５−ケトグルコン酸の高度生産方法
【課題】酢酸菌に属する野生株を用いて、工業的規模で５ＫＧＡを高度に生産する方法を提供する。
【解決手段】酢酸菌に属する菌株の菌体中に５ＫＧＡを生産する菌株を、以下の工程、１）酢酸菌が生育しうる培地で、酢酸菌を培養する工程、２）培養液を平板培地に塗布しコロニーを形成させる工程、３）平板培地から形態別にコロニーを単離する工程、４）単離したコロニーを、ｐＨ６．０〜６．５に調整したＧ−ＧＡ培地で、３０℃、３日間培養する工程、５）培養液から５ＫＧＡを抽出し、５ＫＧＡの蓄積量を測定する工程、を経て選抜し、上記工程により選抜された菌株を、グルコースを含む培地で、ｐＨを３．２〜４．０に維持して培養することにより５ＫＧＡを高度に生産する方法。
【解決手段】酢酸菌に属する菌株の菌体中に５ＫＧＡを生産する菌株を、以下の工程、１）酢酸菌が生育しうる培地で、酢酸菌を培養する工程、２）培養液を平板培地に塗布しコロニーを形成させる工程、３）平板培地から形態別にコロニーを単離する工程、４）単離したコロニーを、ｐＨ６．０〜６．５に調整したＧ−ＧＡ培地で、３０℃、３日間培養する工程、５）培養液から５ＫＧＡを抽出し、５ＫＧＡの蓄積量を測定する工程、を経て選抜し、上記工程により選抜された菌株を、グルコースを含む培地で、ｐＨを３．２〜４．０に維持して培養することにより５ＫＧＡを高度に生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−ケトグルコン酸（５ＫＧＡ）を効率よく生産する菌株の選抜方法、および選抜された菌株を用いた５ＫＧＡの高度な生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５ＫＧＡは、容易に酒石酸やキシラリン酸に転換することができ、それら自身有用な化学物質であるが、さらに、アスコルビン酸（ＡＳＡ、ビタミンＣ）やキシリトールなどの医薬品や食品などのほか、ポリマーの原料など、種々の工業的な用途があげられている。キシラリン酸は、ポリアミンと反応することによって、生分解性のポリマーであるポリハイドロキシ型ポリアミドポリマーを生成することができる。また、ビタミンＣについては、従来のソルボソンや、２，５−ジケトグルコン酸（２，５ＤＫＧＡ）など化学的に不安定な中間体から製造する方法に比べ、５ＫＧＡは安定であり優れた中間体としてビタミンＣの製造に利用することが可能である。
【０００３】
５ＫＧＡの製法は、良く知られているとおり、酢酸菌の１種であるグルコノバクター・サブオキシダンスを用いてグルコースを発酵させて行うことが一般的である。しかしながら、一般的な発酵法では常に不要な副生成物である２−ケトグルコン酸（２ＫＧＡ）や、２，５ＤＫＧＡが生成することが知られている（非特許文献１、２）。そのため、非特許文献３では、グルコースから５ＫＧＡへの酸化を行う酵素であるグルコン酸５−デヒドロゲナーゼ（ＧＡ ５−ＤＨ）の遺伝子を、グルコノバクター・サブオキシダンスからクローニングして、エシュリヒア・コリに導入し、２ＫＧＡや２，５ＤＫＧＡの生成を行わず、５ＫＧＡのみ生産するような遺伝子組み換え体の菌株を作製している。しかしながら、副生成物として酒石酸が多く存在することが明らかになっている。また、非特許文献４では、副生成物の２ＫＧＡ生産を触媒するグルコン酸２−デヒドロゲナーゼ（ＧＡ ２−ＤＨ）を不活性化したグルコノバクター・オキシダンスの変異株から、効率よく５ＫＧＡを生産させる方法を明らかにしているが、その生産量は十分なものとは言えない。非特許文献５では、上記変異株に、グルコン酸５−デヒドロゲナーゼ（ＧＡ ５−ＤＨ）をコードする遺伝子を改変して組込み、さらに効率よく５ＫＧＡを生産させる方法を明らかにしている。しかしながら、５ＫＧＡに変換されず残っているグルコン酸の蓄積量が多いことが問題である。
【０００４】
野生株を用いた５ＫＧＡの生産法として、特許文献１には、グルコノバクター・サブオキシダンスを用いて、その対数増殖期以降に、２８０〜８００ｎｍの波長域の光線を照射して培養することにより、照射しなかった場合の１．５倍の生産量を得る方法が開示されているが、基質からの変換率が低く、高度な生産法とは言えない。
【非特許文献１】Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｅ．，Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．，Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．，Ａｍｅｙａｍａ，Ｍ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６１：３５９−３６３，１９８３
【非特許文献２】Ｗｅｅｎｋ，Ｇ．，Ｏｌｉｊｖｅ，Ｗ．，Ｈａｒｄｅｒ，Ｗ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４００−４０５，１９８４
【非特許文献３】Ｓａｌｕｓｊａｒｖｉ，Ｔ．，Ｐｏｖｅｌａｉｎｅｎ，Ｍ．，Ｈｖｏｒｓｌｅｖ，Ｎ．ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：３０６−３１４，２００４
【非特許文献４】Ｍｕｓｔａｆａ，Ｅ．，Ｓｅｕｎｇ−Ｗｏｏｋ，Ｈ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ，Ｂ．，Ｍａｒｃｅｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６６：６６８−６７４，２００５
【非特許文献５】Ｍａｒｃｅｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７３：４４３−４５１，２００６
【特許文献１】特公平４−３６６７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、工業生産を行う場合には、野生株をそのまま利用することが望ましく、これまでの発酵法では、副生成物の少ない方法で、５ＫＧＡを効率よく、高度に生産する方法が無かった。本発明は、酢酸菌に属する野生株を用いて、工業的規模で５ＫＧＡを高度に生産する方法を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、発酵過程の培養ｐＨを制御することにより、酢酸菌に属する微生物培養液中に、５ＫＧＡを高度に蓄積できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）を提供する。
