Ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａリパーゼによるα−置換カルボン酸またはそのエステルの酵素分割
【課題】α−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの鏡像体混合物の酵素分割法を提供する。
【解決手段】製薬及び農薬の分野で有用なα−アルキルカルボン酸、α−ハロゲンカルボン酸などあるいはそのエステルまたはチオエステルのＲ−及びＳ−鏡像異性体の混合物をCarica papayaリパーゼを生体触媒として使用し、陰イオン交換樹脂担体上に保持した有機塩基と有機溶媒との組み合わせにより処理して分割する。
【解決手段】製薬及び農薬の分野で有用なα−アルキルカルボン酸、α−ハロゲンカルボン酸などあるいはそのエステルまたはチオエステルのＲ−及びＳ−鏡像異性体の混合物をCarica papayaリパーゼを生体触媒として使用し、陰イオン交換樹脂担体上に保持した有機塩基と有機溶媒との組み合わせにより処理して分割する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、台湾出願番号第０９３１１９７１８号「α−置換された酸及びそのエステルの動力学的分割方法」（２００４年６月３０日出願）に基づく利益を主張する。
【０００２】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、所望の分割を達成するための生体触媒としてCarica papayaリパーゼが使用される、α−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体の混合物を酵素分割する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
光学活性であるα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルは、そのα−炭素に立体中心を持つ一群の化合物である。α−（ヘテロ）アリールカルボン酸、α−アリールオキシプロピオン酸、α−アルキルカルボン酸、α−ハロゲンカルボン酸及びα−アミノ酸のような、鏡像異性的に富むα−置換カルボン酸は、製薬及び農薬の分野における合成ユニットとして、または分解剤（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｇｅｎｔｓ）として非常に重要である（Ｓｈｅｌｄｏｎ， Ｒ． Ａ． “Ｃｈｉｒｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”， １９９３， ｐｐ．２０５−２７０； Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ， Ｒ． ａｎｄ Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ， Ｕ．， “Ｂｉｏｔｒａｓｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｌｉｐａｓｅｓ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．８ａ， １９９８， ｐｐ．１０３−１１８； Ｆａｂｅｒ， Ｋ．， Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０００， ｐｐ．９４−１２３ ａｎｄ ｐｐ．３４４−３６６）。
【０００４】
例えば、市販されている（Ｓ）−ナプロキセン、（Ｓ）−フェノプロフェン、（Ｓ）−イブプロフェン、（Ｓ）−ケトプロフェン、（Ｓ）−フルルビプロフェン及び（Ｓ）−スプロフェンのようなα−アリールオキシプロピオン酸は、鎮痛、解熱及び抗炎症作用を持つ非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である（Ｃｈａｎｇ， Ｃ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， “Ｌｉｐａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｄｙｎａｍｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｐｒｏｘｅｎ ２，２，２−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ ｂｙ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｉｓｏｏｃｔａｎｅ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １９９９， Ｖｏｌ．６４， ｐｐ．１２０−１２６； ＵＳ ６，２０１，１５１ ｉｓｓｕｅｄ ｔｏ Ｓ．−Ｗ． Ｔｓａｉ ａｎｄ Ｃ．−Ｓ． Ｃｈａｎｇ； Ｓｅｈｇａｌ， Ａ．Ｃ． ａｎｄ Ｋｅｌｌｙ， Ｒ．Ｍ．， “Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｅｓｔｅｒａｓｅｓ ｆｏｒ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ２−ａｒｙｌｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ｅｓｔｅｒｓ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ， ２００３， Ｖｏｌ．１９， ｐｐ．１４１０−１４１６； Ｓｔｅｅｎｋａｍｐ， Ｌ． ａｎｄ Ｂｒａｄｙ， Ｄ．， “Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒ，Ｓ−ｎａｐｒｏｘｅｎ ｅｓｔｅｒ，” Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００３， Ｖｏｌ．３２， ｐｐ．４７２−４７７； Ｌｉｎ， Ｈ．−Ｙ． ａｎｄ Ｔｓａｉ， Ｓ．−Ｗ．， “Ｄｙｎａｍｉｃ ｋｉｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ （Ｒ，Ｓ）−ｎａｐｒｏｘｅｎ ２，２，２−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ ｖｉａ ｌｉｐａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏ−ａｑｕｅｏｕｓ ｉｓｏｏｃｔａｎｅ，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ： Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ， ２００３， Ｖｏｌ．２４−２５， ｐｐ．１１１−１２０）。
【０００５】
（Ｒ）−２−フェノキシプロピオン酸、（Ｒ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸、市販されている（Ｒ）−メコプロプ及び（Ｒ）−ジクロフォップ等のような、（Ｒ）−α−アリールオキシプロピオン酸は、除草剤または除草剤合成の中間体として使用され得る（Ｕｊａｎｇ， Ｚ． ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ２−（４−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｕｓｉｎｇ Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ ｌｉｐａｓｅ，” Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００３， Ｖｏｌ．３８， ｐｐ．１４８３−１４８８）。さらに、（Ｒ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸、（Ｒ）−２−ブロモ−ｏ−トリル酢酸などのような（Ｒ）−２−ハロゲノ−２−アリール酢酸は、上記除草剤または医薬品の中間体として役に立ち得る。（Ｇｕｉｅｙｓｓｅ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， “Ｌｉｐａｓｅ−ｃａｔａｌｌｙｚｅｄ ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏｗａｒｄ ｅｓｔｅｒｓ ｏｆ ２−ｂｒｏｍｏ−ｔｏｌｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄｓ，” Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ： Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ， ２００３， Ｖｏｌ．１４， ｐｐ．３１７−３２３）。
【０００６】
（Ｓ）−２−メチルヘキサン酸及び（Ｓ）−２−メチルブタン酸のような、光学活性である２−メチルアルカン酸は、昆虫フェロモン、香辛料及び人工甘味料の合成のための中間体として役に立ち得る（Ｈｅｉｎｓｍａｎ， Ｎ． Ｗ． Ｊ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， “Ｌｉｐａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ，” Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ２００２， Ｖｏｌ．２０， ｐｐ．２９７−３０９）。
【０００７】
近年、酵素のエンジニアリング技術の大きな進歩により、高エナンチオ選択的及び有機溶媒耐性であるリパーゼを利用し、有機溶媒の存在下／非存在下で、前述のα−アリールプロピオン酸、あるいはその対応するエステル、チオエステルまたはアミド誘導体のラセミ混合物の、加水分解、エステル化、エステル交換またはアミノ化による分割を行う、多くの工業的方法が確立された。酵素に触媒されるラセミ混合物の分割は、光学的に純粋な医薬品、農薬及び他の特殊な薬品を得る有益な方法となった。
【０００８】
用途の広い生体触媒としてのリパーゼ（トリアシルグリセロールヒドロラーゼ、 ＥＣ ３．１．１．３）は、脂質転化及び様々なラセミ化合物の動力学的分割に広く用いられている（Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ ａｎｄ Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ （１９９８）， ｓｕｐｒａ； Ｋ． Ｆａｂｅｒ （２０００）， ｓｕｐｒａ）。現在、大部分の工業用リパーゼは、一般に、微生物（ペニシリウム属、ゲオトリクム属、アスペルギルス属、リゾムコール属、カンジダ属またはシュードモナス属のような）、または動物（反芻動物の膵臓及びプレガストリック（ｐｒｅｇａｓｔｒｉｃ）組織）から生産される（Ｓｔｅｅｎｋａｍｐ ａｎｄ Ｂｒａｄｙ（２００３）， ｓｕｐｒａ）。
【０００９】
標準的な動力学的分割方法には、ラセミ体である出発基質に対し、所望の光学活性生成物を最大で５０％しか得ることができないという欠点がある。光学純度及び有益な生成物への転化を増大させるため、分割プロセス中の反応混合物に、塩基、有機金属、ハロゲンイオンまたはラセマーゼのようなラセミ化触媒を添加する方法がさらに開発され、これにより、分割酵素による動力学的分割を非常に促進できた（ＵＳ ６，２０１，１５１ ｉｓｓｕｅｄ ｔｏ Ｓ．−Ｗ． Ｔｓａｉ ａｎｄ Ｃ．−Ｓ． Ｃｈａｎｇ； Ｃ．−Ｙ． Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００２）， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．６７， Ｎｏ．１０， ｐｐ．３３２３−３３２６参照）。
【００１０】
特に、米国特許第６，２０１，１５１号において本出願人は、（Ｓ）−立体選択的なリパーゼ及び塩基、並びに必要であればアルコールの存在下で種々の水性有機溶媒中で、選択されたラセミ体であるα−アリールプロピオン酸のチオエステルのエステル交換または加水分解を行うために実施し得、これにより、所望の（Ｓ）−α−アリールプロピオン酸あるいはそのエステルまたはチオエステルを、理論的にはほぼ１００％の転化率及び高い光学純度で得ることができる、光学活性の（Ｓ）−α−アリールプロピオン酸あるいはそのエステルまたはチオエステルの調製方法を開示した。該方法での使用に適したリパーゼは、アスペルギルス ニガー、カンジダ ルゴサ、ゲオトリクム、シュードモナス セパチア、リゾープス オリザエなどを含む微生物から得られ、好ましくはカンジダ ルゴサから得られる。
【００１１】
アルコールやアミンに対する高度なエナンチオ選択性とは対照的に、ほとんどのリパーゼはカルボン酸に対し、低〜中度のエナンチオ選択性を示す（Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ ａｎｄ Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ（１９９８）， ｓｕｐｒａ； Ｋ．Ｆａｂｅｒ（２０００）， ｓｕｐｒａ）。通常、反応を行う前に粗製の調製物からのリパーゼ・アイソエンザイムを精製または修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）することは必須であるにも関わらず、α−アリールプロピオン酸及びα−アリールオキシプロピオン酸に対し高いエナンチオ選択性を示すカンジダ ルゴサ・リパーゼ（Candida rugosa lipase；ＣＲＬ）の場合にはあてはまらない（Ｉ．Ｊ． Ｃｏｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５）， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ６０：２１２−２１７； Ｊ．Ｊ． Ｌａｌｏｎｄｅ ｅｔ ａｌ． （１９９５）， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１７：６８４５−６８５２）。しかしながら、一般に、ＣＲＬは、極性有機溶媒、極端なｐＨ及び高温に対し、低い耐性を示す。したがって、高い酵素活性、エナンチオ選択性、及び高温下での安定性を持つ、キラル酸に対するリパーゼの選択または発見は、競争の激しい工業的バイオプロセスの発展に、明らかに欠くことのできないものである。
【００１２】
植物リパーゼは低コスト、精製の容易さ、及び天然供給源から広く利用可能な点により、非常に魅力的なように思われるにも関わらず、発芽種子、穀物のブラン部分、及び小麦麦芽中のリパーゼ含有量の低さが、実験的または大規模な利用における広範な用途を制限してきた。
【００１３】
近年、例えばCaricaceaeまたはEuphorbiaceaeラテックスのような植物ラテックス由来のリパーゼが、大量に得られるようになってきた（Ｃ． Ｄｈｕｉｑｕｅ−Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００１）， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ．， ２３：１０２１−１０２４； Ｃ． Ｐａｌｏｃｃｉ ｅｔ ａｌ． （２００３）， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．， １６５：５７７−５８２； Ｐ． Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ （２００３）， ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， １０５：３０８−３１７）。パパインの市販名を持つ、噴霧乾燥されたCarica papayaラテックスは、多くのシステインチオールプロテアーゼ、例えばパパイン（ＥＣ ３４．４．２２．２）、キモパパイン Ａ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３、並びにパパイア・ペプチダーゼII、並びにリゾチーム、グルタミニルシクラーゼ、クラスIIキチナーゼ、及びリパーゼのような他のものを含んでいることが良く知られている（Ｍｏｕｓｓａｏｕｉ ＡＥＩ ｅｔ ａｌ．（２００１），ＣＭＬＳ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５８：５５６−５７０）。リパーゼ活性は、ラテックスの非水溶性の画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）に局在し、C. papayaリパーゼ（ＣＰＬ）が非可溶のマトリクスに自然に結合し、固定されることを示唆している。粗製のパパインは豊富に得ることができ、安価であり、例えばＳｉｇｍａ社の粗製のカンジダ ルゴサ・リパーゼ（ＣＲＬ）の約４分の１から３分の１の価格であるため、脂質転化における、微生物リパーゼの有望な代替物と考えられてきた。しかしながら、キラルであるｓｎ−３トリグリセリドの動力学的分割におけるＣＰＬの使用に言及した１つの報告（Ｐ． Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ ｅｔ ａｌ． （１９９５）， Ｊ． Ａｍ． Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．， ７２：７５３−７５５）を除いて、ＣＰＬの性質は、酵素活性、基質選択性、熱安定性などの観点からは、まだ調査されていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要約
本出願人は、実験から、驚くべきことに、Carica papayaリパーゼが、選択されたα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｓ−鏡像異性体またはＲ−鏡像異性体のいずれかに対して、高度にエナンチオ選択的であることを見出した。従って、一つの観点から、本発明は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体の混合物を酵素分割する方法を提供する：
【００１５】
【化１】
【００１６】
ここで、
Ｘは−Ｏ−または−Ｓ−を示し、
Ｙはハロゲンまたはメチル基であり、
Ｒ１は、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基及びアリール基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、アリールオキシ基または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基を示し；そして、
Ｒ２は、Ｈ；ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ基、アリール基、ビニル及び３〜１２の炭素原子を有する２−アルケニル基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ１２脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基を示し；
ただし、Ｙ及びＲ１は同時にメチルになり得ず；
該方法は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体の混合物を、液相中で、Carica papayaリパーゼにより触媒される酵素分割に供することを包含する。
【００１７】
本発明に従う方法の好ましい実施形態において、該混合物は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割は、水溶液、水飽和有機溶媒、及び二相溶液を形成するこれらの組み合わせから選択される溶媒系を含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかは、Carica papayaリパーゼにより、エナンチオ選択的に加水分解される。
【００１８】
本発明に従う方法の他の好ましい実施形態において、該混合物は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割は、無水有機溶媒とアルコールの組み合わせを含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかは、Carica papayaリパーゼにより、エナンチオ選択的に該アルコールを用いてエステル交換される。
【００１９】
本発明に関する方法のさらにもう一つの好ましい実施形態において、該混合物は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸の、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割は、無水有機溶媒とアルコールの組み合わせを含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸の、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかは、Carica papayaリパーゼにより、エナンチオ選択的に該アルコールを用いてエステル化される。
【００２０】
上述される本発明の方法を行う場合、好ましくは有機溶媒系を含む液相は、所望の光学活性生成物の転化を促進するために、ラセミ化触媒の役割をする有機塩基をさらに含み得る。
【００２１】
本発明に従う方法の実施により、カンジダ ルゴサ・リパーゼ（Candida rugosa lipase;ＣＲＬ）を生体触媒として用いる従来の方法に比べ、より効率的及び経済的に、高純度及び高収率の光学活性生成物が得られることが見出された。
【００２２】
本発明の、上記及び他の目的、特徴及び利点は、以下の本発明の詳細な説明を参照することにより、明白に理解されるだろう。
【００２３】
本発明の詳細な説明
現在利用可能な、α−置換カルボン酸あるいはそのエステルの動力学的分割方法のほとんどは、非常に高価で、得ることが困難なリパーゼを使用する。このような方法を行うのに必要なコストを削減するため、及び分割反応のエナンチオ選択性を増大させるために、本出願人は、α−置換カルボン酸あるいはそのエステルの酵素分割における生体触媒としての使用に適した新たなリパーゼを見出そうと試みた。
