ＣＧジヌクレオチド修飾物を含有するトール様受容体の新規な合成アゴニスト
本発明は、免疫療法用途のための免疫調節剤としてのオリゴヌクレオチドの治療的使用に関する。より詳細には、本発明は、免疫応答を生じさせる方法または免疫調節を必要とする患者を処置する方法における使用のために、免疫調節オリゴヌクレオチド組成物を提供する。本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは好ましくは、新規なピリミジンおよびプリンを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2005年12月20日出願の米国仮出願番号第60/752,335号および2006年8月4日出願の米国仮出願番号第60/821,458号の利益を主張する。上記出願の全体的な教示は、本明細書に参照として組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は概して、オリゴヌクレオチドを免疫調節剤として使用する免疫学および免疫療法用途の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、新規な化学組成物およびそれらの使用方法に関する。かかる組成物は、ＴＬＲ９媒介免疫応答を通じて独特のサイトカイン／ケモカインプロフィールを生じさせるのに有効である。
【０００３】
関連技術の概要
免疫応答は、応答に関与する細胞のサブセットに基づき先天性および適応的応答の両方を伴う。例えば、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の遅延型過敏性および活性などの古典的な細胞媒介機能に関与するＴヘルパー（Ｔｈ）細胞は、Ｔｈ１細胞であるのに対し、Ｂ細胞活性のためにヘルパー細胞として関わるＴｈ細胞は、Ｔｈ２細胞である。免疫応答の種類は、抗原曝露に応答して生成されるサイトカインに影響を受ける。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞により分泌されるサイトカインの差は、これらの２種のサブセットの異なる生物学的機能の結果であり得る。
【０００４】
Ｔｈ１細胞は、抗原への身体の先天性応答に関与する（例えばウィルス感染、細胞内病原体、および腫瘍細胞）。結果は、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの分泌およびＣＴＬの同時活性である。Ｔｈ２細胞は、細菌および寄生生物に応答して活性化されることが知られ、ＩＬ−４およびＩＬ−５の分泌を通して身体の適応的免疫応答（例えばＩｇＥ生成および好酸球活性）を媒介し得る。
【０００５】
Ｔｈ１免疫応答は、哺乳動物において、例えば非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する細菌または合成ＤＮＡの導入により誘発することができ、免疫応答は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）として知られるある免疫細胞で受容体への特定のオリゴヌクレオチド配列（例えば非メチル化ＣｐＧ）の提示に起因する。これらのＰＲＲの一部は、トール様受容体（ＴＬＲ）である。
【０００６】
トール様受容体（ＴＬＲ）は、先天性免疫応答に密接に関与する。脊椎動物において、トール様受容体と呼ばれる１０種のタンパク質のファミリー（ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０）が、病原体関連分子パターンを認識することが知られている。１０種のうち、ＴＬＲ３、７、８および９は、細胞内のエンドソーム内に限局化し、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）ならびにヌクレオシドおよび核酸代謝産物などの小分子を認識することが知られている。ＴＬＲ３およびＴＬＲ９は、それぞれウィルスおよび細菌ならびに合成ＤＮＡに存在するｄｓＲＮＡおよび非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドなどの核酸を認識することが知られている。細菌ＤＮＡは、免疫システムおよび抗腫瘍活性を活性化することが示されている（Tokunaga T et al., J. Natl. Cancer Inst. (1984) 72:955-962; Shimada S, et al., Jpn. H cancer Res, 1986, 77, 808-816; Yamamoto S, et al., Jpn. J. Cancer Res., 1986, 79, 866-73）。ＣｐＧジヌクレオチドを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する他の研究では、免疫応答を刺激することが示されてきた（Zhao Q, et al., Biochem.Pharmacol. 1996, 26, 173-82）。続く研究により、ＴＬＲ９が細菌および合成ＤＮＡに存在する非メチル化ＣｐＧモチーフを認識することが示された（Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, Kaisho T, Sato S, Sanjo H, Matsumoto M, Hoshino K, Wagner H, Takeda K, Akira S. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. (2000); 408:740-5）。
【０００７】
ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの他の修飾はまた、ＴＬＲ９を介する免疫応答のモジュレータとして作用するその能力に影響を及ぼすことができる（例えば、Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182; Zhao et al., Biochem Pharmacol. (1996) 52:1537-1544; Zhao et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:495-502; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9:3453-3458; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:1051-1054; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:2585-2588; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2001) 11:2263-2267; およびKandimalla et al., Bioorg. Med. Chem. (2001) 9:807-813参照）。加えて、構造活性相関研究により、合成モチーフおよび非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドから生じるものとは明白に異なる、特異的免疫応答プロフィールを誘発する新規のＤＮＡに基づく化合物の同定を可能にしてきた。
【０００８】
【表１】
【０００９】
加えて、ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの他の修飾もまた、免疫応答のモジュレータとして作用するそれらの能力に影響を及ぼすことができる。例えば、
【表１−２】
【００１０】
オリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチドは、様々な分野で使用されており、診断精査、ＰＣＲプライミング、遺伝子発現のアンチセンス阻害、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、およびトール様受容体（ＴＬＲ）をベースとした免疫療法剤が含まれるがこれらに限定されない。より最近では、多くの刊行物は、オリゴデオキシヌクレオチドの免疫調節剤としての使用や、アレルギー、ぜんそく、自己免疫、癌、および感染症などの多くの疾病への免疫療法用途におけるそれらの単独でのまたはアジュバントとしての使用を実証している。
【００１１】
これらの報告から、独特の免疫応答を生じさせることができる新しい化学物質を作り出す必要性が残っていることが明らかである。しかしながら、独特のサイトカイン／ケモカイン媒介免疫応答を生じさせ、ＴＬＲ９のためのリガンドとしても認識される新規な化学物質を生み出すことが課題として残っている。理想的には、この課題は、新しい新しい免疫療法をもたらす、独特の化学塩基を新規な化学物質に組み込むことを通じて達成され、投与の後に独特のサイトカイン／ケモカインプロフィールを生じさせる。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、新規な化学物質および独特のサイトカイン/ケモカイン媒介免疫応答を生じさせるためのそれらの使用を提供する。新規な化学物質は、オリゴヌクレオチド化合物により引き起こされる免疫応答を調節するのに有用である。本発明の方法は、免疫療法用途のために免疫調節オリゴヌクレオチドにより生成したサイトカイン/ケモカインプロフィールを修飾することを可能にする。本発明の発明者は驚くべきことに、免疫調節ジヌクレオチドの修飾によって、生成した免疫応答のプロフィールにおける柔軟性を可能にすることを発見した。
【００１３】
第１の面において、本発明は、式ＣＧで表される免疫調節ジヌクレオチドを含む免疫調節オリゴヌクレオチドであって、式中、Ｃはシトシン、２’−デオキシシトシン、Ｎ３−メチル−ｄＣ、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣであり、Ｇはグアノシン、２’−デオキシグアノシンまたはＮ１−メチル−ｄＧであり、ただしＣがシトシンまたは２’−デオキシシトシンであるとき、ＧはＮ１−メチル−ｄＧであり、さらにＧがグアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであるとき、ＣはＮ３−メチル−ｄＣ、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣである、前記免疫調節オリゴヌクレオチドを提供する。
第２の面において、本発明は、医薬組成物を提供する。これらの組成物は、本発明の第１の面において開示された組成物および薬学的に許容し得る担体を含む。
【００１４】
第３の面において、本発明は、脊椎動物において免疫応答を生じさせるための方法を提供し、該方法は、脊椎動物に本発明の第１または第２の面の免疫調節オリゴヌクレオチドを投与することを含む。
第４の面において、本発明は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法を提供し、かかる方法は、患者に本発明の第１または第２の面の免疫調節オリゴヌクレオチドを投与することを含む。
【００１５】
第５の面において、本発明は、脊椎動物における癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を予防する方法を提供し、かかる方法は、脊椎動物に本発明の第１または第２の面の免疫調節オリゴヌクレオチドを投与することを含む。
【００１６】
図面の簡単な説明
図１は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの直線的合成に好適な一群の代表的な小分子リンカーを表す。
図２は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの平行合成に好適な一群の代表的な小分子リンカーを表す。
【００１７】
図３は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの直線的合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル、ＣＥ＝シアノエチル。
図４は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの平行合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル、ＣＥ＝シアノエチル。
【００１８】
図５Ａ〜５Ｄは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養におけるＩＬ−１２およびＩＬ−６レベルを示す。図５Ａ〜５Ｄはより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、独特のＩＬ−１２およびＩＬ−６プロフィールが生じることを実証する。
図６Ａおよび６Ｂは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のヒトＰＢＭＣ培養におけるＩＬ−６およびＩＬ−１０レベルを示す。図６Ａ〜６Ｂはより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、独特のＩＬ−６およびＩＬ−１０プロフィールが生じることを実証する。
【００１９】
図７は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＨＥＫ２９３細胞におけるＴＬＲ９活性を、それらのＮＦ−κＢ活性により測定し、示す。図７はより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、独特のＴＬＲ９活性プロフィールが生じることを実証する。
図８は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの皮下（ｓ．ｃ．）投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＩＬ−１２レベルを示す。図８はより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与により、独特のＩＬ−１２プロフィールが生じることを実証する。
【００２０】
図９は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける脾臓重量を示す。図９はより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与により、独特の免疫応答プロフィールが生じることを実証する。
図１０Ａ〜１０Ｄは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＯＶＡ感作マウス脾臓細胞におけるＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γレベルを示す。図１０Ａ〜１０Ｄはより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、免疫システム活性化因子（例えば卵白アルブミン）が存在しても、塩基組成物および投与するオリゴヌクレオチドの量により様々である独特のサイトカイン／ケモカインプロフィールが生じることを実証する。
【００２１】
図１１は、免疫調節オリゴヌクレオチドおよび対照化合物１０ｍｇ／ｍｌの濃度による、マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞の活性を実証する。図１１はより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、独特のＴＬＲ９活性プロフィールが生じることを実証する。
図１２Ａ〜１２Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養における本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによるサイトカイン分泌の誘発を実証する。図１２Ａ〜１２Ｂはより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、塩基組成物および投与するオリゴヌクレオチドの量により様々である独特のＩＬ−６およびＩＬ−１２プロフィールが生じることを実証する。
【００２２】
図１３Ａおよび１３Ｂは、動物が免疫調節オリゴヌクレオチド、対照化合物、またはＰＢＳをｓ．ｃ．投与で受けた７２時間後の脾腫（図１３Ａ）、およびｓ．ｃ．投与後に免疫調節オリゴヌクレオチドにより誘発されたＩＬ−１２分泌（図１３Ｂ）を実証する。図１３Ａ〜１３Ｂはより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与により、独特の免疫応答プロフィールが生じることを実証する。
図１４は、免疫調節オリゴヌクレオチドにより誘発されたヒトＢ細胞増殖を実証する。図１４はより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、塩基組成物および投与するオリゴヌクレオチドの量により様々である独特の細胞増殖プロフィールが生じることを実証する。
【００２３】
様々な態様の詳細な説明
本発明は、免疫療法用途のための免疫調節剤としてのオリゴヌクレオチドの治療的使用に関する。本明細書中に引用される交付済み特許、特許出願および参考文献は、各々が参照として組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ範囲で本明細書中に参照として組み込まれる。引用される参考文献および本明細書の教示の間の不一致は、本発明の目的のために、後者を優先することとする。
【００２４】
本発明は、成人および小児科学上のヒトおよび獣医学的用途において、限定することなく、癌、自己免疫疾患、ぜんそく、呼吸器系アレルギー、食物アレルギー、および細菌、寄生虫、およびウィルス感染の処置などの免疫療法用途のために使用することができる、免疫刺激化合物により引き起こされる免疫応答を増強する方法を提供する。したがって、本発明はさらに、免疫療法のための最適レベルの免疫刺激効果を有する化合物ならびにかかる化合物を作るおよび使用するための方法を提供する。加えて、本発明の化合物は、ＤＮＡワクチン、抗体、およびアレルゲンとの組み合わせにおいて、および化学療法剤および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドとの組み合わせにおいて、アジュバントとして有用である。
【００２５】
第１の面において、本発明は、式ＣＧで表される少なくとも１つの免疫調節ジヌクレオチドを含む免疫調節オリゴヌクレオチドであって、式中、Ｃはシトシン、２’−デオキシシトシン、Ｎ３−メチル−ｄＣ、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣであり、Ｇはグアノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、アラビノグアノシンまたはＮ１−メチル−ｄＧであり、ただしＣがシトシンまたは２’−デオキシシトシンであるとき、ＧはＮ１−メチル−ｄＧであり、さらにＧがグアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであるとき、ＣはＮ３−メチル−ｄＣ、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣである、前記免疫調節オリゴヌクレオチドを提供する。
【００２６】
この面の一態様において、本発明は、単独のまたはそれらの３’末端、またはヌクレオシド間結合または官能化核酸塩基または糖において非ヌクレオチドリンカーに結合した少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含む免疫調節オリゴヌクレオチドを提供し、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、免疫調節オリゴヌクレオチドであり、利用できる５’末端を有する。非ヌクレオチドリンカーを通じて互いに結合したオリゴヌクレオチドは、同一のヌクレオチド配列を有し得、または異なるヌクレオチド配列を有し得るが、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、本発明の少なくとも１つの免疫調節ジヌクレオチドを含有する。
【００２７】
本明細書中では、用語「利用できる５’末端」は、オリゴヌクレオチドの５’末端が、オリゴヌクレオチドを認識して結合し、免疫システムを刺激する要因がそれを利用できるよう、十分に利用可能であることを意味する。利用できる５’末端を有するオリゴヌクレオチドにおいて、末端の糖の５’ＯＨ位は、２より多くのヌクレオシド残基または５’末端との相互作用を妨害するその他の部分と共有結合しない。任意に、５’ＯＨは、リン酸塩、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート部分、芳香族または脂肪族リンカー、コレステロール、または利用可能性を妨害しない別の物質と結合することができる。
【００２８】
本発明の目的のために、用語「免疫刺激オリゴヌクレオチド」または「免疫調節オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つの免疫調節ジヌクレオチドを含む化合物を意味し、免疫調節効果を有しない化合物は含まない。「免疫調節ジヌクレオチド」は、式５’−ＣｐＧ−３’を有するジヌクレオチドであり、式中、「Ｃ」は哺乳動物において天然に存在するピリミジンヌクレオシドまたはその合成誘導体であり、「Ｇ」は哺乳動物において天然に存在するプリンヌクレオシドまたはその合成誘導体である。本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、１種の免疫調節ジヌクレオチドまたは数種の免疫調節ジヌクレオチドを有し得る。例えば、各免疫調節オリゴヌクレオチドは、同一であるかまたは本明細書中に記載のように独立して修飾され得る２、３、４または５種以上の免疫調節ジヌクレオチドを有し得る。
【００２９】
用語「ＣｐＧ」および「ＣｐＧジヌクレオチド」は、ジヌクレオチド５’−デオキシシチジン−デオキシグアノシン−３’のことであり、ここで、ｐはヌクレオシド間結合であり、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート結合が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明の目的のために、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合したヌクレオシド単位から形成されたポリヌクレオシドのことをいう。かかるオリゴヌクレオチドは、ゲノムまたはｃＤＮＡを含む既存の核酸源から得ることができるが、好ましくは合成方法で生成される。いくつかの態様において、各ヌクレオシド単位は、複素環塩基およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換アラビノース、２’−Ｏ−置換アラビノースまたは六炭糖類を含む。ヌクレオシド残基は、多数の既知のヌクレオシド間結合のいずれかによって互いに共役させることができる。かかるヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間結合を含むが、これらに限定されない。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、１または２以上の立体特異的なヌクレオシド間結合（例えば、（ＲＰ）−または（ＳＰ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドを包含する。本明細書中では、用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、結合がリン酸基を含むかどうかいずれにせよ、あらゆるそのようなヌクレオシド間結合を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを明確に意図する。ある態様において、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート結合、またはそれらの組合せであってもよい。
【００３１】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは各々、約３から約３５までのヌクレオシド残基、または約４から約３０までのヌクレオシド残基、または約４から約１８までのヌクレオシド残基を有する。いくつかの態様において、免疫調節オリゴヌクレオチドは、約１から約１８まで、または約１から約１５まで、または約５から約１４までのヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドを含む。本明細書中では、用語「約」は、正確な数は重要ではないことを示唆する。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は、重要ではなく、１個または２個少ないヌクレオシド残基、または１個から数個の追加のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、上記の各態様と同等であると考えられる。いくつかの態様において、１または２以上のオリゴヌクレオチドは、１１のヌクレオチドまたは１８のヌクレオチドを有する。免疫調節オリゴヌクレオチドとの関係で、ある態様は、約１３から約３５までのヌクレオチド、または約１３から約２６までのヌクレオチド、または約１１から約２２までのヌクレオチドを有する。
【００３２】
用語「オリゴヌクレオチド」はまた、タンパク質基、親油基、挿入剤、ジアミン、葉酸、コレステロールおよびアダマンタンを含むがこれらに限定されないさらなる置換基を有するポリヌクレオシドを包含する。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチド、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを伴う骨格部分を有するオリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されないポリマーを含有するその他の核酸塩基を包含する。
【００３３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、またはそれらの混合物を含むことができる。本明細書中では、用語「修飾ヌクレオシド」は、修飾複素環塩基、修飾糖部分、またはそれらの組合せを含むヌクレオシドである。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシドは、本明細書中に記載のように、非天然のピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシドは、２’−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシドまたは２’−デオキシ−２’−置換−アラビノシドである。
【００３４】
本発明の目的のために、用語「２’−置換リボヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」は、リボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含み、ここで、五炭糖部分の２’位のヒドロキシル基が置換され、２’−置換または２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドが生成される。かかる置換は、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含有する低級アルキル基によるもの、または６〜１０個の炭素原子を有するアリール基によるものであり、ここでかかるアルキル、またはアリール基は、置換されていなくても、または、例えば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、またはアミノ基により置換されていてもよい。２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−置換−アラビノシドの例は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メチルアラビノシドおよび２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メトキシエチルアラビノシドを含むが、これらに限定されない。
【００３５】
用語「２’−置換リボヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」はまた、リボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含み、ここで、２’−ヒドロキシル基は、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含有する低級アルキル基で、またはアミノまたはハロ基で置き換えられる。かかる２’−置換リボヌクレオシドまたは２’−置換アラビノシドの例は、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリル、および２’−プロパルギルリボヌクレオシドまたはアラビノシドを含むが、これらに限定されない。
