８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー
【課題】安定な物質を用いた８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）を簡便に検出可能なＤＮＡアプタマーを提供する。
【解決手段】特定の塩基配列からなり、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー。これらのＤＮＡアプタマーを、哺乳動物のストレスを評価するためのストレスマーカーとして利用する。すなわち、哺乳動物の尿を採取するステップと、尿および蛍光標識された上記ＤＮＡアプタマーを接触させるステップと、蛍光標識を測定するステップと、を行うことにより、哺乳動物のストレスを評価する。
【解決手段】特定の塩基配列からなり、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー。これらのＤＮＡアプタマーを、哺乳動物のストレスを評価するためのストレスマーカーとして利用する。すなわち、哺乳動物の尿を採取するステップと、尿および蛍光標識された上記ＤＮＡアプタマーを接触させるステップと、蛍光標識を測定するステップと、を行うことにより、哺乳動物のストレスを評価する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
人体の老化現象、および様々な疾患を引き起こす原因は、活性酸素による人体中での酸化反応であると報告されている。そのため、医療や健康産業の分野で酸化損傷の程度を効果的に評価することが求められている。
【０００３】
近年、生体ストレスのマーカー分子（評価対象）として、遺伝子配列中のデオキシグアノシン（ｄＧ）が活性酸素種によって酸化された８−ヒドロキシデオキシグアノシン（以下、８−ＯＨｄＧと略称する）が注目を浴びている。
【０００４】
例えば、特許文献１には、尿中の修飾核酸塩基である８−ＯＨｄＧを指標として全身的な酸化ストレスの程度を測定して老化度を測定できる旨記載されている。また、特許文献２には、８−ＯＨｄＧ分子を認識できるモノクローナル抗体が記載されている。
【０００５】
【特許文献１】特許第２８５０１２８号明細書
【特許文献２】特許第３０９１９７４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
第一に、特許文献１に記載の技術では、８−ＯＨｄＧを含むサンプルを高速液体クロマトグラフィーにかけて８−ＯＨｄＧを分離した上で、電気化学的手法または紫外部吸収検出器などにより８−ＯＨｄＧの濃度を測定する。そのため、８−ＯＨｄＧの測定方法が複雑かつ煩雑であり、８−ＯＨｄＧの測定方法の面でさらなる改善の余地があった。
【０００７】
第二に、特許文献２に記載の技術では、熱やｐＨの変動に対して不安定であるモノクローナル抗体を用いて８−ＯＨｄＧの濃度を測定するため、測定に用いる物質の安定性の面でさらなる改善の余地があった。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、安定な物質を用いた８−ＯＨｄＧの簡便な検出技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、配列番号１乃至１８いずれかで表される塩基配列からなり、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーが提供される。この構成によれば、安定性および８−ＯＨｄＧに対する特異性に優れるＤＮＡアプタマーを用いるため、安定な物質を用いて簡便に８−ＯＨｄＧを検出することができる。
【００１０】
なお、上記のＤＮＡアプタマーは、上記の塩基配列に限定されず、これらの塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも同様の作用効果を奏する。
【００１１】
なお、上記のＤＮＡアプタマーは、上記の塩基配列に限定されず、これらの塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも同様の作用効果を奏する。
【００１２】
なお、上記のＤＮＡアプタマーは、上記の塩基配列に限定されず、これらの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも同様の作用効果を奏する。
【００１３】
なお、上記のＤＮＡアプタマーは、上記の塩基配列に限定されず、これらの塩基配列からなるポリヌクレオチド分子に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする哺乳動物由来のポリヌクレオチド分子の塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも同様の作用効果を奏する。
【００１４】
なお、上記のＤＮＡアプタマーは、上記の塩基配列に限定されず、上記のＤＮＡアプタマーの塩基配列のうち少なくとも一部を含む塩基配列からなり、前記塩基配列の長さが８０塩基以上９０塩基以下であるＤＮＡアプタマーも同様の作用効果を奏する。
【００１５】
また、本発明によれば、上記のＤＮＡアプタマーを含む、哺乳動物のストレスを評価するためのストレスマーカーが提供される。この構成によれば、安定性および８−ＯＨｄＧに対する特異性に優れるＤＮＡアプタマーを用いるため、安定な物質を用いて簡便に哺乳動物のストレスの指標となる８−ＯＨｄＧを検出することができる。その結果、再現性よく簡便に哺乳動物のストレスを評価することができる。
【００１６】
また、本発明によれば、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーを含む、哺乳動物のストレスを評価するためのストレスマーカーが提供される。この構成によれば、安定性および８−ＯＨｄＧに対する特異性に優れるＤＮＡアプタマーを用いるため、安定な物質を用いて簡便に哺乳動物のストレスの指標となる８−ＯＨｄＧを検出することができる。その結果、再現性よく簡便に哺乳動物のストレスを評価することができる。
【００１７】
また、本発明によれば、上記のＤＮＡアプタマーと、上記のＤＮＡアプタマーを固定化された水晶振動子と、を備える、ＤＮＡアプタマー固定化センサが提供される。この構成によれば、安定性および８−ＯＨｄＧに対する特異性に優れるＤＮＡアプタマーを用いるため、安定な物質を用いて簡便に哺乳動物のストレスの指標となる８−ＯＨｄＧを水晶振動子の振動として検出することができる。
【００１８】
また、本発明によれば、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーと、当該ＤＮＡアプタマーを固定化された水晶振動子と、を備える、ＤＮＡアプタマー固定化センサが提供される。この構成によれば、安定性および８−ＯＨｄＧに対する特異性に優れるＤＮＡアプタマーを用いるため、安定な物質を用いて簡便に哺乳動物のストレスの指標となる８−ＯＨｄＧを水晶振動子の振動として検出することができる。
【００１９】
また、上記のＤＮＡアプタマー、ストレスマーカーおよびＤＮＡアプタマー固定化センサは本発明の一態様であり、本発明のＤＮＡアプタマー、ストレスマーカーおよびＤＮＡアプタマー固定化センサは、以上の構成要素の任意の組合せであってもよい。また、本発明のストレス評価方法なども、上記のストレスマーカーと同様の構成を有し、同様の作用効果を奏する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーを用いるため、安定な物質を用いて簡便に８−ＯＨｄＧを検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２２】
本実施形態に係るストレスマーカーにおいて、上述のＤＮＡアダプターは、蛍光標識されていてもよい。この構成によれば、ＤＮＡアダプターを感度良く検出することが容易になる利点がある。
【００２３】
本実施形態に係るストレス評価方法は、上述の哺乳動物の尿を採取するステップと、上述の尿および蛍光標識された前記ＤＮＡアプタマーを接触させるステップと、上述の蛍光標識を測定するステップと、を含んでもよい。この方法によれば、採取が容易な尿および蛍光検出器を用いて、容易に感度良く８−ＯＨｄＧを検出することができる。
【００２４】
＜ＤＮＡアプタマー＞
ＤＮＡアプタマー（ＤＮＡ ａｐｔａｍｅｒ）とは、様々な分子を特異的に認識し、結合する一本鎖ＤＮＡを意味するものとする。ＤＮＡアプタマーには、（１）化学合成が容易で迅速かつ安価に取得でき、（２）熱およびｐＨ安定性に優れ、（３）理論上あらゆる物質に対するアプタマーの取得が可能であるという利点がある。
【００２５】
ＤＮＡアプタマーは、結合するターゲット分子に合わせ、図１に示すように、（ａ）ヘアピン型、（ｂ）バルジ型、（ｃ）シュードノット型、（ｄ）Ｇカルテット型などの様々な立体構造を取り得ることがわかっている。
【００２６】
現在、ＤＮＡアプタマーは、タンパク質、抗体、糖、また各種有機化合物等、様々な物質に対して結合することが明らかになっている。アプタマーのターゲットは比較的高い分子量の物質が多く、低分子量の物質をターゲットとしたものは、その研究の蓄積が更に必要であると言える。本実施例に係るＤＮＡアプタマーは、比較的低分子量である８−ＯＨｄＧをターゲットとするＤＮＡアプタマーであり、従来見出されてきたＤＮＡアプタマーには希にしか見られない特有の特性を有するものであると想定される。
【００２７】
具体的には、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーには、下記の表１に示す塩基配列からなる１８種類のＤＮＡアプタマーが含まれている。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】
表１および表２には、１８種類の塩基配列が示されている。なお、太字で示した箇所はランダム配列由来の配列である。また、下線を付した箇所は、代表配列に対する変異を有する箇所である。１８種類の塩基配列には、以下の配列が含まれている。
【００３１】
（ｉ）Ｏグループ
配列Ｏ （配列番号１）
配列Ｏ（Ａ２Ｇ） （配列番号２）
配列Ｏ（Ｔ１４Ｃ）（配列番号３）
配列Ｏ（Ａ２８Ｇ）（配列番号４）
配列Ｏ（Ｔ８Ｃ） （配列番号５）
【００３２】
（ｉｉ）Ｐグループ
配列Ｐ（配列番号６）
配列Ｐ（Ｇ８Ａ）（配列番号７）
配列Ｐ（Ｇ１２Ａ）（配列番号８）
配列Ｐ（Ａ１５Ｇ）（配列番号９）
配列Ｐ（Ａ２７Ｇ）（配列番号１０）
【００３３】
（ｉｉｉ）Ｑグループ
配列Ｑ（配列番号１１）
【００３４】
（ｉｖ）Ｒグループ
配列Ｒ（配列番号１２）
配列Ｒ（Ｔ１６Ｃ）（配列番号１３）
【００３５】
（ｖ）Ｓグループ
配列Ｓ（配列番号１４）
配列Ｓ（Ｃ２３Ｔ）（配列番号１５）
【００３６】
（ｖｉ）Ｔグループ
配列Ｔ（配列番号１６）
【００３７】
（ｖｉｉ）Ｕグループ
配列Ｕ（配列番号１７）
【００３８】
（ｖｉｉｉ）Ｖグループ
配列Ｖ（配列番号１８）
【００３９】
なお、上述の１８種類のＤＮＡアプタマーは、後述するように、いずれもＳＥＬＥＸ法により選抜された８−ＯＨｄＧに特異的に結合するＤＮＡアプタマーである。
【００４０】
よって、Ｏグループ、Ｐグループ、Ｒグループ、ＳグループのＤＮＡアプタマーは、グループ内で互いに１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列からなる関係にあるが、いずれも同様に８−ＯＨｄＧに特異的に結合する特性を有していることになる。
【００４１】
この事実から、８−ＯＨｄＧに特異的に結合するＤＮＡアプタマーの塩基配列に対して、１若しくは数個の塩基を欠失・置換若しくは付加させた塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも、同様に８−ＯＨｄＧへの特異的結合性を示すことがわかる。
【００４２】
従って、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーには、上記の表１および表２に示す塩基配列からなる１８種類のＤＮＡアプタマーの１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列からなり、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーも含まれる。
【００４３】
また、上記の事実から、８−ＯＨｄＧに特異的に結合するＤＮＡアプタマーの塩基配列との相同性が９０％以上、好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上である塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも、同様に８−ＯＨｄＧへの特異的結合性を示すことが示唆される。
【００４４】
従って、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーには、上記の表１および表２に示す塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなり、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーも含まれる。
【００４５】
また、上記の事実から、８−ＯＨｄＧに特異的に結合するＤＮＡアプタマーの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも、ＤＮＡアプタマーの２次構造は同様の構造となると予想されるため、同様に８−ＯＨｄＧへの特異的結合性を示すことが示唆される。
【００４６】
従って、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーには、上記の表１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなり、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーも含まれる。
【００４７】
また、上記の事実から、８−ＯＨｄＧに特異的に結合するＤＮＡアプタマーの塩基配列からなるＤＮＡ分子に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする哺乳動物由来のＤＮＡ分子の塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも、同様に８−ＯＨｄＧへの特異的結合性を示すことが示唆される。
【００４８】
従って、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーには、上記の表１および表２に示す塩基配列からなるＤＮＡ分子に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする哺乳動物由来のＤＮＡ分子の塩基配列からなり、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーも含まれる。
【００４９】
＜８−ＯＨｄＧ結合性のＤＮＡアプタマーの応用＞
上述の特許文献１にも示されているように、尿中の８−ＯＨｄＧの濃度および哺乳動物（特にヒト）のストレスの程度との間には相関関係があると考えられる。そのため、本実施形態の８−ＯＨｄＧ結合性のＤＮＡアプタマーは、哺乳動物のストレスを評価するためのストレスマーカーとして応用が可能である。
【００５０】
あるいは、上述の表１および表２に記載の塩基配列と異なっていても、同様に８−ＯＨｄＧに特異的に結合する性質を有するＤＮＡアプタマーであれば、同様に哺乳動物のストレスを評価するためのストレスマーカーとして応用が可能である。