【００２４】
パパイアは、世界の熱帯・亜熱帯地域において、非常に重要な経済的作物である。カンジダ ルゴサ・リパーゼのような微生物由来のリパーゼとの比較では、Carica papayaリパーゼは比較的安価で入手しやすい。本出願人は、驚くべきことにCarica papayaリパーゼは、選択されたα−置換カルボン酸あるいはそのエステルまたはチオエステルのＲ−型またはＳ−型のいずれかの加水分解、エステル化またはエステル交換を、エナンチオ選択的に触媒することができ、所望の光学活性生成物を高収率、高純度及び高転化率で得られることを見出した。さらに、Carica papayaリパーゼは優れた熱安定性及び様々な有機溶媒に対する耐性を示す。
【００２５】
従って、本発明は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体の混合物を酵素分割する方法を提供する：
【００２６】
【化２】
【００２７】
ここで、
Ｘは−Ｏ−または−Ｓ−を示し、
Ｙはハロゲンまたはメチル基であり、
Ｒ１は、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基及びアリール基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、アリールオキシ基または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基を示し；そして、
Ｒ２は、Ｈ；ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ基、アリール基、ビニル及び３〜１２の炭素原子を有する２−アルケニル基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ１２脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基を示し；
ただし、Ｙ及びＲ１は同時にメチルになり得ず、
該方法は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体の混合物を、液相中で、Carica papayaリパーゼにより触媒される酵素分割に供することを包含する。
【００２８】
本発明によれば、Carica papayaリパーゼは、Carica papaya植物のラテックス浸出物、例えばCarica papaya植物の葉、ステム、未熟な果実または傷ついた表面の浸出ラテックスから調製し得る。パパインの市販名を持つ、噴霧乾燥されたCarica papayaラテックスは、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ． （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ， ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｄｅ Ｐ３３７５， ａ ｃｙｓｔｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｏｆ ２．１ ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｓｏｌｉｄ， ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｒｏｍ Ｓｒｉ Ｌａｎｋａ）から購入可能である。部分的に精製されたＣＰＬ（ＰＣＰＬ）は、市販パパインまたは自家製Carica papayaラテックスを、水溶液または緩衝溶液あるいは有機溶媒に穏やかに攪拌しながら溶解した後、遠心分離または濾過を行って沈殿物を得、続いて該沈殿物を凍結乾燥することにより得られ得る。得られた凍結乾燥生成物は、すぐに使用可能であり、また、さらに純粋な酵素生成物を得るために再び上記の処理を実施し得る。
【００２９】
本発明によれば、ここで使用される用語「脂肪族基」は、それぞれがＲ１及びＲ２について記載されている１〜３個の置換基によって必要に応じて置換され得る、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和の、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基を含む。
【００３０】
本発明によれば、ここで使用される用語「アリール基」は、それぞれがＲ１及びＲ２について記載されている１〜３個の置換基によって必要に応じて置換され得る、フェニル、フェノキシ、ナフチル、ナフトキシ、テトラヒドロナフチル等を含む。
【００３１】
本発明によれば、ここで使用される用語「複素環基」は、それぞれがＲ１及びＲ２について記載されている１〜３個の置換基によって必要に応じて置換され得る、チエニル、テノイル、フリル、ピリジル、ピラジニル、イミダジル、ピラニル等を含む。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルにおけるＲ１は、それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ２０アルキル基、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ２０アルケニル基、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ２０アルキニル基及び直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ２０シクロアルキル基からなる群より選択される。
【００３３】
本発明の他の好ましい実施形態において、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルにおけるＲ１基は、それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択されるヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される。
【００３４】
Ｒ１の代表的な例は、ブチル、ヘキシル、オクチル、ペント−３−エニル、フェニル、フェノキシ、２−クロロフェニル、ベンジル、フェニルエチル、ナフチル、６−メトキシ−２−ナフチル、ナフトキシ、（２−フルオロ−３−フェニル）フェニル、４−クロロフェノキシ、２−（２，４−ジクロロフェノキシ）フェニル、ｍ−フェノキシ−フェニル、ｐ−フェノキシ−フェニル、４−イソブチル−フェニル、（２−ベンゾイル）フェニル、ｐ−テノイル−フェニル、Ｎ−メチルイミダジル、４−ニトロピリジル、ピラジニル等を含むがこれらに制限されない。
【００３５】
好ましくは、Ｒ２基は、そのＣ２及び／またはＣ３の位置に少なくとも１つの電子求引性の置換基を持つ。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態において、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルにおけるＲ２基は、水素である。
【００３７】
本発明の他の好ましい実施形態において、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルにおけるＲ２基は、それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ基、アリール基、ビニル及び３〜１２の炭素原子を有する２−アルケニル基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ１２アルキル基、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ１２アルケニル基、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ１２アルキニル基、及び直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ１２シクロアルキルからなる群より選択される。
【００３８】
本発明のさらにもう一つの好ましい実施形態において、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルにおけるＲ２基は、それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択されるヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される。
【００３９】
式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルにおけるＲ２基の代表的な例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ビニル、エチニル、２−アリル、２−ブテニル、２−クロロエチル、２−ブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、２−クロロプロピル、（トリメチルシリル）メチル、（トリメチルシリル）エチル、ベンジル、ナフチルメチル等を含むが、これらに制限されない。
【００４０】
式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの代表的な例は、下記の化合物：
ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸または２−クロロ−２−フェニル酢酸の、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、フェニルまたはトリフルオロエチル エステル；ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸または２−クロロ−２−フェニル酢酸の、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、フェニルまたはトリフルオロエチル チオエステル；及び、ジクロフォッグ（ｄｉｃｌｏｆｏｇ）メチルエステルを含むがこれらに制限されない。
【００４１】
式（Ｉ）のα−置換カルボン酸の代表的な例は、ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸、２−クロロ−２−フェニル酢酸、及びジクロフォッグを含むが、これらに制限されない。
【００４２】
本発明の方法は、水溶液、無水有機溶媒、水飽和有機溶媒、及び二相溶液を形成するこれらの組み合わせから選択される溶媒系を含む液相中で実施し得る。
【００４３】
本発明の方法での使用に適した水溶液は、水及び緩衝水溶液から選択し得る。
【００４４】
本発明の方法での使用に適した有機溶媒は、イソオクタン、ヘプタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ペンタン、デカン、トルエン、ベンゼン、四塩化炭素、ｔ−ブタノール、ｔ−ペンタノール、イソプロピルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル、メチルイソブチルエーテル及びこれらの組み合わせから選択し得る。
【００４５】
あるいは、本発明の方法は、水溶液及び１またはそれ以上の混和性（ｍｉｓｃｉｂｌｅ）の有機相を生じる有機溶媒からなる二相溶液を含む液相中で実施し得る。
【００４６】
本発明の方法は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルのラセミ混合物の酵素分割に使用し得る。過剰のＲ−鏡像異性体またはＳ−鏡像異性体を含む、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの混合物も、本発明の方法により処理し得る。
【００４７】
本発明の方法において、ラセミ化触媒として作用する有機塩基を、所望の光学活性生成物の転化を促進するために、液相に加え得る。
【００４８】
本発明の方法における使用に適した有機塩基は、第三級アミン、アミジン、グアニジン、ホスファゼン塩基及びこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。好ましくは、有機塩基は、トリエチルアミン、トリブチルアミン、トリオクチルアミン、１−ｔ−ブチル−４，４，４−トリス（ジメチルアミノ）−２，２−ビス［トリス（ジメチルアミノ）−ホスホラニリデンアミノ］−２λ５，４λ５−カテナジ（ホスファゼン）、ジエチルアミノメチル−ポリスチレン、ｔ−ブチルイミノ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホラン、７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４，４，０］デカ−５−エン、ｔ−ブチルイミノ−トリス（ピロリジノ）ホスホラン、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。さらに、有機塩基は、有機担体及び無機担体から選択されるた担体上に保持され得る。例えば、有機塩基は陰イオン交換樹脂上に保持される。
【００４９】
本発明の方法は、Carica papayaリパーゼが、選択された式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルのＲ−鏡像異性体及びＳ−鏡像異性体を含む混合物の酵素分割を触媒するのに適した温度で実施し得る。本発明の方法は、好ましくは２０℃から９０℃の範囲の温度、より好ましくは３０℃から７０℃の範囲の温度で実施される。
【００５０】
本発明に関する方法の好ましい実施形態において、該混合物は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼをによる該混合物の酵素分割は、水溶液、水飽和有機溶媒、及び二相溶液を形成するこれらの組み合わせから選択される溶媒系を含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかは、Carica papayaリパーゼにより、エナンチオ選択的に加水分解される。
【００５１】
Carica papayaリパーゼによる、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含む混合物の加水分解は、下記のスキームにより、図示され得る。
【００５２】
【化３】
【００５３】
さらに、記載されている有機塩基は、液相に添加し得、該有機塩基は、所望の光学活性のＲ−またはＳ−α−置換カルボン酸の転化を促進するため、好ましくは有機溶媒を含み得る。
【００５４】
本発明に従う方法の他の好ましい実施形態において、該混合物は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割は、無水有機溶媒とアルコールの組み合わせを含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかは、Carica papayaリパーゼにより、該アルコールを用いてエナンチオ選択的にエステル交換される。
【００５５】
Carica papayaリパーゼによる、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルのＲ−及びＳ−鏡像異性体を含む混合物のエステル交換は、下記のスキームにより、図示され得る。
【００５６】
【化４】
【００５７】
本発明に従う方法のさらにもう一つの好ましい実施形態において、該混合物は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸の、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる該混合物の酵素分割は、無水有機溶媒とアルコールの組み合わせを含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸の、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかは、Carica papayaリパーゼにより、該アルコールを用いてエナンチオ選択的にエステル化される。
【００５８】
Carica papayaリパーゼによる、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸のＲ−及びＳ−鏡像異性体を含む混合物のエステル化は、下記のスキームにより、図示され得る。
【００５９】
【化５】
【００６０】
Carica papayaリパーゼにより触媒される混合物の酵素分割に使用するのに適したアルコールは、式Ｒ３ＯＨであり、
ここで、Ｒ３はＲ２と異なり、そして：ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ基、アリール基、ビニル及び３〜１２の炭素原子を有する２−アルケニル基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ１２脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基；
を示す。
【００６１】
好ましくは、アルコールは、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、トリメチルシリルメタノール及び２−Ｎ−モルホリノエタノールからなる群より選択される。
【００６２】
本発明は、下記の実施例により、さらに説明されるだろう。当業者は、これらの実施例及び、本発明の基本的な、新規な、または有利な特性を利用し、この開示を通して示される実施例の変更を可能にする、多くの技術及び教示に精通している。従って、本発明の範囲は、ここで、または他のところで挙げられた特定の実施例によって制限されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
実施例
Ｉ．材料：
１．イソオクタン、シクロヘキサン、イソプロパノール及び氷酢酸は、Ｔｅｄｉａ Ｃｏ．（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）から購入した。
【００６４】
２．トリオクチルアミン及び２，２，２−トリフルオロエタノールは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）から購入した。
【００６５】
３．トリメチルシリルメタノールは、Ｆｌｕｋａ Ｃｏ．（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。
【００６６】
４．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンは、（Ｓ）−ナプロキセン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）をＮａＯＨを含むエチレングリコール中で１４０℃でラセミ化することにより得た（Ｓ．−Ｗ． Ｔｓａｉ ａｎｄ Ｈ．−Ｊ． Ｗｅｉ （１９９４）， Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． １６：３２８−３３３）。
【００６７】
５．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルは、（Ｓ）−ナプロキセン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）をラセミ化した後、生じたラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンを、２，２，２−トリフルオロエタンチオールでエステル化することにより得た（Ｃ．−Ｙ． Ｃｈｅｎ （２００２）， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ６７ （１０）： ３３２３−３３２６）。
【００６８】
６．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルエステルは、（Ｓ）−ナプロキセン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）をラセミ化した後、生じたラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンを、２，２，２−トリフルオロエタノールでエステル化することにより得た（Ｈ．−Ｙ． Ｌｉｎ ａｎｄ Ｓ．−Ｗ． Ｔｓａｉ （２００３）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃａｔａｌ． Ｂ： Ｅｎｚ．， ２４：１１１−２０）。
【００６９】
７．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−フェノプロフェン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルは、ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−フェノプロフェンのカルシウム塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）を２，２，２−トリフルオロエタンチオールでエステル化することにより得た。
【００７０】
８．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−イブプロフェン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルは、ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−イブプロフェン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）を２，２，２−トリフルオロエタンチオールでエステル化することにより得た。
【００７１】
９．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルは、ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）を２，２，２−トリフルオロエタンチオールでエステル化することにより得た。
【００７２】
