な阻害剤、補因子等が含まれる。
原則的には、血漿プール、クリオプアー(cryopoor)血漿、またはＣohn II ＋ III ペーストといったような、ある特定の製造方法を開始する物質を全て、出発原料としてみなすべきである。一連の可能な出発原料は、Ｈeideら(「Ｔhe Ｐlasma Ｐroteins」中の「Ｐlasma Ｐrotein Ｆractionation」、Ｆrank Ｗ.Ｐutnam編、Ａcademic Ｐress Ｎew Ｙork、Ｓan Ｆrancisco、Ｌondon １９７７、５４５〜５９７頁）による論文で引用されている。
【００３７】
中間体は、与えられた製造工程により得られている、ある特定の製造方法で出発原料から誘導される産物、例えば、出発原料として血漿またはクリオプアー血漿を用いての第IX因子の製造におけるプロトロンビン複合体である。
【００３８】
慣例の製造方法で薬物に後処理される最終血漿誘導体は、該製品に特異的な製造方法により、場合によっては中間体を経て、出発原料から製造される。勿論、この後処理の間に、２つまたはそれ以上の最終血漿誘導体を一緒に合わせることができる。
【００３９】
好ましくは、ＨＩＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ、また特にＨＩＶおよびＨＣＶよりなる群から選択される、少なくとも２つのウイルスに関して、ウイルス汚染が存在しないか、または規定された限界値を越えないウイルス汚染が存在することが好ましい。
【００４０】
さらに、本発明は、上述のウイルスに限定されない；むしろ、存在しないか、または規定された限界値を越えないウイルス汚染を、血液により、または血液から得られた産物により伝達され得、またヒトにとって危険の高いウイルスであることが判明している、あらゆる血液原ウイルス、例えば、パルボウイルス、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに関して、および新たに発見されたウイルスに関して測定することができる。好ましくは、これらのウイルスの薬物中での存在が患者に危険を示すならば、存在しないか、または規定された限界値を越えないウイルス汚染を、血液原ウイルス全てに関して測定するであろう。
【００４１】
いずれの場合でも、この値を越えてはならないという、複製可能な血液原ウイルスによる許容可能な汚染の限界値は、主として、検出反応の能力に、また出発原料および中間体を評価するのに適当な手段に依存する。例えば、検出限界は、検出反応に使用される試料の体積に依存する。例えば、ウイルスゲノム当量を、たった１つの献物の試料２０μl中で検出することができず、また使用する検出方法が、たった１つのゲノム当量を試料中で検出することが可能なら、個々の献物の最大汚染は、血漿１ml当たり５０ ゲノム当量より少ないと結論することができる。陰性の検出結果を得て、さらに試料２０μlを試験して、再びウイルスゲノム当量が検出されないなら、その単一の献物の最大負荷は、血漿１ml当たり２５ ゲノム当量より少ないと結論することができる。
【００４２】
出発原料または中間体１ml当たり、最大値 ５００ ゲノム当量、特に最大値 ２００ ゲノム当量、好ましくは最大値 １００ ゲノム当量、またとりわけ最大値 ５０ ゲノム当量は、複製可能な血液原ウイルスによる許容可能な汚染に関する実際的な限界値であることが証明されている。
【００４３】
本発明の好ましい保証された出発原料または中間体の場合には、少なくとも４つのリダクション(reduction)因子を与える、少なくとも１つの方法により成し遂げられるウイルス不活性化またはウイルス消失が、品質保証された、この出発原料または中間体起源の薬物の製造において成し遂げられる。
【００４４】
本発明の血漿タンパク質含有薬物は、出発原料となる血漿タンパク質の、１つまたはそれ以上の複製可能な血液原ウイルスによる、確かめられた、限定された汚染を基にして、ウイルスを不活性化する、または消失させるためのタンパク質保存方法が、血漿タンパク質をウイルスに安全な形で得るのに十分であるという利点を有する。好ましくは、存在する可能性のある複製可能な血液原ウイルスのウイルス負荷をいずれも不活性化する、または排除するために、４つ未満のリダクション因子を有するタンパク質保存方法を行う。あるタンパク質保存方法は、血漿タンパク質の活性および完全性を出来る限り最も広い範囲で維持することが可能である。回収されるべきタンパク質の(特異的)活性を５０％またはそれ以上、また好ましくは８０％またはそれ以上維持する、ある方法は、タンパク質保存性と見なされる。本発明の薬物の製造方法中での、たった１つのウイルス活性化またはウイルス消失は、存在する可能性のあるウイルスをいずれも完全に不活性化する、または排除するのに十分である。
【００４５】
血漿誘導体または薬物の製造に使用され、また試験ウイルスが加えられている出発原料または中間体の場合には、与えられたウイルス不活性化工程に先立つウイルス消失により、ウイルス負荷を大いに減少させることができることが示されている(例えば、ＥＰ−Ａ−０ ５０６ ６５１)。該消失は、ナノ(nano)濾過、沈降反応、透析、遠心分離、クロマトグラフ精製工程等といったような、既知の方法により行うことができる。ウイルスを不活性化するために、一連の物理的、化学的、または化学的／物理的方法が知られており、これらは、例えば、ＥＰ−Ａ−１５９ ３１１またはＥＰ−Ａ−０ ６３７ ４５１でのような加熱処理、ＥＰ−Ａ−０ ２４７ ９９８による加水分解酵素処理、例えば、ＥＰ−Ａ−０ １３１ ７４０でのような放射線処理または有機溶媒および／または界面活性剤での処理を含んでなる。血漿画分および薬物を製造する間の、さらに適当なウイルス不活性化工程は、ＥＰ−Ａ−０ ５０６ ６５１またはＷＯ ９４／１３３２９に記載されている。様々な不活性化方法が、Ｅur.Ｊ.Ｅpidermal. ３（１９８７）、１０３−１１８において分析されている；そのリダクション因子は、ＥＣ委員会(Ｃommission)のＥＣIII／８ １１５／８９−ＥＮ ガイドラインにおいて扱われている。
【００４６】
本発明の方法により、プールした出発原料、特に血漿プール、または中間体を各々、群を抜いて安全性の増加した品質とすることが可能である。
【００４７】
好ましくは、例えば、適当な予防接種により、１つまたは幾つかのウイルスに対して、能動的に免疫されているか、または免疫性であることから、防御免疫を示す血漿ドナーを、本発明の品質保証された血漿プールの製造のために選択する。血漿ドナーは、肝炎ウイルスに対して、特にＡ型肝炎ウイルスに対して、対応する血漿の感染の可能性を排除するために予防接種されているのが好ましい。
【００４８】
血漿が出発原料であるなら、本発明による品質保証の好ましい態様は、
− ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、パルボウイルスおよびＨＡＶ群の全てのウイルスのゲノム当量を測定する、
− ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびパルボウイルス群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰のＨＡＶ抗体を測定する、
− ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰のＨＡＶおよびパルボウイルス抗体を測定する、
− ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰のＨＡＶ抗体を測定する、
− ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰のパルボウイルス抗体を測定する、
− ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量を測定する、
− ＨＩＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量を測定する、
− ＨＩＶおよびＨＣＶ群の全てのウイルスのゲノム当量、さらにはまた過剰のＨＢＶ抗体を測定する
ということにある。
【００４９】
本発明の品質保証された血漿プールは、例えば、Ａ型肝炎およびＢ型肝炎ウイルスに対して予防接種されており、それ故、抗感染免疫性により、血中に抗体タイターを有し得る血漿ドナーを選択することによっても得ることができる。これらの抗体は、能動免疫化により形成されており、それ故、ウイルス血症を示すものではない。対応するウイルス血症を示すマーカーの不在に関して、献血漿を個々に試験する。この目的のために、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス抗体、また場合により、ＨＩＶ抗体を測定するための試験を、有効とされるＥＬＩＳＡ試験システムの助けをもって行う。ＡＬＴおよびＧＰＤ値といったような、幾つかの肝臓値もまた、Ｃ型肝炎ウイルスのマーカーである。ドナー血漿中のウイルスマーカーの不在を確かめるのなら、個々の献血漿の血漿プール中のＡＩＤＳウイルス(ＨＩＶ−１)、また場合により、Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムまたはゲノムフラグメントの不在の証拠を、さらなる選択基準として用意する。この献血漿が、ウイルス感染を示す、ＨＩＶに対する抗体を何ら含まないという確認にもかかわらず、この方法が推奨される。ＨＩＶウイルスで感染させてから、対応する抗体が検出可能となるまでの時間は、とりわけ、これらのウイルスの場合には、数カ月であり得る。従って、ＨＩＶ抗体の不在に関してのみ試験した血漿プールを、複製可能な感染ウイルスを何ら含まない、またはそれらを規定された限界値以下で含む、制御された血漿プールとして利用可能とすることはできない。
【００５０】
複製可能な血液原ウイルスによる限定された汚染を確かめるための本発明の方法の１つは、核酸を検出する、または測定する、定量可能な、制御された、および非阻害的方法は別として、本発明の血漿プール中のウイルス中和抗体の検出を含んでなる。例えば、適当な酵素免疫試験のような、有効とされる試験システムもまた、抗体タイターを測定するのに使用すべきである。該方法に使用される試料は、場合により、凍結乾燥した後、再構築することができる。
【００５１】
血漿プールの他に、低温型沈降物または他の初期の中間体が本発明の出発原料と考えられる。初期の中間体は、薬物の製造においてヒト血漿から得られる中間体であり、これらはさらに、ウイルス消失またはウイルス不活性化にかけられるであろう。血漿プール、特に、同様に保証された少量のものを、より多量なものに合わせる可能性に関して本明細書中で述べられていることはまた、−可能である限り−本発明により、他の出発原料にも適用される。従って、同じ種類の、品質保証された出発原料または中間体を、各々、品質保証された出発原料または中間体の、より大きなプールへと混合することを、本発明により提供する。
【００５２】
出発原料または中間体に対する、そのような高い品質基準は、まだ満たされていない。一方では、ウイルスで汚染された血漿プールにより引き起こされるウイルス血症を完全に排除することが必要であるとは考えられていない。血漿プールは、主として、血漿誘導体の製造、すなわち、血漿タンパク質に基づいた医薬品製剤の製造に使用される。しかし、この製造では、存在する可能性のあるウイルスを不活性化する、および／または消失させるための付加的方法を行わなければならず、このことは、最終生成物による病原性ウイルスの伝達の危険を倍数的に減少させるので、先行技術により指示された通常のアッセイが適しているとみなされる。
【００５３】
本発明により、過剰のウイルス中和抗体、または確かめられた、限定された負荷のウイルスゲノム配列を示す、それらの出発原料または中間体のみを、生成物のさらなる後処理に使用する。それにもかかわらず、核酸増幅方法で測定されるゲノム当量の量は、複製可能なウイルスによる汚染の上限しか与えないことから、本発明の要件を満たさず、また本発明の範囲内の薬物への、さらなる処理には不適な出発原料を、感染性として証明できるように記載することはできない。従って、測定されるゲノム当量の量は、全てのゲノム当量が活性なウイルスに由来する場合にのみ、複製可能なウイルスの負荷の「真の値」を与える。
【００５４】
本発明により保証された幾つかの出発原料から、混合することにより、より多量のものを得ることができるが、これは、同じ安全基準に従う。
【００５５】
血漿プールの場合、後者を、約２〜約２０個の献血漿からなる小さなプールとして与えるのがよい。少なくとも１０の小さなプールを合わせて、約２０〜２００、また好ましくは約２００個の献血漿からなるミニプールとすることができる。大きさの次のオーダーは、約２００〜２,０００、また好ましくは約２,０００個の献血漿からなるマクロプールであり、これは、場合により、少なくとも１０のミニプール単位で混合することにより製造される。幾つかのマクロプールを合わせて、２００,０００個までの献血漿からなるマルチマクロプールとすることができる。
【００５６】
本発明により、ウイルスゲノムまたはゲノムフラグメントに関する証拠を、これらのプールサイズ各々に用意することができる。小さなプールを試験した後、調べた小さなプールを合わせて、より大きなプール、例えば、ミニプールとすることにより、かつて記載されたことのない品質が、より大きなプールでも得られる。
【００５７】
従って、本発明の特別の態様は、好ましくは約２００個の献血漿からなるミニプールを混合して、好ましくは約２,０００個の献血漿からなるマクロプールとすることにより得られる血漿プールにある。
【００５８】
さらに好ましい態様は、マクロプールを、いずれかの所望の数の他のマクロプールと混合することにより合わせて、２００,０００個までの献物からなるマルチマクロプールとすることを特徴とする、血漿プールからなる。
【００５９】
また別の好ましい態様は、そのミニプールが、２〜約２０個の献物からなる小さなプールを混合することにより得られる、血漿プールにある。
【００６０】
血漿画分または最終血漿誘導体を各々製造するための、および薬物を製造するための、血液血漿の分画に対する出発原料を選択する際には、経済的な理由から、比較的多量のものが好まれるべきである。しかし、今までは、ウイルスゲノムまたはゲノムフラグメントの検出により、ウイルスで汚染されていないとみなすことができたマクロプールの、またはマルチマクロプールの大きさの血漿プールを利用することができなかった。２,０００個以上の献血漿を一緒に混合することから生ずる希釈効果が大きすぎ、また検出すべきゲノムの数が試験方法の検出限界より小さいことが非常に多いことから、マルチマクロプールのみに関しての証拠を用意するには十分ではない。小さなサブユニットを試験した後、合わせて、より大きなユニットとすることにより、こういった検出能力の問題を克服し、また経済的に重要な量が得られる。
【００６１】
本発明の品質保証された出発原料は、血漿タンパク質を中間体として含む画分の製造に、または最終薬物の製造に、群を抜いて適当である。
【００６２】
出発原料、特に血漿プールに与えられた方法は、勿論、全ての種類の血漿画分に対して同様に利用することができる。従って、さらなる態様により、本発明はまた、品質保証された最終血漿誘導体にも関し、この血漿誘導体の複製可能な血液原ウイルスによる汚染は、品質保証された出発原料の使用によって安全に限定される。
【００６３】
さらに、本発明は、勿論、本発明により品質保証された出発原料からの、または本発明により品質保証された１つまたは幾つかの中間体からの製造方法により得られる最終的な血漿誘導体にも関する。
【００６４】
本発明により製造される最終血漿誘導体から医薬的調合によって製造される薬物もまた、本発明に含まれる。
【００６５】