【０００８】
（１）酢酸菌に属する菌株の培養液中に５ＫＧＡを生産する菌株の選抜方法であって、以下の工程からなることを特徴とする、５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。１）酢酸菌が生育しうる培地で、酢酸菌を培養する工程、２）培養液を平板培地に塗布しコロニーを形成させる工程、３）平板培地から形態別にコロニーを単離する工程、４）単離したコロニーを、Ｇ−ＧＡ培地（グルコース-グルコン酸培地）で、２５〜３５℃、２〜５日間培養する工程、５）培養液中の５ＫＧＡの蓄積量を測定する工程。
【０００９】
（２）上記、工程４）が、単離したコロニーを、Ｇ−ＧＡ培地で、３０℃、３日間培養する工程、である上記（１）に記載の５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。
【００１０】
（３）上記、工程５）における５ＫＧＡの蓄積量が、グルコースまたはグルコン酸を基質とする時、変換率が８０％以上である菌株を選抜することを特徴とする上記（１）に記載の５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。
【００１１】
（４）酢酸菌が、グルコノバクター属に属する菌である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。
【００１２】
（５）グルコノバクター属に属する酢酸菌が、グルコノバクター・サブオキシダンス、グルコノバクター・オキシダンス、グルコノバクター・フラテウリの中から選ばれる１種の菌株である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の５ＫＧＡの選抜方法。
【００１３】
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の選抜方法により得られた５ＫＧＡ生産菌を、グルコースを含む培地で培養して５ＫＧＡを生成蓄積させ、これを回収する方法において、発酵過程で低下する培地のｐＨを３．２〜４．０に制御し、維持することを特徴とする５ＫＧＡの生産方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、２ＫＧＡをほとんど含まず、５ＫＧＡを選択的に高度に培養液中に生産する酢酸菌を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明で用いられる微生物としては、５ＫＧＡを生産する酢酸菌に属する微生物であればいかなる微生物でもよく、例えばグルコノバクター・サブオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）、グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｒｉ）などがあげられる。本発明に用いられる微生物の具体的な菌株としては、以下のような菌株が挙げられる。
【００１６】
グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８
グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａ
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２７１
グルコノバクター・オキシダンス ＡＴＣＣ ６２１
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２５５
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２５７
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５−Ｆ
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５−ＴＷ
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５−ＴＹ
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２９３
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２４４
グルコノバクター・フラテウリ ＩＦＯ ３２５４
グルコノバクター・フラテウリ ＩＦＯ ３２７０
【００１７】
グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａ、グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５−Ｆ、グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２５５−ＴＷ、グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５−ＴＹは、住所：日本国山口県山口市吉田１６７７‐１国立大学法人山口大学（ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＹＡＭＡＧＵＣＨＩ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ）から入手可能である。
【００１８】
本発明において、酢酸菌に属する菌株の中で、５ＫＧＡを効率よく生産する菌株を選抜する方法は以下の手順で行うことができる。１）酢酸菌が生育しうる培地で、凍結乾燥した酢酸菌を予備培養する。２）培養液を平板培地に塗布しコロニーを形成させる。３）平板培地から形態別にコロニーを単離する。４）単離したコロニーを、Ｇ−ＧＡ培地で、２５〜３５℃、２〜５日間培養する。より好ましくは、３０℃、３日間培養する。５）培養液中の５ＫＧＡの蓄積量を測定する。
【００１９】
