９位過酸化脂肪酸の製造方法
【課題】生体触媒を利用して９位過酸化脂肪酸を製造する方法の提供。
【解決手段】以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるタンパク質を含む生体触媒を用いて、多価不飽和脂肪酸の９位を過酸化する工程を含む９位過酸化脂肪酸の製造方法。（ａ）シロイヌナズナ由来の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）上記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質。（ｃ）上記アミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質。
【解決手段】以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるタンパク質を含む生体触媒を用いて、多価不飽和脂肪酸の９位を過酸化する工程を含む９位過酸化脂肪酸の製造方法。（ａ）シロイヌナズナ由来の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）上記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質。（ｃ）上記アミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多価不飽和脂肪酸の９位過酸化誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）は、リノール酸、リノレン酸（炭素数１８）やアラキドン酸（炭素数２０）などの１，４−ペンタジエン構造を持つ不飽和脂肪酸に分子状酸素を直接導入し、ヒドロペルオキシ基（−ＯＯＨ）を生成する活性を有しており、植物をはじめ、動物やカビ・酵母などの真核微生物等に存在することが知られている（非特許文献１）。動物においては、アラキドン酸からプロスタグランジンが生成する過程でこの酵素が関与していることから、最も研究が進んでいる（非特許文献２）。
【０００３】
植物のリポキシゲナーゼについては、α−リノレン酸、リノール酸等の炭素数１８の不飽和脂肪酸を基質として、９位と１３位の２つの生成物特異性を示すものに分類されることが知られている（例えば、非特許文献１、非特許文献３）。これまでに、ポテト、ダイズ、トマト、エンドウ豆、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、キュウリ等に９位及び／又は１３位生成物特異性リポキシゲナーゼが存在することが知られており、いくつかのｃＤＮＡも単離されている。しかしながら、主に研究がなされているのは、植物ホルモンとして注目されているジャスモン酸の代謝経路に関係する１３位特異性のリポキシゲナーゼであり、９位生成物特異性リポキシゲナーゼについての研究は比較的少ない。
【０００４】
リポキシゲナーゼは、ロイコトリエン関連化合物等の生理活性物質の生産、小麦粉の色相改善、製パン特性の向上または洗浄剤成分としての利用などが知られている。
また、多価不飽和脂肪酸の９位過酸化誘導体は、揮発性の天然フレーバー及びフレグランス成分や、植物成長調整剤(特許文献１及び２)の原料となりうる。例えばα−リノレン酸の９位過酸化誘導体からはヒドロペルオキシドリアーゼを作用させることにより、トランス−２−シス−６−ノナジエナール、トランス−２−シス−６−ノナジエン−１−オール、シス−３−シス−６−ノナジエナール、シス−３−シス−６−ノナジエン−１−オールなどのスイカ、キュウリ、メロンの香気成分を得ることができ、アレンオキシドサイクラーゼを作用させることにより、α−ケトール脂肪酸などの植物成長調整剤を得ることができる。
【０００５】
上記９位過酸化脂肪酸をα-リノレン酸やリノール酸などを原料に酵素合成によって製造する場合、９位生成物特異性リポキシゲナーゼが必須である。しかしながら９位生成物特異性リポキシゲナーゼは商業的に入手できず、植物から抽出するにも材料の入手や処理に大変手間がかかることから、遺伝子組換えを用いた酵素の大量調製の技術の確立が望まれていた。９位生成物特異的リポキシゲナーゼについては、イネの胚芽やバナナに多く存在することが知られ（非特許文献４及び５）、イネにおいては９位生成物特異性リポキシゲナーゼのｃＤＮＡが単離され、配列が決定されている（非特許文献６）。また、大腸菌内でイネ・リポキシゲナーゼの発現を行い調製した酵素溶液にて９位過酸化α−リノレン酸の製造が試みられている（特許文献３）。
【特許文献１】特開平９−２９５９０８号公報
【特許文献２】特開平１１−０２９４１０号公報
【特許文献３】特開２００２−３２５５７７号公報
【非特許文献１】内山充ら、過酸化脂質と生体、23-26, 1985, 学会出版センター
【非特許文献２】山本尚三、蛋白質核酸酵素、44, 1132-1138, 1999
【非特許文献３】Eur. J. Biochem. 1991;199:451-457
【非特許文献４】Lipids 1980;15:1-5、Agric. Biol. Chem. 1980;44:443-445
【非特許文献５】J. Agric. Food Chem. 2006;54:3151-3156
【非特許文献６】Plant Cell Physiol. 2003;44:1168-1175
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、反応性の高い９位生成物特異性リポキシゲナーゼ、及びこれを用いた９位過酸化脂肪酸の製造方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、９位生成物特異性リポキシゲナーゼを探索したところ、ＮＣＢＩデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery）にて１３位リポキシゲナーゼと登録されているシロイヌナズナ由来ＬＯＸ１が、予想に反して９位過酸化反応を触媒することを明らかとした。また、現在知られている９位生成物特異的リポキシゲナーゼのcDNAを大腸菌で発現すると、多くが不溶性となり活性を示すタンパク質を大量に得られないにもかかわらず、シロイヌナズナ由来ＬＯＸ１では大腸菌内で良好な活性体として発現でき、本ＬＯＸ１を用いることにより９位過酸化脂肪酸を効率的に製造できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるタンパク質を含む生体触媒を用いて、多価不飽和脂肪酸の９位を過酸化する工程を含むことを特徴とする９位過酸化脂肪酸の製造方法を提供するものである。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
