２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール及びその使用
本発明は、２α−メチル−１９−ノルービタミンＤ類似体、具体的には、２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール、及びその医薬的使用を開示する。本化合物は、未分化の細胞の増殖を阻止し、単球への分化を誘導する場合に顕著な活性を示すので、抗癌剤として及び乾癬等の皮膚疾患、さらに、しわ、たるんだ皮膚、乾燥皮膚及び不十分な皮脂分泌等の皮膚状態の治療のための使用が示される。本化合物はさらに、カルシウム血症活性があったとしても極めて低いため、ヒトの自己免疫障害又は炎症性疾患、さらに、腎性骨ジストロフィの治療に用いることができる。本化合物は、さらに、肥満症の治療又は予防に用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンＤ化合物、より具体的には、２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール及びその医薬的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然ホルモンである１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３及びそのエルゴステロール系列の類似体、すなわち、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２は、動物及びヒトのカルシウムホメオスタシスの極めて強力な調節因子であることが知られているが、細胞分化におけるその活性も、Ostrem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2610 (1987)で確認された。１α−ヒドロキシビタミンＤ３、１α−ヒドロキシビタミンＤ２、種々の側鎖同族ビタミン及びフッ素化類似体を含む、これら代謝産物の多数の構造類似体が、製造され、試験されている。本化合物のうちいくつかは、細胞分化及びカルシウム調節において活性の興味深い分離を示す。この活性の相違は、腎性骨ジストロフィ、ビタミンＤ抵抗性くる病、骨粗鬆症、乾癬及びある種の悪性疾患等の様々な疾患の治療に有用でありうる。
【０００３】
別のクラスのビタミンＤ類似体、すなわち、いわゆる１９−ノル−ビタミンＤ化合物は、ビタミンＤ系に典型的なＡ環環外メチレン基（炭素１９）が２個の水素原子で置換されていることを特徴とする。このような１９−ノル類似体（例えば、１α，２５−ジヒドロキシ−１９−ノル−ビタミンＤ３）の生物学的試験は、細胞分化を誘導する場合に高力価となる選択的活性プロフィールとカルシウム動員活性が極めて低いことを示した。従って、本化合物は、悪性疾患の治療又は様々な皮膚障害の治療のための治療薬として潜在的に有用である。このような１９−ノル−ビタミンＤ類似体について二つの異なる合成方法が報告された（Perlman et al., Tetrahedron Lett. 31, 1823 (1990); Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991) 及び DeLucaら、米国特許第５，０８６，１９１号）。
【０００４】
米国特許第４，６６６，６３４号には、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の２β−ヒドロキシ及びアルコキシ（例えば、ＥＤ−７１）類似体が記載されており、中外グループにより、骨粗鬆症薬の薬物及び抗腫瘍薬としての可能性が検討された。Okano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 1444 (1989)も参照されたい。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の他の２−置換（ヒドロキシアルキル、例えば、ＥＤ−１２０及びフルオロアルキル基）Ａ環類似体も、製造され、試験された（Miyamoto et al., Chem. Pharm. Bull. 41, 1111 (1993); Nishii et al., Osteoporosis Int. Suppl. 1, 190 (1993); Posner et al., J. Org. Chem. 59, 7855 (1994), and J. Org. Chem. 60, 4617 (1995)）。
【０００５】
１α，２５−ジヒドロキシ−１９−ノルビタミンＤ３の２−置換類似体、すなわち、２位にヒドロキシ基又はアルコキシ基で（DeLucaら、米国特許第５，５３６，７１３号）、２−アルキル基で（DeLucaら、米国特許第５，９４５，４１０号）及び２−アルキリデン基で（DeLucaら、米国特許第５，８４３，９２８号）置換された化合物も合成されたが、それらは、興味深く選択的な活性プロフィールを示す。上記研究は全て、ビタミンＤ受容体中の結合部位が、合成されたビタミンＤ類似体のＣ−２位に異なる置換基で置換できることを示す。
【０００６】
薬理学的に重要なビタミンＤ化合物の１９−ノル−クラスの調査を精力的に続けて、炭素２（Ｃ−２）にメチレン置換基、炭素１（Ｃ−１）にヒドロキシル基、及び炭素２０（Ｃ−２０）へ結合した短い側鎖の存在を特徴とする類似体をも合成して試験した。１α−ヒドロキシ−２−メチレン−１９−ノル−プレグナカルシフェロールは米国特許第６，５６６，３５２号に報告され、１α−ヒドロキシ−２−メチレン−１９−ノル−ホモプレグナカルシフェロールは米国特許第６，５７９，８６１号に報告され、そして１α−ヒドロキシ−２−メチレン−１９−ノル−ビスホモプレグナカルシフェロールは米国特許第６，６２７，６２２号に報告されている。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と比較したところ、３種類の本化合物は全て、ビタミンＤ受容体への結合活性及び細胞分化活性が比較的高いが、カルシウム血症活性（calcemic activity）は、あったとしても極めて低い。第６，５６６，３５２号、第６，５７９，８６１号及び第６，６２７，６２２号特許に開示されるように、上記化合物は、その生物学的活性のため、様々な医薬的使用の優れた候補物質となる。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、２α−メチル−１９−ノル−ビタミンＤ類似体、より具体的には、２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール、その生物学的活性及び本化合物の様々な医薬的使用に関する。これまでに知られていない、この新規な１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物は、２位にメチル基及び１７位（Ｃ−１７）にイソプロピル置換基がある１９−ノル−ビタミンＤ類似体である。
【０００８】
構造的に、この２α−メチル−１９−ノル−ビタミンＤ類似体は以下に示す一般式Ｉ：
【０００９】
【化１】
【００１０】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を特徴とする。好ましい類似体は、次の式Ｉａ：
【００１１】
【化２】
【００１２】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである。
【００１３】
上の化合物Ｉ、特にＩａは、望ましく、極めて好都合な生物学的活性態様を示す。本化合物は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の場合と比較すると、ビタミンＤ受容体への結合が比較的高いこと特徴とするが、腸管カルシウム輸送活性は極めて低いこと特徴とし、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と比較すると、カルシウムを骨から動員する機能は極めて低い。従って、本化合物は、カルシウム血症活性があったとしても極めて低いと特定することができる。プレプロ副甲状腺ホルモン遺伝子（Darwish & DeLuca, Arch. Biochem. Biophys. 365, 123-130, 1999）及び副甲状腺増殖を抑制する場合、血清カルシウムを超生理学的レベルに上昇させることは望ましくない。カルシウム血症活性が全くない又は極めて低く、分化には極めて活性な本類似体は、腎性骨ジストロフィの続発性副甲状腺機能亢進の抑制の治療に有用であると考えられる。
【００１４】
本発明の化合物Ｉ、特にＩａはさらに、免疫系の不均衡を特徴とする、例えば、多発性硬化症、狼瘡、真性糖尿病、宿主対移植片拒絶反応及び臓器移植拒絶反応を含めた自己免疫疾患のヒト障害の治療及び予防に；さらに、関節リウマチ、喘息、並びにセリアック病、潰瘍性大腸炎及びクローン病等の炎症性腸疾患等の炎症性疾患の治療に、特に適することが見出された。ざ瘡、脱毛症及び高血圧症は、本発明の化合物で治療することができる他の症状である。
【００１５】
上の化合物Ｉ、特にＩａはさらに、細胞分化活性が比較的高いことを特徴とする。従って、本化合物はさらに、乾癬の治療用又は、特に、白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌及び前立腺癌に対する抗癌剤としての治療薬をもたらす。さらに、その細胞分化活性が比較的高いため、本化合物は、しわ、適切な皮膚水和の欠如、すなわち、乾燥皮膚、適切な皮膚引き締めの欠如、すなわち、たるんだ皮膚、及び不十分な皮脂分泌を含めた様々な皮膚状態の治療用の治療薬をもたらす。従って、本化合物を用いると、皮膚に加湿がもたらされるのみならず、皮膚の保護機能も改善される。
【００１６】
式Ｉ、特に式Ｉａの本発明の化合物は、さらに、動物個体の肥満症を予防又は治療する、脂肪細胞分化を阻害する、ＳＣＤ−１遺伝子転写を阻害及び／又は体脂肪を減少させる場合に有用である。従って、ある態様では、動物個体の肥満症を予防する又は治療する、脂肪細胞分化を阻害する、ＳＣＤ−１遺伝子転写を阻害する及び／又は体脂肪を減少させる方法としては、式Ｉの１又はそれ以上の化合物、あるいは１又はそれ以上の化合物を包含する医薬組成物の有効量を、その動物個体に投与することがあげられる。１又はそれ以上の化合物又は医薬組成物を個体へ投与することにより、動物個体の脂肪細胞分化が阻害され、遺伝子転写が阻害され及び／又は体脂肪が減少する。
【００１７】
１又はそれ以上の化合物は、上記疾患及び障害を治療するための組成物中に、組成物の約０．０１μｇ／ｇｍ〜約１０００μｇ／ｇｍ、好ましくは、組成物の約０．１μｇ／ｇｍ〜約５００μｇ／ｇｍの量で存在してよく、局所に、経皮で、経口で、直腸に、鼻腔内に、舌下に又は非経口で、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日、好ましくは、約０．１μｇ／日〜約５００μｇ／日の用量で投与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
炭素２（Ｃ−２）にメチル置換基及び炭素１７（Ｃ−１７）にイソプロピル置換基の存在を特徴とする１９−ノル−ビタミンＤ類似体である２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール（本明細書中２α−メチルＰという）を合成して試験した。本ビタミンＤ類似体は、Ｃ−２位の比較的小さいメチル基により、ビタミンＤ受容体への結合が妨げられることはないため、興味深い標的と考えられた。構造的に、この１９−ノル類似体は、本明細書中上記一般式Ｉａを特徴とし、その（保護されたヒドロキシの形の）プロドラッグは一般式Ｉで示される。
【００１９】
構造Ｉを有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール類似体の製造は、共通の一般的な方法、すなわち、トリス（トリフェニルホスフィン）ロジウム（Ｉ）クロリド［Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ'ｓ触媒（Ｐｈ３Ｐ）３ＲｈＣｌ］の存在下で効率よく行われる、一般式IIの２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール化合物中の炭素２でのエキソメチレン単位の選択的均一接触水素化により達成することができる。本還元条件は、Ｃ（２）＝ＣＨ２単位のみを還元させ、Ｃ（５）−Ｃ（８）ブタジエン部分は影響を受けない。単離物質は、Ｃ−２の立体配置が異なる２−メチル−１９−ノルービタミンＩ及びIIIのエピマー混合物（約１：１）である。その混合物は分離せずに用いることができ、所望の場合は、個々の２α−（式Ｉ）異性体及び２β−（式III）異性体を、有効なＨＰＬＣシステムで分離することができる。
【００２０】
【化３】
【００２１】
構造Ｉ、II及びIIIで、置換基Ｘ１及びＸ２は、上記で定義した基である。
【００２２】
一般的な構造IIを有する２−メチレン−１９−ノルホモプレグナカルシフェロール類似体は公知であり又は既知の方法で製造することができる。
【００２３】
化合物Ｉ、II及びIIIの合成方法全体は、本明細書中にその明細書が具体的に援用される、「２−アルキリデン−１９−ノル−ビタミンＤ化合物」という米国特許第５，８４３，９２８号に詳しく説明され、より完全に記載されている。
【００２４】
本明細書中及び請求の範囲中で用いられる「ヒドロキシ保護基」との用語は、ヒドロキシ官能基の一時的保護に一般的に用いられるいかなる基、例えば、アルコキシカルボニル基、アシル基、アルキルシリル基又はアルキルアリールシリル基（以下、簡潔には「シリル」基という）及びアルコキシアルキル基等があげられる。アルコキシカルボニル保護基は、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基又はアリルオキシカルボニル基等のアルキル−Ｏ−ＣＯ−基群である。「アシル」という用語は、１〜６個の炭素を有するアルカノイル基であって、その全ての異性体の形；又はオキサリル基、マロニル基、スクシニル基、グルタリル基等の、１〜６個の炭素を有するカルボキシアルカノイル基；又はベンゾイル基、又はハロ、ニトロ又はアルキルで置換されたベンゾイル基等の芳香族アシル基を意味する。本明細書及び請求の範囲中で用いられる「アルキル」という語は、１〜１０個の炭素を有する直鎖又は分岐状アルキル基であって、その全ての異性体の形を意味する。アルコキシアルキル保護基は、メトキシメチル基、エトキシメチル基、メトキシエトキシメチル基又はテトラヒドロフラニル基及びテトラヒドロピラニル基等の群である。好ましいシリル保護基は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ジブチルメチルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、フェニルジメチルシリル基、ジフェニル−ｔ−ブチルシリル基及び類似のアルキル化シリル基である。「アリール」という用語は、フェニル−、又はアルキル−、ニトロ−又はハロ−で置換されたフェニル基を意味する。
