Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤耐性腫瘍及び癌を有する被験者を同定、分類及びモニターするための方法及び組成物
本発明は、Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤治療について癌患者を同定、分類及びモニターできる方法及びキットに関する。本発明の方法及び組成物は、癌または腫瘍細胞中のＢｃｌ−ｘＬの増幅または高いＢｃｌ−ｘＬポリペプチド発現の判定に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療について同定、分類及びモニターするために有用な診断アッセイに関し、特に大部分のＢｃｌ−２阻害剤に対して耐性でありそうな癌を有する患者を同定することができる特定のマーカーの計測に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の遺伝的異種性は有効な癌治療薬の開発を複雑にしている要因である。古典的な組織病理学的分類に従って１つの疾病単位であると見なされている癌は、分子プロファイリングにかけるとしばしば複数のゲノムサブタイプを示す。幾つかの症例では、分子分類が古典的病理学よりもより正確であると証明された。標的癌治療薬の有効性は遺伝子増幅のようなゲノム特徴の存在と相関し得る（Ｃｏｂｌｅｉｇｈら，１９９９；Ｌｙｎｃｈら，２００４）。乳癌中のＨｅｒ−２の場合、遺伝子増幅の検出がタンパク質過剰発現の免疫組織化学（ＩＨＣ）による検出と比較して優れた診断・治療選択情報を与えることが立証されている（Ｐａｕｌｅｔｔｉら，２０００）。従って、患者の標的癌治療に対する応答率を向上させ得るゲノム分類マーカーが要望されている。
【０００３】
肺癌は新しい標的癌治療のために活発に研究されている分野である。肺悪性腫瘍は米国では２００６年に約１６０，０００人が死亡した癌死亡率の主たる原因である。小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）は、肺癌症例の約２０％に相当する肺癌の組織病理学的サブタイプである。このサブタイプの生存率は低く（長期生存率４〜５％）、新しい化学療法レジメンが導入されたにも関わらず、過去１０年間で有意に改善されていない。肺癌症例の残りは、幾つかの共通するサブタイプからなるカテゴリーの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。過去数年間で、ＮＳＣＬＣに対する標的治療（例えば、エルロチニブ及びゲフィチニブ）の開発が大きく進歩している。ＮＳＣＬＣ患者を潜在的な応答者及び非応答者に層化することができるゲノムバイオマーカーが発見された。特に、ＥＧＦＲキナーゼドメインにおける変異及び増幅がエルロチニブ及びゲフィチニブに対する応答と相関していることが分かった。残念ながら、たとえＳＣＬＣ細胞株及び腫瘍のゲノム分析が報告されても（Ａｓｈｍａｎら，２００２；Ｃｏｅら，２００６；Ｋｉｍら，２００６）、ＳＣＬＣでは上記進歩は達成されていない。
【０００４】
標的癌治療研究は、プログラム化細胞死の中心的制御因子であるＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーに対して報告されている。アポトーシスを抑制するＢｃｌ−２ファミリーメンバーは癌において過剰発現され、腫瘍形成の原因となる。Ｂｃｌ−２発現は癌治療に対する耐性及び低い生存率と強く相関している。例えば、前立腺癌におけるアンドロゲン非依存性の発現はＢｃｌ−２発現の高い発生率（調べたコホートの＞４０％）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，１９９９）により特徴づけられ、これは治療に対する高い耐性にも相関している。更に、ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣ細胞株の両方におけるＢｃｌ−２の過剰発現が細胞毒性剤に対する耐性を誘発することが立証されている（Ｏｈｍｏｒｉら，１９９３；Ｙａｓｕｉら，２００４）。Ｙａｓｕｉら（２００４）はＢｃｌ−ｗ（ＢＣＬ２Ｌ２）遺伝子座でのコピー数増加を記載しており、Ｂｃｌ−ｗ発現がＳＫＯＶ３／ＶＰの化学耐性に対して少なくとも部分的に関与していると結論付けている。Ｙａｔｓｕｉら（２００４）は他の癌細胞株でのＢｃｌ−２ファミリーコピー数変化の同定を開示していない。
【０００５】
Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｌｉｍｅｎｔら（２００３）は、濾胞性リンパ腫の大細胞性リンパ腫への形質転換におけるＢｃｌ−２遺伝子座を含めた１８ｑ２１でのコピー数変化の同定を記載している（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｌｉｍｅｎｔら，２００３）。Ｍｏｎｎｉら（１９９６）は、びまん性大細胞Ｂ細胞リンパ腫における複数のコピー数変化を報告している（Ｍｏｎｎｉら，１９９６）。Ｇａｌｔｅｌａｎｄら（２００５）はＢ細胞非ホジキンリンパ腫におけるＢｃｌ−２の染色体座の増加を報告している（Ｇａｌｔｅｌａｎｄら，２００５）。Ｎｕｐｐｏｎｅｎら（１９９８）は１７個の再発性前立腺癌サンプルのうちの４個でＢｃｌ−２の低レベルのコピー数増加を記載している（Ｎｕｐｐｏｎｅｎら，１９９８）。Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋらは、Ｂｃｌ−２遺伝子を含んでおり、Ｂｃｌ−２阻害剤ＡＢＴ−７３７に対する感受性に関連していたＳＣＬＣにおける１８ｑ２１上の増加を報告している（Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋら，２００７）。
【０００６】
今日の腫瘍学研究の重要な領域は標的治療に対する獲得耐性の研究である。標的治療は患者に対して優れた効果を与える。しかしながら、多くの場合、腫瘍が上記治療の効果を避けるべく多数の方策を強制するのでその効果は一時的である。これらの耐性メカニズムは複雑であり、様々である。これらのメカニズムが解明されたら、耐性メカニズムを標的とする新しい治療法が開発され、展開され得る。
【０００７】
ＢＨ３ミメティックは、特定の抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバーを抑制することによりアポトーシスを誘発させるように工学操作された高度に標的化された化合物である。これらの薬物の効果に対する耐性は治療中に生じ得る。
【０００８】
前記ミメティックの１つのＡＢＴ−７３７（旧ＡＢＴ−２６３）はＢｃｌ−２ファミリーメンバーＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗの低分子阻害剤であり、固形腫瘍の退縮を誘発することが判明している（Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆら，２００５）。ＡＢＴ−７３７をヒト癌細胞株の多種多様のパネルに対して試験し、ＡＢＴ−７３７がＳＣＬＣ及びリンパ腫細胞株に対して選択的効果を示した（Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆら，２００５）。ＡＢＴ−７３７の化学構造はＯｌｔｅｒｓｄｏｒｆら（２００５）のｐ．６７９に挙げられている。
【０００９】
多くの腫瘍で、生存促進性ファミリーメンバーが過剰発現し、（Ｃｏｒｙら，２００３）、またはｐ５３経路の変異がさもなければアポトーシスを誘発するであろうＢＨ３−オンリータンパク質のｐ５３媒介誘導を停止させる（Ｊｅｆｆｅｒｓら，２００３；Ｓｈｉｂｕｅら，２００３；Ｖｉｌｌｕｎｇｅｒら，２００３）ので、Ｂｃｌ−２ファミリーの損傷細胞を除去する能力は覆る。しかしながら、興味深いことに、たとえＢｃｌ−２阻害剤ファミリーの効果に対して耐性であっても、腫瘍細胞におけるアポトーシス機構は無傷のままである。
【００１０】
生存促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを過剰発現した細胞の１つの研究で、前記細胞が通常Ｂａｘ／Ｂａｋ媒介アポトーシスを誘発させるＡＢＴ−７３７に対して耐性であることが知見された。Ｖａｎ Ｄｅｌｆｔら（２００６）は、別の生存促進性関連物のＭｃＩ−１が過剰発現したので細胞はＡＢＴ−７３７に対して化学不応性であったと知見した。Ｍｃｌ−１をダウンレギュレートすることにより、細胞はＡＢＴ−７３７媒介アポトーシスに対して感受性になった（ｖａｎ Ｄｅｌｆｔら，２００６）。癌細胞をＡＢＴ−７３７の作用に対して難治性とする際のＭｃＩ−１の役割はＴａｈｉｒら（２００７）により立証された（Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋら，２００７）。この研究で、Ｔａｈｉｒら（２００７）は、小細胞肺癌系を漸増量のＡＢＴ−７３７に曝すと、細胞はＡＢＴ−７３７耐性を獲得し、これはＭｃＩ−１発現のアップレギュレーションに関係していたことを観察した。
【００１１】
よって、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーのアンタゴニストに対して耐性である細胞の同定を可能にすることが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｃｏｂｌｅｉｇｈら，１９９９
【非特許文献２】Ｌｙｎｃｈら，２００４
【非特許文献３】Ｐａｕｌｅｔｔｉら，２０００
【非特許文献４】Ａｓｈｍａｎら，２００２
【非特許文献５】Ｃｏｅら，２００６
【非特許文献６】Ｋｉｍら，２００６
【非特許文献７】Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，１９９９
【非特許文献８】Ｏｈｍｏｒｉら，１９９３
【非特許文献９】Ｙａｓｕｉら，２００４
【非特許文献１０】Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｌｉｍｅｎｔら，２００３
【非特許文献１１】Ｍｏｎｎｉら，１９９６
【非特許文献１２】Ｇａｌｔｅｌａｎｄら，２００５
【非特許文献１３】Ｎｕｐｐｏｎｅｎら，１９９８
【非特許文献１４】Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋら，２００７
【非特許文献１５】Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆら，２００５
【非特許文献１６】Ｃｏｒｙら，２００３
【非特許文献１７】Ｊｅｆｆｅｒｓら，２００３
【非特許文献１８】Ｓｈｉｂｕｅら，２００３
【非特許文献１９】Ｖｉｌｌｕｎｇｅｒら，２００３
【非特許文献２０】Ｖａｎ Ｄｅｌｆｔら，２００６
【非特許文献２１】Ｔａｈｉｒら（２００７）
【発明の概要】
【００１３】
第１の態様で、本発明は、
（ａ）患者から組織サンプルを用意し；
（ｂ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し；
（ｃ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるならば患者をＢｃｌ−２低分子阻害剤に対して耐性であると分類する
ことを含むＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性である癌を有する患者を分類する方法に関する。
【００１４】
第２の態様で、本発明は、
（ａ）患者から組織サンプルを用意し；
（ｂ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の発現が増幅されるかを判定し；
（ｃ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されないならば患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤を受ける資格があると分類する
ことを含む癌患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があると同定する方法に関する。
【００１５】
第１及び第２の態様で、Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤はＡＢＴ−２６３であり得、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅はＢｃｌ−ｘＬポリペプチドの発現の増加と相関している。判定ステップは、例えば検出可能に標識されている核酸プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含み得る。或いは、遺伝子増幅を判定するために、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用いてＰＣＲを使用し得る。増幅はマイクロアレイアッセイを用いても判定され得る。
【００１６】
第３の態様で、本発明は、
（ａ）癌患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）検査サンプル中の腫瘍または癌細胞を同定し、または検査サンプルから腫瘍または癌細胞を抽出し；
（ｃ）腫瘍または癌細胞中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し；
（ｄ）治療開始前または治療開始時に測定した増幅Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子を有する腫瘍または癌細胞の数を前記腫瘍または癌細胞の基準レベルと比較する
ことを含む抗−Ｂｃｌ−２ファミリー剤で治療されている患者をモニターする方法に関する。
【００１７】
第４の態様で、本発明は、
（ａ）患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）（ｉ）検査サンプル中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し、及び（ｉｉ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量を測定し；
（ｃ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量が対照中のＢｃｌ−ｘＬの量より多いか少ないかを判定し；
（ｄ）（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅及び（ｉｉ）Ｂｃｌ−ｘＬの量が対照中よりも検査サンプル中で多いことに基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性の癌を有すると分類する
ことを含むＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性の癌を有する患者を分類する方法に関する。
【００１８】
第５の態様で、本発明は、
（ａ）患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）（ｉ）検査サンプル中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し、（ｉｉ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量を測定し；
（ｃ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量が対照中のＢｃｌ−ｘＬの量より多いか少ないかを判定し；
（ｄ）（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅及び（ｉｉ）Ｂｃｌ−ｘＬの量が対照中よりも検査サンプル中で多いことに基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があると分類する
ことを含む癌患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があると同定する方法に関する。
【００１９】
第６の態様で、本発明は、
（ａ）癌患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）サンプル中の腫瘍または癌細胞を同定し、またはサンプルから腫瘍または癌細胞を抽出し；
（ｃ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅の存在または不在に基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤で治療を続けるべきかを決定する
ことを含む抗−Ｂｃｌ−２ファミリー剤で治療されている患者をモニターする方法に関する。
【００２０】
第７の態様で、本発明は、
（ａ）患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）（ｉ）検査サンプル中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し、（ｉｉ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量を測定し；
（ｃ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量が対照中のＢｃｌ−ｘＬの量よりも多いか少ないかを判定し；
（ｄ）（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅及び（ｉｉ）Ｂｃｌ−ｘＬの量が対照中よりも検査サンプル中で多いことに基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤で治療続けるべきかを判定する
ことを含む抗−Ｂｃｌ−２ファミリー剤で治療されている患者をモニターする方法に関する。
【００２１】
測定ステップ（ｂ）（ｉｉ）をイムノアッセイにより実施する。
【００２２】
本発明のこれらの最初の７つの態様で、それぞれＢｃｌ−２ファミリー阻害剤はＡＢＴ−２６３であり得、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅はＢｃｌ−ｘＬタンパク質の発現の増加に相関している。判定ステップは、例えば検出可能に標識されている核酸プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含み得る。或いは、遺伝子増幅を判定するためにＢｃｌ−ｘＬ遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用いてＰＣＲを使用し得る。増幅はマイクロアレイアッセイを用いても判定され得る。幾つかの態様で、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子発現はｍＲＮＡまたはポリペプチドレベルを計測することにより調べられる。ポリペプチドレベルは、サンドイッチ型イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイを用いて、または自動イムノアッセイ計器を用いて計測され得る。患者は特にＳＬＣＬ及びリンパ腫患者であり得る。腫瘍細胞は循環腫瘍細胞であり得る。
【００２３】
第８の態様で、本発明は、
（ａ）増幅されたＢｃｌ−ｘＬ遺伝子を検出するための試薬及び
（ｂ）使用説明書
を含むキットに関する。
【００２４】
キット中の試薬は、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズする検出可能に標識されているポリヌクレオチド、けまたはＢｃｌ−ｘＬポリペプチドを結合する抗体であり得る。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、癌及び腫瘍細胞をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療に対する耐性についてモニターするための方法及び組成物を提供する。本発明者らは、予期せぬことに、すでにＢｃｌ−２ファミリー阻害剤により標的化されている遺伝子産物の１つをコードする領域の遺伝子増幅によりＢｃｌ−２ファミリー阻害剤耐性が生ずることを知見した。この知見は理論上または文献から完全に予期されなかった。
【００２６】
本発明者らは、ゲノムワイドスケールで遺伝子コピー数異常を検出するためのマイクロアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション技術を用いる増幅により、ＤＮＡコピー数の変化を伴う染色体異常の全ゲノム見解が得られることを知見した。この方法は、開示内容を参照により本明細書に組み入れる２００８年１０月３１日に出願された米国特許出願Ｎｏ．６１／１１０，２８１の“ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＡＳＳＥＭＢＬＩＮＧ ＰＡＮＥＬＳ ＯＦ ＣＡＮＣＥＲ ＣＥＬＬ ＬＩＮＥＳ ＦＯＲ ＵＳＥ ＩＮ ＴＥＳＴＩＮＧ ＴＨＥ ＥＦＦＩＣＡＣＹ ＯＦ ＯＮＥ ＯＲ ＭＯＲＥ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ”に詳しく開示されている。
【００２７】
本発明は、患者組織サンプル中のＢｃｌ−ｘＬ遺伝子増幅及び／または遺伝子発現増加を評価することを含む癌患者を同定、分類及びモニターするための診断アッセイを提供する。本発明のアッセイは、Ｂｃｌ−２ファミリーアンタゴニスト治療を受ける資格がある患者を同定するため及び前記治療に対する患者応答をモニターするためのアッセイ方法を含む。本発明は、例えばＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅の存在または不在を蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより判定することを含む。増幅されたＢｃｌ−ｘＬを有すると分類された患者は、抗−Ｂｃｌ−２ファミリー治療に応答しそうにないのでこの治療を受ける資格がない。加えて、この増幅を有する患者は他の癌治療に対して耐性であり得る。よって、癌及び腫瘍細胞中のＢｃｌ−ｘＬの増幅の存在を判定することが一般的な治療層化マーカーである。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から組織サンプルを用意し；
（ｂ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し；
（ｃ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるならば患者をＢｃｌ−２低分子阻害剤に対して耐性であると分類する
ことを含むＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性である癌を有する患者を同定または分類する方法に関する。