さらに、本発明は、品質保証された出発原料からの、または血漿誘導体の製造中に得られる品質保証された中間体からの、１以上の血漿誘導体を含む薬物の製造方法に関し、その品質保証された出発原料または中間体は、１つまたはそれ以上の複製可能な血液原ウイルスで汚染されていないか、または規定された限界値を越えない量で汚染されており、またその規定された限界値は、１つまたはそれ以上の、以下の基準による核酸の検出または測定のための、定量可能な、制御された、および非阻害的方法により、各々のウイルスのゲノム当量を測定する場合において選択される：
【００６６】
− 少なくとも１０,０００コピーの選択された核酸配列の核酸増幅方法の検出限界；
− 出発原料または中間体１ml当り、ある一定数のゲノム当量、特に５００以下のゲノム当量、好ましくは２００以下のゲノム当量、さらに好ましくは１００以下のゲノム当量、またとりわけ好ましくは５０以下のゲノム当量。
【００６７】
本発明により、限界値に関する他の許容可能な選択基準は：
− 細胞培養試験によって測定される限界値、好ましくは、１ml当りのあるＴＣＩＤ５０(ａ ＴＣＩＤ５０)、またはこの量で含まれるゲノム当量、
− 動物モデルによって測定される限界値、好ましくは、１ml当りのあるＣＩＤ５０(ａ ＣＩＤ５０)、またはこの量で含まれるゲノム当量
である。
【００６８】
これらの限界値は、それらの実用的関連(試験方法の検出能力に依存する)、およびそれらの生物学的関連(特に、ＴＣＩＤおよびＣＩＤ値)から好ましい。
【００６９】
非常に鋭敏なＰＣＲ法は、試験物質中に混入し得る非常に僅かな量の幾つかの不純物でさえもまた増幅されて、誤った陽性の結果を生じ得るという不利な点を有する。
【００７０】
本発明の方法の好ましい態様は、１つ以上の検出システムの使用により特徴付けられ、または測定を核酸に対して利用する場合、１つのシステムが誤った陽性の結果を排除して、他のシステムが誤った陰性の結果を排除するよう、その検出または測定システムを選択するのが好ましい。
【００７１】
好ましくは、少なくとも２つの異なったＰＣＲ法を利用し、少なくとも１つの方法をスクリーニングに使用して、少なくとも１つの方法を確認に使用する。
【００７２】
ＤＴＳ−ＰＣＲ(二重標的化(Ｄual Ｔargeting)サザンブロットＰＣＲ)の場合、抽出された核酸の増幅に続いて、合成された核酸をアガロースゲル電気泳動により分離した後、ジゴキシゲニン(ＤＩＧ)標識化プローブとハイブリダイゼーションさせた後、サザンブロットにかける。その評価は、バンド強度のデンシトメーター測定によって行う。配列の不均一性から、ＰＣＲプライマーとテンプレートとの間のミスプライミングにより引き起こされ得る誤った陰性の結果を排除するために、核酸抽出物を増幅して、最初のプライマー対とは異なる、さらなるプライマーを用いての第２のＰＣＲにおいて再度分析する。合成核酸を内部標準として加えることにより、ＤＴＳ−ＰＣＲを調べて、誤った陰性の結果を排除する。
【００７３】
例えば、ＤＴＳ−ＰＣＲにおいて得られた結果をさらに確かめるために、ＬＩＦ−ＰＣＲ(レーザー誘起蛍光ＰＣＲ)をさらなる方法として使用するのが好ましい。
【００７４】
非放射能標識化プライマー(好ましくは、蛍光染料で標識化されたプライマー)を使用することにより、ＰＣＲ産物をＬＩＦ−ＰＣＲにより検出することができる。しかし、増幅産物の検出はまた、伸長反応の間に、非放射能標識化ヌクレオチドアナログを、新しく合成された核酸に組み込むことにより簡易化することもできる。ＬＩＦ−ＰＣＲでは、核酸を蛍光標識化プライマーの存在下に増幅した後、その増幅産物をＰＡＧＥにより分離する。ＬＩＦ−ＰＣＲの各々の試料に関して、さらなる陰性および陽性の対照を行う。ＰＣＲ産物の検出および定量は、遺伝子スキャナーによって達成される。特に、誤った陰性の結果を排除して、陽性の結果をＬＩＦ−ＰＣＲの内部二重標準化法により確認する。
【００７５】
本発明により、陽性および陰性の対照を使用することによって、誤った陽性の結果または誤った陰性の結果を排除することができる。記載した、２つの異なったＰＣＲ法の組み合わせ、特にＤＴＳ−ＰＣＲとレーザー誘起蛍光ＰＣＲ(ＬＩＦ−ＰＣＲ)との組合せは、多数の試料を慣例の対照で試験することを可能とすることから、主として、誤った陰性の結果を排除することができ、また誤った陽性の結果を回避することができる。
【００７６】
本発明のさらなる態様は、試験試料を濃縮することに存し、それによって、より低い負荷のウイルスゲノム配列でさえも検出することができる。本発明の方法の感度は、血漿試料またはその中に含まれるゲノム当量を濃縮することによる、さらなる方法により、増大させることができ、感度を１０倍〜１００倍増大させるのが好ましい。
【００７７】
従って、本発明の方法の好ましい態様では、出発原料(例えば、個々の献血漿または試料プール)もしくは中間体起源の試料、またはその中に含まれるゲノム当量を、好ましくは凍結乾燥、吸着、または遠心分離により濃縮する。
【００７８】
本発明により、ゲノム配列を検出する、または測定するための、定量可能な、制御された、および非阻害的方法を与える方法を利用する。しかし、血漿プール中の限定された負荷の複製可能なウイルスをウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出により測定する場合、検出方法の幾つかの阻害物質が試料中に存在することが起こり得るので、非阻害増幅は、直ちには不可能である。
【００７９】
ＰＣＲ法により測定される血漿プールのウイルス汚染は、過小評価され得ることが証明されている。ＰＣＲ測定法の感度にかなり影響を与え得る因子が血漿プール中に存在することがある(Ｎucleic Ａcids Ｒesearch １６（２１）、１０３５５（１９８８）)。これらの、いわゆるＰＣＲ反応の阻害物質は、検出反応の前に、本発明の方法により除去するか、またはゲノム標準を使用することにより、検出反応の間に排除する。プール中、内部標準が適当な割合で増幅可能であり、また検出可能であるなら、そのような阻害物質の存在は排除される。
【００８０】
ヘパリンのような血漿中に存在する物質、高塩濃縮物およびポリエチレングリコールが、ＰＣＲ反応を阻害し得ることは周知である(ＢioＴechniques ９（２）、１６６（１９９０）、およびＪournal of Ｃlinical Ｍicrobiology ２９（４）、６７６−６７９（１９９１）)。
【００８１】
従って、本発明の方法の好ましい態様は、存在する可能性のある増幅の阻害物質を、個々の献血漿中、または試料プール中から除去する、または消失させることを特徴とする。
【００８２】
血液、血漿または血清中の増幅阻害物質を除去する、または中和するための、これらのさらなる方法は、例えば、試料の超遠心分離、およびその中に含まれる阻害物質を含む上清をデカントすること、および核酸の抽出、さらにはまたヘパリナーゼ、ポリアミンを用いての試料の処理、またはＨＰＬＣによる核酸の予備精製を含んでなる。核酸の無制限増幅を、より高い純度の核酸により確実なものとする。
【００８３】
該方法の好ましい変更態様により、幾つかのウイルスに特異的なプライマー対を増幅試験に使用し、その結果、幾つかの種類のウイルスの存在を同時にアッセイすることができる。特に好ましい試験では、ＨＩＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶの群から選択される、２つまたはそれ以上のウイルスがアッセイされる。
【００８４】
特に、ＲＮＡウイルスは、この変異体または既知の株のサブタイプが大変迅速に発生し得、そのゲノム配列が野生型配列のものとは幾分異なる結果として、高い変異率を受けやすい。しかし、例えば、ＰＣＲのような、鋭敏な増幅方法の場合には、試料中に実在するコピーを測定するために、特に高い増幅効率が、非常に少ないコピー数のウイルスゲノム配列の検出および定量測定に欠くことができない。プライマーのテンプレートとの不十分なアニーリングは、それらの効率を減少させる。従って、プライマーを選択する際の適当な注意を確実なものとしなければならない。
