２粒子複合体を用いた生物学的分子の検出のための方法及び組成物
本発明は、電気発生性の化学発光を用いて、試料における対象の分析物を検出する方法を提供する。本発明は、電気発生性の化学発光部分を捕捉し、又は含む、少なくとも１つの固体支持体を含む組成物も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、本明細書に参照により組み入れられる、２００４年６月２３日出願の米国仮特許出願第６０／５８１７１９号の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、一般的には、試料における対象の分析物を検出するための方法及び組成物に関する。対象の分析物は、ヒト又は他の生物に影響を及ぼす疾患又は病状に関連し得る。対象の分析物には、毒素、化学若しくは生物兵器物質、及び環境汚染物質が含まれる。ある実施形態において、本発明は、特に、第１及び第２の担体、試料中に含まれる対象の分析物、第１の担体を通じて捕捉され又は含有される電気化学発光（ＥＣＬ）部分、並びに第１及び第２の担体の少なくとも１つに連結される対象の分析物の少なくとも１つの特異的結合パートナーを含む組成物に関する。ある実施形態において、本発明は、試料における対象の分析物を検出するための、これらの組成物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
化学的、生化学的、及び生物学的物質などの分析物を、検出し、定量する、迅速で高度に特異的な方法が、引き続き、ますます必要とされている。特に、少量の、薬剤、代謝物、生物学的マーカー、微生物、ウィルス、及び他の病原体を測定するための方法が望まれている。これらの材料の存在は、多くの生物学的システムを特徴づける高度の特異性を利用する結合方法により決定できることが多い。試料に存在する対象の分子を検出するために結合に頼っている既知の方法には、核酸ハイブリダイゼーション技術、及び、抗体−抗原結合などのタンパク質−リガンド相互作用が含まれる。これらの方法では、診断的価値のある複合体の存在が、通常、複合体を含む１つ又は複数の材料に付着している観察可能な標識の存在／活性化、又は非存在／非活性化により示される。
【０００４】
感度及び選択性は双方とも、多数の構成成分からなる試料に存在する対象の特異的分子を検出するためのあらゆるシステムの望ましい特質である。対象の生物学的分子を検出するためのＤＮＡハイブリダイゼーション及び他のバイオアッセイでは、感度は、臨床上の診断（Ｌｉｒｏｎ ａｎｄ Ｆｉｓｈｅｒ編集、Ｎｏｖｅｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｓｓａｙｓ、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００年；Ｋｅｎｔｏｎら、１９９２年、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３８巻、８７３頁；Ｃｈｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓら、２００２年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７４巻、３０３０頁）、法化学（Ｈｅｌｌｅｒ、２００２年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．、４巻、１２９頁；Ｎｅｌｓｏｎら、１９９６年、Ｊ．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ．、４１巻、５５７頁）、環境調査（Ｌｕｃａｒｅｌｌｉら、２００２年、Ｔａｌａｎｔａ、５６巻、９４９頁；Ｍｉｎら、２００２年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０３巻、１８６頁）、薬学研究（Ｈｅｌｌｅｒ、２００２年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．、４巻、１２９頁；Ｐｏｌｌｉｃｅら、１９８５年、Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．、５巻、４６３頁）、及び生物兵器物質の検出（Ｓｍｉｔｈ、２００２年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７４巻、４６２Ａ頁；Ｍｉａｏ及びＢａｒｄ、２００３年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７５巻、５８２５頁）において重要である。したがって、対象分子の感度のある、選択的な検出を提供するあらゆるシステムは、これらの分野全てで広範囲の適用性を有する。
【０００５】
電気化学発光（ＥＣＬ）法は、感度が高く、ダイナミックレンジが広く、選択的であるので、結合試験（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｔｕｄｙ）で広く使われている（米国特許第６３１６６０７号；Ｂａｒｄ，Ａ．Ｊ．編集、Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００４年）。例えば、ＤＮＡの検出に様々な技術が使用可能であり、その場合、標的の１本鎖ＤＮＡ（ｔ−ｓｓＤＮＡ）に結合している電気化学的標識、蛍光標識、及びＥＣＬ活性標識が、分析過程で測定可能なシグナルを生成する（Ｌｉｒｏｎ及びＦｉｓｈｅｒ編集、Ｎｏｖｅｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｓｓａｙｓ、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００年；Ｙａｎｇ及びＮｇｏ編集、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００年；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒｓ、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９８年）。測定されるシグナルの強度は概ねｔ−ｓｓＤＮＡの量に比例するので、これらの方法の感度は制限されることが多く、伝統的に、たった１つ又は少数の標識が１つのｔ−ｓｓＤＮＡに結合することができる。より高感度を実現することができるように、１つのＤＮＡをより多数の標識で標識することができる幾つかの方法が開発されている（Ｗａｎｇ及びＭｅｒｋｏｃｉ、２００３年、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９巻、９８９頁；Ｚｈａｏら、２００３年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２５巻、１１４７４頁）。これらの方法は、フェムトモル（ｆｍｏｌ）範囲の量を検出するのに必要とされる感度はもたらさない。また、これらは相補的なハイブリダイゼーションと、２塩基対のミスマッチ又は多重測定とを区別する能力である、低い非特異的結合ももたらさない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、高い選択性及び低い非特異的結合をもたらす、高感度の（例えば、ｆｍｏｌ範囲の）検出システムが依然として必要とされている。少なくとも１つの他の分子（例えば、特異的結合パートナー）に結合し、又はそれと相互作用することができるのであれば、このシステムは広範囲の適用性を有するはずであり、実質的にあらゆる対象の分子を検出するのに用いることができる。対象の分子が核酸、例えばＤＮＡである場合には、このシステムは、相補的なハイブリダイゼーション、少なくとも２塩基対のミスマッチのハイブリダイゼーション、及び非相補的なＤＮＡハイブリダイゼーションの各々を区別することができなければならない。
【０００７】
理想的には、検出システムは、ＥＣＬ標識の非特異的な結合を除外する単純な処理と、ＥＣＬ標識の高い安定性とを提供し、その結果、シグナルを失わずに、多重測定を取り込む可能性を考慮するものである。これらの必要性はそれぞれ、少なくとも、開示する発明の、ある実施形態により満たされる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ある実施形態では、本発明は、試料における対象の分析物を検出するための、迅速で、感度がよく、選択的な方法及び組成物を提供する。即ち、本発明は、試料中に含まれる、少量（例えば、１ｆｍｏｌ）の対象の分析物を正確に検出する（例えば、偽陽性のシグナルの出現率が低い）ための方法及び組成物に関する。この望ましい感度は、少なくとも部分的に、第１の担体中に捕捉され、又は含まれている多数のＥＣＬ分子を提供することにより実現される。
【０００９】
ある実施形態では、本発明は、
ＢとＤの両方が対象の分析物に連結してはいないという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物に連結しているか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結してあり、
Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の分析物に連結しているか、又は対象の第２の特異的結合パートナーに連結している第２の担体であり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象のを含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象のを検出する方法を提供する。
【００１０】
ある実施形態において、本発明は、
ＢとＤの両方が対象の生物学的分子に連結してはいないという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを捕足若しくは含む第１の固体支持体であり、Ｂは対象の生物学的分子に連結しているか、又は対象の生物学的分子の第１の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の生物学的分子を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の生物学的分子に連結しているか、又は対象の生物学的分子の第２の特異的結合パートナーに連結している第２の固体支持体であり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象の生物学的分子を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより生物学的分子の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の生物学的分子を検出する方法を提供する。
【００１１】
本発明の一部の実施形態では、対象の生物学的分子はタンパク質であることができる。本発明の一部の実施形態では、対象の生物学的分子は核酸であることができる。
【００１２】
ある実施形態において、本発明は、
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物に連結しているか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結しており、Ｃは、対象の分析物を含むことがある試料であり、Ｄは対象の分析物に連結しているか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーに連結している第２の担体であり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、ＢとＤの両方が対象の分析物に連結してはいない。］
を含む、試料における対象の分析物を検出するのに有用な組成物を提供する。
【００１３】
ある実施形態において、本発明は、
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、ＢはＡを含む第１の固体支持体であり、Ｂは対象の生物学的分子に連結しているか、又は対象の生物学的分子の特異的結合パートナーに連結しており、Ｃは対象の生物学的分子を含むことがある試料であり、Ｄは対象の生物学的分子に直接連結するか、又は対象の生物学的分子の第２の特異的結合パートナーに連結することができる第２の固体支持体であり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、ＢとＤの両方が対象の分析物に連結してはいない。］
を含む、試料における生物学的分子を検出するのに有用な組成物を提供する。
【００１４】
本発明の一部の実施形態では、対象の生物学的分子はタンパク質であることができる。本発明の一部の実施形態では、対象の生物学的分子は核酸であることができる。
【００１５】
ある実施形態では、本発明は、ＢとＤの両方が対象の核酸分子に連結してはいないという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
Ｂは、Ａを含む、有機溶剤に可溶のビーズ、例えばポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸分子に結合しているか、又は対象の核酸分子の第１の特異的結合パートナーに結合しており、
Ｃは、対象の核酸分子を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の核酸分子に連結しているか、又は対象の核酸分子の第２の特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象の核酸分子を含む複合体を、他の組成物の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）Ｂを有機溶剤に溶解するステップと、
（ｄ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｅ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の核酸分子の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の核酸分子を検出する方法を提供する。
【００１６】
ある実施形態において、対象の核酸分子はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。一部の実施形態では、対象の核酸分子はリボ核酸（ＲＮＡ）である。
【００１７】
ある実施形態において、本発明は、
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＲｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２部分であり、ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸分子に連結しているか、又は対象の核酸分子の結合パートナーに連結しており、Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、Ｄは対象の核酸分子に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、ＢとＤの両方が対象の核酸分子に連結してはいない。］
を含む、試料における対象の核酸分子を検出するのに有用な組成物を提供する。
【００１８】
ある実施形態において、本発明は
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸分子に連結するか、又は対象の核酸分子の第１の特異的結合パートナーに連結し、Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、Ｄは対象の核酸分子に連結するか、又は対象の核酸分子の第２の特異的結合パートナーに連結する磁性ビーズであり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、ＢとＤの両方が対象の核酸分子に連結してはいない。］
を含む、試料における対象の核酸分子を検出するための組成物を提供する。
【００１９】
ある実施形態においては、本発明は、
ＢとＤの両方が対象のタンパク質に連結してはいないという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質、又は対象のタンパク質に特異的に結合している第１の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象のタンパク質を含むことがある試料であり、
Ｄは対象のタンパク質、又は対象のタンパク質に特異的に結合している第２の特異的結合パートナーに連結することができる磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象のタンパク質分子を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象のタンパク質の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象のタンパク質を検出する方法を提供する。
【００２０】
ある実施形態において、対象のタンパク質の第１及び／又は第２の結合パートナーは、抗体、又は特異的結合タンパク質であることができる。
【００２１】
ある実施形態において、本発明は、
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質に連結しているか、又は対象のタンパク質の第１の特異的結合パートナーに連結しており、Ｃは対象のタンパク質分子を含むことがある試料であり、Ｄは対象のタンパク質に連結しているか、又は対象のタンパク質分子に特異的に結合している第２の特異的結合パートナーに連結している磁化ビーズであり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、ＢとＤの両方が対象のタンパク質に連結してはいない。］
を含む、試料における対象のタンパク質を検出するための組成物を提供する。
【００２２】
ある実施形態では、対象のタンパク質分子の第１及び／又は第２の結合パートナーは、抗体、又は特異的結合タンパク質であることができる。
【００２３】
本発明は、対象の分析物を検出する競合的結合アッセイを行うための方法も提供する。ある実施形態において、本発明は、
Ｂ及びＤの１つのみが、対象の分析物の類似体に連結し、Ｂが対象の分析物の類似体に連結している場合には、Ｄは対象の分析物の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象の分析物の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象の分析物の類似体に連結しているという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物の類似体に連結しているか、又は対象の分析物の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、
Ｄは、対象の分析物の類似体に連結しているか、又は対象の分析物の特異的結合パートナーに連結している第２の担体であり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄを含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）複合体におけるＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の分析物の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の分析物を検出する方法を提供する。
【００２４】
関連の実施形態において、本発明は、
Ｂ及びＤの１つのみが、対象の核酸の類似体に連結し、Ｂが対象の核酸分子の類似体に連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象の核酸分子の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の類似体に連結しているという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の核酸の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象の核酸分子を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）Ｂを有機溶剤に溶解するステップと、
（ｄ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｅ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の核酸分子の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の核酸分子を検出する方法を提供する。
【００２５】
一部の実施形態では、本発明は、
Ｂ及びＤの１つのみが、対象のタンパク質の類似体に連結し、Ｂが対象のタンパク質の類似体に連結している場合は、Ｄは対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結しており、Ｂが対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結しているという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質の類似体、又は対象のタンパク質に特異的に結合している特異的結合パートナーに連結し、
Ｃは対象のタンパク質を含むことがある試料であり、
Ｄは、対象のタンパク質の類似体、又は対象のタンパク質に特異的に結合している特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象のタンパク質を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象のタンパク質の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象のタンパク質を検出する方法を提供する。
【００２６】
一部の実施形態において、本発明は、対象の分析物を検出するための競合的結合アッセイを行うための組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物の類似体に連結しているか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結しており、Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、Ｄは対象の分析物の類似体に連結することができるか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーに連結することができる第２の担体であり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、Ｂ及びＤの１つのみが、対象の分析物の類似体に連結し、Ｂが対象の分析物の類似体に連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結しており、Ｂが対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結している。］
を含む、試料における対象の分析物を検出するための組成物を提供する。
【００２７】
この組成物のある実施形態では、対象の分析物は核酸である。この組成物の一部の実施形態では、対象の分析物はタンパク質である。
【００２８】
関連の実施形態において、本発明は、
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸分子の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結しており、Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、Ｄは対象の核酸分子の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、Ｂ及びＤの１つのみが、対象の核酸分子の類似体に連結し、Ｂが対象の核酸分子の類似体に連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象の核酸分子の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の類似体に連結している。］
を含む、試料における対象の核酸分子を検出するための組成物を提供する。
【００２９】
ある実施形態では、対象の核酸分子はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。ある実施形態では、対象の核酸分子はリボ核酸（ＲＮＡ）である。
【００３０】
一部の実施形態において、本発明は、
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質の類似体に連結するか、又は対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結し、Ｃは対象のタンパク質を含むことがある試料であり、Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結するか、又は対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結する磁性ビーズであり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、Ｂ及びＤの１つのみが、対象のタンパク質の類似体に連結し、Ｂが対象のタンパク質の類似体に連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象のタンパク質の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結している。］
を含む、試料における対象のタンパク質を検出するための組成物を提供する。
【００３１】
更なる実施形態は、本発明のある方法を行い、本発明のある組成物を形成するのに有用なキットを提供する。一部の実施形態において、本発明は、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分と；このＥＣＬ部分を含む第１の担体であって、対象の分析物の類似体に連結するか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結する第１の担体と；対象の分析物の類似体に連結するか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーに連結する第２の担体とを含む、試料における対象の分析物を検出するためのキットを提供する。
【００３２】
当業者であれば、ＥＣＬ部分の各々が異なる波長の光を放射するのであれば、上記に記載した方法、組成物、及びキットを含むあらゆる実施形態は、１つより多いＥＣＬ部分を含むこともできることを理解するであろう。例えば、試料における１つより多い分析物を検出するために、２つ以上のＥＣＬ部分を含む組成物、方法、及びキットを用いることができる。
【００３３】
当業者であれば、ＥＣＬ部分の各々が異なる波長の光を放射するのであれば、上記に記載した方法、組成物、及びキットを含むあらゆる実施形態は、１つより多いＥＣＬ部分を含むこともできることを理解するであろう。１つより多いＥＣＬ部分は、例えば、１つより多い分析物を検出することができる場合に有用である。
【００３４】
本発明のさらなる目的及び利点は以下の記載において一部述べられ、一部はその記載から自明であり、又は本発明の実施により習得することができる。本発明の目的及び利点は、添付する特許請求の範囲で特に指摘される成分及び組合せにより、実現され、達成されるであろう。
【００３５】
前述の全般的な記載も、以下の詳細な記載も、例示的及び説明的なものにすぎず、請求されるように本発明を限定するものではないことを理解されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
Ａ．定義
本明細書で用いられる「抗体」は、免疫グロブリン又はその一部分を意味し、起源、製造方法、又はその他の特徴に関係なく、抗原結合部位を含むあらゆるポリペプチドを包含する。この語は、例えば、ポリクローナルの、モノクローナルの、単一特異性の、多特異性の、ヒト化の、単鎖の、キメラの、合成の、リコンビナントの、ハイブリッドの、変異の、及びＣＤＲ移植の抗体を含む。抗体の一部分は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖなど、抗原と結合することができるあらゆるフラグメントを含むことができる。
【００３７】
本明細書で用いられる「対象の分析物」は、試料に見出される、ウィルスの細胞若しくは細胞の構成要素を含む、あらゆる分子、又は分子の集合体を意味する。試料に見出されるあらゆる分子のフラグメントも含まれる。対象の分析物は、有機化合物、有機金属化合物、又は無機化合物であってもよい。対象の分析物は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ベクター、若しくはオリゴヌクレオチド）、タンパク質（例えば、抗体、抗原、受容体、受容体リガンド、若しくはペプチド）、リポタンパク質、糖タンパク、リボ−若しくはデオキシリボ核タンパク質、ペプチド、多糖類、リポ多糖類、脂質、脂肪酸、ビタミン、アミノ酸、薬剤化合物（例えば、トランキライザー、バルビツレート類、アヘン剤、アルコール、３環系抗うつ薬、ベンゾジアゼピン類、抗ウィルス薬、抗真菌抗生物質、ステロイド類、強心配糖体、若しくは前記のあらゆるものの代謝物）、ホルモン、成長因子、酵素、補酵素、アポ酵素、ハプテン、レシチン、基質、細胞代謝物、細胞の構成要素又は細胞小器官（例えば、膜、細胞壁、リボソーム、染色体、ミトコンドリア、若しくは細胞骨格成分）でもよい。毒素、殺虫剤、除草剤、及び環境汚染物質もこの定義に含まれる。この定義は、この定義内に述べた例の任意の１つ又は複数を含む複合体を更に含む。
【００３８】
本明細書で用いられる「対象の分析物の類似体」は、特異的結合パートナーに結合するのに、対象の分析物と競合する物質を意味する。対象の分析物の類似体は、試料に存在する対象の分析物と特異的結合パートナーに結合するのに競合するために添加されている、既知量の対象の分析物それ自体であってもよい。
【００３９】
本明細書で用いられる「担体」は、１つ又は複数の固体又は液体の封入物質を意味する。担体は、有機又は無機の化合物を含むことができ、試料を提示するため、特異的結合パートナーを提示するため、又はＥＣＬ部分を含む又は捕捉するための少なくとも１つのために用いることができる。担体は、後に更に詳しく記載する。
【００４０】
本明細書で用いられる「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「含まれる（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）」は、ＥＣＬ部分と担体とが相互に物理的に接触しているが必ずしも相互に付着しているとは限らないような、担体の内部とＥＣＬ部分との間の非特異的な関係を意味する。本発明のある実施形態では、担体内に含まれているＥＣＬ部分は、担体に連結することができる。ある実施形態では、担体内に含まれているＥＣＬ部分は、担体に連結しない。含む／含まれるは、「包まれる（ｅｎｃａｓｅｄ）／包む（ｅｎｃａｓｉｎｇ）」及び「捕捉される（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）／捕捉する（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）」と交換可能に用いられる。
【００４１】
本明細書で用いられる「ハイブリダイズする」は、適切な条件下での第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間での２本鎖の形成を意味する。一部の実施形態では、適切な条件は、厳密な条件であることができる。厳密な条件は、配列依存であり、異なる状況では異なる。配列が長くなるほど、より高温で特異的にハイブリダイズする（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．、及びＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。一般的には、厳密な条件は、規定されたイオン強度及びｐＨでの特異的配列に対する熱融解点（Ｔｍ）よりも低い約５℃が選択される。Ｔｍは、標的の配列に相補的なポリヌクレオチドの５０％が、（規定されたイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下で）平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。典型的には、厳密な条件は、ｐＨ７．０から８．３において、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより低く、典型的には約０．０５から１０Ｍナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、温度は、短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃で、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを超える）では少なくとも約６０℃である。厳密な条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加でも実現することができる。溶液のホルムアミド濃度が１％上昇するごとに、ＤＮＡ２本鎖のＴｍは約０．７℃低下する。
【００４２】
ハイブリダイゼーションは、１００％相補的であるポリヌクレオチド間で、即ち、２本鎖の核酸の２本の鎖間にミスマッチがない場合に起こることができる。ハイブリダイゼーションは、２本鎖の核酸の２本の鎖間にミスマッチがある場合にも起こることができる。本明細書で用いられる相補的なハイブリダイゼーションは、２本鎖の核酸の２本のハイブリダイズした鎖間にせいぜい１つのミスマッチが存在する場合の、２本の鎖の核酸の間のハイブリダイゼーションを意味する。
【００４３】
本明細書で用いられる「連結した（ｌｉｎｋｅｄ）」は、２つの部分の間の直接の共有結合（ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ）、２つの部分の間の直接の非共有結合（ｄｉｒｅｃｔ ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ）、及び１つ若しくは複数の更なる部分により媒介される２つの部分の間の間接的総合を包含する。例えば、２つの部分の間の直接の共有結合は、２つのアミノ酸の間のアミド結合を含むことができ、２つの部分の間の直接の非共有結合は、塩を形成する金属と塩基との間のイオン性相互作用、又は２つの水分子間の水素結合を含むことができる。１つ若しくは複数の更なる部分により媒介される２つの部分の間の間接的結合は、Ｉｇ融合タンパク質などの融合タンパク質、及びＴＮＶ受容体などの受容体を含むことができ、この場合、ＩｇとＴＮＦ受容体との間の結合は、ＩｇにもＴＮＦ受容体にも元来存在しない短いアミノ酸配列などのリンカーにより媒介される。
【００４４】
「連結した（ｌｉｎｋｅｄ）」は、対象の分析物により媒介される結合（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ）を包含しない。
【００４５】
本明細書で用いられる「磁化」は、物質の透磁性が自由空間のものと異なる場合の物質の特性を意味する。この語は常磁化、及び超常磁化を含む。
【００４６】
本明細書で用いられる「核酸」は、１本鎖又は２本鎖の形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。典型的には、１本鎖の核酸は１００を超える塩基を含み、２本鎖の核酸は１００を超える塩基対を含む。「核酸」は、天然に存在するヌクレオチドを含む核酸、及び基準の核酸に類似の結合特性を有する天然のヌクレオチドの類似体を含む核酸を包含する。核酸は、遺伝子によりコードされるｃＤＮＡ又はｍＲＮＡも含む。核酸は、相補的塩基対形成により、例えば、水素結合により、その相補体にハイブリダイズすることができる。
【００４７】
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」は、通常１００塩基長以下の１本鎖の核酸を意味する。勿論、相補的なオリゴヌクレオチドをアニールして２本鎖のポリヌクレオチドを形成することができる。本明細書で用いられるように、オリゴヌクレオチドは、天然の（即ち、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、若しくはＵ）又は修飾された塩基を含むことができる。更に、オリゴヌクレオチドにおける塩基は、鎖間の塩基対形成を妨害しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合により結びつけられることができる。したがって、例えば、オリゴヌクレオチドは、成分の塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合により結びついているペプチド−核酸であることができる。（例えば、Ｎｉｅｌｓｏｎ、２００１年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２巻、１６頁を参照されたい）。当業者であれば、オリゴヌクレオチドは、プローブ配列との完全な相補性を欠く配列とハイブリダイズすることができ、本明細書に記載する方法を用いて完全に相補的である結合と完全に至らない相補的な結合とを区別することができることを理解するであろう。場合により、オリゴヌクレオチドは、放射性同位元素、発色団、ルミフォア（ｌｕｍｉｐｈｏｒｅ）、色素原、又はＥＣＬ部分で直接標識することができ、又は、例えば、それに対してストレプトアビジン又はアビジン複合体が後で結合することができるビオチンで間接的に標識することができる。
【００４８】
本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」は、２ヌクレオチドより多く、１００ヌクレオチドよりも少ないヌクレオチドで構成されるポリマーを意味する。
【００４９】
本明細書で用いられる「試料」は、生物系に由来し、又はそれを起源とするあらゆる検体を意味する。生物系は、生態系（例えば、水、空気、若しくは土壌の検体）、又は生物体（例えば、植物、動物、菌類、細菌、他の原核生物若しくは真核生物）、又はウィルス、又はプリオンを含む。試料は、対象の分析物を含むことができる。試料は、単離された、例えば、精製された、対象の分析物も含むことができる。
【００５０】
本明細書で用いられる「特異的結合パートナー」は、生理学的条件下で第２の分子と比較的安定な複合体を形成することができる第１の分子を意味する。一般的に、特異的結合は、相対的に高い親和性と、相対的に低度から中等度の受容能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）とを特徴とする。非特異的結合は、通常、中等度から高度の受容能力と共に、低い親和性を有する。通常、親和性定数Ｋａが約１０６Ｍ−１より高く、又は、１０８Ｍ−１より高い場合に、結合が特異的とみなされる。結合定数が高くなるほど親和性が大きくなることが示され、したがって特異性が大きくなる。抗体は、通常、１０６Ｍ−１から１０９Ｍ−１又はより高い親和性定数で抗原に結合する。必要に応じて、非特異的結合は、結合条件を変化させることにより、特異的な結合に実質的に影響を及ぼさないで減少させることができる。このような条件は当技術分野では知られており、当業者であればルーチンの技術を用いて好適な条件を選択することができる。この条件は、例えば、分子濃度、溶液のイオン強度、温度、結合に与えられる時間、非関連の分子（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などに関して、規定することができる。
【００５１】
特異的結合パートナーの例には、相補的な核酸配列（例えば、相互にハイブリダイズする２つのＤＮＡ配列、相互にハイブリダイズする２つのＲＮＡ配列、又は相互にハイブリダイズするＤＮＡ及びＲＮＡの配列）、抗体と抗原、受容体とリガンド（例えば、ＴＮＦとＴＮＦｒ−１、ＣＤ１４２とＶＩＩａ因子、Ｂ７−２とＣＤ２８、ＨＩＶ−１とＣＤ４と、ＡＴＲ／ＴＥＭ８若しくはＣＭＧと炭疽菌毒素の防御抗原部分）、酵素と基質、又は分子と結合タンパク質（例えば、ビタミンＢ１２と内性因子、葉酸と葉酸結合タンパク質）が含まれる。特異的結合パートナーは、天然に存在する特異的結合パートナーの類似体であることもできる。類似体の例には、ＨＩＶの逆転写酵素に結合するヌクレオチドの類似体であるアジドチミジン（ＡＺＴ）、アミノアシル−ｔＲＮＡの末端のアミノアシルアデノシンの類似体であるピューロマイシン、及びテトラヒドロ葉酸の類似体であるメトトレキセートが含まれる。他の類似体は、対象の分析物の誘導体であることができる。
【００５２】
Ｂ．電気化学発光物質
ある実施形態では、本発明は、ＥＣＬを用いて試料における対象の分析物の検出をもたらす。ＥＣＬ部分は、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射の繰り返し放射が引き起こされ得る、あらゆる化合物であることができる。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、共反応化合物の存在下で電磁放射の繰り返し放射が引き起こされ得る。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、金属が、例えば、ルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、パラジウム、モリブデン、及びテクネチウムから選択される金属含有有機化合物を含むことができる。本発明の一部の実施形態では、金属はルテニウム又はオスミウムである。金属は、例えば、それだけには限定されない、セリウム、ジスプロシウム、エルビウム、ユーロピウム、ガドリニウム、ホルミウム、ランタン、ルテチウム、ネオジム、プラセオジム、プロメチウム、テルビウム、ツリウム、及びイッテルビウムを含む希土類金属から選択することもできる。本発明のいくつかの実施形態では、金属はセリウム、ユーロピウム、テルビウム、又はイッテルビウムである。
【００５３】
本発明のある実施形態によると、本発明による金属含有ＥＣＬ部分は、式Ｍ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓを有し、式中、Ｍは金属であり、ＰはＭの多座配位子であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、及びＬ６はＭの配位子であり、その各々が互いの配位子と同一でも異なってもよく、ｍは１以上の整数であり、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、及びｓは、ゼロ以上の整数であり、Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、及びＬ６はＥＣＬ部分を誘発して電磁放射を放射する組成物及び番号であり、Ｍの配位子により提供される結合の総数はＭの配位数に等しい。
【００５４】
本発明の一部の実施形態では、Ｍはルテニウムである。本発明の一部の実施形態では、Ｍはオスミウムである。
【００５５】
本発明のある実施形態では、ＥＣＬ部分は、Ｍの１つの多座配位子を有する。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、１つより多い多座配位子を有する。１つより多いＭの多座配位子を含む実施形態では、多座配位子は同一でも異なってもよい。多座配位子は、芳香族及び脂肪族の配位子を含む。適切な芳香族の多座配位子は、芳香族複素環配位子を含み、例えば、ビピリジル、ビピラジル（ｂｉｐｙｒａｚｙｌ）、ターピリジル（ｔｅｒｐｙｒｉｄｙｌ）、１，１０フェナントロリン、及びポルフィリンなどの含窒素でもよい。
【００５６】
適切な多座配位子は、非置換でもよく、当技術分野で知られている多数の置換基のあらゆるものにより置換されていてもよい。適切な置換基には、例えば、アルキル、置換されているアルキル、アリール、置換されているアリール、アラルキル、置換されているアラルキル、カルボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グアニジウム、ウレイド、マレイミド、イオウ含有基、リン含有基、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエステルが含まれる。
【００５７】
更に、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、及びＬ６の少なくとも１つは、多座の芳香族複素環配位子であることができる。更に、これらの多座の芳香族複素環配位子の少なくとも１つは、窒素を含むことができる。適切な多座配位子には、それだけには限定されないが、ビピリジル、ビピラジル、ターピリジル、１，１０フェナントロリン、ポルフィリン、置換されているビピリジル、置換されているビピラジル、置換されているターピリジル、置換されている１，１０フェナントロリン、又は置換されているポルフィリンが含まれる。これらの置換されている多座配位子は、アルキル、置換されているアルキル、アリール、置換されているアリール、アラルキル、置換されているアラルキル、カルボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノアルボニル（ａｍｉｎｏａｒｂｏｎｙｌ）、アミジン、グアニジウム、ウレイド、マレイミド、イオウ含有基、リン含有基、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエステルで置換されていてもよい。
【００５８】
本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、その各々がビピリジル、ビピラジル、タービリジル、１，１０フェナントロリン、置換されているビピリジル、置換されているビピラジル、置換されているターピリジル、又は置換されている１，１０フェナントロリンであることができる２つの二座配位子を含むことができる。
【００５９】
本発明のある実施形態では、ＥＣＬ部分は、その各々がビピリジル、ビピラジル、ターピリジル、１，１０フェナントロリン、置換されているビピリジル、置換されているビピラジル、置換されているターピリジル、又は置換されている１，１０フェナントロリンであることができる３つの二座配位子を含むことができる。ＥＣＬ部分は、ルテニウムを含むことができる。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分はルテニウム、２つの二座ビピリジル配位子、及び１つの置換されている二座ビピリジル配位子を含むことができる。
【００６０】
本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、ポルフィリン又は置換されているポルフィリンなどの四座配位子を含むことができる。
【００６１】
ＥＣＬ部分は、１つ又は複数の単座配位子を有することができるが、様々な単座配位子が当技術分野では知られている。適切な単座配位子には、例えば、一酸化炭素、シアン化物、イソシアン化物、ハロゲン化物、並びに、脂肪族、芳香族、及び複素環の、ホスフィン、アミン、スチビン、及びアルシンが含まれる。
【００６２】
このＥＣＬ部分のある実施形態は、ビス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）、及びトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）を含む。
【００６３】
１つ又は複数のＭの配位子が、例えば、放射性同位元素、蛍光の構成成分、又は更なる蛍光のルテニウム若しくはオスミウム含有中心などの、更なる化学標識に付着していることは、本発明の範囲内である。
【００６４】
本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ホウ酸塩である。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、ビス［（４，４’−カルボメトキシ）−２，２’−ビピリジン］２−［３−（４−メチル−２，２’−ビピリジン−４−イル）プロピル］−１，３−ジオキソランルテニウム（ＩＩ）である。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’ビピリジン）［４−（ブタン−１−アル）−４’−メチル−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）である。本発明の更なる実施形態では、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’−ビピリジン）［４−（４’−メチル−２，２’−ビピリジン−４’−イル）−酪酸］ルテニウム（ＩＩ）である。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、（２，２’−ビピリジン）（シス−ビス（１，２−ジフェニルホスフィノ）エチレネル）｛２−［３−（４−メチル−２，２’−ビピリジン−４’−イル）プロピル］−１，３−ジオキソラン｝オスミウム（ＩＩ）である。本発明のまた更なる実施形態では、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’−ジピリジン）［４−（４’メチル−２，２’−ビピリジン）−ブチルアミン］ルテニウム（ＩＩ）である。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’−ビピリジン）［１−ブロモ−４（４’−メチル−２，２’−ビピリジン−４−イル）ブタン］ルテニウム（ＩＩ）である。本発明のまた更なる実施形態では、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２’−ビピリジン−４’−ブチルアミドルテニウム（ＩＩ）である。