培地中に蓄積した５ＫＧＡおよび、副生産物の２ＫＧＡの定量は酵素法により行うことができる。使用する酵素である、５ＫＧＡレダクターゼおよび２ＫＧＡレダクターゼの入手が困難な場合は、例えば、薄層クロマトグラフィーなどを用いて、簡便に５ＫＧＡおよび２ＫＧＡの定性を行うことができる。すなわち、Ｇ−ＧＡ培地で２〜５日間培養した酢酸菌培養液を、例えば、シリカゲルプレート６０（メルク社製）に載せ、展開溶媒（酢酸エチル：酢酸：メタノール：蒸留水＝６：１．５：１．５：１）で展開して薄層クロマトグラフィーを行う。シリカゲルプレートは乾燥させ、発色試薬（例えば、０．２ｇのジフェニルアミンを、２ｍｌのアニリン、１０ｍｌのアセトンおよび１．５ｍｌのリン酸に溶解したもの）を噴霧することにより、５ＫＧＡおよび、副生産物の２ＫＧＡを定性的に確認し、５ＫＧＡの蓄積量の比較は、スポットの大きさで視覚的に判断することができる。
【００２０】
また、本発明は、上記１）〜５）の工程を経て、選抜された菌株を用いて、５ＫＧＡを高度に生産するものである。選抜の基準としては、５ＫＧＡの蓄積量が、グルコースまたはグルコン酸を基質とする時、変換率が８０％以上である菌株を選抜する。より好ましくは、８５％以上の変換率を有する菌株である。得られた菌株は、最終グリセロール濃度が５０％となるようにグリセロールを加えて凍結し、−８０℃で保存しておくことが望ましい。使用に際しては、保存している菌をそのまま、あるいは保存菌体を再度上記１）〜５）の工程を行い、菌株を選抜して用いることもできる。
【００２１】
本発明に使用する酢酸菌の生育培地は、酢酸菌を培養する通常の培地を使用することができるが、炭素源、窒素源、無機イオン、有機栄養源を適切に含む培地を用いることが好ましい。炭素源として、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フラクトース、Ｌ−ソルボースあるいはグリセロールなどの１種又は２種以上を用い、有機栄養源として、ポリペプトン、イーストエキス、麦芽エキス、肉エキス、カゼイン分解物などから選んで用いることができる。特に、グルコノバクター属菌の培養による５ＫＧＡの生産には、Ｇ−ＧＡ培地（１％グルコース、１％グルコン酸ナトリウム、０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス）が望ましく、Ｇ−ＧＡ培地の組成を適切に変更した培地で、例えば、２％グルコース培地（２％グルコース、０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス）、１０％グルコース培地（１０％グルコース、０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス）などで、５ＫＧＡの生産を良好に行うことができる。上記発酵培地は、５ＫＧＡ生産菌の選抜にも使用することができる。
【００２２】
本発明の５ＫＧＡを蓄積させる培養温度は、酢酸菌の培養に通常使用される温度、例えば２０〜３５℃、好ましくは２５〜３５℃で、３０℃が望ましい。反応が進むに伴い、生成物による培養液のｐＨ低下が起ることから、培養液に炭酸カルシウムや水酸化ナトリウム、水酸化カルシウムなどを添加して、培養液のｐＨ制御をすることにより、５ＫＧＡの収率を高めることができる。培地のｐＨは、ｐＨ２．５〜７．０、好ましくはｐＨ３．０〜６．５で行う。副生成物の２ＫＧＡや２，５ＤＫＧなどの生産を減少させ、５ＫＧＡを選択的に生産させるためには、ｐＨ制御をｐＨ３．２〜４．０に行うことが望ましい。
【００２３】
培養は、静置しても、撹伴して行っても良く、５ＫＧＡの生産が高まる方法であればいずれの方法を採用しても良いが、振盪もしくは攪拌することが望ましい。培養時間は、使用する菌体の活性、基質の濃度や種類などの条件によって異なるが、４８〜２００時間が望ましい。５ＫＧＡ生産菌を選抜する際は、２〜５日培養を行うことにより、形態別の単離が可能となる。より好ましい培養期間は３日間である。工業生産においては、菌体の生育曲線と、５ＫＧＡの生産曲線の関連をあらかじめ把握しておくと、生育状況から５ＫＧＡを最も高度に生産する時期に培養を終了することが可能である。
【００２４】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００２５】
＜菌体の選抜方法＞
ＩＦＯ （ＮＢＲＣ）から譲渡されたグルコノバクター属酢酸菌（グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８、グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５）の凍結乾燥菌体を、５ｍｌのＧ−ＧＡ培地（１％グルコース、１％グルコン酸ナトリウム、０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス）に懸濁・接種し、３０℃で３日間程度の振盪培養を行った。その培養液を滅菌水で稀釈し、Ｇ−ＧＡ平板培地に塗布しコロニーを観察した（図１）。得られたコロニーが均一の形態であったものは、そのコロニーを再び５ｍｌのＧ−ＧＡ培地に移して培養し、不均一であった菌株のものは、形態ごとに分別して採取し、再びＧ−ＧＡ培地で培養を行い、培養液中に蓄積した５ＫＧＡを定量した。
【実施例２】
【００２６】
＜グルコノバクター属菌の５ＫＧＡの生産＞
実施例１で選抜した菌株および保存株について、培養液中の５ＫＧＡの蓄積量を測定した。すなわち、グルコノバクター属酢酸菌１６株を各々１００ｍｌのＧ−ＧＡ培地（１％グルコース、１％グルコン酸ナトリウム、０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス）で３０℃、２００回転／分で回転振盪を行いながら２日間または５日間培養した。培養液中の５ＫＧＡおよび２ＫＧＡの蓄積量は、それぞれ５ＫＧＡレダクターゼ、２ＫＧＡレダクターゼを用いた酵素法によって測定した。結果を表１に示した。表から、実施例１で選抜したグルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａ（グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８から選抜した菌株）と、グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５−ＴＹ（グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５から選抜した菌株）が、５ＫＧＡを選択的に高度に生産することが分かった。