【００２９】
この実施形態において、遺伝子増幅は多色蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイにより判定され得、例えば肺癌腫瘍生検サンプルに対して実施される。他の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。
【００３０】
別の実施形態において、本発明は、
（ａ）癌患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）検査サンプル中の腫瘍または癌細胞を同定し、または検査サンプルから腫瘍または癌細胞を抽出し；
（ｃ）腫瘍または癌細胞中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し；
（ｄ）治療開始前または治療開始時に測定した増幅Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子を有する腫瘍または癌細胞の数を前記腫瘍または癌細胞の基準レベルと比較する
ことを含む抗−Ｂｃｌ−２ファミリー剤で治療されている患者をモニターする方法に関する。
【００３１】
ここでも、ＦＩＳＨ及びＰＣＲ方法がＢｃｌ−ｘＬ増幅を検出するために使用され得る。
【００３２】
更に、本発明は、
（ａ）患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）（ｉ）検査サンプル中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し、及び（ｉｉ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量を測定し；
（ｃ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量が対照中のＢｃｌ−ｘＬの量より多いか少ないかを判定し；
（ｄ）（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅及び（ｉｉ）Ｂｃｌ−ｘＬの量が対照中よりも検査サンプル中で多いことに基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性の癌を有すると分類する
ことを含むＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性の癌を有する患者を分類する方法を含む。
【００３３】
これらの同一方法がＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格がある患者を同定するために使用され得る。
【００３４】
本発明は、パッケージ、例えばＰＣＲプライマー、ＦＩＳＨプローブ等として使用されるように工学操作されたポリヌクレオチドを含むキットにも関する。
【００３５】
本発明は、癌治療、特にＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療についての患者の改善された層化を提供できる。これらのバイオマーカーを本発明で評価すると、個々の患者の治療に対する応答を追跡することもできる。
【００３６】
定義
「Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤」は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗの少なくとも１つに結合し、Ｂｃｌ−２ファミリー関連核酸またはタンパク質の活性を拮抗させる任意のタイプの治療用化合物を指し、この中には低分子−、抗体−、アンチセンス−、小型干渉ＲＮＡ、またはミクロＲＮＡベースの化合物が含まれる。本発明の方法は公知のまたは今後開発されるＢｃｌ−２ファミリー阻害剤で有用である。Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤の例は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗの各々に結合するＡＢＴ−７３７、すなわちＮ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミドである。別のＢｃｌ−２ファミリー阻害剤は、ＡＢＴ−２６３、すなわちＮ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミドである。ＡＢＴ−２６３の化学構造はＡＢＴ−７３７に関連しており、その化学構造を式（Ｉ）：
【００３７】
【化１】
に示す。
【００３８】
本発明のアッセイは、標的癌治療、例えば小細胞肺癌及びリンパ腫に対する標的治療と共に使用され得る。アッセイは、Ｂｃｌ−ｘＬの増幅が関与する癌のタイプに関連して実施され得る。癌の他の例には、前立腺癌、卵巣癌及び食道癌のような上皮癌が含まれる。本発明のアッセイは、任意のタイプの患者組織サンプルに対して、または末梢血、（新鮮冷凍及び固定パラフィン包埋組織を含めた）腫瘍または疑わしい腫瘍組織、血液サンプル、リンパ節組織、骨髄及び微小針吸引物中で分離または同定された循環上皮細胞のような細胞単離物に対して実施される。
【００３９】
Ｂｃｌ−２（ＢＣＬ２としても公知）はヒトＢ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２遺伝子を意味する。Ｂｃｌ−ｘｌ（ＢＣＬ２Ｌ１としても公知）はヒトＢＣＬ２様１遺伝子を意味する。Ｂｃｌ−ｗ（ＢＣＬ２Ｌ２としても公知）はヒトＢＣＬ２−ｌ様２遺伝子を意味する。
【００４０】
「特異的にハイブリダイズする」は、核酸が第２核酸に対して検出可能に且つ特異的に結合する能力を指す。ポリヌクレオチドは、非特異的核酸による検出可能な結合の認知し得る量の検出を最小限とするハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で標的核酸鎖と特異的にハイブリダイズする。
【００４１】
「標的配列」または「標的核酸配列」は、ポリヌクレオチドプライマーまたはプローブを用いて増幅及び／または検出される核酸配列を意味し、例えば遺伝子、或いはその補体または断片が含まれる。加えて、用語「標的配列」は時々二本鎖核酸配列を指すが、標的配列は一本鎖であってもよい。標的が二本鎖の場合、ポリヌクレオチドプライマー配列は好ましくは標的配列の両鎖を増幅させる。特定生物に対して多少特異的である標的配列が選択され得る。例えば、標的配列は全属、１つ以上の属、生物の種または亜種、血清群、生育型、血清型、系統、単離物または他の亜集団に対して特異的であり得る。
【００４２】
「検査サンプル」は、被験者または生体流体から採取したサンプルを意味し、該サンプルは標的配列を含み得る。検査サンプルは任意のソース、例えば組織、血液、唾液、痰、粘液、汗、尿、尿道スワブ、子宮頸部スワブ、尿生殖器または肛門スワブ、結膜スワブ、眼房水、脳脊髄液等から採取され得る。検査サンプルは、（ｉ）ソースから得たまま直接、または（ｉｉ）サンプルの特性を調節するための前処理後に使用され得る。よって、検査サンプルは、使用前に例えば血液から血漿または血清を作成する、細胞またはウイルス粒子を破壊する、固体材料から液体を調製する、粘性流体を希釈する、液体を濾過する、試薬を添加する、核酸を精製すること等により前処理され得る。
【００４３】
「被験者」には哺乳動物、鳥類または爬虫類が含まれる。被験者はウシ、ウマ、イヌ、ネコまたは霊長類であり得る。被験者がヒトであってもよい。被験者が生きていても、死んでいてもよい。
【００４４】
「ポリヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、或いはＲＮＡまたはＤＮＡミメティックス（例えば、ＰＮＡ）の核酸ポリマー、並びにその誘導体及びそのホモログである。よって、ポリヌクレオチドには天然に存在するヌクレオ塩基、糖及び共有ヌクレオシド間（骨格）結合から構成されるポリマー、及び同様に機能する非天然部分を有するポリマーが含まれる。前記した修飾または置換核酸ポリマーは当業界で公知であり、「アナログ」と称される。オリゴヌクレオチドは通常約１０〜最高約１６０または２００ヌクレオチドの短ポリヌクレオチドである。
【００４５】
「バリアントポリヌクレオチド」または「バリアント核酸配列」は、所与の核酸配列と少なくとも約６０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するポリヌクレオチドを意味する。バリアントは天然ヌクレオチド配列を含まない。
【００４６】
通常、バリアントポリヌクレオチドは少なくとも約８ヌクレオチド長、しばしば少なくとも約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ヌクレオチド長、更には約７５〜２００ヌクレオチド長またはそれ以上である。
【００４７】
核酸配列に対する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、最大パーセントの配列同一性を得るために配列をアラインさせ、必要ならばギャップを導入した後、当該配列中のヌクレオチドと同一の候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。核酸配列同一性％を判定するためのアラインメントは、例えば公に入手可能なコンピューターソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア）を用いて当業者の範囲内にある各種方法を用いてなされ得る。当業者は、比較しようとする配列の全長にわたり最大のアラインメントを得るために必要なアルゴリズムを含めたアラインメントを調べるための適切なパラメーターを決定することができる。
【００４８】
ヌクレオチド配列をアラインさせたら、所与の核酸配列Ｄに対してまたは核酸配列Ｄと所与の核酸配列Ｃの核酸配列同一性％（或いは、所与の核酸配列Ｄに対してまたは核酸配列Ｄとある％の核酸配列同一性を有するまたは含む所与の核酸配列Ｃとして表され得る）が次のように計算され得る：
核酸配列同一性％＝Ｗ／Ｚ＊１００
ここで、ＷはＣ及びＤの配列アラインメントプログラムまたはアルゴリズムアラインメントにより同一マッチとして採点されたヌクレオチドの数であり、ＺはＤ中のヌクレオチドの総数である。
【００４９】
核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さに等しくない場合、ＣのＤに対する核酸配列同一性％はＤのＣに対する核酸配列同一性％と等しくないであろう。
【００５０】
「％の配列同一性を有するポリヌクレオチドから本質的に構成される」は、ポリヌクレオチドはその長さに実質的な違いはないが、配列が実質的に異なることがあることを意味する。よって、１００ヌクレオチドを有する公知の配列“Ｂ”に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドから本質的に構成されるポリヌクレオチド“Ａ”は、ポリヌクレオチド“Ａ”が約１００ｎｔｓ長であるが、最高２０ｎｔｓが“Ｂ”配列と異なり得ることを意味する。問題のポリヌクレオチド配列は、例えば実質的に非同一の配列を付加して意図する第２構造を形成している場合のように特定タイプのプローブ、プライマー及び他の分子ツールを作成すべく１〜１５ヌクレオチドを付加するように末端が修飾されているためにより長かったり、またはより短かったりする。配列が「本質的にからなる」により修飾されているときには、前記非同一性ヌクレオチドは配列同一性の計算時に考慮されない。
【００５１】
一本鎖ＤＮＡが相補性断片をハイブリダイズする特異性は反応条件のストリンジェンシーにより決定される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ＤＮＡ二本鎖を形成する傾向が低下するにつれて高まる。核酸ハイブリダイゼーション反応において、ストリンジェンシーは特異的ハイブリダイゼーションを促進するように選択され得る（高ストリンジェンシー）。余り特異的でないハイブリダイゼーション（低ストリンジェンシー）は、関連するが、そのままではないＤＮＡ分子（相同ではあるが、同一ではない）またはセグメントを同定するために使用され得る。
【００５２】
ＤＮＡ二本鎖は、（１）相補性塩基対の数、（２）塩基対のタイプ、（３）反応混合物の塩濃度（イオン強度）、（４）反応の温度、及び（５）ＤＮＡ二本鎖安定性を低下させる特定の有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の存在により安定化される。一般的なアプローチは温度を変化させることである。よりストリンジェントな反応条件をもたらすより高い相対温度により（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７）、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーがうまく説明される。
【００５３】
「ストリンジェントな条件」下でのハイブリダイゼーションは、相互に少なくとも６０％相同でヌクレオチド配列がハイブリダイズされたままであることを意味する。
【００５４】
ポリヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的化するため）または細胞膜を超えた輸送を促進する物質のような付加基を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション誘発分割剤（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら，１９８８）またはインターカレート剤（Ｚｏｎ，１９８８）を用いて修飾され得る。オリゴヌクレオチドは別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発分割剤等にコンジュゲートされ得る。
【００５５】
有用なポリヌクレオチドアナログには、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間結合を有するポリマーが含まれる。修飾骨格には、骨格中にリン原子を保持している骨格、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート；及びリン原子を有していない骨格、例えば短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形成される骨格が含まれる。修飾核酸ポリマー（アナログ）は１つ以上の修飾糖部分を含み得る。
【００５６】
ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合の両方が新規な基で置換されているＲＮＡまたはＤＮＡミメティックであるアナログも有用である。これらのミメティックでは、塩基単位は標的配列とのハイブリダイゼーションのために維持されている。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが判明しているミメティックの例はペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｂｕｃｈａｒｄｔら，１９９２；Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９９１）である。
【００５７】
ヌクレオチドの範囲には、核酸分子が天然に存在するヌクレオチド以外の部分で置換、化学、酵素または他の適切な手段により共有的に修飾されている誘導体も含まれる。
【００５８】
ポリヌクレオチドは、核酸配列のアナログ及び／または誘導体を含めた標的配列に対して特異的にハイブリダイズするプライマー及びそのホモログを含む。
【００５９】
ポリヌクレオチドは、市販されている計器、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州フォスター・シティーに所在）、ＤｕＰｏｎｔ（米国デラウェア州ウィルミントンに所在）またはＭｉｌｌｉｇｅｎ（米国マサチューセッツ州ベッドフォードに所在）から入手可能な計器を用いる固相合成のような慣用技術により製造され得る。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体のような修飾ポリヌクレオチドも当業界で公知の類似方法により容易に製造され得る（Ｆｉｎｏ，１９９５；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，１９９５；Ｒｕｔｈ，１９９０）。
【００６０】
「遺伝子」は、コード配列の前の調節配列（５’非コード配列）及び後の調節配列（３’非コード配列）を含めた特定タンパク質を発現する核酸断片を指す。
【００６１】
「未変性遺伝子」は、それ自身の調節配列を有する天然に存在する遺伝子を指す。対照的に、「キメラ構築物」は、通常天然に一緒に存在しない核酸断片の組合せを指す。従って、キメラ構築物は、異なるソースから誘導される調節配列及びコード配列を含み得、或いは同一ソースから誘導されるが、通常天然に存在するとは異なる方法で配列されている調節配列及びコード配列を含み得る。（用語「単離された」は、配列が天然環境から除去されることを意味する）。
【００６２】
本明細書中で使用されている「プローブ」または「プライマー」は、少なくとも８ヌクレオチド長であり、プローブまたはプライマー中の少なくとも１つの配列が標的領域中の配列と相補性であるために標的配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドである。プローブのポリヌクレオチド領域はＤＮＡ及び／またはＲＮＡ及び／または合成ヌクレオチドアナログから構成され得る。好ましくは、プローブはポリメラーゼ連鎖反応中に標的配列をプライムするために使用される配列に対して相補的である配列を含まない。
【００６３】
「発現」は、機能最終産物の産生を指す。遺伝子の発現は、遺伝子の転写及びｍＲＮＡの前駆体または成熟タンパク質への翻訳を含む。「アンセチンス抑制」は、標的タンパク質の発現を阻止し得るアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「共抑制」は、同一または実質的に類似の外来または内因性遺伝子の発現を阻止し得るセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（米国特許Ｎｏ．５，２３１，０２０）。
【００６４】
「組換え体」は、例えば化学合成による、または核酸の単離セグメントを遺伝子工学技術により操作することによる配列の２つの他の方法で分離されているセグメントの人工的組合せを指す。
【００６５】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、一連の反復サイクル（コネチカット州ノーウォークに所在のＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）からなる大量の特定ＤＮＡセグメントを合成するための技術である。典型的には、二本鎖ＤＮＡを熱変性し、標的セグメントの３’境界に相補的な２つのプライマーを低温でアニールした後、中間温度で伸長させる。これら３つの連続したステップの１組をサイクルと呼ぶ。
【００６６】
ＰＣＲは、テンプレートを反復複製することによりＤＮＡを短時間で数百万倍に増幅させるために使用される強力な技術である（（Ｍｕｌｌｉｓら，１９８６）；Ｅｒｌｉｃｈら，欧州特許出願Ｎｏ．５０，４２４；欧州特許出願Ｎｏ．８４，７９６；欧州特許出願Ｎｏ．２５８，０１７、欧州特許出願Ｎｏ．２３７，３６２；欧州特許出願Ｎｏ．２０１，１８４、米国特許Ｎｏ．４，６８３，２０２；米国特許Ｎｏ．４，５８２，７８８；及び米国特許Ｎｏ．４，６８３，１９４）。この方法は、ＤＮＡ合成をプライムするために特定のインビトロ合成したオリゴヌクレオチドの組を使用している。プライマーの設計は分析しようとするＤＮＡの配列に依存する。この技術は、テンプレートを高温で融解し、プライマーをテンプレート内の相補性配列にアニールした後、テンプレートをＤＮＡポリメラーゼを用いて複製するサイクルを複数回（通常２０〜５０回）実施する。
【００６７】
ＰＣＲ反応産物は、アガロースゲルを用いて分離した後、臭化エチジアム染色し、次いでＵＶ透照で視覚化することにより分析され得る。或いは、生成物に標識を取り込むために放射活性ｄＮＴＰをＰＣＲを添加してもよい。この場合、ゲルをｘ線フィルムに曝すことによりＰＣＲの産物を可視化する。ＰＣＲ産物を放射標識する追加の利点は個々の増幅産物のレベルを定量化できることである。
【００６８】
発明の実施
ポリヌクレオチドアッセイ
本発明において有用な核酸アッセイ方法は、（ｉ）無傷の組織または細胞サンプルに対してｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、（ｉｉ）組織サンプルから抽出した染色体ＤＮＡに対してマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ、及び（ｉｉｉ）組織サンプルから抽出した染色体ＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の増幅アッセイを施すことにより増幅ＤＮＡ領域を検出することを含む。これらのフォーマットのいずれにおいても核酸の合成アナログ（例えば、ペプチド核酸）を用いるアッセイを使用し得る。
【００６９】
本発明のアッセイは、治療応答を予測するために及びＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療に対する患者応答をモニターするためにＢｃｌ−ｘＬコピー数バイオマーカーを増加させる増幅Ｂｃｌ−ｘＬ領域を同定すべく使用される。応答予測のためのアッセイは治療開始前に実施され得、Ｂｃｌ−ｘＬ領域の増幅を示す患者はＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格がある。コピー数増加は他の癌治療（例えば、化学療法または放射線治療）に対する耐性の兆候となり得る。患者応答をモニターするためには、組織サンプル中のバイオマーカーの基準レベル（例えば、サンプル中でコピー数増加を示す全細胞の％または細胞の数）を定めるためにアッセイを治療開始時に実施する。次いで、同一組織をサンプリングし、アッセイし、バイオマーカーのレベルを基準と比較する。レベルが同一のままか低下したならば、治療は多分有効であり、継続することができる。基準レベルよりも有意な上昇が生じたならば、患者は応答しないことがあり得る。
【００７０】