【００３６】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ハイブリッドおよびキメラオリゴヌクレオチドを含む。「キメラオリゴヌクレオチド」は、１種より多くのヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドである。かかるキメラオリゴヌクレオチドの一例は、ホスホロチオエート、ホスホジエステルまたはホスホロジチオエート領域およびアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート結合などの非イオン結合を含むキメラオリゴヌクレオチドである（例えば、Pederson他による、米国特許第5,635,377号および第5,366,878号参照）。
【００３７】
「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」は、１種より多くのヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドである。かかるハイブリッドオリゴヌクレオチドの一例は、リボヌクレオチドまたは２’−置換リボヌクレオチド領域、およびデオキシリボヌクレオチド領域を含む（例えば、MetelevおよびAgrawalによる、米国特許第5,652,355号、第6,346,614号および第6,143,881号参照）。
【００３８】
本発明の目的のために、用語「免疫刺激オリゴヌクレオチド」または「免疫調節オリゴヌクレオチド」は、魚、家禽または哺乳動物などの脊椎動物に投与するとき、免疫応答を調節（例えば誘発）する上記のオリゴヌクレオチドのことをいう。本明細書中では、用語「哺乳動物」は、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ(cattle)、ウシ(cows)、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類およびヒトを含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の目的のために、「天然」ヌクレオシドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ中に普通に存在する５種の塩基（例えば、アデノシン、グアノシン、チミジン、シトシンおよびウリジン）のうち１種とデオキシリボースまたはリボース糖とを含むものである。本発明の目的のために、「修飾」または「非天然」ヌクレオシドは、修飾された天然に存在する塩基および／または修飾された天然に存在する糖部分を含むものである。修飾された天然に存在する塩基の例には、式Ｉまたは式ＩＩで表される組成物が含まれるが、これらに限定されない。本発明の目的のために、「ジヌクレオチド類似体」は、上記の免疫刺激ジヌクレオチドであり、ここで、ピリミジンおよびプリンヌクレオシドのいずれかあるいは両方が、非天然のヌクレオシドである。用語「Ｃ＊ｐＧ」および「ＣｐＧ＊」は、シチジン類似体（非天然のピリミジンヌクレオシド）またはグアノシン類似体（非天然のプリンヌクレオシド）をそれぞれ含む免疫刺激ジヌクレオチド類似体のことをいう。
【００４０】
さまざまな場所で、ジヌクレオチドは、Ｒ’ｐＧ、Ｃ＊ｐＧまたはＹＺと表され、その場合それぞれ、Ｒ’、Ｃ＊、またはＹは、限定することなく、Ｎ３−メチル−ｄＣ、プソイド−イソ−デオキシシトジン(pseudo-iso-deoxycytodine)（すなわち、Ψ−イソ−ｄＣ）およびデオキシフラノシル(deoxyfuranosyl）（すなわち、ｄＦ）などの合成または非天然のピリミジンを表す。他の場所で、ジヌクレオチドは、ＣｐＲ、ＣｐＧ＊またはＹＺと表され、その場合それぞれ、Ｒ、Ｇ＊、またはＺは、限定することなく、Ｎ１−メチル−ｄＧまたは７−デアザ−ｄＧなどの合成プリンを表す。本明細書中では、用語「ピリミジンヌクレオシド」は、ヌクレオシドのことであり、ここで、ヌクレオシドの塩基成分は、単環核酸塩基である。同様に、用語「プリンヌクレオシド」は、ヌクレオシドのことであり、ここで、ヌクレオシドの塩基成分は、二環核酸塩基である。本発明の目的のために、「合成」ピリミジンまたはプリンヌクレオシドは、天然に存在しないピリミジンまたはプリン塩基、天然に存在しない糖部分、またはそれらの組合せを含む。
【００４１】
本発明のピリミジンヌクレオシドは、構造(I):
【化１】
【００４２】
式中、
Ｄは、水素結合供与体であり、
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、水素結合受容体、親水性基、疎水性基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され、
ＤおよびＤ’は、５員または６員環の一部であってもよく、
Ａは、窒素またはヘテロ原子、置換されたまたは置換されていないヘテロ原子であり、
Ａ’は、水素結合受容体、親水性基、疎水性基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され、
Ａ’’は、炭素または窒素であり、
Ｘは、炭素または窒素であり、および
Ｓ’は、五炭糖または六炭糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
【００４３】
いくつかの態様において、糖環は、リン酸塩部分、修飾リン酸塩部分、またはピリミジンヌクレオシドを別のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体に結合させるのに好適な他のリンカー部分により誘導体化されている。
水素結合供与体は、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを含むが、これらに限定されない。水素結合受容体は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、および芳香族複素環の環窒素原子、例えば、シトシンのＮ３を含むが、これらに限定されない。
【００４４】
いくつかの態様において、（Ｉ）の塩基部分は、天然に存在しないピリミジン塩基である。天然に存在しないピリミジン塩基の例は、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ３−メチル−ｄＣ、プソイド−イソ−デオキシシトジン（すなわち、Ψ−イソ−ｄＣ）；デオキシフラノシル（すなわち、ｄＦ）、４−チオウラシルおよびＮ４−エチルシトシンなどのＮ４−アルキルシトシンを含むが、これらに限定されない。しかしながら、いくつかの態様において、５−ブロモシトシンは、明確に除外されている。
【００４５】
いくつかの態様において、（Ｉ）の糖部分Ｓ’は、修飾された天然に存在する糖部分である。本発明の目的のために、「天然に存在する糖部分」は、核酸の一部として天然に存在する糖部分、例えば、リボースおよび２’−デオキシリボースであり、「修飾された天然に存在する糖部分」は、核酸の一部として天然に存在しないあらゆる糖であるが、オリゴヌクレオチドの骨格に使用することができる、例えば、六炭糖である。アラビノースおよびアラビノース誘導体は、糖部分の例である。
【００４６】
本発明のプリンヌクレオシド類似体は、構造（ＩＩ）：
【化２】
【００４７】
式中、
Ｄは、窒素またはヘテロ原子、置換されたまたは置換されていないヘテロ原子であり、
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、および親水性基からなる群から選択され、
Ａは、水素結合受容体または親水性基であり、
Ｘは、炭素または窒素であり、
それぞれのＬは独立して、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される原子であり、および
Ｓ’は、五炭糖または六炭糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
【００４８】
いくつかの態様において、糖環は、リン酸塩部分、修飾リン酸塩部分、またはピリミジンヌクレオシドを別のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体に結合させるのに好適な他のリンカー部分により誘導体化されている。
水素結合供与体は、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを含むが、これらに限定されない。水素結合受容体は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、−ＮＯ２および芳香族複素環の環窒素原子、例えば、グアニンのＮ１を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
いくつかの態様において、（ＩＩ）の塩基部分は、天然に存在しないプリン塩基である。天然に存在しないプリン塩基の例は、２−アミノ−６−チオプリン、７−デアザグアノシン、Ｎ１−メチル−ｄＧおよび２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリンを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、（ＩＩ）の糖部分Ｓ’は、構造（Ｉ）について記載したように、天然に存在する糖部分または修飾された天然に存在する糖部分である。
【００５０】
いくつかの態様において、免疫刺激ジヌクレオチドは、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊、およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択され、ここで、Ｃの塩基はシトシンであり、Ｃ＊の塩基はチミン、５−ヒドロキシシトシン、Ｎ３−メチル−ｄＣ、Ｎ４−アルキル−シトシン、プソイド−イソ−デオキシシトジン；デオキシフラノシル、４−チオウラシルまたは他の非天然のピリミジン、または２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリンであり、塩基が２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンのとき、それは好ましくは五炭糖の１’−位に塩基の１位を介して共有結合し、Ｇの塩基はグアノシンであり、Ｇ＊の塩基は２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリン、２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン、６−チオグアニン、７−デアザグアノシン、イノシン、Ｎ１−メチル−ｄＧ、６−オキソプリン、または他の非天然のプリンヌクレオシドであり、およびｐはホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間結合であり、ただし、少なくとも１つのＣまたはＧは、それぞれシトシンまたはグアノシンではない。
【００５１】
免疫調節オリゴヌクレオチドは、免疫刺激ジヌクレオチドの片側または両側に免疫刺激部分を含んでもよい。したがって、いくつかの態様において、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、構造（ＩＩＩ）：
５’−Ｎｎ−Ｎ１−Ｙ−Ｚ−Ｎ１−Ｎｎ−３’ （ＩＩＩ）
【００５２】
式中、
Ｙの塩基は、シトシン、チミン、５−ヒドロキシシトシン、Ｎ４−アルキル−シトシン、Ｎ３−メチル−シトシン、Ψ−イソ−ｄＣ、ｄＦ、４−チオウラシルまたは他の非天然のピリミジンヌクレオシド、または２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリンであり、ここで、塩基が２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリンのとき、それは好ましくは五炭糖の１’−位に塩基の１位を介して共有結合し、
Ｚの塩基は、グアニン、２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリン、２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン、２−アミノ−６−チオ−プリン、７−デアザグアノシン、Ｎ１−メチル−ｄＧ、６−オキソプリンまたは他の非天然のプリンヌクレオシドであり、
【００５３】
Ｎ１およびＮｎは、各発生で独立して、好ましくは天然に存在するあるいは非天然または合成ヌクレオシドまたは脱塩基ヌクレオシド、Ｎ３−メチル−ｄＣ、Ｎ１−メチル−ｄＧ、アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、およびホスホジエステルまたは修飾されたヌクレオシド間結合によって３’側に隣接するヌクレオシドに結合したヌクレオシドからなる群から選択される免疫刺激部分であり、修飾されたヌクレオシド間結合は、約２Åから約２００Åまでの長さを有するリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはメチルホスホネートヌクレオシド間結合から選択されるが、これらに限定されず、
ただし、少なくとも１つのＮ１またはＮｎは、任意に免疫刺激部分であり、
ただし、さらに少なくとも１つのＹまたはＺはそれぞれ、シトシンまたはグアノシンではなく、
ここで、ｎは、０から３０までの数字であり、および
ここで、３’末端、ヌクレオシド間リンカー、または誘導体化された核酸塩基または糖は、直接または非ヌクレオチドリンカーを介して、免疫刺激性であってもなくてもよい別のオリゴヌクレオチドに結合する、
の免疫刺激ドメインを含む。
【００５４】
いくつかの態様において、ＹＺは、シトシン、Ψ−イソ−ｄＣ、ｄＦまたはＮ３−メチル−ｄＣおよびグアノシンまたはＮ１−メチル−ｄＧである。免疫刺激部分は、天然ホスホジエステル骨格およびリン酸塩骨格における修飾物を含み、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホロアミデート、特に第一アミノ−ホスホロアミデート、Ｎ３ホスホロアミデートおよびＮ５ホスホロアミデート、および立体特異的な結合（例えば、（ＲＰ）−または（ＳＰ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル結合）を含むがこれらに限定されない。
【００５５】
いくつかの態様において、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドはさらに、糖修飾物を有するヌクレオシドを含み、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−メトキシエチルリボース、２’−Ｏ−プロパルギルリボース、および２’−デオキシ−２’−フルオロリボースを含むがこれらに限定されない２’−置換五炭糖類；３’−Ｏ−メチルリボース；１’，２’−ジデオキシリボースを含むがこれらに限定されない３’−置換五炭糖類；アラビノース；１’−メチルアラビノース、３’−ヒドロキシメチルアラビノース、４’−ヒドロキシメチルアラビノース、３’−ヒドロキシアラビノースおよび２’−置換アラビノース糖類を含むがこれらに限定されない置換アラビノース糖類；１，５−アンヒドロヘキシトールを含むがこれらに限定されない六炭糖類；およびアルファ−アノマーを含むがこれらに限定されない。修飾糖が３’−デオキシリボヌクレオシドまたは３’−Ｏ−置換リボヌクレオシドである態様において、免疫刺激部分は、２’−５’ヌクレオシド間結合によって隣接するヌクレオシドに結合する。
【００５６】
いくつかの態様において、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドはさらに、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチド、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを含むがこれらに限定されない約２Åから約２００Åまでの長さがある骨格リンカー部分を有するオリゴヌクレオチドを含む他の炭水化物骨格修飾物および置換物を有するオリゴヌクレオチドを含む。アルキルリンカーは、分枝状または非分枝状の、置換されたまたは置換されてない、および単一異性体(chirally pure)またはラセミ混合物であってもよい。いくつかの態様において、かかるアルキルリンカーは、約２〜約１８個の炭素原子を有する。いくつかの態様において、かかるアルキルリンカーは、約３〜約９個の炭素原子を有する。いくつかのアルキルリンカーは、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素およびチオエーテルからなる群から選択された１または２以上の官能基を含む。いくつかのかかる官能化アルキルリンカーは、式−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ（ｎ＝１〜９）で表されるポリ（エチレングリコール）リンカーまたはグリセロールである。いくつかの他の官能化アルキルリンカーは、ペプチドまたはアミノ酸である。
【００５７】
いくつかの態様において、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドはさらに、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシドおよびα−デオキシリボヌクレオシドを含むがこれらに限定されないＤＮＡアイソフォームを含む。いくつかの態様において、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、３’修飾を取り入れ、さらに２’−５’、２’−２’、３’−３’および５’−５’結合を含むがこれらに限定されない不自然なヌクレオシド間結合位置を有するヌクレオシドを含む。
【００５８】
いくつかの態様において、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドはさらに、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、４−チオウラシル、６−チオグアニン、７−デアザグアニン、イノシン、ニトロピロール、Ｃ５−プロピニルピリミジン、Ｎ４−エチルシトシンなどのＮ４−アルキルシトシン、および２，６−ジアミノプリンを含むがこれに限定されないジアミノプリンを含むがこれらに限定されない修飾複素環塩基を有するヌクレオシドを含む。
【００５９】
特定の説明の目的で、限定の目的ではなく、例えば、構造（ＩＩＩ）の免疫刺激ドメインにおいて、Ｎ１またはＮｎ位でのメチルホスホネートヌクレオシド間結合は、免疫刺激部分であり、約２Åから約２００Åまでの長さを有するリンカー、Ｘ１位のＣ２〜Ｃ１８アルキルリンカーは免疫刺激部分であり、およびＸ１位のβ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシドは、免疫刺激部分である。免疫刺激部分の代表的な位置および構造については、以下の表１を参照のこと。特定の位置での免疫刺激部分としてのリンカーは、その位置のヌクレオシド残基がその３’−ヒドロキシルで指示リンカーと置換され、それにより、そのヌクレオシド残基および隣接するヌクレオシドの間で３’側で修飾ヌクレオシド間結合が作られることを意味すると理解される。同様に、特定の位置での免疫刺激部分としての修飾ヌクレオシド間結合は、その位置のヌクレオシド残基が列挙した結合の手段で３’側で隣接するヌクレオシドに結合することを意味する。
【００６０】
【表２】
【００６１】
表２は、上流の増強ドメインを有する免疫調節オリゴヌクレオチド内の免疫刺激部分の代表的な位置および構造を示す。本明細書中では、用語「スペーサー９」は、式−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−のポリ（エチレングリコール）リンカーのことであり、式中、ｎは３である。用語「スペーサー１８」は、式−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−のポリ（エチレングリコール）リンカーのことであり、式中、ｎは６である。本明細書中では、用語「Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー」は、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−Ｏ−のリンカーのことであり、式中、ｑは２〜１８の整数である。したがって、用語「Ｃ３−リンカー」および「Ｃ３−アルキルリンカー」は、式−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｏ−のリンカーのことであり、置換されてもまたは置換されなくてもよく、分枝状でもまたは非分枝状でもよい（例えば１，２，３，プロパントリオール）。スペーサー９、スペーサー１８、およびＣ２〜Ｃ１８アルキルリンカーのそれぞれについて、リンカーは、隣接するヌクレオシドにホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート結合によりつながっている。
【００６２】
【表３】
【００６３】
表３は、下流の増強ドメインを有する免疫調節オリゴヌクレオチド内の免疫刺激部分の代表的な位置および構造を示す。
【００６４】
【表４】
【００６５】
本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、３’末端またはヌクレオシド間結合または官能化核酸塩基または糖において非ヌクレオチドリンカーを介して結合した少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含む。本発明の目的のために、「非ヌクレオチドリンカー」は、共有または非共有結合によりオリゴヌクレオチドに結合することができるあらゆる部分である。かかるリンカーは、長さが約２Åから約２００Åまでである。リンカーの数例を以下に示す。非共有結合には、静電相互作用、疎水性相互作用、π−スタッキング相互作用、および水素結合が含まれるが、これらに限定されない。用語「非ヌクレオチドリンカー」は、上記のようにヌクレオシド間結合、例えば、２つのヌクレオシドの３’−ヒドロキシル基に直接つながるホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート官能基のことを意味しない。本発明の目的のために、かかる直接３’−３’結合（リンカーが関与しない）は、「ヌクレオチド結合」であると考えられる。
【００６６】
いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、金粒子を含むがこれに限定されない金属である。いくつかの他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、可溶性または不溶性の生分解性ポリマービーズである。
【００６７】
また他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドへの結合を可能にする官能基を有する有機部分である。かかる結合は、あらゆる安定した共有結合によるものである。非限定の例として、リンカーは、ヌクレオシドのあらゆる好適な位置に結合してもよい。いくつかの態様において、リンカーは、３’−ヒドロキシルに結合する。かかる態様において、リンカーは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは非リン酸塩をベースとする結合によって３’−ヒドロキシルに結合するヒドロキシル官能基を含む。
【００６８】
いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、ポリペプチド、抗体、脂質、抗原、アレルゲンおよびオリゴ糖を含むがこれらに限定されない生体分子である。いくつかの他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、小分子である。本発明の目的のために、小分子は、１，０００Ｄａ未満の分子重量を有する有機部分である。いくつかの態様において、小分子は、７５０Ｄａ未満の分子重量を有する。
【００６９】
いくつかの態様において、小分子は、脂肪族または芳香族炭化水素であり、これらのいずれかは任意に、オリゴヌクレオチドにつながるまたは付加される直鎖状の、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素、およびチオ尿素からなる群から選択された１または２以上の官能基を含むことができる。小分子は、環状または非環状であり得る。小分子リンカーの例には、アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテンおよび抗生物質が含まれるが、これらに限定されない。しかしながら、非ヌクレオチドリンカーを説明する目的のために、用語「小分子」は、ヌクレオシドを含むことを意図しない。
【００７０】
いくつかの態様において、小分子リンカーは、グリセロールまたは式ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨのグリセロール同族体であり、式中、ｏおよびｐは独立して、１から約６まで、１から約４まで、または１から約３までの整数である。いくつかの他の態様において、小分子リンカーは、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。いくつかのかかる誘導体は、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨを有し、式中、ｍは、０から約１０まで、０から約６まで、２から約６まで、または２から約４までの整数である。
【００７１】
本発明のいくつかの非ヌクレオチドリンカーにより、２より多くのオリゴヌクレオチドの結合が可能となる。例えば、小分子リンカーグリセロールは、オリゴヌクレオチドが共有結合してもよい３個のヒドロキシル基を有する。したがって、本発明のいくつかの免疫調節オリゴヌクレオチドは、３’末端が非ヌクレオチドリンカーに結合する２より多くのオリゴヌクレオチドを含む。
【００７２】
本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドを、図３および４に図式的に描写し、さらに例に記載した自動合成装置およびホスホロアミダイト法を使って都合よく合成してもよい。いくつかの態様において、免疫調節オリゴヌクレオチドを、直線的合成法により合成する（図３参照）。本明細書中では、用語「直線的合成」は、免疫調節オリゴヌクレオチドの一方の末端で始まり、他方の末端に直線的に進行する合成のことをいう。直線的合成により、同一または非同一（長さ、塩基組成物および／または取り入れられる化学修飾物の点で）のモノマー単位を免疫調節オリゴヌクレオチド内に取り入れることが可能となる。
【００７３】
合成の代わりの様式は、「平行合成」であり、合成は、中央のリンカー部分から外側に進む（図４参照）。固体の支持体が結合したリンカーを、米国特許第5,912,332号に記載のように、平行合成に使用することができる。代わりに、一般的な固体の支持体（リン酸塩が結合した多孔性ガラス(controlled pore glass)など）を使用することができる。
【００７４】
免疫調節オリゴヌクレオチドの平行合成は、直線的合成よりもいくつか優れた点を有する：（１）平行合成により、同一モノマー単位の取入れが可能となる；（２）直線的合成とは違って、両方の（またはすべての）モノマー単位が同時に合成され、それにより合成ステップの数および合成に必要な時間が１つのモノマー単位のものと同じである；および（３）合成ステップの削減により、最終免疫調節オリゴヌクレオチド生成物の純度および収率が向上する。
【００７５】
直線的合成または平行合成手順のいずれかによる合成の最後に、修飾ヌクレオシドを取り入れる場合、免疫調節オリゴヌクレオチドを、濃縮アンモニア溶液を用いてまたはホスホロアミダイト供給元により推奨されたように都合よく脱保護してもよい。生成物である免疫調節オリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣ、脱トリチル化(detritylated)、脱塩および透析により精製することができる。
【００７６】
表４は、本発明の代表的な免疫調節オリゴヌクレオチドを示す。
【００７７】
【表５】
Ｃ１＝Ｎ３−メチル−ｄＣ；Ｃ２＝ｄＦ；Ｃ３＝Ψ−イソ−ｄＣ；Ｃ４＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン；Ｇ１＝Ｎ１−メチル−ｄＧ；Ｇ２＝７−デアザ−ｄＧ；Ｇ３＝アラビノグアノシン；Ｘ＝グリセロールリンカー；Ｙ＝Ｃ３リンカー
【００７８】
本発明のこの面のある態様は、上記の免疫刺激オリゴヌクレオチド、および利用できる５’末端以外の位置で免疫刺激オリゴヌクレオチドに共役した化合物を含む免疫調節オリゴヌクレオチド共役体を提供する。いくつかの態様において、化合物は、非ヌクレオチドリンカーに共役される。いくつかの他の態様において、化合物は、その５’末端以外の位置でオリゴヌクレオチドに共役される。本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドに共役され得る好適な化合物には、コレステロール、異なる長さのポリエチレングリコール、ペプチド、抗体、タンパク質、ワクチン、脂質、抗原、および、限定することなく、イミキモド、Ｒ８４８、ロキソリビン、イサトルビン(isatorbin)ならびに化学療法剤などのあらゆる免疫刺激小分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
