４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを有効成分とする細胞周期阻害剤およびその製造法
【課題】 本発明は、微生物が生産する生理活性物質を有効成分とする細胞周期阻害剤およびその製造法の提供を目的とする。
【解決手段】
ペニシリウム属に属するＢＡＵＡ−２３２２株が生産する下記式（Ｉ）で表される４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを有効成分とする細胞周期阻害剤および同株を用いたその製造法。
【解決手段】
ペニシリウム属に属するＢＡＵＡ−２３２２株が生産する下記式（Ｉ）で表される４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを有効成分とする細胞周期阻害剤および同株を用いたその製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞周期阻害剤として有用な４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンおよびその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体を構成する細胞は、生体の恒常性を維持するために増殖と分化が厳密に制御されている。細胞は、Ｍ期・Ｇ１期・Ｓ期・Ｇ２期という一連の過程からなる細胞周期の進行により分裂・増殖を繰り返す。この細胞周期の制御機構に異常が生じると恒常性に乱れが生じ、癌になる可能性が高まる。最近では、細胞周期の調節機構が分子レベルで解明されつつあり、細胞周期を調節する物質には抗腫瘍剤の可能性が示されつつある。これらの用途のため種々の細胞周囲阻害剤が提案されているが、従来の薬剤の中には毒性や副作用などで不十分な面があり、これらの用途に適する化合物の開発が要望されている。
【特許文献１】 特開平９−８７２９６公報
【特許文献２】 特開平１０−２３７０４３公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、微生物が生産する生理活性物質を有効成分とする細胞周期阻害剤およびその製造法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、有用な生理活性物質を得ることを目的として、種々の微生物を分離し、その生産物について研究を行った結果、秋田県の土壌から分離したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＢＡＵＡ２３２２株の培養液中に細胞周期阻害作用を有する物質が生産されることを見出し、本発明を完成したものである。本発明は、以下の式（Ｉ）で表される４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを提供するものである。
【０００５】
【化２】
【０００６】
本発明の４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンは、ペニシリウム属に属する、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボン生産菌を培地に培養し、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを生成蓄積せしめ、これを採取することにより製造することができる。本発明で使用する４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボン生産菌の好ましい例としては、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＢＡＵＡ２３２２株が挙げられる。本発明はさらに、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを有効成分とする細胞周期阻害剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンは細胞周期阻害作用を有し、優れた細胞周期阻害剤の提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明で使用される上記の４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを生産する微生物は、ペニシリウム属に属するが、その中で例えば本発明者らが分離したペニシリウム属に属するＰｅｎｉｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＢＡＵＡ−２３２２株は、本発明の最も有効に使用される菌株の一例であって、本菌株の菌学的性状を示すと次の通りである。
【０００９】
（１）各種培地上での生育形態
培養はすべて２５℃で行い、寒天平板培地上での生育形成を記載した。
（１−１）ＰＤＡ寒天培地生育は良好であり、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は６５ｍｍである。コロニーはビロード状に生育して多くの分生子を形成し、分生子は乳白色である。コロニーの裏面は淡黄色である。分泌液は認められない。
（１−２）ＯＭＡ寒天培地生育は良好であり、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は６０ｍｍである。コロニーはビロード状に生育して多くの分生子を形成し、分生子は緑白色である。コロニーの裏面は淡黄色である。分泌液は認められない。
