ＡＬＫ１受容体およびリガンドアンタゴニストならびにその使用
本開示は、一部分において、アクチビン様キナーゼＩ（ＡＬＫ１）媒介性制御系の特徴づけおよびインビボでの血管形成におけるこの系の役割を示す。一定の態様では、本開示は、アクチビン様キナーゼＩ（ＡＬＫ１）ポリペプチドの細胞外ドメインのリガンド結合部分を含むポリペプチドを使用して、特に、血管形成関連障害を罹患した哺乳動物における血管形成をインビボで阻害することができるという洞察に関する。本開示はまた、ＡＬＫ１のリガンド（かかるリガンドが血管形成誘発活性を有することが証明される）および受容体−リガンド相互作用を阻害する抗体を同定する。一定の態様では、本開示は、ＡＬＫ−１リガンドのアンタゴニストおよび抗血管新生薬としてのかかるアンタゴニストの使用を提供する。さらに、本開示は、ＡＬＫ−１自体のアンタゴニストおよび抗血管新生薬としてのかかるアンタゴニストの使用を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
本願は、題名が「ＡＬＫ１受容体およびリガンドアンタゴニストならびにその使用」である２００６年１１月２日に出願された米国仮特許出願第６０／８５６，５９２号の出願日での利益を主張する。米国仮特許出願第６０／８５６，５９２号の全ての教示が、本明細書中に参考として明白に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
血管形成（新しい血管の形成過程）は、多くの正常または異常な生理学的状態に重要である。正常な生理学的条件下で、ヒトおよび動物は、特定の状況および制限された状況で血管形成をする。例えば、血管形成は、通常、創傷治癒、胎児および胚の発達、ならびに黄体、子宮内膜、および胎盤の形成において認められる。
【０００３】
望ましくないまたは不適切に制御された血管形成は多くの障害で生じ、これには異常な内皮成長が病理学的過程に起因し、または関与し得る。例えば、血管形成は、多くの腫瘍の成長に関与する。無秩序な血管形成は、関節リウマチ、網膜症、血管腫、および乾癬などの病理学的過程に関与している。無秩序な血管形成が存在する多様な病状が血管形成関連疾患として分類されている。
【０００４】
制御された血管形成および制御されない血管形成は、共に類似の様式で進行すると考えられている。毛細血管は、主に、基底膜に囲まれた内皮細胞および周皮細胞から構成される。血管形成は、内皮細胞および白血球から放出された酵素による基底膜の侵食から開始される。次いで、血管内腔を裏打ちする内皮細胞が、基底膜を介して突出する。血管新生因子は、侵食された基底膜を介して移動するように内皮細胞を誘導する。移動する細胞は、親血管から突出した「出芽」を形成し、ここで内皮細胞が有糸分裂および増殖を受ける。内皮出芽が相互に融合して、毛細血管係蹄を形成し、新規の血管を作製する。
【０００５】
血管形成を阻害する薬剤は、種々の障害の治療で有効であることが証明されている。アバスチン（商標）（ベバシズマブ）（血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合するモノクローナル抗体）は、種々の癌の治療で有効であることが証明されている。マクゲン（商標）（ＶＥＧＦに結合するアプタマー）は、新生血管（湿性）加齢性黄斑変性の治療で有効であることが証明されている。ＳＤＦ／ＣＸＣＲ４シグナル伝達経路のアンタゴニストは、腫瘍新血管形成を阻害し、マウスモデルにおいて癌に有効である（非特許文献１）。イソクマリン２−（８−ヒドロキシ−６−メトキシ−１−オキソ−１Ｈ−２−ベンゾピラン−３−イル）プロピオン酸（ＮＭ−３）は、経口で生物学的に利用可能な血管形成阻害剤として第Ｉ相臨床評価が完了している。ＮＭ−３は、インビトロで内皮細胞および腫瘍細胞の両方を直接死滅させ、マウスにおいて多様なヒト腫瘍異種移植片の治療で有効である（非特許文献２）。サリドマイドおよび関連化合物は、癌治療において有益な効果を示しているが、分子の作用機構は明らかではなく、血管形成阻害は抗腫瘍効果の重要な構成要素のようである（例えば、非特許文献３を参照のこと）。関節リウマチ治療におけるＴＮＦ−αアンタゴニストの成功は、炎症を起こした関節組織に及ぼす抗血管形成効果が部分的に寄与している（非特許文献４）。抗血管形成療法は、他の炎症性疾患（特に、乾癬）に対して有益な効果を有することが広く期待されている。多くの抗血管新生薬は、罹患した組織と無関係に血管形成に効果があるにもかかわらず、他の血管形成薬は、組織選択効果を有する傾向があり得る。
【０００６】
血管形成阻害のためのさらなる組成物および方法があることが望ましい。これらには、全身または一定の組織および／もしくは病状における血管の望ましくない成長を阻害することができる方法および組成物が含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｕｌｅｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５ Ｊｕｌ．１；６５（１３）：５８６４−７１
【非特許文献２】Ａｇａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；５６（６）：６１０−４
【非特許文献３】Ｄｒｅｄｇｅら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．２００５ Ｊａｎｕａｒｙ；６９（１−２）：５６−６３
【非特許文献４】Ｆｅｌｄｍａｎｎら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１９：１６３−９６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
本開示は、一部分において、アクチビン様キナーゼＩ（ＡＬＫ１）媒介性制御系の特徴づけおよびインビボでの血管形成におけるこの系の役割を示す。一定の態様では、本開示は、ＡＬＫ−１リガンドのアンタゴニストおよび抗血管新生薬としてのかかるアンタゴニストの使用を提供する。さらに、本開示は、ＡＬＫ−１自体のアンタゴニストおよび抗血管新生薬としてのかかるアンタゴニストの使用を提供する。本明細書に記載されるように、ＡＬＫ１は、リガンドのＧＤＦ５群（ＧＤＦ６およびＧＤＦ７が含まれる）の受容体であり、リガンドのＢＭＰ９群（ＢＭＰ１０が含まれる）の受容体でもある。本開示は、ＡＬＫ１によって媒介されるシグナル伝達および上記リガンドがインビボでの血管形成に関与し、この制御系の阻害が強い抗血管形成効果を有することを証明する。したがって、一定の態様では、本開示は、ＡＬＫ１制御系のアンタゴニスト（血管形成阻害で用いる受容体または１つまたは複数のリガンドのアンタゴニストが含まれる）を提供する。一定の態様では、本開示は、癌（特に、多発性骨髄腫）、関節リウマチ、および眼における病理学的血管形成に関連する障害の治療のためのＡＬＫ１リガンドのアンタゴニストを提供する。
【０００９】
一定の態様では、本開示は、血管形成阻害で使用するＡＬＫ１の細胞外ドメインのリガンド結合部分（「ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド」）を含むポリペプチドを提供する。いかなる特定の作用機構にも拘束されることを望まないが、かかるポリペプチドはＡＬＫ１リガンドへの結合ならびにこれらのリガンドがＡＬＫ１および他の受容体と相互作用する能力の阻害によって作用すると予想される。一定の実施形態では、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のヒトＡＬＫ１配列のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを、特に、眼などの組織への局所投与のために小さな単量体タンパク質または二量体化形態（例えば、融合タンパク質として発現する）として使用することができる。ＡＬＫ１ ＥＣＤを、第２のポリペプチド部分に融合して特性を改善することもできる（半減期の増加またはより容易な産生もしくは精製など）。免疫グロブリンのＦｃ部分への融合またはポリオキシエチレン部分（例えば、ポリエチレングリコール）への連結は、全身投与（例えば、静脈内、動脈内、および腹腔内投与）におけるＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドの血清半減期の増加に特に有用であり得る。本明細書中で証明されるように、全身投与したＡＬＫ１−Ｆｃポリペプチドは眼に強い抗血管形成効果を有し、関節リウマチおよび多発性骨髄腫のマウスモデルでの好ましい効果も得られる。一定の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、このポリペプチドは、介入リンカーを使用し、または使用しないで、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合し、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、１×１０−７Ｍ未満のＫＤでＧＤＦ５、ＧＤＦ７、およびＢＭＰ９に結合し、１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する。Ｆｃ部分を、生物に適切であるように選択することができる。任意選択的に、Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分である。好ましい実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８を含む。任意選択的に、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、哺乳動物細胞株、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株中での配列番号４の核酸の発現によって産生されるタンパク質である。ＡＬＫ１−ＥＣＤポリペプチドを、実質的に発熱物質を含まない薬学的調製物として処方することができる。薬学的調製物を、全身送達（例えば、静脈内、動脈内、または皮下送達）または局所送達（例えば、眼）のために調製することができる。
【００１０】
一定の態様では、本開示は、本明細書に一般的または具体的に記載の任意のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドの投与による哺乳動物における血管形成の阻害方法を提供する。１つの実施形態では、方法は、有効量のＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を哺乳動物に投与する工程であって、ＡＬＫ１ Ｆｃ融合タンパク質が配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に融合し、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する工程を含む。任意選択的に、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する。任意選択的に、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３の配列を有する。ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを、局所（例えば、眼）または全身（例えば、静脈内、動脈内、または皮下）に送達することができる。特定の実施形態では、本開示は、哺乳動物の眼から離れた場所へのＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質の投与（例えば、全身投与）による哺乳動物の眼の血管形成の阻害方法を提供する。
【００１１】
一定の態様では、本開示は、ＡＬＫ１、特に、細胞外ドメイン中に存在するエピトープ（配列番号１のアミノ酸２２〜１１８）に結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドへのＡＬＫ１の結合を阻害する抗体を提供する。これらのリガンドのＡＬＫ１に対する親和性に基づいて、抗体は、５×１０−８Ｍ未満、任意選択的に、５×１０−８と１×１０−１０との間のＫＤで結合することができる。この範囲内の親和性を有する抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ５、６、および７によるシグナル伝達を阻害する一方で、ＢＭＰ９および１０によるシグナル伝達による影響が少ない予想されるであろう。かかる抗体は、好ましくは、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激された血管形成を阻害する。特定の機構に拘束されるのを望まないが、かかる抗体は、ＡＬＫ１活性の直接的阻害によって作用すると予想され、ＡＬＫ１リガンドの活性を阻害すると予想されるＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の活性と対照的なはずである。抗ＡＬＫ１抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０が別の受容体系（ＢＭＰＲ１ａ、ＢＭＰＲ１ｂ、およびＢＭＰＲＩＩ複合体など）によってシグナル伝達する能力を妨害しないと予想される。しかし、抗ＡＬＫ１抗体は、ＡＬＫ１ ＥＣＤがかかる低親和性リガンドを結合または阻害することができないにもかかわらず、ＡＬＫ１の低親和性リガンド（例えば、結合が比較的弱いにもかかわらず、ＡＬＫ−１を介した有意なシグナル伝達事象の誘発として一般に認識されるＴＧＦ−β）がＡＬＫ１を介してシグナル伝達する能力を妨害すると予想される。抗体は、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合することができる。この範囲内の親和性の抗体は、ＢＭＰ９または１０によるシグナル伝達を阻害すると予想されるであろう。かかる抗体は、好ましくは、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のＡＬＫ１への結合を阻害する。とりわけ、本明細書に開示のデータに基づいて、ＡＬＫ１に比較的弱く結合する抗体は、ＡＬＫ１へのＴＧＦβ結合を阻害することができる一方で、ＧＤＦ５またはＢＭＰ９などのより強く結合するリガンドを阻害することができない。本明細書に記載の抗体は、好ましくは、組換え抗体（分子生物学技術を使用して構築された核酸から発現した抗体（ヒト化抗体または単鎖抗体から発生した全ヒト抗体など）を意味する）である。Ｆｖ、Ｆａｂ、および単鎖抗体も、用語「組換え抗体」の範囲内に含まれる。抗体はまた、ポリクローナル抗体または非組換えモノクローナル抗体（ヒトまたはマウス形態およびトランスジェニックマウスから得たヒト抗体が含まれる）であり得る。抗体およびＡＬＫ１−ＥＣＤポリペプチドを、実質的に発熱物質を含まない薬学的調製物として処方することができる。薬学的調製物を、全身送達（例えば、静脈内、動脈内、または皮下送達）または局所送達（例えば、眼）のために調製することができる。
【００１２】
一定の態様では、本開示は、本明細書に記載のＡＬＫ１ポリペプチドに結合する有効量の抗体を、全身または特異的に哺乳動物に投与することによる哺乳動物における血管形成の阻害方法を提供する。この目的に有用な抗体は、ＡＬＫ１の細胞外ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるポリペプチドに結合する）またはＡＬＫ１の別の部分に結合することができる。抗体は、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるポリペプチドに結合することができ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する。抗体は、５×１０−８Ｍ未満、任意選択的に、５×１０−８と１×１０−１０との間のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合することができる。抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害することができる。ＢＭＰ９または１０によるシグナル伝達と比較してＧＤＦ５、６、または７によって媒介されるシグナル伝達を選択的に阻害する抗体を、ＧＤＦ５、６、または７が局在する組織（主に、骨または関節）で起こる血管形成の選択的阻害剤として使用することができる。抗体は、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合することができる。抗体は、ＡＬＫ１リガンドへのＡＬＫ１結合を阻害することができ、ＡＬＫ１リガンドは、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される。抗ＡＬＫ１抗体を、局所（例えば、眼）または全身（例えば、静脈内、動脈内、または皮下）に送達することができる。特定の実施形態では、本開示は、抗ＡＬＫ１抗体の投与による哺乳動物の眼における血管形成の阻害方法を提供する。別の特定の実施形態では、本開示は、多発性骨髄腫患者の治療方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、複数の血管新生促進因子（ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、および／またはＦＧＦなど）の結果としての病理学的血管形成に関連する障害における血管形成の阻害方法を提供する。
【００１３】
一定の態様では、本開示は、本明細書に開示のＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体を提供する。いかなる特定の作用機構にも拘束されることを望まないが、ＡＬＫ１リガンドに結合する抗体が事実上ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドに類似する効果を有すると予想される。これは、両方の型の作用因子が受容体自体よりもむしろリガンドに結合するからである。一定の実施形態では、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択されるリガンドに結合する。抗体は、５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１リガンドに結合することができる。抗体を、ＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成の阻害について選択することができる。ＣＡＭアッセイは、望ましい抗体の選択に適切なアッセイ系である。かかる抗体は、好ましくは、組換え抗体であり、実質的に発熱物質を含まない薬学的調製物として処方することができる。薬学的調製物を、全身送達（例えば、静脈内、動脈内、または皮下送達）または局所送達（例えば、眼）のために調製することができる。
【００１４】
一定の態様では、本開示は、ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、ＡＬＫ１リガンドがＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体を提供する。抗体は、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１リガンドに結合することができる。かかる抗体は、好ましくは、組換え抗体であり、実質的に発熱物質を含まない薬学的調製物として処方することができる。薬学的調製物を、全身送達（例えば、静脈内、動脈内、または皮下送達）または局所送達（例えば、眼）のために調製することができる。
【００１５】
一定の態様では、本開示は、哺乳動物の血管形成を阻害する方法であって、ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する有効量の抗体を哺乳動物に投与する工程を含み、ＡＬＫ１リガンドが、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される方法を提供する。抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害することができる。
【００１６】
ＢＭＰ／ＧＤＦファミリーのメンバー（ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７が含まれる）は、Ｉ型およびＩＩ型受容体に結合して機能的なシグナル伝達複合体を形成する。これらの受容体の結合部位は異なる。したがって、一定の実施形態では、ＡＬＫ１リガンドに結合してリガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体は、リガンドのＩ型受容体結合部位またはその付近に結合する抗体である。
【００１７】
一定の態様では、本開示は、本明細書に開示のＡＬＫ１シグナル伝達系の他の阻害剤の投与による哺乳動物の血管形成の阻害方法を提供する。かかる阻害剤には、ＡＬＫ１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０の産生を減少させる核酸（例えば、アンチセンスまたはＲＮＡｉ構築物）が含まれ得る。種々の親和性結合試薬（アプタマー、ランダムペプチド、選択した標的に結合するように修飾することができるタンパク質足場（かかる足場の例には、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）およびＦＮＩＩＩドメインが含まれる）など）も使用することができる。いずれの場合にも、親和性結合試薬を、ＡＬＫ１−リガンド相互作用の破壊または結合後に起こるシグナル伝達の阻害のいずれかによって本明細書に開示のＡＬＫ１制御系を破壊する能力について選択されるであろう。
【００１８】
さらなる実施形態では、本開示は、ＡＬＫ１制御系のレギュレータとしてのＤＡＮの役割を記載する。本明細書に示されるように、ＤＮＡは、リガンドのＧＤＦ５群に結合するが、リガンドのＢＭＰ９群に結合できない。したがって、ＤＡＮは、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、またはＧＤＦ７によって媒介される血管形成を阻害するが、ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０によって媒介される血管形成を阻害しないと予想される。したがって、ＤＡＮを、タンパク質のＧＤＦ５群が主に発現する骨または関節における血管形成のための選択的阻害剤として使用することができる。したがって、一定の実施形態では、本開示は、骨または関節の血管形成（関節リウマチおよび骨または関節に関与する癌（例えば、多発性骨髄腫および骨転移）が含まれる）の文脈における抗血管新生薬として使用するためのＤＡＮタンパク質を提供する。ＤＡＮタンパク質は、一般に、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する一方で、ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０への結合は比較的低いであろう。ＤＡＮタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸１７〜１８０に対応するアミノ酸配列（成熟ヒトＤＡＮ）または配列番号１０のアミノ酸２１〜１２５（ＤＡＮの保存システインｋｎｏｔドメイン）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ＤＡＮタンパク質は、その相補物がストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７または同一のコード配列を有する配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７の変異体（「静的」変異体（トリプレットコード中のゆらぎ位置に１つまたは複数の変更を含む変異体など））、または配列番号１１のヌクレオチド９３〜６３５またはその静的変異体とハイブリッド形成する配列を含む核酸によってもコードされ得る。一定の態様では、ＤＡＮタンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質などの融合タンパク質である。ＤＡＮが骨および関節における血管形成（骨または関節中に存在する腫瘍（多発性骨髄腫および骨転移など）が含まれる）の阻害に特に有用であると予想されるが、他の文脈（他の場所または眼に存在する腫瘍など）でも有用であり得る。
【００１９】
一定の態様では、本開示は、哺乳動物の関節リウマチを治療する方法であって、ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；およびＤＡＮポリペプチドからなる群から選択される有効量の薬剤を、関節リウマチを有する哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。
【００２０】
一定の態様では、本開示は、哺乳動物の腫瘍を治療する方法を提供する。かかる方法は、ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；およびＤＡＮポリペプチドからなる群から選択される有効量の薬剤を、腫瘍を有する哺乳動物に投与する工程を含むことができる。方法は、血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含むことができる。腫瘍は、白血病、骨髄腫瘍、多発性骨髄腫、または骨転移（乳癌または前立腺癌に付随する転移など）などの骨に関連する腫瘍であり得る。腫瘍はまた、複数の血管新生促進因子を使用する腫瘍（抗ＶＥＧＦ療法に耐性を示す腫瘍など）であり得る。
【００２１】
一定の態様では、本開示は、眼科処方物を提供する。かかる処方物は、ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；およびＤＡＮポリペプチドからなる群から選択される薬剤を含むことができる。
【００２２】
一定の態様では、本開示は、眼の血管形成関連疾患の治療方法を提供する。かかる方法は、ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；およびＤＡＮポリペプチドからなる群から選択される有効量の薬剤を含む薬学的処方物を全身または眼に投与する工程を含むことができる。
【００２３】
各例では、本明細書に記載の薬剤を、血管形成を阻害する第２の薬剤と併せて投与することができる。腫瘍の血管形成を阻害することが望ましい場合、薬剤を、抗癌効果を有する第２の薬剤（例えば、化学療法薬または生物抗癌薬）と併せて投与することができる。
【００２４】
本開示はまた、ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含む眼科薬学的処方物であって、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＧＤＦ５、ＧＤＦ７、およびＢＭＰ９に結合し、１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する眼科薬学的処方物を提供する。１つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３の配列を有する。１つの実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ１に由来する。１つの実施形態では、融合タンパク質を、哺乳動物細胞株中の配列番号４の核酸の発現によって産生する。１つの実施形態では、細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株である。処方物は、１つまたは複数の以下の薬物をさらに含むことができる：ペガプタニブ、ラニビズマブ、または糖質コルチコイド。１つの実施形態では、処方物は、実質的に発熱物質を含まない。
【００２５】
本願はまた、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体を含む眼科薬学的処方物を提供する。１つの実施形態では、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する。１つの実施形態では、抗体は、５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する。別の実施形態では、抗体は、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する。１つの実施形態では、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０によって刺激される血管形成を阻害する。処方物は、１つまたは複数の以下の薬物をさらに含むことができる：ペガプタニブ、ラニビズマブ、または糖質コルチコイド。１つの実施形態では、処方物は、実質的に発熱物質を含まない。
【００２６】
一定の態様では、本開示は、本明細書に開示のＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体を含む眼科薬学的処方物を提供する。一定の実施形態では、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択されるリガンドに結合する。抗体は、５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１リガンドに結合することができる。抗体を、ＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成の阻害について選択することができる。ＣＡＭアッセイは、望ましい抗体の選択に適切なアッセイ系である。かかる抗体は、好ましくは、組換え抗体である。処方物は、１つまたは複数の以下の薬物をさらに含むことができる：ペガプタニブ、ラニビズマブ、または糖質コルチコイド。１つの実施形態では、処方物は、実質的に発熱物質を含まない。
【００２７】
本願はまた、ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含む眼科薬学的処方物であって、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、１×１０−７Ｍ未満のＫＤでＧＤＦ５、ＧＤＦ７、およびＢＭＰ９に結合し、１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、眼科薬学的処方物を眼に投与する工程を含む、眼の血管形成関連疾患を治療する方法を提供する。１つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３の配列を有する。１つの実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ１に由来する。１つの実施形態では、融合タンパク質を、哺乳動物細胞株中の配列番号４の核酸の発現によって産生する。１つの実施形態では、細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株である。処方物は、１つまたは複数の以下の薬物をさらに含むことができる：ペガプタニブ、ラニビズマブ、または糖質コルチコイド。１つの実施形態では、処方物は、実質的に発熱物質を含まない。
【００２８】
本願はまた、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体を含む眼科薬学的処方物を眼に投与する工程を含む、眼の血管形成関連疾患を治療する方法を提供する。１つの実施形態では、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する。１つの実施形態では、抗体は、５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する。別の実施形態では、抗体は、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する。１つの実施形態では、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０によって刺激される血管形成を阻害する。処方物は、１つまたは複数の以下の薬物をさらに含むことができる：ペガプタニブ、ラニビズマブ、または糖質コルチコイド。１つの実施形態では、処方物は、実質的に発熱物質を含まない。
【００２９】
開示の方法の１つの実施形態では、眼の血管形成関連疾患は、腫瘍、抗ＶＥＧＦ療法に耐性を示す腫瘍、多発性骨髄腫の腫瘍、骨に転移した腫瘍、骨または関節の炎症、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、および水晶体後線維増殖からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ヒトアクチビン受容体様キナーゼ１（ＡＬＫ１）のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。一重の下線は、推定細胞外ドメインを示す。二重の下線は細胞内ドメインを示す。シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインには下線を引いていない。
【図２】図２は、ヒトＡＬＫ１ ｃＤＮＡの核酸配列（配列番号２）を示す。コード配列に下線を引いている。細胞外ドメインをコードする部分に二重の下線を引いている。
【図３】図３は、ヒトＡＬＫ１の細胞内ドメインのＦｃドメインとの融合物の例（配列番号３）を示す。ｈＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質は、Ｃ末端でリンカー（下線）に融合したヒトＡＬＫ１タンパク質のアミノ酸２２〜１２０およびＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
【図４】図４は、配列番号３のｈＡＬＫ１−Ｆｃポリペプチドの発現のための核酸配列を示す。コードされたアミノ酸配列も示す。Ａｓｐ２２が分泌タンパク質のＮ末端アミノ酸となるようにリーダー配列を切断する。
【図５】図５は、内皮細胞管形成アッセイにおけるマウスＡＬＫ１−Ｆｃ（「ＲＡＰ」）およびヒトＡＬＫ１−Ｆｃ（「ＡＣＥ」）の抗血管形成効果を示す。全濃度のＲＡＰおよびＡＣＥは内皮細胞成長サプリメント（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（ＥＣＧＦ）に応答して管形成レベルをポジティブコントロール（エンドスタチン）よりも高い程度で減少させた。
【図６】図６は、トリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおけるＧＤＦ７の血管形成効果を示す。ＧＤＦ７効果は、ＶＥＧＦと同程度である。
【図７】図７は、ＣＡＭアッセイにおけるヒトＡＬＫ１−Ｆｃ融合物の血管形成効果を示す。ｈＡＬＫ１−Ｆｃは、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＧＤＦ７によって刺激された血管形成を阻害する。
【図８】図８は、マウスＡＬＫ１−Ｆｃ（ＭＡＬＫ１−Ｆｃ）、ｈＡＬＫ１−Ｆｃ、市販の抗ＡＬＫ１モノクローナル抗体（抗ＡＬＫ１ ｍＡｂ）および市販の中和抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の抗血管形成効果の比較を示す。ＡＬＫ１−Ｆｃ構築物の抗血管形成効果は、抗ＶＥＧＦ抗体の効果と同程度である。
【図９】図９は、インビボでのｈＡＬＫ１−Ｆｃおよび抗ＶＥＧＦ抗体の抗血管形成効果を示す。マウス角膜マイクロポケットアッセイによって測定したところ、ｈＡＬＫ１−Ｆｃおよび抗ＶＥＧＦは、眼における血管形成効果は同程度であった。
【図１０】図１０は、関節リウマチのマウスコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおけるｍＡＬＫ１−Ｆｃの効果を示す。グラフは、コラーゲン誘導性雄ＤＢＡ／１関節炎マウスにおける４２日間の観察期間に決定した平均群関節炎スコアを示す。ＲＡＰ−０４１はｍＡＬＫ１−Ｆｃである。アバスチン（商標）は抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
１．概要
ＡＬＫ１は、リガンドのＴＧＦ−βスーパーファミリーのＩ型細胞表面受容体であり、ＡＣＶＲＬ１およびＡＣＶＲＬＫ１としても公知である。ＡＬＫ１は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３、およびＢＭＰ−９の受容体とされている（Ｍａｒｃｈｕｋら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００３；Ｂｒｏｗｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｊｕｌ １；２８０（２６）：２５１１１−８）。
【００３２】
マウスでは、ＡＬＫ１の機能喪失型変異によって脈管構造の発達に種々の異常を生じる（Ｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２０００，９７，２６２６−２６３１；Ｕｒｎｅｓｓら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０００，２６，３２８−３３１）。
【００３３】
ヒトでは、ＡＬＫ１の機能喪失型変異は、先天性出血性末梢血管拡張症（ＨＨＴ、すなわちオスラー−ランデュ−ウェバー症候群）に関連し、その患者は、毛細血管床を干渉することなく、動脈から静脈への直接的な流れ（連通）（動静脈シャント）を作製する動静脈奇形を発症する。ＨＨＴ患者の典型的な症状は、反復性鼻出血、胃腸出血、皮膚および粘膜皮膚の毛細血管拡張症、ならびに肺、大脳、または肝臓の脈管構造の動静脈奇形（ＡＶＭ）が含まれる。
【００３４】
Ｄａｖｉｄら（Ｂｌｏｏｄ．２００７ Ｍａｒ．１；１０９（５）：１９５３−６１）およびＳｃｈａｒｐｆｅｎｅｃｋｅｒら（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００７ Ｍａｒ．１５；１２０（Ｐｔ ６）：９６４−７２）の近刊では、内皮細胞中でＢＭＰ９およびＢＭＰ１０がＡＬＫ１を活性化し、この活性化の結果が内皮細胞の増殖および移動を阻害することであると結論づけている。これらの効果は、ＶＥＧＦなどの血管新生促進因子の効果と正反対である。したがって、これらの刊行物は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０自体が抗血管新生因子であり、さらに、ＡＬＫ１活性化が抗血管形成効果を有すると結論づけている。対照的に、本開示は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のアゴニストよりもむしろアンタゴニストが抗血管形成効果を有することを証明する。
【００３５】
本開示は、ＡＬＫ１の細胞外ドメイン（「ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド」）の一部を含むポリペプチドを使用して、インビボで血管形成（ＶＥＧＦ非依存性血管形成および複数の血管新生因子（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦが含まれる）によって媒介される血管形成が含まれる）を阻害することができるという発見に関する。ひとつには、本開示は、ＡＬＫ１の生理学的な高親和性リガンドの同一性を提供し、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドが血管形成を阻害することを証明している。データは、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドがＴＧＦ−β１への重要な結合を示さない場合でさえ、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドが抗血管形成効果を発揮することができることを証明している。さらに、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、多数の異なる血管新生促進因子（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＧＤＦ７が含まれる）によって刺激される血管形成を阻害する。したがって、本開示は、ＡＬＫ１制御系を説明する。ここで、ＡＬＫ１は、リガンドのＧＤＦ５群（ＧＤＦ６およびＧＤＦ７が含まれる）の受容体であり、リガンドのＢＭＰ９群（ＢＭＰ１０が含まれる）の受容体でもあり、この２つのリガンド群は異なる親和性を有する。さらに、開示は、上記のＡＬＫ１およびリガンドによって媒介されたシグナル伝達がインビボで血管形成誘発性を示し、この制御系の阻害がインビボで強力な抗血管形成効果を有することを証明している。したがって、一定の態様では、本開示は、ＡＬＫ１制御系のアンタゴニスト（血管形成（ＶＥＧＦ依存性血管形成およびＶＥＧＦ非依存性血管形成が含まれる）の阻害で使用される受容体または１つもしくは複数のリガンドのアンタゴニストが含まれる）を提供する。しかし、ＡＬＫ１自体に指向する抗体がＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド由来の異なる効果を有すると予想されることに留意すべきである。ＡＬＫ１に対する汎中和抗体（ｐａｎ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（全ての強いまたは弱いリガンドの結合を阻害する抗体）は、ＡＬＫ１を介したかかるリガンドのシグナル伝達を阻害すると予想されるが、かかるリガンドが他の受容体（例えば、ＧＤＦ５−７およびＢＭＰ９−１０の場合のＢＭＰＲ１ａ、ＢＭＰＲ１ｂ、ＢＭＰＲＩＩならびにＴＧＦβの場合のＴＢＲＩおよびＴＢＲＩＩ）を介してシグナル伝達する能力を阻害すると予想されないであろう。他方では、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、このポリペプチドが強く結合する全てのリガンド（実施例に示した構築物などの構築物についてのＧＤＦ５〜７およびＢＭＰ９〜１０が含まれる）を阻害すると予想されるが、このポリペプチドが弱く結合するリガンド（ＴＧＦ−βなど）には影響を及ぼさないであろう。従って、ＡＬＫ１に対する汎中和抗体は、ＡＬＫ１を介したＢＭＰ９およびＴＧＦ−βシグナル伝達を遮断する一方で、別の受容体を介したＢＭＰ９およびＴＧＦ−βシグナル伝達を遮断しないであろう。一方、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、全受容体（ＡＬＫ１以外の受容体でさえ）を介したＢＭＰ９シグナル伝達を阻害することができる一方で、任意の受容体（ＡＬＫ１でさえも）を介したＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害すると予想されないであろう。
【００３６】
本明細書に記載のタンパク質は、他で特定しない限り、ヒト形態である。このタンパク質のＧｅｎｂａｎｋリファレンスは以下のとおりである：ヒトＧＤＦ５、ＣＡＡ５６８７４；ヒトＧＤＦ６、ＡＡＨ４３２２２；ヒトＧＤＦ７、ＮＰ＿８７８２４８；ヒトＢＭＰ９、Ｑ９ＵＫ０５；ヒトＢＭＰ１０、Ｏ９５３９３；ヒトＤＡＮ、ＢＡＡ９２２６５。ＡＬＫ１配列を、図１〜５に示す。
【００３７】