本発明は、特定の設計された染色体標的にハイブリダイズするように設計／選択した検出可能に標識されている核酸プローブ（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プローブまたはタンパク質核酸（ＰＮＡ）プローブ）または非標識プライマーを用いるハイブリダイゼーションアッセイを用いることによるゲノムバイオマーカーの検出を含む。非標識プライマーを例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅アッセイにおいて使用し、このＰＣＲではプライマー結合後ポリメラーゼはその後の検出のために標的核酸配列を増幅させる。ＰＣＲまたは他の増幅アッセイにおいて使用される検出プローブは好ましくは蛍光であり、より好ましくは「リアルタイムＰＣＲ」において有用な検出プローブである。蛍光標識もｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて使用するのに好ましいが、ハイブリダイゼーション技術において通常使用されている他の検出可能な標識（例えば、酵素、色素原性及び同位体標識）も使用され得る。有用なプローブ標識技術は文献（Ｆａｎ，２００２）（参照により本明細書に組み入れる）に記載されている。ゲノムバイオマーカーのマイクロアレイ分析による検出において、これらのプローブ標識技術が患者サンプル由来の染色体ＤＮＡ抽出物を標識するために適用され、その後マイクロアレイにハイブリダイズされる。
【００７１】
ヒトＢｃｌ−ｘＬのポリヌクレオチド配列（配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ １３８５７８）を表１に示す。
【００７２】
【表１】
【００７３】
好ましくは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、Ｂｃｌ−２遺伝子座及びプローブＡ ６７ Ｐ０４７４２６１７及びＡ ５３ Ｐ１７４４５６（Ａｇｉｌｅｎｔ（カリフォルニア州サンタクララに所在）から入手可能；マウスＣＧＨマイクロアレイ２４４Ａ，カタログ番号Ｇ４４１５Ａ）により規定される遺伝子座での染色体コピー数増加または遺伝子増幅の存在を検出するために使用される。プローブは配列番号１の配列を用いて当業者により作成され得る。
【００７４】
本発明のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法において使用するためのプローブは２つの広い群；染色体計数プローブ、すなわち染色体領域、通常反復配列領域にハイブリダイズし、全染色体の存在または不在を示すプローブ；及び遺伝子座特異的プローブ、すなわち染色体上の特定遺伝子座にハイブリダイズし、特定遺伝子座の存在または不在を検出するプローブに入る。染色体腕プローブ、すなわち染色体領域にハイブリダイズし、特定染色体の腕の存在または不在を示すプローブも使用され得る。Ｂｃｌ−ｘＬのような問題の遺伝子座でのユニークな染色体ＤＮＡ配列の変化を検出し得る遺伝子座特異的プローブを使用することが好ましい。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためにユニークな配列プローブを使用する方法は参照により本明細書に組み入れる米国特許５，４４７，８４１に記載されている。
【００７５】
染色体計数プローブは動原体近くに位置するかまたは動原体から除去した反復配列にハイブリダイズし得、或いは染色体上の任意の位置にあるユニーク配列にハイブリダイズし得る。例えば、染色体計数プローブは染色体の動原体に関係する反復ＤＮＡとハイブリダイズし得る。霊長類染色体の動原体は、α−サテライトと称される約１７１塩基対のモノマー反復長からなるＤＮＡの長タンデム反復の複合体ファミリーを含む。染色体１４及び１８の各々に対する動原体蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブはＡｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（イリノイ州デス・プレーンズに所在）から市販されている。
【００７６】
特に有用なｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブは、参照により本明細書に組み入れる米国特許５，４９１，２２４に記載されているような直接標識されている蛍光プローブである。米国特許５，４９１，２２４は、２つ以上の蛍光標識されているプローブを用いる同時ＦＩＳＨアッセイも記載している。
【００７７】
有用な遺伝子座特異的プローブは任意の方法で作成され得、通常約１０，０００〜約１，０００，０００塩基長を有する染色体ＤＮＡ標的配列にハイブリダイズする配列を含んでいる。好ましくは、プローブは少なくとも１００，０００〜約５００，０００塩基長を有する標的遺伝子座で染色体ＤＮの標的ストレッチにハイブリダイズし、プローブの非特異的結合を避けるために参照により本明細書に組み入れる米国特許５，７５６，６９６に開示されているようにプローブミックス中に非標識遮断核酸をも含む。遮断核酸として非標識の合成オリゴマー核酸またはペプチド核酸を使用することもできる。特定遺伝子座を標的とするために、プローブが遺伝子に架かっており、よって遺伝子の全ゲノムコーディング座の両側にハイブリダイズする核酸配列を含むことが好ましい。プローブは細菌人工染色体（ＢＡＣ）等のようなヒトＤＮＡ含有クローンから出発して作成され得る。ヒトゲノムのＢＡＣライブラリーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールズバッドに所在）から入手可能であり、有用なクローンを同定するために調べられ得る。標的遺伝子座中のＤＮＡ配列を同定するためにカリフォルニア大学サンタクルーズ校のゲノムブラウザを使用することが好ましい。次いで、これらのＤＮＡ配列を使用して、有用なクローンを同定すべくＢＡＣライブラリーをスクリーニングするために使用するためのＰＣＲプライマーを合成することができる。次いで、クローンを慣用のニック翻訳方法により標識し、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブとして試験し得る。
【００７８】
本明細書中に記載されているｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法で使用され得る蛍光基の例は、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標）（オレゴン州ユージンに所在のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）；５−（及び−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、５−（及び−６）−カルボキシフルオレセイン；フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチル−ローダミン−５−（及び−６）−イソチオシアネート；５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン；７−ヒドロキシ−クマリン−３−カルボン酸；６−［フルオレセイン５−（及び−６）−カルボキサミド］ヘキサン酸；Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−３−インダセンプロピオン酸；エオシン−５−イソチオシアネート；エリスロシン−５−イソチオシアネート；５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ；及びＣａｓｃａｄｅ（商標）ブルーアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎブランド）である。
【００７９】
プローブは蛍光顕微鏡及び蛍光基毎に適切なフィルターを用いて、または複数の蛍光基を観察するためのデュアルまたはトリプルバンド通過フィルター組を用いることにより見ることができる。例えば、参照により本明細書に組み入れるＢｉｔｔｎｅｒらの米国特許Ｎｏ．５，７７６，６８８を参照されたい。ハイブリダイズしたプローブを視覚化するために自動デジタルイメージグシステムを含めた適当な顕微鏡イメージング方法を使用し得る。或いは、染色体プローブのハイブリダイゼーションパターンを調べるためにフローサイトメトリーのような技術を使用し得る。
【００８０】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより生ずるセルバイセル遺伝子増幅分析が好ましいが、ゲノムバイオマーカーも定量ＰＣＲにより検出され得る。この実施形態では、染色体ＤＮＡを組織サンプルから抽出した後、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−ｗの少なくとも１つに対して特異的なプライマーの対を用いるＰＣＲにより、またはプライマーの複数の対を用いるマルチプレックスＰＣＲにより増幅させる。バイオマーカーのために任意のプライマー配列を使用し得る。次いで、参照増幅標準と比較することにより組織のコピー数を測定する。
【００８１】
マイクロアレイコピー数分析も使用し得る。この実施形態では、基質表面１ｃｍ２あたり数百万以下のプローブのプローブ密度で配置した複数の固定化非標識核酸プローブを有する基質を含むマイクロアレイにハイブリダイズするために抽出後の染色体ＤＮＡを標識する。複数のマイクロアレイフォーマットが存在し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州パロアルトに所在）及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（カリフォルニア州にサンタクララに所在）から入手し得るようなＢＡＣ及びオリゴヌクレチドをベースとするマイクロアレイを含めたこれらのいずれかを使用し得る。増幅を検出するためにオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用するときには、標的領域中の３つ以上の別の位置に対するプローブ配列を有するマイクロアレイを使用することが好ましい。
【００８２】
発現の検出：ｍＲＮＡ
Ｂｃｌ−ｘＬの遺伝子発現レベルは、検査サンプル中の１つ以上のｍＲＮＡの量を評価することにより調べられ得る。サンプル中のｍＲＮＡの計測方法は当業者で公知である。ｍＲＮＡレベルを計測するためには、検査サンプル中の細胞を溶解し、ライゼート中、或いはライゼートから精製または半精製したＲＮＡ中のｍＲＮＡのレベルは当業者に周知の各種方法により測定し得る。これらの方法には、検出可能に標識されているＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイ（すなわち、ノーザンブロッティング）、または適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いる定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲ方法が含まれる。或いは、定量または半定量ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイは、例えば組織切片または未溶解細胞懸濁液及び検出可能に標識されている（例えば、蛍光または酵素標識されている）ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて実施し得る。ｍＲＮＡを定量するための別の方法には、ＲＮＡプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、発現差解析（ＲＤＡ）、ディファレンシャルディスプレイ、ＥＳＴ配列分析及び遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）が含まれる。
【００８３】
適当な実施形態では、ＰＣＲ増幅が検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬ遺伝子を検出するために使用される。簡単に説明すると、ＰＣＲでは、マーカー配列（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子）の相手相補鎖上の領域に対して相補性の２つのプライマー配列を作成する。反応混合物に過剰のデオキシヌクレオチドトリホスフェートをＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）と一緒に添加する。標的配列がサンプル中に存在するならば、プライマーは配列に結合し、ポリメラーゼはヌクレオチドに付加することによりプライマーをマーカー配列に沿って伸長させるであろう。反応混合物の温度を上下させることにより、伸長したプライマーはマーカーから解離して反応産物を形成し、過剰のプライマーはマーカー及び反応産物に結合し、このプロセスを繰り返すと増幅産物が生ずる。増幅したｍＲＮＡの量を定量するためには逆転写酵素ＰＣＲ増幅手順を実施し得る。
【００８４】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の適当な断片を増幅し、検出し得る。ＰＣＲのために有効なプライマーを設計することは当業者の範囲内である。典型的には、検出のための増幅断片は約５０〜３００ヌクレオチド長である。
【００８５】
増幅産物は幾つかの方法で検出され得る。増幅産物は、サンプルをゲル中で電気泳動にかけた後、ＤＮＡ結合染料（例えば、臭化エチジウム）で染色することにより視覚化され得る。或いは、増幅産物を放射性または蛍光ヌクレオチドで完全に標識した後、ｘ線フィルムを用いてまたは適当な刺激スペクトル下で視覚化することができる。
【００８６】
増幅は「リアルタイム」方法を用いてもモニターされ得る。リアルタイムＰＣＲにより、核酸標的を検出し、定量することができる。典型的には、定量ＰＣＲに対するこのアプローチは、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ（登録商標）Ｉのような二本鎖特異的染料であり得る蛍光染料を使用する。或いは、他の蛍光染料（例えば、ＦＡＭまたはＨＥＸ）をオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーにコンジュゲートし得る。リアルタイムＰＣＲを実施し得る各種計器が当業界で公知であり、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）システム（Ｒｏｃｈｅ）が含まれる。ＰＣＲの各サイクルで発生する蛍光シグナルはＰＣＲ産物の量に比例している。蛍光対サイクル数のプロットを使用すると増幅のカイネティックスが説明され、蛍光閾値レベルを使用すると最初のテンプレート濃度に対する分割サイクル数が規定される。増幅を実施し、熱サイクリング中蛍光を測定することができる計器を用いて検出するとき、非特異的ＰＣＲ産物由来の意図するＰＣＲ産物を融解分析を用いて区別し得る。増幅及びシグナル発生後の反応の温度を徐々に上昇させながら蛍光の変化を計測することにより、意図する産物及び非特異的産物のＴｍを測定することができる。
【００８７】
この方法は、「マルチプレックス検出」または「マルチプレクシング」としても公知であり、サンプル中の複数の核酸を増幅させることを含む。「マルチプレックスＰＣ」は、１つ以上の標的遺伝子マーカー由来の核酸を含めた複数の核酸を検出し、定量するために反応物に２組以上のＰＣＲプライマーを添加することを含むＰＣＲを指す。更に、内部対照（例えば、１８Ｓ ｒＲＮＡ、ＧＡＤＰＨまたはＯ−アクチン）とマルチプレクシングすると、反応なしにＰＣＲのための対照が得られる。
【００８８】
発現の研修：ポリペプチド
本発明の方法及びアッセイは、ポリペプチド発現の評価、例えばＢｃｌ−ｘＬポリペプチド発現のモニターにも関する。ポリペプチドの発現の量は定性的または定量的に評価し得る。他の実施形態では、ポリペプチドの発現の量を非腫瘍または癌細胞と腫瘍または癌細胞間で比較する。このために当業界で公知の方法が使用され得るが、Ｂｃｌ−ｘＬポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を使用するイムノアッセイが特に好都合である。市販されている抗−Ｂｃｌ−ｘＬ抗体の例を表３に示す。
【００８９】
【表２】
【００９０】
イムノアッセイには２つの基本的タイプ、すなわち競合的または非競合的（例えば、それぞれイムノメトリック型及びサンドイッチ型）がある。いずれのアッセイでも、抗体または抗原試薬を固相に共役的または非共役的に結合させる。共役結合のための連結剤は公知であり、固相の一部であり得、またはコーティングする前に誘導体化され得る。イムノアッセイで使用される固相の例は多孔質または非孔質材料、ラテックス粒子、磁気粒子、ミクロ粒子、ストリップ、ビーズ、膜、マイクロタイターウェル及びプラスチック管である。固相材料及び抗原または抗体試薬を検出可能に標識させる方法の選択は所望のアッセイフォーマット性能特性に基づいて決定される。幾つかのイムノアッセイの場合には、検出可能な標識を必要としない。例えば、抗原が赤血球のような検出可能な粒子上にあるならば、反応性は凝集に基づいて確立され得る。或いは、抗原−抗体反応により目に見える変化（例えば、放射状免疫拡散）が生じ得る。多くの場合、イムノアッセイで使用される抗体または抗原試薬の１つをシグナル発生化合物（検出可能な標識）に結合させる。このシグナル発生化合物または標識はそれ自体検出可能であり、または検出可能な産物を生成させるべく１つ以上の追加化合物と反応させてもよい（米国特許Ｎｏ．６，３９５，４７２ Ｂｌも参照されたい）。前記シグナル発生化合物の例には、色素源、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１１、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ及び１４Ｃ）、蛍光化合物（例えば、フルオレセイン、ローダミン）、化学ルミネセント化合物、粒子（可視または蛍光）、核酸、錯化剤または触媒、例えば酵素（例：アルカリホスファターゼ、アシッドホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びリボヌクレアーゼ）が含まれる。酵素を使用する場合、色素原性、蛍光原性または発光原性基質を添加すると、検出可能なシグナルが発生する。他の検出システム、例えば時間分割蛍光法、内部反射、蛍光、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）及びラマン分光法も有用である。
【００９１】
２つの一般的フォーマットがヒト中の特定の抗体タイター及びタイプをモニターするために通常使用されている：（１）抗原を上記したような固相に提示し、特定の抗体を含有するヒト生体流体を抗原と反応させた後、抗原に結合した抗体をシグナル発生化合物にカップリングさせた抗ヒト抗体を用いて検出する；及び（２）抗ヒト抗体を固相に結合させ、特定の抗体を含有するヒト生体流体を結合抗体と反応させた後、シグナル発生化合物に結合させた抗原を添加して、流体サンプル中に存在する特定の抗体を検出する。いずれのフォーマットでも、抗ヒト抗体試薬は、アッセイの所期目的に応じて、すべての抗体クラスを認識し得、或いは抗体の特定クラスまたはサブクラスに対して特異的であり得る。これらのアッセイフォーマット及び他の公知のフォーマットは本発明の範囲内にあると意図され、当業者に公知である。
【００９２】
本明細書に例示されているフォーマット及び本発明のアッセイまたはキットは、例えば米国特許Ｎｏｓ．５，０８９，４２４及び５，００６，３０９に記載されているような、またＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（イリノイ州アボット・パークに所在）から市販されているような（ミクロ粒子からなる固相が存在しているシステムを含めた）自動及び半自動システム並びに他のプラットフォームにおいて使用するために改造または最適化され得る。市販品にはＡｂｂｏｔｔ’ｓ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ、ＩＭＸ、ＰＲＩＳＭ及びＱｕａｎｔｕｍ ＩＩプラットフォームが含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
本発明のアッセイ及びキットは、Ａｂｂｏｔｔ’ｓ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（商標））電気化学イムノアッセイシステムを含めたポイント・オブ・ケア・アッセイシステムのために改造または最適化され得る。イムノセンサー及びそれを製造し、単使用テストデバイスにおいて操作する方法は、例えば米国特許Ｎｏ．５，０６３，０８１、並びに公開された米国特許出願Ｎｏｓ．２００３０１７０８８１、２００４００１８５７７、２００５００５４０７８及び２００６０１６０１６４（当該部分に関して教示するために参照により本明細書に組み入れる）に記載されている。
【００９４】
サンプル処理及びアッセイ性能
本発明方法によりアッセイしようとする組織サンプルは、末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル；或いは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプルまたはパラフィン包埋組織サンプルから作成される抽出物または処理サンプルを含めた任意のタイプからなり得る。例えば、まず患者末梢血サンプルを処理して上皮細胞集団を抽出した後、この抽出物をアッセイし得る。疑わしい腫瘍細胞を多く含む細胞サンプルを得るために組織サンプルの顕微解剖を使用することもできる。本発明で使用するための好ましい末梢組織サンプルは末梢血、微小針吸引物サンプル、新鮮凍結組織サンプル及びパラフィン包埋組織サンプルを含めた腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、及び骨髄である。
【００９５】
組織サンプルは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは他の核酸アッセイを実施するための望ましい方法により処理され得る。好ましいｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイの場合、パラフィン包埋した腫瘍組織サンプルまたは骨髄サンプルをガラス顕微鏡スライド上に固定し、溶媒（典型的には、キシレン）を用いて脱パラフィン化する。組織脱パラフィン化及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために有用なプロトコルはＡｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｃ．（イリノイ州デス・プレーンズに所在）から入手可能である。適当な計器による計測または自動化が本発明のアッセイの実施において使用され得る。ＰＣＲに基づくアッセイはｍ２０００計器システム（イリノイ州デス・プレーンズに所在のＡｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を用いて実施され得る。自動イメージングが好ましい蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイのために使用され得る。