抗原は、病原体と関連する抗原、癌と関連する抗原、自己免疫疾患と関連する抗原、および、限定することなく、獣医学的または小児科学的疾病などの他の疾病と関連する抗原を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、抗原は、ワクチン効果を生み出す。本発明の目的のために、用語「〜と関連する」は、病原体、癌、自己免疫疾患、食物アレルギー、呼吸器系アレルギー、ぜんそくまたは他の疾病が存在するとき、抗原が存在するが、病原体、癌、自己免疫疾患、食物アレルギー、呼吸器系アレルギー、または疾病が存在しないとき、いずれかが存在しないか、または低減された量で存在することを意味する。
【００８０】
免疫刺激オリゴヌクレオチドは、抗原に共有結合する、またはそうでなければ作動可能なように(operatively)抗原と関連する。本明細書中では、用語「作動可能なように〜と関連する」は、免疫刺激オリゴヌクレオチドおよび抗原の両方の活性を維持するあらゆる関連のことをいう。かかる作動的関連の非限定の例は、同じリポソームまたは他のかかる送達ビヒクルまたは試薬の一部であることを含む。免疫刺激オリゴヌクレオチドが抗原に共有結合する態様において、かかる共有結合は、好ましくはオリゴヌクレオチドは、免疫刺激オリゴヌクレオチドの利用できる５’末端以外の免疫刺激のあらゆる位置にある。例えば、抗原は、ヌクレオシド間結合で結合してもよく、または非ヌクレオチドリンカーに結合してもよい。代わりに、抗原自体が非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
【００８１】
第２の面において、本発明は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体および生理学的に許容し得る担体を含む医薬製剤を提供する。本明細書中では、用語「生理学的に許容し得る」は、免疫調節オリゴヌクレオチドの効果を妨害せず、細胞、細胞培養、組織または生命体などの生物学的システムに適合する材料のことをいう。好ましくは、生物学的システムは、脊椎動物などの生物である。
【００８２】
本明細書中では、用語「担体」は、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、脂質、または医薬製剤において使用される当該技術分野で周知の他の材料を包含する。担体、賦形剤または希釈剤の特徴は、特定の用途のための投与経路に依存することが理解される。これらの材料を含有する薬学的に許容し得る製剤の調製は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
【００８３】
第３の面において、本発明は、脊椎動物において免疫応答を生じさせるための方法を提供し、かかる方法は、脊椎動物に本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体を投与することを含む。いくつかの態様において、脊椎動物は、哺乳動物である。本発明の目的のために、用語「哺乳動物」は、ヒトを含むことを明確に意図する。ある態様において、免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体は、免疫刺激を必要とする脊椎動物に投与される。
【００８４】
本発明のこの面の方法において、免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体の投与は、あらゆる好適な経路によるものであり得、非経口、経口、舌下、経皮、局所、粘膜、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃によるもの、皮膚パッチまたは点眼薬または口腔洗浄薬の形態を含むがこれらに限定されない。免疫調節オリゴヌクレオチドの治療的組成物の投与は、症状または疾病の代替マーカーを軽減させるのに有効な投薬量および時間で、既知の手順を使って行うことができる。全身投与するとき、治療的組成物は、好ましくは免疫調節オリゴヌクレオチドが約０．０００１マイクロモルから約１０マイクロモルまでの血中濃度に到達するのに十分な投薬量で投与する。限局化投与のために、これよりもさらに低濃度が有効であり得、より高濃度に耐性があり得る。好ましくは、免疫調節オリゴヌクレオチドの総投薬量は、患者あたり１日あたり約０．００１ｍｇから体重１ｋｇあたり１日あたり約２００ｍｇまでの範囲である。治療効果のある量の１または２以上の本発明の治療的組成物を個人に１回の処置のエピソードとして同時にまたは連続して投与することが望ましいといえる。
【００８５】
ある態様において、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体は、免疫応答の特異性または大きさを増強させるために、ワクチン、抗体、細胞障害性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチンおよび／またはアジュバントと組み合わせて投与される。これらの態様において、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、アジュバントとしてさまざまに作用し、および／または直接の免疫刺激効果を発揮することができる。
【００８６】
免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体あるいはワクチンのいずれか、または両方は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、コレラ毒素Ｂサブユニットまたはその他の免疫原性担体タンパク質などの免疫原性タンパク質に任意に結合してもよい。あらゆる多量のアジュバントを使用してもよく、フロイド完全アジュバント、ＫＬＨ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ミョウバン、およびＱＳ−２１を含むサポニン、イミキモド、Ｒ８４８、またはそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【００８７】
本発明のこの面の目的のために、用語「〜と組み合わせて」は、同じ患者における同じ疾病の処置過程中を意味し、同時投与、ならびに一時的に数日まで間隔を空ける順序を含むあらゆる順序で免疫調節オリゴヌクレオチドおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントを投与することを含む。かかる併用処置はまた、免疫調節オリゴヌクレオチド、および／またはワクチン単独、および／またはアジュバント単独の単回投与より多いものを含んでもよい。免疫調節オリゴヌクレオチドおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントの投与は、同じまたは異なる経路によるものでもよい。
【００８８】
本発明のこの面の方法は、免疫システムのモデル調査に有用である。本方法はまた、ヒトまたは動物の疾病の予防または治療的処置に有用である。例えば、本方法は、小児科学的および獣医学的ワクチン用途に有用である。
【００８９】
第４の面において、本発明は、疾病または疾患を有する患者を治療的に処置するための方法を提供し、かかる方法は、患者に本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体を投与することを含む。さまざまな態様において、処置される疾病または疾患は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病である。病原体は、細菌、寄生生物、真菌類、ウィルス類、ウイロイド類およびプリオン類を含む。投与は、本発明の第３の面について記載したように行われる。
【００９０】
本発明の目的のために、用語「アレルギー」は、食物アレルギーおよび呼吸器系アレルギーを含むが、これらに限定されない。用語「気道炎症」は、ぜんそくを含むが、これに限定されない。本明細書中では、用語「自己免疫疾患」は、「自己」タンパク質が免疫システムにより攻撃を受ける疾患のことをいう。かかる用語は、自己免疫ぜんそくを含む。
【００９１】
第５の面において、本発明は、疾病または疾患を予防する方法を提供し、かかる方法は、患者に本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体を投与することを含む。さまざまな態様において、予防される疾病または疾患は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病である。病原体は、細菌、寄生生物、真菌類、ウィルス類、ウイロイド類、およびプリオン類を含む。投与は、本発明の第３の面について記載したように行われる。
【００９２】
本発明のこの面の方法のいずれかにおいて、免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体は、免疫調節オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を減少させない疾病または状態を処置するのに有用なその他の剤と組み合わせて投与することができる。本発明の方法のいずれかにおいて、疾病または状態を処置するのに有用な剤は、ワクチン、抗原、抗体、細胞障害性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、免疫応答の特異性または大きさを増強させるためのＤＮＡワクチンおよび／またはアジュバント、またはサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチドおよび修飾アミノ酸を含むペプチドなどの共刺激性分子を含むが、これらに限定されない。例えば、癌の処置において、免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体は、化学療法化合物またはモノクローナル抗体と組み合わせて投与されてもよいと考えられる。代わりに、剤は、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含むことができる。これらの態様において、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、アジュバントとしてさまざまに作用し、および／または直接の免疫刺激効果を発揮することができる。
【００９３】
本発明の方法において使用される化学療法剤は、以下のものを含むが、これらに限定されない。ゲムシタビン、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、非糖含有クロロエチルニトロソウレア、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン(fragyline)、メグラミンＧＬＡ、バルルビシン、カルムスタイン(carmustaine)およびポリフェルポサン(poliferposan)、MMI270、BAY 12-9566、RASファルネシル(farnesyl)トランスフェラーゼ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、MMP、MTA/LY231514、LY264618/ロメテキソール(Lometexol)、グラモレク(Glamolec)、CI-994、TNP-470、ハイカムチン(Hycamtin)/トポテカン、PKC412、バルスポダール(Valspodar)/PSC833、ノバントロン/ミトキサントロン、メタレット(Metaret)/スラミン、バチマスタット、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA 2516/マルミスタット(Marmistat)、BB2516/マルミスタット、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、レモナールDP 2202、FK 317、ピシバニール/OK-432、AD 32/バルルビシン、メタストロン/ストロンチウム誘導体、テモダール(Temodal)/テモゾロマイド(Temozolomide)、エバセット(Evacet)/リポソームドキソルビシン、ユータキサン(Yewtaxan)/パクリタキセル(Paclitaxel)、タキソール/パクリタキセル、キセロード(Xeload)/カペシタビン、フルツロン/ドキシフルリジン、シクロパックス(Cyclopax)/経口パクリタキセル、経口タキソイド、SPU-077/シスプラチン、HMR 1275/フラボピリドール、CP-358 (774)/EGFR、CP-609 (754)/RAS癌遺伝子阻害剤、BMS-182751/経口プラチナ、UFT(テガフール/ウラシル)、エルガミゾール(Ergamisol)/レバミゾール、エニルウラシル/776C85/5FUエンハンサ、カンプト/レバミゾール、カンプトサール(Camptosar)/イリノテカン、ツモデックス(Tumodex)/ラルチトレキセド(Raltitrexed)、ロイスタチン/クラドリビン、パキセックス(Paxex)/パクリタキセル、ドキシル(Doxil)/リポソームドキソルビシン、カエリックス(Caelyx)/リポソームドキソルビシン、フルダラ(Fludara)/フルダラビン、ファルマルビシン(Pharmarubicin)/エピルビシン、デポサイト(DepoCyt)、ZD1839、LU 79553/ビス−ナフタリミド、LU 103793/ドラスタチン、カエチックス(Caetyx)/リポソームドキソルビシン、
【００９４】
ジェムザール(Gemzar)/ゲムシタビン、ZD 0473/アノーメッド(Anormed)、YM 116、ヨウ素シード、CDK4およびCDK2阻害剤、PARP阻害剤、D4809/デキシフォサミド(Dexifosamide)、イフェス(Ifes)/メスネックス(Mesnex)/イホスファミド(Ifosfamide)、ブモン(Vumon)/テニポシド(Teniposide)、パラプラチン/カルボプラチン、プランチノール(Plantinol)/シスプラチン、ベペシド(Vepeside)/エトポシド、ZD 9331、タキソテール(Taxotere)/ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン類似体、ニトロソ尿素、メルフェランおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル(Chlorombucil)、シタラビンＨＣｌ、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、リン酸エストラムスチンナトリウム、エトポシド (VP16-213)、フロクスウリジン、フルオロウラシル(5-FU)、フルタミド、ヒドロキシ尿素 （ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、アルファ−２ｂ、酢酸ロイプロリド（LHRH-放出因子類似体）、ロムスチン(CCNU)、メクロレタミンHCl (ナイトロジェンマスタード)、メルカプトプリン、メスナ(Mesna)、ミトーテン(Mitotane)(o.p'-DDD)、ミトキサントロンHCl、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンHCl、ストレプトゾシン、タモキシフェンクエン酸塩、チオグアニン、チオテパ、ビンブラスチン硫酸塩、アムサクリン(Amsacrine)(m-AMSA)、アザシチジン(Azacitidine)、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン(HMM)、インターロイキン2、ミトグアゾン(Mitoguazone)(メチル-GAG；メチルグリオキサールビスグアニルヒドラゾン；MGBG)、ペントスタチン(Pentostatin) (2'デオキシコホルマイシン)、セムスチン(Semustine)(メチル-CCNU)、テニポシド(VM-26)、ビンデシン硫酸塩、ラパチニブ(Lapatinib)(EGFRおよびErbB-2(Her2/neu)二重チロシンキナーゼ阻害剤(GSK))、ゲフィチニブ(Gefitinib)(ZD1839/イレッサ(Iressa)(AstraZeneca))、エルロチニブ(Erlotinib)(タルセバ(Tarceva)−EGFR/HER1阻害剤(Genentech))、サリドマイド((サリドマイド)−抗血管新生剤)、イマチニブ(グリベック(Glivec))およびバタラニブ(Vatalanib)(VEGFRチロシンキナーゼ阻害剤)、ソラフェニブ(Sorafenib)(Rafキナーゼ阻害剤(Bayer))、VX-680 (オーロラキナーゼ阻害剤)、ステント(Sutent)(受容体型チロシンキナーゼ(RTK)阻害剤(Pfizer))が含まれるが、これらに限定されないEGFRおよびVEGF阻害剤などのチロシンキナーゼ阻害剤、ボルテゾミブ(Bortezomib)((ベルケード(Velcade))プロテオソーム阻害剤)、テモゾロマイド(Temozolomide)((テモダール(Temodal))アルキル化剤)、およびインターフェロンアルファ(Intron A、Roferon A)。
【００９５】
抗体（特にモノクローナル抗体）の形態での受動的免疫療法は、抗癌剤としての多大な研究開発の対象であった。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中では単一分子組成物の抗体分子のことをいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープについて単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する単一の結合特異性を示す抗体のことをいう。抗癌剤の例には、パノレックス(Panorex)(Glaxo-Welicome)、リツキサン(Rituxan)(IDEC/Genentech/Hoffman la Roche)、マイロターグ(Mylotarg)(Wyeth)、キャンパス(Campath)(Millennium)、ゼヴァリン(Zevalin)(IDECおよびSchering AG)、ベキサール(Bexxar)(Corixa/GSK)、エルビタックス(Erbitux)(Imclone/BMS)、アバスチン(Avastin)(Genentech)、ハーセプチン(Herceptin)(Genentech/Hoffman la Roche)、セツキシマブ(Cetuximab)(Imclone)およびパニツムマブ(Panitumumab)(Abgenix/Amgen)が含まれるが、これらに限定されない。抗体はまた、癌抗原を（免疫学的意味で）模倣するように思われる抗イディオタイプ抗体を利用する能動的免疫療法において用いてもよい。モノクローナル抗体は、組み換えＤＮＡ技術の当業者に既知の方法により生じさせることができる。
【００９６】
以下の例は、本発明のある態様をさらに説明することを意図し、本発明の範囲を限定することは意図しない。
【００９７】
例
例１：免疫刺激部分を含有するオリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを、１μｍｏｌ〜０．１ｍＭの規模で自動ＤＮＡ合成装置（OligoPilot II、AKTA、(Amersham)および／またはExpedite 8909 (Applied Biosystem)）を使って、図３および４に概説された直線的合成または平行合成手順に従って合成した。
【００９８】
５’−ＤＭＴ ｄＡ、ｄＧ、ｄＣおよびＴホスホロアミダイトは、Proligo（Boulder, CO）から購入した。５’−ＤＭＴ ７−デアザ−ｄＧおよびアラＧホスホロアミダイトは、Chemgenes（Wilmington, MA）から得た。ＤｉＤＭＴ−グリセロールリンカーの固体の支持体は、Chemgenesから得た。１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンアミダイトは、Glen Research（Sterling, VA）から得た。２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドアミダイトは、Promega（Obispo, CA）から得た。すべてのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格修飾された。
【００９９】
すべてのヌクレオシドホスホロアミダイトは、３１Ｐおよび１Ｈ ＮＭＲスペクトルによって特徴付けた。修飾ヌクレオシドは、供給元に推奨される通常の共役サイクルを使って特定の部位で取り入れた。合成後、オリゴヌクレオチドを濃縮水酸化アンモニウムを使って脱保護し、逆相ＨＰＬＣ、脱トリチル化、続いて透析により精製した。ナトリウム塩形態として精製したオリゴヌクレオチドは、使用前に凍結乾燥した。純度をＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより試験した。内毒素レベルをＬＡＬテストにより決定したところ、１．０ＥＵ／ｍｇを下回った。
【０１００】
例２：マウス脾臓細胞培養
４〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスは、Taconic Farms（Germantown, NY)から得、IderaのＩＡＣＵＣ承認の動物処置に従って維持した。本明細書に報告されたすべての動物実験は、IderaのＩＡＣＵＣガイドラインおよび承認された手順に従って行われた。４〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞を調製し、ＲＰＭＩ完全培地で培養した。マウス脾臓細胞を５×１０６個の細胞／ｍｌで２４ウェルディッシュに蒔いた。ＴＥ緩衝剤（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解したＩＭＯを、最終濃度が０．０３、０．１、０．３、１．０、３．０または１０μｇ／ｍｌとなるよう細胞培養液に添加した。そして、細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、上清をＥＬＩＳＡアッセイのために収集した。
【０１０１】
上清中のＩＬ−１２およびＩＬ−６レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図５Ａから５Ｄに示す。サイトカイン抗体および標準物質を含む必要な試薬は、BD Pharmingenから購入した。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよび基質は、KPLからであった。
【０１０２】
例３：ヒトＰＢＭＣの単離
新しく採血したばかりの健康なボランティアの血液からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（CBR Laboratories, Boston, MA）を、フィコール密度勾配遠心法（Histopaque-1077、Sigma）により単離した。
【０１０３】
例４：サイトカインＥＬＩＳＡ
ヒトＰＢＭＣを、５×１０６個の細胞／ｍｌを使って４８ウェルプレートに蒔いた。ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４；Mediatech）に溶解したＩＭＯを、最終濃度が１０．０μｇ／ｍｌとなるよう細胞培養液に添加した。そして、細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、上清をＥＬＩＳＡアッセイのために収集した。実験を、３つ組のウェルで行った。ＩＬ−６およびＩＬ−１０レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。サイトカイン抗体および標準物質を含む必要な試薬は、PharMingenから購入した。
【０１０４】
例５：ＨＥＫ２９３細胞培養：
ＨＥＫ２９３／ｍＴＬＲ９細胞（Invivogen, San Diego, CA）を、５％ＣＯ２インキュベータ内で１０％の加熱不活性化したＦＢＳを補充した２５０μｌ／ウェルのＤＭＥＭを入れた４８ウェルプレートで培養した。
【０１０５】
例６：レポーター遺伝子形質転換
８０％コンフルエンスで、培養液を、培地中４μｌ／ｍｌのリポフェクタミン（Invitrogen, CA）の存在下で４００ｎｇ／ｍｌのＳｅａｐレポータープラスミド（pNifty2-Seap）（San Diego CA）により一過性形質転換した。プラスミドＤＮＡおよびリポフェクタミンを、無血清培地に別々に希釈し、室温で５分間インキュベートした。インキュベート後、希釈したＤＮＡおよびリポフェクタミンを混合し、混合物を室温で２０分間インキュベートした。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡおよび１μｌのリポフェクタミンを含有する２５μｌのＤＮＡ／リポフェクタミン混合物を細胞培養プレートの各ウェルに添加し、培養を４時間続けた。
【０１０６】
例７：免疫調節オリゴヌクレオチド処置
形質転換後、培地を新鮮な培地と交換し、刺激オリゴである、免疫調節オリゴヌクレオチドを個々に培養液に添加し、培養を１８時間続けた。
【０１０７】
例８：ＳＥＡＰアッセイ
オリゴである、免疫調節オリゴヌクレオチドの処置の最後に、３０μｌの培養上清を各処置から採取し、ＳＥＡＰアッセイに使用した。製造元の手順（Invivogen）に従い、アッセイを行った。シグナルが、プレートリーダーにより４０５ｎｍで検出された。結果を図７に示し、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、独特のＴＬＲ９活性プロフィールが生じることを実証する。
【０１０８】
例９：マウス血清サイトカインレベルの評価
５〜６週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスは、Taconic Farms、Germantown、NYから得、Idera PharmaceuticalのＩＡＣＵＣ承認の動物処置に従って維持した。マウス（ｎ＝２〜３）に、個々の免疫調節オリゴヌクレオチドを２５または１００μｇの用量または１ｍｇ／ｋｇ（単一用量）で皮下注射（ｓ．ｃ）した。血清を、免疫調節オリゴヌクレオチド投与の４時間後に後眼窩出血により収集し、ＩＬ−１２をサンドイッチＥＬＩＳＡにより決定した。結果を図８に示し、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与により、独特のＩＬ−１２プロフィールが生じることを実証する。サイトカイン抗体および標準物質を含むすべての試薬は、PharMingen（San Diego, CA）から購入した。
【０１０９】
例１０：マウス脾臓細胞培養：
Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞を調製し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が入ったＲＰＭＩ １６４０、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミン（HyClone, Logan, UT）からなるＲＰＭＩ完全培地で培養した。マウス脾臓細胞を、５×１０６個の細胞／ｍｌで２４ウェルプレートに蒔いた。ＴＥ緩衝剤［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１ｍＭのＥＤＴＡ］に溶解した個々の免疫調節オリゴヌクレオチドを、最終濃度が３または１０ｍｇ／ｍｌとなるよう細胞培養液に添加した。そして、細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、上清をアッセイ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によるサイトカイン分析のために収集した。
【０１１０】
上清中のＩＬ−１２およびＩＬ−６レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。サイトカイン抗体および標準物質を含む必要な試薬は、BD Pharmingen(San Diego, CA)から購入した。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびＴＭＢ基質は、それぞれSigma (St. Louis, MO)およびKPL（Gaithersburg, MD）からであった。
【０１１１】
例１１：ヒトＢ細胞増殖アッセイ：
ヒトＰＢＭＣから精製した約１×１０５個のＢ細胞を、異なる濃度の免疫調節オリゴヌクレオチドにより６４時間刺激し、０．７５μＣｉの［３Ｈ］−チミジンによりパルスし、８時間後に回収した。［３Ｈ］−チミジンの取り込みを、シンチレーションカウンタにより計測し、カウント毎分（ｃ．ｐ．ｍ．）として表した。
【０１１２】
例１２：ヒトマルチプレックスサイトカインＥＬＩＳＡ：
ヒトＰＢＭＣを、５×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートに蒔いた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した免疫調節オリゴヌクレオチドを、最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるよう細胞培養液に添加した。そして、細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。上清を、Luminex−マルチプレックスＥＬＩＳＡシステムを使ってリストにあるサイトカインについて分析をした。ヒトマルチプレックスキットは、invitrogenから得た。
