ＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤
【課題】抗ＨＩＶ−１作用をもつ宿主因子であるＡＰＯＢＥＣ３の発現を向上させる化合物を有効成分として含有するＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤を提供することにある。また、本発明の別の課題は、上記化合物を有効成分として含有する抗ＨＩＶ剤を提供することにある。
【解決手段】本明細書に定義するジスルフィド化合物を有効成分として含有するＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤。
【解決手段】本明細書に定義するジスルフィド化合物を有効成分として含有するＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジスルフィド化合物を有効成分として含有するＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記構造式で表されるジスルフィド化合物及びその還元体等のジチオール化合物が、転写因子ＨＩＶ−ＥＰ１のＤＮＡ結合を阻害することが報告されている（非特許文献１）。ＨＩＶ−ＥＰ１とは、ＨＩＶプロウイルスの長鎖末端反復配列に存在するＤＮＡκＢサイトに結合するＣ2Ｈ2型ジンク・フィンガータンパク質であり、そのＤＮＡ結合によりＨＩＶ−１（human immunodeficiency virus Type-1）の遺伝子発現を活性化する。また、上記化合物は、同様にＨＩＶ−１の遺伝子発現に関係する転写タンパク質の一つであるＳｐ１のＤＮＡ結合を阻害することが報告されている（非特許文献２及び３）。
【化１】
【０００３】
また、上記還元体のピリジン環の４位をアリール基に変えた化合物が、ファルネシル・タンパク質転移酵素の酵素活性を阻害し、抗癌活性を有することも報告されている（非特許文献４及び特許文献１を参照）。ファルネシル・タンパク質転移酵素は、細胞内シグナル伝達に関与する亜鉛酵素であり、癌遺伝子rasの産物であるＲａｓタンパク質のＣ末端のＣＡＡＸボックスと呼ばれる部位にファルネシル基を転移するものである。
【０００４】
上記化合物の有する阻害活性は、いずれも化合物がタンパク質の亜鉛結合部位に作用することによる。
【０００５】
一方、ＡＰＯＢＥＣ（apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide）ファミリータンパク質は、抗ウイルス作用を有する宿主因子の代表的なものとして知られ、特に、ＡＰＯＢＥＣ３タンパク質は、ＨＩＶ−１のウイルスｃＤＮＡを変異させることにより当該ウイルスの複製を阻害することが知られている（非特許文献５）。このファミリーに属するＡＰＯＢＥＣ３Ｇは、ＨＩＶ−１ Ｖｉｆ(Virion infectivity factor)タンパク質の機能解析の過程で同定されたものであるが（非特許文献６）、ＨＩＶ−１感染の標的細胞であるＴ細胞やマクロファージが有する抗ＨＩＶ−１作用をもつ宿主因子であり、シチジンデアミナーゼに保存されたアミノ酸配列を有するＤＮＡ変換酵素である。ＡＰＯＢＥＣ３ＧはＨＩＶ−１ゲノムの逆転写の際に生成される1本鎖 (−) ＤＮＡのシチジンをウラシルに変換する（非特許文献７）。この変異により、（１）２本鎖ＤＮＡになる際に、＋鎖ＤＮＡにグアニンからアデニンへの超変異（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）がおこり、アミノ酸の変異や停止コドンを出現させる経路、（２）ＤＮＡ修復機構 (ＵＮＧ: ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ) を介しウイルスＤＮＡの切断分解を引き起こす経路、（３）一鎖ＤＮＡへのＵの取り込みが＋鎖ＤＮＡの合成そのものを阻害する経路などにより、その後のウイルス複製が阻害されると考えられている（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１９６７３２
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Journal of Medicinal Chemistry 1996, 39, 503-507
【非特許文献２】Bioorganic & Medicinal Chemistry 1997, 5, 205-215
【非特許文献３】有機合成化学協会誌 1997, 55, 41-48
【非特許文献４】Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2003, 13, 1523-1526
【非特許文献５】Judd F Hultquist & Reuben S Harris, Future Virol. (2009)4(6), 605-619
【非特許文献６】A. M. Sheehy ,N. C. Gaddis, J. D. Choi, M. H. Malim, Nature, 418 646 (2002).
【非特許文献７】Q. Yu, R. Konig, S. Pillai, K. Chiles, M. Kearney, S. Palmer, D. Richman, J. M. Coffin, N. R. Landau, Nat. Struct. Mol. Biol., 11, 435 (2004).
【非特許文献８】高折晃史, ウイルス, 55, 267 (2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、抗ＨＩＶ−１作用をもつ宿主因子であるＡＰＯＢＥＣ３の発現を向上させる化合物を有効成分として含有するＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤を提供することである。また、本発明の別の課題は、上記化合物を有効成分として含有する抗ＨＩＶ剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、下記一般式（Ｉ）で表されるジスルフィド化合物がＡＰＯＢＥＣ３の発現向上活性を有し、ＨＩＶ−１の感染価を低下させる効果（即ち、抗ＨＩＶ−１作用）を有することを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明の態様は以下に関する。
〔１〕 一般式（Ｉ）：
【化２】
〔式中、Ｒ1は、水素原子、低級アルコキシ基又はＮＲ2Ｒ3（Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して低級アルキル基を表す）を表し；ｎ１、ｎ２、ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し；Ｙ1及びＹ2は、それぞれ独立して、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
【化３】
（式中、Ｘは、低級アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲノ低級アルキル基、ニトロ基、シアノ基又はアルデヒド基を表し；ｐは、０〜３の整数を表す）を表す〕
で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含有する、ＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
〔２〕 一般式（Ｉ）において、Ｒ1がＮＲ2Ｒ3を表し、Ｒ2及びＲ3がＣ1−Ｃ4アルキル基である、〔１〕に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
〔３〕 Ｒ2及びＲ3がメチル基である、〔２〕に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
〔４〕 一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が一般式（ＩＩ）で表され、Ｘがニトロ基であり、かつｐが１〜２の整数である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
〔５〕 一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が水素原子である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
〔６〕 一般式（Ｉ）において、ｎ１及びｎ２が１であり、かつｍ１及びｍ２が２である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
〔７〕 一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記構造式（ＩＩＩ）：
【化４】
で表される化合物、又は下記構造式（ＩＶ）：
【化５】
で表される化合物である、〔１〕に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
〔８〕 ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現の向上に用いるための〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【００１１】
〔９〕 一般式（Ｉ）：
【化６】
〔式中、Ｒ1は、水素原子、低級アルコキシ基又はＮＲ2Ｒ3（Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して低級アルキル基を表す）を表し；ｎ１、ｎ２、ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し；Ｙ1及びＹ2は、それぞれ独立して、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
【化７】
（式中、Ｘは、低級アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲノ低級アルキル基、ニトロ基、シアノ基又はアルデヒド基を表し；ｐは、０〜３の整数を表す）を表す〕
で表される化合物、その酸化により得られる２量体又は生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含有する、抗ＨＩＶ剤。
〔１０〕 一般式（Ｉ）において、Ｒ1がＮＲ2Ｒ3を表し、Ｒ2及びＲ3がＣ1−Ｃ4アルキル基である、〔９〕に記載の抗ＨＩＶ剤。
〔１１〕 Ｒ2及びＲ3がメチル基である、〔１０〕に記載の抗ＨＩＶ剤。
〔１２〕 一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が一般式（ＩＩ）で表され、Ｘがニトロ基であり、かつｐが１〜２の整数である、〔９〕〜〔１１〕のいずれかに記載の抗ＨＩＶ剤。
〔１３〕 一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が水素原子である、〔９〕〜〔１２〕のいずれかに記載の抗ＨＩＶ剤。
〔１４〕 一般式（Ｉ）において、ｎ１及びｎ２が１であり、かつｍ１及びｍ２が２である、〔９〕〜〔１３〕のいずれかに記載の抗ＨＩＶ剤。
〔１５〕 一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記構造式（ＩＩＩ）：
【化８】
で表される化合物、又は下記構造式（ＩＶ）：
【化９】
で表される化合物である、〔９〕に記載の抗ＨＩＶ剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤は、顕著なＡＰＯＢＥＣ３発現向上活性を有する。また、本発明の抗ＨＩＶ剤は、顕著なＡＰＯＢＥＣ３発現向上活性を有するジスルフィド化合物を有効成分とし、ＨＩＶ感染、それによって引き起こされる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に対して優れた治療効果を有する。ウイルス側の因子を標的とした従来の抗ＨＩＶ感染と比較すると、本発明の抗ＨＩＶ剤は、宿主因子であるＡＰＯＢＥＣ３を標的としていることから、ウイルス遺伝子の変異による薬剤耐性の問題にも対処できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ分解阻害実験におけるウェスタン・ブロッティングの結果を示す図である。図１において、１５は化合物１５を、１６は化合物１６を示す。