【００５１】
これらのストレスマーカーを用いることにより、図２に示すように、哺乳動物のストレスを評価するストレス評価方法を好適に実施できる。このようなストレス評価方法の一例としては、哺乳動物の尿を採取するステップと、尿および蛍光標識されたＤＮＡアプタマーを接触させるステップと、蛍光標識を測定するステップと、を含む方法などが考えられる。このような方法であれば、尿中の８−ＯＨｄＧの濃度を感度良く簡便に検出することができる。
【００５２】
また、本実施形態の８−ＯＨｄＧ結合性ＤＮＡアプタマーは、図３に示すように、下記のような種々の産業的応用が可能である。つまり、（ｉ）アプタマーの構造解析、（ｉｉ）新しいバイオアッセイ系への展開、（ｉｉｉ）バイオデバイスへの展開などが可能である。
【００５３】
（ｉ）アプタマーの構造解析
図３（ａ）に示すように、本実施形態の８−ＯＨｄＧ結合性ＤＮＡアプタマーおよび８−ＯＨｄＧの相互作用をＳＰＲ検出システム、蛍光偏光法などにより、詳細に解析することにより、低分子化合物の認識機構解析に応用可能である。
【００５４】
（ｉｉ）新しいバイオアッセイ系への展開
図３（ｂ）に示すように、上述のアプタマーの構造解析の結果を進化展開して、新しいバイオアッセイ系への展開を図ることができる。例えば、ＤＮＡアプタマーを２つに断片化し、一方の断片を分子認識に用い、他方の断片に蛍光標識を付加して、一方の断片と複合体を形成させ、シグナル検出に用いるアッセイ系などが考えられる。すなわち、ＤＮＡアプタマーの認識機構を利用して、サンドイッチタイプのバイオアッセイシステムへの展開を図ることなどができる。
【００５５】
（ｉｉｉ）バイオデバイスへの展開
図３（ｃ）に示すように、上述のＤＮＡアプタマーの構造解析の結果を発展研究して、バイオデバイスへの展開を図ることができる。例えば、ＤＮＡアプタマーを水晶振動子に固定化して作製されるＤＮＡアプタマー固定化センサを、ビスフェノールＡやダイオキシンなどの環境ホルモンの測定に用いることが考えられる。
【００５６】
このような水晶振動子としては、例えば、電気回路で発振回路およびフィルター回路と呼ばれている回路に広く用いられている水晶振動子を好適に用いうる。あるいは、腕時計などに組み込まれる水晶振動子なども好適に用いうる。
【００５７】
これらの水晶振動子に、上述のＤＮＡアプタマーを固定化することにより、センサとして利用することができる。その原理は、水晶振動子の表面に物質が吸着すると振動子を組み込んだ発振回路の発振周波数が変化することに基づいている。周波数減少の感度は非常に高く、９ＭＨｚで発振する水晶振動子を用いれば、１ｎｇ／ｃｍ2の吸着で約１Ｈｚの周波数の変化がある。
【００５８】
最近のエレクトロニクスの進歩によりデジタル回路を用いれば、９ＭＨｚのうち数１０Ｈｚの変化は検出できるので、数ｎｇの量が検知できる。９０ＭＨｚの特殊な振動子を用いれば、９ＭＨｚの場合に比べておおよそ１００倍感度が上がるので、０．１ｎｇの吸着は検知できる。そのため、例えば、水晶振動子の表面に８−ＯＨｄＧに特異的に結合するＤＮＡアプタマーを固定化すれば、８−ＯＨｄＧを特異的に検出するＤＮＡアプタマー固定化センサとなる。
【００５９】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００６０】
例えば、上記実施の形態では、バイオデバイスへの展開として、ＤＮＡアプタマーを固定化した水晶振動子を例に挙げたが、他にもＤＮＡチップなどに展開してもよい。このようにしても、ビスフェノールＡやダイオキシンなどに特異的に結合するＤＮＡアプタマーを利用して、環境ホルモンを測定することができる。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記の実施例１〜３を行うにあたって、まず、以下の実験材料および研究設備を準備した。
【００６２】
１．実験材料
（ｉ）ポジティブコントロール
抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（濃度：５ｎＭ）（日本老化制御研究所、ＭＯＧ−０２０）
【００６３】
（ｉｉ）ネガティブコントロール
Ｐ１プライマー
Ｐ２プライマー相補鎖（ＣＳ−Ｐ２プライマー）
なお、Ｐ１プライマーおよびＰ２プライマー相補鎖は、図４に示すように、ランダム配列領域の前後に配置されているＰ１プライマー領域およびＣＳ−Ｐ２プライマー領域にそれぞれ対応するプライマーおよびプライマー相補鎖である。
【００６４】
２．研究設備
下記の実施例１〜３で使用した主要な研究設備は、ＰＣＲ、蛍光偏光度計、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００（ＳＰＲセンサ）である。
【００６５】
＜実施例１＞
本実施例では、８−ＯＨｄＧを特異的に認識するＤＮＡアプタマーを取得し、そのアプタマーについて結合確認を行い、その評価方法を確立することを目的として以下の実験を行った。
【００６６】
１．概要
実験の概要を説明すると、まず、１）ＤＮＡアプタマーの探索のために、ｉ）ＳＥＬＥＸ法による８−ＯＨｄＧアプタマーの選抜を行い、ｉｉ）アプタマーライブラリーの構築を行った。次いで、２）ＤＮＡアプタマーの機能解析のために、ｉｉｉ）ＳＰＲセンサによる８−ＯＨｄＧアプタマーの特性評価を行い、ｉｖ）蛍光偏光分光法による８−ＯＨｄＧアプタマーの特性評価を行い、ｖ）個々のアプタマーの高次構造解析を行った。
【００６７】
２．アプタマーの選抜方法
目的のＤＮＡアプタマーを得るため、６０塩基のランダムな配列を有する一本鎖ＤＮＡのライブラリを用いた。初期のＤＮＡ ライブラリは４60の多様性を有しており、そこからＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法による選抜と、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法による増幅と、を繰り返し、スクリーニングすることによって、ターゲットにより結合するＤＮＡアプタマーの取得を目指した。
【００６８】
ＳＥＬＥＸ法によるＤＮＡの選抜に関しては、８−ＯＨｄＧまたはｄＧが表面に結合されている疎水性ビーズを用いて、増幅したｓｓＤＮＡとビーズを混合して室温で結合反応させ、分離用チューブによりビーズと液体を遠心分離し、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒによる洗浄を行った後、９５℃による熱溶出を行った。この操作を繰り返すことにより、ターゲットと結合するＤＮＡの選抜を行った。
【００６９】
こうして得られたＤＮＡ群をＴ−Ｖｅｃｔｏｒプラスミドに導入し、ＤＮＡライブラリを作製した。得られたライブラリのクローンをシークエンサーにより塩基配列を決定し、その一部についてターゲットとの結合確認を行った。その結果、下記の１８種のＤＮＡアプタマーのうち一部の配列について、８−ＯＨｄＧ分子を特異的に認識することを確認できた。これより、８−ＯＨｄＧ分子に結合するＤＮＡアプタマーをＤＮＡライブラリより選抜できたと考えられる。
【００７０】
具体的には、図５に示すように、プライマーサイト１およびプライマーサイト２に挟まれたランダム配列領域Ｎ６０を有する１本鎖ＤＮＡを作製した。ランダム配列領域Ｎ６０には、Ａ・Ｔ・Ｃ・Ｇをランダムに６０個配列し、理論上４60の多様性が得られるようにした。
【００７１】
次いで、直径４５〜１４５μｍのアガロースゲルマトリックスに８−ＯＨｄＧを担持させた。そして、ＳＥＬＥＸ法を用いて、上述の１本鎖ＤＮＡがアガロースゲルマトリックスに担持された８−ＯＨｄＧに結合するか否かという基準により、上述の１本鎖ＤＮＡ群から８−ＯＨｄＧに特異的に結合するＤＮＡアプタマーを選抜した。
【００７２】
図６は、ＳＥＬＥＸ法（試験管内進化法）について説明するための概念図である。この図に示すように、本実施例のＳＥＬＥＸ法では、８−ＯＨｄＧによる競合的溶出による溶出方法を採用した。すなわち、まず、ランダム配列の１本鎖ＤＮＡ群を、上述の標的化学物質である８−ＯＨｄＧを担持するアガロースゲルを壁面に備えるカラム内にアプライした。
【００７３】
そして、適当なバッファーでカラムを洗浄して、８−ＯＨｄＧに結合しなかった不結合の１本鎖ＤＮＡ群を除去した。その後、別のバッファーを流して、８−ＯＨｄＧに結合した１本鎖ＤＮＡ群を、８−ＯＨｄＧから解離させてカラムから溶出させた。
【００７４】
続いて、溶出した１本鎖ＤＮＡ群を、ＰＣＲ法により増幅させた。そして、ＰＣＲ法による増幅された１本鎖ＤＮＡ群を、再度、上述の標的化学物質である８−ＯＨｄＧを担持するアガロースゲルを壁面に備えるカラム内にアプライして、上述のサイクルを繰り返した。
【００７５】
上述のサイクルを繰り返す際には、ラウンド１〜３のサイクルでは、８−ＯＨｄＧを担持するアガロースゲルを壁面に備えるカラムを用いた。しかし、ラウンド４のサイクルでは、デオキシグアノシン（ｄＧ）との交叉結合性を低減するためのバックプレッシャーを与えることを目的として、ｄＧを担持するアガロースゲルを壁面に備えるカラムを用いた。
【００７６】
さらに、ラウンド５〜７のサイクルでは、再び８−ＯＨｄＧに対する特異性を高めるために、８−ＯＨｄＧを担持するアガロースゲルを壁面に備えるカラムを用いた。しかし、ラウンド８のサイクルでは、デオキシグアノシン（ｄＧ）との交叉結合性を低減するためのバックプレッシャーを与えることを目的として、ｄＧを担持するアガロースゲルを壁面に備えるカラムを用いた。そして、ラウンド９のサイクルでは、最後の仕上げとして８−ＯＨｄＧに対する特異性を高めるために、８−ＯＨｄＧを担持するアガロースゲルを壁面に備えるカラムを用いた。
【００７７】
そして、最後のラウンド９のサイクルでカラムから溶出してきた１本鎖ＤＮＡ群には、後述するように、８−ＯＨｄＧに対する優れた特異性を有するＤＮＡアプタマーが含まれていた。
【００７８】
なお、上述の実験に先だって、あらかじめＰＣＲの検討を行い、ＤＮＡポリメラーゼ酵素にはＥｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、ｄｓＤＮＡの作製には９５℃，１５ ｓｅｃ、７２℃，３０ｓｅｃの２ＳＴＥＰで１５サイクル行い、１００ｍＭのテンプレートを１ｍｌ用いると、ｓｓＤＮＡやダイマー等の非特異的な増幅が最も少なく、目的の１２０ｂｐ付近の大きさに効率よく増幅されたバンドが確認できた。
【００７９】
また、上述の実験に先だって、あらかじめｄｓＤＮＡをテンプレートとして、ｓｓＤＮＡを増幅するＰＣＲの条件を同様に検討した。ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＰＣＲを行い、変性ＰＡＧＥによる確認を行った。その結果、９５℃，１５ｓｅｃ、７２℃，３０ｓｅｃの２ＳＴＥＰで４０サイクル行い、切り出し精製してきたｄｓＤＮＡを２ｍｌ用いると、効率よく増幅することができた。作製したｓｓＤＮＡは、ＨＰＬＣシステムによっても確認した。
【００８０】
なお、この実験の各ラウンドにおいて、精製したｓｓＤＮＡを、変性ＰＡＧＥにて確認した。その結果、ラウンドを重ねていくごとに様々な長さのＤＮＡ断片が増幅されていくことが確認された。このように、カラム内での選抜とＰＣＲによる増幅を繰り返すことにより、非常に多様なランダムな配列のライブラリ（本実施例では４60の多様性）から徐々に焦点を絞っていくことができた。
【００８１】
３．ＳＥＬＥＸ法の結果
上述のＳＥＬＥＸ法により選抜されたＤＮＡアプタマーのリストを下記の表３に示す。表３では、ＳＥＬＥＸ後に得られたＤＮＡ群を大腸菌に形質転換し、個々の配列のシーケンス解析した結果を示している。表３で＊印を付した括弧内の数値は、１ヌクレオチド変異の入ったアプタマーの数を示す。なお、選抜されたＤＮＡアプタマーの配列情報は、既に上述の表１および表２に示している。
【００８２】
【表３】
【００８３】
表１、表２および表３に示したように、上述のＳＥＬＥＸ法の結果得られた１本鎖ＤＮＡ群のライブラリ総数１１４の内、配列が同じであるものが多数確認できた。その中には、類似配列も含まれており、１塩基のみ異なるといったものも確認することができた。
【００８４】
また、１塩基違いの配列も含め全部で３１種類の配列が確認できた。その中には全体の３０％以上の占有率を持つ配列（Ｏ）も確認できた。
【００８５】
これらの結果を考察すると、ライブラリの中で同じ配列（Ｏ、Ｐなど）のＤＮＡが多数存在するという結果は、その配列（Ｏ、Ｐなど）の標的物質（８−ＯＨｄＧ）に対する特異性が高いことを示唆しているものと思われる。そこで、特に占有率の高い配列（Ｏ）を中心に、全３１配列に対してＳＰＲセンサと、蛍光偏光による機能解析を行った。
【００８６】
なお、図７は、配列（Ｏ、Ｏ（Ｔ８Ｃ））の予測される２次構造を示す図である。この図に示すように、配列（Ｏ）および配列（Ｏ（Ｔ８Ｃ））の予測される２次構造は、わずか１塩基置換にもかかわらず、大きく異なっている。
【００８７】
＜実施例２＞
図８は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）検出システムの概要を示す図である。ＳＰＲ検出システムとは、２分子間の相互作用をリアルタイムにモニタリング可能なシステムである。本実施例では、ＳＰＲ検出システムとして、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００（ＳＰＲセンサ）を用いた。
【００８８】
ＢＩＡＣＯＲＥ２０００は、タンパク質の性質を他の分子との結合特異性、相互作用の速度（結合および解離）、そしてアフィニティー（他の分子にどのくらい強く結合するか）という観点から解明する。ＢＩＡＣＯＲＥ２０００を用いると、標識を用いることなく高感度、高精度な結合特異性の測定が可能になる。ＢＩＡＣＯＲＥ２０００の測定法は、対象となる生体分子が特定の結合パートナー分子と相互作用するという特徴を基礎にしており、一般的な測定技術（例えば、タンパク質濃度測定）よりもより多くの情報を得ることができる。
【００８９】
ＢＩＡＣＯＲＥ２０００では、偏光を全反射の条件下で、屈折率の異なる媒体、すなわちセンサ表面のガラス（屈折率の高い物質）と緩衡液(屈折率の低い物質）との界面に存在する金膜に照射すると表面プラズモン共鳴現象（ＳＰＲ）が生じる原理を利用する。
【００９０】
具体的には、広範囲の入射角度をカバーするくさび形の偏光（７６０ｎｍ）がセンサ表面のガラス面へと導かれ、この偏光の反射光がセンサにより検知される。このとき、偏光（７６０ｎｍ）をガラスに照射すると、エバネッセント波が発生し、このエバネッセント波は金膜の自由電子雲と相互作用を起こして吸収される。この吸収の際にプラズモンと呼ばれる電子密度波が発生し、偏光（７６０ｎｍ）の反射光の一部の強度を減衰させる。この反射光が最小となる角度（ＳＰＲアングル）は、センサ表面の反対側の金膜近傍の溶液の屈折率に相関するという性質を持っている。
【００９１】
ＢＩＡＣＯＲＥ２０００では、分子間相互作用はセンサ表面上のフローセルで起こる。分子はマイクロ流路系を通ってフローセルまで運ばれる。フローセルは天井のない流路の構造をしており、装置内ではセンサチップがちょうど蓋をするような形で装着される。フローセル内のセンサチップの表面には標的分子（リガンド）が固定されており、フローセル内を流れてきた分子と標的分子との相互作用を検出することができる。
【００９２】
図９は、ＳＰＲ検出システムの典型的なセンサグラムを示す。この図では、横軸は時間（秒）を示し、縦軸はレスポンス（ＲＵ）を示す。
【００９３】
ＢＩＡＣＯＲＥ２０００は、タンパク質の性質を他の分子との結合特異性、相互作用の速度（結合および解離）、そしてアフィニティー（他の分子にどのくらい強く結合するか）という観点から解明する。そのために、まず、（ｉ）ランニングバッファーを流し、（ｉｉ）分析対象の溶液を流し、（ｉｉｉ）再度ランニングバッファーを流すという手順で分析を行う。