１０．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ジクロフォッグメチルエステルは、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａeｎ Ｃｏ． （Ｓｅｅｌｖｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【００７３】
１１．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルは、２−クロロフェニルアセチルクロリドを２，２，２−トリフルオロエタンチオールでエステル化することにより得た。
【００７４】
１２．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸は、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）から購入した。
【００７５】
１３．Carica papayaリパーゼ（ＣＰＬ）：
（１）Ｓｉｇｍａ Ｃｏ． （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ， ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｄｅ Ｐ３３７５， ａ ｃｙｓｔｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｏｆ ２．１ ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｓｏｌｉｄ， ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｒｏｍ Ｓｒｉ Ｌａｎｋａ）から購入可能な市販製品である、粗製のパパイン；
（２）下記のように調製された、部分的に精製されたＣＰＬ（ＰＣＰＬ）：
粗製のパパイン１．３５ｇを、１５ｍＬの脱イオン水へ、４℃で３０分間穏やかに攪拌しながら添加した。得られた溶液を、１２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。
【００７６】
上澄みを廃棄した後、上記の手順を繰り返して沈殿を得、その沈殿を−４０℃、１００ｍｍＨｇで４時間、凍結乾燥し、粗製のパパインの重量に対し、１５％の回収率でＰＣＰＬを得た。
【００７７】
１４．他の、市販されている分析用の化学薬品は以下のとおりである：
ｎ−ヘキサン、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｎ−ヘキサノール、１，２−ジメトキシエタン、無水ピリジン、フェニルジクロロホスフェート、クロロホルム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、硫酸マグネシウム、酢酸エチル等。
【００７８】
II．一般手順：
１．水飽和有機溶媒の調製：
適切な量の脱イオン水を、イソオクタン及びシクロヘキサンのような選択された有機溶媒へ添加した。２４時間以上攪拌した後、有機層を後に使用するために集めた。水飽和有機溶媒の調製は、Carica papayaリパーゼによって触媒される酵素分割が行われるのと同一の温度で行なわれるのが好ましい。
【００７９】
２．（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルの合成：
氷冷した２５ｍＬの無水１，２−ジメトキシエタンに、４．３０ｍｍｏｌの（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン、１．１５ｍＬの無水ピリジン、１．０７ｍｍｏｌのフェニルジクロロホスフェート及び１０００ｍｇの２，２，２−トリフルオロエタンチオールを添加した。得られた混合物を室温で攪拌しながら１６時間反応させた後、氷冷した２０ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ溶液を添加した。その後、生成物を抽出するために、得られた混合物に２５ｍＬのクロロホルムを３０分間攪拌しながら添加した。有機層を集め、５０ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ溶液で２回、５０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液で２回の順序で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で２４時間乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。得られたオイルをｎ−ヘキサン：酢酸エチル（５：１，ｖ／ｖ）の移動相を用いたシリカゲル液体クロマトグラフィーによって精製した後、真空下で濃縮し、白い固形生成物を最初の（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンに対して６２％の収率で得た。
【００８０】
以下の実施例で使用される他の（Ｒ，Ｓ）−プロフェン２，２，２トリフルオロエチルチオエステルは、同様の方法で調製したのに対し、（Ｒ、Ｓ）−プロフェン２，２，２−トリフルオロエチルエステルはＨ．−Ｙ． Ｌｉｎ ａｎｄ Ｓ．−Ｗ． Ｔｓａｉ （２００３）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃａｔａｌ． Ｂ： Ｅｎｚ．， ２４：１１１−２０で述べられた手順により調製した。
【００８１】
３．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析：
選択された水飽和有機溶媒中での（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルエステルの加水分解及び、ｎ−プロパノールによる（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンのエステル化は、Ｒｅｇｉｓ Ｃｏ．（Ｍｏｒｔｏｎ Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ， ＵＳＡ）から購入した、２−ニトロトルエン、（Ｒ）−及び（Ｓ）−ナプロキセン並びに（Ｒ）−及び（Ｓ）−ナプロキセンエステルの内部標準を分割できるキラルカラム（Ｓ，Ｓ）−ＷＨＥＬＫ−０１を用いたＨＰＬＣによってモニターした。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸（８０：２０：０．５，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出を、カラム温度２５℃で行った。
【００８２】
異なる（Ｒ，Ｓ）−プロフェン、２−フェニルプロピオン酸及び２−クロロ−２−フェニル酢酸の、２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルの加水分解、並びに選択されたアルコールとの２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸のエステル化は、ニトロトルエン、（Ｒ）−及び（Ｓ）−チオエステルまたは（Ｒ）−及び（Ｓ）−エステル、並びに（Ｒ）−及び（Ｓ）−プロフェンの内部標準を分離できるキラルカラム（キラルセル ＯＤまたはＯＪＨ、ダイセル化学工業、東京、日本）を用いたＨＰＬＣによってモニターした。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸の混合物を、流速１ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出を、カラム温度２５℃で行った。
【００８３】
実施例１：Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルエステルの動力学的分割
水飽和有機溶媒は、一般手順II．１の前記項目で述べられた手順により、イソオクタンまたはシクロヘキサンのいずれかを使用して調製した。
【００８４】
ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルエステルを、調製した有機溶媒に添加し、濃度を３ｍＭとした。１５ｍLの得られたラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンエステル溶液に、粗製のパパイン（７５ｍｇ）または部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、１１．３ｍｇ）のいずれかを添加した。得られた混合物を、３５℃から７０℃の範囲から選択された温度下で、規定の時間、攪拌しながら反応させた。
【００８５】
試料のアリコート（２００μＬ）を規定の時間間隔で採取し、（Ｓ，Ｓ）−ＷＨＥＬＫ−０１カラム（Ｒｅｇｉｓ Ｃｏ．（Ｍｏｒｔｏｎ Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ， ＵＳＡ）を用いたＨＰＬＣ分析に供した。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸（８０：２０：０．５，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出を、カラム温度２５℃で行った。
【００８６】
時間ｔにおける（Ｓ）−ナプロキセンエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−ナプロキセンエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンエステルの転化率（Ｘｔで示す）、及び生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）の経時的変化は、下記の計算式に基づいてそれぞれ計算した：
【００８７】
【数１】
【００８８】
ここで：
（ＳＳ）０：時間０における（Ｓ）−ナプロキセンエステルの初期濃度（ｍＭ）
（ＳＲ）０：時間０における（Ｒ）−ナプロキセンエステルの初期濃度（ｍＭ）
（ＳＳ）ｔ：時間ｔ（ｈｒ）における（Ｓ）−ナプロキセンエステルの濃度（ｍＭ）；及び
（ＳＲ）ｔ：時間ｔ（ｈｒ）における（Ｒ）−ナプロキセンエステルの濃度（ｍＭ）
である。
【００８９】
さらに、鏡像異性体比（Ｅで示す）は、（Ｒ）−ナプロキセンエステルの初期反応速度に対する（Ｓ）−ナプロキセンエステルの初期反応速度、またはその反対として定義した。
【００９０】
式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体のラセミ混合物を酵素基質として用いる場合には、（ＳＳ）０＝（ＳＲ）０であり、そして、
Ｘｔ＝１−［（ＳＳ）ｔ＋（ＳＲ）ｔ］／［（ＳＳ）０＋（ＳＲ）０］＝（ＸＳ＋ＸＲ）／２
である。
【００９１】
第１表は、種々の溶媒系及び酵素を使用し、種々の温度下において、規定の時間間隔で実施した実験から集めた実験データをまとめたものである。
【００９２】
【表１】
【００９３】
実施例２：Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルの動力学的分割
上記実施例１に記載の手順により、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルを、選択された水飽和有機溶媒に添加し、１ｍＭの濃度にした。１５ｍＬの得られたラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンチオエステル溶液に、粗製のパパイン（１３５０ｍｇ）または部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、２０３ｍｇ）のいずれかを添加した。得られた混合物を、３５℃から６０℃の範囲から選択された温度下で、規定の時間、攪拌しながら反応させた。
【００９４】
試料のアリコート（２００μＬ）を規定の時間間隔で採取し、キラルセルＯＤカラム（ダイセル化学工業、東京、日本）を用いたＨＰＬＣ分析に供した。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸（９７：３：１，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出を、カラム温度２５℃で行った。
【００９５】
時間ｔにおける（Ｓ）−ナプロキセンチオエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−ナプロキセンチオエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンチオエステルの転化率（Ｘｔで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）、及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【００９６】
第２表は、種々の溶媒系及び酵素を使用し、種々の温度下において、規定の時間間隔で実施した実験から集めた実験データをまとめたものである。
【００９７】
【表２】
【００９８】
実施例３：Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−フェノプロフェン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルの動力学的分割
上記実施例１に記載の手順により、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−フェノプロフェン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルを、水飽和イソオクタンに添加し、１ｍＭの濃度にした。１５ｍＬの得られたラセミ体（Ｒ，Ｓ）−フェノプロフェンチオエステル溶液に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、２０３ｍｇ）を添加した。得られた混合物を、６０℃で、１７０時間、攪拌しながら反応させた。試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、キラルセルＯＤカラム（ダイセル化学工業、東京、日本）を用いたＨＰＬＣ分析に供した。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸（１００：１．０：０．５，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出を、カラム温度２５℃で行った。
【００９９】
時間ｔにおける（Ｓ）−フェノプロフェンチオエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−フェノプロフェンチオエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−フェノプロフェンチオエステルの転化率（Ｘｔで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）、及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１００】
この実施例により得られた実験データを第３表にまとめた。Carica papayaリパーゼが、（Ｓ）−フェノプロフェンチオエステルではなく、（Ｒ）−フェノプロフェンチオエステルの加水分解を触媒することが理解される。
【０１０１】
実施例４：Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−イブプロフェン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルの動力学的分割
上記実施例１に記載の手順により、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−イブプロフェン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルを、水飽和イソオクタンに添加し、１ｍＭの濃度にした。１５ｍＬの得られたラセミ体（Ｒ，Ｓ）−イブプロフェンチオエステル溶液に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、２０３ｍｇ）を添加した。得られた混合物を、４５℃で、１０４時間、攪拌しながら反応させた。試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、キラルセルＯＤカラム（ダイセル化学工業、東京、日本）を用いたＨＰＬＣ分析に供した。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール（１００：０，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出を、カラム温度２５℃で行った。
【０１０２】
時間ｔにおける（Ｓ）−イブプロフェンチオエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−イブプロフェンチオエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−イブプロフェンチオエステルの転化率（Ｘｔで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）、及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１０３】
この実施例により得られた実験データを第３表にまとめた。
【０１０４】
実施例５：Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−2−フェニルプロピオン酸２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルの動力学的分割
上記実施例１に記載の手順により、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルを、水飽和イソオクタンに添加し、１ｍＭの濃度にした。１５ｍＬの得られたラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸チオエステル溶液に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、２０３ｍｇ）を添加した。得られた混合物を、４５℃で、１７０時間、攪拌しながら反応させた。試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、キラルセルＯＤカラム（ダイセル化学工業、東京、日本）を用いたＨＰＬＣ分析に供した。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸（１００：０．３５：０．２２，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出をカラム温度２５℃で行った。
【０１０５】
時間ｔにおける（Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸チオエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−２−フェニルプロピオン酸チオエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸チオエステルの転化率（Ｘｔで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）、及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１０６】
この実施例により得られた実験データを第３表にまとめた。
【０１０７】
実施例６：Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ジクロフォッグメチルエステルの動力学的分割
上記実施例１に記載の手順により、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ジクロフォッグメチルエステルを、水飽和イソオクタンに添加し、１．５ｍＭの濃度にした。１５ｍＬの得られたラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ジクロフォッグメチルエステル溶液に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、１５ｍｇ）を添加した。得られた混合物を、４５℃で、１８．２時間、攪拌しながら反応させた。試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、キラルセルＯＪ−Ｈカラム（ダイセル化学工業、東京、日本）を用いたＨＰＬＣ分析に供した。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸（９７：３：１，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出をカラム温度２５℃で行った。
【０１０８】
時間ｔにおける（Ｓ）−ジクロフォッグメチルエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−ジクロフォッグメチルエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ジクロフォッグメチルエステルの転化率（Ｘｔで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）、及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１０９】
この実施例により得られた実験データを第３表にまとめた。Carica papayaリパーゼが、（Ｓ）−ジクロフォッグメチルエステルではなく、（Ｒ）−ジクロフォッグメチルエステルの加水分解を触媒することが理解され得る。
【０１１０】
実施例７：Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルの動力学的分割
