２型糖尿病およびその早期発症の診断の方法
本発明はヒト遺伝学の分野に属し、ｔｉｅｇ２遺伝子のエクソン２に位置するＡ１８５Ｇ変異ならびにＧ−１５３４Ｃ、５４ａ、３０４ａ、＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９ Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）変異の同定に基づく、ヒト被験者における２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、早期発症２型糖尿病および若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）の新規な診断および治療の方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はヒト遺伝学の分野に属し、ｔｉｅｇ２遺伝子のエクソン２に位置するＡ１８５Ｇ変異ならびにＧ−１５３４Ｃ、５４ａ、３０４ａ、＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９ Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）変異の同定に基づく、ヒト被験者における２型糖尿病、早期発症２型糖尿病および若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）の新規な診断および治療の方法に関する。
【０００２】
２型糖尿病は、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）または成人発症型糖尿病としても知られる、最も多く見られる糖尿病の種類である。２型糖尿病では、膵細胞がインスリンをわずかしか産生しない、もしくは全く産生しないか、または全身の細胞がインスリンを利用することができない（インスリン抵抗性）。これは欧米諸国で全症例の９５％に相当し、米国だけで約１５００万人が罹患している。
【０００３】
今日現在、糖尿病の診断には空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）検査が用いられている。しかし、この検査はひとたび病気を発症した場合にしか適さない。従って、この疾病に関連する遺伝的リスク因子を評価することのできる診断検査が必要である。このような検査は、リスクのある人々の生活習慣を適応させるため、また疾病の発症を予防するために大きな関心が寄せられるだろう。
【０００４】
２型糖尿病の発生において遺伝因子の関与を裏付ける強力な証拠がある。例えば、一卵性双生児間の２型糖尿病のリスク率は約６０〜９０パーセントである(Bennett PH. Epidemiology of diabetes mellitus. In: Rifkin H, Porte D Jr., eds. Ellenburg and Rifkin's Diabetes Mellitus. New York: Elsevier, 1990: 363-77)。その上、２型糖尿病の第一度近親者がいる場合、この病気を発症するリスクは２倍となる(Leslie RD, Pyke DA. Genetics of diabetes. In: Alberti KG, Krall LP, eds. The diabetes annual. Amsterdam: Elsevier, 1987: 39-54)。
【０００５】
もっと最近では、多数の科学研究によって、２型糖尿病に対する遺伝的素因が存在するということが確定された。本発明者らは糖尿病および肥満家系のゲノムワイドスキャンを行い、それによってこのような疾患との関連の証拠を示すいくつかのゲノム領域を同定するに至った(Vionnet N et al. (2000): Genomewide search for type 2 diabetes susceptibility genes in French whites: Evidence for a novel susceptibility locus for early onset diabetes on chromosome 3q27 qter and independent replication of a type 2 diabetes locus on chromosome lq21 q24. Am. J. Hum. Genet. 67: 1470 1480 and Hager J et al. (1998): A genome wide scan for human obesity genes reveals a major susceptibility locus on chromosome 10. Nat. Genet. 20: 304 308.)。
【０００６】
マイクロサテライトマーカーを用いるさらなる微細マッピングによって、この領域を約５Ｍ塩基まで限定することが可能となり、これによりこの領域へ候補遺伝子を同定し、ＬＤマッピング戦略を適用することが可能となった。ＬＤマッピングは膨大な量の一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型解析を伴う。
【０００７】
数年かけて、本発明者らは位置的遺伝子候補を同定するための完璧な戦略および方法を開発した。これには統計分析、生物情報学の情報ルート、ＳＮＰ遺伝子型解析および組織発現プロファイリングが含まれる。本発明者らのアプローチは、結果としてｃｈｒ２区間の微細マッピング、および位置クローニングアプローチによるこのゲノム領域の分析をもたらした。第２染色体の領域に対して確立されたＳＮＰマップにより、ＴＩＥＧ２を２型糖尿病に対する感受性に関連する遺伝子として同定するに至った。
【０００８】
両ＴＩＥＧ遺伝子は、ＴＧＦ−βによって誘発され(Cook et al. 1998 ; Blok et al. 1995)、膵細胞増殖を制御する可能性がある(Cook et al. 1998; Cook and Urrutia 2000)。外分泌ＰＡＮＣ１細胞系統でのＴＩＥＧ１の過剰発現はアポトーシスを誘発し(Tachibana et al. 1997)、類似の増殖阻害効果がＴＩＥＧ２にに関しても示された(Cook et al. 1998)。外分泌膵臓の腺房細胞においてＴＩＥＧ２を発現するトランスジェニックマウス(Mladek et al. 1999)は、ＴＧＦ−βを過剰発現しているマウスと類似の膵臓萎縮を示す(Sanvito et al. 1995)。さらに、ＴＩＥＧ１は骨芽細胞中でＴＧＦ−βと類似の効果を誘発することが示されている(Hefferan et al. 2000)）。このように、ＴＧＦ−βに誘発されるＴＩＥＧ１および２は、ＴＧＦ−βの効果、特に外分泌膵臓組織に見出される効果を模倣することができる。
【０００９】
本発明に関して、本発明者らは、ＴＩＥＧ２のエクソン２に位置する変異体Ａ１８５Ｇ（＝２ＳＮＰ１９９ｂ、ＴＧ２Ｑ６２Ｒ、ＴＧ２ＡＩ８５Ｇ）を同定および分析し、ＴＩＥＧ２が２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）に対する感受性に関連していることを明らかにした。ＳＮＰ１９９ｂ（Ａ＞Ｇ）はＴＩＥＧ２のエクソン２中の非同義（Ｇｌｎ６２Ａｒｇ）変異で、転写の際のＴＩＥＧ２の抑制特性を変化させることができる。
【００１０】
本発明に関して、本発明者らはＡ１８５Ｇと密接な不平衡にある、さらなる変異体Ｇ−１５３４Ｃを同定および分析した。この変異は翻訳開始部位から１．５Ｋｂに位置し、ＴＩＥＧ２遺伝子のまだ定義されていないプロモーター中に存在すると思われる。この配列をＴｒａｎｓＦａｃ(Heinemeyer et al 1998)で解析すると、Ｃ対立遺伝子の導入によってＡＰ−１部位が作成されることが予測された。−１５３４Ｃおよび１８５Ｇ対立遺伝子双方の存在は、非機能的ＴＩＥＧ２タンパク質の過剰発現をもたらす結果となりうる。本発明者らはＴＩＥＧ２におけるまれな突然変異が若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）および早期発症Ｔ２Ｄに関連することも見出した。
【００１１】
この点に関して、機能性の低いＴＩＥＧ２の調節によって引き起こされうる、膵臓の発達における前駆細胞の調節の変化および／またはヒト成人膵臓におけるβ細胞の新生の変化は、外分泌細胞と内分泌細胞との間のバランスを変える可能性がある。
【００１２】
ＴＩＥＧ２は膵臓の内分泌と外分泌のバランスに関連しており、本明細書ではこれを２型糖尿病の発生に影響しうる、膵組織の発達および再生に重要なものであると仮定される。ＴＩＥＧ２は偏在発現するが、骨格筋、外分泌膵臓、脳および脂肪組織でｍＲＮＡレベルが高く、このことは、いくつかの組織で２型糖尿病に対する感受性に影響を与えうる増殖／分化および細胞周期の調節を含み得るさらなる役割をＴＩＥＧ２が有する可能性があることを示唆するものである。
【００１３】
説明
従って、本発明は、２型糖尿病に対する対応の改善に寄与し、ＴＩＥＧ２を媒介とするシグナル伝達が２型糖尿病に対する感受性に関連がある証拠を示す。結果として、ＴＩＥＧ２は、２型糖尿病のための薬剤設計のための新規な標的となる。ＴＩＥＧ２変異体ＴＧ２Ｑ６２Ｒの２型糖尿病との関連は、２型糖尿病への素因を分析する診断検査として特に有用である。
【００１４】
第１の態様では、本発明は、ヒト被験者における２型糖尿病、早期発症型２型糖尿病および若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）の素因を診断するための方法に関し、この方法はｔｉｅｇ２遺伝子の配列中に生殖細胞系の変異があるかどうかを判定することを含み、該変異が２型糖尿病の素因の指標となり、該変異は、そのコード配列が配列番号１に示されるｔｉｅｇ２遺伝子の開始コドンに関して番号が付されたＡ１８５Ｇ、配列番号４に示されるＧ−１５３４Ｃ、図４Ａおよび４Ｂに示される５４ａまたは３０４ａ、ならびにその配列が図７および８にそれぞれ示される配列番号６および７に示される＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９ Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）から選択される。
【００１５】
本発明はまた、上述のように、変異体Ａ１８５Ｇ、Ｇ−１５３４Ｃ、５４ａまたは３０４ａ、＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９ Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）から選択される変異体と、密接に関連する生殖細胞系変異の存在を決定することを含んでなる、２型糖尿病に対する素因を診断する方法に関する。
【００１６】
本発明はより一般には、ｔｉｅｇ２遺伝子の研究に関する。この点で、本発明は、分子（１）前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡ領域と、（２）ｔｉｅｇ２遺伝子ＤＮＡのヒト野生型領域と相補的な核酸プローブとを互いにハイブリダイズさせて二重らせんを形成させた場合に、分子（１）と（２）の間に、前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡの配列中に少なくとも１つの変異が存在することによるミスマッチが存在するかどうかを決定することを含んでなる、ｔｉｅｇ２遺伝子の配列中の変異を同定する方法に関する。
【００１７】
より具体的には、本発明は、分子（１）前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡのエクソン２と、（２）配列番号２で示されるｔｉｅｇ２遺伝子ＤＮＡのヒト野生型エクソン２領域と相補的な核酸プローブとを互いにハイブリダイズさせて二重らせんを形成させた場合に、分子（１）と（２）の間に、前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡの配列中に少なくとも１つの変異が存在することによるミスマッチが存在するかどうかを決定することを含んでなる、ｔｉｅｇ２遺伝子のエクソン２中の変異を同定する方法を対象とする。
【００１８】