【００２５】
「保護されたヒドロキシ」基は、ヒドロキシ官能基の一時的又は永久的保護に一般的に用いられる上のいずれかの基、例えば、前に定義のシリル基、アルコキシアルキル基、アシル基又はアルコキシカルボニル基によって保護された又は誘導体化されたヒドロキシ基である。「ヒドロキシアルキル」、「重アルキル」及び「フルオロアルキル」という用語は、それぞれ、１個又はそれを超えるヒドロキシ基、重水素基又はフルオロ基で置換されたアルキル基を意味する。
【００２６】
より具体的には、化合物２α−メチルＰの製造の詳細な説明については、次の代表的な実施例及び説明、並びに本明細書中のスキーム１を参照すべきである。
【００２７】
この実施例において、アラビア数字（１、２、３）で示される具体的な生成物は、スキーム１に示された具体的な構造を意味する。
【実施例】
【００２８】
共通事項
紫外（ＵＶ）吸収スペクトルは、示した溶媒中で日立モデル６０−１００ＵＶ−ｖｉｓ分光計で記録した。１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、ジュウテリオクロロホルム中５００ＭＨｚで、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭ−５００ＦＴ分光計で記録した。化学シフト（δ）は、内部Ｍｅ４Ｓｉ（δ０．００）から低磁場に報告している。質量スペクトルは、Ｋｒａｔｏｓ ＭＳ−５５データシステムを装備したＫｒａｔｏs ＤＳ−５０ＴＣ計測器で７０ｅＶで記録した。試料は、１２０〜２５０℃に維持したイオン源中に直接挿入プローブにより導入した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、Ｍｏｄｅｌ ６０００Ａ溶媒デリバリーシステム、Ｍｏｄｅｌ ６ＵＫ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌインジェクター、Ｍｏｄｅｌ ４８６波長可変吸光度検出器及び示差Ｒ４０１屈折計を装備した Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ液体クロマトグラフで行った。
【００２９】
実施例１
２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール（１）の水素化
トリス（トリフェニルホスフィン）ロジウム（Ｉ）クロリド（３２．０ｍｇ，３４．６μｍｏｌ）を予め水素で飽和した（２０分間）乾燥ベンゼン（３５ｍＬ）に加えた。本混合物を室温で均一溶液が形成されるまで（約７０分）撹拌した。次に、乾燥ベンゼン（６ｍＬ）中のビタミン１（１１ｍｇ，３３．３μｍｏｌ）の溶液を加え、反応を連続水素流下で３．５時間続けた。ベンゼンを真空下で除去し、残留物をヘキサン／酢酸エチル（７：３）に再溶解し、ＷａｔｅｒｓシリカＳｅｐ−Ｐａｋ（Ｖａｃ １２ｃｃ）上に適用した。粗２−メチルビタミン（約１１ｍｇ）を同一溶媒系（３５ｍＬ）で溶出した。画分を合わせて蒸発させ、ＨＰＬＣ（１０ｍｍ×２５ｃｍ Ｚｏｒｂａｘ−Ｓｉｌカラム、４ｍＬ／分）で、ヘキサン／２−プロパノール（９０：１０）溶媒系を用いてさらに精製した。２α−及び２β−メチル−１９−ノルービタミン２及び３の混合物（約１：１）（５３：４７の比率；６．３７ｍｇ，５８％）はＲｖ２９ｍＬで単一ピークを生じた。双方のエピマーの分離は逆相ＨＰＬＣ（６．２ｍｍ×２５ｃｍ Ｚｏｒｂａｘ−ＯＤＳカラム、２ｍＬ／分）で、メタノール／水（９０：１０）溶媒系を用いて行った。２β−メチルビタミン３をＲｖ１７ｍＬで回収し、２α−エピマー２はＲｖ１９ｍＬで回収した。
【００３０】
2:UV(エタノール中)λmax242.0, 250.0, 260.0nm; 1H NMR (CDCl3) δ0.531 (3H, s, 18-H3), 0.860 及び 0.940(3H及び3H,各々d, J=6.5 Hz, 21-及び22-H3),1.134 (3H, d, J=6.8 Hz, 2α-CH3), 2.13 (1H,〜t, J〜11 Hz, 4β-H), 2.22 (1H, br d, J〜13 Hz, 10β-H),2.60 (1H, dd, J=12.9, 4.1 Hz, 4α-H), 2.80 (2H, m, 9β-及び10α-H), 3.61 (1H, m, w/2=23 Hz, 3α-H), 3.96 (1H, m, w/2=14 Hz, 1β-H), 5.82 及び 6.37 (1H及び1H,各々d, J=11.2 Hz, 7-及び6-H); MS m/z (相対強度) 332 (M+, 100), 289(37), 253(21), 177(67), 135(76), 91(78);Ｃ２２Ｈ３６Ｏ２の正確な理論質量３３２．２７１５，実測値３３２．２７１２。
【００３１】
【化４】
【００３２】
２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールの生物学的活性
メチル基の２位への導入、及び１α−ヒドロキシ−１９−ノルービタミンＤ３の側鎖中の炭素２３、２４、２５、２６及び２７の脱離は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と比較したところ、完全長組換えラットビタミンＤ受容体への結合にほとんど又は全く影響しなかった。化合物２α−メチルＰは、標準の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３と比較して、同等に十分に受容体に結合した（図１）。本結果から、化合物２α−メチルＰは同等の生物学的活性を有するであろうと考えられる。しかしながら、驚くべきことに、化合物２α−メチルＰは、固有の生物学的活性を有する極めて選択的な類似体である。
【００３３】
図５は、２α−メチルＰは、天然ホルモン１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）と比較して、腸管カルシウム輸送を刺激する活性がほとんどないことを示す。
【００３４】
図４は、２α−メチルＰは、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３と比較して、骨カルシウム動員活性がほとんどないことを示す。
【００３５】
従って、図４及び図５は、２α−メチルＰが、カルシウム血症活性があっても極めて低いと特定できることを示す。
【００３６】
図２は、２α−メチルＰは、ＨＬ−６０細胞分化について、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３とほぼ同程度に強力であることを示し、乾癬及び癌、特に、白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌及び前立腺癌の治療のための優れた候補物質となる。さらに、本化合物は細胞分化活性が比較的高いため、しわ、適切な皮膚水和の欠如、すなわち、乾燥皮膚、適切な皮膚引き締めの欠如、すなわち、たるんだ皮膚、及び不十分な皮脂分泌を含めた様々な皮膚状態の治療用の治療薬をもたらす。従って、本化合物の使用は、皮膚を加湿するのみならず、皮膚の保護機能も改善する。
【００３７】
図３は、化合物２α−メチルＰが、骨細胞で、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と同様の転写活性を有することを示す。本結果は、図２の細胞分化活性とともに、２α−メチルＰは、細胞分化、遺伝子転写を起こす場合及び細胞増殖を抑制する場合に直接的な細胞活性を有するため、乾癬に極めて有効であろうことを示唆する。上記データは、さらに、２α−メチルＰが、特に、白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌及び前立腺癌に対する抗癌剤としての活性が有意であることを示す。
【００３８】
図６は、２α−メチルＰには、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の発現を抑制する機能があるが、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３程強力ではないことを示す。
【００３９】
２α−メチルＰはＨＬ−６０分化に対する活性が強いことから、副甲状腺の増殖を抑制する場合及びプレプロ副甲状腺遺伝子の抑制において活性であることを示唆する。
【００４０】
実験方法
ビタミンＤ受容体結合
試験材料
タンパク質源
完全長組換えラット受容体は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Codon Plus ＲＩＬ細胞中で発現させて二つの異なるカラムクロマトグラフィー系を用いて精製して均一にした。最初の系は本タンパク質上のＣ末端ヒスチジン標識を利用するニッケル親和性樹脂であった。この樹脂から溶出したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー（Ｓ−Sepharose Fast Flow）を用いてさらに精製した。精製したタンパク質のアリコートを、液体窒素中で急速冷凍して−８０℃で使用まで貯蔵した。結合アッセイで用いるために、本タンパク質を、０．１％ Chaps洗浄剤を含有するＴＥＤＫ５０（50mM Tris, 1.5mM EDTA, pH7.4, 5mM DTT, 150mM KCl）で希釈した。受容体タンパク質及びリガンド濃度を最適化して、加えた放射性標識リガンドのうち受容体に結合するものが２０％以下になるようにした。
【００４１】
研究用試薬
未標識リガンドをエタノールに溶解し、ＵＶ分光測光を用いて濃度を決定した（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３：モル吸光係数＝１８，２００及びλｍａｘ＝２６５ｎｍ；類似体：モル吸光係数＝４２，０００及びλｍａｘ＝２５２ｎｍ）。放射性標識リガンド（３Ｈ−１，２５（ＯＨ）２Ｄ３，約１５９Ｃｉ／ミリモル）を、エタノール中に最終濃度が１ｎＭになるように加えた。
【００４２】
アッセイ条件
放射性標識リガンド及び未標識リガンドを最終エタノール濃度が１０％以下になるように希釈した１００ｍｃｌのタンパク質に加えて混合し、氷上で一晩インキュベートして結合平衡に到達させた。翌日、１００ｍｃｌのヒドロキシルアパタイトスラリー（５０％）を各試験管に加え、１０分間隔で３０分間混合した。ヒドロキシルアパタイトを遠心分離で回収後、０．５％ Triton Ｘ−１００を含有するTris−ＥＤＴＡ緩衝液（50mM Tris, 1.5mM EDTA, pH7.4）で３回洗浄した。最終洗浄後、ペレットを４ｍｌのBiosafeIIシンチレーション混合物が入っているシンチレーションバイアルに移して混合し、シンチレーション計数計に入れた。放射性標識リガンドのみが入っている試験管から総結合を決定した。
【００４３】
ＨＬ−６０分化
試験材料
研究用試薬
研究用試薬をエタノールに溶解し、ＵＶ分光測光を用いて濃度を決定した。連続希釈液を調製して、一定範囲の薬物濃度を細胞培養物中に存在するエタノールの最終濃度（０．２％以下）を変更せずに調べられるようにした。
【００４４】
細胞
ヒト前骨髄球性白血病（ＨＬ６０）細胞を、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で増殖した。本細胞を５％ＣＯ２の存在下で３７℃でインキュベートした。
【００４５】
アッセイ条件
ＨＬ６０細胞を１．２×１０５個／ｍｌで播種した。播種から８時間後、二重反復試験で細胞を試薬で処理した。４日後、上記細胞を収集してニトロブルーテトラゾリウム還元アッセイを行った（Collins et al., 1979; J. Exp. Med. 149:969-974）。全２００個の細胞を計数し、細胞内に黒〜青色ホルマザン沈着物を含有した数を記録して分化細胞の百分率を決定した。単球細胞への分化のアッセイは食細胞活性を測定して決定した（データ示さず）。
【００４６】
インビトロ転写活性
転写活性は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に２４−ヒドロキシラーゼ（２４Ｏｈａｓｅ）遺伝子プロモーターで安定にトランスフェクションさせたＲＯＳ１７／２．８（骨）細胞で測定した（Arbour et al., 1998）。一定範囲の用量で細胞を与えた。投与１６時間後、細胞を回収し、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
ＲＬＵ＝相対ルシフェラーゼ単位
【００４７】
腸管カルシウム輸送及び骨カルシウム動員
離乳Sprague-Dawley雄ラットを、Diet１１（０．４７％Ｃａ）飼料＋ＡＥＫで１週間、次に、Diet１１（０．０２％Ｃａ）飼料＋ＡＥＫで３週間給餌した。次に、上記ラットを、０．４７％Ｃａ含有飼料を１週間、次に０．０２％Ｃａ含有飼料を２週間へと切り換えた。用量投与は０．０２％カルシウム飼料での最終週で開始した。ｉｐ用量を４回連続して約２４時間隔で与えた。最終投与から２４時間後、首を切断して血液を回収して、血清カルシウム濃度を骨カルシウム動員の指標として決定した。腸管カルシウム輸送分析のため、腸管の最初の１０ｃｍを外転腸嚢法（everted gut sac method）を用いて収集した。
【００４８】
ＰＴＨ抑制及び高カルシウム血症
種
成熟Sprague-Dawley雌ラットを、Harlan（Madison, WI）より入手した。
【００４９】
養畜
受取時に、被験動物を個々の尾のマークで識別した。被験動物を、吊り下げステンレス鋼製ワイヤ底ケージに収容した。各ケージに１匹の動物を収容した。動物室は、温度６８〜７２°Ｆ及び相対湿度２５〜７５％で維持した。待機室は１日に１２時間明るくなるように設定した。
【００５０】
０．４７％及び０．３％のリン並びに脂溶性ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びＫ含有精製齧歯類用飼料（Suda et al., Purified Rodent Diet−Diet １１）と水を随意に与えた。
【００５１】
処置群
被験動物を、無作為に振り分けて処置群とした（５匹／群）。用量は全て１００マイクロリットルのプロピレングリコールで腹腔内投与した。用量を４〜７回連続して約２４時間隔で与えた。投薬は、被験動物を少なくとも１週間順応させた後に開始した。
【００５２】
用量調製
対照物質
負対照物質
負対照物質は、エタノール（＜５％）及びプロピレングリコールを容量測定し、混合後、２〜８℃で貯蔵して調製した。
【００５３】
正対照物質
