Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する、組換え毒素Ａ／毒素Ｂワクチン
【課題】組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａの少なくとも１回の繰り返し単位（ｒＡＲＵ）、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂの少なくとも１回の繰り返し単位（ｒＢＲＵ）、または各毒素Ａおよび毒素Ｂの少なくとも１回の繰り返し単位を含む、免疫原性組成物を提供すること。
【解決手段】組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａの少なくとも１回の繰り返し単位（ｒＡＲＵ）、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂの少なくとも１回の繰り返し単位（ｒＢＲＵ）、または各毒素Ａおよび毒素Ｂの少なくとも１回の繰り返し単位を含む、免疫原性組成物。
【解決手段】組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａの少なくとも１回の繰り返し単位（ｒＡＲＵ）、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂの少なくとも１回の繰り返し単位（ｒＢＲＵ）、または各毒素Ａおよび毒素Ｂの少なくとも１回の繰り返し単位を含む、免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、医学免疫学の分野に関し、そしてさらに薬学的組成物、ワクチンの作製方法およびワクチンの使用方法に関する。より詳細には、本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂをコードする遺伝子由来の組換えタンパク質、ならびにＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する活性なワクチンにおけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、グラム陽性の嫌気性芽胞形成桿菌であり、抗生物質関連下痢（ＡＡＤ）および大腸炎（ＡＡＣ）の病因因子である。この疾患の症状は、軽度の下痢から、劇症でかつ生命を脅かす偽膜性腸炎（ＰＭＣ）までの範囲である。抗生物質治療は、正常な腸の微生物叢を破壊し得る。正常な微生物叢の破壊は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの芽胞が発芽し得、そしてこの生物が増殖して疾患の原因毒素を産生するのを可能にする状態を生じる。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは抗生物質関連下痢のうちの約２５％を引き起こすが、しかし、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅはほぼ常に、ＰＭＣの原因因子である（Ｌｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｍ．およびＴ．Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ，第５８章，８６７−８９１頁（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９５））。さらに、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは頻繁に、院内感染下痢、特に高齢の患者または免疫無防備状態の患者の院内感染下痢の原因因子として同定される（米国特許第４，８６３，８５２号（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８９））。
【０００３】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって引き起こされる疾患は、毒素産生性株によって産生される２つの腸毒素ＡおよびＢに起因する（米国特許第５，０９８，８２６号（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９９２））。毒素Ａは、最小の細胞傷害性活性を有する腸毒素であり、一方、毒素Ｂは、強力な細胞毒であるが、制限された腸毒性活性を有する。腸粘膜に対する広範な損傷は、毒素Ａの作用に起因し得るが、しかし、毒素Ａおよび毒素Ｂは、腸において相乗的に作用する。
【０００４】
公知の中でも最大の細菌毒素であり、それぞれ、３０８，０００および２６９，０００の分子量を有する、毒素産生性タンパク質Ａおよび毒素産生性タンパク質Ｂの両方をコードする遺伝配列が解明されている（Ｍｏｎｃｒｉｅｆら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：１１０５−１１０８（１９９７）；Ｂａｒｒｏｓｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４００４（１９９０）；Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−４８８（１９９０））。保存された置換を考慮した場合の類似性の程度から、これらの毒素は、遺伝子の重複から生じたと考えられる。これらのタンパク質は、互いに多数の類似の構造的特徴を共有する。例えば、両方のタンパク質は、推定のヌクレオチド結合部位、中心の疎水性領域、４つの保存されたシステインおよびカルボキシ末端に長い一連の反復単位を保有する。特に、毒素Ａの反復単位は、免疫優性であり、そして腸上皮の表面の２型コア炭水化物抗原に対する結合を担う（Ｋｒｉｖａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５３：５７３−５８１（１９８６）；Ｔｕｃｋｅｒ，Ｋ．およびＴ．Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：７３−７８（１９９１））。
【０００５】
毒素は、Ｒｈｏタンパク質の共有結合的改変を含む類似の分子作用機構を共有する。Ｒｈｏタンパク質は、細胞骨格の組織化の維持を含む多数の細胞機能を有する低分子量エフェクタータンパク質である。Ｒｈｏタンパク質の共有結合的改変は、毒素のグルコシルトランスフェラーゼ活性に起因する。グルコース部分は、補基質としてＵＤＰ−グルコースを用いてＲｈｏへと付加される（Ｊｕｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３７５：５００−５０３（１９９５）、Ｊｕｓｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７０：１３９３２−１３９３９（１９９５））。グルコシルトランスフェラーゼ活性は、毒素のうちの、酵素活性に関与しない、細胞傷害性を担う、この反復単位を含む大きな部分を残して、これらの毒素の各々のアミノ酸配列のうちの最初のほぼ２５％に局在している（Ｈｏｆｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１１０７４−１１０７８（１９９７）、ＦａｕｓｔおよびＳｏｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５１：１００−１０５（１９９８））。
【０００６】
毒素Ａタンパク質は、３１個の連続した反復単位（ｒＡＲＵ）を含み、そして複数のＴ細胞エピトープを含み得る（Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−４８８（１９９０））。反復単位は、クラスＩ反復およびクラスＩＩと定義される。ｒＡＲＵは、抗原に対するＴ細胞依存性応答を誘導する際の使用に独自に適切であり得る。各々の単位の配列は、類似するが同一ではない。これらの特徴は、毒素Ａ中和抗体を惹起する際のその有用性とともに、ｒＡＲＵをキャリアタンパク質の新規な候補にする。
【０００７】
毒素Ｂ反復単位は、ｒＡＲＵのものと類似の特徴を有する。ｒＡＲＵと同様に、組換え毒素Ｂ反復単位（ｒＢＲＵ）は、比較的大きく（約７０ｋＤａ）、そして類似のアミノ酸配列の連続した反復から構成される（Ｂａｒｒｏｓｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４００４（１９９０）；Ｅｉｃｈｅｌ−Ｓｔｒｅｉｂｅｒら、Ｇｅｎｅ ９６：１０７−１１３（１９９２））。毒素Ｂのこの部分については、毒素Ａの結合ドメインほどには知られていない。
【０００８】
Ｔｈｏｍａｓら（米国特許第５，９１９，４６３（１９９９））は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａもしくは毒素Ｂまたはそれらの特定のフラグメントを、鼻腔内に投与されて抗原（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉウレアーゼ、オボアルブミン（ＯＶＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））に対する免疫応答を刺激する粘膜アジュバントとして開示する。しかし、Ｔｈｏｍａｓは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株に対する防御のためのこのようなアジュバントの使用を教示しない。Ｌｙｅｒｌｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２１：２９−３２（１９９０）は、ハムスター防御アッセイにおいて毒素Ａ反復からのより小さな組換えフラグメントで考慮した。しかし、これらのデータは、せいぜい、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株からの非常に弱いかまたは部分的な防御しか示唆せず、一方、本発明は、明らかな免疫原性応答を提供し、そしてより高いレベルでは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する防御を提供する、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素反復単位の使用を実証する。
【０００９】
ｒＡＲＵおよびｒＢＲＵを結合体ワクチンの候補タンパク質として考えたとはいえ、このようなタンパク質の産生は、特定の抗原投与を提示する。毒素Ａおよびこれに対して惹起されるタンパク質の産生のための方法が存在する（特許文献１（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８５）；特許文献２（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８５）；および特許文献３（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８９））。十分な量のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよび毒素Ｂタンパク質を産生する際には、かなりの困難が存在する。これらの方法は一般に煩雑でかつ高価である。しかし、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉの株におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの非中毒性の短縮化タンパク質またはフラグメントの構築および組換え発現を提供する。このような方法は、抗原に対する体液性免疫原性を惹起するために充分な量のタンパク質分子の産生のためにより効果的でかつ商業的に実行可能である。
【００１０】
本発明が克服する困難性の一部は、大きなタンパク質はＥ．ｃｏｌｉ中で高レベルで発現することが困難であるという事実に関する。さらに、これらのクロストリジウム属の遺伝子配列における異常に高い含量のＡＴ（すなわち、ＡＴリッチ）は、これらが高レベルで発現されるのを特に困難にする（Ｍａｋｏｆｆら、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１０４３−１０４６（１９８９））。大きな（すなわち、１００ｋｄより大きな）フラグメントがＥ．ｃｏｌｉ中で発現される場合にしばしば、発現の困難性に遭遇することが報告された。この遺伝子の小さな領域が、高度のタンパク質分解を伴わずに高レベルまで発現され得るか否かを決定するために、毒素Ａ遺伝子のより小さなフラグメントを含む多数の発現構築物が構築されている。全ての場合、より大きな組換えフラグメントではなく、より高レベルのインタクトな、全長融合タンパク質が観察されたことが報告された（Ｋｉｎｋら，米国特許第５，７３６，１３９号；実施例１１（ｃ）を参照のこと）。ＡＴリッチな遺伝子が、Ｅ．ｃｏｌｉにおける高レベルの発現を妨害すると考えられる稀なコドンを含むことがさらに報告されている（Ｍａｋｏｆｆら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：１０１９１−１０２０２）。本発明は、大きくかつＡＴリッチの両方である遺伝子を産生する方法およびそれらの免疫原性組成物を提供する。例えば、毒素Ａの反復単位は約９８ｋＤａであり、そしてこの遺伝子配列は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの約５０％ ＡＴ含量よりもずっと高い、約７０％のＡＴ含量を有する。本発明は、稀なコドンを変更することも、稀なｔＲＮＡを供給することもなく、ＡＴリッチ遺伝子（非常に大きな遺伝子を含む）をＥ．ｃｏｌｉ中で高レベルで発現する方法を提供する。
【００１１】
上記の文献の引用は、上記のいずれかの文献が適切な先行技術であると認めたことを意図するわけではない。これらの文献の日付についての全ての言明またはこれらの文献の中身についての説明は、出願人に利用可能な情報に基づいており、これらの文献の日付または内容の正確さについては何の承認をも構成しない。さらに、本出願を通して言及される全ての文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。詳細には、本出願は、米国仮特許出願第６０／１９０，１１１号（２０００年３月２０日出願）；および米国仮特許出願第６０／１８６，２０１号（２０００年３月１日出願）；および米国仮特許出願第６０／１２８，６８６号（１９９９年４月９日出願）に対する優先権の利益を主張し、これらの仮特許出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第４，５３０，８３３号明細書