【００８５】
好ましいプライマー対は、それらがアッセイすべき個々の血液原ウイルスの保存されたゲノム配列をコードするよう選択され、そのプライマーの適合性は、調査すべきウイルスの典型的な試料横断切片(cross section)の適当な試料において確立される。
【００８６】
以前同定された、ＨＩＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶの既知のゲノム配列の他に、それらのサブタイプもまた、増幅反応のためのプライマーを選択することにより検出することができる。本発明により、このことは、使用するプライマーを各々のウイルスの高度に保存されたゲノム領域から選択することで達成される。従って、全ての関連あるサブタイプに対する特異性が確認されているプライマーのみが、ＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによる本発明の出発原料または中間体の選択に使用されるであろう。
【００８７】
疫学モニターの範囲内では、標的ウイルスの、新たに発生したウイルス株をアッセイして、それらが対応するテンプレートを含むかどうかを調べ、使用するプライマーを、これに対して配向する。次いで、既知のウイルス株群内で見出される変化を基に、新規ウイルス性株に関して実在するコピーの定量的な検出に適当な新規プライマーを合成することが可能であろう。そこで、新たに合成されたプライマーが有するアッセイの感度は、既に試験されているプライマーの感度と少なくとも同等でなければならない。
【００８８】
保存された核酸配列のための新規プライマーを、新たに発生する標的ウイルスのために開発しなければならない。
【００８９】
試料中の核酸を検出する、または測定する方法を調べるために、好ましくは、該方法を行う前または間に、１つまたはそれ以上の内部標準または標準品を試料に加え、その標準物質は、全く同じアッセイ容器中、存在し得る全てのウイルスゲノムまたはゲノム配列と同時に検出され、または測定される。
【００９０】
この方法は、特に、内部標準を各々の増幅反応の検出限界に近い量で使用するならば、ウイルス核酸の含量の一層正確な定量または増幅方法の検出限界の一層良好な評価の可能性を提供する。
【００９１】
本発明により合わせて、品質保証された血漿プールとした個々の献物を、さらなる同様に品質保証された血漿プールと合わせることができるので、品質保証されたミニプール、マクロプールまたはマルチマクロプールが提供される。品質保証された、より小さなプールから製造される、より大きなプールの利点は、既に十分記載した。
【００９２】
さらなる態様により、本発明は、血漿プールを、２つまたはそれ以上の個々の献物から、複製可能なウイルスによる、確かめられた、限定された汚染を伴う、品質保証された出発原料として製造する方法であって、以下の工程：
− 試料をｎ個の献物から採取し、
− 個々の献物試料を合わせて、ｍの試料プールとし、
− この試料プール中に存在するウイルスゲノムまたはゲノム配列の量を、核酸の検出または測定のための、定量可能な、制御された、および非阻害的方法によって検出する
により特徴付けられる方法に関し、
その方法においては、試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出量が、ある一定の限界値以下にある、個々の献物(ｎｇ)を合わせて、品質保証された血漿プールとして、試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出量が、限界値より大きいか、または限界値に等しい、個々の献物(ｎａ)を、さらなる処理にかけるか、または排除する(ｎおよびｍは正の整数である)。例えば、ウイルスゲノム当量を消失させることにより、またはウイルス中和抗体含有画分を混合することにより、個々の献物のさらなる処理を行うことができる。
【００９３】
さらなる方法の工程では、排除されるｎａ個の献物のさらなる処理に関してもまた、試料を再び採取するのがよく、またこれらの個々の献物試料を合わせて、ｍａの試料プールとするのがよい(ｎａおよびｍａは、ｍａ＞２の正の整数であって、ｍａ：ｎａの割合は、ｍ：ｎの割合より大きい)。この試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の量を、核酸の検出または測定のための、定量可能な、制御された、および非阻害的方法によって再び検出することができ、ここで、試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出量が、ある一定の限界値以下にある、個々の献物を合わせて、品質保証された血漿プールとして、ウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出量が、限界値に等しいか、限界値より大きい、個々の献物を、さらなる処理にかけるか、または排除する。さらに処理すべき、または排除すべき個々の献物の数が、ある一定数に達するか、または一定数以下となるまで、この方法を繰り返すことができる。
【００９４】
これらの方法により、許容不可能なほど高い負荷の複製可能なウイルスを含む可能性のある全ての個々の献血漿を、ほぼ無限に大きな血漿プールから幾つかの試験で排除することを可能とするための、簡単な方法を提供する。他方では、ウイルスで汚染された個々の献物と一緒に、今までに利用した方法により排除されてきた適当な個々の献物は、合わせて分析するなら、簡単な方法の工程により認識され、また最終血漿誘導体へと処理することができる。
【００９５】
従って、本発明のさらなる目的、すなわち、大きな血漿プール中でさえも、たった１人の感染したドナーを、さらなる献物から排除して、直ちに医療処置に付すために、簡単かつ低コストの方法で発見することを達成することができる。そのことで、ドナー集団の安全性が増大する。
【００９６】
本発明の方法を受ける血漿プールにより含まれてなる個々の献物の数は、通常、２〜２００,０００(ｎ＝２〜２００,０００)、また好ましくは２０〜２０,０００、さらに好ましくは２００〜２,０００、またとりわけ２００に達する。数字ｍは、特に、１〜１００,０００の間、また好ましくは２〜１,０００の間にある。さらに処理すべき、または事実上、排除すべき個々の献物に対して決められた数は、１００、好ましくは１０、また特に好ましくは１に達する。従って、最後の場合、ウイルスで汚染された個々の献物は、それ相当に同定される。しかし、実際、このことは、血漿ドナーを同定するという理由でのみ示される；従って、その数は、通常、１０〜１００の間で決められる。
【００９７】
必要ならば、核酸の検出または測定に加えて、アッセイすべきウイルスに対するウイルス中和抗体に関して、血漿プールをアッセイすることができる。
【００９８】
概して、ウイルスに対する抗体が見出された試料プールを用いて、各々の個々の献物を合わせて、さらに使用する。次いで、試料プール中、抗体が全く検出されていない個々の献物をさらなる処理に回すか、または排除する。
【００９９】
さらに、本発明は、本発明の方法の範囲内で製造される、品質保証された出発原料または中間体、特に血漿プールに関し、さらにはまた、好ましくは、ウイルスゲノム当量に関して、またはウイルス中和抗体の存在に関して、各々、一度以上アッセイされている、品質保証された最終血漿誘導体に関する。
【０１００】
本発明はまた、医薬品製剤化工程により、ヒト血漿起源の品質保証された最終血漿誘導体から得ることができる薬物をも含んでなる。
【０１０１】
さらなる態様により、本発明は、複製可能な様々な血液原ウイルスを含まない、１以上の血漿誘導体を含む薬物の製造方法に関し、この方法は、以下の方法の工程により特徴付けられる：
− 血漿誘導体の製造中に生じ、またヒト血漿から誘導される出発原料または中間体を与え、
