ＢＡＣクローンを用いる肝細胞癌の発生リスク評価方法及び予後予測方法
【課題】肝細胞癌の発生リスク及び予後不良リスクを決定するための新規な方法を提供する。
【解決手段】本発明は、（ａ）被験体の肝組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、肝細胞癌発生関連領域又は肝細胞癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が発癌高リスク群又は予後不良群に分類されるか否かを決定するステップを含む、肝細胞癌の発生リスク又は予後不良リスクを検出する方法に関する。
【解決手段】本発明は、（ａ）被験体の肝組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、肝細胞癌発生関連領域又は肝細胞癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が発癌高リスク群又は予後不良群に分類されるか否かを決定するステップを含む、肝細胞癌の発生リスク又は予後不良リスクを検出する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞癌発生関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を決定することを含む、肝細胞癌の発生リスクの評価方法に関する。また、本発明は、肝細胞癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を決定することを含む、肝細胞癌の予後不良リスクの検出方法に関する。特に、本発明は、特定のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域でのＤＮＡメチル化の有無を決定することを含む、肝細胞癌の発生リスクの評価方法及び予後不良リスクの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌は、主要な発生要因が明らかになっている癌の種類の１つである。最も多い要因は、肝炎ウイルスの持続感染である。ウイルスの持続感染によって、肝細胞で長期にわたって炎症と再生が繰り返されるうちに、遺伝子の突然変異が蓄積し、肝細胞癌の発生に至ると考えられている。肝炎ウイルスにはＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型などの種類があり、肝細胞癌に関連するのは主にＢ型及びＣ型の２種類である。
【０００３】
世界中で発生する肝細胞癌の約７５％がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の持続感染によるものである。日本では、肝細胞癌の８０％がＨＣＶ、１５％がＨＢＶの持続感染に起因するものであると試算されている。
【０００４】
慢性肝炎及び肝硬変症は肝細胞癌に対する前癌状態と考えられており、慢性肝炎及び肝硬変症の患者は長く経過観察される。慢性肝炎及び肝硬変症の患者で、肝細胞癌の発生リスクが高ければ、特に密に経過観察をして早期に肝細胞癌を発見し、手術療法等を行うべきである。よって、慢性肝炎又は肝硬変症のために経過観察中の患者の肝生検標本等の試料を用いた、将来肝細胞癌を発症するリスクを評価するための指標の開発が望まれる。
【０００５】
また、上記のとおり肝細胞癌の主な原因は肝炎ウイルスの持続感染である。肝切除などの肝臓癌の治療は、その原因である肝炎ウイルスをも根絶するものではない。そのため、肝臓癌が一旦完治しても、再発する場合も少なからずある。再発を防止する方法について様々な試みがなされているが、確実な手段は未だ開発されていない。したがって、肝細胞癌の治療が完了しても、定期的なチェックが必要である。治療法ごとの治療後５年生存率は、肝切除術を受けた患者で５０〜６０％、穿刺療法を受けた患者で４０〜５０％、肝動脈塞栓術を受けた患者で約２０％である。再発時に早期に治療を開始できるように、個々の個体で肝細胞癌の再発リスクを評価する方法が望まれている。
【０００６】
癌細胞ではゲノム配列の欠失及び増幅、ＣｐＧアイランドのメチル化による発現抑制、ヒストンタンパク質の脱アセチル化による遺伝子の発現抑制、遺伝子点突然変異等が起こっていることが、頻繁に報告されている。
【０００７】
本発明者らは、肝細胞癌の多段階の発癌過程の早期、すなわち前癌段階からＤＮＡメチル化異常が寄与するとの分子病理学的知見を蓄積してきた（非特許文献１及び２）。
【０００８】
【非特許文献１】Ｋａｎａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００７，２８：２４３４−２４４２
【非特許文献２】Ｋａｎａｉ，Ｙ．，Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．，２００８，５８：５４４−５５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のとおり、慢性肝炎及び肝硬変症の患者で将来肝細胞癌を発症するリスクを評価するための指標の開発が望まれ、また肝細胞癌の再発リスクを評価する方法も望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、肝組織検体でのゲノム配列のメチル化について、以下に詳細に説明するようにＢＡＭＣＡ法を用いて網羅的に解析し、複数の肝細胞癌発生関連領域及び肝細胞癌予後関連領域を特定した。
【００１１】
本発明は、具体的には以下の特徴を有する。
〔１〕以下のステップ：
（ａ）被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、肝細胞癌発生関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が発癌高リスク群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、肝細胞癌の発生リスクを検出する方法。
【００１２】
〔２〕前記肝細胞癌発生関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１に含まれるゲノム領域を包含する、上記〔１〕に記載の方法。
【００１３】
〔３〕前記肝細胞癌発生関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、上記〔１〕に記載の方法。
【００１４】
〔４〕以下のステップ：
（ａ）被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、肝細胞癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、肝細胞癌の予後不良リスクを検出する方法。
【００１５】
〔５〕前記肝細胞癌予後関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５に含まれるゲノム領域を包含する、上記〔４〕に記載の方法。
【００１６】
〔６〕前記肝細胞癌予後関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、上記〔４〕に記載の方法。
【００１７】
〔７〕ＤＮＡメチル化を、ＢＡＭＣＡ法によって調べる、上記〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔８〕ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１を少なくとも含む、肝細胞癌の発生リスクを評価するためのアレイ。
【００１８】
〔９〕ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５を少なくとも含む、肝細胞癌の予後不良リスクを決定するためのアレイ。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、肝細胞癌の発生リスク及び予後不良リスクを判定することができる。慢性肝炎や肝硬変症の患者について肝細胞癌の発生リスクを知ることができれば、より精密な肝細胞癌のスクリーニングを行い、肝細胞癌を早期に発見して治療効果を高めることができる。また、肝細胞癌の予後不良リスクの評価により肝内再発を早期に発見できれば、慢性肝炎や肝硬変症により肝予備能が限られていても、肝内再発巣が小型・少数であるうちに、再度の肝部分切除、穿刺療法、冠動脈塞栓術等を施行できる。さらに、肝細胞癌の予後不良リスクの評価により転移を早期に発見できれば、それらに対して免疫療法や分子標的治療薬などの奏効が期待できる。したがって、本発明は医療・健康科学分野で非常に大きな利益をもたらすことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本明細書中、「肝細胞癌」とは、肝臓の実質である肝細胞から発生する原発性肝癌を意味する。
一態様では、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、肝細胞癌発生関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が発癌高リスク群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、肝細胞癌の発生リスクを検出する方法に関する。
【００２１】
また、別の態様では、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、肝細胞癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、肝細胞癌の予後不良リスクを検出する方法に関する。
【００２２】
好ましい実施形態では、上記の態様のステップ（ｂ）において、ＤＮＡメチル化をＢＡＭＣＡ法によって調べる。
【００２３】
ＢＡＭＣＡ法
本明細書中、ＢＡＭＣＡ法とは、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＢＡＣアレイに基づくメチル化ＣｐＧアイランド増幅法）の略称であり、特定のゲノム領域におけるメチル化を検出することができるアッセイ方法である。
【００２４】
以下に、ＢＡＭＣＡ法の代表的な態様を例示する。被験組織（癌組織など）と対照組織（正常組織など）から、フェノール／クロロホルム法などによりＤＮＡを調製し、各々のＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩ（メチル化感受性制限酵素；切断後に平滑末端を形成させる）で消化する。この場合、ＳｍａＩ認識部位がメチル化されている場合には、当該メチル化部位はＳｍａＩで消化されないために、次のステップのＸｍａＩ（メチル化非感受性制限酵素；ＳｍａＩと同じ配列を認識し、切断後に突出末端を形成させる）で消化される。ＸｍａＩ切断末端特異的アダプターライゲーションを行い、ＰＣＲ法で被験組織に由来するＸｍａＩ断片を、例えば蛍光色素Ｃｙ３にて標識し、増幅する。一方、対照組織に由来するＸｍａＩ断片を、例えば蛍光色素Ｃｙ５にて標識する。その両者を混合し、数多くのＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡを搭載した高密度ゲノムアレイ上で競合ハイブリダイゼーション（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行う。ここで、被験組織由来ＤＮＡにおいて、ある領域の両端のＳｍａＩ認識部位がメチル化されていると、当該メチル化部位はＳｍａＩによっては切断されず、当該領域に対応したＸｍａＩ断片が生成される。ＸｍａＩ断片はアダプターライゲーション後のＰＣＲにより標識を伴って増幅される。当該領域が被験組織由来ＤＮＡのみでメチル化されており、対照組織ではメチル化されていない場合、当該プローブ配列に対応する配列を含むＢＡＣクローンを担持するスポットで、Ｃｙ３（被験組織）／Ｃｙ５（対照組織）の比が上昇する。例えば、この値が１．０以上となることを指標として、癌特異的にメチル化されたＤＮＡ断片に一致する配列を含むＢＡＣクローンを同定することができる。この一連のＢＡＭＣＡ法の過程を、図１に示す。
【００２５】
競合ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の条件により行うことができる：上記のように蛍光色素で標識したＤＮＡ断片を、場合により、反復配列をブロックするＣｏｔ−１ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの存在下にてエタノール沈殿する。ＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液（ホルムアミド５ｍＬ、硫酸デキストラン１ｇ、２０×ＳＣＣを混合し滅菌水で７ｍＬに調整）に再懸濁し、ＳＤＳ及び酵母ｔＲＮＡを加え、７５℃にて１０分間変性させる。３７℃にて３０分間インキュベートした後、ＤＮＡ溶液を自動マイクロアレイハイブリダイゼーション装置（Ｈｙｂ４、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）にセットしたアレイにアプライし、４３℃にて４８〜７２時間インキュベートし、ＤＮＡ断片をアレイにハイブリダイズさせる。インキュベート終了後、ハイブリダイゼーション装置を用いて、５０％ホルムアミド＋２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）で４５℃、３０秒間の洗浄を６回、０．１×リン酸ナトリウムバッファー＋ＮＰ４０で２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．２×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回行う。ハイブリダイゼーション装置からアレイを取り出し、０．１×ＳＳＣで室温、５分間の洗浄を行う。