【００６５】
本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は金属を含まず、例えば、ルブレン、又は９，１０−ジフェニルアントラセンであることができる。
【００６６】
一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、担体に含まれていてもよく、包まれていてもよい。担体に包まれ、又は吸着されているＥＣＬ分子の数は、ＥＣＬ分子のサイズ、及び担体のサイズによる。担体は、ＥＣＬ分子を、１×１０２〜１×１０２０、１×１０２〜１×１０１５、１×１０４〜１×１０１２、１×１０２〜１×１０１０、１×１０６〜１×１０１０、又は１×１０６〜１×１０９個含むことができる。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、担体に含まれ、又は包まれ、例えば、共有結合若しくは非共有の相互作用により、担体の表面に結合していることができる。
【００６７】
本明細書で用いられる「ＥＣＬ共反応化合物」は、本発明では、それ自体、又はその電気化学的還元酸化生成物のいずれかによりＥＣＬ反応系列で役割を果たす化学化合物に関係する。
【００６８】
ＥＣＬ共反応化合物は、しばしばＥＣＬを産生するためのより簡単な手段の使用（例えば、２段階の酸化−還元サイクルの半分だけの使用）、及び／又はＥＣＬ強度の向上を可能にする。一部の実施形態では、共反応化合物は、電気化学的酸化／還元の際に、直接又は更なる反応の際のいずれかに、溶液に強力な酸化種又は還元種を生じる化学化合物であってよい。共反応化合物は、不可逆的に電解還元されて酸化性のＳＯ４・−イオンを形成するペルオキソ二硫酸塩（即ち、Ｓ２Ｏ８２−、過硫酸塩）であってよい。共反応化合物は、不可逆的に電解酸化されて還元性のＣＯ２・−イオンを形成するシュウ酸塩（即ち、Ｃ２Ｏ４２−）であってもよい。還元性物質として働くことができる共反応化合物のクラスは、アミン、又はアミン基を含む化合物であり、例えば、トリ−ｎ−プロピルアミン（即ち、Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）３、ＴＰｒＡ）を含む。一部の実施形態では、四級アミンは二級アミンよりも良好な共反応化合物であることができる。一部の実施形態では、二級アミンは一級アミンよりも良好な共反応化合物であることができる。
【００６９】
共反応化合物には、それだけには限定されない、リンコマイシン、クリンダマイシン−２−リン酸、エリスロマイシン、１−メチルピロリドン、ジフェニドール、アトロピン、トラゾドン、ヒドロフルメチアジド、ヒドロクロロチアジド、クリンダマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、レセルピン、トリメチルアミン、トリ−ｎ−ブチルホスフィン、ピペリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、フェニラミン、ブロモフェニラミン、クロロフェニラミン、ジフェニルヒドラミン、２−ジメチルアミノピリジン、ピリラミン、２−ベンジルアミノピリジン、ロイシン、バリン、グルタミン酸、フェニルアラニン、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、チロシン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン、メチオニン、スレオニン、セリン、シクロチアジド、トリクロルメチアジド、１，３−ジアミノプロパン、ピペラジン、クロロチアジド、ヒドラジノタラジン（ｈｙｄｒａｚｉｎｏｔｈａｌａｚｉｎｅ）、バルビツール酸、過硫酸、ペニシリン、１−ピペリジニルエタノール、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、エチレンジアミン、ベンゼンスルホンアミド、テトラメチルスルホン、エチルアミン、ジ−エチルアミン、トリ−エチルアミン、トリ−イソ−プロピルアミン、ジ−ｎ−プロピルアミン、ジ−イソ−プロピルアミン、ジ−ｎ−ブチルアミン、トリ−ｎ−ブチルアミン、トリ−イソ−ブチルアミン、ビ−イソ−ブチルアミン、ｓ−ブチルアミン、ｔ−ブチルアミン、ジ−ｎ−ペンチルアミン、トリ−ｎ−ペンチルアミン、ｎ−ヘキシルアミン、硫酸ヒドラジン、グルコース、ｎ−メチルアセトアミド、ホスホノ酢酸、及び／又はそれらの塩が含まれる。
【００７０】
共反応化合物には、それだけには限定されないが、Ｎ−エチルモルホリン、スパルテイン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、トリエタノールアミン、ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、１，４−ジアゾビシクロ（２．２．２）オクタン、エチレンジアミン四酢酸、シュウ酸、１−エチルピペリジン、ジ−ｎ−プロピルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラプロピル−１，３−ジアミノプロパン；ＤＡＢ−ＡＭ−４、ポリプロピレンイミンテトラアミンデンドリマー；ＤＡＢ−ＡＭ−８、ポリプロピレンイミンオクタアミンデンドリマー；ＤＡＢ−ＡＭ−１６、ポリプロピレンイミンヘキサデカアミンデンドリマー；ＤＡＢ−ＡＭ−３２、ポリプロピレンイミンドトリアコンタアミンデンドリマー；ＤＡＢ−ＡＭ−６４、ポリプロピレンイミンテトラヘキサコンタアミンデンドリマー；３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、グリシル−グリシン、２−モルホリノエタンスルホン酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２”−ニトリロトリエタノール、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）タウリン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）水和物、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）二水和物、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）、及び／又はこれらの塩も含まれる。
【００７１】
本発明によるＥＣＬ測定は、アセトニトリルなどの有機溶剤で、部分的な水系で、又は水系で行うことができる。ＥＣＬ部分の電気化学的還元に適する電極は、例えば、Ｐｔ電極、又はＰｔとＩｒとの合金からなる電極であることができる。
【００７２】
Ｃ．担体
ある実施形態において、本発明は、対象の分析物の検出に用いることができる、第１及び第２の担体を提供する。第１及び第２の担体は、試料の提示、特異的結合パートナーの提示、ＥＣＬ部分の包み込み又は捕捉、及び対象の分析物と特異的結合パートナーとの間に形成された複合体を組成物の他の構成成分から分離するための手段の提供を含む、いくつかの機能の少なくとも１つを果たすことができる。
【００７３】
第１及び第２の担体のいずれかは、ＥＣＬ部分を含むことができる。ある実施形態では、ＥＣＬ部分は担体に含まれ得る。ＥＣＬ部分は担体中に含まれるので、本発明は、例えば、溶剤の性質など、ある一定の条件を変えることにより、ＥＣＬ部分の担体からの容易な放出をもたらす。ある実施形態、例えば、担体がプラスチックなどの材料から構成されている固体支持体である場合には、ＥＣＬ部分は担体中に配合されない。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は担体の表面に共有結合し、担体中に含まれ得る。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は担体中に含まれ、担体の表面に吸着され得る。第１の担体は、任意選択で、対象の分析物を含む試料から構成され得る。ある実施形態では、試料は第１の担体の表面に結合することができ、したがって、第１の担体を特異的結合パートナーに対し結合可能にする。しかし、ある実施形態では、試料は第１又は第２の担体のいずれにも結合することができない。この実施形態では、試料は溶液中であることができる。
【００７４】
ある実施形態では、第１の担体又は第２の担体のいずれかは、対象の分析物の特異的結合パートナーを含むことができる。特異的結合パートナーは、第１の担体の表面に結合することができ、それにより、第１の担体を対象の分析物への結合に対し到達可能にしている。
【００７５】
第２の担体を含む本発明の実施形態では、第２の担体は対象の分析物の特異的結合パートナーを含むことができる。特異的結合パートナーは、第２の担体の表面に結合することができ、それにより第２の担体を対象の分析物への結合に対し到達可能にしている。第２の担体は、対象の分析物と特異的結合パートナーとの間に形成された複合体を分離するための手段を含むことができる。ある実施形態では、第２の担体は、対象の分析物と特異的結合パートナーとの間に形成された複合体を、組成物の他の構成成分から分離する手段を提供することができる。例えば、第２の担体は、対象の分析物と特異的結合パートナーとの間に形成された複合体をマグネットを用いて組成物の他の構成成分から分離できるように磁性であることができる。本発明のある実施形態では、複合体を組成物の他の構成成分から分離するのに用いられるマグネットは、例えば、米国特許第５９３５７７９号及び第６３２５９７３号に記載されているように、電気化学的エネルギーをシステム中に導入するのに用いることができる電極に隣接して位置させることができる。
【００７６】
ある実施形態では、第１及び第２の担体の少なくとも１つは、固体支持体であってよい。一部の実施形態では、第１の担体と第２の担体の両方が固体支持体である。固体支持体は、粒子（即ち、少なくとも１つの寸法が長さ１０００マイクロメートルを超えるポリマー）、ナノ粒子（即ち、少なくとも１つの寸法が長さ１〜１０００ナノメートルの範囲の長さであるポリマー）、又はミクロ粒子（即ち、少なくとも１つの寸法が長さ１０００ナノメートルを超えるが１０００マイクロメートル以下であるポリマー）を含むことができる。ある実施形態では、固体支持体は、例えば、球形、立方体、円錐形などの、不規則な形状及び規則的な形状の両方を含む３次元の形状を有することができる。
【００７７】
固体支持体は、ビーズ、ゲル、又は膜を含むことができる。膜は、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、又はカルボキシル化ポリビニリデン（米国特許第６０３７１２４号）を含むことができる。膜は、塩化ポリビニルベンジルジメチルヒドロキシエチルアンモニウム、塩化ポリビニルベンジルベンゾイルアミノエチルジメチルアンモニウム、塩化ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウム、塩化ポリビニルベンジルトリヘキシルアンモニウムと塩化ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムとの共重合体、塩化ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムと塩化ポリビニルアミノエチルジメチルアンモニウムとの共重合体、及び塩化ポリビニルベンジルフェニルウレイドエチルジメチルアンモニウムと塩化ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムとの共重合体（米国特許第５３３６５９６号）でコーティングされていてもよい。固体支持体は、対象の分析物の特異的結合パートナー及び／又は試料に結合していることができ（例えば、ポリスチレン、セファロース、セファデックス）、並びに／或いはＥＣＬ部分を含み、又は捕捉することができるあらゆる材料を含むことができる。固体支持体は、ポリアクリリック、ビニルポリマー、アクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアシロニトリル（ｐｏｌｙａｃｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）、及びポリオレフィンなどの、あらゆる合成の有機ポリマーを含むことができる。固体支持体は、炭水化物ポリマー、例えば、アガロース、セルロース、ヒアルロン酸、キチン、アシルジェラン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルキチン、ポリ（ラクチド−ｃｏ−エチレングリコール）を含むこともできる。固体支持体は、シリカ、ジルコニア、例えば、カーボン被覆ジルコニア（米国特許第５１８２０１６号）、チタニア、セリア、アルミナ、マンガン、マグネシア（即ち、酸化マグネシウム）、酸化カルシウム、細孔性ガラス（ＣＰＧ）などの無機酸化物を含むことができる。固体支持体は、それだけには限定されないが、デキストラン−アクリルアミドを含む上記に記載した支持体のいくつかの組合せも含むことができる。固体支持体は、特異的結合パートナー及び／又は対象の分析物との非特異的な相互作用を最小にするように調製することができる。
【００７８】
第１又は第２の担体の少なくとも１つが固体支持体であるある実施形態では、固体支持体は、水性の環境に不溶であるが、有機の環境、例えば、アセトニトリル、エーテル、クロロホルム、ベンゼンに可溶であることができる。ＥＣＬ部分が捕捉され、又は別の方法でそのような固体支持体に結びつけられる実施形態では、ＥＣＬ部分は、有機の環境に固体支持体を置くことにより放出されることができ、その結果、ＥＣＬ部分の検出を促進する。有機の環境は、有機溶剤７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜９９％、９９〜９９．９％（容積／容積）である溶剤を含むことができる。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態では、第１又は第２の担体の少なくとも１つは、融点の範囲が３０℃〜６０℃であるゲル、例えば低融点アガロースである。これらの実施形態では、ＥＣＬ部分を含む担体の融点を超えて複合体を加熱することにより、ＥＣＬ部分を放出し、それにより検出が促進される。
【００８０】
ある実施形態では、固体支持体はビーズ、例えばポリスチレンビーズである。第１の担体も第２の担体もビーズである実施形態では、第１の担体は、その中に含まれ、又は捕捉されているＥＣＬ部分を有することができ、第２の担体は、磁化ビーズであることができる。ＥＣＬ含有ビーズも磁化ビーズも、直径が０．１μｍ〜１００μｍ、０．５μｍ〜５０μｍ、１μｍ〜２０μｍ、又は０．５μｍ〜１０μｍの範囲であることができる。一部の実施形態では、第１の担体の直径は１０μｍであり、第２の担体の直径は１μｍであってよい。一部の実施形態では、第１の担体の直径は１０μｍであり、第２の担体の直径は２．８μｍであることができる。
【００８１】
本発明のある実施形態では、担体の少なくとも１つは、液体を含むことができる。液体は、少なくとも１つの両親媒性の分子を含むことができる。両親媒性の分子は、極性の部分も非極性の部分も有し、水性の環境でミセルなどの凝集体を形成することができるものである。したがって、ミセルは、パルミテート又はオレエートなどのあらゆる脂肪酸のイオンから構成され得る。ミセルは、１つ又は複数の非イオン性界面活性剤、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、又はオクチル−β−グルコシドを含むことができる。ミセルは、１つ又は複数のイオン性界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコレート、リゾレシチンを含むことができる。一部の実施形態では、ミセルは、イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤の両方を含むことができる。
【００８２】
したがって、ある実施形態では、第１及び第２の担体の少なくとも１つはミセルであることができる。ミセルでは、対象の分析物がミセルの表面に曝され、したがって、特異的結合パートナーが対象の分析物と接触できるように試料に結合することができる。ＥＣＬ部分は、ミセルの内部中に含まれ得る。従って、例えば、撹拌若しくは超音波処理、又は酸化若しくは還元により、ミセルを破壊することで、ＥＣＬを放出し、対象の分析物の検出を促進する手段が提供されるであろう。
【００８３】
ある実施形態では、担体はリポソームであることができる。リポソームは、リン脂質を水和した際に形成する微小な球状の粒子である。リン脂質を、低いせん断条件下、水中で混合すると、リン脂質はそれ自体をシート状に配列し、分子は「頭」を上に「尻尾」を下にした配向のように並んで整列する。次いで、これらのシートは、尻尾同士で結びついて、中心が水性で表面がリン脂質の、２重層膜を形成する。リポソームは、均一のサイズ、例えば直径２００ｎｍを有することができる。リポソームは、界面活性剤又は他の乳化剤を使用しないで、水溶性の物質と水不溶性の物質とを、配合物で一緒に用いることを可能にしている。水溶性の材料を、リン脂質が水和している水に溶解し、リポソームが形成するとこれらの材料が水性の中心に捕捉される。リポソーム壁はリン脂質の膜であり、油などの脂溶性の材料を保持している。リポソームは、安定化した天然リン脂質の混合物、合成の同一鎖のリン脂質、糖脂質含有リポソーム、２極性の脂肪酸、ｘ−結合した、リポタンパク質コーティングした、又は炭水化物コーティングしたメチル／メチレンから構成され得る。試料を、リポソームの表面上に提示して、特異的結合パートナー又は試料の結合を促進することができる。リポソームは、その中に（即ち、水性の中心に、又は周囲の脂質に）ＥＣＬ部分を含むことができる。例えば、米国特許第６７０６８６１号を参照されたい。
【００８４】
Ｄ．試料又は特異的結合パートナーを担体に連結する方法
対象の分析物又は特異的結合パートナーを含む試料を、当技術分野では知られている手段により担体に連結することができる。例えば、タンパク質及び核酸には、架橋試薬を用いることができる（Ｌｕｎｄら、１９８８年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６巻、１０８６１頁）。同様に、核酸及びタンパク質の両者には、光反応性の架橋試薬が用いられている（Ｐｅｎｃｈｏｖｓｋｙら、２０００年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８巻（２２）、９８頁；Ｈａｒｒｉｓｏｎら、１９８９年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８巻、６０２３頁）。好適な手段の選択は、試料の性質、及び担体の性質による。結合は、例えば、共有結合、非共有の相互作用、例えば、静電気相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は水素結合によることができる。試料を担体に結合する方法の選択は、当業者の通常の技能の範囲内にある。
【００８５】
ある実施形態では、配位子は、配位子上の特別な官能基（例えば、一級アミン、スルフヒドリル、カルボン酸、アルデヒド）と担体上の反応基との間に共有化学結合を形成することにより、担体に固定、又は直接「連結」する。
【００８６】
それだけには限定されないが、リンカーとしてアビジン又はストレプトアビジンと共にビオチンを用いることを含む、他の結合方法も可能である。リンカーとして、ビオチン／アビジン ストレプトアビジンを用いる方法は、当技術分野では知られている（Ｗｉｌｃｈｅｋ及びＢａｙｅｒ編集、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８４巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９０年を参照されたい）。ある実施形態では、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いてビオチンのＮＨＳエステルを形成することができる。ビオチン残基を、それだけには限定されないが、リシン残基上の一級アミン、グルタミン酸残基若しくはアスパラギン酸残基上のカルボキシル部分、又はシステイン残基上のスルフヒドリル部分を含む様々な官能基に連結することができる。アビジンを、臭化シアン（ＣＮＢｒ）で担体を活性化した後、リジン上のアミノ基を介して担体に共有結合することができる。
【００８７】
ある実施形態では、試料又は結合パートナーは、担体の表面上に吸着されているにすぎないことがある。例えば、抗体は、ポリスチレンミクロスフェアの表面に吸着されていることがある。タンパク質が担体の表面に吸着しているのが望まれる実施形態では、最大の表面被覆面積（単層まで）を得るために、溶液のｐＨを、タンパク質の等電点に、又はそれよりもわずかに塩基性に調節することができる。希釈したミクロスフェア懸濁液（固体約１％）を用いると、確実に単一ミクロスフェアがコーティングされる。最終タンパク質濃度約０．１ｍｇ／ｍｌはタンパク質の単層を実現するのに通常十分であるが、その量の約３から約１０倍を添加することにより、好ましい化学量論、及び良好な結合のための推進力を確実にする。
【００８８】
担体の表面を修飾して、試料又は特異的結合パートナーの共有結合を促進することができる。表面が修飾されたポリマーミクロスフェアは、アクリル酸などの機能性モノマーの少量（約５％未満）でスチレンを共重合することにより作成されることが多く、これにより−ＣＯＯＨ基で覆われたミクロスフェアが得られる。他のモノマーを用いて、表面の化学的性質が異なる微粒子を調製することができ、例えば、米国特許第５５９９８８９号を参照されたい。
【００８９】
シリカミクロスフェアの表面上の天然のシラノール基は、水性の、又は溶剤ベースのシラン結合性物質と反応して、様々な表面官能基を有する、予め活性化されたシリカミクロスフェアを生じることができる。例として、クロロメチル、カルボキシル、及びアミノ基が含まれる。ＤＮＡ及びＲＮＡは、カオトロピック剤の存在下でシリカ上に吸着することができる。オリゴヌクレオチドは、表面を修飾されたシリカにその５’−アミノ末端を介して共有結合することができる。Ｂｏｏｍら、１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２８巻、４９５頁に記載されているように、脂質は、脂肪酸鎖上のカルボキシル基、及びシリカ上のプロピルアミン表面基により結合することができる。
【００９０】
対象の分析物、又は特異的結合パートナーは、ミセル中に組み込まれることができ、例えば、Ｓａｖｉｃら、２００３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３００巻、６１５頁；Ｍａｙｓｉｎｇｅｒら、２００１年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１５３９巻（３）、２０５頁を参照されたい。タンパク質の、界面活性剤ミセル中への可溶化及び再構成は、例えば、６Ｍ塩酸グアニジン（Ｇｄｎ・ＨＣｌ）のタンパク質溶液を過剰のリフォールディングバッファー（例えば、３％ジヘキサノイルホスファチジルコリン ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／０．６Ｍ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８．５）にゆっくりと希釈することにより、行うことができる。残余のＧｄｎ−ＨＣｌを除去した後、例えば、透析により、溶液を、限外ろ過を含む様々な技術により濃縮することができる。例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻、２３５８頁を参照されたい。
【００９１】
対象の分析物、又は特異的結合パートナーを、リポソーム中に組み入れることができる。タンパク質をリポソーム中に組み入れる多くの方法が知られている（例えば、Ｒｉｇａｕｄら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ Ｔｏｏｌｓ ｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、７１〜８８頁、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｈｉｌｉｐｐｏｔ，Ｊ．Ｒ．及びＳｃｈｕｂｅｒ編集、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、フロリダ州、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ（１９９５年）を参照されたい）。一例として、超音波処理器又はフレンチプレスなどの機械的手段を用いて、過剰のバッファーでリン脂質のフィルムを膨張させ、乾燥させることにより単層の粒子を生成することができる（Ｌｅｌｋｅｓら、１９８５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０巻、１７９６頁）。或いは、低濃度のコール酸塩又はリゾレシチンの触媒により、タンパク質を、予め形成されたリポソーム中に、自発的に組み入れることができる（Ｗｒｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈら、１９８７年、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、２４６巻（３）、７３７頁）。タンパク質は、また、リン脂質及び界面活性剤の存在下で、ともに可溶化されてミセルを形成することができ、その後、引き続き界面活性剤を除去する。大型のリポソームは、逆相の蒸発により調製し、様々な量のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、オクチルグルコシド、又はコール酸ナトリウムなどの界面活性剤で処理することができる。可溶化プロセスの各ステップで、タンパク質を加えることができる。タンパク質−リン脂質界面活性剤混合物を、次いで、ＳＭ２ Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓ処理に供して、界面活性剤を除去することができる（Ｒｉｇａｕｄら、１９８８年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７巻（８）、２６７７頁）。溶液中の膜タンパク質を準備し、予め形成したリポソームの溶液を準備し、混合物をインキュベートすることにより、膜タンパク質をリポソーム中に組み入れることができる。予め形成したリポソームの溶液を提供するステップの前に、リン脂質の混合物を、少なくとも１タイプの不飽和脂肪酸の溶液と組み合わせることによりリポソームを形成する（米国特許第６７０６８６１号）。当業者であれば、試料を担体に連結する、多くの更なる方法が存在することを理解するであろう。
【００９２】
Ｅ．ＥＣＬ部分を担体に装填する方法
ある実施形態では、ＥＣＬ部分は担体の表面に連結することができる。試料を担体に連結することに関して上記に記載した方法を、同様に、ＥＣＬ部分を担体に連結するのに用いることができる。担体が固体支持体、例えばビーズである場合は、ＥＣＬ部分は、例えば、共有結合、非共有の相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は水素結合により、担体の表面に結合することができる。
【００９３】
本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は有機溶剤に可溶であるが、水性溶剤に不溶である。ＥＣＬ部分を有機溶剤に溶解し、次いで、多数の担体粒子、例えば、ポリスチレンなどの疎水性材料で構成されているビーズと混合することができる。ＥＣＬ部分を含んでいる有機溶剤は、担体の孔を浸透し、有機溶剤が蒸発する際に、ＥＣＬ部分は担体の内部に捕捉され、又は包まれるようになる。ビーズが水性溶剤に溶媒和する場合は、殆ど又は全てのＥＣＬ部分は、担体中に包まれたままである。ある実施形態では、担体はポリスチレンビーズである。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分を含む溶液でゲルを形成することにより、ＥＣＬ部分をゲル中に組み入れることができる。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分を含む溶液でミセルを形成することにより、ＥＣＬ部分をミセル中に組み入れることができる。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分を含む溶液でリポソームを形成することにより、ＥＣＬ部分をリポソーム中に組み入れることができる。
【００９４】
一部の実施形態では、ＥＣＬ部分を、周囲の媒体への実質的な損失なしに、担体の内側に捕捉させることができる。ＥＣＬ部分の周囲の液相への損失は、調製中及び使用中に望まれないことがある。ＥＣＬ部分を捕捉する担体の能力は、分配係数と呼ばれる重要な物理的定数により本質的に表すことができる。分配係数は、Ｋ＝Ｃ担体／Ｃ液体であり、この場合Ｃ担体は、担体で吸収された部分の濃度であり、Ｃ液体は、吸収されない部分の濃度である。
【００９５】
２相の系（担体と液体と）では、分配係数が１を超える部分は、担体相を優先することを示している。分配係数の値が高いということは、担体相を強く優先することを示している。それとは反対に、分配係数が１未満である部分は液相を優先する。初期に担体中に高レベルのＥＣＬ部分のあった分配係数の低い系は、周囲の液相に部分を失うであろう。
【００９６】
一部の実施形態では、担体と水性溶剤との間の分配係数は約２を超える。一部の実施形態では、担体と水性溶剤との間の分配係数は約１０を超える。一部の実施形態では、担体と水性溶剤との間の分配係数は約１００を超える。高い分配係数を実現するために、いくつかの化学的及び物理的デザインが存在する。（１）部分が担体にクーロン引力により保持され得る。このような場合には、ＥＣＬ部分は正味の正の電荷を有し、担体は正味の負の電荷を有する。（２）一部の実施形態では、ＥＣＬ部分の可溶性は、担体相においてずっと大きいことがある。例えば、ＥＣＬ部分は水に可溶ではなく、親油性のポリスチレンの担体に可溶である。（３）一部の実施形態では、顕微鏡的で見た担体の多孔性は部分の直径よりも小さいので、ＥＣＬ部分は担体中に捕捉されることができる。（４）一部の実施形態では、部分は共有結合により担体に結合され得る。
【００９７】
Ｆ．対象の分析物を検出する方法
本発明は、試料中に含まれている対象の分析物を検出する様々な方法を提供する。本発明の一部の実施形態では、対象の分析物は、第１の担体などの担体に連結することができる。対象の分析物は担体の表面上に存在し、したがって特異的結合パートナーへのその接近を促進する。一部の実施形態では、対象の分析物は、いかなる担体とも連結することができない。一部の実施形態では、対象の分析物は溶液に存在することができる。
【００９８】
本発明の方法は、対象の分析物に特異的に結合することができる少なくとも１つの特異的結合パートナーを提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの特異的結合パートナーは、担体に連結することができる。この実施形態では、試料は第２の担体に連結することができる。
【００９９】
一部の実施形態では、少なくとも１つの特異的結合パートナーは、対象の分子に特異的に結合することができる結合タンパク質であることができる。結合パートナーは担体に連結することができる。この実施形態では、試料は第２の担体に連結することができる。
【０１００】
一部の実施形態では、少なくとも１つの特異的結合パートナーは、対象の分析物に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチド又は核酸であることができる。結合パートナーは、担体に連結することができる。この実施形態では、試料は第２の担体に連結することができる。
【０１０１】
一部の実施形態では、本発明は、２つの特異的結合パートナー、即ち、そのどちらも対象の分析物に特異的に結合する第１及び第２の特異的結合パートナーを提供する。２つの特異的結合パートナーは、どちらも担体に連結することができる。したがって、ある実施形態では、第１の特異的結合パートナーは第１の担体に連結することができ、第２の特異的結合パートナーは第２の担体に連結することができる。この実施形態では、試料はいかなる担体にも連結することができない。同一の特異的結合パートナーが第１の担体にも第２の担体にも連結することができることも企図される。一部の実施形態では、対象の分析物に特異的に結合しているポリクローナル抗体は、第１の担体にも第２の担体にも連結することができる。一部の実施形態では、対象の分析物は、モノクローナル抗体が認識するエピトープの複数のコピー（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｐｉｅｓ）を含むことがあり、又は、分析物が核酸である場合には、第１の担体にも第２の担体にも連結するプローブが認識する配列の複数の反復を含むことがある。ある実施形態では、少なくとも１つの特異的結合パートナーは、抗体とすることができる。特異的結合パートナーは両者とも抗体とすることも企図される。本発明は、１つの特異的結合パートナーが抗体であり、第２の特異的結合パートナーが特異的結合タンパク質である実施形態も包含する。
【０１０２】
一部の実施形態では、少なくとも１つの特異的結合パートナーは、試料における対象の分子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとすることができる。抗体と同様に、特異的結合パートナーを両者とも、試料における対象の分子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又は他の核酸とすることが企図される。
【０１０３】
ＥＣＬ部分は、例えば、紫外吸収、赤外吸収、及び蛍光発光などの、発光及び吸光の分光光度法；原子吸光、アノーディックストリッピングボルタメトリーなどの電気化学的方法；中性子放射化、及び化学的方法を含めた、当技術分野ではよく知られている方法により検出することができる。ある実施形態では、光ルミネセンス、化学ルミネセンス、及び電気化学ルミネセンスの方法を用いる。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分を誘発して電磁放射を放射させ、放射された電磁線を検出することにより、化学的部分の存在を検出することができる。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分を誘発して、試薬の混合物を電磁的、化学的、又は電気化学的エネルギーに曝すことにより電磁放射を放射させることができる。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分を誘発して、試薬の混合物を化学的又は電気化学的エネルギーに曝すことにより、電磁放射を放射させることができる。ある実施形態では、ＥＣＬ部分を検出する助けに、共反応化合物、例えばＴＰｒＡを加える。
【０１０４】
発光技術を用いて、非常に低濃度のＲｕ（ｂｐｙ）３２＋を測定することができる。酸化還元法を用いると、５×１０−８Ｍの濃度のＲｕ（ｂｐｙ）３２＋を検出することが可能である。シュウ酸ナトリウム（１ｍＭ）のリン酸バッファー溶液ｐＨ５．０を０から＋１．４ボルトのパルスのポテンシャル対５から１０秒の間隔の飽和カロメル基準電極とともに用いることができる。１８ｍＭ Ｎａ２Ｓ２Ｏ８及び０．１Ｍテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムテトラフルオロボレートのＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（１：１ｖ／ｖ）溶液を用いると、１０−１３Ｍほどに低い濃度のＲｕ（ｂｐｙ）３２を検出することができる（例えば、米国特許第６１４０１３８号、第５７３１０８９号、第５７１４０８９号を参照されたい）。
【０１０５】
本発明は、
（ａ）式
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、Ｂは、Ａと関連している（対象の分析物の特異的結合パートナーに連結する）第１の担体であり、Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、Ｂは対象の分析物の結合パートナーにより対象の分析物に連結し、Ｄは対象の分析物に直接連結するか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーを介して対象の分析物に連結する第２の担体であり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］を有する複合体を形成するステップと、
（ｂ）（ａ）で形成された複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の分析物の存在を検出するステップと
を含む、対象の分析物を検出するためのアッセイにおいて、ＥＣＬ部分を使用するための方法も提供する。
【０１０６】
ある実施形態では、本発明の方法は、競合的結合アッセイ、例えば、競合的阻害アッセイであることができる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｅｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１年を参照されたい）。このアッセイの一部の実施形態では、既知量の対象の分析物又は対象の分析物の類似体を、ＥＣＬ部分を含まない担体、例えば磁性ビーズと連結することができる（「連結する」は、共有結合も非共有結合も含む）。対象の分析物に対する結合パートナーは、第２の担体、例えば、ＥＣＬ部分を含まないポリスチレンビーズと連結することができる。追加した対象の分析物の非存在下では、第１の担体に連結する対象の分析物と、第２の担体に連結する対象の分析物に対する結合パートナーとの間に複合体が形成され、第１の担体を第２の担体に効果的に連結する。この複合体に関連しているＥＣＬ部分の量を、当技術分野では周知の技術により測定することができる。次いで、第２の担体が連結する結合パートナーに対する結合について、担体が連結した対象の分子と競合させることにより、試料における対象の分析物の存在を、形成される複合体の量を減少させるその能力により検出することができる。ある実施形態では、試料における対象の分析物の量を、既知量の対象の分子を含む試料を用いて、検量線と比べて定量することができる。
【０１０７】
一部の実施形態では、本発明は、対象の分析物を検出するための、サンドイッチ型の結合アッセイを提供する。本アッセイの一部の実施形態では、対象の分析物の第１の結合パートナーは、第１の担体、例えば磁性ビーズに連結することができる。対象の分析物の第２の結合パートナーは、第２の担体、例えばＥＣＬ部分を含むことができるポリスチレンビーズに連結することができる。対象の分析物を含む試料の存在下では、第１の担体も第２の担体も含む複合体を形成することができる。この複合体と関連するＥＣＬ部分の量は、試料における対象の生物学的材料の量と比例し、当技術分野で知られている技術により測定することができる。ある実施形態では、試料における対象の分析物の量は、既知量の対象の分子を含む試料を用いて検量線で比べて定量することができる。
【０１０８】
一部の実施形態では、本発明は、試料における対象の分析物を検出するための直接結合方法を提供する。本方法の一部の実施形態では、試料における分子は、第１の担体、例えば磁性ビーズに連結することができる。対象の分析物の結合パートナーは、第２の担体、例えばＥＣＬ部分を含むことができるポリスチレンビーズに連結することができる。試料が対象の分析物を含む場合は、第１の担体も第２の担体も含む複合体を形成することができる。この複合体と関連するＥＣＬ部分の量は、試料における対象の生物学的材料の量と比例し、当技術分野では知られている技術により測定することができる。ある実施形態では、試料における対象の分析物の量は、既知量の対象の分子を含む試料を用いて検量線で比べて定量することができる。
【０１０９】
これらのタイプの結合アッセイに対する多くの変形は、当業者には知られており、本発明の方法と互換性がある。
【０１１０】
存在するＥＣＬ部分の量を定量するための方法は多く存在する。システムへのエネルギー投入量の割合により、ＥＣＬ部分の測定をもたらすことができる。適切な測定には、例えば、ＥＣＬ部分が電気化学的に励起された場合の電流の測定、ＥＣＬ部分が化学的に励起された場合の還元剤又は酸化剤の利用の割合、又は光ルミネセンス技術における電磁エネルギーの吸収の測定が含まれる。ＥＣＬ部分は、放射された電磁放射を測定することにより検出することもできる。これらの測定は全て、継続的な、レートベースの（ｒａｔｅ−ｂａｓｅｄ）測定として、又は長時間にわたりシグナルを蓄積する累加法として行うことができる。レートベースの測定は、光電子増倍管、フォトダイオード、又は入射光強度に対する大きさに比例する電流を生成するフォトトランジスターを用いて行うことができる。累加法は、レートベースのデータの積分、又は蓄積性のデータを直接提供する写真フィルムの使用を伴うことがある。
【０１１１】
本発明は、対象の分析物、少なくとも１つの担体、及びＥＣＬ部分を含む複合体の単離も提供する。一部の実施形態では、例えば、少なくとも１つの担体が磁性ビーズである場合は、磁場を用いて複合体を分離することができる。一部の実施形態では、複合体の分離は、沈殿により、例えば、複合体の質量が個々の構成成分の質量を超える場合には重力の力により実現することができる。一部の実施形態では、フィルターを用いて、複合体を組成物の他の構成成分から分離することができる。フィルターは、例えば、複合体を保持するのに十分小さいが、非複合の材料を通過させるのに十分大きい孔のサイズを有する。一部の実施形態では、サイズ排除カラムを用いて、複合体を分離することができる。複合体を、組成物の他の構成成分から区別する他の性質、例えば、疎水性、又は他の結合パートナーに対する親和性も用いることができる。
【０１１２】
Ｇ．疾患及び病状
ある実施形態では、対象の分析物は、疾患又は病状に関連するマーカーであることができる。本発明は、したがって、疾患又は病状に関連するマーカーを検出し、それにより、疾患又は病状を有する対象を診断する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、疾患又は病状に関連するマーカーの存在又は量をモニターすることにより、疾患又は病状の進行をモニターする方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は疾患又は病状に関連するマーカーの存在又は量をモニターすることにより疾患又は病状を処置するのに用いられる治療法の有効性をモニターするための方法を提供する。
【０１１３】
疾患又は病状には、感染性物質（例えば、細菌、真菌、寄生体、ウィルス、又はプリオン）により引き起こされる感染性疾患が含まれ得る。細菌の病原体の例には、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）、Ｂ群溶血レンサ球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が含まれる。ウィルス感染の例には、天然痘、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ライノウィルス、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）、麻疹、ポリオ、単純ヘルペスウィルス１型（ＨＳＶ−１）、及び単純ヘルペスウィルス２型（ＨＳＶ−２）が含まれる。寄生体の例には、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、及びランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）が含まれる。
【０１１４】
疾患は、癌、又は自己免疫疾患であってもよい。対象の分析物であることができる様々な癌に関連するマーカーには、メラノーマの変異体サイクリン依存性キナーゼ４、メラノーマのｐ１７タンパク質、メラノーマのｇｐ１００、メラノーマのメラノーマ関連抗原１（ＭＡＲＴ−１）（Ｍｅｌａｎ−Ａ）（ＰＣＴ公開ＷＯ第９４／２１１２６号）、メラノーマのｐ１５タンパク質、メラノーマのチロシナーゼ（ＰＣＴ公開ＷＯ第９４／１４４５９号）、メラノーマのメラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）１、２、及び３、甲状腺髄様、小細胞肺癌、結腸及び／又は気管支の扁平上皮細胞癌（ＰＣＴ／ＵＳ第９２／０４３５４号）、メラノーマ関連抗原−Ｘｐ（ＭＡＧＥ−Ｘｐ）（米国特許第５５８７２８９号）、膀胱、メラノーマ、乳房、及び扁平上皮細胞の癌腫のＢメラノーマ抗原（ＢＡＧＥ）（米国特許第５５７１７１１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ９５／００１５９号）、Ｇ抗原（ＧＡＧＥ）（米国特許第５６１００１３号及びＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０３４２２号）、腎臓腫抗原（ＲＡＧＥ）ファミリー（米国特許第５９３９５２６号）、メラノーマで優先的に発現される抗原（ＰＲＡＭＥ）（以前のＤＡＧＥ、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０５７７号）、メラノーマユビキトス変異タンパク質（ｍｅｌａｎｏｍａ ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｍｕｔａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＵＭ−１／ＬＢ−３３Ｂ）（米国特許第５５８９３３４号）、神経芽細胞腫増幅タンパク質（ＮＡＧ）（米国特許第５８２１１２２号）、ＦＢ５（エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ））（米国特許第６２１７８６８号）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）（米国特許第５９３５８１８号）、メラノーマのｇｐ７５、メラノーマの癌胎児性抗原、乳房、膵臓、及び卵巣癌のムチンなどの炭水化物／脂質、メラノーマのＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、癌腫の変異型ｐ５３などの癌遺伝子、結腸癌の変異型ｒａｓ、赤芽球性白血病ウィルス性癌遺伝子ホモログ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、乳癌のプロトオンコジーン、並びに子宮頸及び食道の扁平上皮細胞癌のヒトパローマウィルスタンパク質などのウィルス生成物が含まれる。自己免疫疾患に関連するマーカーには、全身性エリテマトーデスに関連するクロマチンに特異的に結合する抗体、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）対立遺伝子ＤＲ２（多発性硬化症に関連する）の存在、ＤＲ３（グレーブス病に関連する）又はリウマチ性関節炎に関連するＤＲ４（Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１年）が含まれる。
【０１１５】
Ｈ．キット
ある実施形態では、本発明は、試料における対象の分析物を検出するためのキットを提供する。キットは、少なくとも１つのＥＣＬ部分を含む第１の担体と、第２の担体と、第１及び第２の担体の少なくとも１つに連結する対象の分析物の特異的結合パートナーの少なくとも１つと、少なくとも１つの容器と、場合により指示書とを含むことができる。ある実施形態では、キットは２つ又はそれを超えるＥＣＬ部分を含むことができる。
【実施例】
【０１１６】
化学物質及び材料：