【００２７】
【表１】
【００２８】
５ＫＧＡの蓄積が確かめられ、５ＫＧＡの生産が優れていると選抜された菌株は、培養液ごとグリセロールに懸濁し（０．５ｍｌの培養液に対し０．５ｍｌのグリセロール）、よく攪拌した後に液体窒素で瞬時に凍結し、−８０℃に保存した。
【実施例３】
【００２９】
＜５ＫＧＡ生産のための培養条件の検討＞
【００３０】
１．培地組成
実施例２で、５ＫＧＡの生産が優れていたグルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａを用いて、培養条件の検討を行った。培地は、これまで５ＫＧＡ生産に最適とされているＧ−ＧＡ培地（１％グルコース、１％グルコン酸ナトリウム、０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス）を対照としてグルコース単独培地（２％グルコース、０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス）とした。さらに、グルコース単独培地を、１Ｍ塩酸と４ＭのＮａＯＨでｐＨ５に調整した培地での５ＫＧＡの生産も行った。本実験の培養は、卓上型培養装置（ＭＤＬ５００型５Ｌ，４連、丸菱バイオレンジ社製）を用いた。培養液は３Ｌとした。
【００３１】
結果を図２に示した。グルコース単独培地では、グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａの生育がｐＨの著しい低下によって抑えられ、５ＫＧＡの生産量は、対照のＧ−ＧＡ培地での生産量よりも低い値であった。一方、ｐＨの低下を抑えるために行ったｐＨ５調整培地では、グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａは良好に生育したが、５ＫＧＡ生成が更に抑えられ、副生成物の２ＫＧＡが生成していた。結果として、グルコース単独培地ではグルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａの生育と５ＫＧＡの生成がともに抑えられ、また、生育を改善する為に行ったｐＨ５の維持は、副生成物の形成をもたらした。また、ｐＨの著しい低下（ｐＨ３．０以下）はグルコン酸を培地へ蓄積し、良好な５ＫＧＡへの変換を抑制していた。
【００３２】
２．培地のｐＨ
実施例２で、５ＫＧＡの生産が優れていたグルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａを用いて、培養液のｐＨ制御の検討を行った。設定したｐＨは、３．５、４．０、４．５、５．０である。培地はグルコース単独培地を用い、培養液は３Ｌとした。卓上型培養装置（ＭＤＬ５００型５Ｌ，４連、丸菱バイオレンジ社製）を用いて、各ｐＨを維持するために、各ｐＨ以下になると４ＭＮａＯＨが自動的に滴下されるように制御した。
【００３３】
結果を図３に示した。ｐＨ４およびｐＨ３．５では培地中のグルコースが効率よく５ＫＧＡへと変換され、最終的に１１１ｍＭのグルコースから９６ｍＭの５ＫＧＡ（変換率：８６．５％）を生産した。さらにこのｐＨ制御はｐＨが低下することに伴って、副生成物２ＫＧＡの生産を抑えることも明らかとなった。本実験により発酵過程のｐＨ低下をｐＨ３．２〜ｐＨ４．０の領域に制御することで副生成物の生成を抑えた効率のよい５ＫＧＡ生産が可能になることが分かった。一方で、制御するｐＨ領域が高い場合（ｐＨ４．２−ｐＨ５．０）、グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａは、蓄積している５ＫＧＡを資化することにより再び増殖を始め、５ＫＧＡ収量の著しい低下をもたらした。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明による５ＫＧＡの発酵生産法は、遺伝子組み換えに頼らない、野生株を用いた５ＫＧＡの高度生産法であり、環境汚染の問題も無く、生産した５ＫＧＡの使用に関しても安全であることから、食品などの有用な原料となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】凍結乾燥菌体から形態の異なるコロニーを単離する方法を示した図である。
【図２】グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａ株によるグルコース単独培地での培養状況を示す図である。
【図３】グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａ株によるｐＨ制御下での培養状況を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−ケトグルコン酸（５ＫＧＡ）を効率よく生産する菌株の選抜方法、および選抜された菌株を用いた５ＫＧＡの高度な生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５ＫＧＡは、容易に酒石酸やキシラリン酸に転換することができ、それら自身有用な化学物質であるが、さらに、アスコルビン酸（ＡＳＡ、ビタミンＣ）やキシリトールなどの医薬品や食品などのほか、ポリマーの原料など、種々の工業的な用途があげられている。キシラリン酸は、ポリアミンと反応することによって、生分解性のポリマーであるポリハイドロキシ型ポリアミドポリマーを生成することができる。また、ビタミンＣについては、従来のソルボソンや、２，５−ジケトグルコン酸（２，５ＤＫＧＡ）など化学的に不安定な中間体から製造する方法に比べ、５ＫＧＡは安定であり優れた中間体としてビタミンＣの製造に利用することが可能である。
【０００３】