上記実施例１に記載の手順により、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルを、水飽和イソオクタンに添加し、１ｍＭの濃度にした。１５ｍＬの得られたラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸チオエステル溶液に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、２５ｍｇ）を添加した。得られた混合物を、４５℃で、４８時間、攪拌しながら反応させた。試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、キラルセルＯＪ−Ｈカラム（ダイセル化学工業、東京、日本）を用いたＨＰＬＣ分析を行った。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸（２４０：１０：１，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２４０ｎｍでのＵＶ検出を、カラム温度２５℃で行った。
【０１１１】
時間ｔにおける（Ｓ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸チオエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸チオエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸チオエステルの転化率（Ｘｔで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）、及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１１２】
この実施例により得られた実験データを第３表にまとめた。Carica papayaリパーゼが、（Ｓ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸チオエステルではなく、（Ｒ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸チオエステルの加水分解を触媒することが理解され得る。
【０１１３】
【表３】
【０１１４】
実施例８：トリオクチルアミン存在下における、Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルエステルの動力学的分割
上記実施例１に記載の手順により、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルを、水飽和イソオクタンに添加し、１ｍＭの濃度にした。得られたラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンチオエステル溶液のアリコート（１０ｍＬ）に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、１３５ｍｇ）及び種々の濃度のトリオクチルアミンをそれぞれ添加した。得られた混合物を、４５℃で、規定の時間、攪拌しながら反応させた。その後、試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、上記実施例２に記載されているように、ＨＰＬＣ分析に供した。
【０１１５】
時間ｔにおける（Ｓ）−ナプロキセンチオエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−ナプロキセンチオエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンチオエステルの転化率（Ｘｔで示す）、及び生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１１６】
この実施例により得られた実験データを第４表にまとめた。トリオクチルアミンの添加により、ｅｅｐの値がおよそ１００％まで増大されることが理解される。
【０１１７】
【表４】
【０１１８】
実施例９：Carica papayaリパーゼを使用した酵素的エステル化による、（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンの動力学的分割
無水イソオクタンに、ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン及びｎ−プロパノールを添加し、それぞれ０．４５ｍＭ及び１５ｍＭの濃度にした。
【０１１９】
ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン及びｎ−プロパノールを含む、得られた溶液のアリコート（１５ｍＬ）に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、７５ｍｇ）を添加した。得られた混合物を、４５℃で、１６８時間、攪拌しながら反応させた。その後、試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、上記実施例１に記載されているように、ＨＰＬＣ分析に供した。
【０１２０】
時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンの転化率（Ｘｔで示す）、（Ｒ）−ナプロキセンの転化率（ＸＲで示す）、（Ｓ）−ナプロキセンの転化率（ＸＳで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１２１】
この実施例により得られた実験データを第５表にまとめた。
【０１２２】
実施例１０：Carica papayaリパーゼを使用した酵素的エステル化による、（Ｒ，Ｓ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸の動力学的分割
無水イソオクタンに、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸及び選択されたアルコール（ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｎ−ヘキサノールまたはトリメチルシリルメタノール）を添加し、それぞれ１．５ｍＭ及び１５ｍＭの濃度にした。
【０１２３】
ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸及び選択されたアルコールを含む、得られた溶液のアリコート（３ｍＬ）に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、３ｍｇ）を添加した。得られた混合物を、４５℃で、規定の時間、攪拌しながら反応させた。その後、試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、上記実施例６に記載されているように、ＨＰＬＣ分析に供した。
【０１２４】
時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸の転化率（Ｘｔで示す）、（Ｒ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸の転化率（ＸＲで示す）、（Ｓ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸の転化率（ＸＳで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１２５】
この実施例により得られた実験データを第５表にまとめた。Carica papayaリパーゼが、（Ｓ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸ではなく、（Ｒ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸のエステル化を触媒することが理解され得る。
【０１２６】
【表５】
【０１２７】
結論：
市販されている粗製のパパインまたはその部分的に精製された生成物のいずれかのCarica papayaリパーゼが、無水または水飽和有機溶媒系のような様々な溶媒系において実施される、高収率及び高転化率で所望の光学的に純粋な生成物を与える、α−置換カルボン酸あるいはそのエステルまたはチオエステルのＲ−及びＳ−鏡像異性体混合物の酵素分割に使用できることは、上記の実施例の実験結果から明らかである。さらに、上記の実施例において得られたＥ値のほとんどは３０より大きく、１００さえも超えており、Carica papayaリパーゼがα−置換カルボン酸あるいはそのエステルまたはチオエステルの酵素分割を活性化する、反応性の高い生体触媒であることを示している。α−置換カルボン酸あるいはそのエステルまたはチオエステルのCarica papayaリパーゼによる酵素分割中の有機塩基の添加は、生成物の光学純度の増大を１００％に達する程度までさらにアシストする。
【０１２８】
本願明細書に引用された特許及び参考文献はすべて、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含め、本願明細書が優先される。
【０１２９】
本発明が上記の特定の実施形態を参照して記載されている場合であっても、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく多数の改良及び変更を行うことができることは明白である。従って、本発明は、添付の請求項により示される態様でのみ制限されることが意図される。
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、台湾出願番号第０９３１１９７１８号「α−置換された酸及びそのエステルの動力学的分割方法」（２００４年６月３０日出願）に基づく利益を主張する。
【０００２】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、所望の分割を達成するための生体触媒としてCarica papayaリパーゼが使用される、α−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体の混合物を酵素分割する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
光学活性であるα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルは、そのα−炭素に立体中心を持つ一群の化合物である。α−（ヘテロ）アリールカルボン酸、α−アリールオキシプロピオン酸、α−アルキルカルボン酸、α−ハロゲンカルボン酸及びα−アミノ酸のような、鏡像異性的に富むα−置換カルボン酸は、製薬及び農薬の分野における合成ユニットとして、または分解剤（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｇｅｎｔｓ）として非常に重要である（Ｓｈｅｌｄｏｎ， Ｒ． Ａ． “Ｃｈｉｒｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”， １９９３， ｐｐ．２０５−２７０； Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ， Ｒ． ａｎｄ Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ， Ｕ．， “Ｂｉｏｔｒａｓｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｌｉｐａｓｅｓ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．８ａ， １９９８， ｐｐ．１０３−１１８； Ｆａｂｅｒ， Ｋ．， Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０００， ｐｐ．９４−１２３ ａｎｄ ｐｐ．３４４−３６６）。
【０００４】
例えば、市販されている（Ｓ）−ナプロキセン、（Ｓ）−フェノプロフェン、（Ｓ）−イブプロフェン、（Ｓ）−ケトプロフェン、（Ｓ）−フルルビプロフェン及び（Ｓ）−スプロフェンのようなα−アリールオキシプロピオン酸は、鎮痛、解熱及び抗炎症作用を持つ非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である（Ｃｈａｎｇ， Ｃ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， “Ｌｉｐａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｄｙｎａｍｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｐｒｏｘｅｎ ２，２，２−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ ｂｙ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｉｓｏｏｃｔａｎｅ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １９９９， Ｖｏｌ．６４， ｐｐ．１２０−１２６； ＵＳ ６，２０１，１５１ ｉｓｓｕｅｄ ｔｏ Ｓ．−Ｗ． Ｔｓａｉ ａｎｄ Ｃ．−Ｓ． Ｃｈａｎｇ； Ｓｅｈｇａｌ， Ａ．Ｃ． ａｎｄ Ｋｅｌｌｙ， Ｒ．Ｍ．， “Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｅｓｔｅｒａｓｅｓ ｆｏｒ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ２−ａｒｙｌｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ｅｓｔｅｒｓ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ， ２００３， Ｖｏｌ．１９， ｐｐ．１４１０−１４１６； Ｓｔｅｅｎｋａｍｐ， Ｌ． ａｎｄ Ｂｒａｄｙ， Ｄ．， “Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒ，Ｓ−ｎａｐｒｏｘｅｎ ｅｓｔｅｒ，” Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００３， Ｖｏｌ．３２， ｐｐ．４７２−４７７； Ｌｉｎ， Ｈ．−Ｙ． ａｎｄ Ｔｓａｉ， Ｓ．−Ｗ．， “Ｄｙｎａｍｉｃ ｋｉｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ （Ｒ，Ｓ）−ｎａｐｒｏｘｅｎ ２，２，２−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ ｖｉａ ｌｉｐａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏ−ａｑｕｅｏｕｓ ｉｓｏｏｃｔａｎｅ，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ： Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ， ２００３， Ｖｏｌ．２４−２５， ｐｐ．１１１−１２０）。
【０００５】
（Ｒ）−２−フェノキシプロピオン酸、（Ｒ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸、市販されている（Ｒ）−メコプロプ及び（Ｒ）−ジクロフォップ等のような、（Ｒ）−α−アリールオキシプロピオン酸は、除草剤または除草剤合成の中間体として使用され得る（Ｕｊａｎｇ， Ｚ． ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ２−（４−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｕｓｉｎｇ Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ ｌｉｐａｓｅ，” Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００３， Ｖｏｌ．３８， ｐｐ．１４８３−１４８８）。さらに、（Ｒ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸、（Ｒ）−２−ブロモ−ｏ−トリル酢酸などのような（Ｒ）−２−ハロゲノ−２−アリール酢酸は、上記除草剤または医薬品の中間体として役に立ち得る。（Ｇｕｉｅｙｓｓｅ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， “Ｌｉｐａｓｅ−ｃａｔａｌｌｙｚｅｄ ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏｗａｒｄ ｅｓｔｅｒｓ ｏｆ ２−ｂｒｏｍｏ−ｔｏｌｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄｓ，” Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ： Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ， ２００３， Ｖｏｌ．１４， ｐｐ．３１７−３２３）。
【０００６】
（Ｓ）−２−メチルヘキサン酸及び（Ｓ）−２−メチルブタン酸のような、光学活性である２−メチルアルカン酸は、昆虫フェロモン、香辛料及び人工甘味料の合成のための中間体として役に立ち得る（Ｈｅｉｎｓｍａｎ， Ｎ． Ｗ． Ｊ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， “Ｌｉｐａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ，” Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ２００２， Ｖｏｌ．２０， ｐｐ．２９７−３０９）。
【０００７】
近年、酵素のエンジニアリング技術の大きな進歩により、高エナンチオ選択的及び有機溶媒耐性であるリパーゼを利用し、有機溶媒の存在下／非存在下で、前述のα−アリールプロピオン酸、あるいはその対応するエステル、チオエステルまたはアミド誘導体のラセミ混合物の、加水分解、エステル化、エステル交換またはアミノ化による分割を行う、多くの工業的方法が確立された。酵素に触媒されるラセミ混合物の分割は、光学的に純粋な医薬品、農薬及び他の特殊な薬品を得る有益な方法となった。
【０００８】
用途の広い生体触媒としてのリパーゼ（トリアシルグリセロールヒドロラーゼ、 ＥＣ ３．１．１．３）は、脂質転化及び様々なラセミ化合物の動力学的分割に広く用いられている（Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ ａｎｄ Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ （１９９８）， ｓｕｐｒａ； Ｋ． Ｆａｂｅｒ （２０００）， ｓｕｐｒａ）。現在、大部分の工業用リパーゼは、一般に、微生物（ペニシリウム属、ゲオトリクム属、アスペルギルス属、リゾムコール属、カンジダ属またはシュードモナス属のような）、または動物（反芻動物の膵臓及びプレガストリック（ｐｒｅｇａｓｔｒｉｃ）組織）から生産される（Ｓｔｅｅｎｋａｍｐ ａｎｄ Ｂｒａｄｙ（２００３）， ｓｕｐｒａ）。
【０００９】
標準的な動力学的分割方法には、ラセミ体である出発基質に対し、所望の光学活性生成物を最大で５０％しか得ることができないという欠点がある。光学純度及び有益な生成物への転化を増大させるため、分割プロセス中の反応混合物に、塩基、有機金属、ハロゲンイオンまたはラセマーゼのようなラセミ化触媒を添加する方法がさらに開発され、これにより、分割酵素による動力学的分割を非常に促進できた（ＵＳ ６，２０１，１５１ ｉｓｓｕｅｄ ｔｏ Ｓ．−Ｗ． Ｔｓａｉ ａｎｄ Ｃ．−Ｓ． Ｃｈａｎｇ； Ｃ．−Ｙ． Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００２）， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．６７， Ｎｏ．１０， ｐｐ．３３２３−３３２６参照）。
【００１０】
特に、米国特許第６，２０１，１５１号において本出願人は、（Ｓ）−立体選択的なリパーゼ及び塩基、並びに必要であればアルコールの存在下で種々の水性有機溶媒中で、選択されたラセミ体であるα−アリールプロピオン酸のチオエステルのエステル交換または加水分解を行うために実施し得、これにより、所望の（Ｓ）−α−アリールプロピオン酸あるいはそのエステルまたはチオエステルを、理論的にはほぼ１００％の転化率及び高い光学純度で得ることができる、光学活性の（Ｓ）−α−アリールプロピオン酸あるいはそのエステルまたはチオエステルの調製方法を開示した。該方法での使用に適したリパーゼは、アスペルギルス ニガー、カンジダ ルゴサ、ゲオトリクム、シュードモナス セパチア、リゾープス オリザエなどを含む微生物から得られ、好ましくはカンジダ ルゴサから得られる。
【００１１】
アルコールやアミンに対する高度なエナンチオ選択性とは対照的に、ほとんどのリパーゼはカルボン酸に対し、低〜中度のエナンチオ選択性を示す（Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ ａｎｄ Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ（１９９８）， ｓｕｐｒａ； Ｋ．Ｆａｂｅｒ（２０００）， ｓｕｐｒａ）。通常、反応を行う前に粗製の調製物からのリパーゼ・アイソエンザイムを精製または修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）することは必須であるにも関わらず、α−アリールプロピオン酸及びα−アリールオキシプロピオン酸に対し高いエナンチオ選択性を示すカンジダ ルゴサ・リパーゼ（Candida rugosa lipase；ＣＲＬ）の場合にはあてはまらない（Ｉ．Ｊ． Ｃｏｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５）， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ６０：２１２−２１７； Ｊ．Ｊ． Ｌａｌｏｎｄｅ ｅｔ ａｌ． （１９９５）， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１７：６８４５−６８５２）。しかしながら、一般に、ＣＲＬは、極性有機溶媒、極端なｐＨ及び高温に対し、低い耐性を示す。したがって、高い酵素活性、エナンチオ選択性、及び高温下での安定性を持つ、キラル酸に対するリパーゼの選択または発見は、競争の激しい工業的バイオプロセスの発展に、明らかに欠くことのできないものである。