Ａｌｄｒｉｃｈ（ウィスコンシン州、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）より入手した、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）二塩化物六水和物（Ｒｕ（ｂｐｙ）３Ｃｌ２・６Ｈ２Ｏ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ、９９％）、テトラフルオロホウ素銀（ＡｇＢＦ４、９８％）、及びトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ、９９＋％）；Ｂｏｕｌｄｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（コロラド州、Ｍｅａｄ）より入手した、リチウムテトラキス（ペンタフルオロフェニル）ホウ酸塩（Ｌｉ［（Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４）］ｎＥｔ２Ｏ、ｎ＝２〜３）；Ｆｌｕｋａ（ウィスコンシン州、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）から入手した、テトラブチルアンモニウムテトラフルオロボレート（（ＴＢＡ）ＢＦ４、電気化学グレード）；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）から入手した、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ、超高純度）；Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）より入手した、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、フルオレセインビオチン（９０％）、１−メチルイミダゾール、及びＤＮＡハイブリダイゼーションバッファー（ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（登録商標）プラス）；ＥＭ（ニュージャージー州、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ）より入手した、水酸化ナトリウム（ＧＲ）、塩酸（ＧＲ）、塩化ナトリウム（ＧＲ）、エチルエーテル（無水）、アセトニトリル（ＨＰＬＣ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、ＧＲ）、及びエチレンジニトリロテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ（イリノイ州、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）より入手した、アビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）、Ｄ−ビオチン（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（登録商標））、及びビオチン−ＰＥＯ−ＬＣ−アミン；並びにＦｉｓｈｅｒ（ニュージャージー州、Ｆａｉｒｌａｗｎ）より入手した、メタノール（分光分析用グレード）は、別段の記載がなければ更に精製しないで使用した。ポリスチレンカルボキシレート微粒子／ビーズ（ＰＳＢ、直径１０μｍ、ビーズ６．５×１０４個／μＬの２．６％（ｗ／ｗ）水性懸濁液）、及びストレプトアビジンコーティングした超常磁性ポリスチレンビーズ（磁性ビーズ又はＭＢと呼ぶ、（ａ）直径１．０μｍ、約９．５×１０６ビーズ／μＬで１０ｍｇ／ｍＬの水性懸濁液、（ｂ）直径２．８μｍ、約６．５×１０５ビーズ／μＬで１０ｍｇ／ｍＬの水性懸濁液）を、それぞれＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ社（ペンシルベニア州、Ｗａｒｉｎｇｔｏｎ）及びＤｙｎａｌＢｉｏｔｅｃｈ社（ニューヨーク州、Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ）から購入した。炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈａｃｉｓ）（Ｂａ８１３）に由来する合成の２３−ｍｅｒ１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドは、Ｑｉａｇｅｎ Ｏｐｅｒｏｎ（カリフォルニア州、Ａｌａｍｅｄａ）から入手し、以下の配列を有しており、：（ａ）プローブ、５’−［ビオチン−ＴＥＧ］−ＡＡＣＧＡ ＴＡＧＣＴ ＣＣＴＡＣ ＡＴＴＴＧ ＧＡＧ−３’（ｐ−ｓｓ−ＤＮＡ、Ｍ．Ｗ．＝７６１７ｇ／ｍｏｌ；配列番号：１）；（ｂ）標的又は相補的、５’−［ビオチン−ＴＥＧ］−ＣＴＣＣＡ ＡＡＴＧＴ ＡＧＧＡＧ ＣＴＡＴＣ ＧＴＴ−３’（ｔ−ｓｓＤＮＡ、Ｍ．Ｗ．＝７６０８ｇ／ｍｏｌ；配列番号：２）；（ｃ）非相補的、５’−［ビオチン−ＴＥＧ］−ＴＴＡＡＣ ＡＣＣＴＴ ＡＧＣＧＡ ＣＧＧＣＴ ＡＧＴ−３’（ｎｃ−ｓｓＤＮＡ、Ｍ．Ｗ．＝７５９３ｇ／ｍｏｌ；配列番号：３）、及び（ｄ）２塩基対ミスマッチのオリゴマー配列、５’−［ビオチン−ＴＥＧ］−ＣＴＣＣＡ ＡＡＣＧＴ ＡＧＧＡＧ ＴＴＡＴＣ ＧＴＴ−３’（２−ｂｐ−ｍ−ｓｓＤＮＡ；配列番号：４）、この場合、ビオチンＴＥＧはトリエチレングリコールをベースにした１６原子混合の極性スペーサーを含み、ビオチン化したＤＮＡと、表面を制限されたアビジン／ストレプトアビジン相互作用との間の立体障害を減少させるために用いられた。別段の記載がなければ、溶液は全て、１８ＭΩ−ｃｍ脱イオン化Ｍｉｌｌ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州、Ｂｅｄｆｏｒｄ）で新たに調製した。
【０１１７】
ＥＣＬ及び電気化学的測定
直径２．２ｍｍのＰｔディスク、作用電極として直径２．０ｍｍのＡｕ又は直径３．０ｍｍのグラッシーカーボン（ＧＣ）ディスク、対電極としてＰｔワイヤー、及び基準電極としてＡｇ／Ａｇ＋（１０ｍＭ ＡｇＢＦ４及び５０ｍＭ ＴＢＡＢＦ４のＭｅＣＮ溶液）の、３電極セルシステムを用いた。各実験の前に、電極は全て慎重に清浄にした。清浄ステップには、作用電極をコーミック（ｃｈｏｍｉｃ）酸溶液中に浸すステップと、０．０５μｍアルミナスラリー（Ｂｕｅｈｌｅｒ Ｌｔｄ．、イリノイ州、Ｌａｋｅ Ｂｌｕｆｆ）で磨くステップと、大量の水で洗浄するステップと、ＭｅＣＮですすぐステップと、多孔性のＶｙｃｏｒチップとガラスチューブとを基準電極に置き換えるステップが含まれる。５ｍＬの使い捨てのガラスバイアルを、電気化学的セルとした。ＥＣＬシグナルがＲｕ（ｂｐｙ）３２＋の汚染されたシステムから生成される可能性を除外するために、必要に応じて真新しいガラス器具及び電極を用いた。サイクリックボルタモグラム（ＣＶ）とともにＥＣＬ強度を、電気化学的セルの下に設置した光電子増倍管（ＰＭＴ、ＨａｍａｍａｔｓｕＲ４２２０ｐ、日本）と組み合わせた自家製のポテンシオスタットで同時に測定した。高電圧供給電力（Ｂｅｒｔａｎ Ｈｉｇｈ Ｖｏｌｔａｇｅ Ｃｏｒｐ．、Ｓｅｒｉｅｓ２２５、ニューヨーク州、Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ）で、ＰＭＴに７５０Ｖの電圧を供給した。
【０１１８】
別段の記載がなければ、測定は全て、２０±２℃の温度で行った。
【０１１９】
（実施例１）
Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋含有ＥＣＬ標識の合成
本試験では、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ホウ酸塩（Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２）をＥＣＬ標識として用いた、というのは、次項で示すように、この複合体は適切な有機溶液を用いてポリスチレンビーズ中に効果的に充填することができ、水性溶液におけるビーズの一連の修飾の間中ビーズ中の捕捉を維持することができるからである。換言すれば、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２は、有機溶剤に十分可溶であるが、水性溶液には完全に不溶である。ＥＣＬ標識としてＲｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２を選択した別の理由は、複合体のＲｕ（ｂｐｙ）３２＋部分のＥＣＬ効率は非常に高いという事実であった。Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２は、水中でＲｕ（ｂｐｙ）３Ｃｌ２とＬｉ［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］ｎＥｔ２Ｏ（ｎ＝２〜３）との間のメタセシス反応により調製される。沈殿物を水で洗浄し、アセトニトリル／水溶液から再結晶し、真空下で乾燥させる。
【０１２０】
（実施例２）
共反応化合物としてＴＰｒＡを用いた、ＭｅＣＮにおけるＲｕ（ｂｐｙ）３２＋の電気化学的及びＥＣＬの挙動
０．１０μＭ Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２の、０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４電解質−０．１０Ｍ ＴＰｒＡ共反応化合物含有ＭｅＣＮ溶液の、Ｐｔ電極での、スキャン速度５０ｍＶ／ｓでのサイクリックボルタンメトリー及びＥＣＬの応答を、図４に示す。ＴＰｒＡは、約０．５ＶｖｓＡｇ／Ａｇ＋のポテンシャルで酸化し始め、約０．７５ＶｖｓＡｇ／Ａｇ＋で最大の酸化のピークを示す（図４ａ）。電極が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋がＲｕ（ｂｐｙ）３３＋に酸化される１．１ＶｖｓＡｇ／Ａｇ＋よりも陽性のポテンシャルをスキャンされる場合に（図４ｃ）、ＥＣＬが生成される（図４ｂ）。ＥＣＬ強度は、ポテンシャルの上昇とともに継続的に上昇し、最終的に、約７００ｍＶの半波長幅の幅広いピーク及び約１．６ＶｖｓＡｇ／Ａｇ＋のピークポテンシャルを形成する。リバーススキャンの際は、より大きいＥＣＬ強度、及び同様のピーク位置が観察される。ＥＣＬのピークポテンシャルは、ＴＰｒＡの非存在下でのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋の酸化ポテンシャルと比べるとよりポジティブであるので、Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋の酸化ポテンシャルは、ＴＰｒＡの存在下でポジティブにわずかにシフトすることができることを留意されたい（図４ｂ及びｃ）。予想通り、Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋複合体の対イオンにおける変化、例えば、Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４−からＣｌＯ４−への変化は、ＥＣＬの挙動を変化させなかった。ａμＭレベルのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋を用いた場合にＴＰｒＡ・＋とＲｕ（ｂｐｙ）３＋との反応時の励起状態のＲｕ（ｂｐｙ）３２＋・の形成により（Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋とＴＰｒＡ・との反応により形成された）ＴＰｒＡ酸化のポテンシャル領域に前値波のＥＣＬが現れる水溶液の場合とは対照的に（Ｍｉａｏ、Ｃｈｏｉ、及びＢａｒｄ、２００２年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２４巻、１４４７８頁）、顕著な対応するＥＣＬシグナルはＭｅＣＮにおいては見られなかった。これが示唆するのは、本実験条件下では、ＭｅＣＮにおけるＴＰｒＡ・＋の寿命は中性の水溶液におけるよりも短く、又はＴＰｒＡ・＋は、Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋をＲｕ（ｂｐｙ）３２＋＊に酸化するほどエネルギー的に十分強力ではないということのいずれかである。これとは別に、我々の結論は、共反応化合物としてＴＰｒＡを用いて水溶液で展開したＥＣＬのメカニズムは、ＭｅＣＮにおいて効果があるということである。
【０１２１】
ＴＰｒＡの濃度の関数としてのＥＣＬ強度を図５ａに示すが、この場合ＥＣＬ強度の最も高い領域は、ＴＰｒＡ濃度３０ｍＭに対応する。予測されるように、水性溶液におけるＥＣＬ−ｐＨ依存性の試験に基づいて（Ｌｅｌａｎｄら、１９９０年、Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１３７巻、３１２７頁）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）をＲｕ（ｂｐｙ）３２＋／ＴＰｒＡ／ＭｅＣＮ溶液中に添加すると、溶液の酸度が変化するので、ＥＣＬ強度が変化する（図５ｂ）。１００ｍＭ ＴＰｒＡを５５ｍＭ ＴＦＡＡと組み合わせると、最大のＥＣＬ応答が得られた。
【０１２２】
用いた電極の材料によっても、ＥＣＬ強度及び安定性も影響を受けた。Ｐｔ及びＡｕ電極は、同様の応答を示し、ＥＣＬはいくつかのポテンシャルサイクル（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｙｃｌｅｓ）にわたり安定で、Ａｕ電極に比べると、Ｐｔ電極では見られた光電流密度はわずかに小さかった。しかし、ＧＣ電極では、第１のポテンシャルサイクルのフォワードスキャンのみが光を生成した。ＧＣ電極を磨いた後で、光は再び発生し、このことは電極の表面が何かの種類のフィルムにより阻止されていたことを示唆していた。０．１０μＭ Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２−０．１０μＭ ＴｐｒＡ−０．０５５Ｍ ＴＦＡＡ−０．１Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４を含むＭｅＣＮから、スキャン速度５０ｍＶ／ｓで０と３．０ＶｖｓＡｇ／Ａｇ＋の間の第１ポテンシャルサイクルの間中、Ａｕ、Ｐｔ、及びＧＣ電極で得られた相対的ＥＣＬ強度の比率は、１００：９３：６１であった。
【０１２３】
興味深いことに、Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋が非存在であっても、０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４を含むＴＰｒＡのアセトニトリル溶液も、ＥＣＬシグナルを生成することができる（図６ａ）。蒸留によるＴＰｒＡ及びＭｅＣＮの精製、（ＴＢＡ）ＢＦ４から（ＴＢＡ）ＣｌＯ４への電解質の変更、又は新たに開封した電気化学グレードの電極の使用、真新しいガラス器具及び電極の使用、並びにＰｔ対電極を黒色プラスチックの層のコーティング又はそれなしのガラスチューブでの被覆では、結果は変わらなかった。ＥＣＬのピークポテンシャル値は、２．１ＶｖｓＡｇ／Ａｇ＋であり、０．１０μＭ Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋の存在下で得られた値に比べると５００ｍＶのシフトである（図４ｂ）。先に図５ａで示したように、ＴＰｒＡの非存在下では、０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４を含むＴＲｕ（ｂｐｙ）３２＋のＭｅＣＮ溶液は、ポジティブのポテンシャルのみに対してのスキャンでは同じ強度スケールに対して観察可能なＥＣＬ応答は得られなかった。したがって、図６ａに示すＥＣＬシグナルは、ＴＰｒＡを起源とするに違いなく、おそらくはＴＰｒＡ・のフリーラジカルに関連する電荷移行反応逆光電子放出（ＣＴＲＩＰ）によるものである（Ｍｕｒａｋｏｓｈｉら、１９９２年、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、４５９３頁；Ｕｏｓａｋｉら、１９９１年、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９５巻、７７９頁；Ｕｏｓａｋｉら、１９９０年、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、７巻、１１５９頁：Ｍｃｌｎｔｙｒｅら、１９８７年、Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｆａｃ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．、２２８巻、２９３頁；Ｍｃｌｎｔｙｒｅら、１９８６年、Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．、５６巻、６５１頁；Ｍｃｌｎｔｙｒｅら、１９８５年、Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｆａｃ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．、１９６巻、１９９頁；Ｍｕｒａｋｏｓｈｉら、１９９３年、Ｃｏｎｄｅｎ Ｍａｒ Ｍａｔｅｒ．Ｐｈｙｓ．、４７巻、２２７８頁；Ｏｕｙａｎｇ及びＢａｒｄ、１９８８年、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９２巻、５２０１頁；Ｏｕｙａｎｇ及びＢａｒｄ、１９８７年、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９１巻、４０５８頁）。図６ａから得られた、積分したＥＣＬ強度は、図４ｂから得られたものの約１２％であり、ＴＰｒＡの非存在下で０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４／ＭｅＣＮ溶液から測定した残余の光電流は有意に少ないので、意義深いものである（図６ｄ）。バックグラウンドのＴＰｒＡ関連のＥＣＬシグナルは、ＴＦＡＡを溶液に加えることにより劇的に抑制され（図６ｂ）、「不要な」シグナルの更なる消失は、１％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏの０．１０Ｍ ＴＰｒＡ−０．０５５Ｍ ＴＦＡＡ−０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４ＭｅＣＮ溶液中への添加により実現した（図６ｃ）。図６ｅは、図６ａからｄまでから得られた相対的なＥＣＬ強度を示している。
【０１２４】
（実施例３）
ＥＣＬ標識のポリスチレンビーズ中への充填
直径１０μｍのポリスチレンカルボキシレートビーズをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ５４１５Ｄ遠心機（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ、ニューヨーク州、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ）１０ｋｒｐｍ５分間で、好適な容積（０．１０〜１．０ｍＬ）の２．６％（ｗ／ｗ）ポリスチレンビーズ懸濁液から分離し、次いで、水１ｍＬで１回洗浄した。
【０１２５】
ビーズを、６０℃の真空下で１時間乾燥し、その後１．５ｍＬのＥＣＬ標識Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２−飽和（０．７ｍＭ）５％ＴＨＦ−９５％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）溶液を、ＰＳＢを含む２ｍＬの微小遠心管中に加えた。混合物を、Ｄｙｎａｌサンプルミキサー（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）で２０ｒｐｍで２時間回転させ、その後遠心分離し、５０％ＭｅＯＨ−５０％Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）で２回洗浄した。得られた、Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢと呼ばれる、ＥＣＬ標識含有の黄色がかったポリスチレンビーズを、６０℃の真空下で１時間更に乾燥した。上記の処理の経過中、ポリスチレンビーズは、５％ＴＨＦ−９５％ＭｅＯＨの有機溶剤を含むＥＣＬ標識でまず膨張し、水不溶のＥＣＬ標識をポリマーのマトリックス中に拡散させ、そこで有機溶剤が真空蒸発によりビーズから除去されるときに捕捉された。ＥＣＬ標識のポリスチレンビーズ中への効果的な充填は、Ｍａｇｎａｆｉｒｅ−Ｍｏｄｅｌ Ｓ９９８０６ Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ ＣＣＤカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ、ニューヨーク州、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ）と組み合わせたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ）で撮影した蛍光画像（図２ａ）により視覚的に証明することができる。ビーズ１個あたりＲｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２分子７．５×１０９個という典型的なローディングキャパシティー（ｌｏａｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）は、ＴＰｒＡを共反応化合物として用いて、Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢをＭｅＣＮ及び標準のＲｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２溶液に溶解して得たＥＣＬのデータ、に基づいて概算された。
【０１２６】
（実施例４）
Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢの表面上へのアビジンの固定化
ビーズを０．１０Ｍ ＥＤＡＣ及び０．１０Ｍ ＮＨＳを含む、調製してすぐの２５μＭアビジンの０．１０Ｍ １−メチル−イミダゾールバッファー（ｐＨ７）溶液１．５ｍＬに浸漬し、混合物を約４０ｒｐｍで１時間回転することにより、Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−アビジンの形成により、アビジンの層を、Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢの表面に共有結合させた。Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンと呼ばれる、新たに形成された、アビジンでコーティングしたＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢを、５〜１０ｋｒｐｍで５分間反応溶液から遠心分離し、１ｍＬの「１×Ｂ＆Ｗバッファー」（１×バッファー＆洗浄溶液、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋０．５ｍＭ ＥＤＴＡ＋１．０Ｍ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。最終のＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン生成物を、出発のＰＳＢ懸濁液（０．１０〜１．０ｍＬ）と同じ容積を有し、使用まで約４℃に保っていた１×Ｂ＆Ｗバッファー溶液に再懸濁した。このようにして、Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンの調製中のビーズの損失はないと仮定して、約６．５×１０４Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンビーズ／μＬを概算することができる。図２ｂは、ビーズをフルオレセインビオチンと反応させた後のＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンの明緑色蛍光画像を示しており、高品質のアビジンの層がＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢの表面上に形成されたことを示唆している。これとは対照的に、「裸の」Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ上に非特異的に吸着されたフルオレセインビオチンは、非常に弱い蛍光画像を生成するにすぎない。Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンのビオチン化２３−ｍｅｒ ｓｓＤＮＡ（ｐ−ｓｓＤＮＡ）に対する結合能力は、フルオレセインビオチン滴定実験に基づくと、０．５６５ｎｍｏｌ（ｐ−ｓｓＤＮＡ）／ｍｇＰＳＢ又は１．４×１０８ｐ−ｓｓＤＮＡ分子／ビーズの値を有することが見出された（図１０及び以下の表１を参照されたい）。
【０１２７】
（実施例５）
ＭＢ及びＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンビーズの表面へのｓｓＤＮＡの結合
プローブＤＮＡ−ＭＢ複合体
プローブＤＮＡの担体として、直径１．０μｍ又は２．８μｍのストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズ（ＭＢ）を用いた。プローブＤＮＡ−ＭＢ複合体を形成するために、５．０μＬの１．０μｍＭＢ、又は１０．０μＬの２．８μｍＭＢを、最初に２ｍＬの微小遠心管中に移し、次いで、マグネット（Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）−Ｓ）でオリジナルの懸濁液から分離し、その後２００μＬの「２×Ｂ＆Ｗバッファー」（バッファー＆洗浄溶液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、２．０Ｍ ＮａＣｌ）で１回、２００μＬの１×Ｂ＆Ｗバッファーで２回洗浄した後、ビーズを２．５μＭのビオチン化ｐ−ｓｓＤＮＡ１００μＬに浸漬し、４０ｒｐｍで穏やかに回転しながら３０から６０分間インキュベートした。形成したプローブＤＮＡ−ＭＢ複合体を、引き続き分離し、２００μＬのＢ＆Ｗバッファーで３回洗浄し、以前の遠心管の壁面上への可能なプローブＤＮＡの吸着を避けるために新しい２ｍＬの微小遠心管に移し、２０μＬのハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁した。この方法で生成された複合体は、直径１．０μｍ及び２．８μｍのＭＢに対してそれぞれ、約２．５３及び１．１ｎｍｏｌｅ（ｐ−ｓｓＤＮＡ）／ｍｇ（ビーズ）、又はビーズ１個あたり１．６×１０６及び１０×１０７個のｐ−ｓｓＤＮＡ分子の飽和プローブのＤＮＡ付着量を有していた（図１０及び表１を参照されたい）。
【表１】
【０１２８】
標的のＤＮＡ−Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン複合体
好適な濃度のビオチン化ｔ−ｓｓＤＮＡ（１．０×１０−８から１．０×１０−１５Ｍ）１００μＬ、又は１．０×１０−９Ｍの非相補的−ｓｓＤＮＡ（ｎｃ−ｓｓＤＮＡ）及び２塩基対ミスマッチのｓｓＤＮＡ（２−ｂｐ−ｍ−ｓｓＤＮＡ）を、約６．５×１０４ビーズ／μＬ Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンの１×Ｂ＆Ｗバッファー溶液２５μＬに加え、２０ｒｐｍの回転速度で穏やかに混合しながら１時間インキュベートし、１×Ｂ＆Ｗバッファー２００μＬで２回洗浄し、３ｋ−５ｋ−１０ｋｒｐｍで５分間遠心分離し、ハイブリダイゼーションバッファー５０μＬに再懸濁した。
【０１２９】
（実施例６）
ＤＮＡハイブリダイゼーション及びＥＣＬ検出
新たに調製した標的のＤＮＡ−Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン複合体（実施例５）を、先に形成したプローブＤＮＡ−ＭＢ複合体（実施例５）を含む２ｍＬ遠心分離管に移した。好適な容積のハイブリダイゼーションバッファーを分離管中に加えて、ハイブリダイゼーション溶液の全容積を２００μＬにした。２０ｒｐｍで１時間穏やかに混合した後、プローブＤＮＡ−ＭＢ−標的ＤＮＡ−Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン凝集物を、遊離の非結合のＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンビーズを含む「溶液」から磁気的に分離し、２００μＬの１×Ｂ＆Ｗバッファーで３回穏やかに洗浄し、分離管の壁面上への遊離のＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンビーズの可能な吸着を最小にするために新しい遠心分離管中に慎重に移した。ＤＮＡハイブリダイゼーションの凝集物とともに、壁面上の遊離のＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンビーズがＭｅＣＮに溶解することもあるので、この種の非特異的な吸着により、著しく高レベルのバックグラウンドのＥＣＬが生成され得る。凝集物は、最終的に水２００μＬで洗浄し、後にＥＣＬを測定するために０．５０ｍＬの０．１０Ｍ ＴＰｒＡ−０．０５５Ｍ ＴＦＡＡ−０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４ＭｅＣＮ溶液に溶解した。ＤＮＡハイブリダイゼーションの後、プローブＤＮＡ−ＭＢ−標的ＤＮＡ−Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン凝集物の形成は、図３に示すＳＥＭ画像により明らかに証明することができ、この場合、プローブＤＮＡも相補的なＤＮＡも濃度は５μＭであり、ＭＢ／ＰＳＢの初期比率＝２９であり、ＭＢ及びＰＳＢのサイズは、それぞれ１．０μｍ及び１０μｍであった。
【０１３０】
ＥＣＬ強度と、１０ｎＭから１．０μＭの濃度範囲のＲｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２との間の線形の関係は、１％の水を加えた０．１０Ｍ ＴＰｒＡ−０．０５５Ｍ ＴＦＡＡ−０．１０（ＴＢＡ）ＢＦ４ＭｅＣＮで見られた。同じ実験条件下で、ＥＣＬ強度と、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２を充填した直径１０μｍのポリスチレンビーズの数との間にも、良好な相関が見られた（図７ｂ）。ビーズを０．５０ｍＬの電解質溶液に溶解して、ポリスチレンがＥＣＬシグナルを生成せず、又はＥＣＬシグナルに影響を及ぼさないことを実証した。図７ｂを７ａと比べると、２０のＲｕ（ｂｐｙ）３２＋を充填したビーズから生成される光の強度は、０．５ｎＭのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋からの強度と等しい。ビーズのローディングキャパシティーは、このようにして、ビーズ１個あたり７．５×１０９Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２分子であると決定された。この結果は、「大量のビーズ」のＥＣＬ測定に基づいて得られたデータと一致していた。
【０１３１】
ＤＮＡハイブリダイゼーションのＥＣＬ検出のために、２セットの実験を計画した。第１の実験では、直径１．０μｍのＭＢを、ＭＢ対ＰＳＢビーズ比率２９で用いた。図８ａに示すように、この場合、ＥＣＬ強度は、１０ｐＭから１０ｎＭの範囲にわたり標的のＤＮＡ濃度に比例し、２塩基ミスマッチの２−ｂｐ−ｍ−ｓｓＤＮＡ及び非相補的なｎｃ−ｓｓＤＮＡは、相補的なＤＮＡハイブリダイゼーションから容易に区別することができる。図７に示す実施例と異なり、電解質溶液に水を加えなかったことを留意されたい、というのは新たに形成されたＭＢ−ＰＳＢ複合体及び微小遠心管はすでに十分な水を含んでいたからである。図８に示すＥＣＬ強度に対して、バックグラウンドを差し引かなかったことも留意されたい。ＭＢ対ＰＳＢの比率を低下させることにより、したがってＲｕ（ｂｐｙ）３２＋のｔ−ｓｓＤＮＡに対する増幅定数を増大することにより、ずっと低い濃度の標的ＤＮＡ濃度でのＤＮＡハイブリダイゼーションが検出可能でなければならない。以下に実証するように、直径１０μｍのＰＳＢ１個を、直径２．８μｍのＭＢ１個とともに引き出すことができる。その結果、ＤＮＡハイブリダイゼーションに関連するＥＣＬシグナルは非常に低い標的ＤＮＡ濃度で生じ、したがって、２．８μｍのＭＢと１０μｍのＰＳＢとが低い比率で存在する場合に検出可能であり得る。図８ｂは、２．８μｍＭＢ／１０μｍＰＳＢの比率＝４であるような例の結果を示している。ｔ−ｓｓＤＮＡは、１．０ｆｍｏｌほどに低い濃度で検出することができる。このような条件下でさえ、得られたＥＣＬ強度は、２−ｂｐ−ｍ−ｓｓＤＮＡ及びｎｃ−ｓｓＤＮＡのそれぞれの種の１．０ｎＭを用いた場合に、それらのＤＮＡハイブリダイゼーションから得られるものよりも大きく、したがってそれらと区別することができる。
【０１３２】
（実施例７）
ビオチン−ＰＥＯ−ＬＣ−アミンのポリスチレンカルボキシレートビーズへの付着、及びポアソン分布検定
ビオチン−ＰＥＯ−ＬＣ−アミン（Ｍ．Ｗ．＝４１８．６ｇ／ｍｏｌ）は、水に可溶性の架橋剤であり、２２．９Åのポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）ベースのスペーサーアームを用いて、ビオチンとアビジンとの相互作用の立体障害を低下させている（２００３〜２００４年、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ＆Ｃａｔａｌｏｇ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、２００３年）。ビオチン−ＰＥＯ−ＬＣ−アミン分子は、０．１０Ｍ ＥＤＡＣ−０．１０Ｍ ＮＨＳの０．１０Ｍ １−メチル−イミダゾールバッファー溶液（ｐＨ７）の存在下でポリスチレンカルボキシレートビーズの表面に、架橋剤の第１級アミン基とビーズのカルボキシル基との間にアミド結合を形成することにより、共有結合している。５ｍＭビオチン−ＰＥＯ−ＬＣ−アミンの１ｍＬを用いて、２．６％ＰＳＢ懸濁液の２５０μＬから分離したＰＳＢと反応させる。反応は、回転速度４０ｒｐｍで２時間行った。架橋剤が修飾したＰＳＢは、ＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−ＬＣ−ＰＥＯ−ビオチンと呼ばれ、引き続き分離され、１×Ｂ＆Ｗバッファー４００μＬで３回洗浄し、１×Ｂ＆Ｗバッファー２５０μＬに再懸濁し、次いで使用するまで４℃に保った。
【０１３３】
直径１０μｍのＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−ＬＣ−ＰＥＯ−ビオチンビーズを用いて、２つの異なるサイズのストレプトアビジン／ポリスチレンコーティング磁性ビーズ（直径１．０及び２．８μｍのＤｙｎａｌビーズ）で、ポアソン分布の測定を行った。何万個ものＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−ＬＣ−ＰＥＯ−ビオチンビーズを、同一の、又はより大きい数の１．０又は２．８μｍの磁性ビーズのいずれかと溶液で十分に混合する場合に、ＰＳＢのビオチンとＭＢのストレプトアビジンとの間の非可逆的な反応により、ＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−ＬＣ−ＰＥＯ−ビオチンビーズが粘着する確率を観察することができ、ポアソン分布に対して予測されるものと比較することができる。実験上は、約６．５×１０４ビーズ／μＬのＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−ＬＣ−ＰＥＯ−ビオチンビーズ５０μＬ（全部で３．３×１０６ＰＳＢ）を１×Ｂ＆Ｗバッファー１７５μＬで希釈し、製造元のオリジナルの懸濁液から磁気的に分離し２×Ｂ＆Ｗバッファー２００μＬで１回洗浄した既知数のストレプトアビジンコーティング磁性ビーズ（直径１．０μｍ）を含む２．０ｍＬ微小遠心管に移した。混合物を直ちに振とうし、４０ｒｐｍで１時間回転した後、ＰＳＢ−ＭＢ凝集物を磁気的に混合物から分離した。得られた上清は非結合の遊離のＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−ＬＣ−ＰＥＯ−ビオチンビーズを含んでおり、上清におけるＰＳＢの数は、倒立顕微鏡で肉眼的検査により決定した。同様の手順を用いて、２．８μｍＭＢのポアソン分布を試験した。しかし、この場合は、半分の量のＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−ＬＣ−ＰＥＯ−ビオチンビーズ、即ち１．６×１０６ビーズのみを、既知量のＭＢとの反応に用いた。
【０１３４】
非常に多数の磁性ビーズとポリスチレンビーズとを一緒に混合する場合は、これら２種類のビーズが衝突し、非可逆的に反応する確率Ｐ（ｍ，ｎ）は、ポアソン分布に従うはずであり、以下の２つのパラメータに従うはずである：（ａ）磁性ビーズのポリスチレンビーズに対する最初の比率ｍ、及び（ｂ）各ポリスチレンビーズに結合している磁性ビーズの数ｎ。例えば、等しい数のＭＢ及びＰＳビーズを混合した場合（ｍ＝１）、ＰＳに結合するＭＢの平均数は１であるはずである。しかし、この平均値をもたらすには、ｎ＝１、２、・・・・の分布が存在する。Ｐ（ｍ，ｎ）、ｍとｎとの間の関係は、以下のようにポアソン分布により述べることができる。
【０１３５】
Ｐ（ｍ，ｎ）＝ｅ−ｍ［ｍｎ／ｎ！］ ｎ＝０、１、２、・・・
（Ｈａｉｇｈｔ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｉｓｓｏｎ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９６７年を参照されたい。）
【０１３６】
表２は、ｍ及びｎの様々な値に対するＰ（ｍ，ｎ）の値を列挙している。この表及びポアソン分布の試験データ（上記に提供）で、１個のポリスチレンビーズに結合し、反応溶液から引き出すのに必要とされる磁性ビーズの最小数を概算することができる。例えば、上清から回収されたＰＳＢの数から、ＭＢに結合し、反応混合液から磁気的に引き出されるＰＳＢのパーセント値を計算することができる。ｍ値が既知数、例えば、ｍ＝１、２、３、４、５、・・・である１セットの「結合ＰＳＢ％」のデータを、次いで、実験的に得ることができる。データがＰ（ｍ、ｎ＞ｊ）の理論値に当てはまる場合（表２）、ｍは行った実験から既知であり、ｊ＝０、１、２、３、・・・であり、
【数１】
である場合は、１個のポリスチレンビーズに結合し、それを引き出すのに必要とされる磁性ビーズの最小数は、ｊ＋１でなければならない。
【表２】
【０１３７】
図９は、このような試験の２つの例を示している。第１の例（図９ａ）では、２．８μｍＭＢと１０μｍＰＳＢとを用い、最小の結合比率であるＭＢ／ＰＳＢ＝１を導き出すことができる。第２の例（図９ｂ）では、２．８μｍＭＢの代わりに１．０μｍＭＢを用いて１０μｍＰＳＢと反応させた。この場合、ＭＢのＰＳＢに対する、より高い最小の結合比率である３が得られた。これらの結合比率を利用して、ＭＢとＰＳＢとの間のＤＮＡハイブリダイゼーションに対する実験条件を最適化することができ、その結果標的ＤＮＡの最小濃度を検出することができる。
【０１３８】
（実施例８）
２つの芳香族炭化水素であるＤＰＡ及びルブレンのポリスチレンビーズ中への充填
Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２の他に、芳香族炭化水素、例えば、９，１０−ジフェニルアントラセン（ＤＰＡ、図１１ａ）及びルブレン（ＲＵＢ、図１１ｂ）も、ポリスチレンビーズ（ＰＳＢ）中に充填した。その結果、発光波長の様々なＥＣＬ標識が得られた。充填の手順は、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２の捕捉に用いた手順と同様であったが、５％ＴＨＦ−９５％ＭｅＯＨの「膨張溶剤」を５％ベンゼン−９５％ＭｅＯＨに置き換えたので、２つの芳香族炭化水素はベンゼンを含んだ溶剤に十分に可溶である。図１２は、充填手順を要約したものである。
【０１３９】
ＰＳＢ中へのＤＰＡ及びＲＵＢの捕捉は、ＵＶ光線で励起した蛍光画像を用いて肉眼的に検証した。図１３ａ及びｂに示すように、ＤＰＡ及びＲＵＢを充填したＰＳＢに対してそれぞれ強烈な青色、及び黄色から橙色の蛍光画像が観察された。これとは対照的に、芳香族炭化水素のないＰＳＢは、弱い緑色の蛍光を示した（図１３ｃ）。
【０１４０】
ビーズ１個あたりＤＰＡ分子７．５×１０９、又はビーズ１個あたりＲＵＢ分子４．８×１０８というローディングキャパシティーを、ＭｅＣＮに溶解したＰＳＢを充填したＤＰＡ又はＲＵＢ、及び共反応化合物としてトリプロピルアミン（ＴＰｒＡ）を用いた標準のＤＰＡ又はＲＵＢ溶液から得たＥＣＬのデータに基づいて概算した。図１４は、（ａ）ＤＰＡを充填したＰＳＢをＭｅＣＮに溶解したもの、及び（ｂ）共反応化合物としてＴｐＲＡを用いた０．２５ｍＭＤＰＡのアセトニトリル溶液のＣＶ及びＥＣＬの挙動である。ＲＵＢを充填したＰＳＢをＭｅＣＮに溶解したもの、及び共反応化合物としてＴＰｒＡを用いた３５μＭ ＲＵＢのアセトニトリル溶液のＣＶ及びＥＣＬの挙動を、それぞれ図１５ａ及び１５ｂに示す。
【０１４１】
（実施例９）
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のＥＣＬ検出
Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン←抗−ＣＲＰ複合体を、以下のように調製した：０．１００〜０．５００ｍＬのＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン（６．５×１０４ビーズ／μＬ）（実施例４を参照されたい）を、２．０ｍｇ／ｍＬビオチン化抗−ＣＲＰ（Ｍｉａｏ及びＢａｒｄ、２００３年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７５巻、５８２５頁）の０．１０Ｍ ＰＢＳバッファー（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）（ｐＨ７．２）（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）溶液の１ｍＬと、室温で１時間、回転速度２５ｒｐｍで混合した。新たに形成した複合体を遠心分離により回収し、１×Ｂ＆Ｗバッファーで３回洗浄し（実施例４を参照されたい）、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．１０Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液１ｍＬに３０分間再懸濁した。遠心分離及び洗浄後（上記の通り）、複合体を適切な容積（０．１００〜０．５００ｍＬ）の０．１０Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）バッファー溶液に懸濁し、使用するまで４℃に保った。
【０１４２】
ＭＢ←抗−ＣＲＰ複合体を、以下のように調製した：直径２．８μｍのストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズ０．１００〜０．５００ｍＬ（ＭＢ、６．５×１０５ビーズ／μＬ）を磁気的に分離し、２×Ｂ＆Ｗバッファー１ｍＬで１回、１×Ｂ＆Ｗバッファー１ｍＬで２回洗浄し、その後２．０ｍｇ／ｍＬビオチン化抗−ＣＲＰの０．１０Ｍ ＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ７．２）の１．５ｍＬと、室温で１時間、２５ｒｐｍの回転速度で混合した。新たに形成したＭＢ←抗−ＣＲＰ複合体を、１×Ｂ＆Ｗバッファー１ｍＬで３回洗浄し、適切な容積（０．１００〜０．５００ｍＬ）の０．１０Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）バッファー溶液に再懸濁し、使用するまで４℃で貯蔵した。
【０１４３】
サンドイッチタイプのＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン←抗−ＣＲＰ＜ＣＲＰ＞ＭＢ←抗−ＣＲＰ複合体を以下のように形成した：Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン←抗−ＣＲＰ複合体（全部で１．３×１０６ＰＳＢ）２０μＬ及びＭＢ←抗−ＣＲＰ複合体（全部で１．３×１０７ＰＳＢ）２０μＬを、０．１０Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）バッファー溶液２００μＬ中のＣＲＰ試料と、室温で２時間穏やかに混合した。サンドイッチタイプの複合体を混合溶液から磁気的に分離し、１×Ｂ＆Ｗバッファー２００μＬで３回洗浄した。次いで、遊離のＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン←抗−ＣＲＰの古い遠心管の壁面上への可能な吸着が最小になるように、複合体を少容積のＰＢＳバッファーで、新しい２ｍＬの遠心管に移した（実施例６を参照されたい）。最後に「磁性の複合体」をマグネットで溶液から分離した。
【０１４４】
ＥＣＬによりＣＲＰを検出した。得られたサンドイッチ型の複合体を、０．１０Ｍ ＴＰｒＡ−０．０５５ＴＦＡＡ−０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４ＭｅＣＮ溶液０．５００ｍＬに溶解し、直径２．２ｍｍのＰｔ電極で、スキャンスピード５０ｍＶ／ｓで、０〜２．８Ｖ ｖｓ．Ａｇ／Ａｇ＋（０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４ＭｅＣＮ中の１０ｍＭ ＡｇＢＦ４）の走査電位窓でサイクリックボルタンメトリーを用いてＥＣＬ実験を行った。予想通り、サンドイッチタイプの複合体から得られたＣＶ及びＥＣＬのプロファイルは、両方の場合とも「反応種」、Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋及びＴＰｒＡが同一であったので、図４ａ及びｃに示したものと非常に類似していた。図１６に示すように、ＥＣＬ強度（フォワードスキャンピーク強度とリバーススキャンピーク強度との平均）は、０．０１０〜１０μｇ／ｍＬの範囲にわたるＣＲＰ濃度に対して線形に比例している。
【０１４５】
本明細書に引用される参照は全て、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。参照として組み入れられる出版物、及び特許、又は特許出願が本明細書に含まれている開示と矛盾する範囲では、本明細書は、そのような矛盾する材料のあらゆるものに取って代わり、及び／又は優先することが意図される。
【０１４６】
本明細書及び特許請求の範囲で用いられる、成分、反応条件などの量を表す数値は全て、全ての場合において「約」という語により修飾されるものであることを理解されたい。したがって、逆を示さなければ、本明細書及び添付する特許請求の範囲で述べた数のパラメータは、本発明により得られることが求められている、望ましい性質に応じて変化することができる近似値である。控えめに言っても、且つ、特許請求の範囲の同等物の学説の適用を制限しようとするものではないが、数値のパラメータはそれぞれ、有効数字の数、及び通常の数字を丸める取組みを考慮して解釈されたい。
【０１４７】
当業者であれば明らかであるが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の多くの変更形態及び変形形態を行うことは可能である。本明細書に記載した特異的実施形態は、例として提供されるにすぎず、決して限定的なものを意味するものではない。明細書及び実施例は、例示的なものにすぎないとみなすべきであり、本発明の真の範囲及び精神は、以下の特許請求の範囲により示されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】対象の分析物が、ＥＣＬ標識を含む第１の担体としても働くポリスチレンビーズに連結するＤＮＡ分子である、本発明のある実施形態の概略図である。磁性であり、ポリスチレンビーズに連結するＤＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子に連結する第２の担体として働く第２のビーズも示してある。２つのＤＮＡ分子は結合して複合体を形成する。磁場を複合体に適用することにより、対象の分析物（例えばＤＮＡ）を単離する手段がもたらされ、ＥＣＬ標識を検出することにより、対象の分析物を検出する手段がもたらされる。
【図２】直径１０μｍのポリスチレンカルボキシレートビーズの蛍光画像を示す図である。図２（ａ）は、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２の捕捉後のビーズを示し、図２（ｂ）は、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２を充填したビーズの表面上にアビジンが共有結合した後のビーズを示している。使用した暴露時間は３０秒であった。検体は、λｅｘ４９０ｎｍで励起した。
【図３】プローブＤＮＡ−磁性ビーズ複合体（ＤＮＡ−ＭＢ）と、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２を含むアビジンでコーティングしたポリスチレンビーズ（ＤＮＡ−Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンで表してある）に複合した相補的なＤＮＡとの間のＤＮＡハイブリダイゼーション後に得られた走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す図である。両方のＤＮＡ分子に用いた濃度は５μＭであり、ＰＳＢ及びＭＢのサイズは、それぞれ１０μｍ及び１．０μｍであった。
【図４】０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４電解質−０．１０Ｍトリプロピルアミン（ＴＰｒＡ）共反応化合物を含む０．１０μＭ Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２のアセトニトリル（ＭｅＣＮ）から得られた（ａ）サイクリックボルタンメトリーの（ＣＶ）、及び（ｂ）ＥＣＬの、直径２．２ｍｍのＰｔ電極でスキャン速度５０ｍＶ／ｓでの応答を示す図である。比較のために、（ｃ）に、ＴＰｒＡの非存在下で０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４を含む１．０ｍＭ Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２のＭｅＣＮのＣＶを示す。（ｃ）の実験条件は、（ａ）及び（ｂ）と同じであるが、ＣＶ電流は１０倍であった。
【図５】ＥＣＬ強度に対する（ａ）ＴＰｒＡ、及び（ｂ）ＴＰｒＡ−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）の濃度の効果を示す図である。試料は全て、０．１０μＭ Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２及び０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４のＭｅＣＮを含んでいた。作用電極は、直径２．２ｍｍのＰｔ電極であった。スキャン速度は５０ｍＶ／ｓであった。