また、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される９位生成物特異性リポキシゲナーゼを提供するものである。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、多価不飽和脂肪酸の９位過酸化誘導体を効率的に製造することができる。従って、本発明は、揮発性の天然フレーバー及びフレグランス成分や、植物成長調整剤の原料を製造するための方法として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の９位過酸化脂肪酸の製造方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるタンパク質からなる９位生成物特異性リポキシゲナーゼが使用される。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
【００１１】
ここで、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（９位生成物特異性リポキシゲナーゼ）は、ＮＣＢＩデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery）の照会番号ＧＯ００１６１６５にて１３位リポキシゲナーゼと登録されているシロイヌナズナ由来ＬＯＸ１に相当する。当該タンパク質と他の９位生成物特異性リポキシゲナーゼとのアミノ酸配列の同一性は、ポテト由来のＰｏｔａｔｏ ｔｕｂｅｒ ＬＯＸとは６６．３％、タバコ由来のＴａｂａｃｏ ＬＯＸとは６８．５％、大麦由来のＢａｒｌｅｙ ｇｒａｉｎ ＬＯＸ−Ａとは５５．６％、イネ由来のＲｉｃｅ ＬＯＸ１とは５６．４％である。
【００１２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、シロイヌナズナから単離し得るが、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を挿入した発現ベクターを導入した組換え宿主より製造することもできる（後記実施例１参照）。特に、大腸菌内において、イネ由来９位生成物特異性リポキシゲナーゼ（Ｒｉｃｅ ＬＯＸ１、特開２００２−３２５５７７号公報）に比べて良好な活性体として発現される（実施例２参照）。
【００１３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一なタンパク質もまた、本発明で使用される脂肪酸９位過酸化酵素に包含される。「実質的に同一なタンパク質」とは、脂肪酸９位過酸化活性を有する限りにおいて、配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個、例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。
【００１４】
「実質的に同一なタンパク質」としてはまた、脂肪酸９位過酸化活性を有する限りにおいて、配列番号１のアミノ酸配列と、７０％以上の配列同一性、好ましくは８０％以上の配列同一性、より好ましくは８５％以上の配列同一性、さらに好ましくは９０％以上の配列同一性、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。アミノ配列の同一性は、例えば、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５（１９８５））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１５】
所与のタンパク質と実質的に同一なタンパク質は、公知の技術によって取得される。例えば、実質的に同一なタンパク質は、部位特異的変異法によって、所与のタンパク質のアミノ酸配列から特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加等されるようにそのタンパク質の遺伝子の塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された塩基配列を有するポリヌクレオチドは、従来知られている他の突然変異処理によっても取得できる。他の突然変異処理としては、配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをヒドロキシアミン等でインビトロ処理する方法、及び配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持する微生物等を紫外線照射もしくはニトロソグアニジン等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００１６】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、若しくは付加等の改変には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる改変も含まれる。上記のような改変を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の酵素活性を調べることにより、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質及びそれをコードするＤＮＡが得られる。
【００１７】
本発明における「脂肪酸９位過酸化活性」とは、１，４−ペンタジエン構造を持つ多価不飽和脂肪酸の９位に分子状酸素を直接導入し、ヒドロペルオキシ基（−ＯＯＨ）を生成する活性をいう。
【００１８】
本発明の９位過酸化脂肪酸の製造方法は、上記の９位生成物特異性リポキシゲナーゼを含む生体触媒を用いて多価不飽和脂肪酸の９位過酸化反応（９位にヒドロペルオキシ基を導入する工程）を含むものである。すなわち、多価不飽和脂肪酸を、上記の９位生成物特異性リポキシゲナーゼを含む生体触媒と接触させることにより９位に分子状酸素を導入し、過酸化反応終了後、反応混合物から目的の９位過酸化脂肪酸を単離することにより行うことができる。
【００１９】
本発明の方法において、生体触媒は、上記の９位生成物特異性リポキシゲナーゼを含む限り、任意の形態で用いられ得る。これらの酵素を含む生体触媒としては、例えば、本発明の酵素を産生する動物細胞、植物細胞、微生物菌体（生菌体、死滅菌体、休止菌体若しくは静止菌体等）等の生体細胞、又はその培養物；本発明の酵素を含むオルガネラ（細胞小器官）；上記生体細胞やオルガネラのホモジネート又は抽出物；粗酵素；及び精製酵素等が挙げられる。上記の本発明の酵素を産生する生体細胞等は、天然に存在するものであっても、遺伝子操作を初めとする種々の方法で改変された変異体であってもよい。これらの生体触媒は、単独で使用されても組み合わせて使用されてもよく、また、そのまま使用されてもよいが、溶液、懸濁液等の液体形態や、任意の固相担体に固定された形態であってもよい。
【００２０】
固相担体に固定された生体触媒としては、上記生体触媒を、任意の水不溶性固相担体に公知の方法に従って固定したものが挙げられる。生体触媒を固形担体に固定化することにより、バッチ反応における回収・再使用が容易で、かつ半連続、連続反応にも容易に使用可能となることから、長期且つ繰り返して使用可能な固定化生体触媒が得られる。
【００２１】