上述の方法では、サンプルのｍＲＮＡを、前記プローブと前記ｔｉｅｇ２遺伝子に対応するＲＮＡとのハイブリダイゼーションに適した条件下で、ｔｉｅｇ２遺伝子プローブと接触させ、前記プローブのハイブリダイゼーションを判定し、ハイブリダイゼーション後のシグナルレベルを標準のシグナル（陽性対照、陰性対照または双方のいずれか）と比較する。
【００１９】
このハイブリダイゼーション複合体は、プローブ、または直接にはｍＲＮＡの標識化によると思われるシグナルを発する。用いることができる種々の標識は当業者に周知であり、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈまたは１２５Ｉが挙げられる。非放射性標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジオキシゲニン、ハプテン、色素、発光物質（放射性発光物質、化学発光物質、生物発光物質、蛍光物質またはリン光発光物質など）のようなリガンドから選択することができる。本願中に記載されているＳＮＰを同定するためには、ｔｉｅｇ２遺伝子プローブと前記サンプルから単離されたゲノムＤＮＡとを、前記プローブと前記遺伝子とのハイブリダイゼーションに適した条件下で接触させ、前記プローブのハイブリダイゼーションを判定することができる。
【００２０】
前記ｔｉｅｇ２遺伝子領域プローブは、「野生型」ＤＮＡ（すなわち、探索されるＳＮＰがプローブ上に存在せず、本発明のＳＮＰがサンプル中のＤＮＡ上に存在しない場合にハイブリダイゼーションが起こる）か、または「突然変異」ＤＮＡ（すなわち、探索されるＳＮＰを有し、ＳＮＰがサンプル中のＤＮＡ上に存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こる）のいずれかである。この実施形態で用いる対立遺伝子特異的プローブ、それらの長さ、またはハイブリダイゼーション条件を決定する技術は当業者に公知である。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、ｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域の生殖細胞系配列または前記サンプルのその他の領域に変化があるかどうかを、変性または非変性ポリアクリルアミドゲル上で、前記サンプル由来の一本鎖ＤＮＡの電気泳動移動度のシフトを観察することによって決定することにより実行される。前記一本鎖核酸は、好適なプライマーを用いるゲノムＤＮＡの増幅および変性（このような目的では、通常、ゲルおよび電気泳動条件は変性されている）後に得てもよい。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、ｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域の全てまたは一部、あるいは前記サンプル由来のその他の領域の増幅、および前記の増幅されたＤＮＡの配列の決定によって実行される。
【００２３】
別の実施形態では、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、特定のｔｉｅｇ２突然変異対立遺伝子が前記サンプル中に存在するかどうかを決定するが、この場合には増幅のみが起こる。
【００２４】
例えば、これらのプライマーは、それぞれＡ１８５ＧおよびＧ−１５３４Ｃの配列−ｃａａａｇａｔｃｃｃＲｇａａａｇｇｔｇａｃ−（配列番号５）および−ｇｇｇｇｔｇｃｔｇａＳｔｇｇｇａａｇａｇｇ−（配列番号６）を包含し、配列中のＲはＡまたはＧを示し、ＳはＣまたはＧを示す。
【００２５】
本発明はまた、分子（１）前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡと、（２）配列ｇａｃａｃａｃａｃｃｔｃａＸｇｇａｃａｇｔ−（配列番号４２）（配列中、ＸはＣまたはＴ）に由来するプローブおよび配列ｔｔｇｇｔｃｃｔｇｃｃｃｃａｇｇｇａＹｃｃｃｔｃｃｃｔｃｃｇ−（配列番号４３）（配列中、ＹはＧまたはＴ）に由来するプローブなどの＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９ Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）変異配列を包含するヒトｔｉｅｇ２遺伝子ＤＮＡと相補的な核酸プローブとの間にミスマッチが存在するかどうかを決定することを含んでなる、ｔｉｅｇ２遺伝子中の変異を同定する方法を対象とする。
【００２６】
この点に関して、本発明は、＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９ Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）変異配列を包含するプライマーを対象とする。例えば、＋６５９ Ｃ＞Ｔ変異のプライマーは、配列−ｇａｃａｃａｃａｃｃｔｃａＸｇｇａｃａｇｔ−（配列番号４２）（配列中、ＸはＣまたはＴ）を包含するか、またはこれに由来するものであってよい。＋１０３９ Ｇ＞Ｔ変異のプライマーは、配列−ｔｔｇｇｔｃｃｔｇｃｃｃｃａｇｇｇａＹｃｃｃｔｃｃｃｔｃｃｇ−（配列番号４３）（配列中、ＹはＧまたはＴ）を包含するか、またはこれに由来するものであってよい。
【００２７】
別の実施形態では、前記サンプル由来のｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域の全てまたは一部をクローニングしてクローン配列を作出し、前記クローン配列の配列を決定する。
【００２８】
上述の方法は、前記サンプルのｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域配列の増幅、および増幅した配列と野生型ｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域配列（配列番号２で示される）または突然変異型ｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域配列に由来する１以上の核酸プローブとのハイブリダイゼーションによって実施することができ、前記プローブは、Ａ１８５Ｇ変異体およびＧ−１５３４Ｃ変異体に特異的なプローブから選択される。
【００２９】
Ａ１８５Ｇ変異アッセイは、オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによりエクソン２ ＴＩＥＧ２のゲノム配列５’−ＣＴＣ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＧＴ ＴＧＣ ＴＡＴ ＡＧＡ ＣＴ−３’（配列番号７）および５’−ＣＡＧ ＧＧＡ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＣＡ ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＴ−３’（配列番号８）、表１）を増幅することによって実施することができ、その後、対立遺伝子の変異を、プローブＬＣＲｅｄ６４０−ＡＴＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＧＧ ＴＧＡ ＣＣＴ（配列番号３３）およびＴＣＴ ＴＧＴ ＴＴＧ ＴＡＴ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＴＣＡ−フルオレセイン（配列番号３４）を用いてライトサイクラー(Roche)を使用して示差的Ｔｍ変化により評価することができる。
【００３０】
Ｇ−１５３４Ｃ変異アッセイは、オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによりＴＩＥＧ２の上流のゲノム配列（５’−ＧＴＴ ＴＡＡ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＧＡ ＡＣＣ ＧＴＧ ＡＴＡ−３’（配列番号９）および５’−ＧＡＡ ＣＡＧ ＣＡＡ ＧＴＧ ＣＧＡ ＧＧＡ Ｃ−３’、（配列番号１０）、表１）を増幅することによって実施することができ、その後、対立遺伝子の変異を、プローブＬＣＲｅｄ６４０−ＴＣＴＴＣＣＣＡＣＴＣＡＧＣＡＣ（配列番号３５）およびＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡ−フルオレセイン（配列番号３６）を用いてライトサイクラー（Roche）を使用して示差的Ｔｍ変化により評価することができる。
【００３１】
プローブに付着させた蛍光分子は例として示しているものであって、これに限定されるものではない。
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号５〜配列番号３６から選択されるプローブまたはプライマーを対象とする（下記表１参照）。
【００３２】
【表１】
【００３３】
本発明はまた、表１に記載のプローブで増幅した配列番号１および配列番号４の断片、ならびに少なくとも１種類の同定された変異を含む診断キットを対象とする。
【００３４】
本発明はまた、前記サンプル中のｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域と、野生型または突然変異型ｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域配列に由来する１以上の核酸プローブとのin situハイブリダイゼーションを決定することを含んでなる方法に関する。このような方法としては、Ｔ座でのＣＧＨ−ｆｉｓｈ法またはＣＧＨアレイ法が挙げられる。
【００３５】
発明者らは、ＴＩＥＧ２にＧｌｎ６２Ａｒｇ変異が存在すると、ＴＩＥＧ２転写抑制活性を阻害する可能性があることをいく通りかの方法で証明した。従って、ｔｉｅｇ２遺伝子のエクソン２領域またはその他の領域での他の改変もまた、ＴＩＥＧ２タンパク質の転写抑制活性の変化をもたらし、ｍＳｉｎ３Ａとの相互作用の変化によって、２型糖尿病に対する素因につながるとの推測には信憑性がある。
【００３６】
概して、最初にＭａｄタンパク質について示されたように、コリプレッサーｍＳｉｎ３Ａとの相互作用はヒストン脱アセチル化酵素の動員および機能的転写抑制複合体の形成を誘起する。近年、最初の抑制ドメイン近傍のリン酸化がｍＳｉｎ３ＡとＴＩＥＧ２との結合を阻害し、結果としてＴＩＥＧ２の抑制活性が失われることが示されている(Ellenrieder et al 2002)。同様に、６２Ｒ変異が起こるとｍＳｉｎ３Ａ結合が妨げられ、ＴＩＥＧ２の抑制活性が変化しうる。その上、−１５３４Ｃ（％）変異を有する１８５Ｇ変異が起こると、ＴＩＥＧ２のプロモーター中のＡＰ−１反応部位の導入を介してＴＩＥＧ２に可能な転写のアップレギュレーションを誘導し、結果として非機能的ＴＩＥＧ２タンパク質の過剰発現をもたらし得る。
【００３７】
従って、一実施形態では、本発明は、ヒト被験者において２型糖尿病に対する素因を診断する方法に関し、この方法ではＴＩＥＧ２タンパク質とｍＳｉｎ３Ａとの相互作用および前記サンプル中のＴＩＥＧ２ｍＲＮＡの発現レベルの変化が調査される。タンパク質と核酸の間の相互作用の変化は、当技術分野で公知の技術で検出が可能である。
【００３８】
第二の態様では、本発明は、配列番号３のＴＩＥＧ２のＧｌｎ６２Ａｒｇ変異体、ＴＩＥＧ２のＴｈｒ２２０Ｍｅｔ変異体およびＴＩＥＧ２のＡｌａ３４７Ｓｅｒ変異体に関する。これはまた、以下の変異：
Ｇｌｎ６２Ａｒｇ
Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ
Ａｌａ３４７Ｓｅｒ
のうち少なくとも１、２または３つを呈するＴＩＥＧ２の変異体に関する。特に、これらのポリペプチドは免疫ブロット法または免疫細胞化学によって検出することができる。
【００３９】
従って、本発明は、患者のサンプルにおいて前記変異の存在または不在を検出するのに使用可能な、これらのＴＩＥＧ２変異体に特異的な抗体、すなわち正常なＴＩＥＧ２と変異体ＴＩＥＧ２とを区別することのできる抗体を対象とする。免疫学的アッセイは当技術分野で標準的な知識を用いて実施できる。これらのものとしては、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。本発明はこれらの試験に好適なこのような抗体および試薬を含む診断キットを包含する。
【００４０】