− 複製可能な血液原ウイルスによるウイルス汚染の不在を実証することにより、またはそのような汚染が、ある特定の限界値を越えない量で存在することを測定することにより、出発原料または中間体の品質を保証し、
− 出発原料または中間体各々の中の過剰のウイルス中和抗体により、または献血漿時の血漿ドナーの防御免疫により、幾つかの複製可能な血液原ウイルスによる汚染の不在を検出し、
− あるいは、問題の各々のウイルスのゲノム当量を、出発原料中、または中間体中、各々、測定し、
− このようにして品質保証された出発原料または中間体を各々、少なくとも１つのさらなる実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかけて、血漿誘導体を完成し、
− このようにして得られた品質保証された最終血漿誘導体を、公知の方法により後処理して、薬物とする。
【０１０２】
ヒト血漿から薬物を製造するための好ましい方法では、その製造方法中、品質保証工程を少なくとも１つの中間体に用いる。
【０１０３】
好ましい態様により、該品質保証工程は、実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかける中間体に対して行う。最も好ましくは、実質的なウイルス消失またはウイルス不活性化工程にかけるべき、各々の中間体の品質保証である。
本発明を以下の実施例により記載するが、これは、本発明を限定しようとするものではない。
【実施例】
【０１０４】
実施例１
１. ＰＣＲの通則
１.１. ＤＴＳ−ＰＣＲ(二重標的化サザンブロット)の通則
第１の特異的プライマー対によって、核酸をＰＣＲで増幅した後、そのＰＣＲ産物をアガロースゲルでの電気泳動により分離して、フィルターにブロットさせる。フィルターに結合させたＰＣＲ産物をジゴキシゲニン(ＤＩＧ)標識化プローブとハイブリダイズさせると、これが増幅されたゲノム配列内に結合し、発生反応後に検出する。デンシトメーターによって、バンド強度を定量的に測定する。第１のプライマーとは異なる第２のプライマー対を使用する、さらなるＰＣＲでは、核酸を増幅して、サザンブロット分析によってもまた検出する。ゲノム配列の２つの異なる領域のＰＣＲ、およびハイブリダイゼーションによる、それらの視覚化により、誤った陰性の結果を減らすことができ、また陽性の結果を確かめることができる。
【０１０５】
１.２. ＬＩＦ−ＰＣＲ(レーザー誘起蛍光標識化)の通則
蛍光基を有するプライマーを使用するＰＣＲによって、様々な起源の核酸を増幅した。レーザー誘起蛍光測定装置を備えた自動ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂiosystems製のＧene Ｓcan(商標) ソフトウェアを備えたＤＮＡ Ｓequencer ３７３Ａ)の助けをもって、得られた増幅産物の分析および定量を行った。この装置により、変性条件下、ポリアクリルアミドゲル中でのゲル電気泳動によって、蛍光標識化ＰＣＲ産物をサイズにより分離して、それらの量を定量的に測定することができる。試料中の幾つかの配列のコピー数を、定量すべき核酸、および少なくとも２つの内部標準に関して得られた強度に基づいて測定する。
【０１０６】
１.２.１. ウイルス粒子のＤＮＡの抽出
超遠心分離機中、試料５００μlを７０,０００rpmで２０分間遠心分離した。ペレットを、１０mＭ トリス／ＨＣl(pＨ ８.０)５００μl、およびプロテイナーゼ Ｋ(Ｂoehringer Ｍannheim、２０mg／ml)１０μl、さらにはまた２０％ ＳＤＳ１０μlに溶解する。３７℃で一晩インキュベーションするか、または５６℃で４時間インキュベーションした後、既知量の標準核酸を加え、試料をフェノールおよびクロロホルムで順次抽出した後、グリコゲン(Ｂoehringer Ｍannheim、２０mg／ml)１０μlを加える。続いて、生成物をエタノールで沈殿させ、遠心分離して、ペレットを洗浄して、最終的には、水に溶解する。
【０１０７】
１.２.２. 残留ウイルスＤＮＡの抽出
試料５００μlを、１０mＭ トリス／ＨＣl(pＨ ８.０)５μl、およびプロテイナーゼ Ｋ(２０mg／ml)１０μlに溶解する。３７℃で一晩インキュベーションするか、または５６℃で４時間インキュベーションした後、既知量の標準核酸を加え、試料をフェノールおよびクロロホルムで順次抽出して、グリコゲン(２０mg／ml)１０μlを加える。続いて、生成物をエタノールで沈殿させ、遠心分離して、ペレットを洗浄して、最終的には、水に再び溶解する。
【０１０８】
１.２.３. ＰＣＲのためのＲＮＡの抽出
血漿またはＰＢＳで希釈した血漿１mlを７０,０００rpmで２０分間遠心分離する。上清を吸引により取り除いた。ペレットを、イソチオシアン酸グアニジウム溶液(ＢiotexのＲＮＡzol)１ml、および酵母由来の１mg／ml tＲＮＡ５μlにとって、２０μlのような、予め決められた量の標準ＲＮＡを加えた。４００および１,２００コピーといったような、指定された数の(−)ＲＮＡ標準および(＋)ＲＮＡ標準を加えて、渦流する(vortexed)。その溶液を７０℃で１０分間加熱し、１／１０体積のクロロホルムを加えた後、その混合物を氷上で１０分間インキュベートする。次いで、卓上遠心分離機中、これを５分間遠心分離して、上清を新しい管に移す。イソプロパノール５００μlを加えて、温度を−８０℃で１５分間維持する。次いで、これを１０分間遠心分離し、７０％ エタノールで２回洗浄して、ペレットを水５０μlにとる。ＲＴ−ＰＣＲの場合には、５μlを使用した。
【０１０９】
１.２.４. ＤＮＡの検出のためのＰＣＲ
ＰＣＲ製剤は、抽出された核酸のアリコート、ＰＣＲ緩衝液(Ｂoehringer Ｍannheim)、ＭgＣl２、dＮＴＰs、プライマー、Ｔaq ポリメラーゼ(Ｂoehringer Ｍannheim、５.０ユニット／μl)および水を既知の方法で含む。緩衝液および酵素の製造業者の指示に従って、また従来の方法に従って、ＰＣＲを行う(Ｍullisら、Ｍethods in Ｅnzymology １５５：３３５、１９８７)。
【０１１０】
１.２.５. ＨＩＶ ＲＮＡの検出のためのＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲ製剤は、Ｐerkin−Ｅlmer製のＲＴ緩衝液中の抽出された核酸のアリコート、ＭgＣl２、dＮＴＰs、ＲＴ プライマー、およびrＴ.th. ポリメラーゼ(Ｐerkin−Ｅlmer、２.５ユニット／μl)および水を通常の方法で含む。緩衝液および酵素の製造業者の指示に従って、また従来の方法に従って、ＲＴをＰＣＲ装置(Ｐerkin−ＥlmerのＧeneＡmp ＰＣＲ Ｓystem ９６００)で行う(Ｍullisら、Ｍethods in Ｅnzymology １５５：３３５、１９８７)。
ＰＣＲの場合には、ＭgＣl２、キレート緩衝剤、および第２のプライマーをさらに加える。次いで、ＰＣＲを上記のように行う。
【０１１１】
１.２.６. 生成物の分析
ＰＣＲ産物の測定および定量のために、０.５〜１.０μlをＰＣＲ溶液から採取して、製造業者の指示に従って、Ａpplied Ｂiosystems ３７３Ａ装置で分析する。
【０１１２】
１.３. サザンブロットおよびＤＴＳ−ＰＣＲ産物の検出