【００９６】
１つの実施形態において、サンプルは、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子座で増幅を有する循環腫瘍または癌細胞の抽出物を産生するように処理された患者由来の末梢血サンプルからなる。循環腫瘍細胞はＩｍｍｕｎｉｃｏｎ（ペンシルバニア州ハンティンドン・バレーに所在）から入手し得るような免疫磁気分離技術により分離し得る。次いで、少なくとも１コピー数増加を示す循環腫瘍細胞の数を、好ましくは治療開始時に測定して高いコピー数を有する循環腫瘍細胞の基準レベルと比較する。循環腫瘍細胞の数の増加は治療失敗の兆候となり得る。
【００９７】
検査サンプルは、臨床診断のために十分な数の細胞を含み得、典型的には少なくとも約１００個の細胞を含んでいる。典型的なＦＩＳＨアッセイでは、ハイブリダイゼーションパターンを約２５〜１，０００個の細胞で評価する。検査サンプルは、典型的にはサンプルの大部分に遺伝子増幅を含むことが判明したときには「検査陽性」と見なされる。染色体コピー数で同定され、具体的なサンプルを陽性と分類するために使用される細胞の数は、通常サンプル中の細胞数により異なる。陽性分類のために使用される細胞の数はカットオフ値としても公知である。決定の際に使用され得るカットオフ値の例には約５、２５、５０、１００及び２５０個の細胞、或いは同一サンプル集団中の細胞の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％及び６０％が含まれる。サンプルを陽性と分類するには１個くらいの少ない細胞で十分であり得る。典型的なパラフィン包埋組織サンプルの場合、少なくとも３０個の細胞を陽性と同定することが好ましく、少なくとも２０個の細胞を染色体コピー数増加を有する点で陽性であると同定することがより好ましい。例えば、典型的なパラフィン包埋した小細胞肺癌組織中でＢｃｌ−ｘＬ増幅を有する細胞が３０個検出されれば、組織を陽性であり、治療を受ける資格があると分類するのに十分であろう。
【００９８】
アッセイキット
別の態様で、本発明は、Ｂｃｌ−ｘＬに対する結合に対して特異的な少なくとも１つのプローブを収容している容器を含むゲノムバイオマーカーを検出するためのキットを含む。これらのキットは、アッセイのための他の関連試薬を収容している容器をも含む。本発明の好ましいキットは、それぞれＢｃｌ−ｘＬに対して特異的に結合し得る少なくとも１つのＦＩＳＨプローブを収容している容器を含む。本発明のキットは核酸プローブアナログ、例えばペプチド核酸プローブを含み得る。最後に、キットは更に使用説明書を含み得る。
【００９９】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療について同定、分類及びモニターするために有用な診断アッセイに関し、特に大部分のＢｃｌ−２阻害剤に対して耐性でありそうな癌を有する患者を同定することができる特定のマーカーの計測に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の遺伝的異種性は有効な癌治療薬の開発を複雑にしている要因である。古典的な組織病理学的分類に従って１つの疾病単位であると見なされている癌は、分子プロファイリングにかけるとしばしば複数のゲノムサブタイプを示す。幾つかの症例では、分子分類が古典的病理学よりもより正確であると証明された。標的癌治療薬の有効性は遺伝子増幅のようなゲノム特徴の存在と相関し得る（Ｃｏｂｌｅｉｇｈら，１９９９；Ｌｙｎｃｈら，２００４）。乳癌中のＨｅｒ−２の場合、遺伝子増幅の検出がタンパク質過剰発現の免疫組織化学（ＩＨＣ）による検出と比較して優れた診断・治療選択情報を与えることが立証されている（Ｐａｕｌｅｔｔｉら，２０００）。従って、患者の標的癌治療に対する応答率を向上させ得るゲノム分類マーカーが要望されている。
【０００３】
肺癌は新しい標的癌治療のために活発に研究されている分野である。肺悪性腫瘍は米国では２００６年に約１６０，０００人が死亡した癌死亡率の主たる原因である。小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）は、肺癌症例の約２０％に相当する肺癌の組織病理学的サブタイプである。このサブタイプの生存率は低く（長期生存率４〜５％）、新しい化学療法レジメンが導入されたにも関わらず、過去１０年間で有意に改善されていない。肺癌症例の残りは、幾つかの共通するサブタイプからなるカテゴリーの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。過去数年間で、ＮＳＣＬＣに対する標的治療（例えば、エルロチニブ及びゲフィチニブ）の開発が大きく進歩している。ＮＳＣＬＣ患者を潜在的な応答者及び非応答者に層化することができるゲノムバイオマーカーが発見された。特に、ＥＧＦＲキナーゼドメインにおける変異及び増幅がエルロチニブ及びゲフィチニブに対する応答と相関していることが分かった。残念ながら、たとえＳＣＬＣ細胞株及び腫瘍のゲノム分析が報告されても（Ａｓｈｍａｎら，２００２；Ｃｏｅら，２００６；Ｋｉｍら，２００６）、ＳＣＬＣでは上記進歩は達成されていない。
【０００４】
標的癌治療研究は、プログラム化細胞死の中心的制御因子であるＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーに対して報告されている。アポトーシスを抑制するＢｃｌ−２ファミリーメンバーは癌において過剰発現され、腫瘍形成の原因となる。Ｂｃｌ−２発現は癌治療に対する耐性及び低い生存率と強く相関している。例えば、前立腺癌におけるアンドロゲン非依存性の発現はＢｃｌ−２発現の高い発生率（調べたコホートの＞４０％）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，１９９９）により特徴づけられ、これは治療に対する高い耐性にも相関している。更に、ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣ細胞株の両方におけるＢｃｌ−２の過剰発現が細胞毒性剤に対する耐性を誘発することが立証されている（Ｏｈｍｏｒｉら，１９９３；Ｙａｓｕｉら，２００４）。Ｙａｓｕｉら（２００４）はＢｃｌ−ｗ（ＢＣＬ２Ｌ２）遺伝子座でのコピー数増加を記載しており、Ｂｃｌ−ｗ発現がＳＫＯＶ３／ＶＰの化学耐性に対して少なくとも部分的に関与していると結論付けている。Ｙａｔｓｕｉら（２００４）は他の癌細胞株でのＢｃｌ−２ファミリーコピー数変化の同定を開示していない。
【０００５】
Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｌｉｍｅｎｔら（２００３）は、濾胞性リンパ腫の大細胞性リンパ腫への形質転換におけるＢｃｌ−２遺伝子座を含めた１８ｑ２１でのコピー数変化の同定を記載している（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｌｉｍｅｎｔら，２００３）。Ｍｏｎｎｉら（１９９６）は、びまん性大細胞Ｂ細胞リンパ腫における複数のコピー数変化を報告している（Ｍｏｎｎｉら，１９９６）。Ｇａｌｔｅｌａｎｄら（２００５）はＢ細胞非ホジキンリンパ腫におけるＢｃｌ−２の染色体座の増加を報告している（Ｇａｌｔｅｌａｎｄら，２００５）。Ｎｕｐｐｏｎｅｎら（１９９８）は１７個の再発性前立腺癌サンプルのうちの４個でＢｃｌ−２の低レベルのコピー数増加を記載している（Ｎｕｐｐｏｎｅｎら，１９９８）。Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋらは、Ｂｃｌ−２遺伝子を含んでおり、Ｂｃｌ−２阻害剤ＡＢＴ−７３７に対する感受性に関連していたＳＣＬＣにおける１８ｑ２１上の増加を報告している（Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋら，２００７）。
【０００６】
今日の腫瘍学研究の重要な領域は標的治療に対する獲得耐性の研究である。標的治療は患者に対して優れた効果を与える。しかしながら、多くの場合、腫瘍が上記治療の効果を避けるべく多数の方策を強制するのでその効果は一時的である。これらの耐性メカニズムは複雑であり、様々である。これらのメカニズムが解明されたら、耐性メカニズムを標的とする新しい治療法が開発され、展開され得る。
【０００７】
ＢＨ３ミメティックは、特定の抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバーを抑制することによりアポトーシスを誘発させるように工学操作された高度に標的化された化合物である。これらの薬物の効果に対する耐性は治療中に生じ得る。
【０００８】
前記ミメティックの１つのＡＢＴ−７３７（旧ＡＢＴ−２６３）はＢｃｌ−２ファミリーメンバーＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗの低分子阻害剤であり、固形腫瘍の退縮を誘発することが判明している（Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆら，２００５）。ＡＢＴ−７３７をヒト癌細胞株の多種多様のパネルに対して試験し、ＡＢＴ−７３７がＳＣＬＣ及びリンパ腫細胞株に対して選択的効果を示した（Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆら，２００５）。ＡＢＴ−７３７の化学構造はＯｌｔｅｒｓｄｏｒｆら（２００５）のｐ．６７９に挙げられている。
【０００９】
多くの腫瘍で、生存促進性ファミリーメンバーが過剰発現し、（Ｃｏｒｙら，２００３）、またはｐ５３経路の変異がさもなければアポトーシスを誘発するであろうＢＨ３−オンリータンパク質のｐ５３媒介誘導を停止させる（Ｊｅｆｆｅｒｓら，２００３；Ｓｈｉｂｕｅら，２００３；Ｖｉｌｌｕｎｇｅｒら，２００３）ので、Ｂｃｌ−２ファミリーの損傷細胞を除去する能力は覆る。しかしながら、興味深いことに、たとえＢｃｌ−２阻害剤ファミリーの効果に対して耐性であっても、腫瘍細胞におけるアポトーシス機構は無傷のままである。
【００１０】
生存促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを過剰発現した細胞の１つの研究で、前記細胞が通常Ｂａｘ／Ｂａｋ媒介アポトーシスを誘発させるＡＢＴ−７３７に対して耐性であることが知見された。Ｖａｎ Ｄｅｌｆｔら（２００６）は、別の生存促進性関連物のＭｃＩ−１が過剰発現したので細胞はＡＢＴ−７３７に対して化学不応性であったと知見した。Ｍｃｌ−１をダウンレギュレートすることにより、細胞はＡＢＴ−７３７媒介アポトーシスに対して感受性になった（ｖａｎ Ｄｅｌｆｔら，２００６）。癌細胞をＡＢＴ−７３７の作用に対して難治性とする際のＭｃＩ−１の役割はＴａｈｉｒら（２００７）により立証された（Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋら，２００７）。この研究で、Ｔａｈｉｒら（２００７）は、小細胞肺癌系を漸増量のＡＢＴ−７３７に曝すと、細胞はＡＢＴ−７３７耐性を獲得し、これはＭｃＩ−１発現のアップレギュレーションに関係していたことを観察した。
【００１１】
よって、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーのアンタゴニストに対して耐性である細胞の同定を可能にすることが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｃｏｂｌｅｉｇｈら，１９９９
【非特許文献２】Ｌｙｎｃｈら，２００４
【非特許文献３】Ｐａｕｌｅｔｔｉら，２０００
【非特許文献４】Ａｓｈｍａｎら，２００２
【非特許文献５】Ｃｏｅら，２００６
【非特許文献６】Ｋｉｍら，２００６
【非特許文献７】Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，１９９９
【非特許文献８】Ｏｈｍｏｒｉら，１９９３
【非特許文献９】Ｙａｓｕｉら，２００４
【非特許文献１０】Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｌｉｍｅｎｔら，２００３
【非特許文献１１】Ｍｏｎｎｉら，１９９６
【非特許文献１２】Ｇａｌｔｅｌａｎｄら，２００５
【非特許文献１３】Ｎｕｐｐｏｎｅｎら，１９９８
【非特許文献１４】Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋら，２００７
【非特許文献１５】Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆら，２００５
【非特許文献１６】Ｃｏｒｙら，２００３
【非特許文献１７】Ｊｅｆｆｅｒｓら，２００３
【非特許文献１８】Ｓｈｉｂｕｅら，２００３
【非特許文献１９】Ｖｉｌｌｕｎｇｅｒら，２００３
【非特許文献２０】Ｖａｎ Ｄｅｌｆｔら，２００６
【非特許文献２１】Ｔａｈｉｒら（２００７）
【発明の概要】
【００１３】
第１の態様で、本発明は、
（ａ）患者から組織サンプルを用意し；
（ｂ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し；
（ｃ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるならば患者をＢｃｌ−２低分子阻害剤に対して耐性であると分類する
ことを含むＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性である癌を有する患者を分類する方法に関する。
【００１４】
第２の態様で、本発明は、
（ａ）患者から組織サンプルを用意し；
（ｂ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の発現が増幅されるかを判定し；
（ｃ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されないならば患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤を受ける資格があると分類する
ことを含む癌患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があると同定する方法に関する。
【００１５】
第１及び第２の態様で、Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤はＡＢＴ−２６３であり得、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅はＢｃｌ−ｘＬポリペプチドの発現の増加と相関している。判定ステップは、例えば検出可能に標識されている核酸プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含み得る。或いは、遺伝子増幅を判定するために、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用いてＰＣＲを使用し得る。増幅はマイクロアレイアッセイを用いても判定され得る。
【００１６】
第３の態様で、本発明は、
（ａ）癌患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）検査サンプル中の腫瘍または癌細胞を同定し、または検査サンプルから腫瘍または癌細胞を抽出し；
（ｃ）腫瘍または癌細胞中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し；
（ｄ）治療開始前または治療開始時に測定した増幅Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子を有する腫瘍または癌細胞の数を前記腫瘍または癌細胞の基準レベルと比較する
ことを含む抗−Ｂｃｌ−２ファミリー剤で治療されている患者をモニターする方法に関する。
【００１７】
第４の態様で、本発明は、
（ａ）患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）（ｉ）検査サンプル中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し、及び（ｉｉ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量を測定し；
（ｃ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量が対照中のＢｃｌ−ｘＬの量より多いか少ないかを判定し；
（ｄ）（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅及び（ｉｉ）Ｂｃｌ−ｘＬの量が対照中よりも検査サンプル中で多いことに基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性の癌を有すると分類する
ことを含むＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性の癌を有する患者を分類する方法に関する。
【００１８】
第５の態様で、本発明は、
（ａ）患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）（ｉ）検査サンプル中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し、（ｉｉ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量を測定し；
（ｃ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量が対照中のＢｃｌ−ｘＬの量より多いか少ないかを判定し；
（ｄ）（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅及び（ｉｉ）Ｂｃｌ−ｘＬの量が対照中よりも検査サンプル中で多いことに基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があると分類する
ことを含む癌患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があると同定する方法に関する。
【００１９】
第６の態様で、本発明は、
（ａ）癌患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）サンプル中の腫瘍または癌細胞を同定し、またはサンプルから腫瘍または癌細胞を抽出し；
（ｃ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅の存在または不在に基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤で治療を続けるべきかを決定する
ことを含む抗−Ｂｃｌ−２ファミリー剤で治療されている患者をモニターする方法に関する。
【００２０】
第７の態様で、本発明は、
（ａ）患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）（ｉ）検査サンプル中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し、（ｉｉ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量を測定し；
（ｃ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量が対照中のＢｃｌ−ｘＬの量よりも多いか少ないかを判定し；
（ｄ）（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅及び（ｉｉ）Ｂｃｌ−ｘＬの量が対照中よりも検査サンプル中で多いことに基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤で治療続けるべきかを判定する
ことを含む抗−Ｂｃｌ−２ファミリー剤で治療されている患者をモニターする方法に関する。
【００２１】
測定ステップ（ｂ）（ｉｉ）をイムノアッセイにより実施する。
【００２２】
本発明のこれらの最初の７つの態様で、それぞれＢｃｌ−２ファミリー阻害剤はＡＢＴ−２６３であり得、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅はＢｃｌ−ｘＬタンパク質の発現の増加に相関している。判定ステップは、例えば検出可能に標識されている核酸プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含み得る。或いは、遺伝子増幅を判定するためにＢｃｌ−ｘＬ遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用いてＰＣＲを使用し得る。増幅はマイクロアレイアッセイを用いても判定され得る。幾つかの態様で、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子発現はｍＲＮＡまたはポリペプチドレベルを計測することにより調べられる。ポリペプチドレベルは、サンドイッチ型イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイを用いて、または自動イムノアッセイ計器を用いて計測され得る。患者は特にＳＬＣＬ及びリンパ腫患者であり得る。腫瘍細胞は循環腫瘍細胞であり得る。
【００２３】
第８の態様で、本発明は、
（ａ）増幅されたＢｃｌ−ｘＬ遺伝子を検出するための試薬及び
（ｂ）使用説明書
を含むキットに関する。
【００２４】
キット中の試薬は、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズする検出可能に標識されているポリヌクレオチド、けまたはＢｃｌ−ｘＬポリペプチドを結合する抗体であり得る。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、癌及び腫瘍細胞をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療に対する耐性についてモニターするための方法及び組成物を提供する。本発明者らは、予期せぬことに、すでにＢｃｌ−２ファミリー阻害剤により標的化されている遺伝子産物の１つをコードする領域の遺伝子増幅によりＢｃｌ−２ファミリー阻害剤耐性が生ずることを知見した。この知見は理論上または文献から完全に予期されなかった。
【００２６】
本発明者らは、ゲノムワイドスケールで遺伝子コピー数異常を検出するためのマイクロアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション技術を用いる増幅により、ＤＮＡコピー数の変化を伴う染色体異常の全ゲノム見解が得られることを知見した。この方法は、開示内容を参照により本明細書に組み入れる２００８年１０月３１日に出願された米国特許出願Ｎｏ．６１／１１０，２８１の“ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＡＳＳＥＭＢＬＩＮＧ ＰＡＮＥＬＳ ＯＦ ＣＡＮＣＥＲ ＣＥＬＬ ＬＩＮＥＳ ＦＯＲ ＵＳＥ ＩＮ ＴＥＳＴＩＮＧ ＴＨＥ ＥＦＦＩＣＡＣＹ ＯＦ ＯＮＥ ＯＲ ＭＯＲＥ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ”に詳しく開示されている。