【０１１３】
例１３：マウス脾腫アッセイ
メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週、１９〜２１ｇｍ）を、３匹のマウスのグループに分けた。免疫調節オリゴヌクレオチドＤＮＡを滅菌ＰＢＳに溶解し、マウスに５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与（ＳＣ）した。７２時間後、マウスを屠殺し、脾臓を回収し、秤量した。結果を図９に示し、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与により、独特の免疫応答プロフィールが生じることを実証する。
【０１１４】
例１４：ＯＶＡ感作マウス脾臓細胞培養アッセイ
４〜６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスは、Taconic（Germantown, NY）から得た。マウスに、１００μＬのImjectAlumアジュバント（Pierce)と混合した２０μｇのニワトリ卵白アルブミン（OVA；Sigma）の１００μＬのＰＢＳの腹腔内注射を０、７日目に与え、１０μｇのＯＶＡの４０μｌのＰＢＳは１４および２１日目に鼻腔内にチャレンジした。マウスを、最後の挑戦の７２時間後、ＣＯ２吸入により屠殺した。
【０１１５】
脾臓を摘出し、単細胞の懸濁液を上記のように調製した。脾臓細胞を、異なる濃度の免疫調節オリゴヌクレオチドで２時間処置し、続いて１００μｇ／ｍＬのＯＶＡで処置した。
【０１１６】
７２時間後、上清を収集し、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１２、およびＩＦＮ−αレベルを上記のようにＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１０Ａ〜１０Ｄに示し、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、免疫システム活性化因子（例えば卵白アルブミン）が存在しても、塩基組成物および投与するオリゴヌクレオチドの量により様々である独特のサイトカイン／ケモカインプロフィールが生じることを実証する。
【０１１７】
例１５：化学療法剤と組み合わせた免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo抗癌活性
ＰＣ３細胞を、ヒト前立腺癌モデル（ＰＣ３）を確立するために、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が入った９０％のHam's、Ｆ１２Ｋ培地で、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンの存在下で培養することができる。オスの無胸腺マウス、４〜６週齢（Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, MD）を、研究前に環境適応のため、６日間収容することができる。培養したＰＣ３細胞は、単層培養から回収し、Ham's、Ｆ１２Ｋ培地（１０％ＦＢＳ）で洗浄し、ＦＢＳフリーのHam's、Ｆ１２Ｋ培地：Matrigel基底膜マトリックス（Becton Dickinson Labware, Bedford, MA）（５：１；Ｖ／Ｖ）に再懸濁し、各マウスの左鼠径部内に皮下注射（５×１０６個の細胞、総量０．２ｍｌ）することができる。動物は、一般的な臨床的観察、体重、および腫瘍成長により監視することができる。腫瘍成長は、ノギスを用いて、移植片の２つの直交する直径の測定により監視することができる。腫瘍の質量（グラム重量）は、式１／２ａ×ｂ２により計算することができ、ここで「ａ」は長径（ｃｍ）、「ｂ」は短径（ｃｍ）のことである。平均腫瘍サイズがおよそ８０ｍｇに達するとき、ヒト癌異種移植片を有する動物を無作為に処置群および対照群に分ける（５匹／群）。対照群は、滅菌生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）のみを受けることができる。生理食塩水に無菌で溶解した本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、０．５または１．０ｍｇ／ｋｇ／日、３用量／週の用量で皮下注射により投与することができる。化学療法剤は、腹腔内注射により１６０ｍｇ／ｋｇを０および３日目に２回与えることができる。
【０１１８】
例１６：免疫調節部分を含有するオリゴヌクレオチドの合成
２’−デオキシ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２，７（８Ｈ）−ジオン（ｄＦ）または２’−デオキシプソイドイソシチジン（Ψ−イソ−ｄＣ）修飾物を有する免疫調節オリゴヌクレオチドを、PerSeptive Biosystem 8909 Expedite DNA合成装置で、β−シアノエチルホスホロアミダイト化学を用い２μｍｏｌの規模で合成した。ＣＰＧ−固体の支持体に結合したジ−ＤＭＴ保護されたグリセリルリンカーは、ChemGenes Corporation（Wilmington, MA）から得た。ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、およびＴの３’−ホスホロアミダイトは、Applied Biosystemsから得た。一方、ｄｍｆ−ｄＧホスホロアミダイトは、Glen Research（Sterling, VA）から得た。ｄＦおよびΨ−イソ−ｄＣのホスホロアミダイトは、Berry & Associates（Dexter, MI）から得た。Beaucage試薬は、ホスホロチオエート骨格修飾を得るために、酸化剤として使用した。供給元が推奨する合成手順を、ｄＦおよびΨ−イソ−ｄＣホスホロアミダイトの取り入れおよび脱保護に使用した。合成後、免疫調節オリゴヌクレオチドを脱保護し、「トリチルオン（trityl on）」ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、脱トリチル化し、洗浄用の米国薬局方(United States Pharmacopeia)品質の滅菌水（Braun, Irvine, CA）に対して透析した。免疫調節オリゴヌクレオチドを凍結乾燥し、再度蒸留水に溶解し、濃度を、ＵＶ吸収を２６０ｎｍで測定することにより決定した。すべての合成した化合物の純度を、ＰＡＧＥを変性させることにより決定した。配列の完全性を、分子量についてマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法により特徴付けた。すべての免疫調節オリゴヌクレオチド（表４Ａ）を合成し、内毒素汚染を最小限に抑えるため、同一条件下で精製した。
【０１１９】
例１７：ＣｐＧモチーフ中にｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣを含有する免疫調節オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９を活性化する
１０μｇ／ｍｌの濃度の免疫調節オリゴヌクレオチドおよび対照化合物による、マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞の活性化。ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣ修飾を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのＴＬＲ９を活性化させる能力を、マウスＴＬＲ９を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞において研究した。ヒト分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子は、ＮＦ−κＢレポーターとして使用される。結果を、ＰＢＳ対照に対するＮＦ−κＢ活性の倍数の増加として表す（図１１）。ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣを含有した免疫調節オリゴヌクレオチド２７および２８（配列番号２７および２８）（表４Ａ）は、ＮＦ−κＢ活性の増加により示されるように、ＴＬＲ９を活性化した。これらの結果は、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣ修飾は耐性があり、Ｃ−位置で機能的であることを実証し、さらに、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、独特のＴＬＲ９活性プロフィールが生じることを実証する（図１１）。
【０１２０】
例１８：ＣｐＧモチーフ中にｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣを含有する免疫調節オリゴヌクレオチドは、マウス脾臓細胞培養においてサイトカインの分泌を誘発する
Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養におけるＩＭＯによるサイトカイン分泌の誘発。Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞を、単独で（Ｍ）またはさまざまな濃度の免疫調節オリゴヌクレオチドの存在下、培地で２４時間培養し、培養上清中の分泌されたＩＬ−１２（図１２Ａ）およびＩＬ−６（図１２Ｂ）のレベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した。示したデータは、３および１０μｇ／ｍｌの濃度の免疫調節オリゴヌクレオチドである（図１２Ａおよび１２Ｂ）。ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣを含有する免疫調節オリゴヌクレオチド２７（配列番号２７）および２８（配列番号２８）は、対照の免疫調節オリゴヌクレオチド２９（配列番号２９）と比較して、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養におけるＩＬ−１２およびＩＬ−６の分泌を誘発した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。これらの結果は、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣ修飾物を有する免疫調節オリゴヌクレオチドは免疫細胞によって耐性がありそこで活性があることを実証する。さらに、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、塩基組成物および投与するオリゴヌクレオチドの量により様々である独特のＩＬ−６およびＩＬ−１２プロフィールが生じることを実証する。
【０１２１】
例１９：ＣｐＧモチーフ中にｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣを含有する免疫調節オリゴヌクレオチドは、マウスにおいて脾腫およびサイトカインをin vivo誘発する
５ｍｇ／ｋｇ用量の免疫調節オリゴヌクレオチド、対照化合物、またはＰＢＳのｓ．ｃ．投与を受けたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける脾腫（図１３Ａ）。脾臓重量の変化を、免疫調節オリゴヌクレオチド投与７２時間後に決定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＩＬ−１２（１３．Ｂ）の分泌は、１ｍｇ／ｋｇの用量でのｓ．ｃ．投与の後に免疫調節オリゴヌクレオチドにより誘発された。血液を、免疫調節オリゴヌクレオチド投与４時間後に収集し、血清中のＩＬ−１２レベルを、ＥＬＩＳＡにより決定した。ＣｐＧオリゴ投与後のマウスの脾臓重量の増加は、免疫調節活性の指標である。ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣを含有するマウスおよびヒト特異的な免疫調節オリゴヌクレオチドは両方、対照の免疫調節オリゴヌクレオチド４（配列番号４）または５（配列番号５）を受けたマウスと比べて、脾臓の拡大を示した（図１３Ａ）。ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣ修飾を有する、マウス特異的な免疫調節オリゴヌクレオチド２２（配列番号２２）または２３（配列番号２３）を受けたマウスは、ヒト特異的な免疫調節オリゴヌクレオチド２７（配列番号２７）または２８（配列番号２８）を注射したマウスよりも大きな脾臓重量の増加をもたらした。これらの結果はまた、ｄＦ修飾を有する、免疫調節オリゴヌクレオチド２２（配列番号２２）または２８（配列番号２８）を受けたマウスが、それぞれΨ−イソ−ｄＣ修飾を有する免疫調節オリゴヌクレオチド２３（配列番号２３）または２７（配列番号２７）を注射したマウスよりも大きな脾臓重量の増加をもたらしたことを示す。さらなるin vivoのサイトカイン誘発プロフィールの試験は、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣ修飾物を含有したマウスおよびヒト特異的な免疫調節オリゴヌクレオチド両方が、免疫調節オリゴヌクレオチド投与４時間後にマウスにおけるＩＬ−１２の上昇を誘発したことを明らかにした（図１３Ｂ）。脾腫アッセイでみられたように、マウス特異的な免疫調節オリゴヌクレオチド２２（配列番号２２）は、免疫調節オリゴヌクレオチド２３（配列番号２３）よりも高いレベルのＩＬ−１２を誘発した。これらの結果は、両方の修飾物（ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣ）に耐性があり、ＴＬＲ９を活性化するが、免疫応答のレベルは異なること、また、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与により、独特の免疫応答プロフィールが生じることを実証する。
【０１２２】
例２０：免疫調節オリゴヌクレオチドにより誘発されたヒトＢ細胞増殖
健康なヒトのボランティアから得られたＰＢＭＣから単離されたヒトＢ細胞を、さまざまな濃度の免疫調節オリゴヌクレオチドにより刺激し、３Ｈ−チミジン取込みを、シンチレーション測定により決定した（図１４）。図１４は、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与により、塩基組成物および投与するオリゴヌクレオチドの量により様々である独特の細胞増殖プロフィールが生じることを実証する。
【０１２３】
例２１：免疫調節オリゴヌクレオチドによるサイトカイン／ケモカイン誘発
ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＭＣＰ−１の誘発を、ヒトＰＢＭＣ細胞培養において免疫調節オリゴヌクレオチド２６（配列番号２６）、２７（配列番号２７）、２８（配列番号２８）、または対照免疫調節オリゴヌクレオチド２９（配列番号２９）により決定した（表５）。
【表６】
【０１２４】
例２２：ＣｐＧモチーフ中にｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣを含有する免疫調節オリゴヌクレオチドは、ヒトＰＢＭＣおよびＢ細胞を活性化する
ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣ修飾物を有する免疫調節オリゴヌクレオチドのヒトＰＢＭＣを活性化させるおよびサイトカイン生成を誘発する能力を、さらに試験した。これらのアッセイにおいて、ヒト特異的なモチーフを含有した免疫調節オリゴヌクレオチド２７（配列番号２７）および２８（配列番号２８）を使用した（表４Ａ）。免疫調節オリゴヌクレオチド２７（配列番号２７）および２８（配列番号２８）は両方、対照２９（配列番号２９）よりも、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＭＣＰ−１を誘発し（表５）、修飾物は耐性があり、ヒトＴＬＲ９を活性化することを実証した。免疫調節オリゴヌクレオチド２７（配列番号２７）および２８（配列番号２８）は両方、対照の免疫調節オリゴヌクレオチド２９（配列番号２９）と比較して用量依存性Ｂ細胞増殖を誘発した（図１４）。
【０１２５】
同等物
前述の発明が、明確化および理解を目的として詳細に記載されている一方、当然のことながら、当業者であれば、本発明の開示を読むことにより、形態および詳細のさまざまな変形を、本発明の真の範囲および特許請求の範囲から逸脱することなく想到することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの直線的合成に好適な一群の代表的な小分子リンカーを表す図である。
【図２】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの平行合成に好適な一群の代表的な小分子リンカーを表す図である。
【図３】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの直線的合成のための合成スキームを表す図である。
【図４】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの平行合成のための合成スキームを表す図である。
【図５Ａ】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養におけるＩＬ−１２およびＩＬ−６レベルを示す図である。
【図５Ｂ】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養におけるＩＬ−１２およびＩＬ−６レベルを示す図である。
【図５Ｃ】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養におけるＩＬ−１２およびＩＬ−６レベルを示す図である。
【図５Ｄ】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養におけるＩＬ−１２およびＩＬ−６レベルを示す図である。
【図６Ａ】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のヒトＰＢＭＣ培養におけるＩＬ−６レベルを示す図である。
【図６Ｂ】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のヒトＰＢＭＣ培養におけるＩＬ−１０レベルを示す図である。
【０１２７】
【図７】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＨＥＫ２９３細胞におけるＴＬＲ９活性を、それらのＮＦ−κＢ活性により測定し、示す図である。
【図８】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの皮下（ｓ．ｃ．）投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＩＬ−１２レベルを示す図である。
【図９】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける脾臓重量を示す図である。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｄは本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＯＶＡ感作マウス脾臓細胞におけるＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γレベルを示す図である。
【図１１】免疫調節オリゴヌクレオチドおよび対照化合物１０ｍｇ／ｍｌの濃度による、マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞の活性を実証する図である。
【図１２】図１２Ａ〜図１２ＢはＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養における本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによるサイトカイン分泌の誘発を実証する図である。
【図１３】図１３Ａは動物がｓ．ｃ．投与で免疫調節オリゴヌクレオチド、対照化合物、またはＰＢＳを受けた７２時間後の脾腫を実証する図である。図１３Ｂは動物がｓ．ｃ．投与後に免疫調節オリゴヌクレオチドにより誘発されたＩＬ−１２分泌を実証する図である。
【図１４】免疫調節オリゴヌクレオチドにより誘発されたヒトＢ細胞増殖を実証する図である。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2005年12月20日出願の米国仮出願番号第60/752,335号および2006年8月4日出願の米国仮出願番号第60/821,458号の利益を主張する。上記出願の全体的な教示は、本明細書に参照として組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は概して、オリゴヌクレオチドを免疫調節剤として使用する免疫学および免疫療法用途の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、新規な化学組成物およびそれらの使用方法に関する。かかる組成物は、ＴＬＲ９媒介免疫応答を通じて独特のサイトカイン／ケモカインプロフィールを生じさせるのに有効である。
【０００３】
関連技術の概要
免疫応答は、応答に関与する細胞のサブセットに基づき先天性および適応的応答の両方を伴う。例えば、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の遅延型過敏性および活性などの古典的な細胞媒介機能に関与するＴヘルパー（Ｔｈ）細胞は、Ｔｈ１細胞であるのに対し、Ｂ細胞活性のためにヘルパー細胞として関わるＴｈ細胞は、Ｔｈ２細胞である。免疫応答の種類は、抗原曝露に応答して生成されるサイトカインに影響を受ける。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞により分泌されるサイトカインの差は、これらの２種のサブセットの異なる生物学的機能の結果であり得る。
【０００４】
Ｔｈ１細胞は、抗原への身体の先天性応答に関与する（例えばウィルス感染、細胞内病原体、および腫瘍細胞）。結果は、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの分泌およびＣＴＬの同時活性である。Ｔｈ２細胞は、細菌および寄生生物に応答して活性化されることが知られ、ＩＬ−４およびＩＬ−５の分泌を通して身体の適応的免疫応答（例えばＩｇＥ生成および好酸球活性）を媒介し得る。
【０００５】
Ｔｈ１免疫応答は、哺乳動物において、例えば非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する細菌または合成ＤＮＡの導入により誘発することができ、免疫応答は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）として知られるある免疫細胞で受容体への特定のオリゴヌクレオチド配列（例えば非メチル化ＣｐＧ）の提示に起因する。これらのＰＲＲの一部は、トール様受容体（ＴＬＲ）である。
【０００６】
トール様受容体（ＴＬＲ）は、先天性免疫応答に密接に関与する。脊椎動物において、トール様受容体と呼ばれる１０種のタンパク質のファミリー（ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０）が、病原体関連分子パターンを認識することが知られている。１０種のうち、ＴＬＲ３、７、８および９は、細胞内のエンドソーム内に限局化し、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）ならびにヌクレオシドおよび核酸代謝産物などの小分子を認識することが知られている。ＴＬＲ３およびＴＬＲ９は、それぞれウィルスおよび細菌ならびに合成ＤＮＡに存在するｄｓＲＮＡおよび非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドなどの核酸を認識することが知られている。細菌ＤＮＡは、免疫システムおよび抗腫瘍活性を活性化することが示されている（Tokunaga T et al., J. Natl. Cancer Inst. (1984) 72:955-962; Shimada S, et al., Jpn. H cancer Res, 1986, 77, 808-816; Yamamoto S, et al., Jpn. J. Cancer Res., 1986, 79, 866-73）。ＣｐＧジヌクレオチドを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する他の研究では、免疫応答を刺激することが示されてきた（Zhao Q, et al., Biochem.Pharmacol. 1996, 26, 173-82）。続く研究により、ＴＬＲ９が細菌および合成ＤＮＡに存在する非メチル化ＣｐＧモチーフを認識することが示された（Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, Kaisho T, Sato S, Sanjo H, Matsumoto M, Hoshino K, Wagner H, Takeda K, Akira S. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. (2000); 408:740-5）。
【０００７】
ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの他の修飾はまた、ＴＬＲ９を介する免疫応答のモジュレータとして作用するその能力に影響を及ぼすことができる（例えば、Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182; Zhao et al., Biochem Pharmacol. (1996) 52:1537-1544; Zhao et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:495-502; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9:3453-3458; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:1051-1054; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:2585-2588; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2001) 11:2263-2267; およびKandimalla et al., Bioorg. Med. Chem. (2001) 9:807-813参照）。加えて、構造活性相関研究により、合成モチーフおよび非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドから生じるものとは明白に異なる、特異的免疫応答プロフィールを誘発する新規のＤＮＡに基づく化合物の同定を可能にしてきた。
【０００８】
【表１】
【０００９】
加えて、ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの他の修飾もまた、免疫応答のモジュレータとして作用するそれらの能力に影響を及ぼすことができる。例えば、
【表１−２】
【００１０】
オリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチドは、様々な分野で使用されており、診断精査、ＰＣＲプライミング、遺伝子発現のアンチセンス阻害、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、およびトール様受容体（ＴＬＲ）をベースとした免疫療法剤が含まれるがこれらに限定されない。より最近では、多くの刊行物は、オリゴデオキシヌクレオチドの免疫調節剤としての使用や、アレルギー、ぜんそく、自己免疫、癌、および感染症などの多くの疾病への免疫療法用途におけるそれらの単独でのまたはアジュバントとしての使用を実証している。
【００１１】
これらの報告から、独特の免疫応答を生じさせることができる新しい化学物質を作り出す必要性が残っていることが明らかである。しかしながら、独特のサイトカイン／ケモカイン媒介免疫応答を生じさせ、ＴＬＲ９のためのリガンドとしても認識される新規な化学物質を生み出すことが課題として残っている。理想的には、この課題は、新しい新しい免疫療法をもたらす、独特の化学塩基を新規な化学物質に組み込むことを通じて達成され、投与の後に独特のサイトカイン／ケモカインプロフィールを生じさせる。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、新規な化学物質および独特のサイトカイン/ケモカイン媒介免疫応答を生じさせるためのそれらの使用を提供する。新規な化学物質は、オリゴヌクレオチド化合物により引き起こされる免疫応答を調節するのに有用である。本発明の方法は、免疫療法用途のために免疫調節オリゴヌクレオチドにより生成したサイトカイン/ケモカインプロフィールを修飾することを可能にする。本発明の発明者は驚くべきことに、免疫調節ジヌクレオチドの修飾によって、生成した免疫応答のプロフィールにおける柔軟性を可能にすることを発見した。