１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、エタノールストック溶液の濃度をＵＶ分光測光を用いて決定して調製した（吸光係数＝１８，２００及びλｍａｘ＝２６５ｎｍ）。１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の必要量をプロピレングリコールで容量測定して、最終溶液中のエタノールが５％未満になるようにした。本溶液を混合後、２〜８℃で貯蔵した。
【００５４】
試験材料
類似体は、エタノールストック溶液の濃度をＵＶ分光測光を用いて最初に決定して調製した（吸光係数＝４２，０００及びλｍａｘ＝２５２ｎｍ）。次に、類似体溶液をプロピレングリコールに容量的に加えて、最終溶液中のエタノールが５％未満になるようにした。本溶液を混合し、２〜８℃で貯蔵した。
【００５５】
用量投与方法
対照品も試験品も、１００マイクロリットルを腹腔内注射で、約２４時間間隔で連続４〜７日間投与した。１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、連続４日間与えたが、試験薬物は連続７日間与えた。
【００５６】
血清ＰＴＨレベル
最終投与から２４時間後、尾動脈から血液を回収して、生物活性血清ＰＴＨ濃度を、Immutopics, Inc.（San Clemente, CA）製のラットBioActive Intact ＰＴＨ ＥＬＩＳＡ Kit を用いて測定した。
【００５７】
血清カルシウム分析
最終投与から２４時間後、各実験動物の尾動脈から約１ｍｌの血液を回収した。上記血液を室温で凝固させた後、３０００×ｇで１５分間遠心分離した。本血清をポリプロピレン管に移して−２０℃で冷凍した。カルシウムレベルは、本血清を０．１％塩化ランタン（lanthum）で希釈し、原子吸光分光光度計（Perkin Elmer Model ３１１０，Shelton, CT）で吸光度を測定して決定した。
【００５８】
データの解釈
ＶＤＲ結合、ＨＬ６０細胞分化及び転写活性
２α−メチルＰ（Ｋｉ＝９．４×１０−１０Ｍ）は、完全長組換えラットビタミンＤ受容体への結合について［３Ｈ］−１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３との競合能が天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｋｉ＝１．３×１０−１０Ｍ）より僅かに低い（図１）。さらに、ＨＬ６０分化促進能（効力又は力価）は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＥＣ５０＝３．６×１０−９Ｍ）と比較すると、２α−メチルＰ（ＥＣ５０＝３．８×１０−８Ｍ）とほとんど差異がない（図２を参照）。さらに、化合物２α−メチルＰ（ＥＣ５０＝３．３×１０−９Ｍ）は、骨細胞で１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＥＣ５０＝２．９×１０−１０Ｍ）と同様の転写活性である（図３を参照）。上記結果は、２α−メチルＰが、細胞分化、遺伝子転写を引き起こす場合及び細胞増殖を抑制する場合に直接的な細胞活性を有するため、乾癬に極めて有効であることを示唆する。本データは、さらに、２α−メチルＰが、特に、白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌及び前立腺癌に対する抗癌剤として、さらに、乾燥皮膚（皮膚水和の欠如）、過度の皮膚たるみ（不十分な皮膚引き締め）、不十分な皮脂分泌及びしわ等の皮膚状態に対する活性が有意であることを示す。それは、さらに、続発性副甲状腺機能亢進を抑制する活性が極めて高いと考えられる。
【００５９】
ビタミンＤ欠乏動物における骨からのカルシウム動員及び腸管カルシウム吸収
低カルシウム飼料（０．０２％）のビタミンＤ欠乏ラットを用いて腸管及び骨における２α−メチルＰ及び１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の活性を試験した。予想されたように、天然ホルモン（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）では、全ての用量で血清カルシウムレベルが増加した（図４）。図４は、２α−メチルＰが骨からカルシウムを動員する活性が、あったとしてもほとんどないことを示す。２α−メチルＰを８７ｐｍｏｌ／日で連続４日間投与しても骨カルシウムの動員は起こらなかったし、２α−メチルＰの量を２６０ｐｍｏｌ／日、その後、７８０ｐｍｏｌ／日、最後に、２３４０ｐｍｏｌ／日と増やしても、実質的な影響は全くなかった。
【００６０】
腸管カルシウム輸送を同じ動物群で外転腸嚢法を用いて評価した（図５）。その結果、化合物２α−メチルＰを、８７ｐｍｏｌ／日、２６０ｐｍｏｌ／日、７８０ｐｍｏｌ／日又は２３４０ｐｍｏｌ／日で投与した場合、腸管カルシウム輸送を促進しないが、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、２６０ｐｍｏｌ／日の用量での有意の増加を促進することを示す。従って、２α−メチルＰは、試験した用量で腸管カルシウム輸送活性が本質的にないと結論することができる。
【００６１】
ＰＴＨ抑制
ＰＴＨ抑制における２α−メチルＰ及び１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の活性も調べた。予想されたように、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３を１００ｐｍｏｌ／日で投与した場合、１００％のＰＴＨを抑制した。図６は、さらに、２α−メチルＰは、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３程有効ではないものの、ＰＴＨを抑制することを示す。２α−メチルＰを５００ｐｍｏｌ／日及び１５００ｐｍｏｌ／日で投与すると、約２０％のＰＴＨが抑制され、４５００ｐｍｏｌ／日で投与すると、約６０％のＰＴＨが抑制された。本結果は、図４及び図５のデータと相俟って、２α−メチルＰは、血中カルシウムレベルを上昇させずにＰＴＨを抑制する機能があるため、腎性骨ジストロフィの続発性副甲状腺機能亢進を治療する場合に極めて有効であろうことを示唆している。
【００６２】
本結果は、２α−メチルＰが本明細書中に記載の多数のヒトの治療の優れた候補物質であること及び腎性骨ジストロフィの続発性副甲状腺機能亢進、自己免疫疾患、癌及び乾癬等の多数の状態で特に有用でありうることを示す。２α−メチルＰは、（１）有意のＶＤＲ結合、転写活性及び細胞分化活性を有する；（２）１，２５（ＯＨ）２Ｄ３とは異なり、高カルシウム血症の易罹病性がない；及び（３）容易に合成されるという理由で、乾癬を治療するための優れた候補物質である。２α−メチルＰはまた、ビタミンＤ受容体への有意の結合活性を有し、ＰＴＨ発現を抑制するが、血清カルシウムを高める機能がほとんどなく、腎性骨ジストロフィの続発性副甲状腺機能亢進の治療に特に有用でありうる。
【００６３】
本データは、さらに、本発明の化合物２α−メチルＰが、免疫系の不均衡を特徴とする、例えば、多発性硬化症、狼瘡、真性糖尿病、宿主対移植片拒絶反応及び臓器移植拒絶反応を含む自己免疫疾患のヒトの障害の治療及び予防に；さらに、関節リウマチ、喘息、及びセリアック病、潰瘍性大腸炎及びクローン病等の炎症性腸疾患等の炎症性疾患の治療に特に適しうることを示す。ざ瘡、脱毛症及び高血圧症は、本発明の化合物２α−メチルＰで治療できる他の症状である。
【００６４】
式Ｉ、特に式Ｉａを有する本発明の化合物は、さらに、動物対象の肥満症を予防又は治療する、脂肪細胞分化を阻害する、ＳＣＤ−１遺伝子転写を阻害する及び／又は体脂肪を減少させる場合に有用である。従って、ある態様では、動物対象の肥満症を予防又は治療する、脂肪細胞分化を阻害する、ＳＣＤ−１遺伝子転写を阻害する及び／又は体脂肪を減少させる方法は、その動物対象に、式Ｉを有する１又はそれ以上の化合物、又は１又はそれ以上の化合物を包含する医薬組成物の有効量を投与することを包含する。化合物又は医薬組成物の対象への投与は、動物対象の脂肪細胞分化を阻害する、遺伝子転写を阻害する、及び／又は体脂肪を減少させる。その動物は、ヒト、イヌ又はネコ等の家畜、又は農産物用動物、特に、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ又はウズラのような家禽、並びに、ウシ、ヒツジ、ヤギ又はブタ等のヒト消費用食肉を提供する動物でもよい。
【００６５】
予防及び／又は治療目的のため、式Ｉで定義される本発明の化合物は、医薬的用途のため、無害な溶媒中の溶液又は適する溶媒又は担体中のエマルジョン、懸濁液又は分散として、又は丸剤、錠剤又はカプセル剤として固形担体と共に、当該技術分野で公知の慣用法により製剤化できる。本製剤はいずれも、安定化剤、酸化防止剤、結合剤、着色剤又は乳化剤又は風味調節剤等の他の医薬的に許容しうる且つ無毒性の賦形剤を含有してもよい。
【００６６】
式Ｉの化合物、特に、２α−メチルＰは、経口で、局所に、非経口で、直腸に、鼻腔内に、舌下に又は経皮で投与することができる。本化合物は、好都合には、注射により又は静脈内注入又は適する滅菌液剤により、又は消化管を経る液状又は固形用量の形で、又はクリーム剤、軟膏剤、貼付剤、又は経皮用途に適する類似のビヒクルの形で投与される。化合物Ｉ、特に、２α−メチルＰの用量は、０．０１μｇ／日〜１０００μｇ／日、好ましくは、約０．１μｇ／日〜約５００μｇ／日で予防及び／又は治療目的に適し、本用量は、治療される疾患、その重症度及び対象の応答により調整されることは当該技術分野で十分に理解される。本化合物は作用特異性を示すため、各々、好適には、様々な程度の骨無機質動員及びカルシウム輸送刺激が好都合であることが判明している状態では、単独で、又は段階的な用量の他の活性なビタミンＤ化合物、例えば、１α−ヒドロキシビタミンＤ２又はＤ３、又は１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と共に投与することができる。
【００６７】
上記治療に用いる組成物は、上の式Ｉ及び式Ｉａで定義される化合物Ｉ、特に、２α−メチルＰの活性成分としての有効量と、適当な担体を含有する。本発明で用いる上記化合物の有効量は、組成物１ｇｍにつき約０．０１μｇ〜約１０００μｇ、好ましくは、組成物１グラムにつき約０．１μｇ〜約５００μｇであり、局所に、経皮で、経口で、直腸に、鼻腔内に、舌下に又は非経口で、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日、好ましくは、約０．１μｇ／日〜約５００μｇ／日の用量で投与することができる。
【００６８】
化合物Ｉ、特に、２α−メチルＰは、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、局所貼付剤、丸剤、カプセル剤又は錠剤、坐剤、エアゾル剤として、又は医薬的に無害かつ許容しうる溶媒又は油中の液剤、乳剤、分散剤又は懸濁剤として液体で製剤化することができるが、本製剤は、さらに、安定化剤、酸化防止剤、乳化剤、着色剤、結合剤又は風味調節剤等の他の医薬的に無害な又は有益な成分を含有してよい。
【００６９】
化合物Ｉ、特に、２α−メチルＰは、好都合には、前骨髄球を正常マクロファージへ分化させるのに十分な量で投与することができる。上記用量は適しているが、与えられる量は、疾患の重症度、対象の状態及び応答に応じて調整されるべきであることは当該技術分野で十分に理解される。
【００７０】
本発明の製剤は、活性成分を、医薬的に許容しうる担体と共に、すなわち場合により、他の治療的成分と共に含む。その担体は、製剤の他の成分と相溶性であり、レシピエントに有害でないという意味で、「許容しうる」べきである。
【００７１】
経口投与に適する本発明の製剤は、所定量の活性成分を各々含有するカプセル剤、サシェ剤、錠剤又はロゼンジとして分離した単位の剤型；粉末又は顆粒剤の剤型；水性液又は非水性液中の溶液又は懸濁液の剤型；又は水中油エマルジョン又は油中水エマルジョンの剤型であってよい。
【００７２】
直腸投与用の製剤は、活性成分と、カカオ脂等の担体を包含する坐剤の剤型、又は浣腸剤の剤型であってよい。
【００７３】
非経口投与に適する製剤は、好都合には、活性成分の滅菌油状又は水性製剤を含むが、好ましくは、レシピエントの血液と等張である。
【００７４】
局所投与に適する製剤には、液状又は半液状製剤であって、リニメント剤、ローション剤、外用薬（applicants）等、水中油エマルジョン又は油中水エマルジョンであって、クリーム剤、軟膏剤又はペースト剤等；滴剤等の液剤又は懸濁剤；又は噴霧剤が含まれる。
【００７５】
鼻腔内投与用には、スプレー缶、ネブライザー又はアトマイザーで計量分配される粉末、自己推進性又は噴霧製剤の吸入を用いることができる。本製剤の粒度は、計量分配される場合、好ましくは、１０〜１００μの範囲内である。
【００７６】
本製剤は、好都合には、用量単位の形であってもよく、医薬技術分野において周知のいかなる方法により製造してもよい。「用量単位」という用語は、活性成分それ自体又は固形又は液状医薬希釈剤又は担体との混合物として含む物理的かつ化学的に安定な単位用量として患者に投与することができる単一、すなわち、単回の用量を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、「２α−メチルＰ」という２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールを、天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、以下、「１，２５（ＯＨ）２Ｄ３」と比較した場合の種々の生物学的活性を示し、完全長組換えラットビタミンＤ受容体への結合に［３Ｈ］−１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３と競合する、２α−メチルＰ及び１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の相対活性を示すグラフである。
【図２】図２は、「２α−メチルＰ」という２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールを、天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、以下、「１，２５（ＯＨ）２Ｄ３」と比較した場合の種々の生物学的活性を示し、２α−メチルＰ及び１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の濃度の関数としてのＨＬ−６０細胞分化比率（分化パーセント）を示すグラフである。
【図３】図３は、「２α−メチルＰ」という２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールを、天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、以下、「１，２５（ＯＨ）２Ｄ３」と比較した場合の種々の生物学的活性を示し、２α−メチルＰと比較した場合の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３のインビトロ転写活性を示すグラフである。