【図２】実施例１において、各種プロテアソーム阻害剤を含めたＡＰＯＢＥＣ３Ｇ分解阻害実験におけるウェスタン・ブロッティングの結果を示す図である。図２において、１５は化合物１５を、１６は化合物１６を示す。
【図３】実施例２におけるＲＴアッセイの概要を説明する図である。
【図４】実施例２におけるＭＡＧＩアッセイの概要を説明する図である。
【図５】実施例２において、各化合物についてのＨＩＶ−１感染値を示すグラフである。図５において、１５は化合物１５を、１６は化合物１６を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤は、一般式（Ｉ）：
【化１０】
〔式中、Ｒ1は、水素原子、低級アルコキシ基又はＮＲ2Ｒ3（Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して低級アルキル基を表す）を表し；ｎ１、ｎ２、ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し；Ｙ1及びＹ2は、それぞれ独立して、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
【化１１】
（式中、Ｘは、低級アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲノ低級アルキル基、ニトロ基、シアノ基又はアルデヒド基を表し；ｐは、０〜３の整数を表す）を表す〕
で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含有する。
【００１５】
また、本発明の抗ＨＩＶ剤は、一般式（Ｉ）：
【化１２】
〔式中、Ｒ1は、水素原子、低級アルコキシ基又はＮＲ2Ｒ3（Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して低級アルキル基を表す）を表し；ｎ１、ｎ２、ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し；Ｙ1及びＹ2は、それぞれ独立して、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
【化１３】
（式中、Ｘは、低級アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲノ低級アルキル基、ニトロ基、シアノ基又はアルデヒド基を表し；ｐは、０〜３の整数を表す）を表す〕
で表される化合物、その酸化により得られる２量体又は生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含有する。
【００１６】
本明細書において、「低級アルキル基」とは、例えば、炭素数１ないし６個の直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基であり、より具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、シクロブチル基、シクロプロピルメチル基、ペンチル基、イソペンチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、１−エチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、１−メチルペンチル基、３，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基などを挙げることができる。好ましくはＣ1−Ｃ4アルキル基であり、さらに好ましくはＣ1−Ｃ2アルキル基であり、最も好ましくはメチル基である。
【００１７】
「ハロゲン原子」とはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、好ましくはフッ素原子である。「ハロゲノ低級アルキル基」とは、前記「低級アルキル基」にハロゲン原子が１個又は２個以上置換した基を意味する。置換するハロゲン原子の種類、個数、及び置換位置は特に限定されず、２個以上のハロゲン原子が置換している場合には、ハロゲン原子の種類は同一でも異なっていてもよい。「ハロゲノ低級アルキル基」としては、より具体的には、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジフルオロメチル基、ジクロロメチル基、ジブロモメチル基、フルオロメチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、２−ブロモエチル基、２−クロロエチル基、２−フルオロエチル基、２−ヨ−ドエチル基、３−クロロプロピル基、４−フルオロブチル基、６−ヨードヘキシル基、２，２−ジブロモエチル基のようなハロゲノＣ1−Ｃ6アルキル基を挙げることができ、好ましくはハロゲノＣ1−Ｃ2アルキル基であり、好ましくはフルオロＣ1−Ｃ2アルキル基であり、最も好ましくはトリフルオロメチル基である。
【００１８】
「低級アルコキシ基」とは、前記「低級アルキル基」が酸素原子に結合した基を示し、より具体的には、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ペントキシ基、イソペントキシ基、２−メチルブトキシ基、１−エチルプロポキシ基、２−エチルプロポキシ基、ネオペントキシ基、ヘキシルオキシ基、４−メチルペントキシ基、３−メチルペントキシ基、２−メチルペントキシ基、３，３−ジメチルブトキシ基、２，２−ジメチルブトキシ基、１，１−ジメチルブトキシ基、１，２−ジメチルブトキシ基、１，３−ジメチルブトキシ基、２，３−ジメチルブトキシ基などを挙げることができ、好ましくはＣ1−Ｃ4アルコキシ基であり、さらに好ましくはＣ1−Ｃ2アルコキシ基であり、最も好ましくはメトキシ基である。
【００１９】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤の有効成分に関し、一般式（Ｉ）の好ましい態様として、Ｒ1がＮＲ2Ｒ3（Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、Ｃ1−Ｃ4アルキル基であり、より好ましくはＣ1−Ｃ2アルキル基であり、最も好ましくはメチル基である）であり、ｎ1及びｎ２が１〜３、より好ましくは１〜２、最も好ましくは１であり、ｍ１及びｍ２が１〜２、より好ましくは２であり、Ｙ1及びＹ2が水素原子又は一般式（ＩＩ）で表され、一般式（ＩＩ）においてはＸがニトロ基であり、ｐが１であることが好ましい。
【００２０】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤の有効成分として含まれる最も好ましい化合物としては、下記構造式で表される化合物１５及び化合物１が挙げられる。化合物１は、例えば、ジチオトレイトール (dithiothreitol、ＤＴＴ)を用いることにより、化合物１５を還元することで得られる。
【００２１】
【化１４】
【００２２】
また、本発明の抗ＨＩＶ剤は、一般式（Ｉ）で表される化合物の酸化型化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含有し得る。そのような酸化型化合物としては、上記化合物１を酸化して得られる下記構造式で表される化合物１６が挙げられる。
【００２３】
【化１５】
【００２４】
一般式(I)で表される本発明の化合物、その酸化型化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩などの塩の形態で存在する場合があるが、本発明の範囲にはいかなる塩も包含される。酸付加塩としては、塩酸塩若しくは臭化水素酸塩などの鉱酸塩、又はp-トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、シュウ酸塩、若しくは酒石酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、若しくはカルシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩若しくはエタノールアミン塩などの有機アミン塩などを用いることができる。また、グリシン塩などのアミノ酸塩として存在することもできる。さらに、本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合があるが、これらの物質も本発明の範囲に包含される。また、本発明の化合物は、置換基の種類によっては１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【００２５】
上記一般式(I) に包含される化合物は、上述の非特許文献１〜４、特許文献１に開示されている方法を採用し、あるいはこれら方法に公知慣用技術を組合せて合成することができる。
【００２６】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤は、ＡＰＯＢＥＣ３に属する遺伝子（タンパク質）の発現の向上のために使用され得る。ここで、ＡＰＯＢＥＣ３に属するものとしては、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３ＤＥ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈが知られている。本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤は、このうち、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現の向上のために使用されることが好ましい。
【００２７】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤は、上記の一般式(I)で表される化合物及びその塩、並びにそれらの水和物及びそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる物質の１種又は２種以上を有効成分として含んでいる。また、本発明の抗ＨＩＶ剤は、上記一般式(I)で表される化合物を酸化して得られる化合物及びその塩、並びにそれらの水和物及びそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる物質の１種又は２種以上を有効成分として含むこともできる。本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤としては上記物質それ自体を投与してもよいが、好ましくは、当業者に周知の方法によって製造可能な経口用あるいは非経口用の医薬組成物として投与することができる。経口投与に適する医薬用組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、点眼剤、点鼻剤、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤、経皮吸収剤、又は経粘膜吸収剤等を挙げることができる。
【００２８】
上記の医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、pH調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を挙げることができるが、これらは医薬組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することができ、２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記の医薬組成物には、さらに他の医薬の有効成分の１種又は２種以上を配合して、いわゆる合剤の形態の医薬組成物として用いることもできる。医薬組成物は経口投与用又は非経口投与用のいずれの形態で調製することも可能である。