【００２６】
ハイブリダイゼーションが完了したアレイにおける蛍光を、例えば、スキャナ（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ４１００Ａ等）で読み取った後、数値化ソフト（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ５．０等）によって数値化し、肝細胞癌検体及び対照検体における各ＢＡＣクローンの蛍光強度比を算出することができる。
【００２７】
肝細胞癌発生関連領域及び肝細胞癌予後関連領域
好ましい実施形態では、本発明において用いる「肝細胞癌発生関連領域」は、以下に示すようにＢＡＭＣＡ法などの適切な方法により、そのＤＮＡメチル化と肝細胞癌の発生リスクとの関連が示されたゲノム領域である。
【００２８】
本発明者らは、全染色体領域を網羅的に解析するために、正常肝組織と肝細胞癌症例より得られた非癌肝組織に対して、約４５００種類のＢＡＣ ＤＮＡを搭載した高密度ゲノムアレイであるＭＣＧ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ−４５００（Ｉｎａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．，９５（７）：５５９−５６３，２００４）を用いてＢＡＭＣＡ法を実施して、ウィルコクソン検定により正常肝組織と肝細胞癌症例から得られた非癌肝組織でメチル化パターンに差異を有するＢＡＣクローンを特定した。さらに、それらＢＡＣクローンに含まれる肝細胞癌発生関連領域でのメチル化パターンの解析により、正常肝組織検体と肝細胞癌症例から得られた非癌肝組織検体とを区別することが可能であることを示した。すなわち、本発明において、「肝細胞癌発生関連領域」とは、限定するものではないが、以下の２５のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域を包含する：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１。
【００２９】
好ましい実施形態では、試験対象の検体において、上記の２５のＢＡＣクローンのうち１４クローン以上で、以下の実施例に記載する表１に示したものなどの判断基準を満たす場合に、肝細胞癌の発癌高リスク群に属すると判断することができる。
【００３０】
また、別の好ましい実施形態では、本発明において用いる「肝細胞癌発生関連領域」は、以下に示すようにＢＡＭＣＡ法などの適切な方法により、そのＤＮＡメチル化と肝細胞癌の発生リスクとの関連が示されたゲノム領域である。
【００３１】
本発明者らは、上記と同様、ＭＣＧ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ−４５００（Ｉｎａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，上掲）を用いてＢＡＭＣＡ法を実施して、ウィルコクソン検定により予後良好群肝細胞癌組織と予後不良群肝細胞癌組織でメチル化パターンに差異を有するＢＡＣクローンを特定した。さらに、それらＢＡＣクローンに含まれる肝細胞癌予後関連領域でのメチル化パターンの解析により、予後良好症例と予後不良症例とを区別することが可能であることを示した。すなわち、本発明において、「肝細胞癌予後関連領域」とは、限定するものではないが、以下の４１のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域を包含する：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５。
【００３２】
好ましい実施形態では、試験対象の検体において、上記の４１のＢＡＣクローンのうち３２クローン以上で、以下の実施例に記載する表２に示したものなどの判断基準を満たす場合に、肝細胞癌の発癌高リスク群に属すると判断することができる。
【００３３】
また、別の好ましい実施形態では、本発明において用いる「肝細胞癌予後関連領域」は、以下に示すようにＢＡＭＣＡ法などの適切な方法により、そのＤＮＡメチル化と肝細胞癌の予後不良リスクとの関連が示されたゲノム領域である。
【００３４】
ここで、上記のＢＡＣクローンは、ＲＰＣＩ ＢＡＣライブラリー１１に含まれるクローンであり、該ライブラリー中での参照番号により示されている。ＲＰＣＩ ＢＡＣライブラリー１１は、ヒト男性の血液から採取したゲノムを、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ＢＡＣベクターに挿入することにより作製されたライブラリーである。ＲＰＣＩ ＢＡＣライブラリーはＲＰＣＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手可能である。また、一部のクローンについては、その全長配列をデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手可能である。全長配列がデータベースに登録されていないクローンについても、ＮＣＢＩ Ｃｌｏｎｅ Ｒｅｇｉｓｔｒｙデータベースから、ゲノム上の位置、末端配列などについての情報を得ることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｃｌｏｎｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。全長配列又は末端配列がデータベースから入手可能な６４クローンについての、全長配列又は末端配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号を以下に挙げる：
【００３５】
全長配列 末端配列
肝細胞癌発生関連領域
ＲＰ１１−１０４Ｊ１３ ＢＺ７４９０２４
ＣＧ７３４２３３
ＣＧ７３４２３４
ＲＰ１１−５２Ｉ２ ＢＺ７４９１５１
ＢＺ７４９１５０
ＲＰ１１−２９Ｍ２２ Ｂ８７６２３
ＢＺ７４９１２０
ＢＺ７４９１２１
ＲＰ１１−２１Ｋ１ ＡＣ０２６４８２
ＲＰ１１−１０９Ｂ１５ ＡＱ３２２００２
ＡＱ３５００７３
ＲＰ１１−８８Ｂ２４ ＡＺ５１６１２８
ＡＱ２８６６１８
ＡＱ２８６６１６
ＲＰ１１−１１２Ｂ７ ＡＣ０９３６３０
ＲＰ１１−４８Ｄ２１ ＡＱ１９９４４８
ＡＱ１９９４５１
ＲＰ１１−１２０Ｅ２０ ＡＣ０６０８１２
ＡＣ１３６３６４
ＲＰ１１−３３４Ｅ６ ＡＰ００３３９６
ＲＰ１１−１７Ｍ１７ Ｂ８２７８６
Ｂ８２７８７
ＲＰ１１−３１９Ｅ１６ ＡＣ００６２０６
ＲＰ１１−１１００Ｌ３ ＡＣ０２５２５９
ＲＰ１１−７９９Ｏ６ ＡＣ０２３４９９
ＲＰ１１−１１９Ｊ２１ ＡＱ３４１１４０
ＲＰ１１−３３２Ｎ６ ＡＺ０８１７９６
ＡＺ０８１７９９
ＲＰ１１−５２９Ｅ４ ＡＺ０８１７９２
ＡＺ０８１８００
ＲＰ１１−８９Ｍ４ ＡＱ２８３３８２
ＡＱ２８３３８５
ＲＰ１１−２１５Ｍ５ ＡＣ０２７４６７
ＲＰ１１−３４８Ｂ１２ ＡＣ０２１６１８
ＲＰ１１−１３４Ｇ２２ ＡＱ３４４４１２
ＲＰ１１−３５４Ｉ１２ ＡＬ０７８６１３
ＲＰ１１−５５Ｊ１１ ＡＱ０８３４８１
ＡＱ０８３４８２
ＲＰ１１−４８０Ｍ１１ ＡＬ１５９９８８
肝細胞癌予後関連領域
ＲＰ１１−８９Ｋ１６ ＡＺ５１７２５４
ＡＱ２８２９４９
ＡＱ２８２９５０
ＲＰ１１−２０１Ｏ１４ ＡＣ０２５４９３
ＡＬ３５６３２０
ＲＰ１１−１５６Ｋ６ ＡＣ０４０８９７
ＡＣ０９３１１８
ＡＬ３５５６７３
ＲＰ１１−５５３Ｋ８ ＡＬ１５７４０２
ＲＰ１１−８９Ｅ１０ ＡＺ５１７０１４
ＡＱ２８２７３８
ＡＱ２８２７４１
ＲＰ１１−９０Ｂ１３ ＡＺ５１７９７９
ＡＱ２８３５２８
ＡＱ２８３５３１
ＲＰ１１−４４９Ｂ１９ ＡＱ５８４２４８
ＡＱ５８４２５２
ＲＰ１１−３０Ｍ１ ＡＣ０１３４５６
ＲＰ１１−８９Ｂ１３ ＡＱ２８３６３８
ＡＱ２８３６４０
ＲＰ１１−２５５Ｏ１９ ＡＣ０１６９２２
ＡＣ０９０９４５
ＲＰ１１−４２１Ｆ９ ＡＣ０１１３２３
ＡＣ１３３１４１
ＲＰ１１−１２２Ｄ１９ ＡＣ０１８３５４
ＡＣ１１５２８２
ＲＰ１１−３６Ｋ８ ＡＱ０４６９２７
ＲＰ１１−１０１Ｎ１７ ＡＱ３２０３８６
ＡＱ３２０３８９
ＲＰ１１−１７７Ｌ７ ＡＱ４１７４４１
ＡＱ４１７４４３
ＲＰ１１−１３Ｏ１４ Ｂ７６１８７
Ｂ８３４３３
Ｂ７６１８６
ＲＰ１１−８８Ｈ１６ ＡＱ２８６８０９
ＡＺ５１６２４８
ＡＺ５１６２５１
ＡＱ２８６８０６
ＲＰ１１−９１Ｇ９ ＡＱ２８１３６６
ＡＱ２８１３６９
ＲＰ１１−７９Ｋ２２ ＡＰ００６２０１
ＲＰ１１−１２６Ｂ８ ＡＱ３４８９４６
ＲＰ１１−８９Ｐ１１ ＡＱ２８５６４５
ＡＱ２８５６４６
ＲＰ１１−８８Ｎ８ ＡＣ０８７５３２
ＡＦ３０５８７４
ＲＰ１１−８５Ｃ２１ ＡＬ１６１４５６
ＲＰ１１−７１４Ｍ１６ ＡＬ３５５２７３
ＲＰ１１−４８Ａ２ ＡＱ２０１９２９
ＡＱ２０１９３１
ＲＰ１１−２０６Ｉ１ ＡＱ４２１５０５
ＡＱ４２１５０６
ＲＰ１１−３５Ｆ１１ ＡＱ０４５３０７
ＡＱ０４５３０８
ＲＰ１１−１５８Ｉ９ ＡＰ００４６０９
ＲＰ１１−７４Ｉ８ ＡＱ２３８２６１
ＡＱ２６９２３４
ＲＰ１１−１６７Ｂ４ ＡＣ００７２１７
ＲＰ１１−３６８Ｎ２１ ＡＣ００９０８６
ＲＰ１１−３０３Ｇ２１ ＡＺ０８１８８５
ＡＺ０８１８８６
ＲＰ１１−１５１Ｍ１９ ＡＱ３７７０５２
ＡＱ３７７０５５
ＲＰ１１−１３５Ｎ５ ＡＣ０１５７９９
ＲＰ１１−３９８Ａ１ ＡＺ２５４６３９
ＡＺ３０１１４２
ＲＰ１１−１５Ａ１ ＡＣ００６２１３
ＲＰ１１−６９７Ｂ１０ ＡＣ０２７２１８
ＲＰ１１−７９Ａ３ ＡＺ５２０６６０
ＡＱ２８１４７９
ＡＱ２８２１７０
ＲＰ１１−２９Ｈ１９ Ｂ８７５７９
ＲＰ１１−３６Ｎ５ ＡＱ０４５１２９
【００３６】
データベースに配列情報が開示されていない以下の２クローン：ＲＰ１１−３２８Ｍ１７及びＲＰ１１−１８０Ｌ２１に関しては、それぞれについてＳＴＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｔａｇｇｅｄ ｓｉｔｅ）配列が特定されている。ＳＴＳ配列については、以下に示すコード番号を用いてデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｕｎｉｓｔｓ）を検索することにより、具体的な情報を得ることができる。それぞれのクローンに対して特定されているＳＴＳ配列についての情報を、以下に挙げる：
【００３７】
ＲＰ１１−３２８Ｍ１７
ＵｎｉＳＴＳ：６３１８９
Ｄ２２Ｓ９２２
フォワードプライマー：ＴＡＴＣＴＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧ（配列番号１）
リバースプライマー：ＴＴＣＣＴＣＡＧＴＴＴＴＡＣＣＴＧＴＧＣＴ（配列番号２）
ＰＣＲ産物サイズ：１２１−１２３ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｚ５０８９６
【００３８】
ＲＰ１１−１８０Ｌ２１
ＵｎｉＳＴＳ：４９９６９
Ｄ２Ｓ２１８２
フォワードプライマー：ＧＣＴＣＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＴＴＧＡＴＣＣ（配列番号３）
リバースプライマー：ＧＧＣＴＡＡＧＣＣＴＡＧＡＴＧＣＴＴＧＡ（配列番号４）
ＰＣＲ産物サイズ：２２８−２４２ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｚ５２４２３
【００３９】
当業者であれば、上記の入手可能な配列情報をもとに、前記ＢＡＣライブラリーから、本発明に係るＢＡＣクローンを入手することが可能である。
【００４０】
繰り返して言うが、本発明の方法を実施するために用いる肝細胞癌発生関連領域及び肝細胞癌予後関連領域は、上記のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域には限定されず、ＢＡＭＣＡ法などの適切な方法によりそのメチル化が肝細胞癌と関連付けられる他の領域であり得る。
【００４１】
肝細胞癌発生関連領域でのＤＮＡメチル化を、ＢＡＭＣＡ法をはじめとする、下記で例示するような公知の手法を用いて検査することにより、肝細胞癌の発生リスクを評価することが可能であり、また、肝細胞癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化を検査することにより、肝細胞癌の予後不良リスクを決定することが可能である。
【００４２】
ＤＮＡメチル化
本明細書中、「ＣｐＧアイランド」とは、高等生物、特に哺乳動物のゲノム配列中、非翻訳領域に存在するＧ（グアニン）Ｃ（シトシン）含量が多い領域である。「ＣｐＧアイランド」の「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「ｐ」はシトシンとグアニンとの間のホスホジエステル結合を表している。すなわち、ＣｐＧアイランドには、隣接したシトシンとグアニンとがホスホジエステル結合で結合されたジヌクレオチドの繰り返し配列が含まれる。ＣｐＧアイランドの長さは約３００〜３０００塩基対である。ＣｐＧアイランドは、一般に、全配列中にＣｐＧ配列を統計的に期待される６％と同じか又はそれを上回る割合で含む。ＣｐＧアイランド以外のゲノム領域では、ＣＧサプレッションのため、ＣｐＧ配列の含量は１％以下である。
【００４３】
本明細書中、「ＤＮＡメチル化」（又は単に「メチル化」）とは、上記のＣｐＧ配列において、シトシンの５位の炭素がメチル化されていることを意味する。
【００４４】