【００１３】
第１の面において、本発明は、式ＣＧで表される免疫調節ジヌクレオチドを含む免疫調節オリゴヌクレオチドであって、式中、Ｃはシトシン、２’−デオキシシトシン、Ｎ３−メチル−ｄＣ、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣであり、Ｇはグアノシン、２’−デオキシグアノシンまたはＮ１−メチル−ｄＧであり、ただしＣがシトシンまたは２’−デオキシシトシンであるとき、ＧはＮ１−メチル−ｄＧであり、さらにＧがグアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであるとき、ＣはＮ３−メチル−ｄＣ、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣである、前記免疫調節オリゴヌクレオチドを提供する。
第２の面において、本発明は、医薬組成物を提供する。これらの組成物は、本発明の第１の面において開示された組成物および薬学的に許容し得る担体を含む。
【００１４】
第３の面において、本発明は、脊椎動物において免疫応答を生じさせるための方法を提供し、該方法は、脊椎動物に本発明の第１または第２の面の免疫調節オリゴヌクレオチドを投与することを含む。
第４の面において、本発明は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法を提供し、かかる方法は、患者に本発明の第１または第２の面の免疫調節オリゴヌクレオチドを投与することを含む。
【００１５】
第５の面において、本発明は、脊椎動物における癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を予防する方法を提供し、かかる方法は、脊椎動物に本発明の第１または第２の面の免疫調節オリゴヌクレオチドを投与することを含む。
【００１６】
図面の簡単な説明
図１は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの直線的合成に好適な一群の代表的な小分子リンカーを表す。
図２は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの平行合成に好適な一群の代表的な小分子リンカーを表す。
【００１７】
図３は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの直線的合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル、ＣＥ＝シアノエチル。
図４は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの平行合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル、ＣＥ＝シアノエチル。
【００１８】
図５Ａ〜５Ｄは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養におけるＩＬ−１２およびＩＬ−６レベルを示す。図５Ａ〜５Ｄはより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、独特のＩＬ−１２およびＩＬ−６プロフィールが生じることを実証する。
図６Ａおよび６Ｂは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のヒトＰＢＭＣ培養におけるＩＬ−６およびＩＬ−１０レベルを示す。図６Ａ〜６Ｂはより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、独特のＩＬ−６およびＩＬ−１０プロフィールが生じることを実証する。
【００１９】
図７は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＨＥＫ２９３細胞におけるＴＬＲ９活性を、それらのＮＦ−κＢ活性により測定し、示す。図７はより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、独特のＴＬＲ９活性プロフィールが生じることを実証する。
図８は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの皮下（ｓ．ｃ．）投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＩＬ−１２レベルを示す。図８はより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与により、独特のＩＬ−１２プロフィールが生じることを実証する。
【００２０】
図９は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける脾臓重量を示す。図９はより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与により、独特の免疫応答プロフィールが生じることを実証する。
図１０Ａ〜１０Ｄは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＯＶＡ感作マウス脾臓細胞におけるＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γレベルを示す。図１０Ａ〜１０Ｄはより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、免疫システム活性化因子（例えば卵白アルブミン）が存在しても、塩基組成物および投与するオリゴヌクレオチドの量により様々である独特のサイトカイン／ケモカインプロフィールが生じることを実証する。
【００２１】
図１１は、免疫調節オリゴヌクレオチドおよび対照化合物１０ｍｇ／ｍｌの濃度による、マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞の活性を実証する。図１１はより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、独特のＴＬＲ９活性プロフィールが生じることを実証する。
図１２Ａ〜１２Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養における本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによるサイトカイン分泌の誘発を実証する。図１２Ａ〜１２Ｂはより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、塩基組成物および投与するオリゴヌクレオチドの量により様々である独特のＩＬ−６およびＩＬ−１２プロフィールが生じることを実証する。
【００２２】
図１３Ａおよび１３Ｂは、動物が免疫調節オリゴヌクレオチド、対照化合物、またはＰＢＳをｓ．ｃ．投与で受けた７２時間後の脾腫（図１３Ａ）、およびｓ．ｃ．投与後に免疫調節オリゴヌクレオチドにより誘発されたＩＬ−１２分泌（図１３Ｂ）を実証する。図１３Ａ〜１３Ｂはより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与により、独特の免疫応答プロフィールが生じることを実証する。
図１４は、免疫調節オリゴヌクレオチドにより誘発されたヒトＢ細胞増殖を実証する。図１４はより一般的に、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、塩基組成物および投与するオリゴヌクレオチドの量により様々である独特の細胞増殖プロフィールが生じることを実証する。
【００２３】
様々な態様の詳細な説明
本発明は、免疫療法用途のための免疫調節剤としてのオリゴヌクレオチドの治療的使用に関する。本明細書中に引用される交付済み特許、特許出願および参考文献は、各々が参照として組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ範囲で本明細書中に参照として組み込まれる。引用される参考文献および本明細書の教示の間の不一致は、本発明の目的のために、後者を優先することとする。
【００２４】
本発明は、成人および小児科学上のヒトおよび獣医学的用途において、限定することなく、癌、自己免疫疾患、ぜんそく、呼吸器系アレルギー、食物アレルギー、および細菌、寄生虫、およびウィルス感染の処置などの免疫療法用途のために使用することができる、免疫刺激化合物により引き起こされる免疫応答を増強する方法を提供する。したがって、本発明はさらに、免疫療法のための最適レベルの免疫刺激効果を有する化合物ならびにかかる化合物を作るおよび使用するための方法を提供する。加えて、本発明の化合物は、ＤＮＡワクチン、抗体、およびアレルゲンとの組み合わせにおいて、および化学療法剤および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドとの組み合わせにおいて、アジュバントとして有用である。
【００２５】
第１の面において、本発明は、式ＣＧで表される少なくとも１つの免疫調節ジヌクレオチドを含む免疫調節オリゴヌクレオチドであって、式中、Ｃはシトシン、２’−デオキシシトシン、Ｎ３−メチル−ｄＣ、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣであり、Ｇはグアノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、アラビノグアノシンまたはＮ１−メチル−ｄＧであり、ただしＣがシトシンまたは２’−デオキシシトシンであるとき、ＧはＮ１−メチル−ｄＧであり、さらにＧがグアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであるとき、ＣはＮ３−メチル−ｄＣ、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣである、前記免疫調節オリゴヌクレオチドを提供する。
【００２６】
この面の一態様において、本発明は、単独のまたはそれらの３’末端、またはヌクレオシド間結合または官能化核酸塩基または糖において非ヌクレオチドリンカーに結合した少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含む免疫調節オリゴヌクレオチドを提供し、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、免疫調節オリゴヌクレオチドであり、利用できる５’末端を有する。非ヌクレオチドリンカーを通じて互いに結合したオリゴヌクレオチドは、同一のヌクレオチド配列を有し得、または異なるヌクレオチド配列を有し得るが、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、本発明の少なくとも１つの免疫調節ジヌクレオチドを含有する。
【００２７】
本明細書中では、用語「利用できる５’末端」は、オリゴヌクレオチドの５’末端が、オリゴヌクレオチドを認識して結合し、免疫システムを刺激する要因がそれを利用できるよう、十分に利用可能であることを意味する。利用できる５’末端を有するオリゴヌクレオチドにおいて、末端の糖の５’ＯＨ位は、２より多くのヌクレオシド残基または５’末端との相互作用を妨害するその他の部分と共有結合しない。任意に、５’ＯＨは、リン酸塩、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート部分、芳香族または脂肪族リンカー、コレステロール、または利用可能性を妨害しない別の物質と結合することができる。
【００２８】
本発明の目的のために、用語「免疫刺激オリゴヌクレオチド」または「免疫調節オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つの免疫調節ジヌクレオチドを含む化合物を意味し、免疫調節効果を有しない化合物は含まない。「免疫調節ジヌクレオチド」は、式５’−ＣｐＧ−３’を有するジヌクレオチドであり、式中、「Ｃ」は哺乳動物において天然に存在するピリミジンヌクレオシドまたはその合成誘導体であり、「Ｇ」は哺乳動物において天然に存在するプリンヌクレオシドまたはその合成誘導体である。本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、１種の免疫調節ジヌクレオチドまたは数種の免疫調節ジヌクレオチドを有し得る。例えば、各免疫調節オリゴヌクレオチドは、同一であるかまたは本明細書中に記載のように独立して修飾され得る２、３、４または５種以上の免疫調節ジヌクレオチドを有し得る。
【００２９】
用語「ＣｐＧ」および「ＣｐＧジヌクレオチド」は、ジヌクレオチド５’−デオキシシチジン−デオキシグアノシン−３’のことであり、ここで、ｐはヌクレオシド間結合であり、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート結合が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明の目的のために、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合したヌクレオシド単位から形成されたポリヌクレオシドのことをいう。かかるオリゴヌクレオチドは、ゲノムまたはｃＤＮＡを含む既存の核酸源から得ることができるが、好ましくは合成方法で生成される。いくつかの態様において、各ヌクレオシド単位は、複素環塩基およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換アラビノース、２’−Ｏ−置換アラビノースまたは六炭糖類を含む。ヌクレオシド残基は、多数の既知のヌクレオシド間結合のいずれかによって互いに共役させることができる。かかるヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間結合を含むが、これらに限定されない。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、１または２以上の立体特異的なヌクレオシド間結合（例えば、（ＲＰ）−または（ＳＰ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドを包含する。本明細書中では、用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、結合がリン酸基を含むかどうかいずれにせよ、あらゆるそのようなヌクレオシド間結合を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを明確に意図する。ある態様において、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート結合、またはそれらの組合せであってもよい。
【００３１】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは各々、約３から約３５までのヌクレオシド残基、または約４から約３０までのヌクレオシド残基、または約４から約１８までのヌクレオシド残基を有する。いくつかの態様において、免疫調節オリゴヌクレオチドは、約１から約１８まで、または約１から約１５まで、または約５から約１４までのヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドを含む。本明細書中では、用語「約」は、正確な数は重要ではないことを示唆する。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は、重要ではなく、１個または２個少ないヌクレオシド残基、または１個から数個の追加のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、上記の各態様と同等であると考えられる。いくつかの態様において、１または２以上のオリゴヌクレオチドは、１１のヌクレオチドまたは１８のヌクレオチドを有する。免疫調節オリゴヌクレオチドとの関係で、ある態様は、約１３から約３５までのヌクレオチド、または約１３から約２６までのヌクレオチド、または約１１から約２２までのヌクレオチドを有する。
【００３２】
用語「オリゴヌクレオチド」はまた、タンパク質基、親油基、挿入剤、ジアミン、葉酸、コレステロールおよびアダマンタンを含むがこれらに限定されないさらなる置換基を有するポリヌクレオシドを包含する。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチド、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを伴う骨格部分を有するオリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されないポリマーを含有するその他の核酸塩基を包含する。
【００３３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、またはそれらの混合物を含むことができる。本明細書中では、用語「修飾ヌクレオシド」は、修飾複素環塩基、修飾糖部分、またはそれらの組合せを含むヌクレオシドである。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシドは、本明細書中に記載のように、非天然のピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシドは、２’−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシドまたは２’−デオキシ−２’−置換−アラビノシドである。
【００３４】
本発明の目的のために、用語「２’−置換リボヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」は、リボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含み、ここで、五炭糖部分の２’位のヒドロキシル基が置換され、２’−置換または２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドが生成される。かかる置換は、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含有する低級アルキル基によるもの、または６〜１０個の炭素原子を有するアリール基によるものであり、ここでかかるアルキル、またはアリール基は、置換されていなくても、または、例えば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、またはアミノ基により置換されていてもよい。２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−置換−アラビノシドの例は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メチルアラビノシドおよび２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メトキシエチルアラビノシドを含むが、これらに限定されない。
【００３５】
用語「２’−置換リボヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」はまた、リボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含み、ここで、２’−ヒドロキシル基は、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含有する低級アルキル基で、またはアミノまたはハロ基で置き換えられる。かかる２’−置換リボヌクレオシドまたは２’−置換アラビノシドの例は、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリル、および２’−プロパルギルリボヌクレオシドまたはアラビノシドを含むが、これらに限定されない。
【００３６】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ハイブリッドおよびキメラオリゴヌクレオチドを含む。「キメラオリゴヌクレオチド」は、１種より多くのヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドである。かかるキメラオリゴヌクレオチドの一例は、ホスホロチオエート、ホスホジエステルまたはホスホロジチオエート領域およびアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート結合などの非イオン結合を含むキメラオリゴヌクレオチドである（例えば、Pederson他による、米国特許第5,635,377号および第5,366,878号参照）。
【００３７】
「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」は、１種より多くのヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドである。かかるハイブリッドオリゴヌクレオチドの一例は、リボヌクレオチドまたは２’−置換リボヌクレオチド領域、およびデオキシリボヌクレオチド領域を含む（例えば、MetelevおよびAgrawalによる、米国特許第5,652,355号、第6,346,614号および第6,143,881号参照）。
【００３８】
本発明の目的のために、用語「免疫刺激オリゴヌクレオチド」または「免疫調節オリゴヌクレオチド」は、魚、家禽または哺乳動物などの脊椎動物に投与するとき、免疫応答を調節（例えば誘発）する上記のオリゴヌクレオチドのことをいう。本明細書中では、用語「哺乳動物」は、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ(cattle)、ウシ(cows)、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類およびヒトを含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の目的のために、「天然」ヌクレオシドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ中に普通に存在する５種の塩基（例えば、アデノシン、グアノシン、チミジン、シトシンおよびウリジン）のうち１種とデオキシリボースまたはリボース糖とを含むものである。本発明の目的のために、「修飾」または「非天然」ヌクレオシドは、修飾された天然に存在する塩基および／または修飾された天然に存在する糖部分を含むものである。修飾された天然に存在する塩基の例には、式Ｉまたは式ＩＩで表される組成物が含まれるが、これらに限定されない。本発明の目的のために、「ジヌクレオチド類似体」は、上記の免疫刺激ジヌクレオチドであり、ここで、ピリミジンおよびプリンヌクレオシドのいずれかあるいは両方が、非天然のヌクレオシドである。用語「Ｃ＊ｐＧ」および「ＣｐＧ＊」は、シチジン類似体（非天然のピリミジンヌクレオシド）またはグアノシン類似体（非天然のプリンヌクレオシド）をそれぞれ含む免疫刺激ジヌクレオチド類似体のことをいう。
【００４０】
さまざまな場所で、ジヌクレオチドは、Ｒ’ｐＧ、Ｃ＊ｐＧまたはＹＺと表され、その場合それぞれ、Ｒ’、Ｃ＊、またはＹは、限定することなく、Ｎ３−メチル−ｄＣ、プソイド−イソ−デオキシシトジン(pseudo-iso-deoxycytodine)（すなわち、Ψ−イソ−ｄＣ）およびデオキシフラノシル(deoxyfuranosyl）（すなわち、ｄＦ）などの合成または非天然のピリミジンを表す。他の場所で、ジヌクレオチドは、ＣｐＲ、ＣｐＧ＊またはＹＺと表され、その場合それぞれ、Ｒ、Ｇ＊、またはＺは、限定することなく、Ｎ１−メチル−ｄＧまたは７−デアザ−ｄＧなどの合成プリンを表す。本明細書中では、用語「ピリミジンヌクレオシド」は、ヌクレオシドのことであり、ここで、ヌクレオシドの塩基成分は、単環核酸塩基である。同様に、用語「プリンヌクレオシド」は、ヌクレオシドのことであり、ここで、ヌクレオシドの塩基成分は、二環核酸塩基である。本発明の目的のために、「合成」ピリミジンまたはプリンヌクレオシドは、天然に存在しないピリミジンまたはプリン塩基、天然に存在しない糖部分、またはそれらの組合せを含む。
【００４１】
本発明のピリミジンヌクレオシドは、構造(I):
【化１】
【００４２】
式中、
Ｄは、水素結合供与体であり、
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、水素結合受容体、親水性基、疎水性基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され、
ＤおよびＤ’は、５員または６員環の一部であってもよく、
Ａは、窒素またはヘテロ原子、置換されたまたは置換されていないヘテロ原子であり、
Ａ’は、水素結合受容体、親水性基、疎水性基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され、
Ａ’’は、炭素または窒素であり、
Ｘは、炭素または窒素であり、および
Ｓ’は、五炭糖または六炭糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
【００４３】
いくつかの態様において、糖環は、リン酸塩部分、修飾リン酸塩部分、またはピリミジンヌクレオシドを別のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体に結合させるのに好適な他のリンカー部分により誘導体化されている。
水素結合供与体は、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを含むが、これらに限定されない。水素結合受容体は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、および芳香族複素環の環窒素原子、例えば、シトシンのＮ３を含むが、これらに限定されない。
【００４４】
いくつかの態様において、（Ｉ）の塩基部分は、天然に存在しないピリミジン塩基である。天然に存在しないピリミジン塩基の例は、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ３−メチル−ｄＣ、プソイド−イソ−デオキシシトジン（すなわち、Ψ−イソ−ｄＣ）；デオキシフラノシル（すなわち、ｄＦ）、４−チオウラシルおよびＮ４−エチルシトシンなどのＮ４−アルキルシトシンを含むが、これらに限定されない。しかしながら、いくつかの態様において、５−ブロモシトシンは、明確に除外されている。
【００４５】
いくつかの態様において、（Ｉ）の糖部分Ｓ’は、修飾された天然に存在する糖部分である。本発明の目的のために、「天然に存在する糖部分」は、核酸の一部として天然に存在する糖部分、例えば、リボースおよび２’−デオキシリボースであり、「修飾された天然に存在する糖部分」は、核酸の一部として天然に存在しないあらゆる糖であるが、オリゴヌクレオチドの骨格に使用することができる、例えば、六炭糖である。アラビノースおよびアラビノース誘導体は、糖部分の例である。
【００４６】
本発明のプリンヌクレオシド類似体は、構造（ＩＩ）：
【化２】
【００４７】
式中、
Ｄは、窒素またはヘテロ原子、置換されたまたは置換されていないヘテロ原子であり、
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、および親水性基からなる群から選択され、
Ａは、水素結合受容体または親水性基であり、
Ｘは、炭素または窒素であり、
それぞれのＬは独立して、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される原子であり、および
Ｓ’は、五炭糖または六炭糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
【００４８】
いくつかの態様において、糖環は、リン酸塩部分、修飾リン酸塩部分、またはピリミジンヌクレオシドを別のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体に結合させるのに好適な他のリンカー部分により誘導体化されている。
水素結合供与体は、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを含むが、これらに限定されない。水素結合受容体は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、−ＮＯ２および芳香族複素環の環窒素原子、例えば、グアニンのＮ１を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
いくつかの態様において、（ＩＩ）の塩基部分は、天然に存在しないプリン塩基である。天然に存在しないプリン塩基の例は、２−アミノ−６−チオプリン、７−デアザグアノシン、Ｎ１−メチル−ｄＧおよび２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリンを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、（ＩＩ）の糖部分Ｓ’は、構造（Ｉ）について記載したように、天然に存在する糖部分または修飾された天然に存在する糖部分である。
【００５０】