【００１２】
植物リパーゼは低コスト、精製の容易さ、及び天然供給源から広く利用可能な点により、非常に魅力的なように思われるにも関わらず、発芽種子、穀物のブラン部分、及び小麦麦芽中のリパーゼ含有量の低さが、実験的または大規模な利用における広範な用途を制限してきた。
【００１３】
近年、例えばCaricaceaeまたはEuphorbiaceaeラテックスのような植物ラテックス由来のリパーゼが、大量に得られるようになってきた（Ｃ． Ｄｈｕｉｑｕｅ−Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００１）， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ．， ２３：１０２１−１０２４； Ｃ． Ｐａｌｏｃｃｉ ｅｔ ａｌ． （２００３）， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．， １６５：５７７−５８２； Ｐ． Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ （２００３）， ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， １０５：３０８−３１７）。パパインの市販名を持つ、噴霧乾燥されたCarica papayaラテックスは、多くのシステインチオールプロテアーゼ、例えばパパイン（ＥＣ ３４．４．２２．２）、キモパパイン Ａ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３、並びにパパイア・ペプチダーゼII、並びにリゾチーム、グルタミニルシクラーゼ、クラスIIキチナーゼ、及びリパーゼのような他のものを含んでいることが良く知られている（Ｍｏｕｓｓａｏｕｉ ＡＥＩ ｅｔ ａｌ．（２００１），ＣＭＬＳ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５８：５５６−５７０）。リパーゼ活性は、ラテックスの非水溶性の画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）に局在し、C. papayaリパーゼ（ＣＰＬ）が非可溶のマトリクスに自然に結合し、固定されることを示唆している。粗製のパパインは豊富に得ることができ、安価であり、例えばＳｉｇｍａ社の粗製のカンジダ ルゴサ・リパーゼ（ＣＲＬ）の約４分の１から３分の１の価格であるため、脂質転化における、微生物リパーゼの有望な代替物と考えられてきた。しかしながら、キラルであるｓｎ−３トリグリセリドの動力学的分割におけるＣＰＬの使用に言及した１つの報告（Ｐ． Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ ｅｔ ａｌ． （１９９５）， Ｊ． Ａｍ． Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．， ７２：７５３−７５５）を除いて、ＣＰＬの性質は、酵素活性、基質選択性、熱安定性などの観点からは、まだ調査されていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要約
本出願人は、実験から、驚くべきことに、Carica papayaリパーゼが、選択されたα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｓ−鏡像異性体またはＲ−鏡像異性体のいずれかに対して、高度にエナンチオ選択的であることを見出した。従って、一つの観点から、本発明は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体の混合物を酵素分割する方法を提供する：
【００１５】
【化１】
【００１６】
ここで、
Ｘは−Ｏ−または−Ｓ−を示し、
Ｙはハロゲンまたはメチル基であり、
Ｒ１は、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基及びアリール基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、アリールオキシ基または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基を示し；そして、
Ｒ２は、Ｈ；ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ基、アリール基、ビニル及び３〜１２の炭素原子を有する２−アルケニル基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ１２脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基を示し；
ただし、Ｙ及びＲ１は同時にメチルになり得ず；
該方法は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体の混合物を、液相中で、Carica papayaリパーゼにより触媒される酵素分割に供することを包含する。
【００１７】
本発明に従う方法の好ましい実施形態において、該混合物は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割は、水溶液、水飽和有機溶媒、及び二相溶液を形成するこれらの組み合わせから選択される溶媒系を含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかは、Carica papayaリパーゼにより、エナンチオ選択的に加水分解される。
【００１８】
本発明に従う方法の他の好ましい実施形態において、該混合物は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割は、無水有機溶媒とアルコールの組み合わせを含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかは、Carica papayaリパーゼにより、エナンチオ選択的に該アルコールを用いてエステル交換される。
【００１９】
本発明に関する方法のさらにもう一つの好ましい実施形態において、該混合物は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸の、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割は、無水有機溶媒とアルコールの組み合わせを含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸の、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかは、Carica papayaリパーゼにより、エナンチオ選択的に該アルコールを用いてエステル化される。
【００２０】
上述される本発明の方法を行う場合、好ましくは有機溶媒系を含む液相は、所望の光学活性生成物の転化を促進するために、ラセミ化触媒の役割をする有機塩基をさらに含み得る。
【００２１】
本発明に従う方法の実施により、カンジダ ルゴサ・リパーゼ（Candida rugosa lipase;ＣＲＬ）を生体触媒として用いる従来の方法に比べ、より効率的及び経済的に、高純度及び高収率の光学活性生成物が得られることが見出された。
【００２２】
本発明の、上記及び他の目的、特徴及び利点は、以下の本発明の詳細な説明を参照することにより、明白に理解されるだろう。
【００２３】
本発明の詳細な説明
現在利用可能な、α−置換カルボン酸あるいはそのエステルの動力学的分割方法のほとんどは、非常に高価で、得ることが困難なリパーゼを使用する。このような方法を行うのに必要なコストを削減するため、及び分割反応のエナンチオ選択性を増大させるために、本出願人は、α−置換カルボン酸あるいはそのエステルの酵素分割における生体触媒としての使用に適した新たなリパーゼを見出そうと試みた。
【００２４】
パパイアは、世界の熱帯・亜熱帯地域において、非常に重要な経済的作物である。カンジダ ルゴサ・リパーゼのような微生物由来のリパーゼとの比較では、Carica papayaリパーゼは比較的安価で入手しやすい。本出願人は、驚くべきことにCarica papayaリパーゼは、選択されたα−置換カルボン酸あるいはそのエステルまたはチオエステルのＲ−型またはＳ−型のいずれかの加水分解、エステル化またはエステル交換を、エナンチオ選択的に触媒することができ、所望の光学活性生成物を高収率、高純度及び高転化率で得られることを見出した。さらに、Carica papayaリパーゼは優れた熱安定性及び様々な有機溶媒に対する耐性を示す。
【００２５】
従って、本発明は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体の混合物を酵素分割する方法を提供する：
【００２６】
【化２】
【００２７】
ここで、
Ｘは−Ｏ−または−Ｓ−を示し、
Ｙはハロゲンまたはメチル基であり、
Ｒ１は、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基及びアリール基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、アリールオキシ基または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基を示し；そして、
Ｒ２は、Ｈ；ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ基、アリール基、ビニル及び３〜１２の炭素原子を有する２−アルケニル基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ１２脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基を示し；
ただし、Ｙ及びＲ１は同時にメチルになり得ず、
該方法は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体の混合物を、液相中で、Carica papayaリパーゼにより触媒される酵素分割に供することを包含する。
【００２８】
本発明によれば、Carica papayaリパーゼは、Carica papaya植物のラテックス浸出物、例えばCarica papaya植物の葉、ステム、未熟な果実または傷ついた表面の浸出ラテックスから調製し得る。パパインの市販名を持つ、噴霧乾燥されたCarica papayaラテックスは、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ． （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ， ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｄｅ Ｐ３３７５， ａ ｃｙｓｔｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｏｆ ２．１ ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｓｏｌｉｄ， ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｒｏｍ Ｓｒｉ Ｌａｎｋａ）から購入可能である。部分的に精製されたＣＰＬ（ＰＣＰＬ）は、市販パパインまたは自家製Carica papayaラテックスを、水溶液または緩衝溶液あるいは有機溶媒に穏やかに攪拌しながら溶解した後、遠心分離または濾過を行って沈殿物を得、続いて該沈殿物を凍結乾燥することにより得られ得る。得られた凍結乾燥生成物は、すぐに使用可能であり、また、さらに純粋な酵素生成物を得るために再び上記の処理を実施し得る。
【００２９】
本発明によれば、ここで使用される用語「脂肪族基」は、それぞれがＲ１及びＲ２について記載されている１〜３個の置換基によって必要に応じて置換され得る、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和の、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基を含む。
【００３０】
本発明によれば、ここで使用される用語「アリール基」は、それぞれがＲ１及びＲ２について記載されている１〜３個の置換基によって必要に応じて置換され得る、フェニル、フェノキシ、ナフチル、ナフトキシ、テトラヒドロナフチル等を含む。
【００３１】
本発明によれば、ここで使用される用語「複素環基」は、それぞれがＲ１及びＲ２について記載されている１〜３個の置換基によって必要に応じて置換され得る、チエニル、テノイル、フリル、ピリジル、ピラジニル、イミダジル、ピラニル等を含む。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルにおけるＲ１は、それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ２０アルキル基、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ２０アルケニル基、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ２０アルキニル基及び直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ２０シクロアルキル基からなる群より選択される。
【００３３】
本発明の他の好ましい実施形態において、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルにおけるＲ１基は、それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択されるヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される。
【００３４】
Ｒ１の代表的な例は、ブチル、ヘキシル、オクチル、ペント−３−エニル、フェニル、フェノキシ、２−クロロフェニル、ベンジル、フェニルエチル、ナフチル、６−メトキシ−２−ナフチル、ナフトキシ、（２−フルオロ−３−フェニル）フェニル、４−クロロフェノキシ、２−（２，４−ジクロロフェノキシ）フェニル、ｍ−フェノキシ−フェニル、ｐ−フェノキシ−フェニル、４−イソブチル−フェニル、（２−ベンゾイル）フェニル、ｐ−テノイル−フェニル、Ｎ−メチルイミダジル、４−ニトロピリジル、ピラジニル等を含むがこれらに制限されない。
【００３５】
好ましくは、Ｒ２基は、そのＣ２及び／またはＣ３の位置に少なくとも１つの電子求引性の置換基を持つ。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態において、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルにおけるＲ２基は、水素である。
【００３７】
本発明の他の好ましい実施形態において、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルにおけるＲ２基は、それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ基、アリール基、ビニル及び３〜１２の炭素原子を有する２−アルケニル基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ１２アルキル基、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ１２アルケニル基、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ１２アルキニル基、及び直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ１２シクロアルキルからなる群より選択される。
【００３８】
本発明のさらにもう一つの好ましい実施形態において、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルにおけるＲ２基は、それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択されるヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される。
【００３９】
式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルにおけるＲ２基の代表的な例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ビニル、エチニル、２−アリル、２−ブテニル、２−クロロエチル、２−ブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、２−クロロプロピル、（トリメチルシリル）メチル、（トリメチルシリル）エチル、ベンジル、ナフチルメチル等を含むが、これらに制限されない。
【００４０】
式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの代表的な例は、下記の化合物：
ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸または２−クロロ−２−フェニル酢酸の、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、フェニルまたはトリフルオロエチル エステル；ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸または２−クロロ−２−フェニル酢酸の、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、フェニルまたはトリフルオロエチル チオエステル；及び、ジクロフォッグ（ｄｉｃｌｏｆｏｇ）メチルエステルを含むがこれらに制限されない。
【００４１】
式（Ｉ）のα−置換カルボン酸の代表的な例は、ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸、２−クロロ−２−フェニル酢酸、及びジクロフォッグを含むが、これらに制限されない。
【００４２】
本発明の方法は、水溶液、無水有機溶媒、水飽和有機溶媒、及び二相溶液を形成するこれらの組み合わせから選択される溶媒系を含む液相中で実施し得る。
【００４３】
本発明の方法での使用に適した水溶液は、水及び緩衝水溶液から選択し得る。
【００４４】
本発明の方法での使用に適した有機溶媒は、イソオクタン、ヘプタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ペンタン、デカン、トルエン、ベンゼン、四塩化炭素、ｔ−ブタノール、ｔ−ペンタノール、イソプロピルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル、メチルイソブチルエーテル及びこれらの組み合わせから選択し得る。
【００４５】
あるいは、本発明の方法は、水溶液及び１またはそれ以上の混和性（ｍｉｓｃｉｂｌｅ）の有機相を生じる有機溶媒からなる二相溶液を含む液相中で実施し得る。
【００４６】
本発明の方法は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルのラセミ混合物の酵素分割に使用し得る。過剰のＲ−鏡像異性体またはＳ−鏡像異性体を含む、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの混合物も、本発明の方法により処理し得る。
【００４７】
本発明の方法において、ラセミ化触媒として作用する有機塩基を、所望の光学活性生成物の転化を促進するために、液相に加え得る。
【００４８】
本発明の方法における使用に適した有機塩基は、第三級アミン、アミジン、グアニジン、ホスファゼン塩基及びこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。好ましくは、有機塩基は、トリエチルアミン、トリブチルアミン、トリオクチルアミン、１−ｔ−ブチル−４，４，４−トリス（ジメチルアミノ）−２，２−ビス［トリス（ジメチルアミノ）−ホスホラニリデンアミノ］−２λ５，４λ５−カテナジ（ホスファゼン）、ジエチルアミノメチル−ポリスチレン、ｔ−ブチルイミノ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホラン、７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４，４，０］デカ−５−エン、ｔ−ブチルイミノ−トリス（ピロリジノ）ホスホラン、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。さらに、有機塩基は、有機担体及び無機担体から選択されるた担体上に保持され得る。例えば、有機塩基は陰イオン交換樹脂上に保持される。
【００４９】
本発明の方法は、Carica papayaリパーゼが、選択された式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルのＲ−鏡像異性体及びＳ−鏡像異性体を含む混合物の酵素分割を触媒するのに適した温度で実施し得る。本発明の方法は、好ましくは２０℃から９０℃の範囲の温度、より好ましくは３０℃から７０℃の範囲の温度で実施される。
【００５０】
本発明に関する方法の好ましい実施形態において、該混合物は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼをによる該混合物の酵素分割は、水溶液、水飽和有機溶媒、及び二相溶液を形成するこれらの組み合わせから選択される溶媒系を含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかは、Carica papayaリパーゼにより、エナンチオ選択的に加水分解される。