【００２７】
本発明は、患者組織サンプル中のＢｃｌ−ｘＬ遺伝子増幅及び／または遺伝子発現増加を評価することを含む癌患者を同定、分類及びモニターするための診断アッセイを提供する。本発明のアッセイは、Ｂｃｌ−２ファミリーアンタゴニスト治療を受ける資格がある患者を同定するため及び前記治療に対する患者応答をモニターするためのアッセイ方法を含む。本発明は、例えばＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅の存在または不在を蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより判定することを含む。増幅されたＢｃｌ−ｘＬを有すると分類された患者は、抗−Ｂｃｌ−２ファミリー治療に応答しそうにないのでこの治療を受ける資格がない。加えて、この増幅を有する患者は他の癌治療に対して耐性であり得る。よって、癌及び腫瘍細胞中のＢｃｌ−ｘＬの増幅の存在を判定することが一般的な治療層化マーカーである。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から組織サンプルを用意し；
（ｂ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し；
（ｃ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるならば患者をＢｃｌ−２低分子阻害剤に対して耐性であると分類する
ことを含むＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性である癌を有する患者を同定または分類する方法に関する。
【００２９】
この実施形態において、遺伝子増幅は多色蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイにより判定され得、例えば肺癌腫瘍生検サンプルに対して実施される。他の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。
【００３０】
別の実施形態において、本発明は、
（ａ）癌患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）検査サンプル中の腫瘍または癌細胞を同定し、または検査サンプルから腫瘍または癌細胞を抽出し；
（ｃ）腫瘍または癌細胞中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し；
（ｄ）治療開始前または治療開始時に測定した増幅Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子を有する腫瘍または癌細胞の数を前記腫瘍または癌細胞の基準レベルと比較する
ことを含む抗−Ｂｃｌ−２ファミリー剤で治療されている患者をモニターする方法に関する。
【００３１】
ここでも、ＦＩＳＨ及びＰＣＲ方法がＢｃｌ−ｘＬ増幅を検出するために使用され得る。
【００３２】
更に、本発明は、
（ａ）患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）（ｉ）検査サンプル中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し、及び（ｉｉ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量を測定し；
（ｃ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量が対照中のＢｃｌ−ｘＬの量より多いか少ないかを判定し；
（ｄ）（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅及び（ｉｉ）Ｂｃｌ−ｘＬの量が対照中よりも検査サンプル中で多いことに基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性の癌を有すると分類する
ことを含むＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性の癌を有する患者を分類する方法を含む。
【００３３】
これらの同一方法がＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格がある患者を同定するために使用され得る。
【００３４】
本発明は、パッケージ、例えばＰＣＲプライマー、ＦＩＳＨプローブ等として使用されるように工学操作されたポリヌクレオチドを含むキットにも関する。
【００３５】
本発明は、癌治療、特にＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療についての患者の改善された層化を提供できる。これらのバイオマーカーを本発明で評価すると、個々の患者の治療に対する応答を追跡することもできる。
【００３６】
定義
「Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤」は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗの少なくとも１つに結合し、Ｂｃｌ−２ファミリー関連核酸またはタンパク質の活性を拮抗させる任意のタイプの治療用化合物を指し、この中には低分子−、抗体−、アンチセンス−、小型干渉ＲＮＡ、またはミクロＲＮＡベースの化合物が含まれる。本発明の方法は公知のまたは今後開発されるＢｃｌ−２ファミリー阻害剤で有用である。Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤の例は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗの各々に結合するＡＢＴ−７３７、すなわちＮ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミドである。別のＢｃｌ−２ファミリー阻害剤は、ＡＢＴ−２６３、すなわちＮ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミドである。ＡＢＴ−２６３の化学構造はＡＢＴ−７３７に関連しており、その化学構造を式（Ｉ）：
【００３７】
【化１】
に示す。
【００３８】
本発明のアッセイは、標的癌治療、例えば小細胞肺癌及びリンパ腫に対する標的治療と共に使用され得る。アッセイは、Ｂｃｌ−ｘＬの増幅が関与する癌のタイプに関連して実施され得る。癌の他の例には、前立腺癌、卵巣癌及び食道癌のような上皮癌が含まれる。本発明のアッセイは、任意のタイプの患者組織サンプルに対して、または末梢血、（新鮮冷凍及び固定パラフィン包埋組織を含めた）腫瘍または疑わしい腫瘍組織、血液サンプル、リンパ節組織、骨髄及び微小針吸引物中で分離または同定された循環上皮細胞のような細胞単離物に対して実施される。
【００３９】
Ｂｃｌ−２（ＢＣＬ２としても公知）はヒトＢ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２遺伝子を意味する。Ｂｃｌ−ｘｌ（ＢＣＬ２Ｌ１としても公知）はヒトＢＣＬ２様１遺伝子を意味する。Ｂｃｌ−ｗ（ＢＣＬ２Ｌ２としても公知）はヒトＢＣＬ２−ｌ様２遺伝子を意味する。
【００４０】
「特異的にハイブリダイズする」は、核酸が第２核酸に対して検出可能に且つ特異的に結合する能力を指す。ポリヌクレオチドは、非特異的核酸による検出可能な結合の認知し得る量の検出を最小限とするハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で標的核酸鎖と特異的にハイブリダイズする。
【００４１】
「標的配列」または「標的核酸配列」は、ポリヌクレオチドプライマーまたはプローブを用いて増幅及び／または検出される核酸配列を意味し、例えば遺伝子、或いはその補体または断片が含まれる。加えて、用語「標的配列」は時々二本鎖核酸配列を指すが、標的配列は一本鎖であってもよい。標的が二本鎖の場合、ポリヌクレオチドプライマー配列は好ましくは標的配列の両鎖を増幅させる。特定生物に対して多少特異的である標的配列が選択され得る。例えば、標的配列は全属、１つ以上の属、生物の種または亜種、血清群、生育型、血清型、系統、単離物または他の亜集団に対して特異的であり得る。
【００４２】
「検査サンプル」は、被験者または生体流体から採取したサンプルを意味し、該サンプルは標的配列を含み得る。検査サンプルは任意のソース、例えば組織、血液、唾液、痰、粘液、汗、尿、尿道スワブ、子宮頸部スワブ、尿生殖器または肛門スワブ、結膜スワブ、眼房水、脳脊髄液等から採取され得る。検査サンプルは、（ｉ）ソースから得たまま直接、または（ｉｉ）サンプルの特性を調節するための前処理後に使用され得る。よって、検査サンプルは、使用前に例えば血液から血漿または血清を作成する、細胞またはウイルス粒子を破壊する、固体材料から液体を調製する、粘性流体を希釈する、液体を濾過する、試薬を添加する、核酸を精製すること等により前処理され得る。
【００４３】
「被験者」には哺乳動物、鳥類または爬虫類が含まれる。被験者はウシ、ウマ、イヌ、ネコまたは霊長類であり得る。被験者がヒトであってもよい。被験者が生きていても、死んでいてもよい。
【００４４】
「ポリヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、或いはＲＮＡまたはＤＮＡミメティックス（例えば、ＰＮＡ）の核酸ポリマー、並びにその誘導体及びそのホモログである。よって、ポリヌクレオチドには天然に存在するヌクレオ塩基、糖及び共有ヌクレオシド間（骨格）結合から構成されるポリマー、及び同様に機能する非天然部分を有するポリマーが含まれる。前記した修飾または置換核酸ポリマーは当業界で公知であり、「アナログ」と称される。オリゴヌクレオチドは通常約１０〜最高約１６０または２００ヌクレオチドの短ポリヌクレオチドである。
【００４５】
「バリアントポリヌクレオチド」または「バリアント核酸配列」は、所与の核酸配列と少なくとも約６０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するポリヌクレオチドを意味する。バリアントは天然ヌクレオチド配列を含まない。
【００４６】
通常、バリアントポリヌクレオチドは少なくとも約８ヌクレオチド長、しばしば少なくとも約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ヌクレオチド長、更には約７５〜２００ヌクレオチド長またはそれ以上である。
【００４７】
核酸配列に対する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、最大パーセントの配列同一性を得るために配列をアラインさせ、必要ならばギャップを導入した後、当該配列中のヌクレオチドと同一の候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。核酸配列同一性％を判定するためのアラインメントは、例えば公に入手可能なコンピューターソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア）を用いて当業者の範囲内にある各種方法を用いてなされ得る。当業者は、比較しようとする配列の全長にわたり最大のアラインメントを得るために必要なアルゴリズムを含めたアラインメントを調べるための適切なパラメーターを決定することができる。
【００４８】
ヌクレオチド配列をアラインさせたら、所与の核酸配列Ｄに対してまたは核酸配列Ｄと所与の核酸配列Ｃの核酸配列同一性％（或いは、所与の核酸配列Ｄに対してまたは核酸配列Ｄとある％の核酸配列同一性を有するまたは含む所与の核酸配列Ｃとして表され得る）が次のように計算され得る：
核酸配列同一性％＝Ｗ／Ｚ＊１００
ここで、ＷはＣ及びＤの配列アラインメントプログラムまたはアルゴリズムアラインメントにより同一マッチとして採点されたヌクレオチドの数であり、ＺはＤ中のヌクレオチドの総数である。
【００４９】
核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さに等しくない場合、ＣのＤに対する核酸配列同一性％はＤのＣに対する核酸配列同一性％と等しくないであろう。
【００５０】
「％の配列同一性を有するポリヌクレオチドから本質的に構成される」は、ポリヌクレオチドはその長さに実質的な違いはないが、配列が実質的に異なることがあることを意味する。よって、１００ヌクレオチドを有する公知の配列“Ｂ”に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドから本質的に構成されるポリヌクレオチド“Ａ”は、ポリヌクレオチド“Ａ”が約１００ｎｔｓ長であるが、最高２０ｎｔｓが“Ｂ”配列と異なり得ることを意味する。問題のポリヌクレオチド配列は、例えば実質的に非同一の配列を付加して意図する第２構造を形成している場合のように特定タイプのプローブ、プライマー及び他の分子ツールを作成すべく１〜１５ヌクレオチドを付加するように末端が修飾されているためにより長かったり、またはより短かったりする。配列が「本質的にからなる」により修飾されているときには、前記非同一性ヌクレオチドは配列同一性の計算時に考慮されない。
【００５１】
一本鎖ＤＮＡが相補性断片をハイブリダイズする特異性は反応条件のストリンジェンシーにより決定される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ＤＮＡ二本鎖を形成する傾向が低下するにつれて高まる。核酸ハイブリダイゼーション反応において、ストリンジェンシーは特異的ハイブリダイゼーションを促進するように選択され得る（高ストリンジェンシー）。余り特異的でないハイブリダイゼーション（低ストリンジェンシー）は、関連するが、そのままではないＤＮＡ分子（相同ではあるが、同一ではない）またはセグメントを同定するために使用され得る。
【００５２】
ＤＮＡ二本鎖は、（１）相補性塩基対の数、（２）塩基対のタイプ、（３）反応混合物の塩濃度（イオン強度）、（４）反応の温度、及び（５）ＤＮＡ二本鎖安定性を低下させる特定の有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の存在により安定化される。一般的なアプローチは温度を変化させることである。よりストリンジェントな反応条件をもたらすより高い相対温度により（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７）、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーがうまく説明される。
【００５３】
「ストリンジェントな条件」下でのハイブリダイゼーションは、相互に少なくとも６０％相同でヌクレオチド配列がハイブリダイズされたままであることを意味する。
【００５４】
ポリヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的化するため）または細胞膜を超えた輸送を促進する物質のような付加基を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション誘発分割剤（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら，１９８８）またはインターカレート剤（Ｚｏｎ，１９８８）を用いて修飾され得る。オリゴヌクレオチドは別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発分割剤等にコンジュゲートされ得る。
【００５５】
有用なポリヌクレオチドアナログには、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間結合を有するポリマーが含まれる。修飾骨格には、骨格中にリン原子を保持している骨格、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート；及びリン原子を有していない骨格、例えば短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形成される骨格が含まれる。修飾核酸ポリマー（アナログ）は１つ以上の修飾糖部分を含み得る。
【００５６】
ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合の両方が新規な基で置換されているＲＮＡまたはＤＮＡミメティックであるアナログも有用である。これらのミメティックでは、塩基単位は標的配列とのハイブリダイゼーションのために維持されている。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが判明しているミメティックの例はペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｂｕｃｈａｒｄｔら，１９９２；Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９９１）である。
【００５７】
ヌクレオチドの範囲には、核酸分子が天然に存在するヌクレオチド以外の部分で置換、化学、酵素または他の適切な手段により共有的に修飾されている誘導体も含まれる。
【００５８】
ポリヌクレオチドは、核酸配列のアナログ及び／または誘導体を含めた標的配列に対して特異的にハイブリダイズするプライマー及びそのホモログを含む。
【００５９】
ポリヌクレオチドは、市販されている計器、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州フォスター・シティーに所在）、ＤｕＰｏｎｔ（米国デラウェア州ウィルミントンに所在）またはＭｉｌｌｉｇｅｎ（米国マサチューセッツ州ベッドフォードに所在）から入手可能な計器を用いる固相合成のような慣用技術により製造され得る。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体のような修飾ポリヌクレオチドも当業界で公知の類似方法により容易に製造され得る（Ｆｉｎｏ，１９９５；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，１９９５；Ｒｕｔｈ，１９９０）。
【００６０】
「遺伝子」は、コード配列の前の調節配列（５’非コード配列）及び後の調節配列（３’非コード配列）を含めた特定タンパク質を発現する核酸断片を指す。
【００６１】
「未変性遺伝子」は、それ自身の調節配列を有する天然に存在する遺伝子を指す。対照的に、「キメラ構築物」は、通常天然に一緒に存在しない核酸断片の組合せを指す。従って、キメラ構築物は、異なるソースから誘導される調節配列及びコード配列を含み得、或いは同一ソースから誘導されるが、通常天然に存在するとは異なる方法で配列されている調節配列及びコード配列を含み得る。（用語「単離された」は、配列が天然環境から除去されることを意味する）。
【００６２】
本明細書中で使用されている「プローブ」または「プライマー」は、少なくとも８ヌクレオチド長であり、プローブまたはプライマー中の少なくとも１つの配列が標的領域中の配列と相補性であるために標的配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドである。プローブのポリヌクレオチド領域はＤＮＡ及び／またはＲＮＡ及び／または合成ヌクレオチドアナログから構成され得る。好ましくは、プローブはポリメラーゼ連鎖反応中に標的配列をプライムするために使用される配列に対して相補的である配列を含まない。
【００６３】
「発現」は、機能最終産物の産生を指す。遺伝子の発現は、遺伝子の転写及びｍＲＮＡの前駆体または成熟タンパク質への翻訳を含む。「アンセチンス抑制」は、標的タンパク質の発現を阻止し得るアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「共抑制」は、同一または実質的に類似の外来または内因性遺伝子の発現を阻止し得るセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（米国特許Ｎｏ．５，２３１，０２０）。
【００６４】
「組換え体」は、例えば化学合成による、または核酸の単離セグメントを遺伝子工学技術により操作することによる配列の２つの他の方法で分離されているセグメントの人工的組合せを指す。
【００６５】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、一連の反復サイクル（コネチカット州ノーウォークに所在のＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）からなる大量の特定ＤＮＡセグメントを合成するための技術である。典型的には、二本鎖ＤＮＡを熱変性し、標的セグメントの３’境界に相補的な２つのプライマーを低温でアニールした後、中間温度で伸長させる。これら３つの連続したステップの１組をサイクルと呼ぶ。
【００６６】
ＰＣＲは、テンプレートを反復複製することによりＤＮＡを短時間で数百万倍に増幅させるために使用される強力な技術である（（Ｍｕｌｌｉｓら，１９８６）；Ｅｒｌｉｃｈら，欧州特許出願Ｎｏ．５０，４２４；欧州特許出願Ｎｏ．８４，７９６；欧州特許出願Ｎｏ．２５８，０１７、欧州特許出願Ｎｏ．２３７，３６２；欧州特許出願Ｎｏ．２０１，１８４、米国特許Ｎｏ．４，６８３，２０２；米国特許Ｎｏ．４，５８２，７８８；及び米国特許Ｎｏ．４，６８３，１９４）。この方法は、ＤＮＡ合成をプライムするために特定のインビトロ合成したオリゴヌクレオチドの組を使用している。プライマーの設計は分析しようとするＤＮＡの配列に依存する。この技術は、テンプレートを高温で融解し、プライマーをテンプレート内の相補性配列にアニールした後、テンプレートをＤＮＡポリメラーゼを用いて複製するサイクルを複数回（通常２０〜５０回）実施する。
【００６７】
ＰＣＲ反応産物は、アガロースゲルを用いて分離した後、臭化エチジアム染色し、次いでＵＶ透照で視覚化することにより分析され得る。或いは、生成物に標識を取り込むために放射活性ｄＮＴＰをＰＣＲを添加してもよい。この場合、ゲルをｘ線フィルムに曝すことによりＰＣＲの産物を可視化する。ＰＣＲ産物を放射標識する追加の利点は個々の増幅産物のレベルを定量化できることである。
【００６８】
発明の実施
ポリヌクレオチドアッセイ