いくつかの態様において、免疫刺激ジヌクレオチドは、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊、およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択され、ここで、Ｃの塩基はシトシンであり、Ｃ＊の塩基はチミン、５−ヒドロキシシトシン、Ｎ３−メチル−ｄＣ、Ｎ４−アルキル−シトシン、プソイド−イソ−デオキシシトジン；デオキシフラノシル、４−チオウラシルまたは他の非天然のピリミジン、または２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリンであり、塩基が２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンのとき、それは好ましくは五炭糖の１’−位に塩基の１位を介して共有結合し、Ｇの塩基はグアノシンであり、Ｇ＊の塩基は２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリン、２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン、６−チオグアニン、７−デアザグアノシン、イノシン、Ｎ１−メチル−ｄＧ、６−オキソプリン、または他の非天然のプリンヌクレオシドであり、およびｐはホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間結合であり、ただし、少なくとも１つのＣまたはＧは、それぞれシトシンまたはグアノシンではない。
【００５１】
免疫調節オリゴヌクレオチドは、免疫刺激ジヌクレオチドの片側または両側に免疫刺激部分を含んでもよい。したがって、いくつかの態様において、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、構造（ＩＩＩ）：
５’−Ｎｎ−Ｎ１−Ｙ−Ｚ−Ｎ１−Ｎｎ−３’ （ＩＩＩ）
【００５２】
式中、
Ｙの塩基は、シトシン、チミン、５−ヒドロキシシトシン、Ｎ４−アルキル−シトシン、Ｎ３−メチル−シトシン、Ψ−イソ−ｄＣ、ｄＦ、４−チオウラシルまたは他の非天然のピリミジンヌクレオシド、または２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリンであり、ここで、塩基が２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリンのとき、それは好ましくは五炭糖の１’−位に塩基の１位を介して共有結合し、
Ｚの塩基は、グアニン、２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリン、２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン、２−アミノ−６−チオ−プリン、７−デアザグアノシン、Ｎ１−メチル−ｄＧ、６−オキソプリンまたは他の非天然のプリンヌクレオシドであり、
【００５３】
Ｎ１およびＮｎは、各発生で独立して、好ましくは天然に存在するあるいは非天然または合成ヌクレオシドまたは脱塩基ヌクレオシド、Ｎ３−メチル−ｄＣ、Ｎ１−メチル−ｄＧ、アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、およびホスホジエステルまたは修飾されたヌクレオシド間結合によって３’側に隣接するヌクレオシドに結合したヌクレオシドからなる群から選択される免疫刺激部分であり、修飾されたヌクレオシド間結合は、約２Åから約２００Åまでの長さを有するリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはメチルホスホネートヌクレオシド間結合から選択されるが、これらに限定されず、
ただし、少なくとも１つのＮ１またはＮｎは、任意に免疫刺激部分であり、
ただし、さらに少なくとも１つのＹまたはＺはそれぞれ、シトシンまたはグアノシンではなく、
ここで、ｎは、０から３０までの数字であり、および
ここで、３’末端、ヌクレオシド間リンカー、または誘導体化された核酸塩基または糖は、直接または非ヌクレオチドリンカーを介して、免疫刺激性であってもなくてもよい別のオリゴヌクレオチドに結合する、
の免疫刺激ドメインを含む。
【００５４】
いくつかの態様において、ＹＺは、シトシン、Ψ−イソ−ｄＣ、ｄＦまたはＮ３−メチル−ｄＣおよびグアノシンまたはＮ１−メチル−ｄＧである。免疫刺激部分は、天然ホスホジエステル骨格およびリン酸塩骨格における修飾物を含み、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホロアミデート、特に第一アミノ−ホスホロアミデート、Ｎ３ホスホロアミデートおよびＮ５ホスホロアミデート、および立体特異的な結合（例えば、（ＲＰ）−または（ＳＰ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル結合）を含むがこれらに限定されない。
【００５５】
いくつかの態様において、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドはさらに、糖修飾物を有するヌクレオシドを含み、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−メトキシエチルリボース、２’−Ｏ−プロパルギルリボース、および２’−デオキシ−２’−フルオロリボースを含むがこれらに限定されない２’−置換五炭糖類；３’−Ｏ−メチルリボース；１’，２’−ジデオキシリボースを含むがこれらに限定されない３’−置換五炭糖類；アラビノース；１’−メチルアラビノース、３’−ヒドロキシメチルアラビノース、４’−ヒドロキシメチルアラビノース、３’−ヒドロキシアラビノースおよび２’−置換アラビノース糖類を含むがこれらに限定されない置換アラビノース糖類；１，５−アンヒドロヘキシトールを含むがこれらに限定されない六炭糖類；およびアルファ−アノマーを含むがこれらに限定されない。修飾糖が３’−デオキシリボヌクレオシドまたは３’−Ｏ−置換リボヌクレオシドである態様において、免疫刺激部分は、２’−５’ヌクレオシド間結合によって隣接するヌクレオシドに結合する。
【００５６】
いくつかの態様において、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドはさらに、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチド、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを含むがこれらに限定されない約２Åから約２００Åまでの長さがある骨格リンカー部分を有するオリゴヌクレオチドを含む他の炭水化物骨格修飾物および置換物を有するオリゴヌクレオチドを含む。アルキルリンカーは、分枝状または非分枝状の、置換されたまたは置換されてない、および単一異性体(chirally pure)またはラセミ混合物であってもよい。いくつかの態様において、かかるアルキルリンカーは、約２〜約１８個の炭素原子を有する。いくつかの態様において、かかるアルキルリンカーは、約３〜約９個の炭素原子を有する。いくつかのアルキルリンカーは、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素およびチオエーテルからなる群から選択された１または２以上の官能基を含む。いくつかのかかる官能化アルキルリンカーは、式−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ（ｎ＝１〜９）で表されるポリ（エチレングリコール）リンカーまたはグリセロールである。いくつかの他の官能化アルキルリンカーは、ペプチドまたはアミノ酸である。
【００５７】
いくつかの態様において、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドはさらに、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシドおよびα−デオキシリボヌクレオシドを含むがこれらに限定されないＤＮＡアイソフォームを含む。いくつかの態様において、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、３’修飾を取り入れ、さらに２’−５’、２’−２’、３’−３’および５’−５’結合を含むがこれらに限定されない不自然なヌクレオシド間結合位置を有するヌクレオシドを含む。
【００５８】
いくつかの態様において、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドはさらに、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、４−チオウラシル、６−チオグアニン、７−デアザグアニン、イノシン、ニトロピロール、Ｃ５−プロピニルピリミジン、Ｎ４−エチルシトシンなどのＮ４−アルキルシトシン、および２，６−ジアミノプリンを含むがこれに限定されないジアミノプリンを含むがこれらに限定されない修飾複素環塩基を有するヌクレオシドを含む。
【００５９】
特定の説明の目的で、限定の目的ではなく、例えば、構造（ＩＩＩ）の免疫刺激ドメインにおいて、Ｎ１またはＮｎ位でのメチルホスホネートヌクレオシド間結合は、免疫刺激部分であり、約２Åから約２００Åまでの長さを有するリンカー、Ｘ１位のＣ２〜Ｃ１８アルキルリンカーは免疫刺激部分であり、およびＸ１位のβ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシドは、免疫刺激部分である。免疫刺激部分の代表的な位置および構造については、以下の表１を参照のこと。特定の位置での免疫刺激部分としてのリンカーは、その位置のヌクレオシド残基がその３’−ヒドロキシルで指示リンカーと置換され、それにより、そのヌクレオシド残基および隣接するヌクレオシドの間で３’側で修飾ヌクレオシド間結合が作られることを意味すると理解される。同様に、特定の位置での免疫刺激部分としての修飾ヌクレオシド間結合は、その位置のヌクレオシド残基が列挙した結合の手段で３’側で隣接するヌクレオシドに結合することを意味する。
【００６０】
【表２】
【００６１】
表２は、上流の増強ドメインを有する免疫調節オリゴヌクレオチド内の免疫刺激部分の代表的な位置および構造を示す。本明細書中では、用語「スペーサー９」は、式−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−のポリ（エチレングリコール）リンカーのことであり、式中、ｎは３である。用語「スペーサー１８」は、式−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−のポリ（エチレングリコール）リンカーのことであり、式中、ｎは６である。本明細書中では、用語「Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー」は、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−Ｏ−のリンカーのことであり、式中、ｑは２〜１８の整数である。したがって、用語「Ｃ３−リンカー」および「Ｃ３−アルキルリンカー」は、式−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｏ−のリンカーのことであり、置換されてもまたは置換されなくてもよく、分枝状でもまたは非分枝状でもよい（例えば１，２，３，プロパントリオール）。スペーサー９、スペーサー１８、およびＣ２〜Ｃ１８アルキルリンカーのそれぞれについて、リンカーは、隣接するヌクレオシドにホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート結合によりつながっている。
【００６２】
【表３】
【００６３】
表３は、下流の増強ドメインを有する免疫調節オリゴヌクレオチド内の免疫刺激部分の代表的な位置および構造を示す。
【００６４】
【表４】
【００６５】
本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、３’末端またはヌクレオシド間結合または官能化核酸塩基または糖において非ヌクレオチドリンカーを介して結合した少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含む。本発明の目的のために、「非ヌクレオチドリンカー」は、共有または非共有結合によりオリゴヌクレオチドに結合することができるあらゆる部分である。かかるリンカーは、長さが約２Åから約２００Åまでである。リンカーの数例を以下に示す。非共有結合には、静電相互作用、疎水性相互作用、π−スタッキング相互作用、および水素結合が含まれるが、これらに限定されない。用語「非ヌクレオチドリンカー」は、上記のようにヌクレオシド間結合、例えば、２つのヌクレオシドの３’−ヒドロキシル基に直接つながるホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート官能基のことを意味しない。本発明の目的のために、かかる直接３’−３’結合（リンカーが関与しない）は、「ヌクレオチド結合」であると考えられる。
【００６６】
いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、金粒子を含むがこれに限定されない金属である。いくつかの他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、可溶性または不溶性の生分解性ポリマービーズである。
【００６７】
また他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドへの結合を可能にする官能基を有する有機部分である。かかる結合は、あらゆる安定した共有結合によるものである。非限定の例として、リンカーは、ヌクレオシドのあらゆる好適な位置に結合してもよい。いくつかの態様において、リンカーは、３’−ヒドロキシルに結合する。かかる態様において、リンカーは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは非リン酸塩をベースとする結合によって３’−ヒドロキシルに結合するヒドロキシル官能基を含む。
【００６８】
いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、ポリペプチド、抗体、脂質、抗原、アレルゲンおよびオリゴ糖を含むがこれらに限定されない生体分子である。いくつかの他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、小分子である。本発明の目的のために、小分子は、１，０００Ｄａ未満の分子重量を有する有機部分である。いくつかの態様において、小分子は、７５０Ｄａ未満の分子重量を有する。
【００６９】
いくつかの態様において、小分子は、脂肪族または芳香族炭化水素であり、これらのいずれかは任意に、オリゴヌクレオチドにつながるまたは付加される直鎖状の、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素、およびチオ尿素からなる群から選択された１または２以上の官能基を含むことができる。小分子は、環状または非環状であり得る。小分子リンカーの例には、アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテンおよび抗生物質が含まれるが、これらに限定されない。しかしながら、非ヌクレオチドリンカーを説明する目的のために、用語「小分子」は、ヌクレオシドを含むことを意図しない。
【００７０】
いくつかの態様において、小分子リンカーは、グリセロールまたは式ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨのグリセロール同族体であり、式中、ｏおよびｐは独立して、１から約６まで、１から約４まで、または１から約３までの整数である。いくつかの他の態様において、小分子リンカーは、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。いくつかのかかる誘導体は、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨを有し、式中、ｍは、０から約１０まで、０から約６まで、２から約６まで、または２から約４までの整数である。
【００７１】
本発明のいくつかの非ヌクレオチドリンカーにより、２より多くのオリゴヌクレオチドの結合が可能となる。例えば、小分子リンカーグリセロールは、オリゴヌクレオチドが共有結合してもよい３個のヒドロキシル基を有する。したがって、本発明のいくつかの免疫調節オリゴヌクレオチドは、３’末端が非ヌクレオチドリンカーに結合する２より多くのオリゴヌクレオチドを含む。
【００７２】
本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドを、図３および４に図式的に描写し、さらに例に記載した自動合成装置およびホスホロアミダイト法を使って都合よく合成してもよい。いくつかの態様において、免疫調節オリゴヌクレオチドを、直線的合成法により合成する（図３参照）。本明細書中では、用語「直線的合成」は、免疫調節オリゴヌクレオチドの一方の末端で始まり、他方の末端に直線的に進行する合成のことをいう。直線的合成により、同一または非同一（長さ、塩基組成物および／または取り入れられる化学修飾物の点で）のモノマー単位を免疫調節オリゴヌクレオチド内に取り入れることが可能となる。
【００７３】
合成の代わりの様式は、「平行合成」であり、合成は、中央のリンカー部分から外側に進む（図４参照）。固体の支持体が結合したリンカーを、米国特許第5,912,332号に記載のように、平行合成に使用することができる。代わりに、一般的な固体の支持体（リン酸塩が結合した多孔性ガラス(controlled pore glass)など）を使用することができる。
【００７４】
免疫調節オリゴヌクレオチドの平行合成は、直線的合成よりもいくつか優れた点を有する：（１）平行合成により、同一モノマー単位の取入れが可能となる；（２）直線的合成とは違って、両方の（またはすべての）モノマー単位が同時に合成され、それにより合成ステップの数および合成に必要な時間が１つのモノマー単位のものと同じである；および（３）合成ステップの削減により、最終免疫調節オリゴヌクレオチド生成物の純度および収率が向上する。
【００７５】
直線的合成または平行合成手順のいずれかによる合成の最後に、修飾ヌクレオシドを取り入れる場合、免疫調節オリゴヌクレオチドを、濃縮アンモニア溶液を用いてまたはホスホロアミダイト供給元により推奨されたように都合よく脱保護してもよい。生成物である免疫調節オリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣ、脱トリチル化(detritylated)、脱塩および透析により精製することができる。
【００７６】
表４は、本発明の代表的な免疫調節オリゴヌクレオチドを示す。
【００７７】
【表５】
Ｃ１＝Ｎ３−メチル−ｄＣ；Ｃ２＝ｄＦ；Ｃ３＝Ψ−イソ−ｄＣ；Ｃ４＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン；Ｇ１＝Ｎ１−メチル−ｄＧ；Ｇ２＝７−デアザ−ｄＧ；Ｇ３＝アラビノグアノシン；Ｘ＝グリセロールリンカー；Ｙ＝Ｃ３リンカー
【００７８】
本発明のこの面のある態様は、上記の免疫刺激オリゴヌクレオチド、および利用できる５’末端以外の位置で免疫刺激オリゴヌクレオチドに共役した化合物を含む免疫調節オリゴヌクレオチド共役体を提供する。いくつかの態様において、化合物は、非ヌクレオチドリンカーに共役される。いくつかの他の態様において、化合物は、その５’末端以外の位置でオリゴヌクレオチドに共役される。本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドに共役され得る好適な化合物には、コレステロール、異なる長さのポリエチレングリコール、ペプチド、抗体、タンパク質、ワクチン、脂質、抗原、および、限定することなく、イミキモド、Ｒ８４８、ロキソリビン、イサトルビン(isatorbin)ならびに化学療法剤などのあらゆる免疫刺激小分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
抗原は、病原体と関連する抗原、癌と関連する抗原、自己免疫疾患と関連する抗原、および、限定することなく、獣医学的または小児科学的疾病などの他の疾病と関連する抗原を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、抗原は、ワクチン効果を生み出す。本発明の目的のために、用語「〜と関連する」は、病原体、癌、自己免疫疾患、食物アレルギー、呼吸器系アレルギー、ぜんそくまたは他の疾病が存在するとき、抗原が存在するが、病原体、癌、自己免疫疾患、食物アレルギー、呼吸器系アレルギー、または疾病が存在しないとき、いずれかが存在しないか、または低減された量で存在することを意味する。
【００８０】
免疫刺激オリゴヌクレオチドは、抗原に共有結合する、またはそうでなければ作動可能なように(operatively)抗原と関連する。本明細書中では、用語「作動可能なように〜と関連する」は、免疫刺激オリゴヌクレオチドおよび抗原の両方の活性を維持するあらゆる関連のことをいう。かかる作動的関連の非限定の例は、同じリポソームまたは他のかかる送達ビヒクルまたは試薬の一部であることを含む。免疫刺激オリゴヌクレオチドが抗原に共有結合する態様において、かかる共有結合は、好ましくはオリゴヌクレオチドは、免疫刺激オリゴヌクレオチドの利用できる５’末端以外の免疫刺激のあらゆる位置にある。例えば、抗原は、ヌクレオシド間結合で結合してもよく、または非ヌクレオチドリンカーに結合してもよい。代わりに、抗原自体が非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
【００８１】
第２の面において、本発明は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体および生理学的に許容し得る担体を含む医薬製剤を提供する。本明細書中では、用語「生理学的に許容し得る」は、免疫調節オリゴヌクレオチドの効果を妨害せず、細胞、細胞培養、組織または生命体などの生物学的システムに適合する材料のことをいう。好ましくは、生物学的システムは、脊椎動物などの生物である。
【００８２】
本明細書中では、用語「担体」は、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、脂質、または医薬製剤において使用される当該技術分野で周知の他の材料を包含する。担体、賦形剤または希釈剤の特徴は、特定の用途のための投与経路に依存することが理解される。これらの材料を含有する薬学的に許容し得る製剤の調製は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
【００８３】
第３の面において、本発明は、脊椎動物において免疫応答を生じさせるための方法を提供し、かかる方法は、脊椎動物に本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体を投与することを含む。いくつかの態様において、脊椎動物は、哺乳動物である。本発明の目的のために、用語「哺乳動物」は、ヒトを含むことを明確に意図する。ある態様において、免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体は、免疫刺激を必要とする脊椎動物に投与される。
【００８４】
本発明のこの面の方法において、免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体の投与は、あらゆる好適な経路によるものであり得、非経口、経口、舌下、経皮、局所、粘膜、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃によるもの、皮膚パッチまたは点眼薬または口腔洗浄薬の形態を含むがこれらに限定されない。免疫調節オリゴヌクレオチドの治療的組成物の投与は、症状または疾病の代替マーカーを軽減させるのに有効な投薬量および時間で、既知の手順を使って行うことができる。全身投与するとき、治療的組成物は、好ましくは免疫調節オリゴヌクレオチドが約０．０００１マイクロモルから約１０マイクロモルまでの血中濃度に到達するのに十分な投薬量で投与する。限局化投与のために、これよりもさらに低濃度が有効であり得、より高濃度に耐性があり得る。好ましくは、免疫調節オリゴヌクレオチドの総投薬量は、患者あたり１日あたり約０．００１ｍｇから体重１ｋｇあたり１日あたり約２００ｍｇまでの範囲である。治療効果のある量の１または２以上の本発明の治療的組成物を個人に１回の処置のエピソードとして同時にまたは連続して投与することが望ましいといえる。
【００８５】
ある態様において、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体は、免疫応答の特異性または大きさを増強させるために、ワクチン、抗体、細胞障害性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチンおよび／またはアジュバントと組み合わせて投与される。これらの態様において、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、アジュバントとしてさまざまに作用し、および／または直接の免疫刺激効果を発揮することができる。
【００８６】
免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体あるいはワクチンのいずれか、または両方は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、コレラ毒素Ｂサブユニットまたはその他の免疫原性担体タンパク質などの免疫原性タンパク質に任意に結合してもよい。あらゆる多量のアジュバントを使用してもよく、フロイド完全アジュバント、ＫＬＨ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ミョウバン、およびＱＳ−２１を含むサポニン、イミキモド、Ｒ８４８、またはそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【００８７】
本発明のこの面の目的のために、用語「〜と組み合わせて」は、同じ患者における同じ疾病の処置過程中を意味し、同時投与、ならびに一時的に数日まで間隔を空ける順序を含むあらゆる順序で免疫調節オリゴヌクレオチドおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントを投与することを含む。かかる併用処置はまた、免疫調節オリゴヌクレオチド、および／またはワクチン単独、および／またはアジュバント単独の単回投与より多いものを含んでもよい。免疫調節オリゴヌクレオチドおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントの投与は、同じまたは異なる経路によるものでもよい。
【００８８】
本発明のこの面の方法は、免疫システムのモデル調査に有用である。本方法はまた、ヒトまたは動物の疾病の予防または治療的処置に有用である。例えば、本方法は、小児科学的および獣医学的ワクチン用途に有用である。
【００８９】
第４の面において、本発明は、疾病または疾患を有する患者を治療的に処置するための方法を提供し、かかる方法は、患者に本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体を投与することを含む。さまざまな態様において、処置される疾病または疾患は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病である。病原体は、細菌、寄生生物、真菌類、ウィルス類、ウイロイド類およびプリオン類を含む。投与は、本発明の第３の面について記載したように行われる。
【００９０】
本発明の目的のために、用語「アレルギー」は、食物アレルギーおよび呼吸器系アレルギーを含むが、これらに限定されない。用語「気道炎症」は、ぜんそくを含むが、これに限定されない。本明細書中では、用語「自己免疫疾患」は、「自己」タンパク質が免疫システムにより攻撃を受ける疾患のことをいう。かかる用語は、自己免疫ぜんそくを含む。
【００９１】
第５の面において、本発明は、疾病または疾患を予防する方法を提供し、かかる方法は、患者に本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体を投与することを含む。さまざまな態様において、予防される疾病または疾患は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病である。病原体は、細菌、寄生生物、真菌類、ウィルス類、ウイロイド類、およびプリオン類を含む。投与は、本発明の第３の面について記載したように行われる。
【００９２】