本発明は、２型糖尿病の、特に遺伝的感受性が懸念される家系の患者のための、処置および／または予防における新規な分野を開拓するものである。従って、本発明はまた、２型糖尿病を予防および／または処置することの可能な化合物をスクリーニングするための方法に関し、その方法は、（ｉ）候補化合物および（ｉｉ）ＴＩＥＧ２ポリペプチドを混合すること、ならびにＴＩＥＧ２ポリペプチドと前記化合物との結合量を測定することを含んでなる。実際、ＴＩＥＧ２のアゴニストはその転写抑制活性を回復させ、２型糖尿病を単独またはその他の処置と組み合わせて処置するために有用な薬剤であると考えられる。
【００４１】
この実施形態では、「ＴＩＥＧ２」とは、Ｇｌｎ６２Ａｒｇ、Ｔｈｒ２２０ＭｅｔおよびＡｌａ３４７Ｓｅｒ変異ならびに野生型ＴＩＥＧ２を含むものと理解される。
【００４２】
本発明はまた、薬学上許容される賦形剤および本発明に記載の方法によって同定された化合物を含む医薬組成物、ならびに２型糖尿病の処置および／または予防を目的とする薬剤の製造のための本発明の方法によって同定された化合物の使用に関する。
【００４３】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の投与を含んでなる、２型糖尿病の治療方法に関する。
【００４４】
Ｇｌｎ６２Ａｒｇ、Ｔｈｒ２２０ＭｅｔおよびＡｌａ３４７Ｓｅｒ変異体による欠陥を修正するためには、本発明の別の実施形態としてはベクター、より詳しくは、ヒト細胞中で野生型ＴＩＥＧ２のコード配列の発現を可能にするプロモーターと作動可能に連結された前記コード配列を含んでなる、遺伝子治療に好適なベクターに関する。このようなベクターは直接in vivo遺伝子導入に適合させることができ、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスベクターが挙げられる。リポソーム、分子複合体、ポリマーおよびその他のベクターを含む、非ウイルスベクターを用いてもよい。組織への直接注射、静脈内もしくは動脈内投与、吸入、または局所適用ならびにその他の投与経路は当技術分野で公知である。
【００４５】
本発明はまた、２型糖尿病を研究するために有用な新規な動物モデルに関し、該動物内で前記ｔｉｅｇ２変異体が発現される。本発明の動物を得る方法は当業者に公知であり、特に本発明の方法に従って同定することができる薬剤の試験に有用である。この方法には、前記ｔｉｅｇ２変異遺伝子、キメラ動物、および前記ｔｉｅｇ２変異体を発現するベクターでトランスフェクトされた動物の生殖的伝達が可能な新規な系統をもたらすための遺伝子改変動物を含む。
【００４６】
この構築物の、本発明のトランスジェニック動物のゲノムへの挿入は、当業者に周知の方法によって行うことができ、無作為でも標的化してもよい。要するに、当業者であれば、ゲノム内に挿入する配列を含むベクター、および選択マーカー（例えばネオマイシン耐性をもたらすタンパク質をコードする遺伝子）を構築し、それを動物の胚幹（ＥＳ）細胞に導入することができる。次に、これらの細胞を選択マーカーで選択し、それを、例えば胚盤胞へのマイクロインジェクションによって、胚へ組み込み、これは妊娠中の雌の子宮を灌流することによって回収することができる。胚の再移植および形質転換動物の選択の後に可能性のある戻し交雑を行って、このようなトランスジェニック動物を得ることができる。「よりクリーンな」動物を得るためには、それが正しい配列に隣接されているならば部位特異的リコンビナーゼを使用して選択マーカー遺伝子を切り出してもよい。
【００４７】
従って本発明は、前述のようなＴＩＥＧ２変異体タンパク質の、すなわちＧｌｎ６２Ａｒｇ、Ｔｈｒ２２０ＭｅｔおよびＡｌａ３４７Ｓｅｒまたはそのいずれかの組み合わせの発現をもたらす調節エレメントと作動可能に連結されているｔｉｅｇ２変異遺伝子の核酸配列またはそのコード配列をそのゲノムに組み込んでいるトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。
【００４８】
前記実施形態に予見されるｔｉｅｇ２配列は、本発明の動物のゲノム内に導入されたヒトｔｉｅｇ２遺伝子配列、またはそのプロモーターが、変異が配列中に存在する間は過剰発現を誘発するよう修飾されている、内在性ｔｉｅｇ２遺伝子配列であってよい。
【００４９】
さらに、本発明はまた、ＴＩＥＧ２と２型糖尿病との関連を試験するため、および早期発症Ｔ２Ｄを研究するための動物モデルとして、内在性ｔｉｅｇ２遺伝子の破壊をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。特に、前記破壊には、選択可能なマーカー配列の挿入を含む。特に、前記破壊はホモ接合型の破壊であり、前記ホモ接合型の破壊は結果としてＴＩＥＧ２をコードする内在遺伝子のヌル変異をもたらす。
【００５０】
本発明の哺乳類は好ましくはマウスなどの齧歯類である。
【実施例】
【００５１】
実施例１：２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるＴＩＥＧ２の関与の遺伝的証拠
ＳＮＰ１９９ｂ（Ａ＞Ｇ）はＴＩＥＧ２のエクソン変異である。ＳＮＰ１９９ｂ（ＴＧ２Ｑ６２Ｒ）とＴ２Ｄとの強い関連は、家族性Ｔ２Ｄおよび対照群からなるフランス系白人コホートで存在することが示された（優性モデルＴＧ２Ｑ６２Ｒに基づくロジスティック回帰（年齢と性別で階層化）ｐ＜１０〜５）。ＳＮＰ１９９ｂ、４３７ｂ、５４ａおよび３０４ａは強い関連がある（カイ２乗 ｐ＜０．０００１）。ＳＮＰ ４３７ｂ（Ｇ＞Ｃ）は、ＴＩＥＧ２遺伝子の未だ同定されていないプロモーター中に存在する可能性のあるゲノム変異である。本発明者らは、ｃｈｒ２（表現型ｌａｒｇｅ／ｓｔｒｉｃｔ、ｘｔｄロッドスコア４．４５（ｐ＝０．０４））との連鎖の証拠を示す家系全員のゲノムワイドスキャンで５４ａと糖尿病との関連を示した。家族性２型糖尿病との（対照３５２名に対して糖尿病患者２８７名のコホートにおける）顕著な関連に対し、さらに異種の「コルベール」集団（糖尿病患者９４７名）では糖尿病との優性関係は見られなかった。しかし、分散には高いＢＭＩ値との劣性関係が残っていた。
【００５２】
Ｇｌｎ６２Ａｒｇは、ｍＳｉｎ３Ａコリプレッサーと相互作用することが示されているＴＩＥＧ２タンパク質の最初のリプレッサードメインの近傍に位置する。ＴＩＥＧ２のＲ１ドメインはαへリックス型のコンホメーションをとり、ＴＩＥＧ１、ＢＴＥＢ１、３および４において保存されているこのαへリックス抑制モチーフ（ｏｃ−ＨＲＭ）がｍＳｉｎ３Ａとの相互作用を担うことが示されている（Ｓｉｎ相互作用ドメイン；(Zhang et al. 2001))。ＰＩＸ（ＵＫ ＨＧＭＰ資源センター http://www.hizmp.mrc.ac.uk/）を用いるＴＩＥＧ２（６２Ｇｌｎ）および６２Ａｒｇ−ＴＩＥＧ２（ＴＧ２Ｑ６２Ｒを含むタンパク質）のタンパク質二次構造の分析は、ＤＳＣ（使用した３つの２Ｄ解析プログラムの中の１つ(King et al. 2000)）がＳＩＤの近傍にある６２Ａｒｇ−ＴＩＥＧ２に対して長いαへリックスを予測したことを示した。従って、変化した６２Ａｒｇ−ＴＩＥＧ２のコンホメーションは、α−ＨＲＭに媒介されるｍＳｉｎ３Ａとの相互作用を阻害する可能性がある。
【００５３】
それに加えて、グルタミンからアルギニンへの変化がタンパク質に特別な変化を加え、従って、その等電点およびｍＳｉｎ３Ａとの結合特性を変える可能性がある。
【００５４】
さらに、Ｇｌｎ６２Ａｒｇは、プロテインキナーゼＣによってリン酸化されうるセリンの隣に位置する。リン酸化は、タンパク質活性の調節、核への転位またはその他のタンパク質との相互作用ならびにタンパク質分解に対する感受性に重要な役割を果たし得る。
【００５５】
Ｇ−１５３４Ｃは翻訳開始部位から１．５Ｋｂに位置し、ＴＩＥＧ２遺伝子の未だ同定されていないプロモーター中に存在する可能性がある。この配列をＴｒａｎｓＦａｃ(Heinemeyer et al 1998)で解析すると、Ｃ対立遺伝子の導入によってＡＰ−１部位が作り出されることが予測された。−１５３４Ｃおよび１８５Ｇ対立遺伝子双方の存在（連鎖不均衡０．９５）は、非機能的ＴＩＥＧ２タンパク質の過剰発現をもたらす結果となりうる。
【００５６】
要するに、ＴＩＥＧ２は外分泌膵細胞の増殖に関連づけられてはいたが、新規に同定されたＴＧ２Ｑ６２Ｒ（ＳＮＰ１９９ｂ）の解析結果は、初めて、変化したＴＩＥＧ２と２型糖尿病に対する感受性とを直接関連づけるものである。さらに、本発明者らは、ＴＩＥＧ２は偏在的に発現するが、骨格筋、外分泌膵臓、脳および脂肪細胞において高いレベルで発現することが見出されるため、ＴＩＥＧ２はこれらの組織への影響によってＴ２Ｄに対する感受性に影響を及ぼす可能性があるものと仮定する。ＴＧ２Ｑ６２Ｒ（ＳＮＰ１９９ｂ）と２型糖尿病との関連は、２型糖尿病に対する素因を分析するための診断検査として有用である。
【００５７】
２型糖尿病の発生におけるＴＩＥＧ２の役割をさらに調査するために、本発明者らが目的としたのは、ＴＩＥＧ２の標的遺伝子を同定することであった。発明者らは、まず、膵臓で主要な役割を果たす遺伝子に注目した。報告されているＴＩＥＧ２のＳＰ１様結合部位(Cook et al 1998)を基にして、発明者らはＳｍａｄ４、ＩＧＦ２およびＰＤＸ−１のプロモーター中のＴＩＥＧ２結合エレメントを予想した。ＰＤＸ−１に関して、この結合エレメントは最近同定された＜エンハンサー１＞エレメント(Ben-Shushan et al 2001)中に存在する可能性がある。実際、発明者らはＴＩＥＧ２発現ベクターがＰＤＸ−１エンハンサーエレメントの活性を数倍刺激することを示しているが、突然変異したエンハンサーエレメントには何の影響も与えなかった。ＰＤＸ−１は膵臓の発達に重要であり、適正な島細胞機能に重要な遺伝子、例えばインスリン遺伝子、の転写を調節する（Hui et al 2002により概説）。さらに、ＰＤＸ−１遺伝子の突然変異は若年発症成人型糖尿病４型（ＭＯＤＹ４）の発生の原因である。従って、ＴＩＥＧ２によるＰＤＸ−１の調節は、ＴＩＥＧ２の不適切な機能が２型糖尿病の発生の一因である可能性があることを示す。発明者らは現在、ＴＩＥＧ２によるＰＤＸ−１遺伝子調節の正確な機構を調査している。一方で、これはエンハンサー１エレメントとの直接的な相互作用によって生じている可能性がある。他方では、最近、密接に関連するＴＩＥＧ１がｓｍａｄ７およびｓｍａｄ２の双方の遺伝子発現を調節することが報告された(Johnsen et al 2002a, b)ことから、ＴＩＥＧ２はｓｍａｄのシグナル伝達の調節によってＰＤＸ−１遺伝子発現に影響を及ぼしている可能性がある。
【００５８】
従って、本発明者らは、ＴＩＥＧ２のＧ−１５３４ＣおよびＧｌｎ６２Ａｒｇ変異はいくつかの方法でＴＩＥＧ２の転写活性を阻害し、その結果として２型糖尿病の発生と因果関係を持つと結論づける。
【００５９】
実施例２：まれなＴＩＥＧ２の突然変異に関連する若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）および早期発症２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の新規な診断および治療法
本発明者らは、根底にある遺伝子的原因が不明なフランスのＭＯＤＹの家系の１９名の発端者、ならびに４０歳までに糖尿病を発症した１７１名の発端者および最低１名の罹患第一度近親者（男性／女性 ９６／７５、ＢＭＩ２４．９±０．３ｋｇ／ｃｍ２、年齢４９．７±１．０歳、空腹時グルコースレベル８．９±０．３ｍＭ、糖尿病の発症年齢３２．６±０．５歳）についてＴＩＥＧ２突然変異のスクリーニングを行った。発明者らは、３１３名のＴ２Ｄ患者および３１３名の対照被験体に存在しない、２種類の稀な突然変異を確認した。突然変異＋１０３９ Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ４３７Ｓｅｒ）が４世代にわたるＭＯＤＹ−Ｘ家系（ＦＲ２９）で見出され、分析した３世代で糖尿病／グルコース不耐性が遺伝していた（図５ａ）。ヘテロ接合型保因者の２名の配偶者（そのうちの１名も糖尿病）および３名の糖尿病でない兄弟はこの変異を保有していなかった。Ａｌａ４３７ＳｅｒはＴＩＥＧ２の３番目のリプレッサードメイン内に位置し、生物情報学的分析でこの変異がこのドメイン（ＰＩＸおよびＳＯＰＭ）のタンパク質二次構造を変化させるとの予測がなされた。第２の突然変異、＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）は２つの早期発症Ｔ２Ｄ家系に存在した。家系ＦＲ４７（図５ｂ）では、グルコース不耐性または明らかな糖尿病の４名の姉妹のうち３名がヘテロ接合型保因者であった。この家系のうち、分析した糖尿病でない５名の被験者にこの突然変異は存在しなかった。糖尿病を早期発症する家系は、定義では一遺伝子性ではなく、またＴｈｒ２２０Ｍｅｔが糖尿病家系の１家族に存在しなかったという事実は、複雑な形質という面において予期しないものではない。またＴＩＥＧ２は多遺伝子による感受性環境でＴ２Ｄの発症に影響を及ぼしうるという発明者らのこれまでの結論に一致する。家系ＦＲ４８４８（図５ｃ）では、２名の糖尿病被験者がヘテロ接合型保因者であり、糖尿病でない被験者はＴｈｒ２２０Ｍｅｔを保有していなかった。２つのリプレッサードメイン間に位置しているとはいえ、２２０Ｍｅｔ−ＴＩＥＧ２タンパク質はこの領域中に長いαへリックス構造を有しうる（ＰＩＸ）。