【特許文献２】米国特許第４，５３３，６３０号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８７９，２１８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、組換えタンパク質を含む免疫原性組成物に関する。このタンパク質をコードする遺伝子は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株から単離される。本発明の好ましい実施形態は、少なくとも１つのタンパク質が毒素または毒素フラグメントであることを提供する。さらに好ましい実施形態は、この毒素がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａまたは毒素Ｂであることを提供する。本発明のより好ましい実施形態は、組換えタンパク質成分が、非中毒性であり、そしてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａもしくは毒素Ｂの反復単位（ｒＡＲＵもしくはｒＢＲＵ）またはそれらのフラグメントのアミノ酸配列の全てを含む、両方の毒素の一部を含むことを提供する。免疫原性組成物は、炭水化物部分ならびに薬学的に受容可能なキャリアまたは哺乳動物における注射に適切な処方における他の組成物をさらに含み得る。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、ｒＡＲＵ成分およびｒＢＲＵ成分が、好ましくは、免疫原性組成物がワクチンにおいて使用される場合に、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する高レベルの中和抗体をもたらす様式で組み合わされることである。これらの成分は、種々の比率で混合され得る。さらに、ｒＡＲＵ成分およびｒＢＲＵ成分は、化学的または物理的に連結されて複合体を形成し得る。別の好ましい実施形態は、ｒＡＲＵ配列およびｒＢＲＵ配列またはそれらのフラグメントが、ハイブリッド分子の産生をもたらす様式で遺伝的に融合され得ることである。さらなる実施形態は、免疫原性組成物が、ネイティブなＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素を沈澱させ、かつそれらの細胞傷害性活性を中和し、従ってＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患に対する防御を提供する抗体を惹起することである。
・本発明は、さらに以下を提供し得る：
・（項目１） 組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａの少なくとも１回の繰り返し単位（ｒＡＲＵ）、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂの少なくとも１回の繰り返し単位（ｒＢＲＵ）、または各毒素Ａおよび毒素Ｂの少なくとも１回の繰り返し単位を含む、免疫原性組成物。
・（項目２） 上記組換えタンパク質成分が、一般的に互いに融合される、少なくとも２回の上記繰り返し単位を含む、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目３） 上記組換えタンパク質成分が、化学的に互いに結合される、少なくとも２回の上記繰り返し単位を含む、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目４） 上記組成物が、毒素Ａまたは毒素Ｂあるいはその両方を中和させる抗体を誘発する、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目５） 哺乳動物の宿主において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株に対する防御応答を誘発する、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目６） 毒素Ａまたは毒素Ｂあるいはその両方を中和させる抗体を誘発する、項目２に記載の免疫原性組成物。
・（項目７） 哺乳動物の宿主において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株に対する防御応答を誘発する、項目２に記載の免疫原性組成物。
・（項目８） 毒素Ａまたは毒素Ｂあるいはその両方を中和させる抗体を誘発する、項目３に記載の免疫原性組成物。
・（項目９） 哺乳動物の宿主において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株に対する防御応答を誘発する、項目３に記載の免疫原性組成物。
・（項目１０） 薬学的に受容可能なキャリア中に、項目１〜９のいずれか１項に記載される免疫原性組成物を含む、薬学的組成物。
・（項目１１） 哺乳動物の宿主において、防御応答を与える方法であって、当該方法は、項目１〜９のいずれか１項に記載の治療的に有効量の免疫原性組成物を哺乳動物の宿主に投与する工程を包含する、方法。
・（項目１２） 哺乳動物の宿主において、防御応答を与える方法であって、当該方法は、項目１０に記載の治療的に有効量の免疫原性組成物を哺乳動物の宿主に投与する工程を包含する、方法。
・（項目１３） 上記タンパク質成分が、毒素Ａまたはそのフラグメントである、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目１４） 上記タンパク質成分が、上記毒素Ａ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントを含む、組換えアミノ酸配列を含む、項目１３に記載の免疫原性組成物。
・（項目１５） 上記タンパク質が、融合タンパク質である、項目１４に記載の免疫原性組成物。
・（項目１６） 上記タンパク質成分が、毒素Ｂまたはそのフラグメントである、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目１７） 上記タンパク質成分が、上記毒素Ｂ繰り返し単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントを含む、組換えアミノ酸配列を含む、項目１６に記載の免疫原性組成物。
・（項目１８） 上記タンパク質が、融合タンパク質である、項目１７に記載の免疫原性組成物。
・（項目１９） 上記免疫原性組成物が、哺乳動物の宿主において、Ｔ細胞依存性である免疫応答を誘発する、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２０） 上記免疫原性組成物が、哺乳動物の宿主において、Ｔ細胞非依存性である免疫応答を誘発する、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２１） 上記免疫原性組成物が、哺乳動物の宿主において、Ｔ細胞依存性およびＴ細胞非依存性の両方である免疫応答を誘発する、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２２） 上記免疫応答が、細胞依存性免疫応答である、項目１９または２０または２１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２３） 上記免疫応答が、上記哺乳動物の宿主において、追加免疫効果を生じる、項目１９または２０または２１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２４） 上記免疫応答が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株に対する防御応答を誘発する、項目１９または２０または２１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２５） 上記免疫応答組成物が、哺乳動物の宿主において、体液性免疫応答を誘発する、項目１９または２０または２１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２６） 上記免疫応答組成物が、哺乳動物の宿主において、体液性免疫応答または細胞依存性免疫応答の両方を誘発する、項目１９または２０または２１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２７） 上記免疫応答が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株に対する防御応答を誘発する、項目１９または２０または２１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２８） 組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントを含有する、組換えアミノ酸配列を含み、そして当該組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、免疫原性組成物。
・（項目２９） 組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂ繰り返し単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントを含有する、組換えアミノ酸配列を含み、そして当該組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、免疫原性組成物。
・（項目３０） 組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂ繰り返し単位（ｒＢＲＵ）あるいはそれらのいずれかのフラグメントを含有する、組換えアミノ酸配列を含み、そして当該組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、免疫原性組成物。
・（項目３１） 組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメント、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂ繰り返し単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントを含有する、組換えアミノ酸配列を含み、そして当該組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、免疫原性組成物。
・（項目３２） 項目２８、２９、３０または３１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を含む、ワクチン。
・（項目３３） 上記ワクチンが、ヒトでの使用のために処方される、項目３２に記載のワクチン。
・（項目３４） 上記ワクチンが、動物での使用のために処方される、項目３２に記載のワクチン。
・（項目３５） 免疫原性組成物を産生するための方法であって、当該方法は、
組換えタンパク質成分をコードする遺伝子配列を構築する工程であって、当該遺伝子配列がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株から単離される、工程；
微生物宿主で、当該組換えタンパク質を発現する工程；
当該宿主の培養物から当該組換えタンパク質を回収する工程；および
当該組換えタンパク質成分を回収する工程であって、当該タンパク質成分は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントであるか、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂ繰り返し単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントである、工程、
を包含する、方法。
・（項目３６） 上記遺伝子配列の発現が、当該配列の上流に作動可能に配置される誘導性プロモータおよび上記宿主の機能によって調節される、項目３５に記載の方法。
・（項目３７） 上記微生物宿主が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、項目３６に記載の方法。
・（項目３８） 上記組換えタンパク質が、約１０ｍｇ／ｍｌよりも高いレベルで発現される、項目３７に記載の方法。
・（項目３９） 上記組換えタンパク質が、上記培養の約５０ｍｇ／ｌよりも高いレベルで発現される、項目３７に記載の方法。
・（項目４０） 上記組換えタンパク質が、上記培養の約１００ｍｇ／ｌよりも高いレベルで発現される、項目３７に記載の方法。
・（項目４１） 上記タンパク質が、約５０ｋＤａよりも大きい、項目３７に記載の方法。
・（項目４２） 上記タンパク質が、約９０ｋＤａよりも大きい、項目３７に記載の方法。
・（項目４３） 上記タンパク質が、硫酸アンモニウム沈殿、次いでイオン交換クロマトグラフィーによって回収される、項目３７に記載の方法。
・（項目４４） 上記タンパク質が、スクシニル化される、項目３７に記載の方法。
・（項目４５） Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株由来のタンパク質成分をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む、組換え遺伝子配列。
・（項目４６） 上記遺伝子が、毒素Ａまたはそのフラグメントをコードする、項目４５に記載の組換え配列。
・（項目４７） 上記遺伝子が、上記毒素Ａ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントをコードする、項目４６に記載の組換え配列。
・（項目４８） 上記遺伝子が、上記毒素Ｂまたはそのフラグメントをコードする、項目４５に記載の組換え配列。
・（項目４９） 上記遺伝子が、上記毒素Ｂ繰り返し単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントをコードする、項目４８に記載の組換え配列。
・（項目５０） 毒素Ａまたはそのフラグメントをコードする第１遺伝子、および毒素Ｂまたはそのフラグメントをコードする第２遺伝子を含む、項目４５に記載の組換え配列。
・（項目５１） 上記毒素Ａ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントをコードする上記第１遺伝子、および上記毒素Ｂ繰り返し単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントをコードする上記第２遺伝子を含む、項目５０に記載の組換え配列。
・（項目５２） 項目４５または項目５０の遺伝子配列、および微生物宿主に選択的な表現型を与える遺伝子を含む、発現ベクター。
・（項目５３） 上記選択的な表現型が、カナマイシンに対して耐性である、項目５２に記載の発現ベクター。
・（項目５４） 項目５２または項目５３の発現ベクターで形質転換された、微生物宿主。
・（項目５５） 受動免疫治療のための、病原性微生物株に対する抗体の産生のための項目１〜９および１３〜３１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、毒素Ａおよび毒素Ｂの模式図である。これらの毒素の反復単位は、細胞表面への結合において機能する。これらの毒素の反復単位に対する抗体は、細胞表面へのこれらの毒素の結合をブロックすることによって細胞傷害性活性を中和する。
【図２】図２は、ｒＡＲＵおよび毒素Ａ停止コドンをコードする、毒素Ａ遺伝子領域のヌクレオチド配列（番号５６９０〜８２９３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３０３０７、Ｄｏｖｅら、１９９３）を示す。この配列は、Ｄｏｖｅら（Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−４８８（１９９０））によって定義された、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＶＰＩ １０４６３株由来の毒素Ａの反復単位全体をコードする。さらに、この配列は、この反復単位の始まりの上流の４アミノ酸および毒素Ａの末端の疎水性アミノ酸の小さなストレッチをコードする。この配列の始まりのＳａｕ３Ａ部位（下線）を用いて、発現ベクターへと遺伝子フラグメントをサブクローン化した。この配列の末端の停止コドンは、斜体である。
【図３】図３は、ｒＡＲＵのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３０３３０７）を示す。本発明は、このアミノ酸配列を含む任意の組換えタンパク質、その中の任意のフラグメント、ｒＡＲＵを含む任意の融合タンパク質またはその中のフラグメント、およびｒＡＲＵの全てまたは一部を保有する毒素Ａ由来の任意のより大きなフラグメントの、結合体ワクチン組成物のためのキャリアとしての使用を意図する。