担体への結合法としては、例えば、特開平１１−１９２０９６号公報に記載されるような、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、架橋法、包括法又はこれらの組み合わせが挙げられる。結合に用いられる担体としては、例えば、以下：活性炭、多孔性ガラス、酸性白土、漂白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、金属酸化物のような無機物質；デンプン、グルテンのような天然高分子；多孔性の合成樹脂；セラミック；限界濾過膜や限界濾過膜でできた中空糸；疎水基をもつブチル−ヘキシルセファデックス；タンニンをリガンドとするセルロース誘導体；イオン交換基をもった多糖類（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ）；イオン交換樹脂；天然又は合成高分子のゲル又はマイクロカプセルが挙げられる。
【００２２】
本発明の方法においては、必要に応じて、上記の脂肪酸９位過酸化酵素とともに、適切な酵素、その他の本発明の過酸化反応に必要な物質が用いられる。例えば、過酸化反応の副産物として生じる活性酸素や過酸化水素の無毒化を目的とし、スーパーオキシドディスムターゼ、カタラーゼ等が用いられる。上記動物、植物細胞、オルガネラ、微生物菌体等は、ＬＯＸを保護する上記の酵素系を含有している点で、好ましい生体触媒である。
【００２３】
以上に示した生体触媒を用いた本発明の方法による９位過酸化脂肪酸の製造は、化学的手法に比べてマイルドな条件で行うことができる。例えば、生体触媒に含まれる本発明の酵素と原料の多価不飽和脂肪酸との反応においては、ｐＨは通常、本発明の酵素の至適ｐＨ（ｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜９）付近に緩衝液を用いて調整される。反応温度は１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃である。反応時間は、１分〜２４時間、好ましくは１０分〜１６時間である。反応系には、原料の多価不飽和脂肪酸の溶解性を向上させる為に、適宜ノニオン、アニオン、カチオン、両性等の界面活性剤を添加してもよい。同様に、多価不飽和脂肪酸の溶解性向上の為に有機溶媒を添加してもよい。これらの有機溶媒は、酵素活性を阻害せず、原料脂肪酸を溶解するものであれば、いずれの溶媒も使用可能である。具体例としては、アルコール類、ケトン類、エーテル類等の極性溶媒、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、キノリン等の含窒素溶媒、ジメチルスルホキシド等の含硫黄溶媒、芳香族や飽和、不飽和炭化水素等の非極性溶媒等が使用され得るが、エタノール５％添加が最も好ましい。
【００２４】
生体触媒として生体細胞培養物を利用する場合、例えば、当該培養物に原料多価不飽和脂肪酸を添加することができる。９位過酸化反応に必要な補酵素等は、細胞内のものを利用すればよいが、必要に応じて培養物中に添加してもよい。原料及び適切な物質を添加した培養物を、適切な培養条件下で一定時間保持することにより、培養物中の本発明の酵素と多価不飽和脂肪酸とが反応し、９位過酸化脂肪酸が生成される。上記適切な培養条件及び時間は、用いる細胞の種類によって異なるが、当業者の通常の知識に従って適宜設定すればよい。
【００２５】
本発明における多価不飽和脂肪酸とは、分子内に二重結合を２個以上有する（１，４−ペンタジエン構造を持つ）脂肪酸の総称である。本発明の製造方法においては、炭素数が１８〜２２のものが好適であり、更に分子内に二重結合を２〜６個有するものが好適である。具体的には、例えばリノール酸、α−リノレン酸、γ-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、及びそのナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。これらの原料多価不飽和脂肪酸は、単独もしくは組み合わせて使用され得る。
【００２６】
本発明の方法により製造される９位過酸化脂肪酸の例としては、上記の原料脂肪酸の９位にヒドロペルオキシ基が導入されたものが挙げられる。
【００２７】
斯くして製造された９位過酸化脂肪酸は、反応終了後、反応系から単離され、回収される。単離は、当該分野で公知の任意の方法によって行うことができる。例えば、反応物を遠心又は濾過することによって、生成物を生体触媒から分離し、その後、クロマトグラフィーを行うことによって、高純度な生成物を含む画分を得ることができる。
【実施例】
【００２８】
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
実施例１ シロイヌナズナ由来ＬＯＸ１の取得
（ｉ）大腸菌によるＬＯＸ１の発現
タンパク質生産用宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１Ｓｔａｒ (ＤＥ３)(インビトロジェン)を用いた。ＬＯＸ１を高発現するベクターであるｐＥＴＬＯＸ１は、ＬＯＸ１遺伝子をｐＥＴ２１ａ(ノバジェン)のマルチクローニングサイトに挿入したプラスミドである。ＬＯＸ１遺伝子の増幅は市販シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリー（インビトロジェン）を鋳型とし、プライマーとしてｒｂｓＬＯＸ１／ＳａｌI ＦＷ、ＬＯＸ１／ＸｈｏI ＲＶを使用して行った（配列番号２，３）。ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を用いた。ＰＣＲの組成は添付のプロトコールに従った。ＰＣＲ条件は、９８℃ １分の後に、９８℃ １０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３分のサイクルを２５回行った。増幅した約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＳａｌI、ＸｈｏIで処理し、ｐＥＴ２１ａのＳａｌI、ＸｈｏIサイトに挿入した。ｐＥＴＬＯＸ１が導入された大腸菌の形質転換体を以下の様に培養し、タンパク質の発現誘導を行った。即ち、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ培地５ｍＬ（大型試験管を使用）に１白金耳の形質転換体を植菌し、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩培養し種培養液とした。種培養液をアンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ培地５００ｍＬ（５００ｍＬ坂口フラスコに１００ｍＬ仕込み、計５本）に１％(ｖ／ｖ)植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍでＯＤ６００＝約０．４になるまで振盪培養した。次に終濃度としてイソプロピル−β―Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．５ｍＭ、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏを０．００１％となるよう添加し、更に１７℃、１２０ｒｐｍで２０時間振盪培養した。培養液を４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心して集菌し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．０)緩衝液１０ｍＬで１回洗菌を行った。