正常肝組織１０検体及び肝細胞癌症例からの非癌肝組織１５検体に対して、上記のＢＡＭＣＡ法により解析し、ウィルコクソン検定及びサポートベクターマシンアルゴリズムを利用して、正常肝組織と肝細胞癌症例から得られた非癌肝組織とを区別することが可能な２５ＢＡＣクローンを特定した。続いて、これらのクローンを用いた階層的クラスタリングにより、正常肝組織と肝細胞癌症例から得られた非癌肝組織とを別のクラスターに分類することが可能であることを示した（図２）。
【００４５】
肝細胞癌の発生リスクに関わるそれらの領域でのメチル化の有無の判定基準を、例としてＢＡＭＣＡ法を用いて求めた。その例を図３に示す。また、各ＢＡＣクローンについて求めた判定基準を、以下の実施例中の表１に示す。
【００４６】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された肝細胞癌発生関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、例えば前癌状態にある被験者の検体の中から、肝細胞癌が発生するリスクが高い群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
【００４７】
すなわち、例えば上記の２５クローンに含まれるゲノム領域について、メチル化の有無を検査し、その結果を陽性対照及び陰性対照と比較することにより、肝細胞癌の発生リスクを評価することができる。
【００４８】
さらに、異なる予後を有する症例（予後良好群：肝切除術後４年以上生存した症例；予後不良群：肝切除術後６ヵ月以内に再発して１年以内に死亡した症例）の肝細胞癌組織の１１検体について、上記のＢＡＭＣＡ法により解析し、ウィルコクソン検定を利用して、予後良好症例と予後不良症例とを区別することが可能な４１ＢＡＣクローンを特定した。続いて、これらのクローンを用いた階層的クラスタリングにより、予後良好群と予後不良群とを別のクラスターに分類することが可能であることを示した（図５）。
【００４９】
肝細胞癌の予後に関わるそれらの領域でのメチル化の有無の判定基準を、例としてＢＡＭＣＡ法を用いて求めた。その例を図６に示す。また、各ＢＡＣクローンについて求めた判定基準を、以下の実施例中の表２に示す。
【００５０】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された肝細胞癌予後関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、肝細胞癌症例の中から、予後不良な群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
【００５１】
すなわち、例えば上記の４１クローンに含まれるゲノム領域について、メチル化の有無を検査し、その結果を陽性対照及び陰性対照と比較することにより、肝細胞癌の予後不良リスクを決定することができる。
【００５２】
ゲノム領域におけるＤＮＡメチル化の状態を調べるためには、上記のＢＡＭＣＡ法（図１）の他に、ＰＣＲを利用する別の方法、及びサザンブロッティングを利用する方法などを用いることができる。
【００５３】
ＰＣＲを利用する別の方法としては、以下のものなどを挙げることができる：
（ａ）バイサルファイトシークエンシング法：ゲノムＤＮＡをバイサルファイト変換するとシトシンがウラシルに変換されるが、メチル化シトシンにおいてはこの反応がほとんど進まず、シトシンのままとなる。この反応を利用すれば、ＤＮＡメチル化状態の差が塩基配列に変換される。バイサルファイト変換したゲノム領域をＰＣＲ増幅してクローン化するなどし、塩基配列を決定することにより、ＤＮＡメチル化の有無を知ることができる。
（ｂ）ＣＯＢＲＡ法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ、バイサルファイト変換−制限酵素法）：（ａ）と同様にゲノムＤＮＡをバイサルファイト変換して塩基配列を変化させた後に、当該ゲノムＤＮＡを制限酵素で切断して制限酵素の認識部位が残っているか残っていないかを調べることにより、ＤＮＡメチル化の有無を知ることができる。
（ｃ）メチル化特異的ＰＣＲ法：（ａ）と同様にゲノムＤＮＡをバイサルファイト変換し、塩基配列を変化させた後に、当該ゲノムＤＮＡを鋳型として、塩基配列が変化している場合（メチル化がない）に増幅できるプライマー、又は塩基配列が変化していない場合（メチル化がある）に増幅できるプライマーを用いてそれぞれＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ産物の有無によってＤＮＡメチル化の有無を知ることができる。
【００５４】
サザンブロッティングを利用する方法は、以下のように実施することができる。試験する検体中のゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化すると、メチル化されている認識部位は切断されず、メチル化されていない認識部位は切断される。消化済みのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、ＤＮＡ断片をナイロンメンブレンなどにトランスファーし、３２Ｐなどで標識した標的特異的なプローブをハイブリダイズさせる。このとき、検出されるバンドの長さの違いから、対象となる領域のメチル化の有無を知ることができる。
【００５５】
これらの方法において用いる「メチル化感受性制限酵素」とは、例えばＳｍａＩ及びＨｐａＩＩであり、好ましくはＳｍａＩである。それらのメチル化感受性酵素と同じ認識配列を認識する非メチル化感受性酵素は当業者が容易に知ることができ、これをメチル化感受性酵素と組み合わせて上記のようなＤＮＡメチル化の検査方法において用いることができる。
【００５６】
これらの方法を用いるメチル化の検査における、肝細胞癌発生関連領域又は肝細胞癌予後関連領域でのメチル化の有無の判定基準は、当業者ならば公知の統計学的手法等を用いて適宜決定することができる。具体的には、例えば、肝細胞癌検体の予後不良群を陽性対照とし、予後良好群を陰性対照として、所望のＤＮＡメチル化検査法により肝細胞癌予後関連領域のＤＮＡメチル化状態を調べる。その結果を陽性対照と陰性対照とで比較することにより、各肝細胞癌予後関連領域について有意な測定値の閾値を決定する。それにより、その閾値を用いたメチル化検査で陽性（又は陰性）と判定された場合に、検査対象の検体を予後不良群に含めるべきであると規定することができる。
【００５７】
アレイ
本発明は、さらに、上記のように特定された２５のＢＡＣクローン又は４１のＢＡＣクローンを搭載した、肝細胞癌の発生リスク又は予後不良リスクを決定するためのアレイにも関する。
【００５８】
この場合、「アレイ」とは、適切な基板上にゲノム配列を含む複数のＤＮＡを位置特異的な様式で定着（スポット）させたデバイスを意味する。基板は、好ましくは固体基板であり、具体的には、ガラス、プラスチック、メンブレン等が挙げられる。好ましい基板はスライドガラスのようなガラス基板である。ガラス製の固体基板には、ＤＮＡの定着の前に、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着によるコーティングを施すことが望ましい。
【００５９】
本発明を、実施例を用いて以下により詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によりなんら制限されるものではない。
【実施例１】
【００６０】
肝細胞癌発生リスク
検体
国立がんセンター中央病院（日本、東京）で部分肝切除術を受けた肝細胞癌患者の外科切除された組織から、非癌肝組織の１５検体を得た。組織学的検査から、これらの検体のうち５検体において慢性肝炎が、９検体において肝硬変が見られ、１検体においては顕著な組織学的知見は見られなかった。
【００６１】
比較のために、肝細胞癌を患っていない患者から正常肝組織の１０検体を得た。これらの検体について、顕著な組織学的知見は見られなかった。正常肝組織を採取した患者は、９人が原発性大腸癌の肝転移のために部分肝切除術を受け、１人は胃の消化管間質腫瘍の肝転移のために部分肝切除術を受けた。
【００６２】
ＢＡＭＣＡ法
上記の検体について、ＢＡＭＣＡ法を実施した。以下に説明するＢＡＭＣＡ法の実施の詳細については、文献（Ｍｉｓａｗａ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６５：１０２３３−１０２４２，２００５；Ｓｕｇｉｎｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６：７４０１−１３，２００７；Ｔａｎａｋａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６：６４５６−６８，２００７）にも記載されている。
【００６３】
肝細胞癌組織（被験肝組織）、正常肝組織（被験肝組織）、及び参照として用いた正常肝組織の混合物（参照正常肝組織）から、フェノール／クロロホルム法によりＤＮＡを調製し、各々のＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩ（メチル化感受性制限酵素；切断後に平滑末端を形成させる）で消化した。この場合、ＳｍａＩ認識部位がメチル化されている場合には、当該メチル化部位はＳｍａＩで消化されないために、次のステップのＸｍａＩ（メチル化非感受性制限酵素；ＳｍａＩと同じ配列を認識し、切断後に突出末端を形成させる）で消化される。ＸｍａＩ切断末端特異的アダプターライゲーションを行い、ＰＣＲ法で被験肝組織に由来するＸｍａＩ断片を蛍光色素Ｃｙ−３にて標識し、増幅した。一方、参照正常肝組織に由来するＸｍａＩ断片を蛍光色素Ｃｙ−５にて標識した。蛍光色素での標識は、ＢｉｏＰｒｉｍｅ ａｒｒａｙ ＣＧＨ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。アダプターライゲーション及びＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りである：
Ａｄａｐｔｏｒ−Ｌ：ＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧＡＣ（配列番号５）
Ａｄａｐｔｏｒ−Ｓ：ＣＣＧＧＧＴＣＧＧＴＧＡ（配列番号６）
【００６４】
ＰＣＲはＡｄａｐｔｏｒ−Ｌと同一の配列を有するプライマーを用いて行った。
被験肝組織由来のＤＮＡ断片と参照正常肝組織由来のＤＮＡ断片の両者を混合し、４３６１種類のＢＡＣクローンを搭載した高密度ＣＧＨアレイ（ＭＣＧ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ−４５００；Ｉｎａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．，９５（７）：５５９−５６３，２００４）上で競合ハイブリダイゼーション（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。競合ハイブリダイゼーションは、以下の条件により行った：上記のように蛍光色素で標識したＤＮＡ断片を、反復配列をブロックするＣｏｔ−１ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下にてエタノール沈殿した。ＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液（ホルムアミド５ｍＬ、硫酸デキストラン１ｇ、２０×ＳＣＣを混合し滅菌水で７ｍＬに調整）に再懸濁し、ＳＤＳ及び酵母ｔＲＮＡを加え、７５℃にて１０分間変性させた。３７℃にて３０分間インキュベートした後、ＤＮＡ溶液を自動マイクロアレイハイブリダイゼーション装置（Ｈｙｂ４、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）にセットしたアレイにアプライし、４３℃にて７２時間インキュベートし、ＤＮＡ断片をアレイにハイブリダイズさせた。インキュベート終了後、ハイブリダイゼーション装置を用いて、５０％ホルムアミド＋２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）で４５℃、３０秒間の洗浄を６回、０．１×リン酸ナトリウムバッファー＋ＮＰ４０で２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．２×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回行った。ハイブリダイゼーション装置からアレイを取り出し、０．１×ＳＳＣで室温、５分間の洗浄を行った。
【００６５】
ハイブリダイゼーションが完了したアレイにおける蛍光を、スキャナ（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ４１００Ａ）で読み取った後、数値化ソフト（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ５．０）によって数値化し、解析ソフト（三井情報株式会社のＡｃｕｅ２）によって解析して、被験検体及び対照検体における各ＢＡＣクローンの蛍光強度比を算出した。
【００６６】
ここで、肝細胞癌組織由来ＤＮＡにおいて、ある領域の両端のＳｍａＩ認識部位がメチル化されていると、当該メチル化部位はＳｍａＩによっては認識されず、当該領域に対応したＸｍａＩ断片が生成される。ＸｍａＩ断片はアダプターライゲーション後のＰＣＲにより標識を伴って増幅され、プローブが生成される。その結果、当該プローブ配列に対応する配列を含むＢＡＣクローンを担持するスポットで、Ｃｙ３（被験検体）／Ｃｙ５（正常対照）の比が上昇する。例えば、この値が１．０以上となることを指標として、癌特異的にメチル化されたＤＮＡ断片に一致する配列を含むＢＡＣクローンを同定することができる。ＢＡＭＣＡ法の過程を、図１に示す。
【００６７】
肝細胞癌発生関連領域の同定