【００９４】
すなわち、リガンドを固定化したセンサ表面に、結合性を示す試料を含む溶液を添加すると結合反応に伴い測定値は上昇し、バルブの切換えでランニングバッファーを流すことで解離反応が開始され測定値は減少する。ある程度解離反応を測定した後、塩濃度やpHを変化させるなどして、結合競合物質を添加するといった適当な条件で反応物質のみをセンサ表面から除き、表面を再生することができる。再生されたセンサ表面はリガンドの安定性に依存して繰り返し測定が可能となる。得られた相互作用測定グラフをセンサグラムとよぶ。
【００９５】
具体的には、データ処理において、図９で示した、センサグラムの結合容量（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ）を重ね書きするなどして、比較・計算することにより、タンパク質の性質を他の分子との結合特異性、相互作用の速度（結合および解離）、そしてアフィニティー（他の分子にどのくらい強く結合するか）などを評価することができる。
【００９６】
図１０は、ＳＰＲ検出システムによるＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）の分析結果を示すセンサグラムである。このグラフでは、横軸は時間（秒）を示し、縦軸はレスポンス（ＲＵ）を示している。また、８−ＯＨｄＧを担持させたセンサチップを用い、流速：２０μｌ／ｍｉｎ、ＤＮＡアプタマー添加量：２０ｍｌ、ＤＮＡアプタマー濃度：１０μＭの測定条件による測定を行った。ＤＮＡアプタマーを添加した時刻を０秒とすると、ＤＮＡアプタマーの添加を停止した時刻は６０秒であった。
【００９７】
この図には、４種類のＤＮＡアプタマー（配列Ｏ、配列Ｏ（Ｔ８Ｃ）、配列Ｏ（Ａ２８Ｇ）、配列Ｎ−Ｃ（*２５Ｃ））のセンサグラムが重ね書きされている。なお、配列Ｎ−Ｃ（*２５Ｃ）のＤＮＡアプタマーは、ネガティブコントロールとして測定されたものである。
【００９８】
このデータから、３種類のＤＮＡアプタマー（配列Ｏ、配列Ｏ（Ｔ８Ｃ）、配列Ｏ（Ａ２８Ｇ））の８−ＯＨｄＧに対するアフィニティーは、いずれもネガティブコントロールである配列Ｎ−Ｃ（*２５Ｃ）配列Ｎ−Ｃ（*２５Ｃ）のＤＮＡアプタマーよりも高いことが明らかである。
【００９９】
また、３種類のＤＮＡアプタマー（配列Ｏ、配列Ｏ（Ｔ８Ｃ）、配列Ｏ（Ａ２８Ｇ））同士のアフィニティーは、略同程度ではあるが、配列Ｏ、配列Ｏ（Ａ２８Ｇ）、配列Ｏ（Ｔ８Ｃ）の順に高いことも明らかである。
【０１００】
図１１は、ＳＰＲ検出システムによるＤＮＡアプタマーおよび抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの概要を示す概念図である。この競合アッセイにおいては、８−ＯＨｄＧをセンサチップ表面に固定しておき、フローセル中にＤＮＡアプタマーおよび抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体をともに含有する溶液を流す。
【０１０１】
そのため、ＤＮＡアプタマーに８−ＯＨｄＧに対する結合特異性がない場合には、図１１（ａ）に示すように、８−ＯＨｄＧの大部分には抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体が結合することになる。一方、ＤＮＡアプタマーに８−ＯＨｄＧに対する結合特異性がある場合には、図１１（ｂ）に示すように、８−ＯＨｄＧの一部には抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体が結合し、８−ＯＨｄＧの残りの一部にはＤＮＡアプタマーが結合することになる。
【０１０２】
そして、一般的には、ＤＮＡアプタマーよりも、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の質量（分子量）の方が大きいため、図１１（ａ）の場合には、図１１（ｂ）の場合に比べて、ＳＰＲ検出システムのセンサグラムの結合容量が大きく表示されることになる。
【０１０３】
具体的には、競合アッセイは、以下のような条件で行った。
まず、ｍＡｂ溶液５０ｍｌ（終濃度：１ｎＭ）と、アプタマー溶液５０ｍｌとを混合し、２５℃で５分静置した。次いで、ＦＩＴＣ標識８−ＯＨｄＧ溶液５０ｍｌ（８−ＯＨｄＧ：終濃度５００ｎＭ）と、ｍＡｂおよびアプタマーの混合溶液５０μｌとを混合した。その後、遮光して２５℃で１５分静置した。こうして反応させた後、蛍光偏光測定装置によりＩ0、Ｉ90を測定した。
【０１０４】
図１２は、ＳＰＲ検出システムによるＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）および抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの結果を示すセンサグラムである。このグラフでは、横軸は時間（秒）を示し、縦軸はレスポンス（ＲＵ）を示している。また、８−ＯＨｄＧを担持させたセンサチップを用い、流速：２０μｌ／ｍｉｎ、サンプル添加量：２０ｍｌの測定条件による測定を行った。サンプルを添加した時刻を０秒とすると、サンプルの添加を停止した時刻は６０秒であった。
【０１０５】
この図１２には、４種類のサンプルのセンサグラムが重ね書きされている。４種類のサンプルとは、（ｉ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、（ｉｉ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）１００ｎＭ、（ｉｉｉ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）１μＭ、（ｉｖ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）１０μＭの４種類である。
【０１０６】
このデータから、４種類のサンプルの結合容量は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）の順で大きいことが明らかである。すなわち、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）および抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の間で、８−ＯＨｄＧへの結合の競合が起こっていることが明らかである。言い換えれば、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）は、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体と同様に、８−ＯＨｄＧへの特異的な結合性を有しているということになる。
【０１０７】
図１３は、ＳＰＲ検出システムによるＰ２プライマー相補鎖および抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの結果を示すセンサグラムである。なお、Ｐ２プライマー相補鎖とは、図４に示すように、上述のＳＥＬＥＸ法において用いたプライマーサイト２に対応するプライマーの相補鎖である。すなわち、Ｐ２プライマー相補鎖には、８−ＯＨｄＧに対する特異的結合性は存在しない。
【０１０８】
このグラフでは、横軸は時間（秒）を示し、縦軸はレスポンス（ＲＵ）を示している。また、８−ＯＨｄＧを担持させたセンサチップを用い、流速：２０μｌ／ｍｉｎ、サンプル添加量：２０ｍｌの測定条件による測定を行った。サンプルを添加した時刻を０秒とすると、サンプルの添加を停止した時刻は６０秒であった。
【０１０９】
この図には、４種類のサンプルのセンサグラムが重ね書きされている。４種類のサンプルとは、（ｉ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、（ｉｉ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、Ｐ２プライマー相補鎖１００ｎＭ、（ｉｉｉ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、Ｐ２プライマー相補鎖１μＭ、（ｉｖ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、Ｐ２プライマー相補鎖１０μＭの４種類である。
【０１１０】
このデータから、４種類のサンプルの結合容量は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）で約同程度であることが明らかである。すなわち、Ｐ２プライマー相補鎖および抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の間で、８−ＯＨｄＧへの結合の競合が起こっていないことが明らかである。言い換えれば、Ｐ２プライマー相補鎖は、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体と異なり、８−ＯＨｄＧへの特異的な結合性を有していないということになる。
【０１１１】
すなわち、この図１３のデータは、図１２のデータに基づいて、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）は、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体と同様に、８−ＯＨｄＧへの特異的な結合性を有しているという結論を導いた推論が正しいことを裏付けるネガティブコントロールとしての役割を果たしている。
【０１１２】
＜実施例３＞
図１４は、蛍光偏光法（ＦＰ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）の原理を説明するための概念図である。ここで、蛍光偏光法は、偏光励起光を蛍光物質に照射することにより、蛍光物質から発せられる蛍光が分子量に応じて異なった偏光を示すという特性に基づいた測定方法である。
【０１１３】
すなわち、静止した蛍光物質に偏光励起光を照射すると、蛍光も偏光として放出される。溶液中では分子は常に運動をしており、分子量の小さいものほど激しい運動をしている。小さな分子量の蛍光標識物質は溶液中では激しい運動をしているため、偏光励起光をあてても、その偏光を維持した蛍光量は少なく（偏光度が小さく）なる。
【０１１４】
ところが、蛍光標識物質が、抗体、受容体等の高分子のものと結合すると、見かけ上の分子量が大きくなるため、分子運動が小さくなり、結果としてその偏光を維持した蛍光（偏光度が高い）を放出することになる。
【０１１５】
そのため、リガンドである８−ＯＨｄＧに蛍光物質を標識し、それに対して抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体またはＤＮＡアプタマーを結合させることにより、得られる蛍光の偏向度が大きくなることになる。また、一般的に、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の質量（分子量）は、ＤＮＡアプタマーの質量（分子量）よりも大きいため、８−ＯＨｄＧに抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体が結合している場合の方が、８−ＯＨｄＧにＤＮＡアプタマーが結合している場合よりも、偏向度は大きくなる。
【０１１６】
図１５は、ＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧにＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）を結合させた場合のバインディングカーブを示すグラフである。横軸は、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）の濃度（Ｍ）を示し、縦軸は偏向度（ｍＰ）を示している。この実験では、上述の蛍光ラベル用溶液を調整して実験に用いた。
【０１１７】
（ｉ）８−ＯＨｄＧ溶液の調整
まず、８−ＯＨｄＧ ５ｍｇを１Ｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ＝７．７）５ｍｌに溶解した（すなわち、８−ＯＨｄＧの濃度は、１ｍｇ／ｍｌ＝３．５ｍＭである）。次いで、溶解後、得られた溶液をフィルター滅菌（０．２２μｍ）して８−ＯＨｄＧ溶液を調整した。
【０１１８】
（ｉｉ）ＦＩＴＣ溶液の調整
まず、ＦＩＴＣ−Ｉ（ＳＩＧＭＡ、３３２６−３２−７）１ｍｇを、ＭｅｔＯＨ ４００ｍｌに溶解させた。そして、ｍｉｌｌｉＱ水（ろ過滅菌済）１６００ｍｌをさらにくわえて、ＦＩＴＣ−Ｉの濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ（１ｍＭ）になるように調整した。なお、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）は、励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍで蛍光を発する性質を有する。
【０１１９】
（ｉｉｉ）ＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧの作製
まず、８−ＯＨｄＧ溶液とＦＩＴＣ−Ｉ溶液とを以下の割合で混合した。
８−ＯＨｄＧ溶液（３．５ｍＭ）１４ｍｌ（終濃度５００ｍＭ）
ＦＩＴＣ−Ｉ溶液（１ｍＭ）５０ｍｌ（終濃度 ５００ ｍＭ）
ｍｉｌｉＱ水３６ｍｌ
これらを加え全体を１００ｍｌに調整（緩衝溶液の終濃度：１４０ｍＭＰｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ＝７．７）した。
【０１２０】
次いで、遮光して２０時間、緩やかに攪拌（温度：４度）した。そして、下記の化学式に示すように、未反応のＦＩＴＣ−Ｉのアミノ基を保護基によりマスキングするため、反応後の混合溶液１０ｍｌにＦｏｌｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ４９９０ｍｌを加えた（８−ＯＨｄＧ：終濃度１ｍＭ）。その後、遮光して３０分、緩やかに攪拌（温度：２５度）した。そして、得られたＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧ溶液を、室温にて攪拌しながら保存した。
【０１２１】
【化１】
【０１２２】
（ｉｖ）８−ＯＨｄＧとアプタマー溶液の反応
まず、アプタマー溶液（濃度は２ｎＭ、２０ｎＭ、２００ｎＭ、２ｍＭ） ９０ｍｌを９８℃で５ｍｉｎ熱変性させた。次いで、アプタマーをｒｅｆｏｌｄｉｎｇ（再構築）させるために、２５℃で３０分静置した。そして、アプタマー溶液５０ｍｌを、チップ周辺に付着した蛍光物質が混合溶液に混入しないように注意しつつ、ＦＩＴＣ標識８−ＯＨｄＧ溶液５０ｍｌと混合した（ＦＩＴＣ標識８−ＯＨｄＧ：終濃度５００ｎＭ）。
【０１２３】
続いて、この混合溶液を遮光して２５℃で１５分静置した。こうして反応させた混合溶液について、蛍光偏光測定装置によりＩ０、Ｉ９０を測定した。測定条件は、励起波長：４９５ｎｍ、蛍光波長：５４５ｎｍ、測定時間：１分間にて行った。なお、Ｃｏｎｔｒｏｌのサンプルも同様に、上述の（ｉ）〜（ｉｖ）の手順に従って実験を行った。
【０１２４】
なお、蛍光偏光度（ｍＰ）は、以下の式に従って算出した。
ｍＰ＝（Ｉ0−Ｉ90×１．９）／（Ｉ0＋Ｉ90×１．９）×１０００
Ｉ0：照射光の方向に水平な蛍光の強度
Ｉ90：照射光の方向に垂直な蛍光の強度