【００２９】
（ii）組換えタンパク質の精製
回収した菌体を、コンプリートミニＥＤＴＡフリー(ロシュ)を１錠/１０ｍＬとなるように溶解させた５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．０)７ｍＬに懸濁し、懸濁液中の菌体を超音波破砕した後、破砕液を４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清６.７ｍＬを取得し組換えＬＯＸ１を含む菌体抽出液を得た。
【００３０】
実施例２ 組換えＬＯＸ１の活性確認
実施例１記載のように調製した酵素液を用いて、リポキシゲナーゼの活性を測定した。１０ｍＭのα-リノレン酸Ｎａ水溶液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０を含む）０．２５ｍＬ、０．２Ｍのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７）０．１ｍＬ、蒸留水０．１４５ｍＬを１５ｍＬ容量のチューブに入れ、２５℃で５分間振盪した。その後、酵素液０．００５ｍＬを加え、５分間振盪反応した。酵素液添加時および５分後に０．２ｍＬずつ抜き取り、０．１ｍＬの１Ｍ ＨＣｌ溶液を入れた１５ｍＬチューブ中にそれぞれ加えた。そこに、ヘキサン：エタノール（１０：１）溶液５ｍＬをそれぞれ加え、１分間良く混和した。活性は、上層の有機相における吸光度（２３４ｎｍ）の増加により算出した。この吸収は、生成したヒドロペルオキシド体のジエン構造（分子吸光係数：２５０００Ｍ-1ｃｍ-1）に基づく。その結果、２３４ｎｍの吸光度は、５分後の値から酵素液添加時の値を引くと、１．３０７−０．０７９＝１．２３増加した。１分で１μｍｏｌのヒドロペルオキシド体を生成する活性を１ｕｎｉｔとすると、調製した酵素溶液１μＬあたりの活性は０．０２４６ｕｎｉｔ／μＬ、大腸菌培養終了時の培養液あたりの活性に変換すると３２９．６ｕｎｉｔ／Ｌとなる。一方、プラスミドを持たない宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を培養・集菌して得られた粗抽出液を用いた場合、吸光度の増加はまったく認められなかった。イネ由来９位特異的リポキシゲナーゼを大腸菌で発現させている特開２００２−３２５５７７号公報によると、大腸菌培養終了時の培養液あたりの活性は１８８．９ｕｎｉｔ／Ｌであり、本発明記載のシロイヌナズナ由来ＬＯＸ１は、大腸菌での活性発現に適したリポキシゲナーゼであることが判明した。
【００３１】
実施例３ 組換えＬＯＸ１の過酸化位置の特定
ＬＯＸ１による脂肪酸過酸化位置の決定を順相ＨＰＬＣにて行った（Current Microbiology (2007)54:315-319）。リノール酸はＷａｋｏ製９９％品を用いた。酵素反応は以下のように行った。終濃度として、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、ＬＯＸ１を含む菌体抽出液もしくは大豆リポキシゲナーゼ（ＳＩＧＭＡ）（１ｇ／Ｌ）を５０μＬ／ｍＬになるよう調製し、２５℃で２分インキュベートした。インキュベートした溶液に１．０ｇ／Ｌリノール酸（エタノールに溶解）を添加し、２５℃、１５０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。反応液に濃塩酸を２％（ｖ／ｖ）添加した後、酢酸エチル５％（ｖ／ｖ）で抽出した。
上記酢酸エチル抽出物を窒素パージして乾固しリノール酸の酸化物を得た。リノール酸の大豆ＬＯＸ酸化物およびＬＯＸ１酸化物 ２ｍｇをクロロホルム：メタノール＝２：１溶液１ｍＬに溶解した後、トリフェニルホスフィン (ＴＰＰ)１００ｍｇを添加、攪拌し、室温で２時間インキュベートした。サンプルを窒素パージして乾固した後、ヘキサン：イソプロパノール：酢酸＝９８：２：０．１溶液１ｍＬに溶解させＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣはカラムにＺｏｒｂａｘ ＳＩＬ ｃｏｌｕｍｎ ４．６×２５０ｍｍ (Ａｇｉｌｅｎｔ)、溶離液にヘキサン：イソプロパノール：酢酸＝９８：２：０．１を用い、カラムオーブン温度３０℃、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、注入量２μＬの条件で行った。過酸化脂肪酸の標準物質として、自動酸化したリノール酸を用いた。リノール酸の自動酸化は、室温にてリノール酸に１週間空気を通気することにより調製した。その結果、リノール酸のＬＯＸ１反応物より９−ヒドロペルオキシ−（Ｅ，Ｚ）−１０，１２−オクタデカジエン酸が認められ、かつ１３位過酸化物由来のピークは認められなかったことから、ＬＯＸ１は９位特異的リポキシゲナーゼであることが明らかとなった（図１）。尚、ピークの同定は先行文献（Current Microbiology (2007)54:315-319）の情報より行った。
【００３２】
実施例４ ９−ヒドロペルオキシ−（Ｅ，Ｚ）−１０，１２−オクタデカジエン酸の製造
１００ｍＬ容の大型試験管にリノール酸 １０ｍｇを取り、そこに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）１ｍＬ、及び実施例１にて調製したＬＯＸ１酵素溶液０．５ｍＬ、ＭｉｌｌｉＱ水８．５ｍＬを加え、２５℃、スターラーを用い４００ｒｐｍにて３時間攪拌した。反応終了後、濃塩酸２００μＬを添加した後、ヘキサン：エタノール（１０：１）溶液１０ｍＬを加え、１分間混和した。また、反応開始時より濃塩酸２００μＬを加え、酵素反応を進行させない系を対照とした。上層の有機相を回収し、窒素パージして乾固したところ、ＬＯＸ１反応産物から４．３ｍｇ、対照から４．０ｍｇの固形物を得た。固形物を０．００４３ｇ／Ｌとなるようヘキサンで溶解し、２３４ｎｍの吸収を測定したところ、ＬＯＸ１反応産物は０．３２４、対照は０．０３９であった。対照との２３４ｎｍの吸光度の差は０．２８５であり、この値より過酸化脂質量を換算した結果、３．６ｍｇの９−ヒドロペルオキシ−（Ｅ，Ｚ）−１０，１２−オクタデカジエン酸を得た（純度８３．７％、収率３６％）。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】順相ＨＰＬＣによる、組換えシロイヌナズナ由来ＬＯＸ１の過酸化位置の同定（ＬＯＸ反応物の順相ＨＰＬＣ分析結果）。Ａ：リノール酸自動酸化物の還元産物、Ｂ：リノール酸大豆ＬＯＸ過酸化物の還元産物、Ｃ: リノール酸ＬＯＸ１過酸化物の還元産物。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多価不飽和脂肪酸の９位過酸化誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）は、リノール酸、リノレン酸（炭素数１８）やアラキドン酸（炭素数２０）などの１，４−ペンタジエン構造を持つ不飽和脂肪酸に分子状酸素を直接導入し、ヒドロペルオキシ基（−ＯＯＨ）を生成する活性を有しており、植物をはじめ、動物やカビ・酵母などの真核微生物等に存在することが知られている（非特許文献１）。動物においては、アラキドン酸からプロスタグランジンが生成する過程でこの酵素が関与していることから、最も研究が進んでいる（非特許文献２）。