【図４】図４は、「２α−メチルＰ」という２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールを、天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、以下、「１，２５（ＯＨ）２Ｄ３」と比較した場合の種々の生物学的活性を示し、２α−メチルＰと比較した場合の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の骨カルシウム動員活性を示す棒グラフである。
【図５】図５は、「２α−メチルＰ」という２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールを、天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、以下、「１，２５（ＯＨ）２Ｄ３」と比較した場合の種々の生物学的活性を示し、２α−メチルＰと比較した場合の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の腸管カルシウム輸送活性を示す棒グラフである。
【図６】図６は、「２α−メチルＰ」という２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールを、天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、以下、「１，２５（ＯＨ）２Ｄ３」と比較した場合の種々の生物学的活性を示し、ビヒクル対照と比較した場合の、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３及び２α−メチルＰのＰＴＨ抑制％を示す棒グラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンＤ化合物、より具体的には、２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール及びその医薬的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然ホルモンである１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３及びそのエルゴステロール系列の類似体、すなわち、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２は、動物及びヒトのカルシウムホメオスタシスの極めて強力な調節因子であることが知られているが、細胞分化におけるその活性も、Ostrem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2610 (1987)で確認された。１α−ヒドロキシビタミンＤ３、１α−ヒドロキシビタミンＤ２、種々の側鎖同族ビタミン及びフッ素化類似体を含む、これら代謝産物の多数の構造類似体が、製造され、試験されている。本化合物のうちいくつかは、細胞分化及びカルシウム調節において活性の興味深い分離を示す。この活性の相違は、腎性骨ジストロフィ、ビタミンＤ抵抗性くる病、骨粗鬆症、乾癬及びある種の悪性疾患等の様々な疾患の治療に有用でありうる。
【０００３】
別のクラスのビタミンＤ類似体、すなわち、いわゆる１９−ノル−ビタミンＤ化合物は、ビタミンＤ系に典型的なＡ環環外メチレン基（炭素１９）が２個の水素原子で置換されていることを特徴とする。このような１９−ノル類似体（例えば、１α，２５−ジヒドロキシ−１９−ノル−ビタミンＤ３）の生物学的試験は、細胞分化を誘導する場合に高力価となる選択的活性プロフィールとカルシウム動員活性が極めて低いことを示した。従って、本化合物は、悪性疾患の治療又は様々な皮膚障害の治療のための治療薬として潜在的に有用である。このような１９−ノル−ビタミンＤ類似体について二つの異なる合成方法が報告された（Perlman et al., Tetrahedron Lett. 31, 1823 (1990); Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991) 及び DeLucaら、米国特許第５，０８６，１９１号）。
【０００４】
米国特許第４，６６６，６３４号には、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の２β−ヒドロキシ及びアルコキシ（例えば、ＥＤ−７１）類似体が記載されており、中外グループにより、骨粗鬆症薬の薬物及び抗腫瘍薬としての可能性が検討された。Okano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 1444 (1989)も参照されたい。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の他の２−置換（ヒドロキシアルキル、例えば、ＥＤ−１２０及びフルオロアルキル基）Ａ環類似体も、製造され、試験された（Miyamoto et al., Chem. Pharm. Bull. 41, 1111 (1993); Nishii et al., Osteoporosis Int. Suppl. 1, 190 (1993); Posner et al., J. Org. Chem. 59, 7855 (1994), and J. Org. Chem. 60, 4617 (1995)）。
【０００５】
１α，２５−ジヒドロキシ−１９−ノルビタミンＤ３の２−置換類似体、すなわち、２位にヒドロキシ基又はアルコキシ基で（DeLucaら、米国特許第５，５３６，７１３号）、２−アルキル基で（DeLucaら、米国特許第５，９４５，４１０号）及び２−アルキリデン基で（DeLucaら、米国特許第５，８４３，９２８号）置換された化合物も合成されたが、それらは、興味深く選択的な活性プロフィールを示す。上記研究は全て、ビタミンＤ受容体中の結合部位が、合成されたビタミンＤ類似体のＣ−２位に異なる置換基で置換できることを示す。
【０００６】
薬理学的に重要なビタミンＤ化合物の１９−ノル−クラスの調査を精力的に続けて、炭素２（Ｃ−２）にメチレン置換基、炭素１（Ｃ−１）にヒドロキシル基、及び炭素２０（Ｃ−２０）へ結合した短い側鎖の存在を特徴とする類似体をも合成して試験した。１α−ヒドロキシ−２−メチレン−１９−ノル−プレグナカルシフェロールは米国特許第６，５６６，３５２号に報告され、１α−ヒドロキシ−２−メチレン−１９−ノル−ホモプレグナカルシフェロールは米国特許第６，５７９，８６１号に報告され、そして１α−ヒドロキシ−２−メチレン−１９−ノル−ビスホモプレグナカルシフェロールは米国特許第６，６２７，６２２号に報告されている。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と比較したところ、３種類の本化合物は全て、ビタミンＤ受容体への結合活性及び細胞分化活性が比較的高いが、カルシウム血症活性（calcemic activity）は、あったとしても極めて低い。第６，５６６，３５２号、第６，５７９，８６１号及び第６，６２７，６２２号特許に開示されるように、上記化合物は、その生物学的活性のため、様々な医薬的使用の優れた候補物質となる。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、２α−メチル−１９−ノル−ビタミンＤ類似体、より具体的には、２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール、その生物学的活性及び本化合物の様々な医薬的使用に関する。これまでに知られていない、この新規な１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物は、２位にメチル基及び１７位（Ｃ−１７）にイソプロピル置換基がある１９−ノル−ビタミンＤ類似体である。
【０００８】
構造的に、この２α−メチル−１９−ノル−ビタミンＤ類似体は以下に示す一般式Ｉ：
【０００９】
【化１】
【００１０】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を特徴とする。好ましい類似体は、次の式Ｉａ：
【００１１】
【化２】
【００１２】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである。
【００１３】
上の化合物Ｉ、特にＩａは、望ましく、極めて好都合な生物学的活性態様を示す。本化合物は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の場合と比較すると、ビタミンＤ受容体への結合が比較的高いこと特徴とするが、腸管カルシウム輸送活性は極めて低いこと特徴とし、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と比較すると、カルシウムを骨から動員する機能は極めて低い。従って、本化合物は、カルシウム血症活性があったとしても極めて低いと特定することができる。プレプロ副甲状腺ホルモン遺伝子（Darwish & DeLuca, Arch. Biochem. Biophys. 365, 123-130, 1999）及び副甲状腺増殖を抑制する場合、血清カルシウムを超生理学的レベルに上昇させることは望ましくない。カルシウム血症活性が全くない又は極めて低く、分化には極めて活性な本類似体は、腎性骨ジストロフィの続発性副甲状腺機能亢進の抑制の治療に有用であると考えられる。
【００１４】
本発明の化合物Ｉ、特にＩａはさらに、免疫系の不均衡を特徴とする、例えば、多発性硬化症、狼瘡、真性糖尿病、宿主対移植片拒絶反応及び臓器移植拒絶反応を含めた自己免疫疾患のヒト障害の治療及び予防に；さらに、関節リウマチ、喘息、並びにセリアック病、潰瘍性大腸炎及びクローン病等の炎症性腸疾患等の炎症性疾患の治療に、特に適することが見出された。ざ瘡、脱毛症及び高血圧症は、本発明の化合物で治療することができる他の症状である。
【００１５】
上の化合物Ｉ、特にＩａはさらに、細胞分化活性が比較的高いことを特徴とする。従って、本化合物はさらに、乾癬の治療用又は、特に、白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌及び前立腺癌に対する抗癌剤としての治療薬をもたらす。さらに、その細胞分化活性が比較的高いため、本化合物は、しわ、適切な皮膚水和の欠如、すなわち、乾燥皮膚、適切な皮膚引き締めの欠如、すなわち、たるんだ皮膚、及び不十分な皮脂分泌を含めた様々な皮膚状態の治療用の治療薬をもたらす。従って、本化合物を用いると、皮膚に加湿がもたらされるのみならず、皮膚の保護機能も改善される。
【００１６】
式Ｉ、特に式Ｉａの本発明の化合物は、さらに、動物個体の肥満症を予防又は治療する、脂肪細胞分化を阻害する、ＳＣＤ−１遺伝子転写を阻害及び／又は体脂肪を減少させる場合に有用である。従って、ある態様では、動物個体の肥満症を予防する又は治療する、脂肪細胞分化を阻害する、ＳＣＤ−１遺伝子転写を阻害する及び／又は体脂肪を減少させる方法としては、式Ｉの１又はそれ以上の化合物、あるいは１又はそれ以上の化合物を包含する医薬組成物の有効量を、その動物個体に投与することがあげられる。１又はそれ以上の化合物又は医薬組成物を個体へ投与することにより、動物個体の脂肪細胞分化が阻害され、遺伝子転写が阻害され及び／又は体脂肪が減少する。
【００１７】
１又はそれ以上の化合物は、上記疾患及び障害を治療するための組成物中に、組成物の約０．０１μｇ／ｇｍ〜約１０００μｇ／ｇｍ、好ましくは、組成物の約０．１μｇ／ｇｍ〜約５００μｇ／ｇｍの量で存在してよく、局所に、経皮で、経口で、直腸に、鼻腔内に、舌下に又は非経口で、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日、好ましくは、約０．１μｇ／日〜約５００μｇ／日の用量で投与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
炭素２（Ｃ−２）にメチル置換基及び炭素１７（Ｃ−１７）にイソプロピル置換基の存在を特徴とする１９−ノル−ビタミンＤ類似体である２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール（本明細書中２α−メチルＰという）を合成して試験した。本ビタミンＤ類似体は、Ｃ−２位の比較的小さいメチル基により、ビタミンＤ受容体への結合が妨げられることはないため、興味深い標的と考えられた。構造的に、この１９−ノル類似体は、本明細書中上記一般式Ｉａを特徴とし、その（保護されたヒドロキシの形の）プロドラッグは一般式Ｉで示される。
【００１９】
構造Ｉを有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール類似体の製造は、共通の一般的な方法、すなわち、トリス（トリフェニルホスフィン）ロジウム（Ｉ）クロリド［Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ'ｓ触媒（Ｐｈ３Ｐ）３ＲｈＣｌ］の存在下で効率よく行われる、一般式IIの２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール化合物中の炭素２でのエキソメチレン単位の選択的均一接触水素化により達成することができる。本還元条件は、Ｃ（２）＝ＣＨ２単位のみを還元させ、Ｃ（５）−Ｃ（８）ブタジエン部分は影響を受けない。単離物質は、Ｃ−２の立体配置が異なる２−メチル−１９−ノルービタミンＩ及びIIIのエピマー混合物（約１：１）である。その混合物は分離せずに用いることができ、所望の場合は、個々の２α−（式Ｉ）異性体及び２β−（式III）異性体を、有効なＨＰＬＣシステムで分離することができる。
【００２０】
【化３】
【００２１】
構造Ｉ、II及びIIIで、置換基Ｘ１及びＸ２は、上記で定義した基である。
【００２２】
一般的な構造IIを有する２−メチレン−１９−ノルホモプレグナカルシフェロール類似体は公知であり又は既知の方法で製造することができる。
【００２３】
化合物Ｉ、II及びIIIの合成方法全体は、本明細書中にその明細書が具体的に援用される、「２−アルキリデン−１９−ノル−ビタミンＤ化合物」という米国特許第５，８４３，９２８号に詳しく説明され、より完全に記載されている。
【００２４】