（１−３）ＭＥＡ寒天培地生育は良好であり、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は４０ｍｍである。コロニーはビロード状に生育して分生子を形成し、分生子は乳白色である。コロニーの裏面は淡黄色である。分泌液は認められない。
【００１０】
（２）形態的性質
２５℃、７日間、ＰＤＡ寒天培地上での形態的性質は以下のとおりであった。菌糸に隔壁を有している。分生子柄の幅は１〜３μｍ、長さは２０〜１００μｍで、分生子柄先端に幅１〜２μｍ、長さ５〜１０μｍの複数のフィアライドを形成する。分生子形成はフィアロ型であり、直径２〜３．５μｍの球状または楕円形で１細胞により形成される。また、分生子は連鎖し、塊状とならない。以上の菌学的性状から、本菌株はペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する一菌株と同定し、ペニシリウムエスピーＢＡＵＡ−２３２２株（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＢＡＵＡ−２３２２）と命名した。なお、当該菌株Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＢＡＵＡ−２３２２は平成１９年１月に生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１１６３として寄託されている。
【００１１】
上記菌株ＢＡＵＡ−２３２２株を培養し、当該培養物から４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを採取する方法は、具体的には後述する製造例に記載するが、概ねペニシリウム属に属する菌の培養方法に従って実施することができる。培養終了後、培養液から４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを単離・精製するには、一般に微生物代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を適宜利用して行うことができる。例えば、各種イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲルろ過クロマトグラフィー、または活性炭、アルミナ、シリカゲルなどの吸着剤によるクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー、或いは結晶化、減圧濃縮、凍結乾燥などの手段をそれぞれ単独または適宜組み合わせて、或いは反復して使用することが可能である。
【００１２】
以上のようにして製造される４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンは、後述の試験例に示すように細胞周期阻害作用を有する。４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを有効成分とする細胞周期阻害剤は、その使用目的に合わせて、使用方法、剤型、投与量（使用量）が適宜決定される。例えば、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを有効成分とする細胞周期阻害剤を生化学試験用試薬として使用する場合、有機溶剤または含水有機溶剤に溶解して各種培養細胞系へ直接投与すると、細胞周期の進行をＧ２／Ｍ期で停止する。使用可能な有機溶剤としては、例えば、メタノールやジメチルスルホキシドなどを挙げることができる。剤型としては、例えば、粉末または顆粒などの固形剤もしくは有機溶剤または含水有機溶剤に溶解した液体剤などを挙げることができる。通常、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを有効成分とする細胞周期阻害剤の効果的な使用量範囲は３０〜１００μｍｏｌ／ｌであるが、適切な使用量は培養細胞系の種類や使用目的により異なる。また、必要により上記の範囲外の量を用いることもできる。
【実施例】
【００１３】
以下に実施例を記載して本発明を具体的に記載するが、下記実施例は本発明を制限するものではなく、前・後記の趣旨を逸脱しない範囲内で変更実施することは全て本発明の技術的範囲に包含される。
【００１４】
［製造例］
グルコース３．５％、コーンスターチ１％、大豆粉２％、ペプトン０．５％、肉エキス０．５％、酵母エキス０．３％、塩化ナトリウム０．２％、リン酸二水素カリウム０．０５％、および硫酸マグネシウム（七水和物）０．０５％、さらに消泡剤としてＣＢ４４２が０．０１％含んだ培地（ｐＨ５．８）を１０ｍｌ含んだ大試験管に、前記本発明菌株ＢＡＵＡ−２３２２株を接種して２８℃で５日間振盪培養を行った。この培養液を、同組成の培地を１００ｍｌ含んだ５００ｍｌ三角フラスコに１ｍｌ接種し、２８℃、毎分２００回転下で６日間回転振盪培養を行った。この培養液を、同組成の培地を５００ｍｌ含んだ２０００ｍｌ三角フラスコ５本に５ｍｌずつ接種し、２８℃、毎分２００回転下で９日間回転振盪培養を行った。上記培養液を酢酸エチル２．５リットルを用いて２回抽出した。酢酸エチル抽出液を減圧濃縮して、褐色の油状物８ｇを得た。得られた油状物をヘキサンで洗浄し、ヘキサン不溶物４３０ｍｇを得た。このヘキサン不溶物を、０ＤＳカラム（直径２ｃｍ、長さ２５ｃｍ；カプセルパック、資生堂社製）を用いた分取高速液体クロマトグラフィーにより分離した。溶出溶媒にはアセトニトリル：水を３５：６５の割合（容量比）で配合したものを用い、流速１０ｍｌ／分、検出波長２１０ｎｍの条件下で分取高速液体クロマトグラフィーを行った。その結果、本発明化合物４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンの純品４６ｍｇ得た。
【００１５】