ＤＮＡメチル化パターンの解析により肝細胞癌の発生リスクを決定するのに有効なゲノム領域を特定するために、検体を正常群及び発癌高リスク群に分類するのに有益なＢＡＣクローンを同定した。同定の手順は以下の通りである。
【００６８】
はじめに、正常肝組織検体と肝細胞癌症例から得られた非癌肝組織検体とでメチル化パターンが異なる５１２ＢＡＣクローンをウィルコクソン検定を用いて特定した。ここから、サポートベクターマシンアルゴリズムを用いたスポットランキング解析により、４０クローンを選び出した。ウィルコクソン検定については、例えば、市原清志著「バイオサイエンスの統計学」（南江堂、１９９０年）、５０ページに記載されており、サポートベクターマシンアルゴリズムについては、例えば、Ｄａｖｉｄ Ｗ． Ｍｏｕｎｔ著、岡崎康司・坊農秀雄監訳「バイオインフォマティクス第２版」（メディカル・サイエンス・インターナショナル、２００５年）、６０７ページ、及びＮｅｌｌｏ Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉ、Ｊｏｈｎ Ｓｈａｗｅ−Ｔａｙｌｏｒ著、大北剛訳「サポートベクターマシン入門」（共立出版、２００５年）などに記載されている。
【００６９】
続いて、各検体が発癌高リスク群に属することを判定するときの「感度」及び「特異性（特異度）」を、以下のように規定した：
感度＝所定の判断基準により発癌高リスク群に属するとされた症例数／肝細胞癌症例からの非癌肝組織検体数×１００（％）
特異度＝所定の判断基準により正常群に属するとされた症例数／正常肝組織検体数×１００（％）。
【００７０】
この感度及び特異度が最大となるように、各クローンについて以下に示すカットオフ値を設定した。
【００７１】
上記で設定した感度又は特異度が７０％以上となった２５のＢＡＣクローンを特定した。それらのクローンに含まれるゲノム領域を、肝細胞癌発生関連領域と称した。
【００７２】
同定された肝細胞癌発生関連領域のＢＡＣクローンは、以下の２５クローンである：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１。
【００７３】
上記で特定した肝細胞癌発生関連領域２５クローンについて、発癌高リスクの判定基準並びに感度及び特異度を以下の表１に示す。判定基準の数値は、上記で詳述したＢＡＭＣＡ法で得られる蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比である。
【００７４】
【表１】
【００７５】
上記で特定した２５クローンを用い、２次元階層的クラスタリングにより、上記のＢＡＭＣＡ法を用いて得られた測定結果を分析し、２５の検体を２つのクラスター（発癌高リスククラスター及び正常クラスター）に分類した（図２）。非常に簡略化して言えば、これらのクラスターはＤＮＡメチル化パターンの違いにより分類されたと言うことができる。２つのクラスターは、肝細胞癌症例から得た非癌肝組織（慢性肝炎又は肝硬変状態にあるものを含む）と正常肝組織のそれぞれに対応していた。
【００７６】
検出値の閾値の一例を図３に示す。この中で、例えば、ＲＰ１１−１７Ｍ１７については、ＢＡＭＣＡ法での蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比が０．９３未満であるとき、肝細胞癌症例から得られた非癌肝組織検体を感度９３．３％、特異度９０．０％で肝細胞癌高リスク群に分類することができる。
【００７７】
表１の判断基準を満たすＢＡＣクローン数のヒストグラムを、図４に示す。正常肝組織群では判断基準を満たすＢＡＣクローンの数は少なく（図４：左側）、肝細胞癌症例より得られた非癌肝組織群では判断基準を満たすＢＡＣクローンの数は多く（図４：右側）、その差異は明瞭である。このヒストグラムに基づいて、表１の判断基準を１４ＢＡＣクローン以上で満たす非癌肝組織を発癌高リスク群と判断することとすると、肝細胞癌症例より得られた非癌肝組織を感度・特異度ともに１００％で発癌高リスク群に分類することができる。
【００７８】
上記の方法が妥当であることを確認するために、検証セットの１８検体において同様の解析を行った。表１の判断基準を１４ＢＡＣクローン以上で満たす非癌肝組織を発癌高リスク群と判断する場合、検証セットの肝細胞癌症例から得られた非癌肝組織（９検体）を、感度・特異度ともに１００％で発癌高リスク群に分類することができた。
【００７９】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された肝細胞癌発生関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、特にこれらの領域のうちの１４領域以上で所定の判断基準を満たすか否かを検討することにより、発癌リスクの高い群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
【実施例２】
【００８０】
肝細胞癌予後不良リスク
検体
国立がんセンター中央病院（日本、東京）で部分肝切除術を受けた肝細胞癌患者の外科切除された組織から、原発性肝細胞癌組織の１９検体を得た。１９検体のうち、５検体は肝切除術後４年以上生存した患者からのもの（予後良好症例）であり、６検体は肝切除術後６ヵ月以内に再発し、１年以内に死亡した患者からのもの（予後不良症例）であった。
【００８１】
肝細胞癌予後関連領域の同定
上記と同様にＢＡＭＣＡ法を行い、予後良好症例と予後不良症例の１１検体についての結果に基づき、両症例群でＢＡＭＣＡ法のシグナル比が顕著に異なる４１のＢＡＣクローンを選択した。
【００８２】
同定された肝細胞癌予後関連領域のＢＡＣクローンは、以下の４１クローンである：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５。
【００８３】
続いて、各検体が予後不良群に属することを判定するときの「感度」及び「特異性（特異度）」を、以下のように規定した：
感度＝所定の判断基準により予後不良群に属するとされた症例数／予後不良症例検体数×１００（％）
特異度＝所定の判断基準により予後良好群に属するとされた症例数／予後良好症例検体数×１００（％）。
【００８４】
この感度及び特異度が最大となるように、各クローンについて以下に示すカットオフ値を設定した。
【００８５】
上記の肝細胞癌予後関連領域４１クローンについて、予後不良の判定基準並びに感度及び特異度を以下の表２に示す。判定基準の数値は、実施例１で詳述したＢＡＭＣＡ法で得られる蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比である。
【００８６】
【表２】
【００８７】
４１のＢＡＣクローンを用いた２次元階層的クラスタリングを図５に示す。予後良好群の５検体と、予後不良群の６検体は、異なるクラスターに分類された。
【００８８】
検出値の閾値の一例を図６に示す。この中で、例えば、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４については、ＢＡＭＣＡ法での蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比が１．２２未満であるとき、予後不良クラスターに属する検体を感度１００％、特異度１００％で予後不良群に分類することができる。
【００８９】
表２の判断基準を満たすＢＡＣクローン数のヒストグラムを、図７に示す。予後良好群では判断基準を満たすＢＡＣクローンの数は少なく（図７：左側）、予後不良群では判断基準を満たすＢＡＣクローンの数は多く（図７：右側）、その差異は明瞭である。
【００９０】
続いて、１９の全検体について、表２の判断基準に基づき評価した。１９検体を、判断基準を満たすＢＡＣクローンの数（３２クローン以上 ｖｓ．３２クローン未満）に基づいて２群に分けた。図８は、全１９患者についてのカプラン・マイヤー生存曲線を示している。表２の判断基準を３２クローン以上で満たした患者の無病生存率（図８Ａ：実線）は、表２の判断基準を３２クローン未満しか満たさなかった患者の無病生存率（図８Ａ：点線）と比較して、有意に短かった（Ｐ＝０．０００４）。表２の判断基準を３２クローン未満でしか満たさなかった患者は、観察期間中には１人も死亡しなかった（図８Ｂ：点線）。
【００９１】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された肝細胞癌予後関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、特にこれらの領域のうちの３２領域以上で所定の判断基準を満たすか否かを検討することにより、予後不良な群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
上記の実験は、国立がんセンター（日本、東京）倫理委員会により承認を得て行った。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によれば、肝細胞癌の発生リスク及び予後不良リスクを判定することができる。したがって、本発明は医療・健康科学分野で用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ＢＡＭＣＡ法の概略を示す模式図である。
【図２】正常肝組織検体及び肝細胞癌症例からの非癌肝組織検体についての肝細胞癌発生関連領域のＤＮＡメチル化パターンに基づく階層的クラスタリングを示す図である。
【図３】各ＢＡＣクローンにおける、発癌リスクの判定のための判断基準を示す図である。ＢＡＭＣＡ法における蛍光強度比の散布図として示されている。
【図４】表１の判断基準を満たすＢＡＣクローン数のヒストグラムである。
【図５】肝細胞癌検体についての肝細胞癌予後関連領域のＤＮＡメチル化パターンに基づく階層的クラスタリングを示す図である。
【図６】各ＢＡＣクローンにおける、予後不良クラスターの判定のための判断基準を示す図である。ＢＡＭＣＡ法における蛍光強度比の散布図として示されている。
【図７】表２の判断基準を満たすＢＡＣクローン数のヒストグラムである。
【図８】全１９患者についてのカプラン・マイヤー生存曲線である。
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
配列番号１〜４：プライマー
配列番号５及び６：アダプター
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞癌発生関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を決定することを含む、肝細胞癌の発生リスクの評価方法に関する。また、本発明は、肝細胞癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を決定することを含む、肝細胞癌の予後不良リスクの検出方法に関する。特に、本発明は、特定のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域でのＤＮＡメチル化の有無を決定することを含む、肝細胞癌の発生リスクの評価方法及び予後不良リスクの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌は、主要な発生要因が明らかになっている癌の種類の１つである。最も多い要因は、肝炎ウイルスの持続感染である。ウイルスの持続感染によって、肝細胞で長期にわたって炎症と再生が繰り返されるうちに、遺伝子の突然変異が蓄積し、肝細胞癌の発生に至ると考えられている。肝炎ウイルスにはＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型などの種類があり、肝細胞癌に関連するのは主にＢ型及びＣ型の２種類である。
【０００３】
世界中で発生する肝細胞癌の約７５％がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の持続感染によるものである。日本では、肝細胞癌の８０％がＨＣＶ、１５％がＨＢＶの持続感染に起因するものであると試算されている。
【０００４】
慢性肝炎及び肝硬変症は肝細胞癌に対する前癌状態と考えられており、慢性肝炎及び肝硬変症の患者は長く経過観察される。慢性肝炎及び肝硬変症の患者で、肝細胞癌の発生リスクが高ければ、特に密に経過観察をして早期に肝細胞癌を発見し、手術療法等を行うべきである。よって、慢性肝炎又は肝硬変症のために経過観察中の患者の肝生検標本等の試料を用いた、将来肝細胞癌を発症するリスクを評価するための指標の開発が望まれる。
【０００５】
また、上記のとおり肝細胞癌の主な原因は肝炎ウイルスの持続感染である。肝切除などの肝臓癌の治療は、その原因である肝炎ウイルスをも根絶するものではない。そのため、肝臓癌が一旦完治しても、再発する場合も少なからずある。再発を防止する方法について様々な試みがなされているが、確実な手段は未だ開発されていない。したがって、肝細胞癌の治療が完了しても、定期的なチェックが必要である。治療法ごとの治療後５年生存率は、肝切除術を受けた患者で５０〜６０％、穿刺療法を受けた患者で４０〜５０％、肝動脈塞栓術を受けた患者で約２０％である。再発時に早期に治療を開始できるように、個々の個体で肝細胞癌の再発リスクを評価する方法が望まれている。
【０００６】
癌細胞ではゲノム配列の欠失及び増幅、ＣｐＧアイランドのメチル化による発現抑制、ヒストンタンパク質の脱アセチル化による遺伝子の発現抑制、遺伝子点突然変異等が起こっていることが、頻繁に報告されている。
【０００７】
本発明者らは、肝細胞癌の多段階の発癌過程の早期、すなわち前癌段階からＤＮＡメチル化異常が寄与するとの分子病理学的知見を蓄積してきた（非特許文献１及び２）。
【０００８】
【非特許文献１】Ｋａｎａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００７，２８：２４３４−２４４２