【図４】図４は、ｒＡＲＵの発現のために用いられる発現ベクターｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrを示す。ｒＡＲＵ、停止コドンおよび毒素Ａの停止コドンの下流の小さな領域をコードするヌクレオチド配列全体を含む、約２．７ｋｂのＳａｕ３Ａ／ＨｉｎｄＩＩＩ遺伝子フラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したベクターｐＲＳＥＴＢへとサブクローン化した。その後の工程では、カナマイシン耐性遺伝子を、ｒＡＲＵの遺伝子フラグメントの下流に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位でサブクローン化した。Ｋｍr遺伝子をコードする１．２ｋｂフラグメントを、ＥｃｏＲＩでの消化によってｐＵＣ４Ｋ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０６４０４）から誘導し、そしてクレノウフラグメントでのベクターおよびＫｍrカセットの平滑末端化後にＨｉｎｄＩＩＩ部位でのサブクローン化した。発現ベクターｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrを、Ｔ７プロモーターの制御下でｒＡＲＵの発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換した。 *ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位を、平滑末端化によって除去した。
【図５】図５は、ｒＡＲＵの発現および精製の工程のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１５％アクリルアミド）を示す。レーン：１）４μｌの１０×ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍr溶解産物、２）元々の培養溶液の容量に対して１０×の４μｌの透析された４０％硫酸アンモニウム画分、３）ＣＬ−６Ｂ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアニオン交換クロマトグラフィーにより精製された５μｌ ｒＡＲＵ（０．８８ｍｇ／ｍｌ）。
【図６】図６は、ｒＢＲＵおよび上流の小さな部分をコードする毒素Ｂ遺伝子領域のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５３１１３８、Ｗｉｌｋｉｎｓら、１９９０）を示す。サブクローン化のために用いたＳａｕ３ａ制限部位に下線を付す。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＶＰＩ株由来の毒素Ｂの反復単位の配列は、以前に定義された（Ｅｉｃｈｅｌ−Ｓｔｒｅｉｂｅｒら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ．２３３：２６０−２６８）。
【図７】図７は、ｒＢＲＵおよび小さな上流の領域のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５３１３８）を示す。本発明は、このアミノ酸配列を含む任意の組換えタンパク質、その中の任意のフラグメント、ｒＢＲＵを含む任意の融合タンパク質またはその中のフラグメント、およびｒＢＲＵの全てまたは一部を保有する毒素Ｂ由来の任意のより大きなフラグメントの、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対するワクチンにおける成分として使用を意図する。
【図８】図８は、ｒＢＲＵの発現のために用いた発現ベクターｐＲＳＥＴＣ−ＢＲＵ−Ｋｍrを示す。ｒＢＲＵをコードするヌクレオチド配列のほぼ全体を含む約１．８ｋｂの遺伝子フラグメント（毒素Ｂの最後の１０アミノ酸が除去される）を、毒素Ｂ遺伝子（Ｐｈｅｌｐｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：１５０−１５３（１９９１））からサブクローン化してｐＧＥＸ−３Ｘとした。ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＢＲＵ由来のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩをサブクローン化してｐＲＳＥＴＣとした。その後の工程では、カナマイシン耐性遺伝子を、ｒＢＲＵ遺伝子フラグメントの下流に位置するＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。Ｋｍr遺伝子をコードする１．２ｋｂフラグメントを、ＥｃｏＲＩでの消化によってｐＵＣ４Ｋ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０６４０４）から誘導した。発現ベクターｐＲＳＥＴＣ−ＢＲＵ−Ｋｍrを、ｒＢＲＵの発現のためにＴ７プロモーターの制御下でＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換した。
【図９】図９は、精製されたｒＡＲＵおよび部分的に精製されたｒＢＲＵのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン；１）連続した硫酸アンモニウム沈澱およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂアニオン交換クロマトグラフィーによって精製されたｒＡＲＵ、２）硫酸アンモニウム沈澱およびフェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅでの疎水性相互作用クロマトグラフィーによって部分的に精製されたｒＢＲＵ、３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＥＴＣ−ＢＲＵ−Ｋｍrの溶解産物（１０×濃度）。
【図１０】図１０は、（Ａ）Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ培養濾液および（Ｂ）部分的に精製したｒＢＲＵの交叉免疫電気泳動である。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅヤギ抗血清を、沈澱抗体として用いた。
【図１１】図１１は、ｒＡＲＵおよびｒＢＲＵの遺伝子融合物の例を示す。Ｓａｕ３Ａ／ＥｃｏＲＩ毒素Ａ遺伝子フラグメント（ヌクレオチド５５３０〜６５７７）を、ＡｐｏＩ毒素Ｂ遺伝子フラグメント（ヌクレオチド５４６４〜６１８０）へと融合して、両方の毒素遺伝子由来の反復単位のかなりの部分を含む約６８ｋＤａの５８８アミノ酸のｒＡＲＵ’／’ｒＢＲＵ’融合タンパク質を発現するインフレームの１，７６３ｂｐの遺伝子融合物を作製し得る。ｒＡＲＵ’フラグメントは、この遺伝子融合物のｒＡＲＵ’部分において白棒によって示されるＰＣＧ−４についてのエピトープをコードする。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、免疫原性組成物に関する。この組成物は、少なくとも１つの組み換えタンパク質成分を含む。ここで、このタンパク質成分をコードする遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株から単離される。本発明の好ましい実施形態は、そのタンパク質が毒素または毒素フラグメントであることを提供する。なおさらなる好ましい実施形態は、その毒素が毒素Ａであることを提供する。ここで、なおさらに好ましい実施形態は、毒素Ａ反復単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントのアミノ酸配列のすべてを含む毒素の一部分である。別の好ましい実施形態は、その毒素が毒素Ｂであることである。ここで、さらに別の好ましい実施形態は、反復単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントのアミノ酸配列の全てを含むその毒素の一部分である。免疫原性組成物は、さらに、哺乳動物における注射のために適切な処方物において、薬学的に受容可能なキャリアまたは他の組成物を含み得る。
本発明のこれらの免疫原性組成物は、哺乳動物宿主において免疫応答を惹起する。この動物にはヒトおよび他の動物が含まれる。免疫応答は、細胞依存性応答または抗体依存性の応答のいずれかあるいはその両方であり得、そしてさらにその応答は、免疫記憶または追加免疫効果あるいはその両方を、その哺乳動物宿主において提供し得る。これらの免疫原性組成物はワクチンとして有用であり、そしてＣｌｏｓｔｅｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株による感染からの哺乳動物被検体または宿主による保護的応答を提供し得る。
【００１７】
本発明は、さらに、以下による免疫原性組成物を生成するための方法を包含する：組み換えタンパク質成分をコードする遺伝子配列を構築する工程であって、ここでそのタンパク質成分をコードする遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株から単離される、工程；その組み換えタンパク質成分を微生物宿主中で発現する工程；その組み換えタンパク質をその宿主の培養物から回収する工程；そのタンパク質を第二のタンパク質成分と結合体化する工程、ならびにその結合体化されたタンパク質およびポリサッカリド成分を回収する工程。このタンパク質成分はまた、融合タンパク質からなり得、ここでは、その組み換えタンパク質の一部は、第二のタンパク質に遺伝子的に融合されている。好ましくは、遺伝子配列の発現は、その配列の上流に作動可能に配置され、そしてその宿主細胞中で機能性である誘導プロモーターによって調節される。なおさらに、その遺伝子配列は、定常的かつ安定な選択圧力によって、その宿主の増殖の間維持される。その発現ベクターの維持は、選択遺伝子型をコードする遺伝子配列の発現ベクターへの取り込みにより付与され得る。その微生物宿主細胞におけるその配列の発現は、選択表現型を生じる。そのような選択遺伝子型は、カナマイシンのような抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子を含む。カナマイシンの存在のような選択剤または状態の存在下で発現ベクター上のこの選択遺伝子型配列の発現は、その宿主の増殖の間、そのベクターの安定な維持を生じる。選択的遺伝子型配列はまた、条件的に致死変異を補完する遺伝子を含み得る。
【００１８】
他の遺伝子配列は、発現ベクター中に取り込まれ得る（例えば、他の薬物耐性遺伝子または致死変異を補完する遺伝子）。
【００１９】
本発明の微生物宿主は、以下を含み得る：グラム陽性細菌；グラム陰性細菌；好ましくはＥ．ｃｏｌｉ細胞、酵母；糸状真菌細胞；哺乳動物細胞；昆虫細胞；または植物細胞。
【００２０】
本発明の方法はまた、約１０ｍｇ／Ｌ培養物を超える、より好ましくは約５０ｍｇ／Ｌを超える、そしてさらにより好ましくは約１００ｍｇ／Ｌでの、または約１００ｍｇ／Ｌを超えるレベルで、その宿主中の組み換えタンパク質の発現のレベルを提供する。そのタンパク質の分子量は、約３０ｋＤａを超え、好ましくは約５０ｋＤａを超え、そしてさらにより好ましくは、約９０ｋＤａを超える。本発明はまた、そのタンパク質がタンパク質の単離および回収について当業者に公知の多数のいずれかの方法によって回収され得るが、好ましくは、その回収が硫酸アンモニウム沈降、続いてイオン交換クロマトグラフィーによることを提供する。
【００２１】
本発明はさらに、そのタンパク質成分が当該分野において公知の多数の手段の一つによって第二のタンパク質成分へと、特にアミド化反応によって結合体化されることを提供する免疫原性組成物を調製するための方法を包含する。
【００２２】
また、組み換えタンパク質の高収量は、増殖条件、発現速度およびＡＴリッチ遺伝子配列を発現するために使用される時間の長さに依存し得る。一般に、ＡＴリッチ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、指数増殖期の後または遅延増殖期の間により高いレベルで発現されるようである。コードされるタンパク質の高レベルの産生は、より短い時間（例えば、４から６時間）にわたる指数増殖の間の高レベルの発現の代表的なアプローチではなく、指数増殖期後の長期（例えば、２０から２４時間）にわたる中程度のレベルの発現を必要とする。この点に関して、長期の増殖の間のその遺伝子またはその発現ベクターについての定常的選択圧力を維持することにより、目的の遺伝子を有するプラスミドを維持することがより効率的である。本発明の１つの局面は、アンピリシンを用いてみいだされるように、発現宿主細胞の増殖の間に不活化または分解されない抗生物質を用いることである。１つのそのような好ましい実施形態は、その発現ベクターを維持するための選択表現型としてのカナマイシンに対する耐性をコードする遺伝子の発現を含む。このベクターは、そのようなカナマイシン遺伝子配列を含む。Ｅ．ｃｏｌｉにおける本発明の方法により提供されるレベル（＞１００ｍｇ／Ｌ）の大きなＡＴリッチクロストリジアム遺伝子の発現は、これまで未知であった。
【００２３】
本明細書において使用される用語は、その当該分野において認識される意味に基づき、そして当業者に明白に理解されるはずである。
【００２４】
免疫原性組成物は、その免疫原性組成物が注射または他の方法で導入されるときに、哺乳動物宿主における免疫応答を惹起する物質の任意の組成物である。免疫反応は、体液性、細胞性またはその両方であり得る。
【００２５】
融合タンパク質は、遺伝子または遺伝子のフラグメントによってコードされる組み換えタンパク質である。これらは、遺伝子的に別の遺伝子または遺伝子のフラグメントに融合されている。
【００２６】
追加免疫効果とは、同じ免疫原性組成物に対する哺乳動物宿主の続いての暴露の際の免疫原性組成物に対する免疫応答の増加をいう。体液性応答は、免疫原性組成物に対する暴露の際に哺乳動物宿主による抗体の産生を生じる。
【００２７】
ｒＡＲＵは、Ｄｏｖｅらによって規定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ 毒素Ａの反復単位を含む組み換えタンパク質である（Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−４８８ （１９９０））。ｒＡＲＵをコードするヌクレオチド配列およびｒＡＲＵのアミノ酸配列は、図２および３にそれぞれ示される。ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrにによって発現されるｒＡＲＵは、毒素Ａの反復単位領域の全体を含む。本発明はさらに、単独で発現されるものであれ、融合タンパク質としてであれ、この組み換えタンパク質成分、または毒素Ａの反復単位全体を含む他の任意のタンパク質成分またはその中の任意のフラグメントの使用を企図する。
【００２８】
類似の方法を使用してクローンを単離し得、そしてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂの反復単位（ｒＢＲＵ）を含む組み換えタンパク質成分を発現し得る。ｒＢＲＵをコードするヌクレオチド配列およびｒＢＲＵのアミノ酸配列は、図６および７にそれぞれ示される。ｐＲＳＥＴＣ−ＢＲＵ−Ｋｍrによって発現されるｒＢＲＵは、毒素Ｂの反復単位領域全体を含む（図８を参照のこと）。
【００２９】