尚、上記のようにして得られた純品の構造は、各種機器分析（質量分析、核磁気共嗚分析等）の結果から、分子量が２７０．分子式がＣ１５Ｈ１０Ｏ５の４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンであることを確認した。
【００１６】
本発明化合物の活性は以下の方法に従って測定した。
【００１７】
［試験例］
細胞周期阻害活性には、Ｔ細胞性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いた。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、通常３７℃で１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地にて５％炭酸ガスと水蒸気を飽和させた培養器内で培養する。Ｊｕｒｋａｔ細胞を被験試料が含まれる培地中で２０時間培養し、培地を除去後、ＤＮＡ染色液（５０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム、２０μｇ／ｍｌＲＮａｓｅＡ、０．１％クエン酸ナトリウム、０．３％Ｎｏｎｉｄｅｎｔ Ｐ−４０）でＤＮＡを染色する。染色後、フローサイトメーターを用いて細胞周期の分布を解析した。これらの結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】
表１に示すデータから明らかなように、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンによるＧ２／Ｍ期停止作用が検出された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞周期阻害剤として有用な４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンおよびその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体を構成する細胞は、生体の恒常性を維持するために増殖と分化が厳密に制御されている。細胞は、Ｍ期・Ｇ１期・Ｓ期・Ｇ２期という一連の過程からなる細胞周期の進行により分裂・増殖を繰り返す。この細胞周期の制御機構に異常が生じると恒常性に乱れが生じ、癌になる可能性が高まる。最近では、細胞周期の調節機構が分子レベルで解明されつつあり、細胞周期を調節する物質には抗腫瘍剤の可能性が示されつつある。これらの用途のため種々の細胞周囲阻害剤が提案されているが、従来の薬剤の中には毒性や副作用などで不十分な面があり、これらの用途に適する化合物の開発が要望されている。
【特許文献１】 特開平９−８７２９６公報
【特許文献２】 特開平１０−２３７０４３公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、微生物が生産する生理活性物質を有効成分とする細胞周期阻害剤およびその製造法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、有用な生理活性物質を得ることを目的として、種々の微生物を分離し、その生産物について研究を行った結果、秋田県の土壌から分離したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＢＡＵＡ２３２２株の培養液中に細胞周期阻害作用を有する物質が生産されることを見出し、本発明を完成したものである。本発明は、以下の式（Ｉ）で表される４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを提供するものである。
【０００５】
【化２】
【０００６】
本発明の４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンは、ペニシリウム属に属する、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボン生産菌を培地に培養し、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを生成蓄積せしめ、これを採取することにより製造することができる。本発明で使用する４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボン生産菌の好ましい例としては、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＢＡＵＡ２３２２株が挙げられる。本発明はさらに、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを有効成分とする細胞周期阻害剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンは細胞周期阻害作用を有し、優れた細胞周期阻害剤の提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明で使用される上記の４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを生産する微生物は、ペニシリウム属に属するが、その中で例えば本発明者らが分離したペニシリウム属に属するＰｅｎｉｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＢＡＵＡ−２３２２株は、本発明の最も有効に使用される菌株の一例であって、本菌株の菌学的性状を示すと次の通りである。
【０００９】
（１）各種培地上での生育形態
培養はすべて２５℃で行い、寒天平板培地上での生育形成を記載した。