【００５１】
Carica papayaリパーゼによる、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含む混合物の加水分解は、下記のスキームにより、図示され得る。
【００５２】
【化３】
【００５３】
さらに、記載されている有機塩基は、液相に添加し得、該有機塩基は、所望の光学活性のＲ−またはＳ−α−置換カルボン酸の転化を促進するため、好ましくは有機溶媒を含み得る。
【００５４】
本発明に従う方法の他の好ましい実施形態において、該混合物は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割は、無水有機溶媒とアルコールの組み合わせを含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかは、Carica papayaリパーゼにより、該アルコールを用いてエナンチオ選択的にエステル交換される。
【００５５】
Carica papayaリパーゼによる、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルのＲ−及びＳ−鏡像異性体を含む混合物のエステル交換は、下記のスキームにより、図示され得る。
【００５６】
【化４】
【００５７】
本発明に従う方法のさらにもう一つの好ましい実施形態において、該混合物は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸の、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる該混合物の酵素分割は、無水有機溶媒とアルコールの組み合わせを含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸の、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかは、Carica papayaリパーゼにより、該アルコールを用いてエナンチオ選択的にエステル化される。
【００５８】
Carica papayaリパーゼによる、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸のＲ−及びＳ−鏡像異性体を含む混合物のエステル化は、下記のスキームにより、図示され得る。
【００５９】
【化５】
【００６０】
Carica papayaリパーゼにより触媒される混合物の酵素分割に使用するのに適したアルコールは、式Ｒ３ＯＨであり、
ここで、Ｒ３はＲ２と異なり、そして：ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ基、アリール基、ビニル及び３〜１２の炭素原子を有する２−アルケニル基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ１２脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基；
を示す。
【００６１】
好ましくは、アルコールは、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、トリメチルシリルメタノール及び２−Ｎ−モルホリノエタノールからなる群より選択される。
【００６２】
本発明は、下記の実施例により、さらに説明されるだろう。当業者は、これらの実施例及び、本発明の基本的な、新規な、または有利な特性を利用し、この開示を通して示される実施例の変更を可能にする、多くの技術及び教示に精通している。従って、本発明の範囲は、ここで、または他のところで挙げられた特定の実施例によって制限されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
実施例
Ｉ．材料：
１．イソオクタン、シクロヘキサン、イソプロパノール及び氷酢酸は、Ｔｅｄｉａ Ｃｏ．（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）から購入した。
【００６４】
２．トリオクチルアミン及び２，２，２−トリフルオロエタノールは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）から購入した。
【００６５】
３．トリメチルシリルメタノールは、Ｆｌｕｋａ Ｃｏ．（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。
【００６６】
４．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンは、（Ｓ）−ナプロキセン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）をＮａＯＨを含むエチレングリコール中で１４０℃でラセミ化することにより得た（Ｓ．−Ｗ． Ｔｓａｉ ａｎｄ Ｈ．−Ｊ． Ｗｅｉ （１９９４）， Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． １６：３２８−３３３）。
【００６７】
５．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルは、（Ｓ）−ナプロキセン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）をラセミ化した後、生じたラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンを、２，２，２−トリフルオロエタンチオールでエステル化することにより得た（Ｃ．−Ｙ． Ｃｈｅｎ （２００２）， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ６７ （１０）： ３３２３−３３２６）。
【００６８】
６．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルエステルは、（Ｓ）−ナプロキセン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）をラセミ化した後、生じたラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンを、２，２，２−トリフルオロエタノールでエステル化することにより得た（Ｈ．−Ｙ． Ｌｉｎ ａｎｄ Ｓ．−Ｗ． Ｔｓａｉ （２００３）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃａｔａｌ． Ｂ： Ｅｎｚ．， ２４：１１１−２０）。
【００６９】
７．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−フェノプロフェン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルは、ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−フェノプロフェンのカルシウム塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）を２，２，２−トリフルオロエタンチオールでエステル化することにより得た。
【００７０】
８．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−イブプロフェン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルは、ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−イブプロフェン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）を２，２，２−トリフルオロエタンチオールでエステル化することにより得た。
【００７１】
９．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルは、ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）を２，２，２−トリフルオロエタンチオールでエステル化することにより得た。
【００７２】
１０．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ジクロフォッグメチルエステルは、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａeｎ Ｃｏ． （Ｓｅｅｌｖｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【００７３】
１１．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルは、２−クロロフェニルアセチルクロリドを２，２，２−トリフルオロエタンチオールでエステル化することにより得た。
【００７４】
１２．ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸は、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）から購入した。
【００７５】
１３．Carica papayaリパーゼ（ＣＰＬ）：
（１）Ｓｉｇｍａ Ｃｏ． （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ， ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｄｅ Ｐ３３７５， ａ ｃｙｓｔｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｏｆ ２．１ ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｓｏｌｉｄ， ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｒｏｍ Ｓｒｉ Ｌａｎｋａ）から購入可能な市販製品である、粗製のパパイン；
（２）下記のように調製された、部分的に精製されたＣＰＬ（ＰＣＰＬ）：
粗製のパパイン１．３５ｇを、１５ｍＬの脱イオン水へ、４℃で３０分間穏やかに攪拌しながら添加した。得られた溶液を、１２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。
【００７６】
上澄みを廃棄した後、上記の手順を繰り返して沈殿を得、その沈殿を−４０℃、１００ｍｍＨｇで４時間、凍結乾燥し、粗製のパパインの重量に対し、１５％の回収率でＰＣＰＬを得た。
【００７７】
１４．他の、市販されている分析用の化学薬品は以下のとおりである：
ｎ−ヘキサン、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｎ−ヘキサノール、１，２−ジメトキシエタン、無水ピリジン、フェニルジクロロホスフェート、クロロホルム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、硫酸マグネシウム、酢酸エチル等。
【００７８】
II．一般手順：
１．水飽和有機溶媒の調製：
適切な量の脱イオン水を、イソオクタン及びシクロヘキサンのような選択された有機溶媒へ添加した。２４時間以上攪拌した後、有機層を後に使用するために集めた。水飽和有機溶媒の調製は、Carica papayaリパーゼによって触媒される酵素分割が行われるのと同一の温度で行なわれるのが好ましい。
【００７９】
２．（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルの合成：
氷冷した２５ｍＬの無水１，２−ジメトキシエタンに、４．３０ｍｍｏｌの（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン、１．１５ｍＬの無水ピリジン、１．０７ｍｍｏｌのフェニルジクロロホスフェート及び１０００ｍｇの２，２，２−トリフルオロエタンチオールを添加した。得られた混合物を室温で攪拌しながら１６時間反応させた後、氷冷した２０ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ溶液を添加した。その後、生成物を抽出するために、得られた混合物に２５ｍＬのクロロホルムを３０分間攪拌しながら添加した。有機層を集め、５０ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ溶液で２回、５０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液で２回の順序で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で２４時間乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。得られたオイルをｎ−ヘキサン：酢酸エチル（５：１，ｖ／ｖ）の移動相を用いたシリカゲル液体クロマトグラフィーによって精製した後、真空下で濃縮し、白い固形生成物を最初の（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンに対して６２％の収率で得た。
【００８０】
以下の実施例で使用される他の（Ｒ，Ｓ）−プロフェン２，２，２トリフルオロエチルチオエステルは、同様の方法で調製したのに対し、（Ｒ、Ｓ）−プロフェン２，２，２−トリフルオロエチルエステルはＨ．−Ｙ． Ｌｉｎ ａｎｄ Ｓ．−Ｗ． Ｔｓａｉ （２００３）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃａｔａｌ． Ｂ： Ｅｎｚ．， ２４：１１１−２０で述べられた手順により調製した。
【００８１】
３．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析：
選択された水飽和有機溶媒中での（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルエステルの加水分解及び、ｎ−プロパノールによる（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンのエステル化は、Ｒｅｇｉｓ Ｃｏ．（Ｍｏｒｔｏｎ Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ， ＵＳＡ）から購入した、２−ニトロトルエン、（Ｒ）−及び（Ｓ）−ナプロキセン並びに（Ｒ）−及び（Ｓ）−ナプロキセンエステルの内部標準を分割できるキラルカラム（Ｓ，Ｓ）−ＷＨＥＬＫ−０１を用いたＨＰＬＣによってモニターした。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸（８０：２０：０．５，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出を、カラム温度２５℃で行った。
【００８２】
異なる（Ｒ，Ｓ）−プロフェン、２−フェニルプロピオン酸及び２−クロロ−２−フェニル酢酸の、２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルの加水分解、並びに選択されたアルコールとの２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸のエステル化は、ニトロトルエン、（Ｒ）−及び（Ｓ）−チオエステルまたは（Ｒ）−及び（Ｓ）−エステル、並びに（Ｒ）−及び（Ｓ）−プロフェンの内部標準を分離できるキラルカラム（キラルセル ＯＤまたはＯＪＨ、ダイセル化学工業、東京、日本）を用いたＨＰＬＣによってモニターした。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸の混合物を、流速１ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出を、カラム温度２５℃で行った。
【００８３】
実施例１：Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルエステルの動力学的分割
水飽和有機溶媒は、一般手順II．１の前記項目で述べられた手順により、イソオクタンまたはシクロヘキサンのいずれかを使用して調製した。
【００８４】
ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルエステルを、調製した有機溶媒に添加し、濃度を３ｍＭとした。１５ｍLの得られたラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンエステル溶液に、粗製のパパイン（７５ｍｇ）または部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、１１．３ｍｇ）のいずれかを添加した。得られた混合物を、３５℃から７０℃の範囲から選択された温度下で、規定の時間、攪拌しながら反応させた。
【００８５】
試料のアリコート（２００μＬ）を規定の時間間隔で採取し、（Ｓ，Ｓ）−ＷＨＥＬＫ−０１カラム（Ｒｅｇｉｓ Ｃｏ．（Ｍｏｒｔｏｎ Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ， ＵＳＡ）を用いたＨＰＬＣ分析に供した。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸（８０：２０：０．５，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出を、カラム温度２５℃で行った。
【００８６】
時間ｔにおける（Ｓ）−ナプロキセンエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−ナプロキセンエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンエステルの転化率（Ｘｔで示す）、及び生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）の経時的変化は、下記の計算式に基づいてそれぞれ計算した：
【００８７】
【数１】
【００８８】
ここで：
（ＳＳ）０：時間０における（Ｓ）−ナプロキセンエステルの初期濃度（ｍＭ）
（ＳＲ）０：時間０における（Ｒ）−ナプロキセンエステルの初期濃度（ｍＭ）
（ＳＳ）ｔ：時間ｔ（ｈｒ）における（Ｓ）−ナプロキセンエステルの濃度（ｍＭ）；及び
（ＳＲ）ｔ：時間ｔ（ｈｒ）における（Ｒ）−ナプロキセンエステルの濃度（ｍＭ）
である。
【００８９】
さらに、鏡像異性体比（Ｅで示す）は、（Ｒ）−ナプロキセンエステルの初期反応速度に対する（Ｓ）−ナプロキセンエステルの初期反応速度、またはその反対として定義した。
【００９０】
式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体のラセミ混合物を酵素基質として用いる場合には、（ＳＳ）０＝（ＳＲ）０であり、そして、
Ｘｔ＝１−［（ＳＳ）ｔ＋（ＳＲ）ｔ］／［（ＳＳ）０＋（ＳＲ）０］＝（ＸＳ＋ＸＲ）／２
である。
【００９１】
第１表は、種々の溶媒系及び酵素を使用し、種々の温度下において、規定の時間間隔で実施した実験から集めた実験データをまとめたものである。
【００９２】
【表１】
【００９３】
実施例２：Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルの動力学的分割
上記実施例１に記載の手順により、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルを、選択された水飽和有機溶媒に添加し、１ｍＭの濃度にした。１５ｍＬの得られたラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンチオエステル溶液に、粗製のパパイン（１３５０ｍｇ）または部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、２０３ｍｇ）のいずれかを添加した。得られた混合物を、３５℃から６０℃の範囲から選択された温度下で、規定の時間、攪拌しながら反応させた。
【００９４】
試料のアリコート（２００μＬ）を規定の時間間隔で採取し、キラルセルＯＤカラム（ダイセル化学工業、東京、日本）を用いたＨＰＬＣ分析に供した。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸（９７：３：１，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出を、カラム温度２５℃で行った。
【００９５】
時間ｔにおける（Ｓ）−ナプロキセンチオエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−ナプロキセンチオエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンチオエステルの転化率（Ｘｔで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）、及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【００９６】
第２表は、種々の溶媒系及び酵素を使用し、種々の温度下において、規定の時間間隔で実施した実験から集めた実験データをまとめたものである。
【００９７】
【表２】
【００９８】
実施例３：Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−フェノプロフェン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルの動力学的分割