【非特許文献２】Ｋａｎａｉ，Ｙ．，Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．，２００８，５８：５４４−５５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のとおり、慢性肝炎及び肝硬変症の患者で将来肝細胞癌を発症するリスクを評価するための指標の開発が望まれ、また肝細胞癌の再発リスクを評価する方法も望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、肝組織検体でのゲノム配列のメチル化について、以下に詳細に説明するようにＢＡＭＣＡ法を用いて網羅的に解析し、複数の肝細胞癌発生関連領域及び肝細胞癌予後関連領域を特定した。
【００１１】
本発明は、具体的には以下の特徴を有する。
〔１〕以下のステップ：
（ａ）被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、肝細胞癌発生関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が発癌高リスク群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、肝細胞癌の発生リスクを検出する方法。
【００１２】
〔２〕前記肝細胞癌発生関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１に含まれるゲノム領域を包含する、上記〔１〕に記載の方法。
【００１３】
〔３〕前記肝細胞癌発生関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、上記〔１〕に記載の方法。
【００１４】
〔４〕以下のステップ：
（ａ）被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、肝細胞癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、肝細胞癌の予後不良リスクを検出する方法。
【００１５】
〔５〕前記肝細胞癌予後関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５に含まれるゲノム領域を包含する、上記〔４〕に記載の方法。
【００１６】
〔６〕前記肝細胞癌予後関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、上記〔４〕に記載の方法。
【００１７】
〔７〕ＤＮＡメチル化を、ＢＡＭＣＡ法によって調べる、上記〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の方法。
〔８〕ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１を少なくとも含む、肝細胞癌の発生リスクを評価するためのアレイ。
【００１８】
〔９〕ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５を少なくとも含む、肝細胞癌の予後不良リスクを決定するためのアレイ。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、肝細胞癌の発生リスク及び予後不良リスクを判定することができる。慢性肝炎や肝硬変症の患者について肝細胞癌の発生リスクを知ることができれば、より精密な肝細胞癌のスクリーニングを行い、肝細胞癌を早期に発見して治療効果を高めることができる。また、肝細胞癌の予後不良リスクの評価により肝内再発を早期に発見できれば、慢性肝炎や肝硬変症により肝予備能が限られていても、肝内再発巣が小型・少数であるうちに、再度の肝部分切除、穿刺療法、冠動脈塞栓術等を施行できる。さらに、肝細胞癌の予後不良リスクの評価により転移を早期に発見できれば、それらに対して免疫療法や分子標的治療薬などの奏効が期待できる。したがって、本発明は医療・健康科学分野で非常に大きな利益をもたらすことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本明細書中、「肝細胞癌」とは、肝臓の実質である肝細胞から発生する原発性肝癌を意味する。
一態様では、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、肝細胞癌発生関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が発癌高リスク群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、肝細胞癌の発生リスクを検出する方法に関する。
【００２１】
また、別の態様では、本発明は、以下のステップ：
（ａ）被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、肝細胞癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、肝細胞癌の予後不良リスクを検出する方法に関する。
【００２２】
好ましい実施形態では、上記の態様のステップ（ｂ）において、ＤＮＡメチル化をＢＡＭＣＡ法によって調べる。
【００２３】
ＢＡＭＣＡ法
本明細書中、ＢＡＭＣＡ法とは、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＢＡＣアレイに基づくメチル化ＣｐＧアイランド増幅法）の略称であり、特定のゲノム領域におけるメチル化を検出することができるアッセイ方法である。
【００２４】
以下に、ＢＡＭＣＡ法の代表的な態様を例示する。被験組織（癌組織など）と対照組織（正常組織など）から、フェノール／クロロホルム法などによりＤＮＡを調製し、各々のＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩ（メチル化感受性制限酵素；切断後に平滑末端を形成させる）で消化する。この場合、ＳｍａＩ認識部位がメチル化されている場合には、当該メチル化部位はＳｍａＩで消化されないために、次のステップのＸｍａＩ（メチル化非感受性制限酵素；ＳｍａＩと同じ配列を認識し、切断後に突出末端を形成させる）で消化される。ＸｍａＩ切断末端特異的アダプターライゲーションを行い、ＰＣＲ法で被験組織に由来するＸｍａＩ断片を、例えば蛍光色素Ｃｙ３にて標識し、増幅する。一方、対照組織に由来するＸｍａＩ断片を、例えば蛍光色素Ｃｙ５にて標識する。その両者を混合し、数多くのＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡを搭載した高密度ゲノムアレイ上で競合ハイブリダイゼーション（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行う。ここで、被験組織由来ＤＮＡにおいて、ある領域の両端のＳｍａＩ認識部位がメチル化されていると、当該メチル化部位はＳｍａＩによっては切断されず、当該領域に対応したＸｍａＩ断片が生成される。ＸｍａＩ断片はアダプターライゲーション後のＰＣＲにより標識を伴って増幅される。当該領域が被験組織由来ＤＮＡのみでメチル化されており、対照組織ではメチル化されていない場合、当該プローブ配列に対応する配列を含むＢＡＣクローンを担持するスポットで、Ｃｙ３（被験組織）／Ｃｙ５（対照組織）の比が上昇する。例えば、この値が１．０以上となることを指標として、癌特異的にメチル化されたＤＮＡ断片に一致する配列を含むＢＡＣクローンを同定することができる。この一連のＢＡＭＣＡ法の過程を、図１に示す。
【００２５】
競合ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の条件により行うことができる：上記のように蛍光色素で標識したＤＮＡ断片を、場合により、反復配列をブロックするＣｏｔ−１ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの存在下にてエタノール沈殿する。ＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液（ホルムアミド５ｍＬ、硫酸デキストラン１ｇ、２０×ＳＣＣを混合し滅菌水で７ｍＬに調整）に再懸濁し、ＳＤＳ及び酵母ｔＲＮＡを加え、７５℃にて１０分間変性させる。３７℃にて３０分間インキュベートした後、ＤＮＡ溶液を自動マイクロアレイハイブリダイゼーション装置（Ｈｙｂ４、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）にセットしたアレイにアプライし、４３℃にて４８〜７２時間インキュベートし、ＤＮＡ断片をアレイにハイブリダイズさせる。インキュベート終了後、ハイブリダイゼーション装置を用いて、５０％ホルムアミド＋２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）で４５℃、３０秒間の洗浄を６回、０．１×リン酸ナトリウムバッファー＋ＮＰ４０で２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．２×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回行う。ハイブリダイゼーション装置からアレイを取り出し、０．１×ＳＳＣで室温、５分間の洗浄を行う。
【００２６】
ハイブリダイゼーションが完了したアレイにおける蛍光を、例えば、スキャナ（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ４１００Ａ等）で読み取った後、数値化ソフト（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ５．０等）によって数値化し、肝細胞癌検体及び対照検体における各ＢＡＣクローンの蛍光強度比を算出することができる。
【００２７】
肝細胞癌発生関連領域及び肝細胞癌予後関連領域
好ましい実施形態では、本発明において用いる「肝細胞癌発生関連領域」は、以下に示すようにＢＡＭＣＡ法などの適切な方法により、そのＤＮＡメチル化と肝細胞癌の発生リスクとの関連が示されたゲノム領域である。
【００２８】
本発明者らは、全染色体領域を網羅的に解析するために、正常肝組織と肝細胞癌症例より得られた非癌肝組織に対して、約４５００種類のＢＡＣ ＤＮＡを搭載した高密度ゲノムアレイであるＭＣＧ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ−４５００（Ｉｎａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．，９５（７）：５５９−５６３，２００４）を用いてＢＡＭＣＡ法を実施して、ウィルコクソン検定により正常肝組織と肝細胞癌症例から得られた非癌肝組織でメチル化パターンに差異を有するＢＡＣクローンを特定した。さらに、それらＢＡＣクローンに含まれる肝細胞癌発生関連領域でのメチル化パターンの解析により、正常肝組織検体と肝細胞癌症例から得られた非癌肝組織検体とを区別することが可能であることを示した。すなわち、本発明において、「肝細胞癌発生関連領域」とは、限定するものではないが、以下の２５のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域を包含する：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１。
【００２９】
好ましい実施形態では、試験対象の検体において、上記の２５のＢＡＣクローンのうち１４クローン以上で、以下の実施例に記載する表１に示したものなどの判断基準を満たす場合に、肝細胞癌の発癌高リスク群に属すると判断することができる。
【００３０】
また、別の好ましい実施形態では、本発明において用いる「肝細胞癌発生関連領域」は、以下に示すようにＢＡＭＣＡ法などの適切な方法により、そのＤＮＡメチル化と肝細胞癌の発生リスクとの関連が示されたゲノム領域である。
【００３１】
本発明者らは、上記と同様、ＭＣＧ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ−４５００（Ｉｎａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，上掲）を用いてＢＡＭＣＡ法を実施して、ウィルコクソン検定により予後良好群肝細胞癌組織と予後不良群肝細胞癌組織でメチル化パターンに差異を有するＢＡＣクローンを特定した。さらに、それらＢＡＣクローンに含まれる肝細胞癌予後関連領域でのメチル化パターンの解析により、予後良好症例と予後不良症例とを区別することが可能であることを示した。すなわち、本発明において、「肝細胞癌予後関連領域」とは、限定するものではないが、以下の４１のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域を包含する：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５。
【００３２】
好ましい実施形態では、試験対象の検体において、上記の４１のＢＡＣクローンのうち３２クローン以上で、以下の実施例に記載する表２に示したものなどの判断基準を満たす場合に、肝細胞癌の発癌高リスク群に属すると判断することができる。
【００３３】
また、別の好ましい実施形態では、本発明において用いる「肝細胞癌予後関連領域」は、以下に示すようにＢＡＭＣＡ法などの適切な方法により、そのＤＮＡメチル化と肝細胞癌の予後不良リスクとの関連が示されたゲノム領域である。
【００３４】