本発明において有用な核酸アッセイ方法は、（ｉ）無傷の組織または細胞サンプルに対してｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、（ｉｉ）組織サンプルから抽出した染色体ＤＮＡに対してマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ、及び（ｉｉｉ）組織サンプルから抽出した染色体ＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の増幅アッセイを施すことにより増幅ＤＮＡ領域を検出することを含む。これらのフォーマットのいずれにおいても核酸の合成アナログ（例えば、ペプチド核酸）を用いるアッセイを使用し得る。
【００６９】
本発明のアッセイは、治療応答を予測するために及びＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療に対する患者応答をモニターするためにＢｃｌ−ｘＬコピー数バイオマーカーを増加させる増幅Ｂｃｌ−ｘＬ領域を同定すべく使用される。応答予測のためのアッセイは治療開始前に実施され得、Ｂｃｌ−ｘＬ領域の増幅を示す患者はＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格がある。コピー数増加は他の癌治療（例えば、化学療法または放射線治療）に対する耐性の兆候となり得る。患者応答をモニターするためには、組織サンプル中のバイオマーカーの基準レベル（例えば、サンプル中でコピー数増加を示す全細胞の％または細胞の数）を定めるためにアッセイを治療開始時に実施する。次いで、同一組織をサンプリングし、アッセイし、バイオマーカーのレベルを基準と比較する。レベルが同一のままか低下したならば、治療は多分有効であり、継続することができる。基準レベルよりも有意な上昇が生じたならば、患者は応答しないことがあり得る。
【００７０】
本発明は、特定の設計された染色体標的にハイブリダイズするように設計／選択した検出可能に標識されている核酸プローブ（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プローブまたはタンパク質核酸（ＰＮＡ）プローブ）または非標識プライマーを用いるハイブリダイゼーションアッセイを用いることによるゲノムバイオマーカーの検出を含む。非標識プライマーを例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅アッセイにおいて使用し、このＰＣＲではプライマー結合後ポリメラーゼはその後の検出のために標的核酸配列を増幅させる。ＰＣＲまたは他の増幅アッセイにおいて使用される検出プローブは好ましくは蛍光であり、より好ましくは「リアルタイムＰＣＲ」において有用な検出プローブである。蛍光標識もｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて使用するのに好ましいが、ハイブリダイゼーション技術において通常使用されている他の検出可能な標識（例えば、酵素、色素原性及び同位体標識）も使用され得る。有用なプローブ標識技術は文献（Ｆａｎ，２００２）（参照により本明細書に組み入れる）に記載されている。ゲノムバイオマーカーのマイクロアレイ分析による検出において、これらのプローブ標識技術が患者サンプル由来の染色体ＤＮＡ抽出物を標識するために適用され、その後マイクロアレイにハイブリダイズされる。
【００７１】
ヒトＢｃｌ−ｘＬのポリヌクレオチド配列（配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ １３８５７８）を表１に示す。
【００７２】
【表１】
【００７３】
好ましくは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、Ｂｃｌ−２遺伝子座及びプローブＡ ６７ Ｐ０４７４２６１７及びＡ ５３ Ｐ１７４４５６（Ａｇｉｌｅｎｔ（カリフォルニア州サンタクララに所在）から入手可能；マウスＣＧＨマイクロアレイ２４４Ａ，カタログ番号Ｇ４４１５Ａ）により規定される遺伝子座での染色体コピー数増加または遺伝子増幅の存在を検出するために使用される。プローブは配列番号１の配列を用いて当業者により作成され得る。
【００７４】
本発明のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法において使用するためのプローブは２つの広い群；染色体計数プローブ、すなわち染色体領域、通常反復配列領域にハイブリダイズし、全染色体の存在または不在を示すプローブ；及び遺伝子座特異的プローブ、すなわち染色体上の特定遺伝子座にハイブリダイズし、特定遺伝子座の存在または不在を検出するプローブに入る。染色体腕プローブ、すなわち染色体領域にハイブリダイズし、特定染色体の腕の存在または不在を示すプローブも使用され得る。Ｂｃｌ−ｘＬのような問題の遺伝子座でのユニークな染色体ＤＮＡ配列の変化を検出し得る遺伝子座特異的プローブを使用することが好ましい。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためにユニークな配列プローブを使用する方法は参照により本明細書に組み入れる米国特許５，４４７，８４１に記載されている。
【００７５】
染色体計数プローブは動原体近くに位置するかまたは動原体から除去した反復配列にハイブリダイズし得、或いは染色体上の任意の位置にあるユニーク配列にハイブリダイズし得る。例えば、染色体計数プローブは染色体の動原体に関係する反復ＤＮＡとハイブリダイズし得る。霊長類染色体の動原体は、α−サテライトと称される約１７１塩基対のモノマー反復長からなるＤＮＡの長タンデム反復の複合体ファミリーを含む。染色体１４及び１８の各々に対する動原体蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブはＡｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（イリノイ州デス・プレーンズに所在）から市販されている。
【００７６】
特に有用なｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブは、参照により本明細書に組み入れる米国特許５，４９１，２２４に記載されているような直接標識されている蛍光プローブである。米国特許５，４９１，２２４は、２つ以上の蛍光標識されているプローブを用いる同時ＦＩＳＨアッセイも記載している。
【００７７】
有用な遺伝子座特異的プローブは任意の方法で作成され得、通常約１０，０００〜約１，０００，０００塩基長を有する染色体ＤＮＡ標的配列にハイブリダイズする配列を含んでいる。好ましくは、プローブは少なくとも１００，０００〜約５００，０００塩基長を有する標的遺伝子座で染色体ＤＮの標的ストレッチにハイブリダイズし、プローブの非特異的結合を避けるために参照により本明細書に組み入れる米国特許５，７５６，６９６に開示されているようにプローブミックス中に非標識遮断核酸をも含む。遮断核酸として非標識の合成オリゴマー核酸またはペプチド核酸を使用することもできる。特定遺伝子座を標的とするために、プローブが遺伝子に架かっており、よって遺伝子の全ゲノムコーディング座の両側にハイブリダイズする核酸配列を含むことが好ましい。プローブは細菌人工染色体（ＢＡＣ）等のようなヒトＤＮＡ含有クローンから出発して作成され得る。ヒトゲノムのＢＡＣライブラリーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールズバッドに所在）から入手可能であり、有用なクローンを同定するために調べられ得る。標的遺伝子座中のＤＮＡ配列を同定するためにカリフォルニア大学サンタクルーズ校のゲノムブラウザを使用することが好ましい。次いで、これらのＤＮＡ配列を使用して、有用なクローンを同定すべくＢＡＣライブラリーをスクリーニングするために使用するためのＰＣＲプライマーを合成することができる。次いで、クローンを慣用のニック翻訳方法により標識し、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブとして試験し得る。
【００７８】
本明細書中に記載されているｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法で使用され得る蛍光基の例は、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標）（オレゴン州ユージンに所在のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）；５−（及び−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、５−（及び−６）−カルボキシフルオレセイン；フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチル−ローダミン−５−（及び−６）−イソチオシアネート；５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン；７−ヒドロキシ−クマリン−３−カルボン酸；６−［フルオレセイン５−（及び−６）−カルボキサミド］ヘキサン酸；Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−３−インダセンプロピオン酸；エオシン−５−イソチオシアネート；エリスロシン−５−イソチオシアネート；５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ；及びＣａｓｃａｄｅ（商標）ブルーアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎブランド）である。
【００７９】
プローブは蛍光顕微鏡及び蛍光基毎に適切なフィルターを用いて、または複数の蛍光基を観察するためのデュアルまたはトリプルバンド通過フィルター組を用いることにより見ることができる。例えば、参照により本明細書に組み入れるＢｉｔｔｎｅｒらの米国特許Ｎｏ．５，７７６，６８８を参照されたい。ハイブリダイズしたプローブを視覚化するために自動デジタルイメージグシステムを含めた適当な顕微鏡イメージング方法を使用し得る。或いは、染色体プローブのハイブリダイゼーションパターンを調べるためにフローサイトメトリーのような技術を使用し得る。
【００８０】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより生ずるセルバイセル遺伝子増幅分析が好ましいが、ゲノムバイオマーカーも定量ＰＣＲにより検出され得る。この実施形態では、染色体ＤＮＡを組織サンプルから抽出した後、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−ｗの少なくとも１つに対して特異的なプライマーの対を用いるＰＣＲにより、またはプライマーの複数の対を用いるマルチプレックスＰＣＲにより増幅させる。バイオマーカーのために任意のプライマー配列を使用し得る。次いで、参照増幅標準と比較することにより組織のコピー数を測定する。
【００８１】
マイクロアレイコピー数分析も使用し得る。この実施形態では、基質表面１ｃｍ２あたり数百万以下のプローブのプローブ密度で配置した複数の固定化非標識核酸プローブを有する基質を含むマイクロアレイにハイブリダイズするために抽出後の染色体ＤＮＡを標識する。複数のマイクロアレイフォーマットが存在し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州パロアルトに所在）及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（カリフォルニア州にサンタクララに所在）から入手し得るようなＢＡＣ及びオリゴヌクレチドをベースとするマイクロアレイを含めたこれらのいずれかを使用し得る。増幅を検出するためにオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用するときには、標的領域中の３つ以上の別の位置に対するプローブ配列を有するマイクロアレイを使用することが好ましい。
【００８２】
発現の検出：ｍＲＮＡ
Ｂｃｌ−ｘＬの遺伝子発現レベルは、検査サンプル中の１つ以上のｍＲＮＡの量を評価することにより調べられ得る。サンプル中のｍＲＮＡの計測方法は当業者で公知である。ｍＲＮＡレベルを計測するためには、検査サンプル中の細胞を溶解し、ライゼート中、或いはライゼートから精製または半精製したＲＮＡ中のｍＲＮＡのレベルは当業者に周知の各種方法により測定し得る。これらの方法には、検出可能に標識されているＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイ（すなわち、ノーザンブロッティング）、または適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いる定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲ方法が含まれる。或いは、定量または半定量ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイは、例えば組織切片または未溶解細胞懸濁液及び検出可能に標識されている（例えば、蛍光または酵素標識されている）ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて実施し得る。ｍＲＮＡを定量するための別の方法には、ＲＮＡプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、発現差解析（ＲＤＡ）、ディファレンシャルディスプレイ、ＥＳＴ配列分析及び遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）が含まれる。
【００８３】
適当な実施形態では、ＰＣＲ増幅が検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬ遺伝子を検出するために使用される。簡単に説明すると、ＰＣＲでは、マーカー配列（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子）の相手相補鎖上の領域に対して相補性の２つのプライマー配列を作成する。反応混合物に過剰のデオキシヌクレオチドトリホスフェートをＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）と一緒に添加する。標的配列がサンプル中に存在するならば、プライマーは配列に結合し、ポリメラーゼはヌクレオチドに付加することによりプライマーをマーカー配列に沿って伸長させるであろう。反応混合物の温度を上下させることにより、伸長したプライマーはマーカーから解離して反応産物を形成し、過剰のプライマーはマーカー及び反応産物に結合し、このプロセスを繰り返すと増幅産物が生ずる。増幅したｍＲＮＡの量を定量するためには逆転写酵素ＰＣＲ増幅手順を実施し得る。
【００８４】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の適当な断片を増幅し、検出し得る。ＰＣＲのために有効なプライマーを設計することは当業者の範囲内である。典型的には、検出のための増幅断片は約５０〜３００ヌクレオチド長である。
【００８５】
増幅産物は幾つかの方法で検出され得る。増幅産物は、サンプルをゲル中で電気泳動にかけた後、ＤＮＡ結合染料（例えば、臭化エチジウム）で染色することにより視覚化され得る。或いは、増幅産物を放射性または蛍光ヌクレオチドで完全に標識した後、ｘ線フィルムを用いてまたは適当な刺激スペクトル下で視覚化することができる。
【００８６】
増幅は「リアルタイム」方法を用いてもモニターされ得る。リアルタイムＰＣＲにより、核酸標的を検出し、定量することができる。典型的には、定量ＰＣＲに対するこのアプローチは、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ（登録商標）Ｉのような二本鎖特異的染料であり得る蛍光染料を使用する。或いは、他の蛍光染料（例えば、ＦＡＭまたはＨＥＸ）をオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーにコンジュゲートし得る。リアルタイムＰＣＲを実施し得る各種計器が当業界で公知であり、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）システム（Ｒｏｃｈｅ）が含まれる。ＰＣＲの各サイクルで発生する蛍光シグナルはＰＣＲ産物の量に比例している。蛍光対サイクル数のプロットを使用すると増幅のカイネティックスが説明され、蛍光閾値レベルを使用すると最初のテンプレート濃度に対する分割サイクル数が規定される。増幅を実施し、熱サイクリング中蛍光を測定することができる計器を用いて検出するとき、非特異的ＰＣＲ産物由来の意図するＰＣＲ産物を融解分析を用いて区別し得る。増幅及びシグナル発生後の反応の温度を徐々に上昇させながら蛍光の変化を計測することにより、意図する産物及び非特異的産物のＴｍを測定することができる。
【００８７】
この方法は、「マルチプレックス検出」または「マルチプレクシング」としても公知であり、サンプル中の複数の核酸を増幅させることを含む。「マルチプレックスＰＣ」は、１つ以上の標的遺伝子マーカー由来の核酸を含めた複数の核酸を検出し、定量するために反応物に２組以上のＰＣＲプライマーを添加することを含むＰＣＲを指す。更に、内部対照（例えば、１８Ｓ ｒＲＮＡ、ＧＡＤＰＨまたはＯ−アクチン）とマルチプレクシングすると、反応なしにＰＣＲのための対照が得られる。
【００８８】
発現の研修：ポリペプチド
本発明の方法及びアッセイは、ポリペプチド発現の評価、例えばＢｃｌ−ｘＬポリペプチド発現のモニターにも関する。ポリペプチドの発現の量は定性的または定量的に評価し得る。他の実施形態では、ポリペプチドの発現の量を非腫瘍または癌細胞と腫瘍または癌細胞間で比較する。このために当業界で公知の方法が使用され得るが、Ｂｃｌ−ｘＬポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を使用するイムノアッセイが特に好都合である。市販されている抗−Ｂｃｌ−ｘＬ抗体の例を表３に示す。
【００８９】
【表２】
【００９０】
イムノアッセイには２つの基本的タイプ、すなわち競合的または非競合的（例えば、それぞれイムノメトリック型及びサンドイッチ型）がある。いずれのアッセイでも、抗体または抗原試薬を固相に共役的または非共役的に結合させる。共役結合のための連結剤は公知であり、固相の一部であり得、またはコーティングする前に誘導体化され得る。イムノアッセイで使用される固相の例は多孔質または非孔質材料、ラテックス粒子、磁気粒子、ミクロ粒子、ストリップ、ビーズ、膜、マイクロタイターウェル及びプラスチック管である。固相材料及び抗原または抗体試薬を検出可能に標識させる方法の選択は所望のアッセイフォーマット性能特性に基づいて決定される。幾つかのイムノアッセイの場合には、検出可能な標識を必要としない。例えば、抗原が赤血球のような検出可能な粒子上にあるならば、反応性は凝集に基づいて確立され得る。或いは、抗原−抗体反応により目に見える変化（例えば、放射状免疫拡散）が生じ得る。多くの場合、イムノアッセイで使用される抗体または抗原試薬の１つをシグナル発生化合物（検出可能な標識）に結合させる。このシグナル発生化合物または標識はそれ自体検出可能であり、または検出可能な産物を生成させるべく１つ以上の追加化合物と反応させてもよい（米国特許Ｎｏ．６，３９５，４７２ Ｂｌも参照されたい）。前記シグナル発生化合物の例には、色素源、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１１、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ及び１４Ｃ）、蛍光化合物（例えば、フルオレセイン、ローダミン）、化学ルミネセント化合物、粒子（可視または蛍光）、核酸、錯化剤または触媒、例えば酵素（例：アルカリホスファターゼ、アシッドホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びリボヌクレアーゼ）が含まれる。酵素を使用する場合、色素原性、蛍光原性または発光原性基質を添加すると、検出可能なシグナルが発生する。他の検出システム、例えば時間分割蛍光法、内部反射、蛍光、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）及びラマン分光法も有用である。
【００９１】
２つの一般的フォーマットがヒト中の特定の抗体タイター及びタイプをモニターするために通常使用されている：（１）抗原を上記したような固相に提示し、特定の抗体を含有するヒト生体流体を抗原と反応させた後、抗原に結合した抗体をシグナル発生化合物にカップリングさせた抗ヒト抗体を用いて検出する；及び（２）抗ヒト抗体を固相に結合させ、特定の抗体を含有するヒト生体流体を結合抗体と反応させた後、シグナル発生化合物に結合させた抗原を添加して、流体サンプル中に存在する特定の抗体を検出する。いずれのフォーマットでも、抗ヒト抗体試薬は、アッセイの所期目的に応じて、すべての抗体クラスを認識し得、或いは抗体の特定クラスまたはサブクラスに対して特異的であり得る。これらのアッセイフォーマット及び他の公知のフォーマットは本発明の範囲内にあると意図され、当業者に公知である。
【００９２】
本明細書に例示されているフォーマット及び本発明のアッセイまたはキットは、例えば米国特許Ｎｏｓ．５，０８９，４２４及び５，００６，３０９に記載されているような、またＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（イリノイ州アボット・パークに所在）から市販されているような（ミクロ粒子からなる固相が存在しているシステムを含めた）自動及び半自動システム並びに他のプラットフォームにおいて使用するために改造または最適化され得る。市販品にはＡｂｂｏｔｔ’ｓ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ、ＩＭＸ、ＰＲＩＳＭ及びＱｕａｎｔｕｍ ＩＩプラットフォームが含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
本発明のアッセイ及びキットは、Ａｂｂｏｔｔ’ｓ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（商標））電気化学イムノアッセイシステムを含めたポイント・オブ・ケア・アッセイシステムのために改造または最適化され得る。イムノセンサー及びそれを製造し、単使用テストデバイスにおいて操作する方法は、例えば米国特許Ｎｏ．５，０６３，０８１、並びに公開された米国特許出願Ｎｏｓ．２００３０１７０８８１、２００４００１８５７７、２００５００５４０７８及び２００６０１６０１６４（当該部分に関して教示するために参照により本明細書に組み入れる）に記載されている。
【００９４】
サンプル処理及びアッセイ性能