ヒトＤａｎアミノ酸配列（配列番号１０）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＢＡＡ９２２６５）：
【００３８】
【化１】
成熟Ｄａｎタンパク質は、アミノ酸１７〜１８０に対応すると予想される。Ｄａｎの保存システインｋｎｏｔドメインは、アミノ酸２１〜１２５（下線）に対応する。
【００３９】
ヒトＤａｎ ｃＤＮＡ配列（配列番号１１）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＢＣ０１２０３７）：
【００４０】
【化２】
【００４１】
【化３】
ＤＡＮ前駆体のコード配列は、核酸９３〜６３５に対応する。成熟ＤＡＮタンパク質のコード配列は、核酸１４１〜６３２に対応する。ＤＡＮの保存システインｋｎｏｔ部分のコード配列は、核酸１５３〜４６７に対応する。
【００４２】
本明細書で使用される用語は、一般に、本開示の文脈内および各用語が使用される特定の文脈中で、当該分野でのその通常の意味を有する。本明細書に開示の組成物および方法ならびにどのようにしてこれらを作製するのかを説明する際に実施者へのさらなるガイダンスを提供するために、一定の用語を明細書で考察する。用語の任意の用途の範囲または意味は、用語が使用される特定の文脈から明らかであろう。
２．可溶性ＡＬＫ１ポリペプチド
天然に存在するＡＬＫ１タンパク質は膜貫通タンパク質であり、細胞の外側に存在するタンパク質部分（細胞外部分）および細胞内側に存在するタンパク質部分（細胞内部分）を有する。本開示の態様は、ＡＬＫ１の細胞外ドメインの一部を含むポリペプチドを含む。
【００４３】
一定の実施形態では、本開示は、「ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド」を提供する。用語「ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド」は、天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列（任意のシグナル配列およびシグナル配列のＮ末端配列が含まれ、または除外される）または天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも３３％、任意選択的に、天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドの細胞外ドメインの配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸３４〜９５のシステインｋｎｏｔ領域またはシステインｋｎｏｔ＋細胞外ドメインのＮ末端およびＣ末端のさらなるアミノ酸（配列番号１のアミノ酸２２〜１１８など）など）からなるかこれらを含むポリペプチドをいうことが意図される。同様に、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、配列番号２のヌクレオチド１００〜２８５またはストリンジェントなハイブリッド形成条件（一般に、かかる条件は当該分野で公知であるが、例えば、５０％ ｖ／ｖ ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％ ｗ／ｖ ブロッキング剤、０．１％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．３％ ＳＤＳにて６５℃で一晩のハイブリッド形成および、例えば、５×ＳＳＣ中で約６５℃での洗浄を含む）下でその相補物とハイブリッド形成するその静的変異体もしくは核酸によってコードされるポリペプチドを含むことができる。さらに、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、配列番号２のヌクレオチド６４〜３８４またはストリンジェントなハイブリッド形成条件（一般に、かかる条件は当該分野で公知であるが、例えば、５０％ ｖ／ｖ ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％ ｗ／ｖ ブロッキング剤、０．１％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．３％ ＳＤＳにて６５℃で一晩のハイブリッド形成および、例えば、５×ＳＳＣ中で約６５℃での洗浄を含む）下でその相補物とハイブリッド形成するその静的変異体もしくは核酸によってコードされるポリペプチドを含むことができる。したがって、用語「ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド」は、ＡＬＫ１ポリペプチドの単離細胞外部分、その変異体（例えば、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８に対応する配列中にわずか２、３、４、５、または１０個のアミノ酸の置換、付加、または欠失しか含まない変異体および配列番号１のアミノ酸３４〜９５に対応する配列中にたった２、３、４、５、または１０個のアミノ酸の置換、付加、または欠失しか含まない変異体が含まれる）、そのフラグメント、およびに任意の上記を含む融合タンパク質を含むが、いずれの場合にも、任意の上記のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、１つまたは複数のＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０に対する実質的な親和性を保持することが好ましいであろう。用語「ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド」は、任意の全長の天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドを除外することが明確に意図される。一般に、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、生物学的に関連する温度、ｐＨレベル、および浸透圧の水溶液中で溶解性を示すように設計されるであろう。
【００４４】
上記のように、本開示は、天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドと特定の程度の配列同一性または配列類似性を共有するＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを提供する。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列を、最適に比較されるように整列させる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較するために非相同配列を無視することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基を比較する。第１の配列中のある位置が第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基で占められている場合、分子は、その位置で同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸「同一性」は、アミノ酸「相同性」と等価である）。２つの配列間の配列同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した配列が共有する同一の位置の数の関数である。
【００４５】
配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントおよび類似率の決定を、数学アルゴリズムを使用して実施することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。
【００４６】
１つの実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して決定する。特定の実施形態では、以下のパラメータをＧＡＰプログラムで使用する：Ｂｌｏｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６のレングスウェイト。さらに別の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントを、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）中のＧＡＰプログラムを使用して決定する。パラメータの例には、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６のギャップレングスの使用が含まれる。他で指定しない限り、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列、ＧＡＰウェイト１０、ギャップレングス３を使用したＧＡＰプログラムを使用して決定する必要があり、かかるアルゴリズムが所望の同一性パーセントを計算できない場合、本明細書に開示の適切な代替法を選択する必要がある。
【００４７】
別の実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、ＰＡＭ１２０重み付け残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップレングスペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用した、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して決定する。
【００４８】
２つのアミノ酸配列間の最良の全アラインメントを決定するための別の実施形態を、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．，６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントでは、クエリーおよびサブジェクト配列は共にアミノ酸配列である。大域配列アラインメントの結果を、同一性パーセントで示す。１つの実施形態では、アミノ酸配列同一性を、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．，６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して行う。特定の実施形態では、アミノ酸アラインメントの同一性および類似性を計算するために使用されるパラメータは、以下を含む：行列＝ＰＡＭ １５０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティ＝１、ジョイニングペナルティ＝２０、ランダム化グループレングス＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、およびギャップサイズペナルティ＝０．０５。
【００４９】
一定の実施形態では、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１の配列などの天然に存在するＡＬＫ１タンパク質の細胞外部分および好ましくはＡＬＫ１細胞外ドメインのリガンド結合部分を含む。一定の実施形態では、可溶性ＡＬＫ１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一定の実施形態では、欠失細胞外ＡＬＫ１ポリペプチドは、配列番号１の細胞外部分のアミノ酸配列の少なくとも３０、４０、または５０個の連続的アミノ酸を含む。
【００５０】
好ましい実施形態では、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、１つまたは複数のＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０に結合する。任意選択的に、ＡＬＫ１ポリペプチドは、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３に実質的に結合しない。結合を、溶液または表面プラズモン共鳴系（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムなど）で精製タンパク質を使用して評価することができる。好ましい可溶性ＡＬＫ１ポリペプチドは、抗血管形成活性を示すであろう。血管形成阻害活性のためのバイオアッセイには、トリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ、マウス角膜マイクロポケットアッセイ、移植腫瘍に及ぼす単離タンパク質または合成タンパク質投与の効果を測定するためのアッセイが含まれる。ＣＡＭアッセイは、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，ら、「Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ」、Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．７９（２），Ｏｃｔ．１，１９９４，ｐｐ．３１５−３２８に記載されている。簡潔に述べれば、インタクトな卵黄を有する３日齢のニワトリ胚を卵から分離し、ペトリ皿に入れる。３日間のインキュベーション後、試験すべきタンパク質を含むメチルセルロースディスクを、各胚のＣＡＭに適用する。４８時間のインキュベーション後、胚およびＣＡＭを観察して、内皮成長が阻害されたかどうかを判断する。マウス角膜マイクロポケットアッセイは、疑われる内皮成長阻害剤を含む別のペレットと共に、成長因子含有ペレットをマウスの角膜中に移植し、角膜中に構成された毛細管パターンを観察する工程を含む。他のアッセイを、実施例に記載する。
【００５１】
ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを、ＡＬＫ１ポリペプチドの細胞質側末端および膜貫通領域の除去によって産生することができる。あるいは、膜貫通ドメインを、膜貫通ドメインを含む通常は疎水性のアミノ酸残基の欠失または親水性アミノ酸残基との置換によって不活化することができる。いずれにしても、実質的に親水性のハイドロパシープロフィールを作製する。それにより、脂質親和性が減少し、水溶性が改善されるであろう。親水性アミノ酸残基との置換より膜貫通ドメインの欠失が好ましい。これは、潜在的に免疫原性を示すエピトープの導入が回避されるからである。
【００５２】
ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、かなり多数の周知のリーダー配列をＮ末端にさらに含むことができる。かかる配列により、ポリペプチドが発現され、真核生物系の分泌経路に標的化されるであろう。例えば、Ｅｒｎｓｔらの米国特許第５，０８２，７８３号（１９９２）を参照のこと。あるいは、天然ＡＬＫ１シグナル配列を使用して、細胞から突出させることができる。有力なリーダー配列には、天然のｔＰａおよびミツバチメリチンリーダー（それぞれ配列番号７〜９）が含まれる。シグナルペプチドのプロセシングは、他の可変要素の中でも、選択したリーダー配列、使用した細胞型、および培養条件などに応じて変化し得る。したがって、成熟ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドの実際のＮ末端開始部位（配列番号５が含まれる）は、Ｎ末端方向またはＣ末端方向のいずれかに１〜５個のアミノ酸がシフトし得る。
【００５３】
一定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変化させるためのＡＬＫ１ポリペプチドの特異的変異を意図する。かかる変異を、１つまたは複数のグリコシル化部位（Ｏ結合またはＮ結合グリコシル化部位など）が導入または排除されるように選択することができる。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は、一般に、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列（アスパラギン−Ｘ−トレオニン（またはアスパラギン−Ｘ−セリン）（式中、「Ｘ」は、任意のアミノ酸である））を含む。１つまたは複数のセリン残基またはトレオニン残基の野生型ＡＬＫ１ポリペプチド（Ｏ結合グリコシル化部位について）の配列への付加または置換によって変化させることもできる。グリコシル化認識部位の第１または第３のアミノ酸位置の一方または両方での種々のアミノ酸の置換または欠失（および／または第２の位置でのアミノ酸欠失）により、修飾トリペプチド配列が非グリコシル化される。ＡＬＫ１ポリペプチド上の炭水化物部分数の別の増加手段は、ＡＬＫ１ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングである。使用したカップリング様式に応じて、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）遊離スルフヒドリル基（システインの遊離スルフヒドリル基など）；（ｄ）遊離ヒドロキシル基（セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基など）；（ｅ）芳香族基（フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの芳香族基など）；または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０号およびＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ（１９８１）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（本明細書において参考により組み込まれる）に記載されている。ＡＬＫ１ポリペプチド上に存在する１つまたは複数の炭水化物部分の除去を、化学的および／または酵素的に行うことができる。化学的脱グルコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのＡＬＫ１ポリペプチドの曝露を含むことができる。この処理により、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖が切断される一方で、アミノ酸配列がインタクトなままである。化学的脱グルコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２およびＥｄｇｅら（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１にさらに記載されている。Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０に記載のように、ＡＬＫ１ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断を、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって行うことができる。哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞の全てが異なるグリコシル化パターンを導入することができ、このグリコシル化パターンはペプチドのアミノ酸配列の影響を受け得るので、ＡＬＫ１ポリペプチド配列を、使用される発現系の型に依存して必要に応じて調整することができる。一般に、ヒトで用いるＡＬＫ１タンパク質を、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株（ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞株など）で発現するであろうが、他の哺乳動物発現細胞株、操作されたグリコシル化酵素を使用する酵母細胞株、および昆虫細胞も有用であると予想される。
【００５４】
本開示は、変異体、特にＡＬＫ１ポリペプチドの組み合わせ変異体組および欠失変異体の生成方法をさらに意図する。組み合わせ変異体のプールは、特に、機能的変異体配列の同定に有用である。かかるコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングの目的は、例えば、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用することができるか、あるいは、新規の活性を同時に保有するＡＬＫ１ポリペプチド変異体を生成することであり得る。種々のスクリーニングアッセイを以下に提供し、かかるアッセイを使用して変異体を評価することができる。例えば、ＡＬＫ１ポリペプチド変異体を、ＡＬＫ１リガンドに結合する能力、ＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１ポリペプチドへの結合を防止する能力、またはＡＬＫ１リガンドに起因するシグナル伝達を妨害する能力についてスクリーニングすることができる。ＡＬＫ１ポリペプチドまたはその変異体の活性を、細胞ベースのアッセイまたはインビボアッセイ、特に、実施例に開示の任意のアッセイで試験することもできる。
【００５５】
天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドの細胞外ドメインを含むＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドと比較して選択的効力または一般的に増加した効力を有する組み合わせ由来の変異体を生成することができる。同様に、変異誘発により、対応する野生型ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドと劇的に異なる血清半減期を有する変異体を得ることができる。例えば、タンパク質の変化は、未変性ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドが破壊、または消失もしくは不活化されるタンパク質分解または他の過程に対する安定性をより高くするか低くすることができる。かかる変異体および変異体をコードする遺伝子を使用して、ＡＬＫ１ポリペプチドの半減期の調整によってＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドレベルを変化させることができる。例えば、半減期の短縮によって生物学的影響をより一過性にすることができ、それにより、患者内の組換えＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドレベルをより強く制御することができる。Ｆｃ融合タンパク質では、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分を変異させて、タンパク質の半減期を変化させることができる。
【００５６】
潜在的なＡＬＫ１ポリペプチド配列の少なくとも一部をそれぞれ含むポリペプチドライブラリーをコードする遺伝子の縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ライブラリーによってコンビナトリアルライブラリーを産生することができる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、潜在的なＡＬＫ１ポリペプチドのヌクレオチド配列の縮重組が各ポリペプチド、あるいは、より大きな融合タンパク質組（例えば、ファージライブラリー用）として発現可能であるように、遺伝子配列に酵素的にライゲーションすることができる。
【００５７】
潜在的なＡＬＫ１ ＥＣＤ変異体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から生成することができる方法が多数存在する。縮重遺伝子配列を自動化ＤＮＡ合成機で化学合成し、次いで、合成遺伝子を発現に適切なベクターにライゲーションすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ Ａ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｅｄ．Ａ Ｇ Ｗａｌｔｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。かかる技術を、他のタンパク質の定向進化で使用することができる（例えば、Ｓｃｏｔｔら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号、および同第５，０９６，８１５号を参照のこと）。
【００５８】
あるいは、他の変異誘発型を使用してコンビナトリアルライブラリーを生成することができる。例えば、ＡＬＫ１ポリペプチド変異体を生成し、例えば、アラニンスキャニング変異誘発など（Ｒｕｆら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔら（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）、リンカースキャニング変異誘発（Ｇｕｓｔｉｎら（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３１６）；飽和変異誘発（Ｍｅｙｅｒｓら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１３）；ＰＣＲ変異誘発（Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １：１１−１９）；またはランダム変異誘発（化学的変異誘発など（Ｍｉｌｌｅｒら（１９９２）Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；およびＧｒｅｅｎｅｒら（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７：３２−３４）が含まれる）などを使用したスクリーニングによってライブラリーから単離することができる。特に組み合わせ設定におけるリンカースキャニング変異誘発は、欠失（生体活性）形態のＡＬＫ１ポリペプチドの魅力的な同定方法である。
【００５９】
点変異および欠失によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物のスクリーニング、さらに、一定の特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのための広範な技術が当該分野で公知である。かかる技術は、一般に、ＡＬＫ１ポリペプチドの組み合わせ変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合可能である。最も広範に使用されている巨大遺伝子ライブラリーのスクリーニング技術は、典型的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られたベクターライブラリーでの適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検出によってその産物が検出される遺伝子をコードするベクターの比較的簡潔な単離を容易にする条件下での組み合わせ遺伝子の発現を含む。好ましいアッセイには、ＡＬＫ１リガンド結合アッセイおよびリガンド媒介細胞シグナル伝達アッセイが含まれる。
【００６０】
一定の実施形態では、開示のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、ＡＬＫ１ポリペプチド中に天然に存在する任意の修飾に加えて翻訳後修飾をさらに含むことができる。かかる修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、これらに限定されない。結果として、修飾ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、非アミノ酸エレメント（ポリエチレングリコール、脂質、ポリサッカリドまたはモノサッカリド、およびリン酸塩など）を含むことができる。ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド機能に及ぼすかかる非アミノ酸エレメントの影響を、他のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド変異体について本明細書に記載のように試験することができる。ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを、初期形態のＡＬＫ１ポリペプチドの切断によって細胞中に産生する場合、翻訳後プロセシングはまた、タンパク質の正確な折り畳みおよび／または機能に重要であり得る。異なる細胞（ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３、またはＨＥＫ２９３など）は、かかる翻訳後活性についての特定の細胞機構および特徴的機構を有し、ＡＬＫ１ポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択することができる。
【００６１】
一定の態様では、機能的変異体または修飾形態のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドには、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドの少なくとも一部および１つまたは複数の融合ドメインを有する融合タンパク質が含まれる。かかる融合ドメインの周知の例には、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。所望の特性が付与されるように融合ドメインを選択することができる。例えば、いくつかの融合ドメインは、アフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティ精製のために、アフィニティクロマトグラフィのための関連マトリックス（グルタチオン、アミラーゼ、およびニッケルまたはコバルトに抱合した樹脂など）を使用する。多数のかかるマトリックスは、「キット」形態（（ＨＩＳ６）融合パートナーを使用して有用なＰｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システムおよびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）など）で利用可能である。別の例として、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドの検出を容易にするように融合ドメインを選択することができる。かかる検出ドメインの例には、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）ならびに特定の抗体が利用可能な通常は短いペプチド配列である「エピトープタグ」が含まれる。特異的モノクローナル抗体が容易に利用可能な周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃタグが含まれる。場合によっては、融合ドメインは、第Ｘａ因子またはトロンビンなどのためのプロテアーゼ切断部位を有する。このプロテアーゼ切断部位によって関連するプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それにより、融合タンパク質から組換えタンパク質を遊離することが可能である。次いで、遊離タンパク質を、その後のクロマトグラフィ分離によって融合ドメインから単離することができる。一定の好ましい実施形態では、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを、インビボでＡＬＫ１ポリペプチドを安定化するドメイン（「安定剤」ドメイン）と融合する。「安定化」は、破壊の減少、腎臓によるクリアランスの減少、または他の薬物動態学的影響に起因するかどうかに関係なく、血清半減期を増加させる全てのものを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合物は、広範なタンパク質に所望の薬物動態学的特性を付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合物は、望ましい特性を付与することができる。選択することができる他の融合ドメイン型には、多量体化（例えば、二量体化、三量体化）ドメインおよび機能的ドメインが含まれる。
【００６２】
特定の例として、本開示は、Ｆｃドメインに融合したＡＬＫ１の可溶性細胞外ドメインを含む融合タンパク質を提供する（例えば、配列番号６）。
【００６３】
【化４】
【００６４】
【化５】
任意選択的に、Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、リジン３２２、およびＡｓｎ−４３４などの残基に１つまたは複数の変異を有する。一定の例では、１つまたは複数のこれらの変異（例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を有する変異Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較してＦｃγ受容体への結合能力が減少する。他の場合、１つまたは複数のこれらの変異（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を有する変異Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較してＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ−受容体（ＦｃＲＮ）への結合能力が増加した。
【００６５】
融合タンパク質の異なるエレメントを所望の機能性と一致する任意の様式で処理することができると理解される。例えば、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを、異種ドメインのＣ末端に配置するか、異種ドメインをＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドのＣ末端に配置することができる。ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドドメインおよび異種ドメインは融合タンパク質に隣接する必要はなく、さらなるドメインまたはアミノ酸配列を、ドメインまたはドメインの間のいずれかのＣ末端またはＮ末端に含めることができる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「免疫グロブリンＦｃ領域」または簡潔に「Ｆｃ」は、免疫グロブリン鎖定常領域、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域、またはその一部のカルボキシル末端部分を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域との組み合わせを含むことができる。好ましい実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも１つの免疫グロブリンヒンジ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、好ましくはＣＨ１ドメインを欠く。
【００６７】
１つの実施形態では、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３、または４）である。他の免疫グロブリンクラス（ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）、およびＩｇＭ（Ｉｇμ））を使用することができる。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号に詳細に考察されている。特定の結果を達成するための一定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当業者のレベルの範囲内であると見なされる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の一部は、好ましくは、ヒンジドメインの少なくとも一部、好ましくはＦｃγのＣＨ３ドメインまたは任意のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ中の相同ドメインの少なくとも一部を含む。
【００６８】
さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失が本明細書に開示の方法の実施および組成物で有用であり得ることが意図される。１つの例は、上部ＣＨ２領域中にアミノ酸置換を導入してＦｃ受容体に対する親和性が減少したＦｃ変異体を作製することであろう（Ｃｏｌｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３６１３）。
【００６９】
一定の実施形態では、本開示は、他のタンパク質および／または他のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド種から単離されるか、これを実質的に含まない（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、または９９％含まない）単離および／または精製形態のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを利用可能にする。
【００７０】
一定の実施形態では、開示は、ＡＬＫ１タンパク質の細胞外部分のコード配列を含む可溶性ＡＬＫ１ポリペプチドをコードする核酸を含む。さらなる実施形態では、本開示はまた、かかる核酸を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本開示のポリペプチドを、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母、または哺乳動物細胞中で発現することができる。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。したがって、本開示のいくつかの実施形態は、さらに、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドの産生方法に関する。配列番号３に記載のＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質およびＣＨＯ細胞中で発現したＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、強力な抗血管形成活性を有する。
【００７１】
ＤＡＮポリペプチド（野生型ＤＡＮの変異体が含まれる）およびＤＡＮタンパク質を含む融合タンパク質を生成し、ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質に関して上記のように特徴づけることができる。
３．ＡＬＫ１ポリペプチドをコードする核酸
一定の態様では、本開示は、任意のＡＬＫ１ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド）（本明細書中に開示のフラグメント、機能的変異体、および融合タンパク質が含まれる）をコードする単離および／または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号２は天然に存在するヒトＡＬＫ１前駆体ポリペプチドをコードする一方で、配列番号４はＩｇＧ１ Ｆｃドメインに融合したＡＬＫ１細胞外ドメインの前駆体をコードする。本核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。かかる核酸は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。これらの核酸を、例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドの作製方法で使用するか、直接的な治療薬（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、または遺伝子療法でのアプローチ）として使用することができる。
【００７２】
一定の態様では、ＡＬＫ１ポリペプチドをコードする本核酸は、配列番号２または４の変異体である核酸を含むとさらに理解される。変異体ヌクレオチド配列には、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失が異なる配列（対立遺伝子変異体など）が含まれる。
【００７３】
一定の実施形態では、本開示は、配列番号２または４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である単離または組換え核酸配列を提供する。当業者は、配列番号２または４に相補的な核酸配列および配列番号２または４の変異体も本開示の範囲内に含まれることを認識するであろう。さらなる実施形態では、開示の核酸配列は、単離、組み換えであり得、そして／または異種ヌクレオチド配列と融合することができるか、ＤＮＡライブラリー中に存在し得る。
【００７４】
他の実施形態では、開示の核酸には、高ストリンジェントな条件下で配列番号２または４中の指定されたヌクレオチド配列、配列番号２または４の相補配列、またはそのフラグメントとハイブリッド形成するヌクレオチド配列も含まれる。上記で考察されるように、当業者は、ＤＮＡハイブリッド形成を促進する適切なストリンジェンシー条件を変更することができることを容易に理解するであろう。当業者は、ＤＮＡハイブリッド形成を促進する適切なストリンジェンシー条件を変更することができることを容易に理解するであろう。例えば、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）における約４５℃でのハイブリッド形成およびその後の５０℃の２．０×ＳＳＣでの洗浄を実施することができる。例えば、洗浄工程における塩濃度を、５０℃での約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃での約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまでから選択することができる。さらに、洗浄工程中の温度を、室温（約２２℃）での低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増加させることができる。温度および塩の両方を変更することができるか、温度または塩濃度を一定に保持しながら、他の可変要素を変化させることができる。１つの実施形態では、室温の６×ＳＳＣの低ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成し、その後に室温の２×ＳＳＣで洗浄する核酸を提供する。
【００７５】
遺伝暗号の縮重によって配列番号２または４に記載の核酸と異なる単離核酸も、本開示の範囲内に含まれる。例えば、多数のアミノ酸は、１つを超えるトリプレットによって指定される。同一のアミノ酸を特定するコドン（すなわち、シノニム（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンのシノニムである））により、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「静的」変異が起こり得る。しかし、本タンパク質のアミノ酸配列を変化させるＤＮＡ配列多型が哺乳動物細胞間に存在すると予想される。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３〜５％まで）の変動が天然の対立遺伝子の変動によって所与の種の個体間に存在し得ることを認識するであろう。任意および全てのかかるヌクレオチドの変動および得られたアミノ酸多型は、本開示の範囲内である。