上記実施例１に記載の手順により、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−フェノプロフェン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルを、水飽和イソオクタンに添加し、１ｍＭの濃度にした。１５ｍＬの得られたラセミ体（Ｒ，Ｓ）−フェノプロフェンチオエステル溶液に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、２０３ｍｇ）を添加した。得られた混合物を、６０℃で、１７０時間、攪拌しながら反応させた。試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、キラルセルＯＤカラム（ダイセル化学工業、東京、日本）を用いたＨＰＬＣ分析に供した。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸（１００：１．０：０．５，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出を、カラム温度２５℃で行った。
【００９９】
時間ｔにおける（Ｓ）−フェノプロフェンチオエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−フェノプロフェンチオエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−フェノプロフェンチオエステルの転化率（Ｘｔで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）、及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１００】
この実施例により得られた実験データを第３表にまとめた。Carica papayaリパーゼが、（Ｓ）−フェノプロフェンチオエステルではなく、（Ｒ）−フェノプロフェンチオエステルの加水分解を触媒することが理解される。
【０１０１】
実施例４：Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−イブプロフェン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルの動力学的分割
上記実施例１に記載の手順により、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−イブプロフェン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルを、水飽和イソオクタンに添加し、１ｍＭの濃度にした。１５ｍＬの得られたラセミ体（Ｒ，Ｓ）−イブプロフェンチオエステル溶液に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、２０３ｍｇ）を添加した。得られた混合物を、４５℃で、１０４時間、攪拌しながら反応させた。試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、キラルセルＯＤカラム（ダイセル化学工業、東京、日本）を用いたＨＰＬＣ分析に供した。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール（１００：０，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出を、カラム温度２５℃で行った。
【０１０２】
時間ｔにおける（Ｓ）−イブプロフェンチオエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−イブプロフェンチオエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−イブプロフェンチオエステルの転化率（Ｘｔで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）、及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１０３】
この実施例により得られた実験データを第３表にまとめた。
【０１０４】
実施例５：Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−2−フェニルプロピオン酸２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルの動力学的分割
上記実施例１に記載の手順により、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルを、水飽和イソオクタンに添加し、１ｍＭの濃度にした。１５ｍＬの得られたラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸チオエステル溶液に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、２０３ｍｇ）を添加した。得られた混合物を、４５℃で、１７０時間、攪拌しながら反応させた。試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、キラルセルＯＤカラム（ダイセル化学工業、東京、日本）を用いたＨＰＬＣ分析に供した。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸（１００：０．３５：０．２２，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出をカラム温度２５℃で行った。
【０１０５】
時間ｔにおける（Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸チオエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−２−フェニルプロピオン酸チオエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸チオエステルの転化率（Ｘｔで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）、及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１０６】
この実施例により得られた実験データを第３表にまとめた。
【０１０７】
実施例６：Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ジクロフォッグメチルエステルの動力学的分割
上記実施例１に記載の手順により、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ジクロフォッグメチルエステルを、水飽和イソオクタンに添加し、１．５ｍＭの濃度にした。１５ｍＬの得られたラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ジクロフォッグメチルエステル溶液に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、１５ｍｇ）を添加した。得られた混合物を、４５℃で、１８．２時間、攪拌しながら反応させた。試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、キラルセルＯＪ−Ｈカラム（ダイセル化学工業、東京、日本）を用いたＨＰＬＣ分析に供した。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸（９７：３：１，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２７０ｎｍでのＵＶ検出をカラム温度２５℃で行った。
【０１０８】
時間ｔにおける（Ｓ）−ジクロフォッグメチルエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−ジクロフォッグメチルエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ジクロフォッグメチルエステルの転化率（Ｘｔで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）、及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１０９】
この実施例により得られた実験データを第３表にまとめた。Carica papayaリパーゼが、（Ｓ）−ジクロフォッグメチルエステルではなく、（Ｒ）−ジクロフォッグメチルエステルの加水分解を触媒することが理解され得る。
【０１１０】
実施例７：Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルの動力学的分割
上記実施例１に記載の手順により、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルを、水飽和イソオクタンに添加し、１ｍＭの濃度にした。１５ｍＬの得られたラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸チオエステル溶液に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、２５ｍｇ）を添加した。得られた混合物を、４５℃で、４８時間、攪拌しながら反応させた。試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、キラルセルＯＪ−Ｈカラム（ダイセル化学工業、東京、日本）を用いたＨＰＬＣ分析を行った。移動相は、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／氷酢酸（２４０：１０：１，ｖ／ｖ）の混合物を、流速１．０ｍＬ／分で用いた。定量化のため、２４０ｎｍでのＵＶ検出を、カラム温度２５℃で行った。
【０１１１】
時間ｔにおける（Ｓ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸チオエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸チオエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸チオエステルの転化率（Ｘｔで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）、及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１１２】
この実施例により得られた実験データを第３表にまとめた。Carica papayaリパーゼが、（Ｓ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸チオエステルではなく、（Ｒ）−２−クロロ−２−フェニル酢酸チオエステルの加水分解を触媒することが理解され得る。
【０１１３】
【表３】
【０１１４】
実施例８：トリオクチルアミン存在下における、Carica papayaリパーゼを使用した酵素加水分解による、（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルエステルの動力学的分割
上記実施例１に記載の手順により、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン２，２，２−トリフルオロエチルチオエステルを、水飽和イソオクタンに添加し、１ｍＭの濃度にした。得られたラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンチオエステル溶液のアリコート（１０ｍＬ）に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、１３５ｍｇ）及び種々の濃度のトリオクチルアミンをそれぞれ添加した。得られた混合物を、４５℃で、規定の時間、攪拌しながら反応させた。その後、試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、上記実施例２に記載されているように、ＨＰＬＣ分析に供した。
【０１１５】
時間ｔにおける（Ｓ）−ナプロキセンチオエステルの転化率（ＸＳで示す）、時間ｔにおける（Ｒ）−ナプロキセンチオエステルの転化率（ＸＲで示す）、時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンチオエステルの転化率（Ｘｔで示す）、及び生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１１６】
この実施例により得られた実験データを第４表にまとめた。トリオクチルアミンの添加により、ｅｅｐの値がおよそ１００％まで増大されることが理解される。
【０１１７】
【表４】
【０１１８】
実施例９：Carica papayaリパーゼを使用した酵素的エステル化による、（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンの動力学的分割
無水イソオクタンに、ラセミ体である（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン及びｎ−プロパノールを添加し、それぞれ０．４５ｍＭ及び１５ｍＭの濃度にした。
【０１１９】
ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセン及びｎ−プロパノールを含む、得られた溶液のアリコート（１５ｍＬ）に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、７５ｍｇ）を添加した。得られた混合物を、４５℃で、１６８時間、攪拌しながら反応させた。その後、試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、上記実施例１に記載されているように、ＨＰＬＣ分析に供した。
【０１２０】
時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンの転化率（Ｘｔで示す）、（Ｒ）−ナプロキセンの転化率（ＸＲで示す）、（Ｓ）−ナプロキセンの転化率（ＸＳで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１２１】
この実施例により得られた実験データを第５表にまとめた。
【０１２２】
実施例１０：Carica papayaリパーゼを使用した酵素的エステル化による、（Ｒ，Ｓ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸の動力学的分割
無水イソオクタンに、ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸及び選択されたアルコール（ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｎ−ヘキサノールまたはトリメチルシリルメタノール）を添加し、それぞれ１．５ｍＭ及び１５ｍＭの濃度にした。
【０１２３】
ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸及び選択されたアルコールを含む、得られた溶液のアリコート（３ｍＬ）に、部分的に精製されたCarica papayaリパーゼ（ＰＣＰＬ、３ｍｇ）を添加した。得られた混合物を、４５℃で、規定の時間、攪拌しながら反応させた。その後、試料のアリコート（２００μＬ）を採取し、上記実施例６に記載されているように、ＨＰＬＣ分析に供した。
【０１２４】
時間ｔにおけるラセミ体（Ｒ，Ｓ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸の転化率（Ｘｔで示す）、（Ｒ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸の転化率（ＸＲで示す）、（Ｓ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸の転化率（ＸＳで示す）、生成物の光学純度（ｅｅｐで示す）及びＥ値の経時的変化は、上記実施例１の記載に従い計算した。
【０１２５】
この実施例により得られた実験データを第５表にまとめた。Carica papayaリパーゼが、（Ｓ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸ではなく、（Ｒ）−２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸のエステル化を触媒することが理解され得る。
【０１２６】
【表５】
【０１２７】
結論：
市販されている粗製のパパインまたはその部分的に精製された生成物のいずれかのCarica papayaリパーゼが、無水または水飽和有機溶媒系のような様々な溶媒系において実施される、高収率及び高転化率で所望の光学的に純粋な生成物を与える、α−置換カルボン酸あるいはそのエステルまたはチオエステルのＲ−及びＳ−鏡像異性体混合物の酵素分割に使用できることは、上記の実施例の実験結果から明らかである。さらに、上記の実施例において得られたＥ値のほとんどは３０より大きく、１００さえも超えており、Carica papayaリパーゼがα−置換カルボン酸あるいはそのエステルまたはチオエステルの酵素分割を活性化する、反応性の高い生体触媒であることを示している。α−置換カルボン酸あるいはそのエステルまたはチオエステルのCarica papayaリパーゼによる酵素分割中の有機塩基の添加は、生成物の光学純度の増大を１００％に達する程度までさらにアシストする。
【０１２８】
本願明細書に引用された特許及び参考文献はすべて、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含め、本願明細書が優先される。
【０１２９】
本発明が上記の特定の実施形態を参照して記載されている場合であっても、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく多数の改良及び変更を行うことができることは明白である。従って、本発明は、添付の請求項により示される態様でのみ制限されることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
（ここで、
Ｘは−Ｏ−または−Ｓ−を示し、
Ｙはハロゲンまたはメチル基であり、
Ｒ１は、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基及びアリール基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、アリールオキシ基または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基を示し；そして、
Ｒ２は、Ｈ；ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ基、アリール基、ビニル及び３〜１２の炭素原子を有する２−アルケニル基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ１２脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基を示し；
ただし、Ｙ及びＲ１は同時にメチルになり得ない)
のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体の混合物を酵素分割する方法であって、
該方法は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体の混合物を、液相中で、Carica papayaリパーゼにより触媒される酵素分割に供することを包含する。
【請求項２】
液相が、水溶液、無水有機溶媒、水飽和有機溶媒、及び二相溶液を形成するこれらの組み合わせから選択される溶媒系を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
液相が、イソオクタン、ヘプタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ペンタン、デカン、トルエン、ベンゼン、四塩化炭素、ｔ−ブタノール、ｔ−ペンタノール、イソプロピルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル、メチルイソブチルエーテル及びこれらの組み合わせから選択される有機溶媒を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該混合物が、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルのラセミ混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Carica papayaリパーゼが、Carica papaya植物のラテックス浸出液(latex exudate)から調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割が、有機塩基と組み合わせた有機溶媒を含む液相中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
有機溶媒が、イソオクタン、ヘプタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ペンタン、デカン、トルエン、ベンゼン、四塩化炭素、ｔ−ブタノール、ｔ−ペンタノール、イソプロピルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル、メチルイソブチルエーテル及びこれらの組み合わせから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
有機塩基が、第三級アミン、アミジン、グアニジン、ホスファゼン塩基及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
有機塩基が、トリエチルアミン、トリブチルアミン、トリオクチルアミン、７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４，４，０］デカ−５−エン、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、ｔ−ブチルイミノ−トリス（ピロリジノ）ホスホラン、ｔ−ブチルイミノ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホラン、１−ｔ−ブチル−４，４，４−トリス（ジメチルアミノ）−２，２−ビス［トリス（ジメチルアミノ）−ホスホラニリデンアミノ］−２λ５，４λ５−カテナジ（ホスファゼン）、ジエチルアミノメチル−ポリスチレン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