本発明方法によりアッセイしようとする組織サンプルは、末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル；或いは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプルまたはパラフィン包埋組織サンプルから作成される抽出物または処理サンプルを含めた任意のタイプからなり得る。例えば、まず患者末梢血サンプルを処理して上皮細胞集団を抽出した後、この抽出物をアッセイし得る。疑わしい腫瘍細胞を多く含む細胞サンプルを得るために組織サンプルの顕微解剖を使用することもできる。本発明で使用するための好ましい末梢組織サンプルは末梢血、微小針吸引物サンプル、新鮮凍結組織サンプル及びパラフィン包埋組織サンプルを含めた腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、及び骨髄である。
【００９５】
組織サンプルは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは他の核酸アッセイを実施するための望ましい方法により処理され得る。好ましいｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイの場合、パラフィン包埋した腫瘍組織サンプルまたは骨髄サンプルをガラス顕微鏡スライド上に固定し、溶媒（典型的には、キシレン）を用いて脱パラフィン化する。組織脱パラフィン化及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために有用なプロトコルはＡｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｃ．（イリノイ州デス・プレーンズに所在）から入手可能である。適当な計器による計測または自動化が本発明のアッセイの実施において使用され得る。ＰＣＲに基づくアッセイはｍ２０００計器システム（イリノイ州デス・プレーンズに所在のＡｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を用いて実施され得る。自動イメージングが好ましい蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイのために使用され得る。
【００９６】
１つの実施形態において、サンプルは、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子座で増幅を有する循環腫瘍または癌細胞の抽出物を産生するように処理された患者由来の末梢血サンプルからなる。循環腫瘍細胞はＩｍｍｕｎｉｃｏｎ（ペンシルバニア州ハンティンドン・バレーに所在）から入手し得るような免疫磁気分離技術により分離し得る。次いで、少なくとも１コピー数増加を示す循環腫瘍細胞の数を、好ましくは治療開始時に測定して高いコピー数を有する循環腫瘍細胞の基準レベルと比較する。循環腫瘍細胞の数の増加は治療失敗の兆候となり得る。
【００９７】
検査サンプルは、臨床診断のために十分な数の細胞を含み得、典型的には少なくとも約１００個の細胞を含んでいる。典型的なＦＩＳＨアッセイでは、ハイブリダイゼーションパターンを約２５〜１，０００個の細胞で評価する。検査サンプルは、典型的にはサンプルの大部分に遺伝子増幅を含むことが判明したときには「検査陽性」と見なされる。染色体コピー数で同定され、具体的なサンプルを陽性と分類するために使用される細胞の数は、通常サンプル中の細胞数により異なる。陽性分類のために使用される細胞の数はカットオフ値としても公知である。決定の際に使用され得るカットオフ値の例には約５、２５、５０、１００及び２５０個の細胞、或いは同一サンプル集団中の細胞の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％及び６０％が含まれる。サンプルを陽性と分類するには１個くらいの少ない細胞で十分であり得る。典型的なパラフィン包埋組織サンプルの場合、少なくとも３０個の細胞を陽性と同定することが好ましく、少なくとも２０個の細胞を染色体コピー数増加を有する点で陽性であると同定することがより好ましい。例えば、典型的なパラフィン包埋した小細胞肺癌組織中でＢｃｌ−ｘＬ増幅を有する細胞が３０個検出されれば、組織を陽性であり、治療を受ける資格があると分類するのに十分であろう。
【００９８】
アッセイキット
別の態様で、本発明は、Ｂｃｌ−ｘＬに対する結合に対して特異的な少なくとも１つのプローブを収容している容器を含むゲノムバイオマーカーを検出するためのキットを含む。これらのキットは、アッセイのための他の関連試薬を収容している容器をも含む。本発明の好ましいキットは、それぞれＢｃｌ−ｘＬに対して特異的に結合し得る少なくとも１つのＦＩＳＨプローブを収容している容器を含む。本発明のキットは核酸プローブアナログ、例えばペプチド核酸プローブを含み得る。最後に、キットは更に使用説明書を含み得る。
【００９９】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）患者から組織サンプルを用意し；
（ｂ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し；
（ｃ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるならば患者をＢｃｌ−２低分子阻害剤に対して耐性であると分類する
ことを含むＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性である癌を有する患者を分類する方法。
【請求項２】
（ａ）患者から組織サンプルを用意し；
（ｂ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の発現が増幅されるかを判定し；
（ｃ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されないならば患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤を受ける資格があると分類する
ことを含む癌患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があると同定する方法。
【請求項３】
Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤がＡＢＴ−２６３である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅はＢｃｌ−ｘＬポリペプチドの発現の増加と相関している請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
組織サンプルは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル；或いは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプルまたはパラフィン包埋組織サンプルから作成される抽出物または処理サンプルからなる請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
判定ステップはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを検出可能に標識されている核酸プローブを用いて実施する請求項８に記載の方法。
【請求項８】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションをＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の少なくとも一部に対して特異的にハイブリダイズする核酸プローブまたはペプチド核酸プローブを用いて実施する請求項８に記載の方法。
【請求項９】
判定はポリメラーゼ連鎖反応を含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
ポリメラーゼ連鎖反応をＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の核酸配列の少なくとも一部に対して特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを用いて実施する請求項１１に記載の方法。
【請求項１１】
判定ステップは核酸マイクロアレイアッセイを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
組織サンプルは小細胞肺癌及びリンパ腫からなる群から選択される癌を有する患者に由来する請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
患者をＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−ｘＬの１つに結合するように設計されたアンチセンス剤を受ける資格があると分類する請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）癌患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）検査サンプル中の腫瘍または癌細胞を同定し、または検査サンプルから腫瘍または癌細胞を抽出し；
（ｃ）腫瘍または癌細胞中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し；
（ｄ）治療開始前または治療開始時に測定した増幅Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子を有する腫瘍または癌細胞の数を前記腫瘍または癌細胞の基準レベルと比較する
ことを含む抗−Ｂｃｌ−２ファミリー剤で治療されている患者をモニターする方法。
【請求項１５】
癌は小細胞肺癌及びリンパ腫からなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
患者はＡＢＴ−２６３で治療されている請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅はＢｃｌ−ｘＬポリペプチドの発現の増加と相関している請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
患者はＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−ｘの少なくとも１つに結合するように設計されたアンチセンス剤で治療されている請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
判定ステップはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを検出可能に標識されている核酸プローブを用いて実施する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍細胞は循環腫瘍細胞である請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）（ｉ）検査サンプル中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し、及び（ｉｉ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量を測定し；
（ｃ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量が対照中のＢｃｌ−ｘＬの量より多いか少ないかを判定し；
（ｄ）（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅及び（ｉｉ）Ｂｃｌ−ｘＬの量が対照中よりも検査サンプル中で多いことに基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性の癌を有すると分類する
ことを含むＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性の癌を有する患者を分類する方法。
【請求項２３】
（ａ）患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）（ｉ）検査サンプル中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し、（ｉｉ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量を測定し；
（ｃ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量が対照中のＢｃｌ−ｘＬの量より多いか少ないかを判定し；
（ｄ）（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅及び（ｉｉ）Ｂｃｌ−ｘＬの量が対照中よりも検査サンプル中で多いことに基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があると分類する
ことを含む癌患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があると同定する方法。
【請求項２４】
Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤がＡＢＴ−２６３である請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
組織サンプルは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル；或いは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプルまたはパラフィン包埋組織サンプルから作成される抽出物または処理サンプルからなる請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅の判定はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２７】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを検出可能に標識されている核酸プローブを用いて実施する請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションをＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の少なくとも一部に対して特異的にハイブリダイズする核酸プローブまたはペプチド核酸プローブを用いて実施する請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅の判定はポリメラーゼ連鎖反応を含む請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項３０】
ポリメラーゼ連鎖反応をＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の核酸配列の少なくとも一部に対して特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを用いて実施する請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
判定ステップは核酸マイクロアレイアッセイを含む請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項３２】
組織サンプルは小細胞肺癌及びリンパ腫からなる群から選択される癌を有する患者に由来する請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項３３】
患者をＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−ｘＬの１つに結合するように設計されたアンチセンス剤を受ける資格があると分類する請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
測定ステップ（ｂ）（ｉｉ）をイムノアッセイにより実施する請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項３５】
イムノアッセイはサンドイッチ型イムノアッセイである請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
イムノアッセイはＥＬＩＳＡである請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
測定ステップ（ｂ）（ｉｉ）を自動イムノアッセイ計器を用いて実施する請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
測定ステップ（ｂ）（ｉｉ）をＢｃｌ−ｘＬ ｍＲＮＡを計測することにより実施する請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項３９】
（ａ）癌患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）サンプル中の腫瘍または癌細胞を同定し、またはサンプルから腫瘍または癌細胞を抽出し；
（ｃ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅の存在または不在に基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤で治療を続けるべきかを決定する
ことを含む抗−Ｂｃｌ−２ファミリー剤で治療されている患者をモニターする方法。
【請求項４０】
癌は小細胞肺癌及びリンパ腫からなる群から選択される請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
患者がＡＢＴ−２６３で治療されている請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅はＢｃｌ−ｘＬポリペプチドの発現の増加と相関している請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
患者はＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−ｘＬの少なくとも１つに結合するように設計されたアンチセンス剤で治療されている請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
判定ステップはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを検出可能に標識されている核酸プローブを用いて実施する請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを少なくとも２つの核酸プローブを用いて実施する請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
核酸プローブの１つはＢｃｌ−ｘＬ遺伝子にハイブリダイズするように設計されている請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
腫瘍細胞は循環腫瘍細胞である請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
（ａ）患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）（ｉ）検査サンプル中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し、（ｉｉ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量を測定し；
（ｃ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量が対照中のＢｃｌ−ｘＬの量よりも多いか少ないかを判定し；
（ｄ）（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅及び（ｉｉ）Ｂｃｌ−ｘＬの量が対照中よりも検査サンプル中で多いことに基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤で治療を続けるべきかを決定する
ことを含む抗−Ｂｃｌ−２ファミリー剤で治療されている患者をモニターする方法。
【請求項５０】
Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤はＡＢＴ−２６３である請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
組織サンプルは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル；或いは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプルまたはパラフィン包埋組織サンプルから作成される抽出物または処理サンプルからなる請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅の判定はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを検出可能に標識されている核酸プローブを用いて実施する請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションをＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の少なくとも一部に対して特異的にハイブリダイズする核酸プローブまたはペプチド核酸プローブを用いて実施する請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅の判定はポリメラーゼ連鎖反応を含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
ポリメラーゼ連鎖反応をＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の核酸配列の少なくとも一部に対して特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを用いて実施する請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
判定ステップは核酸マイクロアレイアッセイを含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
組織サンプルは小細胞肺癌及びリンパ腫からなる群から選択される癌を有する患者に由来する請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