【００２９】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤の投与経路は特に限定されず、経口投与でも非経口投与（例えば、直腸投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔投与および静脈内投与など）でもよいが、好ましくは経口投与である。
【００３０】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤の投与量は、投与対象又は患者の年齢、体重、症状等に応じて適宜設定することができるが、例えば、有効成分の化合物の量として０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日とすることができる。
【００３１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
［実施例１］
＜ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ分解阻害実験＞
本発明の化合物が、細胞内でＡＰＯＢＥＣ３Ｇの分解を抑制するか検討した。概略、２９３Ｔ細胞にｍｙｃタグが付加されたＡＰＯＢＥＣ３Ｇ (ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ−ｍｙｃ) とＦＬＡＧタグが付加されたＶｉｆ (Ｖｉｆ−ＦＬＡＧ) の発現ベクターと、ＨＩＶ−１感染性クローンｐＮＬ４−３のＶｉｆ欠損体ｐＮＬ−Ｎｄを導入した。導入開始から６時間後に化合物１５（4-(Dimethylamino)-2,6-bis[[N-[2-[(2-nitrophenyl)dithio]ethyl]amino]methyl]pyridine）、化合物１６（4-(Dimethylamino)-2,6-bis [[(2-mercaptoethyl)amino]methyl]pyridineの酸化型）および/またはＤＴＴを加え、さらに３６時間静置培養し、ウイルス液と細胞を回収した。回収した細胞を溶解し、ウェスタン・ブロッティングを行うことで、ＡＰＯＢＥＣ３ＧおよびＶｉｆの発現量を測定した。以下に、化合物１６の合成方法及びＡＰＯＢＥＣ３Ｇ分解阻害実験の手順を説明する。
【００３３】
（化合物１６の合成）
化合物15 (109.0 mg, 0.181 mmol) をCHCl3 5.8 mlに溶かし、dithiothreitol (83.6 mg, 0.542 mmol) を加え室温にて3hr撹拌した。精製水を加え、1M HCl水溶液でpH 1とし、CH2Cl2 (30 ml ×5回) にて洗浄した。水層をsat. NaHCO3水溶液で中和し、CH2Cl2 (30 ml×4回) にて抽出した。MgSO4を加えて乾燥し濾過した。O2雰囲気下室温にて12hr撹拌した。MgSO4を加えて乾燥し濾過した。減圧濃縮し化合物16をアモルファスとして得た。
収量 35.0 mg (0.117 mmol)
収率 65%
1H NMR (C DCl3) δ: 2.59 (4H, t, J = 6.9Hz, S-CH2CH2-N×2), 2.82 (4H, t, J = 6.9Hz, S-CH2CH2-N×2), 2.95 (6H, s, N(CH3)2), 3.76 (4H, s, -CH2-N-×2), 6.27 (2H, s, pyridine)
13C NMR (CDCl3) δ: 39.2 (N(CH3)2), 41.5 (S-CH2CH2-N), 47.7 ( S-CH2CH2-N), 54.9 (-CH2-N-), 104.5 (pyridine), 155.6 (pyridine), 159.5(pyridine)
FAB-MS (m/z) : 299, 597 (M＋H) +
【００３４】
（ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ分解阻害実験）
ヒト胎児腎臓由来上皮細胞である２９３Ｔ細胞〔J. S. Lebkowski, S. Clancy, M. P. Calos, Nature, 317, 169 (1985)〕を、１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地に懸濁し、細胞培養用シャーレに播種して、ＣＯ2インキュベーター中３７℃、５％ＣＯ2下で静置培養した。コンフルエントに達した細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ法によりディッシュから剥離し、１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭを加えてピペッティングした。あらかじめ１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を加えておいた細胞培養用シャーレに細胞懸濁液を播種し、４８時間静置培養した細胞をトランスフェクション実験に用いた。
【００３５】
ＨＩＶ−１の感染性クローンｐＮＬ４−３ 〔A. Adachi, H. E. Gendelman, S. Koenig, T. Folks, R. Willey, A. Rabson, M. A. Martin, J. Virol., 59, 284 (1986)〕のＶｉｆ欠損体ｐＮＬ−Ｎｄ 〔A. Adachi, N. Ono, H. Sakai, K. Ogawa, R. Shibata, T. Kiyomatsu, H. Masuike, S. Ueda, Arch. Virol., 117, 45 (1991)〕と、Ｖｉｆ−ＦＬＡＧを発現させるベクターとしてｐＮＬ−ＡＳＣＦ−ｆＷＴ〔B. Khamsri, M. Fujita, K. Kamada, A. Piroozmand, T. Yamashita, T. Uchiyama, A. Adachi, Int. J. Mol. Med., 18, 679, (2006)〕とを用いた。これらのｍｏｃｋとして、ｐＵＣまたはｐＮＬ−Ａ１ Ｖｉｆ（−） (NIH, USA, Strebel Klaus博士から供与) を用いた。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ−ｍｙｃを発現させるベクターとしてｐｃＤＮＡ−ＡＰＯ３Ｇ (NIH, USA, Strebel Klaus博士から供与) を用い、そのｍｏｃｋとしてｐｃＤＮＡ ３．１（−）を用いた。
【００３６】
遺伝子導入はリン酸カルシウム法で行い、定法に従った。まず、遺伝子発現用プラスミド計１０μｇを用い、超純水で全量を２２０μＬとした。この混合液にＣａＣｌ2水溶液 （２．５Ｍ） ２５μＬを加え、２×Ｈｅｂｓ (42mM HEPES, 290mM NaCl, pH 7.1) ２５０μＬとＮａ2ＨＰＯ4 （７０ｍＭ) ５μＬとの混合溶液に滴下した。３０分間室温でインキュベートした後、細胞培養用シャーレ （６．０ｃｍ） でサブコンフルエント状態にある２９３Ｔ細胞に添加した。３７℃にて６時間培養後、Ｄ−ＭＥＭで置換した。遺伝子導入開始４８時間後に細胞を回収した。遺伝子発現用プラスミドの各組成を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
上記の通り、２９３Ｔ細胞に各種プラスミドベクターを用いてトランスフェクションを行い、遺伝子導入より６時間後上清をＤ−ＭＥＭで置換した際に、ＤＴＴ（１５μＭ）、化合物１５（最終濃度が５μＭ）、化合物１６（最終濃度が５μＭ）、化合物１５（最終濃度が５μＭ）及びＤＴＴ（１５μＭ）の混合物、化合物１６（最終濃度が５μＭ）及びＤＴＴ（１５μＭ）の混合物をそれぞれ添加した。遺伝子導入より４８時間後、スクレーパーにより細胞を剥離して１５ｍＬチューブに移し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。細胞にＰＢＳ（−）１５０μＬと２×sampling buffer １５０μＬを加え、ヒートブロックにより加熱 (100℃, 1 時間)した後、遠心 (14,000 rpm, 1分, r.t.) して上清をウエスタンブロッティング用のサンプルとした。
【００３９】
次に、上記回収した細胞について、通常のウエスタンブロッティング法により解析した。ウエスタンブロッティング用のサンプルについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ＰＶＤＦ膜に転写(100V, 4℃, 3 時間) した。転写したＰＶＤＦ膜を、５％スキムミルクを含むＰＢＳＴ (0.1%Tween-20を含むPBS (-) ) 中で１時間振盪することでマスキングを行った。ＰＶＤＦ膜に１次抗体 (anti-myc又はanti-FLAG) を用いて１時間抗体反応を行った。ＰＢＳＴで洗浄後２次抗体 (anti-mouse IgG) を用いて１時間抗体反応を行った。反応終了後、ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで洗浄し、基質との反応を行い、FUJIFILM LAS-3000（富士フィルム社製）を用いて検出した。その結果を図１に示す。
【００４０】
その結果、予想通りＶｉｆ非存在下ではＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現が見られたが、Ｖｉｆ存在下で発現量は低下した。意外なことに化合物１５および化合物１５＋ＤＴＴを加えたものの存在下では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現量が顕著に上昇した。その発現量はＶｉｆ非存在下よりも高いことから、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇがこの実験系ではＶｉｆ以外の因子により分解を受けており、それが化合物１５および化合物１５＋ＤＴＴを加えたものにより分解阻害されることが示唆された。
【００４１】
次に、この分解がプロテアソーム分解であるかどうか調べるために、前述した実験と同様の方法でプロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２およびLactacystinと活性を比較した。また、同時にBis(2-nitrophenyl)disulfideについても同様の実験を行った。そのウェスタンブロッティングの結果を図２に示す。
【００４２】
その結果、ＭＧ１３２およびLactacystinでも化合物１５と同様ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現量上昇が見られ、この分解がプロテアソーム分解であること、化合物１５やＭＧ１３２またはLactacystinによりプロテアソーム分解が阻害されることが示された。また、Bis(2-nitrophenyl)disulfideはＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現量を上昇させなかった。
【００４３】
また、化合物のin vitroにおけるプロテアソーム阻害活性を、A. Asai, T. Tsujita, S. V. Sharma, Y. Yamashita, S. Akinaga, M. Funakoshi, H. Kobayashi, T. Mizukami, Biochem. Pharmacol., 67, 227 (2004)に記載の方法により調べた。その結果を表２に示す。結果として、化合物１５、１６、１６+ＤＴＴはプロテアソーム分解阻害活性を示し、その中でも化合物１５は最も高いプロテアソーム分解阻害活性を有することが判明した
【００４４】
【表２】
【００４５】