５ＫＧＡの製法は、良く知られているとおり、酢酸菌の１種であるグルコノバクター・サブオキシダンスを用いてグルコースを発酵させて行うことが一般的である。しかしながら、一般的な発酵法では常に不要な副生成物である２−ケトグルコン酸（２ＫＧＡ）や、２，５ＤＫＧＡが生成することが知られている（非特許文献１、２）。そのため、非特許文献３では、グルコースから５ＫＧＡへの酸化を行う酵素であるグルコン酸５−デヒドロゲナーゼ（ＧＡ ５−ＤＨ）の遺伝子を、グルコノバクター・サブオキシダンスからクローニングして、エシュリヒア・コリに導入し、２ＫＧＡや２，５ＤＫＧＡの生成を行わず、５ＫＧＡのみ生産するような遺伝子組み換え体の菌株を作製している。しかしながら、副生成物として酒石酸が多く存在することが明らかになっている。また、非特許文献４では、副生成物の２ＫＧＡ生産を触媒するグルコン酸２−デヒドロゲナーゼ（ＧＡ ２−ＤＨ）を不活性化したグルコノバクター・オキシダンスの変異株から、効率よく５ＫＧＡを生産させる方法を明らかにしているが、その生産量は十分なものとは言えない。非特許文献５では、上記変異株に、グルコン酸５−デヒドロゲナーゼ（ＧＡ ５−ＤＨ）をコードする遺伝子を改変して組込み、さらに効率よく５ＫＧＡを生産させる方法を明らかにしている。しかしながら、５ＫＧＡに変換されず残っているグルコン酸の蓄積量が多いことが問題である。
【０００４】
野生株を用いた５ＫＧＡの生産法として、特許文献１には、グルコノバクター・サブオキシダンスを用いて、その対数増殖期以降に、２８０〜８００ｎｍの波長域の光線を照射して培養することにより、照射しなかった場合の１．５倍の生産量を得る方法が開示されているが、基質からの変換率が低く、高度な生産法とは言えない。
【非特許文献１】Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｅ．，Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．，Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．，Ａｍｅｙａｍａ，Ｍ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６１：３５９−３６３，１９８３
【非特許文献２】Ｗｅｅｎｋ，Ｇ．，Ｏｌｉｊｖｅ，Ｗ．，Ｈａｒｄｅｒ，Ｗ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４００−４０５，１９８４
【非特許文献３】Ｓａｌｕｓｊａｒｖｉ，Ｔ．，Ｐｏｖｅｌａｉｎｅｎ，Ｍ．，Ｈｖｏｒｓｌｅｖ，Ｎ．ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：３０６−３１４，２００４
【非特許文献４】Ｍｕｓｔａｆａ，Ｅ．，Ｓｅｕｎｇ−Ｗｏｏｋ，Ｈ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ，Ｂ．，Ｍａｒｃｅｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６６：６６８−６７４，２００５
【非特許文献５】Ｍａｒｃｅｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７３：４４３−４５１，２００６
【特許文献１】特公平４−３６６７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、工業生産を行う場合には、野生株をそのまま利用することが望ましく、これまでの発酵法では、副生成物の少ない方法で、５ＫＧＡを効率よく、高度に生産する方法が無かった。本発明は、酢酸菌に属する野生株を用いて、工業的規模で５ＫＧＡを高度に生産する方法を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、発酵過程の培養ｐＨを制御することにより、酢酸菌に属する微生物培養液中に、５ＫＧＡを高度に蓄積できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）を提供する。
【０００８】
（１）酢酸菌に属する菌株の培養液中に５ＫＧＡを生産する菌株の選抜方法であって、以下の工程からなることを特徴とする、５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。１）酢酸菌が生育しうる培地で、酢酸菌を培養する工程、２）培養液を平板培地に塗布しコロニーを形成させる工程、３）平板培地から形態別にコロニーを単離する工程、４）単離したコロニーを、Ｇ−ＧＡ培地（グルコース-グルコン酸培地）で、２５〜３５℃、２〜５日間培養する工程、５）培養液中の５ＫＧＡの蓄積量を測定する工程。
【０００９】
（２）上記、工程４）が、単離したコロニーを、Ｇ−ＧＡ培地で、３０℃、３日間培養する工程、である上記（１）に記載の５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。
【００１０】
（３）上記、工程５）における５ＫＧＡの蓄積量が、グルコースまたはグルコン酸を基質とする時、変換率が８０％以上である菌株を選抜することを特徴とする上記（１）に記載の５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。
【００１１】
（４）酢酸菌が、グルコノバクター属に属する菌である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。
【００１２】
（５）グルコノバクター属に属する酢酸菌が、グルコノバクター・サブオキシダンス、グルコノバクター・オキシダンス、グルコノバクター・フラテウリの中から選ばれる１種の菌株である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の５ＫＧＡの選抜方法。
【００１３】
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の選抜方法により得られた５ＫＧＡ生産菌を、グルコースを含む培地で培養して５ＫＧＡを生成蓄積させ、これを回収する方法において、発酵過程で低下する培地のｐＨを３．２〜４．０に制御し、維持することを特徴とする５ＫＧＡの生産方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、２ＫＧＡをほとんど含まず、５ＫＧＡを選択的に高度に培養液中に生産する酢酸菌を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明で用いられる微生物としては、５ＫＧＡを生産する酢酸菌に属する微生物であればいかなる微生物でもよく、例えばグルコノバクター・サブオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）、グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｒｉ）などがあげられる。本発明に用いられる微生物の具体的な菌株としては、以下のような菌株が挙げられる。