【００６０】
ＴＩＥＧ２の情報伝達経路の障害の生理学上の結果を分析するため、発明者らはＴＩＥＧ２によって制御されうる遺伝子を調査した。発明者らはＴＩＥＧ２が膵臓のβ−細胞系統の主要マーカーであるＰＤＸ１／ＩＰＦ１遺伝子およびＭＯＤＹ４遺伝子のエンハンサーＥ１部位、ならびにインスリン遺伝子プロモーター（図６）を活性化させることを見出した。肥満に関連するＴ２Ｄの発生を進行させるβ−細胞機能障害はβ−細胞塊での代償的増加の障害に関与しているので（S. E. Kahn,J. Clin. Endocrinol. Metab., 2001 and S. E. Kahn, Diabetologia 2003に概説）、ＰＤＸ１活性のどのような欠陥も糖尿病の発生に劇的な効果を有しうる。
【００６１】
さらに、トランスフェクション実験は、変異＋１８５ Ａ＞Ｇを含む６２Ａｒｇ−ＴＩＥＧ２により、インスリンプロモーターの活性化が損なわれたことを示し、従って糖尿病に対する遺伝的素因を引き起こす新規な機構を解明しうる。
【００６２】
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＳＮＰマップとＴＩＥＧに近接するコンティグを示す図である。
【図２】ＴＩＥＧ２ ＣＤＳを示す図である。Ｅ１〜４：エクソン１〜４、Ａｔｇ：開始コドン、ＳまたはＴ（網掛け部分）：報告されたリン酸化部位、Ｇａｇ．．：リプレッサードメイン、Ｇａｇ．．：ｍＳｉｎ３Ａと相互作用するリプレッサードメイン、Ｔｇｃ．．：Ｚｎフィンガードメイン、Ｃａｇ：Ａ１８５（Ｇ）、Ｑ Ｇｌｎ６２（Ａｒｇ）
【図３】ｔｉｅｇ２ｍｔＱ６２Ｒを示す図である。凡例：Ｅ１〜４：エクソン１〜４、Ａｔｇ：開始コドン、ＳまたはＴ（網掛け部分）：報告されたリン酸化部位、Ｇａｇ．．：リプレッサードメイン、Ｔｇｃ．．：Ｚｎフィンガードメイン、ＣＧｇ：（Ａ）１８５Ｇ、Ｒ （Ｇｌｎ）６２Ａｒｇ
【図４】３０４ａおよび５４ａの配列を示す図である。
【図５】ＴＩＥＧ２変異を説明する図である。 ａ）ＳＮＰ＋１０３９ Ｇ＞Ｔ Ａｌａ３４７Ｓｅｒを有する家系（ＭＯＤＹ−Ｘ ＦＲ２９）、およびｂ、ｃ）ＳＮＰ＋６５９ Ｃ＞Ｔ Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔを有する家系（早期発症糖尿病ＦＲ４７およびＦＲ４８４８）。アスタリスクは糖尿病性合併症（例えば神経障害）の存在を示す。記号の下は遺伝子型、検診時年齢、糖尿病／グルコース不耐性の発症年齢、糖尿病の処置（ＯＨＡ；経口血糖降下薬、ＩＮＳ；インスリン）およびＢＭＩを示す。
【図６】本明細書に記載の変異体がＴＩＥＧ２転写能を改変することを示す図である。ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされたＴＩＥＧ２発現ベクターはヒトＰＤＸ−１エンハンサーおよびインスリンプロモーターを活性化し、ＳＮＰ＋１８５ Ａ＞Ｇ Ｇｌｎ６２Ａｒｇ、＋１０３９ Ｇ＞Ｔ Ａｌａ３４７ＳｅｒおよびＳＮＰ＋６５９ Ｃ＞Ｔ Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔを含む構築物はこれらの変異体がＴＩＥＧ２の転写能を改変することを示す。
【図７】配列番号４０の配列を示す図である。ｃ＞ｔ Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ ＭＯＤＹ／早期発症
【図８】配列番号４１の配列を示す図である。ｇ＞ｔ Ａ３４７Ｓ ＭＯＤＹ ｆ２９
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はヒト遺伝学の分野に属し、ｔｉｅｇ２遺伝子のエクソン２に位置するＡ１８５Ｇ変異ならびにＧ−１５３４Ｃ、５４ａ、３０４ａ、＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９ Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）変異の同定に基づく、ヒト被験者における２型糖尿病、早期発症２型糖尿病および若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）の新規な診断および治療の方法に関する。
【０００２】
２型糖尿病は、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）または成人発症型糖尿病としても知られる、最も多く見られる糖尿病の種類である。２型糖尿病では、膵細胞がインスリンをわずかしか産生しない、もしくは全く産生しないか、または全身の細胞がインスリンを利用することができない（インスリン抵抗性）。これは欧米諸国で全症例の９５％に相当し、米国だけで約１５００万人が罹患している。
【０００３】
今日現在、糖尿病の診断には空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）検査が用いられている。しかし、この検査はひとたび病気を発症した場合にしか適さない。従って、この疾病に関連する遺伝的リスク因子を評価することのできる診断検査が必要である。このような検査は、リスクのある人々の生活習慣を適応させるため、また疾病の発症を予防するために大きな関心が寄せられるだろう。
【０００４】
２型糖尿病の発生において遺伝因子の関与を裏付ける強力な証拠がある。例えば、一卵性双生児間の２型糖尿病のリスク率は約６０〜９０パーセントである(Bennett PH. Epidemiology of diabetes mellitus. In: Rifkin H, Porte D Jr., eds. Ellenburg and Rifkin's Diabetes Mellitus. New York: Elsevier, 1990: 363-77)。その上、２型糖尿病の第一度近親者がいる場合、この病気を発症するリスクは２倍となる(Leslie RD, Pyke DA. Genetics of diabetes. In: Alberti KG, Krall LP, eds. The diabetes annual. Amsterdam: Elsevier, 1987: 39-54)。
【０００５】
もっと最近では、多数の科学研究によって、２型糖尿病に対する遺伝的素因が存在するということが確定された。本発明者らは糖尿病および肥満家系のゲノムワイドスキャンを行い、それによってこのような疾患との関連の証拠を示すいくつかのゲノム領域を同定するに至った(Vionnet N et al. (2000): Genomewide search for type 2 diabetes susceptibility genes in French whites: Evidence for a novel susceptibility locus for early onset diabetes on chromosome 3q27 qter and independent replication of a type 2 diabetes locus on chromosome lq21 q24. Am. J. Hum. Genet. 67: 1470 1480 and Hager J et al. (1998): A genome wide scan for human obesity genes reveals a major susceptibility locus on chromosome 10. Nat. Genet. 20: 304 308.)。
【０００６】
マイクロサテライトマーカーを用いるさらなる微細マッピングによって、この領域を約５Ｍ塩基まで限定することが可能となり、これによりこの領域へ候補遺伝子を同定し、ＬＤマッピング戦略を適用することが可能となった。ＬＤマッピングは膨大な量の一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型解析を伴う。
【０００７】
数年かけて、本発明者らは位置的遺伝子候補を同定するための完璧な戦略および方法を開発した。これには統計分析、生物情報学の情報ルート、ＳＮＰ遺伝子型解析および組織発現プロファイリングが含まれる。本発明者らのアプローチは、結果としてｃｈｒ２区間の微細マッピング、および位置クローニングアプローチによるこのゲノム領域の分析をもたらした。第２染色体の領域に対して確立されたＳＮＰマップにより、ＴＩＥＧ２を２型糖尿病に対する感受性に関連する遺伝子として同定するに至った。
【０００８】
両ＴＩＥＧ遺伝子は、ＴＧＦ−βによって誘発され(Cook et al. 1998 ; Blok et al. 1995)、膵細胞増殖を制御する可能性がある(Cook et al. 1998; Cook and Urrutia 2000)。外分泌ＰＡＮＣ１細胞系統でのＴＩＥＧ１の過剰発現はアポトーシスを誘発し(Tachibana et al. 1997)、類似の増殖阻害効果がＴＩＥＧ２にに関しても示された(Cook et al. 1998)。外分泌膵臓の腺房細胞においてＴＩＥＧ２を発現するトランスジェニックマウス(Mladek et al. 1999)は、ＴＧＦ−βを過剰発現しているマウスと類似の膵臓萎縮を示す(Sanvito et al. 1995)。さらに、ＴＩＥＧ１は骨芽細胞中でＴＧＦ−βと類似の効果を誘発することが示されている(Hefferan et al. 2000)）。このように、ＴＧＦ−βに誘発されるＴＩＥＧ１および２は、ＴＧＦ−βの効果、特に外分泌膵臓組織に見出される効果を模倣することができる。
【０００９】
本発明に関して、本発明者らは、ＴＩＥＧ２のエクソン２に位置する変異体Ａ１８５Ｇ（＝２ＳＮＰ１９９ｂ、ＴＧ２Ｑ６２Ｒ、ＴＧ２ＡＩ８５Ｇ）を同定および分析し、ＴＩＥＧ２が２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）に対する感受性に関連していることを明らかにした。ＳＮＰ１９９ｂ（Ａ＞Ｇ）はＴＩＥＧ２のエクソン２中の非同義（Ｇｌｎ６２Ａｒｇ）変異で、転写の際のＴＩＥＧ２の抑制特性を変化させることができる。
【００１０】
本発明に関して、本発明者らはＡ１８５Ｇと密接な不平衡にある、さらなる変異体Ｇ−１５３４Ｃを同定および分析した。この変異は翻訳開始部位から１．５Ｋｂに位置し、ＴＩＥＧ２遺伝子のまだ定義されていないプロモーター中に存在すると思われる。この配列をＴｒａｎｓＦａｃ(Heinemeyer et al 1998)で解析すると、Ｃ対立遺伝子の導入によってＡＰ−１部位が作成されることが予測された。−１５３４Ｃおよび１８５Ｇ対立遺伝子双方の存在は、非機能的ＴＩＥＧ２タンパク質の過剰発現をもたらす結果となりうる。本発明者らはＴＩＥＧ２におけるまれな突然変異が若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）および早期発症Ｔ２Ｄに関連することも見出した。
【００１１】
この点に関して、機能性の低いＴＩＥＧ２の調節によって引き起こされうる、膵臓の発達における前駆細胞の調節の変化および／またはヒト成人膵臓におけるβ細胞の新生の変化は、外分泌細胞と内分泌細胞との間のバランスを変える可能性がある。
【００１２】
ＴＩＥＧ２は膵臓の内分泌と外分泌のバランスに関連しており、本明細書ではこれを２型糖尿病の発生に影響しうる、膵組織の発達および再生に重要なものであると仮定される。ＴＩＥＧ２は偏在発現するが、骨格筋、外分泌膵臓、脳および脂肪組織でｍＲＮＡレベルが高く、このことは、いくつかの組織で２型糖尿病に対する感受性に影響を与えうる増殖／分化および細胞周期の調節を含み得るさらなる役割をＴＩＥＧ２が有する可能性があることを示唆するものである。
【００１３】
説明