また、Ｖｉｆの発現量を調べたところ、化合物１５存在下で発現上昇は見られないが、ＭＧ１３２存在下で発現が強く上昇した。Ｖｉｆがプロテアソーム分解を受け、その分解がＭＧ１３２により阻害されることは既に報告されている（M. Fujita, H. Akari, A. Sakurai, A. Yoshida, T. Chiba, K. Tanaka, K. Strebel, A. Adachi, Microbes and Infection, 6, 791 (2004)）。しかし、ここでは化合物１５はＶｉｆのプロテアソーム分解を阻害せず、選択的にＡＰＯＢＥＣ３Ｇのプロテアソーム分解を阻害することが示唆された。
【００４６】
（実施例２）
＜ＨＩＶ−１感染阻害実験＞
次に、実際に化合物１５及び１６がＡＰＯＢＥＣ３Ｇを発現した細胞内でＨＩＶ−１の感染を抑制するか検討した。ＨＩＶ−１の放出量（下記ＲＴアッセイの結果）で補正した感染価をその指標に用いた。
【００４７】
（１）ＲＴアッセイ (ＨＩＶ−１放出量の測定)
本ＲＴアッセイは、R. L. Willey, P. H. Smith, L. A. Lasky, T. S. Thedore, P. L. Earl, B. Moss, D. J. Capon, M. A. Mavtia, J. Virol., 62, 139 (1988)に記載の方法に基づくものである。
【００４８】
ＲＴアッセイの手順を概略すると、２９３Ｔ細胞にＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現ベクターとＨＩＶ−１感染性クローンｐＮＬ４−３を導入し、導入開始から６時間後に化合物１５、１６および/またはＤＴＴ、ＴＰＥＮを加えさらに４２時間静置培養し、ウイルス液を回収した。ウイルス液を溶解して逆転写酵素をとりだし、PolyA, Oligo(dT)12-18 プライマー, ［α32P］-TTPを加えた。オリゴヌクレオチドを単離し、β線を測定することで逆転写酵素 （ＲＴ）の量を算出し、ＨＩＶ−１の放出量とした。ＲＴアッセイ法の概略を図３に示し、以下、その手順について詳述する。
【００４９】
下記遺伝子導入に用いたプラスミドは、上述のＨＩＶ−１の感染性クローンｐＮＬ４−３、及びそのＶｉｆ欠損体ｐＮＬ−Ｎｄである。これらのｍｏｃｋとしてｐＵＣを用いた。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現ベクターとしてｐｃＤＮＡ−ＡＰＯ３Ｇ (NIH, USA, Strebel Klaus博士から供与) を用いた。
【００５０】
遺伝子導入はリン酸カルシウム法で行い、定法に従った。まず、遺伝子発現用プラスミド計３．３μｇを用い、精製水で全量を７３．３μＬとした。この混合液にＣａＣｌ2水溶液 （２．５Ｍ）８．３μＬを加え、2×Hebs (42mM HEPES, 290mM NaCl, pH 7.1) ８３．３μＬとＮａ2ＨＰＯ4 (70mM) １．７μＬとの混合溶液に滴下した。３０分間室温でインキュベートした後、細胞培養用シャーレ （３．５ｃｍ） でサブコンフルエント状態にある２９３Ｔ細胞に添加した。３７℃にて６時間培養後、Ｄ−ＭＥＭで置換した。遺伝子導入開始４８時間後に細胞を回収した。遺伝子発現用プラスミドの組成を表３に示す。
【００５１】
【表３】
【００５２】
２９３Ｔ細胞に各種プラスミドベクターを用いて遺伝子導入した後６時間後上清をＤ−ＭＥＭで置換した時に、ＤＴＴ（１５μＭ）、化合物１５（最終濃度が５μＭ）、化合物１６（最終濃度が５μＭ）、化合物１５（最終濃度が５μＭ）及びＤＴＴ（１５μＭ）の混合物、化合物１６（最終濃度が５μＭ）及びＤＴＴ（１５μＭ）の混合物、並びにＴＰＥＮ（最終濃度が５μＭ）をそれぞれ添加した。遺伝子導入より４８時間後、上清を回収し、遠心 (3,000rpm, １０分, r.t.) した後、上清をウイルス液として得た。この溶液５μＬにＲＴカクテル (50mM Tris-HCl, pH7.8, 75mM KCl, 2.0mM DTT, 5.0mM MgCl2, 0.5μｇ/mL Poly A, 6.3μg/ml Oligo d(T)12-18, 0.05% NP40 25μＬ, [α32P]-TTPを適量(1日目: 0.025μＬ))加え３７℃で３時間静置培養した。これを１０μＬずつクロマトグラフィーペーパーにしみ込ませ、2×SSC (300mM NaCl, 30.0mM Sodium citrate) で洗浄した後乾燥させ、シンチレーションカウンターでβ線を検出した。得られた値をＨＩＶ−１の放出量とした。
【００５３】
（２） ＭＡＧＩアッセイ（ＨＩＶ−１感染価の測定）
本ＭＡＧＩアッセイは、J. Kimpton, M. Emerman, J. Virol., 66, 2232 (1992)に記載の方法に基づくものである。
【００５４】
ＭＡＧＩアッセイの手順を概略すると、ＲＴアッセイに用いたウイルス液をあらかじめ培養したＭＡＧＩ−ＣＸＣＲ４に添加し、感染させた。ＭＡＧＩ−ＣＸＣＲ４にはＣＤ４、ＣＸＣＲ４、ＬＴＲ−β−ｇａｌが導入されている。ＨＩＶ−１が感染するとＨＩＶ−１の転写活性化タンパク質Ｔａｔが発現し、これがＬＴＲ領域にあるＴＡＲに結合し、その下流にあるβ−ｇａｌ遺伝子の転写を促進する。生じたβ−ガラクトシダーゼに基質であるＸ−Ｇａｌを加え、青く染まった細胞を数えることでＨＩＶ−１感染価を測定した。ＭＡＧＩアッセイの概略を図４に示す。以下、その手順を詳述する。
【００５５】
ヒト子宮頸癌由来細胞であるＨｅＬａ細胞にＣＤ４、ＣＸＣＲ４、ＬＴＲ−β−gal遺伝子を導入したＭＡＧＩ−ＣＸＣＲ４細胞を、１０％ＦＣＳ、０．２ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８、 ０．１ｍｇ／ｍＬ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ、１μg/ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ含有Ｄ−ＭＥＭ (以下、ＭＡＧＩ−ＣＸＣＲ４用Ｄ−ＭＥＭ) に懸濁し、細胞培養用シャーレに播種してＣＯ2インキュベーター中３７℃、５％ＣＯ2下で静置培養した。コンフルエントに達した細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ法によりディッシュから剥離し、ＭＡＧＩ−ＣＸＣＲ４用Ｄ−ＭＥＭを加えてピペッティングした。計算板で細胞数を計測し必要量だけ１５ｍＬチューブに移し、遠心後上清をすて細胞数が２×104個／３００μＬとなるように１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭを加えてピペッティングした。９６穴プレートに細胞懸濁液を３００μＬずつ播種し、４８時間静置培養した細胞をＭＡＧＩアッセイに用いた。
【００５６】
ＲＴアッセイに用いたウイルス液をＤ−ＭＥＭで１０分の１、１００分の１、１０００分の１に希釈し、ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎを最終濃度２０μｇ／ｍＬとなるように加えた。９６穴プレートにて培養したＭＡＧＩ細胞の上清を除き、調整したウイルス液を１００μＬずつ加えていった。３７℃で１２時間インキュベーションした後、Ｄ−ＭＥＭを１００μＬずつ加えた。さらに３６時間静置培養した後、上清を除去し、固定液を加え５分インキュベートし、ＰＢＳ（−） で洗浄した後、染色液 (4.0mM K3 [Fe(CN)6], 4.0mM K4 [Fe(CN)6], 2.0mM MgCl2, 0.4 mg/mL X-Gal) を加え、３７℃で５０分インキュベートした。ＰＢＳ（−）で洗浄後、青く染色された細胞数を計測し、得られた値をＨＩＶ−１の感染価とした。
【００５７】
代表的な結果 （ＲＴ活性で補正）を図５に示す。得られた結果より、本発明の化合物１５、化合物１６、および、それらＤＴＴによる還元体は、ＨＩＶ−１の感染価を低下させる効果を有することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤は、医薬、医療等の分野において高い産業上の利用可能性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジスルフィド化合物を有効成分として含有するＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記構造式で表されるジスルフィド化合物及びその還元体等のジチオール化合物が、転写因子ＨＩＶ−ＥＰ１のＤＮＡ結合を阻害することが報告されている（非特許文献１）。ＨＩＶ−ＥＰ１とは、ＨＩＶプロウイルスの長鎖末端反復配列に存在するＤＮＡκＢサイトに結合するＣ2Ｈ2型ジンク・フィンガータンパク質であり、そのＤＮＡ結合によりＨＩＶ−１（human immunodeficiency virus Type-1）の遺伝子発現を活性化する。また、上記化合物は、同様にＨＩＶ−１の遺伝子発現に関係する転写タンパク質の一つであるＳｐ１のＤＮＡ結合を阻害することが報告されている（非特許文献２及び３）。
【化１】
【０００３】
また、上記還元体のピリジン環の４位をアリール基に変えた化合物が、ファルネシル・タンパク質転移酵素の酵素活性を阻害し、抗癌活性を有することも報告されている（非特許文献４及び特許文献１を参照）。ファルネシル・タンパク質転移酵素は、細胞内シグナル伝達に関与する亜鉛酵素であり、癌遺伝子rasの産物であるＲａｓタンパク質のＣ末端のＣＡＡＸボックスと呼ばれる部位にファルネシル基を転移するものである。
【０００４】
上記化合物の有する阻害活性は、いずれも化合物がタンパク質の亜鉛結合部位に作用することによる。
【０００５】
一方、ＡＰＯＢＥＣ（apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide）ファミリータンパク質は、抗ウイルス作用を有する宿主因子の代表的なものとして知られ、特に、ＡＰＯＢＥＣ３タンパク質は、ＨＩＶ−１のウイルスｃＤＮＡを変異させることにより当該ウイルスの複製を阻害することが知られている（非特許文献５）。このファミリーに属するＡＰＯＢＥＣ３Ｇは、ＨＩＶ−１ Ｖｉｆ(Virion infectivity factor)タンパク質の機能解析の過程で同定されたものであるが（非特許文献６）、ＨＩＶ−１感染の標的細胞であるＴ細胞やマクロファージが有する抗ＨＩＶ−１作用をもつ宿主因子であり、シチジンデアミナーゼに保存されたアミノ酸配列を有するＤＮＡ変換酵素である。ＡＰＯＢＥＣ３ＧはＨＩＶ−１ゲノムの逆転写の際に生成される1本鎖 (−) ＤＮＡのシチジンをウラシルに変換する（非特許文献７）。この変異により、（１）２本鎖ＤＮＡになる際に、＋鎖ＤＮＡにグアニンからアデニンへの超変異（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）がおこり、アミノ酸の変異や停止コドンを出現させる経路、（２）ＤＮＡ修復機構 (ＵＮＧ: ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ) を介しウイルスＤＮＡの切断分解を引き起こす経路、（３）一鎖ＤＮＡへのＵの取り込みが＋鎖ＤＮＡの合成そのものを阻害する経路などにより、その後のウイルス複製が阻害されると考えられている（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１９６７３２
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Journal of Medicinal Chemistry 1996, 39, 503-507
【非特許文献２】Bioorganic & Medicinal Chemistry 1997, 5, 205-215
【非特許文献３】有機合成化学協会誌 1997, 55, 41-48
【非特許文献４】Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2003, 13, 1523-1526
【非特許文献５】Judd F Hultquist & Reuben S Harris, Future Virol. (2009)4(6), 605-619
【非特許文献６】A. M. Sheehy ,N. C. Gaddis, J. D. Choi, M. H. Malim, Nature, 418 646 (2002).