本明細書中及び請求の範囲中で用いられる「ヒドロキシ保護基」との用語は、ヒドロキシ官能基の一時的保護に一般的に用いられるいかなる基、例えば、アルコキシカルボニル基、アシル基、アルキルシリル基又はアルキルアリールシリル基（以下、簡潔には「シリル」基という）及びアルコキシアルキル基等があげられる。アルコキシカルボニル保護基は、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基又はアリルオキシカルボニル基等のアルキル−Ｏ−ＣＯ−基群である。「アシル」という用語は、１〜６個の炭素を有するアルカノイル基であって、その全ての異性体の形；又はオキサリル基、マロニル基、スクシニル基、グルタリル基等の、１〜６個の炭素を有するカルボキシアルカノイル基；又はベンゾイル基、又はハロ、ニトロ又はアルキルで置換されたベンゾイル基等の芳香族アシル基を意味する。本明細書及び請求の範囲中で用いられる「アルキル」という語は、１〜１０個の炭素を有する直鎖又は分岐状アルキル基であって、その全ての異性体の形を意味する。アルコキシアルキル保護基は、メトキシメチル基、エトキシメチル基、メトキシエトキシメチル基又はテトラヒドロフラニル基及びテトラヒドロピラニル基等の群である。好ましいシリル保護基は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ジブチルメチルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、フェニルジメチルシリル基、ジフェニル−ｔ−ブチルシリル基及び類似のアルキル化シリル基である。「アリール」という用語は、フェニル−、又はアルキル−、ニトロ−又はハロ−で置換されたフェニル基を意味する。
【００２５】
「保護されたヒドロキシ」基は、ヒドロキシ官能基の一時的又は永久的保護に一般的に用いられる上のいずれかの基、例えば、前に定義のシリル基、アルコキシアルキル基、アシル基又はアルコキシカルボニル基によって保護された又は誘導体化されたヒドロキシ基である。「ヒドロキシアルキル」、「重アルキル」及び「フルオロアルキル」という用語は、それぞれ、１個又はそれを超えるヒドロキシ基、重水素基又はフルオロ基で置換されたアルキル基を意味する。
【００２６】
より具体的には、化合物２α−メチルＰの製造の詳細な説明については、次の代表的な実施例及び説明、並びに本明細書中のスキーム１を参照すべきである。
【００２７】
この実施例において、アラビア数字（１、２、３）で示される具体的な生成物は、スキーム１に示された具体的な構造を意味する。
【実施例】
【００２８】
共通事項
紫外（ＵＶ）吸収スペクトルは、示した溶媒中で日立モデル６０−１００ＵＶ−ｖｉｓ分光計で記録した。１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、ジュウテリオクロロホルム中５００ＭＨｚで、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭ−５００ＦＴ分光計で記録した。化学シフト（δ）は、内部Ｍｅ４Ｓｉ（δ０．００）から低磁場に報告している。質量スペクトルは、Ｋｒａｔｏｓ ＭＳ−５５データシステムを装備したＫｒａｔｏs ＤＳ−５０ＴＣ計測器で７０ｅＶで記録した。試料は、１２０〜２５０℃に維持したイオン源中に直接挿入プローブにより導入した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、Ｍｏｄｅｌ ６０００Ａ溶媒デリバリーシステム、Ｍｏｄｅｌ ６ＵＫ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌインジェクター、Ｍｏｄｅｌ ４８６波長可変吸光度検出器及び示差Ｒ４０１屈折計を装備した Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ液体クロマトグラフで行った。
【００２９】
実施例１
２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール（１）の水素化
トリス（トリフェニルホスフィン）ロジウム（Ｉ）クロリド（３２．０ｍｇ，３４．６μｍｏｌ）を予め水素で飽和した（２０分間）乾燥ベンゼン（３５ｍＬ）に加えた。本混合物を室温で均一溶液が形成されるまで（約７０分）撹拌した。次に、乾燥ベンゼン（６ｍＬ）中のビタミン１（１１ｍｇ，３３．３μｍｏｌ）の溶液を加え、反応を連続水素流下で３．５時間続けた。ベンゼンを真空下で除去し、残留物をヘキサン／酢酸エチル（７：３）に再溶解し、ＷａｔｅｒｓシリカＳｅｐ−Ｐａｋ（Ｖａｃ １２ｃｃ）上に適用した。粗２−メチルビタミン（約１１ｍｇ）を同一溶媒系（３５ｍＬ）で溶出した。画分を合わせて蒸発させ、ＨＰＬＣ（１０ｍｍ×２５ｃｍ Ｚｏｒｂａｘ−Ｓｉｌカラム、４ｍＬ／分）で、ヘキサン／２−プロパノール（９０：１０）溶媒系を用いてさらに精製した。２α−及び２β−メチル−１９−ノルービタミン２及び３の混合物（約１：１）（５３：４７の比率；６．３７ｍｇ，５８％）はＲｖ２９ｍＬで単一ピークを生じた。双方のエピマーの分離は逆相ＨＰＬＣ（６．２ｍｍ×２５ｃｍ Ｚｏｒｂａｘ−ＯＤＳカラム、２ｍＬ／分）で、メタノール／水（９０：１０）溶媒系を用いて行った。２β−メチルビタミン３をＲｖ１７ｍＬで回収し、２α−エピマー２はＲｖ１９ｍＬで回収した。
【００３０】
2:UV(エタノール中)λmax242.0, 250.0, 260.0nm; 1H NMR (CDCl3) δ0.531 (3H, s, 18-H3), 0.860 及び 0.940(3H及び3H,各々d, J=6.5 Hz, 21-及び22-H3),1.134 (3H, d, J=6.8 Hz, 2α-CH3), 2.13 (1H,〜t, J〜11 Hz, 4β-H), 2.22 (1H, br d, J〜13 Hz, 10β-H),2.60 (1H, dd, J=12.9, 4.1 Hz, 4α-H), 2.80 (2H, m, 9β-及び10α-H), 3.61 (1H, m, w/2=23 Hz, 3α-H), 3.96 (1H, m, w/2=14 Hz, 1β-H), 5.82 及び 6.37 (1H及び1H,各々d, J=11.2 Hz, 7-及び6-H); MS m/z (相対強度) 332 (M+, 100), 289(37), 253(21), 177(67), 135(76), 91(78);Ｃ２２Ｈ３６Ｏ２の正確な理論質量３３２．２７１５，実測値３３２．２７１２。
【００３１】
【化４】
【００３２】
２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールの生物学的活性
メチル基の２位への導入、及び１α−ヒドロキシ−１９−ノルービタミンＤ３の側鎖中の炭素２３、２４、２５、２６及び２７の脱離は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と比較したところ、完全長組換えラットビタミンＤ受容体への結合にほとんど又は全く影響しなかった。化合物２α−メチルＰは、標準の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３と比較して、同等に十分に受容体に結合した（図１）。本結果から、化合物２α−メチルＰは同等の生物学的活性を有するであろうと考えられる。しかしながら、驚くべきことに、化合物２α−メチルＰは、固有の生物学的活性を有する極めて選択的な類似体である。
【００３３】
図５は、２α−メチルＰは、天然ホルモン１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）と比較して、腸管カルシウム輸送を刺激する活性がほとんどないことを示す。
【００３４】
図４は、２α−メチルＰは、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３と比較して、骨カルシウム動員活性がほとんどないことを示す。
【００３５】
従って、図４及び図５は、２α−メチルＰが、カルシウム血症活性があっても極めて低いと特定できることを示す。
【００３６】
図２は、２α−メチルＰは、ＨＬ−６０細胞分化について、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３とほぼ同程度に強力であることを示し、乾癬及び癌、特に、白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌及び前立腺癌の治療のための優れた候補物質となる。さらに、本化合物は細胞分化活性が比較的高いため、しわ、適切な皮膚水和の欠如、すなわち、乾燥皮膚、適切な皮膚引き締めの欠如、すなわち、たるんだ皮膚、及び不十分な皮脂分泌を含めた様々な皮膚状態の治療用の治療薬をもたらす。従って、本化合物の使用は、皮膚を加湿するのみならず、皮膚の保護機能も改善する。
【００３７】
図３は、化合物２α−メチルＰが、骨細胞で、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と同様の転写活性を有することを示す。本結果は、図２の細胞分化活性とともに、２α−メチルＰは、細胞分化、遺伝子転写を起こす場合及び細胞増殖を抑制する場合に直接的な細胞活性を有するため、乾癬に極めて有効であろうことを示唆する。上記データは、さらに、２α−メチルＰが、特に、白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌及び前立腺癌に対する抗癌剤としての活性が有意であることを示す。
【００３８】
図６は、２α−メチルＰには、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の発現を抑制する機能があるが、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３程強力ではないことを示す。
【００３９】
２α−メチルＰはＨＬ−６０分化に対する活性が強いことから、副甲状腺の増殖を抑制する場合及びプレプロ副甲状腺遺伝子の抑制において活性であることを示唆する。
【００４０】
実験方法
ビタミンＤ受容体結合
試験材料
タンパク質源
完全長組換えラット受容体は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Codon Plus ＲＩＬ細胞中で発現させて二つの異なるカラムクロマトグラフィー系を用いて精製して均一にした。最初の系は本タンパク質上のＣ末端ヒスチジン標識を利用するニッケル親和性樹脂であった。この樹脂から溶出したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー（Ｓ−Sepharose Fast Flow）を用いてさらに精製した。精製したタンパク質のアリコートを、液体窒素中で急速冷凍して−８０℃で使用まで貯蔵した。結合アッセイで用いるために、本タンパク質を、０．１％ Chaps洗浄剤を含有するＴＥＤＫ５０（50mM Tris, 1.5mM EDTA, pH7.4, 5mM DTT, 150mM KCl）で希釈した。受容体タンパク質及びリガンド濃度を最適化して、加えた放射性標識リガンドのうち受容体に結合するものが２０％以下になるようにした。
【００４１】
研究用試薬
未標識リガンドをエタノールに溶解し、ＵＶ分光測光を用いて濃度を決定した（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３：モル吸光係数＝１８，２００及びλｍａｘ＝２６５ｎｍ；類似体：モル吸光係数＝４２，０００及びλｍａｘ＝２５２ｎｍ）。放射性標識リガンド（３Ｈ−１，２５（ＯＨ）２Ｄ３，約１５９Ｃｉ／ミリモル）を、エタノール中に最終濃度が１ｎＭになるように加えた。
【００４２】
アッセイ条件
放射性標識リガンド及び未標識リガンドを最終エタノール濃度が１０％以下になるように希釈した１００ｍｃｌのタンパク質に加えて混合し、氷上で一晩インキュベートして結合平衡に到達させた。翌日、１００ｍｃｌのヒドロキシルアパタイトスラリー（５０％）を各試験管に加え、１０分間隔で３０分間混合した。ヒドロキシルアパタイトを遠心分離で回収後、０．５％ Triton Ｘ−１００を含有するTris−ＥＤＴＡ緩衝液（50mM Tris, 1.5mM EDTA, pH7.4）で３回洗浄した。最終洗浄後、ペレットを４ｍｌのBiosafeIIシンチレーション混合物が入っているシンチレーションバイアルに移して混合し、シンチレーション計数計に入れた。放射性標識リガンドのみが入っている試験管から総結合を決定した。
【００４３】
ＨＬ−６０分化
試験材料
研究用試薬
研究用試薬をエタノールに溶解し、ＵＶ分光測光を用いて濃度を決定した。連続希釈液を調製して、一定範囲の薬物濃度を細胞培養物中に存在するエタノールの最終濃度（０．２％以下）を変更せずに調べられるようにした。
【００４４】
細胞
ヒト前骨髄球性白血病（ＨＬ６０）細胞を、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で増殖した。本細胞を５％ＣＯ２の存在下で３７℃でインキュベートした。
【００４５】
アッセイ条件
ＨＬ６０細胞を１．２×１０５個／ｍｌで播種した。播種から８時間後、二重反復試験で細胞を試薬で処理した。４日後、上記細胞を収集してニトロブルーテトラゾリウム還元アッセイを行った（Collins et al., 1979; J. Exp. Med. 149:969-974）。全２００個の細胞を計数し、細胞内に黒〜青色ホルマザン沈着物を含有した数を記録して分化細胞の百分率を決定した。単球細胞への分化のアッセイは食細胞活性を測定して決定した（データ示さず）。
【００４６】
インビトロ転写活性
転写活性は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に２４−ヒドロキシラーゼ（２４Ｏｈａｓｅ）遺伝子プロモーターで安定にトランスフェクションさせたＲＯＳ１７／２．８（骨）細胞で測定した（Arbour et al., 1998）。一定範囲の用量で細胞を与えた。投与１６時間後、細胞を回収し、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
ＲＬＵ＝相対ルシフェラーゼ単位
【００４７】
腸管カルシウム輸送及び骨カルシウム動員
離乳Sprague-Dawley雄ラットを、Diet１１（０．４７％Ｃａ）飼料＋ＡＥＫで１週間、次に、Diet１１（０．０２％Ｃａ）飼料＋ＡＥＫで３週間給餌した。次に、上記ラットを、０．４７％Ｃａ含有飼料を１週間、次に０．０２％Ｃａ含有飼料を２週間へと切り換えた。用量投与は０．０２％カルシウム飼料での最終週で開始した。ｉｐ用量を４回連続して約２４時間隔で与えた。最終投与から２４時間後、首を切断して血液を回収して、血清カルシウム濃度を骨カルシウム動員の指標として決定した。腸管カルシウム輸送分析のため、腸管の最初の１０ｃｍを外転腸嚢法（everted gut sac method）を用いて収集した。
【００４８】
ＰＴＨ抑制及び高カルシウム血症
種
成熟Sprague-Dawley雌ラットを、Harlan（Madison, WI）より入手した。
【００４９】
養畜
受取時に、被験動物を個々の尾のマークで識別した。被験動物を、吊り下げステンレス鋼製ワイヤ底ケージに収容した。各ケージに１匹の動物を収容した。動物室は、温度６８〜７２°Ｆ及び相対湿度２５〜７５％で維持した。待機室は１日に１２時間明るくなるように設定した。