【０１２５】
そして、ブランク（サンプルを溶解している緩衝溶液）とサンプルとの偏光度の差（ΔｍＰ）は、以下の式に従い算出した。
ΔｍＰ＝ｍＰ（サンプル）−ｍＰ（ブランク）
【０１２６】
再び図１５に戻ると、上述の実験方法により得られた、このバインディングカーブから、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）を多く添加すればするほど、偏向度が大きくなることが明らかである。すなわち、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）は、８−ＯＨｄＧに特異的に結合していることが明らかである。
【０１２７】
図１６は、ＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧにＰ１プライマーを添加した場合のバインディングカーブを示すグラフである。横軸は、Ｐ１プライマーの濃度（Ｍ）を示し、縦軸は偏向度（ｍＰ）を示している。なお、Ｐ１プライマーとは、図４に示すように、上述のＳＥＬＥＸ法において用いたプライマーサイト１に対応するプライマーである。すなわち、Ｐ１プライマーには、８−ＯＨｄＧに対する特異的結合性は存在しない。この実験でも、上述の蛍光ラベル用溶液を調整して実験に用いた。
【０１２８】
このバインディングカーブから、Ｐ１プライマーを多く添加しても、偏向度が大きくならないことが明らかである。すなわち、Ｐ１プライマーは、８−ＯＨｄＧに特異的に結合しないことが明らかである。
【０１２９】
すなわち、この図１６のデータは、図１５のデータに基づいて、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）は、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体と同様に、８−ＯＨｄＧへの特異的な結合性を有しているという結論を導いた推論が正しいことを裏付るネガティブコントロールとしての役割を果たしている。
【０１３０】
図１７は、蛍光偏光法によるＤＮＡアプタマーおよび抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの概要を示す概念図である。この競合アッセイにおいては、８−ＯＨｄＧに蛍光標識（ＦＩＴＣ）をラベルしておき、ＤＮＡアプタマーおよび抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体をともに添加する。
【０１３１】
そのため、ＤＮＡアプタマーに８−ＯＨｄＧに対する結合特異性がない場合には、図１７（ａ）に示すように、８−ＯＨｄＧの大部分には抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体が結合することになる。一方、ＤＮＡアプタマーに８−ＯＨｄＧに対する結合特異性がある場合には、図１７（ｂ）に示すように、８−ＯＨｄＧの一部には抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体が結合し、８−ＯＨｄＧの残りの一部にはＤＮＡアプタマーが結合することになる。
【０１３２】
そして、一般的には、ＤＮＡアプタマーよりも、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の質量（分子量）の方が大きい（本実施例では、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の分子量は１５０，０００であり、ＤＮＡアプタマーの分子量は３０，０００である）ため、図１７（ａ）の場合には、図１７（ｂ）の場合に比べて、蛍光偏向度が大きく表示されることになる。
【０１３３】
図１８は、ＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧに対する抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体およびＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）を競合的に結合させた場合のバインディングカーブを示すグラフである。横軸は、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）の濃度（Ｍ）を示し、縦軸は偏向度（ｍＰ）を示している。なお、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体は、当初からＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧ溶液に１ｎＭの濃度で含有されており、実験を通じて増減していない。この実験でも、上述の蛍光ラベル用溶液を調整して実験に用いた。
【０１３４】
このバインディングカーブから、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）を多く添加すればするほど、偏向度が小さくなることが明らかである。すなわち、すなわち、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）および抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の間で、８−ＯＨｄＧへの結合の競合が起こっていることが明らかである。言い換えれば、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）は、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体と同様に、８−ＯＨｄＧへの特異的な結合性を有しているということになる。
【０１３５】
上述のように、蛍光偏光測定によって、配列（Ｏ）のＤＮＡアプタマーについては、濃度依存的に偏光度の上昇が確認できたが、Ｐ１プライマーおよびＰ２プライマーについては、濃度依存的に偏光度の上昇は確認できなかった。すなわち、ＳＥＬＥＸ法によりランダム配列から選定してきた配列（Ｏ）などのＤＮＡアプタマーが８−ＯＨｄＧへの特異的結合に関与していることが明らかである。
【０１３６】
＜実施例のまとめ＞
上述の実施例では、バイオマーカーである８−ＯＨｄＧに対するＤＮＡアプタマーの取得を目的として実験を行った。その結果を以下にまとめる。
【０１３７】
（ｉ）ＳＥＬＥＸ法により、８−ＯＨｄＧに対するアプタマーの選抜を行い、１１４サンプルのアプタマーライブラリーの構築をすることができた。
（ｉｉ）ＳＰＲセンサ（ＢＩＡＣＯＲＥ２０００）および蛍光偏光測定にて、上述のアプタマーライブラリーの代表例（配列Ｏおよびその変異体）が、８−ＯＨｄＧに対して非常に高い特異性を有することを確認することができた。
【０１３８】
＜既存のキットとの比較＞
８−ＯＨｄＧ測定キットについては、既に老化制御研究所より抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体を用いたキットが販売されている。その感度は、おおよそ１〜２００ｎｇ／ｍｌであると取扱説明書などには記載されている。すなわち、８−ＯＨｄＧは約３００の分子量であるため、老化制御研究所のキットの検出感度はおおよそ３〜６００ｎＭ程度であると想定される。
【０１３９】
上述の実施例で得られたＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）の検出感度のレンジについては、現在精査中であるが、５００ｎＭ程度の８−ＯＨｄＧは検出することが可能であることを確認している。従って、上述の実施例で得られたＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）は、既存のキットに含まれる抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体と略同等程度の特異的な８−ＯＨｄＧ認識能力を有していると想定される。
【０１４０】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【０１４１】
たとえば、上記実施例では、上述のアプタマーライブラリーの代表例として配列Ｏおよびその変異体を用いたが、配列Ｐおよびその変異体、配列Ｑ、配列Ｒおよびその変異体、配列Ｓおよびその変異体、配列Ｔ、配列Ｕ、配列Ｖなどを代表例として用いても、配列Ｏおよびその変異体と同様に、８−ＯＨｄＧに対して非常に高い特異性を有することを確認することができると想定される。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
以上のように、本発明にかかる８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーは、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有する。このため、このＤＮＡアプタマーは、ストレスマーカー、ストレス評価方法およびＤＮＡアプタマー固定化センサなどにおいて有効に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】ＤＮＡアプタマーの多様な立体構造を説明する概念図である。
【図２】８−ＯＨｄＧ結合性のＤＮＡアプタマーの人体ストレスを評価するための診断応用について説明する概念図である。
【図３】８−ＯＨｄＧ結合性のＤＮＡアプタマーの応用例について説明する概念図である。
【図４】ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールについて説明する概念図である。
【図５】ＤＮＡアプタマーの選抜方法について説明する概念図である。
【図６】ＳＥＬＥＸ法（試験管内進化法）について説明する概念図である。
【図７】配列Ｏおよび配列Ｏ（Ｔ８Ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡアプタマーの予測される２次構造について説明する概念図である。
【図８】ＳＰＲ検出システムの概要を示す概念図である。
【図９】ＳＰＲ検出システムの典型的なセンサグラムを示す概念図である。
【図１０】ＳＰＲ検出システムによるＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）の分析結果を示すセンサグラムである。
【図１１】ＳＰＲ検出システムによるＤＮＡアプタマーおよび抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの概要を示す概念図である。
【図１２】ＳＰＲ検出システムによるＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）および抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの結果を示すセンサグラムである。
【図１３】ＳＰＲ検出システムによるＰ２プライマー相補鎖および抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの結果を示すセンサグラムである。
【図１４】蛍光偏光法の原理を説明するための概念図である。
【図１５】ＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧにＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）を結合させた場合のバインディングカーブを示すグラフである。
【図１６】ＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧにＰ１プライマーを添加した場合のバインディングカーブを示すグラフである。
【図１７】蛍光偏光法によるＤＮＡアプタマーおよび抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの概要を示す概念図である。
【図１８】ＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧに対する抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体およびＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）を競合的に結合させた場合のバインディングカーブを示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
人体の老化現象、および様々な疾患を引き起こす原因は、活性酸素による人体中での酸化反応であると報告されている。そのため、医療や健康産業の分野で酸化損傷の程度を効果的に評価することが求められている。
【０００３】
近年、生体ストレスのマーカー分子（評価対象）として、遺伝子配列中のデオキシグアノシン（ｄＧ）が活性酸素種によって酸化された８−ヒドロキシデオキシグアノシン（以下、８−ＯＨｄＧと略称する）が注目を浴びている。
【０００４】
例えば、特許文献１には、尿中の修飾核酸塩基である８−ＯＨｄＧを指標として全身的な酸化ストレスの程度を測定して老化度を測定できる旨記載されている。また、特許文献２には、８−ＯＨｄＧ分子を認識できるモノクローナル抗体が記載されている。
【０００５】
【特許文献１】特許第２８５０１２８号明細書
【特許文献２】特許第３０９１９７４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
第一に、特許文献１に記載の技術では、８−ＯＨｄＧを含むサンプルを高速液体クロマトグラフィーにかけて８−ＯＨｄＧを分離した上で、電気化学的手法または紫外部吸収検出器などにより８−ＯＨｄＧの濃度を測定する。そのため、８−ＯＨｄＧの測定方法が複雑かつ煩雑であり、８−ＯＨｄＧの測定方法の面でさらなる改善の余地があった。
【０００７】
第二に、特許文献２に記載の技術では、熱やｐＨの変動に対して不安定であるモノクローナル抗体を用いて８−ＯＨｄＧの濃度を測定するため、測定に用いる物質の安定性の面でさらなる改善の余地があった。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、安定な物質を用いた８−ＯＨｄＧの簡便な検出技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、配列番号１乃至１８いずれかで表される塩基配列からなり、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーが提供される。この構成によれば、安定性および８−ＯＨｄＧに対する特異性に優れるＤＮＡアプタマーを用いるため、安定な物質を用いて簡便に８−ＯＨｄＧを検出することができる。
【００１０】
なお、上記のＤＮＡアプタマーは、上記の塩基配列に限定されず、これらの塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも同様の作用効果を奏する。
【００１１】
なお、上記のＤＮＡアプタマーは、上記の塩基配列に限定されず、これらの塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも同様の作用効果を奏する。
【００１２】
なお、上記のＤＮＡアプタマーは、上記の塩基配列に限定されず、これらの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも同様の作用効果を奏する。
【００１３】