ここで、上記のＢＡＣクローンは、ＲＰＣＩ ＢＡＣライブラリー１１に含まれるクローンであり、該ライブラリー中での参照番号により示されている。ＲＰＣＩ ＢＡＣライブラリー１１は、ヒト男性の血液から採取したゲノムを、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ＢＡＣベクターに挿入することにより作製されたライブラリーである。ＲＰＣＩ ＢＡＣライブラリーはＲＰＣＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手可能である。また、一部のクローンについては、その全長配列をデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手可能である。全長配列がデータベースに登録されていないクローンについても、ＮＣＢＩ Ｃｌｏｎｅ Ｒｅｇｉｓｔｒｙデータベースから、ゲノム上の位置、末端配列などについての情報を得ることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｃｌｏｎｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。全長配列又は末端配列がデータベースから入手可能な６４クローンについての、全長配列又は末端配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号を以下に挙げる：
【００３５】
全長配列 末端配列
肝細胞癌発生関連領域
ＲＰ１１−１０４Ｊ１３ ＢＺ７４９０２４
ＣＧ７３４２３３
ＣＧ７３４２３４
ＲＰ１１−５２Ｉ２ ＢＺ７４９１５１
ＢＺ７４９１５０
ＲＰ１１−２９Ｍ２２ Ｂ８７６２３
ＢＺ７４９１２０
ＢＺ７４９１２１
ＲＰ１１−２１Ｋ１ ＡＣ０２６４８２
ＲＰ１１−１０９Ｂ１５ ＡＱ３２２００２
ＡＱ３５００７３
ＲＰ１１−８８Ｂ２４ ＡＺ５１６１２８
ＡＱ２８６６１８
ＡＱ２８６６１６
ＲＰ１１−１１２Ｂ７ ＡＣ０９３６３０
ＲＰ１１−４８Ｄ２１ ＡＱ１９９４４８
ＡＱ１９９４５１
ＲＰ１１−１２０Ｅ２０ ＡＣ０６０８１２
ＡＣ１３６３６４
ＲＰ１１−３３４Ｅ６ ＡＰ００３３９６
ＲＰ１１−１７Ｍ１７ Ｂ８２７８６
Ｂ８２７８７
ＲＰ１１−３１９Ｅ１６ ＡＣ００６２０６
ＲＰ１１−１１００Ｌ３ ＡＣ０２５２５９
ＲＰ１１−７９９Ｏ６ ＡＣ０２３４９９
ＲＰ１１−１１９Ｊ２１ ＡＱ３４１１４０
ＲＰ１１−３３２Ｎ６ ＡＺ０８１７９６
ＡＺ０８１７９９
ＲＰ１１−５２９Ｅ４ ＡＺ０８１７９２
ＡＺ０８１８００
ＲＰ１１−８９Ｍ４ ＡＱ２８３３８２
ＡＱ２８３３８５
ＲＰ１１−２１５Ｍ５ ＡＣ０２７４６７
ＲＰ１１−３４８Ｂ１２ ＡＣ０２１６１８
ＲＰ１１−１３４Ｇ２２ ＡＱ３４４４１２
ＲＰ１１−３５４Ｉ１２ ＡＬ０７８６１３
ＲＰ１１−５５Ｊ１１ ＡＱ０８３４８１
ＡＱ０８３４８２
ＲＰ１１−４８０Ｍ１１ ＡＬ１５９９８８
肝細胞癌予後関連領域
ＲＰ１１−８９Ｋ１６ ＡＺ５１７２５４
ＡＱ２８２９４９
ＡＱ２８２９５０
ＲＰ１１−２０１Ｏ１４ ＡＣ０２５４９３
ＡＬ３５６３２０
ＲＰ１１−１５６Ｋ６ ＡＣ０４０８９７
ＡＣ０９３１１８
ＡＬ３５５６７３
ＲＰ１１−５５３Ｋ８ ＡＬ１５７４０２
ＲＰ１１−８９Ｅ１０ ＡＺ５１７０１４
ＡＱ２８２７３８
ＡＱ２８２７４１
ＲＰ１１−９０Ｂ１３ ＡＺ５１７９７９
ＡＱ２８３５２８
ＡＱ２８３５３１
ＲＰ１１−４４９Ｂ１９ ＡＱ５８４２４８
ＡＱ５８４２５２
ＲＰ１１−３０Ｍ１ ＡＣ０１３４５６
ＲＰ１１−８９Ｂ１３ ＡＱ２８３６３８
ＡＱ２８３６４０
ＲＰ１１−２５５Ｏ１９ ＡＣ０１６９２２
ＡＣ０９０９４５
ＲＰ１１−４２１Ｆ９ ＡＣ０１１３２３
ＡＣ１３３１４１
ＲＰ１１−１２２Ｄ１９ ＡＣ０１８３５４
ＡＣ１１５２８２
ＲＰ１１−３６Ｋ８ ＡＱ０４６９２７
ＲＰ１１−１０１Ｎ１７ ＡＱ３２０３８６
ＡＱ３２０３８９
ＲＰ１１−１７７Ｌ７ ＡＱ４１７４４１
ＡＱ４１７４４３
ＲＰ１１−１３Ｏ１４ Ｂ７６１８７
Ｂ８３４３３
Ｂ７６１８６
ＲＰ１１−８８Ｈ１６ ＡＱ２８６８０９
ＡＺ５１６２４８
ＡＺ５１６２５１
ＡＱ２８６８０６
ＲＰ１１−９１Ｇ９ ＡＱ２８１３６６
ＡＱ２８１３６９
ＲＰ１１−７９Ｋ２２ ＡＰ００６２０１
ＲＰ１１−１２６Ｂ８ ＡＱ３４８９４６
ＲＰ１１−８９Ｐ１１ ＡＱ２８５６４５
ＡＱ２８５６４６
ＲＰ１１−８８Ｎ８ ＡＣ０８７５３２
ＡＦ３０５８７４
ＲＰ１１−８５Ｃ２１ ＡＬ１６１４５６
ＲＰ１１−７１４Ｍ１６ ＡＬ３５５２７３
ＲＰ１１−４８Ａ２ ＡＱ２０１９２９
ＡＱ２０１９３１
ＲＰ１１−２０６Ｉ１ ＡＱ４２１５０５
ＡＱ４２１５０６
ＲＰ１１−３５Ｆ１１ ＡＱ０４５３０７
ＡＱ０４５３０８
ＲＰ１１−１５８Ｉ９ ＡＰ００４６０９
ＲＰ１１−７４Ｉ８ ＡＱ２３８２６１
ＡＱ２６９２３４
ＲＰ１１−１６７Ｂ４ ＡＣ００７２１７
ＲＰ１１−３６８Ｎ２１ ＡＣ００９０８６
ＲＰ１１−３０３Ｇ２１ ＡＺ０８１８８５
ＡＺ０８１８８６
ＲＰ１１−１５１Ｍ１９ ＡＱ３７７０５２
ＡＱ３７７０５５
ＲＰ１１−１３５Ｎ５ ＡＣ０１５７９９
ＲＰ１１−３９８Ａ１ ＡＺ２５４６３９
ＡＺ３０１１４２
ＲＰ１１−１５Ａ１ ＡＣ００６２１３
ＲＰ１１−６９７Ｂ１０ ＡＣ０２７２１８
ＲＰ１１−７９Ａ３ ＡＺ５２０６６０
ＡＱ２８１４７９
ＡＱ２８２１７０
ＲＰ１１−２９Ｈ１９ Ｂ８７５７９
ＲＰ１１−３６Ｎ５ ＡＱ０４５１２９
【００３６】
データベースに配列情報が開示されていない以下の２クローン：ＲＰ１１−３２８Ｍ１７及びＲＰ１１−１８０Ｌ２１に関しては、それぞれについてＳＴＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｔａｇｇｅｄ ｓｉｔｅ）配列が特定されている。ＳＴＳ配列については、以下に示すコード番号を用いてデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｕｎｉｓｔｓ）を検索することにより、具体的な情報を得ることができる。それぞれのクローンに対して特定されているＳＴＳ配列についての情報を、以下に挙げる：
【００３７】
ＲＰ１１−３２８Ｍ１７
ＵｎｉＳＴＳ：６３１８９
Ｄ２２Ｓ９２２
フォワードプライマー：ＴＡＴＣＴＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧ（配列番号１）
リバースプライマー：ＴＴＣＣＴＣＡＧＴＴＴＴＡＣＣＴＧＴＧＣＴ（配列番号２）
ＰＣＲ産物サイズ：１２１−１２３ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｚ５０８９６
【００３８】
ＲＰ１１−１８０Ｌ２１
ＵｎｉＳＴＳ：４９９６９
Ｄ２Ｓ２１８２
フォワードプライマー：ＧＣＴＣＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＴＴＧＡＴＣＣ（配列番号３）
リバースプライマー：ＧＧＣＴＡＡＧＣＣＴＡＧＡＴＧＣＴＴＧＡ（配列番号４）
ＰＣＲ産物サイズ：２２８−２４２ｂｐ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｚ５２４２３
【００３９】
当業者であれば、上記の入手可能な配列情報をもとに、前記ＢＡＣライブラリーから、本発明に係るＢＡＣクローンを入手することが可能である。
【００４０】
繰り返して言うが、本発明の方法を実施するために用いる肝細胞癌発生関連領域及び肝細胞癌予後関連領域は、上記のＢＡＣクローンに含まれるゲノム領域には限定されず、ＢＡＭＣＡ法などの適切な方法によりそのメチル化が肝細胞癌と関連付けられる他の領域であり得る。
【００４１】
肝細胞癌発生関連領域でのＤＮＡメチル化を、ＢＡＭＣＡ法をはじめとする、下記で例示するような公知の手法を用いて検査することにより、肝細胞癌の発生リスクを評価することが可能であり、また、肝細胞癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化を検査することにより、肝細胞癌の予後不良リスクを決定することが可能である。
【００４２】
ＤＮＡメチル化
本明細書中、「ＣｐＧアイランド」とは、高等生物、特に哺乳動物のゲノム配列中、非翻訳領域に存在するＧ（グアニン）Ｃ（シトシン）含量が多い領域である。「ＣｐＧアイランド」の「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「ｐ」はシトシンとグアニンとの間のホスホジエステル結合を表している。すなわち、ＣｐＧアイランドには、隣接したシトシンとグアニンとがホスホジエステル結合で結合されたジヌクレオチドの繰り返し配列が含まれる。ＣｐＧアイランドの長さは約３００〜３０００塩基対である。ＣｐＧアイランドは、一般に、全配列中にＣｐＧ配列を統計的に期待される６％と同じか又はそれを上回る割合で含む。ＣｐＧアイランド以外のゲノム領域では、ＣＧサプレッションのため、ＣｐＧ配列の含量は１％以下である。
【００４３】
本明細書中、「ＤＮＡメチル化」（又は単に「メチル化」）とは、上記のＣｐＧ配列において、シトシンの５位の炭素がメチル化されていることを意味する。
【００４４】
正常肝組織１０検体及び肝細胞癌症例からの非癌肝組織１５検体に対して、上記のＢＡＭＣＡ法により解析し、ウィルコクソン検定及びサポートベクターマシンアルゴリズムを利用して、正常肝組織と肝細胞癌症例から得られた非癌肝組織とを区別することが可能な２５ＢＡＣクローンを特定した。続いて、これらのクローンを用いた階層的クラスタリングにより、正常肝組織と肝細胞癌症例から得られた非癌肝組織とを別のクラスターに分類することが可能であることを示した（図２）。
【００４５】
肝細胞癌の発生リスクに関わるそれらの領域でのメチル化の有無の判定基準を、例としてＢＡＭＣＡ法を用いて求めた。その例を図３に示す。また、各ＢＡＣクローンについて求めた判定基準を、以下の実施例中の表１に示す。
【００４６】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された肝細胞癌発生関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、例えば前癌状態にある被験者の検体の中から、肝細胞癌が発生するリスクが高い群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
【００４７】
すなわち、例えば上記の２５クローンに含まれるゲノム領域について、メチル化の有無を検査し、その結果を陽性対照及び陰性対照と比較することにより、肝細胞癌の発生リスクを評価することができる。
【００４８】
さらに、異なる予後を有する症例（予後良好群：肝切除術後４年以上生存した症例；予後不良群：肝切除術後６ヵ月以内に再発して１年以内に死亡した症例）の肝細胞癌組織の１１検体について、上記のＢＡＭＣＡ法により解析し、ウィルコクソン検定を利用して、予後良好症例と予後不良症例とを区別することが可能な４１ＢＡＣクローンを特定した。続いて、これらのクローンを用いた階層的クラスタリングにより、予後良好群と予後不良群とを別のクラスターに分類することが可能であることを示した（図５）。
【００４９】
肝細胞癌の予後に関わるそれらの領域でのメチル化の有無の判定基準を、例としてＢＡＭＣＡ法を用いて求めた。その例を図６に示す。また、各ＢＡＣクローンについて求めた判定基準を、以下の実施例中の表２に示す。
【００５０】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された肝細胞癌予後関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、肝細胞癌症例の中から、予後不良な群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
【００５１】
すなわち、例えば上記の４１クローンに含まれるゲノム領域について、メチル化の有無を検査し、その結果を陽性対照及び陰性対照と比較することにより、肝細胞癌の予後不良リスクを決定することができる。
【００５２】
ゲノム領域におけるＤＮＡメチル化の状態を調べるためには、上記のＢＡＭＣＡ法（図１）の他に、ＰＣＲを利用する別の方法、及びサザンブロッティングを利用する方法などを用いることができる。
【００５３】
ＰＣＲを利用する別の方法としては、以下のものなどを挙げることができる：
（ａ）バイサルファイトシークエンシング法：ゲノムＤＮＡをバイサルファイト変換するとシトシンがウラシルに変換されるが、メチル化シトシンにおいてはこの反応がほとんど進まず、シトシンのままとなる。この反応を利用すれば、ＤＮＡメチル化状態の差が塩基配列に変換される。バイサルファイト変換したゲノム領域をＰＣＲ増幅してクローン化するなどし、塩基配列を決定することにより、ＤＮＡメチル化の有無を知ることができる。
（ｂ）ＣＯＢＲＡ法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ、バイサルファイト変換−制限酵素法）：（ａ）と同様にゲノムＤＮＡをバイサルファイト変換して塩基配列を変化させた後に、当該ゲノムＤＮＡを制限酵素で切断して制限酵素の認識部位が残っているか残っていないかを調べることにより、ＤＮＡメチル化の有無を知ることができる。
（ｃ）メチル化特異的ＰＣＲ法：（ａ）と同様にゲノムＤＮＡをバイサルファイト変換し、塩基配列を変化させた後に、当該ゲノムＤＮＡを鋳型として、塩基配列が変化している場合（メチル化がない）に増幅できるプライマー、又は塩基配列が変化していない場合（メチル化がある）に増幅できるプライマーを用いてそれぞれＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ産物の有無によってＤＮＡメチル化の有無を知ることができる。
【００５４】