【００７６】
一定の実施形態では、開示の組換え核酸を、発現構築物中の１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結することができる。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に適切であろう。種々の宿主細胞のための多数の適切な発現ベクター型および適切な調節配列型が当該分野で公知である。典型的には、１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列には、プロモータ配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボゾーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、およびエンハンサ配列またはアクチベータ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。当該分野で公知の構成性プロモータおよび誘導性プロモータは、開示によって意図される。プロモータは、天然に存在するプロモータまたは１つを超えるプロモータのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモータのいずれかであり得る。発現構築物は、細胞または（ｏｎ）エピソーム（プラスミドなど）中に存在することができるか、発現構築物を染色体に挿入することができる。好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択可能な選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は当該分野で周知であり、使用される宿主細胞によって変化するであろう。
【００７７】
本明細書中に開示の一定の態様では、本核酸は、ＡＬＫ１ポリペプチドをコードし、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクター中に提供される。調節配列は当該分野で認識されており、ＡＬＫ１ポリペプチドの発現を指示するように選択される。したがって、用語「調節配列」には、プロモータ、エンハンサ、および他の発現調節エレメントが含まれる。調節配列の例は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。例えば、ＤＮＡ配列に作動可能に連結される場合、ＤＮＡ配列の発現を調節する任意の広範な種々の発現調節配列を、これらのベクター中で使用して、ＡＬＫ１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現することができる。かかる有用な発現調節配列には、例えば、ＳＶ４０の初期プロモータおよび後期プロモータ、ｔｅｔプロモータ、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルスの最初期プロモータ、ＲＳＶプロモータ、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系またはＴＲＣ系、その発現がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって指示されるＴ７プロモータ、λファージの主なオペレータ領域およびプロモータ領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホスファターゼのプロモータ（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α接合因子のプロモータ、バキュロウイルス系の多面体プロモータ、および原核細胞または真核細胞またはそのウイルスの遺伝子発現を調節することが公知の他の配列、ならびにその種々の組み合わせが含まれる。発現ベクターのデザインは形質転換すべき宿主細胞の選択および／または発現が望まれるタンパク質の型などの要因に依存し得ると理解すべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を調節する能力、およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（抗生物質マーカーなど）の発現も考慮すべきである。
【００７８】
開示に含まれる組換え核酸を、原核細胞、真核細胞（酵母、トリ、昆虫、または哺乳動物）、またはその両方のいずれかでの発現に適切なベクターへのクローン化した遺伝子またはその一部のライゲーションによって産生することができる。組換えＡＬＫ１ポリペプチド産生のための発現ビヒクルには、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、適切なベクターには、以下の型のプラスミドが含まれる：大腸菌などの原核細胞における発現のためのｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、およびｐＵＣ由来プラスミド。
【００７９】
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を容易にするための原核生物配列、および真核細胞中で発現する１つまたは複数の真核生物転写単位の両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、およびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかを、細菌プラスミド（ｐＢＲ３２２）由来の配列で修飾して、原核細胞および真核細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にする。あるいは、ウイルスの誘導体（ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来、およびｐ２０５）など）を、真核細胞中でのタンパク質の一過性発現のために使用することができる。他のウイルス（レトロウイルスが含まれる）発現系の例を、以下の遺伝子療法送達系の説明で見出すことができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換で使用される種々の方法は、当該分野で周知である。原核細胞および真核細胞の両方に適切な他の発現系および一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）を参照のこと。いくつかの例では、バキュロウイルス発現系の使用によって組換えポリペプチドを発現することが望ましい場合がある。かかるバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩなど）が含まれる。
【００８０】
好ましい実施形態では、ベクターを、ＣＨＯ細胞中での本ＡＬＫ１ポリペプチドの産生のために設計するであろう（Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）など）。明らかなように、本遺伝子構築物を使用して、培養物中で増殖した細胞中で本ＡＬＫ１ポリペプチドを発現させ、例えば、精製のためにタンパク質（融合タンパク質または変異タンパク質が含まれる）を産生することができる。
【００８１】
本開示はまた、１つまたは複数の本ＡＬＫ１ポリペプチドのコード配列（例えば、配列番号２または４）を含む組換え遺伝子でトランスフェクションした宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本明細書に開示のＡＬＫ１ポリペプチドを、細菌細胞（大腸菌など）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用）、酵母、または哺乳動物細胞中で発現することができる。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００８２】
したがって、本開示は、さらに、本ＡＬＫ１ポリペプチド（ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドが含まれる）の産生方法に関する。例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクションした宿主細胞を、ＡＬＫ１ポリペプチドの発現が生じるのに適切な条件下で培養することができる。ＡＬＫ１ポリペプチドを分泌させ、細胞とＡＬＫ１ポリペプチドを含む培地との混合物から単離することができる。あるいは、ＡＬＫ１ポリペプチドを、細胞質または膜画分に保持し、細胞を回収し、溶解し、タンパク質を単離することができる。細胞培養物には、宿主細胞、培地、および他の副生成物が含まれる。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。本ＡＬＫ１ポリペプチドを、当該分野で公知のタンパク質精製技術（イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、限外濾過、電気泳動、ＡＬＫ１ポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体を使用した免疫親和性精製、およびＡＬＫ１ポリペプチドに融合したドメインに結合する作用因子を使用したアフィニティ精製（例えば、プロテインＡカラムを使用してＡＬＫ１−Ｆｃ融合物を精製することができる）が含まれる）を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方から単離することができる。好ましい実施形態では、ＡＬＫ１ポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含む融合タンパク質である。好ましい実施形態では、一連のカラムクロマトグラフィ工程（例えば、３つ以上の以下が任意の順番で含まれる：プロテインＡクロマトグラフィ、Ｑセファロースクロマトグラフィ、フェニルセファロースクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、および陽イオン交換クロマトグラフィ）によって精製する。ウイルス濾過および緩衝液の交換を使用して、精製を完了することができる。
【００８３】
別の実施形態では、精製リーダー配列（所望の組換えＡＬＫ１ポリペプチド部分のＮ末端のポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列など）をコードする融合遺伝子により、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用したアフィニティクロマトグラフィによって発現した融合タンパク質を精製することができる。次いで、精製リーダー配列を、エンテロキナーゼでの処理によって除去して、精製ＡＬＫ１ポリペプチドを得ることができる（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら（１９８７）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８９７２を参照のこと）。
【００８４】
融合遺伝子の作製技術は周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの連結を、ライゲーションのための平滑末端またはスタガー（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を準備するための制限酵素消化、必要に応じて付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素ライゲーションを使用した従来技術にしたがって行う。別の実施形態では、融合遺伝子を、従来技術（自動化ＤＮＡ合成機が含まれる）によって合成することができる。あるいは、遺伝子フラグメントに、２つの連続遺伝子フラグメントの間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用し、その後にアニーリングしてキメラ遺伝子配列を生成することができるＰＣＲ増幅を行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。
【００８５】
ＡＬＫ１、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、またはＧＤＦ７のアンタゴニストである核酸化合物のカテゴリーの例には、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ構築物、および触媒核酸構築物が含まれる。核酸化合物は、一本鎖または二本鎖であり得る。二本鎖化合物には、鎖の一方または他方が一本鎖であるオーバーハングまたは非相補性の領域も含まれ得る。一本鎖化合物には、自己相補領域（化合物が、二重らせん構造領域を有する所謂「ヘアピン」構造または「ステム−ループ」構造を形成することを意味する）が含まれ得る。核酸化合物は、全長ＡＬＫ１核酸配列またはリガンド核酸配列のわずか１０００、わずか５００、わずか２５０、わずか１００、またはわずか５０、３５、３０、２５、２２、２０、または１８個のヌクレオチドからなる領域に相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。相補領域は、好ましくは少なくとも８ヌクレオチド、任意選択的に少なくとも１０または少なくとも１５ヌクレオチド、任意選択的に１５ヌクレオチドと２５ヌクレオチドとの間であろう。相補領域は、標的転写物のイントロン、コード配列、または非コード配列（コード配列部分など）内に含まれ得る。一般に、核酸化合物は、約８〜約５００ヌクレオチド長または塩基対長であり、任意選択的に、長さは約１４〜約５０ヌクレオチドであろう。核酸は、ＤＮＡ（特に、アンチセンスとしての使用のため）、ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドであり得る。任意の１つの鎖には、ＤＮＡとＲＮＡとの混合物およびＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとして容易に分類できない修飾形態が含まれ得る。同様に、二本鎖化合物は、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＲＮＡであり得る。任意の１つの鎖には、ＤＮＡとＲＮＡとの混合物およびＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとして容易に分類できない修飾形態も含まれ得る。核酸化合物には、任意の種々の修飾（骨格（天然の核酸中の糖−リン酸部分（ヌクレオチド間結合が含まれる））または塩基部分（天然の核酸のプリンまたはピリミジン部分）に対する１つまたは複数の修飾が含まれる）を含み得る。アンチセンス核酸化合物は、好ましくは、約１５〜約３０ヌクレオチド長であり、しばしば、血清、細胞、または化合物が送達される可能性が高い場所（経口送達化合物の場合の胃および吸入化合物のための肺）での安定性などの特徴を改善するための１つまたは複数の修飾を含むであろう。ＲＮＡｉ構築物の場合、標的転写物に相補的な鎖は、一般に、ＲＮＡまたはその修飾物であろう。他の鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または任意の他のバリエーションであり得る。二本鎖または一本鎖の「ヘアピン」ＲＮＡｉ構築物の二重鎖部分は、ダイサー基質としての役割を果たす限り、好ましくは１８〜４０ヌクレオチド長、任意選択的に約２１〜２３ヌクレオチド長であろう。触媒核酸または酵素核酸は、リボザイムまたはＤＮＡ酵素であり得、修飾形態も含むことができる。核酸化合物は、生理学的条件下および非センスコントロールまたはセンスコントロールがほとんどまたは全く影響を及ぼさない濃度で細胞に接触した場合、約５０％、７５％、９０％、またはそれを超えて標的の発現を阻害することができる。核酸化合物の影響を試験するための好ましい濃度は、１、５、および１０マイクロモルである。核酸化合物を、例えば、血管形成に及ぼす影響について試験することもできる。
【００８６】
ＤＡＮポリペプチド（野生型ＤＡＮの変異体が含まれる）をコードする核酸およびＤＡＮタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を生成し、上記に記載のように、ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質をコードする核酸に関して特徴づけることができる。
４．抗体
開示の別の態様は、ＡＬＫ１ポリペプチドの細胞外部分と反応する抗体、好ましくは、ＡＬＫ１ポリペプチドと特異的に反応する抗体に関する。好ましい実施形態では、かかる抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ−９、またはＢＭＰ−１０などのリガンドへのＡＬＫ１結合を妨害することができる。ＡＬＫ１のリガンドに対する抗体が成熟したプロセシング形態の関連タンパク質に結合すべきであると理解されるであろう。開示はまた、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、および／またはＢＭＰ１０に結合してかかるリガンドへのＡＬＫ１の結合を阻害する抗体も提供する。好ましい抗体は、バイオアッセイ（ＣＡＭアッセイまたは角膜マイクロポケットアッセイ（上記を参照のこと）など）において抗血管形成活性を示すであろう。
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、例えば、任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）の全抗体が含まれ、選択された抗原との反応性を示す免疫グロブリンのフラグメントまたはドメインが含まれることを意図する。抗体を、従来技術を使用して断片化し、フラグメントを有用性および／または目的の特異的エピトープとの反応についてスクリーニングすることができる。したがって、この用語には、一定のタンパク質と選択的に反応することができる抗体分子のタンパク質分解部分または組換えによって調製された部分のセグメントが含まれる。かかるタンパク質分解フラグメントおよび／または組換えフラグメントの非限定例には、ペプチドリンカーによって連結したＶ［Ｌ］ドメインおよび／またはＶ［Ｈ］ドメインを含むＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、および単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる。ｓｃＦｖを共有結合または非共有結合して、２つ以上の結合部位を有する抗体を形成することができる。用語「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または抗体および組換え抗体の他の精製調製物も含まれる。用語「組換え抗体」は、分子生物学技術を使用して構築した核酸から発現される抗体または免疫グロブリンの抗原結合ドメイン（単鎖抗体から構築したヒト化抗体または全ヒト抗体など）を意味する。１つのドメインおよび単鎖抗体も、用語「組換え抗体」に含まれる。
【００８８】
抗体を、当該分野で公知の任意の種々の方法（動物への抗原の投与、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する動物への抗原の投与、または抗体（しばしば、単鎖抗体または抗体ドメイン）のライブラリーに対する抗原を使用したスクリーニングが含まれる）によって生成することができる。抗原結合活性が検出されると、タンパク質の関連部分を他の抗体フレームワーク（全長ＩｇＧフレームワークが含まれる）にグラフティングすることができる。例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはＡＬＫ１リガンド由来の免疫原の使用により、標準的プロトコールによって抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体を作製することができる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｅｄ．ｂｙ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照のこと）。マウス、ハムスター、またはウサギなどの哺乳動物を、ペプチドの免疫原性形態（例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドもしくは抗体応答を誘発することができる抗原性フラグメントまたは融合タンパク質）で免疫化することができる。タンパク質またはペプチドの免疫原性を付与する技術には、担体への抱合または当該分野で周知の他の技術が含まれる。ＡＬＫ１ポリペプチドの抗原性部分（好ましくは、細胞外部分）を、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行を、血漿または血清中の抗体力価の検出によってモニタリングすることができる。標準的なＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイを、抗体レベルを評価するための抗原としての免疫原と共に使用することができる。
【００８９】
ＡＬＫ１ポリペプチドの抗原性調製物での動物の免疫化後、抗ＡＬＫ１抗血清を得ることができ、必要に応じて、ポリクローナル抗ＡＬＫ１抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫化動物から採取し、骨髄腫細胞などの不死化細胞を使用した標準的な体細胞融合手順によって融合して、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。かかる技術は当該分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７によって最初に開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６）が含まれる。ハイブリドーマ細胞を、本開示の哺乳動物ＡＬＫ１ポリペプチドおよびかかるハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離したモノクローナル抗体と特異的反応性を示す抗体の産生について免疫学的にスクリーニングすることができる。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、本ＡＬＫ１ポリペプチドの１つとも特異的反応性を示すそのフラグメントが含まれることが意図される。抗体を、従来技術を使用して断片化し、フラグメントを上記様式において全抗体の有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ（ａｂ）２フラグメントを、ペプシンでの抗体の処理によって生成することができる。得られたＦ（ａｂ）２フラグメントを処理してジスルフィド架橋を還元して、Ｆａｂフラグメントを産生することができる。本開示の抗体は、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって付与されたＡＬＫ１ポリペプチドに対する親和性を有する二重特異性分子、単鎖分子、キメラ分子、およびヒト化分子が含まれることをさらに意図する。好ましい実施形態では、抗体は、抗体に結合して検出することができる標識（例えば、標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）をさらに含む。
【００９１】
一定の好ましい実施形態では、本開示の抗体は、組換え抗体、特に、ヒト化モノクローナル抗体または全組換え抗体である。
【００９２】
抗体に関して使用する場合、形容詞「〜と特異的反応性を示す」は、当該分野で一般的に理解されるように、抗体が目的の抗原（例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはＡＬＫ１リガンド）と目的としない他の抗原との間で十分な選択性を示し、抗体が最低限でも特定の生体サンプル型中の目的の抗原の存在に検出に有用であることを意味することが意図される。抗体を使用した一定の方法では、抗体結合特異性度がより高いことが望ましい場合がある。例えば、存在量が非常に多い１つまたは複数の目的としないタンパク質の存在下での存在量が少ない目的のタンパク質の検出で使用される抗体は、抗体が目的の抗原と他の交差反応物との間により高い選択性を有する場合より良好に作用することができる。モノクローナル抗体は、一般に、（ポリクローナル抗体と比較して）所望の抗原と交差反応ポリペプチドとを効率的に区別する傾向がより高い。さらに、１つのサンプル型（例えば、糞便サンプル）中の目的の抗原の選択的同定に有効な抗体は、異なる生体サンプル型（例えば、血液サンプル）中の同一抗原の選択的同定に同程度に有効でない場合がある。同様に、他の生体夾雑物を欠く精製タンパク質調製物中の目的の抗原の同定に有効な抗体は、粗生体サンプル（血液サンプルまたは尿サンプルなど）中の目的の抗原の同定に同程度に有効でない場合がある。したがって、好ましい実施形態では、本願は、抗体使用に選択されるサンプル型である可能性が高いサンプル型中の目的の抗原に対する特異性が証明された抗体を提供する。
【００９３】
抗体：抗原相互作用の特異性に影響を及ぼす１つの特徴は、抗原に対する抗体の親和性である。所望の特異性が異なる親和性の範囲に到達することができるにもかかわらず、一般に好ましい抗体は、約１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、またはそれ未満の親和性（解離定数）を有するであろう。ＡＬＫ１に対するＴＧＦβの結合親和性が明らかに低い場合、多くの抗ＡＬＫ１抗体はＴＧＦβ結合を阻害すると予想される。しかし、リガンドのＧＤＦ５、６、７群は、約５×１０−８ＭのＫＤで結合し、ＢＭＰ９、１０リガンドは約１×１０−１０ＭのＫＤで結合する。したがって、適切な親和性の抗体を、これらのリガンドのシグナル伝達活性を妨害するように選択することができる。
【００９４】
さらに、所望の抗体を同定するために抗体をスクリーニングするために使用される技術は、得られた抗体の性質に影響を及ぼし得る。例えば、一定の治療目的のために使用される抗体は、好ましくは、特定の細胞型を標的化することができるであろう。したがって、この抗体型を得るために、目的の抗原を発現する細胞に結合する抗体をスクリーニングすることが望ましい場合がある（例えば、蛍光活性化細胞分類による）。同様に、抗体が溶液中の抗原結合のための使用される場合、溶液結合を試験することが望ましい場合がある。種々の異なる技術は、特定の望ましい抗体を同定するための抗体：抗原相互作用の試験に利用可能である。かかる技術には、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ，Ｂｉａ−ｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．の常磁性ビーズ系）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、および免疫組織化学が含まれる。
５．抗体およびＦｃ−融合タンパク質の変化
本願は、さらに、操作されたＦｃ領域または変異体Ｆｃ領域を有する抗体、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質、およびＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。かかる抗体およびＦｃ融合タンパク質は、例えば、エフェクタ機能（抗原依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）など）の調整で有用であり得る。さらに、修飾により、抗体およびＦｃ融合タンパク質の安定性を改良することができる。抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列変異体を、ＤＮＡへの適切なヌクレオチド変化の導入またはペプチド合成によって調製する。かかる変異体には、例えば、本明細書に開示の抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換が含まれる。欠失、挿入、および置換を任意に組み合わせて最終構築物に到達させるが、最終構築物は所望の特徴を有するものとする。アミノ酸の変化は、抗体およびＦｃ融合タンパク質の翻訳後プロセスを変化させることもできる（グリコシル化部位の数および位置の変化など）。
【００９５】
エフェクタ機能が減少した抗体およびＦｃ融合タンパク質を、アミノ酸配列の変化の導入によって産生することができる（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅら（ＷＯ９４／２８０２７号およびＷＯ９８／４７５３１号を参照のこと、Ｘｕら、２０００ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００；１６−２６も参照のこと）に記載のＡｌａ−Ａｌａ変異が含まれるが、これに限定されない）。したがって、一定の実施形態では、定常領域内に変異（Ａｌａ−Ａｌａ変異が含まれる）を有する開示の抗体およびＦｃ融合タンパク質を使用して、エフェクタ機能を減少または排除することができる。これらの実施形態にしたがって、抗体およびＦｃ融合タンパク質は、２３４位のアラニンへの変異、２３５位のアラニンへの変異、またはその組み合わせを含むことができる。１つの実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質はＩｇＧ４フレームワークを含み、ここで、Ａｌａ−Ａｌａ変異が２３４位のフェニルアラニンからアラニンへの変異および／または２３５位のロイシンからアラニンへの変異を示すであろう。別の実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質はＩｇＧ１フレームワークを含み、ここで、Ａｌａ−Ａｌａ変異は２３４位のロイシンからアラニンへの変異および／または２３５位のロイシンからアラニンへの変異を示すであろう。抗体またはＦｃ融合タンパク質は、他の変異（ＣＨ２ドメイン中の点変異Ｋ３２２Ａが含まれる）を二者択一的またはさらに保有することができる（Ｈｅｚａｒｅｈら、２００１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１２１６１−８）。
【００９６】
特定の実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質を修飾して、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を増強または阻害することができる。ＣＤＣ活性を、Ｆｃ領域中の１つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、または欠失によって調整することができる（例えば、米国特許第６，１９４，５５１号を参照のこと）。あるいはまたはさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域中に鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能である。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、内在化能力を改良または減少した場合があり、そして／または補体媒介性細胞死滅を増加または減少した場合がある。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２），ＷＯ９９／５１６４２号，Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＷＯ９４／２９３５１号を参照のこと。
６．血管形成および一定の障害を調整するための方法および組成物
本開示は、有効量のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド（ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質など）、ＤＡＮタンパク質（ＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質など）、または本明細書に開示の抗体（ＡＬＫ１のＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、またはＥＣＤに対する抗体など）、またはその後に集合的に「治療薬」と呼ばれる上記のいずれかの核酸アンタゴニスト（例えば、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡ）の被験体への投与による、哺乳動物の血管形成を阻害する方法を提供する。示したデータは、本明細書に開示の抗血管形成治療薬を使用して哺乳動物の眼の血管形成を阻害することができることを詳細に示す。これらの治療薬は骨および関節ならびに腫瘍（特に、骨および関節に関連する腫瘍）の血管形成の阻害でも有用であると予想される。
【００９７】
血管形成関連疾患には、血管形成依存性癌（例えば、固形腫瘍、血行性腫瘍（白血病など）、腫瘍転移が含まれる）；良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫など）；関節リウマチ；乾癬；皮膚紅潮；オスラー−ウェバー症候群；心筋血管形成；プラーク心血管新生；毛細血管拡張症；血友病性関節（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｃ ｊｏｉｎｔ）；および血管線維腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
特に、本開示のポリペプチド治療薬は、癌（腫瘍）（特に、成長を補助するために血管形成過程に依存することが公知である癌など）の治療または防止に有用である。ほとんどの抗血管新生薬と異なり、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、複数の要因によって刺激される血管形成に影響を及ぼす。癌が頻繁に腫瘍血管形成を補助する複数の要因を必要とする場合、これは癌と非常に関連する。したがって、本明細書に開示の治療薬は、特に、単一の血管新生因子を標的化する薬物（例えば、ＶＥＧＦを標的化するベバシズマブ）での治療に耐性を示す腫瘍の治療で特に有効であろう。本明細書で証明するように、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、多発性骨髄腫の病理学的影響の減少で有用である。多発性骨髄腫は、有意な血管形成成分を含む癌として広く認識されている。したがって、本明細書に開示のＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質および他の治療薬は、多発性骨髄腫および骨に関連する他の腫瘍の治療で有用であろう。本明細書で証明されるように、本明細書に開示の治療薬を使用して、多発性骨髄腫に関連する骨損傷を改善することができ、従って、これを使用して他の腫瘍（乳房腫瘍および前立腺腫瘍など）の骨転移に関連する骨損傷を改善することができる。本明細書に記載するように、ＧＤＦ５−７リガンドは、骨中で高度に発現し、いかなる特定の機構にも制限されることを望んでいないが、これらのリガンドの干渉によって骨中の腫瘍発達に必要な過程を破壊することができる。
【００９９】
かかる方法の一定の実施形態では、１つまたは複数のポリペプチド治療薬を、共に（同時に）または異なる時間に（連続的に）投与することができる。さらに、ポリペプチド治療薬を、癌治療または血管形成阻害のための別の化合物型と共に投与することができる。
【０１００】
一定の実施形態では、開示の方法を単独で使用することができる。あるいは、本方法を、増殖性障害（例えば、腫瘍）の治療または防止を指示する他の従来の抗癌治療アプローチと組み合わせて使用することができる。例えば、かかる方法を、癌予防、癌再発および術後転移の防止、ならびに他の従来の癌療法の補助として使用することができる。本開示は、本ポリペプチド治療薬の使用によって、従来の癌療法（化学療法、放射線療法、光療法、免疫療法、および手術）の効果を増強することができることを認識する。
【０１０１】
広範な一連の従来の化合物は、新生物活性を有することが示されている。これらの化合物を、固形腫瘍の萎縮、転移およびさらなる成長の防止、または白血性もしくは骨髄性の悪性疾患における悪性細胞数の減少のために化学療法で薬物として使用されている。化学療法は種々の悪性疾患型の治療で有効であるが、多くの抗新生物化合物は望ましくない副作用を誘導する。２つ以上の異なる治療を組み合わせる場合、治療は相乗的に作用し、各治療薬の投薬量を減少させ、それにより、より高い投薬量で各化合物によって発揮される有害な副作用を減少させることができることが示されている。他の例では、治療無反応性の悪性疾患は、２つ以上の異なる治療を使用した併用療法に応答し得る。
【０１０２】
本明細書に開示のポリペプチド治療薬を、別の従来の抗新生物薬と組み合わせて同時または連続的に投与する場合、かかる治療薬は抗新生物薬の治療効果を増強し、または、かかる抗新生物薬に対する細胞耐性を克服することができる。これにより、抗新生物薬の投薬量が減少し、それにより、望ましくない副作用が軽減され、または耐性細胞における抗新生物薬の有効性が回復される。
【０１０３】
本開示によれば、本明細書に記載の抗血管新生薬を、疾患治療のための他の組成物および手順と組み合わせて使用することができる。例えば、腫瘍を、従来のように、ＡＬＫ１またはＡＬＫ１リガンドアンタゴニストと組み合わせた手術、照射、または化学療法で治療し、次いで、アンタゴニストを患者に投与して、微小転移の休止期間を延長し、任意の残留原発性腫瘍を安定化することができる。
【０１０４】
血管形成阻害剤を、新規の癌または再発癌を発症するリスクが高いことが公知の個体に予防的に投与することもできる。したがって、開示の態様は、有効量のＡＬＫ１またはＡＬＫ１リガンドアンタゴニストおよび／またはその誘導体、または本開示の別の血管形成阻害剤を被験体に投与する工程を含む、被験体の癌の防止方法を含む。
【０１０５】
本明細書で証明されるように、ＡＬＫ１−Ｆｃは、関節リウマチのマウスモデルの表現型の縮小に有効である。したがって、本明細書に開示の治療薬を、関節リウマチおよび他の骨または関節の炎症型の治療のために使用することができる。
【０１０６】
一定の正常な生理学的過程（例えば、排卵、月経、および胎盤形成）も、血管形成に関連する。本開示の血管形成阻害タンパク質は、内皮細胞が過剰または異常に刺激される疾患の治療で有用である。これらの疾患には、腸管癒着症、アテローム性動脈硬化症、強皮症、および肥厚性瘢痕（すなわち、ケロイド）が含まれるが、これらに限定されない。これらは、ネコ引っ掻き病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）および潰瘍（ピロリ菌）などの病理学的結果として血管形成を有する疾患の治療でも有用である。
【０１０７】
一般的な血管形成阻害タンパク質を、胚着床に必要な子宮脈管形成の減少または防止による産児制限薬として使用することができる。したがって、本開示は、胚着床の防止に十分な阻害タンパク質量を女性に投与する場合の有効な産児制限方法を提供する。産児制限方法の１つの態様では、胚着床の遮断に十分なタンパク質の阻害量を性交渉および受精が起こる前または後に投与するので、有効な産児制限方法（おそらく、翌朝（ｍｏｒｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ）法）を提供する。この記述に拘束されることを望まないが、子宮内膜の脈管形成の阻害が胚盤胞の着床を妨害すると考えられる。卵管粘膜の類似の脈管形成阻害は、胚盤胞の着床を妨害し、卵管妊娠の発症を防止する。投与方法には、丸薬、注射（静脈内、皮下、筋肉内）、座剤、膣スポンジ、膣タンポン、および子宮内デバイスが含まれるが、これらに限定されない。本開示の血管形成阻害剤の投与が胎盤の正常な脈管形成の増強を妨害し、首尾よく着床した胚盤胞内の血管の発達ならびに胚および胎児の発達も妨害するとも考えられる。
【０１０８】
眼では、血管形成は、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、および水晶体後線維増殖に関連する。本明細書に開示の治療薬を、眼内に投与するか、眼の他の局所投与によって投与することができる。さらに、実施例に示すように、ＡＬＫ１−Ｆｃを全身投与することができ、それでも依然として眼の血管形成に所望の効果を有する。
【０１０９】
眼の血管形成に関連する他の疾患には、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズの過装着、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片乾性角膜炎、シェーグレン、紅斑性座瘡、フィレクテヌロシス（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学火傷（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｕｍｓ）、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状ヘルペス感染、原生動物感染、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角膜炎（ｍａｒｉｇｉｎａｌ ｋｅｒａｔｏｌｙｓｉｓ）、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性動脈炎、外傷、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンス・ジョンソン病、類天疱瘡放射状角膜切開、および角膜移植片拒絶、鎌状赤血球貧血、サルコイド、弾力線維性偽性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、イールス病、ベーチェット病、網膜炎または脈絡膜炎を生じる感染、推定眼ヒストプラズマ症、ベスト病、近視、視窩、スターガート病、毛様体扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠血症候群、トキソプラズマ症、外傷、およびレーザー後合併症が含まれるが、これらに限定されない。他の疾患には、皮膚紅潮に関連する疾患（肋骨角の新血管新生）および線維性血管または線維組織の異常な増殖によって生じる疾患（全ての増殖性硝子体網膜症形態が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