各々の生成物に意図された濃度でのＰＣＲ産物のゲル電気泳動分離のために、アガロースゲルを調製した。ゲル操作は、電気泳動用の１×操作用(running)緩衝液中で行った。ＰＣＲ産物試料を、０.５×操作用緩衝液中のフィコール／ブロモフェノールブルーと混合して、調製したゲルスロットを変えた。ゲル操作後、そのゲルを０.５Ｍ ＮaＯＨ／１.５Ｍ ＮaＣl中で１時間インキュベーションすることにより、ＰＣＲ産物を変性させた後、中和した。ＤＮＡをフィルター(ＤuralonＴＭ、Ｓtratagene、Ｌa Ｊolla、Ｃalifornia)に移して、核酸をＵＶ架橋(cross linking)より膜に結合させた。プレハイブリダイゼーション緩衝液(６×ＳＳＣ、０.５％ ＳＤＳ、５×Ｄenhardt's、１００μg／ml 変性ＤＮＡ)中、その膜を６８℃で１時間インキュベートした。ハイブリダイゼーションでジゴキシゲニン標識化ＤＮＡプローブで起こした後、アルカリ性ホスファターゼがコンジュゲートした抗体、ニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)、および５−ブロモ−１−クロロ−３−インドールホスフェート(ＢＣＩＰ)によって、免疫染色によるバンドの視覚化を成し遂げた。ブロットをデンシトメトリーにより評価した。
【０１１３】
１.４. 使用したプライマー
ＬＩＦ−ＰＣＲに使用したプライマーを表１.１.および表１.２.に要約する。
ＤＴＳ−ＰＣＲに使用したプライマーは、ＨＩＶの場合には、ＳＫ３８、ＳＫ３９、ＳＫ１４５およびＳＫ４３１(Ｒatnerら、１９８５)；ＨＣＶの場合には、３２、Ｒ３、ＣＨＡＡ、Ｒ１、ＣonＡ１、ＣonaＡ２およびＣonＡ(Ｃhironから入手可能)；およびＨＢＶの場合には、ＨＢＶ１ａおよびＨＢＶ１ｂ(Ｋanekoら、１９８９)、さらにはまたＨＢＶ４ａおよびＨＢＶ４ｂ(Ｃarmanら、１９８９)である。
【表１−１】
【表１−２】
【０１１４】
実施例 ２：
２.１. ＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによる、ドナー由来の血漿試料中のＨＩＶ ＲＮＡの定量
献血漿を、ＨＩＶ 血清(−)の健康な被験者、およびＨＩＶ 血清(−)、p２４抗原(＋)の一次感染した被験者から採取した。ドナーの血漿試料をＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによって試験した。ＤＴＳ−ＰＣＲによる試料試験を、プライマー対 ＳＫ１４５／４３１(プライマー対 １)およびＳＫ３８／３９(プライマー対 ２)(表１.１.)で行った；正のハイブリダイゼーションシグナルを有する試料をＬＩＦ−ＰＣＲによってさらに試験した。ＬＩＦ−ＰＣＲによって定量する場合には、ＨＩＶ−１のcＤＮＡ配列に結合し、野生型ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって１１５bpのＰＣＲ産物を与える、プライマー ＳＫ３８およびＳＫ３９(表 １.１)を使用した。標準プラスミド、pgag１、pgag−１５およびpgag＋１２(表１.２.)を使用した結果、１１５bp(pgag１)、１００bp(pgag−１５)および１２７bp(pgag＋１２)のＲＴ−ＰＣＲ産物が生じた。標準プラスミドを共増幅し(coamplified)、Ｇene Ｓcan(商標)で共分析して(coanalyzed)、コピー数／mlを測定した。定量的評価の結果を表２に要約する。
【表２】
ＨＩＶ 血清(−)、p２４抗原(＋)の血漿ドナーでは、最小汚染は２.８×１０５、最大汚染は２.３×１０７コピー／mlであることが測定された。
【０１１５】
２.２. ＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによる、ドナー由来の血漿試料中のＨＣＶ ＲＮＡの定量
献血漿を、ＨＣＶ 血清(−)の健康な被験者、およびＨＣＶの一次感染した被験者から採取した。ドナー由来の血漿試料をＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによって試験した。試料のＤＴＳ−ＰＣＲ試験を、プライマー対 ３２／Ｒ３(プライマー対 １)およびＣＨＡＡ／Ｒ１(プライマー対 ２)(Ｃhiron)で行った；正のハイブリダイゼーションシグナルを有する試料を、ＬＩＦ−ＰＣＲによってさらに試験した。ＬＩＦ−ＰＣＲにより定量する場合には、ＨＣＶのcＤＮＡ配列に結合して、ＲＴ−ＰＣＲにより野生型ＲＮＡから誘導される１１４bpの産物を与える、プライマー ＨＣＶ３２およびＨＣＶＰＴ４(表 １.１)を使用した。標準プラスミドとして、pＨＣＶwt、pＨＣＶ−７およびpＨＣＶ＋８(表１.２.)を使用した結果、長さ １１４bp(pＨＣＶwt)、１０７bp(pＨＣＶ−７)および１２２bp(pＨＣＶ＋８)のＲＴ−ＰＣＲ産物が生じた。標準プラスミドを試料で共増幅し、Ｇene Ｓcan(商標)で共分析して、コピー数／mlを測定した。定量的測定の結果を表３に要約する。
【表３】
ＨＣＶ 血清(−)の一次感染した血漿ドナーでは、最小汚染は２.２×１０４コピー／ml、最大汚染は１.６×１０６コピー／mlであることが測定された。
【０１１６】
２.３. ＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによる、ドナー由来の血漿試料中のＨＢＶ ＤＮＡの定量
献血漿を、ＨＢＶ 血清(−)の健康な被験者、並びに一次感染した、ＨＢsＡg(＋)、抗ＨＢsＡg 血清(−)、およびＨＢsＡg(＋)、抗ＨＢsＡg 血清(＋)の被験者から採取した。ドナーの血漿試料をＬＩＦ−ＰＣＲおよびＤＴＳ−ＰＣＲによってアッセイした。ＤＴＳ−ＰＣＲによる試料試験を、プライマー対 ＨＢＶ１ａ／ＨＢＶ１ｂ(プライマー対 １)およびＨＢＶ４ａ／ＨＢＶ４ｂ(プライマー対 ２)で行った(Ｃarmanら、１９８９)；正のハイブリダイゼーションシグナルを有する試料をＬＩＦ−ＰＣＲによってさらに試験した。ＬＩＦ−ＰＣＲにより定量する場合には、ＨＢＶゲノムのcＤＮＡ配列に結合して、ＲＴ−ＰＣＲにより野生型ＲＮＡから誘導される１８２bpのＰＣＲ産物を与える、プライマー ＨＢＶ＋１７８０ＢおよびＨＢＶ−１９５０Ｂ(表１.１.)を使用した。標準プラスミド、pＨＢＶwt、pＨＢＶ−９およびpＨＢＶ＋１２(表１.２.)を使用したが、これらは、１８２bp(pＨＢＶwt)、１７３bp(pＨＢＶ−９)および１９４bp(pＨＢＶ＋１２)のＲＴ−ＰＣＲ産物を与える。標準プラスミドを試料で共増幅し、Ｇene Ｓcan(商標)で共分析して、コピー数／mlを測定した。定量的評価の結果を表４に要約する。
【表４】
【０１１７】
ＨＢＶ 血清(−)の一次感染した血漿ドナーでは、最小汚染は１.４×１０５コピー／ml、また最大汚染は１.３×１０８コピー／mlであることが各々測定された。
【０１１８】
実施例 ３：
３.１. ＨＩＶ−１ ＲＮＡに関する様々なサイズの血漿プールのアッセイ
１０、５０、１００、５００、１,０００および２,０００のＨＩＶ 血清(−)、p２４抗原(−)の健康な個々のドナー由来の血漿試料を、試料プール中に混合した。各々の個々のプールサイズを、実施例１でのように測定された２.３×１０７コピー／ml(試料)という高いウイルス負荷で一次ＨＩＶ感染したドナー由来の１つの血漿試料と、実施例１でのように測定された２.８×１０５コピー／ml(試料 ２)という最小汚染で一次ＨＩＶ感染したドナー由来の１つの血漿試料と、また対照として、１×１０４コピー／ml(試料 ３)、および１×１０３コピー／ml(試料 ４)であるＨＩＶ ＲＮＡの規定された製剤と混合した。各々のプールサイズに関する定量可能なウイルスのコピー数／mlを、ＬＩＦ−ＰＣＲによって測定した。ＰＣＲ評価の結果を表５.１.に要約する。
【０１１９】
結果：
表５.１.は、高い負荷(２.３×１０７コピー／ml)を有する、さらにはまた最小汚染(３.８×１０５コピー／ml)を有する、一次感染した、抗−ＨＩＶ 血清(−)、p２４抗原(＋)の個々の献物でのウイルス汚染を、１０、５０、１００および５００の個々の献物の血漿プール中、ＰＣＲによって検出することができることを示す。ＨＩＶ−ＲＮＡで高度に汚染された献物はまた、１,０００および２,０００の個々のドナー由来の血漿プール中でも検出することができた；他方、最小汚染を伴う献物はもはや、このサイズのプールでは検出することができなかった。個々の献物中、１×１０４コピー／mlでの汚染により引き起こされるＨＩＶ−ＲＮＡ負荷は、１０個までの献物のプール中で検出することができた。試験したプールサイズではいずれも、個々の献物中、１×１０３コピー／mlの汚染レベルでウイルスゲノム配列を検出することは不可能であった。