サザンブロッティングを利用する方法は、以下のように実施することができる。試験する検体中のゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化すると、メチル化されている認識部位は切断されず、メチル化されていない認識部位は切断される。消化済みのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、ＤＮＡ断片をナイロンメンブレンなどにトランスファーし、３２Ｐなどで標識した標的特異的なプローブをハイブリダイズさせる。このとき、検出されるバンドの長さの違いから、対象となる領域のメチル化の有無を知ることができる。
【００５５】
これらの方法において用いる「メチル化感受性制限酵素」とは、例えばＳｍａＩ及びＨｐａＩＩであり、好ましくはＳｍａＩである。それらのメチル化感受性酵素と同じ認識配列を認識する非メチル化感受性酵素は当業者が容易に知ることができ、これをメチル化感受性酵素と組み合わせて上記のようなＤＮＡメチル化の検査方法において用いることができる。
【００５６】
これらの方法を用いるメチル化の検査における、肝細胞癌発生関連領域又は肝細胞癌予後関連領域でのメチル化の有無の判定基準は、当業者ならば公知の統計学的手法等を用いて適宜決定することができる。具体的には、例えば、肝細胞癌検体の予後不良群を陽性対照とし、予後良好群を陰性対照として、所望のＤＮＡメチル化検査法により肝細胞癌予後関連領域のＤＮＡメチル化状態を調べる。その結果を陽性対照と陰性対照とで比較することにより、各肝細胞癌予後関連領域について有意な測定値の閾値を決定する。それにより、その閾値を用いたメチル化検査で陽性（又は陰性）と判定された場合に、検査対象の検体を予後不良群に含めるべきであると規定することができる。
【００５７】
アレイ
本発明は、さらに、上記のように特定された２５のＢＡＣクローン又は４１のＢＡＣクローンを搭載した、肝細胞癌の発生リスク又は予後不良リスクを決定するためのアレイにも関する。
【００５８】
この場合、「アレイ」とは、適切な基板上にゲノム配列を含む複数のＤＮＡを位置特異的な様式で定着（スポット）させたデバイスを意味する。基板は、好ましくは固体基板であり、具体的には、ガラス、プラスチック、メンブレン等が挙げられる。好ましい基板はスライドガラスのようなガラス基板である。ガラス製の固体基板には、ＤＮＡの定着の前に、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着によるコーティングを施すことが望ましい。
【００５９】
本発明を、実施例を用いて以下により詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によりなんら制限されるものではない。
【実施例１】
【００６０】
肝細胞癌発生リスク
検体
国立がんセンター中央病院（日本、東京）で部分肝切除術を受けた肝細胞癌患者の外科切除された組織から、非癌肝組織の１５検体を得た。組織学的検査から、これらの検体のうち５検体において慢性肝炎が、９検体において肝硬変が見られ、１検体においては顕著な組織学的知見は見られなかった。
【００６１】
比較のために、肝細胞癌を患っていない患者から正常肝組織の１０検体を得た。これらの検体について、顕著な組織学的知見は見られなかった。正常肝組織を採取した患者は、９人が原発性大腸癌の肝転移のために部分肝切除術を受け、１人は胃の消化管間質腫瘍の肝転移のために部分肝切除術を受けた。
【００６２】
ＢＡＭＣＡ法
上記の検体について、ＢＡＭＣＡ法を実施した。以下に説明するＢＡＭＣＡ法の実施の詳細については、文献（Ｍｉｓａｗａ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６５：１０２３３−１０２４２，２００５；Ｓｕｇｉｎｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６：７４０１−１３，２００７；Ｔａｎａｋａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６：６４５６−６８，２００７）にも記載されている。
【００６３】
肝細胞癌組織（被験肝組織）、正常肝組織（被験肝組織）、及び参照として用いた正常肝組織の混合物（参照正常肝組織）から、フェノール／クロロホルム法によりＤＮＡを調製し、各々のＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩ（メチル化感受性制限酵素；切断後に平滑末端を形成させる）で消化した。この場合、ＳｍａＩ認識部位がメチル化されている場合には、当該メチル化部位はＳｍａＩで消化されないために、次のステップのＸｍａＩ（メチル化非感受性制限酵素；ＳｍａＩと同じ配列を認識し、切断後に突出末端を形成させる）で消化される。ＸｍａＩ切断末端特異的アダプターライゲーションを行い、ＰＣＲ法で被験肝組織に由来するＸｍａＩ断片を蛍光色素Ｃｙ−３にて標識し、増幅した。一方、参照正常肝組織に由来するＸｍａＩ断片を蛍光色素Ｃｙ−５にて標識した。蛍光色素での標識は、ＢｉｏＰｒｉｍｅ ａｒｒａｙ ＣＧＨ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。アダプターライゲーション及びＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りである：
Ａｄａｐｔｏｒ−Ｌ：ＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧＡＣ（配列番号５）
Ａｄａｐｔｏｒ−Ｓ：ＣＣＧＧＧＴＣＧＧＴＧＡ（配列番号６）
【００６４】
ＰＣＲはＡｄａｐｔｏｒ−Ｌと同一の配列を有するプライマーを用いて行った。
被験肝組織由来のＤＮＡ断片と参照正常肝組織由来のＤＮＡ断片の両者を混合し、４３６１種類のＢＡＣクローンを搭載した高密度ＣＧＨアレイ（ＭＣＧ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ−４５００；Ｉｎａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．，９５（７）：５５９−５６３，２００４）上で競合ハイブリダイゼーション（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。競合ハイブリダイゼーションは、以下の条件により行った：上記のように蛍光色素で標識したＤＮＡ断片を、反復配列をブロックするＣｏｔ−１ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下にてエタノール沈殿した。ＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液（ホルムアミド５ｍＬ、硫酸デキストラン１ｇ、２０×ＳＣＣを混合し滅菌水で７ｍＬに調整）に再懸濁し、ＳＤＳ及び酵母ｔＲＮＡを加え、７５℃にて１０分間変性させた。３７℃にて３０分間インキュベートした後、ＤＮＡ溶液を自動マイクロアレイハイブリダイゼーション装置（Ｈｙｂ４、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）にセットしたアレイにアプライし、４３℃にて７２時間インキュベートし、ＤＮＡ断片をアレイにハイブリダイズさせた。インキュベート終了後、ハイブリダイゼーション装置を用いて、５０％ホルムアミド＋２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）で４５℃、３０秒間の洗浄を６回、０．１×リン酸ナトリウムバッファー＋ＮＰ４０で２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．２×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣで２５℃、３０秒間の洗浄を２回行った。ハイブリダイゼーション装置からアレイを取り出し、０．１×ＳＳＣで室温、５分間の洗浄を行った。
【００６５】
ハイブリダイゼーションが完了したアレイにおける蛍光を、スキャナ（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ４１００Ａ）で読み取った後、数値化ソフト（Ａｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ５．０）によって数値化し、解析ソフト（三井情報株式会社のＡｃｕｅ２）によって解析して、被験検体及び対照検体における各ＢＡＣクローンの蛍光強度比を算出した。
【００６６】
ここで、肝細胞癌組織由来ＤＮＡにおいて、ある領域の両端のＳｍａＩ認識部位がメチル化されていると、当該メチル化部位はＳｍａＩによっては認識されず、当該領域に対応したＸｍａＩ断片が生成される。ＸｍａＩ断片はアダプターライゲーション後のＰＣＲにより標識を伴って増幅され、プローブが生成される。その結果、当該プローブ配列に対応する配列を含むＢＡＣクローンを担持するスポットで、Ｃｙ３（被験検体）／Ｃｙ５（正常対照）の比が上昇する。例えば、この値が１．０以上となることを指標として、癌特異的にメチル化されたＤＮＡ断片に一致する配列を含むＢＡＣクローンを同定することができる。ＢＡＭＣＡ法の過程を、図１に示す。
【００６７】
肝細胞癌発生関連領域の同定
ＤＮＡメチル化パターンの解析により肝細胞癌の発生リスクを決定するのに有効なゲノム領域を特定するために、検体を正常群及び発癌高リスク群に分類するのに有益なＢＡＣクローンを同定した。同定の手順は以下の通りである。
【００６８】
はじめに、正常肝組織検体と肝細胞癌症例から得られた非癌肝組織検体とでメチル化パターンが異なる５１２ＢＡＣクローンをウィルコクソン検定を用いて特定した。ここから、サポートベクターマシンアルゴリズムを用いたスポットランキング解析により、４０クローンを選び出した。ウィルコクソン検定については、例えば、市原清志著「バイオサイエンスの統計学」（南江堂、１９９０年）、５０ページに記載されており、サポートベクターマシンアルゴリズムについては、例えば、Ｄａｖｉｄ Ｗ． Ｍｏｕｎｔ著、岡崎康司・坊農秀雄監訳「バイオインフォマティクス第２版」（メディカル・サイエンス・インターナショナル、２００５年）、６０７ページ、及びＮｅｌｌｏ Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉ、Ｊｏｈｎ Ｓｈａｗｅ−Ｔａｙｌｏｒ著、大北剛訳「サポートベクターマシン入門」（共立出版、２００５年）などに記載されている。
【００６９】
続いて、各検体が発癌高リスク群に属することを判定するときの「感度」及び「特異性（特異度）」を、以下のように規定した：
感度＝所定の判断基準により発癌高リスク群に属するとされた症例数／肝細胞癌症例からの非癌肝組織検体数×１００（％）
特異度＝所定の判断基準により正常群に属するとされた症例数／正常肝組織検体数×１００（％）。
【００７０】
この感度及び特異度が最大となるように、各クローンについて以下に示すカットオフ値を設定した。
【００７１】
上記で設定した感度又は特異度が７０％以上となった２５のＢＡＣクローンを特定した。それらのクローンに含まれるゲノム領域を、肝細胞癌発生関連領域と称した。
【００７２】
同定された肝細胞癌発生関連領域のＢＡＣクローンは、以下の２５クローンである：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１。
【００７３】
上記で特定した肝細胞癌発生関連領域２５クローンについて、発癌高リスクの判定基準並びに感度及び特異度を以下の表１に示す。判定基準の数値は、上記で詳述したＢＡＭＣＡ法で得られる蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比である。
【００７４】
【表１】
【００７５】
上記で特定した２５クローンを用い、２次元階層的クラスタリングにより、上記のＢＡＭＣＡ法を用いて得られた測定結果を分析し、２５の検体を２つのクラスター（発癌高リスククラスター及び正常クラスター）に分類した（図２）。非常に簡略化して言えば、これらのクラスターはＤＮＡメチル化パターンの違いにより分類されたと言うことができる。２つのクラスターは、肝細胞癌症例から得た非癌肝組織（慢性肝炎又は肝硬変状態にあるものを含む）と正常肝組織のそれぞれに対応していた。
【００７６】
検出値の閾値の一例を図３に示す。この中で、例えば、ＲＰ１１−１７Ｍ１７については、ＢＡＭＣＡ法での蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比が０．９３未満であるとき、肝細胞癌症例から得られた非癌肝組織検体を感度９３．３％、特異度９０．０％で肝細胞癌高リスク群に分類することができる。
【００７７】
表１の判断基準を満たすＢＡＣクローン数のヒストグラムを、図４に示す。正常肝組織群では判断基準を満たすＢＡＣクローンの数は少なく（図４：左側）、肝細胞癌症例より得られた非癌肝組織群では判断基準を満たすＢＡＣクローンの数は多く（図４：右側）、その差異は明瞭である。このヒストグラムに基づいて、表１の判断基準を１４ＢＡＣクローン以上で満たす非癌肝組織を発癌高リスク群と判断することとすると、肝細胞癌症例より得られた非癌肝組織を感度・特異度ともに１００％で発癌高リスク群に分類することができる。
【００７８】
上記の方法が妥当であることを確認するために、検証セットの１８検体において同様の解析を行った。表１の判断基準を１４ＢＡＣクローン以上で満たす非癌肝組織を発癌高リスク群と判断する場合、検証セットの肝細胞癌症例から得られた非癌肝組織（９検体）を、感度・特異度ともに１００％で発癌高リスク群に分類することができた。
【００７９】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された肝細胞癌発生関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、特にこれらの領域のうちの１４領域以上で所定の判断基準を満たすか否かを検討することにより、発癌リスクの高い群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