従って、本発明は、２型糖尿病に対する対応の改善に寄与し、ＴＩＥＧ２を媒介とするシグナル伝達が２型糖尿病に対する感受性に関連がある証拠を示す。結果として、ＴＩＥＧ２は、２型糖尿病のための薬剤設計のための新規な標的となる。ＴＩＥＧ２変異体ＴＧ２Ｑ６２Ｒの２型糖尿病との関連は、２型糖尿病への素因を分析する診断検査として特に有用である。
【００１４】
第１の態様では、本発明は、ヒト被験者における２型糖尿病、早期発症型２型糖尿病および若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）の素因を診断するための方法に関し、この方法はｔｉｅｇ２遺伝子の配列中に生殖細胞系の変異があるかどうかを判定することを含み、該変異が２型糖尿病の素因の指標となり、該変異は、そのコード配列が配列番号１に示されるｔｉｅｇ２遺伝子の開始コドンに関して番号が付されたＡ１８５Ｇ、配列番号４に示されるＧ−１５３４Ｃ、図４Ａおよび４Ｂに示される５４ａまたは３０４ａ、ならびにその配列が図７および８にそれぞれ示される配列番号６および７に示される＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９ Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）から選択される。
【００１５】
本発明はまた、上述のように、変異体Ａ１８５Ｇ、Ｇ−１５３４Ｃ、５４ａまたは３０４ａ、＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９ Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）から選択される変異体と、密接に関連する生殖細胞系変異の存在を決定することを含んでなる、２型糖尿病に対する素因を診断する方法に関する。
【００１６】
本発明はより一般には、ｔｉｅｇ２遺伝子の研究に関する。この点で、本発明は、分子（１）前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡ領域と、（２）ｔｉｅｇ２遺伝子ＤＮＡのヒト野生型領域と相補的な核酸プローブとを互いにハイブリダイズさせて二重らせんを形成させた場合に、分子（１）と（２）の間に、前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡの配列中に少なくとも１つの変異が存在することによるミスマッチが存在するかどうかを決定することを含んでなる、ｔｉｅｇ２遺伝子の配列中の変異を同定する方法に関する。
【００１７】
より具体的には、本発明は、分子（１）前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡのエクソン２と、（２）配列番号２で示されるｔｉｅｇ２遺伝子ＤＮＡのヒト野生型エクソン２領域と相補的な核酸プローブとを互いにハイブリダイズさせて二重らせんを形成させた場合に、分子（１）と（２）の間に、前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡの配列中に少なくとも１つの変異が存在することによるミスマッチが存在するかどうかを決定することを含んでなる、ｔｉｅｇ２遺伝子のエクソン２中の変異を同定する方法を対象とする。
【００１８】
上述の方法では、サンプルのｍＲＮＡを、前記プローブと前記ｔｉｅｇ２遺伝子に対応するＲＮＡとのハイブリダイゼーションに適した条件下で、ｔｉｅｇ２遺伝子プローブと接触させ、前記プローブのハイブリダイゼーションを判定し、ハイブリダイゼーション後のシグナルレベルを標準のシグナル（陽性対照、陰性対照または双方のいずれか）と比較する。
【００１９】
このハイブリダイゼーション複合体は、プローブ、または直接にはｍＲＮＡの標識化によると思われるシグナルを発する。用いることができる種々の標識は当業者に周知であり、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈまたは１２５Ｉが挙げられる。非放射性標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジオキシゲニン、ハプテン、色素、発光物質（放射性発光物質、化学発光物質、生物発光物質、蛍光物質またはリン光発光物質など）のようなリガンドから選択することができる。本願中に記載されているＳＮＰを同定するためには、ｔｉｅｇ２遺伝子プローブと前記サンプルから単離されたゲノムＤＮＡとを、前記プローブと前記遺伝子とのハイブリダイゼーションに適した条件下で接触させ、前記プローブのハイブリダイゼーションを判定することができる。
【００２０】
前記ｔｉｅｇ２遺伝子領域プローブは、「野生型」ＤＮＡ（すなわち、探索されるＳＮＰがプローブ上に存在せず、本発明のＳＮＰがサンプル中のＤＮＡ上に存在しない場合にハイブリダイゼーションが起こる）か、または「突然変異」ＤＮＡ（すなわち、探索されるＳＮＰを有し、ＳＮＰがサンプル中のＤＮＡ上に存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こる）のいずれかである。この実施形態で用いる対立遺伝子特異的プローブ、それらの長さ、またはハイブリダイゼーション条件を決定する技術は当業者に公知である。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、ｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域の生殖細胞系配列または前記サンプルのその他の領域に変化があるかどうかを、変性または非変性ポリアクリルアミドゲル上で、前記サンプル由来の一本鎖ＤＮＡの電気泳動移動度のシフトを観察することによって決定することにより実行される。前記一本鎖核酸は、好適なプライマーを用いるゲノムＤＮＡの増幅および変性（このような目的では、通常、ゲルおよび電気泳動条件は変性されている）後に得てもよい。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、ｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域の全てまたは一部、あるいは前記サンプル由来のその他の領域の増幅、および前記の増幅されたＤＮＡの配列の決定によって実行される。
【００２３】
別の実施形態では、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、特定のｔｉｅｇ２突然変異対立遺伝子が前記サンプル中に存在するかどうかを決定するが、この場合には増幅のみが起こる。
【００２４】
例えば、これらのプライマーは、それぞれＡ１８５ＧおよびＧ−１５３４Ｃの配列−ｃａａａｇａｔｃｃｃＲｇａａａｇｇｔｇａｃ−（配列番号５）および−ｇｇｇｇｔｇｃｔｇａＳｔｇｇｇａａｇａｇｇ−（配列番号６）を包含し、配列中のＲはＡまたはＧを示し、ＳはＣまたはＧを示す。
【００２５】
本発明はまた、分子（１）前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡと、（２）配列ｇａｃａｃａｃａｃｃｔｃａＸｇｇａｃａｇｔ−（配列番号４２）（配列中、ＸはＣまたはＴ）に由来するプローブおよび配列ｔｔｇｇｔｃｃｔｇｃｃｃｃａｇｇｇａＹｃｃｃｔｃｃｃｔｃｃｇ−（配列番号４３）（配列中、ＹはＧまたはＴ）に由来するプローブなどの＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９ Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）変異配列を包含するヒトｔｉｅｇ２遺伝子ＤＮＡと相補的な核酸プローブとの間にミスマッチが存在するかどうかを決定することを含んでなる、ｔｉｅｇ２遺伝子中の変異を同定する方法を対象とする。
【００２６】
この点に関して、本発明は、＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９ Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）変異配列を包含するプライマーを対象とする。例えば、＋６５９ Ｃ＞Ｔ変異のプライマーは、配列−ｇａｃａｃａｃａｃｃｔｃａＸｇｇａｃａｇｔ−（配列番号４２）（配列中、ＸはＣまたはＴ）を包含するか、またはこれに由来するものであってよい。＋１０３９ Ｇ＞Ｔ変異のプライマーは、配列−ｔｔｇｇｔｃｃｔｇｃｃｃｃａｇｇｇａＹｃｃｃｔｃｃｃｔｃｃｇ−（配列番号４３）（配列中、ＹはＧまたはＴ）を包含するか、またはこれに由来するものであってよい。
【００２７】
別の実施形態では、前記サンプル由来のｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域の全てまたは一部をクローニングしてクローン配列を作出し、前記クローン配列の配列を決定する。
【００２８】
上述の方法は、前記サンプルのｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域配列の増幅、および増幅した配列と野生型ｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域配列（配列番号２で示される）または突然変異型ｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域配列に由来する１以上の核酸プローブとのハイブリダイゼーションによって実施することができ、前記プローブは、Ａ１８５Ｇ変異体およびＧ−１５３４Ｃ変異体に特異的なプローブから選択される。
【００２９】
Ａ１８５Ｇ変異アッセイは、オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによりエクソン２ ＴＩＥＧ２のゲノム配列５’−ＣＴＣ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＧＴ ＴＧＣ ＴＡＴ ＡＧＡ ＣＴ−３’（配列番号７）および５’−ＣＡＧ ＧＧＡ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＣＡ ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＴ−３’（配列番号８）、表１）を増幅することによって実施することができ、その後、対立遺伝子の変異を、プローブＬＣＲｅｄ６４０−ＡＴＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＧＧ ＴＧＡ ＣＣＴ（配列番号３３）およびＴＣＴ ＴＧＴ ＴＴＧ ＴＡＴ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＴＣＡ−フルオレセイン（配列番号３４）を用いてライトサイクラー(Roche)を使用して示差的Ｔｍ変化により評価することができる。
【００３０】
Ｇ−１５３４Ｃ変異アッセイは、オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによりＴＩＥＧ２の上流のゲノム配列（５’−ＧＴＴ ＴＡＡ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＧＡ ＡＣＣ ＧＴＧ ＡＴＡ−３’（配列番号９）および５’−ＧＡＡ ＣＡＧ ＣＡＡ ＧＴＧ ＣＧＡ ＧＧＡ Ｃ−３’、（配列番号１０）、表１）を増幅することによって実施することができ、その後、対立遺伝子の変異を、プローブＬＣＲｅｄ６４０−ＴＣＴＴＣＣＣＡＣＴＣＡＧＣＡＣ（配列番号３５）およびＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡ−フルオレセイン（配列番号３６）を用いてライトサイクラー（Roche）を使用して示差的Ｔｍ変化により評価することができる。
【００３１】
プローブに付着させた蛍光分子は例として示しているものであって、これに限定されるものではない。
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号５〜配列番号３６から選択されるプローブまたはプライマーを対象とする（下記表１参照）。
【００３２】
【表１】
【００３３】
本発明はまた、表１に記載のプローブで増幅した配列番号１および配列番号４の断片、ならびに少なくとも１種類の同定された変異を含む診断キットを対象とする。
【００３４】