この方法は、ｒＡＲＵまたはｒＢＲＵあるいはその両方を含む免疫原性組成物の調製を提供する。これらは、ワクチンとして有用である。免疫原性組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物中にワクチンとして処方され得る（例えば、水、生理食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）、重炭酸溶液（例えば、０．２４ Ｍ ＮａＨＣＯ3））、坐剤、クリーム、またはゼリー）。これらは、投与の様式および経路ならびに標準的な薬学的実施に基づいて選択される。以下を参照のこと：米国特許第５，９１９．４６３、Ｔｈｏｍａｓら（１９９９）（これは、本明細書においてその全体が参考として援用される）。適切な薬学的キャリアおよび希釈物、ならびに薬学適所放物においてその使用のための薬学的要件は、この分野において、ＵＳＰ／ＮＦにおける標準的な参考文献である、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ａｌｆｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏら編、第１７版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．．Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．．１９８５）において、およびＬａｃｈｍａｎ ら （Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２版．Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ．ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａＰａ．．１９７６）によって記載される。直腸および膣投与の場合、ワクチンは、これらの領域に対して、薬学的材料を投与することにおいて標準的に使用される方法およびキャリアを用いて投与される。例えば、坐剤、クリーム（例えば、ココアバター）、またはゼリー、ならびに標準的な膣塗布剤、スポイト、シリンジ、または浣腸が、当業者によって適切であるように決定されるように使用され得る。
【００３０】
本発明のワクチン組成物は、臨床的に適合した任意の経路（例えば、粘膜（鼻内、経口、眼内、胃腸、直腸、膣内または尿生殖路を含む）の表面への塗布による）によって投与され得る。あるいは、非経口的（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内）の投与様式もまた使用され得る。投与されるワクチンの量は、当業者によって判定されるように、特定のワクチン抗原、ならびに使用される任意のアジュバント、投与の様式および頻度、および所望の効果（例えば、保護および／処置）に依存する。一般に、本発明のワクチンは、１μｇと１００ｍｇとの間の範囲の量で投与される。投与は、当業者によって必要とされるように決定されるように反復される。例えば、プライム刺激用量に続いて３回の追加免疫用量を、１週間おきに投与され得る。
【００３１】
ここまで、本発明を一般的に記載してきたことから、本発明は、以下の実施例を参酌してより容易に理解される。これらの実施例は、例示の目的で提供され、そして特定しない限り本発明の限定を意図しない。
【実施例】
【００３２】
（実施例）
（実施例１：ｒＡＲＵ発現ベクターの構築）
発現および精製のために使用したベクターをクローニングのための標準的な技術を用いて構築した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｖ Ｍａｎｕａｌ （１９８９））。ｒＡＲＵをコードする毒素Ａ遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列は、クローニングされた毒素Ａ遺伝子から得（Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８．４８０−４８８ （１９９０）；Ｐｈｅｌｐｓら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．５９：１５０−１５３ （１９９１））、そして図２に示す。この遺伝子フラグメントは、タンパク質８６７アミノ酸長をコードする（図３）。ここで、算出される分子量は９８ｋＤａである。この遺伝子フラグメントを発現ベクターｐＲＳＥＴＢへとサブクローニングした。カナマイシン耐性遺伝子を、次にこのベクターへとサブクローニングした。得られたベクターｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrは、ｒＡＲＵを発現する。この組み換えタンパク質のＮ末端にはさらに３１アミノ酸が発現ベクターｐＲＳＥＴＢによって与えられる。その組み換えタンパク質の最後の算出分子量は１０２ｋＤａである。
【００３３】
（実施例２：ｒＡＲＵの発現および精製）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｔ７ 発現宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、記載されるように、ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrで形質転換した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ （１９８９））。１Ｌの培養物を、ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrを含む１０ｍｌのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３）の一晩培養物に接種し、、そして２５ μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃブロス （Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．，ＭＯ）中で１．８−２．０にまでＯ．Ｄ．６００増殖させ、そしてイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度４０μＭにまで添加した。細胞を、誘導の２２時間後採集し、０．２％のカザミノ酸を含む０．１Ｌの標準的なリン酸緩衝化生理食塩水ｐＨ７に懸濁化し、そして超音波処理により破壊した。細胞砕片を遠心分離により溶解物から除去した。溶解物は、代表的に、ＴＯＸ−Ａ試験ＥＩＡにおいて１０6の力価（０．２を超えるＡ４５０を有する最高希釈物の逆数）を含んだ（ＴｅｃｈＬａｂ．Ｉｎｃ．．Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ， ＶＡ）。溶解物を、４０％硫酸アンモニウムで飽和させ、４℃で一晩攪拌し、そして沈澱したタンパク質を遠心分離により採取した。この硫酸アンモニウム画分を０．１Ｌの５ｍＭ Ｋ2ＰＯ4、０−１Ｍ ＮａＣ１2， ｐＨ ８．０中に懸濁し、そして４℃で同じ緩衝液に対して徹底的に透析した。可溶性材料を遠心分離により除去した。透析した溶液をＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂクロマトグラフィー媒体（５０ｍｌ媒体／１００ｍｌ溶液）を含むカラムに通した。画分を収集し、そしてｒＡＲＵの存在について、ＴＯＸ−Ａ試験を用いてＥＩＡによりモニターした。ＥＩＡ活性を含む画分を、およそ１０２ＫＤａの分子量でのｒＡＲＵの存在についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分析した。単一バンドのｒＡＲＵを含む画分をプールした。純度をさらに確実とするために、プールされた溶液をＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ カラム （２５ ｍｌ媒体／１００ ｍｌタンパク質溶液）に対して通過させた。精製されたｒＡＲＵを含む溶液を２２μフィルターを通過させることによりフィルター濾過し、そして４℃で保存した。精製されたｒＡＲＵを、精製（溶解物および透析された硫酸アンモニウム画分）の工程からのサンプルとともに、図５に示す。その手順は、代表的に、１リットルのＥ．ｃｏｌｉ／ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍr培養物あたりおよそ１００ｍｇ ｒＡＲＵを得る。併せて６リットルのバッチにより、合計で７４８ｍｇのｒＡＲＵについて０．８８ｍｇ／ｍｌでまたは１２５ｍｇ／リットルの培養物０．８５０リットルのｒＡＲＵが得られた。回収されたｒＡＲＵの量は可溶性タンパク質の合計の２３％を示す。
【００３４】
（実施例３：ｒＢＲＵ発現ベクターの構築）
発現および精製のために使用されたベクターｐＲＳＥＴＣ−ＢＲＵ−Ｋｍrを標準的なクローニング技術を用いて構築した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９））。ｒＢＲＵをコードする毒素Ｂ遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列はクローニングした毒素Ｂ遺伝子に由来し（Ｂａｒｒｏｓｏ ｅｔ
ａｌ．．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １ ８：４００４ （１９９０）） 、そして図６に示す。この遺伝子フラグメントは、６２２アミノ酸長のタンパク質をコードし、分子量は約７０ｋＤａである。カナマイシン耐性遺伝子を、次にそのベクター中にサブクローニングした。得られたベクターｐＲＳＥＴＣ−ＢＲＵ−ＫｍrはｒＢＲＵを発現する。
【００３５】
（実施例４：ｒＢＡＲＵの高レベル発現および部分精製）
１リットルのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐＲＳＥＴＣ−ＢＲＵ−Ｋｍrを３７℃で２５時間、振盪インキュベーターで増殖させた。細胞を、遠心分離し、そして０．２％カザミノ酸を含む０．１リットルのリン酸緩衝化生理食塩水中に再懸濁した。採取時の培養物の上性は、６．２のｐＨを有した。細胞を超音波処理により墓石、そして細胞砕片を遠心分離により除去した。１０×溶解物を図９、レーン３に示す。
【００３６】
（実施例５：結合体のｒＡＲＵ成分に対する免疫応答）
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ（ＣＤＴＡ）に対する抗体。ネイティブ毒素Ａに対する抗体を、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅから単離された毒素Ａｗｏコーティング抗原として使用したＥＬＩＳＡ、および細胞傷害性のインビトロ中和によってにより測定した（Ｌｖｅｒｌｖ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３５：１１４７−１１５０ （１９８２））。ヒト小腸上皮ＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＩ３ ３８）を、５％ＣＯ2雰囲気下で１０％の仔ウシ血清を補充したＭｃＣｏｖ５Ａ培地を有する９６ウェルプレート中に維持した。ＨＴ−２９細胞を選択した。なぜなら、それらは、その表面に高密度の糖レセプターにおそらく起因してＣＤＴＡに対して高感度であるからである。連続的に２倍の希釈の血清を、０．４μｇ／ｍｌのＣＤＴＡとともに３０分で室温でインキュベートした。ＣＤＴＡ血清混合物を、ウェルに、最終容量０．２ｍｌ中に、１ウェルあたり最終濃度２０ｎｇ（ＨＴ−２９細胞についての最小細胞傷害性用量の約２００倍）の毒素Ａで添加した。中和力価を、細胞傷害性を完全に中和した最高希釈の逆数として表す。
【００３７】
【表１】
すべての５つの結合体は、高いレベルの抗ＣＤＴＡ（１９４−６１３μｇ／ｍｌ）を惹起した（表１）。２．５μｇの免疫用量の結合体は、そのポリサッカリド含量に基づいていたことから、注射したｒＡＲＵの量は、各結合体について異なった。例えば、タンパク質重量ベースで、Ｐｎｌ４−ｒＡＲＵは、１．２９μｇのｒＡＲＵとともに、１９４μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌ（１５０．３μｇＡｂ／μｇｒ注射したＡＲＵ）を惹起した。対照的に、１用量あたり７．３μｇのｒＡＲＵを含んだＰｎ Ｉ４−ｒＡＲＵｓｕｃｃは、３７１μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌ（５０．８μｇ Ａｂ／注射したμｇ ｒＡＲＵｓｕｃｃ）を惹起した。ＰｎＩ４−ｒＡＲＵは、１μｇのｒＡＲＵあたり、Ｐｎ１４−ｒＡＲＵｓｃｃより多くの抗ＣＤＴＡを誘導したが、Ｐｎ１４−ｒＡＲＵｓｃｃによって惹起された合計量の抗ＣＤＴＡは、ｒＡＲＵのそのより高い含量に起因して多かった。Ｐｎ１４−ｒＡＲＵによって惹起される抗ＣＤＴＡ（１９４μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌ）、Ｐｎ１４−ｒＡＲＵ−ｒＡＲＵｓｕｃｃによって惹起される抗ＣＤＴＡ（３７１μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌ）に比較しての相違は、顕著であった。
【００３８】
３．９μｇのｒＡＲＵを含むＳＦ−ｒＡＲＵは、４３７μｇのＣＤＴＡ抗体／ｍｌ（１１２．０μｇ Ａｂ／注射されたμｇ ｒＡＲＵ）は、ＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃ（３４．９μｇ Ａｂ／注射したμｇ ｒＡＲＵｓｕｃｃ）についての５１８μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌに匹敵した。ｒＡＲＵｓｕｃｃに対する特定の免疫原性活性は、ＳＦ結合体においてｒＡＲＵのものよりも低かったが、２つの結合体によって惹起されるＣＤＴＡ抗体のレベルの間には統計学的な差異はなかった（ＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃについて４３７μｇ Ａｂ／ｍｌに対してＳＦ−らＲＵについての２４２μｇ Ａｂ／ｍｌ）。
【００３９】
３９０μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌを含むＫ１−ｒＡＲＵｓｕｃｃは、そのｒＡＲＵ成分の匹敵する特異的免疫原性活性を有した（１μｇのｒＡＲＵｓｕｃｃあたり４８μｇ Ａｂ／ｍｌ）
（実施例６：ＣＤＴＡ中和抗体）
その結合体の第三注射の後７日で得た個々の血清を、ヒト小腸上皮ＨＴ−２９細胞に対するＣＤＴＡの細胞傷害性用量の約２００倍のその中和について個々にアッセイした。その結合体で免疫したマウスからのすべての血清は、６４以上の中和力価を有した。各結合体についての中和力価の幾何平均の範囲を表２に示す。
【００４０】
【表２】
（実施例７：ＣＤＴＡでの致死チャレンジからの保護（表３））
Ｈｓｄ／ＩＣＲマウスに、ＳＦ−ｒＡＲＵ、ＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃまたはｒＡＲＵを、上記実施例４に記載のように注射した。第三注射の後１週間で、そのマウスに、致死用量（１５０ｎｇ）のＣＤＴＡで腹腔内チャレンジした。結合体またはｒＡＲＵのいずれかをワクチン接種したほぼすべてのマウスが保護された。注射されたｒＡＲＵの量に基づいて、ｒＡＲＵおよびＳＦ−ｒＡＲＵは、抗ＣＤＴＡの類似のレベルを惹起した。浴されるように、ＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃは、他の２つの免疫原よりもより低いレベルの抗ＣＤＴＡを惹起したがレシピエントは比較的保護された。
【００４１】
結合体誘導された抗体レベルは、ホルマリン不活化ＣＤＴＡで惹起された、０．５ｍｇ／ｍｌを含むアフィニティー精製された薬学的組成物ギ抗体の中和活性に近づくかまたは超過していた。
【００４２】
【表３】
本発明を、直接の説明および実施例によって説明してきた。上記のように、実施例は、本発明の例示のみであり、そして本発明を何らの意味でも限定しないことが意図される。さらに、本発明に関連する当業者は、明細書および上記特許請求の範囲に鑑み、本発明の請求された局面と等価物が存在することを認識する。本発明者らは、請求された本発明の合理的範囲内にそれらの等価物が包含されることを意図する。
【００４３】