なお、上記のＤＮＡアプタマーは、上記の塩基配列に限定されず、これらの塩基配列からなるポリヌクレオチド分子に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする哺乳動物由来のポリヌクレオチド分子の塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも同様の作用効果を奏する。
【００１４】
なお、上記のＤＮＡアプタマーは、上記の塩基配列に限定されず、上記のＤＮＡアプタマーの塩基配列のうち少なくとも一部を含む塩基配列からなり、前記塩基配列の長さが８０塩基以上９０塩基以下であるＤＮＡアプタマーも同様の作用効果を奏する。
【００１５】
また、本発明によれば、上記のＤＮＡアプタマーを含む、哺乳動物のストレスを評価するためのストレスマーカーが提供される。この構成によれば、安定性および８−ＯＨｄＧに対する特異性に優れるＤＮＡアプタマーを用いるため、安定な物質を用いて簡便に哺乳動物のストレスの指標となる８−ＯＨｄＧを検出することができる。その結果、再現性よく簡便に哺乳動物のストレスを評価することができる。
【００１６】
また、本発明によれば、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーを含む、哺乳動物のストレスを評価するためのストレスマーカーが提供される。この構成によれば、安定性および８−ＯＨｄＧに対する特異性に優れるＤＮＡアプタマーを用いるため、安定な物質を用いて簡便に哺乳動物のストレスの指標となる８−ＯＨｄＧを検出することができる。その結果、再現性よく簡便に哺乳動物のストレスを評価することができる。
【００１７】
また、本発明によれば、上記のＤＮＡアプタマーと、上記のＤＮＡアプタマーを固定化された水晶振動子と、を備える、ＤＮＡアプタマー固定化センサが提供される。この構成によれば、安定性および８−ＯＨｄＧに対する特異性に優れるＤＮＡアプタマーを用いるため、安定な物質を用いて簡便に哺乳動物のストレスの指標となる８−ＯＨｄＧを水晶振動子の振動として検出することができる。
【００１８】
また、本発明によれば、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーと、当該ＤＮＡアプタマーを固定化された水晶振動子と、を備える、ＤＮＡアプタマー固定化センサが提供される。この構成によれば、安定性および８−ＯＨｄＧに対する特異性に優れるＤＮＡアプタマーを用いるため、安定な物質を用いて簡便に哺乳動物のストレスの指標となる８−ＯＨｄＧを水晶振動子の振動として検出することができる。
【００１９】
また、上記のＤＮＡアプタマー、ストレスマーカーおよびＤＮＡアプタマー固定化センサは本発明の一態様であり、本発明のＤＮＡアプタマー、ストレスマーカーおよびＤＮＡアプタマー固定化センサは、以上の構成要素の任意の組合せであってもよい。また、本発明のストレス評価方法なども、上記のストレスマーカーと同様の構成を有し、同様の作用効果を奏する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーを用いるため、安定な物質を用いて簡便に８−ＯＨｄＧを検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２２】
本実施形態に係るストレスマーカーにおいて、上述のＤＮＡアダプターは、蛍光標識されていてもよい。この構成によれば、ＤＮＡアダプターを感度良く検出することが容易になる利点がある。
【００２３】
本実施形態に係るストレス評価方法は、上述の哺乳動物の尿を採取するステップと、上述の尿および蛍光標識された前記ＤＮＡアプタマーを接触させるステップと、上述の蛍光標識を測定するステップと、を含んでもよい。この方法によれば、採取が容易な尿および蛍光検出器を用いて、容易に感度良く８−ＯＨｄＧを検出することができる。
【００２４】
＜ＤＮＡアプタマー＞
ＤＮＡアプタマー（ＤＮＡ ａｐｔａｍｅｒ）とは、様々な分子を特異的に認識し、結合する一本鎖ＤＮＡを意味するものとする。ＤＮＡアプタマーには、（１）化学合成が容易で迅速かつ安価に取得でき、（２）熱およびｐＨ安定性に優れ、（３）理論上あらゆる物質に対するアプタマーの取得が可能であるという利点がある。
【００２５】
ＤＮＡアプタマーは、結合するターゲット分子に合わせ、図１に示すように、（ａ）ヘアピン型、（ｂ）バルジ型、（ｃ）シュードノット型、（ｄ）Ｇカルテット型などの様々な立体構造を取り得ることがわかっている。
【００２６】
現在、ＤＮＡアプタマーは、タンパク質、抗体、糖、また各種有機化合物等、様々な物質に対して結合することが明らかになっている。アプタマーのターゲットは比較的高い分子量の物質が多く、低分子量の物質をターゲットとしたものは、その研究の蓄積が更に必要であると言える。本実施例に係るＤＮＡアプタマーは、比較的低分子量である８−ＯＨｄＧをターゲットとするＤＮＡアプタマーであり、従来見出されてきたＤＮＡアプタマーには希にしか見られない特有の特性を有するものであると想定される。
【００２７】
具体的には、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーには、下記の表１に示す塩基配列からなる１８種類のＤＮＡアプタマーが含まれている。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】
表１および表２には、１８種類の塩基配列が示されている。なお、太字で示した箇所はランダム配列由来の配列である。また、下線を付した箇所は、代表配列に対する変異を有する箇所である。１８種類の塩基配列には、以下の配列が含まれている。
【００３１】
（ｉ）Ｏグループ
配列Ｏ （配列番号１）
配列Ｏ（Ａ２Ｇ） （配列番号２）
配列Ｏ（Ｔ１４Ｃ）（配列番号３）
配列Ｏ（Ａ２８Ｇ）（配列番号４）
配列Ｏ（Ｔ８Ｃ） （配列番号５）
【００３２】
（ｉｉ）Ｐグループ
配列Ｐ（配列番号６）
配列Ｐ（Ｇ８Ａ）（配列番号７）
配列Ｐ（Ｇ１２Ａ）（配列番号８）
配列Ｐ（Ａ１５Ｇ）（配列番号９）
配列Ｐ（Ａ２７Ｇ）（配列番号１０）
【００３３】
（ｉｉｉ）Ｑグループ
配列Ｑ（配列番号１１）
【００３４】
（ｉｖ）Ｒグループ
配列Ｒ（配列番号１２）
配列Ｒ（Ｔ１６Ｃ）（配列番号１３）
【００３５】
（ｖ）Ｓグループ
配列Ｓ（配列番号１４）
配列Ｓ（Ｃ２３Ｔ）（配列番号１５）
【００３６】
（ｖｉ）Ｔグループ
配列Ｔ（配列番号１６）
【００３７】
（ｖｉｉ）Ｕグループ
配列Ｕ（配列番号１７）
【００３８】
（ｖｉｉｉ）Ｖグループ
配列Ｖ（配列番号１８）
【００３９】
なお、上述の１８種類のＤＮＡアプタマーは、後述するように、いずれもＳＥＬＥＸ法により選抜された８−ＯＨｄＧに特異的に結合するＤＮＡアプタマーである。
【００４０】
よって、Ｏグループ、Ｐグループ、Ｒグループ、ＳグループのＤＮＡアプタマーは、グループ内で互いに１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列からなる関係にあるが、いずれも同様に８−ＯＨｄＧに特異的に結合する特性を有していることになる。
【００４１】
この事実から、８−ＯＨｄＧに特異的に結合するＤＮＡアプタマーの塩基配列に対して、１若しくは数個の塩基を欠失・置換若しくは付加させた塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも、同様に８−ＯＨｄＧへの特異的結合性を示すことがわかる。
【００４２】
従って、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーには、上記の表１および表２に示す塩基配列からなる１８種類のＤＮＡアプタマーの１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列からなり、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーも含まれる。
【００４３】
また、上記の事実から、８−ＯＨｄＧに特異的に結合するＤＮＡアプタマーの塩基配列との相同性が９０％以上、好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上である塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも、同様に８−ＯＨｄＧへの特異的結合性を示すことが示唆される。
【００４４】
従って、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーには、上記の表１および表２に示す塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなり、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーも含まれる。
【００４５】
また、上記の事実から、８−ＯＨｄＧに特異的に結合するＤＮＡアプタマーの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも、ＤＮＡアプタマーの２次構造は同様の構造となると予想されるため、同様に８−ＯＨｄＧへの特異的結合性を示すことが示唆される。
【００４６】
従って、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーには、上記の表１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなり、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーも含まれる。
【００４７】
また、上記の事実から、８−ＯＨｄＧに特異的に結合するＤＮＡアプタマーの塩基配列からなるＤＮＡ分子に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする哺乳動物由来のＤＮＡ分子の塩基配列からなるＤＮＡアプタマーも、同様に８−ＯＨｄＧへの特異的結合性を示すことが示唆される。
【００４８】
従って、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーには、上記の表１および表２に示す塩基配列からなるＤＮＡ分子に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする哺乳動物由来のＤＮＡ分子の塩基配列からなり、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーも含まれる。
【００４９】
＜８−ＯＨｄＧ結合性のＤＮＡアプタマーの応用＞
上述の特許文献１にも示されているように、尿中の８−ＯＨｄＧの濃度および哺乳動物（特にヒト）のストレスの程度との間には相関関係があると考えられる。そのため、本実施形態の８−ＯＨｄＧ結合性のＤＮＡアプタマーは、哺乳動物のストレスを評価するためのストレスマーカーとして応用が可能である。
【００５０】
あるいは、上述の表１および表２に記載の塩基配列と異なっていても、同様に８−ＯＨｄＧに特異的に結合する性質を有するＤＮＡアプタマーであれば、同様に哺乳動物のストレスを評価するためのストレスマーカーとして応用が可能である。
【００５１】
これらのストレスマーカーを用いることにより、図２に示すように、哺乳動物のストレスを評価するストレス評価方法を好適に実施できる。このようなストレス評価方法の一例としては、哺乳動物の尿を採取するステップと、尿および蛍光標識されたＤＮＡアプタマーを接触させるステップと、蛍光標識を測定するステップと、を含む方法などが考えられる。このような方法であれば、尿中の８−ＯＨｄＧの濃度を感度良く簡便に検出することができる。
【００５２】
また、本実施形態の８−ＯＨｄＧ結合性ＤＮＡアプタマーは、図３に示すように、下記のような種々の産業的応用が可能である。つまり、（ｉ）アプタマーの構造解析、（ｉｉ）新しいバイオアッセイ系への展開、（ｉｉｉ）バイオデバイスへの展開などが可能である。
【００５３】
（ｉ）アプタマーの構造解析
図３（ａ）に示すように、本実施形態の８−ＯＨｄＧ結合性ＤＮＡアプタマーおよび８−ＯＨｄＧの相互作用をＳＰＲ検出システム、蛍光偏光法などにより、詳細に解析することにより、低分子化合物の認識機構解析に応用可能である。
【００５４】
（ｉｉ）新しいバイオアッセイ系への展開
図３（ｂ）に示すように、上述のアプタマーの構造解析の結果を進化展開して、新しいバイオアッセイ系への展開を図ることができる。例えば、ＤＮＡアプタマーを２つに断片化し、一方の断片を分子認識に用い、他方の断片に蛍光標識を付加して、一方の断片と複合体を形成させ、シグナル検出に用いるアッセイ系などが考えられる。すなわち、ＤＮＡアプタマーの認識機構を利用して、サンドイッチタイプのバイオアッセイシステムへの展開を図ることなどができる。
【００５５】
（ｉｉｉ）バイオデバイスへの展開
図３（ｃ）に示すように、上述のＤＮＡアプタマーの構造解析の結果を発展研究して、バイオデバイスへの展開を図ることができる。例えば、ＤＮＡアプタマーを水晶振動子に固定化して作製されるＤＮＡアプタマー固定化センサを、ビスフェノールＡやダイオキシンなどの環境ホルモンの測定に用いることが考えられる。
【００５６】
このような水晶振動子としては、例えば、電気回路で発振回路およびフィルター回路と呼ばれている回路に広く用いられている水晶振動子を好適に用いうる。あるいは、腕時計などに組み込まれる水晶振動子なども好適に用いうる。
【００５７】
これらの水晶振動子に、上述のＤＮＡアプタマーを固定化することにより、センサとして利用することができる。その原理は、水晶振動子の表面に物質が吸着すると振動子を組み込んだ発振回路の発振周波数が変化することに基づいている。周波数減少の感度は非常に高く、９ＭＨｚで発振する水晶振動子を用いれば、１ｎｇ／ｃｍ2の吸着で約１Ｈｚの周波数の変化がある。
【００５８】
最近のエレクトロニクスの進歩によりデジタル回路を用いれば、９ＭＨｚのうち数１０Ｈｚの変化は検出できるので、数ｎｇの量が検知できる。９０ＭＨｚの特殊な振動子を用いれば、９ＭＨｚの場合に比べておおよそ１００倍感度が上がるので、０．１ｎｇの吸着は検知できる。そのため、例えば、水晶振動子の表面に８−ＯＨｄＧに特異的に結合するＤＮＡアプタマーを固定化すれば、８−ＯＨｄＧを特異的に検出するＤＮＡアプタマー固定化センサとなる。
【００５９】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００６０】
例えば、上記実施の形態では、バイオデバイスへの展開として、ＤＮＡアプタマーを固定化した水晶振動子を例に挙げたが、他にもＤＮＡチップなどに展開してもよい。このようにしても、ビスフェノールＡやダイオキシンなどに特異的に結合するＤＮＡアプタマーを利用して、環境ホルモンを測定することができる。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記の実施例１〜３を行うにあたって、まず、以下の実験材料および研究設備を準備した。
【００６２】
１．実験材料
（ｉ）ポジティブコントロール
抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（濃度：５ｎＭ）（日本老化制御研究所、ＭＯＧ−０２０）
【００６３】
（ｉｉ）ネガティブコントロール
Ｐ１プライマー
Ｐ２プライマー相補鎖（ＣＳ−Ｐ２プライマー）
なお、Ｐ１プライマーおよびＰ２プライマー相補鎖は、図４に示すように、ランダム配列領域の前後に配置されているＰ１プライマー領域およびＣＳ−Ｐ２プライマー領域にそれぞれ対応するプライマーおよびプライマー相補鎖である。
【００６４】
２．研究設備