眼の容態を、例えば、治療薬の全身注射、局所注射、眼内注射、または治療薬を放出する徐放性デバイスの挿入によって治療または防止することができる。化合物が角膜および眼の内部領域（例えば、前眼房、後眼房、硝子体、眼房水、硝子体液、角膜、虹彩／睫毛、レンズ、脈絡膜／網膜、および強膜）を貫通するのに十分な期間、化合物が眼表面と接触するように、治療薬を薬学的に許容可能な眼科ビヒクル中で送達させることができる。薬学的に許容可能な眼科ビヒクルは、例えば、軟膏、植物油、またはカプセル化材料であり得る。あるいは、開示の治療薬を、硝子体液および房水に直接注射することができる。さらに別では、化合物を、眼の治療のために静脈内注入または注射などによって全身投与することができる。
【０１１１】
１つまたは複数の治療薬を投与することができる。開示の方法は、眼の容態を治療するために使用される他の薬物との同時投与も含む。１つを超える薬剤または薬剤と薬物との組み合わせを投与する場合、同時または時間内に連続的に投与することができる。治療薬および／または薬物を、異なる投与経路または同一の投与経路によって投与することができる。１つの実施形態では、治療薬および薬物を、眼科薬学的処方物中で共に投与する。
【０１１２】
１つの実施形態では、治療薬を使用して、薬理学的機構によって血管形成を遮断するように作用する他の薬物との同時投与によって眼の血管形成に関連する疾患を治療する。開示の治療薬と同時に投与することができる薬物には、ペガプタニブ（マクゲン（商標））、ラニビズマブ（ルセンチス（商標））、乳酸スクアラミン（エビゾン（Ｅｖｉｚｏｎ）（商標））、ヘパリナーゼ、および糖質コルチコイド（例えば、トリアムシノロン）が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、少なくとも１つの本明細書に開示の治療薬および少なくとも１つの以下の薬物を含む眼科薬学的処方物の投与によって治療される血管形成に関連する疾患の治療方法を提供する：ペガプタニブ（マクゲン（商標））、ラニビズマブ（ルセンチス（商標））、乳酸スクアラミン（エビゾン（商標））、ヘパリナーゼ、および糖質コルチコイド（例えば、トリアムシノロン）。
７．処方物および有効用量
本明細書に記載の治療薬を薬学的組成物に処方することができる。本開示にしたがって使用する薬学的組成物を、１つまたは複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を使用した従来の様式で処方することができる。かかる処方物は、一般に、ほとんどの規制基準に従って実質的に発熱物質を含まない。
【０１１３】
一定の実施形態では、開示の治療方法は、組成物の全身投与または移植片もしくはデバイスとしての局所投与を含む。投与する場合、本開示で使用する治療組成物は、発熱物質を含まない生理学的に許容可能な形態である。本明細書に開示の方法において、任意選択的に上記組成物中にも含まれ得るＡＬＫ１シグナル伝達アンタゴニスト以外の治療的に有用な薬剤を、本化合物（例えば、本明細書に開示のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドまたは任意の抗体）と同時または連続的に投与することができる。
【０１１４】
典型的には、本明細書に開示のタンパク質治療薬を、非経口、特に静脈内または皮下に投与するであろう。非経口投与に適切な薬学的組成物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、処方物を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質、懸濁液、または増粘剤を含むことができる１つまたは複数の薬学的に許容可能な滅菌等張水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液、または乳濁液、または使用直前に滅菌注射液もしくは分散液で再構成することができる滅菌粉末と組み合わせた１つまたは複数のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドまたは他の抗体を含むことができる。開示の薬学的組成物中で使用することができる適切な水性および非水性の担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、植物油（オリーブ油）、注射用有機エステル（オレイン酸エチルなど）が含まれる。例えば、レシチンなどのコーティング物質、分散液の場合の必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。
【０１１５】
１つの実施形態では、本明細書に開示の抗体およびＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質を、眼科薬学的処方物中で投与することができる。いくつかの実施形態では、眼科薬学的処方物は、滅菌水溶液（注射に適切な濃度が好ましい）、または蝋膏もしくは軟膏である。かかる蝋膏または軟膏は、典型的には、滅菌された薬学的に許容可能な蝋膏または軟膏の基剤（鉱物油−白色ワセリン基剤）中に溶解または懸濁した本明細書に開示の１つまたは複数の抗体またはＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質を含む。蝋膏または軟膏組成物では、無水ラノリンも処方放物に含めることができる。抗菌薬としてチロメサールまたはクロロブタノールを、かかる軟膏組成物に添加することも好ましい。１つの実施形態では、滅菌水溶液は、米国特許第６，０７１，９５８号に記載されている。
【０１１６】
本開示は、ｐＨを調整するための酸および塩基、狭い範囲内にｐＨを維持するための緩衝剤を含むように変化することができる処方物を提供する。さらなる薬物を処方物に添加することができる。これらには、ペガプタニブ、ヘパリナーゼ、ラニビズマブ、または糖質コルチコイドが含まれるが、これらに限定されない。本開示の眼科薬学的処方物を、無菌操作法によって調製するか、または適切な調製段階で滅菌する。
【０１１７】
組成物および処方物は、所望により、有効成分を含む１つまたは複数の単位投薬形態を含むことができるパックまたは分注デバイス中に存在することができる。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイル（ブリスターパックなど）を含むことができる。パックまたは分注デバイスは、投与説明書を添付することができる。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１）ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現
出願人は、ヒトＦｃに融合したヒトＡＬＫ１またはマウスＦｃドメインに融合したマウスＡＬＫ１（その間に最小のリンカーを有する）の細胞外ドメインを有する可溶性ＡＬＫ１融合タンパク質を構築した。構築物を、それぞれ、ｈＡＬＫ１−ＦｃおよびｍＡＬＫ１−Ｆｃと呼ぶ。
【０１１９】
ＣＨＯ細胞株から精製されるｈＡＬＫ１−Ｆｃを、図３に示す。特に、ヒトＡＬＫ１タンパク質の細胞外ドメインの従来のＣ末端が配列番号１のアミノ酸１１８である一方で、本発明者らは、グルタミン残基で終結するドメインを有するのを回避することが望ましいと判断した。したがって、ヒトＡＬＫ１由来の配列番号３の一部は、Ｑ１１８に対してＣ末端に２つの残基（ロイシンおよびアラニン）を組み込む。したがって、本開示は、Ｑ１１８の１〜５アミノ酸上流（配列番号１に対して１１３〜１１７）または下流（１１９〜１２３）のどこかであるＡＬＫ１由来の配列のｃ末端を有するＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド（Ｆｃ融合タンパク質が含まれる）を提供する。
【０１２０】
ｈＡＬＫ１−ＦｃおよびｍＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質を、ＣＨＯ細胞株中で発現した。以下の３つの異なるリーダー配列を考慮した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号７）
（ｉｉ）組織プラスミノゲンアクチベータ（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号８）
（ｉｉｉ）未変性：ＭＴＬＧＳＰＲＫＧＬＬＭＬＬＭＡＬＶＴＱＧ（配列番号９）。
【０１２１】
選択された形態はＴＰＡリーダーを使用し、図４に示す非プロセシングアミノ酸配列を有する（配列番号５）。
【０１２２】
このポリペプチドは、図４に示す核酸配列によってコードされる（配列番号４）。
【０１２３】
一連のカラムクロマトグラフィ工程（例えば、３つ以上の以下が任意の順番で含まれる：プロテインＡクロマトグラフィ、Ｑセファロースクロマトグラフィ、フェニルセファロースクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、および陽イオン交換クロマトグラフィ）によって精製することができる。ウイルス濾過および緩衝液の交換を使用して、精製を完了することができる。ｈＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィによって決定したところ９８％超の純度、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定したところ９５％超に精製した。
【０１２４】
（実施例２）ＡＬＫ１−Ｆｃリガンドの同定
ＡＬＫ１は、ＴＧＦβファミリーメンバーの１型受容体である。ＴＧＦβファミリーの種々のメンバーを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムを使用して、ヒトＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質への結合について試験した。ＴＧＦβ自体、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ２、およびＢＭＰ４は全て、ｈＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質への実質的結合を示すことができなかった。ＢＭＰ２およびＢＭＰ４は、制限された結合を示した。ＧＤＦ５、ＧＤＦ７、およびＢＭＰ９は、それぞれ、５×１０−８Ｍ、５×１０−８Ｍ、および１×１０−１０ＭのＫＤ値の結合を示した。ＧＤＦ５およびＧＤＦ７のＧＤＦ６との類似性に基づいて、ＧＤＦ６が類似の親和性で結合すると予想される。ＢＭＰ１０は、ＢＭＰ９と密接に関連し、類似の親和性で結合することも予想される。
【０１２５】
（実施例３）内皮細胞に及ぼすＡＬＫ１−Ｆｃおよび抗ＡＬＫ１抗体の影響の特徴づけ
Ｓｍａｄ１／５／８媒介シグナル伝達に応答する４つの連続コンセンサスＳＢＥ部位の調節下でルシフェラーゼレポータ構築物（ＳＢＥ４−ｌｕｃ）を使用して、本発明者らは、ＨＭＶＥＣ細胞中のｈＡＬＫ１−Ｆｃ薬または中和ＡＬＫ１特異的モノクローナル抗体の存在下および不在下でのＢＭＰ−９媒介性活性を測定した。ＨＭＶＥＣ細胞を、ｒｈＢＭＰ−９（５０ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、それにより、Ｓｍａｄ１／５／８媒介性転写活性化が誘導され、ＳＢＥ４−ｌｕｃ調整転写上方制御の増加によってここで証明された。添加する場合、ｈＡＬＫ１−Ｆｃ化合物（１０μｇ／ｍｌ）または抗体（１０μｇ／ｍｌ）はこの転写応答を減少させ（それぞれ、約６０％）、ＡＬＫ１−Ｆｃの存在がＢＭＰ９シグナル伝達を有意に減少させ、さらに、ＢＭＰ９シグナル伝達がＡＬＫ１活性に関連することを示す。
【０１２６】
ＳＭＡＤリン酸化の活性化は、上流アクチビン受容体の活性化をアッセイするために一般的に使用される。ＡＬＫ１は、そのリガンドによる活性化の際にＳＭＡＤタンパク質１、５、および８のリン酸化を調整することが公知である。ここに、本発明者らは、ｒｈＢＭＰ−９（５０ｎｇ／ｍｌ）を３０分間のタイムコースにわたって添加してＨＵＶＥＣ細胞（ＡＬＫ１受容体を本質的に発現するヒト内皮細胞株）中でのＳＭＡＤリン酸化を開始させた。リガンドでの細胞の処理から５分後にＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化が認められ、リン酸化は、全３０分間にわたって維持された。比較的低濃度のｈＡＬＫ１−Ｆｃ（２５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＳＭＡＤ１／５／８リン酸化が減少し、この薬剤が内皮細胞中でＳｍａｄ１／５／８活性化を阻害することが確認された。
【０１２７】
インビトロ系でのＡＬＫ１−Ｆｃの血管形成効果を評価するために、本発明者らは、マトリゲル基質上での内皮細胞の管形成の減少における化合物の有効性をアッセイした。この技術は、新血管形成を評価するために一般的に使用されており、迅速且つ高再現性の結果が得られる。内皮細胞成長サプリメント（ＥＣＧＳ）を使用してマトリゲル上の内皮細胞由来の微細血管の形成を誘導し、次いで、抗血管形成化合物の有効性を１８時間のタイムコースにわたる薬物およびＥＣＧＳの両方の存在下での索形成の減少として測定した。予想通り、ネガティブコントロール（処理なし）と比較した場合にＥＣＧＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）の添加によって有意なコード形成が誘導され、これは、マトリゲル基質上で産生された内皮細胞索形成の基底レベルを示す（図５）。ｈＡＬＫ１−Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはｍＡＬＫ１−Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍｌ）のいずれかの添加の際、索形成は明白に減少した。全サンプル中の脈管長の最終定量により、あらゆる濃度のｈＡＬＫ１−ｆｃまたはｍＡＬＫ１−Ｆｃが基底レベルへの新血管形成を減少させることが明らかとなった。さらに、血管新生促進性の強い因子ＥＣＧＳの存在下でのｈＡＬＫ１−ＦｃおよびｍＡＬＫ１−Ｆｃによって新血管形成の強い阻害が維持され、ネガティブコントロールであるエンドスタチン（１００ｎｇ／ｍｌ）よりもさらにより強力な抗血管形成活性が証明された。
【０１２８】
（実施例４）ＣＡＭアッセイ
ＶＥＧＦおよびＦＧＦは、血管形成を刺激することが周知である。ＣＡＭ（トリ絨毛尿膜）アッセイ系を使用して、ＧＤＦ７の血管形成効果を評価した。図６に示すように、ＧＤＦ７は、ＶＥＧＦと類似の効力で血管形成を刺激する。ＧＤＦ５およびＧＤＦ６を使用して類似の結果が認められた。
【０１２９】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合物を、ＣＡＭアッセイにおいて抗血管形成活性について試験した。これらの融合タンパク質は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＧＤＦ７によって刺激された血管形成に対して強力な抗血管形成効果を示した。図７を参照のこと。ＢＭＰ９およびＰＤＧＦは、このアッセイにおいて比較的弱い血管形成誘導能力を示したが、これらの因子のかかる血管形成効果は、それでもなおＡＬＫ１によって阻害された。
【０１３０】
ＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質および市販の抗血管形成性抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を、ＣＡＭアッセイで比較した。ＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質は、抗ＶＥＧＦと比較して類似の効力を有していた。抗ＶＥＧＦ抗体であるベバシズマブは、現在、ヒトにおける癌および黄斑変性の治療で使用されている。図８を参照のこと。
【０１３１】
興味深いことに、抗ＡＬＫ１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、このアッセイ系で血管形成を有意に阻害できなかった。本発明者らは、これは異なる種におけるＡＬＫ１配列の相違を反映し得ると予想する。
【０１３２】
（実施例５）マウス角膜マイクロポケットアッセイ
マウス角膜マイクロポケットアッセイを使用して、マウス眼における血管形成に及ぼすＡＬＫ１−Ｆｃの影響を評価した。腹腔内に投与したｈＡＬＫ１−Ｆｃは、眼の血管形成を有意に阻害した。図９に示すように、ｈＡＬＫ１−Ｆｃは、抗ＶＥＧＦと同程度に眼の血管形成を阻害した。ｈＡＬＫ１−Ｆｃおよび抗ＶＥＧＦを、同一の重量／重量投薬量で使用した。ＶＥＧＦを充填したマトリゲルを眼でない位置に移植した場合に類似のデータが得られた。
【０１３３】
これらのデータは、ＡＬＫ１に対する高親和性リガンドが血管形成を促進し、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が強力な抗血管形成活性を有することを証明している。ＡＬＫ１のリガンドは、以下の２つのカテゴリーに分類される：ＡＬＫ１に中程度の親和性を有するＧＤＦ５、６、７群およびＡＬＫ１に高親和性を有するＢＭＰ９、１０群。
【０１３４】
ＧＤＦ５、６、および７は主に骨および関節に局在化する一方で、ＢＭＰ９は血液中を循環する。したがって、ＡＬＫ１、ＧＤＦ５、６、および７を含む骨および関節の血管新生促進系であり、ＡＬＫ１およびＢＭＰ９（およびおそらくＢＭＰ１０）を含む全身血管形成系のようである。
【０１３５】
（実施例６）関節リウマチのマウスモデル
マウスコラーゲン誘導性関節炎モデルは、十分に承認された関節リウマチモデルである。本研究では、１０匹のマウス群を、ビヒクル、抗ＶＥＧＦ（ベバシズマブ−ネガティブコントロールとして、ベバシズマブはマウスＶＥＧＦを阻害しないため）、または１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または２５ｍｇ／ｋｇの用量のｍＡＬＫ１−Ｆｃ（「ＲＡＰ−０４１」）で処理した。２１日目のコラーゲン追加免疫後、関節炎スコア（図１０を参照のこと）および足の腫脹は、全群で安定的に増加し、約３８日目でピークになった。ｍＡＬＫ１−Ｆｃ（「ＲＡＰ−０４１」）で処理したマウスは、特に最も高い用量（２５ｍｇ／ｋｇ）で両方の特徴についてスコアが減少したが、この減少は統計的に有意ではなかった。それにもかかわらず、用量に関連する傾向は明らかである。
【０１３６】
４２日目の研究終了までに、関節炎の発症率は、ビヒクルコントロール処置マウスで１０／１０、ベバシズマブ処置マウスで９／１０、１ｍｇ／ｋｇのｍＡＬＫ１−Ｆｃで処置した群で８／１０、１０ｍｇ／ｋｇのｍＡＬＫ１−Ｆｃで処置した群で９／１０に到達した。２５ｍｇ／ｋｇのｍＡＬＫ１−Ｆｃで処置した群の疾患の発生は、６／１０とより低かった。
【０１３７】
（実施例７）多発性骨髄腫のマウスモデル
多発性骨髄腫は、実質的な骨量減少に関連する主に骨の癌である。マウス骨髄腫の５Ｔ２ＭＭモデルは、高齢マウスで発症し、ヒト多発性骨髄腫患者で認められる影響と類似する影響をマウスで生じる自発性腫瘍型由来の腫瘍細胞（５Ｔ２ＭＭ細胞）の使用に基づく。例えば、Ｖａｎｄｅｒｋｅｒｋｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００５；１１３：１９１−２０５を参照のこと。ｍＡＬＫ１−Ｆｃを、このモデルにおける影響について試験した。
【０１３８】
Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊマウスに注射した５Ｔ２ＭＭ細胞により、破骨細胞表面の増加が促進され、溶骨性病変が形成され、骨領域の減少を生じた。骨疾患は、骨芽細胞数および骨芽細胞表面の減少、および石灰化の減少に関連する。
【０１３９】
５Ｔ２ＭＭ細胞を保有するマウスを、ｍＡＬＫ１−Ｆｃ（ＲＡＰ−０４１）（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内に週２回）またはビヒクルで５Ｔ２ＭＭ注射時から全部で１２週間処置した。近位脛骨および腰椎のＭｉｃｒｏＣＴ分析により、ナイーブマウスと比較して５Ｔ２ＭＭ保有マウスにおいて海綿骨体積および小柱数の統計的に有意な減少が証明された（コントロールと比較して骨体積は４０％減少し、小柱数は４０％減少した）。ＲＡＰ−０４１は、ビヒクル処置マウスと比較した場合、骨体積および小柱数の５Ｔ２ＭＭ誘導減少を完全に防止した（処置マウスは、非腫瘍化コントロールと比較して骨体積が１２０％であり、非腫瘍化コントロールと比較して小柱数が１１５％であった）。さらに、腫瘍処置マウスは、溶骨性病変を発症し、これはｍｉｃｒｏＣＴで検出された。ｍＡＬＫ１−Ｆｃ処置により、ビヒクル処置マウスと比較して、溶血性骨病変数が５０％減少した。
【０１４０】
ＡＬＫ１−Ｆｃの抗血管形成効果に基づいて、本発明者らは、この薬剤によって得られた骨の防御効果が腫瘍成長の結果であると推測する。
【０１４１】
したがって、ＡＬＫ１−Ｆｃを使用して多発性骨髄腫を処置し、この腫瘍型に起因する骨疾患の影響を減少させることができる。
【０１４２】
（実施例８）ＤＡＮのリガンド結合特性
ＤＡＮは、ＭＢＰ活性を阻害する分泌性シスチンｋｎｏｔタンパク質ファミリーのメンバーである。ＤＡＮは、ＧＤＦ５に結合して拮抗することが公知である。本発明者らは、ＤＡＮはＧＤＦ７に強固に結合するが、ＢＭＰ９に結合しないと判断した。したがって、本発明者らは、ＤＡＮが一連のＡＬＫ１の骨および関節局在リガンドを阻害し、ＤＡＮが骨および関節関連血管形成の強力なアンタゴニストであると予想されると結論づけた。したがって、ＤＡＮは、骨の癌（例えば、多発性骨髄腫および骨転移）ならびに関節リウマチおよび骨関節炎の治療で有用であり得る。
【０１４３】
まとめると、これらの実施例で開示した所見は、インビボでの血管形成、特に眼の血管形成の阻害のための本明細書に記載の多くの試薬を提供する。これらの所見は、ＧＤＦ５、６、および７に標的化される薬剤を使用して、骨および関節の血管形成を選択的に阻害することができることも示す。これらの所見は、かかる薬剤を使用して癌および関節リウマチを治療することができることをさらに示す。
文献の引用
本明細書で言及した全ての刊行物および特許は、各刊行物または特許が具体的且つ個別に参考により組み込まれることを意図するように、その全体が本明細書で参考により組み込まれる。矛盾する場合、本願（本明細書の任意の定義が含まれる）に従う。
等価物
本発明の特定の実施形態を本明細書に明確に開示しているが、上記明細書は例示であり、本発明を制限しない。本明細書および以下の特許請求の範囲の再検討の際に本発明の多くの変形形態が当業者に明らかとなるであろう。本発明の全範囲を、特許請求の範囲およびその等価物の全範囲ならびに明細書およびかかる変形形態を参照して判断すべきである。
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
本願は、題名が「ＡＬＫ１受容体およびリガンドアンタゴニストならびにその使用」である２００６年１１月２日に出願された米国仮特許出願第６０／８５６，５９２号の出願日での利益を主張する。米国仮特許出願第６０／８５６，５９２号の全ての教示が、本明細書中に参考として明白に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
血管形成（新しい血管の形成過程）は、多くの正常または異常な生理学的状態に重要である。正常な生理学的条件下で、ヒトおよび動物は、特定の状況および制限された状況で血管形成をする。例えば、血管形成は、通常、創傷治癒、胎児および胚の発達、ならびに黄体、子宮内膜、および胎盤の形成において認められる。
【０００３】
望ましくないまたは不適切に制御された血管形成は多くの障害で生じ、これには異常な内皮成長が病理学的過程に起因し、または関与し得る。例えば、血管形成は、多くの腫瘍の成長に関与する。無秩序な血管形成は、関節リウマチ、網膜症、血管腫、および乾癬などの病理学的過程に関与している。無秩序な血管形成が存在する多様な病状が血管形成関連疾患として分類されている。
【０００４】
制御された血管形成および制御されない血管形成は、共に類似の様式で進行すると考えられている。毛細血管は、主に、基底膜に囲まれた内皮細胞および周皮細胞から構成される。血管形成は、内皮細胞および白血球から放出された酵素による基底膜の侵食から開始される。次いで、血管内腔を裏打ちする内皮細胞が、基底膜を介して突出する。血管新生因子は、侵食された基底膜を介して移動するように内皮細胞を誘導する。移動する細胞は、親血管から突出した「出芽」を形成し、ここで内皮細胞が有糸分裂および増殖を受ける。内皮出芽が相互に融合して、毛細血管係蹄を形成し、新規の血管を作製する。
【０００５】
血管形成を阻害する薬剤は、種々の障害の治療で有効であることが証明されている。アバスチン（商標）（ベバシズマブ）（血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合するモノクローナル抗体）は、種々の癌の治療で有効であることが証明されている。マクゲン（商標）（ＶＥＧＦに結合するアプタマー）は、新生血管（湿性）加齢性黄斑変性の治療で有効であることが証明されている。ＳＤＦ／ＣＸＣＲ４シグナル伝達経路のアンタゴニストは、腫瘍新血管形成を阻害し、マウスモデルにおいて癌に有効である（非特許文献１）。イソクマリン２−（８−ヒドロキシ−６−メトキシ−１−オキソ−１Ｈ−２−ベンゾピラン−３−イル）プロピオン酸（ＮＭ−３）は、経口で生物学的に利用可能な血管形成阻害剤として第Ｉ相臨床評価が完了している。ＮＭ−３は、インビトロで内皮細胞および腫瘍細胞の両方を直接死滅させ、マウスにおいて多様なヒト腫瘍異種移植片の治療で有効である（非特許文献２）。サリドマイドおよび関連化合物は、癌治療において有益な効果を示しているが、分子の作用機構は明らかではなく、血管形成阻害は抗腫瘍効果の重要な構成要素のようである（例えば、非特許文献３を参照のこと）。関節リウマチ治療におけるＴＮＦ−αアンタゴニストの成功は、炎症を起こした関節組織に及ぼす抗血管形成効果が部分的に寄与している（非特許文献４）。抗血管形成療法は、他の炎症性疾患（特に、乾癬）に対して有益な効果を有することが広く期待されている。多くの抗血管新生薬は、罹患した組織と無関係に血管形成に効果があるにもかかわらず、他の血管形成薬は、組織選択効果を有する傾向があり得る。
【０００６】
血管形成阻害のためのさらなる組成物および方法があることが望ましい。これらには、全身または一定の組織および／もしくは病状における血管の望ましくない成長を阻害することができる方法および組成物が含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｕｌｅｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５ Ｊｕｌ．１；６５（１３）：５８６４−７１
【非特許文献２】Ａｇａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；５６（６）：６１０−４
【非特許文献３】Ｄｒｅｄｇｅら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．２００５ Ｊａｎｕａｒｙ；６９（１−２）：５６−６３
【非特許文献４】Ｆｅｌｄｍａｎｎら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１９：１６３−９６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
本開示は、一部分において、アクチビン様キナーゼＩ（ＡＬＫ１）媒介性制御系の特徴づけおよびインビボでの血管形成におけるこの系の役割を示す。一定の態様では、本開示は、ＡＬＫ−１リガンドのアンタゴニストおよび抗血管新生薬としてのかかるアンタゴニストの使用を提供する。さらに、本開示は、ＡＬＫ−１自体のアンタゴニストおよび抗血管新生薬としてのかかるアンタゴニストの使用を提供する。本明細書に記載されるように、ＡＬＫ１は、リガンドのＧＤＦ５群（ＧＤＦ６およびＧＤＦ７が含まれる）の受容体であり、リガンドのＢＭＰ９群（ＢＭＰ１０が含まれる）の受容体でもある。本開示は、ＡＬＫ１によって媒介されるシグナル伝達および上記リガンドがインビボでの血管形成に関与し、この制御系の阻害が強い抗血管形成効果を有することを証明する。したがって、一定の態様では、本開示は、ＡＬＫ１制御系のアンタゴニスト（血管形成阻害で用いる受容体または１つまたは複数のリガンドのアンタゴニストが含まれる）を提供する。一定の態様では、本開示は、癌（特に、多発性骨髄腫）、関節リウマチ、および眼における病理学的血管形成に関連する障害の治療のためのＡＬＫ１リガンドのアンタゴニストを提供する。
【０００９】
一定の態様では、本開示は、血管形成阻害で使用するＡＬＫ１の細胞外ドメインのリガンド結合部分（「ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド」）を含むポリペプチドを提供する。いかなる特定の作用機構にも拘束されることを望まないが、かかるポリペプチドはＡＬＫ１リガンドへの結合ならびにこれらのリガンドがＡＬＫ１および他の受容体と相互作用する能力の阻害によって作用すると予想される。一定の実施形態では、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のヒトＡＬＫ１配列のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを、特に、眼などの組織への局所投与のために小さな単量体タンパク質または二量体化形態（例えば、融合タンパク質として発現する）として使用することができる。ＡＬＫ１ ＥＣＤを、第２のポリペプチド部分に融合して特性を改善することもできる（半減期の増加またはより容易な産生もしくは精製など）。免疫グロブリンのＦｃ部分への融合またはポリオキシエチレン部分（例えば、ポリエチレングリコール）への連結は、全身投与（例えば、静脈内、動脈内、および腹腔内投与）におけるＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドの血清半減期の増加に特に有用であり得る。本明細書中で証明されるように、全身投与したＡＬＫ１−Ｆｃポリペプチドは眼に強い抗血管形成効果を有し、関節リウマチおよび多発性骨髄腫のマウスモデルでの好ましい効果も得られる。一定の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、このポリペプチドは、介入リンカーを使用し、または使用しないで、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合し、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、１×１０−７Ｍ未満のＫＤでＧＤＦ５、ＧＤＦ７、およびＢＭＰ９に結合し、１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する。Ｆｃ部分を、生物に適切であるように選択することができる。任意選択的に、Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分である。好ましい実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８を含む。任意選択的に、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、哺乳動物細胞株、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株中での配列番号４の核酸の発現によって産生されるタンパク質である。ＡＬＫ１−ＥＣＤポリペプチドを、実質的に発熱物質を含まない薬学的調製物として処方することができる。薬学的調製物を、全身送達（例えば、静脈内、動脈内、または皮下送達）または局所送達（例えば、眼）のために調製することができる。
【００１０】
一定の態様では、本開示は、本明細書に一般的または具体的に記載の任意のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドの投与による哺乳動物における血管形成の阻害方法を提供する。１つの実施形態では、方法は、有効量のＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を哺乳動物に投与する工程であって、ＡＬＫ１ Ｆｃ融合タンパク質が配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に融合し、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する工程を含む。任意選択的に、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する。任意選択的に、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３の配列を有する。ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを、局所（例えば、眼）または全身（例えば、静脈内、動脈内、または皮下）に送達することができる。特定の実施形態では、本開示は、哺乳動物の眼から離れた場所へのＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質の投与（例えば、全身投与）による哺乳動物の眼の血管形成の阻害方法を提供する。
【００１１】
一定の態様では、本開示は、ＡＬＫ１、特に、細胞外ドメイン中に存在するエピトープ（配列番号１のアミノ酸２２〜１１８）に結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドへのＡＬＫ１の結合を阻害する抗体を提供する。これらのリガンドのＡＬＫ１に対する親和性に基づいて、抗体は、５×１０−８Ｍ未満、任意選択的に、５×１０−８と１×１０−１０との間のＫＤで結合することができる。この範囲内の親和性を有する抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ５、６、および７によるシグナル伝達を阻害する一方で、ＢＭＰ９および１０によるシグナル伝達による影響が少ない予想されるであろう。かかる抗体は、好ましくは、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激された血管形成を阻害する。特定の機構に拘束されるのを望まないが、かかる抗体は、ＡＬＫ１活性の直接的阻害によって作用すると予想され、ＡＬＫ１リガンドの活性を阻害すると予想されるＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の活性と対照的なはずである。抗ＡＬＫ１抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０が別の受容体系（ＢＭＰＲ１ａ、ＢＭＰＲ１ｂ、およびＢＭＰＲＩＩ複合体など）によってシグナル伝達する能力を妨害しないと予想される。しかし、抗ＡＬＫ１抗体は、ＡＬＫ１ ＥＣＤがかかる低親和性リガンドを結合または阻害することができないにもかかわらず、ＡＬＫ１の低親和性リガンド（例えば、結合が比較的弱いにもかかわらず、ＡＬＫ−１を介した有意なシグナル伝達事象の誘発として一般に認識されるＴＧＦ−β）がＡＬＫ１を介してシグナル伝達する能力を妨害すると予想される。抗体は、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合することができる。この範囲内の親和性の抗体は、ＢＭＰ９または１０によるシグナル伝達を阻害すると予想されるであろう。かかる抗体は、好ましくは、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のＡＬＫ１への結合を阻害する。とりわけ、本明細書に開示のデータに基づいて、ＡＬＫ１に比較的弱く結合する抗体は、ＡＬＫ１へのＴＧＦβ結合を阻害することができる一方で、ＧＤＦ５またはＢＭＰ９などのより強く結合するリガンドを阻害することができない。本明細書に記載の抗体は、好ましくは、組換え抗体（分子生物学技術を使用して構築された核酸から発現した抗体（ヒト化抗体または単鎖抗体から発生した全ヒト抗体など）を意味する）である。Ｆｖ、Ｆａｂ、および単鎖抗体も、用語「組換え抗体」の範囲内に含まれる。抗体はまた、ポリクローナル抗体または非組換えモノクローナル抗体（ヒトまたはマウス形態およびトランスジェニックマウスから得たヒト抗体が含まれる）であり得る。抗体およびＡＬＫ１−ＥＣＤポリペプチドを、実質的に発熱物質を含まない薬学的調製物として処方することができる。薬学的調製物を、全身送達（例えば、静脈内、動脈内、または皮下送達）または局所送達（例えば、眼）のために調製することができる。
【００１２】
一定の態様では、本開示は、本明細書に記載のＡＬＫ１ポリペプチドに結合する有効量の抗体を、全身または特異的に哺乳動物に投与することによる哺乳動物における血管形成の阻害方法を提供する。この目的に有用な抗体は、ＡＬＫ１の細胞外ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるポリペプチドに結合する）またはＡＬＫ１の別の部分に結合することができる。抗体は、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるポリペプチドに結合することができ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する。抗体は、５×１０−８Ｍ未満、任意選択的に、５×１０−８と１×１０−１０との間のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合することができる。抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害することができる。ＢＭＰ９または１０によるシグナル伝達と比較してＧＤＦ５、６、または７によって媒介されるシグナル伝達を選択的に阻害する抗体を、ＧＤＦ５、６、または７が局在する組織（主に、骨または関節）で起こる血管形成の選択的阻害剤として使用することができる。抗体は、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合することができる。抗体は、ＡＬＫ１リガンドへのＡＬＫ１結合を阻害することができ、ＡＬＫ１リガンドは、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される。抗ＡＬＫ１抗体を、局所（例えば、眼）または全身（例えば、静脈内、動脈内、または皮下）に送達することができる。特定の実施形態では、本開示は、抗ＡＬＫ１抗体の投与による哺乳動物の眼における血管形成の阻害方法を提供する。別の特定の実施形態では、本開示は、多発性骨髄腫患者の治療方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、複数の血管新生促進因子（ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、および／またはＦＧＦなど）の結果としての病理学的血管形成に関連する障害における血管形成の阻害方法を提供する。
【００１３】
一定の態様では、本開示は、本明細書に開示のＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体を提供する。いかなる特定の作用機構にも拘束されることを望まないが、ＡＬＫ１リガンドに結合する抗体が事実上ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドに類似する効果を有すると予想される。これは、両方の型の作用因子が受容体自体よりもむしろリガンドに結合するからである。一定の実施形態では、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択されるリガンドに結合する。抗体は、５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１リガンドに結合することができる。抗体を、ＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成の阻害について選択することができる。ＣＡＭアッセイは、望ましい抗体の選択に適切なアッセイ系である。かかる抗体は、好ましくは、組換え抗体であり、実質的に発熱物質を含まない薬学的調製物として処方することができる。薬学的調製物を、全身送達（例えば、静脈内、動脈内、または皮下送達）または局所送達（例えば、眼）のために調製することができる。
【００１４】
一定の態様では、本開示は、ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、ＡＬＫ１リガンドがＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体を提供する。抗体は、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１リガンドに結合することができる。かかる抗体は、好ましくは、組換え抗体であり、実質的に発熱物質を含まない薬学的調製物として処方することができる。薬学的調製物を、全身送達（例えば、静脈内、動脈内、または皮下送達）または局所送達（例えば、眼）のために調製することができる。
【００１５】
一定の態様では、本開示は、哺乳動物の血管形成を阻害する方法であって、ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する有効量の抗体を哺乳動物に投与する工程を含み、ＡＬＫ１リガンドが、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される方法を提供する。抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害することができる。
【００１６】
ＢＭＰ／ＧＤＦファミリーのメンバー（ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７が含まれる）は、Ｉ型およびＩＩ型受容体に結合して機能的なシグナル伝達複合体を形成する。これらの受容体の結合部位は異なる。したがって、一定の実施形態では、ＡＬＫ１リガンドに結合してリガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体は、リガンドのＩ型受容体結合部位またはその付近に結合する抗体である。
【００１７】
一定の態様では、本開示は、本明細書に開示のＡＬＫ１シグナル伝達系の他の阻害剤の投与による哺乳動物の血管形成の阻害方法を提供する。かかる阻害剤には、ＡＬＫ１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０の産生を減少させる核酸（例えば、アンチセンスまたはＲＮＡｉ構築物）が含まれ得る。種々の親和性結合試薬（アプタマー、ランダムペプチド、選択した標的に結合するように修飾することができるタンパク質足場（かかる足場の例には、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）およびＦＮＩＩＩドメインが含まれる）など）も使用することができる。いずれの場合にも、親和性結合試薬を、ＡＬＫ１−リガンド相互作用の破壊または結合後に起こるシグナル伝達の阻害のいずれかによって本明細書に開示のＡＬＫ１制御系を破壊する能力について選択されるであろう。
【００１８】