【表５−１】
【０１２０】
３.２. 試料を濃縮することによる感度の増大
ＨＩＶ−ＲＮＡのコピーを検出することができなかったプールサイズでの検出感度を増大させるために、プールした血漿の１０倍濃縮した試料をＰＣＲに使用した。この目的のために、実施例３.１.で使用した、試料２、３および４の個々の血漿プールの各々の場合における試料体積の１０倍体積を遠心分離により濃縮し、１／１０の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲに使用した。ＰＣＲ評価の結果を表５.２.に要約する。
【０１２１】
ＰＣＲの初期試料体積を１０倍濃縮することにより、１つの一次ＨＩＶ感染した献物を含む２,０００の個々のドナー由来のプールの最小汚染を検出することが可能であった(２.８×１０５コピー／ml)。同様に、たった１つの献物中に１×１０４コピー／mlのウイルス汚染を伴う、５０および１００の個々のドナー由来の血漿プール中での検出の感度を増大させることが可能であった。たった１つの献物中の１×１０３コピー／mlでのウイルス汚染は、１０の個々のドナー由来の最も小さなプールサイズでしか検出することができなかった。
【０１２２】
次に大きいプールサイズでのウイルスゲノムの検出を改良するために、１００倍の初期体積の、実施例３.１.で使用した試料３および４を、さらなる実験において濃縮し、１／１００の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲに使用した。ＰＣＲ評価の結果を表５.３.に要約する。
【０１２３】
血漿試料を１００倍濃縮することにより、たった１つの献物中の１×１０４コピー／mlのウイルスＨＩＶゲノム汚染をさらに、５００、１,０００および２,０００の個々のドナー由来の血漿プール中で検出することができた。
【表５−２】
【表５−３】
【０１２４】
実施例 ４
４.１. ＨＣＶ−ＲＮＡに関する様々なサイズの血漿プールの試験
１０、５０、１００、５００および１,０００のＨＣＶ 血清(−)の健康な個々のドナー由来の血漿試料を混合して、試料プールとした。各々の個々のプールサイズを、実施例１でのように測定された１.６×１０６コピー／ml(試料 １)という高い汚染を有する、一次ＨＣＶ感染したドナーの献血漿に由来する１つの血漿試料と、実施例１でのように測定された２.２×１０４コピー／ml(試料 ２)という最小汚染で一次感染したドナー由来の１つの血漿試料と、また対象として、１×１０３コピー／ml(試料 ３)、および５×１０２コピー／ml(試料 ４)であるＨＣＶの規定された製剤と混合した。各々のプールサイズに関する、定量可能なコピー数／mlを、ＰＣＲによって測定した。ＰＣＲ評価の結果を表６.１.に要約する。
【０１２５】
結果：
表６.１.は、１.６×１０６コピー／mlという高い汚染を有する、一次感染した献物でのウイルス汚染を、１０、５０、１００、５００、および１,０００個の献物からなる血漿プール中で検出することができることを示す。１００、５００および１,０００の個々のドナー由来のプールでは、たった１つの、最小限度に汚染された献物(２.２×１０４コピー／ml)により引き起こされるＨＣＶ−ＲＮＡはもはや、検出することができなかった。ＨＣＶゲノム当量の検出は、１０および５０までのドナー由来のプール中、たった１つの献物における２.２×１０４コピー／mlの汚染で可能である。たった１つの献物における約１×１０３または５×１０２コピー／mlという、より少ない数のＨＣＶコピーでのウイルスゲノム当量汚染は、試験したプールサイズではいずれも検出することができなかった。
【表６−１】
【０１２６】
４.２. 試料を濃縮することによる感度の増大
ＨＣＶ−ＲＮＡのコピーを検出することができなかったプールサイズでの感度を増大させるために、プールした血漿の１０倍濃縮した試料をＰＣＲに使用した。この目的のために、実施例４．１．で使用した、試料２、３および４の個々の血漿プールの各々の場合における試料体積の１０倍体積を遠心分離により濃縮し、１／１０の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲに使用した。ＰＣＲ評価の結果を表６.２.に要約する。
ＰＣＲの初期試料体積を１０倍濃縮することにより、１つの一次ＨＣＶ感染した献物を含む１０、５０および５００の個々のドナー由来のプールの最小負荷を検出することが可能であった(２.２×１０４コピー／ml)。同様に、１０の個々のドナー由来の血漿プール中、たった１つの献物における１×１０３または５×１０２コピー／mlという、各々のウイルス汚染の検出の感度を増大させることが可能であった。
【０１２７】
次に大きいプールサイズでのウイルスゲノムの検出を改良するために、１００倍の初期体積の、実施例４.１.で使用した試料３および４を、さらなる実験において濃縮し、１／１００の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲに使用した。ＰＣＲ評価の結果を表６.３.に要約する。
【０１２８】
血漿試料を１００倍濃縮することにより、たった１つの献物中の１×１０３および５×１０２コピー／mlのウイルスＨＣＶゲノム汚染をさらに、１００の個々のドナー由来の血漿プール中で検出することができた。
【表６−２】
【表６−３】
【０１２９】
実施例 ５：
５.１. ＨＢＶ−ＤＮＡに関する様々なサイズの血漿プールの試験
１０、５０、１００、５００、１,０００および２,０００のＨＢＶ 血清(−)の健康な個々のドナーの血漿試料を混合して、試料プールとした。そのプールを、実施例１でのように測定された１.３×１０８コピー／ml(試料 １)という高い汚染を有する、一次ＨＢＶ感染したドナー由来の血漿試料と、実施例１でのように測定された１.４×１０４コピー／ml(試料 ２)という最小汚染で一次感染したドナー由来の血漿と、また対象として、５×１０３コピー／ml(試料 ３)、および１×１０３コピー／ml(試料 ４)であるＨＢＶの規定された製剤と混合した。各々のプールサイズに関する、定量可能なコピー数／mlを、ＰＣＲによって測定した。ＰＣＲ評価の結果を表７.１.に要約する。
表７.１.は、高いゲノム汚染を有する、一次ＨＢＶ感染した献物でのウイルス汚染を、１０、５０、１００、５００、１,０００および２,０００個の献物からなる血漿試料プール中で検出することができることを示す。５００、１,０００および２,０００の個々のドナー由来のプールでは、たった１つの、最小限度に汚染された献物(１.４×１０４コピー／ml)により引き起こされるＨＢＶ−ＤＮＡはもはや、検出することができなかった。ＨＢＶゲノム当量の検出は、１０および５０までのドナー由来のプール中、たった１つの献物における５×１０３コピー／mlの汚染で、また１０までのドナー由来のプール中、たった１つの献物における１×１０３コピー／mlの汚染で可能であった。
【表７−１】
【０１３０】
５.２. 試料を濃縮することによる感度の増大
ＨＢＶ−ＤＮＡのコピーを検出することができなかったプールサイズでの感度を増大させるために、プールした血漿の１０倍濃縮した試料をＰＣＲに使用した。この目的のために、実施例５.１.で使用した、試料２、３および４の個々の血漿プールの各々の場合における試料体積の１０倍体積を遠心分離により濃縮し、１／１０の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲに使用した。ＰＣＲ評価の結果を表７.２.に要約する。