下記の実施例１〜３で使用した主要な研究設備は、ＰＣＲ、蛍光偏光度計、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００（ＳＰＲセンサ）である。
【００６５】
＜実施例１＞
本実施例では、８−ＯＨｄＧを特異的に認識するＤＮＡアプタマーを取得し、そのアプタマーについて結合確認を行い、その評価方法を確立することを目的として以下の実験を行った。
【００６６】
１．概要
実験の概要を説明すると、まず、１）ＤＮＡアプタマーの探索のために、ｉ）ＳＥＬＥＸ法による８−ＯＨｄＧアプタマーの選抜を行い、ｉｉ）アプタマーライブラリーの構築を行った。次いで、２）ＤＮＡアプタマーの機能解析のために、ｉｉｉ）ＳＰＲセンサによる８−ＯＨｄＧアプタマーの特性評価を行い、ｉｖ）蛍光偏光分光法による８−ＯＨｄＧアプタマーの特性評価を行い、ｖ）個々のアプタマーの高次構造解析を行った。
【００６７】
２．アプタマーの選抜方法
目的のＤＮＡアプタマーを得るため、６０塩基のランダムな配列を有する一本鎖ＤＮＡのライブラリを用いた。初期のＤＮＡ ライブラリは４60の多様性を有しており、そこからＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法による選抜と、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法による増幅と、を繰り返し、スクリーニングすることによって、ターゲットにより結合するＤＮＡアプタマーの取得を目指した。
【００６８】
ＳＥＬＥＸ法によるＤＮＡの選抜に関しては、８−ＯＨｄＧまたはｄＧが表面に結合されている疎水性ビーズを用いて、増幅したｓｓＤＮＡとビーズを混合して室温で結合反応させ、分離用チューブによりビーズと液体を遠心分離し、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒによる洗浄を行った後、９５℃による熱溶出を行った。この操作を繰り返すことにより、ターゲットと結合するＤＮＡの選抜を行った。
【００６９】
こうして得られたＤＮＡ群をＴ−Ｖｅｃｔｏｒプラスミドに導入し、ＤＮＡライブラリを作製した。得られたライブラリのクローンをシークエンサーにより塩基配列を決定し、その一部についてターゲットとの結合確認を行った。その結果、下記の１８種のＤＮＡアプタマーのうち一部の配列について、８−ＯＨｄＧ分子を特異的に認識することを確認できた。これより、８−ＯＨｄＧ分子に結合するＤＮＡアプタマーをＤＮＡライブラリより選抜できたと考えられる。
【００７０】
具体的には、図５に示すように、プライマーサイト１およびプライマーサイト２に挟まれたランダム配列領域Ｎ６０を有する１本鎖ＤＮＡを作製した。ランダム配列領域Ｎ６０には、Ａ・Ｔ・Ｃ・Ｇをランダムに６０個配列し、理論上４60の多様性が得られるようにした。
【００７１】
次いで、直径４５〜１４５μｍのアガロースゲルマトリックスに８−ＯＨｄＧを担持させた。そして、ＳＥＬＥＸ法を用いて、上述の１本鎖ＤＮＡがアガロースゲルマトリックスに担持された８−ＯＨｄＧに結合するか否かという基準により、上述の１本鎖ＤＮＡ群から８−ＯＨｄＧに特異的に結合するＤＮＡアプタマーを選抜した。
【００７２】
図６は、ＳＥＬＥＸ法（試験管内進化法）について説明するための概念図である。この図に示すように、本実施例のＳＥＬＥＸ法では、８−ＯＨｄＧによる競合的溶出による溶出方法を採用した。すなわち、まず、ランダム配列の１本鎖ＤＮＡ群を、上述の標的化学物質である８−ＯＨｄＧを担持するアガロースゲルを壁面に備えるカラム内にアプライした。
【００７３】
そして、適当なバッファーでカラムを洗浄して、８−ＯＨｄＧに結合しなかった不結合の１本鎖ＤＮＡ群を除去した。その後、別のバッファーを流して、８−ＯＨｄＧに結合した１本鎖ＤＮＡ群を、８−ＯＨｄＧから解離させてカラムから溶出させた。
【００７４】
続いて、溶出した１本鎖ＤＮＡ群を、ＰＣＲ法により増幅させた。そして、ＰＣＲ法による増幅された１本鎖ＤＮＡ群を、再度、上述の標的化学物質である８−ＯＨｄＧを担持するアガロースゲルを壁面に備えるカラム内にアプライして、上述のサイクルを繰り返した。
【００７５】
上述のサイクルを繰り返す際には、ラウンド１〜３のサイクルでは、８−ＯＨｄＧを担持するアガロースゲルを壁面に備えるカラムを用いた。しかし、ラウンド４のサイクルでは、デオキシグアノシン（ｄＧ）との交叉結合性を低減するためのバックプレッシャーを与えることを目的として、ｄＧを担持するアガロースゲルを壁面に備えるカラムを用いた。
【００７６】
さらに、ラウンド５〜７のサイクルでは、再び８−ＯＨｄＧに対する特異性を高めるために、８−ＯＨｄＧを担持するアガロースゲルを壁面に備えるカラムを用いた。しかし、ラウンド８のサイクルでは、デオキシグアノシン（ｄＧ）との交叉結合性を低減するためのバックプレッシャーを与えることを目的として、ｄＧを担持するアガロースゲルを壁面に備えるカラムを用いた。そして、ラウンド９のサイクルでは、最後の仕上げとして８−ＯＨｄＧに対する特異性を高めるために、８−ＯＨｄＧを担持するアガロースゲルを壁面に備えるカラムを用いた。
【００７７】
そして、最後のラウンド９のサイクルでカラムから溶出してきた１本鎖ＤＮＡ群には、後述するように、８−ＯＨｄＧに対する優れた特異性を有するＤＮＡアプタマーが含まれていた。
【００７８】
なお、上述の実験に先だって、あらかじめＰＣＲの検討を行い、ＤＮＡポリメラーゼ酵素にはＥｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、ｄｓＤＮＡの作製には９５℃，１５ ｓｅｃ、７２℃，３０ｓｅｃの２ＳＴＥＰで１５サイクル行い、１００ｍＭのテンプレートを１ｍｌ用いると、ｓｓＤＮＡやダイマー等の非特異的な増幅が最も少なく、目的の１２０ｂｐ付近の大きさに効率よく増幅されたバンドが確認できた。
【００７９】
また、上述の実験に先だって、あらかじめｄｓＤＮＡをテンプレートとして、ｓｓＤＮＡを増幅するＰＣＲの条件を同様に検討した。ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＰＣＲを行い、変性ＰＡＧＥによる確認を行った。その結果、９５℃，１５ｓｅｃ、７２℃，３０ｓｅｃの２ＳＴＥＰで４０サイクル行い、切り出し精製してきたｄｓＤＮＡを２ｍｌ用いると、効率よく増幅することができた。作製したｓｓＤＮＡは、ＨＰＬＣシステムによっても確認した。
【００８０】
なお、この実験の各ラウンドにおいて、精製したｓｓＤＮＡを、変性ＰＡＧＥにて確認した。その結果、ラウンドを重ねていくごとに様々な長さのＤＮＡ断片が増幅されていくことが確認された。このように、カラム内での選抜とＰＣＲによる増幅を繰り返すことにより、非常に多様なランダムな配列のライブラリ（本実施例では４60の多様性）から徐々に焦点を絞っていくことができた。
【００８１】
３．ＳＥＬＥＸ法の結果
上述のＳＥＬＥＸ法により選抜されたＤＮＡアプタマーのリストを下記の表３に示す。表３では、ＳＥＬＥＸ後に得られたＤＮＡ群を大腸菌に形質転換し、個々の配列のシーケンス解析した結果を示している。表３で＊印を付した括弧内の数値は、１ヌクレオチド変異の入ったアプタマーの数を示す。なお、選抜されたＤＮＡアプタマーの配列情報は、既に上述の表１および表２に示している。
【００８２】
【表３】
【００８３】
表１、表２および表３に示したように、上述のＳＥＬＥＸ法の結果得られた１本鎖ＤＮＡ群のライブラリ総数１１４の内、配列が同じであるものが多数確認できた。その中には、類似配列も含まれており、１塩基のみ異なるといったものも確認することができた。
【００８４】
また、１塩基違いの配列も含め全部で３１種類の配列が確認できた。その中には全体の３０％以上の占有率を持つ配列（Ｏ）も確認できた。
【００８５】
これらの結果を考察すると、ライブラリの中で同じ配列（Ｏ、Ｐなど）のＤＮＡが多数存在するという結果は、その配列（Ｏ、Ｐなど）の標的物質（８−ＯＨｄＧ）に対する特異性が高いことを示唆しているものと思われる。そこで、特に占有率の高い配列（Ｏ）を中心に、全３１配列に対してＳＰＲセンサと、蛍光偏光による機能解析を行った。
【００８６】
なお、図７は、配列（Ｏ、Ｏ（Ｔ８Ｃ））の予測される２次構造を示す図である。この図に示すように、配列（Ｏ）および配列（Ｏ（Ｔ８Ｃ））の予測される２次構造は、わずか１塩基置換にもかかわらず、大きく異なっている。
【００８７】
＜実施例２＞
図８は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）検出システムの概要を示す図である。ＳＰＲ検出システムとは、２分子間の相互作用をリアルタイムにモニタリング可能なシステムである。本実施例では、ＳＰＲ検出システムとして、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００（ＳＰＲセンサ）を用いた。
【００８８】
ＢＩＡＣＯＲＥ２０００は、タンパク質の性質を他の分子との結合特異性、相互作用の速度（結合および解離）、そしてアフィニティー（他の分子にどのくらい強く結合するか）という観点から解明する。ＢＩＡＣＯＲＥ２０００を用いると、標識を用いることなく高感度、高精度な結合特異性の測定が可能になる。ＢＩＡＣＯＲＥ２０００の測定法は、対象となる生体分子が特定の結合パートナー分子と相互作用するという特徴を基礎にしており、一般的な測定技術（例えば、タンパク質濃度測定）よりもより多くの情報を得ることができる。
【００８９】
ＢＩＡＣＯＲＥ２０００では、偏光を全反射の条件下で、屈折率の異なる媒体、すなわちセンサ表面のガラス（屈折率の高い物質）と緩衡液(屈折率の低い物質）との界面に存在する金膜に照射すると表面プラズモン共鳴現象（ＳＰＲ）が生じる原理を利用する。
【００９０】
具体的には、広範囲の入射角度をカバーするくさび形の偏光（７６０ｎｍ）がセンサ表面のガラス面へと導かれ、この偏光の反射光がセンサにより検知される。このとき、偏光（７６０ｎｍ）をガラスに照射すると、エバネッセント波が発生し、このエバネッセント波は金膜の自由電子雲と相互作用を起こして吸収される。この吸収の際にプラズモンと呼ばれる電子密度波が発生し、偏光（７６０ｎｍ）の反射光の一部の強度を減衰させる。この反射光が最小となる角度（ＳＰＲアングル）は、センサ表面の反対側の金膜近傍の溶液の屈折率に相関するという性質を持っている。
【００９１】
ＢＩＡＣＯＲＥ２０００では、分子間相互作用はセンサ表面上のフローセルで起こる。分子はマイクロ流路系を通ってフローセルまで運ばれる。フローセルは天井のない流路の構造をしており、装置内ではセンサチップがちょうど蓋をするような形で装着される。フローセル内のセンサチップの表面には標的分子（リガンド）が固定されており、フローセル内を流れてきた分子と標的分子との相互作用を検出することができる。
【００９２】
図９は、ＳＰＲ検出システムの典型的なセンサグラムを示す。この図では、横軸は時間（秒）を示し、縦軸はレスポンス（ＲＵ）を示す。
【００９３】
ＢＩＡＣＯＲＥ２０００は、タンパク質の性質を他の分子との結合特異性、相互作用の速度（結合および解離）、そしてアフィニティー（他の分子にどのくらい強く結合するか）という観点から解明する。そのために、まず、（ｉ）ランニングバッファーを流し、（ｉｉ）分析対象の溶液を流し、（ｉｉｉ）再度ランニングバッファーを流すという手順で分析を行う。
【００９４】
すなわち、リガンドを固定化したセンサ表面に、結合性を示す試料を含む溶液を添加すると結合反応に伴い測定値は上昇し、バルブの切換えでランニングバッファーを流すことで解離反応が開始され測定値は減少する。ある程度解離反応を測定した後、塩濃度やpHを変化させるなどして、結合競合物質を添加するといった適当な条件で反応物質のみをセンサ表面から除き、表面を再生することができる。再生されたセンサ表面はリガンドの安定性に依存して繰り返し測定が可能となる。得られた相互作用測定グラフをセンサグラムとよぶ。
【００９５】
具体的には、データ処理において、図９で示した、センサグラムの結合容量（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ）を重ね書きするなどして、比較・計算することにより、タンパク質の性質を他の分子との結合特異性、相互作用の速度（結合および解離）、そしてアフィニティー（他の分子にどのくらい強く結合するか）などを評価することができる。
【００９６】
図１０は、ＳＰＲ検出システムによるＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）の分析結果を示すセンサグラムである。このグラフでは、横軸は時間（秒）を示し、縦軸はレスポンス（ＲＵ）を示している。また、８−ＯＨｄＧを担持させたセンサチップを用い、流速：２０μｌ／ｍｉｎ、ＤＮＡアプタマー添加量：２０ｍｌ、ＤＮＡアプタマー濃度：１０μＭの測定条件による測定を行った。ＤＮＡアプタマーを添加した時刻を０秒とすると、ＤＮＡアプタマーの添加を停止した時刻は６０秒であった。
【００９７】
この図には、４種類のＤＮＡアプタマー（配列Ｏ、配列Ｏ（Ｔ８Ｃ）、配列Ｏ（Ａ２８Ｇ）、配列Ｎ−Ｃ（*２５Ｃ））のセンサグラムが重ね書きされている。なお、配列Ｎ−Ｃ（*２５Ｃ）のＤＮＡアプタマーは、ネガティブコントロールとして測定されたものである。
【００９８】
このデータから、３種類のＤＮＡアプタマー（配列Ｏ、配列Ｏ（Ｔ８Ｃ）、配列Ｏ（Ａ２８Ｇ））の８−ＯＨｄＧに対するアフィニティーは、いずれもネガティブコントロールである配列Ｎ−Ｃ（*２５Ｃ）配列Ｎ−Ｃ（*２５Ｃ）のＤＮＡアプタマーよりも高いことが明らかである。
【００９９】
また、３種類のＤＮＡアプタマー（配列Ｏ、配列Ｏ（Ｔ８Ｃ）、配列Ｏ（Ａ２８Ｇ））同士のアフィニティーは、略同程度ではあるが、配列Ｏ、配列Ｏ（Ａ２８Ｇ）、配列Ｏ（Ｔ８Ｃ）の順に高いことも明らかである。
【０１００】
図１１は、ＳＰＲ検出システムによるＤＮＡアプタマーおよび抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの概要を示す概念図である。この競合アッセイにおいては、８−ＯＨｄＧをセンサチップ表面に固定しておき、フローセル中にＤＮＡアプタマーおよび抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体をともに含有する溶液を流す。
【０１０１】
そのため、ＤＮＡアプタマーに８−ＯＨｄＧに対する結合特異性がない場合には、図１１（ａ）に示すように、８−ＯＨｄＧの大部分には抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体が結合することになる。一方、ＤＮＡアプタマーに８−ＯＨｄＧに対する結合特異性がある場合には、図１１（ｂ）に示すように、８−ＯＨｄＧの一部には抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体が結合し、８−ＯＨｄＧの残りの一部にはＤＮＡアプタマーが結合することになる。
【０１０２】
そして、一般的には、ＤＮＡアプタマーよりも、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の質量（分子量）の方が大きいため、図１１（ａ）の場合には、図１１（ｂ）の場合に比べて、ＳＰＲ検出システムのセンサグラムの結合容量が大きく表示されることになる。
【０１０３】
具体的には、競合アッセイは、以下のような条件で行った。
まず、ｍＡｂ溶液５０ｍｌ（終濃度：１ｎＭ）と、アプタマー溶液５０ｍｌとを混合し、２５℃で５分静置した。次いで、ＦＩＴＣ標識８−ＯＨｄＧ溶液５０ｍｌ（８−ＯＨｄＧ：終濃度５００ｎＭ）と、ｍＡｂおよびアプタマーの混合溶液５０μｌとを混合した。その後、遮光して２５℃で１５分静置した。こうして反応させた後、蛍光偏光測定装置によりＩ0、Ｉ90を測定した。