【非特許文献７】Q. Yu, R. Konig, S. Pillai, K. Chiles, M. Kearney, S. Palmer, D. Richman, J. M. Coffin, N. R. Landau, Nat. Struct. Mol. Biol., 11, 435 (2004).
【非特許文献８】高折晃史, ウイルス, 55, 267 (2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、抗ＨＩＶ−１作用をもつ宿主因子であるＡＰＯＢＥＣ３の発現を向上させる化合物を有効成分として含有するＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤を提供することである。また、本発明の別の課題は、上記化合物を有効成分として含有する抗ＨＩＶ剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、下記一般式（Ｉ）で表されるジスルフィド化合物がＡＰＯＢＥＣ３の発現向上活性を有し、ＨＩＶ−１の感染価を低下させる効果（即ち、抗ＨＩＶ−１作用）を有することを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明の態様は以下に関する。
〔１〕 一般式（Ｉ）：
【化２】
〔式中、Ｒ1は、水素原子、低級アルコキシ基又はＮＲ2Ｒ3（Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して低級アルキル基を表す）を表し；ｎ１、ｎ２、ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し；Ｙ1及びＹ2は、それぞれ独立して、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
【化３】
（式中、Ｘは、低級アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲノ低級アルキル基、ニトロ基、シアノ基又はアルデヒド基を表し；ｐは、０〜３の整数を表す）を表す〕
で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含有する、ＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
〔２〕 一般式（Ｉ）において、Ｒ1がＮＲ2Ｒ3を表し、Ｒ2及びＲ3がＣ1−Ｃ4アルキル基である、〔１〕に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
〔３〕 Ｒ2及びＲ3がメチル基である、〔２〕に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
〔４〕 一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が一般式（ＩＩ）で表され、Ｘがニトロ基であり、かつｐが１〜２の整数である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
〔５〕 一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が水素原子である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
〔６〕 一般式（Ｉ）において、ｎ１及びｎ２が１であり、かつｍ１及びｍ２が２である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
〔７〕 一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記構造式（ＩＩＩ）：
【化４】
で表される化合物、又は下記構造式（ＩＶ）：
【化５】
で表される化合物である、〔１〕に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
〔８〕 ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現の向上に用いるための〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【００１１】
〔９〕 一般式（Ｉ）：
【化６】
〔式中、Ｒ1は、水素原子、低級アルコキシ基又はＮＲ2Ｒ3（Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して低級アルキル基を表す）を表し；ｎ１、ｎ２、ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し；Ｙ1及びＹ2は、それぞれ独立して、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
【化７】
（式中、Ｘは、低級アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲノ低級アルキル基、ニトロ基、シアノ基又はアルデヒド基を表し；ｐは、０〜３の整数を表す）を表す〕
で表される化合物、その酸化により得られる２量体又は生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含有する、抗ＨＩＶ剤。
〔１０〕 一般式（Ｉ）において、Ｒ1がＮＲ2Ｒ3を表し、Ｒ2及びＲ3がＣ1−Ｃ4アルキル基である、〔９〕に記載の抗ＨＩＶ剤。
〔１１〕 Ｒ2及びＲ3がメチル基である、〔１０〕に記載の抗ＨＩＶ剤。
〔１２〕 一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が一般式（ＩＩ）で表され、Ｘがニトロ基であり、かつｐが１〜２の整数である、〔９〕〜〔１１〕のいずれかに記載の抗ＨＩＶ剤。
〔１３〕 一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が水素原子である、〔９〕〜〔１２〕のいずれかに記載の抗ＨＩＶ剤。
〔１４〕 一般式（Ｉ）において、ｎ１及びｎ２が１であり、かつｍ１及びｍ２が２である、〔９〕〜〔１３〕のいずれかに記載の抗ＨＩＶ剤。
〔１５〕 一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記構造式（ＩＩＩ）：
【化８】
で表される化合物、又は下記構造式（ＩＶ）：
【化９】
で表される化合物である、〔９〕に記載の抗ＨＩＶ剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤は、顕著なＡＰＯＢＥＣ３発現向上活性を有する。また、本発明の抗ＨＩＶ剤は、顕著なＡＰＯＢＥＣ３発現向上活性を有するジスルフィド化合物を有効成分とし、ＨＩＶ感染、それによって引き起こされる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に対して優れた治療効果を有する。ウイルス側の因子を標的とした従来の抗ＨＩＶ感染と比較すると、本発明の抗ＨＩＶ剤は、宿主因子であるＡＰＯＢＥＣ３を標的としていることから、ウイルス遺伝子の変異による薬剤耐性の問題にも対処できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ分解阻害実験におけるウェスタン・ブロッティングの結果を示す図である。図１において、１５は化合物１５を、１６は化合物１６を示す。
【図２】実施例１において、各種プロテアソーム阻害剤を含めたＡＰＯＢＥＣ３Ｇ分解阻害実験におけるウェスタン・ブロッティングの結果を示す図である。図２において、１５は化合物１５を、１６は化合物１６を示す。
【図３】実施例２におけるＲＴアッセイの概要を説明する図である。
【図４】実施例２におけるＭＡＧＩアッセイの概要を説明する図である。
【図５】実施例２において、各化合物についてのＨＩＶ−１感染値を示すグラフである。図５において、１５は化合物１５を、１６は化合物１６を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤は、一般式（Ｉ）：
【化１０】
〔式中、Ｒ1は、水素原子、低級アルコキシ基又はＮＲ2Ｒ3（Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して低級アルキル基を表す）を表し；ｎ１、ｎ２、ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し；Ｙ1及びＹ2は、それぞれ独立して、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
【化１１】
（式中、Ｘは、低級アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲノ低級アルキル基、ニトロ基、シアノ基又はアルデヒド基を表し；ｐは、０〜３の整数を表す）を表す〕
で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含有する。
【００１５】
また、本発明の抗ＨＩＶ剤は、一般式（Ｉ）：
【化１２】
〔式中、Ｒ1は、水素原子、低級アルコキシ基又はＮＲ2Ｒ3（Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して低級アルキル基を表す）を表し；ｎ１、ｎ２、ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し；Ｙ1及びＹ2は、それぞれ独立して、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
【化１３】
（式中、Ｘは、低級アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲノ低級アルキル基、ニトロ基、シアノ基又はアルデヒド基を表し；ｐは、０〜３の整数を表す）を表す〕
で表される化合物、その酸化により得られる２量体又は生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含有する。
【００１６】
本明細書において、「低級アルキル基」とは、例えば、炭素数１ないし６個の直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基であり、より具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、シクロブチル基、シクロプロピルメチル基、ペンチル基、イソペンチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、１−エチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、１−メチルペンチル基、３，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基などを挙げることができる。好ましくはＣ1−Ｃ4アルキル基であり、さらに好ましくはＣ1−Ｃ2アルキル基であり、最も好ましくはメチル基である。
【００１７】
「ハロゲン原子」とはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、好ましくはフッ素原子である。「ハロゲノ低級アルキル基」とは、前記「低級アルキル基」にハロゲン原子が１個又は２個以上置換した基を意味する。置換するハロゲン原子の種類、個数、及び置換位置は特に限定されず、２個以上のハロゲン原子が置換している場合には、ハロゲン原子の種類は同一でも異なっていてもよい。「ハロゲノ低級アルキル基」としては、より具体的には、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジフルオロメチル基、ジクロロメチル基、ジブロモメチル基、フルオロメチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、２−ブロモエチル基、２−クロロエチル基、２−フルオロエチル基、２−ヨ−ドエチル基、３−クロロプロピル基、４−フルオロブチル基、６−ヨードヘキシル基、２，２−ジブロモエチル基のようなハロゲノＣ1−Ｃ6アルキル基を挙げることができ、好ましくはハロゲノＣ1−Ｃ2アルキル基であり、好ましくはフルオロＣ1−Ｃ2アルキル基であり、最も好ましくはトリフルオロメチル基である。
【００１８】