【００５０】
０．４７％及び０．３％のリン並びに脂溶性ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びＫ含有精製齧歯類用飼料（Suda et al., Purified Rodent Diet−Diet １１）と水を随意に与えた。
【００５１】
処置群
被験動物を、無作為に振り分けて処置群とした（５匹／群）。用量は全て１００マイクロリットルのプロピレングリコールで腹腔内投与した。用量を４〜７回連続して約２４時間隔で与えた。投薬は、被験動物を少なくとも１週間順応させた後に開始した。
【００５２】
用量調製
対照物質
負対照物質
負対照物質は、エタノール（＜５％）及びプロピレングリコールを容量測定し、混合後、２〜８℃で貯蔵して調製した。
【００５３】
正対照物質
１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、エタノールストック溶液の濃度をＵＶ分光測光を用いて決定して調製した（吸光係数＝１８，２００及びλｍａｘ＝２６５ｎｍ）。１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の必要量をプロピレングリコールで容量測定して、最終溶液中のエタノールが５％未満になるようにした。本溶液を混合後、２〜８℃で貯蔵した。
【００５４】
試験材料
類似体は、エタノールストック溶液の濃度をＵＶ分光測光を用いて最初に決定して調製した（吸光係数＝４２，０００及びλｍａｘ＝２５２ｎｍ）。次に、類似体溶液をプロピレングリコールに容量的に加えて、最終溶液中のエタノールが５％未満になるようにした。本溶液を混合し、２〜８℃で貯蔵した。
【００５５】
用量投与方法
対照品も試験品も、１００マイクロリットルを腹腔内注射で、約２４時間間隔で連続４〜７日間投与した。１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、連続４日間与えたが、試験薬物は連続７日間与えた。
【００５６】
血清ＰＴＨレベル
最終投与から２４時間後、尾動脈から血液を回収して、生物活性血清ＰＴＨ濃度を、Immutopics, Inc.（San Clemente, CA）製のラットBioActive Intact ＰＴＨ ＥＬＩＳＡ Kit を用いて測定した。
【００５７】
血清カルシウム分析
最終投与から２４時間後、各実験動物の尾動脈から約１ｍｌの血液を回収した。上記血液を室温で凝固させた後、３０００×ｇで１５分間遠心分離した。本血清をポリプロピレン管に移して−２０℃で冷凍した。カルシウムレベルは、本血清を０．１％塩化ランタン（lanthum）で希釈し、原子吸光分光光度計（Perkin Elmer Model ３１１０，Shelton, CT）で吸光度を測定して決定した。
【００５８】
データの解釈
ＶＤＲ結合、ＨＬ６０細胞分化及び転写活性
２α−メチルＰ（Ｋｉ＝９．４×１０−１０Ｍ）は、完全長組換えラットビタミンＤ受容体への結合について［３Ｈ］−１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３との競合能が天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｋｉ＝１．３×１０−１０Ｍ）より僅かに低い（図１）。さらに、ＨＬ６０分化促進能（効力又は力価）は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＥＣ５０＝３．６×１０−９Ｍ）と比較すると、２α−メチルＰ（ＥＣ５０＝３．８×１０−８Ｍ）とほとんど差異がない（図２を参照）。さらに、化合物２α−メチルＰ（ＥＣ５０＝３．３×１０−９Ｍ）は、骨細胞で１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＥＣ５０＝２．９×１０−１０Ｍ）と同様の転写活性である（図３を参照）。上記結果は、２α−メチルＰが、細胞分化、遺伝子転写を引き起こす場合及び細胞増殖を抑制する場合に直接的な細胞活性を有するため、乾癬に極めて有効であることを示唆する。本データは、さらに、２α−メチルＰが、特に、白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌及び前立腺癌に対する抗癌剤として、さらに、乾燥皮膚（皮膚水和の欠如）、過度の皮膚たるみ（不十分な皮膚引き締め）、不十分な皮脂分泌及びしわ等の皮膚状態に対する活性が有意であることを示す。それは、さらに、続発性副甲状腺機能亢進を抑制する活性が極めて高いと考えられる。
【００５９】
ビタミンＤ欠乏動物における骨からのカルシウム動員及び腸管カルシウム吸収
低カルシウム飼料（０．０２％）のビタミンＤ欠乏ラットを用いて腸管及び骨における２α−メチルＰ及び１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の活性を試験した。予想されたように、天然ホルモン（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）では、全ての用量で血清カルシウムレベルが増加した（図４）。図４は、２α−メチルＰが骨からカルシウムを動員する活性が、あったとしてもほとんどないことを示す。２α−メチルＰを８７ｐｍｏｌ／日で連続４日間投与しても骨カルシウムの動員は起こらなかったし、２α−メチルＰの量を２６０ｐｍｏｌ／日、その後、７８０ｐｍｏｌ／日、最後に、２３４０ｐｍｏｌ／日と増やしても、実質的な影響は全くなかった。
【００６０】
腸管カルシウム輸送を同じ動物群で外転腸嚢法を用いて評価した（図５）。その結果、化合物２α−メチルＰを、８７ｐｍｏｌ／日、２６０ｐｍｏｌ／日、７８０ｐｍｏｌ／日又は２３４０ｐｍｏｌ／日で投与した場合、腸管カルシウム輸送を促進しないが、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、２６０ｐｍｏｌ／日の用量での有意の増加を促進することを示す。従って、２α−メチルＰは、試験した用量で腸管カルシウム輸送活性が本質的にないと結論することができる。
【００６１】
ＰＴＨ抑制
ＰＴＨ抑制における２α−メチルＰ及び１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の活性も調べた。予想されたように、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３を１００ｐｍｏｌ／日で投与した場合、１００％のＰＴＨを抑制した。図６は、さらに、２α−メチルＰは、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３程有効ではないものの、ＰＴＨを抑制することを示す。２α−メチルＰを５００ｐｍｏｌ／日及び１５００ｐｍｏｌ／日で投与すると、約２０％のＰＴＨが抑制され、４５００ｐｍｏｌ／日で投与すると、約６０％のＰＴＨが抑制された。本結果は、図４及び図５のデータと相俟って、２α−メチルＰは、血中カルシウムレベルを上昇させずにＰＴＨを抑制する機能があるため、腎性骨ジストロフィの続発性副甲状腺機能亢進を治療する場合に極めて有効であろうことを示唆している。
【００６２】
本結果は、２α−メチルＰが本明細書中に記載の多数のヒトの治療の優れた候補物質であること及び腎性骨ジストロフィの続発性副甲状腺機能亢進、自己免疫疾患、癌及び乾癬等の多数の状態で特に有用でありうることを示す。２α−メチルＰは、（１）有意のＶＤＲ結合、転写活性及び細胞分化活性を有する；（２）１，２５（ＯＨ）２Ｄ３とは異なり、高カルシウム血症の易罹病性がない；及び（３）容易に合成されるという理由で、乾癬を治療するための優れた候補物質である。２α−メチルＰはまた、ビタミンＤ受容体への有意の結合活性を有し、ＰＴＨ発現を抑制するが、血清カルシウムを高める機能がほとんどなく、腎性骨ジストロフィの続発性副甲状腺機能亢進の治療に特に有用でありうる。
【００６３】
本データは、さらに、本発明の化合物２α−メチルＰが、免疫系の不均衡を特徴とする、例えば、多発性硬化症、狼瘡、真性糖尿病、宿主対移植片拒絶反応及び臓器移植拒絶反応を含む自己免疫疾患のヒトの障害の治療及び予防に；さらに、関節リウマチ、喘息、及びセリアック病、潰瘍性大腸炎及びクローン病等の炎症性腸疾患等の炎症性疾患の治療に特に適しうることを示す。ざ瘡、脱毛症及び高血圧症は、本発明の化合物２α−メチルＰで治療できる他の症状である。
【００６４】
式Ｉ、特に式Ｉａを有する本発明の化合物は、さらに、動物対象の肥満症を予防又は治療する、脂肪細胞分化を阻害する、ＳＣＤ−１遺伝子転写を阻害する及び／又は体脂肪を減少させる場合に有用である。従って、ある態様では、動物対象の肥満症を予防又は治療する、脂肪細胞分化を阻害する、ＳＣＤ−１遺伝子転写を阻害する及び／又は体脂肪を減少させる方法は、その動物対象に、式Ｉを有する１又はそれ以上の化合物、又は１又はそれ以上の化合物を包含する医薬組成物の有効量を投与することを包含する。化合物又は医薬組成物の対象への投与は、動物対象の脂肪細胞分化を阻害する、遺伝子転写を阻害する、及び／又は体脂肪を減少させる。その動物は、ヒト、イヌ又はネコ等の家畜、又は農産物用動物、特に、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ又はウズラのような家禽、並びに、ウシ、ヒツジ、ヤギ又はブタ等のヒト消費用食肉を提供する動物でもよい。
【００６５】
予防及び／又は治療目的のため、式Ｉで定義される本発明の化合物は、医薬的用途のため、無害な溶媒中の溶液又は適する溶媒又は担体中のエマルジョン、懸濁液又は分散として、又は丸剤、錠剤又はカプセル剤として固形担体と共に、当該技術分野で公知の慣用法により製剤化できる。本製剤はいずれも、安定化剤、酸化防止剤、結合剤、着色剤又は乳化剤又は風味調節剤等の他の医薬的に許容しうる且つ無毒性の賦形剤を含有してもよい。
【００６６】
式Ｉの化合物、特に、２α−メチルＰは、経口で、局所に、非経口で、直腸に、鼻腔内に、舌下に又は経皮で投与することができる。本化合物は、好都合には、注射により又は静脈内注入又は適する滅菌液剤により、又は消化管を経る液状又は固形用量の形で、又はクリーム剤、軟膏剤、貼付剤、又は経皮用途に適する類似のビヒクルの形で投与される。化合物Ｉ、特に、２α−メチルＰの用量は、０．０１μｇ／日〜１０００μｇ／日、好ましくは、約０．１μｇ／日〜約５００μｇ／日で予防及び／又は治療目的に適し、本用量は、治療される疾患、その重症度及び対象の応答により調整されることは当該技術分野で十分に理解される。本化合物は作用特異性を示すため、各々、好適には、様々な程度の骨無機質動員及びカルシウム輸送刺激が好都合であることが判明している状態では、単独で、又は段階的な用量の他の活性なビタミンＤ化合物、例えば、１α−ヒドロキシビタミンＤ２又はＤ３、又は１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と共に投与することができる。
【００６７】
上記治療に用いる組成物は、上の式Ｉ及び式Ｉａで定義される化合物Ｉ、特に、２α−メチルＰの活性成分としての有効量と、適当な担体を含有する。本発明で用いる上記化合物の有効量は、組成物１ｇｍにつき約０．０１μｇ〜約１０００μｇ、好ましくは、組成物１グラムにつき約０．１μｇ〜約５００μｇであり、局所に、経皮で、経口で、直腸に、鼻腔内に、舌下に又は非経口で、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日、好ましくは、約０．１μｇ／日〜約５００μｇ／日の用量で投与することができる。
【００６８】
化合物Ｉ、特に、２α−メチルＰは、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、局所貼付剤、丸剤、カプセル剤又は錠剤、坐剤、エアゾル剤として、又は医薬的に無害かつ許容しうる溶媒又は油中の液剤、乳剤、分散剤又は懸濁剤として液体で製剤化することができるが、本製剤は、さらに、安定化剤、酸化防止剤、乳化剤、着色剤、結合剤又は風味調節剤等の他の医薬的に無害な又は有益な成分を含有してよい。
【００６９】
化合物Ｉ、特に、２α−メチルＰは、好都合には、前骨髄球を正常マクロファージへ分化させるのに十分な量で投与することができる。上記用量は適しているが、与えられる量は、疾患の重症度、対象の状態及び応答に応じて調整されるべきであることは当該技術分野で十分に理解される。
【００７０】
本発明の製剤は、活性成分を、医薬的に許容しうる担体と共に、すなわち場合により、他の治療的成分と共に含む。その担体は、製剤の他の成分と相溶性であり、レシピエントに有害でないという意味で、「許容しうる」べきである。
【００７１】
経口投与に適する本発明の製剤は、所定量の活性成分を各々含有するカプセル剤、サシェ剤、錠剤又はロゼンジとして分離した単位の剤型；粉末又は顆粒剤の剤型；水性液又は非水性液中の溶液又は懸濁液の剤型；又は水中油エマルジョン又は油中水エマルジョンの剤型であってよい。
【００７２】
直腸投与用の製剤は、活性成分と、カカオ脂等の担体を包含する坐剤の剤型、又は浣腸剤の剤型であってよい。
【００７３】
非経口投与に適する製剤は、好都合には、活性成分の滅菌油状又は水性製剤を含むが、好ましくは、レシピエントの血液と等張である。
【００７４】
局所投与に適する製剤には、液状又は半液状製剤であって、リニメント剤、ローション剤、外用薬（applicants）等、水中油エマルジョン又は油中水エマルジョンであって、クリーム剤、軟膏剤又はペースト剤等；滴剤等の液剤又は懸濁剤；又は噴霧剤が含まれる。
【００７５】
鼻腔内投与用には、スプレー缶、ネブライザー又はアトマイザーで計量分配される粉末、自己推進性又は噴霧製剤の吸入を用いることができる。本製剤の粒度は、計量分配される場合、好ましくは、１０〜１００μの範囲内である。
【００７６】
本製剤は、好都合には、用量単位の形であってもよく、医薬技術分野において周知のいかなる方法により製造してもよい。「用量単位」という用語は、活性成分それ自体又は固形又は液状医薬希釈剤又は担体との混合物として含む物理的かつ化学的に安定な単位用量として患者に投与することができる単一、すなわち、単回の用量を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、「２α−メチルＰ」という２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールを、天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、以下、「１，２５（ＯＨ）２Ｄ３」と比較した場合の種々の生物学的活性を示し、完全長組換えラットビタミンＤ受容体への結合に［３Ｈ］−１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３と競合する、２α−メチルＰ及び１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の相対活性を示すグラフである。