【００１６】
グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８
グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａ
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２７１
グルコノバクター・オキシダンス ＡＴＣＣ ６２１
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２５５
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２５７
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５−Ｆ
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５−ＴＷ
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５−ＴＹ
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２９３
グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２４４
グルコノバクター・フラテウリ ＩＦＯ ３２５４
グルコノバクター・フラテウリ ＩＦＯ ３２７０
【００１７】
グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａ、グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５−Ｆ、グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２５５−ＴＷ、グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５−ＴＹは、住所：日本国山口県山口市吉田１６７７‐１国立大学法人山口大学（ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＹＡＭＡＧＵＣＨＩ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ）から入手可能である。
【００１８】
本発明において、酢酸菌に属する菌株の中で、５ＫＧＡを効率よく生産する菌株を選抜する方法は以下の手順で行うことができる。１）酢酸菌が生育しうる培地で、凍結乾燥した酢酸菌を予備培養する。２）培養液を平板培地に塗布しコロニーを形成させる。３）平板培地から形態別にコロニーを単離する。４）単離したコロニーを、Ｇ−ＧＡ培地で、２５〜３５℃、２〜５日間培養する。より好ましくは、３０℃、３日間培養する。５）培養液中の５ＫＧＡの蓄積量を測定する。
【００１９】
培地中に蓄積した５ＫＧＡおよび、副生産物の２ＫＧＡの定量は酵素法により行うことができる。使用する酵素である、５ＫＧＡレダクターゼおよび２ＫＧＡレダクターゼの入手が困難な場合は、例えば、薄層クロマトグラフィーなどを用いて、簡便に５ＫＧＡおよび２ＫＧＡの定性を行うことができる。すなわち、Ｇ−ＧＡ培地で２〜５日間培養した酢酸菌培養液を、例えば、シリカゲルプレート６０（メルク社製）に載せ、展開溶媒（酢酸エチル：酢酸：メタノール：蒸留水＝６：１．５：１．５：１）で展開して薄層クロマトグラフィーを行う。シリカゲルプレートは乾燥させ、発色試薬（例えば、０．２ｇのジフェニルアミンを、２ｍｌのアニリン、１０ｍｌのアセトンおよび１．５ｍｌのリン酸に溶解したもの）を噴霧することにより、５ＫＧＡおよび、副生産物の２ＫＧＡを定性的に確認し、５ＫＧＡの蓄積量の比較は、スポットの大きさで視覚的に判断することができる。
【００２０】
また、本発明は、上記１）〜５）の工程を経て、選抜された菌株を用いて、５ＫＧＡを高度に生産するものである。選抜の基準としては、５ＫＧＡの蓄積量が、グルコースまたはグルコン酸を基質とする時、変換率が８０％以上である菌株を選抜する。より好ましくは、８５％以上の変換率を有する菌株である。得られた菌株は、最終グリセロール濃度が５０％となるようにグリセロールを加えて凍結し、−８０℃で保存しておくことが望ましい。使用に際しては、保存している菌をそのまま、あるいは保存菌体を再度上記１）〜５）の工程を行い、菌株を選抜して用いることもできる。
【００２１】
本発明に使用する酢酸菌の生育培地は、酢酸菌を培養する通常の培地を使用することができるが、炭素源、窒素源、無機イオン、有機栄養源を適切に含む培地を用いることが好ましい。炭素源として、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フラクトース、Ｌ−ソルボースあるいはグリセロールなどの１種又は２種以上を用い、有機栄養源として、ポリペプトン、イーストエキス、麦芽エキス、肉エキス、カゼイン分解物などから選んで用いることができる。特に、グルコノバクター属菌の培養による５ＫＧＡの生産には、Ｇ−ＧＡ培地（１％グルコース、１％グルコン酸ナトリウム、０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス）が望ましく、Ｇ−ＧＡ培地の組成を適切に変更した培地で、例えば、２％グルコース培地（２％グルコース、０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス）、１０％グルコース培地（１０％グルコース、０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス）などで、５ＫＧＡの生産を良好に行うことができる。上記発酵培地は、５ＫＧＡ生産菌の選抜にも使用することができる。
【００２２】