【図６】ＴＰｒＡ−ＭｅＣＮシステムに対するＥＣＬバックグラウンドの消失を示す図である。（ａ）では、０．１０Ｍ ＴＰｒＡ及び０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４−ＭｅＣＮを用いた。（ｂ）では、０．０５５Ｍ ＴＦＡＡを添加し、（ａ）と同じ条件を用いた。（ｃ）では、１．０％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏを添加し、（ｂ）と同じ条件を用いた。（ｄ）では、０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４−ＭｅＣＮを用いた。図６（ｅ）は、（ａ）〜（ｄ）に示した相対的なＥＣＬ強度を示している。
【図７】Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２濃度の関数としてのＥＣＬ強度（ａ）、及びＲｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２を充填した直径１０μｍのポリスチレンビーズの数（ｂ）を示す図である。
【図８】ＤＮＡハイブリダイゼーションのＥＣＬ検出を示す図である。図８（ａ）は、ＭＢ／ＰＳＢ＝２９の比率で、プローブＤＮＡ−ＭＢ（１．０μｍ）と、標的のＤＮＡ−Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン（１０μｍ）との間でＤＮＡハイブリダイゼーションが起こったことを示す。図８（ｂ）は、ＭＢ／ＰＳＢ＝４の比率で、プローブＤＮＡ−ＭＢ（２．８μｍ）と標的のＤＮＡ−Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン（１０μｍ）との間でＤＮＡハイブリダイゼーションが起こったことを示す。
【図９】直径１０μｍのビオチン化ＰＳＢと反応した直径（ａ）２．８μｍ、及び（ｂ）１．０μｍのストレプトアビジンコーティングしたＭＢを用いた、ポアソン分布の検定を示す図である。「結合しているＰＳＢ％」は、反応媒体からＭＢ−ＰＳＢ複合体を磁気的に分離した後、上清に見られたＰＳＢの数から計算した。
【図１０】フルオレセインビオチン滴定実験で得られた、ビオチン化した２３−ｍｅｒ−ｓｓＤＮＡ（ｐ−ｓｓＤＮＡ）に対する（ａ）Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋で捕捉されたストレプトアビジンでコーティングした直径１０μｍのポリスチレンビーズ、（ｂ）ストレプトアビジンでコーティングした直径１．０μｍの磁性ビーズ、及び（ｃ）ストレプトアビジンでコーティングした直径２．８μｍの磁性ビーズの結合能力を示す図である。
【図１１】ＤＰＡ（ａ）及びＲＵＢ（ｂ）の分子構造を示す図である。
【図１２】芳香族炭化水素をポリスチレンビーズ中に充填するための手順におけるステップを表すフローチャートである。
【図１３】（ａ）ＤＰＡを充填したＰＳＢ、（ｂ）ＲＵＢを充填したＰＳＢ、及び（ｃ）ＰＳＢのみの蛍光画像を示す図である。
【図１４】（ａ）ＭｅＣＮに溶解した、ＤＰＡを充填したＰＳＢ、及び（ｂ）共反応化合物としてＴＰｒＡを用いた０．２５ｍＭ ＤＰＡのアセトニトリル溶液の、ＣＶ及びＥＣＬの挙動を示す図である。
【図１５】（ａ）ＭｅＣＮに溶解した、ＲＵＢを充填したＰＳＢ、及び（ｂ）共反応化合物としてＴＰｒＡを用いた３５μＭ ＲＵＢのアセトニトリル溶液の、ＣＶ及びＥＣＬの挙動を示す図である。
【図１６】ＥＣＬシグナルとＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の濃度との間の関係を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、本明細書に参照により組み入れられる、２００４年６月２３日出願の米国仮特許出願第６０／５８１７１９号の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、一般的には、試料における対象の分析物を検出するための方法及び組成物に関する。対象の分析物は、ヒト又は他の生物に影響を及ぼす疾患又は病状に関連し得る。対象の分析物には、毒素、化学若しくは生物兵器物質、及び環境汚染物質が含まれる。ある実施形態において、本発明は、特に、第１及び第２の担体、試料中に含まれる対象の分析物、第１の担体を通じて捕捉され又は含有される電気化学発光（ＥＣＬ）部分、並びに第１及び第２の担体の少なくとも１つに連結される対象の分析物の少なくとも１つの特異的結合パートナーを含む組成物に関する。ある実施形態において、本発明は、試料における対象の分析物を検出するための、これらの組成物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
化学的、生化学的、及び生物学的物質などの分析物を、検出し、定量する、迅速で高度に特異的な方法が、引き続き、ますます必要とされている。特に、少量の、薬剤、代謝物、生物学的マーカー、微生物、ウィルス、及び他の病原体を測定するための方法が望まれている。これらの材料の存在は、多くの生物学的システムを特徴づける高度の特異性を利用する結合方法により決定できることが多い。試料に存在する対象の分子を検出するために結合に頼っている既知の方法には、核酸ハイブリダイゼーション技術、及び、抗体−抗原結合などのタンパク質−リガンド相互作用が含まれる。これらの方法では、診断的価値のある複合体の存在が、通常、複合体を含む１つ又は複数の材料に付着している観察可能な標識の存在／活性化、又は非存在／非活性化により示される。
【０００４】
感度及び選択性は双方とも、多数の構成成分からなる試料に存在する対象の特異的分子を検出するためのあらゆるシステムの望ましい特質である。対象の生物学的分子を検出するためのＤＮＡハイブリダイゼーション及び他のバイオアッセイでは、感度は、臨床上の診断（Ｌｉｒｏｎ ａｎｄ Ｆｉｓｈｅｒ編集、Ｎｏｖｅｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｓｓａｙｓ、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００年；Ｋｅｎｔｏｎら、１９９２年、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３８巻、８７３頁；Ｃｈｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓら、２００２年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７４巻、３０３０頁）、法化学（Ｈｅｌｌｅｒ、２００２年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．、４巻、１２９頁；Ｎｅｌｓｏｎら、１９９６年、Ｊ．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ．、４１巻、５５７頁）、環境調査（Ｌｕｃａｒｅｌｌｉら、２００２年、Ｔａｌａｎｔａ、５６巻、９４９頁；Ｍｉｎら、２００２年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０３巻、１８６頁）、薬学研究（Ｈｅｌｌｅｒ、２００２年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．、４巻、１２９頁；Ｐｏｌｌｉｃｅら、１９８５年、Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．、５巻、４６３頁）、及び生物兵器物質の検出（Ｓｍｉｔｈ、２００２年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７４巻、４６２Ａ頁；Ｍｉａｏ及びＢａｒｄ、２００３年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７５巻、５８２５頁）において重要である。したがって、対象分子の感度のある、選択的な検出を提供するあらゆるシステムは、これらの分野全てで広範囲の適用性を有する。
【０００５】
電気化学発光（ＥＣＬ）法は、感度が高く、ダイナミックレンジが広く、選択的であるので、結合試験（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｔｕｄｙ）で広く使われている（米国特許第６３１６６０７号；Ｂａｒｄ，Ａ．Ｊ．編集、Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００４年）。例えば、ＤＮＡの検出に様々な技術が使用可能であり、その場合、標的の１本鎖ＤＮＡ（ｔ−ｓｓＤＮＡ）に結合している電気化学的標識、蛍光標識、及びＥＣＬ活性標識が、分析過程で測定可能なシグナルを生成する（Ｌｉｒｏｎ及びＦｉｓｈｅｒ編集、Ｎｏｖｅｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｓｓａｙｓ、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００年；Ｙａｎｇ及びＮｇｏ編集、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００年；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒｓ、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９８年）。測定されるシグナルの強度は概ねｔ−ｓｓＤＮＡの量に比例するので、これらの方法の感度は制限されることが多く、伝統的に、たった１つ又は少数の標識が１つのｔ−ｓｓＤＮＡに結合することができる。より高感度を実現することができるように、１つのＤＮＡをより多数の標識で標識することができる幾つかの方法が開発されている（Ｗａｎｇ及びＭｅｒｋｏｃｉ、２００３年、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９巻、９８９頁；Ｚｈａｏら、２００３年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２５巻、１１４７４頁）。これらの方法は、フェムトモル（ｆｍｏｌ）範囲の量を検出するのに必要とされる感度はもたらさない。また、これらは相補的なハイブリダイゼーションと、２塩基対のミスマッチ又は多重測定とを区別する能力である、低い非特異的結合ももたらさない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、高い選択性及び低い非特異的結合をもたらす、高感度の（例えば、ｆｍｏｌ範囲の）検出システムが依然として必要とされている。少なくとも１つの他の分子（例えば、特異的結合パートナー）に結合し、又はそれと相互作用することができるのであれば、このシステムは広範囲の適用性を有するはずであり、実質的にあらゆる対象の分子を検出するのに用いることができる。対象の分子が核酸、例えばＤＮＡである場合には、このシステムは、相補的なハイブリダイゼーション、少なくとも２塩基対のミスマッチのハイブリダイゼーション、及び非相補的なＤＮＡハイブリダイゼーションの各々を区別することができなければならない。
【０００７】
理想的には、検出システムは、ＥＣＬ標識の非特異的な結合を除外する単純な処理と、ＥＣＬ標識の高い安定性とを提供し、その結果、シグナルを失わずに、多重測定を取り込む可能性を考慮するものである。これらの必要性はそれぞれ、少なくとも、開示する発明の、ある実施形態により満たされる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ある実施形態では、本発明は、試料における対象の分析物を検出するための、迅速で、感度がよく、選択的な方法及び組成物を提供する。即ち、本発明は、試料中に含まれる、少量（例えば、１ｆｍｏｌ）の対象の分析物を正確に検出する（例えば、偽陽性のシグナルの出現率が低い）ための方法及び組成物に関する。この望ましい感度は、少なくとも部分的に、第１の担体中に捕捉され、又は含まれている多数のＥＣＬ分子を提供することにより実現される。
【０００９】
ある実施形態では、本発明は、
ＢとＤの両方が対象の分析物に連結してはいないという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物に連結しているか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結してあり、
Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の分析物に連結しているか、又は対象の第２の特異的結合パートナーに連結している第２の担体であり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象のを含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象のを検出する方法を提供する。
【００１０】
ある実施形態において、本発明は、
ＢとＤの両方が対象の生物学的分子に連結してはいないという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを捕足若しくは含む第１の固体支持体であり、Ｂは対象の生物学的分子に連結しているか、又は対象の生物学的分子の第１の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の生物学的分子を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の生物学的分子に連結しているか、又は対象の生物学的分子の第２の特異的結合パートナーに連結している第２の固体支持体であり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象の生物学的分子を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより生物学的分子の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の生物学的分子を検出する方法を提供する。
【００１１】
本発明の一部の実施形態では、対象の生物学的分子はタンパク質であることができる。本発明の一部の実施形態では、対象の生物学的分子は核酸であることができる。
【００１２】
ある実施形態において、本発明は、
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物に連結しているか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結しており、Ｃは、対象の分析物を含むことがある試料であり、Ｄは対象の分析物に連結しているか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーに連結している第２の担体であり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、ＢとＤの両方が対象の分析物に連結してはいない。］
を含む、試料における対象の分析物を検出するのに有用な組成物を提供する。
【００１３】
ある実施形態において、本発明は、
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、ＢはＡを含む第１の固体支持体であり、Ｂは対象の生物学的分子に連結しているか、又は対象の生物学的分子の特異的結合パートナーに連結しており、Ｃは対象の生物学的分子を含むことがある試料であり、Ｄは対象の生物学的分子に直接連結するか、又は対象の生物学的分子の第２の特異的結合パートナーに連結することができる第２の固体支持体であり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、ＢとＤの両方が対象の分析物に連結してはいない。］
を含む、試料における生物学的分子を検出するのに有用な組成物を提供する。
【００１４】
本発明の一部の実施形態では、対象の生物学的分子はタンパク質であることができる。本発明の一部の実施形態では、対象の生物学的分子は核酸であることができる。
【００１５】
ある実施形態では、本発明は、ＢとＤの両方が対象の核酸分子に連結してはいないという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
Ｂは、Ａを含む、有機溶剤に可溶のビーズ、例えばポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸分子に結合しているか、又は対象の核酸分子の第１の特異的結合パートナーに結合しており、
Ｃは、対象の核酸分子を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の核酸分子に連結しているか、又は対象の核酸分子の第２の特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象の核酸分子を含む複合体を、他の組成物の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）Ｂを有機溶剤に溶解するステップと、
（ｄ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｅ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の核酸分子の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の核酸分子を検出する方法を提供する。
【００１６】
ある実施形態において、対象の核酸分子はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。一部の実施形態では、対象の核酸分子はリボ核酸（ＲＮＡ）である。
【００１７】
ある実施形態において、本発明は、
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＲｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２部分であり、ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸分子に連結しているか、又は対象の核酸分子の結合パートナーに連結しており、Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、Ｄは対象の核酸分子に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、ＢとＤの両方が対象の核酸分子に連結してはいない。］
を含む、試料における対象の核酸分子を検出するのに有用な組成物を提供する。
【００１８】
ある実施形態において、本発明は
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸分子に連結するか、又は対象の核酸分子の第１の特異的結合パートナーに連結し、Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、Ｄは対象の核酸分子に連結するか、又は対象の核酸分子の第２の特異的結合パートナーに連結する磁性ビーズであり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、ＢとＤの両方が対象の核酸分子に連結してはいない。］
を含む、試料における対象の核酸分子を検出するための組成物を提供する。
【００１９】
ある実施形態においては、本発明は、
ＢとＤの両方が対象のタンパク質に連結してはいないという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質、又は対象のタンパク質に特異的に結合している第１の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象のタンパク質を含むことがある試料であり、
Ｄは対象のタンパク質、又は対象のタンパク質に特異的に結合している第２の特異的結合パートナーに連結することができる磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象のタンパク質分子を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象のタンパク質の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象のタンパク質を検出する方法を提供する。
【００２０】
ある実施形態において、対象のタンパク質の第１及び／又は第２の結合パートナーは、抗体、又は特異的結合タンパク質であることができる。
【００２１】
ある実施形態において、本発明は、
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質に連結しているか、又は対象のタンパク質の第１の特異的結合パートナーに連結しており、Ｃは対象のタンパク質分子を含むことがある試料であり、Ｄは対象のタンパク質に連結しているか、又は対象のタンパク質分子に特異的に結合している第２の特異的結合パートナーに連結している磁化ビーズであり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、ＢとＤの両方が対象のタンパク質に連結してはいない。］
を含む、試料における対象のタンパク質を検出するための組成物を提供する。
【００２２】
ある実施形態では、対象のタンパク質分子の第１及び／又は第２の結合パートナーは、抗体、又は特異的結合タンパク質であることができる。
【００２３】
本発明は、対象の分析物を検出する競合的結合アッセイを行うための方法も提供する。ある実施形態において、本発明は、
Ｂ及びＤの１つのみが、対象の分析物の類似体に連結し、Ｂが対象の分析物の類似体に連結している場合には、Ｄは対象の分析物の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象の分析物の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象の分析物の類似体に連結しているという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物の類似体に連結しているか、又は対象の分析物の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、
Ｄは、対象の分析物の類似体に連結しているか、又は対象の分析物の特異的結合パートナーに連結している第２の担体であり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄを含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）複合体におけるＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の分析物の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の分析物を検出する方法を提供する。
【００２４】
関連の実施形態において、本発明は、
Ｂ及びＤの１つのみが、対象の核酸の類似体に連結し、Ｂが対象の核酸分子の類似体に連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象の核酸分子の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の類似体に連結しているという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の核酸の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象の核酸分子を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）Ｂを有機溶剤に溶解するステップと、
（ｄ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｅ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の核酸分子の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の核酸分子を検出する方法を提供する。
【００２５】
一部の実施形態では、本発明は、
Ｂ及びＤの１つのみが、対象のタンパク質の類似体に連結し、Ｂが対象のタンパク質の類似体に連結している場合は、Ｄは対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結しており、Ｂが対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結しているという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質の類似体、又は対象のタンパク質に特異的に結合している特異的結合パートナーに連結し、
Ｃは対象のタンパク質を含むことがある試料であり、
Ｄは、対象のタンパク質の類似体、又は対象のタンパク質に特異的に結合している特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象のタンパク質を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象のタンパク質の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象のタンパク質を検出する方法を提供する。
【００２６】
一部の実施形態において、本発明は、対象の分析物を検出するための競合的結合アッセイを行うための組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物の類似体に連結しているか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結しており、Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、Ｄは対象の分析物の類似体に連結することができるか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーに連結することができる第２の担体であり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、Ｂ及びＤの１つのみが、対象の分析物の類似体に連結し、Ｂが対象の分析物の類似体に連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結しており、Ｂが対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結している。］
を含む、試料における対象の分析物を検出するための組成物を提供する。
【００２７】
この組成物のある実施形態では、対象の分析物は核酸である。この組成物の一部の実施形態では、対象の分析物はタンパク質である。
【００２８】
関連の実施形態において、本発明は、
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸分子の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結しており、Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、Ｄは対象の核酸分子の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、Ｂ及びＤの１つのみが、対象の核酸分子の類似体に連結し、Ｂが対象の核酸分子の類似体に連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象の核酸分子の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の類似体に連結している。］
を含む、試料における対象の核酸分子を検出するための組成物を提供する。
【００２９】
ある実施形態では、対象の核酸分子はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。ある実施形態では、対象の核酸分子はリボ核酸（ＲＮＡ）である。
【００３０】
一部の実施形態において、本発明は、
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質の類似体に連結するか、又は対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結し、Ｃは対象のタンパク質を含むことがある試料であり、Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結するか、又は対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結する磁性ビーズであり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。但し、Ｂ及びＤの１つのみが、対象のタンパク質の類似体に連結し、Ｂが対象のタンパク質の類似体に連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象のタンパク質の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結している。］
を含む、試料における対象のタンパク質を検出するための組成物を提供する。
【００３１】
更なる実施形態は、本発明のある方法を行い、本発明のある組成物を形成するのに有用なキットを提供する。一部の実施形態において、本発明は、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分と；このＥＣＬ部分を含む第１の担体であって、対象の分析物の類似体に連結するか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結する第１の担体と；対象の分析物の類似体に連結するか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーに連結する第２の担体とを含む、試料における対象の分析物を検出するためのキットを提供する。
【００３２】
当業者であれば、ＥＣＬ部分の各々が異なる波長の光を放射するのであれば、上記に記載した方法、組成物、及びキットを含むあらゆる実施形態は、１つより多いＥＣＬ部分を含むこともできることを理解するであろう。例えば、試料における１つより多い分析物を検出するために、２つ以上のＥＣＬ部分を含む組成物、方法、及びキットを用いることができる。
【００３３】
当業者であれば、ＥＣＬ部分の各々が異なる波長の光を放射するのであれば、上記に記載した方法、組成物、及びキットを含むあらゆる実施形態は、１つより多いＥＣＬ部分を含むこともできることを理解するであろう。１つより多いＥＣＬ部分は、例えば、１つより多い分析物を検出することができる場合に有用である。
【００３４】
本発明のさらなる目的及び利点は以下の記載において一部述べられ、一部はその記載から自明であり、又は本発明の実施により習得することができる。本発明の目的及び利点は、添付する特許請求の範囲で特に指摘される成分及び組合せにより、実現され、達成されるであろう。
【００３５】
前述の全般的な記載も、以下の詳細な記載も、例示的及び説明的なものにすぎず、請求されるように本発明を限定するものではないことを理解されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
Ａ．定義
本明細書で用いられる「抗体」は、免疫グロブリン又はその一部分を意味し、起源、製造方法、又はその他の特徴に関係なく、抗原結合部位を含むあらゆるポリペプチドを包含する。この語は、例えば、ポリクローナルの、モノクローナルの、単一特異性の、多特異性の、ヒト化の、単鎖の、キメラの、合成の、リコンビナントの、ハイブリッドの、変異の、及びＣＤＲ移植の抗体を含む。抗体の一部分は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖなど、抗原と結合することができるあらゆるフラグメントを含むことができる。
【００３７】
本明細書で用いられる「対象の分析物」は、試料に見出される、ウィルスの細胞若しくは細胞の構成要素を含む、あらゆる分子、又は分子の集合体を意味する。試料に見出されるあらゆる分子のフラグメントも含まれる。対象の分析物は、有機化合物、有機金属化合物、又は無機化合物であってもよい。対象の分析物は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ベクター、若しくはオリゴヌクレオチド）、タンパク質（例えば、抗体、抗原、受容体、受容体リガンド、若しくはペプチド）、リポタンパク質、糖タンパク、リボ−若しくはデオキシリボ核タンパク質、ペプチド、多糖類、リポ多糖類、脂質、脂肪酸、ビタミン、アミノ酸、薬剤化合物（例えば、トランキライザー、バルビツレート類、アヘン剤、アルコール、３環系抗うつ薬、ベンゾジアゼピン類、抗ウィルス薬、抗真菌抗生物質、ステロイド類、強心配糖体、若しくは前記のあらゆるものの代謝物）、ホルモン、成長因子、酵素、補酵素、アポ酵素、ハプテン、レシチン、基質、細胞代謝物、細胞の構成要素又は細胞小器官（例えば、膜、細胞壁、リボソーム、染色体、ミトコンドリア、若しくは細胞骨格成分）でもよい。毒素、殺虫剤、除草剤、及び環境汚染物質もこの定義に含まれる。この定義は、この定義内に述べた例の任意の１つ又は複数を含む複合体を更に含む。
【００３８】
本明細書で用いられる「対象の分析物の類似体」は、特異的結合パートナーに結合するのに、対象の分析物と競合する物質を意味する。対象の分析物の類似体は、試料に存在する対象の分析物と特異的結合パートナーに結合するのに競合するために添加されている、既知量の対象の分析物それ自体であってもよい。
【００３９】
本明細書で用いられる「担体」は、１つ又は複数の固体又は液体の封入物質を意味する。担体は、有機又は無機の化合物を含むことができ、試料を提示するため、特異的結合パートナーを提示するため、又はＥＣＬ部分を含む又は捕捉するための少なくとも１つのために用いることができる。担体は、後に更に詳しく記載する。
【００４０】
本明細書で用いられる「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「含まれる（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）」は、ＥＣＬ部分と担体とが相互に物理的に接触しているが必ずしも相互に付着しているとは限らないような、担体の内部とＥＣＬ部分との間の非特異的な関係を意味する。本発明のある実施形態では、担体内に含まれているＥＣＬ部分は、担体に連結することができる。ある実施形態では、担体内に含まれているＥＣＬ部分は、担体に連結しない。含む／含まれるは、「包まれる（ｅｎｃａｓｅｄ）／包む（ｅｎｃａｓｉｎｇ）」及び「捕捉される（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）／捕捉する（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）」と交換可能に用いられる。
【００４１】
本明細書で用いられる「ハイブリダイズする」は、適切な条件下での第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間での２本鎖の形成を意味する。一部の実施形態では、適切な条件は、厳密な条件であることができる。厳密な条件は、配列依存であり、異なる状況では異なる。配列が長くなるほど、より高温で特異的にハイブリダイズする（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．、及びＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。一般的には、厳密な条件は、規定されたイオン強度及びｐＨでの特異的配列に対する熱融解点（Ｔｍ）よりも低い約５℃が選択される。Ｔｍは、標的の配列に相補的なポリヌクレオチドの５０％が、（規定されたイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下で）平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。典型的には、厳密な条件は、ｐＨ７．０から８．３において、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより低く、典型的には約０．０５から１０Ｍナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、温度は、短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃で、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを超える）では少なくとも約６０℃である。厳密な条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加でも実現することができる。溶液のホルムアミド濃度が１％上昇するごとに、ＤＮＡ２本鎖のＴｍは約０．７℃低下する。
【００４２】
ハイブリダイゼーションは、１００％相補的であるポリヌクレオチド間で、即ち、２本鎖の核酸の２本の鎖間にミスマッチがない場合に起こることができる。ハイブリダイゼーションは、２本鎖の核酸の２本の鎖間にミスマッチがある場合にも起こることができる。本明細書で用いられる相補的なハイブリダイゼーションは、２本鎖の核酸の２本のハイブリダイズした鎖間にせいぜい１つのミスマッチが存在する場合の、２本の鎖の核酸の間のハイブリダイゼーションを意味する。
【００４３】
本明細書で用いられる「連結した（ｌｉｎｋｅｄ）」は、２つの部分の間の直接の共有結合（ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ）、２つの部分の間の直接の非共有結合（ｄｉｒｅｃｔ ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ）、及び１つ若しくは複数の更なる部分により媒介される２つの部分の間の間接的総合を包含する。例えば、２つの部分の間の直接の共有結合は、２つのアミノ酸の間のアミド結合を含むことができ、２つの部分の間の直接の非共有結合は、塩を形成する金属と塩基との間のイオン性相互作用、又は２つの水分子間の水素結合を含むことができる。１つ若しくは複数の更なる部分により媒介される２つの部分の間の間接的結合は、Ｉｇ融合タンパク質などの融合タンパク質、及びＴＮＶ受容体などの受容体を含むことができ、この場合、ＩｇとＴＮＦ受容体との間の結合は、ＩｇにもＴＮＦ受容体にも元来存在しない短いアミノ酸配列などのリンカーにより媒介される。
【００４４】
「連結した（ｌｉｎｋｅｄ）」は、対象の分析物により媒介される結合（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ）を包含しない。
【００４５】
本明細書で用いられる「磁化」は、物質の透磁性が自由空間のものと異なる場合の物質の特性を意味する。この語は常磁化、及び超常磁化を含む。
【００４６】
本明細書で用いられる「核酸」は、１本鎖又は２本鎖の形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。典型的には、１本鎖の核酸は１００を超える塩基を含み、２本鎖の核酸は１００を超える塩基対を含む。「核酸」は、天然に存在するヌクレオチドを含む核酸、及び基準の核酸に類似の結合特性を有する天然のヌクレオチドの類似体を含む核酸を包含する。核酸は、遺伝子によりコードされるｃＤＮＡ又はｍＲＮＡも含む。核酸は、相補的塩基対形成により、例えば、水素結合により、その相補体にハイブリダイズすることができる。
【００４７】
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」は、通常１００塩基長以下の１本鎖の核酸を意味する。勿論、相補的なオリゴヌクレオチドをアニールして２本鎖のポリヌクレオチドを形成することができる。本明細書で用いられるように、オリゴヌクレオチドは、天然の（即ち、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、若しくはＵ）又は修飾された塩基を含むことができる。更に、オリゴヌクレオチドにおける塩基は、鎖間の塩基対形成を妨害しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合により結びつけられることができる。したがって、例えば、オリゴヌクレオチドは、成分の塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合により結びついているペプチド−核酸であることができる。（例えば、Ｎｉｅｌｓｏｎ、２００１年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２巻、１６頁を参照されたい）。当業者であれば、オリゴヌクレオチドは、プローブ配列との完全な相補性を欠く配列とハイブリダイズすることができ、本明細書に記載する方法を用いて完全に相補的である結合と完全に至らない相補的な結合とを区別することができることを理解するであろう。場合により、オリゴヌクレオチドは、放射性同位元素、発色団、ルミフォア（ｌｕｍｉｐｈｏｒｅ）、色素原、又はＥＣＬ部分で直接標識することができ、又は、例えば、それに対してストレプトアビジン又はアビジン複合体が後で結合することができるビオチンで間接的に標識することができる。
【００４８】
本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」は、２ヌクレオチドより多く、１００ヌクレオチドよりも少ないヌクレオチドで構成されるポリマーを意味する。
【００４９】
本明細書で用いられる「試料」は、生物系に由来し、又はそれを起源とするあらゆる検体を意味する。生物系は、生態系（例えば、水、空気、若しくは土壌の検体）、又は生物体（例えば、植物、動物、菌類、細菌、他の原核生物若しくは真核生物）、又はウィルス、又はプリオンを含む。試料は、対象の分析物を含むことができる。試料は、単離された、例えば、精製された、対象の分析物も含むことができる。
【００５０】
本明細書で用いられる「特異的結合パートナー」は、生理学的条件下で第２の分子と比較的安定な複合体を形成することができる第１の分子を意味する。一般的に、特異的結合は、相対的に高い親和性と、相対的に低度から中等度の受容能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）とを特徴とする。非特異的結合は、通常、中等度から高度の受容能力と共に、低い親和性を有する。通常、親和性定数Ｋａが約１０６Ｍ−１より高く、又は、１０８Ｍ−１より高い場合に、結合が特異的とみなされる。結合定数が高くなるほど親和性が大きくなることが示され、したがって特異性が大きくなる。抗体は、通常、１０６Ｍ−１から１０９Ｍ−１又はより高い親和性定数で抗原に結合する。必要に応じて、非特異的結合は、結合条件を変化させることにより、特異的な結合に実質的に影響を及ぼさないで減少させることができる。このような条件は当技術分野では知られており、当業者であればルーチンの技術を用いて好適な条件を選択することができる。この条件は、例えば、分子濃度、溶液のイオン強度、温度、結合に与えられる時間、非関連の分子（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などに関して、規定することができる。
【００５１】
特異的結合パートナーの例には、相補的な核酸配列（例えば、相互にハイブリダイズする２つのＤＮＡ配列、相互にハイブリダイズする２つのＲＮＡ配列、又は相互にハイブリダイズするＤＮＡ及びＲＮＡの配列）、抗体と抗原、受容体とリガンド（例えば、ＴＮＦとＴＮＦｒ−１、ＣＤ１４２とＶＩＩａ因子、Ｂ７−２とＣＤ２８、ＨＩＶ−１とＣＤ４と、ＡＴＲ／ＴＥＭ８若しくはＣＭＧと炭疽菌毒素の防御抗原部分）、酵素と基質、又は分子と結合タンパク質（例えば、ビタミンＢ１２と内性因子、葉酸と葉酸結合タンパク質）が含まれる。特異的結合パートナーは、天然に存在する特異的結合パートナーの類似体であることもできる。類似体の例には、ＨＩＶの逆転写酵素に結合するヌクレオチドの類似体であるアジドチミジン（ＡＺＴ）、アミノアシル−ｔＲＮＡの末端のアミノアシルアデノシンの類似体であるピューロマイシン、及びテトラヒドロ葉酸の類似体であるメトトレキセートが含まれる。他の類似体は、対象の分析物の誘導体であることができる。
【００５２】
Ｂ．電気化学発光物質
ある実施形態では、本発明は、ＥＣＬを用いて試料における対象の分析物の検出をもたらす。ＥＣＬ部分は、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射の繰り返し放射が引き起こされ得る、あらゆる化合物であることができる。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、共反応化合物の存在下で電磁放射の繰り返し放射が引き起こされ得る。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、金属が、例えば、ルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、パラジウム、モリブデン、及びテクネチウムから選択される金属含有有機化合物を含むことができる。本発明の一部の実施形態では、金属はルテニウム又はオスミウムである。金属は、例えば、それだけには限定されない、セリウム、ジスプロシウム、エルビウム、ユーロピウム、ガドリニウム、ホルミウム、ランタン、ルテチウム、ネオジム、プラセオジム、プロメチウム、テルビウム、ツリウム、及びイッテルビウムを含む希土類金属から選択することもできる。本発明のいくつかの実施形態では、金属はセリウム、ユーロピウム、テルビウム、又はイッテルビウムである。
【００５３】
本発明のある実施形態によると、本発明による金属含有ＥＣＬ部分は、式Ｍ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓを有し、式中、Ｍは金属であり、ＰはＭの多座配位子であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、及びＬ６はＭの配位子であり、その各々が互いの配位子と同一でも異なってもよく、ｍは１以上の整数であり、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、及びｓは、ゼロ以上の整数であり、Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、及びＬ６はＥＣＬ部分を誘発して電磁放射を放射する組成物及び番号であり、Ｍの配位子により提供される結合の総数はＭの配位数に等しい。
【００５４】
本発明の一部の実施形態では、Ｍはルテニウムである。本発明の一部の実施形態では、Ｍはオスミウムである。
【００５５】
本発明のある実施形態では、ＥＣＬ部分は、Ｍの１つの多座配位子を有する。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、１つより多い多座配位子を有する。１つより多いＭの多座配位子を含む実施形態では、多座配位子は同一でも異なってもよい。多座配位子は、芳香族及び脂肪族の配位子を含む。適切な芳香族の多座配位子は、芳香族複素環配位子を含み、例えば、ビピリジル、ビピラジル（ｂｉｐｙｒａｚｙｌ）、ターピリジル（ｔｅｒｐｙｒｉｄｙｌ）、１，１０フェナントロリン、及びポルフィリンなどの含窒素でもよい。
【００５６】
適切な多座配位子は、非置換でもよく、当技術分野で知られている多数の置換基のあらゆるものにより置換されていてもよい。適切な置換基には、例えば、アルキル、置換されているアルキル、アリール、置換されているアリール、アラルキル、置換されているアラルキル、カルボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グアニジウム、ウレイド、マレイミド、イオウ含有基、リン含有基、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエステルが含まれる。
【００５７】
更に、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、及びＬ６の少なくとも１つは、多座の芳香族複素環配位子であることができる。更に、これらの多座の芳香族複素環配位子の少なくとも１つは、窒素を含むことができる。適切な多座配位子には、それだけには限定されないが、ビピリジル、ビピラジル、ターピリジル、１，１０フェナントロリン、ポルフィリン、置換されているビピリジル、置換されているビピラジル、置換されているターピリジル、置換されている１，１０フェナントロリン、又は置換されているポルフィリンが含まれる。これらの置換されている多座配位子は、アルキル、置換されているアルキル、アリール、置換されているアリール、アラルキル、置換されているアラルキル、カルボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノアルボニル（ａｍｉｎｏａｒｂｏｎｙｌ）、アミジン、グアニジウム、ウレイド、マレイミド、イオウ含有基、リン含有基、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエステルで置換されていてもよい。
【００５８】
本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、その各々がビピリジル、ビピラジル、タービリジル、１，１０フェナントロリン、置換されているビピリジル、置換されているビピラジル、置換されているターピリジル、又は置換されている１，１０フェナントロリンであることができる２つの二座配位子を含むことができる。