患者をＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−ｘＬの１つに結合するように設計されたアンチセンス剤を受ける資格があると分類する請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
測定ステップ（ｂ）（ｉｉ）をイムノアッセイにより実施する請求項４９に記載の方法。
【請求項６１】
イムノアッセイはサンドイッチ型イムノアッセイである請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
イムノアッセイはＥＬＩＳＡである請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
測定ステップ（ｂ）（ｉｉ）を自動イムノアッセイ計器を用いて実施する請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
測定ステップ（ｂ）（ｉｉ）をＢｃｌ−ｘＬ ｍＲＮＡを計測することにより実施する請求項４９に記載の方法。
【請求項６５】
（ａ）増幅されたＢｃｌ−ｘＬ遺伝子を検出するための試薬及び（ｂ）使用説明書を含む
キット。
【請求項６６】
増幅されたＢｃｌ−ｘＬ遺伝子を検出するための試薬はＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズする検出可能に標識されているポリヌクレオチドを含む請求項６５に記載のキット。
【請求項１】
（ａ）患者から組織サンプルを用意し；
（ｂ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し；
（ｃ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるならば患者をＢｃｌ−２低分子阻害剤に対して耐性であると分類する
ことを含むＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性である癌を有する患者を分類する方法。
【請求項２】
（ａ）患者から組織サンプルを用意し；
（ｂ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の発現が増幅されるかを判定し；
（ｃ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されないならば患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤を受ける資格があると分類する
ことを含む癌患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があると同定する方法。
【請求項３】
Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤がＡＢＴ−２６３である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅はＢｃｌ−ｘＬポリペプチドの発現の増加と相関している請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
組織サンプルは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル；或いは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプルまたはパラフィン包埋組織サンプルから作成される抽出物または処理サンプルからなる請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
判定ステップはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを検出可能に標識されている核酸プローブを用いて実施する請求項８に記載の方法。
【請求項８】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションをＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の少なくとも一部に対して特異的にハイブリダイズする核酸プローブまたはペプチド核酸プローブを用いて実施する請求項８に記載の方法。
【請求項９】
判定はポリメラーゼ連鎖反応を含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
ポリメラーゼ連鎖反応をＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の核酸配列の少なくとも一部に対して特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを用いて実施する請求項１１に記載の方法。
【請求項１１】
判定ステップは核酸マイクロアレイアッセイを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
組織サンプルは小細胞肺癌及びリンパ腫からなる群から選択される癌を有する患者に由来する請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
患者をＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−ｘＬの１つに結合するように設計されたアンチセンス剤を受ける資格があると分類する請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）癌患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）検査サンプル中の腫瘍または癌細胞を同定し、または検査サンプルから腫瘍または癌細胞を抽出し；
（ｃ）腫瘍または癌細胞中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し；
（ｄ）治療開始前または治療開始時に測定した増幅Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子を有する腫瘍または癌細胞の数を前記腫瘍または癌細胞の基準レベルと比較する
ことを含む抗−Ｂｃｌ−２ファミリー剤で治療されている患者をモニターする方法。
【請求項１５】
癌は小細胞肺癌及びリンパ腫からなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
患者はＡＢＴ−２６３で治療されている請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅はＢｃｌ−ｘＬポリペプチドの発現の増加と相関している請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
患者はＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−ｘの少なくとも１つに結合するように設計されたアンチセンス剤で治療されている請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
判定ステップはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを検出可能に標識されている核酸プローブを用いて実施する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍細胞は循環腫瘍細胞である請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）（ｉ）検査サンプル中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し、及び（ｉｉ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量を測定し；
（ｃ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量が対照中のＢｃｌ−ｘＬの量より多いか少ないかを判定し；
（ｄ）（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅及び（ｉｉ）Ｂｃｌ−ｘＬの量が対照中よりも検査サンプル中で多いことに基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性の癌を有すると分類する
ことを含むＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して耐性の癌を有する患者を分類する方法。
【請求項２３】
（ａ）患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）（ｉ）検査サンプル中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し、（ｉｉ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量を測定し；
（ｃ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量が対照中のＢｃｌ−ｘＬの量より多いか少ないかを判定し；
（ｄ）（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅及び（ｉｉ）Ｂｃｌ−ｘＬの量が対照中よりも検査サンプル中で多いことに基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があると分類する
ことを含む癌患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があると同定する方法。
【請求項２４】
Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤がＡＢＴ−２６３である請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
組織サンプルは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル；或いは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプルまたはパラフィン包埋組織サンプルから作成される抽出物または処理サンプルからなる請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅の判定はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２７】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを検出可能に標識されている核酸プローブを用いて実施する請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションをＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の少なくとも一部に対して特異的にハイブリダイズする核酸プローブまたはペプチド核酸プローブを用いて実施する請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅の判定はポリメラーゼ連鎖反応を含む請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項３０】
ポリメラーゼ連鎖反応をＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の核酸配列の少なくとも一部に対して特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを用いて実施する請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
判定ステップは核酸マイクロアレイアッセイを含む請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項３２】
組織サンプルは小細胞肺癌及びリンパ腫からなる群から選択される癌を有する患者に由来する請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項３３】
患者をＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−ｘＬの１つに結合するように設計されたアンチセンス剤を受ける資格があると分類する請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
測定ステップ（ｂ）（ｉｉ）をイムノアッセイにより実施する請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項３５】
イムノアッセイはサンドイッチ型イムノアッセイである請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
イムノアッセイはＥＬＩＳＡである請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
測定ステップ（ｂ）（ｉｉ）を自動イムノアッセイ計器を用いて実施する請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
測定ステップ（ｂ）（ｉｉ）をＢｃｌ−ｘＬ ｍＲＮＡを計測することにより実施する請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項３９】
（ａ）癌患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）サンプル中の腫瘍または癌細胞を同定し、またはサンプルから腫瘍または癌細胞を抽出し；
（ｃ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅の存在または不在に基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤で治療を続けるべきかを決定する
ことを含む抗−Ｂｃｌ−２ファミリー剤で治療されている患者をモニターする方法。
【請求項４０】
癌は小細胞肺癌及びリンパ腫からなる群から選択される請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
患者がＡＢＴ−２６３で治療されている請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅はＢｃｌ−ｘＬポリペプチドの発現の増加と相関している請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
患者はＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−ｘＬの少なくとも１つに結合するように設計されたアンチセンス剤で治療されている請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
判定ステップはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを検出可能に標識されている核酸プローブを用いて実施する請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを少なくとも２つの核酸プローブを用いて実施する請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
核酸プローブの１つはＢｃｌ−ｘＬ遺伝子にハイブリダイズするように設計されている請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
腫瘍細胞は循環腫瘍細胞である請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
（ａ）患者から検査サンプルを用意し；
（ｂ）（ｉ）検査サンプル中でＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が増幅されるかを判定し、（ｉｉ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量を測定し；
（ｃ）検査サンプル中のＢｃｌ−ｘＬの量が対照中のＢｃｌ−ｘＬの量よりも多いか少ないかを判定し；
（ｄ）（ｉ）Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅及び（ｉｉ）Ｂｃｌ−ｘＬの量が対照中よりも検査サンプル中で多いことに基づいて患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤で治療を続けるべきかを決定する
ことを含む抗−Ｂｃｌ−２ファミリー剤で治療されている患者をモニターする方法。
【請求項５０】
Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤はＡＢＴ−２６３である請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
組織サンプルは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル；或いは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、微小針吸引物サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシサンプル、膀胱または肺洗浄液サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引物サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸膜滲出液サンプル、新鮮凍結組織サンプルまたはパラフィン包埋組織サンプルから作成される抽出物または処理サンプルからなる請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅の判定はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを検出可能に標識されている核酸プローブを用いて実施する請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションをＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の少なくとも一部に対して特異的にハイブリダイズする核酸プローブまたはペプチド核酸プローブを用いて実施する請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増幅の判定はポリメラーゼ連鎖反応を含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
ポリメラーゼ連鎖反応をＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の核酸配列の少なくとも一部に対して特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを用いて実施する請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
判定ステップは核酸マイクロアレイアッセイを含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
組織サンプルは小細胞肺癌及びリンパ腫からなる群から選択される癌を有する患者に由来する請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
患者をＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−ｘＬの１つに結合するように設計されたアンチセンス剤を受ける資格があると分類する請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
測定ステップ（ｂ）（ｉｉ）をイムノアッセイにより実施する請求項４９に記載の方法。
【請求項６１】
イムノアッセイはサンドイッチ型イムノアッセイである請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
イムノアッセイはＥＬＩＳＡである請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
測定ステップ（ｂ）（ｉｉ）を自動イムノアッセイ計器を用いて実施する請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
測定ステップ（ｂ）（ｉｉ）をＢｃｌ−ｘＬ ｍＲＮＡを計測することにより実施する請求項４９に記載の方法。
【請求項６５】
（ａ）増幅されたＢｃｌ−ｘＬ遺伝子を検出するための試薬及び（ｂ）使用説明書を含む
キット。
【請求項６６】
増幅されたＢｃｌ−ｘＬ遺伝子を検出するための試薬はＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズする検出可能に標識されているポリヌクレオチドを含む請求項６５に記載のキット。
【公表番号】特表２０１２−５１７２４１（Ｐ２０１２−５１７２４１Ａ）
【公表日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５０２１３（Ｐ２０１１−５５０２１３）
【出願日】平成２２年２月１１日（２０１０．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２３８１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９３７４２
【国際公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【出願人】（５１１１９５５４１）ザ・ウオルター・アンド・エリザ・ホール・インステイテユート・オブ・メデイカル・リサーチ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１１日（２０１０．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２３８１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９３７４２
【国際公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【出願人】（５１１１９５５４１）ザ・ウオルター・アンド・エリザ・ホール・インステイテユート・オブ・メデイカル・リサーチ (1)
【Ｆターム（参考）】
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