（引用された文献）
【００４４】
【表４】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、医学免疫学の分野に関し、そしてさらに薬学的組成物、ワクチンの作製方法およびワクチンの使用方法に関する。より詳細には、本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂをコードする遺伝子由来の組換えタンパク質、ならびにＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する活性なワクチンにおけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、グラム陽性の嫌気性芽胞形成桿菌であり、抗生物質関連下痢（ＡＡＤ）および大腸炎（ＡＡＣ）の病因因子である。この疾患の症状は、軽度の下痢から、劇症でかつ生命を脅かす偽膜性腸炎（ＰＭＣ）までの範囲である。抗生物質治療は、正常な腸の微生物叢を破壊し得る。正常な微生物叢の破壊は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの芽胞が発芽し得、そしてこの生物が増殖して疾患の原因毒素を産生するのを可能にする状態を生じる。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは抗生物質関連下痢のうちの約２５％を引き起こすが、しかし、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅはほぼ常に、ＰＭＣの原因因子である（Ｌｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｍ．およびＴ．Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ，第５８章，８６７−８９１頁（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９５））。さらに、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは頻繁に、院内感染下痢、特に高齢の患者または免疫無防備状態の患者の院内感染下痢の原因因子として同定される（米国特許第４，８６３，８５２号（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８９））。
【０００３】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって引き起こされる疾患は、毒素産生性株によって産生される２つの腸毒素ＡおよびＢに起因する（米国特許第５，０９８，８２６号（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９９２））。毒素Ａは、最小の細胞傷害性活性を有する腸毒素であり、一方、毒素Ｂは、強力な細胞毒であるが、制限された腸毒性活性を有する。腸粘膜に対する広範な損傷は、毒素Ａの作用に起因し得るが、しかし、毒素Ａおよび毒素Ｂは、腸において相乗的に作用する。
【０００４】
公知の中でも最大の細菌毒素であり、それぞれ、３０８，０００および２６９，０００の分子量を有する、毒素産生性タンパク質Ａおよび毒素産生性タンパク質Ｂの両方をコードする遺伝配列が解明されている（Ｍｏｎｃｒｉｅｆら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：１１０５−１１０８（１９９７）；Ｂａｒｒｏｓｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４００４（１９９０）；Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−４８８（１９９０））。保存された置換を考慮した場合の類似性の程度から、これらの毒素は、遺伝子の重複から生じたと考えられる。これらのタンパク質は、互いに多数の類似の構造的特徴を共有する。例えば、両方のタンパク質は、推定のヌクレオチド結合部位、中心の疎水性領域、４つの保存されたシステインおよびカルボキシ末端に長い一連の反復単位を保有する。特に、毒素Ａの反復単位は、免疫優性であり、そして腸上皮の表面の２型コア炭水化物抗原に対する結合を担う（Ｋｒｉｖａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５３：５７３−５８１（１９８６）；Ｔｕｃｋｅｒ，Ｋ．およびＴ．Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：７３−７８（１９９１））。
【０００５】
毒素は、Ｒｈｏタンパク質の共有結合的改変を含む類似の分子作用機構を共有する。Ｒｈｏタンパク質は、細胞骨格の組織化の維持を含む多数の細胞機能を有する低分子量エフェクタータンパク質である。Ｒｈｏタンパク質の共有結合的改変は、毒素のグルコシルトランスフェラーゼ活性に起因する。グルコース部分は、補基質としてＵＤＰ−グルコースを用いてＲｈｏへと付加される（Ｊｕｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３７５：５００−５０３（１９９５）、Ｊｕｓｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７０：１３９３２−１３９３９（１９９５））。グルコシルトランスフェラーゼ活性は、毒素のうちの、酵素活性に関与しない、細胞傷害性を担う、この反復単位を含む大きな部分を残して、これらの毒素の各々のアミノ酸配列のうちの最初のほぼ２５％に局在している（Ｈｏｆｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１１０７４−１１０７８（１９９７）、ＦａｕｓｔおよびＳｏｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５１：１００−１０５（１９９８））。
【０００６】
毒素Ａタンパク質は、３１個の連続した反復単位（ｒＡＲＵ）を含み、そして複数のＴ細胞エピトープを含み得る（Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−４８８（１９９０））。反復単位は、クラスＩ反復およびクラスＩＩと定義される。ｒＡＲＵは、抗原に対するＴ細胞依存性応答を誘導する際の使用に独自に適切であり得る。各々の単位の配列は、類似するが同一ではない。これらの特徴は、毒素Ａ中和抗体を惹起する際のその有用性とともに、ｒＡＲＵをキャリアタンパク質の新規な候補にする。
【０００７】
毒素Ｂ反復単位は、ｒＡＲＵのものと類似の特徴を有する。ｒＡＲＵと同様に、組換え毒素Ｂ反復単位（ｒＢＲＵ）は、比較的大きく（約７０ｋＤａ）、そして類似のアミノ酸配列の連続した反復から構成される（Ｂａｒｒｏｓｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４００４（１９９０）；Ｅｉｃｈｅｌ−Ｓｔｒｅｉｂｅｒら、Ｇｅｎｅ ９６：１０７−１１３（１９９２））。毒素Ｂのこの部分については、毒素Ａの結合ドメインほどには知られていない。
【０００８】
Ｔｈｏｍａｓら（米国特許第５，９１９，４６３（１９９９））は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａもしくは毒素Ｂまたはそれらの特定のフラグメントを、鼻腔内に投与されて抗原（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉウレアーゼ、オボアルブミン（ＯＶＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））に対する免疫応答を刺激する粘膜アジュバントとして開示する。しかし、Ｔｈｏｍａｓは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株に対する防御のためのこのようなアジュバントの使用を教示しない。Ｌｙｅｒｌｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２１：２９−３２（１９９０）は、ハムスター防御アッセイにおいて毒素Ａ反復からのより小さな組換えフラグメントで考慮した。しかし、これらのデータは、せいぜい、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株からの非常に弱いかまたは部分的な防御しか示唆せず、一方、本発明は、明らかな免疫原性応答を提供し、そしてより高いレベルでは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する防御を提供する、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素反復単位の使用を実証する。
【０００９】
ｒＡＲＵおよびｒＢＲＵを結合体ワクチンの候補タンパク質として考えたとはいえ、このようなタンパク質の産生は、特定の抗原投与を提示する。毒素Ａおよびこれに対して惹起されるタンパク質の産生のための方法が存在する（特許文献１（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８５）；特許文献２（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８５）；および特許文献３（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８９））。十分な量のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよび毒素Ｂタンパク質を産生する際には、かなりの困難が存在する。これらの方法は一般に煩雑でかつ高価である。しかし、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉの株におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａおよび毒素Ｂの非中毒性の短縮化タンパク質またはフラグメントの構築および組換え発現を提供する。このような方法は、抗原に対する体液性免疫原性を惹起するために充分な量のタンパク質分子の産生のためにより効果的でかつ商業的に実行可能である。
【００１０】
本発明が克服する困難性の一部は、大きなタンパク質はＥ．ｃｏｌｉ中で高レベルで発現することが困難であるという事実に関する。さらに、これらのクロストリジウム属の遺伝子配列における異常に高い含量のＡＴ（すなわち、ＡＴリッチ）は、これらが高レベルで発現されるのを特に困難にする（Ｍａｋｏｆｆら、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１０４３−１０４６（１９８９））。大きな（すなわち、１００ｋｄより大きな）フラグメントがＥ．ｃｏｌｉ中で発現される場合にしばしば、発現の困難性に遭遇することが報告された。この遺伝子の小さな領域が、高度のタンパク質分解を伴わずに高レベルまで発現され得るか否かを決定するために、毒素Ａ遺伝子のより小さなフラグメントを含む多数の発現構築物が構築されている。全ての場合、より大きな組換えフラグメントではなく、より高レベルのインタクトな、全長融合タンパク質が観察されたことが報告された（Ｋｉｎｋら，米国特許第５，７３６，１３９号；実施例１１（ｃ）を参照のこと）。ＡＴリッチな遺伝子が、Ｅ．ｃｏｌｉにおける高レベルの発現を妨害すると考えられる稀なコドンを含むことがさらに報告されている（Ｍａｋｏｆｆら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：１０１９１−１０２０２）。本発明は、大きくかつＡＴリッチの両方である遺伝子を産生する方法およびそれらの免疫原性組成物を提供する。例えば、毒素Ａの反復単位は約９８ｋＤａであり、そしてこの遺伝子配列は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの約５０％ ＡＴ含量よりもずっと高い、約７０％のＡＴ含量を有する。本発明は、稀なコドンを変更することも、稀なｔＲＮＡを供給することもなく、ＡＴリッチ遺伝子（非常に大きな遺伝子を含む）をＥ．ｃｏｌｉ中で高レベルで発現する方法を提供する。
【００１１】
上記の文献の引用は、上記のいずれかの文献が適切な先行技術であると認めたことを意図するわけではない。これらの文献の日付についての全ての言明またはこれらの文献の中身についての説明は、出願人に利用可能な情報に基づいており、これらの文献の日付または内容の正確さについては何の承認をも構成しない。さらに、本出願を通して言及される全ての文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。詳細には、本出願は、米国仮特許出願第６０／１９０，１１１号（２０００年３月２０日出願）；および米国仮特許出願第６０／１８６，２０１号（２０００年３月１日出願）；および米国仮特許出願第６０／１２８，６８６号（１９９９年４月９日出願）に対する優先権の利益を主張し、これらの仮特許出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第４，５３０，８３３号明細書
【特許文献２】米国特許第４，５３３，６３０号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８７９，２１８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、組換えタンパク質を含む免疫原性組成物に関する。このタンパク質をコードする遺伝子は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株から単離される。本発明の好ましい実施形態は、少なくとも１つのタンパク質が毒素または毒素フラグメントであることを提供する。さらに好ましい実施形態は、この毒素がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａまたは毒素Ｂであることを提供する。本発明のより好ましい実施形態は、組換えタンパク質成分が、非中毒性であり、そしてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａもしくは毒素Ｂの反復単位（ｒＡＲＵもしくはｒＢＲＵ）またはそれらのフラグメントのアミノ酸配列の全てを含む、両方の毒素の一部を含むことを提供する。免疫原性組成物は、炭水化物部分ならびに薬学的に受容可能なキャリアまたは哺乳動物における注射に適切な処方における他の組成物をさらに含み得る。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、ｒＡＲＵ成分およびｒＢＲＵ成分が、好ましくは、免疫原性組成物がワクチンにおいて使用される場合に、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する高レベルの中和抗体をもたらす様式で組み合わされることである。これらの成分は、種々の比率で混合され得る。さらに、ｒＡＲＵ成分およびｒＢＲＵ成分は、化学的または物理的に連結されて複合体を形成し得る。別の好ましい実施形態は、ｒＡＲＵ配列およびｒＢＲＵ配列またはそれらのフラグメントが、ハイブリッド分子の産生をもたらす様式で遺伝的に融合され得ることである。さらなる実施形態は、免疫原性組成物が、ネイティブなＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素を沈澱させ、かつそれらの細胞傷害性活性を中和し、従ってＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患に対する防御を提供する抗体を惹起することである。
・本発明は、さらに以下を提供し得る：