ＰＣＲの初期試料体積を１０倍濃縮することにより、１.４×１０４コピー／mlという、１つの一次ＨＢＶ感染した献物を含む５００の個々のドナー由来のプールの最小負荷を検出することが可能であった。同様に、１００および５００の個々のドナー由来の血漿プール中、たった１つの献物に由来する５×１０３コピー／mlのウイルス汚染を、また５０および１００の個々のドナー由来の血漿プール中、たった１つの献物に由来する１×１０３コピー／mlの汚染を検出する感度を増大させることが可能であった。
次に大きいプールサイズでのウイルスゲノムの検出を改良するために、１００倍の初期体積の、実施例５.１.で使用した試料３および４を、さらなる実験において濃縮し、１／１００の初期体積を有する緩衝液中に再び懸濁させて、ＰＣＲに使用した(表７.３.)。
【０１３１】
結果：
血漿試料を１００倍濃縮することにより、たった１つの献物中の１×１０３コピー／mlのウイルスＨＩＶゲノム汚染をさらに、５００および１,０００の個々のドナー由来の血漿プール中で検出することができた。
【表７−２】
【表７−３】
【０１３２】
実施例 ６：
ＨＩＶおよびＨＣＶ ＲＮＡに関する様々なサイズの血漿プールの試験
１０、５０、１００、５００、１,０００および２,０００のＨＩＶ 血清(−)およびＨＣＶ 血清(−)の健康な個々のドナー由来の血漿試料を混合して、血漿試料プールとした。各々の個々のプールサイズを、実施例２.１.および２.２.でのように測定された２.３×１０７コピー／mlという高いＨＩＶ負荷、および１.６×１０６コピー／ml(試料 １)というＨＣＶ負荷、並びに実施例２.１.および２.２.でのように測定された２.８×１０５コピー／mlという最小ＨＩＶ負荷、および２.２×１０４コピー／ml(試料 ２)というＨＣＶ負荷を有する、一次ＨＩＶ感染したドナー由来の血漿試料、および一次ＨＣＶ感染したドナー由来の血漿試料、また対照として、１×１０４コピー／mlであるＨＩＶ、および１×１０３コピー／ml(試料 ３)であるＨＣＶの規定された製剤、並びに１×１０３コピー／mlであるＨＩＶ、および２×１０２コピー／ml(試料 ４)であるＨＣＶの製剤と混合した。ＨＩＶおよびＨＣＶに特異的な核酸の存在に関して、各々のプールサイズを、ＨＩＶおよびＨＣＶに特異的なプライマーを用いてのＬＩＦ−ＰＣＲによって試験した。１,０００の個々のドナー由来のプールサイズまでの、たった１つの献物による２.３×１０７ ＨＩＶコピー／mlおよび１.６×１０６ ＨＣＶコピー／mlという最大汚染を伴う汚染で、ＨＩＶに特異的なゲノム配列およびＨＣＶに特異的なゲノム配列を検出することが可能であった。ＨＩＶゲノム当量はさらに、僅かに汚染された献物で汚染された５００個の献物のプール中で見出されたが、ＨＣＶゲノム当量は、５０の個々のドナー由来のプール中でしか見出すことはできなかった。従って、試験したプール中でのＨＣＶゲノム配列の検出に対する感度は、ＨＩＶゲノム配列に対する感度より対数減衰的に(log step)低い。
【０１３３】
７．プール中のＨＡＶウイルス汚染に対する、ＨＡＶ免疫化献物の中和効果の検出
ＨＡＶ免疫化ドナー由来の献血漿の中和能力は、インビトロにおける中和試験により示すことができる。
血漿中に存在するＡ型肝炎ウイルスに対するＨＡＶ抗体の中和効果を検出するために、防御免疫を有する１００の予め免疫化されたＨＡＶドナー由来の血漿プールを試験して、そのプールをＨＡＶ(タイター １０６．４ＴＣＩＤ５０／ml)と混合した。３７℃で１時間インキュベーションした後、ＨＡＶタイターを測定した。血漿プール中に存在するＨＡＶ抗体により、ＨＡＶ感染力を対数減衰的に＞４.６まで減少させることができた。このことは、免疫されたドナー由来の血漿中に存在する防御抗体が、より大きな血漿プール中でのウイルス汚染を中和することができることを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
再生できるある血液ウイルスによる汚染に関し品質保証された血漿プール（品質保証血漿プール）を製造する方法であって、以下のことを特徴とする方法：
（ａ）再生できるある血液ウイルスによる個別の献血漿の汚染の不存在を、対応するウイルス血症を示すマーカーの不存在により、または出発材料中における過剰のウイルス中和抗体により、または献血漿の時の血漿ドナーの保護免疫により測定し；
（ｂ）ウイルスのゲノム当量の測定を以下のように行う；
−ｎ個の個々の献物 (donation) から試料をとり、
−その個々の献物試料をｍ個の試料プールに集め、
−それぞれ核酸検出または測定方法によりこれらの試料プール中に存在するウイルスゲノムまたはゲノム配列の量を、１つまたは数個の内部標準を添加することによる内部標準を用いて検出し、その標準は、多分存在するウイルスゲノムまたはウイルスゲノム配列を１つの同じ試験管中で同時にそれぞれ測定または検出し、
それによって試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出された量が規定された限界値以下であるこれらの個々の献物（ｎｇ）を品質保証血漿プールに混合し、
試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出された量が該規定された限界値より大きい、または等しいこれらの個々の献物（ｎａ）をさらなる処理に付すか、または除去する（ｎおよびｍは正の整数である）。
【請求項１】
再生できるある血液ウイルスによる汚染に関し品質保証された血漿プール（品質保証血漿プール）を製造する方法であって、以下のことを特徴とする方法：
（ａ）再生できるある血液ウイルスによる個別の献血漿の汚染の不存在を、対応するウイルス血症を示すマーカーの不存在により、または出発材料中における過剰のウイルス中和抗体により、または献血漿の時の血漿ドナーの保護免疫により測定し；
（ｂ）ウイルスのゲノム当量の測定を以下のように行う；
−ｎ個の個々の献物 (donation) から試料をとり、
−その個々の献物試料をｍ個の試料プールに集め、
−それぞれ核酸検出または測定方法によりこれらの試料プール中に存在するウイルスゲノムまたはゲノム配列の量を、１つまたは数個の内部標準を添加することによる内部標準を用いて検出し、その標準は、多分存在するウイルスゲノムまたはウイルスゲノム配列を１つの同じ試験管中で同時にそれぞれ測定または検出し、
それによって試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出された量が規定された限界値以下であるこれらの個々の献物（ｎｇ）を品質保証血漿プールに混合し、
試料プール中のウイルスゲノムまたはゲノム配列の検出された量が該規定された限界値より大きい、または等しいこれらの個々の献物（ｎａ）をさらなる処理に付すか、または除去する（ｎおよびｍは正の整数である）。
【公開番号】特開２００８−２４７９１３（Ｐ２００８−２４７９１３Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１１５６５（Ｐ２００８−１１１５６５）
【出願日】平成２０年４月２２日（２００８．４．２２）
【分割の表示】特願平８−５３３５９８の分割
【原出願日】平成８年５月６日（１９９６．５．６）
【出願人】（５９１１５４７６２）イムノ・アクチエンゲゼルシャフト (4)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＯ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２２日（２００８．４．２２）
【分割の表示】特願平８−５３３５９８の分割
【原出願日】平成８年５月６日（１９９６．５．６）
【出願人】（５９１１５４７６２）イムノ・アクチエンゲゼルシャフト (4)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＯ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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