【０１０４】
図１２は、ＳＰＲ検出システムによるＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）および抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの結果を示すセンサグラムである。このグラフでは、横軸は時間（秒）を示し、縦軸はレスポンス（ＲＵ）を示している。また、８−ＯＨｄＧを担持させたセンサチップを用い、流速：２０μｌ／ｍｉｎ、サンプル添加量：２０ｍｌの測定条件による測定を行った。サンプルを添加した時刻を０秒とすると、サンプルの添加を停止した時刻は６０秒であった。
【０１０５】
この図１２には、４種類のサンプルのセンサグラムが重ね書きされている。４種類のサンプルとは、（ｉ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、（ｉｉ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）１００ｎＭ、（ｉｉｉ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）１μＭ、（ｉｖ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）１０μＭの４種類である。
【０１０６】
このデータから、４種類のサンプルの結合容量は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）の順で大きいことが明らかである。すなわち、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）および抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の間で、８−ＯＨｄＧへの結合の競合が起こっていることが明らかである。言い換えれば、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）は、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体と同様に、８−ＯＨｄＧへの特異的な結合性を有しているということになる。
【０１０７】
図１３は、ＳＰＲ検出システムによるＰ２プライマー相補鎖および抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの結果を示すセンサグラムである。なお、Ｐ２プライマー相補鎖とは、図４に示すように、上述のＳＥＬＥＸ法において用いたプライマーサイト２に対応するプライマーの相補鎖である。すなわち、Ｐ２プライマー相補鎖には、８−ＯＨｄＧに対する特異的結合性は存在しない。
【０１０８】
このグラフでは、横軸は時間（秒）を示し、縦軸はレスポンス（ＲＵ）を示している。また、８−ＯＨｄＧを担持させたセンサチップを用い、流速：２０μｌ／ｍｉｎ、サンプル添加量：２０ｍｌの測定条件による測定を行った。サンプルを添加した時刻を０秒とすると、サンプルの添加を停止した時刻は６０秒であった。
【０１０９】
この図には、４種類のサンプルのセンサグラムが重ね書きされている。４種類のサンプルとは、（ｉ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、（ｉｉ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、Ｐ２プライマー相補鎖１００ｎＭ、（ｉｉｉ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、Ｐ２プライマー相補鎖１μＭ、（ｉｖ）抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体１０ｎＭ、Ｐ２プライマー相補鎖１０μＭの４種類である。
【０１１０】
このデータから、４種類のサンプルの結合容量は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）で約同程度であることが明らかである。すなわち、Ｐ２プライマー相補鎖および抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の間で、８−ＯＨｄＧへの結合の競合が起こっていないことが明らかである。言い換えれば、Ｐ２プライマー相補鎖は、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体と異なり、８−ＯＨｄＧへの特異的な結合性を有していないということになる。
【０１１１】
すなわち、この図１３のデータは、図１２のデータに基づいて、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）は、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体と同様に、８−ＯＨｄＧへの特異的な結合性を有しているという結論を導いた推論が正しいことを裏付けるネガティブコントロールとしての役割を果たしている。
【０１１２】
＜実施例３＞
図１４は、蛍光偏光法（ＦＰ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）の原理を説明するための概念図である。ここで、蛍光偏光法は、偏光励起光を蛍光物質に照射することにより、蛍光物質から発せられる蛍光が分子量に応じて異なった偏光を示すという特性に基づいた測定方法である。
【０１１３】
すなわち、静止した蛍光物質に偏光励起光を照射すると、蛍光も偏光として放出される。溶液中では分子は常に運動をしており、分子量の小さいものほど激しい運動をしている。小さな分子量の蛍光標識物質は溶液中では激しい運動をしているため、偏光励起光をあてても、その偏光を維持した蛍光量は少なく（偏光度が小さく）なる。
【０１１４】
ところが、蛍光標識物質が、抗体、受容体等の高分子のものと結合すると、見かけ上の分子量が大きくなるため、分子運動が小さくなり、結果としてその偏光を維持した蛍光（偏光度が高い）を放出することになる。
【０１１５】
そのため、リガンドである８−ＯＨｄＧに蛍光物質を標識し、それに対して抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体またはＤＮＡアプタマーを結合させることにより、得られる蛍光の偏向度が大きくなることになる。また、一般的に、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の質量（分子量）は、ＤＮＡアプタマーの質量（分子量）よりも大きいため、８−ＯＨｄＧに抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体が結合している場合の方が、８−ＯＨｄＧにＤＮＡアプタマーが結合している場合よりも、偏向度は大きくなる。
【０１１６】
図１５は、ＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧにＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）を結合させた場合のバインディングカーブを示すグラフである。横軸は、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）の濃度（Ｍ）を示し、縦軸は偏向度（ｍＰ）を示している。この実験では、上述の蛍光ラベル用溶液を調整して実験に用いた。
【０１１７】
（ｉ）８−ＯＨｄＧ溶液の調整
まず、８−ＯＨｄＧ ５ｍｇを１Ｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ＝７．７）５ｍｌに溶解した（すなわち、８−ＯＨｄＧの濃度は、１ｍｇ／ｍｌ＝３．５ｍＭである）。次いで、溶解後、得られた溶液をフィルター滅菌（０．２２μｍ）して８−ＯＨｄＧ溶液を調整した。
【０１１８】
（ｉｉ）ＦＩＴＣ溶液の調整
まず、ＦＩＴＣ−Ｉ（ＳＩＧＭＡ、３３２６−３２−７）１ｍｇを、ＭｅｔＯＨ ４００ｍｌに溶解させた。そして、ｍｉｌｌｉＱ水（ろ過滅菌済）１６００ｍｌをさらにくわえて、ＦＩＴＣ−Ｉの濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ（１ｍＭ）になるように調整した。なお、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）は、励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍで蛍光を発する性質を有する。
【０１１９】
（ｉｉｉ）ＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧの作製
まず、８−ＯＨｄＧ溶液とＦＩＴＣ−Ｉ溶液とを以下の割合で混合した。
８−ＯＨｄＧ溶液（３．５ｍＭ）１４ｍｌ（終濃度５００ｍＭ）
ＦＩＴＣ−Ｉ溶液（１ｍＭ）５０ｍｌ（終濃度 ５００ ｍＭ）
ｍｉｌｉＱ水３６ｍｌ
これらを加え全体を１００ｍｌに調整（緩衝溶液の終濃度：１４０ｍＭＰｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ＝７．７）した。
【０１２０】
次いで、遮光して２０時間、緩やかに攪拌（温度：４度）した。そして、下記の化学式に示すように、未反応のＦＩＴＣ−Ｉのアミノ基を保護基によりマスキングするため、反応後の混合溶液１０ｍｌにＦｏｌｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ４９９０ｍｌを加えた（８−ＯＨｄＧ：終濃度１ｍＭ）。その後、遮光して３０分、緩やかに攪拌（温度：２５度）した。そして、得られたＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧ溶液を、室温にて攪拌しながら保存した。
【０１２１】
【化１】
【０１２２】
（ｉｖ）８−ＯＨｄＧとアプタマー溶液の反応
まず、アプタマー溶液（濃度は２ｎＭ、２０ｎＭ、２００ｎＭ、２ｍＭ） ９０ｍｌを９８℃で５ｍｉｎ熱変性させた。次いで、アプタマーをｒｅｆｏｌｄｉｎｇ（再構築）させるために、２５℃で３０分静置した。そして、アプタマー溶液５０ｍｌを、チップ周辺に付着した蛍光物質が混合溶液に混入しないように注意しつつ、ＦＩＴＣ標識８−ＯＨｄＧ溶液５０ｍｌと混合した（ＦＩＴＣ標識８−ＯＨｄＧ：終濃度５００ｎＭ）。
【０１２３】
続いて、この混合溶液を遮光して２５℃で１５分静置した。こうして反応させた混合溶液について、蛍光偏光測定装置によりＩ０、Ｉ９０を測定した。測定条件は、励起波長：４９５ｎｍ、蛍光波長：５４５ｎｍ、測定時間：１分間にて行った。なお、Ｃｏｎｔｒｏｌのサンプルも同様に、上述の（ｉ）〜（ｉｖ）の手順に従って実験を行った。
【０１２４】
なお、蛍光偏光度（ｍＰ）は、以下の式に従って算出した。
ｍＰ＝（Ｉ0−Ｉ90×１．９）／（Ｉ0＋Ｉ90×１．９）×１０００
Ｉ0：照射光の方向に水平な蛍光の強度
Ｉ90：照射光の方向に垂直な蛍光の強度
【０１２５】
そして、ブランク（サンプルを溶解している緩衝溶液）とサンプルとの偏光度の差（ΔｍＰ）は、以下の式に従い算出した。
ΔｍＰ＝ｍＰ（サンプル）−ｍＰ（ブランク）
【０１２６】
再び図１５に戻ると、上述の実験方法により得られた、このバインディングカーブから、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）を多く添加すればするほど、偏向度が大きくなることが明らかである。すなわち、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）は、８−ＯＨｄＧに特異的に結合していることが明らかである。
【０１２７】
図１６は、ＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧにＰ１プライマーを添加した場合のバインディングカーブを示すグラフである。横軸は、Ｐ１プライマーの濃度（Ｍ）を示し、縦軸は偏向度（ｍＰ）を示している。なお、Ｐ１プライマーとは、図４に示すように、上述のＳＥＬＥＸ法において用いたプライマーサイト１に対応するプライマーである。すなわち、Ｐ１プライマーには、８−ＯＨｄＧに対する特異的結合性は存在しない。この実験でも、上述の蛍光ラベル用溶液を調整して実験に用いた。
【０１２８】
このバインディングカーブから、Ｐ１プライマーを多く添加しても、偏向度が大きくならないことが明らかである。すなわち、Ｐ１プライマーは、８−ＯＨｄＧに特異的に結合しないことが明らかである。
【０１２９】
すなわち、この図１６のデータは、図１５のデータに基づいて、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）は、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体と同様に、８−ＯＨｄＧへの特異的な結合性を有しているという結論を導いた推論が正しいことを裏付るネガティブコントロールとしての役割を果たしている。
【０１３０】
図１７は、蛍光偏光法によるＤＮＡアプタマーおよび抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの概要を示す概念図である。この競合アッセイにおいては、８−ＯＨｄＧに蛍光標識（ＦＩＴＣ）をラベルしておき、ＤＮＡアプタマーおよび抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体をともに添加する。
【０１３１】
そのため、ＤＮＡアプタマーに８−ＯＨｄＧに対する結合特異性がない場合には、図１７（ａ）に示すように、８−ＯＨｄＧの大部分には抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体が結合することになる。一方、ＤＮＡアプタマーに８−ＯＨｄＧに対する結合特異性がある場合には、図１７（ｂ）に示すように、８−ＯＨｄＧの一部には抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体が結合し、８−ＯＨｄＧの残りの一部にはＤＮＡアプタマーが結合することになる。
【０１３２】
そして、一般的には、ＤＮＡアプタマーよりも、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の質量（分子量）の方が大きい（本実施例では、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の分子量は１５０，０００であり、ＤＮＡアプタマーの分子量は３０，０００である）ため、図１７（ａ）の場合には、図１７（ｂ）の場合に比べて、蛍光偏向度が大きく表示されることになる。
【０１３３】
図１８は、ＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧに対する抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体およびＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）を競合的に結合させた場合のバインディングカーブを示すグラフである。横軸は、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）の濃度（Ｍ）を示し、縦軸は偏向度（ｍＰ）を示している。なお、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体は、当初からＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧ溶液に１ｎＭの濃度で含有されており、実験を通じて増減していない。この実験でも、上述の蛍光ラベル用溶液を調整して実験に用いた。