さらなる実施形態では、本開示は、ＡＬＫ１制御系のレギュレータとしてのＤＡＮの役割を記載する。本明細書に示されるように、ＤＮＡは、リガンドのＧＤＦ５群に結合するが、リガンドのＢＭＰ９群に結合できない。したがって、ＤＡＮは、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、またはＧＤＦ７によって媒介される血管形成を阻害するが、ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０によって媒介される血管形成を阻害しないと予想される。したがって、ＤＡＮを、タンパク質のＧＤＦ５群が主に発現する骨または関節における血管形成のための選択的阻害剤として使用することができる。したがって、一定の実施形態では、本開示は、骨または関節の血管形成（関節リウマチおよび骨または関節に関与する癌（例えば、多発性骨髄腫および骨転移）が含まれる）の文脈における抗血管新生薬として使用するためのＤＡＮタンパク質を提供する。ＤＡＮタンパク質は、一般に、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する一方で、ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０への結合は比較的低いであろう。ＤＡＮタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸１７〜１８０に対応するアミノ酸配列（成熟ヒトＤＡＮ）または配列番号１０のアミノ酸２１〜１２５（ＤＡＮの保存システインｋｎｏｔドメイン）の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ＤＡＮタンパク質は、その相補物がストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７または同一のコード配列を有する配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７の変異体（「静的」変異体（トリプレットコード中のゆらぎ位置に１つまたは複数の変更を含む変異体など））、または配列番号１１のヌクレオチド９３〜６３５またはその静的変異体とハイブリッド形成する配列を含む核酸によってもコードされ得る。一定の態様では、ＤＡＮタンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質などの融合タンパク質である。ＤＡＮが骨および関節における血管形成（骨または関節中に存在する腫瘍（多発性骨髄腫および骨転移など）が含まれる）の阻害に特に有用であると予想されるが、他の文脈（他の場所または眼に存在する腫瘍など）でも有用であり得る。
【００１９】
一定の態様では、本開示は、哺乳動物の関節リウマチを治療する方法であって、ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；およびＤＡＮポリペプチドからなる群から選択される有効量の薬剤を、関節リウマチを有する哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。
【００２０】
一定の態様では、本開示は、哺乳動物の腫瘍を治療する方法を提供する。かかる方法は、ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；およびＤＡＮポリペプチドからなる群から選択される有効量の薬剤を、腫瘍を有する哺乳動物に投与する工程を含むことができる。方法は、血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含むことができる。腫瘍は、白血病、骨髄腫瘍、多発性骨髄腫、または骨転移（乳癌または前立腺癌に付随する転移など）などの骨に関連する腫瘍であり得る。腫瘍はまた、複数の血管新生促進因子を使用する腫瘍（抗ＶＥＧＦ療法に耐性を示す腫瘍など）であり得る。
【００２１】
一定の態様では、本開示は、眼科処方物を提供する。かかる処方物は、ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；およびＤＡＮポリペプチドからなる群から選択される薬剤を含むことができる。
【００２２】
一定の態様では、本開示は、眼の血管形成関連疾患の治療方法を提供する。かかる方法は、ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；およびＤＡＮポリペプチドからなる群から選択される有効量の薬剤を含む薬学的処方物を全身または眼に投与する工程を含むことができる。
【００２３】
各例では、本明細書に記載の薬剤を、血管形成を阻害する第２の薬剤と併せて投与することができる。腫瘍の血管形成を阻害することが望ましい場合、薬剤を、抗癌効果を有する第２の薬剤（例えば、化学療法薬または生物抗癌薬）と併せて投与することができる。
【００２４】
本開示はまた、ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含む眼科薬学的処方物であって、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＧＤＦ５、ＧＤＦ７、およびＢＭＰ９に結合し、１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する眼科薬学的処方物を提供する。１つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３の配列を有する。１つの実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ１に由来する。１つの実施形態では、融合タンパク質を、哺乳動物細胞株中の配列番号４の核酸の発現によって産生する。１つの実施形態では、細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株である。処方物は、１つまたは複数の以下の薬物をさらに含むことができる：ペガプタニブ、ラニビズマブ、または糖質コルチコイド。１つの実施形態では、処方物は、実質的に発熱物質を含まない。
【００２５】
本願はまた、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体を含む眼科薬学的処方物を提供する。１つの実施形態では、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する。１つの実施形態では、抗体は、５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する。別の実施形態では、抗体は、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する。１つの実施形態では、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０によって刺激される血管形成を阻害する。処方物は、１つまたは複数の以下の薬物をさらに含むことができる：ペガプタニブ、ラニビズマブ、または糖質コルチコイド。１つの実施形態では、処方物は、実質的に発熱物質を含まない。
【００２６】
一定の態様では、本開示は、本明細書に開示のＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体を含む眼科薬学的処方物を提供する。一定の実施形態では、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択されるリガンドに結合する。抗体は、５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１リガンドに結合することができる。抗体を、ＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成の阻害について選択することができる。ＣＡＭアッセイは、望ましい抗体の選択に適切なアッセイ系である。かかる抗体は、好ましくは、組換え抗体である。処方物は、１つまたは複数の以下の薬物をさらに含むことができる：ペガプタニブ、ラニビズマブ、または糖質コルチコイド。１つの実施形態では、処方物は、実質的に発熱物質を含まない。
【００２７】
本願はまた、ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含む眼科薬学的処方物であって、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、１×１０−７Ｍ未満のＫＤでＧＤＦ５、ＧＤＦ７、およびＢＭＰ９に結合し、１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、眼科薬学的処方物を眼に投与する工程を含む、眼の血管形成関連疾患を治療する方法を提供する。１つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３の配列を有する。１つの実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ１に由来する。１つの実施形態では、融合タンパク質を、哺乳動物細胞株中の配列番号４の核酸の発現によって産生する。１つの実施形態では、細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株である。処方物は、１つまたは複数の以下の薬物をさらに含むことができる：ペガプタニブ、ラニビズマブ、または糖質コルチコイド。１つの実施形態では、処方物は、実質的に発熱物質を含まない。
【００２８】
本願はまた、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体を含む眼科薬学的処方物を眼に投与する工程を含む、眼の血管形成関連疾患を治療する方法を提供する。１つの実施形態では、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する。１つの実施形態では、抗体は、５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する。別の実施形態では、抗体は、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する。１つの実施形態では、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０によって刺激される血管形成を阻害する。処方物は、１つまたは複数の以下の薬物をさらに含むことができる：ペガプタニブ、ラニビズマブ、または糖質コルチコイド。１つの実施形態では、処方物は、実質的に発熱物質を含まない。
【００２９】
開示の方法の１つの実施形態では、眼の血管形成関連疾患は、腫瘍、抗ＶＥＧＦ療法に耐性を示す腫瘍、多発性骨髄腫の腫瘍、骨に転移した腫瘍、骨または関節の炎症、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、および水晶体後線維増殖からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ヒトアクチビン受容体様キナーゼ１（ＡＬＫ１）のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。一重の下線は、推定細胞外ドメインを示す。二重の下線は細胞内ドメインを示す。シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインには下線を引いていない。
【図２】図２は、ヒトＡＬＫ１ ｃＤＮＡの核酸配列（配列番号２）を示す。コード配列に下線を引いている。細胞外ドメインをコードする部分に二重の下線を引いている。
【図３】図３は、ヒトＡＬＫ１の細胞内ドメインのＦｃドメインとの融合物の例（配列番号３）を示す。ｈＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質は、Ｃ末端でリンカー（下線）に融合したヒトＡＬＫ１タンパク質のアミノ酸２２〜１２０およびＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
【図４】図４は、配列番号３のｈＡＬＫ１−Ｆｃポリペプチドの発現のための核酸配列を示す。コードされたアミノ酸配列も示す。Ａｓｐ２２が分泌タンパク質のＮ末端アミノ酸となるようにリーダー配列を切断する。
【図５】図５は、内皮細胞管形成アッセイにおけるマウスＡＬＫ１−Ｆｃ（「ＲＡＰ」）およびヒトＡＬＫ１−Ｆｃ（「ＡＣＥ」）の抗血管形成効果を示す。全濃度のＲＡＰおよびＡＣＥは内皮細胞成長サプリメント（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（ＥＣＧＦ）に応答して管形成レベルをポジティブコントロール（エンドスタチン）よりも高い程度で減少させた。
【図６】図６は、トリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおけるＧＤＦ７の血管形成効果を示す。ＧＤＦ７効果は、ＶＥＧＦと同程度である。
【図７】図７は、ＣＡＭアッセイにおけるヒトＡＬＫ１−Ｆｃ融合物の血管形成効果を示す。ｈＡＬＫ１−Ｆｃは、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＧＤＦ７によって刺激された血管形成を阻害する。
【図８】図８は、マウスＡＬＫ１−Ｆｃ（ＭＡＬＫ１−Ｆｃ）、ｈＡＬＫ１−Ｆｃ、市販の抗ＡＬＫ１モノクローナル抗体（抗ＡＬＫ１ ｍＡｂ）および市販の中和抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の抗血管形成効果の比較を示す。ＡＬＫ１−Ｆｃ構築物の抗血管形成効果は、抗ＶＥＧＦ抗体の効果と同程度である。
【図９】図９は、インビボでのｈＡＬＫ１−Ｆｃおよび抗ＶＥＧＦ抗体の抗血管形成効果を示す。マウス角膜マイクロポケットアッセイによって測定したところ、ｈＡＬＫ１−Ｆｃおよび抗ＶＥＧＦは、眼における血管形成効果は同程度であった。
【図１０】図１０は、関節リウマチのマウスコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおけるｍＡＬＫ１−Ｆｃの効果を示す。グラフは、コラーゲン誘導性雄ＤＢＡ／１関節炎マウスにおける４２日間の観察期間に決定した平均群関節炎スコアを示す。ＲＡＰ−０４１はｍＡＬＫ１−Ｆｃである。アバスチン（商標）は抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
１．概要
ＡＬＫ１は、リガンドのＴＧＦ−βスーパーファミリーのＩ型細胞表面受容体であり、ＡＣＶＲＬ１およびＡＣＶＲＬＫ１としても公知である。ＡＬＫ１は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３、およびＢＭＰ−９の受容体とされている（Ｍａｒｃｈｕｋら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００３；Ｂｒｏｗｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｊｕｌ １；２８０（２６）：２５１１１−８）。
【００３２】
マウスでは、ＡＬＫ１の機能喪失型変異によって脈管構造の発達に種々の異常を生じる（Ｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２０００，９７，２６２６−２６３１；Ｕｒｎｅｓｓら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０００，２６，３２８−３３１）。
【００３３】
ヒトでは、ＡＬＫ１の機能喪失型変異は、先天性出血性末梢血管拡張症（ＨＨＴ、すなわちオスラー−ランデュ−ウェバー症候群）に関連し、その患者は、毛細血管床を干渉することなく、動脈から静脈への直接的な流れ（連通）（動静脈シャント）を作製する動静脈奇形を発症する。ＨＨＴ患者の典型的な症状は、反復性鼻出血、胃腸出血、皮膚および粘膜皮膚の毛細血管拡張症、ならびに肺、大脳、または肝臓の脈管構造の動静脈奇形（ＡＶＭ）が含まれる。
【００３４】
Ｄａｖｉｄら（Ｂｌｏｏｄ．２００７ Ｍａｒ．１；１０９（５）：１９５３−６１）およびＳｃｈａｒｐｆｅｎｅｃｋｅｒら（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００７ Ｍａｒ．１５；１２０（Ｐｔ ６）：９６４−７２）の近刊では、内皮細胞中でＢＭＰ９およびＢＭＰ１０がＡＬＫ１を活性化し、この活性化の結果が内皮細胞の増殖および移動を阻害することであると結論づけている。これらの効果は、ＶＥＧＦなどの血管新生促進因子の効果と正反対である。したがって、これらの刊行物は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０自体が抗血管新生因子であり、さらに、ＡＬＫ１活性化が抗血管形成効果を有すると結論づけている。対照的に、本開示は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のアゴニストよりもむしろアンタゴニストが抗血管形成効果を有することを証明する。
【００３５】
本開示は、ＡＬＫ１の細胞外ドメイン（「ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド」）の一部を含むポリペプチドを使用して、インビボで血管形成（ＶＥＧＦ非依存性血管形成および複数の血管新生因子（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦが含まれる）によって媒介される血管形成が含まれる）を阻害することができるという発見に関する。ひとつには、本開示は、ＡＬＫ１の生理学的な高親和性リガンドの同一性を提供し、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドが血管形成を阻害することを証明している。データは、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドがＴＧＦ−β１への重要な結合を示さない場合でさえ、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドが抗血管形成効果を発揮することができることを証明している。さらに、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、多数の異なる血管新生促進因子（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＧＤＦ７が含まれる）によって刺激される血管形成を阻害する。したがって、本開示は、ＡＬＫ１制御系を説明する。ここで、ＡＬＫ１は、リガンドのＧＤＦ５群（ＧＤＦ６およびＧＤＦ７が含まれる）の受容体であり、リガンドのＢＭＰ９群（ＢＭＰ１０が含まれる）の受容体でもあり、この２つのリガンド群は異なる親和性を有する。さらに、開示は、上記のＡＬＫ１およびリガンドによって媒介されたシグナル伝達がインビボで血管形成誘発性を示し、この制御系の阻害がインビボで強力な抗血管形成効果を有することを証明している。したがって、一定の態様では、本開示は、ＡＬＫ１制御系のアンタゴニスト（血管形成（ＶＥＧＦ依存性血管形成およびＶＥＧＦ非依存性血管形成が含まれる）の阻害で使用される受容体または１つもしくは複数のリガンドのアンタゴニストが含まれる）を提供する。しかし、ＡＬＫ１自体に指向する抗体がＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド由来の異なる効果を有すると予想されることに留意すべきである。ＡＬＫ１に対する汎中和抗体（ｐａｎ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（全ての強いまたは弱いリガンドの結合を阻害する抗体）は、ＡＬＫ１を介したかかるリガンドのシグナル伝達を阻害すると予想されるが、かかるリガンドが他の受容体（例えば、ＧＤＦ５−７およびＢＭＰ９−１０の場合のＢＭＰＲ１ａ、ＢＭＰＲ１ｂ、ＢＭＰＲＩＩならびにＴＧＦβの場合のＴＢＲＩおよびＴＢＲＩＩ）を介してシグナル伝達する能力を阻害すると予想されないであろう。他方では、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、このポリペプチドが強く結合する全てのリガンド（実施例に示した構築物などの構築物についてのＧＤＦ５〜７およびＢＭＰ９〜１０が含まれる）を阻害すると予想されるが、このポリペプチドが弱く結合するリガンド（ＴＧＦ−βなど）には影響を及ぼさないであろう。従って、ＡＬＫ１に対する汎中和抗体は、ＡＬＫ１を介したＢＭＰ９およびＴＧＦ−βシグナル伝達を遮断する一方で、別の受容体を介したＢＭＰ９およびＴＧＦ−βシグナル伝達を遮断しないであろう。一方、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、全受容体（ＡＬＫ１以外の受容体でさえ）を介したＢＭＰ９シグナル伝達を阻害することができる一方で、任意の受容体（ＡＬＫ１でさえも）を介したＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害すると予想されないであろう。
【００３６】
本明細書に記載のタンパク質は、他で特定しない限り、ヒト形態である。このタンパク質のＧｅｎｂａｎｋリファレンスは以下のとおりである：ヒトＧＤＦ５、ＣＡＡ５６８７４；ヒトＧＤＦ６、ＡＡＨ４３２２２；ヒトＧＤＦ７、ＮＰ＿８７８２４８；ヒトＢＭＰ９、Ｑ９ＵＫ０５；ヒトＢＭＰ１０、Ｏ９５３９３；ヒトＤＡＮ、ＢＡＡ９２２６５。ＡＬＫ１配列を、図１〜５に示す。
【００３７】
ヒトＤａｎアミノ酸配列（配列番号１０）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＢＡＡ９２２６５）：
【００３８】
【化１】
成熟Ｄａｎタンパク質は、アミノ酸１７〜１８０に対応すると予想される。Ｄａｎの保存システインｋｎｏｔドメインは、アミノ酸２１〜１２５（下線）に対応する。
【００３９】
ヒトＤａｎ ｃＤＮＡ配列（配列番号１１）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＢＣ０１２０３７）：
【００４０】
【化２】
【００４１】
【化３】
ＤＡＮ前駆体のコード配列は、核酸９３〜６３５に対応する。成熟ＤＡＮタンパク質のコード配列は、核酸１４１〜６３２に対応する。ＤＡＮの保存システインｋｎｏｔ部分のコード配列は、核酸１５３〜４６７に対応する。
【００４２】
本明細書で使用される用語は、一般に、本開示の文脈内および各用語が使用される特定の文脈中で、当該分野でのその通常の意味を有する。本明細書に開示の組成物および方法ならびにどのようにしてこれらを作製するのかを説明する際に実施者へのさらなるガイダンスを提供するために、一定の用語を明細書で考察する。用語の任意の用途の範囲または意味は、用語が使用される特定の文脈から明らかであろう。
２．可溶性ＡＬＫ１ポリペプチド
天然に存在するＡＬＫ１タンパク質は膜貫通タンパク質であり、細胞の外側に存在するタンパク質部分（細胞外部分）および細胞内側に存在するタンパク質部分（細胞内部分）を有する。本開示の態様は、ＡＬＫ１の細胞外ドメインの一部を含むポリペプチドを含む。
【００４３】
一定の実施形態では、本開示は、「ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド」を提供する。用語「ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド」は、天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列（任意のシグナル配列およびシグナル配列のＮ末端配列が含まれ、または除外される）または天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも３３％、任意選択的に、天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドの細胞外ドメインの配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸３４〜９５のシステインｋｎｏｔ領域またはシステインｋｎｏｔ＋細胞外ドメインのＮ末端およびＣ末端のさらなるアミノ酸（配列番号１のアミノ酸２２〜１１８など）など）からなるかこれらを含むポリペプチドをいうことが意図される。同様に、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、配列番号２のヌクレオチド１００〜２８５またはストリンジェントなハイブリッド形成条件（一般に、かかる条件は当該分野で公知であるが、例えば、５０％ ｖ／ｖ ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％ ｗ／ｖ ブロッキング剤、０．１％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．３％ ＳＤＳにて６５℃で一晩のハイブリッド形成および、例えば、５×ＳＳＣ中で約６５℃での洗浄を含む）下でその相補物とハイブリッド形成するその静的変異体もしくは核酸によってコードされるポリペプチドを含むことができる。さらに、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、配列番号２のヌクレオチド６４〜３８４またはストリンジェントなハイブリッド形成条件（一般に、かかる条件は当該分野で公知であるが、例えば、５０％ ｖ／ｖ ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％ ｗ／ｖ ブロッキング剤、０．１％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．３％ ＳＤＳにて６５℃で一晩のハイブリッド形成および、例えば、５×ＳＳＣ中で約６５℃での洗浄を含む）下でその相補物とハイブリッド形成するその静的変異体もしくは核酸によってコードされるポリペプチドを含むことができる。したがって、用語「ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド」は、ＡＬＫ１ポリペプチドの単離細胞外部分、その変異体（例えば、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８に対応する配列中にわずか２、３、４、５、または１０個のアミノ酸の置換、付加、または欠失しか含まない変異体および配列番号１のアミノ酸３４〜９５に対応する配列中にたった２、３、４、５、または１０個のアミノ酸の置換、付加、または欠失しか含まない変異体が含まれる）、そのフラグメント、およびに任意の上記を含む融合タンパク質を含むが、いずれの場合にも、任意の上記のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、１つまたは複数のＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０に対する実質的な親和性を保持することが好ましいであろう。用語「ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド」は、任意の全長の天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドを除外することが明確に意図される。一般に、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、生物学的に関連する温度、ｐＨレベル、および浸透圧の水溶液中で溶解性を示すように設計されるであろう。
【００４４】
上記のように、本開示は、天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドと特定の程度の配列同一性または配列類似性を共有するＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを提供する。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列を、最適に比較されるように整列させる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較するために非相同配列を無視することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基を比較する。第１の配列中のある位置が第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基で占められている場合、分子は、その位置で同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸「同一性」は、アミノ酸「相同性」と等価である）。２つの配列間の配列同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した配列が共有する同一の位置の数の関数である。
【００４５】
配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントおよび類似率の決定を、数学アルゴリズムを使用して実施することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。
【００４６】
１つの実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して決定する。特定の実施形態では、以下のパラメータをＧＡＰプログラムで使用する：Ｂｌｏｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６のレングスウェイト。さらに別の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントを、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）中のＧＡＰプログラムを使用して決定する。パラメータの例には、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６のギャップレングスの使用が含まれる。他で指定しない限り、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列、ＧＡＰウェイト１０、ギャップレングス３を使用したＧＡＰプログラムを使用して決定する必要があり、かかるアルゴリズムが所望の同一性パーセントを計算できない場合、本明細書に開示の適切な代替法を選択する必要がある。
【００４７】
別の実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、ＰＡＭ１２０重み付け残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップレングスペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用した、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して決定する。
【００４８】
２つのアミノ酸配列間の最良の全アラインメントを決定するための別の実施形態を、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．，６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントでは、クエリーおよびサブジェクト配列は共にアミノ酸配列である。大域配列アラインメントの結果を、同一性パーセントで示す。１つの実施形態では、アミノ酸配列同一性を、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．，６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して行う。特定の実施形態では、アミノ酸アラインメントの同一性および類似性を計算するために使用されるパラメータは、以下を含む：行列＝ＰＡＭ １５０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティ＝１、ジョイニングペナルティ＝２０、ランダム化グループレングス＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、およびギャップサイズペナルティ＝０．０５。
【００４９】
一定の実施形態では、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１の配列などの天然に存在するＡＬＫ１タンパク質の細胞外部分および好ましくはＡＬＫ１細胞外ドメインのリガンド結合部分を含む。一定の実施形態では、可溶性ＡＬＫ１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一定の実施形態では、欠失細胞外ＡＬＫ１ポリペプチドは、配列番号１の細胞外部分のアミノ酸配列の少なくとも３０、４０、または５０個の連続的アミノ酸を含む。
【００５０】
好ましい実施形態では、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、１つまたは複数のＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０に結合する。任意選択的に、ＡＬＫ１ポリペプチドは、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３に実質的に結合しない。結合を、溶液または表面プラズモン共鳴系（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムなど）で精製タンパク質を使用して評価することができる。好ましい可溶性ＡＬＫ１ポリペプチドは、抗血管形成活性を示すであろう。血管形成阻害活性のためのバイオアッセイには、トリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ、マウス角膜マイクロポケットアッセイ、移植腫瘍に及ぼす単離タンパク質または合成タンパク質投与の効果を測定するためのアッセイが含まれる。ＣＡＭアッセイは、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，ら、「Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ」、Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．７９（２），Ｏｃｔ．１，１９９４，ｐｐ．３１５−３２８に記載されている。簡潔に述べれば、インタクトな卵黄を有する３日齢のニワトリ胚を卵から分離し、ペトリ皿に入れる。３日間のインキュベーション後、試験すべきタンパク質を含むメチルセルロースディスクを、各胚のＣＡＭに適用する。４８時間のインキュベーション後、胚およびＣＡＭを観察して、内皮成長が阻害されたかどうかを判断する。マウス角膜マイクロポケットアッセイは、疑われる内皮成長阻害剤を含む別のペレットと共に、成長因子含有ペレットをマウスの角膜中に移植し、角膜中に構成された毛細管パターンを観察する工程を含む。他のアッセイを、実施例に記載する。
【００５１】
ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを、ＡＬＫ１ポリペプチドの細胞質側末端および膜貫通領域の除去によって産生することができる。あるいは、膜貫通ドメインを、膜貫通ドメインを含む通常は疎水性のアミノ酸残基の欠失または親水性アミノ酸残基との置換によって不活化することができる。いずれにしても、実質的に親水性のハイドロパシープロフィールを作製する。それにより、脂質親和性が減少し、水溶性が改善されるであろう。親水性アミノ酸残基との置換より膜貫通ドメインの欠失が好ましい。これは、潜在的に免疫原性を示すエピトープの導入が回避されるからである。
【００５２】
ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、かなり多数の周知のリーダー配列をＮ末端にさらに含むことができる。かかる配列により、ポリペプチドが発現され、真核生物系の分泌経路に標的化されるであろう。例えば、Ｅｒｎｓｔらの米国特許第５，０８２，７８３号（１９９２）を参照のこと。あるいは、天然ＡＬＫ１シグナル配列を使用して、細胞から突出させることができる。有力なリーダー配列には、天然のｔＰａおよびミツバチメリチンリーダー（それぞれ配列番号７〜９）が含まれる。シグナルペプチドのプロセシングは、他の可変要素の中でも、選択したリーダー配列、使用した細胞型、および培養条件などに応じて変化し得る。したがって、成熟ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドの実際のＮ末端開始部位（配列番号５が含まれる）は、Ｎ末端方向またはＣ末端方向のいずれかに１〜５個のアミノ酸がシフトし得る。
【００５３】
一定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変化させるためのＡＬＫ１ポリペプチドの特異的変異を意図する。かかる変異を、１つまたは複数のグリコシル化部位（Ｏ結合またはＮ結合グリコシル化部位など）が導入または排除されるように選択することができる。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は、一般に、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列（アスパラギン−Ｘ−トレオニン（またはアスパラギン−Ｘ−セリン）（式中、「Ｘ」は、任意のアミノ酸である））を含む。１つまたは複数のセリン残基またはトレオニン残基の野生型ＡＬＫ１ポリペプチド（Ｏ結合グリコシル化部位について）の配列への付加または置換によって変化させることもできる。グリコシル化認識部位の第１または第３のアミノ酸位置の一方または両方での種々のアミノ酸の置換または欠失（および／または第２の位置でのアミノ酸欠失）により、修飾トリペプチド配列が非グリコシル化される。ＡＬＫ１ポリペプチド上の炭水化物部分数の別の増加手段は、ＡＬＫ１ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングである。使用したカップリング様式に応じて、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）遊離スルフヒドリル基（システインの遊離スルフヒドリル基など）；（ｄ）遊離ヒドロキシル基（セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基など）；（ｅ）芳香族基（フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの芳香族基など）；または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０号およびＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ（１９８１）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（本明細書において参考により組み込まれる）に記載されている。ＡＬＫ１ポリペプチド上に存在する１つまたは複数の炭水化物部分の除去を、化学的および／または酵素的に行うことができる。化学的脱グルコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのＡＬＫ１ポリペプチドの曝露を含むことができる。この処理により、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖が切断される一方で、アミノ酸配列がインタクトなままである。化学的脱グルコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２およびＥｄｇｅら（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１にさらに記載されている。Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０に記載のように、ＡＬＫ１ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断を、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって行うことができる。哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞の全てが異なるグリコシル化パターンを導入することができ、このグリコシル化パターンはペプチドのアミノ酸配列の影響を受け得るので、ＡＬＫ１ポリペプチド配列を、使用される発現系の型に依存して必要に応じて調整することができる。一般に、ヒトで用いるＡＬＫ１タンパク質を、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株（ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞株など）で発現するであろうが、他の哺乳動物発現細胞株、操作されたグリコシル化酵素を使用する酵母細胞株、および昆虫細胞も有用であると予想される。
【００５４】
本開示は、変異体、特にＡＬＫ１ポリペプチドの組み合わせ変異体組および欠失変異体の生成方法をさらに意図する。組み合わせ変異体のプールは、特に、機能的変異体配列の同定に有用である。かかるコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングの目的は、例えば、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用することができるか、あるいは、新規の活性を同時に保有するＡＬＫ１ポリペプチド変異体を生成することであり得る。種々のスクリーニングアッセイを以下に提供し、かかるアッセイを使用して変異体を評価することができる。例えば、ＡＬＫ１ポリペプチド変異体を、ＡＬＫ１リガンドに結合する能力、ＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１ポリペプチドへの結合を防止する能力、またはＡＬＫ１リガンドに起因するシグナル伝達を妨害する能力についてスクリーニングすることができる。ＡＬＫ１ポリペプチドまたはその変異体の活性を、細胞ベースのアッセイまたはインビボアッセイ、特に、実施例に開示の任意のアッセイで試験することもできる。
【００５５】
天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドの細胞外ドメインを含むＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドと比較して選択的効力または一般的に増加した効力を有する組み合わせ由来の変異体を生成することができる。同様に、変異誘発により、対応する野生型ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドと劇的に異なる血清半減期を有する変異体を得ることができる。例えば、タンパク質の変化は、未変性ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドが破壊、または消失もしくは不活化されるタンパク質分解または他の過程に対する安定性をより高くするか低くすることができる。かかる変異体および変異体をコードする遺伝子を使用して、ＡＬＫ１ポリペプチドの半減期の調整によってＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドレベルを変化させることができる。例えば、半減期の短縮によって生物学的影響をより一過性にすることができ、それにより、患者内の組換えＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドレベルをより強く制御することができる。Ｆｃ融合タンパク質では、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分を変異させて、タンパク質の半減期を変化させることができる。