「低級アルコキシ基」とは、前記「低級アルキル基」が酸素原子に結合した基を示し、より具体的には、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ペントキシ基、イソペントキシ基、２−メチルブトキシ基、１−エチルプロポキシ基、２−エチルプロポキシ基、ネオペントキシ基、ヘキシルオキシ基、４−メチルペントキシ基、３−メチルペントキシ基、２−メチルペントキシ基、３，３−ジメチルブトキシ基、２，２−ジメチルブトキシ基、１，１−ジメチルブトキシ基、１，２−ジメチルブトキシ基、１，３−ジメチルブトキシ基、２，３−ジメチルブトキシ基などを挙げることができ、好ましくはＣ1−Ｃ4アルコキシ基であり、さらに好ましくはＣ1−Ｃ2アルコキシ基であり、最も好ましくはメトキシ基である。
【００１９】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤の有効成分に関し、一般式（Ｉ）の好ましい態様として、Ｒ1がＮＲ2Ｒ3（Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、Ｃ1−Ｃ4アルキル基であり、より好ましくはＣ1−Ｃ2アルキル基であり、最も好ましくはメチル基である）であり、ｎ1及びｎ２が１〜３、より好ましくは１〜２、最も好ましくは１であり、ｍ１及びｍ２が１〜２、より好ましくは２であり、Ｙ1及びＹ2が水素原子又は一般式（ＩＩ）で表され、一般式（ＩＩ）においてはＸがニトロ基であり、ｐが１であることが好ましい。
【００２０】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤の有効成分として含まれる最も好ましい化合物としては、下記構造式で表される化合物１５及び化合物１が挙げられる。化合物１は、例えば、ジチオトレイトール (dithiothreitol、ＤＴＴ)を用いることにより、化合物１５を還元することで得られる。
【００２１】
【化１４】
【００２２】
また、本発明の抗ＨＩＶ剤は、一般式（Ｉ）で表される化合物の酸化型化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含有し得る。そのような酸化型化合物としては、上記化合物１を酸化して得られる下記構造式で表される化合物１６が挙げられる。
【００２３】
【化１５】
【００２４】
一般式(I)で表される本発明の化合物、その酸化型化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩などの塩の形態で存在する場合があるが、本発明の範囲にはいかなる塩も包含される。酸付加塩としては、塩酸塩若しくは臭化水素酸塩などの鉱酸塩、又はp-トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、シュウ酸塩、若しくは酒石酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、若しくはカルシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩若しくはエタノールアミン塩などの有機アミン塩などを用いることができる。また、グリシン塩などのアミノ酸塩として存在することもできる。さらに、本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合があるが、これらの物質も本発明の範囲に包含される。また、本発明の化合物は、置換基の種類によっては１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【００２５】
上記一般式(I) に包含される化合物は、上述の非特許文献１〜４、特許文献１に開示されている方法を採用し、あるいはこれら方法に公知慣用技術を組合せて合成することができる。
【００２６】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤は、ＡＰＯＢＥＣ３に属する遺伝子（タンパク質）の発現の向上のために使用され得る。ここで、ＡＰＯＢＥＣ３に属するものとしては、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３ＤＥ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈが知られている。本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤は、このうち、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現の向上のために使用されることが好ましい。
【００２７】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤は、上記の一般式(I)で表される化合物及びその塩、並びにそれらの水和物及びそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる物質の１種又は２種以上を有効成分として含んでいる。また、本発明の抗ＨＩＶ剤は、上記一般式(I)で表される化合物を酸化して得られる化合物及びその塩、並びにそれらの水和物及びそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる物質の１種又は２種以上を有効成分として含むこともできる。本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤としては上記物質それ自体を投与してもよいが、好ましくは、当業者に周知の方法によって製造可能な経口用あるいは非経口用の医薬組成物として投与することができる。経口投与に適する医薬用組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、点眼剤、点鼻剤、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤、経皮吸収剤、又は経粘膜吸収剤等を挙げることができる。
【００２８】
上記の医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、pH調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を挙げることができるが、これらは医薬組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することができ、２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記の医薬組成物には、さらに他の医薬の有効成分の１種又は２種以上を配合して、いわゆる合剤の形態の医薬組成物として用いることもできる。医薬組成物は経口投与用又は非経口投与用のいずれの形態で調製することも可能である。
【００２９】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤の投与経路は特に限定されず、経口投与でも非経口投与（例えば、直腸投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔投与および静脈内投与など）でもよいが、好ましくは経口投与である。
【００３０】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤の投与量は、投与対象又は患者の年齢、体重、症状等に応じて適宜設定することができるが、例えば、有効成分の化合物の量として０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日とすることができる。
【００３１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
［実施例１］
＜ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ分解阻害実験＞
本発明の化合物が、細胞内でＡＰＯＢＥＣ３Ｇの分解を抑制するか検討した。概略、２９３Ｔ細胞にｍｙｃタグが付加されたＡＰＯＢＥＣ３Ｇ (ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ−ｍｙｃ) とＦＬＡＧタグが付加されたＶｉｆ (Ｖｉｆ−ＦＬＡＧ) の発現ベクターと、ＨＩＶ−１感染性クローンｐＮＬ４−３のＶｉｆ欠損体ｐＮＬ−Ｎｄを導入した。導入開始から６時間後に化合物１５（4-(Dimethylamino)-2,6-bis[[N-[2-[(2-nitrophenyl)dithio]ethyl]amino]methyl]pyridine）、化合物１６（4-(Dimethylamino)-2,6-bis [[(2-mercaptoethyl)amino]methyl]pyridineの酸化型）および/またはＤＴＴを加え、さらに３６時間静置培養し、ウイルス液と細胞を回収した。回収した細胞を溶解し、ウェスタン・ブロッティングを行うことで、ＡＰＯＢＥＣ３ＧおよびＶｉｆの発現量を測定した。以下に、化合物１６の合成方法及びＡＰＯＢＥＣ３Ｇ分解阻害実験の手順を説明する。
【００３３】
（化合物１６の合成）
化合物15 (109.0 mg, 0.181 mmol) をCHCl3 5.8 mlに溶かし、dithiothreitol (83.6 mg, 0.542 mmol) を加え室温にて3hr撹拌した。精製水を加え、1M HCl水溶液でpH 1とし、CH2Cl2 (30 ml ×5回) にて洗浄した。水層をsat. NaHCO3水溶液で中和し、CH2Cl2 (30 ml×4回) にて抽出した。MgSO4を加えて乾燥し濾過した。O2雰囲気下室温にて12hr撹拌した。MgSO4を加えて乾燥し濾過した。減圧濃縮し化合物16をアモルファスとして得た。
収量 35.0 mg (0.117 mmol)
収率 65%
1H NMR (C DCl3) δ: 2.59 (4H, t, J = 6.9Hz, S-CH2CH2-N×2), 2.82 (4H, t, J = 6.9Hz, S-CH2CH2-N×2), 2.95 (6H, s, N(CH3)2), 3.76 (4H, s, -CH2-N-×2), 6.27 (2H, s, pyridine)
13C NMR (CDCl3) δ: 39.2 (N(CH3)2), 41.5 (S-CH2CH2-N), 47.7 ( S-CH2CH2-N), 54.9 (-CH2-N-), 104.5 (pyridine), 155.6 (pyridine), 159.5(pyridine)
FAB-MS (m/z) : 299, 597 (M＋H) +
【００３４】
（ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ分解阻害実験）
ヒト胎児腎臓由来上皮細胞である２９３Ｔ細胞〔J. S. Lebkowski, S. Clancy, M. P. Calos, Nature, 317, 169 (1985)〕を、１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地に懸濁し、細胞培養用シャーレに播種して、ＣＯ2インキュベーター中３７℃、５％ＣＯ2下で静置培養した。コンフルエントに達した細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ法によりディッシュから剥離し、１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭを加えてピペッティングした。あらかじめ１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を加えておいた細胞培養用シャーレに細胞懸濁液を播種し、４８時間静置培養した細胞をトランスフェクション実験に用いた。
【００３５】
ＨＩＶ−１の感染性クローンｐＮＬ４−３ 〔A. Adachi, H. E. Gendelman, S. Koenig, T. Folks, R. Willey, A. Rabson, M. A. Martin, J. Virol., 59, 284 (1986)〕のＶｉｆ欠損体ｐＮＬ−Ｎｄ 〔A. Adachi, N. Ono, H. Sakai, K. Ogawa, R. Shibata, T. Kiyomatsu, H. Masuike, S. Ueda, Arch. Virol., 117, 45 (1991)〕と、Ｖｉｆ−ＦＬＡＧを発現させるベクターとしてｐＮＬ−ＡＳＣＦ−ｆＷＴ〔B. Khamsri, M. Fujita, K. Kamada, A. Piroozmand, T. Yamashita, T. Uchiyama, A. Adachi, Int. J. Mol. Med., 18, 679, (2006)〕とを用いた。これらのｍｏｃｋとして、ｐＵＣまたはｐＮＬ−Ａ１ Ｖｉｆ（−） (NIH, USA, Strebel Klaus博士から供与) を用いた。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ−ｍｙｃを発現させるベクターとしてｐｃＤＮＡ−ＡＰＯ３Ｇ (NIH, USA, Strebel Klaus博士から供与) を用い、そのｍｏｃｋとしてｐｃＤＮＡ ３．１（−）を用いた。