【０００３】
植物のリポキシゲナーゼについては、α−リノレン酸、リノール酸等の炭素数１８の不飽和脂肪酸を基質として、９位と１３位の２つの生成物特異性を示すものに分類されることが知られている（例えば、非特許文献１、非特許文献３）。これまでに、ポテト、ダイズ、トマト、エンドウ豆、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、キュウリ等に９位及び／又は１３位生成物特異性リポキシゲナーゼが存在することが知られており、いくつかのｃＤＮＡも単離されている。しかしながら、主に研究がなされているのは、植物ホルモンとして注目されているジャスモン酸の代謝経路に関係する１３位特異性のリポキシゲナーゼであり、９位生成物特異性リポキシゲナーゼについての研究は比較的少ない。
【０００４】
リポキシゲナーゼは、ロイコトリエン関連化合物等の生理活性物質の生産、小麦粉の色相改善、製パン特性の向上または洗浄剤成分としての利用などが知られている。
また、多価不飽和脂肪酸の９位過酸化誘導体は、揮発性の天然フレーバー及びフレグランス成分や、植物成長調整剤(特許文献１及び２)の原料となりうる。例えばα−リノレン酸の９位過酸化誘導体からはヒドロペルオキシドリアーゼを作用させることにより、トランス−２−シス−６−ノナジエナール、トランス−２−シス−６−ノナジエン−１−オール、シス−３−シス−６−ノナジエナール、シス−３−シス−６−ノナジエン−１−オールなどのスイカ、キュウリ、メロンの香気成分を得ることができ、アレンオキシドサイクラーゼを作用させることにより、α−ケトール脂肪酸などの植物成長調整剤を得ることができる。
【０００５】
上記９位過酸化脂肪酸をα-リノレン酸やリノール酸などを原料に酵素合成によって製造する場合、９位生成物特異性リポキシゲナーゼが必須である。しかしながら９位生成物特異性リポキシゲナーゼは商業的に入手できず、植物から抽出するにも材料の入手や処理に大変手間がかかることから、遺伝子組換えを用いた酵素の大量調製の技術の確立が望まれていた。９位生成物特異的リポキシゲナーゼについては、イネの胚芽やバナナに多く存在することが知られ（非特許文献４及び５）、イネにおいては９位生成物特異性リポキシゲナーゼのｃＤＮＡが単離され、配列が決定されている（非特許文献６）。また、大腸菌内でイネ・リポキシゲナーゼの発現を行い調製した酵素溶液にて９位過酸化α−リノレン酸の製造が試みられている（特許文献３）。
【特許文献１】特開平９−２９５９０８号公報
【特許文献２】特開平１１−０２９４１０号公報
【特許文献３】特開２００２−３２５５７７号公報
【非特許文献１】内山充ら、過酸化脂質と生体、23-26, 1985, 学会出版センター
【非特許文献２】山本尚三、蛋白質核酸酵素、44, 1132-1138, 1999
【非特許文献３】Eur. J. Biochem. 1991;199:451-457
【非特許文献４】Lipids 1980;15:1-5、Agric. Biol. Chem. 1980;44:443-445
【非特許文献５】J. Agric. Food Chem. 2006;54:3151-3156
【非特許文献６】Plant Cell Physiol. 2003;44:1168-1175
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、反応性の高い９位生成物特異性リポキシゲナーゼ、及びこれを用いた９位過酸化脂肪酸の製造方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、９位生成物特異性リポキシゲナーゼを探索したところ、ＮＣＢＩデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery）にて１３位リポキシゲナーゼと登録されているシロイヌナズナ由来ＬＯＸ１が、予想に反して９位過酸化反応を触媒することを明らかとした。また、現在知られている９位生成物特異的リポキシゲナーゼのcDNAを大腸菌で発現すると、多くが不溶性となり活性を示すタンパク質を大量に得られないにもかかわらず、シロイヌナズナ由来ＬＯＸ１では大腸菌内で良好な活性体として発現でき、本ＬＯＸ１を用いることにより９位過酸化脂肪酸を効率的に製造できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるタンパク質を含む生体触媒を用いて、多価不飽和脂肪酸の９位を過酸化する工程を含むことを特徴とする９位過酸化脂肪酸の製造方法を提供するものである。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
また、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される９位生成物特異性リポキシゲナーゼを提供するものである。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、多価不飽和脂肪酸の９位過酸化誘導体を効率的に製造することができる。従って、本発明は、揮発性の天然フレーバー及びフレグランス成分や、植物成長調整剤の原料を製造するための方法として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の９位過酸化脂肪酸の製造方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるタンパク質からなる９位生成物特異性リポキシゲナーゼが使用される。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
【００１１】
ここで、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（９位生成物特異性リポキシゲナーゼ）は、ＮＣＢＩデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery）の照会番号ＧＯ００１６１６５にて１３位リポキシゲナーゼと登録されているシロイヌナズナ由来ＬＯＸ１に相当する。当該タンパク質と他の９位生成物特異性リポキシゲナーゼとのアミノ酸配列の同一性は、ポテト由来のＰｏｔａｔｏ ｔｕｂｅｒ ＬＯＸとは６６．３％、タバコ由来のＴａｂａｃｏ ＬＯＸとは６８．５％、大麦由来のＢａｒｌｅｙ ｇｒａｉｎ ＬＯＸ−Ａとは５５．６％、イネ由来のＲｉｃｅ ＬＯＸ１とは５６．４％である。
【００１２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、シロイヌナズナから単離し得るが、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を挿入した発現ベクターを導入した組換え宿主より製造することもできる（後記実施例１参照）。特に、大腸菌内において、イネ由来９位生成物特異性リポキシゲナーゼ（Ｒｉｃｅ ＬＯＸ１、特開２００２−３２５５７７号公報）に比べて良好な活性体として発現される（実施例２参照）。