【００５６】
潜在的なＡＬＫ１ポリペプチド配列の少なくとも一部をそれぞれ含むポリペプチドライブラリーをコードする遺伝子の縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ライブラリーによってコンビナトリアルライブラリーを産生することができる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、潜在的なＡＬＫ１ポリペプチドのヌクレオチド配列の縮重組が各ポリペプチド、あるいは、より大きな融合タンパク質組（例えば、ファージライブラリー用）として発現可能であるように、遺伝子配列に酵素的にライゲーションすることができる。
【００５７】
潜在的なＡＬＫ１ ＥＣＤ変異体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から生成することができる方法が多数存在する。縮重遺伝子配列を自動化ＤＮＡ合成機で化学合成し、次いで、合成遺伝子を発現に適切なベクターにライゲーションすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ Ａ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｅｄ．Ａ Ｇ Ｗａｌｔｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。かかる技術を、他のタンパク質の定向進化で使用することができる（例えば、Ｓｃｏｔｔら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号、および同第５，０９６，８１５号を参照のこと）。
【００５８】
あるいは、他の変異誘発型を使用してコンビナトリアルライブラリーを生成することができる。例えば、ＡＬＫ１ポリペプチド変異体を生成し、例えば、アラニンスキャニング変異誘発など（Ｒｕｆら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔら（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）、リンカースキャニング変異誘発（Ｇｕｓｔｉｎら（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３１６）；飽和変異誘発（Ｍｅｙｅｒｓら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１３）；ＰＣＲ変異誘発（Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １：１１−１９）；またはランダム変異誘発（化学的変異誘発など（Ｍｉｌｌｅｒら（１９９２）Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；およびＧｒｅｅｎｅｒら（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７：３２−３４）が含まれる）などを使用したスクリーニングによってライブラリーから単離することができる。特に組み合わせ設定におけるリンカースキャニング変異誘発は、欠失（生体活性）形態のＡＬＫ１ポリペプチドの魅力的な同定方法である。
【００５９】
点変異および欠失によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物のスクリーニング、さらに、一定の特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのための広範な技術が当該分野で公知である。かかる技術は、一般に、ＡＬＫ１ポリペプチドの組み合わせ変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合可能である。最も広範に使用されている巨大遺伝子ライブラリーのスクリーニング技術は、典型的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られたベクターライブラリーでの適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検出によってその産物が検出される遺伝子をコードするベクターの比較的簡潔な単離を容易にする条件下での組み合わせ遺伝子の発現を含む。好ましいアッセイには、ＡＬＫ１リガンド結合アッセイおよびリガンド媒介細胞シグナル伝達アッセイが含まれる。
【００６０】
一定の実施形態では、開示のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、ＡＬＫ１ポリペプチド中に天然に存在する任意の修飾に加えて翻訳後修飾をさらに含むことができる。かかる修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、これらに限定されない。結果として、修飾ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、非アミノ酸エレメント（ポリエチレングリコール、脂質、ポリサッカリドまたはモノサッカリド、およびリン酸塩など）を含むことができる。ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド機能に及ぼすかかる非アミノ酸エレメントの影響を、他のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド変異体について本明細書に記載のように試験することができる。ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを、初期形態のＡＬＫ１ポリペプチドの切断によって細胞中に産生する場合、翻訳後プロセシングはまた、タンパク質の正確な折り畳みおよび／または機能に重要であり得る。異なる細胞（ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３、またはＨＥＫ２９３など）は、かかる翻訳後活性についての特定の細胞機構および特徴的機構を有し、ＡＬＫ１ポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択することができる。
【００６１】
一定の態様では、機能的変異体または修飾形態のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドには、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドの少なくとも一部および１つまたは複数の融合ドメインを有する融合タンパク質が含まれる。かかる融合ドメインの周知の例には、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。所望の特性が付与されるように融合ドメインを選択することができる。例えば、いくつかの融合ドメインは、アフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティ精製のために、アフィニティクロマトグラフィのための関連マトリックス（グルタチオン、アミラーゼ、およびニッケルまたはコバルトに抱合した樹脂など）を使用する。多数のかかるマトリックスは、「キット」形態（（ＨＩＳ６）融合パートナーを使用して有用なＰｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システムおよびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）など）で利用可能である。別の例として、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドの検出を容易にするように融合ドメインを選択することができる。かかる検出ドメインの例には、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）ならびに特定の抗体が利用可能な通常は短いペプチド配列である「エピトープタグ」が含まれる。特異的モノクローナル抗体が容易に利用可能な周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃタグが含まれる。場合によっては、融合ドメインは、第Ｘａ因子またはトロンビンなどのためのプロテアーゼ切断部位を有する。このプロテアーゼ切断部位によって関連するプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それにより、融合タンパク質から組換えタンパク質を遊離することが可能である。次いで、遊離タンパク質を、その後のクロマトグラフィ分離によって融合ドメインから単離することができる。一定の好ましい実施形態では、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを、インビボでＡＬＫ１ポリペプチドを安定化するドメイン（「安定剤」ドメイン）と融合する。「安定化」は、破壊の減少、腎臓によるクリアランスの減少、または他の薬物動態学的影響に起因するかどうかに関係なく、血清半減期を増加させる全てのものを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合物は、広範なタンパク質に所望の薬物動態学的特性を付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合物は、望ましい特性を付与することができる。選択することができる他の融合ドメイン型には、多量体化（例えば、二量体化、三量体化）ドメインおよび機能的ドメインが含まれる。
【００６２】
特定の例として、本開示は、Ｆｃドメインに融合したＡＬＫ１の可溶性細胞外ドメインを含む融合タンパク質を提供する（例えば、配列番号６）。
【００６３】
【化４】
【００６４】
【化５】
任意選択的に、Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、リジン３２２、およびＡｓｎ−４３４などの残基に１つまたは複数の変異を有する。一定の例では、１つまたは複数のこれらの変異（例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を有する変異Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較してＦｃγ受容体への結合能力が減少する。他の場合、１つまたは複数のこれらの変異（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を有する変異Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較してＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ−受容体（ＦｃＲＮ）への結合能力が増加した。
【００６５】
融合タンパク質の異なるエレメントを所望の機能性と一致する任意の様式で処理することができると理解される。例えば、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを、異種ドメインのＣ末端に配置するか、異種ドメインをＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドのＣ末端に配置することができる。ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドドメインおよび異種ドメインは融合タンパク質に隣接する必要はなく、さらなるドメインまたはアミノ酸配列を、ドメインまたはドメインの間のいずれかのＣ末端またはＮ末端に含めることができる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「免疫グロブリンＦｃ領域」または簡潔に「Ｆｃ」は、免疫グロブリン鎖定常領域、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域、またはその一部のカルボキシル末端部分を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域との組み合わせを含むことができる。好ましい実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも１つの免疫グロブリンヒンジ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、好ましくはＣＨ１ドメインを欠く。
【００６７】
１つの実施形態では、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３、または４）である。他の免疫グロブリンクラス（ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）、およびＩｇＭ（Ｉｇμ））を使用することができる。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号に詳細に考察されている。特定の結果を達成するための一定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当業者のレベルの範囲内であると見なされる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の一部は、好ましくは、ヒンジドメインの少なくとも一部、好ましくはＦｃγのＣＨ３ドメインまたは任意のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ中の相同ドメインの少なくとも一部を含む。
【００６８】
さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失が本明細書に開示の方法の実施および組成物で有用であり得ることが意図される。１つの例は、上部ＣＨ２領域中にアミノ酸置換を導入してＦｃ受容体に対する親和性が減少したＦｃ変異体を作製することであろう（Ｃｏｌｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３６１３）。
【００６９】
一定の実施形態では、本開示は、他のタンパク質および／または他のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド種から単離されるか、これを実質的に含まない（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、または９９％含まない）単離および／または精製形態のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドを利用可能にする。
【００７０】
一定の実施形態では、開示は、ＡＬＫ１タンパク質の細胞外部分のコード配列を含む可溶性ＡＬＫ１ポリペプチドをコードする核酸を含む。さらなる実施形態では、本開示はまた、かかる核酸を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本開示のポリペプチドを、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母、または哺乳動物細胞中で発現することができる。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。したがって、本開示のいくつかの実施形態は、さらに、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドの産生方法に関する。配列番号３に記載のＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質およびＣＨＯ細胞中で発現したＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、強力な抗血管形成活性を有する。
【００７１】
ＤＡＮポリペプチド（野生型ＤＡＮの変異体が含まれる）およびＤＡＮタンパク質を含む融合タンパク質を生成し、ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質に関して上記のように特徴づけることができる。
３．ＡＬＫ１ポリペプチドをコードする核酸
一定の態様では、本開示は、任意のＡＬＫ１ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド）（本明細書中に開示のフラグメント、機能的変異体、および融合タンパク質が含まれる）をコードする単離および／または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号２は天然に存在するヒトＡＬＫ１前駆体ポリペプチドをコードする一方で、配列番号４はＩｇＧ１ Ｆｃドメインに融合したＡＬＫ１細胞外ドメインの前駆体をコードする。本核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。かかる核酸は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。これらの核酸を、例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドの作製方法で使用するか、直接的な治療薬（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、または遺伝子療法でのアプローチ）として使用することができる。
【００７２】
一定の態様では、ＡＬＫ１ポリペプチドをコードする本核酸は、配列番号２または４の変異体である核酸を含むとさらに理解される。変異体ヌクレオチド配列には、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失が異なる配列（対立遺伝子変異体など）が含まれる。
【００７３】
一定の実施形態では、本開示は、配列番号２または４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である単離または組換え核酸配列を提供する。当業者は、配列番号２または４に相補的な核酸配列および配列番号２または４の変異体も本開示の範囲内に含まれることを認識するであろう。さらなる実施形態では、開示の核酸配列は、単離、組み換えであり得、そして／または異種ヌクレオチド配列と融合することができるか、ＤＮＡライブラリー中に存在し得る。
【００７４】
他の実施形態では、開示の核酸には、高ストリンジェントな条件下で配列番号２または４中の指定されたヌクレオチド配列、配列番号２または４の相補配列、またはそのフラグメントとハイブリッド形成するヌクレオチド配列も含まれる。上記で考察されるように、当業者は、ＤＮＡハイブリッド形成を促進する適切なストリンジェンシー条件を変更することができることを容易に理解するであろう。当業者は、ＤＮＡハイブリッド形成を促進する適切なストリンジェンシー条件を変更することができることを容易に理解するであろう。例えば、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）における約４５℃でのハイブリッド形成およびその後の５０℃の２．０×ＳＳＣでの洗浄を実施することができる。例えば、洗浄工程における塩濃度を、５０℃での約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃での約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまでから選択することができる。さらに、洗浄工程中の温度を、室温（約２２℃）での低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増加させることができる。温度および塩の両方を変更することができるか、温度または塩濃度を一定に保持しながら、他の可変要素を変化させることができる。１つの実施形態では、室温の６×ＳＳＣの低ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成し、その後に室温の２×ＳＳＣで洗浄する核酸を提供する。
【００７５】
遺伝暗号の縮重によって配列番号２または４に記載の核酸と異なる単離核酸も、本開示の範囲内に含まれる。例えば、多数のアミノ酸は、１つを超えるトリプレットによって指定される。同一のアミノ酸を特定するコドン（すなわち、シノニム（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンのシノニムである））により、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「静的」変異が起こり得る。しかし、本タンパク質のアミノ酸配列を変化させるＤＮＡ配列多型が哺乳動物細胞間に存在すると予想される。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３〜５％まで）の変動が天然の対立遺伝子の変動によって所与の種の個体間に存在し得ることを認識するであろう。任意および全てのかかるヌクレオチドの変動および得られたアミノ酸多型は、本開示の範囲内である。
【００７６】
一定の実施形態では、開示の組換え核酸を、発現構築物中の１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結することができる。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に適切であろう。種々の宿主細胞のための多数の適切な発現ベクター型および適切な調節配列型が当該分野で公知である。典型的には、１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列には、プロモータ配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボゾーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、およびエンハンサ配列またはアクチベータ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。当該分野で公知の構成性プロモータおよび誘導性プロモータは、開示によって意図される。プロモータは、天然に存在するプロモータまたは１つを超えるプロモータのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモータのいずれかであり得る。発現構築物は、細胞または（ｏｎ）エピソーム（プラスミドなど）中に存在することができるか、発現構築物を染色体に挿入することができる。好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択可能な選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は当該分野で周知であり、使用される宿主細胞によって変化するであろう。
【００７７】
本明細書中に開示の一定の態様では、本核酸は、ＡＬＫ１ポリペプチドをコードし、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクター中に提供される。調節配列は当該分野で認識されており、ＡＬＫ１ポリペプチドの発現を指示するように選択される。したがって、用語「調節配列」には、プロモータ、エンハンサ、および他の発現調節エレメントが含まれる。調節配列の例は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。例えば、ＤＮＡ配列に作動可能に連結される場合、ＤＮＡ配列の発現を調節する任意の広範な種々の発現調節配列を、これらのベクター中で使用して、ＡＬＫ１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現することができる。かかる有用な発現調節配列には、例えば、ＳＶ４０の初期プロモータおよび後期プロモータ、ｔｅｔプロモータ、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルスの最初期プロモータ、ＲＳＶプロモータ、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系またはＴＲＣ系、その発現がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって指示されるＴ７プロモータ、λファージの主なオペレータ領域およびプロモータ領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホスファターゼのプロモータ（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α接合因子のプロモータ、バキュロウイルス系の多面体プロモータ、および原核細胞または真核細胞またはそのウイルスの遺伝子発現を調節することが公知の他の配列、ならびにその種々の組み合わせが含まれる。発現ベクターのデザインは形質転換すべき宿主細胞の選択および／または発現が望まれるタンパク質の型などの要因に依存し得ると理解すべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を調節する能力、およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（抗生物質マーカーなど）の発現も考慮すべきである。
【００７８】
開示に含まれる組換え核酸を、原核細胞、真核細胞（酵母、トリ、昆虫、または哺乳動物）、またはその両方のいずれかでの発現に適切なベクターへのクローン化した遺伝子またはその一部のライゲーションによって産生することができる。組換えＡＬＫ１ポリペプチド産生のための発現ビヒクルには、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、適切なベクターには、以下の型のプラスミドが含まれる：大腸菌などの原核細胞における発現のためのｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、およびｐＵＣ由来プラスミド。
【００７９】
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を容易にするための原核生物配列、および真核細胞中で発現する１つまたは複数の真核生物転写単位の両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、およびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかを、細菌プラスミド（ｐＢＲ３２２）由来の配列で修飾して、原核細胞および真核細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にする。あるいは、ウイルスの誘導体（ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来、およびｐ２０５）など）を、真核細胞中でのタンパク質の一過性発現のために使用することができる。他のウイルス（レトロウイルスが含まれる）発現系の例を、以下の遺伝子療法送達系の説明で見出すことができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換で使用される種々の方法は、当該分野で周知である。原核細胞および真核細胞の両方に適切な他の発現系および一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）を参照のこと。いくつかの例では、バキュロウイルス発現系の使用によって組換えポリペプチドを発現することが望ましい場合がある。かかるバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩなど）が含まれる。
【００８０】
好ましい実施形態では、ベクターを、ＣＨＯ細胞中での本ＡＬＫ１ポリペプチドの産生のために設計するであろう（Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）など）。明らかなように、本遺伝子構築物を使用して、培養物中で増殖した細胞中で本ＡＬＫ１ポリペプチドを発現させ、例えば、精製のためにタンパク質（融合タンパク質または変異タンパク質が含まれる）を産生することができる。
【００８１】
本開示はまた、１つまたは複数の本ＡＬＫ１ポリペプチドのコード配列（例えば、配列番号２または４）を含む組換え遺伝子でトランスフェクションした宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本明細書に開示のＡＬＫ１ポリペプチドを、細菌細胞（大腸菌など）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用）、酵母、または哺乳動物細胞中で発現することができる。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００８２】
したがって、本開示は、さらに、本ＡＬＫ１ポリペプチド（ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドが含まれる）の産生方法に関する。例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクションした宿主細胞を、ＡＬＫ１ポリペプチドの発現が生じるのに適切な条件下で培養することができる。ＡＬＫ１ポリペプチドを分泌させ、細胞とＡＬＫ１ポリペプチドを含む培地との混合物から単離することができる。あるいは、ＡＬＫ１ポリペプチドを、細胞質または膜画分に保持し、細胞を回収し、溶解し、タンパク質を単離することができる。細胞培養物には、宿主細胞、培地、および他の副生成物が含まれる。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。本ＡＬＫ１ポリペプチドを、当該分野で公知のタンパク質精製技術（イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、限外濾過、電気泳動、ＡＬＫ１ポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体を使用した免疫親和性精製、およびＡＬＫ１ポリペプチドに融合したドメインに結合する作用因子を使用したアフィニティ精製（例えば、プロテインＡカラムを使用してＡＬＫ１−Ｆｃ融合物を精製することができる）が含まれる）を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方から単離することができる。好ましい実施形態では、ＡＬＫ１ポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含む融合タンパク質である。好ましい実施形態では、一連のカラムクロマトグラフィ工程（例えば、３つ以上の以下が任意の順番で含まれる：プロテインＡクロマトグラフィ、Ｑセファロースクロマトグラフィ、フェニルセファロースクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、および陽イオン交換クロマトグラフィ）によって精製する。ウイルス濾過および緩衝液の交換を使用して、精製を完了することができる。
【００８３】
別の実施形態では、精製リーダー配列（所望の組換えＡＬＫ１ポリペプチド部分のＮ末端のポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列など）をコードする融合遺伝子により、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用したアフィニティクロマトグラフィによって発現した融合タンパク質を精製することができる。次いで、精製リーダー配列を、エンテロキナーゼでの処理によって除去して、精製ＡＬＫ１ポリペプチドを得ることができる（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら（１９８７）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８９７２を参照のこと）。
【００８４】
融合遺伝子の作製技術は周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの連結を、ライゲーションのための平滑末端またはスタガー（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を準備するための制限酵素消化、必要に応じて付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素ライゲーションを使用した従来技術にしたがって行う。別の実施形態では、融合遺伝子を、従来技術（自動化ＤＮＡ合成機が含まれる）によって合成することができる。あるいは、遺伝子フラグメントに、２つの連続遺伝子フラグメントの間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用し、その後にアニーリングしてキメラ遺伝子配列を生成することができるＰＣＲ増幅を行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。
【００８５】
ＡＬＫ１、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、またはＧＤＦ７のアンタゴニストである核酸化合物のカテゴリーの例には、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ構築物、および触媒核酸構築物が含まれる。核酸化合物は、一本鎖または二本鎖であり得る。二本鎖化合物には、鎖の一方または他方が一本鎖であるオーバーハングまたは非相補性の領域も含まれ得る。一本鎖化合物には、自己相補領域（化合物が、二重らせん構造領域を有する所謂「ヘアピン」構造または「ステム−ループ」構造を形成することを意味する）が含まれ得る。核酸化合物は、全長ＡＬＫ１核酸配列またはリガンド核酸配列のわずか１０００、わずか５００、わずか２５０、わずか１００、またはわずか５０、３５、３０、２５、２２、２０、または１８個のヌクレオチドからなる領域に相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。相補領域は、好ましくは少なくとも８ヌクレオチド、任意選択的に少なくとも１０または少なくとも１５ヌクレオチド、任意選択的に１５ヌクレオチドと２５ヌクレオチドとの間であろう。相補領域は、標的転写物のイントロン、コード配列、または非コード配列（コード配列部分など）内に含まれ得る。一般に、核酸化合物は、約８〜約５００ヌクレオチド長または塩基対長であり、任意選択的に、長さは約１４〜約５０ヌクレオチドであろう。核酸は、ＤＮＡ（特に、アンチセンスとしての使用のため）、ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドであり得る。任意の１つの鎖には、ＤＮＡとＲＮＡとの混合物およびＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとして容易に分類できない修飾形態が含まれ得る。同様に、二本鎖化合物は、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＲＮＡであり得る。任意の１つの鎖には、ＤＮＡとＲＮＡとの混合物およびＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとして容易に分類できない修飾形態も含まれ得る。核酸化合物には、任意の種々の修飾（骨格（天然の核酸中の糖−リン酸部分（ヌクレオチド間結合が含まれる））または塩基部分（天然の核酸のプリンまたはピリミジン部分）に対する１つまたは複数の修飾が含まれる）を含み得る。アンチセンス核酸化合物は、好ましくは、約１５〜約３０ヌクレオチド長であり、しばしば、血清、細胞、または化合物が送達される可能性が高い場所（経口送達化合物の場合の胃および吸入化合物のための肺）での安定性などの特徴を改善するための１つまたは複数の修飾を含むであろう。ＲＮＡｉ構築物の場合、標的転写物に相補的な鎖は、一般に、ＲＮＡまたはその修飾物であろう。他の鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または任意の他のバリエーションであり得る。二本鎖または一本鎖の「ヘアピン」ＲＮＡｉ構築物の二重鎖部分は、ダイサー基質としての役割を果たす限り、好ましくは１８〜４０ヌクレオチド長、任意選択的に約２１〜２３ヌクレオチド長であろう。触媒核酸または酵素核酸は、リボザイムまたはＤＮＡ酵素であり得、修飾形態も含むことができる。核酸化合物は、生理学的条件下および非センスコントロールまたはセンスコントロールがほとんどまたは全く影響を及ぼさない濃度で細胞に接触した場合、約５０％、７５％、９０％、またはそれを超えて標的の発現を阻害することができる。核酸化合物の影響を試験するための好ましい濃度は、１、５、および１０マイクロモルである。核酸化合物を、例えば、血管形成に及ぼす影響について試験することもできる。
【００８６】
ＤＡＮポリペプチド（野生型ＤＡＮの変異体が含まれる）をコードする核酸およびＤＡＮタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を生成し、上記に記載のように、ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質をコードする核酸に関して特徴づけることができる。
４．抗体
開示の別の態様は、ＡＬＫ１ポリペプチドの細胞外部分と反応する抗体、好ましくは、ＡＬＫ１ポリペプチドと特異的に反応する抗体に関する。好ましい実施形態では、かかる抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ−９、またはＢＭＰ−１０などのリガンドへのＡＬＫ１結合を妨害することができる。ＡＬＫ１のリガンドに対する抗体が成熟したプロセシング形態の関連タンパク質に結合すべきであると理解されるであろう。開示はまた、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、および／またはＢＭＰ１０に結合してかかるリガンドへのＡＬＫ１の結合を阻害する抗体も提供する。好ましい抗体は、バイオアッセイ（ＣＡＭアッセイまたは角膜マイクロポケットアッセイ（上記を参照のこと）など）において抗血管形成活性を示すであろう。
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、例えば、任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）の全抗体が含まれ、選択された抗原との反応性を示す免疫グロブリンのフラグメントまたはドメインが含まれることを意図する。抗体を、従来技術を使用して断片化し、フラグメントを有用性および／または目的の特異的エピトープとの反応についてスクリーニングすることができる。したがって、この用語には、一定のタンパク質と選択的に反応することができる抗体分子のタンパク質分解部分または組換えによって調製された部分のセグメントが含まれる。かかるタンパク質分解フラグメントおよび／または組換えフラグメントの非限定例には、ペプチドリンカーによって連結したＶ［Ｌ］ドメインおよび／またはＶ［Ｈ］ドメインを含むＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、および単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる。ｓｃＦｖを共有結合または非共有結合して、２つ以上の結合部位を有する抗体を形成することができる。用語「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または抗体および組換え抗体の他の精製調製物も含まれる。用語「組換え抗体」は、分子生物学技術を使用して構築した核酸から発現される抗体または免疫グロブリンの抗原結合ドメイン（単鎖抗体から構築したヒト化抗体または全ヒト抗体など）を意味する。１つのドメインおよび単鎖抗体も、用語「組換え抗体」に含まれる。
【００８８】
抗体を、当該分野で公知の任意の種々の方法（動物への抗原の投与、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する動物への抗原の投与、または抗体（しばしば、単鎖抗体または抗体ドメイン）のライブラリーに対する抗原を使用したスクリーニングが含まれる）によって生成することができる。抗原結合活性が検出されると、タンパク質の関連部分を他の抗体フレームワーク（全長ＩｇＧフレームワークが含まれる）にグラフティングすることができる。例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはＡＬＫ１リガンド由来の免疫原の使用により、標準的プロトコールによって抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体を作製することができる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｅｄ．ｂｙ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照のこと）。マウス、ハムスター、またはウサギなどの哺乳動物を、ペプチドの免疫原性形態（例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドもしくは抗体応答を誘発することができる抗原性フラグメントまたは融合タンパク質）で免疫化することができる。タンパク質またはペプチドの免疫原性を付与する技術には、担体への抱合または当該分野で周知の他の技術が含まれる。ＡＬＫ１ポリペプチドの抗原性部分（好ましくは、細胞外部分）を、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行を、血漿または血清中の抗体力価の検出によってモニタリングすることができる。標準的なＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイを、抗体レベルを評価するための抗原としての免疫原と共に使用することができる。
【００８９】