本発明のこの面の方法のいずれかにおいて、免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体は、免疫調節オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を減少させない疾病または状態を処置するのに有用なその他の剤と組み合わせて投与することができる。本発明の方法のいずれかにおいて、疾病または状態を処置するのに有用な剤は、ワクチン、抗原、抗体、細胞障害性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、免疫応答の特異性または大きさを増強させるためのＤＮＡワクチンおよび／またはアジュバント、またはサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチドおよび修飾アミノ酸を含むペプチドなどの共刺激性分子を含むが、これらに限定されない。例えば、癌の処置において、免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節オリゴヌクレオチド共役体は、化学療法化合物またはモノクローナル抗体と組み合わせて投与されてもよいと考えられる。代わりに、剤は、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含むことができる。これらの態様において、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、アジュバントとしてさまざまに作用し、および／または直接の免疫刺激効果を発揮することができる。
【００９３】
本発明の方法において使用される化学療法剤は、以下のものを含むが、これらに限定されない。ゲムシタビン、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、非糖含有クロロエチルニトロソウレア、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン(fragyline)、メグラミンＧＬＡ、バルルビシン、カルムスタイン(carmustaine)およびポリフェルポサン(poliferposan)、MMI270、BAY 12-9566、RASファルネシル(farnesyl)トランスフェラーゼ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、MMP、MTA/LY231514、LY264618/ロメテキソール(Lometexol)、グラモレク(Glamolec)、CI-994、TNP-470、ハイカムチン(Hycamtin)/トポテカン、PKC412、バルスポダール(Valspodar)/PSC833、ノバントロン/ミトキサントロン、メタレット(Metaret)/スラミン、バチマスタット、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA 2516/マルミスタット(Marmistat)、BB2516/マルミスタット、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、レモナールDP 2202、FK 317、ピシバニール/OK-432、AD 32/バルルビシン、メタストロン/ストロンチウム誘導体、テモダール(Temodal)/テモゾロマイド(Temozolomide)、エバセット(Evacet)/リポソームドキソルビシン、ユータキサン(Yewtaxan)/パクリタキセル(Paclitaxel)、タキソール/パクリタキセル、キセロード(Xeload)/カペシタビン、フルツロン/ドキシフルリジン、シクロパックス(Cyclopax)/経口パクリタキセル、経口タキソイド、SPU-077/シスプラチン、HMR 1275/フラボピリドール、CP-358 (774)/EGFR、CP-609 (754)/RAS癌遺伝子阻害剤、BMS-182751/経口プラチナ、UFT(テガフール/ウラシル)、エルガミゾール(Ergamisol)/レバミゾール、エニルウラシル/776C85/5FUエンハンサ、カンプト/レバミゾール、カンプトサール(Camptosar)/イリノテカン、ツモデックス(Tumodex)/ラルチトレキセド(Raltitrexed)、ロイスタチン/クラドリビン、パキセックス(Paxex)/パクリタキセル、ドキシル(Doxil)/リポソームドキソルビシン、カエリックス(Caelyx)/リポソームドキソルビシン、フルダラ(Fludara)/フルダラビン、ファルマルビシン(Pharmarubicin)/エピルビシン、デポサイト(DepoCyt)、ZD1839、LU 79553/ビス−ナフタリミド、LU 103793/ドラスタチン、カエチックス(Caetyx)/リポソームドキソルビシン、
【００９４】
ジェムザール(Gemzar)/ゲムシタビン、ZD 0473/アノーメッド(Anormed)、YM 116、ヨウ素シード、CDK4およびCDK2阻害剤、PARP阻害剤、D4809/デキシフォサミド(Dexifosamide)、イフェス(Ifes)/メスネックス(Mesnex)/イホスファミド(Ifosfamide)、ブモン(Vumon)/テニポシド(Teniposide)、パラプラチン/カルボプラチン、プランチノール(Plantinol)/シスプラチン、ベペシド(Vepeside)/エトポシド、ZD 9331、タキソテール(Taxotere)/ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン類似体、ニトロソ尿素、メルフェランおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル(Chlorombucil)、シタラビンＨＣｌ、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、リン酸エストラムスチンナトリウム、エトポシド (VP16-213)、フロクスウリジン、フルオロウラシル(5-FU)、フルタミド、ヒドロキシ尿素 （ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、アルファ−２ｂ、酢酸ロイプロリド（LHRH-放出因子類似体）、ロムスチン(CCNU)、メクロレタミンHCl (ナイトロジェンマスタード)、メルカプトプリン、メスナ(Mesna)、ミトーテン(Mitotane)(o.p'-DDD)、ミトキサントロンHCl、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンHCl、ストレプトゾシン、タモキシフェンクエン酸塩、チオグアニン、チオテパ、ビンブラスチン硫酸塩、アムサクリン(Amsacrine)(m-AMSA)、アザシチジン(Azacitidine)、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン(HMM)、インターロイキン2、ミトグアゾン(Mitoguazone)(メチル-GAG；メチルグリオキサールビスグアニルヒドラゾン；MGBG)、ペントスタチン(Pentostatin) (2'デオキシコホルマイシン)、セムスチン(Semustine)(メチル-CCNU)、テニポシド(VM-26)、ビンデシン硫酸塩、ラパチニブ(Lapatinib)(EGFRおよびErbB-2(Her2/neu)二重チロシンキナーゼ阻害剤(GSK))、ゲフィチニブ(Gefitinib)(ZD1839/イレッサ(Iressa)(AstraZeneca))、エルロチニブ(Erlotinib)(タルセバ(Tarceva)−EGFR/HER1阻害剤(Genentech))、サリドマイド((サリドマイド)−抗血管新生剤)、イマチニブ(グリベック(Glivec))およびバタラニブ(Vatalanib)(VEGFRチロシンキナーゼ阻害剤)、ソラフェニブ(Sorafenib)(Rafキナーゼ阻害剤(Bayer))、VX-680 (オーロラキナーゼ阻害剤)、ステント(Sutent)(受容体型チロシンキナーゼ(RTK)阻害剤(Pfizer))が含まれるが、これらに限定されないEGFRおよびVEGF阻害剤などのチロシンキナーゼ阻害剤、ボルテゾミブ(Bortezomib)((ベルケード(Velcade))プロテオソーム阻害剤)、テモゾロマイド(Temozolomide)((テモダール(Temodal))アルキル化剤)、およびインターフェロンアルファ(Intron A、Roferon A)。
【００９５】
抗体（特にモノクローナル抗体）の形態での受動的免疫療法は、抗癌剤としての多大な研究開発の対象であった。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中では単一分子組成物の抗体分子のことをいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープについて単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する単一の結合特異性を示す抗体のことをいう。抗癌剤の例には、パノレックス(Panorex)(Glaxo-Welicome)、リツキサン(Rituxan)(IDEC/Genentech/Hoffman la Roche)、マイロターグ(Mylotarg)(Wyeth)、キャンパス(Campath)(Millennium)、ゼヴァリン(Zevalin)(IDECおよびSchering AG)、ベキサール(Bexxar)(Corixa/GSK)、エルビタックス(Erbitux)(Imclone/BMS)、アバスチン(Avastin)(Genentech)、ハーセプチン(Herceptin)(Genentech/Hoffman la Roche)、セツキシマブ(Cetuximab)(Imclone)およびパニツムマブ(Panitumumab)(Abgenix/Amgen)が含まれるが、これらに限定されない。抗体はまた、癌抗原を（免疫学的意味で）模倣するように思われる抗イディオタイプ抗体を利用する能動的免疫療法において用いてもよい。モノクローナル抗体は、組み換えＤＮＡ技術の当業者に既知の方法により生じさせることができる。
【００９６】
以下の例は、本発明のある態様をさらに説明することを意図し、本発明の範囲を限定することは意図しない。
【００９７】
例
例１：免疫刺激部分を含有するオリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを、１μｍｏｌ〜０．１ｍＭの規模で自動ＤＮＡ合成装置（OligoPilot II、AKTA、(Amersham)および／またはExpedite 8909 (Applied Biosystem)）を使って、図３および４に概説された直線的合成または平行合成手順に従って合成した。
【００９８】
５’−ＤＭＴ ｄＡ、ｄＧ、ｄＣおよびＴホスホロアミダイトは、Proligo（Boulder, CO）から購入した。５’−ＤＭＴ ７−デアザ−ｄＧおよびアラＧホスホロアミダイトは、Chemgenes（Wilmington, MA）から得た。ＤｉＤＭＴ−グリセロールリンカーの固体の支持体は、Chemgenesから得た。１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンアミダイトは、Glen Research（Sterling, VA）から得た。２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドアミダイトは、Promega（Obispo, CA）から得た。すべてのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格修飾された。
【００９９】
すべてのヌクレオシドホスホロアミダイトは、３１Ｐおよび１Ｈ ＮＭＲスペクトルによって特徴付けた。修飾ヌクレオシドは、供給元に推奨される通常の共役サイクルを使って特定の部位で取り入れた。合成後、オリゴヌクレオチドを濃縮水酸化アンモニウムを使って脱保護し、逆相ＨＰＬＣ、脱トリチル化、続いて透析により精製した。ナトリウム塩形態として精製したオリゴヌクレオチドは、使用前に凍結乾燥した。純度をＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより試験した。内毒素レベルをＬＡＬテストにより決定したところ、１．０ＥＵ／ｍｇを下回った。
【０１００】
例２：マウス脾臓細胞培養
４〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスは、Taconic Farms（Germantown, NY)から得、IderaのＩＡＣＵＣ承認の動物処置に従って維持した。本明細書に報告されたすべての動物実験は、IderaのＩＡＣＵＣガイドラインおよび承認された手順に従って行われた。４〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞を調製し、ＲＰＭＩ完全培地で培養した。マウス脾臓細胞を５×１０６個の細胞／ｍｌで２４ウェルディッシュに蒔いた。ＴＥ緩衝剤（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解したＩＭＯを、最終濃度が０．０３、０．１、０．３、１．０、３．０または１０μｇ／ｍｌとなるよう細胞培養液に添加した。そして、細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、上清をＥＬＩＳＡアッセイのために収集した。
【０１０１】
上清中のＩＬ−１２およびＩＬ−６レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図５Ａから５Ｄに示す。サイトカイン抗体および標準物質を含む必要な試薬は、BD Pharmingenから購入した。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよび基質は、KPLからであった。
【０１０２】
例３：ヒトＰＢＭＣの単離
新しく採血したばかりの健康なボランティアの血液からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（CBR Laboratories, Boston, MA）を、フィコール密度勾配遠心法（Histopaque-1077、Sigma）により単離した。
【０１０３】
例４：サイトカインＥＬＩＳＡ
ヒトＰＢＭＣを、５×１０６個の細胞／ｍｌを使って４８ウェルプレートに蒔いた。ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４；Mediatech）に溶解したＩＭＯを、最終濃度が１０．０μｇ／ｍｌとなるよう細胞培養液に添加した。そして、細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、上清をＥＬＩＳＡアッセイのために収集した。実験を、３つ組のウェルで行った。ＩＬ−６およびＩＬ−１０レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。サイトカイン抗体および標準物質を含む必要な試薬は、PharMingenから購入した。
【０１０４】
例５：ＨＥＫ２９３細胞培養：
ＨＥＫ２９３／ｍＴＬＲ９細胞（Invivogen, San Diego, CA）を、５％ＣＯ２インキュベータ内で１０％の加熱不活性化したＦＢＳを補充した２５０μｌ／ウェルのＤＭＥＭを入れた４８ウェルプレートで培養した。
【０１０５】
例６：レポーター遺伝子形質転換
８０％コンフルエンスで、培養液を、培地中４μｌ／ｍｌのリポフェクタミン（Invitrogen, CA）の存在下で４００ｎｇ／ｍｌのＳｅａｐレポータープラスミド（pNifty2-Seap）（San Diego CA）により一過性形質転換した。プラスミドＤＮＡおよびリポフェクタミンを、無血清培地に別々に希釈し、室温で５分間インキュベートした。インキュベート後、希釈したＤＮＡおよびリポフェクタミンを混合し、混合物を室温で２０分間インキュベートした。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡおよび１μｌのリポフェクタミンを含有する２５μｌのＤＮＡ／リポフェクタミン混合物を細胞培養プレートの各ウェルに添加し、培養を４時間続けた。
【０１０６】
例７：免疫調節オリゴヌクレオチド処置
形質転換後、培地を新鮮な培地と交換し、刺激オリゴである、免疫調節オリゴヌクレオチドを個々に培養液に添加し、培養を１８時間続けた。
【０１０７】
例８：ＳＥＡＰアッセイ
オリゴである、免疫調節オリゴヌクレオチドの処置の最後に、３０μｌの培養上清を各処置から採取し、ＳＥＡＰアッセイに使用した。製造元の手順（Invivogen）に従い、アッセイを行った。シグナルが、プレートリーダーにより４０５ｎｍで検出された。結果を図７に示し、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、独特のＴＬＲ９活性プロフィールが生じることを実証する。
【０１０８】
例９：マウス血清サイトカインレベルの評価
５〜６週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスは、Taconic Farms、Germantown、NYから得、Idera PharmaceuticalのＩＡＣＵＣ承認の動物処置に従って維持した。マウス（ｎ＝２〜３）に、個々の免疫調節オリゴヌクレオチドを２５または１００μｇの用量または１ｍｇ／ｋｇ（単一用量）で皮下注射（ｓ．ｃ）した。血清を、免疫調節オリゴヌクレオチド投与の４時間後に後眼窩出血により収集し、ＩＬ−１２をサンドイッチＥＬＩＳＡにより決定した。結果を図８に示し、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与により、独特のＩＬ−１２プロフィールが生じることを実証する。サイトカイン抗体および標準物質を含むすべての試薬は、PharMingen（San Diego, CA）から購入した。
【０１０９】
例１０：マウス脾臓細胞培養：
Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞を調製し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が入ったＲＰＭＩ １６４０、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミン（HyClone, Logan, UT）からなるＲＰＭＩ完全培地で培養した。マウス脾臓細胞を、５×１０６個の細胞／ｍｌで２４ウェルプレートに蒔いた。ＴＥ緩衝剤［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１ｍＭのＥＤＴＡ］に溶解した個々の免疫調節オリゴヌクレオチドを、最終濃度が３または１０ｍｇ／ｍｌとなるよう細胞培養液に添加した。そして、細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、上清をアッセイ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によるサイトカイン分析のために収集した。
【０１１０】
上清中のＩＬ−１２およびＩＬ−６レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。サイトカイン抗体および標準物質を含む必要な試薬は、BD Pharmingen(San Diego, CA)から購入した。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびＴＭＢ基質は、それぞれSigma (St. Louis, MO)およびKPL（Gaithersburg, MD）からであった。
【０１１１】
例１１：ヒトＢ細胞増殖アッセイ：
ヒトＰＢＭＣから精製した約１×１０５個のＢ細胞を、異なる濃度の免疫調節オリゴヌクレオチドにより６４時間刺激し、０．７５μＣｉの［３Ｈ］−チミジンによりパルスし、８時間後に回収した。［３Ｈ］−チミジンの取り込みを、シンチレーションカウンタにより計測し、カウント毎分（ｃ．ｐ．ｍ．）として表した。
【０１１２】
例１２：ヒトマルチプレックスサイトカインＥＬＩＳＡ：
ヒトＰＢＭＣを、５×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートに蒔いた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した免疫調節オリゴヌクレオチドを、最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるよう細胞培養液に添加した。そして、細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。上清を、Luminex−マルチプレックスＥＬＩＳＡシステムを使ってリストにあるサイトカインについて分析をした。ヒトマルチプレックスキットは、invitrogenから得た。
【０１１３】
例１３：マウス脾腫アッセイ
メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週、１９〜２１ｇｍ）を、３匹のマウスのグループに分けた。免疫調節オリゴヌクレオチドＤＮＡを滅菌ＰＢＳに溶解し、マウスに５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与（ＳＣ）した。７２時間後、マウスを屠殺し、脾臓を回収し、秤量した。結果を図９に示し、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与により、独特の免疫応答プロフィールが生じることを実証する。
【０１１４】
例１４：ＯＶＡ感作マウス脾臓細胞培養アッセイ
４〜６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスは、Taconic（Germantown, NY）から得た。マウスに、１００μＬのImjectAlumアジュバント（Pierce)と混合した２０μｇのニワトリ卵白アルブミン（OVA；Sigma）の１００μＬのＰＢＳの腹腔内注射を０、７日目に与え、１０μｇのＯＶＡの４０μｌのＰＢＳは１４および２１日目に鼻腔内にチャレンジした。マウスを、最後の挑戦の７２時間後、ＣＯ２吸入により屠殺した。
【０１１５】
脾臓を摘出し、単細胞の懸濁液を上記のように調製した。脾臓細胞を、異なる濃度の免疫調節オリゴヌクレオチドで２時間処置し、続いて１００μｇ／ｍＬのＯＶＡで処置した。
【０１１６】
７２時間後、上清を収集し、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１２、およびＩＦＮ−αレベルを上記のようにＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１０Ａ〜１０Ｄに示し、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、免疫システム活性化因子（例えば卵白アルブミン）が存在しても、塩基組成物および投与するオリゴヌクレオチドの量により様々である独特のサイトカイン／ケモカインプロフィールが生じることを実証する。
【０１１７】
例１５：化学療法剤と組み合わせた免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo抗癌活性
ＰＣ３細胞を、ヒト前立腺癌モデル（ＰＣ３）を確立するために、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が入った９０％のHam's、Ｆ１２Ｋ培地で、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンの存在下で培養することができる。オスの無胸腺マウス、４〜６週齢（Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, MD）を、研究前に環境適応のため、６日間収容することができる。培養したＰＣ３細胞は、単層培養から回収し、Ham's、Ｆ１２Ｋ培地（１０％ＦＢＳ）で洗浄し、ＦＢＳフリーのHam's、Ｆ１２Ｋ培地：Matrigel基底膜マトリックス（Becton Dickinson Labware, Bedford, MA）（５：１；Ｖ／Ｖ）に再懸濁し、各マウスの左鼠径部内に皮下注射（５×１０６個の細胞、総量０．２ｍｌ）することができる。動物は、一般的な臨床的観察、体重、および腫瘍成長により監視することができる。腫瘍成長は、ノギスを用いて、移植片の２つの直交する直径の測定により監視することができる。腫瘍の質量（グラム重量）は、式１／２ａ×ｂ２により計算することができ、ここで「ａ」は長径（ｃｍ）、「ｂ」は短径（ｃｍ）のことである。平均腫瘍サイズがおよそ８０ｍｇに達するとき、ヒト癌異種移植片を有する動物を無作為に処置群および対照群に分ける（５匹／群）。対照群は、滅菌生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）のみを受けることができる。生理食塩水に無菌で溶解した本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドは、０．５または１．０ｍｇ／ｋｇ／日、３用量／週の用量で皮下注射により投与することができる。化学療法剤は、腹腔内注射により１６０ｍｇ／ｋｇを０および３日目に２回与えることができる。
【０１１８】
例１６：免疫調節部分を含有するオリゴヌクレオチドの合成
２’−デオキシ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２，７（８Ｈ）−ジオン（ｄＦ）または２’−デオキシプソイドイソシチジン（Ψ−イソ−ｄＣ）修飾物を有する免疫調節オリゴヌクレオチドを、PerSeptive Biosystem 8909 Expedite DNA合成装置で、β−シアノエチルホスホロアミダイト化学を用い２μｍｏｌの規模で合成した。ＣＰＧ−固体の支持体に結合したジ−ＤＭＴ保護されたグリセリルリンカーは、ChemGenes Corporation（Wilmington, MA）から得た。ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、およびＴの３’−ホスホロアミダイトは、Applied Biosystemsから得た。一方、ｄｍｆ−ｄＧホスホロアミダイトは、Glen Research（Sterling, VA）から得た。ｄＦおよびΨ−イソ−ｄＣのホスホロアミダイトは、Berry & Associates（Dexter, MI）から得た。Beaucage試薬は、ホスホロチオエート骨格修飾を得るために、酸化剤として使用した。供給元が推奨する合成手順を、ｄＦおよびΨ−イソ−ｄＣホスホロアミダイトの取り入れおよび脱保護に使用した。合成後、免疫調節オリゴヌクレオチドを脱保護し、「トリチルオン（trityl on）」ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、脱トリチル化し、洗浄用の米国薬局方(United States Pharmacopeia)品質の滅菌水（Braun, Irvine, CA）に対して透析した。免疫調節オリゴヌクレオチドを凍結乾燥し、再度蒸留水に溶解し、濃度を、ＵＶ吸収を２６０ｎｍで測定することにより決定した。すべての合成した化合物の純度を、ＰＡＧＥを変性させることにより決定した。配列の完全性を、分子量についてマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法により特徴付けた。すべての免疫調節オリゴヌクレオチド（表４Ａ）を合成し、内毒素汚染を最小限に抑えるため、同一条件下で精製した。
【０１１９】
例１７：ＣｐＧモチーフ中にｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣを含有する免疫調節オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９を活性化する
１０μｇ／ｍｌの濃度の免疫調節オリゴヌクレオチドおよび対照化合物による、マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞の活性化。ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣ修飾を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのＴＬＲ９を活性化させる能力を、マウスＴＬＲ９を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞において研究した。ヒト分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子は、ＮＦ−κＢレポーターとして使用される。結果を、ＰＢＳ対照に対するＮＦ−κＢ活性の倍数の増加として表す（図１１）。ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣを含有した免疫調節オリゴヌクレオチド２７および２８（配列番号２７および２８）（表４Ａ）は、ＮＦ−κＢ活性の増加により示されるように、ＴＬＲ９を活性化した。これらの結果は、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣ修飾は耐性があり、Ｃ−位置で機能的であることを実証し、さらに、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、独特のＴＬＲ９活性プロフィールが生じることを実証する（図１１）。
【０１２０】
例１８：ＣｐＧモチーフ中にｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣを含有する免疫調節オリゴヌクレオチドは、マウス脾臓細胞培養においてサイトカインの分泌を誘発する
Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養におけるＩＭＯによるサイトカイン分泌の誘発。Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞を、単独で（Ｍ）またはさまざまな濃度の免疫調節オリゴヌクレオチドの存在下、培地で２４時間培養し、培養上清中の分泌されたＩＬ−１２（図１２Ａ）およびＩＬ−６（図１２Ｂ）のレベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した。示したデータは、３および１０μｇ／ｍｌの濃度の免疫調節オリゴヌクレオチドである（図１２Ａおよび１２Ｂ）。ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣを含有する免疫調節オリゴヌクレオチド２７（配列番号２７）および２８（配列番号２８）は、対照の免疫調節オリゴヌクレオチド２９（配列番号２９）と比較して、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養におけるＩＬ−１２およびＩＬ−６の分泌を誘発した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。これらの結果は、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣ修飾物を有する免疫調節オリゴヌクレオチドは免疫細胞によって耐性がありそこで活性があることを実証する。さらに、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドの投与により、塩基組成物および投与するオリゴヌクレオチドの量により様々である独特のＩＬ−６およびＩＬ−１２プロフィールが生じることを実証する。
【０１２１】
例１９：ＣｐＧモチーフ中にｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣを含有する免疫調節オリゴヌクレオチドは、マウスにおいて脾腫およびサイトカインをin vivo誘発する
５ｍｇ／ｋｇ用量の免疫調節オリゴヌクレオチド、対照化合物、またはＰＢＳのｓ．ｃ．投与を受けたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける脾腫（図１３Ａ）。脾臓重量の変化を、免疫調節オリゴヌクレオチド投与７２時間後に決定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＩＬ−１２（１３．Ｂ）の分泌は、１ｍｇ／ｋｇの用量でのｓ．ｃ．投与の後に免疫調節オリゴヌクレオチドにより誘発された。血液を、免疫調節オリゴヌクレオチド投与４時間後に収集し、血清中のＩＬ−１２レベルを、ＥＬＩＳＡにより決定した。ＣｐＧオリゴ投与後のマウスの脾臓重量の増加は、免疫調節活性の指標である。ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣを含有するマウスおよびヒト特異的な免疫調節オリゴヌクレオチドは両方、対照の免疫調節オリゴヌクレオチド４（配列番号４）または５（配列番号５）を受けたマウスと比べて、脾臓の拡大を示した（図１３Ａ）。ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣ修飾を有する、マウス特異的な免疫調節オリゴヌクレオチド２２（配列番号２２）または２３（配列番号２３）を受けたマウスは、ヒト特異的な免疫調節オリゴヌクレオチド２７（配列番号２７）または２８（配列番号２８）を注射したマウスよりも大きな脾臓重量の増加をもたらした。これらの結果はまた、ｄＦ修飾を有する、免疫調節オリゴヌクレオチド２２（配列番号２２）または２８（配列番号２８）を受けたマウスが、それぞれΨ−イソ−ｄＣ修飾を有する免疫調節オリゴヌクレオチド２３（配列番号２３）または２７（配列番号２７）を注射したマウスよりも大きな脾臓重量の増加をもたらしたことを示す。さらなるin vivoのサイトカイン誘発プロフィールの試験は、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣ修飾物を含有したマウスおよびヒト特異的な免疫調節オリゴヌクレオチド両方が、免疫調節オリゴヌクレオチド投与４時間後にマウスにおけるＩＬ−１２の上昇を誘発したことを明らかにした（図１３Ｂ）。脾腫アッセイでみられたように、マウス特異的な免疫調節オリゴヌクレオチド２２（配列番号２２）は、免疫調節オリゴヌクレオチド２３（配列番号２３）よりも高いレベルのＩＬ−１２を誘発した。これらの結果は、両方の修飾物（ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣ）に耐性があり、ＴＬＲ９を活性化するが、免疫応答のレベルは異なること、また、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与により、独特の免疫応答プロフィールが生じることを実証する。
【０１２２】
例２０：免疫調節オリゴヌクレオチドにより誘発されたヒトＢ細胞増殖
健康なヒトのボランティアから得られたＰＢＭＣから単離されたヒトＢ細胞を、さまざまな濃度の免疫調節オリゴヌクレオチドにより刺激し、３Ｈ−チミジン取込みを、シンチレーション測定により決定した（図１４）。図１４は、新規な塩基を含有する免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与により、塩基組成物および投与するオリゴヌクレオチドの量により様々である独特の細胞増殖プロフィールが生じることを実証する。
【０１２３】
例２１：免疫調節オリゴヌクレオチドによるサイトカイン／ケモカイン誘発
ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＭＣＰ−１の誘発を、ヒトＰＢＭＣ細胞培養において免疫調節オリゴヌクレオチド２６（配列番号２６）、２７（配列番号２７）、２８（配列番号２８）、または対照免疫調節オリゴヌクレオチド２９（配列番号２９）により決定した（表５）。
【表６】
【０１２４】
例２２：ＣｐＧモチーフ中にｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣを含有する免疫調節オリゴヌクレオチドは、ヒトＰＢＭＣおよびＢ細胞を活性化する
ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣ修飾物を有する免疫調節オリゴヌクレオチドのヒトＰＢＭＣを活性化させるおよびサイトカイン生成を誘発する能力を、さらに試験した。これらのアッセイにおいて、ヒト特異的なモチーフを含有した免疫調節オリゴヌクレオチド２７（配列番号２７）および２８（配列番号２８）を使用した（表４Ａ）。免疫調節オリゴヌクレオチド２７（配列番号２７）および２８（配列番号２８）は両方、対照２９（配列番号２９）よりも、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＭＣＰ−１を誘発し（表５）、修飾物は耐性があり、ヒトＴＬＲ９を活性化することを実証した。免疫調節オリゴヌクレオチド２７（配列番号２７）および２８（配列番号２８）は両方、対照の免疫調節オリゴヌクレオチド２９（配列番号２９）と比較して用量依存性Ｂ細胞増殖を誘発した（図１４）。
【０１２５】
同等物
前述の発明が、明確化および理解を目的として詳細に記載されている一方、当然のことながら、当業者であれば、本発明の開示を読むことにより、形態および詳細のさまざまな変形を、本発明の真の範囲および特許請求の範囲から逸脱することなく想到することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの直線的合成に好適な一群の代表的な小分子リンカーを表す図である。
【図２】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの平行合成に好適な一群の代表的な小分子リンカーを表す図である。
【図３】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの直線的合成のための合成スキームを表す図である。
【図４】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの平行合成のための合成スキームを表す図である。
【図５Ａ】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養におけるＩＬ−１２およびＩＬ−６レベルを示す図である。
【図５Ｂ】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養におけるＩＬ−１２およびＩＬ−６レベルを示す図である。
【図５Ｃ】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養におけるＩＬ−１２およびＩＬ−６レベルを示す図である。
【図５Ｄ】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養におけるＩＬ−１２およびＩＬ−６レベルを示す図である。
【図６Ａ】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のヒトＰＢＭＣ培養におけるＩＬ−６レベルを示す図である。
【図６Ｂ】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のヒトＰＢＭＣ培養におけるＩＬ−１０レベルを示す図である。
【０１２７】
【図７】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＨＥＫ２９３細胞におけるＴＬＲ９活性を、それらのＮＦ−κＢ活性により測定し、示す図である。
【図８】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの皮下（ｓ．ｃ．）投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＩＬ−１２レベルを示す図である。
【図９】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける脾臓重量を示す図である。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｄは本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与後のＯＶＡ感作マウス脾臓細胞におけるＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γレベルを示す図である。
【図１１】免疫調節オリゴヌクレオチドおよび対照化合物１０ｍｇ／ｍｌの濃度による、マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞の活性を実証する図である。
【図１２】図１２Ａ〜図１２ＢはＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞培養における本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによるサイトカイン分泌の誘発を実証する図である。
【図１３】図１３Ａは動物がｓ．ｃ．投与で免疫調節オリゴヌクレオチド、対照化合物、またはＰＢＳを受けた７２時間後の脾腫を実証する図である。図１３Ｂは動物がｓ．ｃ．投与後に免疫調節オリゴヌクレオチドにより誘発されたＩＬ−１２分泌を実証する図である。
【図１４】免疫調節オリゴヌクレオチドにより誘発されたヒトＢ細胞増殖を実証する図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＣＧで表される少なくとも１つの免疫調節ジヌクレオチドを含む免疫調節オリゴヌクレオチドであって、式中、Ｃはシトシン、２’−デオキシシトシン、Ｎ３−メチル−ｄＣ、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣであり、Ｇはグアノシン、２’−デオキシグアノシン ２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、アラビノグアノシンまたはＮ１−メチル−ｄＧであり、ただしＣがシトシンまたは２’−デオキシシトシンであるとき、ＧはＮ１−メチル−ｄＧであり、さらにＧがグアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであるとき、ＣはＮ３−メチル−ｄＣ、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣである、前記免疫調節オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
構造
【化１】
を有し、ここで、Ｃ１＝Ｎ３−メチル−ｄＣ、Ｃ２＝ｄＦ、Ｃ３＝Ψ−イソ−ｄＣ、Ｇ１＝Ｎ１−メチル−ｄＧおよびＸ＝グリセロールリンカーである、請求項１に記載の免疫調節オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤。
【請求項４】
脊椎動物において免疫応答を生じさせるための方法であり、脊椎動物に請求項１に記載の免疫調節オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項５】
投与経路が、非経口、経口、舌下、経皮、局所、粘膜、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼薬および口腔洗浄薬から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
免疫調節オリゴヌクレオチドが、
【化２】
から選択され、ここで、Ｃ１＝Ｎ３−メチル−ｄＣ、Ｃ２＝ｄＦ、Ｃ３＝Ψ−イソ−ｄＣ、Ｇ１＝Ｎ１−メチル−ｄＧおよびＸ＝グリセロールリンカーである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法であり、患者に請求項１に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
投与経路が、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼薬および口腔洗浄薬から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
免疫調節オリゴヌクレオチドが、
【化３】
から選択され、ここで、Ｃ１＝Ｎ３−メチル−ｄＣ、Ｃ２＝ｄＦ、Ｃ３＝Ψ−イソ−ｄＣ、Ｇ１＝Ｎ１−メチル−ｄＧおよびＸ＝グリセロールリンカーである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
脊椎動物における癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を予防する方法であり、脊椎動物に請求項１に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
投与経路が、非経口、経口、舌下、経皮、局所、粘膜、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼薬および口腔洗浄薬から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
免疫調節オリゴヌクレオチドが、
【化４】
から選択され、ここで、Ｃ１＝Ｎ３−メチル−ｄＣ、Ｃ２＝ｄＦ、Ｃ３＝Ψ−イソ−ｄＣ、Ｇ１＝Ｎ１−メチル−ｄＧおよびＸ＝グリセロールリンカーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
式５’−ピリミジン−プリン−３’で表される免疫刺激ジヌクレオチドを含み、式中、ピリミジンがＮ３−メチル−ｄＣであり、プリンが天然または修飾プリンヌクレオシドである、免疫調節オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１９】
式５’−ピリミジン−プリン−３’で表される免疫刺激ジヌクレオチドを含み、式中、ピリミジンが天然または修飾ピリミジンヌクレオシドであり、プリンがＮ１−メチル−ｄＧである、免疫調節オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２０】
請求項１８に記載のオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤。
【請求項２１】
請求項１９に記載のオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤。
【請求項２２】
脊椎動物において免疫応答を生じさせるための方法であり、脊椎動物に請求項１８に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
脊椎動物において免疫応答を生じさせるための方法であり、脊椎動物に請求項１９に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項２４】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法であり、患者に請求項１８に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項２５】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法であり、患者に請求項１９に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
脊椎動物における癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を予防する方法であり、脊椎動物に請求項１８に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
脊椎動物における癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を予防する方法であり、脊椎動物に請求項１９に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項２８】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
式５’−ピリミジン−プリン−３’で表される免疫刺激ジヌクレオチドを含み、式中、ピリミジンがＮ３−メチル−ｄＣであり、プリンがＮ１−メチル−ｄＧである、免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項３９】
請求項３８に記載のオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤。
【請求項４０】
脊椎動物において免疫応答を生じさせるための方法であり、脊椎動物に請求項３８に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項４１】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法であり、患者に請求項３８に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項４２】
脊椎動物における癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法であり、脊椎動物に請求項３８に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項４３】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項１】
式ＣＧで表される少なくとも１つの免疫調節ジヌクレオチドを含む免疫調節オリゴヌクレオチドであって、式中、Ｃはシトシン、２’−デオキシシトシン、Ｎ３−メチル−ｄＣ、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣであり、Ｇはグアノシン、２’−デオキシグアノシン ２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、アラビノグアノシンまたはＮ１−メチル−ｄＧであり、ただしＣがシトシンまたは２’−デオキシシトシンであるとき、ＧはＮ１−メチル−ｄＧであり、さらにＧがグアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであるとき、ＣはＮ３−メチル−ｄＣ、ｄＦまたはΨ−イソ−ｄＣである、前記免疫調節オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
構造
【化１】
を有し、ここで、Ｃ１＝Ｎ３−メチル−ｄＣ、Ｃ２＝ｄＦ、Ｃ３＝Ψ−イソ−ｄＣ、Ｇ１＝Ｎ１−メチル−ｄＧおよびＸ＝グリセロールリンカーである、請求項１に記載の免疫調節オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤。
【請求項４】
脊椎動物において免疫応答を生じさせるための方法であり、脊椎動物に請求項１に記載の免疫調節オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項５】
投与経路が、非経口、経口、舌下、経皮、局所、粘膜、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼薬および口腔洗浄薬から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
免疫調節オリゴヌクレオチドが、
【化２】
から選択され、ここで、Ｃ１＝Ｎ３−メチル−ｄＣ、Ｃ２＝ｄＦ、Ｃ３＝Ψ−イソ−ｄＣ、Ｇ１＝Ｎ１−メチル−ｄＧおよびＸ＝グリセロールリンカーである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法であり、患者に請求項１に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
投与経路が、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼薬および口腔洗浄薬から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
免疫調節オリゴヌクレオチドが、
【化３】
から選択され、ここで、Ｃ１＝Ｎ３−メチル−ｄＣ、Ｃ２＝ｄＦ、Ｃ３＝Ψ−イソ−ｄＣ、Ｇ１＝Ｎ１−メチル−ｄＧおよびＸ＝グリセロールリンカーである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
脊椎動物における癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を予防する方法であり、脊椎動物に請求項１に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
投与経路が、非経口、経口、舌下、経皮、局所、粘膜、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼薬および口腔洗浄薬から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
免疫調節オリゴヌクレオチドが、
【化４】
から選択され、ここで、Ｃ１＝Ｎ３−メチル−ｄＣ、Ｃ２＝ｄＦ、Ｃ３＝Ψ−イソ−ｄＣ、Ｇ１＝Ｎ１−メチル−ｄＧおよびＸ＝グリセロールリンカーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
式５’−ピリミジン−プリン−３’で表される免疫刺激ジヌクレオチドを含み、式中、ピリミジンがＮ３−メチル−ｄＣであり、プリンが天然または修飾プリンヌクレオシドである、免疫調節オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１９】
式５’−ピリミジン−プリン−３’で表される免疫刺激ジヌクレオチドを含み、式中、ピリミジンが天然または修飾ピリミジンヌクレオシドであり、プリンがＮ１−メチル−ｄＧである、免疫調節オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２０】
請求項１８に記載のオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤。
【請求項２１】
請求項１９に記載のオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤。
【請求項２２】
脊椎動物において免疫応答を生じさせるための方法であり、脊椎動物に請求項１８に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
脊椎動物において免疫応答を生じさせるための方法であり、脊椎動物に請求項１９に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項２４】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法であり、患者に請求項１８に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項２５】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法であり、患者に請求項１９に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
脊椎動物における癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を予防する方法であり、脊椎動物に請求項１８に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
脊椎動物における癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を予防する方法であり、脊椎動物に請求項１９に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項２８】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
式５’−ピリミジン−プリン−３’で表される免疫刺激ジヌクレオチドを含み、式中、ピリミジンがＮ３−メチル−ｄＣであり、プリンがＮ１−メチル−ｄＧである、免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項３９】
請求項３８に記載のオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤。
【請求項４０】
脊椎動物において免疫応答を生じさせるための方法であり、脊椎動物に請求項３８に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項４１】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法であり、患者に請求項３８に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項４２】
脊椎動物における癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾病を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法であり、脊椎動物に請求項３８に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項４３】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントを投与することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００９−５２０５０２（Ｐ２００９−５２０５０２Ａ）
【公表日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４７４２５（Ｐ２００８−５４７４２５）
【出願日】平成１８年１２月１９日（２００６．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４８３６２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８４２３７
【国際公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【出願人】（３９８０３２７１７）イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (38)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１９日（２００６．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４８３６２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８４２３７
【国際公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【出願人】（３９８０３２７１７）イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (38)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]