（１−１）ＰＤＡ寒天培地生育は良好であり、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は６５ｍｍである。コロニーはビロード状に生育して多くの分生子を形成し、分生子は乳白色である。コロニーの裏面は淡黄色である。分泌液は認められない。
（１−２）ＯＭＡ寒天培地生育は良好であり、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は６０ｍｍである。コロニーはビロード状に生育して多くの分生子を形成し、分生子は緑白色である。コロニーの裏面は淡黄色である。分泌液は認められない。
（１−３）ＭＥＡ寒天培地生育は良好であり、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は４０ｍｍである。コロニーはビロード状に生育して分生子を形成し、分生子は乳白色である。コロニーの裏面は淡黄色である。分泌液は認められない。
【００１０】
（２）形態的性質
２５℃、７日間、ＰＤＡ寒天培地上での形態的性質は以下のとおりであった。菌糸に隔壁を有している。分生子柄の幅は１〜３μｍ、長さは２０〜１００μｍで、分生子柄先端に幅１〜２μｍ、長さ５〜１０μｍの複数のフィアライドを形成する。分生子形成はフィアロ型であり、直径２〜３．５μｍの球状または楕円形で１細胞により形成される。また、分生子は連鎖し、塊状とならない。以上の菌学的性状から、本菌株はペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する一菌株と同定し、ペニシリウムエスピーＢＡＵＡ−２３２２株（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＢＡＵＡ−２３２２）と命名した。なお、当該菌株Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＢＡＵＡ−２３２２は平成１９年１月に生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１１６３として寄託されている。
【００１１】
上記菌株ＢＡＵＡ−２３２２株を培養し、当該培養物から４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを採取する方法は、具体的には後述する製造例に記載するが、概ねペニシリウム属に属する菌の培養方法に従って実施することができる。培養終了後、培養液から４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを単離・精製するには、一般に微生物代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を適宜利用して行うことができる。例えば、各種イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲルろ過クロマトグラフィー、または活性炭、アルミナ、シリカゲルなどの吸着剤によるクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー、或いは結晶化、減圧濃縮、凍結乾燥などの手段をそれぞれ単独または適宜組み合わせて、或いは反復して使用することが可能である。
【００１２】
以上のようにして製造される４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンは、後述の試験例に示すように細胞周期阻害作用を有する。４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを有効成分とする細胞周期阻害剤は、その使用目的に合わせて、使用方法、剤型、投与量（使用量）が適宜決定される。例えば、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを有効成分とする細胞周期阻害剤を生化学試験用試薬として使用する場合、有機溶剤または含水有機溶剤に溶解して各種培養細胞系へ直接投与すると、細胞周期の進行をＧ２／Ｍ期で停止する。使用可能な有機溶剤としては、例えば、メタノールやジメチルスルホキシドなどを挙げることができる。剤型としては、例えば、粉末または顆粒などの固形剤もしくは有機溶剤または含水有機溶剤に溶解した液体剤などを挙げることができる。通常、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを有効成分とする細胞周期阻害剤の効果的な使用量範囲は３０〜１００μｍｏｌ／ｌであるが、適切な使用量は培養細胞系の種類や使用目的により異なる。また、必要により上記の範囲外の量を用いることもできる。
【実施例】
【００１３】
以下に実施例を記載して本発明を具体的に記載するが、下記実施例は本発明を制限するものではなく、前・後記の趣旨を逸脱しない範囲内で変更実施することは全て本発明の技術的範囲に包含される。
【００１４】
［製造例］
グルコース３．５％、コーンスターチ１％、大豆粉２％、ペプトン０．５％、肉エキス０．５％、酵母エキス０．３％、塩化ナトリウム０．２％、リン酸二水素カリウム０．０５％、および硫酸マグネシウム（七水和物）０．０５％、さらに消泡剤としてＣＢ４４２が０．０１％含んだ培地（ｐＨ５．８）を１０ｍｌ含んだ大試験管に、前記本発明菌株ＢＡＵＡ−２３２２株を接種して２８℃で５日間振盪培養を行った。この培養液を、同組成の培地を１００ｍｌ含んだ５００ｍｌ三角フラスコに１ｍｌ接種し、２８℃、毎分２００回転下で６日間回転振盪培養を行った。この培養液を、同組成の培地を５００ｍｌ含んだ２０００ｍｌ三角フラスコ５本に５ｍｌずつ接種し、２８℃、毎分２００回転下で９日間回転振盪培養を行った。上記培養液を酢酸エチル２．５リットルを用いて２回抽出した。酢酸エチル抽出液を減圧濃縮して、褐色の油状物８ｇを得た。得られた油状物をヘキサンで洗浄し、ヘキサン不溶物４３０ｍｇを得た。このヘキサン不溶物を、０ＤＳカラム（直径２ｃｍ、長さ２５ｃｍ；カプセルパック、資生堂社製）を用いた分取高速液体クロマトグラフィーにより分離した。溶出溶媒にはアセトニトリル：水を３５：６５の割合（容量比）で配合したものを用い、流速１０ｍｌ／分、検出波長２１０ｎｍの条件下で分取高速液体クロマトグラフィーを行った。その結果、本発明化合物４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンの純品４６ｍｇ得た。