ＡＬＫ１ポリペプチドの抗原性調製物での動物の免疫化後、抗ＡＬＫ１抗血清を得ることができ、必要に応じて、ポリクローナル抗ＡＬＫ１抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫化動物から採取し、骨髄腫細胞などの不死化細胞を使用した標準的な体細胞融合手順によって融合して、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。かかる技術は当該分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７によって最初に開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６）が含まれる。ハイブリドーマ細胞を、本開示の哺乳動物ＡＬＫ１ポリペプチドおよびかかるハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離したモノクローナル抗体と特異的反応性を示す抗体の産生について免疫学的にスクリーニングすることができる。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、本ＡＬＫ１ポリペプチドの１つとも特異的反応性を示すそのフラグメントが含まれることが意図される。抗体を、従来技術を使用して断片化し、フラグメントを上記様式において全抗体の有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ（ａｂ）２フラグメントを、ペプシンでの抗体の処理によって生成することができる。得られたＦ（ａｂ）２フラグメントを処理してジスルフィド架橋を還元して、Ｆａｂフラグメントを産生することができる。本開示の抗体は、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって付与されたＡＬＫ１ポリペプチドに対する親和性を有する二重特異性分子、単鎖分子、キメラ分子、およびヒト化分子が含まれることをさらに意図する。好ましい実施形態では、抗体は、抗体に結合して検出することができる標識（例えば、標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）をさらに含む。
【００９１】
一定の好ましい実施形態では、本開示の抗体は、組換え抗体、特に、ヒト化モノクローナル抗体または全組換え抗体である。
【００９２】
抗体に関して使用する場合、形容詞「〜と特異的反応性を示す」は、当該分野で一般的に理解されるように、抗体が目的の抗原（例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはＡＬＫ１リガンド）と目的としない他の抗原との間で十分な選択性を示し、抗体が最低限でも特定の生体サンプル型中の目的の抗原の存在に検出に有用であることを意味することが意図される。抗体を使用した一定の方法では、抗体結合特異性度がより高いことが望ましい場合がある。例えば、存在量が非常に多い１つまたは複数の目的としないタンパク質の存在下での存在量が少ない目的のタンパク質の検出で使用される抗体は、抗体が目的の抗原と他の交差反応物との間により高い選択性を有する場合より良好に作用することができる。モノクローナル抗体は、一般に、（ポリクローナル抗体と比較して）所望の抗原と交差反応ポリペプチドとを効率的に区別する傾向がより高い。さらに、１つのサンプル型（例えば、糞便サンプル）中の目的の抗原の選択的同定に有効な抗体は、異なる生体サンプル型（例えば、血液サンプル）中の同一抗原の選択的同定に同程度に有効でない場合がある。同様に、他の生体夾雑物を欠く精製タンパク質調製物中の目的の抗原の同定に有効な抗体は、粗生体サンプル（血液サンプルまたは尿サンプルなど）中の目的の抗原の同定に同程度に有効でない場合がある。したがって、好ましい実施形態では、本願は、抗体使用に選択されるサンプル型である可能性が高いサンプル型中の目的の抗原に対する特異性が証明された抗体を提供する。
【００９３】
抗体：抗原相互作用の特異性に影響を及ぼす１つの特徴は、抗原に対する抗体の親和性である。所望の特異性が異なる親和性の範囲に到達することができるにもかかわらず、一般に好ましい抗体は、約１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、またはそれ未満の親和性（解離定数）を有するであろう。ＡＬＫ１に対するＴＧＦβの結合親和性が明らかに低い場合、多くの抗ＡＬＫ１抗体はＴＧＦβ結合を阻害すると予想される。しかし、リガンドのＧＤＦ５、６、７群は、約５×１０−８ＭのＫＤで結合し、ＢＭＰ９、１０リガンドは約１×１０−１０ＭのＫＤで結合する。したがって、適切な親和性の抗体を、これらのリガンドのシグナル伝達活性を妨害するように選択することができる。
【００９４】
さらに、所望の抗体を同定するために抗体をスクリーニングするために使用される技術は、得られた抗体の性質に影響を及ぼし得る。例えば、一定の治療目的のために使用される抗体は、好ましくは、特定の細胞型を標的化することができるであろう。したがって、この抗体型を得るために、目的の抗原を発現する細胞に結合する抗体をスクリーニングすることが望ましい場合がある（例えば、蛍光活性化細胞分類による）。同様に、抗体が溶液中の抗原結合のための使用される場合、溶液結合を試験することが望ましい場合がある。種々の異なる技術は、特定の望ましい抗体を同定するための抗体：抗原相互作用の試験に利用可能である。かかる技術には、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ，Ｂｉａ−ｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．の常磁性ビーズ系）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、および免疫組織化学が含まれる。
５．抗体およびＦｃ−融合タンパク質の変化
本願は、さらに、操作されたＦｃ領域または変異体Ｆｃ領域を有する抗体、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質、およびＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。かかる抗体およびＦｃ融合タンパク質は、例えば、エフェクタ機能（抗原依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）など）の調整で有用であり得る。さらに、修飾により、抗体およびＦｃ融合タンパク質の安定性を改良することができる。抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列変異体を、ＤＮＡへの適切なヌクレオチド変化の導入またはペプチド合成によって調製する。かかる変異体には、例えば、本明細書に開示の抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換が含まれる。欠失、挿入、および置換を任意に組み合わせて最終構築物に到達させるが、最終構築物は所望の特徴を有するものとする。アミノ酸の変化は、抗体およびＦｃ融合タンパク質の翻訳後プロセスを変化させることもできる（グリコシル化部位の数および位置の変化など）。
【００９５】
エフェクタ機能が減少した抗体およびＦｃ融合タンパク質を、アミノ酸配列の変化の導入によって産生することができる（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅら（ＷＯ９４／２８０２７号およびＷＯ９８／４７５３１号を参照のこと、Ｘｕら、２０００ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００；１６−２６も参照のこと）に記載のＡｌａ−Ａｌａ変異が含まれるが、これに限定されない）。したがって、一定の実施形態では、定常領域内に変異（Ａｌａ−Ａｌａ変異が含まれる）を有する開示の抗体およびＦｃ融合タンパク質を使用して、エフェクタ機能を減少または排除することができる。これらの実施形態にしたがって、抗体およびＦｃ融合タンパク質は、２３４位のアラニンへの変異、２３５位のアラニンへの変異、またはその組み合わせを含むことができる。１つの実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質はＩｇＧ４フレームワークを含み、ここで、Ａｌａ−Ａｌａ変異が２３４位のフェニルアラニンからアラニンへの変異および／または２３５位のロイシンからアラニンへの変異を示すであろう。別の実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質はＩｇＧ１フレームワークを含み、ここで、Ａｌａ−Ａｌａ変異は２３４位のロイシンからアラニンへの変異および／または２３５位のロイシンからアラニンへの変異を示すであろう。抗体またはＦｃ融合タンパク質は、他の変異（ＣＨ２ドメイン中の点変異Ｋ３２２Ａが含まれる）を二者択一的またはさらに保有することができる（Ｈｅｚａｒｅｈら、２００１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１２１６１−８）。
【００９６】
特定の実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質を修飾して、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を増強または阻害することができる。ＣＤＣ活性を、Ｆｃ領域中の１つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、または欠失によって調整することができる（例えば、米国特許第６，１９４，５５１号を参照のこと）。あるいはまたはさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域中に鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能である。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、内在化能力を改良または減少した場合があり、そして／または補体媒介性細胞死滅を増加または減少した場合がある。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２），ＷＯ９９／５１６４２号，Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＷＯ９４／２９３５１号を参照のこと。
６．血管形成および一定の障害を調整するための方法および組成物
本開示は、有効量のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド（ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質など）、ＤＡＮタンパク質（ＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質など）、または本明細書に開示の抗体（ＡＬＫ１のＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、またはＥＣＤに対する抗体など）、またはその後に集合的に「治療薬」と呼ばれる上記のいずれかの核酸アンタゴニスト（例えば、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡ）の被験体への投与による、哺乳動物の血管形成を阻害する方法を提供する。示したデータは、本明細書に開示の抗血管形成治療薬を使用して哺乳動物の眼の血管形成を阻害することができることを詳細に示す。これらの治療薬は骨および関節ならびに腫瘍（特に、骨および関節に関連する腫瘍）の血管形成の阻害でも有用であると予想される。
【００９７】
血管形成関連疾患には、血管形成依存性癌（例えば、固形腫瘍、血行性腫瘍（白血病など）、腫瘍転移が含まれる）；良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫など）；関節リウマチ；乾癬；皮膚紅潮；オスラー−ウェバー症候群；心筋血管形成；プラーク心血管新生；毛細血管拡張症；血友病性関節（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｃ ｊｏｉｎｔ）；および血管線維腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
特に、本開示のポリペプチド治療薬は、癌（腫瘍）（特に、成長を補助するために血管形成過程に依存することが公知である癌など）の治療または防止に有用である。ほとんどの抗血管新生薬と異なり、ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドは、複数の要因によって刺激される血管形成に影響を及ぼす。癌が頻繁に腫瘍血管形成を補助する複数の要因を必要とする場合、これは癌と非常に関連する。したがって、本明細書に開示の治療薬は、特に、単一の血管新生因子を標的化する薬物（例えば、ＶＥＧＦを標的化するベバシズマブ）での治療に耐性を示す腫瘍の治療で特に有効であろう。本明細書で証明するように、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、多発性骨髄腫の病理学的影響の減少で有用である。多発性骨髄腫は、有意な血管形成成分を含む癌として広く認識されている。したがって、本明細書に開示のＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質および他の治療薬は、多発性骨髄腫および骨に関連する他の腫瘍の治療で有用であろう。本明細書で証明されるように、本明細書に開示の治療薬を使用して、多発性骨髄腫に関連する骨損傷を改善することができ、従って、これを使用して他の腫瘍（乳房腫瘍および前立腺腫瘍など）の骨転移に関連する骨損傷を改善することができる。本明細書に記載するように、ＧＤＦ５−７リガンドは、骨中で高度に発現し、いかなる特定の機構にも制限されることを望んでいないが、これらのリガンドの干渉によって骨中の腫瘍発達に必要な過程を破壊することができる。
【００９９】
かかる方法の一定の実施形態では、１つまたは複数のポリペプチド治療薬を、共に（同時に）または異なる時間に（連続的に）投与することができる。さらに、ポリペプチド治療薬を、癌治療または血管形成阻害のための別の化合物型と共に投与することができる。
【０１００】
一定の実施形態では、開示の方法を単独で使用することができる。あるいは、本方法を、増殖性障害（例えば、腫瘍）の治療または防止を指示する他の従来の抗癌治療アプローチと組み合わせて使用することができる。例えば、かかる方法を、癌予防、癌再発および術後転移の防止、ならびに他の従来の癌療法の補助として使用することができる。本開示は、本ポリペプチド治療薬の使用によって、従来の癌療法（化学療法、放射線療法、光療法、免疫療法、および手術）の効果を増強することができることを認識する。
【０１０１】
広範な一連の従来の化合物は、新生物活性を有することが示されている。これらの化合物を、固形腫瘍の萎縮、転移およびさらなる成長の防止、または白血性もしくは骨髄性の悪性疾患における悪性細胞数の減少のために化学療法で薬物として使用されている。化学療法は種々の悪性疾患型の治療で有効であるが、多くの抗新生物化合物は望ましくない副作用を誘導する。２つ以上の異なる治療を組み合わせる場合、治療は相乗的に作用し、各治療薬の投薬量を減少させ、それにより、より高い投薬量で各化合物によって発揮される有害な副作用を減少させることができることが示されている。他の例では、治療無反応性の悪性疾患は、２つ以上の異なる治療を使用した併用療法に応答し得る。
【０１０２】
本明細書に開示のポリペプチド治療薬を、別の従来の抗新生物薬と組み合わせて同時または連続的に投与する場合、かかる治療薬は抗新生物薬の治療効果を増強し、または、かかる抗新生物薬に対する細胞耐性を克服することができる。これにより、抗新生物薬の投薬量が減少し、それにより、望ましくない副作用が軽減され、または耐性細胞における抗新生物薬の有効性が回復される。
【０１０３】
本開示によれば、本明細書に記載の抗血管新生薬を、疾患治療のための他の組成物および手順と組み合わせて使用することができる。例えば、腫瘍を、従来のように、ＡＬＫ１またはＡＬＫ１リガンドアンタゴニストと組み合わせた手術、照射、または化学療法で治療し、次いで、アンタゴニストを患者に投与して、微小転移の休止期間を延長し、任意の残留原発性腫瘍を安定化することができる。
【０１０４】
血管形成阻害剤を、新規の癌または再発癌を発症するリスクが高いことが公知の個体に予防的に投与することもできる。したがって、開示の態様は、有効量のＡＬＫ１またはＡＬＫ１リガンドアンタゴニストおよび／またはその誘導体、または本開示の別の血管形成阻害剤を被験体に投与する工程を含む、被験体の癌の防止方法を含む。
【０１０５】
本明細書で証明されるように、ＡＬＫ１−Ｆｃは、関節リウマチのマウスモデルの表現型の縮小に有効である。したがって、本明細書に開示の治療薬を、関節リウマチおよび他の骨または関節の炎症型の治療のために使用することができる。
【０１０６】
一定の正常な生理学的過程（例えば、排卵、月経、および胎盤形成）も、血管形成に関連する。本開示の血管形成阻害タンパク質は、内皮細胞が過剰または異常に刺激される疾患の治療で有用である。これらの疾患には、腸管癒着症、アテローム性動脈硬化症、強皮症、および肥厚性瘢痕（すなわち、ケロイド）が含まれるが、これらに限定されない。これらは、ネコ引っ掻き病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）および潰瘍（ピロリ菌）などの病理学的結果として血管形成を有する疾患の治療でも有用である。
【０１０７】
一般的な血管形成阻害タンパク質を、胚着床に必要な子宮脈管形成の減少または防止による産児制限薬として使用することができる。したがって、本開示は、胚着床の防止に十分な阻害タンパク質量を女性に投与する場合の有効な産児制限方法を提供する。産児制限方法の１つの態様では、胚着床の遮断に十分なタンパク質の阻害量を性交渉および受精が起こる前または後に投与するので、有効な産児制限方法（おそらく、翌朝（ｍｏｒｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ）法）を提供する。この記述に拘束されることを望まないが、子宮内膜の脈管形成の阻害が胚盤胞の着床を妨害すると考えられる。卵管粘膜の類似の脈管形成阻害は、胚盤胞の着床を妨害し、卵管妊娠の発症を防止する。投与方法には、丸薬、注射（静脈内、皮下、筋肉内）、座剤、膣スポンジ、膣タンポン、および子宮内デバイスが含まれるが、これらに限定されない。本開示の血管形成阻害剤の投与が胎盤の正常な脈管形成の増強を妨害し、首尾よく着床した胚盤胞内の血管の発達ならびに胚および胎児の発達も妨害するとも考えられる。
【０１０８】
眼では、血管形成は、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、および水晶体後線維増殖に関連する。本明細書に開示の治療薬を、眼内に投与するか、眼の他の局所投与によって投与することができる。さらに、実施例に示すように、ＡＬＫ１−Ｆｃを全身投与することができ、それでも依然として眼の血管形成に所望の効果を有する。
【０１０９】
眼の血管形成に関連する他の疾患には、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズの過装着、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片乾性角膜炎、シェーグレン、紅斑性座瘡、フィレクテヌロシス（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学火傷（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｕｍｓ）、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状ヘルペス感染、原生動物感染、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角膜炎（ｍａｒｉｇｉｎａｌ ｋｅｒａｔｏｌｙｓｉｓ）、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性動脈炎、外傷、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンス・ジョンソン病、類天疱瘡放射状角膜切開、および角膜移植片拒絶、鎌状赤血球貧血、サルコイド、弾力線維性偽性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、イールス病、ベーチェット病、網膜炎または脈絡膜炎を生じる感染、推定眼ヒストプラズマ症、ベスト病、近視、視窩、スターガート病、毛様体扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠血症候群、トキソプラズマ症、外傷、およびレーザー後合併症が含まれるが、これらに限定されない。他の疾患には、皮膚紅潮に関連する疾患（肋骨角の新血管新生）および線維性血管または線維組織の異常な増殖によって生じる疾患（全ての増殖性硝子体網膜症形態が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
眼の容態を、例えば、治療薬の全身注射、局所注射、眼内注射、または治療薬を放出する徐放性デバイスの挿入によって治療または防止することができる。化合物が角膜および眼の内部領域（例えば、前眼房、後眼房、硝子体、眼房水、硝子体液、角膜、虹彩／睫毛、レンズ、脈絡膜／網膜、および強膜）を貫通するのに十分な期間、化合物が眼表面と接触するように、治療薬を薬学的に許容可能な眼科ビヒクル中で送達させることができる。薬学的に許容可能な眼科ビヒクルは、例えば、軟膏、植物油、またはカプセル化材料であり得る。あるいは、開示の治療薬を、硝子体液および房水に直接注射することができる。さらに別では、化合物を、眼の治療のために静脈内注入または注射などによって全身投与することができる。
【０１１１】
１つまたは複数の治療薬を投与することができる。開示の方法は、眼の容態を治療するために使用される他の薬物との同時投与も含む。１つを超える薬剤または薬剤と薬物との組み合わせを投与する場合、同時または時間内に連続的に投与することができる。治療薬および／または薬物を、異なる投与経路または同一の投与経路によって投与することができる。１つの実施形態では、治療薬および薬物を、眼科薬学的処方物中で共に投与する。
【０１１２】
１つの実施形態では、治療薬を使用して、薬理学的機構によって血管形成を遮断するように作用する他の薬物との同時投与によって眼の血管形成に関連する疾患を治療する。開示の治療薬と同時に投与することができる薬物には、ペガプタニブ（マクゲン（商標））、ラニビズマブ（ルセンチス（商標））、乳酸スクアラミン（エビゾン（Ｅｖｉｚｏｎ）（商標））、ヘパリナーゼ、および糖質コルチコイド（例えば、トリアムシノロン）が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、少なくとも１つの本明細書に開示の治療薬および少なくとも１つの以下の薬物を含む眼科薬学的処方物の投与によって治療される血管形成に関連する疾患の治療方法を提供する：ペガプタニブ（マクゲン（商標））、ラニビズマブ（ルセンチス（商標））、乳酸スクアラミン（エビゾン（商標））、ヘパリナーゼ、および糖質コルチコイド（例えば、トリアムシノロン）。
７．処方物および有効用量
本明細書に記載の治療薬を薬学的組成物に処方することができる。本開示にしたがって使用する薬学的組成物を、１つまたは複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を使用した従来の様式で処方することができる。かかる処方物は、一般に、ほとんどの規制基準に従って実質的に発熱物質を含まない。
【０１１３】
一定の実施形態では、開示の治療方法は、組成物の全身投与または移植片もしくはデバイスとしての局所投与を含む。投与する場合、本開示で使用する治療組成物は、発熱物質を含まない生理学的に許容可能な形態である。本明細書に開示の方法において、任意選択的に上記組成物中にも含まれ得るＡＬＫ１シグナル伝達アンタゴニスト以外の治療的に有用な薬剤を、本化合物（例えば、本明細書に開示のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドまたは任意の抗体）と同時または連続的に投与することができる。
【０１１４】
典型的には、本明細書に開示のタンパク質治療薬を、非経口、特に静脈内または皮下に投与するであろう。非経口投与に適切な薬学的組成物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、処方物を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質、懸濁液、または増粘剤を含むことができる１つまたは複数の薬学的に許容可能な滅菌等張水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液、または乳濁液、または使用直前に滅菌注射液もしくは分散液で再構成することができる滅菌粉末と組み合わせた１つまたは複数のＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドまたは他の抗体を含むことができる。開示の薬学的組成物中で使用することができる適切な水性および非水性の担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、植物油（オリーブ油）、注射用有機エステル（オレイン酸エチルなど）が含まれる。例えば、レシチンなどのコーティング物質、分散液の場合の必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。
【０１１５】
１つの実施形態では、本明細書に開示の抗体およびＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質を、眼科薬学的処方物中で投与することができる。いくつかの実施形態では、眼科薬学的処方物は、滅菌水溶液（注射に適切な濃度が好ましい）、または蝋膏もしくは軟膏である。かかる蝋膏または軟膏は、典型的には、滅菌された薬学的に許容可能な蝋膏または軟膏の基剤（鉱物油−白色ワセリン基剤）中に溶解または懸濁した本明細書に開示の１つまたは複数の抗体またはＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質を含む。蝋膏または軟膏組成物では、無水ラノリンも処方放物に含めることができる。抗菌薬としてチロメサールまたはクロロブタノールを、かかる軟膏組成物に添加することも好ましい。１つの実施形態では、滅菌水溶液は、米国特許第６，０７１，９５８号に記載されている。
【０１１６】
本開示は、ｐＨを調整するための酸および塩基、狭い範囲内にｐＨを維持するための緩衝剤を含むように変化することができる処方物を提供する。さらなる薬物を処方物に添加することができる。これらには、ペガプタニブ、ヘパリナーゼ、ラニビズマブ、または糖質コルチコイドが含まれるが、これらに限定されない。本開示の眼科薬学的処方物を、無菌操作法によって調製するか、または適切な調製段階で滅菌する。
【０１１７】
組成物および処方物は、所望により、有効成分を含む１つまたは複数の単位投薬形態を含むことができるパックまたは分注デバイス中に存在することができる。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイル（ブリスターパックなど）を含むことができる。パックまたは分注デバイスは、投与説明書を添付することができる。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１）ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現
出願人は、ヒトＦｃに融合したヒトＡＬＫ１またはマウスＦｃドメインに融合したマウスＡＬＫ１（その間に最小のリンカーを有する）の細胞外ドメインを有する可溶性ＡＬＫ１融合タンパク質を構築した。構築物を、それぞれ、ｈＡＬＫ１−ＦｃおよびｍＡＬＫ１−Ｆｃと呼ぶ。
【０１１９】
ＣＨＯ細胞株から精製されるｈＡＬＫ１−Ｆｃを、図３に示す。特に、ヒトＡＬＫ１タンパク質の細胞外ドメインの従来のＣ末端が配列番号１のアミノ酸１１８である一方で、本発明者らは、グルタミン残基で終結するドメインを有するのを回避することが望ましいと判断した。したがって、ヒトＡＬＫ１由来の配列番号３の一部は、Ｑ１１８に対してＣ末端に２つの残基（ロイシンおよびアラニン）を組み込む。したがって、本開示は、Ｑ１１８の１〜５アミノ酸上流（配列番号１に対して１１３〜１１７）または下流（１１９〜１２３）のどこかであるＡＬＫ１由来の配列のｃ末端を有するＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチド（Ｆｃ融合タンパク質が含まれる）を提供する。
【０１２０】
ｈＡＬＫ１−ＦｃおよびｍＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質を、ＣＨＯ細胞株中で発現した。以下の３つの異なるリーダー配列を考慮した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号７）
（ｉｉ）組織プラスミノゲンアクチベータ（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号８）
（ｉｉｉ）未変性：ＭＴＬＧＳＰＲＫＧＬＬＭＬＬＭＡＬＶＴＱＧ（配列番号９）。
【０１２１】
選択された形態はＴＰＡリーダーを使用し、図４に示す非プロセシングアミノ酸配列を有する（配列番号５）。
【０１２２】
このポリペプチドは、図４に示す核酸配列によってコードされる（配列番号４）。
【０１２３】
一連のカラムクロマトグラフィ工程（例えば、３つ以上の以下が任意の順番で含まれる：プロテインＡクロマトグラフィ、Ｑセファロースクロマトグラフィ、フェニルセファロースクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、および陽イオン交換クロマトグラフィ）によって精製することができる。ウイルス濾過および緩衝液の交換を使用して、精製を完了することができる。ｈＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィによって決定したところ９８％超の純度、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定したところ９５％超に精製した。
【０１２４】
（実施例２）ＡＬＫ１−Ｆｃリガンドの同定
ＡＬＫ１は、ＴＧＦβファミリーメンバーの１型受容体である。ＴＧＦβファミリーの種々のメンバーを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムを使用して、ヒトＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質への結合について試験した。ＴＧＦβ自体、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ２、およびＢＭＰ４は全て、ｈＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質への実質的結合を示すことができなかった。ＢＭＰ２およびＢＭＰ４は、制限された結合を示した。ＧＤＦ５、ＧＤＦ７、およびＢＭＰ９は、それぞれ、５×１０−８Ｍ、５×１０−８Ｍ、および１×１０−１０ＭのＫＤ値の結合を示した。ＧＤＦ５およびＧＤＦ７のＧＤＦ６との類似性に基づいて、ＧＤＦ６が類似の親和性で結合すると予想される。ＢＭＰ１０は、ＢＭＰ９と密接に関連し、類似の親和性で結合することも予想される。
【０１２５】
（実施例３）内皮細胞に及ぼすＡＬＫ１−Ｆｃおよび抗ＡＬＫ１抗体の影響の特徴づけ
Ｓｍａｄ１／５／８媒介シグナル伝達に応答する４つの連続コンセンサスＳＢＥ部位の調節下でルシフェラーゼレポータ構築物（ＳＢＥ４−ｌｕｃ）を使用して、本発明者らは、ＨＭＶＥＣ細胞中のｈＡＬＫ１−Ｆｃ薬または中和ＡＬＫ１特異的モノクローナル抗体の存在下および不在下でのＢＭＰ−９媒介性活性を測定した。ＨＭＶＥＣ細胞を、ｒｈＢＭＰ−９（５０ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、それにより、Ｓｍａｄ１／５／８媒介性転写活性化が誘導され、ＳＢＥ４−ｌｕｃ調整転写上方制御の増加によってここで証明された。添加する場合、ｈＡＬＫ１−Ｆｃ化合物（１０μｇ／ｍｌ）または抗体（１０μｇ／ｍｌ）はこの転写応答を減少させ（それぞれ、約６０％）、ＡＬＫ１−Ｆｃの存在がＢＭＰ９シグナル伝達を有意に減少させ、さらに、ＢＭＰ９シグナル伝達がＡＬＫ１活性に関連することを示す。
【０１２６】
ＳＭＡＤリン酸化の活性化は、上流アクチビン受容体の活性化をアッセイするために一般的に使用される。ＡＬＫ１は、そのリガンドによる活性化の際にＳＭＡＤタンパク質１、５、および８のリン酸化を調整することが公知である。ここに、本発明者らは、ｒｈＢＭＰ−９（５０ｎｇ／ｍｌ）を３０分間のタイムコースにわたって添加してＨＵＶＥＣ細胞（ＡＬＫ１受容体を本質的に発現するヒト内皮細胞株）中でのＳＭＡＤリン酸化を開始させた。リガンドでの細胞の処理から５分後にＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化が認められ、リン酸化は、全３０分間にわたって維持された。比較的低濃度のｈＡＬＫ１−Ｆｃ（２５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＳＭＡＤ１／５／８リン酸化が減少し、この薬剤が内皮細胞中でＳｍａｄ１／５／８活性化を阻害することが確認された。
【０１２７】
インビトロ系でのＡＬＫ１−Ｆｃの血管形成効果を評価するために、本発明者らは、マトリゲル基質上での内皮細胞の管形成の減少における化合物の有効性をアッセイした。この技術は、新血管形成を評価するために一般的に使用されており、迅速且つ高再現性の結果が得られる。内皮細胞成長サプリメント（ＥＣＧＳ）を使用してマトリゲル上の内皮細胞由来の微細血管の形成を誘導し、次いで、抗血管形成化合物の有効性を１８時間のタイムコースにわたる薬物およびＥＣＧＳの両方の存在下での索形成の減少として測定した。予想通り、ネガティブコントロール（処理なし）と比較した場合にＥＣＧＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）の添加によって有意なコード形成が誘導され、これは、マトリゲル基質上で産生された内皮細胞索形成の基底レベルを示す（図５）。ｈＡＬＫ１−Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはｍＡＬＫ１−Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍｌ）のいずれかの添加の際、索形成は明白に減少した。全サンプル中の脈管長の最終定量により、あらゆる濃度のｈＡＬＫ１−ｆｃまたはｍＡＬＫ１−Ｆｃが基底レベルへの新血管形成を減少させることが明らかとなった。さらに、血管新生促進性の強い因子ＥＣＧＳの存在下でのｈＡＬＫ１−ＦｃおよびｍＡＬＫ１−Ｆｃによって新血管形成の強い阻害が維持され、ネガティブコントロールであるエンドスタチン（１００ｎｇ／ｍｌ）よりもさらにより強力な抗血管形成活性が証明された。
【０１２８】
（実施例４）ＣＡＭアッセイ
ＶＥＧＦおよびＦＧＦは、血管形成を刺激することが周知である。ＣＡＭ（トリ絨毛尿膜）アッセイ系を使用して、ＧＤＦ７の血管形成効果を評価した。図６に示すように、ＧＤＦ７は、ＶＥＧＦと類似の効力で血管形成を刺激する。ＧＤＦ５およびＧＤＦ６を使用して類似の結果が認められた。
【０１２９】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合物を、ＣＡＭアッセイにおいて抗血管形成活性について試験した。これらの融合タンパク質は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＧＤＦ７によって刺激された血管形成に対して強力な抗血管形成効果を示した。図７を参照のこと。ＢＭＰ９およびＰＤＧＦは、このアッセイにおいて比較的弱い血管形成誘導能力を示したが、これらの因子のかかる血管形成効果は、それでもなおＡＬＫ１によって阻害された。
【０１３０】
ＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質および市販の抗血管形成性抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を、ＣＡＭアッセイで比較した。ＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質は、抗ＶＥＧＦと比較して類似の効力を有していた。抗ＶＥＧＦ抗体であるベバシズマブは、現在、ヒトにおける癌および黄斑変性の治療で使用されている。図８を参照のこと。
【０１３１】
興味深いことに、抗ＡＬＫ１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、このアッセイ系で血管形成を有意に阻害できなかった。本発明者らは、これは異なる種におけるＡＬＫ１配列の相違を反映し得ると予想する。
【０１３２】
（実施例５）マウス角膜マイクロポケットアッセイ
マウス角膜マイクロポケットアッセイを使用して、マウス眼における血管形成に及ぼすＡＬＫ１−Ｆｃの影響を評価した。腹腔内に投与したｈＡＬＫ１−Ｆｃは、眼の血管形成を有意に阻害した。図９に示すように、ｈＡＬＫ１−Ｆｃは、抗ＶＥＧＦと同程度に眼の血管形成を阻害した。ｈＡＬＫ１−Ｆｃおよび抗ＶＥＧＦを、同一の重量／重量投薬量で使用した。ＶＥＧＦを充填したマトリゲルを眼でない位置に移植した場合に類似のデータが得られた。
【０１３３】
これらのデータは、ＡＬＫ１に対する高親和性リガンドが血管形成を促進し、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が強力な抗血管形成活性を有することを証明している。ＡＬＫ１のリガンドは、以下の２つのカテゴリーに分類される：ＡＬＫ１に中程度の親和性を有するＧＤＦ５、６、７群およびＡＬＫ１に高親和性を有するＢＭＰ９、１０群。
【０１３４】
ＧＤＦ５、６、および７は主に骨および関節に局在化する一方で、ＢＭＰ９は血液中を循環する。したがって、ＡＬＫ１、ＧＤＦ５、６、および７を含む骨および関節の血管新生促進系であり、ＡＬＫ１およびＢＭＰ９（およびおそらくＢＭＰ１０）を含む全身血管形成系のようである。
【０１３５】
（実施例６）関節リウマチのマウスモデル
マウスコラーゲン誘導性関節炎モデルは、十分に承認された関節リウマチモデルである。本研究では、１０匹のマウス群を、ビヒクル、抗ＶＥＧＦ（ベバシズマブ−ネガティブコントロールとして、ベバシズマブはマウスＶＥＧＦを阻害しないため）、または１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または２５ｍｇ／ｋｇの用量のｍＡＬＫ１−Ｆｃ（「ＲＡＰ−０４１」）で処理した。２１日目のコラーゲン追加免疫後、関節炎スコア（図１０を参照のこと）および足の腫脹は、全群で安定的に増加し、約３８日目でピークになった。ｍＡＬＫ１−Ｆｃ（「ＲＡＰ−０４１」）で処理したマウスは、特に最も高い用量（２５ｍｇ／ｋｇ）で両方の特徴についてスコアが減少したが、この減少は統計的に有意ではなかった。それにもかかわらず、用量に関連する傾向は明らかである。
【０１３６】
４２日目の研究終了までに、関節炎の発症率は、ビヒクルコントロール処置マウスで１０／１０、ベバシズマブ処置マウスで９／１０、１ｍｇ／ｋｇのｍＡＬＫ１−Ｆｃで処置した群で８／１０、１０ｍｇ／ｋｇのｍＡＬＫ１−Ｆｃで処置した群で９／１０に到達した。２５ｍｇ／ｋｇのｍＡＬＫ１−Ｆｃで処置した群の疾患の発生は、６／１０とより低かった。
【０１３７】
（実施例７）多発性骨髄腫のマウスモデル
多発性骨髄腫は、実質的な骨量減少に関連する主に骨の癌である。マウス骨髄腫の５Ｔ２ＭＭモデルは、高齢マウスで発症し、ヒト多発性骨髄腫患者で認められる影響と類似する影響をマウスで生じる自発性腫瘍型由来の腫瘍細胞（５Ｔ２ＭＭ細胞）の使用に基づく。例えば、Ｖａｎｄｅｒｋｅｒｋｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００５；１１３：１９１−２０５を参照のこと。ｍＡＬＫ１−Ｆｃを、このモデルにおける影響について試験した。
【０１３８】
Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊマウスに注射した５Ｔ２ＭＭ細胞により、破骨細胞表面の増加が促進され、溶骨性病変が形成され、骨領域の減少を生じた。骨疾患は、骨芽細胞数および骨芽細胞表面の減少、および石灰化の減少に関連する。
【０１３９】
５Ｔ２ＭＭ細胞を保有するマウスを、ｍＡＬＫ１−Ｆｃ（ＲＡＰ−０４１）（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内に週２回）またはビヒクルで５Ｔ２ＭＭ注射時から全部で１２週間処置した。近位脛骨および腰椎のＭｉｃｒｏＣＴ分析により、ナイーブマウスと比較して５Ｔ２ＭＭ保有マウスにおいて海綿骨体積および小柱数の統計的に有意な減少が証明された（コントロールと比較して骨体積は４０％減少し、小柱数は４０％減少した）。ＲＡＰ−０４１は、ビヒクル処置マウスと比較した場合、骨体積および小柱数の５Ｔ２ＭＭ誘導減少を完全に防止した（処置マウスは、非腫瘍化コントロールと比較して骨体積が１２０％であり、非腫瘍化コントロールと比較して小柱数が１１５％であった）。さらに、腫瘍処置マウスは、溶骨性病変を発症し、これはｍｉｃｒｏＣＴで検出された。ｍＡＬＫ１−Ｆｃ処置により、ビヒクル処置マウスと比較して、溶血性骨病変数が５０％減少した。
【０１４０】
ＡＬＫ１−Ｆｃの抗血管形成効果に基づいて、本発明者らは、この薬剤によって得られた骨の防御効果が腫瘍成長の結果であると推測する。
【０１４１】
したがって、ＡＬＫ１−Ｆｃを使用して多発性骨髄腫を処置し、この腫瘍型に起因する骨疾患の影響を減少させることができる。
【０１４２】
（実施例８）ＤＡＮのリガンド結合特性
ＤＡＮは、ＭＢＰ活性を阻害する分泌性シスチンｋｎｏｔタンパク質ファミリーのメンバーである。ＤＡＮは、ＧＤＦ５に結合して拮抗することが公知である。本発明者らは、ＤＡＮはＧＤＦ７に強固に結合するが、ＢＭＰ９に結合しないと判断した。したがって、本発明者らは、ＤＡＮが一連のＡＬＫ１の骨および関節局在リガンドを阻害し、ＤＡＮが骨および関節関連血管形成の強力なアンタゴニストであると予想されると結論づけた。したがって、ＤＡＮは、骨の癌（例えば、多発性骨髄腫および骨転移）ならびに関節リウマチおよび骨関節炎の治療で有用であり得る。
【０１４３】
まとめると、これらの実施例で開示した所見は、インビボでの血管形成、特に眼の血管形成の阻害のための本明細書に記載の多くの試薬を提供する。これらの所見は、ＧＤＦ５、６、および７に標的化される薬剤を使用して、骨および関節の血管形成を選択的に阻害することができることも示す。これらの所見は、かかる薬剤を使用して癌および関節リウマチを治療することができることをさらに示す。
文献の引用
本明細書で言及した全ての刊行物および特許は、各刊行物または特許が具体的且つ個別に参考により組み込まれることを意図するように、その全体が本明細書で参考により組み込まれる。矛盾する場合、本願（本明細書の任意の定義が含まれる）に従う。
等価物