【図２】図２は、「２α−メチルＰ」という２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールを、天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、以下、「１，２５（ＯＨ）２Ｄ３」と比較した場合の種々の生物学的活性を示し、２α−メチルＰ及び１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の濃度の関数としてのＨＬ−６０細胞分化比率（分化パーセント）を示すグラフである。
【図３】図３は、「２α−メチルＰ」という２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールを、天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、以下、「１，２５（ＯＨ）２Ｄ３」と比較した場合の種々の生物学的活性を示し、２α−メチルＰと比較した場合の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３のインビトロ転写活性を示すグラフである。
【図４】図４は、「２α−メチルＰ」という２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールを、天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、以下、「１，２５（ＯＨ）２Ｄ３」と比較した場合の種々の生物学的活性を示し、２α−メチルＰと比較した場合の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の骨カルシウム動員活性を示す棒グラフである。
【図５】図５は、「２α−メチルＰ」という２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールを、天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、以下、「１，２５（ＯＨ）２Ｄ３」と比較した場合の種々の生物学的活性を示し、２α−メチルＰと比較した場合の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の腸管カルシウム輸送活性を示す棒グラフである。
【図６】図６は、「２α−メチルＰ」という２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールを、天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、以下、「１，２５（ＯＨ）２Ｄ３」と比較した場合の種々の生物学的活性を示し、ビヒクル対照と比較した場合の、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３及び２α−メチルＰのＰＴＨ抑制％を示す棒グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物。
【請求項２】
Ｘ２が水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ１が水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ１及びＸ２が共にｔ−ブチルジメチルシリルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
有効量の、少なくとも一つの請求項１に記載の化合物を、医薬的に許容しうる賦形剤と共に含有する、医薬組成物。
【請求項６】
有効量が、組成物１グラムにつき約０．０１μｇ〜約１０００μｇを含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
有効量が、組成物１グラムにつき約０．１μｇ〜約５００μｇを含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
式
【化２】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール。
【請求項９】
有効量の、２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールを、医薬的に許容しうる賦形剤と共に含有する医薬組成物。
【請求項１０】
有効量が、組成物１グラムにつき約０．０１μｇ〜約１０００μｇを含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
有効量が、組成物１グラムにつき約０．１μｇ〜約５００μｇを含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
乾癬を治療する方法であって、乾癬に罹患した対象に、式
【化３】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項１３】
化合物を経口投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
化合物を非経口投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
化合物を経皮投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
化合物を局所投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
化合物を直腸投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
化合物を鼻腔内投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
化合物を舌下投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の用量で投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
化合物が、式
【化４】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌又は前立腺癌からなる群から選択される疾患を治療する方法であって、前記疾患に罹患した対象に、式
【化５】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項２３】
化合物を経口投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
化合物を非経口投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
化合物を経皮投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
化合物を直腸投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
化合物を鼻腔内投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
化合物を舌下投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の用量で投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
化合物が、式
【化６】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
多発性硬化症、狼瘡、真性糖尿病、宿主対移植片拒絶反応及び臓器移植拒絶反応からなる群から選択される自己免疫疾患を治療する方法であって、前記疾患に罹患した対象に、式
【化７】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項３２】
化合物を経口投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
化合物を非経口投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
化合物を経皮投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
化合物を直腸投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
化合物を鼻腔内投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
化合物を舌下投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の用量で投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
化合物が、式
【化８】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
関節リウマチ、喘息及び炎症性腸疾患からなる群から選択される炎症性疾患を治療する方法であって、前記疾患に罹患した対象に、式
【化９】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項４１】
化合物を経口投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
化合物を非経口投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
化合物を経皮投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
化合物を直腸投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
化合物を鼻腔内投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
化合物を舌下投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の用量で投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
化合物が、式
【化１０】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
しわ、適切な皮膚引き締めの欠如、適切な皮膚水和の欠如及び不十分な皮脂分泌からなる群から選択される皮膚状態を治療する方法であって、前記皮膚状態に罹患した対象に、式
【化１１】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項５０】
化合物を経口投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
化合物を非経口投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
化合物を経皮投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
化合物を局所投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
化合物を直腸投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
化合物を鼻腔内投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
化合物を舌下投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の用量で投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
化合物が、式
【化１２】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
腎性骨ジストロフィを治療する方法であって、腎性骨ジストロフィに罹患した対象に、式
【化１３】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項６０】
化合物を経口投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
化合物を非経口投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
化合物を経皮投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
化合物を直腸投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
化合物を鼻腔内投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
化合物を舌下投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の用量で投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
化合物が、式
【化１４】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６８】
動物の肥満症を治療又は予防し、脂肪細胞分化を阻害し、ＳＣＤ−１遺伝子転写を阻害及び／又は動物の体脂肪を減少させる方法であって、式
【化１５】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物の有効量を必要な対象に投与することを含む方法。
【請求項６９】
化合物を経口投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
化合物を非経口投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
化合物を経皮投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
化合物を直腸投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
化合物を鼻腔内投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
化合物を舌下投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の用量で投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７６】
化合物が、式
【化１６】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７７】