有機塩基が、有機担体及び無機担体から選ばれた担体上に保持される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
有機塩基が、陰イオン交換樹脂上で保持される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割が、２０℃から９０℃の温度範囲で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
混合物が、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割が、水溶液、水飽和有機溶媒、及び二相溶液を形成するこれらの組み合わせから選択される溶媒系を含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかを、Carica papayaリパーゼによりエナンチオ選択的に加水分解する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルが、下記の化合物：ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸または２−クロロ−２−フェニル酢酸の、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、フェニルまたはトリフルオロエチル エステル；ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸または２−クロロ−２−フェニル酢酸の、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、フェニルまたはトリフルオロエチル チオエステル；及び、ジクロフォッグ(diclofog)メチルエステル；
の少なくともいずれか１つである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
液相が、第三級アミン、アミジン、グアニジン、ホスファゼン塩基またはこれらの組み合わせからなる群より選択される有機塩基をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
有機塩基が、トリエチルアミン、トリブチルアミン、トリオクチルアミン、７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４，４，０］デカ−５−エン、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、ｔ−ブチルイミノ−トリス（ピロリジノ）ホスホラン、ｔ−ブチルイミノトリス（ジメチルアミノ）−ホスホラン、１−ｔ−ブチル−４，４，４−トリス（ジメチルアミノ）−２，２−ビス［トリス（ジメチルアミノ）−ホスホラニリデンアミノ］−２λ５，４λ５−カテナジ（ホスファゼン）、ジエチルアミノメチル−ポリスチレン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１７】
混合物が、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割が、無水有機溶媒とアルコールの組み合わせを含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかを、Carica papayaリパーゼによりエナンチオ選択的に、該アルコールを用いてエステル交換する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルが、下記の化合物：
ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸または２−クロロ−２−フェニル酢酸の、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、フェニルまたはトリフルオロエチル エステル；ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸または２−クロロ−２−フェニル酢酸の、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、フェニルまたはトリフルオロエチル チオエステル；及び、ジクロフォッグメチルエステル、
の少なくともいずれか１つである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割に使用するアルコールが、式ＲＯＨであり、
ここで、ＲはＲ２とは異なり、そして：ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ基、アリール基、ビニル及び３〜１２の炭素原子を有する２−アルケニル基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ１２脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基；
を示す、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該アルコールが、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、トリメチルシリルメタノール及び２−Ｎ−モルホリノエタノールからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
混合物が、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸の、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割が、無水有機溶媒とアルコールの組み合わせを含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸の、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかを、Carica papayaリパーゼによりエナンチオ選択的に、該アルコールを用いてエステル化する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
式（Ｉ）のα−置換カルボン酸が、下記の化合物：ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、ジクロフォッグ、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸及び２−クロロ−２−フェニル酢酸、の少なくともいずれか１つである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割に使用されるアルコールが、式ＲＯＨであり、
ここで、ＲはＲ２とは異なり、そして：ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ基、アリール基、ビニル及び３〜１２の炭素原子を有する２−アルケニル基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ１２脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、アリール並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基；
を示す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
該アルコールが、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、トリメチルシリルメタノール及び２−Ｎ−モルホリノエタノールからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
（ここで、
Ｘは−Ｏ−または−Ｓ−を示し、
Ｙはハロゲンまたはメチル基であり、
Ｒ１は、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基及びアリール基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、アリールオキシ基または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基を示し；そして、
Ｒ２は、Ｈ；ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ基、アリール基、ビニル及び３〜１２の炭素原子を有する２−アルケニル基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ１２脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基を示し；
ただし、Ｙ及びＲ１は同時にメチルになり得ない)
のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体の混合物を酵素分割する方法であって、
該方法は、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体の混合物を、液相中で、Carica papayaリパーゼにより触媒される酵素分割に供することを包含する。
【請求項２】
液相が、水溶液、無水有機溶媒、水飽和有機溶媒、及び二相溶液を形成するこれらの組み合わせから選択される溶媒系を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
液相が、イソオクタン、ヘプタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ペンタン、デカン、トルエン、ベンゼン、四塩化炭素、ｔ−ブタノール、ｔ−ペンタノール、イソプロピルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル、メチルイソブチルエーテル及びこれらの組み合わせから選択される有機溶媒を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該混合物が、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸、あるいはそのエステルまたはチオエステルのラセミ混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Carica papayaリパーゼが、Carica papaya植物のラテックス浸出液(latex exudate)から調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割が、有機塩基と組み合わせた有機溶媒を含む液相中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
有機溶媒が、イソオクタン、ヘプタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ペンタン、デカン、トルエン、ベンゼン、四塩化炭素、ｔ−ブタノール、ｔ−ペンタノール、イソプロピルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル、メチルイソブチルエーテル及びこれらの組み合わせから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
有機塩基が、第三級アミン、アミジン、グアニジン、ホスファゼン塩基及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
有機塩基が、トリエチルアミン、トリブチルアミン、トリオクチルアミン、７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４，４，０］デカ−５−エン、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、ｔ−ブチルイミノ−トリス（ピロリジノ）ホスホラン、ｔ−ブチルイミノ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホラン、１−ｔ−ブチル−４，４，４−トリス（ジメチルアミノ）−２，２−ビス［トリス（ジメチルアミノ）−ホスホラニリデンアミノ］−２λ５，４λ５−カテナジ（ホスファゼン）、ジエチルアミノメチル−ポリスチレン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
有機塩基が、有機担体及び無機担体から選ばれた担体上に保持される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
有機塩基が、陰イオン交換樹脂上で保持される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割が、２０℃から９０℃の温度範囲で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
混合物が、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割が、水溶液、水飽和有機溶媒、及び二相溶液を形成するこれらの組み合わせから選択される溶媒系を含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかを、Carica papayaリパーゼによりエナンチオ選択的に加水分解する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルが、下記の化合物：ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸または２−クロロ−２−フェニル酢酸の、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、フェニルまたはトリフルオロエチル エステル；ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸または２−クロロ−２−フェニル酢酸の、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、フェニルまたはトリフルオロエチル チオエステル；及び、ジクロフォッグ(diclofog)メチルエステル；
の少なくともいずれか１つである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
液相が、第三級アミン、アミジン、グアニジン、ホスファゼン塩基またはこれらの組み合わせからなる群より選択される有機塩基をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
有機塩基が、トリエチルアミン、トリブチルアミン、トリオクチルアミン、７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４，４，０］デカ−５−エン、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、ｔ−ブチルイミノ−トリス（ピロリジノ）ホスホラン、ｔ−ブチルイミノトリス（ジメチルアミノ）−ホスホラン、１−ｔ−ブチル−４，４，４−トリス（ジメチルアミノ）−２，２−ビス［トリス（ジメチルアミノ）−ホスホラニリデンアミノ］−２λ５，４λ５−カテナジ（ホスファゼン）、ジエチルアミノメチル−ポリスチレン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１７】
混合物が、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割が、無水有機溶媒とアルコールの組み合わせを含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルまたはチオエステルの、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかを、Carica papayaリパーゼによりエナンチオ選択的に、該アルコールを用いてエステル交換する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
式（Ｉ）のα−置換カルボン酸エステルが、下記の化合物：
ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸または２−クロロ−２−フェニル酢酸の、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、フェニルまたはトリフルオロエチル エステル；ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸または２−クロロ−２−フェニル酢酸の、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、フェニルまたはトリフルオロエチル チオエステル；及び、ジクロフォッグメチルエステル、
の少なくともいずれか１つである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割に使用するアルコールが、式ＲＯＨであり、
ここで、ＲはＲ２とは異なり、そして：ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ基、アリール基、ビニル及び３〜１２の炭素原子を有する２−アルケニル基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ１２脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基；
を示す、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該アルコールが、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、トリメチルシリルメタノール及び２−Ｎ−モルホリノエタノールからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
混合物が、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸の、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体を含み、Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割が、無水有機溶媒とアルコールの組み合わせを含む液相中で行われ、式（Ｉ）のα−置換カルボン酸の、Ｒ−型またはＳ−型のいずれかを、Carica papayaリパーゼによりエナンチオ選択的に、該アルコールを用いてエステル化する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
式（Ｉ）のα−置換カルボン酸が、下記の化合物：ナプロキセン、フェノプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、スプロフェン、フルルビプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、ジクロフォッグ、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸及び２−クロロ−２−フェニル酢酸、の少なくともいずれか１つである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Carica papayaリパーゼによる混合物の酵素分割に使用されるアルコールが、式ＲＯＨであり、
ここで、ＲはＲ２とは異なり、そして：ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ基、アリール基、ビニル及び３〜１２の炭素原子を有する２−アルケニル基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１−Ｃ１２脂肪族基；それぞれの基が、ハロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＣＯＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、アリール並びに、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基からなる群より選択される１〜３個の置換基によって必要に応じて置換された、アリール基、または、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含むＣ３−Ｃ１２複素環基；
を示す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
該アルコールが、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、トリメチルシリルメタノール及び２−Ｎ−モルホリノエタノールからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【公開番号】特開２００６−１４７３７（Ｐ２００６−１４７３７Ａ）
【公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００５−１８９３７３（Ｐ２００５−１８９３７３）
【出願日】平成１７年６月２９日（２００５．６．２９）
【出願人】（５０２２５０７４３）國立成功大學 (16)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１８９３７３（Ｐ２００５−１８９３７３）
【出願日】平成１７年６月２９日（２００５．６．２９）
【出願人】（５０２２５０７４３）國立成功大學 (16)
【Ｆターム（参考）】
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