本発明はまた、前記サンプル中のｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域と、野生型または突然変異型ｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域配列に由来する１以上の核酸プローブとのin situハイブリダイゼーションを決定することを含んでなる方法に関する。このような方法としては、Ｔ座でのＣＧＨ−ｆｉｓｈ法またはＣＧＨアレイ法が挙げられる。
【００３５】
発明者らは、ＴＩＥＧ２にＧｌｎ６２Ａｒｇ変異が存在すると、ＴＩＥＧ２転写抑制活性を阻害する可能性があることをいく通りかの方法で証明した。従って、ｔｉｅｇ２遺伝子のエクソン２領域またはその他の領域での他の改変もまた、ＴＩＥＧ２タンパク質の転写抑制活性の変化をもたらし、ｍＳｉｎ３Ａとの相互作用の変化によって、２型糖尿病に対する素因につながるとの推測には信憑性がある。
【００３６】
概して、最初にＭａｄタンパク質について示されたように、コリプレッサーｍＳｉｎ３Ａとの相互作用はヒストン脱アセチル化酵素の動員および機能的転写抑制複合体の形成を誘起する。近年、最初の抑制ドメイン近傍のリン酸化がｍＳｉｎ３ＡとＴＩＥＧ２との結合を阻害し、結果としてＴＩＥＧ２の抑制活性が失われることが示されている(Ellenrieder et al 2002)。同様に、６２Ｒ変異が起こるとｍＳｉｎ３Ａ結合が妨げられ、ＴＩＥＧ２の抑制活性が変化しうる。その上、−１５３４Ｃ（％）変異を有する１８５Ｇ変異が起こると、ＴＩＥＧ２のプロモーター中のＡＰ−１反応部位の導入を介してＴＩＥＧ２に可能な転写のアップレギュレーションを誘導し、結果として非機能的ＴＩＥＧ２タンパク質の過剰発現をもたらし得る。
【００３７】
従って、一実施形態では、本発明は、ヒト被験者において２型糖尿病に対する素因を診断する方法に関し、この方法ではＴＩＥＧ２タンパク質とｍＳｉｎ３Ａとの相互作用および前記サンプル中のＴＩＥＧ２ｍＲＮＡの発現レベルの変化が調査される。タンパク質と核酸の間の相互作用の変化は、当技術分野で公知の技術で検出が可能である。
【００３８】
第二の態様では、本発明は、配列番号３のＴＩＥＧ２のＧｌｎ６２Ａｒｇ変異体、ＴＩＥＧ２のＴｈｒ２２０Ｍｅｔ変異体およびＴＩＥＧ２のＡｌａ３４７Ｓｅｒ変異体に関する。これはまた、以下の変異：
Ｇｌｎ６２Ａｒｇ
Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ
Ａｌａ３４７Ｓｅｒ
のうち少なくとも１、２または３つを呈するＴＩＥＧ２の変異体に関する。特に、これらのポリペプチドは免疫ブロット法または免疫細胞化学によって検出することができる。
【００３９】
従って、本発明は、患者のサンプルにおいて前記変異の存在または不在を検出するのに使用可能な、これらのＴＩＥＧ２変異体に特異的な抗体、すなわち正常なＴＩＥＧ２と変異体ＴＩＥＧ２とを区別することのできる抗体を対象とする。免疫学的アッセイは当技術分野で標準的な知識を用いて実施できる。これらのものとしては、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。本発明はこれらの試験に好適なこのような抗体および試薬を含む診断キットを包含する。
【００４０】
本発明は、２型糖尿病の、特に遺伝的感受性が懸念される家系の患者のための、処置および／または予防における新規な分野を開拓するものである。従って、本発明はまた、２型糖尿病を予防および／または処置することの可能な化合物をスクリーニングするための方法に関し、その方法は、（ｉ）候補化合物および（ｉｉ）ＴＩＥＧ２ポリペプチドを混合すること、ならびにＴＩＥＧ２ポリペプチドと前記化合物との結合量を測定することを含んでなる。実際、ＴＩＥＧ２のアゴニストはその転写抑制活性を回復させ、２型糖尿病を単独またはその他の処置と組み合わせて処置するために有用な薬剤であると考えられる。
【００４１】
この実施形態では、「ＴＩＥＧ２」とは、Ｇｌｎ６２Ａｒｇ、Ｔｈｒ２２０ＭｅｔおよびＡｌａ３４７Ｓｅｒ変異ならびに野生型ＴＩＥＧ２を含むものと理解される。
【００４２】
本発明はまた、薬学上許容される賦形剤および本発明に記載の方法によって同定された化合物を含む医薬組成物、ならびに２型糖尿病の処置および／または予防を目的とする薬剤の製造のための本発明の方法によって同定された化合物の使用に関する。
【００４３】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の投与を含んでなる、２型糖尿病の治療方法に関する。
【００４４】
Ｇｌｎ６２Ａｒｇ、Ｔｈｒ２２０ＭｅｔおよびＡｌａ３４７Ｓｅｒ変異体による欠陥を修正するためには、本発明の別の実施形態としてはベクター、より詳しくは、ヒト細胞中で野生型ＴＩＥＧ２のコード配列の発現を可能にするプロモーターと作動可能に連結された前記コード配列を含んでなる、遺伝子治療に好適なベクターに関する。このようなベクターは直接in vivo遺伝子導入に適合させることができ、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスベクターが挙げられる。リポソーム、分子複合体、ポリマーおよびその他のベクターを含む、非ウイルスベクターを用いてもよい。組織への直接注射、静脈内もしくは動脈内投与、吸入、または局所適用ならびにその他の投与経路は当技術分野で公知である。
【００４５】
本発明はまた、２型糖尿病を研究するために有用な新規な動物モデルに関し、該動物内で前記ｔｉｅｇ２変異体が発現される。本発明の動物を得る方法は当業者に公知であり、特に本発明の方法に従って同定することができる薬剤の試験に有用である。この方法には、前記ｔｉｅｇ２変異遺伝子、キメラ動物、および前記ｔｉｅｇ２変異体を発現するベクターでトランスフェクトされた動物の生殖的伝達が可能な新規な系統をもたらすための遺伝子改変動物を含む。
【００４６】
この構築物の、本発明のトランスジェニック動物のゲノムへの挿入は、当業者に周知の方法によって行うことができ、無作為でも標的化してもよい。要するに、当業者であれば、ゲノム内に挿入する配列を含むベクター、および選択マーカー（例えばネオマイシン耐性をもたらすタンパク質をコードする遺伝子）を構築し、それを動物の胚幹（ＥＳ）細胞に導入することができる。次に、これらの細胞を選択マーカーで選択し、それを、例えば胚盤胞へのマイクロインジェクションによって、胚へ組み込み、これは妊娠中の雌の子宮を灌流することによって回収することができる。胚の再移植および形質転換動物の選択の後に可能性のある戻し交雑を行って、このようなトランスジェニック動物を得ることができる。「よりクリーンな」動物を得るためには、それが正しい配列に隣接されているならば部位特異的リコンビナーゼを使用して選択マーカー遺伝子を切り出してもよい。
【００４７】
従って本発明は、前述のようなＴＩＥＧ２変異体タンパク質の、すなわちＧｌｎ６２Ａｒｇ、Ｔｈｒ２２０ＭｅｔおよびＡｌａ３４７Ｓｅｒまたはそのいずれかの組み合わせの発現をもたらす調節エレメントと作動可能に連結されているｔｉｅｇ２変異遺伝子の核酸配列またはそのコード配列をそのゲノムに組み込んでいるトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。
【００４８】
前記実施形態に予見されるｔｉｅｇ２配列は、本発明の動物のゲノム内に導入されたヒトｔｉｅｇ２遺伝子配列、またはそのプロモーターが、変異が配列中に存在する間は過剰発現を誘発するよう修飾されている、内在性ｔｉｅｇ２遺伝子配列であってよい。
【００４９】
さらに、本発明はまた、ＴＩＥＧ２と２型糖尿病との関連を試験するため、および早期発症Ｔ２Ｄを研究するための動物モデルとして、内在性ｔｉｅｇ２遺伝子の破壊をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。特に、前記破壊には、選択可能なマーカー配列の挿入を含む。特に、前記破壊はホモ接合型の破壊であり、前記ホモ接合型の破壊は結果としてＴＩＥＧ２をコードする内在遺伝子のヌル変異をもたらす。
【００５０】
本発明の哺乳類は好ましくはマウスなどの齧歯類である。
【実施例】
【００５１】
実施例１：２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるＴＩＥＧ２の関与の遺伝的証拠
ＳＮＰ１９９ｂ（Ａ＞Ｇ）はＴＩＥＧ２のエクソン変異である。ＳＮＰ１９９ｂ（ＴＧ２Ｑ６２Ｒ）とＴ２Ｄとの強い関連は、家族性Ｔ２Ｄおよび対照群からなるフランス系白人コホートで存在することが示された（優性モデルＴＧ２Ｑ６２Ｒに基づくロジスティック回帰（年齢と性別で階層化）ｐ＜１０〜５）。ＳＮＰ１９９ｂ、４３７ｂ、５４ａおよび３０４ａは強い関連がある（カイ２乗 ｐ＜０．０００１）。ＳＮＰ ４３７ｂ（Ｇ＞Ｃ）は、ＴＩＥＧ２遺伝子の未だ同定されていないプロモーター中に存在する可能性のあるゲノム変異である。本発明者らは、ｃｈｒ２（表現型ｌａｒｇｅ／ｓｔｒｉｃｔ、ｘｔｄロッドスコア４．４５（ｐ＝０．０４））との連鎖の証拠を示す家系全員のゲノムワイドスキャンで５４ａと糖尿病との関連を示した。家族性２型糖尿病との（対照３５２名に対して糖尿病患者２８７名のコホートにおける）顕著な関連に対し、さらに異種の「コルベール」集団（糖尿病患者９４７名）では糖尿病との優性関係は見られなかった。しかし、分散には高いＢＭＩ値との劣性関係が残っていた。
【００５２】
Ｇｌｎ６２Ａｒｇは、ｍＳｉｎ３Ａコリプレッサーと相互作用することが示されているＴＩＥＧ２タンパク質の最初のリプレッサードメインの近傍に位置する。ＴＩＥＧ２のＲ１ドメインはαへリックス型のコンホメーションをとり、ＴＩＥＧ１、ＢＴＥＢ１、３および４において保存されているこのαへリックス抑制モチーフ（ｏｃ−ＨＲＭ）がｍＳｉｎ３Ａとの相互作用を担うことが示されている（Ｓｉｎ相互作用ドメイン；(Zhang et al. 2001))。ＰＩＸ（ＵＫ ＨＧＭＰ資源センター http://www.hizmp.mrc.ac.uk/）を用いるＴＩＥＧ２（６２Ｇｌｎ）および６２Ａｒｇ−ＴＩＥＧ２（ＴＧ２Ｑ６２Ｒを含むタンパク質）のタンパク質二次構造の分析は、ＤＳＣ（使用した３つの２Ｄ解析プログラムの中の１つ(King et al. 2000)）がＳＩＤの近傍にある６２Ａｒｇ−ＴＩＥＧ２に対して長いαへリックスを予測したことを示した。従って、変化した６２Ａｒｇ−ＴＩＥＧ２のコンホメーションは、α−ＨＲＭに媒介されるｍＳｉｎ３Ａとの相互作用を阻害する可能性がある。
【００５３】
それに加えて、グルタミンからアルギニンへの変化がタンパク質に特別な変化を加え、従って、その等電点およびｍＳｉｎ３Ａとの結合特性を変える可能性がある。
【００５４】
さらに、Ｇｌｎ６２Ａｒｇは、プロテインキナーゼＣによってリン酸化されうるセリンの隣に位置する。リン酸化は、タンパク質活性の調節、核への転位またはその他のタンパク質との相互作用ならびにタンパク質分解に対する感受性に重要な役割を果たし得る。
【００５５】
Ｇ−１５３４Ｃは翻訳開始部位から１．５Ｋｂに位置し、ＴＩＥＧ２遺伝子の未だ同定されていないプロモーター中に存在する可能性がある。この配列をＴｒａｎｓＦａｃ(Heinemeyer et al 1998)で解析すると、Ｃ対立遺伝子の導入によってＡＰ−１部位が作り出されることが予測された。−１５３４Ｃおよび１８５Ｇ対立遺伝子双方の存在（連鎖不均衡０．９５）は、非機能的ＴＩＥＧ２タンパク質の過剰発現をもたらす結果となりうる。
【００５６】
要するに、ＴＩＥＧ２は外分泌膵細胞の増殖に関連づけられてはいたが、新規に同定されたＴＧ２Ｑ６２Ｒ（ＳＮＰ１９９ｂ）の解析結果は、初めて、変化したＴＩＥＧ２と２型糖尿病に対する感受性とを直接関連づけるものである。さらに、本発明者らは、ＴＩＥＧ２は偏在的に発現するが、骨格筋、外分泌膵臓、脳および脂肪細胞において高いレベルで発現することが見出されるため、ＴＩＥＧ２はこれらの組織への影響によってＴ２Ｄに対する感受性に影響を及ぼす可能性があるものと仮定する。ＴＧ２Ｑ６２Ｒ（ＳＮＰ１９９ｂ）と２型糖尿病との関連は、２型糖尿病に対する素因を分析するための診断検査として有用である。
【００５７】