【００１３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一なタンパク質もまた、本発明で使用される脂肪酸９位過酸化酵素に包含される。「実質的に同一なタンパク質」とは、脂肪酸９位過酸化活性を有する限りにおいて、配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個、例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。
【００１４】
「実質的に同一なタンパク質」としてはまた、脂肪酸９位過酸化活性を有する限りにおいて、配列番号１のアミノ酸配列と、７０％以上の配列同一性、好ましくは８０％以上の配列同一性、より好ましくは８５％以上の配列同一性、さらに好ましくは９０％以上の配列同一性、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。アミノ配列の同一性は、例えば、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５（１９８５））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１５】
所与のタンパク質と実質的に同一なタンパク質は、公知の技術によって取得される。例えば、実質的に同一なタンパク質は、部位特異的変異法によって、所与のタンパク質のアミノ酸配列から特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加等されるようにそのタンパク質の遺伝子の塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された塩基配列を有するポリヌクレオチドは、従来知られている他の突然変異処理によっても取得できる。他の突然変異処理としては、配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをヒドロキシアミン等でインビトロ処理する方法、及び配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持する微生物等を紫外線照射もしくはニトロソグアニジン等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００１６】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、若しくは付加等の改変には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる改変も含まれる。上記のような改変を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の酵素活性を調べることにより、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質及びそれをコードするＤＮＡが得られる。
【００１７】
本発明における「脂肪酸９位過酸化活性」とは、１，４−ペンタジエン構造を持つ多価不飽和脂肪酸の９位に分子状酸素を直接導入し、ヒドロペルオキシ基（−ＯＯＨ）を生成する活性をいう。
【００１８】
本発明の９位過酸化脂肪酸の製造方法は、上記の９位生成物特異性リポキシゲナーゼを含む生体触媒を用いて多価不飽和脂肪酸の９位過酸化反応（９位にヒドロペルオキシ基を導入する工程）を含むものである。すなわち、多価不飽和脂肪酸を、上記の９位生成物特異性リポキシゲナーゼを含む生体触媒と接触させることにより９位に分子状酸素を導入し、過酸化反応終了後、反応混合物から目的の９位過酸化脂肪酸を単離することにより行うことができる。
【００１９】
本発明の方法において、生体触媒は、上記の９位生成物特異性リポキシゲナーゼを含む限り、任意の形態で用いられ得る。これらの酵素を含む生体触媒としては、例えば、本発明の酵素を産生する動物細胞、植物細胞、微生物菌体（生菌体、死滅菌体、休止菌体若しくは静止菌体等）等の生体細胞、又はその培養物；本発明の酵素を含むオルガネラ（細胞小器官）；上記生体細胞やオルガネラのホモジネート又は抽出物；粗酵素；及び精製酵素等が挙げられる。上記の本発明の酵素を産生する生体細胞等は、天然に存在するものであっても、遺伝子操作を初めとする種々の方法で改変された変異体であってもよい。これらの生体触媒は、単独で使用されても組み合わせて使用されてもよく、また、そのまま使用されてもよいが、溶液、懸濁液等の液体形態や、任意の固相担体に固定された形態であってもよい。
【００２０】
固相担体に固定された生体触媒としては、上記生体触媒を、任意の水不溶性固相担体に公知の方法に従って固定したものが挙げられる。生体触媒を固形担体に固定化することにより、バッチ反応における回収・再使用が容易で、かつ半連続、連続反応にも容易に使用可能となることから、長期且つ繰り返して使用可能な固定化生体触媒が得られる。
【００２１】
担体への結合法としては、例えば、特開平１１−１９２０９６号公報に記載されるような、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、架橋法、包括法又はこれらの組み合わせが挙げられる。結合に用いられる担体としては、例えば、以下：活性炭、多孔性ガラス、酸性白土、漂白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、金属酸化物のような無機物質；デンプン、グルテンのような天然高分子；多孔性の合成樹脂；セラミック；限界濾過膜や限界濾過膜でできた中空糸；疎水基をもつブチル−ヘキシルセファデックス；タンニンをリガンドとするセルロース誘導体；イオン交換基をもった多糖類（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ）；イオン交換樹脂；天然又は合成高分子のゲル又はマイクロカプセルが挙げられる。
【００２２】
本発明の方法においては、必要に応じて、上記の脂肪酸９位過酸化酵素とともに、適切な酵素、その他の本発明の過酸化反応に必要な物質が用いられる。例えば、過酸化反応の副産物として生じる活性酸素や過酸化水素の無毒化を目的とし、スーパーオキシドディスムターゼ、カタラーゼ等が用いられる。上記動物、植物細胞、オルガネラ、微生物菌体等は、ＬＯＸを保護する上記の酵素系を含有している点で、好ましい生体触媒である。
【００２３】