【００３６】
遺伝子導入はリン酸カルシウム法で行い、定法に従った。まず、遺伝子発現用プラスミド計１０μｇを用い、超純水で全量を２２０μＬとした。この混合液にＣａＣｌ2水溶液 （２．５Ｍ） ２５μＬを加え、２×Ｈｅｂｓ (42mM HEPES, 290mM NaCl, pH 7.1) ２５０μＬとＮａ2ＨＰＯ4 （７０ｍＭ) ５μＬとの混合溶液に滴下した。３０分間室温でインキュベートした後、細胞培養用シャーレ （６．０ｃｍ） でサブコンフルエント状態にある２９３Ｔ細胞に添加した。３７℃にて６時間培養後、Ｄ−ＭＥＭで置換した。遺伝子導入開始４８時間後に細胞を回収した。遺伝子発現用プラスミドの各組成を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
上記の通り、２９３Ｔ細胞に各種プラスミドベクターを用いてトランスフェクションを行い、遺伝子導入より６時間後上清をＤ−ＭＥＭで置換した際に、ＤＴＴ（１５μＭ）、化合物１５（最終濃度が５μＭ）、化合物１６（最終濃度が５μＭ）、化合物１５（最終濃度が５μＭ）及びＤＴＴ（１５μＭ）の混合物、化合物１６（最終濃度が５μＭ）及びＤＴＴ（１５μＭ）の混合物をそれぞれ添加した。遺伝子導入より４８時間後、スクレーパーにより細胞を剥離して１５ｍＬチューブに移し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。細胞にＰＢＳ（−）１５０μＬと２×sampling buffer １５０μＬを加え、ヒートブロックにより加熱 (100℃, 1 時間)した後、遠心 (14,000 rpm, 1分, r.t.) して上清をウエスタンブロッティング用のサンプルとした。
【００３９】
次に、上記回収した細胞について、通常のウエスタンブロッティング法により解析した。ウエスタンブロッティング用のサンプルについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ＰＶＤＦ膜に転写(100V, 4℃, 3 時間) した。転写したＰＶＤＦ膜を、５％スキムミルクを含むＰＢＳＴ (0.1%Tween-20を含むPBS (-) ) 中で１時間振盪することでマスキングを行った。ＰＶＤＦ膜に１次抗体 (anti-myc又はanti-FLAG) を用いて１時間抗体反応を行った。ＰＢＳＴで洗浄後２次抗体 (anti-mouse IgG) を用いて１時間抗体反応を行った。反応終了後、ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで洗浄し、基質との反応を行い、FUJIFILM LAS-3000（富士フィルム社製）を用いて検出した。その結果を図１に示す。
【００４０】
その結果、予想通りＶｉｆ非存在下ではＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現が見られたが、Ｖｉｆ存在下で発現量は低下した。意外なことに化合物１５および化合物１５＋ＤＴＴを加えたものの存在下では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現量が顕著に上昇した。その発現量はＶｉｆ非存在下よりも高いことから、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇがこの実験系ではＶｉｆ以外の因子により分解を受けており、それが化合物１５および化合物１５＋ＤＴＴを加えたものにより分解阻害されることが示唆された。
【００４１】
次に、この分解がプロテアソーム分解であるかどうか調べるために、前述した実験と同様の方法でプロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２およびLactacystinと活性を比較した。また、同時にBis(2-nitrophenyl)disulfideについても同様の実験を行った。そのウェスタンブロッティングの結果を図２に示す。
【００４２】
その結果、ＭＧ１３２およびLactacystinでも化合物１５と同様ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現量上昇が見られ、この分解がプロテアソーム分解であること、化合物１５やＭＧ１３２またはLactacystinによりプロテアソーム分解が阻害されることが示された。また、Bis(2-nitrophenyl)disulfideはＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現量を上昇させなかった。
【００４３】
また、化合物のin vitroにおけるプロテアソーム阻害活性を、A. Asai, T. Tsujita, S. V. Sharma, Y. Yamashita, S. Akinaga, M. Funakoshi, H. Kobayashi, T. Mizukami, Biochem. Pharmacol., 67, 227 (2004)に記載の方法により調べた。その結果を表２に示す。結果として、化合物１５、１６、１６+ＤＴＴはプロテアソーム分解阻害活性を示し、その中でも化合物１５は最も高いプロテアソーム分解阻害活性を有することが判明した
【００４４】
【表２】
【００４５】
また、Ｖｉｆの発現量を調べたところ、化合物１５存在下で発現上昇は見られないが、ＭＧ１３２存在下で発現が強く上昇した。Ｖｉｆがプロテアソーム分解を受け、その分解がＭＧ１３２により阻害されることは既に報告されている（M. Fujita, H. Akari, A. Sakurai, A. Yoshida, T. Chiba, K. Tanaka, K. Strebel, A. Adachi, Microbes and Infection, 6, 791 (2004)）。しかし、ここでは化合物１５はＶｉｆのプロテアソーム分解を阻害せず、選択的にＡＰＯＢＥＣ３Ｇのプロテアソーム分解を阻害することが示唆された。
【００４６】
（実施例２）
＜ＨＩＶ−１感染阻害実験＞
次に、実際に化合物１５及び１６がＡＰＯＢＥＣ３Ｇを発現した細胞内でＨＩＶ−１の感染を抑制するか検討した。ＨＩＶ−１の放出量（下記ＲＴアッセイの結果）で補正した感染価をその指標に用いた。
【００４７】
（１）ＲＴアッセイ (ＨＩＶ−１放出量の測定)
本ＲＴアッセイは、R. L. Willey, P. H. Smith, L. A. Lasky, T. S. Thedore, P. L. Earl, B. Moss, D. J. Capon, M. A. Mavtia, J. Virol., 62, 139 (1988)に記載の方法に基づくものである。
【００４８】
ＲＴアッセイの手順を概略すると、２９３Ｔ細胞にＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現ベクターとＨＩＶ−１感染性クローンｐＮＬ４−３を導入し、導入開始から６時間後に化合物１５、１６および/またはＤＴＴ、ＴＰＥＮを加えさらに４２時間静置培養し、ウイルス液を回収した。ウイルス液を溶解して逆転写酵素をとりだし、PolyA, Oligo(dT)12-18 プライマー, ［α32P］-TTPを加えた。オリゴヌクレオチドを単離し、β線を測定することで逆転写酵素 （ＲＴ）の量を算出し、ＨＩＶ−１の放出量とした。ＲＴアッセイ法の概略を図３に示し、以下、その手順について詳述する。
【００４９】
下記遺伝子導入に用いたプラスミドは、上述のＨＩＶ−１の感染性クローンｐＮＬ４−３、及びそのＶｉｆ欠損体ｐＮＬ−Ｎｄである。これらのｍｏｃｋとしてｐＵＣを用いた。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現ベクターとしてｐｃＤＮＡ−ＡＰＯ３Ｇ (NIH, USA, Strebel Klaus博士から供与) を用いた。
【００５０】
遺伝子導入はリン酸カルシウム法で行い、定法に従った。まず、遺伝子発現用プラスミド計３．３μｇを用い、精製水で全量を７３．３μＬとした。この混合液にＣａＣｌ2水溶液 （２．５Ｍ）８．３μＬを加え、2×Hebs (42mM HEPES, 290mM NaCl, pH 7.1) ８３．３μＬとＮａ2ＨＰＯ4 (70mM) １．７μＬとの混合溶液に滴下した。３０分間室温でインキュベートした後、細胞培養用シャーレ （３．５ｃｍ） でサブコンフルエント状態にある２９３Ｔ細胞に添加した。３７℃にて６時間培養後、Ｄ−ＭＥＭで置換した。遺伝子導入開始４８時間後に細胞を回収した。遺伝子発現用プラスミドの組成を表３に示す。
【００５１】
【表３】
【００５２】
２９３Ｔ細胞に各種プラスミドベクターを用いて遺伝子導入した後６時間後上清をＤ−ＭＥＭで置換した時に、ＤＴＴ（１５μＭ）、化合物１５（最終濃度が５μＭ）、化合物１６（最終濃度が５μＭ）、化合物１５（最終濃度が５μＭ）及びＤＴＴ（１５μＭ）の混合物、化合物１６（最終濃度が５μＭ）及びＤＴＴ（１５μＭ）の混合物、並びにＴＰＥＮ（最終濃度が５μＭ）をそれぞれ添加した。遺伝子導入より４８時間後、上清を回収し、遠心 (3,000rpm, １０分, r.t.) した後、上清をウイルス液として得た。この溶液５μＬにＲＴカクテル (50mM Tris-HCl, pH7.8, 75mM KCl, 2.0mM DTT, 5.0mM MgCl2, 0.5μｇ/mL Poly A, 6.3μg/ml Oligo d(T)12-18, 0.05% NP40 25μＬ, [α32P]-TTPを適量(1日目: 0.025μＬ))加え３７℃で３時間静置培養した。これを１０μＬずつクロマトグラフィーペーパーにしみ込ませ、2×SSC (300mM NaCl, 30.0mM Sodium citrate) で洗浄した後乾燥させ、シンチレーションカウンターでβ線を検出した。得られた値をＨＩＶ−１の放出量とした。
【００５３】
（２） ＭＡＧＩアッセイ（ＨＩＶ−１感染価の測定）
本ＭＡＧＩアッセイは、J. Kimpton, M. Emerman, J. Virol., 66, 2232 (1992)に記載の方法に基づくものである。
【００５４】
ＭＡＧＩアッセイの手順を概略すると、ＲＴアッセイに用いたウイルス液をあらかじめ培養したＭＡＧＩ−ＣＸＣＲ４に添加し、感染させた。ＭＡＧＩ−ＣＸＣＲ４にはＣＤ４、ＣＸＣＲ４、ＬＴＲ−β−ｇａｌが導入されている。ＨＩＶ−１が感染するとＨＩＶ−１の転写活性化タンパク質Ｔａｔが発現し、これがＬＴＲ領域にあるＴＡＲに結合し、その下流にあるβ−ｇａｌ遺伝子の転写を促進する。生じたβ−ガラクトシダーゼに基質であるＸ−Ｇａｌを加え、青く染まった細胞を数えることでＨＩＶ−１感染価を測定した。ＭＡＧＩアッセイの概略を図４に示す。以下、その手順を詳述する。
【００５５】
ヒト子宮頸癌由来細胞であるＨｅＬａ細胞にＣＤ４、ＣＸＣＲ４、ＬＴＲ−β−gal遺伝子を導入したＭＡＧＩ−ＣＸＣＲ４細胞を、１０％ＦＣＳ、０．２ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８、 ０．１ｍｇ／ｍＬ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ、１μg/ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ含有Ｄ−ＭＥＭ (以下、ＭＡＧＩ−ＣＸＣＲ４用Ｄ−ＭＥＭ) に懸濁し、細胞培養用シャーレに播種してＣＯ2インキュベーター中３７℃、５％ＣＯ2下で静置培養した。コンフルエントに達した細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ法によりディッシュから剥離し、ＭＡＧＩ−ＣＸＣＲ４用Ｄ−ＭＥＭを加えてピペッティングした。計算板で細胞数を計測し必要量だけ１５ｍＬチューブに移し、遠心後上清をすて細胞数が２×104個／３００μＬとなるように１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭを加えてピペッティングした。９６穴プレートに細胞懸濁液を３００μＬずつ播種し、４８時間静置培養した細胞をＭＡＧＩアッセイに用いた。
【００５６】
ＲＴアッセイに用いたウイルス液をＤ−ＭＥＭで１０分の１、１００分の１、１０００分の１に希釈し、ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎを最終濃度２０μｇ／ｍＬとなるように加えた。９６穴プレートにて培養したＭＡＧＩ細胞の上清を除き、調整したウイルス液を１００μＬずつ加えていった。３７℃で１２時間インキュベーションした後、Ｄ−ＭＥＭを１００μＬずつ加えた。さらに３６時間静置培養した後、上清を除去し、固定液を加え５分インキュベートし、ＰＢＳ（−） で洗浄した後、染色液 (4.0mM K3 [Fe(CN)6], 4.0mM K4 [Fe(CN)6], 2.0mM MgCl2, 0.4 mg/mL X-Gal) を加え、３７℃で５０分インキュベートした。ＰＢＳ（−）で洗浄後、青く染色された細胞数を計測し、得られた値をＨＩＶ−１の感染価とした。