２型糖尿病の発生におけるＴＩＥＧ２の役割をさらに調査するために、本発明者らが目的としたのは、ＴＩＥＧ２の標的遺伝子を同定することであった。発明者らは、まず、膵臓で主要な役割を果たす遺伝子に注目した。報告されているＴＩＥＧ２のＳＰ１様結合部位(Cook et al 1998)を基にして、発明者らはＳｍａｄ４、ＩＧＦ２およびＰＤＸ−１のプロモーター中のＴＩＥＧ２結合エレメントを予想した。ＰＤＸ−１に関して、この結合エレメントは最近同定された＜エンハンサー１＞エレメント(Ben-Shushan et al 2001)中に存在する可能性がある。実際、発明者らはＴＩＥＧ２発現ベクターがＰＤＸ−１エンハンサーエレメントの活性を数倍刺激することを示しているが、突然変異したエンハンサーエレメントには何の影響も与えなかった。ＰＤＸ−１は膵臓の発達に重要であり、適正な島細胞機能に重要な遺伝子、例えばインスリン遺伝子、の転写を調節する（Hui et al 2002により概説）。さらに、ＰＤＸ−１遺伝子の突然変異は若年発症成人型糖尿病４型（ＭＯＤＹ４）の発生の原因である。従って、ＴＩＥＧ２によるＰＤＸ−１の調節は、ＴＩＥＧ２の不適切な機能が２型糖尿病の発生の一因である可能性があることを示す。発明者らは現在、ＴＩＥＧ２によるＰＤＸ−１遺伝子調節の正確な機構を調査している。一方で、これはエンハンサー１エレメントとの直接的な相互作用によって生じている可能性がある。他方では、最近、密接に関連するＴＩＥＧ１がｓｍａｄ７およびｓｍａｄ２の双方の遺伝子発現を調節することが報告された(Johnsen et al 2002a, b)ことから、ＴＩＥＧ２はｓｍａｄのシグナル伝達の調節によってＰＤＸ−１遺伝子発現に影響を及ぼしている可能性がある。
【００５８】
従って、本発明者らは、ＴＩＥＧ２のＧ−１５３４ＣおよびＧｌｎ６２Ａｒｇ変異はいくつかの方法でＴＩＥＧ２の転写活性を阻害し、その結果として２型糖尿病の発生と因果関係を持つと結論づける。
【００５９】
実施例２：まれなＴＩＥＧ２の突然変異に関連する若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）および早期発症２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の新規な診断および治療法
本発明者らは、根底にある遺伝子的原因が不明なフランスのＭＯＤＹの家系の１９名の発端者、ならびに４０歳までに糖尿病を発症した１７１名の発端者および最低１名の罹患第一度近親者（男性／女性 ９６／７５、ＢＭＩ２４．９±０．３ｋｇ／ｃｍ２、年齢４９．７±１．０歳、空腹時グルコースレベル８．９±０．３ｍＭ、糖尿病の発症年齢３２．６±０．５歳）についてＴＩＥＧ２突然変異のスクリーニングを行った。発明者らは、３１３名のＴ２Ｄ患者および３１３名の対照被験体に存在しない、２種類の稀な突然変異を確認した。突然変異＋１０３９ Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ４３７Ｓｅｒ）が４世代にわたるＭＯＤＹ−Ｘ家系（ＦＲ２９）で見出され、分析した３世代で糖尿病／グルコース不耐性が遺伝していた（図５ａ）。ヘテロ接合型保因者の２名の配偶者（そのうちの１名も糖尿病）および３名の糖尿病でない兄弟はこの変異を保有していなかった。Ａｌａ４３７ＳｅｒはＴＩＥＧ２の３番目のリプレッサードメイン内に位置し、生物情報学的分析でこの変異がこのドメイン（ＰＩＸおよびＳＯＰＭ）のタンパク質二次構造を変化させるとの予測がなされた。第２の突然変異、＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）は２つの早期発症Ｔ２Ｄ家系に存在した。家系ＦＲ４７（図５ｂ）では、グルコース不耐性または明らかな糖尿病の４名の姉妹のうち３名がヘテロ接合型保因者であった。この家系のうち、分析した糖尿病でない５名の被験者にこの突然変異は存在しなかった。糖尿病を早期発症する家系は、定義では一遺伝子性ではなく、またＴｈｒ２２０Ｍｅｔが糖尿病家系の１家族に存在しなかったという事実は、複雑な形質という面において予期しないものではない。またＴＩＥＧ２は多遺伝子による感受性環境でＴ２Ｄの発症に影響を及ぼしうるという発明者らのこれまでの結論に一致する。家系ＦＲ４８４８（図５ｃ）では、２名の糖尿病被験者がヘテロ接合型保因者であり、糖尿病でない被験者はＴｈｒ２２０Ｍｅｔを保有していなかった。２つのリプレッサードメイン間に位置しているとはいえ、２２０Ｍｅｔ−ＴＩＥＧ２タンパク質はこの領域中に長いαへリックス構造を有しうる（ＰＩＸ）。
【００６０】
ＴＩＥＧ２の情報伝達経路の障害の生理学上の結果を分析するため、発明者らはＴＩＥＧ２によって制御されうる遺伝子を調査した。発明者らはＴＩＥＧ２が膵臓のβ−細胞系統の主要マーカーであるＰＤＸ１／ＩＰＦ１遺伝子およびＭＯＤＹ４遺伝子のエンハンサーＥ１部位、ならびにインスリン遺伝子プロモーター（図６）を活性化させることを見出した。肥満に関連するＴ２Ｄの発生を進行させるβ−細胞機能障害はβ−細胞塊での代償的増加の障害に関与しているので（S. E. Kahn,J. Clin. Endocrinol. Metab., 2001 and S. E. Kahn, Diabetologia 2003に概説）、ＰＤＸ１活性のどのような欠陥も糖尿病の発生に劇的な効果を有しうる。
【００６１】
さらに、トランスフェクション実験は、変異＋１８５ Ａ＞Ｇを含む６２Ａｒｇ−ＴＩＥＧ２により、インスリンプロモーターの活性化が損なわれたことを示し、従って糖尿病に対する遺伝的素因を引き起こす新規な機構を解明しうる。
【００６２】
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＳＮＰマップとＴＩＥＧに近接するコンティグを示す図である。
【図２】ＴＩＥＧ２ ＣＤＳを示す図である。Ｅ１〜４：エクソン１〜４、Ａｔｇ：開始コドン、ＳまたはＴ（網掛け部分）：報告されたリン酸化部位、Ｇａｇ．．：リプレッサードメイン、Ｇａｇ．．：ｍＳｉｎ３Ａと相互作用するリプレッサードメイン、Ｔｇｃ．．：Ｚｎフィンガードメイン、Ｃａｇ：Ａ１８５（Ｇ）、Ｑ Ｇｌｎ６２（Ａｒｇ）
【図３】ｔｉｅｇ２ｍｔＱ６２Ｒを示す図である。凡例：Ｅ１〜４：エクソン１〜４、Ａｔｇ：開始コドン、ＳまたはＴ（網掛け部分）：報告されたリン酸化部位、Ｇａｇ．．：リプレッサードメイン、Ｔｇｃ．．：Ｚｎフィンガードメイン、ＣＧｇ：（Ａ）１８５Ｇ、Ｒ （Ｇｌｎ）６２Ａｒｇ
【図４】３０４ａおよび５４ａの配列を示す図である。
【図５】ＴＩＥＧ２変異を説明する図である。 ａ）ＳＮＰ＋１０３９ Ｇ＞Ｔ Ａｌａ３４７Ｓｅｒを有する家系（ＭＯＤＹ−Ｘ ＦＲ２９）、およびｂ、ｃ）ＳＮＰ＋６５９ Ｃ＞Ｔ Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔを有する家系（早期発症糖尿病ＦＲ４７およびＦＲ４８４８）。アスタリスクは糖尿病性合併症（例えば神経障害）の存在を示す。記号の下は遺伝子型、検診時年齢、糖尿病／グルコース不耐性の発症年齢、糖尿病の処置（ＯＨＡ；経口血糖降下薬、ＩＮＳ；インスリン）およびＢＭＩを示す。
【図６】本明細書に記載の変異体がＴＩＥＧ２転写能を改変することを示す図である。ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされたＴＩＥＧ２発現ベクターはヒトＰＤＸ−１エンハンサーおよびインスリンプロモーターを活性化し、ＳＮＰ＋１８５ Ａ＞Ｇ Ｇｌｎ６２Ａｒｇ、＋１０３９ Ｇ＞Ｔ Ａｌａ３４７ＳｅｒおよびＳＮＰ＋６５９ Ｃ＞Ｔ Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔを含む構築物はこれらの変異体がＴＩＥＧ２の転写能を改変することを示す。
【図７】配列番号４０の配列を示す図である。ｃ＞ｔ Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ ＭＯＤＹ／早期発症
【図８】配列番号４１の配列を示す図である。ｇ＞ｔ Ａ３４７Ｓ ＭＯＤＹ ｆ２９
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｔｉｅｇ２遺伝子の配列中に生殖細胞系の変異があるかどうかを決定することを含んでなり、該変異は２型糖尿病の素因の指標となるヒト被験者における２型糖尿病、早期発症型２型糖尿病および若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）の素因を診断する方法であって、該変異は、そのコード配列が配列番号１で表されるｔｉｅｇ２遺伝子の開始コドンに関して番号が付されたＡ１８５Ｇ、配列番号４に示されるＧ−１５３４Ｃ、図４Ａおよび４Ｂに示される５４ａまたは３０４ａ、ならびにその配列が図７および８にそれぞれ示される配列番号４０および４１に表される＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９ Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）から選択される方法。
【請求項２】
変異Ａ１８５Ｇ、Ｇ−１５３４Ｃ、５４ａまたは３０４ａ、＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）から選択される変異と密接に関連する生殖細胞系の変異の存在を判定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分子（１）前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡ領域と、（２）ｔｉｅｇ２遺伝子ＤＮＡのヒト野生型領域と相補的な核酸プローブとを互いにハイブリダイズさせて二重らせんを形成させた場合に、分子（１）と（２）の間に、前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡの配列中に少なくとも１つの変異が存在することによるミスマッチが存在するかどうかを決定することを含んでなる、ｔｉｅｇ２遺伝子の配列中の変異を同定する方法。
【請求項４】
分子（１）前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡのエクソン２と、（２）配列番号２で表されるｔｉｅｇ２遺伝子ＤＮＡのヒト野生型エクソン２領域と相補的な核酸プローブとを互いにハイブリダイズさせて二重らせんを形成させた場合に、分子（１）と（２）の間に、前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡの配列中に少なくとも１つの変異が存在することによるミスマッチが存在するかどうかを決定することを含んでなる、ｔｉｅｇ２遺伝子のエクソン２中の変異を同定する方法。
【請求項５】
前記サンプル中のｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域の増幅、および増幅した配列と野生型ｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域配列（配列番号２で表される）または突然変異型ｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域配列に由来する１以上の核酸プローブとのハイブリダイゼーションを含んでなり、前記プローブまたはプライマーがそれぞれＡ１８５ＧおよびＧ−１５３４Ｃの配列として、−ｃａａａｇａｔｃｃｃＲｇａａａｇｇｔｇａｃ−（配列番号５）および−ｇｇｇｇｔｇｃｔｇａＳｔｇｇｇａａｇａｇｇ−（配列番号６）を包含する（配列中のＲはＡまたはＧを示し、ＳはＣまたはＧを示す）、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
分子（１）前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡと、（２）配列ｇａｃａｃａｃａｃｃｔｃａＸｇｇａｃａｇｔ−（配列番号４２）（配列中、ＸはＣまたはＴ）に由来するプローブおよび配列ｔｔｇｇｔｃｃｔｇｃｃｃｃａｇｇｇａＹｃｃｃｔｃｃｃｔｃｃｇ−（配列番号４３）（配列中、ＹはＧまたはＴ）に由来するプローブなどの＋６５９Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）変異配列を包含するヒトｔｉｅｇ２遺伝子ＤＮＡと相補的な核酸プローブとの間にミスマッチが存在するかどうかを決定することを含んでなる、ｔｉｅｇ２遺伝子中の変異を同定する方法。
【請求項７】
配列番号５乃至３６から選択されるプローブまたはプライマーならびに配列番号４２および４３由来のプライマー。
【請求項８】