【０１３４】
このバインディングカーブから、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）を多く添加すればするほど、偏向度が小さくなることが明らかである。すなわち、すなわち、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）および抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の間で、８−ＯＨｄＧへの結合の競合が起こっていることが明らかである。言い換えれば、ＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）は、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体と同様に、８−ＯＨｄＧへの特異的な結合性を有しているということになる。
【０１３５】
上述のように、蛍光偏光測定によって、配列（Ｏ）のＤＮＡアプタマーについては、濃度依存的に偏光度の上昇が確認できたが、Ｐ１プライマーおよびＰ２プライマーについては、濃度依存的に偏光度の上昇は確認できなかった。すなわち、ＳＥＬＥＸ法によりランダム配列から選定してきた配列（Ｏ）などのＤＮＡアプタマーが８−ＯＨｄＧへの特異的結合に関与していることが明らかである。
【０１３６】
＜実施例のまとめ＞
上述の実施例では、バイオマーカーである８−ＯＨｄＧに対するＤＮＡアプタマーの取得を目的として実験を行った。その結果を以下にまとめる。
【０１３７】
（ｉ）ＳＥＬＥＸ法により、８−ＯＨｄＧに対するアプタマーの選抜を行い、１１４サンプルのアプタマーライブラリーの構築をすることができた。
（ｉｉ）ＳＰＲセンサ（ＢＩＡＣＯＲＥ２０００）および蛍光偏光測定にて、上述のアプタマーライブラリーの代表例（配列Ｏおよびその変異体）が、８−ＯＨｄＧに対して非常に高い特異性を有することを確認することができた。
【０１３８】
＜既存のキットとの比較＞
８−ＯＨｄＧ測定キットについては、既に老化制御研究所より抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体を用いたキットが販売されている。その感度は、おおよそ１〜２００ｎｇ／ｍｌであると取扱説明書などには記載されている。すなわち、８−ＯＨｄＧは約３００の分子量であるため、老化制御研究所のキットの検出感度はおおよそ３〜６００ｎＭ程度であると想定される。
【０１３９】
上述の実施例で得られたＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）の検出感度のレンジについては、現在精査中であるが、５００ｎＭ程度の８−ＯＨｄＧは検出することが可能であることを確認している。従って、上述の実施例で得られたＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）は、既存のキットに含まれる抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体と略同等程度の特異的な８−ＯＨｄＧ認識能力を有していると想定される。
【０１４０】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【０１４１】
たとえば、上記実施例では、上述のアプタマーライブラリーの代表例として配列Ｏおよびその変異体を用いたが、配列Ｐおよびその変異体、配列Ｑ、配列Ｒおよびその変異体、配列Ｓおよびその変異体、配列Ｔ、配列Ｕ、配列Ｖなどを代表例として用いても、配列Ｏおよびその変異体と同様に、８−ＯＨｄＧに対して非常に高い特異性を有することを確認することができると想定される。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
以上のように、本発明にかかる８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーは、８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有する。このため、このＤＮＡアプタマーは、ストレスマーカー、ストレス評価方法およびＤＮＡアプタマー固定化センサなどにおいて有効に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】ＤＮＡアプタマーの多様な立体構造を説明する概念図である。
【図２】８−ＯＨｄＧ結合性のＤＮＡアプタマーの人体ストレスを評価するための診断応用について説明する概念図である。
【図３】８−ＯＨｄＧ結合性のＤＮＡアプタマーの応用例について説明する概念図である。
【図４】ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールについて説明する概念図である。
【図５】ＤＮＡアプタマーの選抜方法について説明する概念図である。
【図６】ＳＥＬＥＸ法（試験管内進化法）について説明する概念図である。
【図７】配列Ｏおよび配列Ｏ（Ｔ８Ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡアプタマーの予測される２次構造について説明する概念図である。
【図８】ＳＰＲ検出システムの概要を示す概念図である。
【図９】ＳＰＲ検出システムの典型的なセンサグラムを示す概念図である。
【図１０】ＳＰＲ検出システムによるＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）の分析結果を示すセンサグラムである。
【図１１】ＳＰＲ検出システムによるＤＮＡアプタマーおよび抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの概要を示す概念図である。
【図１２】ＳＰＲ検出システムによるＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）および抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの結果を示すセンサグラムである。
【図１３】ＳＰＲ検出システムによるＰ２プライマー相補鎖および抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの結果を示すセンサグラムである。
【図１４】蛍光偏光法の原理を説明するための概念図である。
【図１５】ＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧにＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）を結合させた場合のバインディングカーブを示すグラフである。
【図１６】ＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧにＰ１プライマーを添加した場合のバインディングカーブを示すグラフである。
【図１７】蛍光偏光法によるＤＮＡアプタマーおよび抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体の競合アッセイの概要を示す概念図である。
【図１８】ＦＩＴＣラベル８−ＯＨｄＧに対する抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体およびＤＮＡアプタマー（配列Ｏ）を競合的に結合させた場合のバインディングカーブを示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１乃至１８いずれかで表される塩基配列からなり、８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー。
【請求項２】
配列番号１乃至１８いずれかで表される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列からなり、８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー。
【請求項３】
配列番号１乃至１８いずれかで表される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなり、８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー。
【請求項４】
配列番号１乃至１８いずれかで表される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなり、８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー。
【請求項５】
配列番号１乃至１８いずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡ分子に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする哺乳動物由来のＤＮＡ分子の塩基配列からなり、８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれかに記載のＤＮＡアプタマーの塩基配列のうち少なくとも一部を含む塩基配列からなり、前記塩基配列の長さが８０塩基以上９０塩基以下であり、８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー。
【請求項７】
請求項１乃至６いずれかに記載のＤＮＡアプタマーを含む、哺乳動物のストレスを評価するためのストレスマーカー。
【請求項８】
８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーを含む、哺乳動物のストレスを評価するためのストレスマーカー。
【請求項９】
請求項７または８記載のストレスマーカーにおいて、
前記ＤＮＡアダプターは、蛍光標識されている、ストレスマーカー。
【請求項１０】
請求項１乃至６いずれかに記載のＤＮＡアプタマーを用いて、哺乳動物のストレスを評価するストレス評価方法。
【請求項１１】
８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーを用いて、哺乳動物のストレスを評価するストレス評価方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１記載のストレス評価方法において、
前記哺乳動物の尿を採取するステップと、
前記尿および蛍光標識された前記ＤＮＡアプタマーを接触させるステップと、
前記蛍光標識を測定するステップと、
を含む、ストレス評価方法。
【請求項１３】
請求項１乃至６いずれかに記載のＤＮＡアプタマーと、
前記ＤＮＡアプタマーを固定化された水晶振動子と、
を備える、ＤＮＡアプタマー固定化センサ。
【請求項１４】
８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーと、
前記ＤＮＡアプタマーを固定化された水晶振動子と、
を備える、ＤＮＡアプタマー固定化センサ。
【請求項１】
配列番号１乃至１８いずれかで表される塩基配列からなり、８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー。
【請求項２】
配列番号１乃至１８いずれかで表される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列からなり、８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー。
【請求項３】
配列番号１乃至１８いずれかで表される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなり、８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー。
【請求項４】
配列番号１乃至１８いずれかで表される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなり、８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー。
【請求項５】
配列番号１乃至１８いずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡ分子に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする哺乳動物由来のＤＮＡ分子の塩基配列からなり、８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれかに記載のＤＮＡアプタマーの塩基配列のうち少なくとも一部を含む塩基配列からなり、前記塩基配列の長さが８０塩基以上９０塩基以下であり、８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー。
【請求項７】
請求項１乃至６いずれかに記載のＤＮＡアプタマーを含む、哺乳動物のストレスを評価するためのストレスマーカー。
【請求項８】
８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーを含む、哺乳動物のストレスを評価するためのストレスマーカー。
【請求項９】
請求項７または８記載のストレスマーカーにおいて、
前記ＤＮＡアダプターは、蛍光標識されている、ストレスマーカー。
【請求項１０】
請求項１乃至６いずれかに記載のＤＮＡアプタマーを用いて、哺乳動物のストレスを評価するストレス評価方法。
【請求項１１】
８−ヒドロキシデオキシグアノシンに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーを用いて、哺乳動物のストレスを評価するストレス評価方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１記載のストレス評価方法において、
前記哺乳動物の尿を採取するステップと、
前記尿および蛍光標識された前記ＤＮＡアプタマーを接触させるステップと、
前記蛍光標識を測定するステップと、
を含む、ストレス評価方法。
【請求項１３】
請求項１乃至６いずれかに記載のＤＮＡアプタマーと、
前記ＤＮＡアプタマーを固定化された水晶振動子と、
を備える、ＤＮＡアプタマー固定化センサ。
【請求項１４】
８−ＯＨｄＧに特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーと、
前記ＤＮＡアプタマーを固定化された水晶振動子と、
を備える、ＤＮＡアプタマー固定化センサ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２００７−２４４２５４（Ｐ２００７−２４４２５４Ａ）
【公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−６９９９０（Ｐ２００６−６９９９０）
【出願日】平成１８年３月１４日（２００６．３．１４）
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月１４日（２００６．３．１４）
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
【Ｆターム（参考）】
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