動物がヒトである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７８】
動物が家畜である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７９】
動物が農業用動物である、請求項６８に記載の方法。
【請求項１】
式
【化１】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物。
【請求項２】
Ｘ２が水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ１が水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ１及びＸ２が共にｔ−ブチルジメチルシリルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
有効量の、少なくとも一つの請求項１に記載の化合物を、医薬的に許容しうる賦形剤と共に含有する、医薬組成物。
【請求項６】
有効量が、組成物１グラムにつき約０．０１μｇ〜約１０００μｇを含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
有効量が、組成物１グラムにつき約０．１μｇ〜約５００μｇを含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
式
【化２】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロール。
【請求項９】
有効量の、２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールを、医薬的に許容しうる賦形剤と共に含有する医薬組成物。
【請求項１０】
有効量が、組成物１グラムにつき約０．０１μｇ〜約１０００μｇを含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
有効量が、組成物１グラムにつき約０．１μｇ〜約５００μｇを含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
乾癬を治療する方法であって、乾癬に罹患した対象に、式
【化３】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項１３】
化合物を経口投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
化合物を非経口投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
化合物を経皮投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
化合物を局所投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
化合物を直腸投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
化合物を鼻腔内投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
化合物を舌下投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の用量で投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
化合物が、式
【化４】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌又は前立腺癌からなる群から選択される疾患を治療する方法であって、前記疾患に罹患した対象に、式
【化５】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項２３】
化合物を経口投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
化合物を非経口投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
化合物を経皮投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
化合物を直腸投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
化合物を鼻腔内投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
化合物を舌下投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の用量で投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
化合物が、式
【化６】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
多発性硬化症、狼瘡、真性糖尿病、宿主対移植片拒絶反応及び臓器移植拒絶反応からなる群から選択される自己免疫疾患を治療する方法であって、前記疾患に罹患した対象に、式
【化７】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項３２】
化合物を経口投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
化合物を非経口投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
化合物を経皮投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
化合物を直腸投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
化合物を鼻腔内投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
化合物を舌下投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の用量で投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
化合物が、式
【化８】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
関節リウマチ、喘息及び炎症性腸疾患からなる群から選択される炎症性疾患を治療する方法であって、前記疾患に罹患した対象に、式
【化９】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項４１】
化合物を経口投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
化合物を非経口投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
化合物を経皮投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
化合物を直腸投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
化合物を鼻腔内投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
化合物を舌下投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の用量で投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
化合物が、式
【化１０】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
しわ、適切な皮膚引き締めの欠如、適切な皮膚水和の欠如及び不十分な皮脂分泌からなる群から選択される皮膚状態を治療する方法であって、前記皮膚状態に罹患した対象に、式
【化１１】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項５０】
化合物を経口投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
化合物を非経口投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
化合物を経皮投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
化合物を局所投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
化合物を直腸投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
化合物を鼻腔内投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
化合物を舌下投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の用量で投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
化合物が、式
【化１２】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
腎性骨ジストロフィを治療する方法であって、腎性骨ジストロフィに罹患した対象に、式
【化１３】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項６０】
化合物を経口投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
化合物を非経口投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
化合物を経皮投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
化合物を直腸投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
化合物を鼻腔内投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
化合物を舌下投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の用量で投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
化合物が、式
【化１４】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６８】
動物の肥満症を治療又は予防し、脂肪細胞分化を阻害し、ＳＣＤ−１遺伝子転写を阻害及び／又は動物の体脂肪を減少させる方法であって、式
【化１５】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なっていてもよく、各々、水素又はヒドロキシ保護基から選択される）
を有する化合物の有効量を必要な対象に投与することを含む方法。
【請求項６９】
化合物を経口投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
化合物を非経口投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
化合物を経皮投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
化合物を直腸投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
化合物を鼻腔内投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
化合物を舌下投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の用量で投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７６】
化合物が、式
【化１６】
を有する２α−メチル−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７７】
動物がヒトである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７８】
動物が家畜である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７９】
動物が農業用動物である、請求項６８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５２０７０６（Ｐ２００８−５２０７０６Ａ）
【公表日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４３２７０（Ｐ２００７−５４３２７０）
【出願日】平成１７年１１月１８日（２００５．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４１８２１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５７９０２
【国際公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【出願人】（５９１０５７７０６）ウィスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファウンデーション (26)
【氏名又は名称原語表記】ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＡＬＵＭＮＩ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月１８日（２００５．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４１８２１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５７９０２
【国際公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【出願人】（５９１０５７７０６）ウィスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファウンデーション (26)
【氏名又は名称原語表記】ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＡＬＵＭＮＩ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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