以上に示した生体触媒を用いた本発明の方法による９位過酸化脂肪酸の製造は、化学的手法に比べてマイルドな条件で行うことができる。例えば、生体触媒に含まれる本発明の酵素と原料の多価不飽和脂肪酸との反応においては、ｐＨは通常、本発明の酵素の至適ｐＨ（ｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜９）付近に緩衝液を用いて調整される。反応温度は１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃である。反応時間は、１分〜２４時間、好ましくは１０分〜１６時間である。反応系には、原料の多価不飽和脂肪酸の溶解性を向上させる為に、適宜ノニオン、アニオン、カチオン、両性等の界面活性剤を添加してもよい。同様に、多価不飽和脂肪酸の溶解性向上の為に有機溶媒を添加してもよい。これらの有機溶媒は、酵素活性を阻害せず、原料脂肪酸を溶解するものであれば、いずれの溶媒も使用可能である。具体例としては、アルコール類、ケトン類、エーテル類等の極性溶媒、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、キノリン等の含窒素溶媒、ジメチルスルホキシド等の含硫黄溶媒、芳香族や飽和、不飽和炭化水素等の非極性溶媒等が使用され得るが、エタノール５％添加が最も好ましい。
【００２４】
生体触媒として生体細胞培養物を利用する場合、例えば、当該培養物に原料多価不飽和脂肪酸を添加することができる。９位過酸化反応に必要な補酵素等は、細胞内のものを利用すればよいが、必要に応じて培養物中に添加してもよい。原料及び適切な物質を添加した培養物を、適切な培養条件下で一定時間保持することにより、培養物中の本発明の酵素と多価不飽和脂肪酸とが反応し、９位過酸化脂肪酸が生成される。上記適切な培養条件及び時間は、用いる細胞の種類によって異なるが、当業者の通常の知識に従って適宜設定すればよい。
【００２５】
本発明における多価不飽和脂肪酸とは、分子内に二重結合を２個以上有する（１，４−ペンタジエン構造を持つ）脂肪酸の総称である。本発明の製造方法においては、炭素数が１８〜２２のものが好適であり、更に分子内に二重結合を２〜６個有するものが好適である。具体的には、例えばリノール酸、α−リノレン酸、γ-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、及びそのナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。これらの原料多価不飽和脂肪酸は、単独もしくは組み合わせて使用され得る。
【００２６】
本発明の方法により製造される９位過酸化脂肪酸の例としては、上記の原料脂肪酸の９位にヒドロペルオキシ基が導入されたものが挙げられる。
【００２７】
斯くして製造された９位過酸化脂肪酸は、反応終了後、反応系から単離され、回収される。単離は、当該分野で公知の任意の方法によって行うことができる。例えば、反応物を遠心又は濾過することによって、生成物を生体触媒から分離し、その後、クロマトグラフィーを行うことによって、高純度な生成物を含む画分を得ることができる。
【実施例】
【００２８】
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
実施例１ シロイヌナズナ由来ＬＯＸ１の取得
（ｉ）大腸菌によるＬＯＸ１の発現
タンパク質生産用宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１Ｓｔａｒ (ＤＥ３)(インビトロジェン)を用いた。ＬＯＸ１を高発現するベクターであるｐＥＴＬＯＸ１は、ＬＯＸ１遺伝子をｐＥＴ２１ａ(ノバジェン)のマルチクローニングサイトに挿入したプラスミドである。ＬＯＸ１遺伝子の増幅は市販シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリー（インビトロジェン）を鋳型とし、プライマーとしてｒｂｓＬＯＸ１／ＳａｌI ＦＷ、ＬＯＸ１／ＸｈｏI ＲＶを使用して行った（配列番号２，３）。ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を用いた。ＰＣＲの組成は添付のプロトコールに従った。ＰＣＲ条件は、９８℃ １分の後に、９８℃ １０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３分のサイクルを２５回行った。増幅した約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＳａｌI、ＸｈｏIで処理し、ｐＥＴ２１ａのＳａｌI、ＸｈｏIサイトに挿入した。ｐＥＴＬＯＸ１が導入された大腸菌の形質転換体を以下の様に培養し、タンパク質の発現誘導を行った。即ち、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ培地５ｍＬ（大型試験管を使用）に１白金耳の形質転換体を植菌し、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩培養し種培養液とした。種培養液をアンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ培地５００ｍＬ（５００ｍＬ坂口フラスコに１００ｍＬ仕込み、計５本）に１％(ｖ／ｖ)植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍでＯＤ６００＝約０．４になるまで振盪培養した。次に終濃度としてイソプロピル−β―Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．５ｍＭ、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏを０．００１％となるよう添加し、更に１７℃、１２０ｒｐｍで２０時間振盪培養した。培養液を４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心して集菌し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．０)緩衝液１０ｍＬで１回洗菌を行った。
【００２９】
（ii）組換えタンパク質の精製
回収した菌体を、コンプリートミニＥＤＴＡフリー(ロシュ)を１錠/１０ｍＬとなるように溶解させた５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．０)７ｍＬに懸濁し、懸濁液中の菌体を超音波破砕した後、破砕液を４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清６.７ｍＬを取得し組換えＬＯＸ１を含む菌体抽出液を得た。
【００３０】
実施例２ 組換えＬＯＸ１の活性確認