・（項目１） 組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａの少なくとも１回の繰り返し単位（ｒＡＲＵ）、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂの少なくとも１回の繰り返し単位（ｒＢＲＵ）、または各毒素Ａおよび毒素Ｂの少なくとも１回の繰り返し単位を含む、免疫原性組成物。
・（項目２） 上記組換えタンパク質成分が、一般的に互いに融合される、少なくとも２回の上記繰り返し単位を含む、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目３） 上記組換えタンパク質成分が、化学的に互いに結合される、少なくとも２回の上記繰り返し単位を含む、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目４） 上記組成物が、毒素Ａまたは毒素Ｂあるいはその両方を中和させる抗体を誘発する、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目５） 哺乳動物の宿主において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株に対する防御応答を誘発する、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目６） 毒素Ａまたは毒素Ｂあるいはその両方を中和させる抗体を誘発する、項目２に記載の免疫原性組成物。
・（項目７） 哺乳動物の宿主において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株に対する防御応答を誘発する、項目２に記載の免疫原性組成物。
・（項目８） 毒素Ａまたは毒素Ｂあるいはその両方を中和させる抗体を誘発する、項目３に記載の免疫原性組成物。
・（項目９） 哺乳動物の宿主において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株に対する防御応答を誘発する、項目３に記載の免疫原性組成物。
・（項目１０） 薬学的に受容可能なキャリア中に、項目１〜９のいずれか１項に記載される免疫原性組成物を含む、薬学的組成物。
・（項目１１） 哺乳動物の宿主において、防御応答を与える方法であって、当該方法は、項目１〜９のいずれか１項に記載の治療的に有効量の免疫原性組成物を哺乳動物の宿主に投与する工程を包含する、方法。
・（項目１２） 哺乳動物の宿主において、防御応答を与える方法であって、当該方法は、項目１０に記載の治療的に有効量の免疫原性組成物を哺乳動物の宿主に投与する工程を包含する、方法。
・（項目１３） 上記タンパク質成分が、毒素Ａまたはそのフラグメントである、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目１４） 上記タンパク質成分が、上記毒素Ａ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントを含む、組換えアミノ酸配列を含む、項目１３に記載の免疫原性組成物。
・（項目１５） 上記タンパク質が、融合タンパク質である、項目１４に記載の免疫原性組成物。
・（項目１６） 上記タンパク質成分が、毒素Ｂまたはそのフラグメントである、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目１７） 上記タンパク質成分が、上記毒素Ｂ繰り返し単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントを含む、組換えアミノ酸配列を含む、項目１６に記載の免疫原性組成物。
・（項目１８） 上記タンパク質が、融合タンパク質である、項目１７に記載の免疫原性組成物。
・（項目１９） 上記免疫原性組成物が、哺乳動物の宿主において、Ｔ細胞依存性である免疫応答を誘発する、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２０） 上記免疫原性組成物が、哺乳動物の宿主において、Ｔ細胞非依存性である免疫応答を誘発する、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２１） 上記免疫原性組成物が、哺乳動物の宿主において、Ｔ細胞依存性およびＴ細胞非依存性の両方である免疫応答を誘発する、項目１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２２） 上記免疫応答が、細胞依存性免疫応答である、項目１９または２０または２１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２３） 上記免疫応答が、上記哺乳動物の宿主において、追加免疫効果を生じる、項目１９または２０または２１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２４） 上記免疫応答が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株に対する防御応答を誘発する、項目１９または２０または２１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２５） 上記免疫応答組成物が、哺乳動物の宿主において、体液性免疫応答を誘発する、項目１９または２０または２１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２６） 上記免疫応答組成物が、哺乳動物の宿主において、体液性免疫応答または細胞依存性免疫応答の両方を誘発する、項目１９または２０または２１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２７） 上記免疫応答が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株に対する防御応答を誘発する、項目１９または２０または２１に記載の免疫原性組成物。
・（項目２８） 組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントを含有する、組換えアミノ酸配列を含み、そして当該組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、免疫原性組成物。
・（項目２９） 組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂ繰り返し単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントを含有する、組換えアミノ酸配列を含み、そして当該組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、免疫原性組成物。
・（項目３０） 組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂ繰り返し単位（ｒＢＲＵ）あるいはそれらのいずれかのフラグメントを含有する、組換えアミノ酸配列を含み、そして当該組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、免疫原性組成物。
・（項目３１） 組換えタンパク質成分を含む免疫原性組成物であって、当該タンパク質成分は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメント、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂ繰り返し単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントを含有する、組換えアミノ酸配列を含み、そして当該組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、免疫原性組成物。
・（項目３２） 項目２８、２９、３０または３１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を含む、ワクチン。
・（項目３３） 上記ワクチンが、ヒトでの使用のために処方される、項目３２に記載のワクチン。
・（項目３４） 上記ワクチンが、動物での使用のために処方される、項目３２に記載のワクチン。
・（項目３５） 免疫原性組成物を産生するための方法であって、当該方法は、
組換えタンパク質成分をコードする遺伝子配列を構築する工程であって、当該遺伝子配列がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株から単離される、工程；
微生物宿主で、当該組換えタンパク質を発現する工程；
当該宿主の培養物から当該組換えタンパク質を回収する工程；および
当該組換えタンパク質成分を回収する工程であって、当該タンパク質成分は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントであるか、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂ繰り返し単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントである、工程、
を包含する、方法。
・（項目３６） 上記遺伝子配列の発現が、当該配列の上流に作動可能に配置される誘導性プロモータおよび上記宿主の機能によって調節される、項目３５に記載の方法。
・（項目３７） 上記微生物宿主が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、項目３６に記載の方法。
・（項目３８） 上記組換えタンパク質が、約１０ｍｇ／ｍｌよりも高いレベルで発現される、項目３７に記載の方法。
・（項目３９） 上記組換えタンパク質が、上記培養の約５０ｍｇ／ｌよりも高いレベルで発現される、項目３７に記載の方法。
・（項目４０） 上記組換えタンパク質が、上記培養の約１００ｍｇ／ｌよりも高いレベルで発現される、項目３７に記載の方法。
・（項目４１） 上記タンパク質が、約５０ｋＤａよりも大きい、項目３７に記載の方法。
・（項目４２） 上記タンパク質が、約９０ｋＤａよりも大きい、項目３７に記載の方法。
・（項目４３） 上記タンパク質が、硫酸アンモニウム沈殿、次いでイオン交換クロマトグラフィーによって回収される、項目３７に記載の方法。
・（項目４４） 上記タンパク質が、スクシニル化される、項目３７に記載の方法。
・（項目４５） Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株由来のタンパク質成分をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む、組換え遺伝子配列。
・（項目４６） 上記遺伝子が、毒素Ａまたはそのフラグメントをコードする、項目４５に記載の組換え配列。
・（項目４７） 上記遺伝子が、上記毒素Ａ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントをコードする、項目４６に記載の組換え配列。
・（項目４８） 上記遺伝子が、上記毒素Ｂまたはそのフラグメントをコードする、項目４５に記載の組換え配列。
・（項目４９） 上記遺伝子が、上記毒素Ｂ繰り返し単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントをコードする、項目４８に記載の組換え配列。
・（項目５０） 毒素Ａまたはそのフラグメントをコードする第１遺伝子、および毒素Ｂまたはそのフラグメントをコードする第２遺伝子を含む、項目４５に記載の組換え配列。
・（項目５１） 上記毒素Ａ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントをコードする上記第１遺伝子、および上記毒素Ｂ繰り返し単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントをコードする上記第２遺伝子を含む、項目５０に記載の組換え配列。
・（項目５２） 項目４５または項目５０の遺伝子配列、および微生物宿主に選択的な表現型を与える遺伝子を含む、発現ベクター。
・（項目５３） 上記選択的な表現型が、カナマイシンに対して耐性である、項目５２に記載の発現ベクター。
・（項目５４） 項目５２または項目５３の発現ベクターで形質転換された、微生物宿主。
・（項目５５） 受動免疫治療のための、病原性微生物株に対する抗体の産生のための項目１〜９および１３〜３１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、毒素Ａおよび毒素Ｂの模式図である。これらの毒素の反復単位は、細胞表面への結合において機能する。これらの毒素の反復単位に対する抗体は、細胞表面へのこれらの毒素の結合をブロックすることによって細胞傷害性活性を中和する。
【図２】図２は、ｒＡＲＵおよび毒素Ａ停止コドンをコードする、毒素Ａ遺伝子領域のヌクレオチド配列（番号５６９０〜８２９３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３０３０７、Ｄｏｖｅら、１９９３）を示す。この配列は、Ｄｏｖｅら（Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−４８８（１９９０））によって定義された、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＶＰＩ １０４６３株由来の毒素Ａの反復単位全体をコードする。さらに、この配列は、この反復単位の始まりの上流の４アミノ酸および毒素Ａの末端の疎水性アミノ酸の小さなストレッチをコードする。この配列の始まりのＳａｕ３Ａ部位（下線）を用いて、発現ベクターへと遺伝子フラグメントをサブクローン化した。この配列の末端の停止コドンは、斜体である。
【図３】図３は、ｒＡＲＵのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３０３３０７）を示す。本発明は、このアミノ酸配列を含む任意の組換えタンパク質、その中の任意のフラグメント、ｒＡＲＵを含む任意の融合タンパク質またはその中のフラグメント、およびｒＡＲＵの全てまたは一部を保有する毒素Ａ由来の任意のより大きなフラグメントの、結合体ワクチン組成物のためのキャリアとしての使用を意図する。
【図４】図４は、ｒＡＲＵの発現のために用いられる発現ベクターｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrを示す。ｒＡＲＵ、停止コドンおよび毒素Ａの停止コドンの下流の小さな領域をコードするヌクレオチド配列全体を含む、約２．７ｋｂのＳａｕ３Ａ／ＨｉｎｄＩＩＩ遺伝子フラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したベクターｐＲＳＥＴＢへとサブクローン化した。その後の工程では、カナマイシン耐性遺伝子を、ｒＡＲＵの遺伝子フラグメントの下流に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位でサブクローン化した。Ｋｍr遺伝子をコードする１．２ｋｂフラグメントを、ＥｃｏＲＩでの消化によってｐＵＣ４Ｋ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０６４０４）から誘導し、そしてクレノウフラグメントでのベクターおよびＫｍrカセットの平滑末端化後にＨｉｎｄＩＩＩ部位でのサブクローン化した。発現ベクターｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrを、Ｔ７プロモーターの制御下でｒＡＲＵの発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換した。 *ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位を、平滑末端化によって除去した。