配列番号３のＴＩＥＧ２のＧｌｎ６２Ａｒｇタンパク質変異体、Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔタンパク質変異体、Ａｌａ３４７Ｓｅｒタンパク質変異体および以下の変異：
Ｇｌｎ６２Ａｒｇ
Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ
Ａｌａ３４７Ｓｅｒ
のうち少なくとも２つを呈する変異体から選択されるＴＩＥＧ２の変異体。
【請求項９】
正常なＴＩＥＧ２と請求項８に記載のＴＩＥＧ２の変異体とを区別することができる抗体。
【請求項１０】
請求項８に記載の抗体、ならびにウエスタンブロット法、免疫組織化学的アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイに好適な試薬、または少なくとも１種の請求項７に記載のプローブを含んでなる、診断用キット。
【請求項１１】
（ｉ）候補化合物および（ｉｉ）ＴＩＥＧ２ポリペプチドを混合すること、ならびにＴＩＥＧ２ポリペプチドと前記化合物との結合量を測定することを含んでなる、２型糖尿病の予防および／または処置をすることができる化合物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
ヒト細胞中で野生型ＴＩＥＧ２のコード配列の発現を可能にするプロモーターと作動可能に連結された野生型ＴＩＥＧ２のコード配列を含んでなる、遺伝子療法に好適なベクター。
【請求項１３】
２型糖尿病の予防および／または処置用薬剤を製造するための請求項１１に記載の方法によって同定される化合物または請求項１１に記載のベクターの使用。
【請求項１４】
請求項８に記載のタンパク質変異体を発現する、２型糖尿病の研究に用いられる動物モデル。
【請求項１５】
配列番号３のＴＩＥＧ２のＧｌｎ６２Ａｒｇタンパク質変異体、Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔタンパク質変異体、Ａｌａ３４７Ｓｅｒタンパク質変異体および以下の変異：
Ｇｌｎ６２Ａｒｇ
Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ
Ａｌａ３４７Ｓｅｒ
のうち少なくとも２つを呈する変異体から選択されるＴＩＥＧ２の変異体の発現をもたらす、調節エレメントと作動可能に連結された請求項８に記載のタンパク質変異体をコードする核酸分子配列をそのゲノムに組み込んでいる、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１６】
２型糖尿病、早期発症型２型糖尿病および若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）に用いられる動物モデルとして、そのゲノム中に内在性ｔｉｅｇ２遺伝子の破壊を含んでなる、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１７】
遺伝子の破壊が、Ａ１８５Ｇ、Ｇ−１５３４Ｃ、５４ａ、３０４ａ、＋６５９ Ｃ＞Ｔおよび＋１０３９Ｇ＞Ｔである、請求項１６に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１】
ｔｉｅｇ２遺伝子の配列中に生殖細胞系の変異があるかどうかを決定することを含んでなり、該変異は２型糖尿病の素因の指標となるヒト被験者における２型糖尿病、早期発症型２型糖尿病および若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）の素因を診断する方法であって、該変異は、そのコード配列が配列番号１で表されるｔｉｅｇ２遺伝子の開始コドンに関して番号が付されたＡ１８５Ｇ、配列番号４に示されるＧ−１５３４Ｃ、図４Ａおよび４Ｂに示される５４ａまたは３０４ａ、ならびにその配列が図７および８にそれぞれ示される配列番号４０および４１に表される＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９ Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）から選択される方法。
【請求項２】
変異Ａ１８５Ｇ、Ｇ−１５３４Ｃ、５４ａまたは３０４ａ、＋６５９ Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）から選択される変異と密接に関連する生殖細胞系の変異の存在を判定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分子（１）前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡ領域と、（２）ｔｉｅｇ２遺伝子ＤＮＡのヒト野生型領域と相補的な核酸プローブとを互いにハイブリダイズさせて二重らせんを形成させた場合に、分子（１）と（２）の間に、前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡの配列中に少なくとも１つの変異が存在することによるミスマッチが存在するかどうかを決定することを含んでなる、ｔｉｅｇ２遺伝子の配列中の変異を同定する方法。
【請求項４】
分子（１）前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡのエクソン２と、（２）配列番号２で表されるｔｉｅｇ２遺伝子ＤＮＡのヒト野生型エクソン２領域と相補的な核酸プローブとを互いにハイブリダイズさせて二重らせんを形成させた場合に、分子（１）と（２）の間に、前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡの配列中に少なくとも１つの変異が存在することによるミスマッチが存在するかどうかを決定することを含んでなる、ｔｉｅｇ２遺伝子のエクソン２中の変異を同定する方法。
【請求項５】
前記サンプル中のｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域の増幅、および増幅した配列と野生型ｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域配列（配列番号２で表される）または突然変異型ｔｉｅｇ２遺伝子エクソン２領域配列に由来する１以上の核酸プローブとのハイブリダイゼーションを含んでなり、前記プローブまたはプライマーがそれぞれＡ１８５ＧおよびＧ−１５３４Ｃの配列として、−ｃａａａｇａｔｃｃｃＲｇａａａｇｇｔｇａｃ−（配列番号５）および−ｇｇｇｇｔｇｃｔｇａＳｔｇｇｇａａｇａｇｇ−（配列番号６）を包含する（配列中のＲはＡまたはＧを示し、ＳはＣまたはＧを示す）、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
分子（１）前記サンプルから単離されたｔｉｅｇ２遺伝子ゲノムＤＮＡと、（２）配列ｇａｃａｃａｃａｃｃｔｃａＸｇｇａｃａｇｔ−（配列番号４２）（配列中、ＸはＣまたはＴ）に由来するプローブおよび配列ｔｔｇｇｔｃｃｔｇｃｃｃｃａｇｇｇａＹｃｃｃｔｃｃｃｔｃｃｇ−（配列番号４３）（配列中、ＹはＧまたはＴ）に由来するプローブなどの＋６５９Ｃ＞Ｔ（Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ）および＋１０３９Ｇ＞Ｔ（Ａｌａ３４７Ｓｅｒ）変異配列を包含するヒトｔｉｅｇ２遺伝子ＤＮＡと相補的な核酸プローブとの間にミスマッチが存在するかどうかを決定することを含んでなる、ｔｉｅｇ２遺伝子中の変異を同定する方法。
【請求項７】
配列番号５乃至３６から選択されるプローブまたはプライマーならびに配列番号４２および４３由来のプライマー。
【請求項８】
配列番号３のＴＩＥＧ２のＧｌｎ６２Ａｒｇタンパク質変異体、Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔタンパク質変異体、Ａｌａ３４７Ｓｅｒタンパク質変異体および以下の変異：
Ｇｌｎ６２Ａｒｇ
Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ
Ａｌａ３４７Ｓｅｒ
のうち少なくとも２つを呈する変異体から選択されるＴＩＥＧ２の変異体。
【請求項９】
正常なＴＩＥＧ２と請求項８に記載のＴＩＥＧ２の変異体とを区別することができる抗体。
【請求項１０】
請求項８に記載の抗体、ならびにウエスタンブロット法、免疫組織化学的アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイに好適な試薬、または少なくとも１種の請求項７に記載のプローブを含んでなる、診断用キット。
【請求項１１】
（ｉ）候補化合物および（ｉｉ）ＴＩＥＧ２ポリペプチドを混合すること、ならびにＴＩＥＧ２ポリペプチドと前記化合物との結合量を測定することを含んでなる、２型糖尿病の予防および／または処置をすることができる化合物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
ヒト細胞中で野生型ＴＩＥＧ２のコード配列の発現を可能にするプロモーターと作動可能に連結された野生型ＴＩＥＧ２のコード配列を含んでなる、遺伝子療法に好適なベクター。
【請求項１３】
２型糖尿病の予防および／または処置用薬剤を製造するための請求項１１に記載の方法によって同定される化合物または請求項１１に記載のベクターの使用。
【請求項１４】
請求項８に記載のタンパク質変異体を発現する、２型糖尿病の研究に用いられる動物モデル。
【請求項１５】
配列番号３のＴＩＥＧ２のＧｌｎ６２Ａｒｇタンパク質変異体、Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔタンパク質変異体、Ａｌａ３４７Ｓｅｒタンパク質変異体および以下の変異：
Ｇｌｎ６２Ａｒｇ
Ｔｈｒ２２０Ｍｅｔ
Ａｌａ３４７Ｓｅｒ
のうち少なくとも２つを呈する変異体から選択されるＴＩＥＧ２の変異体の発現をもたらす、調節エレメントと作動可能に連結された請求項８に記載のタンパク質変異体をコードする核酸分子配列をそのゲノムに組み込んでいる、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１６】
２型糖尿病、早期発症型２型糖尿病および若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）に用いられる動物モデルとして、そのゲノム中に内在性ｔｉｅｇ２遺伝子の破壊を含んでなる、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１７】
遺伝子の破壊が、Ａ１８５Ｇ、Ｇ−１５３４Ｃ、５４ａ、３０４ａ、＋６５９ Ｃ＞Ｔおよび＋１０３９Ｇ＞Ｔである、請求項１６に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００６−５１８２１３（Ｐ２００６−５１８２１３Ａ）
【公表日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０２５００（Ｐ２００６−５０２５００）
【出願日】平成１６年２月２０日（２００４．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／０００９４７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７４５１４
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【出願人】（５９４０１６８７２）サントル、ナショナール、ド、ラ、ルシェルシュ、シアンティフィク、（セーエヌエルエス） (83)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年２月２０日（２００４．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／０００９４７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７４５１４
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【出願人】（５９４０１６８７２）サントル、ナショナール、ド、ラ、ルシェルシュ、シアンティフィク、（セーエヌエルエス） (83)
【Ｆターム（参考）】
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