【００５９】
本発明のある実施形態では、ＥＣＬ部分は、その各々がビピリジル、ビピラジル、ターピリジル、１，１０フェナントロリン、置換されているビピリジル、置換されているビピラジル、置換されているターピリジル、又は置換されている１，１０フェナントロリンであることができる３つの二座配位子を含むことができる。ＥＣＬ部分は、ルテニウムを含むことができる。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分はルテニウム、２つの二座ビピリジル配位子、及び１つの置換されている二座ビピリジル配位子を含むことができる。
【００６０】
本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、ポルフィリン又は置換されているポルフィリンなどの四座配位子を含むことができる。
【００６１】
ＥＣＬ部分は、１つ又は複数の単座配位子を有することができるが、様々な単座配位子が当技術分野では知られている。適切な単座配位子には、例えば、一酸化炭素、シアン化物、イソシアン化物、ハロゲン化物、並びに、脂肪族、芳香族、及び複素環の、ホスフィン、アミン、スチビン、及びアルシンが含まれる。
【００６２】
このＥＣＬ部分のある実施形態は、ビス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）、及びトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）を含む。
【００６３】
１つ又は複数のＭの配位子が、例えば、放射性同位元素、蛍光の構成成分、又は更なる蛍光のルテニウム若しくはオスミウム含有中心などの、更なる化学標識に付着していることは、本発明の範囲内である。
【００６４】
本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ホウ酸塩である。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、ビス［（４，４’−カルボメトキシ）−２，２’−ビピリジン］２−［３−（４−メチル−２，２’−ビピリジン−４−イル）プロピル］−１，３−ジオキソランルテニウム（ＩＩ）である。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’ビピリジン）［４−（ブタン−１−アル）−４’−メチル−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）である。本発明の更なる実施形態では、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’−ビピリジン）［４−（４’−メチル−２，２’−ビピリジン−４’−イル）−酪酸］ルテニウム（ＩＩ）である。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、（２，２’−ビピリジン）（シス−ビス（１，２−ジフェニルホスフィノ）エチレネル）｛２−［３−（４−メチル−２，２’−ビピリジン−４’−イル）プロピル］−１，３−ジオキソラン｝オスミウム（ＩＩ）である。本発明のまた更なる実施形態では、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’−ジピリジン）［４−（４’メチル−２，２’−ビピリジン）−ブチルアミン］ルテニウム（ＩＩ）である。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’−ビピリジン）［１−ブロモ−４（４’−メチル−２，２’−ビピリジン−４−イル）ブタン］ルテニウム（ＩＩ）である。本発明のまた更なる実施形態では、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２’−ビピリジン−４’−ブチルアミドルテニウム（ＩＩ）である。
【００６５】
本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は金属を含まず、例えば、ルブレン、又は９，１０−ジフェニルアントラセンであることができる。
【００６６】
一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、担体に含まれていてもよく、包まれていてもよい。担体に包まれ、又は吸着されているＥＣＬ分子の数は、ＥＣＬ分子のサイズ、及び担体のサイズによる。担体は、ＥＣＬ分子を、１×１０２〜１×１０２０、１×１０２〜１×１０１５、１×１０４〜１×１０１２、１×１０２〜１×１０１０、１×１０６〜１×１０１０、又は１×１０６〜１×１０９個含むことができる。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は、担体に含まれ、又は包まれ、例えば、共有結合若しくは非共有の相互作用により、担体の表面に結合していることができる。
【００６７】
本明細書で用いられる「ＥＣＬ共反応化合物」は、本発明では、それ自体、又はその電気化学的還元酸化生成物のいずれかによりＥＣＬ反応系列で役割を果たす化学化合物に関係する。
【００６８】
ＥＣＬ共反応化合物は、しばしばＥＣＬを産生するためのより簡単な手段の使用（例えば、２段階の酸化−還元サイクルの半分だけの使用）、及び／又はＥＣＬ強度の向上を可能にする。一部の実施形態では、共反応化合物は、電気化学的酸化／還元の際に、直接又は更なる反応の際のいずれかに、溶液に強力な酸化種又は還元種を生じる化学化合物であってよい。共反応化合物は、不可逆的に電解還元されて酸化性のＳＯ４・−イオンを形成するペルオキソ二硫酸塩（即ち、Ｓ２Ｏ８２−、過硫酸塩）であってよい。共反応化合物は、不可逆的に電解酸化されて還元性のＣＯ２・−イオンを形成するシュウ酸塩（即ち、Ｃ２Ｏ４２−）であってもよい。還元性物質として働くことができる共反応化合物のクラスは、アミン、又はアミン基を含む化合物であり、例えば、トリ−ｎ−プロピルアミン（即ち、Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）３、ＴＰｒＡ）を含む。一部の実施形態では、四級アミンは二級アミンよりも良好な共反応化合物であることができる。一部の実施形態では、二級アミンは一級アミンよりも良好な共反応化合物であることができる。
【００６９】
共反応化合物には、それだけには限定されない、リンコマイシン、クリンダマイシン−２−リン酸、エリスロマイシン、１−メチルピロリドン、ジフェニドール、アトロピン、トラゾドン、ヒドロフルメチアジド、ヒドロクロロチアジド、クリンダマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、レセルピン、トリメチルアミン、トリ−ｎ−ブチルホスフィン、ピペリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、フェニラミン、ブロモフェニラミン、クロロフェニラミン、ジフェニルヒドラミン、２−ジメチルアミノピリジン、ピリラミン、２−ベンジルアミノピリジン、ロイシン、バリン、グルタミン酸、フェニルアラニン、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、チロシン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン、メチオニン、スレオニン、セリン、シクロチアジド、トリクロルメチアジド、１，３−ジアミノプロパン、ピペラジン、クロロチアジド、ヒドラジノタラジン（ｈｙｄｒａｚｉｎｏｔｈａｌａｚｉｎｅ）、バルビツール酸、過硫酸、ペニシリン、１−ピペリジニルエタノール、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、エチレンジアミン、ベンゼンスルホンアミド、テトラメチルスルホン、エチルアミン、ジ−エチルアミン、トリ−エチルアミン、トリ−イソ−プロピルアミン、ジ−ｎ−プロピルアミン、ジ−イソ−プロピルアミン、ジ−ｎ−ブチルアミン、トリ−ｎ−ブチルアミン、トリ−イソ−ブチルアミン、ビ−イソ−ブチルアミン、ｓ−ブチルアミン、ｔ−ブチルアミン、ジ−ｎ−ペンチルアミン、トリ−ｎ−ペンチルアミン、ｎ−ヘキシルアミン、硫酸ヒドラジン、グルコース、ｎ−メチルアセトアミド、ホスホノ酢酸、及び／又はそれらの塩が含まれる。
【００７０】
共反応化合物には、それだけには限定されないが、Ｎ−エチルモルホリン、スパルテイン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、トリエタノールアミン、ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、１，４−ジアゾビシクロ（２．２．２）オクタン、エチレンジアミン四酢酸、シュウ酸、１−エチルピペリジン、ジ−ｎ−プロピルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラプロピル−１，３−ジアミノプロパン；ＤＡＢ−ＡＭ−４、ポリプロピレンイミンテトラアミンデンドリマー；ＤＡＢ−ＡＭ−８、ポリプロピレンイミンオクタアミンデンドリマー；ＤＡＢ−ＡＭ−１６、ポリプロピレンイミンヘキサデカアミンデンドリマー；ＤＡＢ−ＡＭ−３２、ポリプロピレンイミンドトリアコンタアミンデンドリマー；ＤＡＢ−ＡＭ−６４、ポリプロピレンイミンテトラヘキサコンタアミンデンドリマー；３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、グリシル−グリシン、２−モルホリノエタンスルホン酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２”−ニトリロトリエタノール、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）タウリン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）水和物、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）二水和物、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）、及び／又はこれらの塩も含まれる。
【００７１】
本発明によるＥＣＬ測定は、アセトニトリルなどの有機溶剤で、部分的な水系で、又は水系で行うことができる。ＥＣＬ部分の電気化学的還元に適する電極は、例えば、Ｐｔ電極、又はＰｔとＩｒとの合金からなる電極であることができる。
【００７２】
Ｃ．担体
ある実施形態において、本発明は、対象の分析物の検出に用いることができる、第１及び第２の担体を提供する。第１及び第２の担体は、試料の提示、特異的結合パートナーの提示、ＥＣＬ部分の包み込み又は捕捉、及び対象の分析物と特異的結合パートナーとの間に形成された複合体を組成物の他の構成成分から分離するための手段の提供を含む、いくつかの機能の少なくとも１つを果たすことができる。
【００７３】
第１及び第２の担体のいずれかは、ＥＣＬ部分を含むことができる。ある実施形態では、ＥＣＬ部分は担体に含まれ得る。ＥＣＬ部分は担体中に含まれるので、本発明は、例えば、溶剤の性質など、ある一定の条件を変えることにより、ＥＣＬ部分の担体からの容易な放出をもたらす。ある実施形態、例えば、担体がプラスチックなどの材料から構成されている固体支持体である場合には、ＥＣＬ部分は担体中に配合されない。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は担体の表面に共有結合し、担体中に含まれ得る。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は担体中に含まれ、担体の表面に吸着され得る。第１の担体は、任意選択で、対象の分析物を含む試料から構成され得る。ある実施形態では、試料は第１の担体の表面に結合することができ、したがって、第１の担体を特異的結合パートナーに対し結合可能にする。しかし、ある実施形態では、試料は第１又は第２の担体のいずれにも結合することができない。この実施形態では、試料は溶液中であることができる。
【００７４】
ある実施形態では、第１の担体又は第２の担体のいずれかは、対象の分析物の特異的結合パートナーを含むことができる。特異的結合パートナーは、第１の担体の表面に結合することができ、それにより、第１の担体を対象の分析物への結合に対し到達可能にしている。
【００７５】
第２の担体を含む本発明の実施形態では、第２の担体は対象の分析物の特異的結合パートナーを含むことができる。特異的結合パートナーは、第２の担体の表面に結合することができ、それにより第２の担体を対象の分析物への結合に対し到達可能にしている。第２の担体は、対象の分析物と特異的結合パートナーとの間に形成された複合体を分離するための手段を含むことができる。ある実施形態では、第２の担体は、対象の分析物と特異的結合パートナーとの間に形成された複合体を、組成物の他の構成成分から分離する手段を提供することができる。例えば、第２の担体は、対象の分析物と特異的結合パートナーとの間に形成された複合体をマグネットを用いて組成物の他の構成成分から分離できるように磁性であることができる。本発明のある実施形態では、複合体を組成物の他の構成成分から分離するのに用いられるマグネットは、例えば、米国特許第５９３５７７９号及び第６３２５９７３号に記載されているように、電気化学的エネルギーをシステム中に導入するのに用いることができる電極に隣接して位置させることができる。
【００７６】
ある実施形態では、第１及び第２の担体の少なくとも１つは、固体支持体であってよい。一部の実施形態では、第１の担体と第２の担体の両方が固体支持体である。固体支持体は、粒子（即ち、少なくとも１つの寸法が長さ１０００マイクロメートルを超えるポリマー）、ナノ粒子（即ち、少なくとも１つの寸法が長さ１〜１０００ナノメートルの範囲の長さであるポリマー）、又はミクロ粒子（即ち、少なくとも１つの寸法が長さ１０００ナノメートルを超えるが１０００マイクロメートル以下であるポリマー）を含むことができる。ある実施形態では、固体支持体は、例えば、球形、立方体、円錐形などの、不規則な形状及び規則的な形状の両方を含む３次元の形状を有することができる。
【００７７】
固体支持体は、ビーズ、ゲル、又は膜を含むことができる。膜は、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、又はカルボキシル化ポリビニリデン（米国特許第６０３７１２４号）を含むことができる。膜は、塩化ポリビニルベンジルジメチルヒドロキシエチルアンモニウム、塩化ポリビニルベンジルベンゾイルアミノエチルジメチルアンモニウム、塩化ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウム、塩化ポリビニルベンジルトリヘキシルアンモニウムと塩化ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムとの共重合体、塩化ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムと塩化ポリビニルアミノエチルジメチルアンモニウムとの共重合体、及び塩化ポリビニルベンジルフェニルウレイドエチルジメチルアンモニウムと塩化ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムとの共重合体（米国特許第５３３６５９６号）でコーティングされていてもよい。固体支持体は、対象の分析物の特異的結合パートナー及び／又は試料に結合していることができ（例えば、ポリスチレン、セファロース、セファデックス）、並びに／或いはＥＣＬ部分を含み、又は捕捉することができるあらゆる材料を含むことができる。固体支持体は、ポリアクリリック、ビニルポリマー、アクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアシロニトリル（ｐｏｌｙａｃｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）、及びポリオレフィンなどの、あらゆる合成の有機ポリマーを含むことができる。固体支持体は、炭水化物ポリマー、例えば、アガロース、セルロース、ヒアルロン酸、キチン、アシルジェラン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルキチン、ポリ（ラクチド−ｃｏ−エチレングリコール）を含むこともできる。固体支持体は、シリカ、ジルコニア、例えば、カーボン被覆ジルコニア（米国特許第５１８２０１６号）、チタニア、セリア、アルミナ、マンガン、マグネシア（即ち、酸化マグネシウム）、酸化カルシウム、細孔性ガラス（ＣＰＧ）などの無機酸化物を含むことができる。固体支持体は、それだけには限定されないが、デキストラン−アクリルアミドを含む上記に記載した支持体のいくつかの組合せも含むことができる。固体支持体は、特異的結合パートナー及び／又は対象の分析物との非特異的な相互作用を最小にするように調製することができる。
【００７８】
第１又は第２の担体の少なくとも１つが固体支持体であるある実施形態では、固体支持体は、水性の環境に不溶であるが、有機の環境、例えば、アセトニトリル、エーテル、クロロホルム、ベンゼンに可溶であることができる。ＥＣＬ部分が捕捉され、又は別の方法でそのような固体支持体に結びつけられる実施形態では、ＥＣＬ部分は、有機の環境に固体支持体を置くことにより放出されることができ、その結果、ＥＣＬ部分の検出を促進する。有機の環境は、有機溶剤７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜９９％、９９〜９９．９％（容積／容積）である溶剤を含むことができる。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態では、第１又は第２の担体の少なくとも１つは、融点の範囲が３０℃〜６０℃であるゲル、例えば低融点アガロースである。これらの実施形態では、ＥＣＬ部分を含む担体の融点を超えて複合体を加熱することにより、ＥＣＬ部分を放出し、それにより検出が促進される。
【００８０】
ある実施形態では、固体支持体はビーズ、例えばポリスチレンビーズである。第１の担体も第２の担体もビーズである実施形態では、第１の担体は、その中に含まれ、又は捕捉されているＥＣＬ部分を有することができ、第２の担体は、磁化ビーズであることができる。ＥＣＬ含有ビーズも磁化ビーズも、直径が０．１μｍ〜１００μｍ、０．５μｍ〜５０μｍ、１μｍ〜２０μｍ、又は０．５μｍ〜１０μｍの範囲であることができる。一部の実施形態では、第１の担体の直径は１０μｍであり、第２の担体の直径は１μｍであってよい。一部の実施形態では、第１の担体の直径は１０μｍであり、第２の担体の直径は２．８μｍであることができる。
【００８１】
本発明のある実施形態では、担体の少なくとも１つは、液体を含むことができる。液体は、少なくとも１つの両親媒性の分子を含むことができる。両親媒性の分子は、極性の部分も非極性の部分も有し、水性の環境でミセルなどの凝集体を形成することができるものである。したがって、ミセルは、パルミテート又はオレエートなどのあらゆる脂肪酸のイオンから構成され得る。ミセルは、１つ又は複数の非イオン性界面活性剤、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、又はオクチル−β−グルコシドを含むことができる。ミセルは、１つ又は複数のイオン性界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコレート、リゾレシチンを含むことができる。一部の実施形態では、ミセルは、イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤の両方を含むことができる。
【００８２】
したがって、ある実施形態では、第１及び第２の担体の少なくとも１つはミセルであることができる。ミセルでは、対象の分析物がミセルの表面に曝され、したがって、特異的結合パートナーが対象の分析物と接触できるように試料に結合することができる。ＥＣＬ部分は、ミセルの内部中に含まれ得る。従って、例えば、撹拌若しくは超音波処理、又は酸化若しくは還元により、ミセルを破壊することで、ＥＣＬを放出し、対象の分析物の検出を促進する手段が提供されるであろう。
【００８３】
ある実施形態では、担体はリポソームであることができる。リポソームは、リン脂質を水和した際に形成する微小な球状の粒子である。リン脂質を、低いせん断条件下、水中で混合すると、リン脂質はそれ自体をシート状に配列し、分子は「頭」を上に「尻尾」を下にした配向のように並んで整列する。次いで、これらのシートは、尻尾同士で結びついて、中心が水性で表面がリン脂質の、２重層膜を形成する。リポソームは、均一のサイズ、例えば直径２００ｎｍを有することができる。リポソームは、界面活性剤又は他の乳化剤を使用しないで、水溶性の物質と水不溶性の物質とを、配合物で一緒に用いることを可能にしている。水溶性の材料を、リン脂質が水和している水に溶解し、リポソームが形成するとこれらの材料が水性の中心に捕捉される。リポソーム壁はリン脂質の膜であり、油などの脂溶性の材料を保持している。リポソームは、安定化した天然リン脂質の混合物、合成の同一鎖のリン脂質、糖脂質含有リポソーム、２極性の脂肪酸、ｘ−結合した、リポタンパク質コーティングした、又は炭水化物コーティングしたメチル／メチレンから構成され得る。試料を、リポソームの表面上に提示して、特異的結合パートナー又は試料の結合を促進することができる。リポソームは、その中に（即ち、水性の中心に、又は周囲の脂質に）ＥＣＬ部分を含むことができる。例えば、米国特許第６７０６８６１号を参照されたい。
【００８４】
Ｄ．試料又は特異的結合パートナーを担体に連結する方法
対象の分析物又は特異的結合パートナーを含む試料を、当技術分野では知られている手段により担体に連結することができる。例えば、タンパク質及び核酸には、架橋試薬を用いることができる（Ｌｕｎｄら、１９８８年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６巻、１０８６１頁）。同様に、核酸及びタンパク質の両者には、光反応性の架橋試薬が用いられている（Ｐｅｎｃｈｏｖｓｋｙら、２０００年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８巻（２２）、９８頁；Ｈａｒｒｉｓｏｎら、１９８９年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８巻、６０２３頁）。好適な手段の選択は、試料の性質、及び担体の性質による。結合は、例えば、共有結合、非共有の相互作用、例えば、静電気相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は水素結合によることができる。試料を担体に結合する方法の選択は、当業者の通常の技能の範囲内にある。
【００８５】
ある実施形態では、配位子は、配位子上の特別な官能基（例えば、一級アミン、スルフヒドリル、カルボン酸、アルデヒド）と担体上の反応基との間に共有化学結合を形成することにより、担体に固定、又は直接「連結」する。
【００８６】
それだけには限定されないが、リンカーとしてアビジン又はストレプトアビジンと共にビオチンを用いることを含む、他の結合方法も可能である。リンカーとして、ビオチン／アビジン ストレプトアビジンを用いる方法は、当技術分野では知られている（Ｗｉｌｃｈｅｋ及びＢａｙｅｒ編集、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８４巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９０年を参照されたい）。ある実施形態では、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いてビオチンのＮＨＳエステルを形成することができる。ビオチン残基を、それだけには限定されないが、リシン残基上の一級アミン、グルタミン酸残基若しくはアスパラギン酸残基上のカルボキシル部分、又はシステイン残基上のスルフヒドリル部分を含む様々な官能基に連結することができる。アビジンを、臭化シアン（ＣＮＢｒ）で担体を活性化した後、リジン上のアミノ基を介して担体に共有結合することができる。
【００８７】
ある実施形態では、試料又は結合パートナーは、担体の表面上に吸着されているにすぎないことがある。例えば、抗体は、ポリスチレンミクロスフェアの表面に吸着されていることがある。タンパク質が担体の表面に吸着しているのが望まれる実施形態では、最大の表面被覆面積（単層まで）を得るために、溶液のｐＨを、タンパク質の等電点に、又はそれよりもわずかに塩基性に調節することができる。希釈したミクロスフェア懸濁液（固体約１％）を用いると、確実に単一ミクロスフェアがコーティングされる。最終タンパク質濃度約０．１ｍｇ／ｍｌはタンパク質の単層を実現するのに通常十分であるが、その量の約３から約１０倍を添加することにより、好ましい化学量論、及び良好な結合のための推進力を確実にする。
【００８８】
担体の表面を修飾して、試料又は特異的結合パートナーの共有結合を促進することができる。表面が修飾されたポリマーミクロスフェアは、アクリル酸などの機能性モノマーの少量（約５％未満）でスチレンを共重合することにより作成されることが多く、これにより−ＣＯＯＨ基で覆われたミクロスフェアが得られる。他のモノマーを用いて、表面の化学的性質が異なる微粒子を調製することができ、例えば、米国特許第５５９９８８９号を参照されたい。
【００８９】
シリカミクロスフェアの表面上の天然のシラノール基は、水性の、又は溶剤ベースのシラン結合性物質と反応して、様々な表面官能基を有する、予め活性化されたシリカミクロスフェアを生じることができる。例として、クロロメチル、カルボキシル、及びアミノ基が含まれる。ＤＮＡ及びＲＮＡは、カオトロピック剤の存在下でシリカ上に吸着することができる。オリゴヌクレオチドは、表面を修飾されたシリカにその５’−アミノ末端を介して共有結合することができる。Ｂｏｏｍら、１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２８巻、４９５頁に記載されているように、脂質は、脂肪酸鎖上のカルボキシル基、及びシリカ上のプロピルアミン表面基により結合することができる。
【００９０】
対象の分析物、又は特異的結合パートナーは、ミセル中に組み込まれることができ、例えば、Ｓａｖｉｃら、２００３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３００巻、６１５頁；Ｍａｙｓｉｎｇｅｒら、２００１年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１５３９巻（３）、２０５頁を参照されたい。タンパク質の、界面活性剤ミセル中への可溶化及び再構成は、例えば、６Ｍ塩酸グアニジン（Ｇｄｎ・ＨＣｌ）のタンパク質溶液を過剰のリフォールディングバッファー（例えば、３％ジヘキサノイルホスファチジルコリン ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／０．６Ｍ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８．５）にゆっくりと希釈することにより、行うことができる。残余のＧｄｎ−ＨＣｌを除去した後、例えば、透析により、溶液を、限外ろ過を含む様々な技術により濃縮することができる。例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻、２３５８頁を参照されたい。
【００９１】
対象の分析物、又は特異的結合パートナーを、リポソーム中に組み入れることができる。タンパク質をリポソーム中に組み入れる多くの方法が知られている（例えば、Ｒｉｇａｕｄら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ Ｔｏｏｌｓ ｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、７１〜８８頁、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｈｉｌｉｐｐｏｔ，Ｊ．Ｒ．及びＳｃｈｕｂｅｒ編集、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、フロリダ州、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ（１９９５年）を参照されたい）。一例として、超音波処理器又はフレンチプレスなどの機械的手段を用いて、過剰のバッファーでリン脂質のフィルムを膨張させ、乾燥させることにより単層の粒子を生成することができる（Ｌｅｌｋｅｓら、１９８５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０巻、１７９６頁）。或いは、低濃度のコール酸塩又はリゾレシチンの触媒により、タンパク質を、予め形成されたリポソーム中に、自発的に組み入れることができる（Ｗｒｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈら、１９８７年、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、２４６巻（３）、７３７頁）。タンパク質は、また、リン脂質及び界面活性剤の存在下で、ともに可溶化されてミセルを形成することができ、その後、引き続き界面活性剤を除去する。大型のリポソームは、逆相の蒸発により調製し、様々な量のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、オクチルグルコシド、又はコール酸ナトリウムなどの界面活性剤で処理することができる。可溶化プロセスの各ステップで、タンパク質を加えることができる。タンパク質−リン脂質界面活性剤混合物を、次いで、ＳＭ２ Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓ処理に供して、界面活性剤を除去することができる（Ｒｉｇａｕｄら、１９８８年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７巻（８）、２６７７頁）。溶液中の膜タンパク質を準備し、予め形成したリポソームの溶液を準備し、混合物をインキュベートすることにより、膜タンパク質をリポソーム中に組み入れることができる。予め形成したリポソームの溶液を提供するステップの前に、リン脂質の混合物を、少なくとも１タイプの不飽和脂肪酸の溶液と組み合わせることによりリポソームを形成する（米国特許第６７０６８６１号）。当業者であれば、試料を担体に連結する、多くの更なる方法が存在することを理解するであろう。
【００９２】
Ｅ．ＥＣＬ部分を担体に装填する方法
ある実施形態では、ＥＣＬ部分は担体の表面に連結することができる。試料を担体に連結することに関して上記に記載した方法を、同様に、ＥＣＬ部分を担体に連結するのに用いることができる。担体が固体支持体、例えばビーズである場合は、ＥＣＬ部分は、例えば、共有結合、非共有の相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は水素結合により、担体の表面に結合することができる。
【００９３】
本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分は有機溶剤に可溶であるが、水性溶剤に不溶である。ＥＣＬ部分を有機溶剤に溶解し、次いで、多数の担体粒子、例えば、ポリスチレンなどの疎水性材料で構成されているビーズと混合することができる。ＥＣＬ部分を含んでいる有機溶剤は、担体の孔を浸透し、有機溶剤が蒸発する際に、ＥＣＬ部分は担体の内部に捕捉され、又は包まれるようになる。ビーズが水性溶剤に溶媒和する場合は、殆ど又は全てのＥＣＬ部分は、担体中に包まれたままである。ある実施形態では、担体はポリスチレンビーズである。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分を含む溶液でゲルを形成することにより、ＥＣＬ部分をゲル中に組み入れることができる。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分を含む溶液でミセルを形成することにより、ＥＣＬ部分をミセル中に組み入れることができる。一部の実施形態では、ＥＣＬ部分を含む溶液でリポソームを形成することにより、ＥＣＬ部分をリポソーム中に組み入れることができる。
【００９４】
一部の実施形態では、ＥＣＬ部分を、周囲の媒体への実質的な損失なしに、担体の内側に捕捉させることができる。ＥＣＬ部分の周囲の液相への損失は、調製中及び使用中に望まれないことがある。ＥＣＬ部分を捕捉する担体の能力は、分配係数と呼ばれる重要な物理的定数により本質的に表すことができる。分配係数は、Ｋ＝Ｃ担体／Ｃ液体であり、この場合Ｃ担体は、担体で吸収された部分の濃度であり、Ｃ液体は、吸収されない部分の濃度である。
【００９５】
２相の系（担体と液体と）では、分配係数が１を超える部分は、担体相を優先することを示している。分配係数の値が高いということは、担体相を強く優先することを示している。それとは反対に、分配係数が１未満である部分は液相を優先する。初期に担体中に高レベルのＥＣＬ部分のあった分配係数の低い系は、周囲の液相に部分を失うであろう。
【００９６】
一部の実施形態では、担体と水性溶剤との間の分配係数は約２を超える。一部の実施形態では、担体と水性溶剤との間の分配係数は約１０を超える。一部の実施形態では、担体と水性溶剤との間の分配係数は約１００を超える。高い分配係数を実現するために、いくつかの化学的及び物理的デザインが存在する。（１）部分が担体にクーロン引力により保持され得る。このような場合には、ＥＣＬ部分は正味の正の電荷を有し、担体は正味の負の電荷を有する。（２）一部の実施形態では、ＥＣＬ部分の可溶性は、担体相においてずっと大きいことがある。例えば、ＥＣＬ部分は水に可溶ではなく、親油性のポリスチレンの担体に可溶である。（３）一部の実施形態では、顕微鏡的で見た担体の多孔性は部分の直径よりも小さいので、ＥＣＬ部分は担体中に捕捉されることができる。（４）一部の実施形態では、部分は共有結合により担体に結合され得る。
【００９７】
Ｆ．対象の分析物を検出する方法
本発明は、試料中に含まれている対象の分析物を検出する様々な方法を提供する。本発明の一部の実施形態では、対象の分析物は、第１の担体などの担体に連結することができる。対象の分析物は担体の表面上に存在し、したがって特異的結合パートナーへのその接近を促進する。一部の実施形態では、対象の分析物は、いかなる担体とも連結することができない。一部の実施形態では、対象の分析物は溶液に存在することができる。
【００９８】
本発明の方法は、対象の分析物に特異的に結合することができる少なくとも１つの特異的結合パートナーを提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの特異的結合パートナーは、担体に連結することができる。この実施形態では、試料は第２の担体に連結することができる。
【００９９】
一部の実施形態では、少なくとも１つの特異的結合パートナーは、対象の分子に特異的に結合することができる結合タンパク質であることができる。結合パートナーは担体に連結することができる。この実施形態では、試料は第２の担体に連結することができる。
【０１００】
一部の実施形態では、少なくとも１つの特異的結合パートナーは、対象の分析物に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチド又は核酸であることができる。結合パートナーは、担体に連結することができる。この実施形態では、試料は第２の担体に連結することができる。
【０１０１】
一部の実施形態では、本発明は、２つの特異的結合パートナー、即ち、そのどちらも対象の分析物に特異的に結合する第１及び第２の特異的結合パートナーを提供する。２つの特異的結合パートナーは、どちらも担体に連結することができる。したがって、ある実施形態では、第１の特異的結合パートナーは第１の担体に連結することができ、第２の特異的結合パートナーは第２の担体に連結することができる。この実施形態では、試料はいかなる担体にも連結することができない。同一の特異的結合パートナーが第１の担体にも第２の担体にも連結することができることも企図される。一部の実施形態では、対象の分析物に特異的に結合しているポリクローナル抗体は、第１の担体にも第２の担体にも連結することができる。一部の実施形態では、対象の分析物は、モノクローナル抗体が認識するエピトープの複数のコピー（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｐｉｅｓ）を含むことがあり、又は、分析物が核酸である場合には、第１の担体にも第２の担体にも連結するプローブが認識する配列の複数の反復を含むことがある。ある実施形態では、少なくとも１つの特異的結合パートナーは、抗体とすることができる。特異的結合パートナーは両者とも抗体とすることも企図される。本発明は、１つの特異的結合パートナーが抗体であり、第２の特異的結合パートナーが特異的結合タンパク質である実施形態も包含する。
【０１０２】
一部の実施形態では、少なくとも１つの特異的結合パートナーは、試料における対象の分子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとすることができる。抗体と同様に、特異的結合パートナーを両者とも、試料における対象の分子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又は他の核酸とすることが企図される。
【０１０３】
ＥＣＬ部分は、例えば、紫外吸収、赤外吸収、及び蛍光発光などの、発光及び吸光の分光光度法；原子吸光、アノーディックストリッピングボルタメトリーなどの電気化学的方法；中性子放射化、及び化学的方法を含めた、当技術分野ではよく知られている方法により検出することができる。ある実施形態では、光ルミネセンス、化学ルミネセンス、及び電気化学ルミネセンスの方法を用いる。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分を誘発して電磁放射を放射させ、放射された電磁線を検出することにより、化学的部分の存在を検出することができる。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分を誘発して、試薬の混合物を電磁的、化学的、又は電気化学的エネルギーに曝すことにより電磁放射を放射させることができる。本発明の一部の実施形態では、ＥＣＬ部分を誘発して、試薬の混合物を化学的又は電気化学的エネルギーに曝すことにより、電磁放射を放射させることができる。ある実施形態では、ＥＣＬ部分を検出する助けに、共反応化合物、例えばＴＰｒＡを加える。
【０１０４】
発光技術を用いて、非常に低濃度のＲｕ（ｂｐｙ）３２＋を測定することができる。酸化還元法を用いると、５×１０−８Ｍの濃度のＲｕ（ｂｐｙ）３２＋を検出することが可能である。シュウ酸ナトリウム（１ｍＭ）のリン酸バッファー溶液ｐＨ５．０を０から＋１．４ボルトのパルスのポテンシャル対５から１０秒の間隔の飽和カロメル基準電極とともに用いることができる。１８ｍＭ Ｎａ２Ｓ２Ｏ８及び０．１Ｍテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムテトラフルオロボレートのＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（１：１ｖ／ｖ）溶液を用いると、１０−１３Ｍほどに低い濃度のＲｕ（ｂｐｙ）３２を検出することができる（例えば、米国特許第６１４０１３８号、第５７３１０８９号、第５７１４０８９号を参照されたい）。
【０１０５】
本発明は、
（ａ）式
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、Ｂは、Ａと関連している（対象の分析物の特異的結合パートナーに連結する）第１の担体であり、Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、Ｂは対象の分析物の結合パートナーにより対象の分析物に連結し、Ｄは対象の分析物に直接連結するか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーを介して対象の分析物に連結する第２の担体であり、ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］を有する複合体を形成するステップと、
（ｂ）（ａ）で形成された複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の分析物の存在を検出するステップと
を含む、対象の分析物を検出するためのアッセイにおいて、ＥＣＬ部分を使用するための方法も提供する。
【０１０６】
ある実施形態では、本発明の方法は、競合的結合アッセイ、例えば、競合的阻害アッセイであることができる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｅｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１年を参照されたい）。このアッセイの一部の実施形態では、既知量の対象の分析物又は対象の分析物の類似体を、ＥＣＬ部分を含まない担体、例えば磁性ビーズと連結することができる（「連結する」は、共有結合も非共有結合も含む）。対象の分析物に対する結合パートナーは、第２の担体、例えば、ＥＣＬ部分を含まないポリスチレンビーズと連結することができる。追加した対象の分析物の非存在下では、第１の担体に連結する対象の分析物と、第２の担体に連結する対象の分析物に対する結合パートナーとの間に複合体が形成され、第１の担体を第２の担体に効果的に連結する。この複合体に関連しているＥＣＬ部分の量を、当技術分野では周知の技術により測定することができる。次いで、第２の担体が連結する結合パートナーに対する結合について、担体が連結した対象の分子と競合させることにより、試料における対象の分析物の存在を、形成される複合体の量を減少させるその能力により検出することができる。ある実施形態では、試料における対象の分析物の量を、既知量の対象の分子を含む試料を用いて、検量線と比べて定量することができる。
【０１０７】
一部の実施形態では、本発明は、対象の分析物を検出するための、サンドイッチ型の結合アッセイを提供する。本アッセイの一部の実施形態では、対象の分析物の第１の結合パートナーは、第１の担体、例えば磁性ビーズに連結することができる。対象の分析物の第２の結合パートナーは、第２の担体、例えばＥＣＬ部分を含むことができるポリスチレンビーズに連結することができる。対象の分析物を含む試料の存在下では、第１の担体も第２の担体も含む複合体を形成することができる。この複合体と関連するＥＣＬ部分の量は、試料における対象の生物学的材料の量と比例し、当技術分野で知られている技術により測定することができる。ある実施形態では、試料における対象の分析物の量は、既知量の対象の分子を含む試料を用いて検量線で比べて定量することができる。
【０１０８】
一部の実施形態では、本発明は、試料における対象の分析物を検出するための直接結合方法を提供する。本方法の一部の実施形態では、試料における分子は、第１の担体、例えば磁性ビーズに連結することができる。対象の分析物の結合パートナーは、第２の担体、例えばＥＣＬ部分を含むことができるポリスチレンビーズに連結することができる。試料が対象の分析物を含む場合は、第１の担体も第２の担体も含む複合体を形成することができる。この複合体と関連するＥＣＬ部分の量は、試料における対象の生物学的材料の量と比例し、当技術分野では知られている技術により測定することができる。ある実施形態では、試料における対象の分析物の量は、既知量の対象の分子を含む試料を用いて検量線で比べて定量することができる。
【０１０９】
これらのタイプの結合アッセイに対する多くの変形は、当業者には知られており、本発明の方法と互換性がある。
【０１１０】
存在するＥＣＬ部分の量を定量するための方法は多く存在する。システムへのエネルギー投入量の割合により、ＥＣＬ部分の測定をもたらすことができる。適切な測定には、例えば、ＥＣＬ部分が電気化学的に励起された場合の電流の測定、ＥＣＬ部分が化学的に励起された場合の還元剤又は酸化剤の利用の割合、又は光ルミネセンス技術における電磁エネルギーの吸収の測定が含まれる。ＥＣＬ部分は、放射された電磁放射を測定することにより検出することもできる。これらの測定は全て、継続的な、レートベースの（ｒａｔｅ−ｂａｓｅｄ）測定として、又は長時間にわたりシグナルを蓄積する累加法として行うことができる。レートベースの測定は、光電子増倍管、フォトダイオード、又は入射光強度に対する大きさに比例する電流を生成するフォトトランジスターを用いて行うことができる。累加法は、レートベースのデータの積分、又は蓄積性のデータを直接提供する写真フィルムの使用を伴うことがある。
【０１１１】
本発明は、対象の分析物、少なくとも１つの担体、及びＥＣＬ部分を含む複合体の単離も提供する。一部の実施形態では、例えば、少なくとも１つの担体が磁性ビーズである場合は、磁場を用いて複合体を分離することができる。一部の実施形態では、複合体の分離は、沈殿により、例えば、複合体の質量が個々の構成成分の質量を超える場合には重力の力により実現することができる。一部の実施形態では、フィルターを用いて、複合体を組成物の他の構成成分から分離することができる。フィルターは、例えば、複合体を保持するのに十分小さいが、非複合の材料を通過させるのに十分大きい孔のサイズを有する。一部の実施形態では、サイズ排除カラムを用いて、複合体を分離することができる。複合体を、組成物の他の構成成分から区別する他の性質、例えば、疎水性、又は他の結合パートナーに対する親和性も用いることができる。
【０１１２】
Ｇ．疾患及び病状
ある実施形態では、対象の分析物は、疾患又は病状に関連するマーカーであることができる。本発明は、したがって、疾患又は病状に関連するマーカーを検出し、それにより、疾患又は病状を有する対象を診断する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、疾患又は病状に関連するマーカーの存在又は量をモニターすることにより、疾患又は病状の進行をモニターする方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は疾患又は病状に関連するマーカーの存在又は量をモニターすることにより疾患又は病状を処置するのに用いられる治療法の有効性をモニターするための方法を提供する。
【０１１３】
疾患又は病状には、感染性物質（例えば、細菌、真菌、寄生体、ウィルス、又はプリオン）により引き起こされる感染性疾患が含まれ得る。細菌の病原体の例には、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）、Ｂ群溶血レンサ球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が含まれる。ウィルス感染の例には、天然痘、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ライノウィルス、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）、麻疹、ポリオ、単純ヘルペスウィルス１型（ＨＳＶ−１）、及び単純ヘルペスウィルス２型（ＨＳＶ−２）が含まれる。寄生体の例には、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、及びランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）が含まれる。
【０１１４】
疾患は、癌、又は自己免疫疾患であってもよい。対象の分析物であることができる様々な癌に関連するマーカーには、メラノーマの変異体サイクリン依存性キナーゼ４、メラノーマのｐ１７タンパク質、メラノーマのｇｐ１００、メラノーマのメラノーマ関連抗原１（ＭＡＲＴ−１）（Ｍｅｌａｎ−Ａ）（ＰＣＴ公開ＷＯ第９４／２１１２６号）、メラノーマのｐ１５タンパク質、メラノーマのチロシナーゼ（ＰＣＴ公開ＷＯ第９４／１４４５９号）、メラノーマのメラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）１、２、及び３、甲状腺髄様、小細胞肺癌、結腸及び／又は気管支の扁平上皮細胞癌（ＰＣＴ／ＵＳ第９２／０４３５４号）、メラノーマ関連抗原−Ｘｐ（ＭＡＧＥ−Ｘｐ）（米国特許第５５８７２８９号）、膀胱、メラノーマ、乳房、及び扁平上皮細胞の癌腫のＢメラノーマ抗原（ＢＡＧＥ）（米国特許第５５７１７１１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ９５／００１５９号）、Ｇ抗原（ＧＡＧＥ）（米国特許第５６１００１３号及びＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０３４２２号）、腎臓腫抗原（ＲＡＧＥ）ファミリー（米国特許第５９３９５２６号）、メラノーマで優先的に発現される抗原（ＰＲＡＭＥ）（以前のＤＡＧＥ、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０５７７号）、メラノーマユビキトス変異タンパク質（ｍｅｌａｎｏｍａ ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｍｕｔａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＵＭ−１／ＬＢ−３３Ｂ）（米国特許第５５８９３３４号）、神経芽細胞腫増幅タンパク質（ＮＡＧ）（米国特許第５８２１１２２号）、ＦＢ５（エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ））（米国特許第６２１７８６８号）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）（米国特許第５９３５８１８号）、メラノーマのｇｐ７５、メラノーマの癌胎児性抗原、乳房、膵臓、及び卵巣癌のムチンなどの炭水化物／脂質、メラノーマのＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、癌腫の変異型ｐ５３などの癌遺伝子、結腸癌の変異型ｒａｓ、赤芽球性白血病ウィルス性癌遺伝子ホモログ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、乳癌のプロトオンコジーン、並びに子宮頸及び食道の扁平上皮細胞癌のヒトパローマウィルスタンパク質などのウィルス生成物が含まれる。自己免疫疾患に関連するマーカーには、全身性エリテマトーデスに関連するクロマチンに特異的に結合する抗体、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）対立遺伝子ＤＲ２（多発性硬化症に関連する）の存在、ＤＲ３（グレーブス病に関連する）又はリウマチ性関節炎に関連するＤＲ４（Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１年）が含まれる。