本発明の５ＫＧＡを蓄積させる培養温度は、酢酸菌の培養に通常使用される温度、例えば２０〜３５℃、好ましくは２５〜３５℃で、３０℃が望ましい。反応が進むに伴い、生成物による培養液のｐＨ低下が起ることから、培養液に炭酸カルシウムや水酸化ナトリウム、水酸化カルシウムなどを添加して、培養液のｐＨ制御をすることにより、５ＫＧＡの収率を高めることができる。培地のｐＨは、ｐＨ２．５〜７．０、好ましくはｐＨ３．０〜６．５で行う。副生成物の２ＫＧＡや２，５ＤＫＧなどの生産を減少させ、５ＫＧＡを選択的に生産させるためには、ｐＨ制御をｐＨ３．２〜４．０に行うことが望ましい。
【００２３】
培養は、静置しても、撹伴して行っても良く、５ＫＧＡの生産が高まる方法であればいずれの方法を採用しても良いが、振盪もしくは攪拌することが望ましい。培養時間は、使用する菌体の活性、基質の濃度や種類などの条件によって異なるが、４８〜２００時間が望ましい。５ＫＧＡ生産菌を選抜する際は、２〜５日培養を行うことにより、形態別の単離が可能となる。より好ましい培養期間は３日間である。工業生産においては、菌体の生育曲線と、５ＫＧＡの生産曲線の関連をあらかじめ把握しておくと、生育状況から５ＫＧＡを最も高度に生産する時期に培養を終了することが可能である。
【００２４】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００２５】
＜菌体の選抜方法＞
ＩＦＯ （ＮＢＲＣ）から譲渡されたグルコノバクター属酢酸菌（グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８、グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５）の凍結乾燥菌体を、５ｍｌのＧ−ＧＡ培地（１％グルコース、１％グルコン酸ナトリウム、０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス）に懸濁・接種し、３０℃で３日間程度の振盪培養を行った。その培養液を滅菌水で稀釈し、Ｇ−ＧＡ平板培地に塗布しコロニーを観察した（図１）。得られたコロニーが均一の形態であったものは、そのコロニーを再び５ｍｌのＧ−ＧＡ培地に移して培養し、不均一であった菌株のものは、形態ごとに分別して採取し、再びＧ−ＧＡ培地で培養を行い、培養液中に蓄積した５ＫＧＡを定量した。
【実施例２】
【００２６】
＜グルコノバクター属菌の５ＫＧＡの生産＞
実施例１で選抜した菌株および保存株について、培養液中の５ＫＧＡの蓄積量を測定した。すなわち、グルコノバクター属酢酸菌１６株を各々１００ｍｌのＧ−ＧＡ培地（１％グルコース、１％グルコン酸ナトリウム、０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス）で３０℃、２００回転／分で回転振盪を行いながら２日間または５日間培養した。培養液中の５ＫＧＡおよび２ＫＧＡの蓄積量は、それぞれ５ＫＧＡレダクターゼ、２ＫＧＡレダクターゼを用いた酵素法によって測定した。結果を表１に示した。表から、実施例１で選抜したグルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａ（グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８から選抜した菌株）と、グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５−ＴＹ（グルコノバクター・オキシダンス ＩＦＯ ３２８５から選抜した菌株）が、５ＫＧＡを選択的に高度に生産することが分かった。
【００２７】
【表１】
【００２８】
５ＫＧＡの蓄積が確かめられ、５ＫＧＡの生産が優れていると選抜された菌株は、培養液ごとグリセロールに懸濁し（０．５ｍｌの培養液に対し０．５ｍｌのグリセロール）、よく攪拌した後に液体窒素で瞬時に凍結し、−８０℃に保存した。
【実施例３】
【００２９】
＜５ＫＧＡ生産のための培養条件の検討＞
【００３０】
１．培地組成
実施例２で、５ＫＧＡの生産が優れていたグルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａを用いて、培養条件の検討を行った。培地は、これまで５ＫＧＡ生産に最適とされているＧ−ＧＡ培地（１％グルコース、１％グルコン酸ナトリウム、０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス）を対照としてグルコース単独培地（２％グルコース、０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス）とした。さらに、グルコース単独培地を、１Ｍ塩酸と４ＭのＮａＯＨでｐＨ５に調整した培地での５ＫＧＡの生産も行った。本実験の培養は、卓上型培養装置（ＭＤＬ５００型５Ｌ，４連、丸菱バイオレンジ社製）を用いた。培養液は３Ｌとした。
【００３１】
結果を図２に示した。グルコース単独培地では、グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａの生育がｐＨの著しい低下によって抑えられ、５ＫＧＡの生産量は、対照のＧ−ＧＡ培地での生産量よりも低い値であった。一方、ｐＨの低下を抑えるために行ったｐＨ５調整培地では、グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａは良好に生育したが、５ＫＧＡ生成が更に抑えられ、副生成物の２ＫＧＡが生成していた。結果として、グルコース単独培地ではグルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａの生育と５ＫＧＡの生成がともに抑えられ、また、生育を改善する為に行ったｐＨ５の維持は、副生成物の形成をもたらした。また、ｐＨの著しい低下（ｐＨ３．０以下）はグルコン酸を培地へ蓄積し、良好な５ＫＧＡへの変換を抑制していた。
【００３２】
２．培地のｐＨ
実施例２で、５ＫＧＡの生産が優れていたグルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａを用いて、培養液のｐＨ制御の検討を行った。設定したｐＨは、３．５、４．０、４．５、５．０である。培地はグルコース単独培地を用い、培養液は３Ｌとした。卓上型培養装置（ＭＤＬ５００型５Ｌ，４連、丸菱バイオレンジ社製）を用いて、各ｐＨを維持するために、各ｐＨ以下になると４ＭＮａＯＨが自動的に滴下されるように制御した。
【００３３】