【実施例２】
【００８０】
肝細胞癌予後不良リスク
検体
国立がんセンター中央病院（日本、東京）で部分肝切除術を受けた肝細胞癌患者の外科切除された組織から、原発性肝細胞癌組織の１９検体を得た。１９検体のうち、５検体は肝切除術後４年以上生存した患者からのもの（予後良好症例）であり、６検体は肝切除術後６ヵ月以内に再発し、１年以内に死亡した患者からのもの（予後不良症例）であった。
【００８１】
肝細胞癌予後関連領域の同定
上記と同様にＢＡＭＣＡ法を行い、予後良好症例と予後不良症例の１１検体についての結果に基づき、両症例群でＢＡＭＣＡ法のシグナル比が顕著に異なる４１のＢＡＣクローンを選択した。
【００８２】
同定された肝細胞癌予後関連領域のＢＡＣクローンは、以下の４１クローンである：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５。
【００８３】
続いて、各検体が予後不良群に属することを判定するときの「感度」及び「特異性（特異度）」を、以下のように規定した：
感度＝所定の判断基準により予後不良群に属するとされた症例数／予後不良症例検体数×１００（％）
特異度＝所定の判断基準により予後良好群に属するとされた症例数／予後良好症例検体数×１００（％）。
【００８４】
この感度及び特異度が最大となるように、各クローンについて以下に示すカットオフ値を設定した。
【００８５】
上記の肝細胞癌予後関連領域４１クローンについて、予後不良の判定基準並びに感度及び特異度を以下の表２に示す。判定基準の数値は、実施例１で詳述したＢＡＭＣＡ法で得られる蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比である。
【００８６】
【表２】
【００８７】
４１のＢＡＣクローンを用いた２次元階層的クラスタリングを図５に示す。予後良好群の５検体と、予後不良群の６検体は、異なるクラスターに分類された。
【００８８】
検出値の閾値の一例を図６に示す。この中で、例えば、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４については、ＢＡＭＣＡ法での蛍光測定値のＣｙ３／Ｃｙ５比が１．２２未満であるとき、予後不良クラスターに属する検体を感度１００％、特異度１００％で予後不良群に分類することができる。
【００８９】
表２の判断基準を満たすＢＡＣクローン数のヒストグラムを、図７に示す。予後良好群では判断基準を満たすＢＡＣクローンの数は少なく（図７：左側）、予後不良群では判断基準を満たすＢＡＣクローンの数は多く（図７：右側）、その差異は明瞭である。
【００９０】
続いて、１９の全検体について、表２の判断基準に基づき評価した。１９検体を、判断基準を満たすＢＡＣクローンの数（３２クローン以上 ｖｓ．３２クローン未満）に基づいて２群に分けた。図８は、全１９患者についてのカプラン・マイヤー生存曲線を示している。表２の判断基準を３２クローン以上で満たした患者の無病生存率（図８Ａ：実線）は、表２の判断基準を３２クローン未満しか満たさなかった患者の無病生存率（図８Ａ：点線）と比較して、有意に短かった（Ｐ＝０．０００４）。表２の判断基準を３２クローン未満でしか満たさなかった患者は、観察期間中には１人も死亡しなかった（図８Ｂ：点線）。
【００９１】
これらの結果は、本実施例に記載の方法により特定された肝細胞癌予後関連領域に関してＤＮＡメチル化の有無を解析することにより、特にこれらの領域のうちの３２領域以上で所定の判断基準を満たすか否かを検討することにより、予後不良な群を非常に高感度かつ特異性高く分類することが可能であることを意味している。
上記の実験は、国立がんセンター（日本、東京）倫理委員会により承認を得て行った。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によれば、肝細胞癌の発生リスク及び予後不良リスクを判定することができる。したがって、本発明は医療・健康科学分野で用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ＢＡＭＣＡ法の概略を示す模式図である。
【図２】正常肝組織検体及び肝細胞癌症例からの非癌肝組織検体についての肝細胞癌発生関連領域のＤＮＡメチル化パターンに基づく階層的クラスタリングを示す図である。
【図３】各ＢＡＣクローンにおける、発癌リスクの判定のための判断基準を示す図である。ＢＡＭＣＡ法における蛍光強度比の散布図として示されている。
【図４】表１の判断基準を満たすＢＡＣクローン数のヒストグラムである。
【図５】肝細胞癌検体についての肝細胞癌予後関連領域のＤＮＡメチル化パターンに基づく階層的クラスタリングを示す図である。
【図６】各ＢＡＣクローンにおける、予後不良クラスターの判定のための判断基準を示す図である。ＢＡＭＣＡ法における蛍光強度比の散布図として示されている。
【図７】表２の判断基準を満たすＢＡＣクローン数のヒストグラムである。
【図８】全１９患者についてのカプラン・マイヤー生存曲線である。
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
配列番号１〜４：プライマー
配列番号５及び６：アダプター
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、肝細胞癌発生関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が発癌高リスク群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、肝細胞癌の発生リスクを検出する方法。
【請求項２】
前記肝細胞癌発生関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１に含まれるゲノム領域を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記肝細胞癌発生関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
以下のステップ：
（ａ）被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、肝細胞癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、肝細胞癌の予後不良リスクを検出する方法。
【請求項５】
前記肝細胞癌予後関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５に含まれるゲノム領域を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記肝細胞癌予後関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡメチル化を、ＢＡＭＣＡ法によって調べる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１を少なくとも含む、肝細胞癌の発生リスクを評価するためのアレイ。
【請求項９】
ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５を少なくとも含む、肝細胞癌の予後不良リスクを決定するためのアレイ。
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、肝細胞癌発生関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が発癌高リスク群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、肝細胞癌の発生リスクを検出する方法。
【請求項２】
前記肝細胞癌発生関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１に含まれるゲノム領域を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記肝細胞癌発生関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
以下のステップ：
（ａ）被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを準備するステップ、
（ｂ）（ａ）で準備したゲノムＤＮＡについて、肝細胞癌予後関連領域でのＤＮＡメチル化の有無を調べるステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で明らかになったＤＮＡメチル化パターンから、該被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するステップ
を含む、肝細胞癌の予後不良リスクを検出する方法。
【請求項５】
前記肝細胞癌予後関連領域が、少なくとも、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５に含まれるゲノム領域を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記肝細胞癌予後関連領域が、ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５に含まれるゲノム領域からなる群より選択される１つ以上のゲノム領域である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡメチル化を、ＢＡＭＣＡ法によって調べる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−１０４Ｊ１３、ＲＰ１１−５２Ｉ２、ＲＰ１１−２９Ｍ２２、ＲＰ１１−２１Ｋ１、ＲＰ１１−１０９Ｂ１５、ＲＰ１１−８８Ｂ２４、ＲＰ１１−１１２Ｂ７、ＲＰ１１−４８Ｄ２１、ＲＰ１１−１２０Ｅ２０、ＲＰ１１−３３４Ｅ６、ＲＰ１１−１７Ｍ１７、ＲＰ１１−３１９Ｅ１６、ＲＰ１１−１１００Ｌ３、ＲＰ１１−７９９Ｏ６、ＲＰ１１−１１９Ｊ２１、ＲＰ１１−３３２Ｎ６、ＲＰ１１−５２９Ｅ４、ＲＰ１１−８９Ｍ４、ＲＰ１１−２１５Ｍ５、ＲＰ１１−３４８Ｂ１２、ＲＰ１１−１３４Ｇ２２、ＲＰ１１−３２８Ｍ１７、ＲＰ１１−３５４Ｉ１２、ＲＰ１１−５５Ｊ１１、及びＲＰ１１−４８０Ｍ１１を少なくとも含む、肝細胞癌の発生リスクを評価するためのアレイ。
【請求項９】
ＢＡＣクローン：ＲＰ１１−８９Ｋ１６、ＲＰ１１−２０１Ｏ１４、ＲＰ１１−１５６Ｋ６、ＲＰ１１−５５３Ｋ８、ＲＰ１１−８９Ｅ１０、ＲＰ１１−１８０Ｌ２１、ＲＰ１１−９０Ｂ１３、ＲＰ１１−４４９Ｂ１９、ＲＰ１１−３０Ｍ１、ＲＰ１１−８９Ｂ１３、ＲＰ１１−２５５Ｏ１９、ＲＰ１１−４２１Ｆ９、ＲＰ１１−１２２Ｄ１９、ＲＰ１１−３６Ｋ８、ＲＰ１１−１０１Ｎ１７、ＲＰ１１−１７７Ｌ７、ＲＰ１１−１３Ｏ１４、ＲＰ１１−８８Ｈ１６、ＲＰ１１−９１Ｇ９、ＲＰ１１−７９Ｋ２２、ＲＰ１１−１２６Ｂ８、ＲＰ１１−８９Ｐ１１、ＲＰ１１−８８Ｎ８、ＲＰ１１−８５Ｃ２１、ＲＰ１１−７１４Ｍ１６、ＲＰ１１−４８Ａ２、ＲＰ１１−２０６Ｉ１、ＲＰ１１−３５Ｆ１１、ＲＰ１１−１５８Ｉ９、ＲＰ１１−７４Ｉ８、ＲＰ１１−１６７Ｂ４、ＲＰ１１−３６８Ｎ２１、ＲＰ１１−３０３Ｇ２１、ＲＰ１１−１５１Ｍ１９、ＲＰ１１−１３５Ｎ５、ＲＰ１１−３９８Ａ１、ＲＰ１１−１５Ａ１、ＲＰ１１−６９７Ｂ１０、ＲＰ１１−７９Ａ３、ＲＰ１１−２９Ｈ１９、及びＲＰ１１−３６Ｎ５を少なくとも含む、肝細胞癌の予後不良リスクを決定するためのアレイ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−１４８４２６（Ｐ２０１０−１４８４２６Ａ）
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３２９８７２（Ｐ２００８−３２９８７２）
【出願日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １．発行者：日本癌学会 刊行物名：第６７回 日本癌学会学術総会記事 掲載頁：２５３頁 刊行物発行年月日：２００８年９月３０日 ２．発行者：株式会社先端医学社 刊行物名：分子消化器病 １２ 巻数・号数：Ｖｏｌ．５ Ｎｏ．４ ２００８ 掲載頁：３７０頁〜３７５頁 刊行物発行年月日：２００８年１２月１日
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究、「健康安心プログラム／個別化医療の実現のための技術融合バイオ診断技術開発／染色体解析技術開発／癌の染色体構造異常の解析と診断のコンテンツ開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １．発行者：日本癌学会 刊行物名：第６７回 日本癌学会学術総会記事 掲載頁：２５３頁 刊行物発行年月日：２００８年９月３０日 ２．発行者：株式会社先端医学社 刊行物名：分子消化器病 １２ 巻数・号数：Ｖｏｌ．５ Ｎｏ．４ ２００８ 掲載頁：３７０頁〜３７５頁 刊行物発行年月日：２００８年１２月１日
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究、「健康安心プログラム／個別化医療の実現のための技術融合バイオ診断技術開発／染色体解析技術開発／癌の染色体構造異常の解析と診断のコンテンツ開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
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