【図５】図５は、ｒＡＲＵの発現および精製の工程のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１５％アクリルアミド）を示す。レーン：１）４μｌの１０×ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍr溶解産物、２）元々の培養溶液の容量に対して１０×の４μｌの透析された４０％硫酸アンモニウム画分、３）ＣＬ−６Ｂ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアニオン交換クロマトグラフィーにより精製された５μｌ ｒＡＲＵ（０．８８ｍｇ／ｍｌ）。
【図６】図６は、ｒＢＲＵおよび上流の小さな部分をコードする毒素Ｂ遺伝子領域のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５３１１３８、Ｗｉｌｋｉｎｓら、１９９０）を示す。サブクローン化のために用いたＳａｕ３ａ制限部位に下線を付す。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＶＰＩ株由来の毒素Ｂの反復単位の配列は、以前に定義された（Ｅｉｃｈｅｌ−Ｓｔｒｅｉｂｅｒら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ．２３３：２６０−２６８）。
【図７】図７は、ｒＢＲＵおよび小さな上流の領域のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５３１３８）を示す。本発明は、このアミノ酸配列を含む任意の組換えタンパク質、その中の任意のフラグメント、ｒＢＲＵを含む任意の融合タンパク質またはその中のフラグメント、およびｒＢＲＵの全てまたは一部を保有する毒素Ｂ由来の任意のより大きなフラグメントの、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対するワクチンにおける成分として使用を意図する。
【図８】図８は、ｒＢＲＵの発現のために用いた発現ベクターｐＲＳＥＴＣ−ＢＲＵ−Ｋｍrを示す。ｒＢＲＵをコードするヌクレオチド配列のほぼ全体を含む約１．８ｋｂの遺伝子フラグメント（毒素Ｂの最後の１０アミノ酸が除去される）を、毒素Ｂ遺伝子（Ｐｈｅｌｐｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：１５０−１５３（１９９１））からサブクローン化してｐＧＥＸ−３Ｘとした。ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＢＲＵ由来のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩをサブクローン化してｐＲＳＥＴＣとした。その後の工程では、カナマイシン耐性遺伝子を、ｒＢＲＵ遺伝子フラグメントの下流に位置するＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。Ｋｍr遺伝子をコードする１．２ｋｂフラグメントを、ＥｃｏＲＩでの消化によってｐＵＣ４Ｋ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０６４０４）から誘導した。発現ベクターｐＲＳＥＴＣ−ＢＲＵ−Ｋｍrを、ｒＢＲＵの発現のためにＴ７プロモーターの制御下でＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換した。
【図９】図９は、精製されたｒＡＲＵおよび部分的に精製されたｒＢＲＵのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン；１）連続した硫酸アンモニウム沈澱およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂアニオン交換クロマトグラフィーによって精製されたｒＡＲＵ、２）硫酸アンモニウム沈澱およびフェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅでの疎水性相互作用クロマトグラフィーによって部分的に精製されたｒＢＲＵ、３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＥＴＣ−ＢＲＵ−Ｋｍrの溶解産物（１０×濃度）。
【図１０】図１０は、（Ａ）Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ培養濾液および（Ｂ）部分的に精製したｒＢＲＵの交叉免疫電気泳動である。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅヤギ抗血清を、沈澱抗体として用いた。
【図１１】図１１は、ｒＡＲＵおよびｒＢＲＵの遺伝子融合物の例を示す。Ｓａｕ３Ａ／ＥｃｏＲＩ毒素Ａ遺伝子フラグメント（ヌクレオチド５５３０〜６５７７）を、ＡｐｏＩ毒素Ｂ遺伝子フラグメント（ヌクレオチド５４６４〜６１８０）へと融合して、両方の毒素遺伝子由来の反復単位のかなりの部分を含む約６８ｋＤａの５８８アミノ酸のｒＡＲＵ’／’ｒＢＲＵ’融合タンパク質を発現するインフレームの１，７６３ｂｐの遺伝子融合物を作製し得る。ｒＡＲＵ’フラグメントは、この遺伝子融合物のｒＡＲＵ’部分において白棒によって示されるＰＣＧ−４についてのエピトープをコードする。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、免疫原性組成物に関する。この組成物は、少なくとも１つの組み換えタンパク質成分を含む。ここで、このタンパク質成分をコードする遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株から単離される。本発明の好ましい実施形態は、そのタンパク質が毒素または毒素フラグメントであることを提供する。なおさらなる好ましい実施形態は、その毒素が毒素Ａであることを提供する。ここで、なおさらに好ましい実施形態は、毒素Ａ反復単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントのアミノ酸配列のすべてを含む毒素の一部分である。別の好ましい実施形態は、その毒素が毒素Ｂであることである。ここで、さらに別の好ましい実施形態は、反復単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントのアミノ酸配列の全てを含むその毒素の一部分である。免疫原性組成物は、さらに、哺乳動物における注射のために適切な処方物において、薬学的に受容可能なキャリアまたは他の組成物を含み得る。
本発明のこれらの免疫原性組成物は、哺乳動物宿主において免疫応答を惹起する。この動物にはヒトおよび他の動物が含まれる。免疫応答は、細胞依存性応答または抗体依存性の応答のいずれかあるいはその両方であり得、そしてさらにその応答は、免疫記憶または追加免疫効果あるいはその両方を、その哺乳動物宿主において提供し得る。これらの免疫原性組成物はワクチンとして有用であり、そしてＣｌｏｓｔｅｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株による感染からの哺乳動物被検体または宿主による保護的応答を提供し得る。
【００１７】
本発明は、さらに、以下による免疫原性組成物を生成するための方法を包含する：組み換えタンパク質成分をコードする遺伝子配列を構築する工程であって、ここでそのタンパク質成分をコードする遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株から単離される、工程；その組み換えタンパク質成分を微生物宿主中で発現する工程；その組み換えタンパク質をその宿主の培養物から回収する工程；そのタンパク質を第二のタンパク質成分と結合体化する工程、ならびにその結合体化されたタンパク質およびポリサッカリド成分を回収する工程。このタンパク質成分はまた、融合タンパク質からなり得、ここでは、その組み換えタンパク質の一部は、第二のタンパク質に遺伝子的に融合されている。好ましくは、遺伝子配列の発現は、その配列の上流に作動可能に配置され、そしてその宿主細胞中で機能性である誘導プロモーターによって調節される。なおさらに、その遺伝子配列は、定常的かつ安定な選択圧力によって、その宿主の増殖の間維持される。その発現ベクターの維持は、選択遺伝子型をコードする遺伝子配列の発現ベクターへの取り込みにより付与され得る。その微生物宿主細胞におけるその配列の発現は、選択表現型を生じる。そのような選択遺伝子型は、カナマイシンのような抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子を含む。カナマイシンの存在のような選択剤または状態の存在下で発現ベクター上のこの選択遺伝子型配列の発現は、その宿主の増殖の間、そのベクターの安定な維持を生じる。選択的遺伝子型配列はまた、条件的に致死変異を補完する遺伝子を含み得る。
【００１８】
他の遺伝子配列は、発現ベクター中に取り込まれ得る（例えば、他の薬物耐性遺伝子または致死変異を補完する遺伝子）。
【００１９】
本発明の微生物宿主は、以下を含み得る：グラム陽性細菌；グラム陰性細菌；好ましくはＥ．ｃｏｌｉ細胞、酵母；糸状真菌細胞；哺乳動物細胞；昆虫細胞；または植物細胞。
【００２０】
本発明の方法はまた、約１０ｍｇ／Ｌ培養物を超える、より好ましくは約５０ｍｇ／Ｌを超える、そしてさらにより好ましくは約１００ｍｇ／Ｌでの、または約１００ｍｇ／Ｌを超えるレベルで、その宿主中の組み換えタンパク質の発現のレベルを提供する。そのタンパク質の分子量は、約３０ｋＤａを超え、好ましくは約５０ｋＤａを超え、そしてさらにより好ましくは、約９０ｋＤａを超える。本発明はまた、そのタンパク質がタンパク質の単離および回収について当業者に公知の多数のいずれかの方法によって回収され得るが、好ましくは、その回収が硫酸アンモニウム沈降、続いてイオン交換クロマトグラフィーによることを提供する。
【００２１】
本発明はさらに、そのタンパク質成分が当該分野において公知の多数の手段の一つによって第二のタンパク質成分へと、特にアミド化反応によって結合体化されることを提供する免疫原性組成物を調製するための方法を包含する。
【００２２】
また、組み換えタンパク質の高収量は、増殖条件、発現速度およびＡＴリッチ遺伝子配列を発現するために使用される時間の長さに依存し得る。一般に、ＡＴリッチ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、指数増殖期の後または遅延増殖期の間により高いレベルで発現されるようである。コードされるタンパク質の高レベルの産生は、より短い時間（例えば、４から６時間）にわたる指数増殖の間の高レベルの発現の代表的なアプローチではなく、指数増殖期後の長期（例えば、２０から２４時間）にわたる中程度のレベルの発現を必要とする。この点に関して、長期の増殖の間のその遺伝子またはその発現ベクターについての定常的選択圧力を維持することにより、目的の遺伝子を有するプラスミドを維持することがより効率的である。本発明の１つの局面は、アンピリシンを用いてみいだされるように、発現宿主細胞の増殖の間に不活化または分解されない抗生物質を用いることである。１つのそのような好ましい実施形態は、その発現ベクターを維持するための選択表現型としてのカナマイシンに対する耐性をコードする遺伝子の発現を含む。このベクターは、そのようなカナマイシン遺伝子配列を含む。Ｅ．ｃｏｌｉにおける本発明の方法により提供されるレベル（＞１００ｍｇ／Ｌ）の大きなＡＴリッチクロストリジアム遺伝子の発現は、これまで未知であった。
【００２３】
本明細書において使用される用語は、その当該分野において認識される意味に基づき、そして当業者に明白に理解されるはずである。
【００２４】
免疫原性組成物は、その免疫原性組成物が注射または他の方法で導入されるときに、哺乳動物宿主における免疫応答を惹起する物質の任意の組成物である。免疫反応は、体液性、細胞性またはその両方であり得る。
【００２５】
融合タンパク質は、遺伝子または遺伝子のフラグメントによってコードされる組み換えタンパク質である。これらは、遺伝子的に別の遺伝子または遺伝子のフラグメントに融合されている。
【００２６】
追加免疫効果とは、同じ免疫原性組成物に対する哺乳動物宿主の続いての暴露の際の免疫原性組成物に対する免疫応答の増加をいう。体液性応答は、免疫原性組成物に対する暴露の際に哺乳動物宿主による抗体の産生を生じる。
【００２７】
ｒＡＲＵは、Ｄｏｖｅらによって規定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ 毒素Ａの反復単位を含む組み換えタンパク質である（Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−４８８ （１９９０））。ｒＡＲＵをコードするヌクレオチド配列およびｒＡＲＵのアミノ酸配列は、図２および３にそれぞれ示される。ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrにによって発現されるｒＡＲＵは、毒素Ａの反復単位領域の全体を含む。本発明はさらに、単独で発現されるものであれ、融合タンパク質としてであれ、この組み換えタンパク質成分、または毒素Ａの反復単位全体を含む他の任意のタンパク質成分またはその中の任意のフラグメントの使用を企図する。
【００２８】
類似の方法を使用してクローンを単離し得、そしてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂの反復単位（ｒＢＲＵ）を含む組み換えタンパク質成分を発現し得る。ｒＢＲＵをコードするヌクレオチド配列およびｒＢＲＵのアミノ酸配列は、図６および７にそれぞれ示される。ｐＲＳＥＴＣ−ＢＲＵ−Ｋｍrによって発現されるｒＢＲＵは、毒素Ｂの反復単位領域全体を含む（図８を参照のこと）。
【００２９】
この方法は、ｒＡＲＵまたはｒＢＲＵあるいはその両方を含む免疫原性組成物の調製を提供する。これらは、ワクチンとして有用である。免疫原性組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物中にワクチンとして処方され得る（例えば、水、生理食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）、重炭酸溶液（例えば、０．２４ Ｍ ＮａＨＣＯ3））、坐剤、クリーム、またはゼリー）。これらは、投与の様式および経路ならびに標準的な薬学的実施に基づいて選択される。以下を参照のこと：米国特許第５，９１９．４６３、Ｔｈｏｍａｓら（１９９９）（これは、本明細書においてその全体が参考として援用される）。適切な薬学的キャリアおよび希釈物、ならびに薬学適所放物においてその使用のための薬学的要件は、この分野において、ＵＳＰ／ＮＦにおける標準的な参考文献である、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ａｌｆｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏら編、第１７版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．．Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．．１９８５）において、およびＬａｃｈｍａｎ ら （Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２版．Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ．ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａＰａ．．１９７６）によって記載される。直腸および膣投与の場合、ワクチンは、これらの領域に対して、薬学的材料を投与することにおいて標準的に使用される方法およびキャリアを用いて投与される。例えば、坐剤、クリーム（例えば、ココアバター）、またはゼリー、ならびに標準的な膣塗布剤、スポイト、シリンジ、または浣腸が、当業者によって適切であるように決定されるように使用され得る。