【０１１５】
Ｈ．キット
ある実施形態では、本発明は、試料における対象の分析物を検出するためのキットを提供する。キットは、少なくとも１つのＥＣＬ部分を含む第１の担体と、第２の担体と、第１及び第２の担体の少なくとも１つに連結する対象の分析物の特異的結合パートナーの少なくとも１つと、少なくとも１つの容器と、場合により指示書とを含むことができる。ある実施形態では、キットは２つ又はそれを超えるＥＣＬ部分を含むことができる。
【実施例】
【０１１６】
化学物質及び材料：
Ａｌｄｒｉｃｈ（ウィスコンシン州、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）より入手した、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）二塩化物六水和物（Ｒｕ（ｂｐｙ）３Ｃｌ２・６Ｈ２Ｏ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ、９９％）、テトラフルオロホウ素銀（ＡｇＢＦ４、９８％）、及びトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ、９９＋％）；Ｂｏｕｌｄｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（コロラド州、Ｍｅａｄ）より入手した、リチウムテトラキス（ペンタフルオロフェニル）ホウ酸塩（Ｌｉ［（Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４）］ｎＥｔ２Ｏ、ｎ＝２〜３）；Ｆｌｕｋａ（ウィスコンシン州、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）から入手した、テトラブチルアンモニウムテトラフルオロボレート（（ＴＢＡ）ＢＦ４、電気化学グレード）；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）から入手した、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ、超高純度）；Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）より入手した、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、フルオレセインビオチン（９０％）、１−メチルイミダゾール、及びＤＮＡハイブリダイゼーションバッファー（ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（登録商標）プラス）；ＥＭ（ニュージャージー州、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ）より入手した、水酸化ナトリウム（ＧＲ）、塩酸（ＧＲ）、塩化ナトリウム（ＧＲ）、エチルエーテル（無水）、アセトニトリル（ＨＰＬＣ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、ＧＲ）、及びエチレンジニトリロテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ（イリノイ州、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）より入手した、アビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）、Ｄ−ビオチン（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（登録商標））、及びビオチン−ＰＥＯ−ＬＣ−アミン；並びにＦｉｓｈｅｒ（ニュージャージー州、Ｆａｉｒｌａｗｎ）より入手した、メタノール（分光分析用グレード）は、別段の記載がなければ更に精製しないで使用した。ポリスチレンカルボキシレート微粒子／ビーズ（ＰＳＢ、直径１０μｍ、ビーズ６．５×１０４個／μＬの２．６％（ｗ／ｗ）水性懸濁液）、及びストレプトアビジンコーティングした超常磁性ポリスチレンビーズ（磁性ビーズ又はＭＢと呼ぶ、（ａ）直径１．０μｍ、約９．５×１０６ビーズ／μＬで１０ｍｇ／ｍＬの水性懸濁液、（ｂ）直径２．８μｍ、約６．５×１０５ビーズ／μＬで１０ｍｇ／ｍＬの水性懸濁液）を、それぞれＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ社（ペンシルベニア州、Ｗａｒｉｎｇｔｏｎ）及びＤｙｎａｌＢｉｏｔｅｃｈ社（ニューヨーク州、Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ）から購入した。炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈａｃｉｓ）（Ｂａ８１３）に由来する合成の２３−ｍｅｒ１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドは、Ｑｉａｇｅｎ Ｏｐｅｒｏｎ（カリフォルニア州、Ａｌａｍｅｄａ）から入手し、以下の配列を有しており、：（ａ）プローブ、５’−［ビオチン−ＴＥＧ］−ＡＡＣＧＡ ＴＡＧＣＴ ＣＣＴＡＣ ＡＴＴＴＧ ＧＡＧ−３’（ｐ−ｓｓ−ＤＮＡ、Ｍ．Ｗ．＝７６１７ｇ／ｍｏｌ；配列番号：１）；（ｂ）標的又は相補的、５’−［ビオチン−ＴＥＧ］−ＣＴＣＣＡ ＡＡＴＧＴ ＡＧＧＡＧ ＣＴＡＴＣ ＧＴＴ−３’（ｔ−ｓｓＤＮＡ、Ｍ．Ｗ．＝７６０８ｇ／ｍｏｌ；配列番号：２）；（ｃ）非相補的、５’−［ビオチン−ＴＥＧ］−ＴＴＡＡＣ ＡＣＣＴＴ ＡＧＣＧＡ ＣＧＧＣＴ ＡＧＴ−３’（ｎｃ−ｓｓＤＮＡ、Ｍ．Ｗ．＝７５９３ｇ／ｍｏｌ；配列番号：３）、及び（ｄ）２塩基対ミスマッチのオリゴマー配列、５’−［ビオチン−ＴＥＧ］−ＣＴＣＣＡ ＡＡＣＧＴ ＡＧＧＡＧ ＴＴＡＴＣ ＧＴＴ−３’（２−ｂｐ−ｍ−ｓｓＤＮＡ；配列番号：４）、この場合、ビオチンＴＥＧはトリエチレングリコールをベースにした１６原子混合の極性スペーサーを含み、ビオチン化したＤＮＡと、表面を制限されたアビジン／ストレプトアビジン相互作用との間の立体障害を減少させるために用いられた。別段の記載がなければ、溶液は全て、１８ＭΩ−ｃｍ脱イオン化Ｍｉｌｌ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州、Ｂｅｄｆｏｒｄ）で新たに調製した。
【０１１７】
ＥＣＬ及び電気化学的測定
直径２．２ｍｍのＰｔディスク、作用電極として直径２．０ｍｍのＡｕ又は直径３．０ｍｍのグラッシーカーボン（ＧＣ）ディスク、対電極としてＰｔワイヤー、及び基準電極としてＡｇ／Ａｇ＋（１０ｍＭ ＡｇＢＦ４及び５０ｍＭ ＴＢＡＢＦ４のＭｅＣＮ溶液）の、３電極セルシステムを用いた。各実験の前に、電極は全て慎重に清浄にした。清浄ステップには、作用電極をコーミック（ｃｈｏｍｉｃ）酸溶液中に浸すステップと、０．０５μｍアルミナスラリー（Ｂｕｅｈｌｅｒ Ｌｔｄ．、イリノイ州、Ｌａｋｅ Ｂｌｕｆｆ）で磨くステップと、大量の水で洗浄するステップと、ＭｅＣＮですすぐステップと、多孔性のＶｙｃｏｒチップとガラスチューブとを基準電極に置き換えるステップが含まれる。５ｍＬの使い捨てのガラスバイアルを、電気化学的セルとした。ＥＣＬシグナルがＲｕ（ｂｐｙ）３２＋の汚染されたシステムから生成される可能性を除外するために、必要に応じて真新しいガラス器具及び電極を用いた。サイクリックボルタモグラム（ＣＶ）とともにＥＣＬ強度を、電気化学的セルの下に設置した光電子増倍管（ＰＭＴ、ＨａｍａｍａｔｓｕＲ４２２０ｐ、日本）と組み合わせた自家製のポテンシオスタットで同時に測定した。高電圧供給電力（Ｂｅｒｔａｎ Ｈｉｇｈ Ｖｏｌｔａｇｅ Ｃｏｒｐ．、Ｓｅｒｉｅｓ２２５、ニューヨーク州、Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ）で、ＰＭＴに７５０Ｖの電圧を供給した。
【０１１８】
別段の記載がなければ、測定は全て、２０±２℃の温度で行った。
【０１１９】
（実施例１）
Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋含有ＥＣＬ標識の合成
本試験では、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ホウ酸塩（Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２）をＥＣＬ標識として用いた、というのは、次項で示すように、この複合体は適切な有機溶液を用いてポリスチレンビーズ中に効果的に充填することができ、水性溶液におけるビーズの一連の修飾の間中ビーズ中の捕捉を維持することができるからである。換言すれば、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２は、有機溶剤に十分可溶であるが、水性溶液には完全に不溶である。ＥＣＬ標識としてＲｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２を選択した別の理由は、複合体のＲｕ（ｂｐｙ）３２＋部分のＥＣＬ効率は非常に高いという事実であった。Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２は、水中でＲｕ（ｂｐｙ）３Ｃｌ２とＬｉ［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］ｎＥｔ２Ｏ（ｎ＝２〜３）との間のメタセシス反応により調製される。沈殿物を水で洗浄し、アセトニトリル／水溶液から再結晶し、真空下で乾燥させる。
【０１２０】
（実施例２）
共反応化合物としてＴＰｒＡを用いた、ＭｅＣＮにおけるＲｕ（ｂｐｙ）３２＋の電気化学的及びＥＣＬの挙動
０．１０μＭ Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２の、０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４電解質−０．１０Ｍ ＴＰｒＡ共反応化合物含有ＭｅＣＮ溶液の、Ｐｔ電極での、スキャン速度５０ｍＶ／ｓでのサイクリックボルタンメトリー及びＥＣＬの応答を、図４に示す。ＴＰｒＡは、約０．５ＶｖｓＡｇ／Ａｇ＋のポテンシャルで酸化し始め、約０．７５ＶｖｓＡｇ／Ａｇ＋で最大の酸化のピークを示す（図４ａ）。電極が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋がＲｕ（ｂｐｙ）３３＋に酸化される１．１ＶｖｓＡｇ／Ａｇ＋よりも陽性のポテンシャルをスキャンされる場合に（図４ｃ）、ＥＣＬが生成される（図４ｂ）。ＥＣＬ強度は、ポテンシャルの上昇とともに継続的に上昇し、最終的に、約７００ｍＶの半波長幅の幅広いピーク及び約１．６ＶｖｓＡｇ／Ａｇ＋のピークポテンシャルを形成する。リバーススキャンの際は、より大きいＥＣＬ強度、及び同様のピーク位置が観察される。ＥＣＬのピークポテンシャルは、ＴＰｒＡの非存在下でのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋の酸化ポテンシャルと比べるとよりポジティブであるので、Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋の酸化ポテンシャルは、ＴＰｒＡの存在下でポジティブにわずかにシフトすることができることを留意されたい（図４ｂ及びｃ）。予想通り、Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋複合体の対イオンにおける変化、例えば、Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４−からＣｌＯ４−への変化は、ＥＣＬの挙動を変化させなかった。ａμＭレベルのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋を用いた場合にＴＰｒＡ・＋とＲｕ（ｂｐｙ）３＋との反応時の励起状態のＲｕ（ｂｐｙ）３２＋・の形成により（Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋とＴＰｒＡ・との反応により形成された）ＴＰｒＡ酸化のポテンシャル領域に前値波のＥＣＬが現れる水溶液の場合とは対照的に（Ｍｉａｏ、Ｃｈｏｉ、及びＢａｒｄ、２００２年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２４巻、１４４７８頁）、顕著な対応するＥＣＬシグナルはＭｅＣＮにおいては見られなかった。これが示唆するのは、本実験条件下では、ＭｅＣＮにおけるＴＰｒＡ・＋の寿命は中性の水溶液におけるよりも短く、又はＴＰｒＡ・＋は、Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋をＲｕ（ｂｐｙ）３２＋＊に酸化するほどエネルギー的に十分強力ではないということのいずれかである。これとは別に、我々の結論は、共反応化合物としてＴＰｒＡを用いて水溶液で展開したＥＣＬのメカニズムは、ＭｅＣＮにおいて効果があるということである。
【０１２１】
ＴＰｒＡの濃度の関数としてのＥＣＬ強度を図５ａに示すが、この場合ＥＣＬ強度の最も高い領域は、ＴＰｒＡ濃度３０ｍＭに対応する。予測されるように、水性溶液におけるＥＣＬ−ｐＨ依存性の試験に基づいて（Ｌｅｌａｎｄら、１９９０年、Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１３７巻、３１２７頁）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）をＲｕ（ｂｐｙ）３２＋／ＴＰｒＡ／ＭｅＣＮ溶液中に添加すると、溶液の酸度が変化するので、ＥＣＬ強度が変化する（図５ｂ）。１００ｍＭ ＴＰｒＡを５５ｍＭ ＴＦＡＡと組み合わせると、最大のＥＣＬ応答が得られた。
【０１２２】
用いた電極の材料によっても、ＥＣＬ強度及び安定性も影響を受けた。Ｐｔ及びＡｕ電極は、同様の応答を示し、ＥＣＬはいくつかのポテンシャルサイクル（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｙｃｌｅｓ）にわたり安定で、Ａｕ電極に比べると、Ｐｔ電極では見られた光電流密度はわずかに小さかった。しかし、ＧＣ電極では、第１のポテンシャルサイクルのフォワードスキャンのみが光を生成した。ＧＣ電極を磨いた後で、光は再び発生し、このことは電極の表面が何かの種類のフィルムにより阻止されていたことを示唆していた。０．１０μＭ Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２−０．１０μＭ ＴｐｒＡ−０．０５５Ｍ ＴＦＡＡ−０．１Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４を含むＭｅＣＮから、スキャン速度５０ｍＶ／ｓで０と３．０ＶｖｓＡｇ／Ａｇ＋の間の第１ポテンシャルサイクルの間中、Ａｕ、Ｐｔ、及びＧＣ電極で得られた相対的ＥＣＬ強度の比率は、１００：９３：６１であった。
【０１２３】
興味深いことに、Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋が非存在であっても、０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４を含むＴＰｒＡのアセトニトリル溶液も、ＥＣＬシグナルを生成することができる（図６ａ）。蒸留によるＴＰｒＡ及びＭｅＣＮの精製、（ＴＢＡ）ＢＦ４から（ＴＢＡ）ＣｌＯ４への電解質の変更、又は新たに開封した電気化学グレードの電極の使用、真新しいガラス器具及び電極の使用、並びにＰｔ対電極を黒色プラスチックの層のコーティング又はそれなしのガラスチューブでの被覆では、結果は変わらなかった。ＥＣＬのピークポテンシャル値は、２．１ＶｖｓＡｇ／Ａｇ＋であり、０．１０μＭ Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋の存在下で得られた値に比べると５００ｍＶのシフトである（図４ｂ）。先に図５ａで示したように、ＴＰｒＡの非存在下では、０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４を含むＴＲｕ（ｂｐｙ）３２＋のＭｅＣＮ溶液は、ポジティブのポテンシャルのみに対してのスキャンでは同じ強度スケールに対して観察可能なＥＣＬ応答は得られなかった。したがって、図６ａに示すＥＣＬシグナルは、ＴＰｒＡを起源とするに違いなく、おそらくはＴＰｒＡ・のフリーラジカルに関連する電荷移行反応逆光電子放出（ＣＴＲＩＰ）によるものである（Ｍｕｒａｋｏｓｈｉら、１９９２年、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、４５９３頁；Ｕｏｓａｋｉら、１９９１年、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９５巻、７７９頁；Ｕｏｓａｋｉら、１９９０年、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、７巻、１１５９頁：Ｍｃｌｎｔｙｒｅら、１９８７年、Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｆａｃ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．、２２８巻、２９３頁；Ｍｃｌｎｔｙｒｅら、１９８６年、Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．、５６巻、６５１頁；Ｍｃｌｎｔｙｒｅら、１９８５年、Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｆａｃ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．、１９６巻、１９９頁；Ｍｕｒａｋｏｓｈｉら、１９９３年、Ｃｏｎｄｅｎ Ｍａｒ Ｍａｔｅｒ．Ｐｈｙｓ．、４７巻、２２７８頁；Ｏｕｙａｎｇ及びＢａｒｄ、１９８８年、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９２巻、５２０１頁；Ｏｕｙａｎｇ及びＢａｒｄ、１９８７年、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９１巻、４０５８頁）。図６ａから得られた、積分したＥＣＬ強度は、図４ｂから得られたものの約１２％であり、ＴＰｒＡの非存在下で０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４／ＭｅＣＮ溶液から測定した残余の光電流は有意に少ないので、意義深いものである（図６ｄ）。バックグラウンドのＴＰｒＡ関連のＥＣＬシグナルは、ＴＦＡＡを溶液に加えることにより劇的に抑制され（図６ｂ）、「不要な」シグナルの更なる消失は、１％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏの０．１０Ｍ ＴＰｒＡ−０．０５５Ｍ ＴＦＡＡ−０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４ＭｅＣＮ溶液中への添加により実現した（図６ｃ）。図６ｅは、図６ａからｄまでから得られた相対的なＥＣＬ強度を示している。
【０１２４】
（実施例３）
ＥＣＬ標識のポリスチレンビーズ中への充填
直径１０μｍのポリスチレンカルボキシレートビーズをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ５４１５Ｄ遠心機（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ、ニューヨーク州、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ）１０ｋｒｐｍ５分間で、好適な容積（０．１０〜１．０ｍＬ）の２．６％（ｗ／ｗ）ポリスチレンビーズ懸濁液から分離し、次いで、水１ｍＬで１回洗浄した。
【０１２５】
ビーズを、６０℃の真空下で１時間乾燥し、その後１．５ｍＬのＥＣＬ標識Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２−飽和（０．７ｍＭ）５％ＴＨＦ−９５％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）溶液を、ＰＳＢを含む２ｍＬの微小遠心管中に加えた。混合物を、Ｄｙｎａｌサンプルミキサー（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）で２０ｒｐｍで２時間回転させ、その後遠心分離し、５０％ＭｅＯＨ−５０％Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）で２回洗浄した。得られた、Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢと呼ばれる、ＥＣＬ標識含有の黄色がかったポリスチレンビーズを、６０℃の真空下で１時間更に乾燥した。上記の処理の経過中、ポリスチレンビーズは、５％ＴＨＦ−９５％ＭｅＯＨの有機溶剤を含むＥＣＬ標識でまず膨張し、水不溶のＥＣＬ標識をポリマーのマトリックス中に拡散させ、そこで有機溶剤が真空蒸発によりビーズから除去されるときに捕捉された。ＥＣＬ標識のポリスチレンビーズ中への効果的な充填は、Ｍａｇｎａｆｉｒｅ−Ｍｏｄｅｌ Ｓ９９８０６ Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ ＣＣＤカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ、ニューヨーク州、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ）と組み合わせたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ）で撮影した蛍光画像（図２ａ）により視覚的に証明することができる。ビーズ１個あたりＲｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２分子７．５×１０９個という典型的なローディングキャパシティー（ｌｏａｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）は、ＴＰｒＡを共反応化合物として用いて、Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢをＭｅＣＮ及び標準のＲｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２溶液に溶解して得たＥＣＬのデータ、に基づいて概算された。
【０１２６】
（実施例４）
Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢの表面上へのアビジンの固定化
ビーズを０．１０Ｍ ＥＤＡＣ及び０．１０Ｍ ＮＨＳを含む、調製してすぐの２５μＭアビジンの０．１０Ｍ １−メチル−イミダゾールバッファー（ｐＨ７）溶液１．５ｍＬに浸漬し、混合物を約４０ｒｐｍで１時間回転することにより、Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−アビジンの形成により、アビジンの層を、Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢの表面に共有結合させた。Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンと呼ばれる、新たに形成された、アビジンでコーティングしたＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢを、５〜１０ｋｒｐｍで５分間反応溶液から遠心分離し、１ｍＬの「１×Ｂ＆Ｗバッファー」（１×バッファー＆洗浄溶液、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋０．５ｍＭ ＥＤＴＡ＋１．０Ｍ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。最終のＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン生成物を、出発のＰＳＢ懸濁液（０．１０〜１．０ｍＬ）と同じ容積を有し、使用まで約４℃に保っていた１×Ｂ＆Ｗバッファー溶液に再懸濁した。このようにして、Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンの調製中のビーズの損失はないと仮定して、約６．５×１０４Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンビーズ／μＬを概算することができる。図２ｂは、ビーズをフルオレセインビオチンと反応させた後のＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンの明緑色蛍光画像を示しており、高品質のアビジンの層がＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢの表面上に形成されたことを示唆している。これとは対照的に、「裸の」Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ上に非特異的に吸着されたフルオレセインビオチンは、非常に弱い蛍光画像を生成するにすぎない。Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンのビオチン化２３−ｍｅｒ ｓｓＤＮＡ（ｐ−ｓｓＤＮＡ）に対する結合能力は、フルオレセインビオチン滴定実験に基づくと、０．５６５ｎｍｏｌ（ｐ−ｓｓＤＮＡ）／ｍｇＰＳＢ又は１．４×１０８ｐ−ｓｓＤＮＡ分子／ビーズの値を有することが見出された（図１０及び以下の表１を参照されたい）。
【０１２７】
（実施例５）
ＭＢ及びＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンビーズの表面へのｓｓＤＮＡの結合
プローブＤＮＡ−ＭＢ複合体
プローブＤＮＡの担体として、直径１．０μｍ又は２．８μｍのストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズ（ＭＢ）を用いた。プローブＤＮＡ−ＭＢ複合体を形成するために、５．０μＬの１．０μｍＭＢ、又は１０．０μＬの２．８μｍＭＢを、最初に２ｍＬの微小遠心管中に移し、次いで、マグネット（Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）−Ｓ）でオリジナルの懸濁液から分離し、その後２００μＬの「２×Ｂ＆Ｗバッファー」（バッファー＆洗浄溶液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、２．０Ｍ ＮａＣｌ）で１回、２００μＬの１×Ｂ＆Ｗバッファーで２回洗浄した後、ビーズを２．５μＭのビオチン化ｐ−ｓｓＤＮＡ１００μＬに浸漬し、４０ｒｐｍで穏やかに回転しながら３０から６０分間インキュベートした。形成したプローブＤＮＡ−ＭＢ複合体を、引き続き分離し、２００μＬのＢ＆Ｗバッファーで３回洗浄し、以前の遠心管の壁面上への可能なプローブＤＮＡの吸着を避けるために新しい２ｍＬの微小遠心管に移し、２０μＬのハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁した。この方法で生成された複合体は、直径１．０μｍ及び２．８μｍのＭＢに対してそれぞれ、約２．５３及び１．１ｎｍｏｌｅ（ｐ−ｓｓＤＮＡ）／ｍｇ（ビーズ）、又はビーズ１個あたり１．６×１０６及び１０×１０７個のｐ−ｓｓＤＮＡ分子の飽和プローブのＤＮＡ付着量を有していた（図１０及び表１を参照されたい）。
【表１】
【０１２８】
標的のＤＮＡ−Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン複合体
好適な濃度のビオチン化ｔ−ｓｓＤＮＡ（１．０×１０−８から１．０×１０−１５Ｍ）１００μＬ、又は１．０×１０−９Ｍの非相補的−ｓｓＤＮＡ（ｎｃ−ｓｓＤＮＡ）及び２塩基対ミスマッチのｓｓＤＮＡ（２−ｂｐ−ｍ−ｓｓＤＮＡ）を、約６．５×１０４ビーズ／μＬ Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンの１×Ｂ＆Ｗバッファー溶液２５μＬに加え、２０ｒｐｍの回転速度で穏やかに混合しながら１時間インキュベートし、１×Ｂ＆Ｗバッファー２００μＬで２回洗浄し、３ｋ−５ｋ−１０ｋｒｐｍで５分間遠心分離し、ハイブリダイゼーションバッファー５０μＬに再懸濁した。
【０１２９】
（実施例６）
ＤＮＡハイブリダイゼーション及びＥＣＬ検出
新たに調製した標的のＤＮＡ−Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン複合体（実施例５）を、先に形成したプローブＤＮＡ−ＭＢ複合体（実施例５）を含む２ｍＬ遠心分離管に移した。好適な容積のハイブリダイゼーションバッファーを分離管中に加えて、ハイブリダイゼーション溶液の全容積を２００μＬにした。２０ｒｐｍで１時間穏やかに混合した後、プローブＤＮＡ−ＭＢ−標的ＤＮＡ−Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン凝集物を、遊離の非結合のＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンビーズを含む「溶液」から磁気的に分離し、２００μＬの１×Ｂ＆Ｗバッファーで３回穏やかに洗浄し、分離管の壁面上への遊離のＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンビーズの可能な吸着を最小にするために新しい遠心分離管中に慎重に移した。ＤＮＡハイブリダイゼーションの凝集物とともに、壁面上の遊離のＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンビーズがＭｅＣＮに溶解することもあるので、この種の非特異的な吸着により、著しく高レベルのバックグラウンドのＥＣＬが生成され得る。凝集物は、最終的に水２００μＬで洗浄し、後にＥＣＬを測定するために０．５０ｍＬの０．１０Ｍ ＴＰｒＡ−０．０５５Ｍ ＴＦＡＡ−０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４ＭｅＣＮ溶液に溶解した。ＤＮＡハイブリダイゼーションの後、プローブＤＮＡ−ＭＢ−標的ＤＮＡ−Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン凝集物の形成は、図３に示すＳＥＭ画像により明らかに証明することができ、この場合、プローブＤＮＡも相補的なＤＮＡも濃度は５μＭであり、ＭＢ／ＰＳＢの初期比率＝２９であり、ＭＢ及びＰＳＢのサイズは、それぞれ１．０μｍ及び１０μｍであった。
【０１３０】
ＥＣＬ強度と、１０ｎＭから１．０μＭの濃度範囲のＲｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２との間の線形の関係は、１％の水を加えた０．１０Ｍ ＴＰｒＡ−０．０５５Ｍ ＴＦＡＡ−０．１０（ＴＢＡ）ＢＦ４ＭｅＣＮで見られた。同じ実験条件下で、ＥＣＬ強度と、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２を充填した直径１０μｍのポリスチレンビーズの数との間にも、良好な相関が見られた（図７ｂ）。ビーズを０．５０ｍＬの電解質溶液に溶解して、ポリスチレンがＥＣＬシグナルを生成せず、又はＥＣＬシグナルに影響を及ぼさないことを実証した。図７ｂを７ａと比べると、２０のＲｕ（ｂｐｙ）３２＋を充填したビーズから生成される光の強度は、０．５ｎＭのＲｕ（ｂｐｙ）３２＋からの強度と等しい。ビーズのローディングキャパシティーは、このようにして、ビーズ１個あたり７．５×１０９Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２分子であると決定された。この結果は、「大量のビーズ」のＥＣＬ測定に基づいて得られたデータと一致していた。
【０１３１】
ＤＮＡハイブリダイゼーションのＥＣＬ検出のために、２セットの実験を計画した。第１の実験では、直径１．０μｍのＭＢを、ＭＢ対ＰＳＢビーズ比率２９で用いた。図８ａに示すように、この場合、ＥＣＬ強度は、１０ｐＭから１０ｎＭの範囲にわたり標的のＤＮＡ濃度に比例し、２塩基ミスマッチの２−ｂｐ−ｍ−ｓｓＤＮＡ及び非相補的なｎｃ−ｓｓＤＮＡは、相補的なＤＮＡハイブリダイゼーションから容易に区別することができる。図７に示す実施例と異なり、電解質溶液に水を加えなかったことを留意されたい、というのは新たに形成されたＭＢ−ＰＳＢ複合体及び微小遠心管はすでに十分な水を含んでいたからである。図８に示すＥＣＬ強度に対して、バックグラウンドを差し引かなかったことも留意されたい。ＭＢ対ＰＳＢの比率を低下させることにより、したがってＲｕ（ｂｐｙ）３２＋のｔ−ｓｓＤＮＡに対する増幅定数を増大することにより、ずっと低い濃度の標的ＤＮＡ濃度でのＤＮＡハイブリダイゼーションが検出可能でなければならない。以下に実証するように、直径１０μｍのＰＳＢ１個を、直径２．８μｍのＭＢ１個とともに引き出すことができる。その結果、ＤＮＡハイブリダイゼーションに関連するＥＣＬシグナルは非常に低い標的ＤＮＡ濃度で生じ、したがって、２．８μｍのＭＢと１０μｍのＰＳＢとが低い比率で存在する場合に検出可能であり得る。図８ｂは、２．８μｍＭＢ／１０μｍＰＳＢの比率＝４であるような例の結果を示している。ｔ−ｓｓＤＮＡは、１．０ｆｍｏｌほどに低い濃度で検出することができる。このような条件下でさえ、得られたＥＣＬ強度は、２−ｂｐ−ｍ−ｓｓＤＮＡ及びｎｃ−ｓｓＤＮＡのそれぞれの種の１．０ｎＭを用いた場合に、それらのＤＮＡハイブリダイゼーションから得られるものよりも大きく、したがってそれらと区別することができる。
【０１３２】
（実施例７）
ビオチン−ＰＥＯ−ＬＣ−アミンのポリスチレンカルボキシレートビーズへの付着、及びポアソン分布検定
ビオチン−ＰＥＯ−ＬＣ−アミン（Ｍ．Ｗ．＝４１８．６ｇ／ｍｏｌ）は、水に可溶性の架橋剤であり、２２．９Åのポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）ベースのスペーサーアームを用いて、ビオチンとアビジンとの相互作用の立体障害を低下させている（２００３〜２００４年、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ＆Ｃａｔａｌｏｇ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、２００３年）。ビオチン−ＰＥＯ−ＬＣ−アミン分子は、０．１０Ｍ ＥＤＡＣ−０．１０Ｍ ＮＨＳの０．１０Ｍ １−メチル−イミダゾールバッファー溶液（ｐＨ７）の存在下でポリスチレンカルボキシレートビーズの表面に、架橋剤の第１級アミン基とビーズのカルボキシル基との間にアミド結合を形成することにより、共有結合している。５ｍＭビオチン−ＰＥＯ−ＬＣ−アミンの１ｍＬを用いて、２．６％ＰＳＢ懸濁液の２５０μＬから分離したＰＳＢと反応させる。反応は、回転速度４０ｒｐｍで２時間行った。架橋剤が修飾したＰＳＢは、ＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−ＬＣ−ＰＥＯ−ビオチンと呼ばれ、引き続き分離され、１×Ｂ＆Ｗバッファー４００μＬで３回洗浄し、１×Ｂ＆Ｗバッファー２５０μＬに再懸濁し、次いで使用するまで４℃に保った。
【０１３３】
直径１０μｍのＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−ＬＣ−ＰＥＯ−ビオチンビーズを用いて、２つの異なるサイズのストレプトアビジン／ポリスチレンコーティング磁性ビーズ（直径１．０及び２．８μｍのＤｙｎａｌビーズ）で、ポアソン分布の測定を行った。何万個ものＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−ＬＣ−ＰＥＯ−ビオチンビーズを、同一の、又はより大きい数の１．０又は２．８μｍの磁性ビーズのいずれかと溶液で十分に混合する場合に、ＰＳＢのビオチンとＭＢのストレプトアビジンとの間の非可逆的な反応により、ＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−ＬＣ−ＰＥＯ−ビオチンビーズが粘着する確率を観察することができ、ポアソン分布に対して予測されるものと比較することができる。実験上は、約６．５×１０４ビーズ／μＬのＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−ＬＣ−ＰＥＯ−ビオチンビーズ５０μＬ（全部で３．３×１０６ＰＳＢ）を１×Ｂ＆Ｗバッファー１７５μＬで希釈し、製造元のオリジナルの懸濁液から磁気的に分離し２×Ｂ＆Ｗバッファー２００μＬで１回洗浄した既知数のストレプトアビジンコーティング磁性ビーズ（直径１．０μｍ）を含む２．０ｍＬ微小遠心管に移した。混合物を直ちに振とうし、４０ｒｐｍで１時間回転した後、ＰＳＢ−ＭＢ凝集物を磁気的に混合物から分離した。得られた上清は非結合の遊離のＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−ＬＣ−ＰＥＯ−ビオチンビーズを含んでおり、上清におけるＰＳＢの数は、倒立顕微鏡で肉眼的検査により決定した。同様の手順を用いて、２．８μｍＭＢのポアソン分布を試験した。しかし、この場合は、半分の量のＰＳＢ−ＣＯ−ＮＨ−ＬＣ−ＰＥＯ−ビオチンビーズ、即ち１．６×１０６ビーズのみを、既知量のＭＢとの反応に用いた。
【０１３４】
非常に多数の磁性ビーズとポリスチレンビーズとを一緒に混合する場合は、これら２種類のビーズが衝突し、非可逆的に反応する確率Ｐ（ｍ，ｎ）は、ポアソン分布に従うはずであり、以下の２つのパラメータに従うはずである：（ａ）磁性ビーズのポリスチレンビーズに対する最初の比率ｍ、及び（ｂ）各ポリスチレンビーズに結合している磁性ビーズの数ｎ。例えば、等しい数のＭＢ及びＰＳビーズを混合した場合（ｍ＝１）、ＰＳに結合するＭＢの平均数は１であるはずである。しかし、この平均値をもたらすには、ｎ＝１、２、・・・・の分布が存在する。Ｐ（ｍ，ｎ）、ｍとｎとの間の関係は、以下のようにポアソン分布により述べることができる。
【０１３５】
Ｐ（ｍ，ｎ）＝ｅ−ｍ［ｍｎ／ｎ！］ ｎ＝０、１、２、・・・
（Ｈａｉｇｈｔ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｉｓｓｏｎ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９６７年を参照されたい。）
【０１３６】
表２は、ｍ及びｎの様々な値に対するＰ（ｍ，ｎ）の値を列挙している。この表及びポアソン分布の試験データ（上記に提供）で、１個のポリスチレンビーズに結合し、反応溶液から引き出すのに必要とされる磁性ビーズの最小数を概算することができる。例えば、上清から回収されたＰＳＢの数から、ＭＢに結合し、反応混合液から磁気的に引き出されるＰＳＢのパーセント値を計算することができる。ｍ値が既知数、例えば、ｍ＝１、２、３、４、５、・・・である１セットの「結合ＰＳＢ％」のデータを、次いで、実験的に得ることができる。データがＰ（ｍ、ｎ＞ｊ）の理論値に当てはまる場合（表２）、ｍは行った実験から既知であり、ｊ＝０、１、２、３、・・・であり、
【数１】
である場合は、１個のポリスチレンビーズに結合し、それを引き出すのに必要とされる磁性ビーズの最小数は、ｊ＋１でなければならない。
【表２】
【０１３７】
図９は、このような試験の２つの例を示している。第１の例（図９ａ）では、２．８μｍＭＢと１０μｍＰＳＢとを用い、最小の結合比率であるＭＢ／ＰＳＢ＝１を導き出すことができる。第２の例（図９ｂ）では、２．８μｍＭＢの代わりに１．０μｍＭＢを用いて１０μｍＰＳＢと反応させた。この場合、ＭＢのＰＳＢに対する、より高い最小の結合比率である３が得られた。これらの結合比率を利用して、ＭＢとＰＳＢとの間のＤＮＡハイブリダイゼーションに対する実験条件を最適化することができ、その結果標的ＤＮＡの最小濃度を検出することができる。
【０１３８】
（実施例８）
２つの芳香族炭化水素であるＤＰＡ及びルブレンのポリスチレンビーズ中への充填
Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２の他に、芳香族炭化水素、例えば、９，１０−ジフェニルアントラセン（ＤＰＡ、図１１ａ）及びルブレン（ＲＵＢ、図１１ｂ）も、ポリスチレンビーズ（ＰＳＢ）中に充填した。その結果、発光波長の様々なＥＣＬ標識が得られた。充填の手順は、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２の捕捉に用いた手順と同様であったが、５％ＴＨＦ−９５％ＭｅＯＨの「膨張溶剤」を５％ベンゼン−９５％ＭｅＯＨに置き換えたので、２つの芳香族炭化水素はベンゼンを含んだ溶剤に十分に可溶である。図１２は、充填手順を要約したものである。
【０１３９】
ＰＳＢ中へのＤＰＡ及びＲＵＢの捕捉は、ＵＶ光線で励起した蛍光画像を用いて肉眼的に検証した。図１３ａ及びｂに示すように、ＤＰＡ及びＲＵＢを充填したＰＳＢに対してそれぞれ強烈な青色、及び黄色から橙色の蛍光画像が観察された。これとは対照的に、芳香族炭化水素のないＰＳＢは、弱い緑色の蛍光を示した（図１３ｃ）。
【０１４０】
ビーズ１個あたりＤＰＡ分子７．５×１０９、又はビーズ１個あたりＲＵＢ分子４．８×１０８というローディングキャパシティーを、ＭｅＣＮに溶解したＰＳＢを充填したＤＰＡ又はＲＵＢ、及び共反応化合物としてトリプロピルアミン（ＴＰｒＡ）を用いた標準のＤＰＡ又はＲＵＢ溶液から得たＥＣＬのデータに基づいて概算した。図１４は、（ａ）ＤＰＡを充填したＰＳＢをＭｅＣＮに溶解したもの、及び（ｂ）共反応化合物としてＴｐＲＡを用いた０．２５ｍＭＤＰＡのアセトニトリル溶液のＣＶ及びＥＣＬの挙動である。ＲＵＢを充填したＰＳＢをＭｅＣＮに溶解したもの、及び共反応化合物としてＴＰｒＡを用いた３５μＭ ＲＵＢのアセトニトリル溶液のＣＶ及びＥＣＬの挙動を、それぞれ図１５ａ及び１５ｂに示す。
【０１４１】
（実施例９）
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のＥＣＬ検出
Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン←抗−ＣＲＰ複合体を、以下のように調製した：０．１００〜０．５００ｍＬのＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン（６．５×１０４ビーズ／μＬ）（実施例４を参照されたい）を、２．０ｍｇ／ｍＬビオチン化抗−ＣＲＰ（Ｍｉａｏ及びＢａｒｄ、２００３年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７５巻、５８２５頁）の０．１０Ｍ ＰＢＳバッファー（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）（ｐＨ７．２）（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）溶液の１ｍＬと、室温で１時間、回転速度２５ｒｐｍで混合した。新たに形成した複合体を遠心分離により回収し、１×Ｂ＆Ｗバッファーで３回洗浄し（実施例４を参照されたい）、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．１０Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液１ｍＬに３０分間再懸濁した。遠心分離及び洗浄後（上記の通り）、複合体を適切な容積（０．１００〜０．５００ｍＬ）の０．１０Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）バッファー溶液に懸濁し、使用するまで４℃に保った。
【０１４２】
ＭＢ←抗−ＣＲＰ複合体を、以下のように調製した：直径２．８μｍのストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズ０．１００〜０．５００ｍＬ（ＭＢ、６．５×１０５ビーズ／μＬ）を磁気的に分離し、２×Ｂ＆Ｗバッファー１ｍＬで１回、１×Ｂ＆Ｗバッファー１ｍＬで２回洗浄し、その後２．０ｍｇ／ｍＬビオチン化抗−ＣＲＰの０．１０Ｍ ＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ７．２）の１．５ｍＬと、室温で１時間、２５ｒｐｍの回転速度で混合した。新たに形成したＭＢ←抗−ＣＲＰ複合体を、１×Ｂ＆Ｗバッファー１ｍＬで３回洗浄し、適切な容積（０．１００〜０．５００ｍＬ）の０．１０Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）バッファー溶液に再懸濁し、使用するまで４℃で貯蔵した。
【０１４３】
サンドイッチタイプのＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン←抗−ＣＲＰ＜ＣＲＰ＞ＭＢ←抗−ＣＲＰ複合体を以下のように形成した：Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン←抗−ＣＲＰ複合体（全部で１．３×１０６ＰＳＢ）２０μＬ及びＭＢ←抗−ＣＲＰ複合体（全部で１．３×１０７ＰＳＢ）２０μＬを、０．１０Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）バッファー溶液２００μＬ中のＣＲＰ試料と、室温で２時間穏やかに混合した。サンドイッチタイプの複合体を混合溶液から磁気的に分離し、１×Ｂ＆Ｗバッファー２００μＬで３回洗浄した。次いで、遊離のＲｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン←抗−ＣＲＰの古い遠心管の壁面上への可能な吸着が最小になるように、複合体を少容積のＰＢＳバッファーで、新しい２ｍＬの遠心管に移した（実施例６を参照されたい）。最後に「磁性の複合体」をマグネットで溶液から分離した。
【０１４４】
ＥＣＬによりＣＲＰを検出した。得られたサンドイッチ型の複合体を、０．１０Ｍ ＴＰｒＡ−０．０５５ＴＦＡＡ−０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４ＭｅＣＮ溶液０．５００ｍＬに溶解し、直径２．２ｍｍのＰｔ電極で、スキャンスピード５０ｍＶ／ｓで、０〜２．８Ｖ ｖｓ．Ａｇ／Ａｇ＋（０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４ＭｅＣＮ中の１０ｍＭ ＡｇＢＦ４）の走査電位窓でサイクリックボルタンメトリーを用いてＥＣＬ実験を行った。予想通り、サンドイッチタイプの複合体から得られたＣＶ及びＥＣＬのプロファイルは、両方の場合とも「反応種」、Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋及びＴＰｒＡが同一であったので、図４ａ及びｃに示したものと非常に類似していた。図１６に示すように、ＥＣＬ強度（フォワードスキャンピーク強度とリバーススキャンピーク強度との平均）は、０．０１０〜１０μｇ／ｍＬの範囲にわたるＣＲＰ濃度に対して線形に比例している。
【０１４５】
本明細書に引用される参照は全て、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。参照として組み入れられる出版物、及び特許、又は特許出願が本明細書に含まれている開示と矛盾する範囲では、本明細書は、そのような矛盾する材料のあらゆるものに取って代わり、及び／又は優先することが意図される。
【０１４６】
本明細書及び特許請求の範囲で用いられる、成分、反応条件などの量を表す数値は全て、全ての場合において「約」という語により修飾されるものであることを理解されたい。したがって、逆を示さなければ、本明細書及び添付する特許請求の範囲で述べた数のパラメータは、本発明により得られることが求められている、望ましい性質に応じて変化することができる近似値である。控えめに言っても、且つ、特許請求の範囲の同等物の学説の適用を制限しようとするものではないが、数値のパラメータはそれぞれ、有効数字の数、及び通常の数字を丸める取組みを考慮して解釈されたい。
【０１４７】
当業者であれば明らかであるが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の多くの変更形態及び変形形態を行うことは可能である。本明細書に記載した特異的実施形態は、例として提供されるにすぎず、決して限定的なものを意味するものではない。明細書及び実施例は、例示的なものにすぎないとみなすべきであり、本発明の真の範囲及び精神は、以下の特許請求の範囲により示されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】対象の分析物が、ＥＣＬ標識を含む第１の担体としても働くポリスチレンビーズに連結するＤＮＡ分子である、本発明のある実施形態の概略図である。磁性であり、ポリスチレンビーズに連結するＤＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子に連結する第２の担体として働く第２のビーズも示してある。２つのＤＮＡ分子は結合して複合体を形成する。磁場を複合体に適用することにより、対象の分析物（例えばＤＮＡ）を単離する手段がもたらされ、ＥＣＬ標識を検出することにより、対象の分析物を検出する手段がもたらされる。