実施例１記載のように調製した酵素液を用いて、リポキシゲナーゼの活性を測定した。１０ｍＭのα-リノレン酸Ｎａ水溶液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０を含む）０．２５ｍＬ、０．２Ｍのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７）０．１ｍＬ、蒸留水０．１４５ｍＬを１５ｍＬ容量のチューブに入れ、２５℃で５分間振盪した。その後、酵素液０．００５ｍＬを加え、５分間振盪反応した。酵素液添加時および５分後に０．２ｍＬずつ抜き取り、０．１ｍＬの１Ｍ ＨＣｌ溶液を入れた１５ｍＬチューブ中にそれぞれ加えた。そこに、ヘキサン：エタノール（１０：１）溶液５ｍＬをそれぞれ加え、１分間良く混和した。活性は、上層の有機相における吸光度（２３４ｎｍ）の増加により算出した。この吸収は、生成したヒドロペルオキシド体のジエン構造（分子吸光係数：２５０００Ｍ-1ｃｍ-1）に基づく。その結果、２３４ｎｍの吸光度は、５分後の値から酵素液添加時の値を引くと、１．３０７−０．０７９＝１．２３増加した。１分で１μｍｏｌのヒドロペルオキシド体を生成する活性を１ｕｎｉｔとすると、調製した酵素溶液１μＬあたりの活性は０．０２４６ｕｎｉｔ／μＬ、大腸菌培養終了時の培養液あたりの活性に変換すると３２９．６ｕｎｉｔ／Ｌとなる。一方、プラスミドを持たない宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を培養・集菌して得られた粗抽出液を用いた場合、吸光度の増加はまったく認められなかった。イネ由来９位特異的リポキシゲナーゼを大腸菌で発現させている特開２００２−３２５５７７号公報によると、大腸菌培養終了時の培養液あたりの活性は１８８．９ｕｎｉｔ／Ｌであり、本発明記載のシロイヌナズナ由来ＬＯＸ１は、大腸菌での活性発現に適したリポキシゲナーゼであることが判明した。
【００３１】
実施例３ 組換えＬＯＸ１の過酸化位置の特定
ＬＯＸ１による脂肪酸過酸化位置の決定を順相ＨＰＬＣにて行った（Current Microbiology (2007)54:315-319）。リノール酸はＷａｋｏ製９９％品を用いた。酵素反応は以下のように行った。終濃度として、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、ＬＯＸ１を含む菌体抽出液もしくは大豆リポキシゲナーゼ（ＳＩＧＭＡ）（１ｇ／Ｌ）を５０μＬ／ｍＬになるよう調製し、２５℃で２分インキュベートした。インキュベートした溶液に１．０ｇ／Ｌリノール酸（エタノールに溶解）を添加し、２５℃、１５０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。反応液に濃塩酸を２％（ｖ／ｖ）添加した後、酢酸エチル５％（ｖ／ｖ）で抽出した。
上記酢酸エチル抽出物を窒素パージして乾固しリノール酸の酸化物を得た。リノール酸の大豆ＬＯＸ酸化物およびＬＯＸ１酸化物 ２ｍｇをクロロホルム：メタノール＝２：１溶液１ｍＬに溶解した後、トリフェニルホスフィン (ＴＰＰ)１００ｍｇを添加、攪拌し、室温で２時間インキュベートした。サンプルを窒素パージして乾固した後、ヘキサン：イソプロパノール：酢酸＝９８：２：０．１溶液１ｍＬに溶解させＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣはカラムにＺｏｒｂａｘ ＳＩＬ ｃｏｌｕｍｎ ４．６×２５０ｍｍ (Ａｇｉｌｅｎｔ)、溶離液にヘキサン：イソプロパノール：酢酸＝９８：２：０．１を用い、カラムオーブン温度３０℃、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、注入量２μＬの条件で行った。過酸化脂肪酸の標準物質として、自動酸化したリノール酸を用いた。リノール酸の自動酸化は、室温にてリノール酸に１週間空気を通気することにより調製した。その結果、リノール酸のＬＯＸ１反応物より９−ヒドロペルオキシ−（Ｅ，Ｚ）−１０，１２−オクタデカジエン酸が認められ、かつ１３位過酸化物由来のピークは認められなかったことから、ＬＯＸ１は９位特異的リポキシゲナーゼであることが明らかとなった（図１）。尚、ピークの同定は先行文献（Current Microbiology (2007)54:315-319）の情報より行った。
【００３２】
実施例４ ９−ヒドロペルオキシ−（Ｅ，Ｚ）−１０，１２−オクタデカジエン酸の製造
１００ｍＬ容の大型試験管にリノール酸 １０ｍｇを取り、そこに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）１ｍＬ、及び実施例１にて調製したＬＯＸ１酵素溶液０．５ｍＬ、ＭｉｌｌｉＱ水８．５ｍＬを加え、２５℃、スターラーを用い４００ｒｐｍにて３時間攪拌した。反応終了後、濃塩酸２００μＬを添加した後、ヘキサン：エタノール（１０：１）溶液１０ｍＬを加え、１分間混和した。また、反応開始時より濃塩酸２００μＬを加え、酵素反応を進行させない系を対照とした。上層の有機相を回収し、窒素パージして乾固したところ、ＬＯＸ１反応産物から４．３ｍｇ、対照から４．０ｍｇの固形物を得た。固形物を０．００４３ｇ／Ｌとなるようヘキサンで溶解し、２３４ｎｍの吸収を測定したところ、ＬＯＸ１反応産物は０．３２４、対照は０．０３９であった。対照との２３４ｎｍの吸光度の差は０．２８５であり、この値より過酸化脂質量を換算した結果、３．６ｍｇの９−ヒドロペルオキシ−（Ｅ，Ｚ）−１０，１２−オクタデカジエン酸を得た（純度８３．７％、収率３６％）。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】順相ＨＰＬＣによる、組換えシロイヌナズナ由来ＬＯＸ１の過酸化位置の同定（ＬＯＸ反応物の順相ＨＰＬＣ分析結果）。Ａ：リノール酸自動酸化物の還元産物、Ｂ：リノール酸大豆ＬＯＸ過酸化物の還元産物、Ｃ: リノール酸ＬＯＸ１過酸化物の還元産物。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるタンパク質を含む生体触媒を用いて、多価不飽和脂肪酸の９位を過酸化する工程を含むことを特徴とする９位過酸化脂肪酸の製造方法。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
【請求項２】
原料の多価不飽和脂肪酸が炭素数１８〜２２の脂肪酸である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される９位生成物特異性リポキシゲナーゼ。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるタンパク質を含む生体触媒を用いて、多価不飽和脂肪酸の９位を過酸化する工程を含むことを特徴とする９位過酸化脂肪酸の製造方法。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
【請求項２】
原料の多価不飽和脂肪酸が炭素数１８〜２２の脂肪酸である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される９位生成物特異性リポキシゲナーゼ。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ脂肪酸９位過酸化活性を有するタンパク質
【図１】
【公開番号】特開２０１０−１１０２４６（Ｐ２０１０−１１０２４６Ａ）
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８４５０４（Ｐ２００８−２８４５０４）
【出願日】平成２０年１１月５日（２００８．１１．５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月５日（２００８．１１．５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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