結果を図３に示した。ｐＨ４およびｐＨ３．５では培地中のグルコースが効率よく５ＫＧＡへと変換され、最終的に１１１ｍＭのグルコースから９６ｍＭの５ＫＧＡ（変換率：８６．５％）を生産した。さらにこのｐＨ制御はｐＨが低下することに伴って、副生成物２ＫＧＡの生産を抑えることも明らかとなった。本実験により発酵過程のｐＨ低下をｐＨ３．２〜ｐＨ４．０の領域に制御することで副生成物の生成を抑えた効率のよい５ＫＧＡ生産が可能になることが分かった。一方で、制御するｐＨ領域が高い場合（ｐＨ４．２−ｐＨ５．０）、グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａは、蓄積している５ＫＧＡを資化することにより再び増殖を始め、５ＫＧＡ収量の著しい低下をもたらした。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明による５ＫＧＡの発酵生産法は、遺伝子組み換えに頼らない、野生株を用いた５ＫＧＡの高度生産法であり、環境汚染の問題も無く、生産した５ＫＧＡの使用に関しても安全であることから、食品などの有用な原料となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】凍結乾燥菌体から形態の異なるコロニーを単離する方法を示した図である。
【図２】グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａ株によるグルコース単独培地での培養状況を示す図である。
【図３】グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８−Ａ株によるｐＨ制御下での培養状況を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸菌に属する菌株の菌体中に５ＫＧＡを生産する菌株の選抜方法であって、以下の工程からなることを特徴とする、５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。１）酢酸菌が生育しうる培地で、酢酸菌を培養する工程、２）培養液を平板培地に塗布しコロニーを形成させる工程、３）平板培地から形態別にコロニーを単離する工程、４）単離したコロニーを、Ｇ−ＧＡ培地（グルコース-グルコン酸培地）で、２５〜３５℃、２〜５日間培養する工程、５）培養液中の５ＫＧＡの蓄積量を測定する工程。
【請求項２】
上記、工程４）が、単離したコロニーを、Ｇ−ＧＡ培地で、３０℃、３日間培養する工程、である請求項１に記載の５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。
【請求項３】
上記、工程５）における５ＫＧＡの蓄積量が、グルコースまたはグルコン酸を基質とする時、変換率が８０％以上である菌株を選抜することを特徴とする請求項１に記載の５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。
【請求項４】
酢酸菌が、グルコノバクター属に属する菌である、請求項１〜３のいずれかに記載の５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。
【請求項５】
グルコノバクター属に属する酢酸菌が、グルコノバクター・サブオキシダンス、グルコノバクター・オキシダンス、グルコノバクター・フラテウリの中から選ばれる１種の菌株である、請求項１〜４のいずれかに記載の５ＫＧＡの選抜方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の選抜方法により得られた５ＫＧＡ生産菌を、グルコースを含む培地で培養して５ＫＧＡを生成蓄積させ、これを回収する方法において、発酵過程で低下する培地のｐＨを３．２〜４．０に制御し、維持することを特徴とする５ＫＧＡの生産方法。
【請求項１】
酢酸菌に属する菌株の菌体中に５ＫＧＡを生産する菌株の選抜方法であって、以下の工程からなることを特徴とする、５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。１）酢酸菌が生育しうる培地で、酢酸菌を培養する工程、２）培養液を平板培地に塗布しコロニーを形成させる工程、３）平板培地から形態別にコロニーを単離する工程、４）単離したコロニーを、Ｇ−ＧＡ培地（グルコース-グルコン酸培地）で、２５〜３５℃、２〜５日間培養する工程、５）培養液中の５ＫＧＡの蓄積量を測定する工程。
【請求項２】
上記、工程４）が、単離したコロニーを、Ｇ−ＧＡ培地で、３０℃、３日間培養する工程、である請求項１に記載の５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。
【請求項３】
上記、工程５）における５ＫＧＡの蓄積量が、グルコースまたはグルコン酸を基質とする時、変換率が８０％以上である菌株を選抜することを特徴とする請求項１に記載の５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。
【請求項４】
酢酸菌が、グルコノバクター属に属する菌である、請求項１〜３のいずれかに記載の５ＫＧＡ生産菌の選抜方法。
【請求項５】
グルコノバクター属に属する酢酸菌が、グルコノバクター・サブオキシダンス、グルコノバクター・オキシダンス、グルコノバクター・フラテウリの中から選ばれる１種の菌株である、請求項１〜４のいずれかに記載の５ＫＧＡの選抜方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の選抜方法により得られた５ＫＧＡ生産菌を、グルコースを含む培地で培養して５ＫＧＡを生成蓄積させ、これを回収する方法において、発酵過程で低下する培地のｐＨを３．２〜４．０に制御し、維持することを特徴とする５ＫＧＡの生産方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−２３７１９１（Ｐ２００８−２３７１９１Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８６５９２（Ｐ２００７−８６５９２）
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【Ｆターム（参考）】
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