【図２】直径１０μｍのポリスチレンカルボキシレートビーズの蛍光画像を示す図である。図２（ａ）は、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２の捕捉後のビーズを示し、図２（ｂ）は、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２を充填したビーズの表面上にアビジンが共有結合した後のビーズを示している。使用した暴露時間は３０秒であった。検体は、λｅｘ４９０ｎｍで励起した。
【図３】プローブＤＮＡ−磁性ビーズ複合体（ＤＮＡ−ＭＢ）と、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２を含むアビジンでコーティングしたポリスチレンビーズ（ＤＮＡ−Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジンで表してある）に複合した相補的なＤＮＡとの間のＤＮＡハイブリダイゼーション後に得られた走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す図である。両方のＤＮＡ分子に用いた濃度は５μＭであり、ＰＳＢ及びＭＢのサイズは、それぞれ１０μｍ及び１．０μｍであった。
【図４】０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４電解質−０．１０Ｍトリプロピルアミン（ＴＰｒＡ）共反応化合物を含む０．１０μＭ Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２のアセトニトリル（ＭｅＣＮ）から得られた（ａ）サイクリックボルタンメトリーの（ＣＶ）、及び（ｂ）ＥＣＬの、直径２．２ｍｍのＰｔ電極でスキャン速度５０ｍＶ／ｓでの応答を示す図である。比較のために、（ｃ）に、ＴＰｒＡの非存在下で０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４を含む１．０ｍＭ Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２のＭｅＣＮのＣＶを示す。（ｃ）の実験条件は、（ａ）及び（ｂ）と同じであるが、ＣＶ電流は１０倍であった。
【図５】ＥＣＬ強度に対する（ａ）ＴＰｒＡ、及び（ｂ）ＴＰｒＡ−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）の濃度の効果を示す図である。試料は全て、０．１０μＭ Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２及び０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４のＭｅＣＮを含んでいた。作用電極は、直径２．２ｍｍのＰｔ電極であった。スキャン速度は５０ｍＶ／ｓであった。
【図６】ＴＰｒＡ−ＭｅＣＮシステムに対するＥＣＬバックグラウンドの消失を示す図である。（ａ）では、０．１０Ｍ ＴＰｒＡ及び０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４−ＭｅＣＮを用いた。（ｂ）では、０．０５５Ｍ ＴＦＡＡを添加し、（ａ）と同じ条件を用いた。（ｃ）では、１．０％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏを添加し、（ｂ）と同じ条件を用いた。（ｄ）では、０．１０Ｍ（ＴＢＡ）ＢＦ４−ＭｅＣＮを用いた。図６（ｅ）は、（ａ）〜（ｄ）に示した相対的なＥＣＬ強度を示している。
【図７】Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２濃度の関数としてのＥＣＬ強度（ａ）、及びＲｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２を充填した直径１０μｍのポリスチレンビーズの数（ｂ）を示す図である。
【図８】ＤＮＡハイブリダイゼーションのＥＣＬ検出を示す図である。図８（ａ）は、ＭＢ／ＰＳＢ＝２９の比率で、プローブＤＮＡ−ＭＢ（１．０μｍ）と、標的のＤＮＡ−Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン（１０μｍ）との間でＤＮＡハイブリダイゼーションが起こったことを示す。図８（ｂ）は、ＭＢ／ＰＳＢ＝４の比率で、プローブＤＮＡ−ＭＢ（２．８μｍ）と標的のＤＮＡ−Ｒｕ（ＩＩ）⊂ＰＳＢ／アビジン（１０μｍ）との間でＤＮＡハイブリダイゼーションが起こったことを示す。
【図９】直径１０μｍのビオチン化ＰＳＢと反応した直径（ａ）２．８μｍ、及び（ｂ）１．０μｍのストレプトアビジンコーティングしたＭＢを用いた、ポアソン分布の検定を示す図である。「結合しているＰＳＢ％」は、反応媒体からＭＢ−ＰＳＢ複合体を磁気的に分離した後、上清に見られたＰＳＢの数から計算した。
【図１０】フルオレセインビオチン滴定実験で得られた、ビオチン化した２３−ｍｅｒ−ｓｓＤＮＡ（ｐ−ｓｓＤＮＡ）に対する（ａ）Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋で捕捉されたストレプトアビジンでコーティングした直径１０μｍのポリスチレンビーズ、（ｂ）ストレプトアビジンでコーティングした直径１．０μｍの磁性ビーズ、及び（ｃ）ストレプトアビジンでコーティングした直径２．８μｍの磁性ビーズの結合能力を示す図である。
【図１１】ＤＰＡ（ａ）及びＲＵＢ（ｂ）の分子構造を示す図である。
【図１２】芳香族炭化水素をポリスチレンビーズ中に充填するための手順におけるステップを表すフローチャートである。
【図１３】（ａ）ＤＰＡを充填したＰＳＢ、（ｂ）ＲＵＢを充填したＰＳＢ、及び（ｃ）ＰＳＢのみの蛍光画像を示す図である。
【図１４】（ａ）ＭｅＣＮに溶解した、ＤＰＡを充填したＰＳＢ、及び（ｂ）共反応化合物としてＴＰｒＡを用いた０．２５ｍＭ ＤＰＡのアセトニトリル溶液の、ＣＶ及びＥＣＬの挙動を示す図である。
【図１５】（ａ）ＭｅＣＮに溶解した、ＲＵＢを充填したＰＳＢ、及び（ｂ）共反応化合物としてＴＰｒＡを用いた３５μＭ ＲＵＢのアセトニトリル溶液の、ＣＶ及びＥＣＬの挙動を示す図である。
【図１６】ＥＣＬシグナルとＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の濃度との間の関係を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢとＤの両方が対象の分析物に連結してはいないという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物に連結しているか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の分析物に連結しているか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーに連結している第２の担体であり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象の分析物を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）複合体におけるＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の分析物の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の分析物を検出する方法。
【請求項２】
Ｂ及びＤの少なくとも１つが固体支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｂが第１の固体支持体であり、Ｄが第２の固体支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対象の分析物がＤに直接連結している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象の分析物の第２の結合パートナーがＤに連結している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
対象の分析物がＢにもＤにも連結しない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの特異的結合パートナーが、Ｂ及びＤの少なくとも１つに連結している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
同一の特異的結合パートナーがＢとＤに連結する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの特異的結合パートナーが抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象の分析物が核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの特異的結合パートナーが核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象の分析物がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＣＬ部分が前記第１の担体に含まれており、該第１の担体の表面に連結する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＥＣＬ部分が有機溶剤に可溶である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＥＣＬ部分が水性溶剤に不溶である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥＣＬ部分に電気化学的ポテンシャルを適用することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記放射された電磁放射を光電子増倍管で検出することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１及び第２の担体が、ビーズ、ゲル、膜、リポソーム、及びミセルから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１及び第２の担体が、ポリスチレン、ポリプロピレン、アガロース、アクリルアミド、リン脂質、ニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ、セファロース、セファデックス、ヒアルロン酸、キチン、アシルジェラン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルキチン、ポリ（ラクチド−ｃｏ−エチレングリコール）、及び界面活性剤から選択される化合物を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１及び第２の担体がビーズである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の担体が磁性ビーズである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の担体がポリスチレンビーズである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）で形成された複合体が、電磁場を適用することにより前記組成物の他の構成成分から単離される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
Ｂを有機溶剤に溶解するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記有機溶剤がアセトニトリルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
共反応化合物の添加を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記共反応化合物がアミン又はアミン部分である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記共反応化合物がトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料における前記対象の分析物の量が定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料における前記対象の分析物の量を、既知量の対象の分析物を含む試料Ｃを用いる方法を実行することにより調製した検量線と、放射された電磁放射の量を比較することにより定量される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＢとＤの両方が対象の核酸分子に連結してはいないという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸分子に連結しているか、又は対象の核酸分子の第１の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の核酸分子に連結しているか、又は対象の核酸分子の第２の特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象の核酸分子を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）Ｂを有機溶剤に溶解するステップと、
（ｄ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｅ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の核酸分子の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の核酸分子を検出する方法。
【請求項３５】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
Ｄが前記対象の核酸分子の前記第２の特異的結合パートナーに連結しており、更に該第２の特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
Ｂが前記対象の核酸分子の前記第１の特異的結合パートナーに連結しており、Ｄが前記対象の核酸分子の前記第２の特異的結合に連結している、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１及び前記第２の特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
Ｂが、アセトニトリル、ＴＨＦ、ベンゼン、又はこれらの混合物から選択される有機溶剤に溶解している、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記対象の核酸分子がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
共反応化合物の添加を更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記共反応化合物がアミン又はアミン部分である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記共反応化合物がトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料における前記対象の核酸の量が定量される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料における前記対象の核酸の量を、既知量の対象の核酸を含む試料（Ｃ）を用いる方法を実行することにより調製した検量線と、放射された電磁放射の量を比較することにより定量される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物に連結しているか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の分析物に連結しているか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーに連結している第２の担体であり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。
但し、ＢとＤの両方が対象の分析物に連結してはいない。］
を含む、試料における対象の分析物を検出するための組成物。
【請求項４９】
前記対象の分析物がＢに連結している、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記対象の分析物がＤに連結している、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
前記対象の分析物がＢにもＤにも連結していない、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５２】
Ｂ及びＤの少なくとも１つが固体支持体である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５３】
Ｂが第１の固体支持体であり、Ｄが第２の固体支持体である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記第１の特異的結合パートナーがＢに連結している、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５５】
前記第２の特異的結合パートナーがＤに連結している、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５６】
前記第１の特異的結合パートナーがＢに連結しており、前記第２の特異的結合パートナーがＤに連結している、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５７】
２つの特異的結合パートナーを含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５８】
前記２つの特異的結合パートナーが、前記第１及び第２の担体に独立して連結している、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記対象の分析物が核酸である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記核酸がＤＮＡである、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記対象の分析物がタンパク質である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６２】
前記ＥＣＬ部分が有機溶剤に可溶である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６３】
前記ＥＣＬ部分が水性溶剤に不溶である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６４】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６５】
Ｂ及びＤが、ビーズ、ゲル、膜、リポソーム、又はミセルである、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６６】
前記第１及び第２の固体支持体が、ポリスチレン、ポリプロピレン、アガロース、アクリルアミド、ニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ、セファロース、セファデックス、ヒアルロン酸、キチン、アシルジェラン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、及びカルボキシメチルキチン、ポリ（ラクチド−ｃｏ−エチレングリコール）から選択される化合物から独立して構成される、請求項５３に記載の組成物。
【請求項６７】
前記第１及び第２の固体支持体の少なくとも１つがビーズである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項６８】
前記第２の固体支持体が磁化ビーズである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項６９】
前記第１の固体支持体がポリスチレンビーズである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項７０】
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸分子に連結し、又は対象の核酸分子の第１の特異的結合パートナーに連結し、
Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、及び
Ｄは対象の核酸分子に連結し、又は対象の核酸分子の第２の特異的結合パートナーに連結する磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。
但し、ＢとＤの両方が対象の核酸分子に連結してはいない］。
を含む、試料における対象の核酸分子を検出するための組成物。
【請求項７１】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７３】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
Ｂが対象の核酸分子の前記第１の特異的結合パートナーに連結し、更に該第１の特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７５】
Ｄが対象の核酸分子の第２の特異的結合パートナーに連結し、更に該第２の特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７６】
Ｂが対象の核酸分子の第１の特異的結合パートナーに連結しており、Ｄが対象の核酸分子の第２の特異的結合に連結する、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７７】
前記第１及び前記第２の特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
前記対象の核酸分子がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７９】
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質に連結しているか、又は対象のタンパク質の第１の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象のタンパク質を含むことがある試料であり、
Ｄは対象のタンパク質に連結しているか、又は対象のタンパク質の第２の特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。
但し、ＢとＤの両方が対象のタンパク質に連結してはいない。］
を含む、試料における対象のタンパク質を検出するための組成物。
【請求項８０】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８２】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項８１に記載の組成物。
【請求項８３】
Ｂが前記対象のタンパク質の前記第１の特異的結合パートナーに連結しており、更に該特異的結合パートナーが抗体又は結合タンパク質である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８４】
Ｄが前記対象のタンパク質の前記第２の特異的結合パートナーに連結しており、更に該特異的結合パートナーが抗体又は結合タンパク質である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８５】
前記対象のタンパク質の前記第１の特異的結合パートナー、及び前記対象のタンパク質の前記第２の特異的結合パートナーが抗体である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８６】
但し、ＢとＤの両方が対象のタンパク質に連結してはいないという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質に、又は対象のタンパク質に特異的に結合している第１の特異的結合パートナーに連結し、
Ｃは対象のタンパク質を含むことがある試料であり、
Ｄは対象のタンパク質に、又は対象のタンパク質に特異的に結合している第２の特異的結合パートナーに連結することができる磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象のタンパク質を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象のタンパク質の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象のタンパク質を検出する方法。
【請求項８７】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＥＣＬ部分を光電子増倍管で検出することを更に含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
Ｂが前記対象のタンパク質の前記第１の特異的結合パートナーに連結し、更に該第１の特異的結合パートナーが抗体、抗体の一部分、又は結合タンパク質である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９２】
Ｄが前記対象のタンパク質の前記第２の特異的結合パートナーに連結し、更に該第２の特異的結合パートナーが抗体、抗体の一部分、又は結合タンパク質である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９３】
Ｂが前記対象のタンパク質の前記第１の特異的結合パートナーに連結し、Ｄが前記対象のタンパク質の前記第２の特異的結合パートナーに連結している、請求項８６に記載の方法。
【請求項９４】
前記第１及び第２の特異的結合パートナーが抗体、抗体の一部分、又は結合タンパク質である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
Ｂが、アセトニトリル、ＴＨＦ、ベンゼン、又はそれらの混合物から選択される有機溶剤に溶解している、請求項８６に記載の方法。
【請求項９６】
共反応化合物の添加を更に含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９７】
前記共反応化合物がアミン又はアミン部分である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記共反応化合物がトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ）である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記試料における前記対象のタンパク質の量が定量される、請求項８６に記載の方法。
【請求項１００】
前記試料における前記対象のタンパク質の量を、既知量の対象のタンパク質を含む試料（Ｃ）を用いる方法を実行することにより調製した検量線と、放射された電磁放射の量を比較することにより定量する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
Ｂ及びＤの１つのみが対象の分析物の類似体に連結し、
Ｂが対象の分析物の類似体に連結している場合には、Ｄは対象の分析物の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象の分析物の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象の分析物の類似体に連結しているという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物の類似体に連結しているか、又は対象の分析物の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の分析物の類似体に連結しているか、又は対象の分析物の特異的結合パートナーに連結している第２の担体であり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄを含む複合体を、該組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）該複合体におけるＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の分析物の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の分析物を検出する方法。
【請求項１０２】
Ｂ及びＤの少なくとも１つが固体支持体である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
Ｂが第１の固体支持体であり、Ｄが第２の固体支持体である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記特異的結合パートナーが抗体である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記対象の分析物が核酸である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記特異的結合パートナーが核酸である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０７】
前記対象の核酸分子がＤＮＡである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０８】
前記対象の分析物がタンパク質である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＥＣＬ部分が第１の担体に含まれている、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ＥＣＬ部分が有機溶剤に可溶である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＥＣＬ部分が水性溶剤に不溶である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ＥＣＬ部分に電気化学的ポテンシャルを適用することを更に含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記放射された電磁放射を光電子増倍管で検出することを更に含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１６】
前記第１及び第２の担体が、ビーズ、ゲル、膜、リポソーム、及びミセルから選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１７】
Ｂ及びＤが、ポリスチレン、ポリプロピレン、アガロース、アクリルアミド、ニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ、セファロース、セファデックス、ヒアルロン酸、キチン、アシルジェラン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルキチン、及びポリ（ラクチド−ｃｏ−エチレングリコール）から選択される化合物を独立に含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１８】
前記第１及び第２の担体がビーズである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１９】
前記第２の担体が磁化ビーズである、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記第１の担体がポリスチレンビーズである、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
Ａ、Ｂ、Ｄを含む複合体が、電磁場を適用することにより前記組成物の他の構成成分から単離される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２２】
Ｂを有機溶剤に溶解するステップを更に含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記有機溶剤がアセトニトリルである、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
共反応化合物の添加を更に含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１２５】
前記共反応化合物がアミン又はアミン部分である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記共反応化合物がトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ）である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２７】
前記試料における前記対象の分析物の量を定量する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１２８】
前記試料における前記対象の分析物の量を、既知量の対象の分析物を含む試料（Ｃ）を用いる方法を実行することにより調製した検量線と、放射された電磁放射の量を比較することにより定量する、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
Ｂ及びＤの１つのみが、対象の核酸の類似体に連結し、
Ｂが対象の核酸分子の類似体に連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象の核酸分子の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の類似体に連結しているという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の核酸の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結する磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象の核酸分子を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）Ｂを有機溶剤に溶解するステップと、
（ｄ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｅ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の核酸分子の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の核酸分子を検出する方法。
【請求項１３０】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
Ｂが前記対象の核酸分子の類似体に連結しており、更に該類似体がオリゴヌクレオチドである、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３４】
Ｄが前記対象の核酸分子の類似体に連結し、更に該類似体がオリゴヌクレオチドである、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３５】
前記対象の核酸分子の類似体と、前記対象の核酸分子の特異的結合パートナーの両方が、オリゴヌクレオチドである、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３６】
Ｂが、アセトニトリル、ＴＨＦ、ベンゼン、又はこれらの混合物から選択される有機溶剤に溶解している、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３７】
前記対象の核酸分子がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３８】
共反応化合物の添加を更に含む、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３９】
前記共反応化合物がアミン又はアミン部分である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１４０】
前記共反応化合物がトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ）である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記試料における前記対象の核酸の量を定量する、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１４２】
前記試料における前記対象の核酸の量を、既知量の対象の核酸を含む試料（Ｃ）を用いる方法を実行することにより調製した検量線と、放射された電磁放射の量を比較することにより定量する、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
Ｂ及びＤの１つのみが、対象のタンパク質の類似体に連結して、
Ｂが対象のタンパク質の類似体に連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結しており、Ｂが対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結しているという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質の類似体、又は対象のタンパク質に特異的に結合している特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象のタンパク質を含むことがある試料であり、
Ｄは対象のタンパク質の類似体、又は対象のタンパク質に特異的に結合している特異的結合パートナーのいずれかに連結する磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象のタンパク質を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象のタンパク質の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象のタンパク質を検出する方法。
【請求項１４４】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４６】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４７】
前記ＥＣＬ部分を光電子増倍管で検出することを更に含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４８】
前記Ｂが前記対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結し、更に該特異的結合パートナーが抗体、抗体の一部分、又は結合タンパク質である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４９】
Ｄが前記対象のタンパク質の前記特異的結合パートナーに連結し、更に該特異的結合パートナーが抗体、抗体の一部分、又は結合タンパク質である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５０】
Ｂが、アセトニトリル、ＴＨＦ、ベンゼン、又はこれらの混合物から選択される有機溶剤に溶解している、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５１】
共反応化合物の添加を更に含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５２】
前記共反応化合物がアミン又はアミン部分である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記共反応化合物がトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ）である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５４】
前記試料における前記対象のタンパク質の量を定量する、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記試料における前記対象のタンパク質の量を、既知量の対象のタンパク質を含む試料（Ｃ）を用いる方法を実行することにより調製した検量線と、放射された電磁放射の量を比較することにより定量する、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物の類似体に連結しているか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の分析物の類似体に連結することができるか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーに連結することができる第２の担体であり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。
但し、Ｂ及びＤの１つのみが、対象の分析物の類似体に連結し、
Ｂが対象の分析物の類似体に連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結しており、Ｂが対象のタンパク質の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結している。］
を含む、試料における対象の分析物を検出するための組成物。
【請求項１５７】
Ｂ及びＤの少なくとも１つが固体支持体である、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１５８】
Ｂが第１の固体支持体であり、Ｄが第２の固体支持体である、請求項１５７に記載の組成物。
【請求項１５９】
前記特異的結合パートナーがＢに連結している、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６０】
前記特異的結合パートナーがＤに連結している、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６１】
前記対象の分析物が核酸である、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６２】
前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１６３】
前記対象の分析物がタンパク質である、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６４】
前記ＥＣＬ部分が有機溶剤に可溶である、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６５】
前記ＥＣＬ部分が水性溶剤に不溶である、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６６】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６７】
Ｂ及びＤが、ビーズ、ゲル、膜、リポソーム、及びミセルである、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６８】
Ｂ及びＤが、ポリスチレン、ポリプロピレン、アガロース、アクリルアミド、ニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ、セファロース、セファデックス、ヒアルロン酸、キチン、アシルジェラン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、及びカルボキシメチルキチン、ポリ（ラクチド−ｃｏ−エチレングリコール）から選択される化合物から独立に構成される、請求項１５７に記載の組成物。
【請求項１６９】
前記固体支持体がビーズである、請求項１５７に記載の組成物。
【請求項１７０】
前記第２の固体支持体が磁化ビーズである、請求項１５８に記載の組成物。
【請求項１７１】
前記第１の固体支持体がポリスチレンビーズである、請求項１５８に記載の組成物。
【請求項１７２】
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸分子の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の核酸分子の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。
但し、Ｂ及びＤの１つのみが、対象の核酸分子の類似体に連結し、
Ｂが対象の核酸分子の類似体に連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象の核酸分子の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の類似体に連結している］
を含む、試料における対象の核酸分子を検出するための組成物。
【請求項１７３】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７４】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７５】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１７６】
Ｂが前記対象の核酸分子の前記特異的結合パートナーに連結し、更に該特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７７】
Ｄが前記対象の核酸分子の前記特異的結合パートナーに連結し、更に該特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７８】
前記対象の核酸分子の類似体、及び前記特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７９】
前記対象の核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１８０】
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質の類似体に連結するか、又は対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結し、
Ｃは対象のタンパク質を含むことがある試料であり、
Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結するか、又は対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結する磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。
但し、Ｂ及びＤの１つのみが、対象のタンパク質の類似体に連結し、
Ｂが対象のタンパク質の類似体に連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象のタンパク質の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結している。］
を含む、試料における対象のタンパク質を検出するための組成物。
【請求項１８１】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項１８０に記載の組成物。
【請求項１８２】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１８０に記載の組成物。
【請求項１８３】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項１８２に記載の組成物。
【請求項１８４】
Ｂが前記対象のタンパク質の前記特異的結合パートナーに連結し、更に該特異的結合パートナーが抗体又は結合タンパク質である、請求項１８０に記載の組成物。
【請求項１８５】
Ｄが前記対象のタンパク質の前記特異的結合パートナーに連結し、更に該特異的結合パートナーが抗体又は結合タンパク質である、請求項１８０に記載の組成物。
【請求項１８６】
電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得る少なくとも１つのＥＣＬ部分と、
該ＥＣＬ部分を含む第１の担体であって、対象の分析物の類似体に連結するか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結する、第１の担体と、
対象の分析物の類似体に連結するか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーに連結する、第２の担体と
を含む、試料における対象の分析物を検出するためのキット。
【請求項１８７】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１８６に記載のキット。
【請求項１８８】
前記第１及び第２の担体が固体支持体である、請求項１８６に記載のキット。
【請求項１８９】
前記第１の担体がポリスチレンビーズである、請求項１８６に記載のキット。
【請求項１９０】