本発明の特定の実施形態を本明細書に明確に開示しているが、上記明細書は例示であり、本発明を制限しない。本明細書および以下の特許請求の範囲の再検討の際に本発明の多くの変形形態が当業者に明らかとなるであろう。本発明の全範囲を、特許請求の範囲およびその等価物の全範囲ならびに明細書およびかかる変形形態を参照して判断すべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に融合している、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質であって、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＧＤＦ５、ＧＤＦ７、およびＢＭＰ９に結合し、１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合するＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項２】
Ｆｃ部分がヒトＩｇＧ１のＦｃ部分であるＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項３】
配列番号３のアミノ酸配列を含むＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項４】
哺乳動物細胞株中の配列番号４の核酸の発現によって産生されるＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項５】
哺乳動物細胞株がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項４に記載のＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項６】
請求項５に記載のＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含む、実質的に発熱物質を含まない薬学的調製物。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体。
【請求項８】
抗体が５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
抗体が１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体がＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のＡＬＫ１への結合を阻害する、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項７に記載の抗体を含む、実質的に発熱物質を含まない薬学的調製物。
【請求項１３】
哺乳動物の血管形成を阻害する方法であって、有効量のＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質を哺乳動物に投与する工程を含む方法。
【請求項１４】
ＡＬＫ−１ ＥＣＤタンパク質がＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合しており、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質がＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドが配列番号１のアミノ酸３４〜９５に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ＡＬＫ１ ＥＣＤが、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号２のヌクレオチド１００〜２８５または同一のコード配列を有する配列番号２のヌクレオチド１００〜２８５の変異体とハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号３の配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ＡＬＫ１ ＥＣＤ融合タンパク質を静脈内または眼に局所送達する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
阻害すべき血管形成が、哺乳動物の眼内、腫瘍内、骨内、または関節内で生じる血管形成である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する有効量の抗体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の血管形成を阻害する方法。
【請求項２４】
抗体が５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
抗体が１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
抗体がＡＬＫ１のＡＬＫ１リガンドへの結合を阻害し、該ＡＬＫ１リガンドがＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
抗体を静脈内送達する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
阻害すべき血管形成が、哺乳動物の眼内、腫瘍内、骨内、または関節内で生じる血管形成である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、該ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される抗体。
【請求項３２】
抗体が５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
抗体がＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３４】
請求項３１に記載の抗体を含む薬学的調製物。
【請求項３５】
ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、該ＡＬＫ１リガンドがＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体。
【請求項３６】
抗体が１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
請求項３５に記載の抗体を含む薬学的調製物。
【請求項３８】
哺乳動物の血管形成を阻害する方法であって、ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する有効量の抗体を哺乳動物に投与する工程を含み、該ＡＬＫ１リガンドが、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される方法。
【請求項３９】
抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
抗体が、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
抗体を静脈内送達する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
阻害すべき血管形成が、哺乳動物の眼内、腫瘍内、骨内、または関節内で生じる血管形成である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
哺乳動物の血管形成の阻害薬の製造におけるＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドまたはＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドをコードする核酸の使用。
【請求項４５】
ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドがＡＬＫ−１Ｆｃ融合タンパク質である、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合しており、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
哺乳動物の血管形成の阻害薬の製造におけるＡＬＫ１またはＡＬＫ１をコードする核酸に結合する抗体の使用であって、該抗体が配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する使用。
【請求項４８】
哺乳動物の血管形成の阻害薬の製造におけるＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１またはＡＬＫ１をコードする核酸への結合を阻害する抗体の使用であって、該抗体がＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択されるＡＬＫ１リガンドに結合する使用。
【請求項４９】
哺乳動物の血管形成を阻害する方法であって、有効量のＤＡＮタンパク質を哺乳動物に投与する工程を含む方法。
【請求項５０】
ＤＡＮタンパク質がＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号１０のアミノ酸２１〜１２５の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合しており、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
ＤＡＮタンパク質が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
ＤＡＮタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸１７〜１８０に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
ＤＡＮタンパク質が、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７または同一のコード配列を有する配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７の変異体とハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
阻害すべき血管形成が、哺乳動物の眼内、腫瘍内、骨内、または関節内で生じる血管形成である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
哺乳動物の関節リウマチを治療する方法であって、関節リウマチを有する哺乳動物に：
（ａ）ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；
（ｂ）ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、該ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；および
（ｄ）ＤＡＮポリペプチド
からなる群から選択される有効量の薬剤を投与する工程を含む方法。
【請求項５８】
ＡＬＫ−１ ＥＣＤタンパク質がＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合しており、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質がＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号３の配列を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドが配列番号１のアミノ酸３４〜９５に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
ＡＬＫ１ ＥＣＤが、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号２のヌクレオチド１００〜２８５または同一のコード配列を有する配列番号２のヌクレオチド１００〜２８５の変異体とハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
（ｂ）の抗体が、５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
（ｂ）の抗体が、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６６】
（ｂ）の抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６７】
（ｂ）の抗体が、ＡＬＫ１のＡＬＫ１リガンドへの結合を阻害し、該ＡＬＫ１リガンドがＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６８】
（ｃ）の抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６９】
（ｃ）の抗体が、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項５７に記載の方法。
【請求項７０】
ＤＡＮタンパク質がＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項５７に記載の方法。
【請求項７１】
ＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号１０のアミノ酸２１〜１２５の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合しており、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ＤＡＮタンパク質が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項５７に記載の方法。
【請求項７３】
ＤＡＮタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸１７〜１８０に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項７４】
ＤＡＮタンパク質が、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７または同一のコード配列を有する配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７の変異体とハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項７５】
薬剤を静脈内送達する、請求項５７に記載の方法。
【請求項７６】
血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項７７】
哺乳動物の腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を有する哺乳動物に：
（ａ）ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；
（ｂ）ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、該ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；および
（ｄ）ＤＡＮポリペプチド
からなる群から選択される有効量の薬剤を投与する工程を含む方法。
【請求項７８】
ＡＬＫ−１ ＥＣＤタンパク質がＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合しており、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質がＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号３の配列を有する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドが配列番号１のアミノ酸３４〜９５に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
ＡＬＫ１ ＥＣＤが、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号２のヌクレオチド１００〜２８５または同一のコード配列を有する配列番号２のヌクレオチド１００〜２８５の変異体とハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
（ｂ）の抗体が、５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８５】
（ｂ）の抗体が、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８６】
（ｂ）の抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８７】
（ｂ）の抗体が、ＡＬＫ１のＡＬＫ１リガンドへの結合を阻害し、該ＡＬＫ１リガンドがＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８８】
（ｃ）の抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８９】
（ｃ）の抗体が、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項７７に記載の方法。
【請求項９０】
ＤＡＮタンパク質がＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９１】
ＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号１０のアミノ酸２１〜１２５の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合しており、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
ＤＡＮタンパク質が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項７７に記載の方法。
【請求項９３】
ＤＡＮタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸１７〜１８０に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項９４】
ＤＡＮタンパク質が、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７または同一のコード配列を有する配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７の変異体とハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項９５】
薬剤を静脈内送達する、請求項７７に記載の方法。
【請求項９６】
血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項９７】
血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項９８】
腫瘍が骨に関連する、請求項７７に記載の方法。
【請求項９９】
腫瘍が骨髄腫または骨に転移した腫瘍である、請求項７７に記載の方法。
【請求項１００】
腫瘍が抗ＶＥＧＦ療法に耐性を示す、請求項７７に記載の方法。
【請求項１０１】
（ａ）ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；
（ｂ）ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、該ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；および
（ｄ）ＤＡＮポリペプチド
からなる群から選択される薬剤を含む眼科薬学的処方物。
【請求項１０２】
眼科疾患に関連する血管形成を治療する方法であって、
（ａ）ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；
（ｂ）ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、該ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；および
（ｄ）ＤＡＮポリペプチド
からなる群から選択される有効量の薬剤を含む薬学的処方物を全身または眼に投与する工程を含む方法。
【請求項１】
ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に融合している、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質であって、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＧＤＦ５、ＧＤＦ７、およびＢＭＰ９に結合し、１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合するＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項２】
Ｆｃ部分がヒトＩｇＧ１のＦｃ部分であるＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項３】
配列番号３のアミノ酸配列を含むＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項４】
哺乳動物細胞株中の配列番号４の核酸の発現によって産生されるＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項５】
哺乳動物細胞株がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項４に記載のＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項６】
請求項５に記載のＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含む、実質的に発熱物質を含まない薬学的調製物。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体。
【請求項８】
抗体が５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
抗体が１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体がＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のＡＬＫ１への結合を阻害する、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項７に記載の抗体を含む、実質的に発熱物質を含まない薬学的調製物。
【請求項１３】
哺乳動物の血管形成を阻害する方法であって、有効量のＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質を哺乳動物に投与する工程を含む方法。
【請求項１４】
ＡＬＫ−１ ＥＣＤタンパク質がＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合しており、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質がＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドが配列番号１のアミノ酸３４〜９５に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ＡＬＫ１ ＥＣＤが、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号２のヌクレオチド１００〜２８５または同一のコード配列を有する配列番号２のヌクレオチド１００〜２８５の変異体とハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号３の配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ＡＬＫ１ ＥＣＤ融合タンパク質を静脈内または眼に局所送達する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
阻害すべき血管形成が、哺乳動物の眼内、腫瘍内、骨内、または関節内で生じる血管形成である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する有効量の抗体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の血管形成を阻害する方法。
【請求項２４】
抗体が５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
抗体が１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
抗体がＡＬＫ１のＡＬＫ１リガンドへの結合を阻害し、該ＡＬＫ１リガンドがＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
抗体を静脈内送達する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
阻害すべき血管形成が、哺乳動物の眼内、腫瘍内、骨内、または関節内で生じる血管形成である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、該ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される抗体。
【請求項３２】
抗体が５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
抗体がＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３４】
請求項３１に記載の抗体を含む薬学的調製物。
【請求項３５】
ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、該ＡＬＫ１リガンドがＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体。
【請求項３６】
抗体が１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
請求項３５に記載の抗体を含む薬学的調製物。
【請求項３８】
哺乳動物の血管形成を阻害する方法であって、ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する有効量の抗体を哺乳動物に投与する工程を含み、該ＡＬＫ１リガンドが、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される方法。
【請求項３９】
抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
抗体が、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
抗体を静脈内送達する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
阻害すべき血管形成が、哺乳動物の眼内、腫瘍内、骨内、または関節内で生じる血管形成である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
哺乳動物の血管形成の阻害薬の製造におけるＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドまたはＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドをコードする核酸の使用。
【請求項４５】
ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドがＡＬＫ−１Ｆｃ融合タンパク質である、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合しており、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
哺乳動物の血管形成の阻害薬の製造におけるＡＬＫ１またはＡＬＫ１をコードする核酸に結合する抗体の使用であって、該抗体が配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する使用。
【請求項４８】
哺乳動物の血管形成の阻害薬の製造におけるＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１またはＡＬＫ１をコードする核酸への結合を阻害する抗体の使用であって、該抗体がＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択されるＡＬＫ１リガンドに結合する使用。
【請求項４９】
哺乳動物の血管形成を阻害する方法であって、有効量のＤＡＮタンパク質を哺乳動物に投与する工程を含む方法。
【請求項５０】
ＤＡＮタンパク質がＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号１０のアミノ酸２１〜１２５の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合しており、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
ＤＡＮタンパク質が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
ＤＡＮタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸１７〜１８０に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
ＤＡＮタンパク質が、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７または同一のコード配列を有する配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７の変異体とハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
阻害すべき血管形成が、哺乳動物の眼内、腫瘍内、骨内、または関節内で生じる血管形成である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
哺乳動物の関節リウマチを治療する方法であって、関節リウマチを有する哺乳動物に：
（ａ）ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；
（ｂ）ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、該ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；および
（ｄ）ＤＡＮポリペプチド
からなる群から選択される有効量の薬剤を投与する工程を含む方法。
【請求項５８】
ＡＬＫ−１ ＥＣＤタンパク質がＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合しており、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質がＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号３の配列を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドが配列番号１のアミノ酸３４〜９５に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
ＡＬＫ１ ＥＣＤが、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号２のヌクレオチド１００〜２８５または同一のコード配列を有する配列番号２のヌクレオチド１００〜２８５の変異体とハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
（ｂ）の抗体が、５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
（ｂ）の抗体が、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６６】
（ｂ）の抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６７】
（ｂ）の抗体が、ＡＬＫ１のＡＬＫ１リガンドへの結合を阻害し、該ＡＬＫ１リガンドがＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６８】
（ｃ）の抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６９】
（ｃ）の抗体が、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項５７に記載の方法。
【請求項７０】
ＤＡＮタンパク質がＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項５７に記載の方法。
【請求項７１】
ＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号１０のアミノ酸２１〜１２５の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合しており、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ＤＡＮタンパク質が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項５７に記載の方法。
【請求項７３】
ＤＡＮタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸１７〜１８０に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項７４】
ＤＡＮタンパク質が、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７または同一のコード配列を有する配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７の変異体とハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項７５】
薬剤を静脈内送達する、請求項５７に記載の方法。
【請求項７６】
血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項７７】
哺乳動物の腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を有する哺乳動物に：
（ａ）ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；
（ｂ）ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、該ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；および
（ｄ）ＤＡＮポリペプチド
からなる群から選択される有効量の薬剤を投与する工程を含む方法。
【請求項７８】
ＡＬＫ−１ ＥＣＤタンパク質がＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸２２〜１１８の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合しており、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質がＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号３の配列を有する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
ＡＬＫ１ ＥＣＤポリペプチドが配列番号１のアミノ酸３４〜９５に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
ＡＬＫ１ ＥＣＤが、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号２のヌクレオチド１００〜２８５または同一のコード配列を有する配列番号２のヌクレオチド１００〜２８５の変異体とハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
（ｂ）の抗体が、５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８５】
（ｂ）の抗体が、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８６】
（ｂ）の抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８７】
（ｂ）の抗体が、ＡＬＫ１のＡＬＫ１リガンドへの結合を阻害し、該ＡＬＫ１リガンドがＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８８】
（ｃ）の抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８９】
（ｃ）の抗体が、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管形成を阻害する、請求項７７に記載の方法。
【請求項９０】
ＤＡＮタンパク質がＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９１】
ＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号１０のアミノ酸２１〜１２５の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合しており、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６を超えるＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
ＤＡＮタンパク質が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する、請求項７７に記載の方法。
【請求項９３】
ＤＡＮタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸１７〜１８０に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項９４】
ＤＡＮタンパク質が、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７または同一のコード配列を有する配列番号１１のヌクレオチド１５３〜４６７の変異体とハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項９５】
薬剤を静脈内送達する、請求項７７に記載の方法。
【請求項９６】
血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項９７】
血管形成を阻害する第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項９８】
腫瘍が骨に関連する、請求項７７に記載の方法。
【請求項９９】
腫瘍が骨髄腫または骨に転移した腫瘍である、請求項７７に記載の方法。
【請求項１００】
腫瘍が抗ＶＥＧＦ療法に耐性を示す、請求項７７に記載の方法。
【請求項１０１】
（ａ）ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；
（ｂ）ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、該ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；および
（ｄ）ＤＡＮポリペプチド
からなる群から選択される薬剤を含む眼科薬学的処方物。
【請求項１０２】
眼科疾患に関連する血管形成を治療する方法であって、
（ａ）ＡＬＫ１ ＥＣＤタンパク質；
（ｂ）ＡＬＫ１リガンドに結合してＡＬＫ１リガンドのＡＬＫ１への結合を阻害する抗体であって、該ＡＬＫ１リガンドがＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される抗体；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸２２〜１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；および
（ｄ）ＤＡＮポリペプチド
からなる群から選択される有効量の薬剤を含む薬学的処方物を全身または眼に投与する工程を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１０−５０８８１６（Ｐ２０１０−５０８８１６Ａ）
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３５３４１（Ｐ２００９−５３５３４１）
【出願日】平成１９年１１月２日（２００７．１１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２３２１７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５７４６１
【国際公開日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５０９１２５４７５）アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２日（２００７．１１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２３２１７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５７４６１
【国際公開日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５０９１２５４７５）アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
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