【００５７】
代表的な結果 （ＲＴ活性で補正）を図５に示す。得られた結果より、本発明の化合物１５、化合物１６、および、それらＤＴＴによる還元体は、ＨＩＶ−１の感染価を低下させる効果を有することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤及び抗ＨＩＶ剤は、医薬、医療等の分野において高い産業上の利用可能性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
〔式中、Ｒ1は、水素原子、低級アルコキシ基又はＮＲ2Ｒ3（Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して低級アルキル基を表す）を表し；ｎ１、ｎ２、ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し；Ｙ1及びＹ2は、それぞれ独立して、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
【化２】
（式中、Ｘは、低級アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲノ低級アルキル基、ニトロ基、シアノ基又はアルデヒド基を表し；ｐは、０〜３の整数を表す）を表す〕
で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含有するＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項２】
一般式（Ｉ）において、Ｒ1がＮＲ2Ｒ3を表し、Ｒ2及びＲ3がＣ1−Ｃ4アルキル基である、請求項１に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項３】
Ｒ2及びＲ3がメチル基である、請求項２に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項４】
一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が一般式（ＩＩ）で表され、Ｘがニトロ基であり、かつｐが１〜２の整数である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項５】
一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が水素原子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項６】
一般式（Ｉ）において、ｎ１及びｎ２が１であり、かつｍ１及びｍ２が２である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項７】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記構造式（ＩＩＩ）：
【化３】
で表される化合物、又は下記構造式（ＩＶ）：
【化４】
で表される化合物である、請求項１に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項８】
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現の向上に用いるための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項９】
一般式（Ｉ）：
【化５】
〔式中、Ｒ1は、水素原子、低級アルコキシ基又はＮＲ2Ｒ3（Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して低級アルキル基を表す）を表し；ｎ１、ｎ２、ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し；Ｙ1及びＹ2は、それぞれ独立して、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
【化６】
（式中、Ｘは、低級アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲノ低級アルキル基、ニトロ基、シアノ基又はアルデヒド基を表し；ｐは、０〜３の整数を表す）を表す〕
で表される化合物、その酸化により得られる２量体又は生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含有する、抗ＨＩＶ剤。
【請求項１０】
一般式（Ｉ）において、Ｒ1がＮＲ2Ｒ3を表し、Ｒ2及びＲ3がＣ1−Ｃ4アルキル基である、請求項９に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１１】
Ｒ2及びＲ3がメチル基である、請求項１０に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１２】
一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が一般式（ＩＩ）で表され、Ｘがニトロ基であり、かつｐが１〜２の整数である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１３】
一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が水素原子である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１４】
一般式（Ｉ）において、ｎ１及びｎ２が１であり、かつｍ１及びｍ２が２である、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１５】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記構造式（ＩＩＩ）：
【化７】
で表される化合物、又は下記構造式（ＩＶ）：
【化８】
で表される化合物である、請求項９に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
〔式中、Ｒ1は、水素原子、低級アルコキシ基又はＮＲ2Ｒ3（Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して低級アルキル基を表す）を表し；ｎ１、ｎ２、ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し；Ｙ1及びＹ2は、それぞれ独立して、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
【化２】
（式中、Ｘは、低級アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲノ低級アルキル基、ニトロ基、シアノ基又はアルデヒド基を表し；ｐは、０〜３の整数を表す）を表す〕
で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含有するＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項２】
一般式（Ｉ）において、Ｒ1がＮＲ2Ｒ3を表し、Ｒ2及びＲ3がＣ1−Ｃ4アルキル基である、請求項１に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項３】
Ｒ2及びＲ3がメチル基である、請求項２に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項４】
一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が一般式（ＩＩ）で表され、Ｘがニトロ基であり、かつｐが１〜２の整数である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項５】
一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が水素原子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項６】
一般式（Ｉ）において、ｎ１及びｎ２が１であり、かつｍ１及びｍ２が２である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項７】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記構造式（ＩＩＩ）：
【化３】
で表される化合物、又は下記構造式（ＩＶ）：
【化４】
で表される化合物である、請求項１に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項８】
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの発現の向上に用いるための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＡＰＯＢＥＣ３発現向上剤。
【請求項９】
一般式（Ｉ）：
【化５】
〔式中、Ｒ1は、水素原子、低級アルコキシ基又はＮＲ2Ｒ3（Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して低級アルキル基を表す）を表し；ｎ１、ｎ２、ｍ１及びｍ２は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し；Ｙ1及びＹ2は、それぞれ独立して、水素原子又は一般式（ＩＩ）：
【化６】
（式中、Ｘは、低級アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲノ低級アルキル基、ニトロ基、シアノ基又はアルデヒド基を表し；ｐは、０〜３の整数を表す）を表す〕
で表される化合物、その酸化により得られる２量体又は生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含有する、抗ＨＩＶ剤。
【請求項１０】
一般式（Ｉ）において、Ｒ1がＮＲ2Ｒ3を表し、Ｒ2及びＲ3がＣ1−Ｃ4アルキル基である、請求項９に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１１】
Ｒ2及びＲ3がメチル基である、請求項１０に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１２】
一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が一般式（ＩＩ）で表され、Ｘがニトロ基であり、かつｐが１〜２の整数である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１３】
一般式（Ｉ）において、Ｙ1及びＹ2が水素原子である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１４】
一般式（Ｉ）において、ｎ１及びｎ２が１であり、かつｍ１及びｍ２が２である、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１５】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記構造式（ＩＩＩ）：
【化７】
で表される化合物、又は下記構造式（ＩＶ）：
【化８】
で表される化合物である、請求項９に記載の抗ＨＩＶ剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−２３１０５３（Ｐ２０１１−２３１０５３Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０３１８２（Ｐ２０１０−１０３１８２）
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【出願人】（５０４１５９２３５）国立大学法人 熊本大学 (314)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【出願人】（５０４１５９２３５）国立大学法人 熊本大学 (314)
【Ｆターム（参考）】
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