前記第２の担体が磁性ビーズである、請求項１８６に記載のキット。
【請求項１９１】
前記第１の担体がポリスチレンビーズであり、前記第２の担体が磁性ビーズである、請求項１８６に記載のキット。
【請求項１９２】
前記対象の分析物が核酸である、請求項１８６に記載のキット。
【請求項１９３】
前記対象の分析物の前記第１及び第２の結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項１９２に記載のキット。
【請求項１９４】
前記対象の分析物の類似体がオリゴヌクレオチドである、請求項１９２に記載のキット。
【請求項１９５】
前記対象の分析物がタンパク質である、請求項１８６に記載のキット。
【請求項１９６】
前記対象の分析物の前記第１及び第２の結合パートナーが抗体又は特異的結合タンパク質である、請求項１９５に記載のキット。
【請求項１９７】
芳香族炭化水素を含有するポリスチレンビーズを含む組成物。
【請求項１９８】
前記芳香族炭化水素がジフェニルアントラセン及びルブレンから選択される、請求項１９７に記載の組成物。
【請求項１９９】
前記ポリスチレンビーズが約７．５×１０９個のジフェニルアントラセン分子を含む、請求項１９７に記載の組成物。
【請求項２００】
前記ポリスチレンビーズが約４×１０８個のルブレン分子を含む、請求項１９７に記載の組成物。
【請求項２０１】
前記タンパク質がＣ反応性タンパク質である、請求項１３、８６、１０８、又は１４３に記載の方法。
【請求項２０２】
前記タンパク質がＣ反応性タンパク質である、請求項６１、７９、１６３、又は１８０に記載の組成物。
【請求項２０３】
前記タンパク質がＣ反応性タンパク質である、請求項１９５に記載のキット。
【請求項２０４】
ｋが２以上の整数である、請求項１、３４、８６、１０１、１２９、又は１４３に記載の方法。
【請求項２０５】
ｋが２以上の整数である、請求項４８、７０、７９、１５６、１７２、又は１８０に記載の組成物。
【請求項２０６】
少なくとも２つのＥＣＬ部分を更に含む、請求項１８６に記載のキット。
【請求項１】
ＢとＤの両方が対象の分析物に連結してはいないという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物に連結しているか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の分析物に連結しているか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーに連結している第２の担体であり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象の分析物を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）複合体におけるＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の分析物の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の分析物を検出する方法。
【請求項２】
Ｂ及びＤの少なくとも１つが固体支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｂが第１の固体支持体であり、Ｄが第２の固体支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対象の分析物がＤに直接連結している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象の分析物の第２の結合パートナーがＤに連結している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
対象の分析物がＢにもＤにも連結しない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの特異的結合パートナーが、Ｂ及びＤの少なくとも１つに連結している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
同一の特異的結合パートナーがＢとＤに連結する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの特異的結合パートナーが抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象の分析物が核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの特異的結合パートナーが核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象の分析物がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＣＬ部分が前記第１の担体に含まれており、該第１の担体の表面に連結する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＥＣＬ部分が有機溶剤に可溶である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＥＣＬ部分が水性溶剤に不溶である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥＣＬ部分に電気化学的ポテンシャルを適用することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記放射された電磁放射を光電子増倍管で検出することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１及び第２の担体が、ビーズ、ゲル、膜、リポソーム、及びミセルから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１及び第２の担体が、ポリスチレン、ポリプロピレン、アガロース、アクリルアミド、リン脂質、ニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ、セファロース、セファデックス、ヒアルロン酸、キチン、アシルジェラン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルキチン、ポリ（ラクチド−ｃｏ−エチレングリコール）、及び界面活性剤から選択される化合物を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１及び第２の担体がビーズである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の担体が磁性ビーズである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の担体がポリスチレンビーズである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）で形成された複合体が、電磁場を適用することにより前記組成物の他の構成成分から単離される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
Ｂを有機溶剤に溶解するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記有機溶剤がアセトニトリルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
共反応化合物の添加を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記共反応化合物がアミン又はアミン部分である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記共反応化合物がトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料における前記対象の分析物の量が定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料における前記対象の分析物の量を、既知量の対象の分析物を含む試料Ｃを用いる方法を実行することにより調製した検量線と、放射された電磁放射の量を比較することにより定量される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＢとＤの両方が対象の核酸分子に連結してはいないという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸分子に連結しているか、又は対象の核酸分子の第１の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の核酸分子に連結しているか、又は対象の核酸分子の第２の特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象の核酸分子を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）Ｂを有機溶剤に溶解するステップと、
（ｄ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｅ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の核酸分子の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の核酸分子を検出する方法。
【請求項３５】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
Ｄが前記対象の核酸分子の前記第２の特異的結合パートナーに連結しており、更に該第２の特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
Ｂが前記対象の核酸分子の前記第１の特異的結合パートナーに連結しており、Ｄが前記対象の核酸分子の前記第２の特異的結合に連結している、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１及び前記第２の特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
Ｂが、アセトニトリル、ＴＨＦ、ベンゼン、又はこれらの混合物から選択される有機溶剤に溶解している、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記対象の核酸分子がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
共反応化合物の添加を更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記共反応化合物がアミン又はアミン部分である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記共反応化合物がトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料における前記対象の核酸の量が定量される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料における前記対象の核酸の量を、既知量の対象の核酸を含む試料（Ｃ）を用いる方法を実行することにより調製した検量線と、放射された電磁放射の量を比較することにより定量される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物に連結しているか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の分析物に連結しているか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーに連結している第２の担体であり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。
但し、ＢとＤの両方が対象の分析物に連結してはいない。］
を含む、試料における対象の分析物を検出するための組成物。
【請求項４９】
前記対象の分析物がＢに連結している、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記対象の分析物がＤに連結している、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
前記対象の分析物がＢにもＤにも連結していない、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５２】
Ｂ及びＤの少なくとも１つが固体支持体である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５３】
Ｂが第１の固体支持体であり、Ｄが第２の固体支持体である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記第１の特異的結合パートナーがＢに連結している、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５５】
前記第２の特異的結合パートナーがＤに連結している、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５６】
前記第１の特異的結合パートナーがＢに連結しており、前記第２の特異的結合パートナーがＤに連結している、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５７】
２つの特異的結合パートナーを含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５８】
前記２つの特異的結合パートナーが、前記第１及び第２の担体に独立して連結している、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記対象の分析物が核酸である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記核酸がＤＮＡである、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記対象の分析物がタンパク質である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６２】
前記ＥＣＬ部分が有機溶剤に可溶である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６３】
前記ＥＣＬ部分が水性溶剤に不溶である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６４】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６５】
Ｂ及びＤが、ビーズ、ゲル、膜、リポソーム、又はミセルである、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６６】
前記第１及び第２の固体支持体が、ポリスチレン、ポリプロピレン、アガロース、アクリルアミド、ニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ、セファロース、セファデックス、ヒアルロン酸、キチン、アシルジェラン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、及びカルボキシメチルキチン、ポリ（ラクチド−ｃｏ−エチレングリコール）から選択される化合物から独立して構成される、請求項５３に記載の組成物。
【請求項６７】
前記第１及び第２の固体支持体の少なくとも１つがビーズである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項６８】
前記第２の固体支持体が磁化ビーズである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項６９】
前記第１の固体支持体がポリスチレンビーズである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項７０】
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸分子に連結し、又は対象の核酸分子の第１の特異的結合パートナーに連結し、
Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、及び
Ｄは対象の核酸分子に連結し、又は対象の核酸分子の第２の特異的結合パートナーに連結する磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。
但し、ＢとＤの両方が対象の核酸分子に連結してはいない］。
を含む、試料における対象の核酸分子を検出するための組成物。
【請求項７１】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７３】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
Ｂが対象の核酸分子の前記第１の特異的結合パートナーに連結し、更に該第１の特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７５】
Ｄが対象の核酸分子の第２の特異的結合パートナーに連結し、更に該第２の特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７６】
Ｂが対象の核酸分子の第１の特異的結合パートナーに連結しており、Ｄが対象の核酸分子の第２の特異的結合に連結する、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７７】
前記第１及び前記第２の特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
前記対象の核酸分子がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７９】
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質に連結しているか、又は対象のタンパク質の第１の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象のタンパク質を含むことがある試料であり、
Ｄは対象のタンパク質に連結しているか、又は対象のタンパク質の第２の特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。
但し、ＢとＤの両方が対象のタンパク質に連結してはいない。］
を含む、試料における対象のタンパク質を検出するための組成物。
【請求項８０】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８２】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項８１に記載の組成物。
【請求項８３】
Ｂが前記対象のタンパク質の前記第１の特異的結合パートナーに連結しており、更に該特異的結合パートナーが抗体又は結合タンパク質である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８４】
Ｄが前記対象のタンパク質の前記第２の特異的結合パートナーに連結しており、更に該特異的結合パートナーが抗体又は結合タンパク質である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８５】
前記対象のタンパク質の前記第１の特異的結合パートナー、及び前記対象のタンパク質の前記第２の特異的結合パートナーが抗体である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８６】
但し、ＢとＤの両方が対象のタンパク質に連結してはいないという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質に、又は対象のタンパク質に特異的に結合している第１の特異的結合パートナーに連結し、
Ｃは対象のタンパク質を含むことがある試料であり、
Ｄは対象のタンパク質に、又は対象のタンパク質に特異的に結合している第２の特異的結合パートナーに連結することができる磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象のタンパク質を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象のタンパク質の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象のタンパク質を検出する方法。
【請求項８７】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＥＣＬ部分を光電子増倍管で検出することを更に含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
Ｂが前記対象のタンパク質の前記第１の特異的結合パートナーに連結し、更に該第１の特異的結合パートナーが抗体、抗体の一部分、又は結合タンパク質である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９２】
Ｄが前記対象のタンパク質の前記第２の特異的結合パートナーに連結し、更に該第２の特異的結合パートナーが抗体、抗体の一部分、又は結合タンパク質である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９３】
Ｂが前記対象のタンパク質の前記第１の特異的結合パートナーに連結し、Ｄが前記対象のタンパク質の前記第２の特異的結合パートナーに連結している、請求項８６に記載の方法。
【請求項９４】
前記第１及び第２の特異的結合パートナーが抗体、抗体の一部分、又は結合タンパク質である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
Ｂが、アセトニトリル、ＴＨＦ、ベンゼン、又はそれらの混合物から選択される有機溶剤に溶解している、請求項８６に記載の方法。
【請求項９６】
共反応化合物の添加を更に含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９７】
前記共反応化合物がアミン又はアミン部分である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記共反応化合物がトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ）である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記試料における前記対象のタンパク質の量が定量される、請求項８６に記載の方法。
【請求項１００】
前記試料における前記対象のタンパク質の量を、既知量の対象のタンパク質を含む試料（Ｃ）を用いる方法を実行することにより調製した検量線と、放射された電磁放射の量を比較することにより定量する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
Ｂ及びＤの１つのみが対象の分析物の類似体に連結し、
Ｂが対象の分析物の類似体に連結している場合には、Ｄは対象の分析物の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象の分析物の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象の分析物の類似体に連結しているという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物の類似体に連結しているか、又は対象の分析物の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の分析物の類似体に連結しているか、又は対象の分析物の特異的結合パートナーに連結している第２の担体であり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄを含む複合体を、該組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）該複合体におけるＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の分析物の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の分析物を検出する方法。
【請求項１０２】
Ｂ及びＤの少なくとも１つが固体支持体である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
Ｂが第１の固体支持体であり、Ｄが第２の固体支持体である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記特異的結合パートナーが抗体である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記対象の分析物が核酸である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記特異的結合パートナーが核酸である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０７】
前記対象の核酸分子がＤＮＡである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０８】
前記対象の分析物がタンパク質である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＥＣＬ部分が第１の担体に含まれている、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ＥＣＬ部分が有機溶剤に可溶である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＥＣＬ部分が水性溶剤に不溶である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ＥＣＬ部分に電気化学的ポテンシャルを適用することを更に含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記放射された電磁放射を光電子増倍管で検出することを更に含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１６】
前記第１及び第２の担体が、ビーズ、ゲル、膜、リポソーム、及びミセルから選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１７】
Ｂ及びＤが、ポリスチレン、ポリプロピレン、アガロース、アクリルアミド、ニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ、セファロース、セファデックス、ヒアルロン酸、キチン、アシルジェラン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルキチン、及びポリ（ラクチド−ｃｏ−エチレングリコール）から選択される化合物を独立に含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１８】
前記第１及び第２の担体がビーズである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１９】
前記第２の担体が磁化ビーズである、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記第１の担体がポリスチレンビーズである、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
Ａ、Ｂ、Ｄを含む複合体が、電磁場を適用することにより前記組成物の他の構成成分から単離される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２２】
Ｂを有機溶剤に溶解するステップを更に含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記有機溶剤がアセトニトリルである、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
共反応化合物の添加を更に含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１２５】
前記共反応化合物がアミン又はアミン部分である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記共反応化合物がトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ）である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２７】
前記試料における前記対象の分析物の量を定量する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１２８】
前記試料における前記対象の分析物の量を、既知量の対象の分析物を含む試料（Ｃ）を用いる方法を実行することにより調製した検量線と、放射された電磁放射の量を比較することにより定量する、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
Ｂ及びＤの１つのみが、対象の核酸の類似体に連結し、
Ｂが対象の核酸分子の類似体に連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象の核酸分子の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の類似体に連結しているという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の核酸の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結する磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象の核酸分子を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）Ｂを有機溶剤に溶解するステップと、
（ｄ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｅ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象の核酸分子の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象の核酸分子を検出する方法。
【請求項１３０】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
Ｂが前記対象の核酸分子の類似体に連結しており、更に該類似体がオリゴヌクレオチドである、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３４】
Ｄが前記対象の核酸分子の類似体に連結し、更に該類似体がオリゴヌクレオチドである、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３５】
前記対象の核酸分子の類似体と、前記対象の核酸分子の特異的結合パートナーの両方が、オリゴヌクレオチドである、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３６】
Ｂが、アセトニトリル、ＴＨＦ、ベンゼン、又はこれらの混合物から選択される有機溶剤に溶解している、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３７】
前記対象の核酸分子がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３８】
共反応化合物の添加を更に含む、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３９】
前記共反応化合物がアミン又はアミン部分である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１４０】
前記共反応化合物がトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ）である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記試料における前記対象の核酸の量を定量する、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１４２】
前記試料における前記対象の核酸の量を、既知量の対象の核酸を含む試料（Ｃ）を用いる方法を実行することにより調製した検量線と、放射された電磁放射の量を比較することにより定量する、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
Ｂ及びＤの１つのみが、対象のタンパク質の類似体に連結して、
Ｂが対象のタンパク質の類似体に連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結しており、Ｂが対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結しているという条件で、
（ａ）（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質の類似体、又は対象のタンパク質に特異的に結合している特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象のタンパク質を含むことがある試料であり、
Ｄは対象のタンパク質の類似体、又は対象のタンパク質に特異的に結合している特異的結合パートナーのいずれかに連結する磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である］
を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄ、及び対象のタンパク質を含む複合体を、組成物の他の構成成分から分離するステップと、
（ｃ）ＥＣＬ部分を電気化学的エネルギーに直接曝すことにより、ＥＣＬ部分に電磁放射の繰り返し放射を引き起こすステップと、
（ｄ）放射された電磁放射を検出し、それにより対象のタンパク質の存在を検出するステップと
を含む、試料における対象のタンパク質を検出する方法。
【請求項１４４】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４６】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４７】
前記ＥＣＬ部分を光電子増倍管で検出することを更に含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４８】
前記Ｂが前記対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結し、更に該特異的結合パートナーが抗体、抗体の一部分、又は結合タンパク質である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４９】
Ｄが前記対象のタンパク質の前記特異的結合パートナーに連結し、更に該特異的結合パートナーが抗体、抗体の一部分、又は結合タンパク質である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５０】
Ｂが、アセトニトリル、ＴＨＦ、ベンゼン、又はこれらの混合物から選択される有機溶剤に溶解している、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５１】
共反応化合物の添加を更に含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５２】
前記共反応化合物がアミン又はアミン部分である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記共反応化合物がトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰｒＡ）である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５４】
前記試料における前記対象のタンパク質の量を定量する、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記試料における前記対象のタンパク質の量を、既知量の対象のタンパク質を含む試料（Ｃ）を用いる方法を実行することにより調製した検量線と、放射された電磁放射の量を比較することにより定量する、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含む第１の担体であり、Ｂは対象の分析物の類似体に連結しているか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の分析物を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の分析物の類似体に連結することができるか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーに連結することができる第２の担体であり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。
但し、Ｂ及びＤの１つのみが、対象の分析物の類似体に連結し、
Ｂが対象の分析物の類似体に連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結しており、Ｂが対象のタンパク質の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結している。］
を含む、試料における対象の分析物を検出するための組成物。
【請求項１５７】
Ｂ及びＤの少なくとも１つが固体支持体である、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１５８】
Ｂが第１の固体支持体であり、Ｄが第２の固体支持体である、請求項１５７に記載の組成物。
【請求項１５９】
前記特異的結合パートナーがＢに連結している、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６０】
前記特異的結合パートナーがＤに連結している、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６１】
前記対象の分析物が核酸である、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６２】
前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１６３】
前記対象の分析物がタンパク質である、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６４】
前記ＥＣＬ部分が有機溶剤に可溶である、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６５】
前記ＥＣＬ部分が水性溶剤に不溶である、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６６】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６７】
Ｂ及びＤが、ビーズ、ゲル、膜、リポソーム、及びミセルである、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１６８】
Ｂ及びＤが、ポリスチレン、ポリプロピレン、アガロース、アクリルアミド、ニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ、セファロース、セファデックス、ヒアルロン酸、キチン、アシルジェラン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、及びカルボキシメチルキチン、ポリ（ラクチド−ｃｏ−エチレングリコール）から選択される化合物から独立に構成される、請求項１５７に記載の組成物。
【請求項１６９】
前記固体支持体がビーズである、請求項１５７に記載の組成物。
【請求項１７０】
前記第２の固体支持体が磁化ビーズである、請求項１５８に記載の組成物。
【請求項１７１】
前記第１の固体支持体がポリスチレンビーズである、請求項１５８に記載の組成物。
【請求項１７２】
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象の核酸分子の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結しており、
Ｃは対象の核酸分子を含むことがある試料であり、
Ｄは対象の核酸分子の類似体に連結しているか、又は対象の核酸分子の特異的結合パートナーに連結している磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。
但し、Ｂ及びＤの１つのみが、対象の核酸分子の類似体に連結し、
Ｂが対象の核酸分子の類似体に連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象の核酸分子の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象の核酸分子の類似体に連結している］
を含む、試料における対象の核酸分子を検出するための組成物。
【請求項１７３】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７４】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７５】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１７６】
Ｂが前記対象の核酸分子の前記特異的結合パートナーに連結し、更に該特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７７】
Ｄが前記対象の核酸分子の前記特異的結合パートナーに連結し、更に該特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７８】
前記対象の核酸分子の類似体、及び前記特異的結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７９】
前記対象の核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１８０】
（Ａ）ｋ、（Ｂ）ｕ、（Ｃ）、（Ｄ）ｘ
［式中、
Ａは、電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得るＥＣＬ部分であり、
ＢはＡを含むポリスチレンビーズであり、Ｂは対象のタンパク質の類似体に連結するか、又は対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結し、
Ｃは対象のタンパク質を含むことがある試料であり、
Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結するか、又は対象のタンパク質の特異的結合パートナーに連結する磁性ビーズであり、
ｋ、ｕ、及びｘは、各々、１以上の整数である。
但し、Ｂ及びＤの１つのみが、対象のタンパク質の類似体に連結し、
Ｂが対象のタンパク質の類似体に連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の結合パートナーに連結しており、Ｂが対象のタンパク質の結合パートナーに連結している場合には、Ｄは対象のタンパク質の類似体に連結している。］
を含む、試料における対象のタンパク質を検出するための組成物。
【請求項１８１】
前記ＥＣＬ部分がオスミウム及びルテニウムから選択される金属イオンを含む、請求項１８０に記載の組成物。
【請求項１８２】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１８０に記載の組成物。
【請求項１８３】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２である、請求項１８２に記載の組成物。
【請求項１８４】
Ｂが前記対象のタンパク質の前記特異的結合パートナーに連結し、更に該特異的結合パートナーが抗体又は結合タンパク質である、請求項１８０に記載の組成物。
【請求項１８５】
Ｄが前記対象のタンパク質の前記特異的結合パートナーに連結し、更に該特異的結合パートナーが抗体又は結合タンパク質である、請求項１８０に記載の組成物。
【請求項１８６】
電気化学的エネルギー源に直接曝すことにより電磁放射を繰り返し放射することが引き起こされ得る少なくとも１つのＥＣＬ部分と、
該ＥＣＬ部分を含む第１の担体であって、対象の分析物の類似体に連結するか、又は対象の分析物の第１の特異的結合パートナーに連結する、第１の担体と、
対象の分析物の類似体に連結するか、又は対象の分析物の第２の特異的結合パートナーに連結する、第２の担体と
を含む、試料における対象の分析物を検出するためのキット。
【請求項１８７】
前記ＥＣＬ部分が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３［Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４］２、ルブレン、及び９，１０−ジフェニルアントラセンから選択される、請求項１８６に記載のキット。
【請求項１８８】
前記第１及び第２の担体が固体支持体である、請求項１８６に記載のキット。
【請求項１８９】
前記第１の担体がポリスチレンビーズである、請求項１８６に記載のキット。
【請求項１９０】
前記第２の担体が磁性ビーズである、請求項１８６に記載のキット。
【請求項１９１】
前記第１の担体がポリスチレンビーズであり、前記第２の担体が磁性ビーズである、請求項１８６に記載のキット。
【請求項１９２】
前記対象の分析物が核酸である、請求項１８６に記載のキット。
【請求項１９３】
前記対象の分析物の前記第１及び第２の結合パートナーがオリゴヌクレオチドである、請求項１９２に記載のキット。
【請求項１９４】
前記対象の分析物の類似体がオリゴヌクレオチドである、請求項１９２に記載のキット。
【請求項１９５】
前記対象の分析物がタンパク質である、請求項１８６に記載のキット。
【請求項１９６】
前記対象の分析物の前記第１及び第２の結合パートナーが抗体又は特異的結合タンパク質である、請求項１９５に記載のキット。
【請求項１９７】
芳香族炭化水素を含有するポリスチレンビーズを含む組成物。
【請求項１９８】
前記芳香族炭化水素がジフェニルアントラセン及びルブレンから選択される、請求項１９７に記載の組成物。
【請求項１９９】
前記ポリスチレンビーズが約７．５×１０９個のジフェニルアントラセン分子を含む、請求項１９７に記載の組成物。
【請求項２００】
前記ポリスチレンビーズが約４×１０８個のルブレン分子を含む、請求項１９７に記載の組成物。
【請求項２０１】
前記タンパク質がＣ反応性タンパク質である、請求項１３、８６、１０８、又は１４３に記載の方法。
【請求項２０２】
前記タンパク質がＣ反応性タンパク質である、請求項６１、７９、１６３、又は１８０に記載の組成物。
【請求項２０３】
前記タンパク質がＣ反応性タンパク質である、請求項１９５に記載のキット。
【請求項２０４】
ｋが２以上の整数である、請求項１、３４、８６、１０１、１２９、又は１４３に記載の方法。
【請求項２０５】
ｋが２以上の整数である、請求項４８、７０、７９、１５６、１７２、又は１８０に記載の組成物。
【請求項２０６】
少なくとも２つのＥＣＬ部分を更に含む、請求項１８６に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１５ａ】
【図１５ｂ】
【図１６】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１５ａ】
【図１５ｂ】
【図１６】
【図１３】
【公表番号】特表２００８−５０４５２８（Ｐ２００８−５０４５２８Ａ）
【公表日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１８２９５（Ｐ２００７−５１８２９５）
【出願日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２２３８８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８３３０５
【国際公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【出願人】（５０００６８０４９）ザ、ユニバーシティ、オブ、テキサス、システム (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＸＡＳ ＳＹＳＴＥＭ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２２３８８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８３３０５
【国際公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【出願人】（５０００６８０４９）ザ、ユニバーシティ、オブ、テキサス、システム (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＸＡＳ ＳＹＳＴＥＭ
【Ｆターム（参考）】
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