【００１５】
尚、上記のようにして得られた純品の構造は、各種機器分析（質量分析、核磁気共嗚分析等）の結果から、分子量が２７０．分子式がＣ１５Ｈ１０Ｏ５の４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンであることを確認した。
【００１６】
本発明化合物の活性は以下の方法に従って測定した。
【００１７】
［試験例］
細胞周期阻害活性には、Ｔ細胞性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いた。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、通常３７℃で１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地にて５％炭酸ガスと水蒸気を飽和させた培養器内で培養する。Ｊｕｒｋａｔ細胞を被験試料が含まれる培地中で２０時間培養し、培地を除去後、ＤＮＡ染色液（５０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム、２０μｇ／ｍｌＲＮａｓｅＡ、０．１％クエン酸ナトリウム、０．３％Ｎｏｎｉｄｅｎｔ Ｐ−４０）でＤＮＡを染色する。染色後、フローサイトメーターを用いて細胞周期の分布を解析した。これらの結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】
表１に示すデータから明らかなように、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンによるＧ２／Ｍ期停止作用が検出された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で表される、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを有効成分とする細胞周期阻害剤。
【化１】
【請求項２】
ペニシリウム属に属する、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボン生産菌を培地に培養し、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを生産蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンの製造法。
【請求項３】
４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボン生産菌が、ペニシリウムエスピーＢＡＵＡ−２３２２株である請求項２に記載の４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンの製造法。
【請求項１】
式（Ｉ）で表される、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを有効成分とする細胞周期阻害剤。
【化１】
【請求項２】
ペニシリウム属に属する、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボン生産菌を培地に培養し、４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンを生産蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンの製造法。
【請求項３】
４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボン生産菌が、ペニシリウムエスピーＢＡＵＡ−２３２２株である請求項２に記載の４’、７、８−トリハイドロキシイソフラボンの製造法。
【公開番号】特開２００９−７３２０（Ｐ２００９−７３２０Ａ）
【公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１９３９２６（Ｐ２００７−１９３９２６）
【出願日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 「日本薬学会第１２７年会要旨集」，２００７年３月５日，社団法人日本薬学会 「日本農芸化学会２００７年度（平成１９年度）大会講演要旨集」，２００７年３月５日，社団法人日本農芸化学会
【出願人】（５０４４０９５４３）国立大学法人秋田大学 (210)
【出願人】（５９３０６１９０５）株式会社 秋田今野商店 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 「日本薬学会第１２７年会要旨集」，２００７年３月５日，社団法人日本薬学会 「日本農芸化学会２００７年度（平成１９年度）大会講演要旨集」，２００７年３月５日，社団法人日本農芸化学会
【出願人】（５０４４０９５４３）国立大学法人秋田大学 (210)
【出願人】（５９３０６１９０５）株式会社 秋田今野商店 (4)
【Ｆターム（参考）】
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