【００３０】
本発明のワクチン組成物は、臨床的に適合した任意の経路（例えば、粘膜（鼻内、経口、眼内、胃腸、直腸、膣内または尿生殖路を含む）の表面への塗布による）によって投与され得る。あるいは、非経口的（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内）の投与様式もまた使用され得る。投与されるワクチンの量は、当業者によって判定されるように、特定のワクチン抗原、ならびに使用される任意のアジュバント、投与の様式および頻度、および所望の効果（例えば、保護および／処置）に依存する。一般に、本発明のワクチンは、１μｇと１００ｍｇとの間の範囲の量で投与される。投与は、当業者によって必要とされるように決定されるように反復される。例えば、プライム刺激用量に続いて３回の追加免疫用量を、１週間おきに投与され得る。
【００３１】
ここまで、本発明を一般的に記載してきたことから、本発明は、以下の実施例を参酌してより容易に理解される。これらの実施例は、例示の目的で提供され、そして特定しない限り本発明の限定を意図しない。
【実施例】
【００３２】
（実施例）
（実施例１：ｒＡＲＵ発現ベクターの構築）
発現および精製のために使用したベクターをクローニングのための標準的な技術を用いて構築した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｖ Ｍａｎｕａｌ （１９８９））。ｒＡＲＵをコードする毒素Ａ遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列は、クローニングされた毒素Ａ遺伝子から得（Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８．４８０−４８８ （１９９０）；Ｐｈｅｌｐｓら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．５９：１５０−１５３ （１９９１））、そして図２に示す。この遺伝子フラグメントは、タンパク質８６７アミノ酸長をコードする（図３）。ここで、算出される分子量は９８ｋＤａである。この遺伝子フラグメントを発現ベクターｐＲＳＥＴＢへとサブクローニングした。カナマイシン耐性遺伝子を、次にこのベクターへとサブクローニングした。得られたベクターｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrは、ｒＡＲＵを発現する。この組み換えタンパク質のＮ末端にはさらに３１アミノ酸が発現ベクターｐＲＳＥＴＢによって与えられる。その組み換えタンパク質の最後の算出分子量は１０２ｋＤａである。
【００３３】
（実施例２：ｒＡＲＵの発現および精製）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｔ７ 発現宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、記載されるように、ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrで形質転換した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ （１９８９））。１Ｌの培養物を、ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrを含む１０ｍｌのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３）の一晩培養物に接種し、、そして２５ μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃブロス （Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．，ＭＯ）中で１．８−２．０にまでＯ．Ｄ．６００増殖させ、そしてイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度４０μＭにまで添加した。細胞を、誘導の２２時間後採集し、０．２％のカザミノ酸を含む０．１Ｌの標準的なリン酸緩衝化生理食塩水ｐＨ７に懸濁化し、そして超音波処理により破壊した。細胞砕片を遠心分離により溶解物から除去した。溶解物は、代表的に、ＴＯＸ−Ａ試験ＥＩＡにおいて１０6の力価（０．２を超えるＡ４５０を有する最高希釈物の逆数）を含んだ（ＴｅｃｈＬａｂ．Ｉｎｃ．．Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ， ＶＡ）。溶解物を、４０％硫酸アンモニウムで飽和させ、４℃で一晩攪拌し、そして沈澱したタンパク質を遠心分離により採取した。この硫酸アンモニウム画分を０．１Ｌの５ｍＭ Ｋ2ＰＯ4、０−１Ｍ ＮａＣ１2， ｐＨ ８．０中に懸濁し、そして４℃で同じ緩衝液に対して徹底的に透析した。可溶性材料を遠心分離により除去した。透析した溶液をＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂクロマトグラフィー媒体（５０ｍｌ媒体／１００ｍｌ溶液）を含むカラムに通した。画分を収集し、そしてｒＡＲＵの存在について、ＴＯＸ−Ａ試験を用いてＥＩＡによりモニターした。ＥＩＡ活性を含む画分を、およそ１０２ＫＤａの分子量でのｒＡＲＵの存在についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分析した。単一バンドのｒＡＲＵを含む画分をプールした。純度をさらに確実とするために、プールされた溶液をＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ カラム （２５ ｍｌ媒体／１００ ｍｌタンパク質溶液）に対して通過させた。精製されたｒＡＲＵを含む溶液を２２μフィルターを通過させることによりフィルター濾過し、そして４℃で保存した。精製されたｒＡＲＵを、精製（溶解物および透析された硫酸アンモニウム画分）の工程からのサンプルとともに、図５に示す。その手順は、代表的に、１リットルのＥ．ｃｏｌｉ／ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍr培養物あたりおよそ１００ｍｇ ｒＡＲＵを得る。併せて６リットルのバッチにより、合計で７４８ｍｇのｒＡＲＵについて０．８８ｍｇ／ｍｌでまたは１２５ｍｇ／リットルの培養物０．８５０リットルのｒＡＲＵが得られた。回収されたｒＡＲＵの量は可溶性タンパク質の合計の２３％を示す。
【００３４】
（実施例３：ｒＢＲＵ発現ベクターの構築）
発現および精製のために使用されたベクターｐＲＳＥＴＣ−ＢＲＵ−Ｋｍrを標準的なクローニング技術を用いて構築した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９））。ｒＢＲＵをコードする毒素Ｂ遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列はクローニングした毒素Ｂ遺伝子に由来し（Ｂａｒｒｏｓｏ ｅｔ
ａｌ．．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １ ８：４００４ （１９９０）） 、そして図６に示す。この遺伝子フラグメントは、６２２アミノ酸長のタンパク質をコードし、分子量は約７０ｋＤａである。カナマイシン耐性遺伝子を、次にそのベクター中にサブクローニングした。得られたベクターｐＲＳＥＴＣ−ＢＲＵ−ＫｍrはｒＢＲＵを発現する。
【００３５】
（実施例４：ｒＢＡＲＵの高レベル発現および部分精製）
１リットルのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐＲＳＥＴＣ−ＢＲＵ−Ｋｍrを３７℃で２５時間、振盪インキュベーターで増殖させた。細胞を、遠心分離し、そして０．２％カザミノ酸を含む０．１リットルのリン酸緩衝化生理食塩水中に再懸濁した。採取時の培養物の上性は、６．２のｐＨを有した。細胞を超音波処理により墓石、そして細胞砕片を遠心分離により除去した。１０×溶解物を図９、レーン３に示す。
【００３６】
（実施例５：結合体のｒＡＲＵ成分に対する免疫応答）
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ（ＣＤＴＡ）に対する抗体。ネイティブ毒素Ａに対する抗体を、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅから単離された毒素Ａｗｏコーティング抗原として使用したＥＬＩＳＡ、および細胞傷害性のインビトロ中和によってにより測定した（Ｌｖｅｒｌｖ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３５：１１４７−１１５０ （１９８２））。ヒト小腸上皮ＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＩ３ ３８）を、５％ＣＯ2雰囲気下で１０％の仔ウシ血清を補充したＭｃＣｏｖ５Ａ培地を有する９６ウェルプレート中に維持した。ＨＴ−２９細胞を選択した。なぜなら、それらは、その表面に高密度の糖レセプターにおそらく起因してＣＤＴＡに対して高感度であるからである。連続的に２倍の希釈の血清を、０．４μｇ／ｍｌのＣＤＴＡとともに３０分で室温でインキュベートした。ＣＤＴＡ血清混合物を、ウェルに、最終容量０．２ｍｌ中に、１ウェルあたり最終濃度２０ｎｇ（ＨＴ−２９細胞についての最小細胞傷害性用量の約２００倍）の毒素Ａで添加した。中和力価を、細胞傷害性を完全に中和した最高希釈の逆数として表す。
【００３７】
【表１】
すべての５つの結合体は、高いレベルの抗ＣＤＴＡ（１９４−６１３μｇ／ｍｌ）を惹起した（表１）。２．５μｇの免疫用量の結合体は、そのポリサッカリド含量に基づいていたことから、注射したｒＡＲＵの量は、各結合体について異なった。例えば、タンパク質重量ベースで、Ｐｎｌ４−ｒＡＲＵは、１．２９μｇのｒＡＲＵとともに、１９４μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌ（１５０．３μｇＡｂ／μｇｒ注射したＡＲＵ）を惹起した。対照的に、１用量あたり７．３μｇのｒＡＲＵを含んだＰｎ Ｉ４−ｒＡＲＵｓｕｃｃは、３７１μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌ（５０．８μｇ Ａｂ／注射したμｇ ｒＡＲＵｓｕｃｃ）を惹起した。ＰｎＩ４−ｒＡＲＵは、１μｇのｒＡＲＵあたり、Ｐｎ１４−ｒＡＲＵｓｃｃより多くの抗ＣＤＴＡを誘導したが、Ｐｎ１４−ｒＡＲＵｓｃｃによって惹起された合計量の抗ＣＤＴＡは、ｒＡＲＵのそのより高い含量に起因して多かった。Ｐｎ１４−ｒＡＲＵによって惹起される抗ＣＤＴＡ（１９４μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌ）、Ｐｎ１４−ｒＡＲＵ−ｒＡＲＵｓｕｃｃによって惹起される抗ＣＤＴＡ（３７１μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌ）に比較しての相違は、顕著であった。
【００３８】
３．９μｇのｒＡＲＵを含むＳＦ−ｒＡＲＵは、４３７μｇのＣＤＴＡ抗体／ｍｌ（１１２．０μｇ Ａｂ／注射されたμｇ ｒＡＲＵ）は、ＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃ（３４．９μｇ Ａｂ／注射したμｇ ｒＡＲＵｓｕｃｃ）についての５１８μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌに匹敵した。ｒＡＲＵｓｕｃｃに対する特定の免疫原性活性は、ＳＦ結合体においてｒＡＲＵのものよりも低かったが、２つの結合体によって惹起されるＣＤＴＡ抗体のレベルの間には統計学的な差異はなかった（ＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃについて４３７μｇ Ａｂ／ｍｌに対してＳＦ−らＲＵについての２４２μｇ Ａｂ／ｍｌ）。
【００３９】
３９０μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌを含むＫ１−ｒＡＲＵｓｕｃｃは、そのｒＡＲＵ成分の匹敵する特異的免疫原性活性を有した（１μｇのｒＡＲＵｓｕｃｃあたり４８μｇ Ａｂ／ｍｌ）
（実施例６：ＣＤＴＡ中和抗体）
その結合体の第三注射の後７日で得た個々の血清を、ヒト小腸上皮ＨＴ−２９細胞に対するＣＤＴＡの細胞傷害性用量の約２００倍のその中和について個々にアッセイした。その結合体で免疫したマウスからのすべての血清は、６４以上の中和力価を有した。各結合体についての中和力価の幾何平均の範囲を表２に示す。
【００４０】
【表２】
（実施例７：ＣＤＴＡでの致死チャレンジからの保護（表３））
Ｈｓｄ／ＩＣＲマウスに、ＳＦ−ｒＡＲＵ、ＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃまたはｒＡＲＵを、上記実施例４に記載のように注射した。第三注射の後１週間で、そのマウスに、致死用量（１５０ｎｇ）のＣＤＴＡで腹腔内チャレンジした。結合体またはｒＡＲＵのいずれかをワクチン接種したほぼすべてのマウスが保護された。注射されたｒＡＲＵの量に基づいて、ｒＡＲＵおよびＳＦ−ｒＡＲＵは、抗ＣＤＴＡの類似のレベルを惹起した。浴されるように、ＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃは、他の２つの免疫原よりもより低いレベルの抗ＣＤＴＡを惹起したがレシピエントは比較的保護された。
【００４１】
結合体誘導された抗体レベルは、ホルマリン不活化ＣＤＴＡで惹起された、０．５ｍｇ／ｍｌを含むアフィニティー精製された薬学的組成物ギ抗体の中和活性に近づくかまたは超過していた。
【００４２】
【表３】
本発明を、直接の説明および実施例によって説明してきた。上記のように、実施例は、本発明の例示のみであり、そして本発明を何らの意味でも限定しないことが意図される。さらに、本発明に関連する当業者は、明細書および上記特許請求の範囲に鑑み、本発明の請求された局面と等価物が存在することを認識する。本発明者らは、請求された本発明の合理的範囲内にそれらの等価物が包含されることを意図する。
【００４３】
（引用された文献）
【００４４】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載されるような発明。
【請求項１】
本願明細書に記載されるような発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１０−８３８９８（Ｐ２０１０−８３８９８Ａ）
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２９８９２５（Ｐ２００９−２９８９２５）
【出願日】平成２１年１２月２８日（２００９．１２．２８）
【分割の表示】特願２０００−６１１６８５（Ｐ２０００−６１１６８５）の分割
【原出願日】平成１２年４月１０日（２０００．４．１０）
【出願人】（５０９３１３１２０）インターセル ユーエスエー， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２８日（２００９．１２．２８）
【分割の表示】特願２０００−６１１６８５（Ｐ２０００−６１１６８５）の分割
【原出願日】平成１２年４月１０日（２０００．４．１０）
【出願人】（５０９３１３１２０）インターセル ユーエスエー， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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